CN112226412B - 一种表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞及其应用，所述免疫抑制检查点受体分子嵌合表达于T细胞膜上，包括免疫抑制检查点和免疫激活信号结构域；所述免疫抑制检查点为所述免疫抑制检查点受体分子的信号肽、胞外结构域和跨膜结构域；所述免疫激活信号结构域包括CD28胞内段、CD3ζ和TLR2的组合；所述CD28位于所述CD3ζ的N端，所述TLR2位于所述CD3ζ的C端。本发明的T细胞相较于野生型T细胞具有显著增强的抗免疫抑制作用，对表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，不会引起细胞因子风暴，安全性强，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方法，通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞，是近年来治疗恶性血液肿瘤的有力手段。
然而，靶向实体瘤的CAR-T免疫治疗面临巨大的考验，CAR-T细胞存在无法突破实体瘤组织壁垒、不能抵抗肿瘤组织内的免疫抑制、在缺氧微环境中竞争生存能力弱等问题。
科研人员通过构建PD-1抗体(Pembrolizumab、Nivolumab)或CTLA-4抗体(Ipilimumab)，或使用PD-1或CTLA-4的抑制剂或信号通路阻断剂，进行肿瘤免疫治疗。但是，抗体需要渗入肿瘤组织中才能发挥疗效，PD-1抗体和CTLA-4抗体的临床应用存在不确定性。
现有技术还报道了共表达双抗体PD-1和CD19/Mesothelin/PSCA的CAR-T，虽然可以靶向表达PD-1或CD19/Mesothelin/PSCA或同时表达两者的肿瘤细胞，但是可能引起细胞因子风暴，误伤正常细胞。
因此，有必要对现有技术进行改进，构建更加合理的嵌合受体分子，解除肿瘤免疫抑制微环境，增强肿瘤微环境中的免疫作用，缓解过度的非特异性免疫效应和细胞因子风暴等副作用。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞及其应用，改造后的T细胞有利于避免细胞因子风暴等副反应的发生，安全性高。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞，所述免疫抑制检查点受体分子嵌合表达于T细胞膜上，包括免疫抑制检查点和免疫激活信号结构域；
所述免疫抑制检查点为所述免疫抑制检查点受体分子的信号肽、胞外结构域和跨膜结构域；
所述免疫激活信号结构域包括CD28胞内段、CD3ζ和TLR2的组合；
所述CD28位于所述CD3ζ的N端，所述TLR2位于所述CD3ζ的C端。
本发明中，向T细胞导入将免疫抑制信号转变为免疫激活信号的功能性嵌合受体的编码基因，使得改造后的T细胞对表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞具有显著增强的杀伤作用，而由于T细胞天然表达免疫抑制检查点，免疫抑制检查点和配体结合后传递的抑制信号有利于避免T细胞过度激活，减缓了细胞因子风暴等副反应的发生几率。
进一步地，本发明采用Toll样受体2(TLR2)作为信号传递结构域，并设置在CD3ζ的C端，不仅加强了改造的T细胞特异性识别肿瘤抗原的能力，更显著扩大了由胞外区传递的细胞信号，引起下级细胞杀伤作用的级联放大，提高了T细胞的抗肿瘤能力。
本发明中，免疫抑制检查点受体分子、其特定的免疫激活信号结构域、以及T细胞天然表达的免疫抑制检查点相互促进并相互制约，使得表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞得到了显著增强的抗肿瘤能力，且安全性高，有效避免了脱靶效应、细胞因子风暴。
优选地，所述免疫抑制检查点包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、A2AR、B7H3或B7H4中的任意一种，优选为CTLA-4。
优选地，所述CTLA-4免疫抑制检查点包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN。
优选地，所述免疫抑制检查点受体分子由CTLA-4免疫抑制检查点、CD28胞内段、CD3ζ和TLR2串联组成。
优选地，所述免疫抑制检查点受体分子包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPINRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。
第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括CTLA-4免疫抑制检查点编码基因、CD28胞内段编码基因、CD3ζ编码基因和TLR2编码基因。
优选地，所述CTLA-4免疫抑制检查点编码基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
SEQ ID NO:3：
atggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaat。
优选地，所述CD28胞内段编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
SEQ ID NO:4：
attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc。
优选地，所述CD3ζ编码基因包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
SEQ ID NO:5：
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
优选地，所述TLR2编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；
SEQ ID NO:6：
caggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc。
优选地，所述表达载体包括病毒载体。
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
第三方面，本发明提供了一种慢病毒，所述慢病毒采用第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞的制备方法，所述方法包括将第二方面所述的表达载体或第三方面所述的慢病毒导入T细胞的步骤。
第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的慢病毒或第五方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明构建的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞，将免疫抑制检查点和配体结合后传递的抑制信号转变为免疫激活信号，能特异性识别杀伤肿瘤免疫抑制微环境中表达免疫抑制检查点配体的细胞，有效消除了肿瘤免疫抑制作用；
(2)本发明的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞天然表达免疫抑制检查点，与肿瘤细胞、肿瘤相关免疫抑制细胞的抗原结合后产生一定的反馈抑制调节信号，激活信号与抑制信号相互调节与制约，避免了T细胞的过度激活，安全性高；
(3)本发明的T细胞表达的免疫抑制检查点受体分子结构合理，将CD28胞内段、CD3ζ和TLR2串联，具有极强的免疫激活效果，协同促进抗肿瘤免疫效应；
(4)本发明的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞肿瘤杀伤能力强、抗免疫抑制效果好、安全性高，在抗肿瘤治疗中具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为免疫抑制检查点受体分子的结构示意图；
图2为表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞对白血病细胞系的体外杀伤作用；
图3为表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞对非霍金森淋巴瘤的体外杀伤作用。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1慢病毒载体的制备
本实施例首先基因合成以下核酸分子：
①由CTLA-4、CD28胞内段、CD3ζ和TLR2的核酸序列串联形成的受体分子(示意图如图1所示)；
②由CTLA-4、CD28胞内段、TLR2和CD3ζ的核酸序列串联形成的受体分子；
其中，CTLA-4免疫抑制检查点编码基因如SEQ ID NO:3所示，CD28胞内段编码基因如SEQ ID NO:4所示，CD3ζ编码基因如SEQ ID NO:5所示，TLR2编码基因如SEQ ID NO:6所示。
在上述核酸分子的C端和N端分别添加限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；
利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到含有CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2或CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ的编码基因的慢病毒载体。
实施例2慢病毒包装
为了将受体分子导入T细胞，采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：
病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；
配制如表1所示的质粒混合液，pWPXLd-表达质粒包括含有CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2的编码基因的慢病毒载体，或含有CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有受体分子编码基因的空载体；
表1
Figure BDA0002720606750000091
将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；
将表1所示的质粒混合液与PEI混合，吹打混匀，室温静置25～30min；
将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；
培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；
包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；
1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达受体分子的重组慢病毒或或空白对照eGFP慢病毒，4℃保存待用。
实施例3 T细胞激活和慢病毒转染
采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；
分选出来的T细胞采用培养基(AIM-V培养基+5％FBS+青霉素100U/mL+链霉素0.1mg/mL)稀释至细胞浓度为2.5×106个/mL待用；
采用CD2/CD3/CD28 T细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活T细胞，置于37℃、5％CO2培养箱培养刺激48h；
T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入不同的慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱培养；
24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，每2～3天进行一次半量换液。
本实施例构建的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞分别为野生型T(WT)、CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2-T和CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ-T。
实施例4体外检测表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞对白血病细胞系的杀伤作用
将实施例3制备的WT、CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2-T和CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ-T分别与1×104个白血病细胞系NALM6-GL(含有荧光素酶基因)按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO2培养箱共培养18h；
18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2-T和CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ-T对NALM6-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图2所示，CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2-T和CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ-T对NALM6-GL的体外杀伤效率显著高于WT，其中，CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2-T杀伤能力又大于CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ-T，说明当免疫激活信号结构域为CD28-CD3ζ-TLR2时，可以高效将免疫抑制信号转换为免疫激活信号，使得T细胞表现出较强的肿瘤杀伤活性。
实施例5体外检测表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞对非霍金森淋巴瘤的杀伤作用
将实施例3制备的WT、CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2-T和CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ-T分别与1×104个非霍金森淋巴瘤细胞(含有荧光素酶基因)按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO2培养箱共培养18h；
18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、CTLA-4-CD28-CD3ζ-TLR2-T和CTLA-4-CD28-TLR2-CD3ζ-T对NALM6-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图3所示，表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞对非霍金森淋巴瘤细胞也具有特异性识别杀伤作用。
综上所述，本发明的免疫抑制检查点受体分子采用将免疫抑制信号转变为免疫激活信号，构建的T细胞相较于野生型T细胞具有显著增强的抗免疫抑制作用，对表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，不会引起细胞因子风暴，安全性强，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞及其应用
<130> 202009
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1               5                   10                  15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
            20                  25                  30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
        115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
                165                 170                 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
            180                 185                 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
        195                 200                 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
    210                 215                 220
<210> 2
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1               5                   10                  15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
            20                  25                  30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
        115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
                165                 170                 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
            180                 185                 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
        195                 200                 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn Arg
    210                 215                 220
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
225                 230                 235                 240
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
                245                 250                 255
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
            260                 265                 270
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
        275                 280                 285
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
    290                 295                 300
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
305                 310                 315                 320
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
                325                 330                 335
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
            340                 345                 350
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
        355                 360                 365
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys
    370                 375                 380
Ala Pro Ser Arg Asn Ile Cys Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu
385                 390                 395                 400
Arg Asp Ala Tyr Trp Val Glu Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn
                405                 410                 415
Phe Asn Pro Pro Phe Lys Leu Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro
            420                 425                 430
Gly Lys Trp Ile Ile Asp Asn Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His
        435                 440                 445
Lys Thr Val Phe Val Leu Ser Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys
    450                 455                 460
Lys Tyr Glu Leu Asp Phe Ser His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn
465                 470                 475                 480
Asp Ala Ala Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile
                485                 490                 495
Pro Gln Arg Phe Cys Lys Leu Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr
            500                 505                 510
Leu Glu Trp Pro Met Asp Glu Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn
        515                 520                 525
Leu Arg Ala Ala Ile Lys Ser
    530                 535
<210> 3
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctac caggacctgg 60
ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120
gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180
gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240
gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300
tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360
gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420
ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480
gacttcctcc tctggatcct tgcagcagtt agttcggggt tgttttttta tagctttctc 540
ctcacagctg tttctttgag caaaatgcta aagaaaagaa gccctcttac aacaggggtc 600
tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660
cccatcaat 669
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300
gacttcgcag cctatcgctc c 321
<210> 5
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300
gacttcgcag cctatcgctc c 321
<210> 6
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caggccaaaa ggaagcccag gaaagctccc agcaggaaca tctgctatga tgcatttgtt 60
tcttacagtg agcgggatgc ctactgggtg gagaacctta tggtccagga gctggagaac 120
ttcaatcccc ccttcaagtt gtgtcttcat aagcgggact tcattcctgg caagtggatc 180
attgacaata tcattgactc cattgaaaag agccacaaaa ctgtctttgt gctttctgaa 240
aactttgtga agagtgagtg gtgcaagtat gaactggact tctcccattt ccgtcttttt 300
gatgagaaca atgatgctgc cattctcatt cttctggagc ccattgagaa aaaagccatt 360
ccccagcgct tctgcaagct gcggaagata atgaacacca agacctacct ggagtggccc 420
atggacgagg ctcagcggga aggattttgg gtaaatctga gagctgcgat aaagtcc 477

Claims (11)

1.一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞，其特征在于，所述免疫抑制检查点受体分子嵌合表达于T细胞膜上，包括免疫抑制检查点和免疫激活信号结构域；
所述免疫抑制检查点为所述免疫抑制检查点受体分子的信号肽、胞外结构域和跨膜结构域；
所述免疫激活信号结构域包括CD28胞内段、CD3ζ和TLR2的组合；
所述CD28胞内段位于所述CD3ζ的N端，所述TLR2位于所述CD3ζ的C端；
所述免疫抑制检查点为CTLA-4；
所述CTLA-4免疫抑制检查点包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述免疫抑制检查点受体分子由CTLA-4免疫抑制检查点、CD28胞内段、CD3ζ和TLR2串联组成；
所述免疫抑制检查点受体分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求1所述的免疫抑制检查点受体分子的编码基因、CD28胞内段的编码基因、CD3ζ的编码基因和TLR2的编码基因。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为病毒载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体。
6.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒采用权利要求2-5任一项所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
7.根据权利要求6所述的慢病毒，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种权利要求1所述的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2-5任一项所述的表达载体或权利要求6或7所述的慢病毒导入T细胞的步骤。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
11.权利要求1所述的表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞、权利要求2-5任一项所述的表达载体、权利要求6或7所述的慢病毒或权利要求9或10所述的药物组合物在制备表达CTLA-4的配体的肿瘤的治疗药物中的应用。
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Applicant before: GUANGDONG ZHAOTAI INVIVO BIOMEDICINE Co.,Ltd.

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