CN112521515B

CN112521515B - Cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN112521515B
Application number: CN202011524344.4A
Authority: CN
Inventors: 汤朝阳; 秦乐; 吴迪; 冯世忠; 冯嘉昆; 杨乐旋; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangdong Zhaotai Cell Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112521515A

Abstract

本发明提供了CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD10单链抗体。本发明的抗CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体副作用小、安全性高，构建的CAR‑T细胞有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

Description

CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。通常，CAR分子包含的抗体单链片段可变区(single chain fragment variable，scFv)对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性结合作用，其通过铰链和跨膜区与信号传导分子的胞质结构域偶联。嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)已成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。

目前以CD19为靶点的新一代CAR-T疗法在治疗血液肿瘤方面取得了巨大成功，然而，受到肿瘤免疫逃逸现象的影响，其在实体瘤治疗方法效果不佳。医学诊断表明，很多肿瘤细胞并不表达专一、特异的肿瘤抗原。例如，某些血液肿瘤中的肿瘤细胞并不表达CD19分子，而表达CD10分子，仅利用靶向CD19分子的CAR-T细胞治疗效果不佳，一段时间后部分患者出现了肿瘤复发现象。肿瘤异质性已成为阻碍细胞疗法应用于实体肿瘤治疗的一大障碍。

因此，有必要开发双靶向CD19和CD10分子的嵌合抗原受体，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的靶向和清除作用。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体可以同时靶向CD19和CD10分子，在治疗实体瘤方面具有广阔的前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD10单链抗体。

本发明中，与单靶点嵌合抗原受体相比，抗CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体有效避免了靶点逃逸现象的发生。

优选地，所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAP。

优选地，所述抗CD10单链抗体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

DIVMTQSPDSLAVSLGDRATIACSVSSSISSSNLHWYQQKPGQSPKPWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYFTLTISSLQAEDVATYYCQQWSSYPLTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISGGSYTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYGNFWYFDVWGQGTTVTVSS。

优选地，所述抗CD19单链抗体和抗CD10单链抗体通过连接肽连接。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。

优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。

优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD10单链抗体、CD28和CD3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGDRATIACSVSSSISSSNLHWYQQKPGQSPKPWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYFTLTISSLQAEDVATYYCQQWSSYPLTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISGGSYTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYGNFWYFDVWGQGTTVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述编码基因包括抗CD19单链抗体编码序列和抗CD10单链抗体编码序列。

优选地，所述抗CD19单链抗体编码序列包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

SEQ ID NO:4：

gacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggccccc。

优选地，所述抗CD10单链抗体编码序列包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

SEQ ID NO:5：

gacatcgtgatgacccagagccccgacagcctggccgtgagcctgggcgacagagccaccatcgcctgcagcgtgagcagcagcatcagcagcagcaacctgcactggtaccagcagaagcccggccagagccccaagccctggatctacggcaccagcaacctggccagcggcgtgcccgtgagattcagcggcagcggcagcggcaccagctacttcaccctgaccatcagcagcctgcaggccgaggacgtggccacctactactgccagcagtggagcagctaccccctgaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggcagaagcctgagactgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagcttcggcatgcactgggtgagacaggcccccggcaagggcctggagtgggtggcctacatcagcggcggcagctacaccatctactacgccgacaccgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaagctacggcaacttctggtacttcgacgtgtggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc。

优选地，所述嵌合抗原受体的编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；

SEQ ID NO:6：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggcccccggtggaggcggcagtggcggaggtgggagcggagggggcggttccggtggcgggggatctgacatcgtgatgacccagagccccgacagcctggccgtgagcctgggcgacagagccaccatcgcctgcagcgtgagcagcagcatcagcagcagcaacctgcactggtaccagcagaagcccggccagagccccaagccctggatctacggcaccagcaacctggccagcggcgtgcccgtgagattcagcggcagcggcagcggcaccagctacttcaccctgaccatcagcagcctgcaggccgaggacgtggccacctactactgccagcagtggagcagctaccccctgaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggcagaagcctgagactgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagcttcggcatgcactgggtgagacaggcccccggcaagggcctggagtgggtggcctacatcagcggcggcagctacaccatctactacgccgacaccgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaagctacggcaacttctggtacttcgacgtgtggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括含有第二方面所述的编码基因的病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

第五方面，本发明提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述CAR-T细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。

优选地，所述CAR-T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第六方面所述的CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括CD19阳性和/或CD10阳性疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的抗CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体与单靶点嵌合抗原受体相比，对CD19阳性和/或CD10阳性细胞具有更强的靶向活性，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD10抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象；

(2)本发明表达抗CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体的T细胞对表达CD19和CD10的K562具有高效的杀伤活性，有效避免了靶点逃逸现象的发生，延缓了肿瘤复发。

附图说明

图1为CAR-T对肿瘤细胞K562-CD19在不同E:T比例下的杀伤效率；

图2为CAR-T对肿瘤细胞K562-CD10在不同E:T比例下的杀伤效率；

图3为CAR-T与检测细胞共培养后IFN-γ的分泌。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 CAR分子载体的构建

本实施例构建了抗CD19和抗CD10双靶点嵌合抗原受体19-10-CAR，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码基因如SEQ ID NO:6所示；

首先全基因合成SEQ ID NO:6，并在两端分别添加EcoRI和BamHI酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶EcoRI和BamHI对编码基因进行双酶切，37℃水浴中孵育30min，使用1.5％琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物；

将酶切产物连接入经EcoRI和BamHI双酶切的线性化pLVX-EF1-MCS质粒(含粘性末端)中，连接体系如表1所示，得到含有靶向CD19和CD10双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体。

表1

组分	用量(μL)
		pLVX-EF1-MCS质粒	2(50ng)
CAR基因	10(150ng)
		T4 DNA连接缓冲液	2
T4 DNA连接酶(NEB)	1
		ddH<sub>2</sub>O	5

本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗CD19 scFv的CAR(antiCD19scFv-CD28-CD3ζ)和抗CD10 scFv的CAR(antiCD10 scFv-CD28-CD3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。

实施例2 慢病毒包装

本实施例对实施例1构建的慢病毒载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，步骤如下：

将辅助质粒gag/pol、Rev和VSV-G与重组载体按比例混合后，加至一定体积的无血清DMEM中，混匀放置15min；将上述混合液加至铺有293T细胞的细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养6h；6h后更换新鲜培养基，继续培养，并加入10mM丁酸钠溶液；72h后收集慢病毒培养上清进行纯化检测。

重组载体包括含有靶向CD19和CD10双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD19单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD10单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体，pLVX-EF1-MCS质粒为不含有CAR编码基因的空载体。

实施例3 T细胞激活和慢病毒转染

采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；

分选出来的T细胞采用培养基(AIM-V培养基+5％FBS+青霉素100U/mL+链霉素0.1mg/mL)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/mL待用；

采用CD2/CD3/CD28 T细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活T细胞，即包被磁珠与T细胞以1:2比例混合，T细胞最终密度为5×10⁶个/mL/cm²，混合后，置于37℃、5％CO₂培养箱培养刺激48h；

T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，即得CAR-T细胞；

将CAR-T细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，每2～3天进行一次半量换液。

本实施例构建的CAR-T细胞分别为19-10-CAR-T(表达抗CD19和CD10双靶点CAR)、19-CAR-T(表达抗CD19单靶点CAR)、10-CAR-T(表达抗CD10单靶点CAR)，同时设置WT对照组(转染空白对照慢病毒)。

实施例4 体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD19的杀伤功能

将实施例3制备的WT、19-CAR-T和19-10-CAR-T分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD19按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、19-CAR-T和19-10-CAR-T对K562-CD19的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图1所示，19-CAR-T和19-10-CAR-T对K562-CD19的体外杀伤效率显著高于WT。

实施例5 体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD10的杀伤功能

将实施例3制备的WT、10-CAR-T和19-10-CAR-T分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD10按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、10-CAR-T和19-10-CAR-T对K562-CD10的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

结果如图2所示，10-CAR-T和19-10-CAR-T对K562-CD10的体外杀伤效率显著高于WT。

实施例6

分别将K562、K562-CD19和K562-CD10细胞按照5×10⁵细胞/孔的密度接种24孔板，随后加入WT、19-CAR-T、10-CAR-T和19-10-CAR-T，于孵箱中共培养12h；采用IFN-γELISA检测试剂盒对共培养上清进行检测。

结果如图3所示，和与CD10阴性细胞(K562和K562-CD19)共培养相比，10-CAR-T与CD10阳性细胞(K562-CD10)共培养的上清中IFN-γ细胞因子的水平得到显著升高；和与CD19阴性细胞(K562和K562-CD10)共培养相比，19-CAR-T细胞与CD19阳性细胞(K562-CD19)共培养的上清中IFN-γ细胞因子的水平得到显著升高；而19-10-CAR-T与K562-CD19或K562-CD10共培养，上清中IFN-γ细胞因子水平均得到显著提高。

综上所述，本发明构建的抗CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体对CD19阳性和/或CD10阳性细胞具有靶向活性，表达抗CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD10抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> CD19和CD10双靶点嵌合抗原受体及其应用

<130> 202012

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln

100 105 110

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

115 120 125

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His Gly

130 135 140

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

145 150 155 160

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

165 170 175

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp Leu

180 185 190

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

195 200 205

Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

225 230 235 240

Pro Leu Ala Pro

<210> 2

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Ala Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr

85 90 95

Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr

100 105 110

Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

145 150 155 160

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg Ser Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Thr Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 3

<211> 749

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn

100 105 110

Ser Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

145 150 155 160

Ser Arg His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val

180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

195 200 205

Thr Leu Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala

245 250 255

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met

275 280 285

Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Asp Arg Ala Thr

290 295 300

Ile Ala Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp

305 310 315 320

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr

325 330 335

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

340 345 350

Gly Thr Ser Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp

355 360 365

Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe

370 375 380

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly

385 390 395 400

Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val

405 410 415

Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser

420 425 430

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val

435 440 445

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Gly

450 455 460

Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr

465 470 475 480

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

485 490 495

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Gly

500 505 510

Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

515 520 525

Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys

530 535 540

Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser

545 550 555 560

Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val

565 570 575

Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile

580 585 590

Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr

595 600 605

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln

610 615 620

Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys

625 630 635 640

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

645 650 655

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

660 665 670

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

675 680 685

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

690 695 700

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

705 710 715 720

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

725 730 735

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

740 745

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccccc 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagcg cctacacctt cggccagggc 300

accaagctgg agatcaagtc cggtggcggt ggccaggtgc agctggtgga gagcggcggc 360

ggcgtggtgc agcccggccg cagcctgcgc ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 420

agccgccacg gcatgcactg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 480

gtgatctggt acgacggcag caaccagtac tacgtggaca gcgtgaaggg ccgcttcacc 540

atcagccgcg acaacagcaa gaacaccctg gacctgcaga tgaacagcct gcgcgtggag 600

gacaccgccg tgtactactg cgcccgccgc agcatcacct ggtacggcgg cttcgacatc 660

tggggccagg gcaccatggt gaccgtgagc agcgcccaga ccaccgcccc cagcgtgtac 720

cccctggccc cc 732

<210> 5

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga cagagccacc 60

atcgcctgca gcgtgagcag cagcatcagc agcagcaacc tgcactggta ccagcagaag 120

cccggccaga gccccaagcc ctggatctac ggcaccagca acctggccag cggcgtgccc 180

gtgagattca gcggcagcgg cagcggcacc agctacttca ccctgaccat cagcagcctg 240

caggccgagg acgtggccac ctactactgc cagcagtgga gcagctaccc cctgaccttc 300

ggccagggca ccaaggtgga gatcaagggc agcaccagcg gcagcggcaa gcccggcagc 360

agcgagggca gcaccaaggg cgaggtgcag ctggtggaga gcggcggcgg cgtggtgcag 420

cccggcagaa gcctgagact gagctgcgcc gccagcggct tcaccttcag cagcttcggc 480

atgcactggg tgagacaggc ccccggcaag ggcctggagt gggtggccta catcagcggc 540

ggcagctaca ccatctacta cgccgacacc gtgaagggca gattcaccat cagcagagac 600

aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctga gagccgagga caccgccgtg 660

tactactgcg ccagaagcta cggcaacttc tggtacttcg acgtgtgggg ccagggcacc 720

accgtgaccg tgagcagc 738

<210> 6

<211> 2247

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 120

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctggctgg cctggtacca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccccc 240

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagcg cctacacctt cggccagggc 360

accaagctgg agatcaagtc cggtggcggt ggccaggtgc agctggtgga gagcggcggc 420

ggcgtggtgc agcccggccg cagcctgcgc ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 480

agccgccacg gcatgcactg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 540

gtgatctggt acgacggcag caaccagtac tacgtggaca gcgtgaaggg ccgcttcacc 600

atcagccgcg acaacagcaa gaacaccctg gacctgcaga tgaacagcct gcgcgtggag 660

gacaccgccg tgtactactg cgcccgccgc agcatcacct ggtacggcgg cttcgacatc 720

tggggccagg gcaccatggt gaccgtgagc agcgcccaga ccaccgcccc cagcgtgtac 780

cccctggccc ccggtggagg cggcagtggc ggaggtggga gcggaggggg cggttccggt 840

ggcgggggat ctgacatcgt gatgacccag agccccgaca gcctggccgt gagcctgggc 900

gacagagcca ccatcgcctg cagcgtgagc agcagcatca gcagcagcaa cctgcactgg 960

taccagcaga agcccggcca gagccccaag ccctggatct acggcaccag caacctggcc 1020

agcggcgtgc ccgtgagatt cagcggcagc ggcagcggca ccagctactt caccctgacc 1080

atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc acctactact gccagcagtg gagcagctac 1140

cccctgacct tcggccaggg caccaaggtg gagatcaagg gcagcaccag cggcagcggc 1200

aagcccggca gcagcgaggg cagcaccaag ggcgaggtgc agctggtgga gagcggcggc 1260

ggcgtggtgc agcccggcag aagcctgaga ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 1320

agcagcttcg gcatgcactg ggtgagacag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 1380

tacatcagcg gcggcagcta caccatctac tacgccgaca ccgtgaaggg cagattcacc 1440

atcagcagag acaacagcaa gaacaccctg tacctgcaga tgaacagcct gagagccgag 1500

gacaccgccg tgtactactg cgccagaagc tacggcaact tctggtactt cgacgtgtgg 1560

ggccagggca ccaccgtgac cgtgagcagc attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 1620

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 1680

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 1740

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1800

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1860

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1920

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1980

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 2040

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 2100

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 2160

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 2220

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 2247

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，

所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD10单链抗体、CD28和CD3ζ串联组成；

所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述抗CD10单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的嵌合抗原受体；

所述编码基因包括抗CD19单链抗体编码序列和抗CD10单链抗体编码序列；

所述抗CD19单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:4所示；

所述抗CD10单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:5所示；

所述嵌合抗原受体的编码基因的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求2所述的编码基因的病毒载体；

所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。

4.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求3所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

5.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体；

所述CAR-T细胞的基因组中整合有权利要求2所述的编码基因。

6.根据权利要求5所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞包括权利要求3所述的表达载体和/或权利要求4所述的重组慢病毒。

7.权利要求5或6所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因导入T细胞的步骤。

8.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的表达载体、权利要求4所述的重组慢病毒或权利要求5或6所述的CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用；

所述疾病为CD19阳性和/或CD10阳性肿瘤。