WO2020045610A1 - Ｃａｒ発現ｔ細胞及びｃａｒ発現ベクター - Google Patents

Ｃａｒ発現ｔ細胞及びｃａｒ発現ベクター Download PDF

Info

Publication number
WO2020045610A1
WO2020045610A1 PCT/JP2019/034055 JP2019034055W WO2020045610A1 WO 2020045610 A1 WO2020045610 A1 WO 2020045610A1 JP 2019034055 W JP2019034055 W JP 2019034055W WO 2020045610 A1 WO2020045610 A1 WO 2020045610A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
cells
car
ccl19
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/034055
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
千央 武
貴之 疊家
山口　晶子
Original Assignee
ノイルイミューン・バイオテック株式会社
武田薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EA202190624A priority Critical patent/EA202190624A1/ru
Priority to JP2020539612A priority patent/JPWO2020045610A1/ja
Priority to CA3111170A priority patent/CA3111170A1/en
Priority to US17/271,451 priority patent/US20210309712A1/en
Priority to SG11202101930XA priority patent/SG11202101930XA/en
Priority to AU2019331866A priority patent/AU2019331866A1/en
Priority to CN201980056592.XA priority patent/CN112771166A/zh
Priority to BR112021003640-7A priority patent/BR112021003640A2/pt
Application filed by ノイルイミューン・バイオテック株式会社, 武田薬品工業株式会社 filed Critical ノイルイミューン・バイオテック株式会社
Priority to EP19853937.1A priority patent/EP3845654A4/en
Priority to MX2021002373A priority patent/MX2021002373A/es
Priority to KR1020217009198A priority patent/KR20210053925A/ko
Publication of WO2020045610A1 publication Critical patent/WO2020045610A1/ja
Priority to IL281013A priority patent/IL281013A/en
Priority to CONC2021/0003508A priority patent/CO2021003508A2/es

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464419—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464424—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464436—Cytokines
    • A61K39/464442—Chemokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/82—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2327—Interleukin-27 (IL-27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to an immune cell expressing a chimeric antigen receptor (hereinafter, referred to as “CAR”) that can be used for cancer immunotherapy (herein, “CAR-expressing immune cell”).
  • CAR-expressing immune cell a chimeric antigen receptor
  • CAR-T cells T cells expressing CAR
  • CAR-expressing immune cells such as CAR-T cells
  • CAR-expressing immune cells such as CAR-T cells
  • the present invention relates to CAR-expressing immune cells (such as CAR-T cells) expressing predetermined cytokines and chemokines, and expression vectors for producing the same.
  • Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 1 describe CAR-T cells expressing IL-7 and CCL19, which have better antitumor activity than conventional CAR-T cells. However, Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 1 do not include specific descriptions of other combinations of cytokines and chemokines.
  • Non-Patent Document 2 describes a CAR-T cell expressing a membrane-bound chimeric IL-15 (mbIL-15) that has improved persistence independently of CAR signaling. However, Non-Patent Document 2 does not include a specific description of a combination of mbIL-15 and a chemokine such as CCL19.
  • Non-Patent Document 3 discloses that by using a fusion protein in which IL-15 and an IL-15R ⁇ sushi domain are linked via a flexible linker, the use of a conventional IL-15 and an IL-15R ⁇ sushi domain in combination can be improved. It is described that the activity of proliferation of lymphocytes (NK cells, NK-T cells, memory CD8-positive cells) and activation of dendritic cells can be enhanced. However, Non-Patent Document 3 does not include a specific description of a combination of IL-15 and IL-15R ⁇ sushi domain with a chemokine such as CCL19.
  • Non-Patent Document 4 describes that the transfection of a secretory fusion protein of mouse IL-15 and IL-15R ⁇ improves the survival and proliferation of CD8-positive T cells. .
  • Non-Patent Document 4 does not include a specific description of a combination of IL-15 with a chemokine such as CCL19.
  • Non-Patent Document 5 describes single-chain IL-27 (p28 and EBI3 linked by a flexible linker) and its effect on the treatment of inflammatory bowel disease (IBD). However, Non-Patent Document 5 does not include a specific description of CAR-T cells or a combination of single-chain IL-27 with a chemokine such as CCL19.
  • U.S. Patent No. 6,064,064 discloses T cells expressing recombinant IL-7, recombinant IL-15, or a combination thereof, wherein expression of such cytokines enhances T cell survival. Is described. However, Patent Document 2 does not include a specific description of CAR-T cells or a combination of the above specific cytokine with a chemokine such as CCL19.
  • Patent Document 3 describes a modified natural killer T cell containing an expression construct encoding IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 or a combination thereof, and a CAR construct. I have. However, Patent Document 3 does not include a specific description of a combination of the above specific cytokine and a chemokine such as CCL19.
  • Patent Document 4 describes CAR-T cells expressing membrane-bound cytokines such as IL-7, IL-15 (IL-15 / IL-15R ⁇ fusion protein), and IL-21. However, Patent Document 4 does not include a specific description of a combination of the above specific cytokine and a chemokine such as CCL19.
  • Patent Document 5 describes a CD19-targeted CAR-T cell expressing IL-15. However, Patent Document 5 does not include a specific description of a combination of IL-15 with a chemokine such as CCL19.
  • Non-Patent Document 6 describes a GPC3-targeted CAR-T cell expressing IL-15 and / or IL-21. However, Patent Document 6 does not include a specific description of a combination of the above specific cytokine and a chemokine such as CCL19.
  • the present invention provides an immune cell (such as a CAR-T cell) having a higher antitumor activity than an immune cell (such as a CAR-T cell) that expresses CAR alone (and does not express a cytokine and / or chemokine). As an issue.
  • an immune cell such as a CAR-T cell
  • an immune cell such as a CAR-T cell
  • ILIL-15, IL-18, IL-27, and CCL19 are cytokines and chemokines that are not expressed in natural (non-exogenous gene-introduced) T cells present in vivo.
  • IL-21 is a cytokine expressed by natural T cells (eg, NKT cells, CD4-positive T cells) existing in a living body.
  • the expression of the predetermined cytokine and chemokine is achieved by introducing a gene for expressing the exogenous predetermined cytokine and chemokine into T cells, thereby allowing natural T cells existing in a living body to be expressed. Also means expressing the above-mentioned predetermined cytokine and chemokine at a high level.
  • the gene is introduced into immune cells other than the T cell, for example, NK cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, and the like. It is possible to extend to an embodiment in which the expression is carried out.
  • the present invention includes at least the following inventions.
  • [1] (1) chimeric antigen receptor (CAR), (2) at least one selected from the group consisting of interleukin-15 (IL-15), interleukin-18 (IL-18), interleukin-21 (IL-21) and interleukin-27 (IL-27) Species, and (3) CC chemokine ligand 19 (CCL19) T cells expressing [2] Item 2.
  • Item 3 The T cell according to Item 2, wherein the IL-15 is IL-15 in a state of being linked to IL-15R ⁇ to form a fusion protein.
  • the fusion protein is a fusion protein in which IL-15 LSP and IL-15 are linked (IL15 LSP ), a fusion protein in which IL-15R ⁇ extracellular domain is linked to IL-15 ( s IL15 RA ), IL-15 and full-length IL fusion proteins -15R ⁇ are linked (mb IL15 RA), or is a fusion protein IL-15R [alpha] and IL15, including a signal peptide and sushi domain are linked (sushi IL15), T cell according to claim 3.
  • the fusion protein is a fusion protein in which IL-15 and full-length IL-15R ⁇ are linked ( mb IL15 RA ), or a fusion protein in which IL-15R ⁇ and IL-15 containing a signal peptide and a sushi domain are linked ( sushi IL15) Item 4.
  • the T cell according to Item 3 [6] Item 10.
  • Item 7. The medicine according to Item 6, which is a therapeutic agent for cancer.
  • the cancer is melanoma, Merkel cell carcinoma, colon cancer, kidney cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, cervical cancer, liver cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, head and neck Cancer, small intestine cancer, prostate cancer, bladder cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, Ewing sarcoma, rhabdomyosarcoma, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, neuroblastoma, osteosarcoma, Item 8.
  • nucleic acid encoding a CAR (2) An expression vector comprising a nucleic acid encoding at least one selected from the group consisting of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27, and (3) a nucleic acid encoding CCL19.
  • Item 10 The expression vector according to Item 9, wherein (2) is IL-15.
  • Item 11 The expression vector according to Item 10, wherein the IL-15 is IL-15 in a state of being linked to IL-15R ⁇ to form a fusion protein.
  • the fusion protein is a fusion protein in which IL-15 LSP and IL-15 are linked (IL15 LSP ), a fusion protein in which IL-15R ⁇ extracellular domain is linked to IL-15 ( s IL15 RA ), IL-15 and full-length IL Item 12.
  • the fusion protein is a fusion protein in which IL-15 and full-length IL-15R ⁇ are linked ( mb IL15 RA ), or a fusion protein in which IL-15R ⁇ and IL-15 containing a signal peptide and a sushi domain are linked ( sushi IL15) Item 12.
  • a method for producing CAR-T cells comprising a step of introducing the expression vector according to Item 9 into T cells.
  • Item 7. A method for treating cancer, comprising a step of administering the T cell according to Item 1 to a subject in need of treatment for cancer.
  • the cancer may be melanoma, Merkel cell carcinoma, colon cancer, kidney cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, cervical cancer, liver cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, head and neck. Cancer, small intestine cancer, prostate cancer, bladder cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, Ewing sarcoma, rhabdomyosarcoma, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, neuroblastoma, osteosarcoma, Item 16.
  • Item 10 The method according to Item 15, which is acute myeloid leukemia, multiple myeloma, lymphoma or leukemia.
  • the T cell according to Item 1 for use as an active ingredient for treating cancer.
  • the cancer may be melanoma, Merkel cell carcinoma, colon cancer, kidney cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, cervical cancer, liver cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, head and neck. Cancer, small intestine cancer, prostate cancer, bladder cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, Ewing sarcoma, rhabdomyosarcoma, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, neuroblastoma, osteosarcoma, Item 18.
  • the T cell according to Item 17 which is acute myeloid leukemia, multiple myeloma, lymphoma or leukemia.
  • the T cell of the above [1] is the “T cell of the present invention”
  • the drug of the above [6] is “the drug of the present invention”
  • the expression vector of the above [9] is “the expression vector of the present invention”.
  • the method for producing CAR-T cells according to the above [14] may be referred to as “the production method of the present invention”.
  • the medicine of the present invention according to the above [6] includes, for example, "at least one selected from the group consisting of (1) CAR, (2) IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27, and ( 3) a method for treating cancer, which comprises a step of administering a T cell expressing CCL19 to a subject in need of treatment for cancer, "(1) a method for using as an active ingredient for treating cancer, CAR, (2) at least one selected from the group consisting of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27, and (3) T cells expressing CCL19 "," (1) CAR, (2 ) Use of at least one selected from the group consisting of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27, and (3) T cells expressing CCL19 in the manufacture of a medicament for treating cancer.
  • a method for treating cancer which comprises a step of administering a T cell expressing CCL19 to a subject in need of treatment for cancer, "(1) a method for using as an active ingredient for treating cancer,
  • T cell of the present invention obtained by expressing the predetermined cytokine and chemokine together with CAR in the T cell, and the related practice.
  • Each invention such as the medicament of the present invention, the expression vector of the present invention, and the production method of the present invention as a form can be prepared by combining CAR and a predetermined cytokine and chemokine with immune cells other than T cells (NK cells, monocytes, macrophages, dendrites). Cells, etc.) and related inventions such as a drug, an expression vector, a production method, and the like as appropriate embodiments.
  • the T cells of the present invention enhance the CAR's antitumor activity because the expression of certain cytokines (such as IL-15) and chemokines (CCL19) enhances the persistence and proliferation of the T cells.
  • cytokines such as IL-15
  • CCL19 chemokines
  • the number of residual tumor cells can be reduced, the amount of IFN ⁇ produced can be increased, and the migration and accumulation of host immune cells (T cells, dendritic cells, NK cells, etc.) at the tumor location can be improved.
  • a medicament containing the T cell of the present invention can improve the therapeutic effect of cancer.
  • the T cells of the present invention may be involved in NK cell activation, whereby carcinomas that are sensitive to NK cells (melanoma, Merkel cell carcinoma, colon cancer, kidney cancer, breast cancer , Ovarian, fallopian tube, cervical, liver, lung, non-small cell lung, head and neck, small intestine, prostate, bladder, rectum, pancreas , Ewing sarcoma, rhabdomyosarcoma, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, neuroblastoma, osteosarcoma, acute myeloid leukemia, multiple myeloma, lymphoma, leukemia, etc.) there is a possibility. Furthermore, by reducing the number of cells to be administered due to enhancement of the antitumor activity, effects such as reduction of side effects such as CRS (Cytokine Release Syndrome) and reduction of production cost are expected.
  • CRS Cytokine Release Syndrome
  • the combination of the predetermined cytokine and chemokine of the present invention can be used in combination with the CAR gene together with the CAR gene for all immune cells, that is, not only for the T cells as described above, but also for NK cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, and the like. Even when introduced and expressed, the effect of obtaining various CAR-expressing immune cells having high antitumor activity can be obtained.
  • FIG. 1 shows the results of analyzing the expression levels of CAR (horizontal axis) and CD8 (vertical axis) by flow cytometry for the following T cells in the example (Test Example 1). Numerical values (%) in the figure represent the percentage of the cell population in each compartment relative to the total cells. "Transduction (-)” is the transduction (-) T cell (T cell without transduction) of Comparative Example 1, and "conv. CAR-T” is the conv.
  • CAR-T cells (anti-human CD20 CAR-T cells), "15 LSP x 19 CAR-T” as IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells of Example 1-1 (IL15 LSP _CCL19_ anti-human CD20 CAR-T cells ), "s 15 RA x 19 CAR-T” is s IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells of example 1-2 (s IL15 RA _CCL19_ anti-human CD20 CAR-T cells), "mb 15 RA x 19 CAR “-T” is the mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cell ( mb IL15 RA _CCL19_anti-human CD20 CAR-T cell) of Example 1-3, and “ sushi 15 ⁇ 19 CAR-T” is the product of Example 1-4.
  • sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR-T cells ( sushi IL15_CCL19_anti-human CD20 CAR-T cells) and “18 ⁇ 19 CAR-T” are the IL-18 ⁇ CCL19 CAR-T cells (IL18_CCL19_anti-human CD20 CAR-T cells) of Example 2.
  • FIG. 2 shows that (A) IL-15, (B) IL-18, (C) IL-21, (D) IL-27 and (E) The results obtained by measuring the amount of CCL19 secreted into the culture supernatant by ELISA are shown.
  • FIG. 3 shows the production of each of the above T cells 3 days, 5 days and 7 days after the activation stimulation by co-culture with human CD20-expressing P815 mast cytooma (hCD20 / P815) in the example (Test Example 2). The result of measuring the number of cells is shown.
  • FIG. 4 shows the results of histogram analysis of the staining intensity of each of the T cells with the CytoTell reagent in the example (Test Example 2).
  • FIG. 5 shows the flow cytometry of the cytotoxicity of each of the T cells against the target tumor cell (hCD20 / P815) and the control tumor cell (P815) in the example (Test Example 3). Shows the results of the measurement.
  • FIG. 6 shows the culture supernatant of each T cell when co-cultured with (A) a target tumor cell (hCD20 / P815) and (B) a control tumor cell (P815) in an example (Test Example 3).
  • 4 shows the results of measuring the concentration of IFN ⁇ in the medium.
  • FIG. 7 shows the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (anti-human CD20 CAR DNA fragment).
  • FIG. 8 shows the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (MCS ⁇ DNA fragment).
  • Figure 9 represents the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (IL15 LSP _F2A_CCL19 DNA fragment).
  • Figure 10 represents the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 (s IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment).
  • Figure 11 represents the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 (mb IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment).
  • FIG. 12 shows the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 ( sushi IL15_F2A_CCL19 DNA fragment).
  • FIG. 13 shows the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 (IL-18_F2A_CCL19 DNA fragment).
  • FIG. 14 shows the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 (IL-21_F2A_CCL19 DNA fragment).
  • Figure 15 represents the arrangement of genes and the like contained in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 (sc IL27_F2A_CCL19 DNA fragment).
  • FIG. 16 shows the results of measuring the antitumor activity (change in tumor volume) of the mouse melanoma tumor transplant model in the example (Test Example 4).
  • FIG. 17 shows the results of measuring the antitumor activity (change in tumor volume) against the mouse colon cancer tumor model in the example (Test Example 4).
  • transfection means introducing an arbitrary substance into a cell.
  • the inside of the cell includes at least the cytoplasm and the nucleus.
  • “Culture” or “culturing” refers to maintaining, growing, and / or differentiating cells outside a tissue or body, for example, in a dish, petri dish, flask, or culture tank (tank). Means
  • “Pluripotency” refers to the ability to differentiate into tissues and cells with a variety of different morphologies and functions and to differentiate into cells of any lineage of the three germ layers.
  • a “pluripotency” is a “totipotency” that can differentiate into any tissue of the organism, including the scutellum, in that it cannot differentiate into the scutellum and thus has no ability to form an individual. ".
  • Multipotency means the ability to differentiate into a plurality of a limited number of lineage cells. For example, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, and neural stem cells are multipotent, but not pluripotent.
  • Stetem cells include, for example, pluripotent stem cells.
  • “Pluripotent stem cells” that can be used in the present invention can be differentiated into tissues and cells having various different morphologies and functions of a living body, and can be divided into three germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm) Refers to stem cells that have the ability to differentiate into cells of any lineage. Examples thereof include, but are not limited to, embryonic stem cells (ESC), embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer, sperm stem cells, embryonic germ cells, induced pluripotent stem cells (in the present specification, “iPSC ”).
  • ESC embryonic stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • the“ multipotent stem cell ”(multipotent stem cell) that can be used in the present invention refers to a stem cell capable of differentiating into a plurality of cells of a limited number of lineages.
  • the “multipotent stem cells” that can be used in the present invention include dental pulp stem cells, oral mucosal stem cells, hair follicle stem cells, cultured fibroblasts, and somatic stem cells derived from bone marrow stem cells.
  • Preferred pluripotent stem cells are ESCs and iPSCs.
  • iPSCs Induced pluripotent stem cells
  • Nanog expression was selected as an index and established Nanog-iPS cells (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), IPS cells prepared by a method without c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101) -106), iPS cells established by introducing 6 factors by virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8 (5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31 ( 3): 458-66.) Also used Door can be.
  • induced pluripotent stem cells Yu J., Thomson JA. Et al., Science (2007) 318: 318: established by introducing four factors of OCT3 / 4, SOX2, NANOG, and LIN28 produced by Thomson et al. 1917-1920.
  • Induced pluripotent stem cells produced by Daley et al. Park IH, Daley GQ. Et al., Nature (2007) 451: 141-146
  • induced pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-307007
  • iPSC strains established by NIH, RIKEN (RIKEN), Kyoto University, etc. can be used.
  • RIKEN RIKEN
  • RIKEN RIKEN
  • Kyoto University etc.
  • human iPSC strain RIKEN HiPS-RIKEN-1A strain
  • HiPS-RIKEN-2A strain HiPS-RIKEN-12A strain
  • Nips-B2 strain Kyoto University 253G1, 201B7, 409B2 strain
  • 454E2 Strains 606A1, 610B1 and 648A1 strains.
  • clinical grade cell lines provided by Kyoto University and Cellular @ Dynamics @ International, etc., and research and clinical cell lines produced using these cell lines may be used.
  • ESC embryonic stem cells
  • RIKEN RIKEN
  • NIH Various human ESC strains established by RIKEN, Kyoto University and Cellartis are available.
  • human ESC strains include NIH CHB-1 to CHB-12 strains, RUES1, RUES2 strains, HUES1 to HUES28 strains, WisCell Research H1 strains, H9 strains, RIKEN KhES-1 strains, and KhES-2 strains. Strains, KhES-3, KhES-4, KhES-5, SSES1, SSES2, SSES3 and the like can be used.
  • clinical grade cell lines and research and clinical cell lines produced using those cell lines may be used.
  • “Comprise (s) or” comprising “indicates the inclusion of, but is not limited to, the element following the phrase. Thus, inclusion of an element that follows the phrase is suggested, but not exclusion of any other element.
  • Consist (s) of or consistent of means including and limited to any element that follows the phrase. Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed elements are required or required, and that no other elements are substantially present.
  • Consisting essentially of means including any element that follows the phrase, and limited to that element that does not affect the activity or action identified in this disclosure for that element. . Thus, the phrase “consisting essentially of” requires or requires the listed elements, while other elements are optional and may affect the activity or action of the listed elements. , Depending on whether or not it is caused, it indicates that it may or may not be present.
  • the combination of the predetermined cytokine and chemokine of the present invention can be used together with the CAR gene in immune cells, in particular, T cells that carry cellular immunity among acquired immunity, NK cells, monocytes, macrophages, and dendritic cells that carry natural immunity.
  • immune cells in particular, T cells that carry cellular immunity among acquired immunity, NK cells, monocytes, macrophages, and dendritic cells that carry natural immunity.
  • the gene transfer and expression of the combination of the predetermined cytokine and chemokine of the present invention can be carried out by T cell (CAR-T cell), NK cell (CAR-NK cell), monocyte (CAR-monocytes), macrophages (CAR-macrophages), dendritic cells (CAR-dendritic cells) and the like can be provided with further technical features.
  • CAR-T cell T cell
  • CAR-NK cell NK cell
  • monocyte CAR-monocytes
  • macrophages CAR-macrophages
  • dendritic cells CAR-dendritic cells
  • the “immune cell” is not particularly limited as long as it is a cell (so-called immune effector cell) having the ability to damage target cells (pathogenic cells) such as cancer cells by some mechanism of action.
  • T cells responsible for cell-mediated immunity NK cells responsible for innate immunity, monocytes, macrophages, dendritic cells and the like can be mentioned.
  • the immune cells can be T cells.
  • the immune cell may be a cell responsible for innate immunity, such as NK cells, macrophages, dendritic cells, and the like.
  • HLA-type alloimmunocytes can be used off-the-shelf.
  • CAR-NK cells see, for example, US2016 / 0096892, Mol ⁇ Ther. ⁇ 25 (8): ⁇ 1769-1781 ⁇ (2017), and for CAR-dendritic cells, CAR-macrophages, etc., for example, WO2017 / 019848, eLIFE . 2018 e36688 etc.
  • the present invention will be described based on the description according to the embodiment in which a T cell is adopted as a representative example of an immune cell.
  • the present invention is not limited to the embodiment in which the immune cells are T cells, but also includes embodiments in which the immune cells are NK cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, and the like.
  • the immune cells are NK cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, and the like.
  • “(CAR-) T cells” may be appropriately replaced with "(CAR-) NK cells", “(CAR-) monocytes", “(CAR-) macrophages", “(CAR-) dendritic cells”. "Can be read.
  • T cells of the present invention express (1) CAR, (2) at least one selected from the group consisting of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27, and (3) CCL19.
  • T cells in the present invention include ⁇ T cells, ⁇ T cells, CD8 + T cells, CD4 + T cells, tumor infiltrating T cells, memory T cells, and naive T cells in the same manner as T cells expressing general or known CARs. Any T cells such as T cells and NKT cells may be used.
  • T cells are isolated and purified from body fluids such as blood and bone marrow fluid, tissues such as spleen, thymus, and lymph nodes, or immune cells that infiltrate cancer tissues such as primary tumors, metastatic tumors, and cancerous ascites. It may be something. T cells are induced to differentiate into T cells by culturing induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), or other stem cells, progenitor cells, and the like under appropriate conditions. May be used.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • progenitor cells progenitor cells
  • ⁇ T cells may be derived from humans or cells derived from non-human mammals (non-human mammals).
  • Non-human mammals include, for example, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, pigs, cows, horses, sheep, monkeys.
  • CAR expressed by the T cell of the present invention is basically the same as a general or known CAR, (i) a single-chain antibody that recognizes a cell surface antigen of a cancer cell, (ii) a transmembrane region, and (Iii) a peptide at each site of a signal transduction region that induces activation of T cells is constituted by being linked via a spacer as necessary.
  • a single-chain antibody that recognizes a cell surface antigen of a cancer cell is typically a light chain variable region and a heavy chain variable region derived from an antigen-binding site of a monoclonal antibody that specifically binds to the antigen. And a single-chain variable region fragment (scFv) composed of a linker peptide linking them.
  • scFv single-chain variable region fragment
  • Cell surface antigens of cancer cells targeted by CAR are biomolecules that are specifically expressed on cancer cells and their precursor cells, and biomolecules that are newly expressed by canceration of cells Alternatively, any biomolecule having an increased expression level in cancer cells as compared to normal cells may be used.
  • antigens are commonly referred to as “tumor-associated antigens” (TAAs) and include, for example, BCMA, B7-H3, B7-H6, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30.
  • the transmembrane region is a polypeptide that serves as a region for fixing CAR to the cell membrane of T cells.
  • Examples of such a transmembrane region include BTLA, CD3 ⁇ , CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 4-1BB.
  • CD137 CTLA-4, GITR, ICOS, LAG3, OX40, SLAMF4 (CD244, 2B4), or a transmembrane region derived from the ⁇ or ⁇ chain of the T cell receptor.
  • the transmembrane region of CD8 is preferably the transmembrane region of CD8.
  • a hinge region consisting of a peptide (oligopeptide or polypeptide) having an arbitrary amino acid sequence and having a length of 1 to 100 amino acids, preferably 10 to 70 amino acids may be linked to the cell transmembrane region.
  • Such hinge regions include, for example, hinge regions derived from CD3, CD8, KIR2DS2, or IgG4, IgD or other immunoglobulins.
  • 97% or more, 98% or more or 99% or more homologous amino acid sequence can be used.
  • the hinge region is preferably a hinge region of CD8.
  • a signal transduction region that induces T cell activation is a region for transmitting a signal into a T cell when the single-chain antibody recognizes and binds to a cell surface antigen of a cancer cell; Is a polypeptide.
  • Such signaling regions include, for example, MHC class I molecules, TNF receptor proteins, immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, activated NK cell receptors, Toll-like receptors, B7-H3, BAFFR, BTLA, BY55 (CD160), CD2, CD3 ⁇ , CD4, CD7, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD18, CD19, CD19a, CD27, CD28, CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69 CD84, CD96 (Tactile), CD103, 4-1BB (CD137), CDS, CEACAM1, CRTAM, CNAM1 (CD226), DAP10, Fc @ Receptor-associate d ⁇ chain, GADS, GITR, HVEM (LIGHTTR), IA4, ICAM-1, ICOS (CD278), IL2R ⁇ , IL2R ⁇ , IL
  • the signaling region preferably comprises three intracellular regions: CD28, 4-1BB, and CD3 ⁇ .
  • the respective intracellular regions may be connected to each other via a linker peptide (oligopeptide or polypeptide) composed of 2 to 10 amino acids.
  • linker peptide include a peptide consisting of a glycine-serine continuous sequence.
  • Each of the single-chain antibody and the transmembrane region, and the transmembrane region and the signal transduction region are peptides (oligopeptides or polypeptides) each having an arbitrary amino acid sequence and having a length of 1 to 100 amino acids, preferably 10 to 50 amino acids.
  • Certain spacer regions may be included. Examples of the spacer region include a peptide consisting of a glycine-serine continuous sequence.
  • the amino acid sequence of CAR as described above expressed by the T cell of the present invention may be appropriate depending on the use of the T cell, typically the function as an active ingredient of a medicament for treating cancer. I just need.
  • Various amino acid sequences are known for the single-chain antibody (i) against the cell surface antigen of cancer cells, and information on the amino acid sequence can be used in the present invention.
  • an antibody against a cell surface antigen of a desired cancer cell is newly prepared according to a conventional method, and the amino acid sequence of the new antibody (preferably, heavy and light chain variable regions, particularly CDR) is determined. Information may be used in the present invention.
  • various amino acid sequences of the transmembrane region (ii) and the T cell activation signal transduction region (iii) are known from humans and non-human mammals, and are known from NCBI (National Center for Biotechnology). Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) and UniProt (The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org) Information can also be used in the present invention.
  • the cytokine expressed by the T cell of the present invention is at least one selected from the group consisting of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27.
  • the T cell of the present invention may express any one of the above four types of cytokines, or may express two or more types.
  • IL-15 is a cytokine having functions related to T cell survival, activation and differentiation into memory T cells, and NK cell activation.
  • the term “IL-15” in the present invention encompasses not only natural full-length IL-15 protein but also various embodiments as long as the function of IL-15 in the effect of the present invention is retained. That is, “IL-15” in the present invention includes not only the entire protein (polypeptide) consisting of the amino acid sequence of natural IL-15 but also a part thereof (functional partial polypeptide) and the natural amino acid sequence.
  • the whole or part of native IL-15 or a variant thereof is linked to another protein to form a fusion protein (eg, linked to the whole or part of IL-15R ⁇ and fused).
  • a fusion protein eg, linked to the whole or part of IL-15R ⁇ and fused.
  • IL-15 includes, for example, the following four embodiments. These are all publicly known (see Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4, and Patent Document 4 and the like described above). However, IL-15 that can be used in the present invention is not limited to these specific examples, and the presence or absence and type of signal peptide and linker in the sequence, the order of each element, and various other aspects modified from other viewpoints It is also possible to use IL-15 (sometimes referred to herein as "modified" IL-15).
  • IL-15 LSP / IL-15 may be referred to as “IL15 LSP ” in this specification).
  • IL-15LSP is a long-chain signal peptide consisting of 29 amino acids, which is bound to the N-terminal side of IL-15 in the first embodiment.
  • IL-15LSP also refers to not only the entire polypeptide consisting of the amino acid sequence of natural IL-15LSP, but also a part thereof (functional partial polypeptide) or one or more polypeptides relative to the natural amino acid sequence.
  • IL-15 LSP in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is deleted, substituted or added (preferably to the extent having homology as described later), or a part thereof.
  • IL-15LSP is replaced with “IL-2SP” (a signal peptide of IL-2. Or a variant thereof).
  • IL15 / IL-15R ⁇ extracellular domain (herein may be referred to as "s IL15 RA".)
  • IL-15R ⁇ extracellular domain refers to a portion of IL-15R ⁇ (interleukin 15 receptor ⁇ chain) excluding the transmembrane domain and the intracellular domain.
  • the IL-15R ⁇ extracellular domain contains a sushi domain (a motif commonly found in various binding proteins).
  • the term “IL-15R ⁇ extracellular domain” refers to not only the entire polypeptide consisting of the amino acid sequence of the natural IL-15R ⁇ extracellular domain but also a part thereof (functional partial polypeptide) or the natural amino acid sequence.
  • IL-15R ⁇ extracellular domain in which one or more amino acid sequences have been deleted, substituted or added (preferably to the extent having homology as described below), or a part thereof, Include.
  • the IL-15R ⁇ extracellular domain is usually bound to the C-terminal side of IL-15 via a linker (for example, a glycine-serine linker consisting of 26 amino acids).
  • IL-2SP IL-2SP, which is an IL-2 signal peptide and is a whole or part of a natural protein, or a part thereof
  • IL-15LSP May be variants.
  • the second embodiment is of the secretory type, such as IL-15R ⁇ (interleukin 15 receptor ⁇ chain shared with interleukin 2 receptor) and ⁇ c (interleukin 2, 4, 7, 9, 15, 21, etc.).
  • IL-15R ⁇ interleukin 15 receptor ⁇ chain shared with interleukin 2 receptor
  • ⁇ c interleukin 2, 4, 7, 9, 15, 21, etc.
  • IL-15 Full length of IL-15 / IL-15R ⁇ (may be referred to as “ mb IL15 RA ” herein)
  • the “full-length IL-15R ⁇ ” includes both the extracellular domain, the transmembrane domain and the intracellular domain of IL-15R ⁇ , and in the third embodiment, is usually a linker (for example, a glycine-serine linker composed of 20 amino acids). ) To the C-terminal side of IL-15.
  • full-length IL-15R ⁇ refers to not only the entire protein (polypeptide) consisting of the full-length amino acid sequence of natural IL-15R ⁇ but also one or more amino acid sequences relative to the natural amino acid sequence (preferably described below). Also included are full-length variants of native IL-15R ⁇ deleted, substituted or added (to the extent that they have homology to the same). Also in the third embodiment, IL-2SP (which may be the whole or a part of a natural protein or a variant thereof) is usually provided on the N-terminal side of IL-15 instead of IL-15LSP. Are combined. The third embodiment is of the membrane-bound type, and the expression thereof enhances the antitumor activity of CAR-T cells.
  • IL-15R ⁇ sushi / IL-15 may be referred to as “ sushi IL15” in this specification).
  • IL-15R ⁇ containing a signal peptide and a sushi domain is bound to the N-terminal side of IL-15, usually via a linker (eg, a linker consisting of 20 amino acids).
  • the term “IL-15R ⁇ sushi” refers to not only the entire polypeptide consisting of the amino acid sequence of natural IL-15R ⁇ sushi, but also a part thereof (functional partial polypeptide) or one or more polypeptides relative to the natural amino acid sequence.
  • the whole or a part of the natural IL-15R ⁇ sushi in which the amino acid sequence of the present invention is deleted, substituted or added (preferably to the extent having homology as described later) is also encompassed.
  • the fourth embodiment is a secretory type.
  • IL-15R ⁇ whole protein having a natural amino acid sequence or whole
  • Preference is given to IL-15 (whole or part of a protein having the natural amino acid sequence or a variant thereof) in the form of a fusion protein with that part or a variant thereof.
  • the above-described second, third or fourth embodiments or modified versions thereof are preferable, and the above-described third and fourth embodiments or modified versions thereof are more preferable.
  • IL-18 is a cytokine having functions related to T cell activation, NK cell activation, and dendritic cell activation.
  • the term “IL-18” in the present invention encompasses not only natural full-length IL-18 protein but also various embodiments as long as the function of IL-18 in the effect of the present invention is retained. That is, “IL-18” in the present invention includes not only the full-length protein (polypeptide) consisting of the amino acid sequence of natural IL-18 but also a part thereof (functional partial polypeptide) and the natural amino acid sequence.
  • the T cell expresses IL-18 refers to the various forms of IL-18 (total proteins having a natural amino acid sequence) as described above as long as the effects of the present invention are not lost. Or a portion thereof, or a variant thereof, which may or may not be in the form of a fusion protein).
  • IL-21 is a cytokine having functions related to the function of CD8 + T cells, differentiation into memory T cells, and survival of NK cells.
  • the term “IL-21” in the present invention includes not only natural full-length IL-21 protein but also various embodiments as long as the function of IL-21 in the effects of the present invention is retained. That is, “IL-21” in the present invention includes not only the full length protein (polypeptide) consisting of the amino acid sequence of natural IL-21 but also a part thereof (functional partial polypeptide) and the natural amino acid sequence.
  • the expression "the T cell expresses IL-21” refers to various forms of IL-21 (total protein having a natural amino acid sequence) as described above as long as the effects of the present invention are not lost. Or a portion thereof, or a variant thereof, which may or may not be in the form of a fusion protein).
  • IL-27 is a cytokine having functions related to survival of T cells, activation of NK cells, inhibition of tumor growth and angiogenesis, and the like.
  • the term “IL-27” in the present invention encompasses not only natural full-length IL-27 protein but also various embodiments as long as the function of IL-27 in the effect of the present invention is retained. That is, “IL-27” in the present invention includes not only the full-length protein (polypeptide) consisting of the amino acid sequence of natural IL-27 but also a part thereof (functional partial polypeptide) and the natural amino acid sequence.
  • the expression “the T cell expresses IL-27” refers to various forms of IL-27 (total protein having a natural amino acid sequence) as described above as long as the effects of the present invention are not lost. Or a portion thereof, or a variant thereof, which may or may not be in the form of a fusion protein).
  • IL-27 for example, two subunits constituting IL-27, p28 and EBI3 (Epstein-Barr virus-inducible gene 3) are formed from a linker, eg, 20 to 30 amino acids such as (G 4 S) 3. And a fusion protein (single-chain protein) linked by a linker consisting of GSTSGSGKPGSGEGSTKG (J Immunol. 183, 6217-26 (2009)).
  • the terms "p28” and "EBI3" also encompass the whole or a portion of a polypeptide having the naturally occurring amino acid sequence, or a variant thereof, respectively.
  • the amino acid sequence of the above-described cytokine expressed by the T cell of the present invention can be used for the T cell (CAR-T cell) of the present invention, typically as an active ingredient of a medicament for treating cancer.
  • CAR-T cell T cell
  • the amino acid sequences of native IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27 and IL-15R ⁇ from humans and non-human mammals (eg, mice) are known and can be found in databases such as NCBI, UniProt and the like. Is also registered, the information can be used in the present invention.
  • the amino acid sequence of human native IL-15 (full length including the signal peptide and propeptide portions) registered as UniProtKB-P40933 is shown as SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence of human registered as UniProtKB-Q13261 is shown as SEQ ID NO: 18.
  • the amino acid sequence of natural IL-15R ⁇ (full length including signal peptide, sushi domain, extracellular domain, etc.) is shown as SEQ ID NO: 19, respectively.
  • the amino acid sequence of the corresponding portion contained in SEQ ID NO: 18 and 19 is Can be referenced.
  • Various variants of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27 and IL-15R ⁇ , fusion proteins with other proteins, and their modified forms are known, and their amino acid sequences are known. Can be used in the present invention.
  • each of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27 for example, as a whole or a partial region (domain), when a signal peptide is replaced as described below, for example, the signal peptide Is 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more with respect to the natural amino acid sequence of each human or non-human mammal. , 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more homologous amino acid sequences.
  • Variants having the above range of homology to a natural amino acid sequence derived from one species may include (substantially include) a natural amino acid sequence derived from another species.
  • IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27 may be obtained by replacing the signal peptide in the sequence with a known signal peptide.
  • SEQ ID NO 4 IL15 LSP _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 3)
  • SEQ ID NO 6 s IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 4)
  • SEQ ID NO 8 mb IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 5)
  • SEQ ID NO: 14 IL-21_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment) # 8)
  • SEQ ID NO 16 sc IL27_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 9), in the amino acid sequence of a protein
  • Each of the IL-15R ⁇ extracellular domain, IL-15R ⁇ full-length and IL-15R ⁇ sushi variants may be 80% or more, 85% or more, and 90% or more of the natural amino acid sequence derived from each human or non-human mammal. Above, those having an amino acid sequence having a homology of 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • SEQ ID NO 4 IL15 LSP _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 3), SEQ ID NO 6: s IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 4), SEQ ID NO 8: mb IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 5), SEQ ID NO: 10: sushi IL15_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 6), in the amino acid sequence of a protein (polypeptide) expressed from each base sequence, or SEQ ID NO: 5: fusion protein containing IL15 LSP SEQ ID NO: 7: fusion protein containing s IL15 RA , SEQ ID NO: 9: fusion protein containing mb IL15 RA , SEQ ID NO: 11: fusion protein containing sushi IL15, In addition, the amino acid sequence of the mouse extracellular IL-15R ⁇ extracellular domain, IL-15R ⁇ full length or IL-15
  • IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27 are the T cells (IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27 possessed by the T cells) used for producing the T cells of the present invention.
  • the receptor is preferably of the same type as that of the human or non-human mammal (eg, mouse).
  • IL-15R ⁇ sites other than IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27 contained in the fusion proteins of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27.
  • Those derived from humans or non-human mammals of the same type as the T cells used to produce the T cells of the present invention are preferred.
  • SEQ ID NO 4 IL15 LSP _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 3), SEQ ID NO 6: s IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 4), SEQ ID NO 8: mb IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 5), SEQ ID NO: 10: sushi IL15_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 6), SEQ ID NO: 12: IL-18_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 7), SEQ ID NO: 14: IL-21_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment) # 8), SEQ ID NO 16: sc IL27_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 9), in the amino acid sequence of a protein (polypeptide) expressed from the respective base sequences, or sequences Issue 5: IL15 fusion protein containing the LSP, SEQ ID NO 7: s Issue 5: IL15 fusion protein
  • CCL19 The chemokine expressed by the T cell of the present invention is CCL19.
  • CCL19 is mainly produced from lymph node dendritic cells and macrophages, and has a function of inducing mailing of T cells, B cells and mature dendritic cells via its receptor, CCR7.
  • CCL19 in the present invention refers to not only the full-length protein (polypeptide) consisting of the amino acid sequence of natural CCL19, but also a part thereof (functional partial polypeptide) or one or more amino acids relative to the natural amino acid sequence.
  • the full-length natural CCL19 or a partial variant thereof in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is deleted, substituted or added (preferably to the extent having homology as described below) is also encompassed.
  • the amino acid sequence of the above-described chemokine expressed by the T cell of the present invention depends on the use of the T cell (CAR) of the present invention, typically as a function as an active ingredient of a medicament for treating cancer. It may be appropriate while taking into account the effect of CAR-T cells on the enhancement of antitumor activity, including the enhancement of CAR-T cell persistence and proliferation.
  • Amino acid sequences of natural CCL19 derived from humans and mammals other than humans (for example, mice) are known and registered in databases such as NCBI and UniProt, and the information can be used in the present invention. .
  • amino acid sequence information of those known as variants of CCL19 can also be used in the present invention.
  • CCL19 for example, as a whole or a partial region, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more of the amino acid sequence of natural CCL19 derived from human or non-human mammal Above, those having an amino acid sequence of 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of homology can be mentioned.
  • SEQ ID NO 4 IL15 LSP _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 3), SEQ ID NO 6: s IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 4), SEQ ID NO 8: mb IL15 RA _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 5), SEQ ID NO: 10: sushi IL15_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 6), SEQ ID NO: 12: IL-18_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 7), SEQ ID NO: 14: IL-21_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment) # 8), SEQ ID NO 16: sc IL27_F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 9), in the amino acid sequence of the protein expressed from the respective base sequences (polypeptides), mouse natural
  • the amino acid sequence of CCL19 is an amino acid sequence variants having homology as described above, or corresponds substantially
  • the CCL19 is preferably derived from a human or a non-human mammal (for example, a mouse) of the same type as the T cell (the receptor for CCL19 possessed by the T cell) used for producing the T cell of the present invention, or a variant thereof. .
  • the medicament of the present invention contains the T cell of the present invention as described above, and may further contain other components as necessary.
  • a person skilled in the art can appropriately prepare the medicament of the present invention using the T cell of the present invention in consideration of the use (target for treatment) and the dosage form.
  • the medicament of the present invention is mainly intended for the treatment of cancer corresponding to a cell surface antigen (cancer-specific antigen) of a cancer cell, which is targeted by the CAR expressed by the T cell of the present invention.
  • cancer-specific antigen a cell surface antigen
  • the cancer of the present invention contains the cancer cell expressing the antigen targeted by the CAR in the cancer tissue, and as long as a certain level of therapeutic effect is recognized by the T cell of the present invention, the pharmaceutical of the present invention is targeted.
  • the type of cancer is not particularly limited.
  • NK cell-sensitive carcinoma (melanoma, Merkel cell carcinoma, colon cancer, kidney cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, cervical cancer, liver cancer, lung cancer, non-small cancer Cell lung cancer, head and neck cancer, small intestine cancer, prostate cancer, bladder cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, Ewing sarcoma, rhabdomyosarcoma, nasopharyngeal cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, nerve Blastoma, osteosarcoma, acute myeloid leukemia, multiple myeloma, lymphoma, leukemia, etc.). More preferably, melanoma, colorectal cancer, kidney cancer, multiple myeloma, lymphoma, leukemia are mentioned.
  • Components other than T cells that can be contained in the medicament of the present invention include, for example, pharmaceutically acceptable additives, more specifically, physiological saline, buffered saline, cell culture medium, dextrose, Water for injection, glycerol, ethanol, stabilizers, solubilizers, surfactants, buffers, preservatives, isotonic agents, fillers, lubricants and the like can be mentioned.
  • pharmaceutically acceptable additives more specifically, physiological saline, buffered saline, cell culture medium, dextrose, Water for injection, glycerol, ethanol, stabilizers, solubilizers, surfactants, buffers, preservatives, isotonic agents, fillers, lubricants and the like can be mentioned.
  • the medicament of the present invention can be used by administering it to a subject in need of cancer treatment (cancer patient, tumor-bearing animal, etc.) in the same manner as known T cells expressing CAR.
  • Examples of the administration method include injection into a tumor, intravenously, intraarterially, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally and the like.
  • the amount of the T cells of the present invention contained in the medicament of the present invention depends on the use, dosage form, target therapeutic effect, and the like, for example, the type, location, and severity of cancer, the age and weight of the subject to be treated. It can be appropriately adjusted in consideration of the condition and the state.
  • the medicament of the present invention contains 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 10 T cells of the present invention, preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 cells, more preferably 5 ⁇ , in one administration. It can be formulated so that 10 6 to 5 ⁇ 10 8 are administered.
  • the administration interval of the medicament of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately adjusted in consideration of the amount of the T cell of the present invention to be administered at one time, for example, four times a day, 3 times, 2 times or once every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, every 5 days, once a week, every 7 days, every 8 days, every 9 days, twice a week, every month It can be administered once or twice a month independently.
  • Anticancer agent include, for example, alkylating agents such as cyclophosphamide, bendamustine, iosfamide, and dacarbazine; antimetabolites such as pentostatin, fludarabine, cladribine, methotrexate, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, and enocitabine; Targeted drugs such as rituximab, cetuximab, trastuzumab; kinase inhibitors such as imatinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib, trametinib; proteasome inhibitors such as bortezomib; Anticancer antibiotics such as C; plant alkaloids such as irinotecan and etoposide; cisplatin,
  • the medicament of the present invention When the medicament of the present invention is used in combination with another anticancer agent, (a) the medicament of the present invention is used after using the other anticancer agent, and (b) the medicament of the present invention and another anticancer agent are used. And (c) using the medicament of the present invention and then using another anticancer agent.
  • the pharmaceutical of the present invention When the pharmaceutical of the present invention is used in combination with another anticancer agent, the therapeutic effect of cancer is further improved, and the number of administrations or the dose of the pharmaceutical and / or other anticancer agent of the present invention is reduced. Therefore, it is expected that side effects of each anticancer drug can be reduced.
  • the expression vector of the present invention comprises (1) a nucleic acid encoding CAR, (2) a nucleic acid encoding at least one selected from the group consisting of IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27, and ( 3) a nucleic acid encoding CCL19.
  • the expression vector including "a nucleic acid encoding IL-15” includes not only a nucleic acid encoding a natural full-length IL-15 protein but also various embodiments as described above. IL-15.
  • the expression vectors “including a nucleic acid encoding IL-18”, “including a nucleic acid encoding IL-21”, “including a nucleic acid encoding IL-27”, and “including a nucleic acid encoding CCL19” are also described. The same is true.
  • nucleic acid may be any molecule as long as it is a polymer of a nucleotide and a molecule having a function equivalent to the nucleotide, such as RNA that is a polymer of ribonucleotide, DNA that is a polymer of deoxyribonucleotide, Examples thereof include a polymer in which nucleotides and deoxyribonucleotides are mixed, and a nucleotide polymer including a nucleotide analog, and further a nucleotide polymer including a nucleic acid derivative.
  • the nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid also includes a double-stranded nucleic acid in which one strand hybridizes to another strand under stringent conditions.
  • Nucleotide analogs include, as compared to RNA or DNA, ribonucleases for improving or stabilizing nuclease resistance, increasing affinity with complementary strand nucleic acids, increasing cell permeability, or visualizing. Any molecule may be used as long as it is a modified molecule of nucleotide, deoxyribonucleotide, RNA or DNA.
  • the nucleotide analog may be a naturally occurring molecule or a non-natural molecule, such as a sugar-modified nucleotide analog or a phosphodiester bond-modified nucleotide analog.
  • the sugar moiety-modified nucleotide analog may be any analog as long as an arbitrary chemical structural substance is added or substituted to part or all of the chemical structure of the nucleotide sugar, and specific examples thereof include 2 ′ Nucleotide analog substituted with -O-methylribose, nucleotide analog substituted with 2'-O-propylribose, nucleotide analog substituted with 2'-methoxyethoxyribose, 2'-O-methoxyethylribose Nucleotide analogues substituted with 2'-O- [2- (guanidium) ethyl] ribose, nucleotide analogues substituted with 2'-fluororibose, introducing a cross-linked structure into the sugar moiety
  • BNA bridged structure-type artificial nucleic acid
  • LNA locked artificial nucleic acid
  • any or all of the chemical structure of the nucleotide phosphodiester bond may be added or substituted with any chemical substance, and specific examples thereof include May include nucleotide analogs substituted with a phosphorothioate bond, nucleotide analogs substituted with an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond [Cell Engineering, ⁇ 16, ⁇ 1463-1473 ⁇ (1997) [RNAi and antisense methods, Kodansha (2005)].
  • nucleic acid derivative compared to nucleic acids, in order to improve nuclease resistance, stabilize, increase affinity with complementary strand nucleic acid, increase cell permeability, or visualize the nucleic acid with another chemical compound.
  • Any molecule may be used as long as it is a molecule to which a substance is added. Specific examples thereof include 5′-polyamine addition derivatives, cholesterol addition derivatives, steroid addition derivatives, bile acid addition derivatives, vitamin addition derivatives, Cy5 addition derivatives, and Cy3 addition derivatives. , 6-FAM addition derivatives, and biotin addition derivatives.
  • the expression vector of the present invention is introduced into a cell by contacting the cell with a T cell or a precursor thereof, and expressing a predetermined protein (polypeptide) encoded thereby in the T cell, thereby transforming the T cell of the present invention.
  • a predetermined protein polypeptide
  • Any embodiment can be used as long as it can be manufactured, and the embodiment is not particularly limited.
  • Those skilled in the art can design and produce an expression vector capable of expressing a desired protein (polypeptide) in T cells.
  • the expression vector of the present invention may be linear or circular, and may be a non-viral vector such as a plasmid, a viral vector, or a transposon-based vector.
  • the virus vector examples include a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • Preferred retrovirus vectors include, for example, pMSGV vectors (Tamada @ k @ et @ al., ClinCancer @ Res @ 18: 6436-6445 (2002)) and pMSCV vectors (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • pMSGV vectors Temada @ k @ et @ al., ClinCancer @ Res @ 18: 6436-6445 (2002)
  • pMSCV vectors manufactured by Takara Bio Inc.
  • one expression vector contains at least one selected from the group consisting of (1) a nucleic acid encoding CAR, and (2) IL-15, IL-18, IL-21 and IL-27. And (3) a nucleic acid encoding CCL19.
  • the first expression vector contains one or two of the above (1) to (3), and the second expression vector contains the remaining elements.
  • the first expression vector contains the above (1), the second expression vector contains the above (2), and the third expression vector contains the above (3). It is.
  • the expression vector of the present invention is a combination (set) of a plurality of expression vectors, that is, a combination of the first and second expression vectors or a combination of the first, second, and third expression vectors. Combination, may mean.
  • a single expression vector contains a plurality of elements, the order in which the elements are arranged from the upstream side to the downstream side is not particularly limited.
  • the nucleotide sequence of the predetermined three elements (CAR, cytokine and chemokine) contained in the expression vector of the present invention depends on the type of protein (polypeptide) to be selected as each element. You just need to design it to code the array.
  • the nucleic acid (oligonucleotide) contained in the expression vector may be prepared by a chemical oligo DNA synthesis reaction, or may be prepared (cloned) as cDNA.
  • the expression vector of the present invention may further comprise, in addition to the sequence (gene) encoding the predetermined element, if necessary (for a combination of a plurality of expression vectors as described above, each expression vector is independent) It may contain sequences such as a promoter, a terminator, an enhancer, a start codon, a stop codon, a polyadenylation signal, a nuclear localization signal (NLS), and a multiple cloning site (MCS) involved in the expression of each gene.
  • sequences such as a promoter, a terminator, an enhancer, a start codon, a stop codon, a polyadenylation signal, a nuclear localization signal (NLS), and a multiple cloning site (MCS) involved in the expression of each gene.
  • a self-cleaving peptide (2A peptide) or an IRES (Internal ⁇ Ribozyme ⁇ Entry ⁇ Site) is inserted between the elements. ) May be inserted.
  • the 2A peptide is a self-cleaving peptide derived from a virus, and is characterized in that a predetermined position (one residue from the C-terminus) in the amino acid sequence is cleaved by the endoplasmic reticulum (Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5 (5): 627-638 (2005)). Therefore, the genes integrated before and after via the 2A peptide are independently expressed in the cell.
  • Examples of the 2A peptide include those derived from picornavirus, rotavirus, insect virus, aphthovirus or trypanosomal virus.
  • the expression vector of the present invention may further contain a nucleic acid (base sequence) encoding a “functional gene” such as a reporter gene (typically, a gene encoding a fluorescent protein), a drug selection gene, and a suicide gene. .
  • a “functional gene” such as a reporter gene (typically, a gene encoding a fluorescent protein), a drug selection gene, and a suicide gene.
  • the expression vector of the present invention containing the drug resistance gene is introduced by adding a predetermined drug to the medium in the method for producing CAR-T cells of the present invention. It is possible to sort out the cells that have been lost.
  • the drug resistance gene include a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, and a puromycin resistance gene. One of these genes may be used, or two or more of them may be used.
  • the method for producing a CAR-T cell of the present invention may be used to observe T cells into which the expression vector of the present invention has been introduced using a fluorescence microscope, Cells into which the expression vector of the present invention has been introduced can be selected by a flow cytometer (cell sorter).
  • a typical example of a reporter gene is a gene encoding a fluorescent protein.
  • Examples of the "gene encoding a fluorescent protein” include, for example, blue fluorescent proteins such as Sirius, BFP, and EBFP; cyan fluorescent proteins such as mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, and CFP; TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (E.g., hmAG1), green fluorescent proteins such as ZsGreen, EmGFP, EGFP, GFP2, HyPer; yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, mBanana; KusabiraOrange (for example, hmKO2), orange fluorescent protein such as mOrange; red fluorescent protein such as TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry; TurboFP602, mRFP
  • the present invention can be used in vivo by administering a drug that activates the function of the suicide gene according to the course of cancer treatment, for example, at the stage when the tumor has disappeared. It is possible to control the number of T cells.
  • suicide genes include diphtheria A toxin, herpes simplex thymidine kinase (HSV-TK), carboxypeptidase G2 (CPG2), carboxylesterase (CA), cytosine deaminase (CD), cytochrome P450 (cyt-450), and deoxycytidine.
  • dCK nitroreductase
  • NR nitroreductase
  • PNP purine nucleoside phosphorylase
  • TP thymidine phosphorylase
  • VZV-TK varicella-zoster virus thymidine kinase
  • XGPRT xanthine-guanine phosphoribosyltransferase
  • inducible caspase 9 inducible caspase 9
  • Drugs that activate the function of each suicide gene are known, such as ganciclovir for herpes simplex thymidine kinase (HSV-TK) and a dimer-inducing compound for inducible caspase 9 AP1903.
  • HSV-TK herpes simplex thymidine kinase
  • the method for producing a CAR-T cell of the present invention includes a step of introducing the expression vector of the present invention into a T cell as described above (hereinafter, referred to as “expression vector introducing step”).
  • the method for introducing the expression vector into the T cell can be an appropriate expression vector depending on the embodiment.
  • the expression vector can be introduced into T cells by a known method such as a virus infection method, a calcium phosphate method, a lipofection method, a microinjection method, and an electroporation method.
  • the expression vector of the present invention can be prepared in a form suitable for use in each technique by a known means or appropriately using a commercially available kit (according to the instructions). In the expression vector introduction step, such a preparation is brought into contact with T cells, and generally, T cells may be cultured in a medium to which a preparation containing an expression vector is added.
  • the expression vector of the present invention is introduced into T cells by a virus infection method.
  • a virus infection method for example, using a commercially available kit corresponding to each virus vector such as a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector, the vector of the present invention and the packaging vector (plasmid) of each virus are used as host cells, To prepare a recombinant virus, and then infecting T cells with the obtained recombinant virus.
  • kits for viral vectors include, for example, Retrovirus packagin Kit Eco (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Examples of the host cell include GP2-293 cells (manufactured by Takara Bio Inc.), Plat-GP cells (manufactured by Cosmo Bio Inc.), PG13 cells (ATCC @ CRL-10686), PA317 cells (ATCC @ CRL-9078), and the like. .
  • the method for producing CAR-T cells of the present invention may further include other steps before and after the step of introducing the expression vector.
  • Other steps include, for example, a step of culturing a T cell and a step including a treatment for causing a functional gene included in an expression vector to function.
  • the T cells to which the expression vector of the present invention is introduced can be cultured in advance, usually in an in vitro environment, by a known method. For example, from body fluids such as blood and bone marrow fluid collected from human or non-human animals; tissues such as spleen, thymus, and lymph nodes; or cancer tissues such as primary tumors, metastatic tumors, and cancerous ascites. After isolating and purifying the T cells according to the method, the T cells may be cultured in an appropriate medium, and the expression vector of the present invention (preparation containing) may be added to the medium.
  • body fluids such as blood and bone marrow fluid collected from human or non-human animals
  • tissues such as spleen, thymus, and lymph nodes
  • cancer tissues such as primary tumors, metastatic tumors, and cancerous ascites.
  • T cells are prepared in advance from iPS cells, ES cells, or other pluripotent stem cells through an appropriate differentiation inducing step, and the medium containing the expression vector (preparation containing the expression vector of the present invention) is prepared. ) May be added.
  • the expression vector of the present invention contains a drug resistance gene as a functional gene
  • the expression vector corresponding to the drug resistance gene used is used.
  • a step of culturing T cells by adding a drug to a medium can be performed.
  • Those skilled in the art can appropriately adjust the use conditions of the drug corresponding to the drug resistance gene, such as the concentration in the medium and the culture period.
  • the expression vector of the present invention contains a gene encoding a fluorescent protein (reporter gene) as a functional gene
  • a step of observing the T cell into which the expression vector has been introduced by a fluorescence microscope A step of selecting T cells into which the vector has been introduced using a cell sorter can be performed.
  • Those skilled in the art can appropriately adjust the conditions for observation with a fluorescence microscope and selection with a cell sorter, such as irradiation with light having an excitation wavelength corresponding to the fluorescent protein and detection of light having an emission wavelength.
  • the CAR in the following examples is a CAR targeting human CD20, specifically, an anti-human CD20 scFv, an anti-human CD20 CAR comprising a mouse CD8 cell transmembrane region and a mouse CD28_4-1BB_CD3 ⁇ intracellular signal motif.
  • cytokines in the following examples include mouse IL-15 (“IL15 LSP ”, “ s IL15RA”, “ mb IL15 RA ” or “ sushi IL15”); mouse IL-18; mouse IL-21; mouse IL- 27 is either (p28 and EBI3) single chain protein containing a "sc IL27".
  • the chemokine in the following examples is mouse CCL19. T cells derived from mice expressing these CARs, cytokines and chemokines were prepared as described below, and then tested.
  • Example 1-1 In the step of preparing an IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cell vector, first, in step 1, three types of DNA fragments (DNA fragments 1 to 3) are artificially synthesized. Using three types of DNA fragments, one expression vector containing all the genes encoding the predetermined CAR, cytokine and chemokine was prepared. Subsequently, in the CAR-T cell production process, first, a retrovirus vector is prepared using the above-described expression vector in step 1, and then, in step 2, the predetermined gene is added to mouse T cells using the retrovirus vector preparation. Transduced.
  • DNA fragment # 1 DNA fragment anti-human CD20scFv containing anti-human CD20 CAR, murine CD8 transmembrane region, and a mouse
  • a DNA fragment (DNA fragment # 1) containing a base sequence encoding an anti-human CD20 CAR comprising a CD28_4-1BB_CD3 ⁇ intracellular signal motif was artificially synthesized.
  • the nucleotide sequence of the entire DNA fragment # 1 is shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 7).
  • nucleotides 3 to 785 encode a sequence encoding anti-human CD20 scFv; nucleotides 795 to 1040 encode a mouse CD8 transmembrane region; nucleotides 1041 to 1637 encode mouse CD28_4-1BB_CD3CD cells. Sequences encoding signal motifs (bases 1041 to 1163 encode the intracellular region of mouse CD28, bases 1164 to 1298 encode the intracellular region of mouse 4-1BB, bases 1299 to 1637 Represents a polypeptide in the intracellular region of mouse CD3 ⁇ ).
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the fusion protein expressed by the nucleotide sequence at positions 3 to 1637 of DNA fragment # 1.
  • DNA fragment # 2 DNA fragment containing stop codon and multiple cloning site
  • the nucleotide sequence of the entire DNA fragment # 2 is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 8).
  • DNA fragment # 3 DNA fragment for IL15 LSP and CCL19 2A peptide (F2A) which is a self-cleaving peptide, mouse IL-2 signal peptide (IL-2SP), mouse IL-15 construct "IL15 LSP " (IL-15 LSP and A DNA fragment (DNA fragment # 3) containing a nucleotide sequence encoding a fusion peptide composed of IL-15), F2A, and mouse CCL19 was artificially synthesized.
  • the nucleotide sequence of the entire DNA fragment # 3 is shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 9).
  • the 7th to 81st bases encode the first F2A
  • the 82nd to 168th bases encode the mouse IL-15 LSP
  • the 169th to 567th bases encode the mouse IL-15
  • the bases at positions 568 to 642 are sequences encoding the second F2A
  • the bases at positions 646 to 969 are sequences encoding mouse CCL19.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of the entire fusion protein containing IL15 LSP, which is expressed by the 7th to 969th base sequence of DNA fragment # 3 and is self-cleaved at two F2A sites.
  • Step 2 Construction of Retrovirus Expression Vector DNA fragment # 1 and DNA fragment # 2 were ligated to construct a construct (anti-human CD20 CAR_MCS). The resulting construct was incorporated into a pMSGV retrovirus expression vector (Tamadak et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) by treatment with restriction enzymes (NcoI and SalI) and contained anti-human CD20 CAR_MCS. A pMSGV retrovirus expression vector was created.
  • Step 2 Transduction of mouse T cells An anti-mouse CD3 monoclonal antibody (3 ⁇ g / mL) and an anti-mouse CD28 monoclonal antibody obtained by immobilizing 3 ⁇ 10 6 purified mouse T cells derived from mouse spleen and lymph node (1 ⁇ g / mL) and activated for 48 hours in the presence of IL-2.
  • RetroNectin in the wells (R Takara Bio Inc.) immobilized plate, IL15 LSP _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector containing preparation obtained in Step 1 (GP2-293
  • the cell culture supernatant) and the mouse T cells activated as described above were mixed, centrifuged at 1500 rpm for 2 hours, and cultured in the presence of IL-2 for 6 hours.
  • mouse T cells were collected, transferred to a new complete RPMI medium containing IL-2, and cultured for another 42 hours to introduce the IL15 LSP _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector.
  • the “complete RPMI medium” used for culturing the T cells is an RPMI-1640 medium supplemented with inactivated 10% FBS, antibiotics, 50 mM 2-mercaptoethanol, and 25 mM HEPES buffer.
  • a complete RPMI medium to which components described separately were further added as necessary was used.
  • s IL15 RA secretory IL-15 / IL-15RA fusion protein
  • CCL19 CAR-T cell [A: Vector preparation step] Preparation of s IL15 RA _CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector Using the same DNA fragment # 1 and DNA fragment # 2 as in step 1 of Example 1-1, and using the following DNA fragment # 4 in place of DNA fragment # 3, after producing the constructs were obtained in the same manner the anti-human CD20 CAR_F2A_ s IL15 RA _F2A_CCL19 containing pMSGV retroviral expression vector (s IL15 RA _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector).
  • DNA fragment # 4 s IL15 RA and CCL19 for DNA fragments F2A, murine IL-2SP, murine IL15 construct "s IL15 RA" (IL15, consisting linker and IL-15R [alpha] extracellular domain fusion peptide), F2A And a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding mouse CCL19 (DNA fragment # 4).
  • the base sequence of the entire DNA fragment # 4 is shown in SEQ ID NO: 6 (FIG. 10).
  • mb IL15 RA membrane-bound IL-15 / IL-15RA fusion protein
  • CCL19 CAR-T cells [A: Vector preparation process] Preparation of mb IL15 RA _CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector Using the same DNA fragment # 1 and DNA fragment # 2 as in Step 1 of Example 1-1, and using the following DNA fragment # 5 in place of DNA fragment # 3, Step 2 of Example 1-1 after producing the construct in the same manner as to give the anti-human CD20 CAR_F2A_ mb IL15 RA _F2A_CCL19 containing pMSGV retroviral expression vector (mb IL15 RA _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector).
  • DNA fragment # 5 DNA fragment for mb IL15 RA and CCL19 F2A, mouse IL-2SP, mouse IL-15 construct " mb IL15 RA " (fusion peptide consisting of IL-15, linker and full-length IL-15R ⁇ ), F2A And a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding mouse CCL19.
  • the base sequence of the entire DNA fragment # 5 is shown in SEQ ID NO: 8 (FIG. 11).
  • SEQ ID NO: 8 the 7th to 81st bases encode the first F2A
  • the 82nd to 141st bases encode the mouse IL-2SP
  • the 142nd to 1311th bases encode the mb IL15 RA .
  • bases 142 to 540 encode mouse IL-15 (excluding the signal sequence and the stop codon), bases 541 to 618 are a linker, and bases 619 to 1311 are a mouse IL-15R ⁇ ( Nucleotides 1312 to 1386 are a sequence encoding the second F2A, and nucleotides 1390 to 1713 are a sequence encoding mouse CCL19.
  • the amino acid sequence of the entire fusion protein containing mb IL15 RA, which is expressed by the nucleotide sequence at positions 7 to 1713 of DNA fragment # 5 and self-cleaves at two F2As, is shown in SEQ ID NO: 9.
  • Example 1-4 sushi IL15 (secretory IL-15RA / IL-15 fusion protein) ⁇ CCL19 CAR-T cells
  • A: Vector preparation step Preparation of sushi IL15_CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector
  • Example 1 Using the same DNA fragment 1 and DNA fragment 2 as in Step 1 of Example 1 and the following DNA fragment # 6 in place of DNA fragment # 3, construct the construct in the same manner as in Step 2 of Example 1-1. after producing obtain an anti-human CD20 CAR_F2A_ sushi IL15_F2A_CCL19 containing pMSGV retroviral expression vector (sushi IL15_CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector).
  • DNA fragment # 6 DNA fragment F2A for sushi IL15 and CCL19, encoding mouse IL-15 construct " sushi IL15” (fusion peptide consisting of sushi domain of IL-15R ⁇ , linker and IL-15), F2A, and mouse CCL19
  • a DNA fragment containing the nucleotide sequence was synthesized. The base sequence of the entire DNA fragment # 6 is shown in SEQ ID NO: 10 (FIG. 12).
  • the bases at positions 7 to 81 encode the first F2A
  • the bases at positions 82 to 777 encode a sequence encoding sushi IL15
  • the bases at positions 82 to 375 are SP of mouse IL-15R ⁇ and sushi domain
  • bases 376 to 435 are linkers
  • bases 436 to 777 encode mouse IL-15 (excluding signal sequence and propeptide)
  • bases 778 to 852 are bases.
  • bases at positions 856 to 1179 are a sequence encoding mouse CCL19.
  • SEQ ID NO: 11 shows the amino acid sequence of the entire fusion protein containing sushi IL15, which is expressed by the nucleotide sequence at positions 7 to 1179 of DNA fragment # 6 and is self-cleaved at two F2A sites.
  • [B CAR-T cells production process] sushi IL15_CCL19_ anti-human CD20 CAR-T cells, obtained by the above vector production process instead of IL15 LSP _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector sushi Except for using the IL15_CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector, a retrovirus-containing preparation was obtained in Step 1 and contained in the retrovirus in Step 2 in the same manner as in the CAR-T cell production process of Example 1-1.
  • IL-18 ⁇ CCL19 CAR-T cells [A: Vector preparation step] Preparation of IL18_CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector DNA fragment 1 and DNA fragment 2 similar to step 1 of Example 1-1 Using the following DNA fragment # 7 in place of DNA fragment # 3 to prepare a construct in the same manner as in step 2 of Example 1-1, expression of pMSGV retrovirus containing anti-human CD20 CAR_F2A_IL-18_F2A_CCL19 A vector (IL18_CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector) was obtained.
  • DNA fragment # 7 DNA fragment for IL-18 and CCL19
  • the base sequence of the entire DNA fragment # 7 is shown in SEQ ID NO: 12 (FIG. 13).
  • SEQ ID NO: 12 nucleotides 7 to 81 encode a first F2A
  • nucleotides 82 to 657 encode a mouse IL-18
  • nucleotides 658 to 732 encode a second F2A.
  • the bases at positions 736 to 1059 are the sequence encoding mouse CCL19.
  • SEQ ID NO: 13 shows the amino acid sequence of the entire fusion protein expressed by the nucleotide sequence at positions 7 to 1059 of DNA fragment # 7 and self-cleaved at two F2As.
  • [B CAR-T cells production process Production retroviral expression vectors IL18_CCL19_ anti-human CD20 CAR-T cells, obtained by the above vector production process instead of IL15 LSP _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector IL18_CCL19_ Except that an anti-human CD20 CAR expression vector was used, a retrovirus-containing preparation was obtained in step 1 and contained in the retrovirus in step 2, in the same manner as in the CAR-T cell production step of Example 1-1.
  • IL18_CCL19_anti-human CD20 CAR-T cells referred to herein as “IL18 ⁇ CCL19 CAR-T cells” in which the anti-human CD20 CAR, IL-18 and CCL19 genes were expressed were obtained. .
  • IL-21 ⁇ CCL19 CAR-T cells [A: Vector preparation step] Preparation of IL21_CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector DNA fragment 1 and DNA fragment 2 similar to step 1 of Example 1-1 Using the following DNA fragment # 8 in place of DNA fragment # 3 and constructing a construct in the same manner as in Step 2 of Example 1-1, expression of pMSGV retrovirus containing anti-human CD20 CAR_F2A_IL-21_F2A_CCL19 A vector (IL21_CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector) was obtained.
  • DNA fragment # 8 DNA fragment for IL-21 and CCL19
  • the base sequence of the entire DNA fragment # 8 is shown in SEQ ID NO: 14 (FIG. 14).
  • bases 7 to 81 encode a first F2A
  • bases 82 to 567 encode a mouse IL-21
  • bases 568 to 642 encode a second F2A.
  • the bases at positions 646 to 969 are the sequence encoding mouse CCL19.
  • SEQ ID NO: 15 shows the amino acid sequence of the entire fusion protein expressed by the nucleotide sequence of positions 7 to 969 of DNA fragment # 8 and self-cleaved at two F2As.
  • [B CAR-T cells production process Production retroviral expression vectors IL21_CCL19_ anti-human CD20 CAR-T cells, obtained by the above vector production process instead of IL15 LSP _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector IL21_CCL19_ Except that an anti-human CD20 CAR expression vector was used, a retrovirus-containing preparation was obtained in step 1 and contained in the retrovirus in step 2, in the same manner as in the CAR-T cell production step of Example 1-1.
  • IL21_CCL19_anti-human CD20 CAR-T cells referred to herein as “IL21 ⁇ CCL19 CAR-T cells” in which anti-human CD20 CAR, IL-21 and CCL19 genes were expressed were obtained. .
  • sc IL27 ⁇ CCL19 CAR-T cells [A: Vector preparation step] Preparation of sc IL27_CCL19_anti-human CD20 CAR expression vector DNA fragment 1 and DNA fragment 2 similar to step 1 in Example 1-1 Using the following DNA fragment # 9 in place of DNA fragment # 3 and constructing a construct in the same manner as in step 2 of Example 1-1, expression of pMSGV retrovirus containing anti-human CD20 CAR_F2A_scIL-27_F2A_CCL19 resulting in the vector (sc IL27_CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector).
  • DNA fragment # 9 sc IL27 and CCL19 DNA fragment for the first F2A, murine IL27 construct "scIL27" (p28, a fusion peptide consisting of the linker and EBI3), second F2A, as well as nucleotide sequences encoding CCL19
  • the DNA fragment was artificially synthesized.
  • the base sequence of the entire DNA fragment # 9 is shown in SEQ ID NO: 16 (FIG. 15).
  • SEQ ID NO: 16 Oite 7 to 81st bases encoding the first F2A sequence, 82-1437 th bases encoding the sc IL27 sequence (of which 82 to 765 th nucleotide encodes a murine EBI3, Bases 766 to 819 are a linker; bases 820 to 1437 encode mouse p28); bases 1438 to 1512 encode a second F2A sequence; bases 1516 to 1839 are a mouse CCL19.
  • Is an array that encodes SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the entire fusion protein containing sc IL27, which is expressed by the nucleotide sequence at positions 7 to 1839 of DNA fragment # 9 and is self-cleaved at two F2A sites.
  • retroviral expression vectors [B CAR-T cells production process] sc IL27_CCL19_ anti-human CD20 CAR-T cells, obtained by the above vector production process instead of IL15 LSP _CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector except for using the sc IL27_CCL19_ anti-human CD20 CAR expression vector in the same manner as CAR-T cells production process of example 1-1, to obtain a retroviral-containing preparation in step 1, the retrovirus in step 2 mouse T cells each gene of anti-human CD20 CAR, scIL27 and CCL19 were expressed included in (sc IL27_CCL19_ anti-human CD20 CAR-T cells, referred to herein as "sc IL27 ⁇ CCL19 CAR-T cells".)
  • transduction (-) T cell In the step B, step 2 of Example 1-1, IL15 LSP _CCL19_anti-human CD20 was not prepared without preparing a retrovirus vector and transfecting the T cell using the same.
  • Mouse T cells activated only in the present specification, "transduction (-) T” were used in the same procedure except that an equal amount of DMEM medium used for culturing GP2-293 cells was added instead of using the CAR expression vector preparation. Cells ").
  • Comparative Example 2 conv. CAR-T cells
  • A: Vector preparation step Preparation of anti-human CD20 CAR expression vector DNA fragment 1, DNA fragment 2, and pMSGV retrovirus vector were prepared in the same manner as in step A of step A of Example 1-1. Was used to create an anti-human CD20 CAR_MCS-containing pMSGV retrovirus expression vector. This was used as a control retroviral expression vector (anti-human CD20 CAR expression vector) that did not co-express cytokines and chemokines.
  • a retrovirus-containing preparation is obtained in step 1, and only the anti-human CD20 CAR contained in the retrovirus is expressed in step 2 (cytokine and chemokine)
  • Mouse T cells anti-human CD20 CAR-T cells, which are referred to herein as "conv. CAR-T cells").
  • Each T cell was treated with biotin-labeled protein L (specifically binds to the ⁇ light chain of anti-human CD20 scFv) and Brilliant Violet TM 421 (BV421) -conjugated streptavidin to detect CAR expression.
  • the CD8 positive rate in each T cell population was measured using an allophycocyanin (APC) -conjugated anti-mouse CD8 monoclonal antibody (BioLegend). Since it is generally considered that CD8-positive T cells have direct cytotoxic activity, the presence (positivity rate) of CD8-positive T cells can be used to support potency.
  • APC allophycocyanin
  • IL-15 was detected at a concentration of 250 pg / mL from the culture supernatant of the CAR-T cells (15LSPx19 ⁇ CAR-T) of Example 1-1.
  • IL- in the culture supernatant of CAR-T cells of Example 1-2 s15RAx19 @ CAR-T
  • Example 1-3 mb15RAx19 @ CAR-T
  • Example 1-4 sushi15x19 @ CAR-T.
  • the concentration of 15 was similar to that of activated T cells not transduced (transduction (-): Comparative Example 1) and control anti-human CD20 CAR-expressing T cells (conv.
  • CAR-T Comparative Example 2.
  • ELISA kit used in Test Example 1
  • no secretion of IL-15 was observed.
  • Examples 1-2, 1-3 and Example 1-4 show a remarkable cell proliferation effect.
  • IL-15 is expressed and secreted.
  • IL-18 was detected at a concentration of 150 pg / mL or more from the culture supernatant of the CAR-T cells of Example 2 (18 ⁇ 19-CAR-T).
  • the amount of secretion from the control anti-human CD20 CAR-expressing T cells (conv. CAR-T: Comparative Example 2) into the culture supernatant was the same as that of the activated T cells not transduced (transduction (-): The amount was as small as that of Example 1).
  • IL-18 was detected at a concentration of 400 pg / mL or more from the culture supernatant of the CAR-T cells of Example 3 (21 ⁇ 19 ⁇ CAR-T).
  • the amount of secretion from the control anti-human CD20 ⁇ CAR-expressing T cells (conv. ⁇ CAR-T: Comparative Example 2) was detected together with the activated T cells not transduced (transduction ⁇ (-): Comparative Example 1). It was below the limit (Not Detected).
  • IL-27 (FIG. 2D)
  • p28 which is a subunit of IL-27 was detected at a concentration of 250 pg / mL or more from the culture supernatant of the CAR-T cells (sc27x19xCAR-T) of Example 4.
  • the amount of secretion from the control anti-human CD20 ⁇ CAR-T cells (conv. ⁇ CAR-T: Comparative Example 2) is comparable to that of activated T cells not transduced (transduction ⁇ ( ⁇ ): Comparative Example 1). (About 50 pg / mL in the culture supernatant).
  • Test Example 2 Evaluation of in vitro proliferation ability of CAR-T cells Using the T cells produced in the above Examples and Comparative Examples, cytokines (IL-15, IL-18, IL- 21 and IL-27) exerted biological functions and exhibited an immunity-inducing effect by examining the cell number and proliferation ability of CAR-T cells as described below.
  • cytokines IL-15, IL-18, IL- 21 and IL-27
  • Each T cell was stained with CytoTell TM UltraGreen (AAT Bioquest), and then co-treated in the same well with P815 mastcytoma (hCD20 / P815) treated with mitomycin C and genetically modified to express human CD20. Cultured and stimulated. After culturing for 3 days, 5 days or 7 days from the start of stimulation, the cells were collected and subjected to flow cytometry analysis. The cells were stained with an APC-conjugated anti-Thy1.2 monoclonal antibody (eBioscience), and the number of cells was determined assuming that Thy1.2 positive cells in each T cell (lymphocyte) population were viable T cells.
  • APC-conjugated anti-Thy1.2 monoclonal antibody eBioscience
  • Transduction (-) T cells did not stimulate activation even when co-cultured with hCD20 / P815 cells, and the number of viable cells was 1/10 or less on the third day of culture.
  • hCD20 / P815 cells co-cultured with IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-1
  • s IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-2
  • mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR- T cells Example 1-3
  • sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-4
  • IL-18 ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 2
  • IL-21 ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 3
  • scIL27 ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 4
  • IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-1), IL-18 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 2), IL-21 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 3) and scIL27 ⁇ CCL19 CAR -T cells (Example 4) were used as control conv. From day 3 to day 7 of culture. The cell number equivalent to that of the CAR-T cells (Comparative Example 2) was maintained.
  • IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-1
  • s IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-2
  • mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-3
  • sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-4
  • IL-18 ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 2
  • IL-21 ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 3
  • IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-2
  • mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells Examples 1-3
  • sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR- Combination of IL-15 / IL-15R ⁇ fusion protein and CCL-19 produced in T cells Examples 1-4
  • a P815 mastcytoma (hCD20 / P815) genetically modified to express human CD20 is used as a target tumor cell, and a P815 mastcytoma (P815) not genetically modified is used as a control tumor cell.
  • the target tumor cells or control tumor cells are collected and seeded on a culture plate, and then, as effector T cells, CAR-T cells of each example (IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-1), s ) IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-2), mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-3), sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-4), IL -18 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 2), IL-21 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 3) and scIL27 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 4) or CAR-T of Comparative Example 2.
  • IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells Example 1-1
  • s IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells
  • Example 1-3 mb IL15 RA
  • the cells were stained with an APC-conjugated anti-Thy1.2 monoclonal antibody (eBioscience) and Zombie Green Fixable Viability Kit (BioLegend), and the proportion of T cells and tumor cells in the living cell population was calculated from the Thy1.2 positive rate. The number of viable cells was measured using NucleoCounter NC-200 (chemometec).
  • FIG. 5 shows the results. As shown in FIG. 5A, the number of hCD20 / P815 tumor cells 72 hours after co-culture was calculated from the Thy1.2 negative rate in living cells, and the results were IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-1).
  • s IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-2), mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-3), sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-4), HCD20 / P815 tumor co-cultured with IL-18 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 2), IL-21 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 3) or scIL27 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 4) The number of cells was significantly reduced as compared with the transduction (-) T cells (Comparative Example 1).
  • IFN ⁇ production measurement by ELISA assay As an indicator of activation of target antigen-specific cytotoxicity, interferon ⁇ (IFN ⁇ ) produced from CAR-T cells was measured using a commercially available ELISA assay kit (R & D).
  • CAR-T cells of each example IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-1), co-cultured with the aforementioned P815 cells (control tumor cells) or hCD20-P815 cells (target tumor cells), s IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-2), mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-3), sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-4), IL -18 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 2), IL-21 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 3) and scIL27 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 4) or CAR-T of Comparative Example 2.
  • the amount of IFN ⁇ in the culture supernatant of the cells (conv. CAR-T cells) 4 days after co-culture was measured.
  • FIG. 6 shows the results.
  • IL15 LSP ⁇ CCL19 CAR- T cells co-cultured with hCD20-P815 cells (Example 1-1), s IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-2), mb IL15 RA ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-3), sushi IL15 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 1-4), IL-18 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 2), IL-21 ⁇ In either culture supernatant of CCL19 CAR-T cells (Example 3) or scIL27 ⁇ CCL19 CAR-T cells (Example 4), conv.
  • IFN ⁇ of about 15 ng / mL or more was detected, which was higher than that of CAR-T cells (Comparative Example 2).
  • the amount of IFN ⁇ production in the group co-cultured with the transduction ( ⁇ ) T cells (Comparative Example 1) was below the detection limit.
  • the concentration of IFN ⁇ in the culture supernatant of each CAR-expressing cell co-cultured with P815 cells was 10 pg / mL or less.
  • Test Example 4 Therapeutic effect in a mouse tumor model Using the T cells produced in Examples 1-3 and 1-4 and Comparative Example 2 above, a mouse melanoma tumor transplant model or a mouse colon cancer tumor model was used. The therapeutic effect was examined using the following tumor-bearing mice.
  • mice (Therapeutic effect in mouse melanoma tumor transplantation model) 5 ⁇ 10 5 mouse melanomas B16F10 (B16F10-hCD20) that had been genetically modified to express human CD20 were inoculated subcutaneously into C57BL / 6N mice. On day 7 after inoculation, cyclophosphamide (CPA, 50 mg / kg) as an anticancer agent was intraperitoneally administered, and on day 10, 1 ⁇ 10 6 CAR-T cells of Example 1-3 were administered. ( Mb IL15 RA xCCL19 CAR-T), the CAR-T cells of Example 1-4 ( sushi IL15xCCL19 CAR-T), or Comparative Example 2 (Conv.
  • CPA cyclophosphamide
  • CAR-T CAR-T
  • a control group a CAR-T untreated group to which only CPA was administered and a non-treated group not treated after inoculation of B16F10-hCD20 mouse melanoma were set.
  • the tumor volume of the mice was measured twice a week.
  • FIG. 16 shows the results of the tumor volume of the mouse melanoma tumor transplant model.
  • the horizontal axis is the number of days after inoculation with the 0 day on the days for which the B16F10-hCD20 were inoculated subcutaneously into mice, and the vertical axis tumor volume (longer diameter ⁇ tumors (short diameter) 2/2 (mm 3 tumor)). Standard deviation was calculated in each experimental group. “No treatment” was untreated, “CPA” was CPA administration only, “CPA + Conv.” Was administered after CPA administration, and Comparative Example 2 (Conv. CAR-T) was administered. “CPA + mb IL15 RA x19” was administered after CPA administration.
  • the CAR-T cells of Example 1-3 ( mb IL15 RA xCCL19 CAR-T) and the CAR-T cells of Example 1-4 ( sushi IL15 RA xCCL19 CAR-T) were administered.
  • the effect of reducing the tumor volume was confirmed as compared with the case where Comparative Example 2 (Conv. CAR-T) was administered, the case where no treatment was performed (no treatment), and the case where only CPA was administered.
  • the CAR-T cells of Example 1-3 ( mb IL15 RA xCCL19 CAR-T) and the CAR-T cells of Example 1-4 ( sushi IL15xCCL19 CAR-T) were excellent antitumors in a mouse melanoma tumor model. It was found to have activity.
  • FIG. 17 shows the results of the tumor volume of the mouse colon cancer tumor transplant model.
  • the horizontal axis is the number of days after inoculation with the date of the MC38-hCD20 were inoculated subcutaneously in mice with day 0, and the vertical axis represents the tumor volume (longer diameter ⁇ tumors (short diameter) 2/2 (mm 3 tumor)). Standard deviation was calculated in each experimental group. “No treatment” was untreated, “CPA” was CPA administration only, “CPA + Conv.” Was administered after CPA administration, and Comparative Example 2 (Conv. CAR-T) was administered. “CPA + mb IL15 RA x19” was administered after CPA administration.
  • Example 1-3 mb IL15 RA xCCL19 CAR-T
  • Example 1-4 sushi IL15xCCL19 CAR-T
  • mice and cytokines containing a natural amino acid sequence of mice such as fusion proteins in which IL-15 is linked to IL-15R ⁇ or the like
  • chemokines CCL19
  • mice ie, T-cells of human origin or cytokines containing human natural amino acid sequences (such as IL-15R ⁇
  • the present invention can be carried out in the same manner even when using a linked fusion protein) and a chemokine (CCL19), or when performing an in vivo test in humans. Can be understood.
  • a fusion protein comprising the IL15 LSP , which is implemented (made and used) utilizing the native amino acid sequence of the mouse shown in SEQ ID NO: 5, is a human protein for IL-15 shown in SEQ ID NO: 18.
  • Fusion proteins comprising an s IL15 RA being performed utilizing the natural amino acid sequence of mouse shown in SEQ ID NO: 7, the human relates IL15 shown in SEQ ID NO: 18 of the native amino acid sequence Among them, the amino acid sequence at positions 49 to 162 (IL-15 portion) and the 31st to 205th position (extracellular IL-15R ⁇ cell) in the human natural amino acid sequence for IL-15R ⁇ shown in SEQ ID NO: 19 Domain) and a nucleic acid having a base sequence encoding such an amino acid sequence.
  • a fusion protein comprising mb IL15 RA implemented using the native amino acid sequence of the mouse shown in SEQ ID NO: 9, comprises the human native amino acid sequence for IL-15 shown in SEQ ID NO: 18. Among them, the amino acid sequence at positions 49 to 162 (IL-15 portion), and the amino acid sequence at positions 1 to 267 (full length of IL-15R ⁇ ) in the human natural amino acid sequence for IL-15R ⁇ shown in SEQ ID NO: 19 ), And a nucleic acid having a base sequence encoding such an amino acid sequence.
  • the fusion protein containing sushi IL15 which is carried out using the mouse natural amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, is one of the human natural amino acid sequences related to IL-15 shown in SEQ ID NO: 18. And the amino acid sequence of positions 31-95 (sushi domain) of the human natural amino acid sequence for IL-15R ⁇ shown in SEQ ID NO: 19. And a nucleic acid having a base sequence encoding such an amino acid sequence.
  • the CAR-T cells excellent in persistence and proliferation according to the present invention are suitable for use in producing a medicament for treating cancer and the like. Also, the expression vector according to the present invention is suitable for use for producing such CAR-T cells.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of DNA fragment containing anti-human CD20 CAR (DNA fragment # 1)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of fusion protein expressed by nucleotide sequence from position 3 to 1637 of DNA fragment # 1
  • SEQ ID NO: 3 Termination nucleotide sequence SEQ ID NO of MCS DNA fragment encoding the codon and restriction enzyme sites (DNA fragment # 2)
  • 4 IL15 LSP _F2A_CCL19 DNA fragment (DNA fragment # 3) of the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 18 Registered as UniProtKB-P40933 Amino acid sequence of human native IL-15 (full length including signal peptide and propeptide portions)
  • SEQ ID NO: 19 human native IL-15R ⁇ (signal peptide, sushi domain, cell registered as UniProtKB-Q13261 Amino acid sequence)

Abstract

本発明は、ＣＡＲを単独で発現する（サイトカインおよび／またはケモカインを発現しない）免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞等）よりも、抗腫瘍活性の高い免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞等）を提供する。本発明の一側面において提供されるＴ細胞は、（１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、（２）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）およびインターロイキン－２７（ＩＬ－２７）からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびに（３）ＣＣケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現する。

Description

ＣＡＲ発現Ｔ細胞及びＣＡＲ発現ベクター
　本発明は、がん免疫治療に用いることのできる、キメラ抗原受容体（本明細書において「ＣＡＲ」と表記する。）を発現している免疫細胞（本明細書において「ＣＡＲ発現免疫細胞」と表記する。）、代表的にはＣＡＲを発現しているＴ細胞（本明細書において「ＣＡＲ－Ｔ細胞」と表記する。）、およびＣＡＲ発現免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞等）を作製するための発現ベクターに関する。より詳しくは、本発明は、所定のサイトカインおよびケモカインを発現しているＣＡＲ発現免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞等）およびその作製のための発現ベクターに関する。
［発明の背景］
　ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与によるがん免疫療法は、白血病やリンパ腫などの造血器悪性腫瘍において有効性が示されているが、特に固形がんにおいては、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内での生存効率の低さ、がん細胞が有する腫瘍免疫回避機構によるがん微小環境におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の活性阻害等の課題により、治療効果が認められないがん種や症例が存在する。そのため、特に固形がんにおいて治療効果を示す、より抗腫瘍活性の高いＣＡＲ－Ｔ細胞が求められている。
　特許文献１および非特許文献１には、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも抗腫瘍活性に優れている、ＩＬ－７およびＣＣＬ１９を発現しているＣＡＲ－Ｔ細胞が記載されている。しかしながら特許文献１および非特許文献１には、それ以外のサイトカインおよびケモカインの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　非特許文献２には、ＣＡＲのシグナリングから独立して持続性が向上した、膜結合型キメラＩＬ－１５（ｍｂＩＬ－１５）を発現しているＣＡＲ－Ｔ細胞が記載されている。しかしながら非特許文献２には、ｍｂＩＬ－１５とＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　非特許文献３には、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインとがフレキシブルなリンカーを介して連結している融合タンパク質を用いることにより、従来のＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインとを併用するよりも、リンパ球（ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、メモリーＣＤ８陽性細胞）の増殖や樹状細胞の活性化などにおける活性を強力にすることができることが記載されている。しかしながら非特許文献３には、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５ＲαｓｕｓｈｉドメインとＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　非特許文献４には、マウスのＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの、分泌型の融合タンパク質をトランスフェクションすることにより、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の生存能および増殖能が向上することが記載されている。しかしながら非特許文献４には、ＩＬ－１５とＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　非特許文献５には、一本鎖ＩＬ－２７（ｐ２８とＥＢＩ３をフレキシブルなリンカーで連結したもの）およびその炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療に対する効果を記載している。しかしながら非特許文献５には、ＣＡＲ－Ｔ細胞について、また一本鎖ＩＬ－２７とＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　特許文献２には、組換えＩＬ－７、組換えＩＬ－１５、またはこれらの組み合わせを発現しているＴ細胞が開示されており、そのようなサイトカインの発現がＴ細胞の生存を向上させることが記載されている。しかしながら特許文献２には、ＣＡＲ－Ｔ細胞について、また上記特定のサイトカインとＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれてない。
　特許文献３には、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５またはこれらの組み合わせをコードする発現コンストラクトと、ＣＡＲコンストラクトとを含有する、改変されたナチュラルキラーＴ細胞が記載されている。しかしながら特許文献３には、上記特定のサイトカインとＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　特許文献４には、ＩＬ－７、ＩＬ－１５（ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質）、ＩＬ－２１といった、膜結合型のサイトカインを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞が記載されている。しかしながら特許文献４には、上記特定のサイトカインとＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　特許文献５には、ＩＬ－１５を発現している、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞が記載されている。しかしながら特許文献５には、ＩＬ－１５とＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
　非特許文献６には、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１を発現している、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞が記載されている。しかしながら特許文献６には、上記特定のサイトカインとＣＣＬ１９等のケモカインとの組み合わせについての具体的な記載は含まれていない。
WO2016/056228 WO2007/037780 WO2013/040371 WO2014/186469 US2013/0071414
Adachi et al., Nature Biotechnology, VOL 36, No 4, 346-353 Hurton etal., Proc Natl Acad Sci., 113(48), E7788-97, 2016 Mortieret al., J Biol Chem. 281(3), 1612-9, 2006 Rowley etal., Eur J Immunol. 39(2), 491-506, 2009 Sasaokaet al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 300: G568-576 Barta etal., Armored Glypican-3-Specific CAR T cells for the Immunotherapy ofHepatocellular Carcinoma, ASGCT 2018, May 2018, abstract
　本発明は、ＣＡＲを単独で発現する（サイトカインおよび／またはケモカインを発現しない）免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞等）よりも、抗腫瘍活性の高い免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞等）を提供することを課題とする。
　Ｔ細胞等の免疫細胞の機能を制御しうる分子は生体内に少なくとも数百種類も存在する。本発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＣＡＲとともに、サイトカインであるインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）およびインターロイキン－２７（ＩＬ－２７）からなる群より選ばれる少なくとも１種を、ケモカインであるＣＣケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）と組み合わせて発現させることにより、ＣＡＲを単独で発現させた場合と比較して、抗腫瘍活性が増強されること、特にＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および増殖性が向上することを見出し、本発明を成し遂げた。
　なお、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７およびＣＣＬ１９は、生体内に存在する天然の（外因性の遺伝子が導入されていない）Ｔ細胞は発現していないサイトカインおよびケモカインである。ＩＬ－２１は、生体内に存在する天然のＴ細胞（例えば、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞）が発現しているサイトカインである。本発明において、上記所定のサイトカインおよびケモカインを発現させることは、Ｔ細胞に外因性の上記所定のサイトカインおよびケモカインを発現させるための遺伝子を導入することにより、生体内に存在する天然のＴ細胞よりも高いレベルで上記所定のサイトカインおよびケモカインを発現させることを意味する。
　また、上記所定のインターロイキンおよびケモカインをＣＡＲとともにＴ細胞に遺伝子導入して発現させる実施形態は、それらをＴ細胞以外の免疫細胞、例えばＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等に遺伝子導入して発現させる実施形態へと拡張することが可能である。
　本発明は、少なくとも下記の発明を包含する。
［１］
　（１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
　（２）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）およびインターロイキン－２７（ＩＬ－２７）からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびに
　（３）ＣＣケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）
を発現するＴ細胞。
［２］
　前記（２）がＩＬ－１５である、項１に記載のＴ細胞。
［３］
　前記ＩＬ－１５が、ＩＬ－１５Ｒαと連結して融合タンパク質を形成した状態にあるＩＬ－１５である、項２に記載のＴ細胞。
［４］
　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５ＬＳＰとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ＩＬ１５ＬＳＰ）、ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓＩＬ１５ＲＡ）、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、項３に記載のＴ細胞。
［５］
　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、項３に記載のＴ細胞。
［６］
　項１に記載のＴ細胞を含有する医薬。
［７］
　がんの治療剤である、項６に記載の医薬。
［８］
　前記がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫または白血病である、項７に記載の医薬。
［９］
　（１）ＣＡＲをコードする核酸、
　（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種をコードする核酸、ならびに
　（３）ＣＣＬ１９をコードする核酸
を含む、発現ベクター。
［１０］
　前記（２）がＩＬ－１５である、項９に記載の発現ベクター。
［１１］
　前記ＩＬ－１５が、ＩＬ－１５Ｒαと連結して融合タンパク質を形成した状態にあるＩＬ－１５である、項１０に記載の発現ベクター。
［１２］
　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５ＬＳＰとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ＩＬ１５ＬＳＰ）、ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓＩＬ１５ＲＡ）、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、項１１に記載の発現ベクター。
［１３］
　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、項１１に記載の発現ベクター。
［１４］
　項９に記載の発現ベクターをＴ細胞に導入する工程を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法。
［１５］
　項１に記載のＴ細胞を、がんの治療を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの治療方法。
［１６］
　前記がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫または白血病である、項１５に記載の治療方法。
［１７］
　がんの治療の有効成分として使用するための、項１に記載のＴ細胞。
［１８］
　前記がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫または白血病である、項１７に記載のT細胞。
　本明細書において、上記［１］のＴ細胞を「本発明のＴ細胞」、上記［６］の医薬を「本発明の医薬」、上記［９］の発現ベクターを「本発明の発現ベクター」、上記［１４］のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法を「本発明の製造方法」と呼ぶことがある。
　当業者であれば、本明細書に開示されている内容を全体的に勘案して、上記の発明の形態（カテゴリー）を適宜変換することが可能である。上記［６］に係る本発明の医薬は、例えば、「（１）ＣＡＲ、（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびに（３）ＣＣＬ１９を発現するＴ細胞を、がんの治療を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの治療方法」、「がんの治療の有効成分として使用するための、（１）ＣＡＲ、（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびに（３）ＣＣＬ１９を発現するＴ細胞」、「（１）ＣＡＲ、（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびに（３）ＣＣＬ１９を発現するＴ細胞の、がんを治療するための医薬の製造における使用」などに変換することができる。
　当業者であれば、本明細書に開示されている内容を全体的に勘案して、ＣＡＲと共に所定のサイトカインおよびケモカインをＴ細胞に発現させることにより得られる本発明のＴ細胞ならびにそれに関連する実施形態としての本発明の医薬、本発明の発現ベクター、本発明の製造方法などの各発明を、ＣＡＲと共に所定のサイトカインおよびケモカインをＴ細胞以外の免疫細胞（ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等）ならびにそれに関連する実施形態としての医薬、発現ベクター、製造方法などの各発明に適宜変換することが可能である。
　本発明のＴ細胞は、所定のサイトカイン（ＩＬ－１５等）およびケモカイン（ＣＣＬ１９）が発現することにより、Ｔ細胞の持続性および増殖性が向上しているため、ＣＡＲによる抗腫瘍活性を増強する（残存腫瘍細胞数を低減する、ＩＦＮγの産生量を向上させる、腫瘍局所への宿主免疫細胞（Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞等）の遊走と蓄積を向上させる）ことができる。また、そのような本発明のＴ細胞を含有する医薬により、がんの治療効果を向上させることができる。特に、本発明のＴ細胞は、ＮＫ細胞の活性化に関与している可能性があり、それによりＮＫ細胞に感受性がある癌腫（メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病等）の治療に有用である可能性がある。さらに、抗腫瘍活性の増強により投与細胞数が減少することで、ＣＲＳ（Cytokine Release Syndorome）等の副作用の低減や、製造コストの低減といった効果が期待される。
　本発明の所定のサイトカインおよびケモカインの組み合わせは、免疫細胞全般に対して、すなわち上述したようなＴ細胞のみならず、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等に対して、ＣＡＲ遺伝子とともに遺伝子導入し、発現させる場合であっても、抗腫瘍活性の高い各種のＣＡＲ発現免疫細胞が得られるという作用効果が奏される。
図１は、実施例（試験例１）において、下記の各Ｔ細胞について、ＣＡＲ（横軸）およびＣＤ８（縦軸）の発現レベルをフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。図中の数値（％）は、全細胞に対する各区画の細胞集団のパーセンテージを表す。「transduction (-)」は比較例１のｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（－）Ｔ細胞（形質導入なしのT細胞）、「conv. CAR-T」は比較例２のｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ヒトCD20 CAR-T細胞）、「15LSP x 19 CAR-T」は実施例１－１のＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞）、「s15RA x 19 CAR-T」は実施例１－２のｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（sIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞）、「mb15RA x 19 CAR-T」は実施例１－３のｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（mbIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞）、「sushi15 x 19 CAR-T」は実施例１－４のｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（sushiIL15_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞）、「18 x 19 CAR-T」は実施例２のＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（IL18_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞）、「21 x 19 CAR-T」は実施例３のＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（IL21_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞）、「sc27 x 19 CAR-T」は実施例４のｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（scIL27_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞）についての結果である。（下記図２～６においても同様である。） 図２は、実施例（試験例１）において、前記各Ｔ細胞について、（Ａ）ＩＬ－１５、（Ｂ）ＩＬ－１８、（Ｃ）ＩＬ－２１、（Ｄ）ＩＬ－２７および（Ｅ）ＣＣＬ１９の培養上清への分泌量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。 図３は、実施例（試験例２）において、ヒトＣＤ２０発現Ｐ８１５マストサイトーマ（hCD20/P815）との共培養による活性化刺激から３日後、５日後および７日後の、前記各Ｔ細胞の生細胞数を測定した結果を示す。 図４は、実施例（試験例２）において、前記各Ｔ細胞のＣｙｔｏＴｅｌｌ試薬による染色強度のヒストグラム解析を行った結果を示す。ヒストグラムのピークは細胞分裂による世代数を示し、ドーナツグラフ中の数値（％）はＴｈｙ１．２陽性Ｔ細胞集団におけるゲーティングしたフラクション（１は未分裂の第一世代、２は１回分裂後の第二世代、３は２回分裂後の第三世代、４は３回分裂後の第四世代、＞５は４回以上分裂した第五世代以降を示す。）のパーセンテージを示す。 図５は、実施例（試験例３）において、（Ａ）ターゲット腫瘍細胞（hCD20/P815）および（Ｂ）コントロール腫瘍細胞（P815）に対する、前記各Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を、フローサイトメトリーにより測定した結果を示す。 図６は、実施例（試験例３）において、（Ａ）ターゲット腫瘍細胞（hCD20/P815）、および（Ｂ）コントロール腫瘍細胞（P815）と共培養したときの、前記各Ｔ細胞の培養上清中のＩＦＮγの濃度を測定した結果を示す。 図７は、配列番号１（抗ヒトCD20 CAR DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図８は、配列番号３（MCS DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図９は、配列番号４（IL15LSP_F2A_CCL19　DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図１０は、配列番号６（sIL15RA_F2A_CCL19 DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図１１は、配列番号８（mbIL15RA_F2A_CCL19 DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図１２は、配列番号１０（sushiIL15_F2A_CCL19 DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図１３は、配列番号１２（IL-18_F2A_CCL19 DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図１４は、配列番号１４（IL-21_F2A_CCL19 DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図１５は、配列番号１６（scIL27_F2A_CCL19 DNA断片）の塩基配列に含まれる遺伝子等の配置を表す。 図１６は、実施例（試験例４）において、マウスメラノーマ腫瘍移植モデルに対する抗腫瘍活性（腫瘍体積の変化）を測定した結果を示す。 図１７は、実施例（試験例４）において、マウス大腸がん腫瘍モデルに対する抗腫瘍活性（腫瘍体積の変化）を測定した結果を示す。
　本明細書において、「トランスフェクション」とは、任意の物質を細胞の内部に導入することを意味する。細胞の内部には、少なくとも、細胞質内及び核内が包含される。
　「培養（Culture)」又は「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、ディッシュ、シャーレ、フラスコ、あるいは培養槽（タンク）中で細胞を維持し、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。
　「多能性（pluripotency）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（pluripotency）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（totipotency）」とは区別される。
　「多能性（multipotency）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はmultipotentだが、pluripotentではない。
　「幹細胞（stem cell）」としては、例えば、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）が挙げられる。
　本発明において使用可能な「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、生体の種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力を有する幹細胞を指す。それには、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ESC）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞、精子幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞（本明細書中、「iPSC」と称することもある）などが挙げられる。
　また、本発明において使用可能な「多能性幹細胞（multipotent stem cell）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を有する幹細胞を指す。本発明において使用可能な「多能性幹細胞（multipotent stem cell）」としては、例えば、歯髄幹細胞、口腔粘膜由来幹細胞、毛包幹細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の体性幹細胞などが挙げられる。好ましい多能性幹細胞（pluripotent stem cell）は、ESC及びiPSCである。
　「人工多能性幹細胞（iPSC）」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　「人工多能性幹細胞」としては、NIH、理研（理化学研究所）、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等が挙げられる。あるいは、京都大学やCellular Dynamics International等から提供される臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。
　「胚性幹細胞（ESC）」としては、マウスESCであれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスESC株が利用可能であり、ヒトESCであれば、NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトESC株が利用可能である。たとえば、ヒトESC株としては、NIHのCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。あるいは、臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。
　「～を含む（comprise(s)又はcomprising）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
　「～からなる（consist(s) of又はconsisting of）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「～から本質的になる」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
　本発明の所定のサイトカインおよびケモカインの組み合わせは、免疫細胞、特に獲得免疫のうち細胞性免疫を担うＴ細胞や、自然免疫を担うＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等に、ＣＡＲ遺伝子とともに遺伝子導入し、発現させることにより、抗腫瘍活性の高いＣＡＲ発現免疫細胞を提供することができる。言い換えれば、本発明の所定のサイトカインおよびケモカインの組み合わせの遺伝子導入および発現は、それぞれＣＡＲの遺伝子導入および発現がなされるＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、単球（ＣＡＲ－単球）、マクロファージ（ＣＡＲ－マクロファージ）、樹状細胞（ＣＡＲ－樹状細胞）などに対して、さらなる技術的特徴して賦与することができる。
　「免疫細胞」は、がん細胞等の標的細胞（病原細胞）を、何らかの作用機序により障害し得る能力を有する細胞（いわゆる免疫エフェクター細胞）であれば特に制限はないが、例えば、獲得免疫のうち細胞性免疫を担うＴ細胞や、自然免疫を担うＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等が挙げられる。好ましい一実施形態においては、免疫細胞はＴ細胞であり得る。一方、別の好ましい実施形態においては、免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の自然免疫を担う細胞であり得る。Ｔ細胞はＨＬＡタイプが一致する場合でも、同種異系（アロ）移植によりＧＶＨＤを引き起こすリスクが相当程度あるのに対し、アロＮＫ細胞等はＧＶＨＤを引き起こさないと考えられている。従って、種々のＨＬＡタイプのアロ免疫細胞を準備しておけば、off-the-shelfでの使用が可能となる。ＣＡＲ－ＮＫ細胞については、例えば、US2016/0096892、Mol Ther. 25(8): 1769-1781 (2017)等に、ＣＡＲ－樹状細胞、ＣＡＲ－マクロファージ等については、例えば、WO2017/019848、eLIFE. 2018 e36688等に記載されている。
　以下、免疫細胞の代表例としてＴ細胞を採用した場合の実施形態に準じた記載により、本発明を説明する。しかしながら、本発明は免疫細胞がＴ細胞である実施形態だけに限定されるものではなく、免疫細胞がＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等である実施形態も本発明に包含される。以下の記載において、「（ＣＡＲ－）Ｔ細胞」は適宜、「（ＣＡＲ－）ＮＫ細胞」、「（ＣＡＲ－）単球」、「（ＣＡＲ－）マクロファージ」、「（ＣＡＲ－）樹状細胞」などに読み替えることができる。
　以下、本発明のＴ細胞について詳細に説明する。
　本発明のＴ細胞は、（１）ＣＡＲ、（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびに（３）ＣＣＬ１９を発現する。
　本発明におけるＴ細胞は、一般的ないし公知のＣＡＲを発現しているＴ細胞と同様に、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞などのいずれのＴ細胞であってもよい。
　Ｔ細胞は、血液、骨髄液などの体液、脾臓、胸腺、リンパ節などの組織、または原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水などのがん組織に浸潤する免疫細胞から単離、精製したものであってもよい。また、Ｔ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、またはその他の幹細胞、前駆細胞などを、適切な条件下で培養することにより、Ｔ細胞へ分化誘導させたものであってもよい。
　Ｔ細胞は、ヒト由来であってもよいし、ヒト以外の哺乳類（非ヒト哺乳類）由来の細胞であってもよい。非ヒト哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルが挙げられる。
　（１）ＣＡＲ
　本発明のＴ細胞が発現するＣＡＲは基本的に、一般的ないし公知のＣＡＲと同様に、（i）がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体、（ii）細胞膜貫通領域、および（iii）Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域、の各部位のペプチドが、必要応じてスペーサーを介して連結することによって構成されている。
　（i）がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体は、典型的には、当該抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体の抗原結合部位に由来する軽鎖可変領域および重鎖可変領域と、それらを連結するリンカーペプチドとによって構成される単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
　ＣＡＲが標的とする「がん細胞の細胞表面抗原」は、がん細胞及びその前駆細胞に特異的に発現する生体分子、細胞のがん化によって新たに発現が認められるようになった生体分子、またはがん細胞において正常細胞に比べて発現レベルが増加している生体分子であればよい。そのような抗原は、一般的に「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）と呼ばれており、例えば、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４，ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ２４８、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＣＳＰＧ４、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤ１８Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＮＡＭ－１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＦＲα４、ＧＰＣ３、ＧＰＲ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ｇｌｏｂｏＨ、Ｇｐ１００、ＧＰＲ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖａｒｉａｎｔ、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＦＡＰ、ＦＩＴＣ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＰＶ　Ｅ６、ＨＰＶ　Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、ＩｇＧ　κ鎖、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＫＩＴ、Ｌｅｗｉｓ　Ａ、Ｌｅｗｉｓ　Ｙ、Ｌｅｇｕｍａｉｎ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、Ｌｙ６ｋ、ＬＩＣＡＭ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＡＧＥ－Ａ１、Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｏ－ａｃｅｔｙｌ－ＧＤ２、ｈ５Ｔ４、ＰＡＮＸ３、ＰＤＧＲＦｂ、ＰＬＡＣ１、Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ　ａｃｉｄ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ１、ＲＯＲ１、ｓＬｅ、ＳＳＥＡ－４、ＴＡＲＰ、ＴＡＧ－７２、ＴＥＭ７Ｒ、Ｔｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ２、ＴＳＨＲ、αフェトプロテイン、メソテリン、葉酸受容体α（ＦＲα）、葉酸受容体β（ＦＲβ）、ＦＢＰ、ＵＰＫ２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　（ii）細胞膜貫通領域は、ＣＡＲをＴ細胞の細胞膜に固定するための領域となるポリペプチドである。そのような細胞膜貫通領域としては、例えば、ＢＴＬＡ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、またはＴ細胞受容体のαもしくはβ鎖に由来する細胞膜貫通領域を挙げることができる。あるいは、上記の細胞膜貫通領域の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性のアミノ酸配列を有する変異型の細胞膜貫通領域を用いることも可能である。本発明の一実施形態において、細胞膜貫通領域としては、ＣＤ８の細胞膜貫通領域が好ましい。
　細胞膜貫通領域には、任意のアミノ酸配列からなる、長さが１～１００アミノ酸、好ましくは１０～７０アミノ酸のペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド）である、ヒンジ領域が連結していてもよい。そのようなヒンジ領域としては、例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＫＩＲ２ＤＳ２、またはＩｇＧ４、ＩｇＤもしくはその他の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域を挙げることができる。あるいは、上記のヒンジ領域の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性のアミノ酸配列を有する変異型のヒンジ領域を用いることも可能である。本発明の一実施形態において、ヒンジ領域としては、ＣＤ８のヒンジ領域が好ましい。
　（iii）Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域は、前記一本鎖抗体ががん細胞の細胞表面抗原を認識して結合した際に、Ｔ細胞内にシグナル伝達するための領域となるポリペプチドである。そのようなシグナル伝達領域としては、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５（ＣＤ１６０）、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１０３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＤＡＰ１０、Ｆｃ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　γｃｈａｉｎ、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１およびＶＬＡ－６からなる群より選ばれる１種または２種以上の細胞内領域を挙げることができる。あるいは、上記のシグナル伝達領域（細胞内領域）の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性のアミノ酸配列を有する変異型のシグナル伝達領域（細胞内領域）を用いることも可能である。本発明の一実施形態において、シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζの３種の細胞内領域を含むことが好ましい。
　シグナル伝達領域が複数の細胞内領域を含む場合、各細胞内領域同士は、２～１０アミノ酸からなるリンカーペプチド（オリゴペプチドリまたはポリペプチド）を介して連結されていてもよい。そのようなリンカーペプチドとしては、例えば、グリシン－セリン連続配列からなるペプチドを挙げることができる。
　一本鎖抗体と細胞膜貫通領域、および細胞膜貫通領域とシグナル伝達領域はそれぞれ、任意のアミノ酸配列からなる長さが１～１００アミノ酸、好ましくは１０～５０アミノ酸のペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド）である、スペーサー領域を含んでもよい。スペーサー領域としては、例えば、グリシン－セリン連続配列からなるペプチドを挙げることができる。
　本発明のＴ細胞が発現する上述したようなＣＡＲのアミノ酸配列は、Ｔ細胞の用途、典型的にはがんを治療するための医薬の有効成分としての機能に応じて、適切なものとすればよい。がん細胞の細胞表面抗原に対する一本鎖抗体（i）のアミノ酸配列としては様々なものが公知であり、それらのアミノ酸配列の情報を本発明でも利用することができる。あるいは、常法に従って、所望のがん細胞の細胞表面抗原に対する抗体を新たに作製し、その新規の抗体（好ましくは重鎖及び軽鎖可変領域、特にＣＤＲ）のアミノ酸配列を決定して、その情報を本発明において利用するようにしてもよい。また、細胞膜貫通領域（ii）およびＴ細胞活性化シグナル伝達領域（iii）それぞれのアミノ酸配列としても、ヒト由来およびヒト以外の哺乳動物由来のさまざまなものが公知であり、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）、ＵｎｉＰｒｏｔ（The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org）などのデータベースにも登録されているので、それらの情報を本発明でも利用することができる。
　（２）サイトカイン
　本発明のＴ細胞が発現するサイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種である。本発明のＴ細胞は、上記４種のサイトカインのうち、いずれか１種を発現していてもよいし、２種以上を発現していてもよい。
　ＩＬ－１５は、Ｔ細胞の生存、活性化およびメモリーＴ細胞への分化、ならびにＮＫ細胞の活性化などに関係する機能を有しているサイトカインである。本発明における「ＩＬ－１５」という用語は、天然の完全長のＩＬ－１５タンパク質だけでなく、本発明の作用効果におけるＩＬ－１５の機能を保持する範囲で種々の実施形態を包含する。すなわち、本発明における「ＩＬ－１５」は、天然のＩＬ－１５のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全体のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－１５の全体またはその一部のバリアントも包含し、さらに天然のＩＬ－１５の全体またはその一部あるいはそれらのバリアントが、他のタンパク質と連結して融合タンパク質の形態をとっている（例、ＩＬ－１５Ｒαの全体またはその一部と連結して融合タンパク質を形成した状態にある）場合も包含する。本発明において、Ｔ細胞が「ＩＬ－１５を発現する」とは、本発明の作用効果が失われない範囲で上記のような種々の形態のＩＬ－１５（天然のアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアントであって、融合タンパク質の形態をとっていてもとっていなくてもよいもの）を発現することを包含する。
　ＩＬ－１５としては、例えば次のような４つの実施形態が挙げられる。これらはいずれも公知である（前掲非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、および特許文献４などを参照）。しかしながら本発明で用いることのできるＩＬ－１５はこれらの具体例に限定されるものではなく、配列中のシグナルペプチドおよびリンカーの有無および種類、各要素の順序、その他の観点から改変された様々なＩＬ－１５（本明細書において「改変型」のＩＬ－１５と呼ぶことがある。）を用いることも可能である。
　ＩＬ－１５の第１実施形態：ＩＬ－１５ＬＳＰ／ＩＬ－１５（本明細書において「ＩＬ１５ＬＳＰ」と表記することがある。）
　「ＩＬ－１５ＬＳＰ」は、２９アミノ酸からなる長鎖シグナルペプチドであり、第１実施形態においてＩＬ－１５のＮ末端側に結合している。第１実施形態のＩＬ－１５を発現することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性が増強される。「ＩＬ－１５ＬＳＰ」という用語も、天然のＩＬ－１５ＬＳＰのアミノ酸配列からなるポリペプチドの全体のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－１５ＬＳＰの全体またはその一部のバリアントも包含する。なお、第１実施形態の改変型の一例としては、「ＩＬ－１５ＬＳＰ」を「ＩＬ－２ＳＰ」（ＩＬ－２のシグナルペプチドであって、ＩＬ－１５ＬＳＰと同様、天然のタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアントであってもよいもの）に置き換えたものが挙げられる。
　ＩＬ－１５の第２実施形態：ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン（本明細書において「ｓＩＬ１５ＲＡ」と表記することがある。）
　「ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン」は、ＩＬ－１５Ｒα（インターロイキン１５受容体α鎖）のうち、細胞膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを除く部分を指す。ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインにはｓｕｓｈｉドメイン（様々な結合性タンパク質に共通して見られるモチーフ）が含まれている。「ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン」という用語も、天然のＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインのアミノ酸配列からなるポリペプチドの全体のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインの全体またはその一部のバリアントも包含する。ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインは、第２実施形態においては、通常はリンカー（例えば２６アミノ酸からなるグリシン－セリンリンカー）を介して、ＩＬ－１５のＣ末端側に結合している。また、第２実施形態においては通常、ＩＬ－１５のＮ末端側にはＩＬ－１５ＬＳＰに代えて、ＩＬ－２ＳＰ（ＩＬ－２シグナルペプチドであって、天然のタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアントであってもよいもの）が結合している。第２実施形態は分泌型であり、ＩＬ－１５Ｒβ（インターロイキン２受容体と共有される、インターロイキン１５受容体β鎖）およびγｃ（インターロイキン２、４、７、９、１５、２１等の受容体として共有される共通γ鎖）に対して強く結合するアゴニストとなる。
　ＩＬ－１５の第３実施形態：ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα全長（本明細書において「ｍｂＩＬ１５ＲＡ」と表記することがある。）
　「ＩＬ－１５Ｒα全長」は、ＩＬ－１５Ｒαの細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方を含んでおり、第３実施形態においては、通常はリンカー（例えば２０アミノ酸からなるグリシン－セリンリンカー）を介して、ＩＬ－１５のＣ末端側に結合している。「ＩＬ－１５Ｒα全長」という用語も、天然のＩＬ－１５Ｒα全長のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全体のみならず、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－１５Ｒα全長のバリアントも包含する。また、第３実施形態においても通常、ＩＬ－１５のＮ末端側にはＩＬ－１５ＬＳＰに代えてＩＬ－２ＳＰ（天然のタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアントであってもよいもの）が結合している。第３実施形態は膜結合型であり、これを発現することによりＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性が増強される。
　ＩＬ－１５の第４実施形態：ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉ／ＩＬ－１５（本明細書において「ｓｕｓｈｉＩＬ１５」と表記することがある。）
　第４実施形態では、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５Ｒαが、通常はリンカー（例えば２０アミノ酸からなるリンカー）を介して、ＩＬ－１５のＮ末端側に結合している。「ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉ」という用語も、天然のＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列からなるポリペプチドの全体のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉの全体またはその一部のバリアントも包含する。第４実施形態は分泌型である。
　本発明において、後記実施例（試験例）に示されているような細胞の持続性および増殖性の観点からは、ＩＬ－１５としては、ＩＬ－１５Ｒα（天然のアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアント）との融合タンパク質の形態にあるＩＬ－１５（天然のアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアント）が好ましい。例えば、上記第２、第３または第４の実施形態あるいはそれらの改変型が好ましく、上記第３および第４の実施形態あるいはそれらの改変型がより好ましい。
　ＩＬ－１８は、Ｔ細胞の活性化、ＮＫ細胞の活性化、および樹状細胞の活性化などに関係する機能を有しているサイトカインである。本発明における「ＩＬ－１８」という用語は、天然の完全長のＩＬ－１８タンパク質だけでなく、本発明の作用効果におけるＩＬ－１８の機能を保持する範囲で種々の実施形態を包含する。すなわち、本発明における「ＩＬ－１８」は、天然のＩＬ－１８のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全長のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－１８の全体またはその一部のバリアントも包含し、さらに天然のＩＬ－１８の全体またはその一部が、他のタンパク質と連結して融合タンパク質の形態をとっている場合も包含する。本発明において、Ｔ細胞が「ＩＬ－１８を発現する」とは、本発明の作用効果が失われない範囲で上記のような種々の形態のＩＬ－１８（天然のアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアントであって、融合タンパク質の形態をとっていてもとっていなくてもよいもの）を発現することを包含する。
　ＩＬ－２１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能およびメモリーＴ細胞への分化、ならびにＮＫ細胞の生存などに関係する機能を有しているサイトカインである。本発明における「ＩＬ－２１」という用語は、天然の完全長のＩＬ－２１タンパク質だけでなく、本発明の作用効果におけるＩＬ－２１の機能を保持する範囲で種々の実施形態を包含する。すなわち、本発明における「ＩＬ－２１」は、天然のＩＬ－２１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全長のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－２１の全体またはその一部のバリアントも包含し、さらに天然のＩＬ－２１の全体またはその一部が、他のタンパク質と連結して融合タンパク質の形態をとっている場合も包含する。本発明において、Ｔ細胞が「ＩＬ－２１を発現する」とは、本発明の作用効果が失われない範囲で上記のような種々の形態のＩＬ－２１（天然のアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアントであって、融合タンパク質の形態をとっていてもとっていなくてもよいもの）を発現することを包含する。
　ＩＬ－２７は、Ｔ細胞の生存、ＮＫ細胞の活性化、腫瘍の増殖と血管新生の阻害などに関係する機能を有しているサイトカインである。本発明における「ＩＬ－２７」という用語は、天然の完全長のＩＬ－２７タンパク質だけでなく、本発明の作用効果におけるＩＬ－２７の機能を保持する範囲で種々の実施形態を包含する。すなわち、本発明における「ＩＬ－２７」は、天然のＩＬ－２７のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全長のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＩＬ－２７の全体またはその一部のバリアントも包含し、さらに天然のＩＬ－２７の全体またはその一部が、他のタンパク質と連結して融合タンパク質の形態をとっている場合も包含する。本発明において、Ｔ細胞が「ＩＬ－２７を発現する」とは、本発明の作用効果が失われない範囲で上記のような種々の形態のＩＬ－２７（天然のアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくはその一部またはそれらのバリアントであって、融合タンパク質の形態をとっていてもとっていなくてもよいもの）を発現することを包含する。
　ＩＬ－２７としては、例えば、ＩＬ－２７を構成する２つのサブユニット、ｐ２８およびＥＢＩ３（エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３）が、リンカー、例えば（Ｇ４Ｓ）３のような２０～３０アミノ酸からなるリンカー（前掲非特許文献５などを参照）、GSTSGSGKPGSGEGSTKGからなるリンカー（J Immunol. 183, 6217-26 (2009)）で連結されている融合タンパク質（一本鎖タンパク質）が挙げられる。「ｐ２８」および「ＥＢＩ３」という用語も、それぞれ、天然のアミノ酸配列を有するポリペプチドの全体もしくはその一部またはそれらのバリアントを包含する。
　本発明のＴ細胞が発現する上述したようなサイトカインのアミノ酸配列は、本発明のＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の用途、典型的にはがんを治療するための医薬の有効成分としての機能に応じて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および増殖性の向上を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増強に対する効果を考慮しながら、適切なものとすればよい。ヒト由来およびヒト以外の哺乳動物（例えばマウス）由来の天然のＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７ならびにＩＬ－１５Ｒαのアミノ酸配列は公知であり、ＮＣＢＩ、ＵｎｉＰｒｏｔなどのデータベースにも登録されているので、その情報を本発明でも利用することができる。一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０９３３として登録されている、ヒトの天然のＩＬ－１５（シグナルペプチドおよびプロペプチド部分を含む全長）のアミノ酸配列を配列番号１８として示し、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１３２６１として登録されているヒトの天然のＩＬ－１５Ｒα（シグナルペプチド、ｓｕｓｈｉドメイン、細胞外ドメイン等を含む全長）のアミノ酸配列を配列番号１９として、それぞれ示す。後述するような、所定の配列番号のアミノ酸配列においてマウスの天然のアミノ酸配列をヒトの天然のアミノ酸配列に置き換える実施形態においては、配列番号１８および１９に含まれている対応する部分のアミノ酸配列を参照することができる。また、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７ならびにＩＬ－１５Ｒαそれぞれのバリアント、他のタンパク質との融合タンパク質およびそれらの改変型として様々なものが公知であり、それらのアミノ酸配列の情報を本発明でも利用することができる。
　ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７それぞれのバリアントとしては、例えば、全体としてまたは部分的な領域（ドメイン）として、例えば下記のようにシグナルペプチドを置き換えた場合はそのシグナルペプチドを除く領域の相同性として、それぞれのヒトまたはヒト以外の哺乳動物由来の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ある生物種由来の天然のアミノ酸配列に対して上記のような範囲の相同性を有するバリアントとして、他の生物種由来の天然のアミノ酸配列が該当する（実質的に包含される）こともある。またＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７は、配列中のシグナルペプチドを公知のシグナルペプチドに置き換えたものであってもよい。本発明の一側面において、配列番号４：ＩＬ１５ＬＳＰ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃３）、配列番号６：ｓＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃４）、配列番号８：ｍｂＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃５）、配列番号１０：ｓｕｓｈｉＩＬ１５＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃６）、配列番号１２：ＩＬ－１８＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃７）、配列番号１４：ＩＬ－２１＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃８）、配列番号１６：ｓｃＩＬ２７＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃９）、それぞれの塩基配列から発現するタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列において、あるいは配列番号５：ＩＬ１５ＬＳＰを含む融合タンパク質、配列番号７：ｓＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質、配列番号９：ｍｂＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質、配列番号１１：ｓｕｓｈｉＩＬ１５を含む融合タンパク質、配列番号１３：ＩＬ－１８を含む融合タンパク質、配列番号１５：ＩＬ－２１を含む融合タンパク質、配列番号１７：ｓｃＩＬ２７を含む融合タンパク質、それぞれのアミノ酸配列において、マウスの天然のＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１またはＩＬ－２７のアミノ酸配列は、上記のような相同性を有するバリアントのアミノ酸配列、あるいはそのようなバリアントに実質的に該当する、ヒトの天然のＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１もしくはＩＬ－２７のアミノ酸配列またはそれらのさらなるバリアントに、置き換えることができる。
　ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ－１５Ｒα全長およびＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉそれぞれのバリアントとしては、それぞれのヒトまたはヒト以外の哺乳動物由来の天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。本発明の一側面において、配列番号４：ＩＬ１５ＬＳＰ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃３）、配列番号６：ｓＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃４）、配列番号８：ｍｂＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃５）、配列番号１０：ｓｕｓｈｉＩＬ１５＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃６）、それぞれの塩基配列から発現するタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列において、あるいは配列番号５：ＩＬ１５ＬＳＰを含む融合タンパク質、配列番号７：ｓＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質、配列番号９：ｍｂＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質、配列番号１１：ｓｕｓｈｉＩＬ１５を含む融合タンパク質、それぞれのアミノ酸配列において、マウスの天然のＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ－１５Ｒα全長またはＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列は、上記のような相同性を有するバリアントのアミノ酸配列、あるいはそのようなバリアントに実質的に該当する、ヒトの天然のＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ－１５Ｒα全長もしくはＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列またはそれらのさらなるバリアントに、置き換えることができる。
　ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７は、本発明のＴ細胞の作製に用いるＴ細胞（そのＴ細胞が有するＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７の受容体）と同じ種類の、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えばマウス）に由来するものが好ましい。ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７それぞれの融合タンパク質に含まれる、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７以外の部位（例えばＩＬ－１５Ｒα）についても、本発明のＴ細胞の作製に用いるＴ細胞と同じ種類の、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物に由来するものが好ましい。本発明の一側面において、配列番号４：ＩＬ１５ＬＳＰ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃３）、配列番号６：ｓＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃４）、配列番号８：ｍｂＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃５）、配列番号１０：ｓｕｓｈｉＩＬ１５＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃６）、配列番号１２：ＩＬ－１８＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃７）、配列番号１４：ＩＬ－２１＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃８）、配列番号１６：ｓｃＩＬ２７＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃９）、それぞれの塩基配列から発現するタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列において、あるいは配列番号５：ＩＬ１５ＬＳＰを含む融合タンパク質、配列番号７：ｓＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質、配列番号９：ｍｂＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質、配列番号１１：ｓｕｓｈｉＩＬ１５を含む融合タンパク質、配列番号１３：ＩＬ－１８を含む融合タンパク質、配列番号１５：ＩＬ－２１を含む融合タンパク質、配列番号１７：ｓｃＩＬ２７を含む融合タンパク質、それぞれのアミノ酸配列において、マウスの天然のＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１またはＩＬ－２７のアミノ酸配列あるいはＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ－１５Ｒα全長またはＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉのアミノ酸配列は、それぞれのヒトの天然のアミノ酸配列に置き換えることができる。
　（３）ケモカイン
　本発明のＴ細胞が発現するケモカインはＣＣＬ１９である。ＣＣＬ１９は、主にリンパ節の樹状細胞やマクロファージから産生され、その受容体であるＣＣＲ７を介して、Ｔ細胞、Ｂ細胞および成熟した樹状細胞の郵送を惹起する機能を有している。本発明における「ＣＣＬ１９」は、天然のＣＣＬ１９のアミノ酸配列からなるタンパク質（ポリペプチド）の全長のみならず、その一部（機能的な部分ポリペプチド）や、天然のアミノ酸配列に対して一または複数のアミノ酸配列が（好ましくは後述するような相同性を有する範囲で）欠失、置換または付加された、天然のＣＣＬ１９の全長またはその一部のバリアントも包含する。
　本発明のＴ細胞が発現する上述したようなケモカインのアミノ酸配列は、本発明のＴ細胞（ＣＡＲ）の用途、典型的にはがんを治療するための医薬の有効成分としての機能に応じて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および増殖性の向上を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増強に対する効果を考慮しながら、適切なものとすればよい。ヒト由来およびヒト以外の哺乳動物（例えばマウス）由来の天然のＣＣＬ１９のアミノ酸配列は公知であり、ＮＣＢＩ、ＵｎｉＰｒｏｔなどのデータベースにも登録されているので、その情報を本発明でも利用することができる。また、ＣＣＬ１９のバリアントとして公知になっているもののアミノ酸配列の情報を本発明でも利用することができる。
　ＣＣＬ１９のバリアントとしては、例えば、全体としてまたは部分的な領域として、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物由来の天然のＣＣＬ１９のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。本発明の一側面において、配列番号４：ＩＬ１５ＬＳＰ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃３）、配列番号６：ｓＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃４）、配列番号８：ｍｂＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃５）、配列番号１０：ｓｕｓｈｉＩＬ１５＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃６）、配列番号１２：ＩＬ－１８＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃７）、配列番号１４：ＩＬ－２１＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃８）、配列番号１６：ｓｃＩＬ２７＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃９）、それぞれの塩基配列から発現するタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列において、マウスの天然のＣＣＬ１９のアミノ酸配列は、上記のような相同性を有するバリアントのアミノ酸配列、あるいはそのようなバリアントに実質的に該当する、ヒトの天然のＣＣＬ１９のアミノ酸配列またはそのさらなるバリアントに、置き換えることができる。
　ＣＣＬ１９は、本発明のＴ細胞の作製に用いるＴ細胞（そのＴ細胞が有するＣＣＬ１９の受容体）と同じ種類の、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えばマウス）に由来するものまたはそのバリアントが好ましい。
　以下、本発明の医薬について詳細に説明する。
　本発明の医薬は、上述したような本発明のＴ細胞を含有し、必要に応じてその他の成分をさらに含有してもよい。当業者であれば、本発明の医薬を、用途（治療対象）や剤型を考慮しながら、本発明のＴ細胞を使用して適切に調製することができる。
　本発明の医薬は、主として、本発明のＴ細胞が発現しているＣＡＲが標的としている、がん細胞の細胞表面抗原（がん特異抗原）に対応しているがんを治療の対象とする医薬（抗がん剤）である。したがって、ＣＡＲが標的とする抗原を発現しているがん細胞をがん組織内に含んでおり、本発明のＴ細胞によって一定水準の治療効果が認められる限り、本発明の医薬が対象とするがんの種類は特に限定されるものではない。本発明の医薬が対象とし得るがんとしては、例えば、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん（例、メラノーマ、メルケル細胞がん）、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頚部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、直腸がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がん、卵管がん、上咽頭がんなどのがん；骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがん；軟骨肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫；肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫；胚細胞腫瘍；リンパ腫；白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、を挙げることができる。好ましくは、ＮＫ細胞に感受性がある癌腫（メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病等）が挙げられる。より好ましくは、メラノーマ、大腸がん、腎臓がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病が挙げられる。
　本発明の医薬が含有することができるＴ細胞以外の成分としては、例えば、薬学的に許容される添加剤、より具体的には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、潤滑剤などが挙げられる。
　本発明の医薬は、公知のＣＡＲを発現しているＴ細胞と同様の手法で、がんの治療を必要とする対象（がん患者、担癌動物等）に投与して使用することができる。投与方法としては、例えば、腫瘍内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内などへの注射が挙げられる。
　本発明の医薬に含まれる本発明のＴ細胞の量は、用途、剤型および目的とする治療効果などに応じて、例えばがんの種類、位置、重症度、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態などを考慮しながら、適切に調節することができる。例えば、本発明の医薬は、１回の投与において、本発明のＴ細胞が通常１×１０４～１×１０１０個、好ましくは１×１０５～１×１０９個、より好ましくは５×１０６～５×１０８個投与されるよう、製剤化することができる。
　本発明の医薬の投与間隔は特に限定されるものではなく、１回あたりに投与される本発明のＴ細胞の量などを考慮しながら適宜調整することができるが、例えば、１日４回、３回、２回もしくは１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回または月２回、独立して投与することができる。
　本発明の医薬（抗がん剤）は、公知の抗がん剤と併用することができる。抗がん剤としては、例えば、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジンなどのアルキル化薬；ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、エノシタビンなどの代謝拮抗薬；リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブなどの分子標的薬；イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブなどのキナーゼ阻害剤；ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤；シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害薬；イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣなどの抗がん性抗生物質；イリノテカン、エトポシドなどの植物アルカロイド；シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどのプラチナ製剤；タモキシフェン、ビカルダミドなどのホルモン療法薬；インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブなどの免疫制御薬；を挙げることができる。
　本発明の医薬と他の抗がん剤とを併用する場合、（ａ）他の抗がん剤を使用した後に本発明の医薬を使用する、（ｂ）本発明の医薬と他の抗がん剤とを同時に使用する、（ｃ）本発明の医薬を使用した後に他の抗がん剤を使用する、のいずれの形態であってもよい。本発明の医薬と他の抗がん剤と併用した場合、がんの治療効果がより向上するとともに、本発明の医薬および／または他の抗がん剤それぞれの投与回数または投与量を減らすことで、それぞれの抗がん剤による副作用を低減させることが可能になるものと期待される。
　以下、本発明の発現ベクターについて詳細に説明する。
　本発明の発現ベクターは、（１）ＣＡＲをコードする核酸、（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種をコードする核酸、ならびに（３）ＣＣＬ１９をコードする核酸、を含む。
　本発明において、発現ベクターが「ＩＬ－１５をコードする核酸を含む」とは、天然の完全長のＩＬ－１５タンパク質をコードする核酸を含むことだけでなく、前述したような種々の実施形態をとっているＩＬ－１５を包含する。発現ベクターが「ＩＬ－１８をコードする核酸を含む」、「ＩＬ－２１をコードする核酸を含む」、「ＩＬ－２７をコードする核酸を含む」、「ＣＣＬ１９をコードする核酸を含む」についても同様である。
　「核酸」とは、ヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体を挙げることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。また、核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。また二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
　ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、あるいは細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよい。ヌクレオチド類似体としては、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等が挙げられる。
　糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、２’－Ｏ－メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－[２－(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックド人工核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）、およびエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］が挙げられ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am．Chem. Soc., 123， 4653 (2001)］、およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J．Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)］等を挙げることができる。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’－Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等を挙げることができる［細胞工学， 16, 1463-1473 (1997)］［RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)］。
　核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、その具体例としては、５’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６－ＦＡＭ付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等を挙げることができる。
　本発明の発現ベクターは、Ｔ細胞またはその前駆体と接触させて細胞内に導入し、そこにコードされた所定のタンパク質（ポリペプチド）をＴ細胞において発現させることにより、本発明のＴ細胞を作製することができるものであればよく、どのような実施形態であるかは特に限定されるものではない。当業者であれば、所望のタンパク質（ポリペプチド）をＴ細胞において発現させることのできる発現ベクターを設計し、作製することが可能である。
　本発明の発現ベクターは、直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。
　ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを挙げることができる。好ましいレトロウイルスベクターとしては、例えば、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada k et al., ClinCancer Res 18:6436-6445(2002)）およびｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）を挙げることができる。レトロウイルスベクターを用いた場合、そのベクターに含まれる遺伝子はホスト細胞（本発明ではＴ細胞）のゲノムへ取り込まれるため、長期間、安定的に遺伝子を発現させることが可能である。
　本発明の一実施形態では、１つの発現ベクターに、（１）ＣＡＲをコードする核酸、（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種をコードする核酸、ならびに（３）ＣＣＬ１９をコードする核酸、の全ての要素が含まれている。本発明の他の一実施形態では、第１の発現ベクターに上記（１）～（３）のうちの１つまたは２つの要素が含まれ、第２の発現ベクターに残りの要素が含まれる。本発明の他の一実施形態では、第１の発現ベクターに上記（１）が含まれ、第２の発現ベクターに上記（２）が含まれ、第３の発現ベクターに上記（３）が含まれる。したがって、本発明の発現ベクターは、実施形態によって、複数の発現ベクターの組み合わせ（セット）、すなわち上記第１および第２の発現ベクターの組み合わせ、または上記第１、第２および第３の発現ベクターの組み合わせ、を意味する場合がある。１つの発現ベクターに複数の要素が含まれる場合、上流側から下流側に向けてどの順序でそれらの要素が配置されるかは特に限定されるものではない。
　本発明の発現ベクターが含む所定の３要素（ＣＡＲ、サイトカインおよびケモカイン）の塩基配列は、各要素としてどのようなタンパク質（ポリペプチド）を選択するかに応じて、そのタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列をコードするよう設計すればよい。発現ベクターが含む核酸（オリゴヌクレオチド）は、化学的なオリゴＤＮＡ合成反応により作製してもよいし、ｃＤＮＡとして作製（クローニング）してもよい。
　本発明の発現ベクターは、上記所定の要素をコードする配列（遺伝子）に加えて、必要に応じて（上述したように複数の発現ベクターの組み合わせについては、それぞれの発現ベクターが独立して）、各遺伝子の発現に関与する、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）等の配列を含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態において、上記３つの要素のうち２つ以上が１つの発現ベクターに含まれている場合、各要素の間に、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）またはＩＲＥＳ（Internal Ribozyme Entry Site）をコードする遺伝子が挿入されていてもよい。
　２Ａペプチドは、ウイルス由来の自己切断型ペプチドであり、アミノ酸配列中の所定の位置（Ｃ末端から１残基の位置）が小胞体で切断されるという特徴を有する（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5(5):627-638(2005)）。そのため、２Ａペプチドを介してその前後に組み込まれた遺伝子は、細胞内で互いに独立して発現することとなる。２Ａペプチドとしては、例えば、ピコルナウイルス、ロタウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス又はトリパノソーマウイルスに由来するものが挙げられる。
　本発明の発現ベクターはさらに、レポーター遺伝子（代表的には蛍光タンパク質をコードする遺伝子）、薬剤選択遺伝子、自殺遺伝子などの“機能的遺伝子”をコードする核酸（塩基配列）を含んでいてもよい。
　機能的遺伝子として「薬剤耐性遺伝子」を用いた場合、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法において、所定の薬剤を培地に添加することにより、薬剤耐性遺伝子を含む本発明の発現ベクターが導入された細胞を選別することが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、いずれか１種を用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　機能的遺伝子として「蛍光タンパク質をコードする遺伝子」を用いた場合、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法において、蛍光顕微鏡を用いて本発明の発現ベクターが導入されたＴ細胞を観察したり、フローサイトメーター（セルソーター）によって本発明の発現ベクターが導入された細胞を選別したりすることが可能となる。レポーター遺伝子の代表例としては蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「蛍光タンパク質をコードする遺伝子」としては、例えば、Sirius、BFP、EBFPなどの青色蛍光タンパク質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光タンパク質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPerなどの緑色蛍光タンパク質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光タンパク質；KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光タンパク質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberryなどの赤色蛍光タンパク質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光タンパク質が挙げられる。これらの遺伝子は、いずれか１種を用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。２種以上の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を利用する場合、その蛍光タンパク質の発光波長を異なるものとすれば、互いの視認性を妨げないため好ましい。
　機能的遺伝子として「自殺遺伝子」を用いた場合、がんの治療経過に応じて、例えば腫瘍が消失した段階で、自殺遺伝子の機能を活性化する薬剤を投与することにより、生体内の本発明のＴ細胞の数を制御することが可能となる。自殺遺伝子としては、例えば、ジフテリアＡ毒素、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）、カルボキシルエステラーゼ（CA）、シトシンデアミナーゼ（CD）、チトクロームP450（cyt-450）、デオキシシチジンキナーゼ（dCK）、ニトロレダクターゼ（NR）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）、チミジンホスホリラーゼ（TP）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（VZV-TK）、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）、または誘導性カスパーゼ９（inducible caspase 9）をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、いずれか１種を用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。それぞれの自殺遺伝子の機能を活性化する薬剤は公知であり、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ（HSV-TK）に対してはガンシクロビル、誘導性カスパーゼ９（inducible caspase 9）に対しては二量体誘導化合物であるＡＰ１９０３が挙げられる。
　以下、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法について詳細に説明する。
　本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法は、上述したような本発明の発現ベクターをＴ細胞に導入する工程（以下「発現ベクター導入工程」と呼ぶ。）を含む。
　発現ベクターをＴ細胞に導入するための手法は、発現ベクターに実施形態に応じた適切なものとすることができる。例えば、ウイルス感染法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法により、発現ベクターをＴ細胞に導入することができる。本発明の発現ベクターは、公知の手段によって、また適宜市販のキットを用いて（その指示書に従って）、各手法における使用に適した形態に調製することができる。発現ベクター導入工程では、そのような調製物をＴ細胞に接触させる、一般的には発現ベクターを含む調製物を添加した培地中でＴ細胞を培養するようにすればよい。
　本発明の好ましい一実施形態において、本発明の発現ベクターは、ウイルス感染法によりＴ細胞に導入される。例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターの各ウイルスベクターに対応した市販のキットを用いて、本発明のベクターおよび各ウイルスのパッケージングベクター（プラスミド）を宿主細胞、にトランスフェクションして組換えウイルスを作製した後、得られた組換えウイルスをＴ細胞に感染させる方法を挙げることができる。市販のウイルスベクター用キットとしては、例えばRetrovirus packagin Kit Eco（タカラバイオ社製）が挙げられる。宿主細胞としては、例えばＧＰ２－２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ－ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）などが挙げられる。
　本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法では、発現ベクター導入工程の前後に、その他の工程をさらに含んでいてもよい。その他の工程としては、例えば、Ｔ細胞の培養工程や、発現ベクターに含めた機能的遺伝子を機能させる処理を含む工程が挙げられる。
　本発明の発現ベクターを導入する対象となるＴ細胞は、通常はin vitroの環境下で、公知の手法によりあらかじめ培養しておくことができる。例えば、ヒトまたは非ヒト動物から採取された、血液、骨髄液などの体液；脾臓、胸腺、リンパ節などの組織；または原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水などのがん組織から、常法に従ってＴ細胞を単離、精製した後、適切な培地でＴ細胞を培養しておき、その培地に本発明の発現ベクター（を含有する調製物）を添加するようにしてもよい。あるいは、あらかじめｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞その他の多能性幹細胞から適切な分化誘導工程を経てＴ細胞（またはその前駆体）を作製しておき、その培地に本発明の発現ベクター（を含有する調製物）を添加するようにしてもよい。
　また、本発明の発現ベクターが機能的遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含むものである場合、その発現ベクターが導入されたＴ細胞を選別するために、発現ベクター導入工程の後に、用いた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を培地に添加してＴ細胞を培養する工程を行うことができる。薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤の使用条件、例えば培地中の濃度や培養期間などは、当業者であれば適切に調整することができる。
　本発明の発現ベクターが機能的遺伝子として蛍光タンパク質をコードする遺伝子（レポーター遺伝子）を含むものである場合、発現ベクター導入工程の後に、発現ベクターが導入されたＴ細胞を蛍光顕微鏡によって観察する工程や、発現ベクターが導入されたＴ細胞をセルソーターで選別する工程を行うことができる。蛍光顕微鏡による観察やセルソーターによる選別の際の条件、例えば蛍光タンパク質に対応した励起波長の光の照射や発光波長の光の検出などは、当業者であれば適切に調整することができる。
　以下の実施例におけるＣＡＲは、ヒトＣＤ２０を標的とするＣＡＲ、具体的には抗ヒトＣＤ２０ｓｃＦｖ、マウスＣＤ８細胞膜貫通領域およびマウスＣＤ２８＿４－１ＢＢ＿ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフからなる抗ヒトＣＤ２０ＣＡＲである。また、以下の実施例におけるサイトカインは、マウスＩＬ－１５（「ＩＬ１５ＬＳＰ」、「ｓＩＬ１５ＲＡ」、「ｍｂＩＬ１５ＲＡ」または「ｓｕｓｈｉＩＬ１５」）；マウスＩＬ－１８；マウスＩＬ－２１；マウスＩＬ－２７（ｐ２８およびＥＢＩ３）を含む一本鎖タンパク質「ｓｃＩＬ２７」のいずれかである。以下の実施例におけるケモカインは、マウスＣＣＬ１９である。これらのＣＡＲ、サイトカインおよびケモカインを発現するマウス由来のＴ細胞を下記のようにして作製した後、試験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［実施例１－１］ＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞
　ベクター作製工程では、まずステップ１により、３種類のＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片１～３）を人工的に合成し、その後ステップ２により、上記３種類のＤＮＡ断片を用いて、所定のＣＡＲ、サイトカインおよびケモカインをコードする遺伝子を全て含む１つの発現ベクターを作製した。続いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程では、まずステップ１により上記発現ベクターを用いてレトロウイルスベクターを調製し、その後ステップ２によりそのレトロウイルスベクター調製物を用いてマウスＴ細胞に上記所定の遺伝子を形質導入した。
　［Ａ：ベクター作製工程］IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの作製
　ステップ１：ＤＮＡ断片の合成
　ＤＮＡ断片＃１：抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲを含むＤＮＡ断片
　抗ヒトＣＤ２０ｓcＦｖ、マウスＣＤ８貫通領域、およびマウスＣＤ２８＿４－１ＢＢ＿ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフからなる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃１）を人工合成した。ＤＮＡ断片＃１全体の塩基配列を配列番号１（図７）に示す。配列番号１において、３～７８５番目の塩基が抗ヒトＣＤ２０ｓｃＦｖをコードする配列、７９５～１０４０番目の塩基がマウスＣＤ８細胞膜貫通領域をコードする配列、１０４１～１６３７番目の塩基がマウスＣＤ２８＿４－１ＢＢ＿ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフをコードする配列（そのうち１０４１～１１６３番目の塩基がマウスＣＤ２８の細胞内領域をコードし、１１６４～１２９８番目の塩基がマウス４－１ＢＢの細胞内領域をコードし、１２９９～１６３７番目の塩基がマウスＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドをコードする）である。ＤＮＡ断片＃１の３～１６３７番目の塩基配列によって発現する融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　ＤＮＡ断片＃２：終止コドンおよびマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ断片
　終止コドンの塩基配列およびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の塩基配列を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃２）を人工合成した。ＤＮＡ断片＃２全体の塩基配列を配列番号３（図８）に示す。
　ＤＮＡ断片＃３：ＩＬ１５ＬＳＰおよびＣＣＬ１９用ＤＮＡ断片
　自己切断型ペプチドである２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、マウスＩＬ－２シグナルペプチド（ＩＬ－２ＳＰ）、マウスＩＬ－１５コンストラクト「ＩＬ１５ＬＳＰ」（ＩＬ－１５ＬＳＰおよびＩＬ－１５からなる融合ペプチド）、Ｆ２Ａ、ならびにマウスＣＣＬ１９をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃３）を人工合成した。ＤＮＡ断片＃３全体の塩基配列を配列番号４（図９）に示す。配列番号４において、７～８１番目の塩基が第１のＦ２Ａをコードする配列、８２～１６８番目の塩基がマウスＩＬ－１５ＬＳＰをコードする配列、１６９～５６７番目の塩基がマウスＩＬ－１５（終止コドンを除く）をコードする配列、５６８～６４２番目の塩基が第２のＦ２Ａをコードする配列、６４６～９６９番目の塩基がマウスＣＣＬ１９をコードする配列である。ＤＮＡ断片＃３の７～９６９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ＩＬ１５ＬＳＰを含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
　ステップ２：レトロウイルス発現ベクターの作製
　ＤＮＡ断片＃１およびＤＮＡ断片＃２を連結してコンストラクト（抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿ＭＣＳ）を作製した。得られたコンストラクトを、制限酵素（Ｎｃｏ　ＩおよびＳａｌ　Ｉ）処理によりｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）に組み込んで、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿ＭＣＳ含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクターを作製した。
　次に、ＤＮＡ断片＃１の１３３７～１６３７番目の塩基配列およびＤＮＡ断片＃３を連結したコンストラクトを作製した。得られたコンストラクトを、制限酵素（Ｓｂｆ　ＩおよびＳａｌ　Ｉ）処理により抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿ＭＣＳ含有ｐＭＳＧＶレトロウイルスベクターに組み込み、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿Ｆ２Ａ＿ＩＬ１５ＬＳＰ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）を作製した。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造
　ステップ１：レトロウイルスの調製
　リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、前記ベクター作製工程により得られたIL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターを、ｐＣＬ－Ｅｃｏプラスミド（Novus biologicals社）と共に、ＧＰ２－２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社）にトランスフェクションした。なお、ＧＰ２－２９３パッケージング細胞株の培養液としては、１０％の非働化済ＦＢＳおよび抗生物質を加えたＤＭＥＭを用いた。トランスフェクションから４８時間後、ＧＰ２－２９３パッケージング細胞株の培養液の上清を回収し、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター調製物とした。
　ステップ２：マウスＴ細胞の形質導入
　マウスの脾臓及びリンパ節由来の３×１０６個の精製したマウスＴ細胞を、固相化した抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ）、抗マウスＣＤ２８モノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）およびＩＬ－２の存在下で４８時間活性化した。続いて、２５μｇ／ｍＬのレトロネクチン（登録商標：タカラバイオ社）を固相化したプレートのウェル内で、ステップ１で得られたIL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター含有調製物（ＧＰ２－２９３細胞培養液上清）と、上記のように活性化させたマウスＴ細胞とを混合し、１５００ｒｐｍで２時間遠心後、ＩＬ－２の存在下で６時間培養した。培養液からレトロウイルスを除去するため、マウスＴ細胞を回収し、ＩＬ－２を含有する新しいｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＲＰＭＩ培地に移し、さらに４２時間培養することで、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターが導入された、すなわち抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ、ＩＬ１５ＬＳＰおよびＣＣＬ１９を発現するマウスＴ細胞（IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書において「ＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞」と呼ぶ。）を得た。
　なお、上記Ｔ細胞の培養に用いた「ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＲＰＭＩ培地」は、非働化済１０％ＦＢＳ、抗生物質、５０ｍＭの２－メルカプトエタノール、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を加えたＲＰＭＩ－１６４０培地である。以下、Ｔ細胞の培養液としては、必要に応じて別途記載した成分をさらに添加した、ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＲＰＭＩ培地を用いた。
　［実施例１－２］ｓＩＬ１５ＲＡ（分泌型IL-15/IL-15RA融合タンパク）×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞
　［Ａ：ベクター作製工程］sIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの作製
　実施例１－１のステップ１と同様のＤＮＡ断片＃１およびＤＮＡ断片＃２と、ＤＮＡ断片＃３に代えて下記のようなＤＮＡ断片＃４とを用いて、実施例１－１のステップ２と同様にしてコンストラクトを作製した後、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿Ｆ２Ａ＿ｓＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（sIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）を得た。
　ＤＮＡ断片＃４：ｓＩＬ１５ＲＡおよびＣＣＬ１９用ＤＮＡ断片
　Ｆ２Ａ、マウスＩＬ－２ＳＰ、マウスＩＬ－１５コンストラクト「ｓＩＬ１５ＲＡ」（ＩＬ－１５、リンカーおよびＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインからなる融合ペプチド）、Ｆ２Ａ、ならびにマウスＣＣＬ１９をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃４）を合成した。ＤＮＡ断片＃４全体の塩基配列を配列番号６（図１０）に示す。配列番号６において、７～８１番目の塩基が第１のＦ２Ａをコードする配列、８２～１４１番目の塩基がマウスＩＬ－２ＳＰをコードする配列、１４２～１１３７番目の塩基がｓＩＬ１５ＲＡをコードする配列（そのうち１４２～５４０番目の塩基がマウスＩＬ－１５（シグナル配列および終止コドンを除く）をコードし、５４１～６１８番目の塩基がリンカーであり、６１９～１１３７番目の塩基がマウスＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインをコードする）、１１３８～１２１２番目の塩基が第２のＦ２Ａをコードする配列、１２１６～１５３９番目の塩基がマウスＣＣＬ１９をコードする配列である。ＤＮＡ断片＃４の７～１５３９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｓＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］sIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造
　レトロウイルス発現ベクターとして、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの代わりに上記ベクター作製工程により得られたsIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターを用いたこと以外は実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程と同様にして、ステップ１においてレトロウイルス含有調製物を得て、ステップ２においてそのレトロウイルスに含まれる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ、ｓＩＬ１５ＲＡおよびＣＣＬ１９の各遺伝子が発現したマウスＴ細胞（sIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書においてｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞）を得た。
　［実施例１－３］ｍｂＩＬ１５ＲＡ（膜結合型IL-15/IL-15RA融合タンパク）×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞
　［Ａ：ベクター作製工程］mbIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの作製
　実施例１－１のステップ１と同様のＤＮＡ断片＃１およびＤＮＡ断片＃２と、ＤＮＡ断片＃３に代えて下記のようなＤＮＡ断片＃５とを用いて、実施例１－１のステップ２と同様にしてコンストラクトを作製した後、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿Ｆ２Ａ＿ｍｂＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（mbIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）を得た。
　ＤＮＡ断片＃５：ｍｂＩＬ１５ＲＡおよびＣＣＬ１９用ＤＮＡ断片
　Ｆ２Ａ、マウスＩＬ－２ＳＰ、マウスＩＬ－１５のコンストラクト「ｍｂＩＬ１５ＲＡ」（ＩＬ－１５、リンカーおよび全長のＩＬ－１５Ｒαからなる融合ペプチド）、Ｆ２Ａ、ならびにマウスＣＣＬ１９をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を合成した。このＤＮＡ断片＃５全体の塩基配列を配列番号８（図１１）に示す。配列番号８において、７～８１番目の塩基が第１のＦ２Ａをコードする配列、８２～１４１番目の塩基がマウスＩＬ－２ＳＰをコードする配列、１４２～１３１１番目の塩基がｍｂＩＬ１５ＲＡをコードする配列（そのうち１４２～５４０番目の塩基がマウスＩＬ－１５（シグナル配列および終止コドンを除く）をコードし、５４１～６１８番目の塩基がリンカーであり、６１９～１３１１番目の塩基がマウスＩＬ－１５Ｒα（全長）をコードする）、１３１２～１３８６番目の塩基が第２のＦ２Ａをコードする配列、１３９０～１７１３番目の塩基がマウスＣＣＬ１９をコードする配列である。ＤＮＡ断片＃５の７～１７１３番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｍｂＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号９に示す。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］mbIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造
　レトロウイルス発現ベクターとして、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの代わりに上記ベクター作製工程により得られたmbIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターを用いたこと以外は実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程と同様にして、ステップ１においてレトロウイルス含有調製物を得て、ステップ２においてそのレトロウイルスに含まれる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ、ｍｂＩＬ１５ＲＡおよびＣＣＬ１９の各遺伝子が発現したマウスＴ細胞（mbIL15RA_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書において「ｍｂＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞」と呼ぶ。）を製造した。
　［実施例１－４］ｓｕｓｈｉＩＬ１５（分泌型IL-15RA/IL-15融合タンパク）×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞
　［Ａ：ベクター作製工程］sushiIL15_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの作製
　実施例１－１のステップ１と同様のＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片２と、ＤＮＡ断片＃３に代えて下記のようなＤＮＡ断片＃６とを用いて、実施例１－１のステップ２と同様にしてコンストラクトを作製した後、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿Ｆ２Ａ＿ｓｕｓｈｉＩＬ１５＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（sushiIL15_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）を得た。
　ＤＮＡ断片＃６：ｓｕｓｈｉＩＬ１５およびＣＣＬ１９用ＤＮＡ断片
　Ｆ２Ａ、マウスＩＬ－１５コンストラクト「ｓｕｓｈｉＩＬ１５」（ＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン、リンカーおよびＩＬ－１５からなる融合ペプチド）、Ｆ２Ａ、ならびにマウスＣＣＬ１９をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を合成した。このＤＮＡ断片＃６全体の塩基配列を配列番号１０（図１２）に示す。配列番号１０において、７～８１番目の塩基が第１のＦ２Ａをコードする配列、８２～７７７番目の塩基がｓｕｓｈｉＩＬ１５をコードする配列（そのうち８２～３７５番目の塩基がマウスＩＬ－１５ＲαのＳＰおよびｓｕｓｈｉドメインをコードし、３７６～４３５番目の塩基がリンカーであり、４３６～７７７番目の塩基がマウスＩＬ－１５（シグナル配列およびプロペプチドを除く）をコードする）、７７８～８５２番目の塩基が第２のＦ２Ａをコードする配列、８５６～１１７９番目の塩基がマウスＣＣＬ１９をコードする配列である。ＤＮＡ断片＃６の７～１１７９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｓｕｓｈｉＩＬ１５を含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］sushiIL15_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造
　レトロウイルス発現ベクターとして、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの代わりに上記ベクター作製工程により得られたsushiIL15_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター用いたこと以外は実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程と同様にして、ステップ１においてレトロウイルス含有調製物を得て、ステップ２においてそのレトロウイルスに含まれる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ、sushiＩＬ１５およびＣＣＬ１９の各遺伝子が発現したマウスＴ細胞（sushiIL15_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書において「ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞」と呼ぶ。）を得た。
　［実施例２］ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞
　［Ａ：ベクター作製工程］IL18_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの作製
　実施例１－１のステップ１と同様のＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片２と、ＤＮＡ断片＃３に代えて下記のようなＤＮＡ断片＃７とを用いて、実施例１－１のステップ２と同様にしてコンストラクトを作製した後、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿Ｆ２Ａ＿ＩＬ－１８＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（IL18_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）を得た。
　ＤＮＡ断片＃７：ＩＬ－１８およびＣＣＬ１９用ＤＮＡ断片
　第１のＦ２Ａ、マウスＩＬ－１８、第２のＦ２Ａ、およびマウスＣＣＬ１９をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を人工合成した。このＤＮＡ断片＃７全体の塩基配列を配列番号１２（図１３）に示す。配列番号１２において、７～８１番目の塩基が第１のＦ２Ａをコードする配列、８２～６５７番目の塩基がマウスＩＬ－１８をコードする配列、６５８～７３２番目の塩基が第２のＦ２Ａをコードする配列、７３６～１０５９番目の塩基がマウスＣＣＬ１９をコードする配列である。ＤＮＡ断片＃７の７～１０５９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する融合タンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］IL18_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造
　レトロウイルス発現ベクターとして、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの代わりに上記ベクター作製工程により得られたIL18_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターを用いたこと以外は実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程と同様にして、ステップ１においてレトロウイルス含有調製物を得て、ステップ２においてそのレトロウイルスに含まれる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ、ＩＬ－１８およびＣＣＬ１９の各遺伝子が発現したマウスＴ細胞（IL18_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書において「ＩＬ１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞」と呼ぶ。）を得た。
　［実施例３］ＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞
　［Ａ：ベクター作製工程］IL21_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの作製
　実施例１－１のステップ１と同様のＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片２と、ＤＮＡ断片＃３に代えて下記のようなＤＮＡ断片＃８とを用いて、実施例１－１のステップ２と同様にしてコンストラクトを作製した後、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿Ｆ２Ａ＿ＩＬ－２１＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（IL21_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）を得た。
　ＤＮＡ断片＃８：ＩＬ－２１およびＣＣＬ１９用ＤＮＡ断片
　第１のＦ２Ａ、マウスＩＬ－２１、第２のＦ２Ａ、およびマウスＣＣＬ１９をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を人工合成した。このＤＮＡ断片＃８全体の塩基配列を配列番号１４（図１４）に示す。配列番号１４において、７～８１番目の塩基が第１のＦ２Ａをコードする配列、８２～５６７番目の塩基がマウスＩＬ－２１をコードする配列、５６８～６４２番目の塩基が第２のＦ２Ａをコードする配列、６４６～９６９番目の塩基がマウスＣＣＬ１９をコードする配列である。ＤＮＡ断片＃８の７～９６９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する融合タンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］IL21_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造
　レトロウイルス発現ベクターとして、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの代わりに上記ベクター作製工程により得られたIL21_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターを用いたこと以外は実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程と同様にして、ステップ１においてレトロウイルス含有調製物を得て、ステップ２においてそのレトロウイルスに含まれる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ、ＩＬ－２１およびＣＣＬ１９の各遺伝子が発現したマウスＴ細胞（IL21_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書において「ＩＬ２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞」と呼ぶ。）を得た。
　［実施例４］ｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞
　［Ａ：ベクター作製工程］scIL27_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの作製
　実施例１－１のステップ１と同様のＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片２と、ＤＮＡ断片＃３に代えて下記のようなＤＮＡ断片＃９とを用いて、実施例１－１のステップ２と同様にしてコンストラクトを作製した後、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿Ｆ２Ａ＿ｓｃＩＬ－２７＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（scIL27_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）を得た。
　ＤＮＡ断片＃９：ｓｃＩＬ２７およびＣＣＬ１９用ＤＮＡ断片
　第１のＦ２Ａ、マウスＩＬ－２７コンストラクト「ｓｃＩＬ２７」（ｐ２８、リンカーおよびＥＢＩ３からなる融合ペプチド）、第２のＦ２Ａ、ならびにＣＣＬ１９をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を人工合成した。このＤＮＡ断片＃９全体の塩基配列を配列番号１６（図１５）に示す。配列番号１６おいて、７～８１番目の塩基が第１のＦ２Ａをコードする配列、８２～１４３７番目の塩基がｓｃＩＬ２７をコードする配列（そのうち８２～７６５番目の塩基がマウスＥＢＩ３をコードし、７６６～８１９番目の塩基がリンカーであり、８２０～１４３７番目の塩基がマウスｐ２８をコードする）、１４３８～１５１２番目の塩基が第２のＦ２Ａをコードする配列、１５１６～１８３９番目の塩基がマウスＣＣＬ１９をコードする配列である。ＤＮＡ断片＃９の７～１８３９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｓｃＩＬ２７を含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］scIL27_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造工程
　レトロウイルス発現ベクターとして、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの代わりに上記ベクター作製工程により得られたscIL27_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターを用いたこと以外は実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程と同様にして、ステップ１においてレトロウイルス含有調製物を得て、ステップ２においてそのレトロウイルスに含まれる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ、ｓｃＩＬ２７およびＣＣＬ１９の各遺伝子が発現したマウスＴ細胞（scIL27_CCL19_抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書において「ｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞」と呼ぶ。）を得た。
　［比較例１］ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（－）Ｔ細胞
　レトロウイルスベクターの作製およびそれを用いたＴ細胞へのトランスフェクションを行わず、実施例１－１の工程Ｂステップ２において、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクター調製物を用いるかわりにGP2-293細胞培養に用いるDMEM培地を等量加えたこと以外は同様の手順で、活性化のみ行ったマウスＴ細胞（本明細書において「ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（－）Ｔ細胞」と呼ぶ。）を製造した。
　［比較例２］ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞
　［Ａ：ベクター作製工程］抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ発現ベクターの作製
　実施例１－１の工程Ａステップ２の途中までと同様の手順で、ＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断片２およびｐＭＳＧＶレトロウイルスベクターを用いて、抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ＿ＭＣＳ含有ｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクターを作製した。これを、サイトカインおよびケモカインを共発現させない、コントロール用のレトロウイルス発現ベクター（抗ヒトCD20 CAR発現ベクター）として用いた。
　［Ｂ：ＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程］抗ヒトCD20 CAR-T細胞の製造
　レトロウイルス発現ベクターとして、IL15LSP_CCL19_抗ヒトCD20 CAR発現ベクターの代わりに抗ヒトCD20 CAR発現ベクターを用いたこと以外は実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞製造工程と同様にして、ステップ１においてレトロウイルス含有調製物を得て、ステップ２においてそのレトロウイルスに含まれる抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲのみを発現する（サイトカインおよびケモカインを発現しない）マウスＴ細胞（抗ヒトCD20 CAR-T細胞、本明細書において「ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞」と呼ぶ。）を得た。
　［試験例１］導入したＣＡＲ、サイトカインおよびケモカインの発現レベルの確認
　［Ａ：フローサイトメトリーによるＣＡＲの発現測定］
　上記実施例および比較例で製造したＴ細胞を用いて、細胞表面における抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲの発現レベルを、下記のようなフローサイトメトリーによって解析した。
　なお、フローサイトメトリーにはフローサイトメーター「ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｎｔｏTM　ＩＩ」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用い、データ解析にはＦｌｏｗＪｏ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた。
　ビオチン標識したプロテインＬ（抗ヒトＣＤ２０ｓｃＦｖのκ軽鎖と特異的に結合する）およびBrilliant VioletTM 421（ＢＶ４２１）結合ストレプトアビジンを用いて各Ｔ細胞を処理し、ＣＡＲの発現を検出した。同時に、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗マウスＣＤ８モノクローナル抗体（BioLegend社）を用いて各Ｔ細胞集団中のＣＤ８陽性率を測定した。一般的にＣＤ８陽性Ｔ細胞が直接の細胞傷害活性を有すると考えられるため、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在（陽性率）を示すことにより効力（potency）の裏付けとすることができる。
　結果を図１に示す。全ての実施例（および比較例２）のＣＡＲ－Ｔ細胞について、細胞集団中の６０％以上の細胞で抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲが発現している（陽性である）ことが確認された。
　［Ｂ：サイトカインおよびケモカインの分泌量の測定］
　形質導入から４２時間後の各Ｔ細胞の培養上清を回収し、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７およびＣＣＬ１９の濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＬ－１８のみＭＢＬ社、それ以外はＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。
　結果を図２に示す。ＩＬ－１５に関して（図２Ａ）、実施例１－１のＣＡＲ－Ｔ細胞（15LSPx19 CAR-T）の培養上清からは、ＩＬ－１５が２５０ｐｇ／ｍＬの濃度で検出された。一方、実施例１－２（s15RAx19 CAR-T）、実施例１－３（mb15RAx19 CAR-T）および実施例１－４（sushi15x19 CAR-T）のＣＡＲ－Ｔ細胞の培養上清中のＩＬ－１５の濃度は、形質導入していない活性化Ｔ細胞（transduction (-)：比較例１）およびコントロールの抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ発現Ｔ細胞（conv. CAR-T：比較例２）と同程度であり、試験例１で用いた上記ＥＬＩＳＡキットではＩＬ－１５の分泌は認められなかった。ただし、後述する試験例２において実施例１－２、実施例１－３および実施例１－４は顕著な細胞増殖効果を示していることから、これらの実施例においても実施例１－１と同様にＩＬ－１５が発現・分泌されていると解される。
　ＩＬ－１８に関して（図２Ｂ）、実施例２のＣＡＲ－Ｔ細胞（18x19 CAR-T）の培養上清からは、ＩＬ－１８が１５０ｐｇ／ｍＬ以上の濃度で検出された。一方、コントロールの抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ発現Ｔ細胞（conv. CAR-T：比較例２）からの培養上清中への分泌量は、形質導入していない活性化Ｔ細胞（transduction (-)：比較例１）と同程度の微量であった。
　ＩＬ－２１に関して（図２Ｃ）、実施例３のＣＡＲ－Ｔ細胞（21x19 CAR-T）の培養上清からは、ＩＬ－１８が４００ｐｇ／ｍＬ以上の濃度で検出された。一方、コントロールの抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ発現Ｔ細胞（conv. CAR-T：比較例２）からの分泌量は、形質導入していない活性化Ｔ細胞（transduction (-)：比較例１）とともに、検出限界以下（Not Detected）であった。
　ＩＬ－２７に関して（図２Ｄ）、実施例４のＣＡＲ－Ｔ細胞（sc27x19 CAR-T）の培養上清からは、ＩＬ－２７のサブユニットであるｐ２８が２５０ｐｇ／ｍＬ以上の濃度で検出された。一方、コントロールの抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ－Ｔ細胞（conv. CAR-T：比較例２）からの分泌量は、形質導入していない活性化Ｔ細胞（transduction (-)：比較例１）と同程度（培養上清中の濃度５０ｐｇ／ｍＬ前後）であった。
　ＣＣＬ１９に関して（図２Ｅ）、コントロールの抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲ－Ｔ細胞（conv. CAR-T：比較例２）および形質導入していない活性化Ｔ細胞（transduction (-)：比較例１）の培養上清中の濃度は検出限界以下であったのに対し、各実施例のＣＡＲ－Ｔ細胞の培養上清中の濃度は１５０～５００ｐｇ／ｍＬであった。
　［試験例２］ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖能力の評価
　上記実施例および比較例で製造したＴ細胞を用いて、各Ｔ細胞から産生されるサイトカイン（ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７）が生物的な機能を発揮し、免疫誘導効果を示すか否かを、下記のようにしてＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞数および増殖能力を測定することにより検討した。
　各Ｔ細胞をＣｙｔｏＴｅｌｌTM　UltraGreen（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）で染色した後、マイトマイシンＣで処理した、ヒトＣＤ２０を発現するよう遺伝子組換えを行ったＰ８１５マストサイトーマ（hCD20/P815）と同じウェル内で共培養し、刺激を行った。刺激開始から３日間、５日間または７日間培養したのち、細胞を回収し、フローサイトメトリー分析を行った。ＡＰＣ結合抗Ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体（eBioscience社）で染色し、各Ｔ細胞（リンパ球）集団におけるＴｈｙ１．２陽性細胞を生存するＴ細胞とみなして、細胞数を測定した。
　結果を図３に示す。ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（－）Ｔ細胞（比較例１）は、hCD20/P815細胞と共培養しても活性化刺激が起こらず、生細胞数は培養３日目には１／１０以下となった。一方、hCD20/P815細胞と共培養したＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－１）、ｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）、ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）、ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例２）、ＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例３）およびｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例４）はいずれも、培養３日目において、コントロールであるｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞（比較例２）と同等、あるいは同等以上の生細胞数の増殖維持が確認された。さらに、７日まで培養を続けると、特にｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）、ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）は顕著な細胞増殖を示した。ＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－１）、ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例２）、ＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例３）およびｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例４）は、培養３日目から７日目にかけてコントロールであるｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞（比較例２）と同等の細胞数を維持した。
　あわせて、Ｔｈｙ１．２陽性細胞集団中のＣｙｔｏＴｅｌｌ試薬による染色強度のヒストグラム解析を行った。刺激開始５日後の細胞集団についての結果を図４に示す。ＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－１）、ｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）、ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）、ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例２）およびＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例３）は、コントロールであるｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞（比較例２）と比較して、第二世代（１回分裂後）の細胞集団の割合がとくに減少し、また第五世代以降（４回以上の分裂後）の細胞集団の割合が増加していた。
　図３および図４の結果より、特にｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）およびｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）において産生される、IL-15/IL-15Rα融合タンパク質およびCCL-19の組み合わせが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存と増殖を亢進し生物学的な機能を発揮する上で好ましいことが明らかとなった。
　［試験例３］ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の評価
　上記実施例および比較例で製造したＴ細胞を用いて、ターゲット抗原特異的な腫瘍細胞傷害活性を検討した。
　［Ａ：フローサイトメトリーによる腫瘍細胞傷害活性の測定］
　ヒトＣＤ２０を発現するよう遺伝子組換えを行ったＰ８１５マストサイトーマ（hCD20/P815）をターゲット腫瘍細胞とし、そのような遺伝子組換えを行っていないＰ８１５マストサイトーマ（P815）をコントロール腫瘍細胞として用いた。
　前記ターゲット腫瘍細胞またはコントロール腫瘍細胞を採取し、培養プレートに播種したのち、エフェクターＴ細胞として、各実施例のＣＡＲ－Ｔ細胞（ＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－１）、ｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）、ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）、ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例２）、ＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例３）およびｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例４））または比較例２のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞）を加え、７２時間共培養を行った。エフェクターＴ細胞はＣＡＲ陽性細胞数がターゲット腫瘍細胞の１／３量となるように加え（Ｅ：Ｔ比＝１：３）、ＣＡＲ発現率が最も低いＴ細胞の播種数に合わせて、その他のＴ細胞群には形質導入をしていないＴ細胞を添加することで、播種した全Ｔ細胞数が各群で同数となるようにした。７２時間の共培養ののち、全細胞を回収し、フローサイトメトリー解析および生細胞数の測定を行った。ＡＰＣ結合抗Ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体（eBioscience社)およびZombie Green Fixable Viability Kit（BioLegend社）で染色し、生細胞集団中のＴ細胞および腫瘍細胞の割合をＴｈｙ１．２陽性率から算出した。生細胞数は、NucleoCounter NC-200（chemometec社）を用いて測定した。
　結果を図５に示す。図５Ａに示すように、共培養７２時間後のhCD20/P815腫瘍細胞数を生細胞中のThy1.2陰性率から算出したところ、ＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－１）、ｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）、ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）、ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例２）、ＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例３）またはｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例４）と共培養したhCD20/P815腫瘍細胞数はいずれも、ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（－）Ｔ細胞（比較例１）と比較して著しく減少しており、ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞（比較例２）と比較してもより減少しており、生存した腫瘍細胞は１％以下であった。一方、図５Ｂに示すように、ヒトCD20を発現していないP815細胞については、いずれの群でも腫瘍細胞の減少は見られず、ヒトCD20を発現していない腫瘍細胞に対する非特異的な細胞傷害は確認されなかった。
　［Ｂ：ＥＬＩＳＡアッセイによるＩＦＮγ産生測定］
　ターゲット抗原特異的な細胞傷害能力の活性化の指標として、CAR-T細胞から産生されるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を市販のＥＬＩＳＡアッセイキット（R&D社）によって測定した。前述のP815細胞（コントロール腫瘍細胞）またはhCD20-P815細胞（ターゲット腫瘍細胞）と共培養した、各実施例のＣＡＲ－Ｔ細胞（ＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－１）、ｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）、ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）、ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例２）、ＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例３）およびｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例４））または比較例２のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞）の、共培養４日後の培養上清中のＩＦＮγの量を測定した。
　結果を図６に示す。図６Ａに示すように、hCD20-P815細胞と共培養したＩＬ１５ＬＳＰ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－１）、ｓＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－２）、ｍｂＩＬ１５ＲＡ×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－３）、ｓｕｓｈｉＩＬ１５×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例１－４）、ＩＬ－１８×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例２）、ＩＬ－２１×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例３）またはｓｃＩＬ２７×ＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例４）のいずれの培養上清においても、ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ細胞（比較例２）より高く、約１５ｎｇ／ｍＬ以上のＩＦＮγが検出された。ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（－）Ｔ細胞（比較例１）と共培養した群におけるＩＦＮγ産生量は検出限界限界以下であった。一方、図６Ｂに示すように、P815細胞と共培養した各ＣＡＲ発現細胞培養上清中のＩＦＮγの濃度は１０ｐｇ／ｍＬ以下であった。
　以上の試験例３（図５および図６）の結果から、上記各実施例および比較例２のＴ細胞はいずれも、ヒトCD20発現細胞に対する、つまりターゲット抗原特異的な、細胞傷害活性を示すことが確認された。
　［試験例４］マウス腫瘍モデルでの治療効果
　上記実施例１－３および実施例１－４、比較例２で製造したＴ細胞を用いて、マウスメラノーマ腫瘍移植モデル又はマウス大腸がん腫瘍モデルに対する治療効果を下記のような担癌マウスを用いて検討した。
（マウスメラノーマ腫瘍移植モデルでの治療効果）
　ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子組換えを行ったマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０（Ｂ１６Ｆ１０－ｈＣＤ２０）５×１０５個をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮下に接種した。接種後７日目に抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ、５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与し、１０日目に１×１０６個の実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）又は、実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）又は、比較例２（Ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ）を静脈内に投与した。対照群として、ＣＰＡ投与のみを行ったＣＡＲ－Ｔ未治療群、Ｂ１６Ｆ１０－ｈＣＤ２０マウスメラノーマを接種後無処置の非治療群を設定した。マウスの腫瘍体積は１週間に２回測定した。
　マウスメラノーマ腫瘍移植モデルの腫瘍体積の結果を図１６に示す。横軸はマウスにＢ１６Ｆ１０－ｈＣＤ２０を皮下接種した日を０日とした接種後の日数、縦軸は腫瘍体積（腫瘍の長径×（腫瘍の短径）２／２（ｍｍ３））である。標準偏差はそれぞれの実験グループにおいて算出した。「ｎｏ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は無処置、「ＣＰＡ」はＣＰＡ投与のみ、「ＣＰＡ＋Ｃｏｎｖ．」はＣＰＡ投与後に比較例２（Ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ）を投与、「ＣＰＡ＋ｍｂＩＬ１５ＲＡｘ１９」はＣＰＡ投与後に実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）を投与、「ＣＰＡ＋ｓｕｓｈｉＩＬ１５ＲＡｘ１９」はＣＰＡ投与後に実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）を投与したグループである。
　図１６に示すように、実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）及び、実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）を投与した場合には、比較例２（Ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ）を投与した場合や無処置群（ｎｏ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）およびＣＰＡ投与のみの場合と比較して腫瘍体積の減少効果が確認された。したがって、実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）及び、実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）はマウスメラノーマ腫瘍モデルにおいて優れた抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。
（マウス大腸がん腫瘍移植モデルでの治療効果）
　ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子組換えを行ったマウス大腸がんＭＣ３８（ＭＣ３８－ｈＣＤ２０）５×１０５個をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮下に接種した。接種後７日目に抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ、５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与し、１０日目に１×１０６個の実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）又は、実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）又は、比較例２（Ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ）を静脈内に投与した。対照群として、ＣＰＡ投与のみを行ったＣＡＲ－Ｔ未治療群、ＭＣ３８－ｈＣＤ２０マウス大腸がんを接種後無処置の非治療群を設定した。マウスの腫瘍体積は１週間に２回測定した。
　マウス大腸がん腫瘍移植モデルの腫瘍体積の結果を図１７に示す。横軸はマウスにＭＣ３８－ｈＣＤ２０を皮下接種した日を０日とした接種後の日数、縦軸は腫瘍体積（腫瘍の長径×（腫瘍の短径）２／２（ｍｍ３））である。標準偏差はそれぞれの実験グループにおいて算出した。「ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は無処置、「ＣＰＡ」はＣＰＡ投与のみ、「ＣＰＡ＋Ｃｏｎｖ．」はＣＰＡ投与後に比較例２（Ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ）を投与、「ＣＰＡ＋ｍｂＩＬ１５ＲＡｘ１９」はＣＰＡ投与後に実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）を投与、「ＣＰＡ＋ｓｕｓｈｉＩＬ１５ＲＡｘ１９」はＣＰＡ投与後に実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）を投与したグループである。
　図１７に示すように、実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）及び、実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）を投与した場合には、比較例２（Ｃｏｎｖ．ＣＡＲ－Ｔ）を投与した場合や無処置群（ｎｏ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）およびＣＰＡ投与のみの場合と比較して腫瘍体積の減少効果が確認された。したがって、実施例１－３のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｍｂＩＬ１５ＲＡｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）及び、実施例１－４のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｓｕｓｈｉＩＬ１５ｘＣＣＬ１９　ＣＡＲ－Ｔ）はマウス大腸がんモデルにおいても優れた抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。
　上記の実施例および試験例では、マウス由来のＴ細胞やマウスの天然のアミノ酸配列を含むサイトカイン（ＩＬ－１５Ｒα等にＩＬ－１５が連結している融合タンパク質等）およびケモカイン（ＣＣＬ１９）を用いており、またマウスにおけるin vivo試験を行っている。しかしながら当業者であれば、マウス以外の哺乳動物、好ましくはヒトに関係する実施形態においても、すなわちヒト由来のＴ細胞やヒトの天然のアミノ酸配列を含むサイトカイン（ＩＬ－１５Ｒα等にＩＬ－１５が連結している融合タンパク質等）およびケモカイン（ＣＣＬ１９）を用いる場合であっても、またヒトにおけるin vivo試験を行う場合であっても、同様にして本発明を実施することができ、かつ本発明の作用効果が奏されることを理解することができる。
　例えば、配列番号５に示されているマウスの天然のアミノ酸配列を利用して実施（作製および使用）されているＩＬ１５ＬＳＰを含む融合タンパク質は、配列番号１８に示されているＩＬ－１５に関するヒトの天然のアミノ酸配列のうちの、１～２９番目（シグナルペプチド部分）および４９～１６２番目（ＩＬ－１５部分）のアミノ酸配列を利用して、またそのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を利用して、実施することができる。
　配列番号７に示されているマウスの天然のアミノ酸配列を利用して実施されているｓＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質は、配列番号１８に示されているＩＬ－１５に関するヒトの天然のアミノ酸配列のうちの、４９～１６２番目（ＩＬ－１５部分）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９に示されているＩＬ－１５Ｒαに関するヒトの天然のアミノ酸配列のうちの、３１～２０５番目（ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン）のアミノ酸配列を利用して、またそのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を利用して、実施することができる。
　配列番号９に示されているマウスの天然のアミノ酸配列を利用して実施されているｍｂＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質は、配列番号１８に示されているＩＬ－１５に関するヒトの天然のアミノ酸配列のうちの、４９～１６２番目（ＩＬ－１５部分）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９に示されているＩＬ－１５Ｒαに関するヒトの天然のアミノ酸配列のうちの、１～２６７番目（ＩＬ－１５Ｒαの全長）のアミノ酸配列を利用して、またそのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を利用して、実施することができる。
　配列番号１１に示されているマウスの天然のアミノ酸配列を利用して実施されているｓｕｓｈｉＩＬ１５を含む融合タンパク質は、配列番号１８に示されているＩＬ－１５に関するヒトの天然のアミノ酸配列のうちの、４９～１６２番目（ＩＬ－１５部分）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９に示されているＩＬ－１５Ｒαに関するヒトの天然のアミノ酸配列のうちの、３１～９５番目（ｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を利用して、またそのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を利用して、実施することができる。
　本発明による持続性および増殖性に優れたＣＡＲ－Ｔ細胞は、がん等の治療用の医薬を製造するための使用に好適である。また、本発明による発現ベクターは、そのようなＣＡＲ－Ｔ細胞を製造するための使用に好適である。
　配列番号１：抗ヒトＣＤ２０　ＣＡＲを含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃１）の塩基配列
　配列番号２：ＤＮＡ断片＃１の３～１６３７番目の塩基配列によって発現する融合タンパク質のアミノ酸配列
　配列番号３：終止コドンおよび制限酵素サイトをコードするＭＣＳ　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃２）の塩基配列
　配列番号４：ＩＬ１５ＬＳＰ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃３）の塩基配列
　配列番号５：ＤＮＡ断片＃３の７～９６９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ＩＬ１５ＬＳＰを含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列
　配列番号６：ｓＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃４）のアミノ酸配列
　配列番号７：ＤＮＡ断片＃４の７～１５３９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｓＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列
　配列番号８：ｍｂＩＬ１５ＲＡ＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃５）の塩基配列
　配列番号９：ＤＮＡ断片＃５の７～１７１３番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｍｂＩＬ１５ＲＡを含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列
　配列番号１０：ｓｕｓｈｉＩＬ１５＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃６）の塩基配列
　配列番号１１：ＤＮＡ断片＃６の７～１１７９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｓｕｓｈｉＩＬ１５を含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列
　配列番号１２：ＩＬ－１８＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃７）の塩基配列
　配列番号１３：ＤＮＡ断片＃７の７～１０５９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する融合タンパク質全体のアミノ酸配列
　配列番号１４：ＩＬ－２１＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃８）の塩基配列
　配列番号１５：ＤＮＡ断片＃８の７～９６９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する融合タンパク質全体のアミノ酸配列
　配列番号１６：ｓｃＩＬ２７＿Ｆ２Ａ＿ＣＣＬ１９　ＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片＃９）
　配列番号１７：ＤＮＡ断片＃９の７～１８３９番目の塩基配列によって発現し、２箇所のＦ２Ａで自己切断する、ｓｃＩＬ２７を含む融合タンパク質全体のアミノ酸配列
　配列番号１８：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０９３３として登録されている、ヒトの天然のＩＬ－１５（シグナルペプチドおよびプロペプチド部分を含む全長）のアミノ酸配列
　配列番号１９：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１３２６１として登録されているヒトの天然のＩＬ－１５Ｒα（シグナルペプチド、ｓｕｓｈｉドメイン、細胞外ドメイン等を含む全長）のアミノ酸配列

Claims (18)

  1. 　（１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
    　（２）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）およびインターロイキン－２７（ＩＬ－２７）からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびに
    　（３）ＣＣケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）
    を発現するＴ細胞。
  2. 　前記（２）がＩＬ－１５である、請求項１に記載のＴ細胞。
  3. 　前記ＩＬ－１５が、ＩＬ－１５Ｒαと連結して融合タンパク質を形成した状態にあるＩＬ－１５である、請求項２に記載のＴ細胞。
  4. 　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５ＬＳＰとＩＬ－１５とが連結した融合タンパク質（ＩＬ１５ＬＳＰ）、ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓＩＬ１５ＲＡ）、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、請求項３に記載のＴ細胞。
  5. 　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、請求項３に記載のＴ細胞。
  6. 　請求項１に記載のＴ細胞を含有する医薬。
  7. 　がんの治療剤である、請求項６に記載の医薬。
  8. 　前記がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫または白血病である、請求項７に記載の医薬。
  9. 　（１）ＣＡＲをコードする核酸、
    　（２）ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１およびＩＬ－２７からなる群より選ばれる少なくとも１種をコードする核酸、ならびに
    　（３）ＣＣＬ１９をコードする核酸
    を含む、発現ベクター。
  10. 　前記（２）がＩＬ－１５である、請求項９に記載の発現ベクター。
  11. 　前記ＩＬ－１５が、ＩＬ－１５Ｒαと連結して融合タンパク質を形成した状態にあるＩＬ－１５である、請求項１０に記載の発現ベクター。
  12. 　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５ＬＳＰとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ＩＬ１５ＬＳＰ）、ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓＩＬ１５ＲＡ）、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、請求項１１に記載の発現ベクター。
  13. 　前記融合タンパク質が、ＩＬ－１５と全長のＩＬ－１５Ｒαが連結した融合タンパク質（ｍｂＩＬ１５ＲＡ）、または、シグナルペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５ＲαとＩＬ－１５が連結した融合タンパク質（ｓｕｓｈｉＩＬ１５）である、請求項１１に記載の発現ベクター。
  14. 　請求項９に記載の発現ベクターをＴ細胞に導入する工程を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法。
  15. 　請求項１に記載のＴ細胞を、がんの治療を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの治療方法。
  16. 　前記がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫または白血病である、請求項１５に記載の治療方法。
  17. 　がんの治療の有効成分として使用するための、請求項１に記載のＴ細胞。
  18. 　前記がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、大腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、小腸がん、前立腺がん、膀胱がん、直腸がん、膵臓がん、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上咽頭がん、食道がん、胆道がん、神経芽腫、骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫または白血病である、請求項１７に記載のＴ細胞。
PCT/JP2019/034055 2018-08-31 2019-08-30 Ｃａｒ発現ｔ細胞及びｃａｒ発現ベクター WO2020045610A1 (ja)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980056592.XA CN112771166A (zh) 2018-08-31 2019-08-30 表达car的t细胞和car表达载体
CA3111170A CA3111170A1 (en) 2018-08-31 2019-08-30 Car-expressing t cells and car expression vector
US17/271,451 US20210309712A1 (en) 2018-08-31 2019-08-30 Car-expressing t cells and car expression vector
SG11202101930XA SG11202101930XA (en) 2018-08-31 2019-08-30 Car-expressing t cells and car expression vector
AU2019331866A AU2019331866A1 (en) 2018-08-31 2019-08-30 Car-expressing T cells and car expression vector
EA202190624A EA202190624A1 (ru) 2018-08-31 2019-08-30 Car-экспрессирующие т-клетки и car-экспрессирующий вектор
BR112021003640-7A BR112021003640A2 (pt) 2018-08-31 2019-08-30 célula t, medicamento, vetor de expressão, e, métodos para produzir uma célula de t car e para tratar câncer
JP2020539612A JPWO2020045610A1 (ja) 2018-08-31 2019-08-30 Ｃａｒ発現ｔ細胞及びｃａｒ発現ベクター
EP19853937.1A EP3845654A4 (en) 2018-08-31 2019-08-30 CAR-EXPRESSING T CELLS AND CAR-EXPRESSION VECTOR
MX2021002373A MX2021002373A (es) 2018-08-31 2019-08-30 Celulas t que expresan car y vector de expresion de car.
KR1020217009198A KR20210053925A (ko) 2018-08-31 2019-08-30 Car 발현 t 세포 및 car 발현 벡터
IL281013A IL281013A (en) 2018-08-31 2021-02-22 T cells express CAR and CAR expression vector
CONC2021/0003508A CO2021003508A2 (es) 2018-08-31 2021-03-18 Células t que expresan car y vector de expresión de car

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018163310 2018-08-31
JP2018-163310 2018-08-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020045610A1 true WO2020045610A1 (ja) 2020-03-05

Family

ID=69643612

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/034055 WO2020045610A1 (ja) 2018-08-31 2019-08-30 Ｃａｒ発現ｔ細胞及びｃａｒ発現ベクター

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20210309712A1 (ja)
EP (1) EP3845654A4 (ja)
JP (1) JPWO2020045610A1 (ja)
KR (1) KR20210053925A (ja)
CN (1) CN112771166A (ja)
AU (1) AU2019331866A1 (ja)
BR (1) BR112021003640A2 (ja)
CA (1) CA3111170A1 (ja)
CO (1) CO2021003508A2 (ja)
EA (1) EA202190624A1 (ja)
IL (1) IL281013A (ja)
MX (1) MX2021002373A (ja)
SG (1) SG11202101930XA (ja)
TW (1) TW202016295A (ja)
WO (1) WO2020045610A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175998A (zh) * 2020-10-12 2021-01-05 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
WO2022036041A1 (en) * 2020-08-14 2022-02-17 Kite Pharma, Inc Improving immune cell function
WO2023205868A1 (pt) * 2022-04-29 2023-11-02 Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto Sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de célula natural killer de antígeno quimérico (nk-car), polipeptídeo do referido nk car, vetor que compreende a referida sequência de ácido nucleico, método in vitro de obtenção de uma célula nk, uso dos referidos sequência de ácido nucleica, polipeptídeo ou vetor, e composição farmacêutica
US11896620B2 (en) 2020-05-27 2024-02-13 Bioheng Therapeutics Limited Engineered immune cell and use thereof
KR20240038723A (ko) 2021-07-29 2024-03-25 다케다 야쿠힝 고교 가부시키가이샤 메소텔린을 특이적으로 표적화하는 car-발현 면역 세포 및 이의 용도

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113286874A (zh) * 2018-10-12 2021-08-20 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(CARs)组合物及使用方法
CN113046320B (zh) * 2021-02-19 2023-04-14 中国医学科学院基础医学研究所 胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途
CA3224887A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor to target trop-2-positive cancers
WO2023211180A1 (ko) * 2022-04-27 2023-11-02 주식회사 티에스디라이프사이언스 이종 면역세포에 대한 화학주성을 유도하는 전능성 줄기세포 유래 면역세포

Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007037780A2 (en) 2004-10-08 2007-04-05 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy with enhanced t lymphocyte survival
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2008118220A2 (en) 2006-11-28 2008-10-02 Veritainer Corporation Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane
US20080236610A1 (en) 2004-04-10 2008-10-02 Holger Bartels Hair Rollers
WO2008124133A1 (en) 2007-04-07 2008-10-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
WO2008151058A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The General Hospital Corporation Methods of generating pluripotent cells from somatic cells
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US20090047263A1 (en) 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
WO2013040371A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2014186469A2 (en) 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
US20160096892A1 (en) 2014-07-21 2016-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
WO2016056228A1 (ja) 2014-10-09 2016-04-14 国立大学法人山口大学 Ｃａｒ発現ベクター及びｃａｒ発現ｔ細胞
WO2017019848A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified monocytes/macrophage expressing chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2017222593A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
WO2018014038A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors and methods for use
WO2018027155A1 (en) * 2016-08-04 2018-02-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
WO2018073393A2 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Tal-effector nuclease (talen) -modified allogenic cells suitable for therapy
CN109055430A (zh) * 2018-08-14 2018-12-21 杭州荣泽生物科技有限公司 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU20170052A7 (es) * 2014-10-14 2017-11-07 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1

Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080236610A1 (en) 2004-04-10 2008-10-02 Holger Bartels Hair Rollers
WO2007037780A2 (en) 2004-10-08 2007-04-05 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy with enhanced t lymphocyte survival
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
JP2008283972A (ja) 2005-12-13 2008-11-27 Kyoto Univ 誘導多能性幹細胞の製造方法
US20090047263A1 (en) 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
WO2008118220A2 (en) 2006-11-28 2008-10-02 Veritainer Corporation Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane
WO2008124133A1 (en) 2007-04-07 2008-10-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
WO2008151058A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The General Hospital Corporation Methods of generating pluripotent cells from somatic cells
WO2009006997A1 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc. Human pluripotent stem cells and their medical use
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009006930A1 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc. Human pluripotent stem cells induced from undifferentiated stem cells derived from a human postnatal tissue
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2013040371A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
WO2014186469A2 (en) 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
US20160096892A1 (en) 2014-07-21 2016-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
WO2016056228A1 (ja) 2014-10-09 2016-04-14 国立大学法人山口大学 Ｃａｒ発現ベクター及びｃａｒ発現ｔ細胞
WO2017019848A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified monocytes/macrophage expressing chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2017222593A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
WO2018014038A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors and methods for use
WO2018027155A1 (en) * 2016-08-04 2018-02-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
WO2018073393A2 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Tal-effector nuclease (talen) -modified allogenic cells suitable for therapy
CN109055430A (zh) * 2018-08-14 2018-12-21 杭州荣泽生物科技有限公司 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法

Non-Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"UniProtKB", Database accession no. Q13261
ACC. CHEM. RES., vol. 32, 1999, pages 624
BARTA ET AL.: "Armored Glypican-3-Specific CAR T cells for the Immunotherapy of Hepatocellular Carcinoma", ASGCT 2018, May 2018 (2018-05-01)
CELL TECHNOLOGY, vol. 16, 1997, pages 1463 - 1473
HUANGFU D.MELTON, DA. ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 26, no. 7, 2008, pages 795 - 797
HURTON ET AL., PROC NATL ACAD SCI., vol. 113, no. 48, 2016, pages E7788 - 97
J IMMUNOL., vol. 183, 2009, pages 6217 - 26
J. AM. CHEM. SOC., vol. 122, 2000, pages 6900
J. AM. CHEM. SOC., vol. 123, 2001, pages 4653
KIM JB.SCHOLER HR. ET AL., NATURE, vol. 454, 2008, pages 646 - 650
MOL THER, vol. 25, no. 8, 2017, pages 1769 - 1781
MORTIER ET AL., J BIOL CHEM., vol. 281, no. 3, 2006, pages 1612 - 9
NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 32, 2004, pages e175
OKITA K ET AL., NAT. METHODS, vol. 8, no. 5, May 2011 (2011-05-01), pages 409 - 12
OKITA K ET AL., STEM CELLS, vol. 31, no. 3, pages 458 - 66
OKITA, K.ICHISAKA, T.YAMANAKA, S, NATURE, vol. 451, 2007, pages 141 - 146
ROWLEY ET AL., EUR J IMMUNOL., vol. 39, no. 2, 2009, pages 491 - 506
SASAOKA ET AL., AM J PHYSIOL GASTROINTEST LIVER PHYSIOL, vol. 300, pages G568 - 576
See also references of EP3845654A4
SHI Y.DING S. ET AL., CELL STEM CELL, vol. 3, 2008, pages 568 - 574
SZYMCZAK ET AL., EXPERT OPIN. BIOL. THER., vol. 5, no. 5, pages 627 - 638
TAKAHASHI KYAMANAKA S. ET AL., CELL, vol. 131, 2007, pages 861 - 872
TAMADA K ET AL., CLIN CANCER RES, vol. 18, 2002, pages 6436 - 6445
TAMADA K ET AL., CLINCANCER RES, vol. 18, 2002, pages 6436 - 6445
YAMANAKATAKAHASHI KYAMANAKA S. ET AL., CELL, vol. 126, 2006, pages 663 - 676
YU J.THOMSON JA ET AL., SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1917 - 1920

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11896620B2 (en) 2020-05-27 2024-02-13 Bioheng Therapeutics Limited Engineered immune cell and use thereof
JP7462782B2 (ja) 2020-05-27 2024-04-05 バイオヘン セラピューティクス リミテッド 改変免疫細胞とその使用
WO2022036041A1 (en) * 2020-08-14 2022-02-17 Kite Pharma, Inc Improving immune cell function
CN112175998A (zh) * 2020-10-12 2021-01-05 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
KR20240038723A (ko) 2021-07-29 2024-03-25 다케다 야쿠힝 고교 가부시키가이샤 메소텔린을 특이적으로 표적화하는 car-발현 면역 세포 및 이의 용도
WO2023205868A1 (pt) * 2022-04-29 2023-11-02 Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto Sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de célula natural killer de antígeno quimérico (nk-car), polipeptídeo do referido nk car, vetor que compreende a referida sequência de ácido nucleico, método in vitro de obtenção de uma célula nk, uso dos referidos sequência de ácido nucleica, polipeptídeo ou vetor, e composição farmacêutica

Also Published As

Publication number Publication date
EA202190624A1 (ru) 2021-06-09
JPWO2020045610A1 (ja) 2021-08-26
CA3111170A1 (en) 2020-03-05
CN112771166A (zh) 2021-05-07
IL281013A (en) 2021-04-29
EP3845654A1 (en) 2021-07-07
KR20210053925A (ko) 2021-05-12
TW202016295A (zh) 2020-05-01
SG11202101930XA (en) 2021-03-30
MX2021002373A (es) 2021-07-15
CO2021003508A2 (es) 2021-08-09
AU2019331866A1 (en) 2021-04-01
US20210309712A1 (en) 2021-10-07
EP3845654A4 (en) 2022-05-11
BR112021003640A2 (pt) 2021-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020045610A1 (ja) Ｃａｒ発現ｔ細胞及びｃａｒ発現ベクター
US11312939B2 (en) Constructs for chimeric antigen receptors
KR20210139472A (ko) 조작된 iPSC 및 면역 효과기 세포에서의 CD3 재구성
JP7233720B2 (ja) ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ｉｌ－７、及びｃｃｌ１９を発現する免疫担当細胞
CN114901693A (zh) 用于免疫效应细胞工程化的增强的嵌合抗原受体和其用途
WO2021256522A1 (ja) キメラ抗原受容体発現免疫担当細胞
TW202039832A (zh) γδＴ細胞及其用途
CN110819596B (zh) 具有增强的迁移能力的修饰的细胞
JP2020530993A (ja) キメラ抗原受容体または改変ｔｃｒを発現し、選択的に発現されるヌクレオチド配列を含む細胞
KR20220118532A (ko) 고형 종양들 암 면역요법을 위한 새로운 메소텔린 특이적 키메라 항원 수용체들 (car)
CN114514247A (zh) Car-cd123载体及其用途
US20210324083A1 (en) Methods and compositions comprising b7h3 chimeric antigen receptors
EA045607B1 (ru) Car-экспрессирующие т-клетки и car-экспрессирующий вектор
EP4321534A1 (en) Method for activating t-cells
WO2024024551A1 (ja) シェディング構造を有する人工受容体
JP7475088B2 (ja) ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ｉｌ－７、及びｃｃｌ１９を発現する免疫担当細胞
EP4353253A1 (en) Purification of tcr-modified t cells using tcr-specific car-nk cells
JP7054181B2 (ja) キメラ抗原受容体
Diwanji et al. Chimeric Antigen Cytotoxic Receptors for In-Vivo Engineering of Tumor-targeting Natural Killer Cells
KR20240035506A (ko) 키메라 항원 수용체, 상기 수용체를 발현하는 세포, 상기 세포를 포함하는 의약 조성물, 상기 세포의 제조 방법, 및 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터
JP2024518011A (ja) 多様な免疫細胞のための単鎖および多鎖合成抗原受容体
WO2023242434A1 (en) Modified immune cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19853937

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020539612

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3111170

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112021003640

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20217009198

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019331866

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20190830

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019853937

Country of ref document: EP

Effective date: 20210331

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112021003640

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20210225