CN112870227B - 一种肝癌治疗药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肝癌治疗药物及其制备方法和应用，所述肝癌治疗药物包括嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域，所述抗原结合结构域为抗成纤维细胞活化蛋白单链抗体。本发明采用抗FAP单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，表达所述嵌合抗原受体的T细胞对肝癌细胞具有显著的特异性靶向杀伤作用，为临床治疗肝癌提供了新思路。

Description

一种肝癌治疗药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，涉及一种肝癌治疗药物及其制备方法和应用。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，传统的治疗方法包括外科手术、化疗、放疗、肝移植、射频消融、肝动脉化疗栓塞和中医治疗等，但是这些方法对晚期肝癌、转移或复发肿瘤疗效较差。此外，也有多种针对肝癌的免疫疗法，包括免疫检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法(adoptive cell transfer，ACT)、肿瘤疫苗以及细胞因子治疗等。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，CAR)T细胞是指表面表达识别特定抗原并向胞内传递信号的嵌合型受体的T细胞，核心是CAR分子携带有特异性识别细胞表面抗原的单链抗体(scFv)，从而识别并杀伤表达特定抗原的细胞。目前，CAR-T细胞疗法主要应用于癌症治疗，在血液瘤和部分实体瘤中展现出一定疗效，但是对大部分实体瘤的临床效果不明显，寻找实体瘤的新型靶点至关重要。目前，针对肝癌的过继性细胞疗法主要为以磷脂酰肌醇聚糖(glypican-3，GPC3)为靶点的CAR-T细胞疗法，对清除GPC3高表达的肝癌细胞具有一定的效果。
通过调研GEPIA数据库的数据发现，肝癌组织的成纤维细胞活化蛋白(FibroblastActivation Protein，FAP)表达量明显高于正常组织。FAP独特表达于肿瘤、纤维化、动脉粥样硬化以及关节炎等疾病中，是潜在的疾病生物标志物和药物治疗靶点，它还是成纤维细胞和部分肿瘤细胞的表面标志物，在健康组织器官中的表达量较低。研究发现，FAP在90％以上的上皮瘤中表达阳性，在胚胎期、伤口愈合的肉芽组织、慢性炎症肉芽肿及肝硬化星形细胞中少量表达，在正常发育成熟的组织中不表达。目前，已经有以FAP为靶点的肿瘤治疗药物(如Talabostat)的报道，也有研究者采用靶向FAP的CAR-T细胞治疗恶性胸膜间皮瘤，因此，FAP是一个潜在的肿瘤治疗靶点。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种肝癌治疗药物及其制备方法和应用，所述肝癌治疗药物以特异性靶向成纤维细胞活化蛋白的CAR-T细胞为主要功效成分，CAR-T细胞特异性靶向成纤维细胞活化蛋白表达阳性的肝癌细胞并发挥杀伤作用，在治疗肝癌中具有潜在的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肝癌治疗药物，所述肝癌治疗药物包括嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体；
所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域，所述抗原结合结构域为抗成纤维细胞活化蛋白单链抗体。
本发明中，采用抗成纤维细胞活化蛋白(FAP)单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，使得嵌合抗原受体可以特异性结合表达FAP的肝癌细胞，表达靶向FAP嵌合抗原受体的T细胞，利用嵌合抗原受体对肝癌细胞标志物FAP的特异性结合作用，靶向结合肝癌细胞，发挥T细胞的杀伤功能，实现了对肝癌细胞的杀伤作用。
优选地，所述铰链区包括CH3。
优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区。
优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ。
优选地，所述信号传导结构域还包括4-1BB、CD28胞内区、DAP10或OX40中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB。
优选地，所述嵌合抗原受体包括抗FAP单链抗体、CH3铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ。
优选地，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
HVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNNYYWGWIRQTPGKGLEWIGSIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGARWQARPATRIDGVAFDIWGQGTMVTVSSGGGSGGGSGGGGSETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVTRNYLAWYQQKPGQAPRLLMYGASNRAAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFGSPYTFGQGTKVEIK。
优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPHVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNNYYWGWIRQTPGKGLEWIGSIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGARWQARPATRIDGVAFDIWGQGTMVTVSSGGGSGGGSGGGGSETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVTRNYLAWYQQKPGQAPRLLMYGASNRAAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFGSPYTFGQGTKVEIKGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKFEIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCTRTSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPASMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*。
优选地，所述肝癌治疗药物还包括药学上接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括特异性靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体的编码基因。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
SEQ ID NO:3：
atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccacatgtccaactgcaagagtcaggtcctggtctggtgaagcctagtgaaaccctcagcctcacatgtaccgtctccggaggttccatcagcagtaataactactactgggggtggattcgccagactccagggaagggactcgaatggatcggatcaatctattattccggaagcaccaactacaaccctagtctcaaaagcagagtgacaatcagcgtggatacttccaagaaccaattctcactgaaactgtctagtgtgactgccgctgataccgccgtgtattattgtgccagaggtgctagatggcaagcccgcccagccaccagaattgacggtgtcgccttcgatatttggggccaaggcacaatggttaccgtcagctccggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagcgaaacaacactcacacagtctcctggaactctctcactcagtccaggcgagcgcgcaacactgtcatgcagggctagtcagacagtcacacgcaattatctggcatggtatcagcagaaaccaggccaggcacccagactgctcatgtacggtgcttctaatagggctgccggagtccctgatcggttcagcgggtccgggtctggaaccgactttacactcacaatctctcggctggaacccgaagatttcgctgtctattattgccagcaatttggttctccttatacatttggacagggcactaaggttgaaattaagggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaattcgaaatctacatttgggccccactcgccggaacatgtggcgtcctcctgctgtcactggtgatcaccctgtactgtacgcgtactagtaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcactagtaaaattgtcgctcctgtcaaacaaactcttaactttgatttactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtccagctagcatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的核酸分子的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。
第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的肝癌治疗药物的制备方法，所述制备方法包括将第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的肝癌治疗药物、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体或第四方面所述的重组慢病毒在制备肝癌治疗药物组合物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明以成纤维细胞活化蛋白(FAP)作为新的治疗靶点，构建靶向FAP的CAR-T细胞，并以此作为肝癌治疗药物的主要功效成分，实现了对肝癌细胞的特异性靶向杀伤作用；
(2)本发明的CAR-T细胞在不同的效靶比下对FAP阳性肝癌细胞均具有显著的杀伤作用，为临床治疗肝癌提供了新思路。
附图说明
图1为anti-FAP CAR的结构示意图；
图2为anti-FAP CAR-T细胞杀伤过表达FAP的A549细胞系的结果；
图3为anti-FAP CAR-T细胞杀伤野生型A549细胞系的结果；
图4为anti-FAP CAR-T细胞杀伤肝癌细胞系Huh-7的结果；
图5为anti-FAP CAR-T细胞杀伤肝癌细胞系Hep-G2的结果；
图6为anti-FAP CAR-T细胞杀伤肝癌细胞系SNU-387的结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1构建anti-FAP CAR慢病毒载体
本实施例采用抗FAP单链抗体(PCT/US10/02660)作为CAR分子的抗原结合结构域，与CH3铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ结合，设计anti-FAP CAR(SEQ ID NO:2)，示意图如图1所示；
全基因合成anti-FAP CAR编码基因，通过PCR、酶切、重组等步骤将合成的CAR分子编码基因克隆至慢病毒载体中，导入宿主菌，保存于甘油中；
取100μL甘油菌于50mL离心管中，加入25mL新鲜LB培养基，于37℃、220rpm摇床中培养16小时，然后用质粒小提中量试剂盒提取质粒，取少量质粒交于生工生物工程(上海)股份有限公司测序，检验其序列是否与构建的目的图谱一致，其余质粒保存于-20℃。
实施例2包装anti-FAP CAR慢病毒和滴度检测
利用PEI转染的方式，将提取的anti-FAP CAR慢病毒载体和辅助质粒与PEI混合均匀，常温孵育20min后，加入到培养于10cm培养皿中的密度为70％～80％的293T细胞中(培养基为含1％FBS的DMEM培养基)；12小时后换液为新鲜的含1％FBS的DMEM培养基，继续培养24小时收集上清，置于4℃保存；补加培养基继续培养，连续收集3天上清，用0.45μM过滤器过滤，保存待用。
分别取过滤后的病毒溶液25μL、50μL、100μL于48孔板，再加入1×105个Jurkat细胞(用300μL含10％FBS的1640培养基重悬)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，用流式细胞术检测GFP阳性比例，GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，计算出病毒溶液的滴度，即1mL病毒感染细胞的数量。
实施例3制备anti-FAP CAR-T细胞
(1)利用Ficoll密度梯度法从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；
(2)分选出来的T细胞用培养基(T551培养基+5％FBS+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素+1000IU/mL IL-2)稀释至细胞浓度为1×107个/mL，待用；
(3)用T细胞激活试剂盒TransAct(加拿大StemCell)激活T细胞，具体为向1×106个T细胞中加入10μL TransAct，使T细胞终浓度为1×106个/mL/cm2，置于37℃、5％CO2培养箱培养激活36小时；
(4)T细胞激活36小时后，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，加入anti-FAP CAR慢病毒(病毒加入量为MOI＝10)、8μg/mL polybrene和1000IU/ml IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱培养24小时；300g离心5min，去上清，用含1000IU/ml IL-2的新鲜培养基重悬，即得过表达anti-FAP CAR分子的T细胞；
另取一定已激活的T细胞，正常培养扩增，作为阴性对照T细胞(Negative ControlT，NCT)；
(5)将CAR-T细胞密度维持在1×106个/mL左右，每2～3天进行一次半量换液，两周后，CAR-T细胞扩增了50～100倍，流式检测GFP阳性细胞比例，即为转染成功的anti-FAPCAR-T细胞的比例。
实施例4 anti-FAP CAR-T细胞的体外杀伤效果
(1)将实施例3制备的anti-FAP CAR-T或NCT分别与野生型A549细胞、过表达FAP的A549细胞混合，效靶比(E:T)分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4，加入到96孔细胞培养板中，每组设3个复孔，置于37℃、5％CO2培养箱共培养24小时；
(2)24小时后，向96孔细胞培养板中加入100μL/孔荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为0.1秒，荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法的杀伤比例计算公式为：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图2和图3所示，说明anti-FAP CAR-T细胞可以特异性杀伤FAP阳性细胞，效果显著，安全性好。
实施例5anti-FAP CAR-T细胞对肝癌细胞系的体外杀伤效果
(1)将实施例3制备的anti-FAP CAR-T或NCT分别与肝癌细胞系Huh-7/HepG2/SNU-387(肿瘤细胞均带荧光素酶)混合，效靶比(E:T)分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4，加入到96孔细胞培养板中，每组设3个复孔，置于37℃、5％CO2培养箱共培养24小时；
(2)24小时后，向96孔细胞培养板中加入100μL/孔荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为0.1秒，荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法的杀伤比例计算公式为：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图4、图5和图6所示，说明anti-FAP CAR-T细胞可以特异性杀伤FAP阳性肝癌细胞，具有治疗肝癌的潜在应用前景。
综上所述，本发明采用表达靶向FAP的CAR分子的T细胞作为肝癌治疗药物的功效成分，发挥对肝癌细胞的靶向杀伤作用，所述靶向FAP的CAR-T细胞在不同的效靶比下对FAP阳性肝癌细胞均具有显著的杀伤作用，为临床治疗肝癌提供了新思路。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司
<120> 一种肝癌治疗药物及其制备方法和应用
<130> 20210210
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
His Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp
            100                 105                 110
Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr
    130                 135                 140
Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Thr Arg Asn Tyr Leu
                165                 170                 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr
            180                 185                 190
Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
        195                 200                 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
    210                 215                 220
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Pro Tyr Thr Phe
225                 230                 235                 240
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                245
<210> 2
<211> 842
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1               5                   10                  15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro His Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
            20                  25                  30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Ser Ile Ser Ser Asn Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr
    50                  55                  60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser
65                  70                  75                  80
Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
                85                  90                  95
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
            100                 105                 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg
        115                 120                 125
Pro Ala Thr Arg Ile Asp Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
    130                 135                 140
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr
            180                 185                 190
Val Thr Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
        195                 200                 205
Pro Arg Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro
    210                 215                 220
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
225                 230                 235                 240
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
                245                 250                 255
Gly Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
            260                 265                 270
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        275                 280                 285
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    290                 295                 300
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
305                 310                 315                 320
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                325                 330                 335
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            340                 345                 350
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        355                 360                 365
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    370                 375                 380
Ser Pro Gly Lys Phe Glu Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
385                 390                 395                 400
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Thr Arg
                405                 410                 415
Thr Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
            420                 425                 430
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
        435                 440                 445
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
    450                 455                 460
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
465                 470                 475                 480
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
                485                 490                 495
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
            500                 505                 510
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
        515                 520                 525
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
    530                 535                 540
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
545                 550                 555                 560
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Lys Ile
                565                 570                 575
Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
            580                 585                 590
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ala Ser Met Val Ser Lys Gly
        595                 600                 605
Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly
    610                 615                 620
Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp
625                 630                 635                 640
Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys
                645                 650                 655
Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val
            660                 665                 670
Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe
        675                 680                 685
Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe
    690                 695                 700
Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly
705                 710                 715                 720
Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu
                725                 730                 735
Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His
            740                 745                 750
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn
        755                 760                 765
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
    770                 775                 780
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
785                 790                 795                 800
Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn
                805                 810                 815
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
            820                 825                 830
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
        835                 840
<210> 3
<211> 2529
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacatg tccaactgca agagtcaggt cctggtctgg tgaagcctag tgaaaccctc 120
agcctcacat gtaccgtctc cggaggttcc atcagcagta ataactacta ctgggggtgg 180
attcgccaga ctccagggaa gggactcgaa tggatcggat caatctatta ttccggaagc 240
accaactaca accctagtct caaaagcaga gtgacaatca gcgtggatac ttccaagaac 300
caattctcac tgaaactgtc tagtgtgact gccgctgata ccgccgtgta ttattgtgcc 360
agaggtgcta gatggcaagc ccgcccagcc accagaattg acggtgtcgc cttcgatatt 420
tggggccaag gcacaatggt taccgtcagc tccggcggtg gctccggagg cggctccgga 480
ggtggcggca gcgaaacaac actcacacag tctcctggaa ctctctcact cagtccaggc 540
gagcgcgcaa cactgtcatg cagggctagt cagacagtca cacgcaatta tctggcatgg 600
tatcagcaga aaccaggcca ggcacccaga ctgctcatgt acggtgcttc taatagggct 660
gccggagtcc ctgatcggtt cagcgggtcc gggtctggaa ccgactttac actcacaatc 720
tctcggctgg aacccgaaga tttcgctgtc tattattgcc agcaatttgg ttctccttat 780
acatttggac agggcactaa ggttgaaatt aagggcggag gtagctctgg cggtggatcc 840
ggcgggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 900
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 960
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1020
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1080
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1140
agcctctccc tgtctccggg taaattcgaa atctacattt gggccccact cgccggaaca 1200
tgtggcgtcc tcctgctgtc actggtgatc accctgtact gtacgcgtac tagtaaacgg 1260
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1320
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1380
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1440
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1500
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1560
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1620
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1680
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgcacta gtaaaattgt cgctcctgtc 1740
aaacaaactc ttaactttga tttactcaaa ctggctgggg atgtagaaag caatccaggt 1800
ccagctagca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 1860
gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 1920
gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 1980
tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 2040
cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 2100
accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 2160
gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 2220
ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 2280
cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 2340
cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 2400
gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 2460
cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 2520
tacaagtaa 2529

Claims (10)

1.一种肝癌治疗药物，其特征在于，所述肝癌治疗药物包括嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体；
所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域，所述抗原结合结构域为抗成纤维细胞活化蛋白单链抗体；
所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.根据权利要求1所述的肝癌治疗药物，其特征在于，所述肝癌治疗药物还包括药学上接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1所述的特异性靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核酸序列如SEQ IDNO: 3所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求3或4所述的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求3或4所述的核酸分子的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体。
8.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求5-7中任一项所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。
9.一种权利要求1或2所述的肝癌治疗药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求5-7中任一项所述的表达载体和/或权利要求8所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。
10.权利要求1或2所述的肝癌治疗药物、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5-7中任一项所述的表达载体或权利要求8所述的重组慢病毒在制备肝癌治疗药物组合物中的应用。
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