CN112048481A

CN112048481A - 一种靶向cd19的嵌合抗原受体nk细胞及其应用

Info

Publication number: CN112048481A
Application number: CN202010941241.1A
Authority: CN
Inventors: 汤朝阳; 秦乐; 吴迪; 魏志辉; 王翠花; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-09-09
Also published as: CN112048481B

Abstract

本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞及其应用，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19的嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体；所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明构建的靶向CD19的CAR‑NK细胞通过结合肿瘤细胞表面的CD19抗原发挥细胞杀伤作用，在肿瘤治疗领域具有重要意义。

Description

一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞及其应用。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是机体重要的免疫细胞，在外周血单个核细胞组成中占10％左右，是人体抗肿瘤、抗病原体感染的第一道防线。肿瘤经常以丢失肿瘤相关抗原和/或MHC分子作为逃逸T细胞免疫监控的手段，NK细胞可以以非MHC限制的方式裂解肿瘤细胞，而且无需肿瘤细胞表达相关抗原，因此，NK细胞被认为是过继性癌症免疫治疗的理想选择。在临床上，NK细胞的免疫治疗已被推荐用于治疗改善血液恶性肿瘤和实体瘤。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。通常，CAR分子包含的抗体单链片段可变区(single chain fragment variable，scFv)对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性结合作用，其通过铰链和跨膜区与信号传导分子的胞质结构域偶联。

CAR可以将任意的特异性受体嫁接到免疫效应细胞上，如CIK细胞、NK细胞和γδT细胞。由于CAR-NK细胞的毒性相对较小，在异体NK细胞的免疫治疗应用上，不会产生免疫排斥作用，因此是一种比T细胞更安全的免疫治疗候选细胞。

靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。为进一步提高B细胞恶性肿瘤的治疗效果，同时解决CAR-T疗法存在的缺陷，有必要构建靶向CD19的CAR-NK细胞。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞及其应用，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19的嵌合抗原受体，在治疗B细胞恶性肿瘤方面具有广阔的前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19的嵌合抗原受体；

所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体；

所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAP。

本发明中，表达特异性结合CD19的嵌合抗原受体的NK细胞对CD19阳性肿瘤具有靶向杀伤作用，同时发挥NK细胞固有的裂解肿瘤细胞的功能，有效避免了CAR-T疗法过程中的靶点逃逸现象。

优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α，优选为CD8α跨膜结构域。

优选地，所述抗原结合结构域和跨膜结构域通过铰链区连接。

优选地，所述铰链区包括IgG1铰链区和/或CD8α铰链区，优选为CD8α铰链区。

优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB、CD3ζ和TLR2的组合。

优选地，所述GM-CSF信号肽包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLL。

优选地，所述CD8α跨膜结构域包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。

优选地，所述CD8α铰链区包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。

优选地，所述4-1BB包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。

优选地，所述CD3ζ包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:6：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

优选地，所述TLR2包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:7：

QAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。

作为优选技术方案，本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体、CD8α、4-1BB、CD3ζ和TLR2串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

SEQ ID NO:8：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。

第二方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体用于制备第一方面所述的嵌合抗原受体NK细胞。

优选地，所述慢病毒载体包括嵌合抗原受体的编码基因。

优选地，所述编码基因包括GM-CSF信号肽编码序列、抗CD19单链抗体编码序列、CD8α编码序列、4-1BB编码序列、CD3ζ编码序列和TLR2编码序列。

优选地，所述抗CD19单链抗体编码序列包括SEQ ID NO:9所示的核酸序列；

SEQ ID NO:9：

gacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggccccc。

优选地，所述嵌合抗原受体的编码基因包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列；

SEQ ID NO:10：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggcccccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaagagaggcaggaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgcgccccgtgcagacaacccaggaggaggacggctgcagctgtcggttcccagaggaggaggagggaggatgtgagctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgccaggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的慢病毒载体和辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，所述方法包括将第三方面所述的重组慢病毒导入NK细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体NK细胞、第二方面所述的慢病毒载体或第三方面所述的重组慢病毒在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括血液肿瘤。

优选地，所述血液肿瘤包括急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤或浆细胞样树突细胞肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明构建的靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞相对于嵌合抗原受体T细胞，对CD19阳性细胞具有更强的靶向活性，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞也具有一定的靶向杀伤作用，有效避免了靶点逃逸现象的发生，延缓了肿瘤复发。

附图说明

图1为靶向CD19的嵌合抗原受体的结构示意图；

图2为Blank-NK和19-CAR-NK对肿瘤细胞K562-CD19在不同E:T比例下的杀伤效率；

图3为Blank-NK和19-CAR-NK与检测细胞共培养后IFN-γ的分泌。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 CAR分子载体的构建

本实施例构建了靶向CD19的嵌合抗原受体19-CAR，结构示意图如图1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码基因如SEQ ID NO:10所示；

首先全基因合成SEQ ID NO:10，并在两端分别添加EcoRI和BamHI酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶EcoRI和BamHI对编码基因进行双酶切，37℃水浴中孵育30min，使用1.5％琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物；

将酶切产物连接入经EcoRI和BamHI双酶切的线性化pLVX-EF1-MCS质粒(含粘性末端)中，连接体系如表1所示，得到含有靶向CD19的CAR的编码基因的慢病毒载体。

表1

组分	用量(μL)
		pLVX-EF1-MCS质粒	2(50ng)
CAR基因	10(150ng)
		T4 DNA连接缓冲液	2
T4 DNA连接酶(NEB)	1
		ddH<sub>2</sub>O	5

实施例2慢病毒包装

本实施例对实施例1构建的慢病毒载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，步骤如下：

将辅助质粒gag/pol、Rev和VSV-G与重组载体按比例混合后，加至一定体积的无血清DMEM中，混匀放置15min；将上述混合液加至铺有293T细胞的细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养6h；6h后更换新鲜培养基，继续培养，并加入10mM丁酸钠溶液；72h后收集慢病毒培养上清进行纯化检测，得到含有19-CAR的编码基因的慢病毒载体，pLVX-EF1-MCS质粒为不含有CAR编码基因的空载体。

实施例3 NK细胞激活和慢病毒转染

采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再分选出NK细胞；

分选出的NK细胞采用培养基(AIM-V培养基+1％人类AB血清)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/mL待用；

采用CD3/CD28抗体激活NK细胞，NK细胞最终密度为5×10⁶个/mL/cm²，混合后，置于37℃、5％CO₂培养箱培养刺激48h；

NK细胞激活48h后，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬NK细胞，分别加入表达19-CAR的重组慢病毒或空白对照慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬NK细胞，即得CAR-NK细胞19-CAR-NK或Blank-NK。

实施例4体外检测CAR-NK细胞对肿瘤细胞K562-CD19的杀伤功能

将实施例3制备的Blank-NK和19-CAR-NK分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD19按E:T为8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较Blank-NK和19-CAR-NK对K562-CD19的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图2所示，19-CAR-NK对K562-CD19的体外杀伤效率显著高于WT。

实施例5

分别将K562和K562-CD19细胞按照5×10⁵细胞/孔的密度接种24孔板，随后加入Blank-NK或19-CAR-NK，于孵箱中共培养12h；采用IFN-γELISA检测试剂盒对共培养上清进行检测。

结果如图3所示，和与CD19阴性细胞(K562)共培养相比，19-CAR-NK细胞与CD19阳性细胞(K562-CD19)共培养的上清中IFN-γ细胞因子的水平得到显著升高。

综上所述，本发明构建的靶向CD19的CAR-NK细胞通过结合肿瘤细胞表面的CD19抗原发挥细胞杀伤作用，在肿瘤治疗领域具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> 一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞及其应用

<130> 2020

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln

100 105 110

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

115 120 125

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His Gly

130 135 140

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

145 150 155 160

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

165 170 175

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp Leu

180 185 190

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

195 200 205

Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

225 230 235 240

Pro Leu Ala Pro

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 7

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 7

Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asn Ile Cys Tyr

1 5 10 15

Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Trp Val Glu Asn

20 25 30

Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe Asn Pro Pro Phe Lys Leu Cys

35 40 45

Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly Lys Trp Ile Ile Asp Asn Ile

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val Leu Ser Glu

65 70 75 80

Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp Phe Ser His

85 90 95

Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu Ile Leu Leu

100 105 110

Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys Lys Leu Arg

115 120 125

Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Met Asp Glu Ala

130 135 140

Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu Arg Ala Ala Ile Lys Ser

145 150 155

<210> 8

<211> 646

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 8

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

100 105 110

Ser Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

145 150 155 160

Ser Arg His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val

180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

195 200 205

Thr Leu Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala

245 250 255

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala

485 490 495

Pro Ser Arg Asn Ile Cys Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg

500 505 510

Asp Ala Tyr Trp Val Glu Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe

515 520 525

Asn Pro Pro Phe Lys Leu Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly

530 535 540

Lys Trp Ile Ile Asp Asn Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys

545 550 555 560

Thr Val Phe Val Leu Ser Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys

565 570 575

Tyr Glu Leu Asp Phe Ser His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp

580 585 590

Ala Ala Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro

595 600 605

Gln Arg Phe Cys Lys Leu Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu

610 615 620

Glu Trp Pro Met Asp Glu Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu

625 630 635 640

Arg Ala Ala Ile Lys Ser

645

<210> 9

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccccc 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagcg cctacacctt cggccagggc 300

accaagctgg agatcaagtc cggtggcggt ggccaggtgc agctggtgga gagcggcggc 360

ggcgtggtgc agcccggccg cagcctgcgc ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 420

agccgccacg gcatgcactg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 480

gtgatctggt acgacggcag caaccagtac tacgtggaca gcgtgaaggg ccgcttcacc 540

atcagccgcg acaacagcaa gaacaccctg gacctgcaga tgaacagcct gcgcgtggag 600

gacaccgccg tgtactactg cgcccgccgc agcatcacct ggtacggcgg cttcgacatc 660

tggggccagg gcaccatggt gaccgtgagc agcgcccaga ccaccgcccc cagcgtgtac 720

cccctggccc cc 732

<210> 10

<211> 1938

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 120

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctggctgg cctggtacca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccccc 240

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagcg cctacacctt cggccagggc 360

accaagctgg agatcaagtc cggtggcggt ggccaggtgc agctggtgga gagcggcggc 420

ggcgtggtgc agcccggccg cagcctgcgc ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 480

agccgccacg gcatgcactg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 540

gtgatctggt acgacggcag caaccagtac tacgtggaca gcgtgaaggg ccgcttcacc 600

atcagccgcg acaacagcaa gaacaccctg gacctgcaga tgaacagcct gcgcgtggag 660

gacaccgccg tgtactactg cgcccgccgc agcatcacct ggtacggcgg cttcgacatc 720

tggggccagg gcaccatggt gaccgtgagc agcgcccaga ccaccgcccc cagcgtgtac 780

cccctggccc ccaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca agagaggcag gaagaagctg 1020

ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgcgc cccgtgcaga caacccagga ggaggacggc 1080

tgcagctgtc ggttcccaga ggaggaggag ggaggatgtg agctgagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440

atgcaggccc tgccccctcg ccaggccaaa aggaagccca ggaaagctcc cagcaggaac 1500

atctgctatg atgcatttgt ttcttacagt gagcgggatg cctactgggt ggagaacctt 1560

atggtccagg agctggagaa cttcaatccc cccttcaagt tgtgtcttca taagcgggac 1620

ttcattcctg gcaagtggat cattgacaat atcattgact ccattgaaaa gagccacaaa 1680

actgtctttg tgctttctga aaactttgtg aagagtgagt ggtgcaagta tgaactggac 1740

ttctcccatt tccgtctttt tgatgagaac aatgatgctg ccattctcat tcttctggag 1800

cccattgaga aaaaagccat tccccagcgc ttctgcaagc tgcggaagat aatgaacacc 1860

aagacctacc tggagtggcc catggacgag gctcagcggg aaggattttg ggtaaatctg 1920

agagctgcga taaagtcc 1938

Claims

1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19的嵌合抗原受体；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体；

所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述信号肽包括GM-CSF信号肽；

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α，优选为CD8α跨膜结构域；

优选地，所述抗原结合结构域和跨膜结构域通过铰链区连接；

优选地，所述铰链区包括IgG1铰链区和/或CD8α铰链区，优选为CD8α铰链区；

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述GM-CSF信号肽包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

优选地，所述CD8α铰链区包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

优选地，所述4-1BB包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述CD3ζ包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

优选地，所述TLR2包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体、CD8α、4-1BB、CD3ζ和TLR2串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

5.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体用于制备权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞；

优选地，所述慢病毒载体包括嵌合抗原受体的编码基因。

6.根据权利要求5所述的慢病毒载体，其特征在于，所述编码基因包括GM-CSF信号肽编码序列、抗CD19单链抗体编码序列、CD8α编码序列、4-1BB编码序列、CD3ζ编码序列和TLR2编码序列；

优选地，所述嵌合抗原受体的编码基因包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列。

7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求5或6所述的慢病毒载体和辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到；

8.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求7所述的重组慢病毒导入NK细胞的步骤。

9.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞、权利要求5或6所述的慢病毒载体或权利要求7所述的重组慢病毒在制备疾病治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括血液肿瘤；