CN113004423A

CN113004423A - 一种特异性靶向活化肝星状细胞的car-t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113004423A
Application number: CN202110257361.4A
Authority: CN
Inventors: 周林付; 汤朝阳; 蒋治武; 姚瑶; 胡朵; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Hunan Zhao Tai Biological Medicine Co ltd
Current assignee: Hunan Zhao Tai Biological Medicine Co ltd
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: CN113004423B

Abstract

本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR‑T细胞及其制备方法和应用，所述CAR包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；所述抗原结合结构域为抗FAP单链抗体。本发明采用抗FAP单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，表达所述嵌合抗原受体的T细胞对活化肝星状细胞具有显著的特异性靶向杀伤作用，拓展了细胞免疫疗法的应用范围，为临床治疗肝纤维化和非肿瘤疾病提供了新思路。

Description

一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肝纤维化是肝硬化的前期病变，慢性肝病如脂肪肝、肝炎等都会导致肝纤维化，肝纤维化长期积累有可能发展为肝硬化。在肝脏疾病的早期，细胞外基质的生成与降解处于动态平衡过程，肝纤维化形成伴随着纤维化金属蛋白酶(MMP)生成上调并将过量的细胞外基质水解；随着损伤时间的延长，静息肝星状细胞被激活为活化肝星状细胞，快速增殖的活化肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，促进金属蛋白酶组织抑制剂的合成，抑制纤维化金属蛋白酶(MMP)的生成，从而造成纤维溶解受阻、细胞外基质过量沉积和纤维组织异常增生，破坏了肝脏正常组织结构，最终导致肝纤维化。因此从细胞水平看，导致肝纤维化的原因是活化肝星状细胞，而活化肝星状细胞的表面标志物是成纤维细胞活化蛋白(FibroblastActivation Protein，FAP)。

肝纤维化的治疗方式包括药物治疗、手术治疗和干细胞移植治疗，尚无特效的治疗药物或方法能够治愈肝纤维化，目前的临床手段主要通过消除原发病因，减轻病变程度。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T细胞是指表面表达识别特定抗原并向胞内传递信号的嵌合型受体的T细胞，核心是CAR分子携带有特异性识别细胞表面抗原的单链抗体(scFv)，从而识别并杀伤表达特定抗原的细胞。目前，CAR-T细胞疗法主要应用于癌症治疗，在血液瘤和部分实体肿瘤中展现出一定疗效，但是极少用于癌症以外的疾病治疗，鲜有将CAR-T应用于肝纤维化治疗的报道。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用，以FAP为靶点设计特异性靶向活化肝星状细胞的CAR载体，构建用于治疗肝纤维化的CAR-T细胞。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；

所述抗原结合结构域为抗FAP单链抗体。

本发明中，采用抗FAP单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，使得嵌合抗原受体可以特异性结合表达成纤维细胞活化蛋白(FAP)的活化肝星状细胞，实现对活化肝星状细胞的特异性靶向作用。

优选地，所述铰链区包括CH3。

优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区。

优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ。

优选地，所述信号传导结构域还包括4-1BB、CD28胞内区、DAP10或OX40中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB。

优选地，所述嵌合抗原受体包括抗FAP单链抗体、CH3铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ。

优选地，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

HVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNNYYWGWIRQTPGKGLEWIGSIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGARWQARPATRIDGVAFDIWGQGTMVTVSSGGGSGGGSGGGGSETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVTRNYLAWYQQKPGQAPRLLMYGASNRAAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFGSPYTFGQGTKVEIK。

优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPHVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNNYYWGWIRQTPGKGLEWIGSIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGARWQARPATRIDGVAFDIWGQGTMVTVSSGGGSGGGSGGGGSETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVTRNYLAWYQQKPGQAPRLLMYGASNRAAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFGSPYTFGQGTKVEIKGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKFEIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCTRTSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPASMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的核酸分子的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。

第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

本发明中，表达靶向活化肝星状细胞嵌合抗原受体的T细胞，利用嵌合抗原受体对活化肝星状细胞标志物FAP的特异性结合作用，靶向结合活化肝星状细胞，发挥T细胞的杀伤功能，实现了对活化肝星状细胞的杀伤作用。

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述制备方法包括将第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞或第七方面所述的药物组合物在制备肝病治疗药物中的应用。

优选地，所述肝病包括肝纤维化和/或肝硬化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体采用抗FAP单链抗体作为抗原结合结构域，通过结合活化肝星状细胞表面的FAP标志物，实现了对活化肝星状细胞的特异性靶向作用；

(2)本发明的表达嵌合抗原受体的T细胞在不同的效靶比下对FAP阳性细胞均具有显著的杀伤作用，为临床治疗肝纤维化、肝硬化和非肿瘤疾病提供了新思路。

附图说明

图1为anti-FAP CAR的结构示意图；

图2为anti-FAP CAR-T细胞杀伤过表达FAP的A549细胞系的结果；

图3为anti-FAP CAR-T细胞杀伤野生型A549细胞系的结果；

图4为免疫荧光验证肝星状细胞系LX2表达FAP；

图5为anti-FAP CAR-T细胞杀伤肝星状细胞系LX2的结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1构建anti-FAP CAR慢病毒载体

本实施例采用抗FAP单链抗体(PCT/US10/02660)作为CAR分子的抗原结合结构域，与CH3铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ结合，设计anti-FAP CAR(SEQ ID NO:2)，示意图如图1所示；

全基因合成anti-FAP CAR编码基因，通过PCR、酶切、重组等步骤将合成的CAR分子编码基因克隆至慢病毒载体中，导入宿主菌，保存于甘油中；

取100μL甘油菌于50mL离心管中，加入25mL新鲜LB培养基，于37℃、220rpm摇床中培养16小时，然后用质粒小提中量试剂盒提取质粒，取少量质粒交于生工生物工程(上海)股份有限公司测序，检验其序列是否与构建的目的图谱一致，其余质粒保存于-20℃。

实施例2包装anti-FAP CAR慢病毒和滴度检测

利用PEI转染的方式，将提取的anti-FAP CAR慢病毒载体和辅助质粒与PEI混合均匀，常温孵育20min后，加入到培养于10cm培养皿中的密度为70％～80％的293T细胞中(培养基为含1％FBS的DMEM培养基)；12小时后换液为新鲜的含1％FBS的DMEM培养基，继续培养24小时收集上清，置于4℃保存；补加培养基继续培养，连续收集3天上清，用0.45μM过滤器过滤，保存待用。

分别取过滤后的病毒溶液25μL、50μL、100μL于48孔板，再加入1×10⁵个Jurkat细胞(用300μL含10％FBS的1640培养基重悬)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时，用流式细胞术检测GFP阳性比例，GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，计算出病毒溶液的滴度，即1mL病毒感染细胞的数量。

实施例3制备anti-FAP CAR-T细胞

(1)利用Ficoll密度梯度法从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；

(2)分选出来的T细胞用培养基(T551培养基+5％FBS+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素+1000IU/mL IL-2)稀释至细胞浓度为1×10⁷个/mL，待用；

(3)用T细胞激活试剂盒TransAct(加拿大StemCell)激活T细胞，具体为向1×10⁶个T细胞中加入10μL TransAct，使T细胞终浓度为1×10⁶个/mL/cm²，置于37℃、5％CO₂培养箱培养激活36小时；

(4)T细胞激活36小时后，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，加入anti-FAP CAR慢病毒(病毒加入量为MOI＝10)、8μg/mL polybrene和1000IU/ml IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养24小时；300g离心5min，去上清，用含1000IU/ml IL-2的新鲜培养基重悬，即得过表达anti-FAP CAR分子的T细胞；

另取一定已激活的T细胞，正常培养扩增，作为阴性对照T细胞(Negative ControlT，NCT)；

(5)将CAR-T细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，每2～3天进行一次半量换液，两周后，CAR-T细胞扩增了50～100倍，流式检测GFP阳性细胞比例，即为转染成功的anti-FAPCAR-T细胞的比例。

实施例4 anti-FAP CAR-T细胞体外杀伤肝星状细胞系

(1)将实施例3制备的anti-FAP CAR-T或NCT分别与野生型A549细胞、过表达FAP的A549细胞以及FAP阳性肝星状细胞系LX2(肿瘤细胞均带荧光素酶)混合，效靶比(E:T)分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4，加入到96孔细胞培养板中，每组设3个复孔，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养24小时；

(2)24小时后，向96孔细胞培养板中加入100μL/孔荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为0.1秒，荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法的杀伤比例计算公式为：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图2、图3、图4和图5所示，说明anti-FAP CAR-T细胞可以特异性杀伤FAP阳性细胞，效果显著，安全性好。

综上所述，本发明的嵌合抗原受体具有特异性结合活化肝星状细胞表面的FAP标志物的能力，表达所述嵌合抗原受体的T细胞对活化肝星状细胞具有特异性靶向杀伤作用，拓展了细胞免疫疗法的应用范围，为临床治疗肝纤维化、肝硬化和非肿瘤疾病提供了新思路。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南昭泰生物医药有限公司

<120> 一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用

<130> 20210226

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp

100 105 110

Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr

130 135 140

Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

145 150 155 160

Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn Tyr Leu

165 170 175

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr

180 185 190

Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

210 215 220

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr Thr Phe

225 230 235 240

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<212> PRT

<213> 人工序列

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20 25 30

Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Ser Asn Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr

50 55 60

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser

65 70 75 80

Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp

85 90 95

Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala

100 105 110

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg

115 120 125

Pro Ala Thr Arg Ile Asp Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

130 135 140

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

165 170 175

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr

180 185 190

Val Thr Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

195 200 205

Pro Arg Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro

210 215 220

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

225 230 235 240

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe

245 250 255

Gly Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

275 280 285

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

290 295 300

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

305 310 315 320

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

325 330 335

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

340 345 350

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

355 360 365

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

370 375 380

Ser Pro Gly Lys Phe Glu Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

385 390 395 400

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Thr Arg

405 410 415

Thr Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

420 425 430

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

435 440 445

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

450 455 460

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

465 470 475 480

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

485 490 495

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

500 505 510

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

515 520 525

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Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Lys Ile

565 570 575

Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

580 585 590

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ala Ser Met Val Ser Lys Gly

595 600 605

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610 615 620

Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp

625 630 635 640

Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys

645 650 655

Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val

660 665 670

Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe

675 680 685

Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe

690 695 700

Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly

705 710 715 720

Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu

725 730 735

Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His

740 745 750

Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn

755 760 765

Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp

770 775 780

His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro

785 790 795 800

Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn

805 810 815

Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly

820 825 830

Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

835 840

Claims

1.一种特异性靶向活化肝星状细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；

所述抗原结合结构域为抗FAP单链抗体。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区包括CH3；

优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区；

优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ；

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗FAP单链抗体、CH3铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ；

优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求4所述的核酸分子；

优选地，所述表达载体为含有权利要求4所述的核酸分子的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求5所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。

7.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有权利要求4所述的核酸分子；

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括权利要求5所述的表达载体和/或权利要求6所述的重组慢病毒。

8.一种权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求5所述的表达载体和/或权利要求6所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞；

优选地，所述药物组合物还包括药学上接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

10.权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的重组慢病毒、权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备肝病治疗药物中的应用；

优选地，所述肝病包括肝纤维化和/或肝硬化。