CN112029729A

CN112029729A - Cd19和cd22双靶点嵌合抗原受体nk细胞及其应用

Info

Publication number: CN112029729A
Application number: CN202010942436.8A
Authority: CN
Inventors: 汤朝阳; 秦乐; 吴迪; 魏志辉; 王翠花; 杨凯纯; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Zhaotai In Vivo Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2040-09-09
Also published as: CN112029729B

Abstract

本发明提供了CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体NK细胞及其应用，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体。本发明的表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的NK细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

Description

CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体NK细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体NK细胞及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。通常，CAR分子包含的抗体单链片段可变区(single chain fragment variable，scFv)对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性结合作用，其通过铰链和跨膜区与信号传导分子的胞质结构域偶联。

近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。除了T细胞，自然杀伤(NK)细胞也是机体重要的免疫细胞，是人体抗肿瘤、抗病原体感染的第一道防线。肿瘤经常以丢失肿瘤相关抗原和/或MHC分子作为逃逸T细胞免疫监控的手段，NK细胞可以以非MHC限制的方式裂解肿瘤细胞，而且无需肿瘤细胞表达相关抗原，因此，NK细胞被认为是过继性癌症免疫治疗的理想选择。

CAR可以将任意的特异性受体嫁接到免疫效应细胞上，如CIK细胞、NK细胞和γδT细胞。由于CAR-NK细胞的毒性相对较小，在异体NK细胞的免疫治疗应用上，不会产生免疫排斥作用，因此是一种比T细胞更安全的免疫治疗候选细胞。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体NK细胞及其应用，所述嵌合抗原受体NK细胞可以同时靶向CD19和CD22分子，对CD19阳性和/或CD22阳性的肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用，在治疗血液恶性疾病方面具有广阔的前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体NK细胞，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体；

所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体。

本发明中，表达CD19和CD22双靶点的CAR-NK细胞对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有高效的靶向活性和杀伤能力，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象。

优选地，所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAP。

优选地，所述抗CD22单链抗体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVS。

优选地，所述抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体通过连接肽连接。

优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α，优选为CD28。

优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD3ζ。

作为优选技术方案，本发明提供了一种靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体NK细胞，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD22单链抗体、CD28和CD3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体的编码序列。

优选地，所述表达载体为含有GM-CSF信号肽编码序列、抗CD19单链抗体编码序列、连接肽编码序列、抗CD22单链抗体编码序列、CD28编码序列和CD3ζ编码序列的慢病毒载体。

优选地，所述表达载体为含有SEQ ID NO:4所示的核酸序列的慢病毒载体；

SEQ ID NO:4：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggcccccggtggaggcggcagtggcggaggtgggagcggagggggcggttccggtggcgggggatctgacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgacagagtgaccatcagctgcagagccagccaggacatcagcaactacctgaactggtaccagcagaagcccgacggcaccgtgaagctgctgatctactacaccagcatcctgcacagcggcgtgcccagcagattcagcggcagcggcagcggcaccgactacagcctgaccatcagcaacctggagcaggaggacttcgccacctacttctgccagcagggcaacaccctgccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgaagcccggcggcagcctgaagctgagctgcgccgccagcggcttcgccttcagcatctacgacatgagctgggtgagacagacccccgagaagagactggagtgggtggcctacatcagcagcggcggcggcaccacctactaccccgacaccgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaagagcgaggacaccgccatgtactactgcgccagacacagcggctacggcacccactggggcgtgctgttcgcctactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的表达载体和辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，所述方法包括将第三方面所述的重组慢病毒导入NK细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的嵌合抗原受体NK细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

第六方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体NK细胞和/或第五方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括血液肿瘤。

优选地，所述疾病包括CD19阳性和/或CD22阳性疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明构建的表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的NK细胞对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有高效的靶向活性和杀伤效力，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性，细胞毒性低，反应温和，避免了细胞因子风暴。

附图说明

图1为Blank-NK、19-CAR-NK和19-22-CAR-NK对肿瘤细胞K562-CD19在不同E:T比下的杀伤效率；

图2为Blank-NK、19-CAR-NK和19-22-CAR-NK对肿瘤细胞K562-CD22在不同E:T比下的杀伤效率。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 CAR分子载体的构建

本实施例首先基因合成抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的编码基因(SEQ IDNO:4)，并在编码基因的C端和N端分别添加限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到含有靶向CD19和CD22双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体。

本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗CD19 scFv的CAR(antiCD19 scFv-CD28-CD3ζ)和抗CD22 scFv的CAR(antiCD22 scFv-CD28-CD3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。

实施例2慢病毒包装

为了将CAR分子导入NK细胞，采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：

病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液，pWPXLd-表达质粒包括含有靶向CD19和CD22双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD19单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD22单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体；

表1

将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；

将表1所示的质粒混合液与PEI混合，吹打混匀，室温静置30min；

将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；

包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；

1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒，4℃保存待用。

实施例3 NK细胞激活和慢病毒转染

采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再分选出NK细胞；

分选出的NK细胞采用培养基(AIM-V培养基+1％人类AB血清)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/mL待用；

采用CD3/CD28抗体激活NK细胞，NK细胞最终密度为5×10⁶个/mL/cm²，混合后，置于37℃、5％CO₂培养箱培养刺激48h；

NK细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬NK细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mLpolybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬NK细胞，即得CAR-NK细胞。

本实施例构建的CAR-NK细胞分别为19-22-CAR-NK(表达抗CD19和CD22双靶点CAR)、19-CAR-NK(表达抗CD19单靶点CAR)、22-CAR-NK(表达抗CD22单靶点CAR)，同时设置Blank-NK对照组(转染空白对照eGFP慢病毒)。

实施例4体外检测CAR-NK细胞对肿瘤细胞K562-CD19的杀伤功能

将实施例3制备的Blank-NK、19-CAR-NK和19-22-CAR-NK分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD19按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较Blank-NK、19-CAR-NK和19-22-CAR-NK对K562-CD19的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图1所示19-CAR-NK和19-22-CAR-NK对K562-CD19的体外杀伤效率显著高于Blank-NK。

实施例5体外检测CAR-NK细胞对肿瘤细胞K562-CD22的杀伤功能

将实施例3制备的Blank-NK、22-CAR-NK和19-22-CAR-NK分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD22按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较Blank-NK、22-CAR-NK和19-22-CAR-NK对K562-CD22的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

结果如图2所示，22-CAR-NK和19-22-CAR-NK对K562-CD22的体外杀伤效率显著高于Blank-NK。

综上所述，本发明构建的表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的NK细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体NK细胞及其应用

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln

100 105 110

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

115 120 125

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His Gly

130 135 140

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

145 150 155 160

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

165 170 175

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp Leu

180 185 190

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

195 200 205

Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

225 230 235 240

Pro Leu Ala Pro

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ile Tyr Asp Met Ser

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile

165 170 175

Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His

210 215 220

Ser Gly Tyr Gly Thr His Trp Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

245

<210> 3

<211> 750

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

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50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Ser Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

145 150 155 160

Ser Arg His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val

180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

195 200 205

Thr Leu Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala

245 250 255

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

275 280 285

Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr

290 295 300

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr

305 310 315 320

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser

325 330 335

Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

340 345 350

Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala

355 360 365

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly

370 375 380

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro

385 390 395 400

Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

405 410 415

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

420 425 430

Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln

435 440 445

Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly

450 455 460

Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

465 470 475 480

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys

485 490 495

Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly

500 505 510

Thr His Trp Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

515 520 525

Thr Val Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu

530 535 540

Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro

545 550 555 560

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val

565 570 575

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe

580 585 590

Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

595 600 605

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

610 615 620

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val

625 630 635 640

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

645 650 655

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

660 665 670

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

675 680 685

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

690 695 700

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

705 710 715 720

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

725 730 735

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

740 745 750

<210> 4

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 120

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctggctgg cctggtacca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccccc 240

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagcg cctacacctt cggccagggc 360

accaagctgg agatcaagtc cggtggcggt ggccaggtgc agctggtgga gagcggcggc 420

ggcgtggtgc agcccggccg cagcctgcgc ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 480

agccgccacg gcatgcactg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 540

gtgatctggt acgacggcag caaccagtac tacgtggaca gcgtgaaggg ccgcttcacc 600

atcagccgcg acaacagcaa gaacaccctg gacctgcaga tgaacagcct gcgcgtggag 660

gacaccgccg tgtactactg cgcccgccgc agcatcacct ggtacggcgg cttcgacatc 720

tggggccagg gcaccatggt gaccgtgagc agcgcccaga ccaccgcccc cagcgtgtac 780

cccctggccc ccggtggagg cggcagtggc ggaggtggga gcggaggggg cggttccggt 840

ggcgggggat ctgacatcca gatgacccag accaccagca gcctgagcgc cagcctgggc 900

gacagagtga ccatcagctg cagagccagc caggacatca gcaactacct gaactggtac 960

cagcagaagc ccgacggcac cgtgaagctg ctgatctact acaccagcat cctgcacagc 1020

ggcgtgccca gcagattcag cggcagcggc agcggcaccg actacagcct gaccatcagc 1080

aacctggagc aggaggactt cgccacctac ttctgccagc agggcaacac cctgccctgg 1140

accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagggcagca ccagcggcag cggcaagccc 1200

ggcagcagcg agggcagcac caagggcgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg 1260

gtgaagcccg gcggcagcct gaagctgagc tgcgccgcca gcggcttcgc cttcagcatc 1320

tacgacatga gctgggtgag acagaccccc gagaagagac tggagtgggt ggcctacatc 1380

agcagcggcg gcggcaccac ctactacccc gacaccgtga agggcagatt caccatcagc 1440

agagacaacg ccaagaacac cctgtacctg cagatgagca gcctgaagag cgaggacacc 1500

gccatgtact actgcgccag acacagcggc tacggcaccc actggggcgt gctgttcgcc 1560

tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg agcattgaag ttatgtatcc tcctccttac 1620

ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca 1680

agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc 1740

ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag 1800

aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 1860

cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg 1920

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1980

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 2040

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 2100

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 2160

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 2220

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 2250

Claims

1.一种靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体NK细胞表达特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD22单链抗体。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述信号肽包括GM-CSF信号肽；

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α，优选为CD28；

4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD22单链抗体、CD28和CD3ζ串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有特异性结合CD19和CD22的嵌合抗原受体的编码序列；

优选地，所述表达载体为含有GM-CSF信号肽编码序列、抗CD19单链抗体编码序列、连接肽编码序列、抗CD22单链抗体编码序列、CD28编码序列和CD3ζ编码序列的慢病毒载体；

优选地，所述表达载体为含有SEQ ID NO:4所示的核酸序列的慢病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求5所述的表达载体和辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

7.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求6所述的重组慢病毒导入NK细胞的步骤。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞；

9.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞和/或权利要求8所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括血液肿瘤；

优选地，所述疾病包括CD19阳性和/或CD22阳性疾病。