CN112522207A

CN112522207A - 一种靶向muc1的car-t细胞及其应用

Info

Publication number: CN112522207A
Application number: CN202011521236.1A
Authority: CN
Inventors: 汤朝阳; 秦乐; 吴迪; 冯世忠; 冯嘉昆; 杨乐旋; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Zhaotai Cell Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112522207B

Abstract

本发明提供了一种靶向MUC1的CAR‑T细胞及其应用，所述CAR‑T细胞表达特异性结合MUC1抗原的嵌合抗原受体和复合型IL‑6；所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域为抗MUC1单链抗体；所述铰链区为IgG4‑CH3；所述复合型IL‑6为NFAT调控型过表达。本发明构建条件性表达复合型IL‑6的CAR‑T细胞，CAR分子含有IgG4‑CH3铰链区，两者相互配合、协同作用，从条件性分泌复合型IL‑6和提高CD4+T细胞比例两方面，增强了CAR‑T的扩增能力和抗肿瘤作用。

Description

一种靶向MUC1的CAR-T细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向MUC1的CAR-T细胞及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术，是最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T免疫治疗方法在白血病治疗领域取得了巨大突破。

尽管CAR-T细胞疗法已取得了惊人的疗效，但是仍然存在许多阻碍。例如，CAR-T细胞疗法存在复发率高的问题，促进CAR-T细胞的维持和记忆性T细胞的形成可能是解决该问题的技术突破口；此外，CAR-T细胞中CD4+和CD8+T细胞的比例对于CAR-T细胞的抗肿瘤活性有很大影响，但是在常规的体外培养体系中，CD8+T细胞相较于CD4+T细胞具有更明显的生长优势，体外培养主要获得CD8+T细胞，CD4+T细胞的比例极低。

因此，为提高CAR-T的治疗效果，需要对现有技术进行进一步改进。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种靶向MUC1的CAR-T细胞及其应用，通过条件性表达复合型IL-6和含有IgG4-CH3铰链区的嵌合抗原受体，显著提高了CAR-T数量和抗肿瘤效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向MUC1的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达特异性结合MUC1抗原的嵌合抗原受体和复合型IL-6；

所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域为抗MUC1单链抗体；

所述铰链区为IgG4-CH3；

所述复合型IL-6为NFAT调控型过表达。

本发明中，采用NFAT调控启动子调控T细胞对复合型IL-6的表达，配合含有IgG4-CH3铰链区的嵌合抗原受体，显著提高了CD4+CAR-T细胞的增殖能力和比例，提高了CAR-T的抗肿瘤效果，同时降低了CAR-T的副作用。

优选地，所述IgG4-CH3包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

GGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域。

优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB和CD3ζ的组合。

优选地，所述嵌合抗原受体还包括CD8α信号肽。

优选地，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、MUC1抗原结合结构域、IgG4-CH3、CD8α跨膜结构域、4-1BB和CD3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGSGSGGSGSGGSGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

优选地，所述复合型IL-6为IL-6和IL-6Rα的复合物，所述复合型IL-6包括SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

PPEEPQLSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPARGGGSGGGGSVEPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括嵌合抗原受体编码基因、NFAT调控启动子和复合型IL-6编码基因。

优选地，所述嵌合抗原受体编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

SEQ ID NO:4：

atggcactgcctgtgactgccctgctgctccctctcgcactcctgctgcacgcagcccgcccagatatcgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaacaagtaactatgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtaccaacaaccgagcaccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattgggtgttcggtggaggaaccaaactgactgtcctaggatccgagggtggctcaggatcgggtggatcaggctctggtggctcaggatcggaggtccagctgcagcagtcaggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctctggattcactttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgaaatctaataattatgcaacacattatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgtacctttggtaactcctttgcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。

优选地，所述NFAT调控启动子5×NFAT-RE-minP包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

SEQ ID NO:5：

ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc。

优选地，所述复合型IL-6编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；

SEQ ID NO:6：

ccccccgaggagccccagctctcctgcttccggaagagccccctcagcaatgttgtttgtgagtggggtcctcggagcaccccatccctgacgacaaaggctgtgctcttggtgaggaagtttcagaacagtccggccgaagacttccaggagccgtgccagtattcccaggagtcccagaagttctcctgccagttagcagtcccggagggagacagctctttctacatagtgtccatgtgcgtcgccagtagtgtcgggagcaagttcagcaaaactcaaacctttcagggttgtggaatcttgcagcctgatccgcctgccaacatcacagtcactgccgtggccagaaacccccgctggctcagtgtcacctggcaagacccccactcctggaactcatctttctacagactacggtttgagctcagatatcgggctgaacggtcaaagacattcacaacatggatggtcaaggacctccagcatcactgtgtcatccacgacgcctggagcggcctgaggcacgtggtgcagcttcgtgcccaggaggagttcgggcaaggcgagtggagcgagtggagcccggaggccatgggcacgccttggacagaatccaggagtcctccagctcgcggtggtggatcaggaggtggagggtcagtcgagccagtacccccaggagaagattccaaagatgtagccgccccacacagacagccactcacctcttcagaacgaattgacaaacaaattcggtacatcctcgacggcatctcagccctgagaaaggagacatgtaacaagagtaacatgtgtgaaagcagcaaagaggcactggcagaaaacaacctgaaccttccaaagatggctgaaaaagatggatgcttccaatctggattcaatgaggagacttgcctggtgaaaatcatcactggtcttttggagtttgaggtatacctagagtacctccagaacagatttgagagtagtgaggaacaagccagagctgtgcagatgagtacaaaagtcctgatccagttcctgcagaaaaaggcaaagaatctagatgcaataaccacccctgacccaaccacaaatgccagcctgctgacgaagctgcaggcacagaaccagtggctgcaggacatgacaactcatctcattctgcgcagctttaaggagttcctgcagtccagcctgagggctcttcggcaaatg。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括将第二方面所述的表达载体或第三方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的CAR-T细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的CAR-T细胞、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建条件性表达复合型IL-6的CAR-T细胞，当CAR-T细胞处于静息状态时，复合型IL-6不表达，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活后，NFAT调控启动子5×NFAT-RE-minP启动对复合型IL-6的转录和翻译，复合型IL-6表达并刺激CAR-T细胞增殖、记忆分化、增强杀伤效果，

(2)本发明的CAR分子含有IgG4-CH3铰链区，提高了CD4+T细胞比例，增强了CAR-T的杀伤能力；

(3)本发明的CAR-T从条件性分泌复合型IL-6和提高CD4+T细胞比例两方面，增强了CAR-T的扩增能力和抗肿瘤作用。

附图说明

图1为不同CAR-T的体外扩增效率；

图2为不同CAR-T的体外杀伤效率。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1重组慢病毒载体的构建

通过全基因合成以下核酸分子：

①由CD8α信号肽、MUC1 scFv、IgG4-CH3、CD8α跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ和2A肽的核酸序列串联形成的CAR分子；

②由CD8α信号肽、MUC1 scFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ和2A肽的核酸序列串联形成的CAR分子；

③由5×NFAT-RE-minP启动子和HIL-6串联形成的条件性分子；

将①克隆至慢病毒表达载体pwpxld-eGFP中，得到CAR(H)-pwpxld-eGFP；

将②克隆至慢病毒表达载体pwpxld-eGFP中，得到CAR-pwpxld-eGFP；

将①克隆至慢病毒表达载体pwpxld-tCD19中，随后将③反向克隆至pwpxld-tCD19的末端，得到CAR(H)-HIL-6-pwpxld-tCD19；

将②克隆至慢病毒表达载体pwpxld-tCD19中，随后将③反向克隆至pwpxld-tCD19的末端，得到CAR-HIL-6-pwpxld-tCD19。

实施例2慢病毒包装

采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：

病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液；

表1

将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；

将表1所示的质粒混合液与PEI混合，吹打混匀，室温静置25～30min；

将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；

包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；

1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到重组慢病毒，4℃保存待用。

实施例3 T细胞激活和慢病毒转染

通过Ficoll密度梯度法分离血液中的单个核细胞，采用红细胞裂解液裂解去除红细胞后，通过MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，采用培养基AIM-V加5％FBS、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素稀释至浓度为2.5×10⁶个/mL待用；利用包被CD2、CD3和CD28抗体的磁珠(美天旎)刺激T细胞，磁珠与T细胞比例为1:2，T细胞密度为5×10⁶个/mL/cm²，T细胞在37℃、5％CO₂培养箱中培养刺激48h；

去除T细胞中的磁珠，将激活后的T细胞在300g下离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，分别加入不同的重组慢病毒、8μg/mL的polybrene和300IU/mL的IL-2，病毒加入量为MOI＝10，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬细胞，37℃、5％CO₂培养箱培养；

将CAR-T细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，每2～3天进行一次半量换液；培养10天后进行后续实验。

本实施例制备的CAR-T细胞为MUC1-H-CAR-T、MUC1-CAR-T、HIL-6/MUC1-H-CAR-T和HIL-6/MUC1-CAR-T。

实施例4 CAR-T细胞的体外增殖实验

取不同CAR-T细胞各2×10⁶个，用新鲜的T细胞培养基培养；同时取2×10⁶个不同CAR-T细胞，与等量的MUC1阳性细胞K562-MUC1-GL共培养，连续培养7天，分析CAR-T细胞的增殖情况。

结果图1所示，在不与K562-MUC1-GL共培养的条件下，IgG4-CH3铰链区促进了CAR-T细胞的增殖，与K562-MUC1-GL共培养后，HIL-6/MUC1-H-CAR-T分泌HIL-6，进一步提高了CAR-T的扩增能力，7天后CAR-T数量增长了约200倍，说明HIL-6和IgG4-CH3铰链区发挥协同增效作用，共同促进CAR-T细胞的增殖。

实施例5 CAR-T细胞的体外杀伤实验

取WT、MUC1-H-CAR-T、MUC1-CAR-T、HIL-6/MUC1-H-CAR-T和HIL-6/MUC1-CAR-T细胞各2×10⁶个，与肿瘤细胞K562-MUC1-GL按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、MUC1-H-CAR-T、MUC1-CAR-T、HIL-6/MUC1-H-CAR-T和HIL-6/MUC1-CAR-T对K562-MUC1-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

如图2所示，HIL-6提高了CAR-T的杀伤效果，而当CAR分子的铰链区为IgG4-CH3时，CD4+T细胞比例高，进一步提高了CAR-T的杀伤效果，HIL-6/MUC1-H-CAR-T在E:T很小的情况下，即肿瘤靶细胞远大于效应T细胞，也能表现出较强的肿瘤杀伤活性。

综上所述，本发明构建条件性表达复合型IL-6的CAR-T细胞，CAR分子含有IgG4-CH3铰链区，两者相互配合、协同作用，从条件性分泌复合型IL-6和提高CD4+T细胞比例两方面，增强了CAR-T的扩增能力和抗肿瘤作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> 一种靶向MUC1的CAR-T细胞及其应用

<130> 202012

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro

1 5 10 15

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

20 25 30

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

35 40 45

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

50 55 60

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

65 70 75 80

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

85 90 95

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

100 105 110

Leu Ser Pro Gly Lys

115

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr

20 25 30

Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly

35 40 45

Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp

50 55 60

His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu

85 90 95

Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Ser Glu Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val

145 150 155 160

Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr

165 170 175

Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr

195 200 205

His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp

210 215 220

Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp

225 230 235 240

Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

275 280 285

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

290 295 300

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

305 310 315 320

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

325 330 335

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

340 345 350

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

355 360 365

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr

370 375 380

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

385 390 395 400

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

405 410 415

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

420 425 430

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

435 440 445

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

450 455 460

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

465 470 475 480

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

485 490 495

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

515 520 525

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

530 535 540

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

545 550 555 560

<210> 3

<211> 407

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser

1 5 10 15

Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr

20 25 30

Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp

35 40 45

Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys

50 55 60

Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met

65 70 75 80

Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe

85 90 95

Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val

100 105 110

Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp

115 120 125

Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg

130 135 140

Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp

145 150 155 160

Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His

165 170 175

Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser

180 185 190

Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser

195 200 205

Pro Pro Ala Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro

210 215 220

Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln

225 230 235 240

Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu

245 250 255

Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met

260 265 270

Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro

275 280 285

Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu

290 295 300

Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr

305 310 315 320

Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg

325 330 335

Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys

340 345 350

Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala

355 360 365

Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met

370 375 380

Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser

385 390 395 400

Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met

405

<210> 4

<211> 1680

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcactgc ctgtgactgc cctgctgctc cctctcgcac tcctgctgca cgcagcccgc 60

ccagatatcg ttgtgactca ggaatctgca ctcaccacat cacctggtga aacagtcaca 120

ctcacttgtc gctcaagtac tggggctgtt acaacaagta actatgccaa ctgggtccaa 180

gaaaaaccag atcatttatt cactggtcta ataggtggta ccaacaaccg agcaccaggt 240

gttcctgcca gattctcagg ctccctgatt ggagacaagg ctgccctcac catcacaggg 300

gcacagactg aggatgaggc aatatatttc tgtgctctat ggtacagcaa ccattgggtg 360

ttcggtggag gaaccaaact gactgtccta ggatccgagg gtggctcagg atcgggtgga 420

tcaggctctg gtggctcagg atcggaggtc cagctgcagc agtcaggagg aggcttggtg 480

caacctggag gatccatgaa actctcctgt gttgcctctg gattcacttt cagtaactac 540

tggatgaact gggtccgcca gtctccagag aaggggcttg agtgggttgc tgaaattaga 600

ttgaaatcta ataattatgc aacacattat gcggagtctg tgaaagggag gttcaccatc 660

tcaagagatg attccaaaag tagtgtctac ctgcaaatga acaacttaag agctgaagac 720

actggcattt attactgtac ctttggtaac tcctttgctt actggggcca agggaccacg 780

gtcaccgtct cctcaggcgg aggtagctct ggcggtggat ccggcgggca gccccgagaa 840

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 900

acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 960

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1020

ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1080

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1140

ggtaaaatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 1200

gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1260

tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1320

gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1380

taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1440

gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1500

aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1560

gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1620

ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1680

<210> 5

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt agatctagac tctagagggt atataatgga 180

agctcgaatt ccagcttggc attccggtac tgttggtaaa aagcttggca atccggtact 240

gttggtaaag ccacc 255

<210> 6

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccccccgagg agccccagct ctcctgcttc cggaagagcc ccctcagcaa tgttgtttgt 60

gagtggggtc ctcggagcac cccatccctg acgacaaagg ctgtgctctt ggtgaggaag 120

tttcagaaca gtccggccga agacttccag gagccgtgcc agtattccca ggagtcccag 180

aagttctcct gccagttagc agtcccggag ggagacagct ctttctacat agtgtccatg 240

tgcgtcgcca gtagtgtcgg gagcaagttc agcaaaactc aaacctttca gggttgtgga 300

atcttgcagc ctgatccgcc tgccaacatc acagtcactg ccgtggccag aaacccccgc 360

tggctcagtg tcacctggca agacccccac tcctggaact catctttcta cagactacgg 420

tttgagctca gatatcgggc tgaacggtca aagacattca caacatggat ggtcaaggac 480

ctccagcatc actgtgtcat ccacgacgcc tggagcggcc tgaggcacgt ggtgcagctt 540

cgtgcccagg aggagttcgg gcaaggcgag tggagcgagt ggagcccgga ggccatgggc 600

acgccttgga cagaatccag gagtcctcca gctcgcggtg gtggatcagg aggtggaggg 660

tcagtcgagc cagtaccccc aggagaagat tccaaagatg tagccgcccc acacagacag 720

ccactcacct cttcagaacg aattgacaaa caaattcggt acatcctcga cggcatctca 780

gccctgagaa aggagacatg taacaagagt aacatgtgtg aaagcagcaa agaggcactg 840

gcagaaaaca acctgaacct tccaaagatg gctgaaaaag atggatgctt ccaatctgga 900

ttcaatgagg agacttgcct ggtgaaaatc atcactggtc ttttggagtt tgaggtatac 960

ctagagtacc tccagaacag atttgagagt agtgaggaac aagccagagc tgtgcagatg 1020

agtacaaaag tcctgatcca gttcctgcag aaaaaggcaa agaatctaga tgcaataacc 1080

acccctgacc caaccacaaa tgccagcctg ctgacgaagc tgcaggcaca gaaccagtgg 1140

ctgcaggaca tgacaactca tctcattctg cgcagcttta aggagttcct gcagtccagc 1200

ctgagggctc ttcggcaaat g 1221

Claims

1.一种靶向MUC1的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达特异性结合MUC1抗原的嵌合抗原受体和复合型IL-6；

所述抗原结合结构域为抗MUC1单链抗体；

所述铰链区为IgG4-CH3；

所述复合型IL-6为NFAT调控型过表达。

2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述IgG4-CH3包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；

优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB和CD3ζ的组合；

优选地，所述嵌合抗原受体还包括CD8α信号肽。

3.根据权利要求1或2所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、MUC1抗原结合结构域、IgG4-CH3、CD8α跨膜结构域、4-1BB和CD3ζ串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述复合型IL-6为IL-6和IL-6Rα的复合物，所述复合型IL-6包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括嵌合抗原受体编码基因、NFAT调控启动子和复合型IL-6编码基因；

优选地，所述NFAT调控启动子包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

优选地，所述复合型IL-6编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括病毒载体；

7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求5或6所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

8.一种权利要求1-4任一项所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求5或6所述的表达载体或权利要求7所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的CAR-T细胞；

10.权利要求1-4任一项所述的CAR-T细胞、权利要求5或6所述的表达载体、权利要求7所述的重组慢病毒或权利要求9所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。