WO2023211180A1 - 이종 면역세포에 대한 화학주성을 유도하는 전능성 줄기세포 유래 면역세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IL-7, CCL19 또는 이들의 조합을 발현하는 전능성 줄기세포 유래 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 T 세포 이외의 면역세포, 구체적으로는 자연살해세포의 치료적 유효량만을 주입함으로써 환자의 내인성 T 세포와 주입된 자연살해세포의 상호 보완적 면역 반응으로 인해 다각적이고 상승적인 치료 효과를 거둘 수 있다. 본 발명의 자연살해세포는 또한 외인성 T 세포와 병용 투여되는 경우에도 이들 상이한 세포군이 병변 부위에 보다 집중적으로 작용하도록 할 수 있다. 본 발명은 전능성 줄기세포, 구체적으로는 유도만능줄기세포(iPSC)를 출발세포로 하여 면역세포로 분화시킴으로서 필요에 따라 동종(allogenic) 또는 자가(autologous) 세포를 제한 없이 이용할 수 있으며, 무한 증식을 통해 희소가치가 높은 면역치료용 세포 자원을 대량으로 확보하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 전능성 줄기세포를 출발세포로 하여, 이종 면역세포가 병변 부위로 이동하도록 특정 화학주성인자를 발현하는 자연살해세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.
인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)를 포함하는 인간 전능성 줄기세포(Human pluripotent stem cells, hPSCs)는 다양한 형태의 체세포로 분화될 수 있는 능력을 유지하면서 무한정 증식할 수 있다. 이러한 세포들은 세포 치료 및 재생 의학에서 무제한적인 세포 공급원을 제공함으로써 가치를 높이 평가받으며, 치료용 면역 세포 또는 재생하고자 하는 조직에 적합한 형태의 세포 등으로 특이적으로 분화시키기 위한 다양한 분화 유도 방법, 분화된 세포의 분리 방법 및 미분화 세포의 제거 방법에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
한편, 자연살해세포(Natural Killer cell)는 말초혈액림프구(peripheral blood lymphocyte)의 약 15% 정도를 차지하는 림프구계 세포로서 선천성 면역반응에 중요한 역할을 하며, 구체적으로 수지상세포를 활성화시키고 세포독성 T 림프구(CTL)를 종양에 특이적으로 반응하도록 유도하여 종양세포를 제거한다. 자연살해세포는 육종(sarcoma), 골수종(myeloma), 림프종(lymphomas) 및 백혈병(leukemia)과 같은 악성 종양을 직접적으로 사멸시키며, 체외에서 활성화된 NK 세포를 백혈병 등의 혈액암 환자를 대상으로 동종 골수이식 후 투여함으로써 그 치료 효과가 확인되기도 하였다(Blood Cells Molecules & Disease, 33: p261-266, 2004). 그러나 정상인의 체내에서 대부분의 자연살해세포는 비활성화 상태로 존재하므로, 이의 치료 효율을 높이기 위해 혈액에서 분리된 NK 세포를 체외에서 활성화시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.
면역세포의 또 하나의 축을 이루는 T 세포는 골수에서 생성되어 흉선(thymus)에서 성숙하는 림프구로서 면역체계에서 기억 능력을 가지며 B세포에 정보를 제공하여 항체 생성을 유도한다. T 세포는 흉선에서 면역관용 테스트를 거친 후 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 헬퍼 T 세포(helper T cell), 조절 T 세포(regulatory T cell) 및 기억 T 세포(memory T cell)의 4가지 세포로 분화되는데, 이중 CD8+ T 세포인 세포독성 T 세포는 I형 MHC와 결합해 암세포 또는 감염세포를 식별하며, 주로 자연살해세포와 같이 병변 세포를 목표로 삼는다.
이와 같이 자연살해세포와 세포독성 T 세포를 병용 투여할 경우 치료 효과가 극대화될 수 있으나, 각각 치료적 유효량을 만족하는 두 가지 세포를 주입해야 하는 비효율성을 극복하면서도 치료 자원으로서의 세포원을 제한 없이 공급받을 수 있는 새로운 형태의 세포 치료제의 개발이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 이종 면역세포의 조합에 의한 복합적 면역반응을 통해 보다 효율적으로 병변부를 제거하면서도, 치료적 유효량의 대량 수급이 용이한 효율적인 세포 치료제 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전능성 줄기세포에 IL-7 유전자, CCL19 유전자 또는 이들의 조합을 형질도입한 뒤 이를 면역세포, 구체적으로는 T 세포 이외의 면역세포, 가장 구체적으로는 자연살해세포로 분화시킬 경우, 분화된 자연살해세포를 생체 내 주입함으로써 자연살해세포가 발현하는 IL-7 및 CCL19에 의해 증식 및 호밍(homing)된 내인성 T 세포와 주입된 자연살해세포가 병변부에 동시에 작용함으로써 다각적이고 상승적인 면역반응이 유도될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 IL-7, CCL19 또는 이들의 조합을 발현하는 전능성 줄기세포 유래 면역세포, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 전능성(pluripotent) 줄기세포로부터 분화되며, IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; 또는 이들의 조합을 발현하는 면역세포를 제공한다.
본 발명자들은 이종 면역세포의 조합에 의한 복합적 면역반응을 통해 보다 효율적으로 병변부를 제거하면서도, 치료적 유효량의 대량 수급이 용이한 효율적인 세포 치료제 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전능성 줄기세포에 IL-7 유전자, CCL19 유전자 또는 이들의 조합을 형질도입한 뒤 이를 면역세포, 구체적으로는 T 세포 이외의 면역세포, 가장 구체적으로는 자연살해세포로 분화시킬 경우, 분화된 자연살해세포를 생체 내 주입함으로써 자연살해세포가 발현하는 IL-7 및 CCL19에 의해 증식 및 호밍(homing)된 내인성 T 세포와 주입된 자연살해세포가 병변부에 동시에 작용함으로써 다각적이고 상승적인 면역반응이 유도될 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 “면역세포”는 면역 반응의 개시 또는 촉진 과정에 관여하는 모든 세포를 의미하며, 보다 구체적으로는 면역 작동세포(immune effector cell)를 의미한다. 면역세포는 예를 들어 T 세포, B 세포, 자연살해(NK)세포, 자연살해 T(NKT) 세포, 비만 세포(mast cell) 및 수지상 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 상기 면역세포는 T 세포 이외의 면역세포이며, 가장 구체적으로는 자연살해세포이다.
본 명세서에서 용어 “T 세포”는 당업계에서 이해되는 의미와 동일한 범위의 세포군으로서, 구체적으로는 타겟 세포를 직접 용해시키거나 또는 타겟 세포의 사멸을 유발하는 작동 기능(effector function) 또는 보조 기능(helper function)을 제공하는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않고 본 발명이 속하는 기술분야에서 “T 세포”로 분류되는 여하한 세포도 포함된다.
본 명세서에서, 용어 “줄기세포(stem cell)”는 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포로서, 특정 분화 자극(환경) 하에서 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고, 분화 자극이 가해지면 자극의 성격에 따라 다양한 세포로 분화될 수 있는, 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
본 발명에서 이용되는 줄기세포는 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 가져 재생하고자 하는 조직으로 분화 유도가 가능한 세포라면 제한 없이 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어“전능성 줄기세포(pluripotent stem cell)”는 수정란보다 발생이 진행된 상태의 세포로서 내배엽, 중간엽 및 외배엽을 구성하는 세포로 모두 분화할 수 있는 줄기세포를 의미한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC), 배아생식세포(Embryonic Germ Cell), 배아종양세포(Embryonic Carcinoma Cell) 또는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)이며, 보다 구체적으로는 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포이며, 가장 구체적으로는 유도만능 줄기세포이다.
본 명세서에서 용어“유도만능 줄기세포”는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)에 미분화 또는 전분화능 표현형과 관련된 특정 유전자를 삽입하여 인공적으로 유래된 전분화능 줄기세포의 하나이다. 유도만능 줄기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가진다는 점에서 배아줄기세포와 같은 천연의 전분화능 줄기세포와 동일한 표현형, 생리학적 특성 및 발생학적 특성을 가지는 것으로 당업계에서 간주되고 있다.
본 명세서에서, 용어“줄기세포의 분화”는 미분화 상태의 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 전구체(precursor) 세포의 형성도 포함하는 것이다.
본 명세서에서 용어“기능적 일부”는 전장 단백질에서 일부 아미노산 잔기가 삭제된 절편으로서 그 본연의 생물학적 활성 및 기능을 유지하는 전장 단백질의 유사체를 의미한다.
본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA)와 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 핵산 분자는 첨부된 서열목록 상의 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다. 뉴클레오타이드에서의 변이는 코돈의 축퇴성 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈의 존재로 인해 단백질 구조의 변화로 이어지지 않을 수 있다. 이러한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려하면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석하였을 때 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 85%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 명세서에서 용어“발현하다”는 본 발명의 면역세포가 발현하지 않는 외래(exogenous) 유전자가 유전자 전달체를 통해 도입됨으로써 인위적으로 발현되거나, 내인성(endogenous) 유전자가 내재적인 발현 시스템에 의해 자연적으로 발현되거나, 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 과발현시키는 것을 모두 포함하는 의미이다. 따라서, 본 발명의 면역세포는 IL-7과 CCL19를 내재적으로 발현하는 세포, IL-7을 내재적으로 발현하고 CCL19를 인위적으로 발현시킨 세포, CCL19를 내재적으로 발현하고 IL-7을 인위적으로 발현시킨 세포 및 IL-7과 CCL19를 인위적으로 발현시킨 세포를 모두 포괄한다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상 세포가 외래 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성 유전자를 과발현하도록 하기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 목적 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현시키다”에서의 “발현”은 “형질전환(transformation)”,“형질주입(transfection)”또는“형질도입(transduction)”과 동일한 의미이다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달체(gene delivery system)”는 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 용어“유전자 전달”은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
IL-7 및 CCL19 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 도입에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있으며, 구체적으로는 리포좀-매개 형질감염법을 사용할 수 있다.
IL-7 및 CCL19 유전자는 하나의 유전자 전달체에 함께 삽입되거나 또는 2개의 유전자 전달체에 각각 삽입되어 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 IL-7은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 상동성을 가지며, 보다 구체적으로는 90% 이상의 서열 상동성을 가지고, 가장 구체적으로는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CCL19는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 상동성을 가지며, 보다 구체적으로는 90% 이상의 서열 상동성을 가지고, 가장 구체적으로는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 IL-7 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CCL19 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제3서열 및 제4서열은 IL-7 및 CCL19 유전자의 염기서열이 자연살해세포에서 효율적으로 발현되도록 코던 최적화를 수행한 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 면역세포에서 IL-7과 CCL19를 인위적으로 발현시키기 위해 전능성 줄기세포에 이들 유전자를 형질도입 후 이를 면역세포로 분화 유도할 수도 있으며, 또는 전능성 줄기세포를 면역세포로 분화시킨 뒤 분화 완료된 면역세포에 이들 유전자를 형질도입할 수도 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전능성 줄기세포는 IL-7 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자가 형질도입된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 면역세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 면역세포가 세포 치료제로 적용될 경우, 다양한 종양 및 감염성 질환의 치료에 적용될 수 있다. 본 발명의 면역세포, 구체적으로는 자연살해세포는 고형암(solid cancer) 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 종양에 적용이 가능하며, 상기 암은 예를 들어 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 면역세포, 구체적으로는 자연살해세포를 이용하여 예방 또는 치료될 수 있는 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다. 이러한 감염성 질환은 예를 들어 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus:HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 면역세포가 대상체에 투여되면 자연살해세포와 이에 의해 병변부로 유도된 내인성 T 세포 또는 외부에서 주입된 자가 또는 동종 T 세포에 의한 복합적인 면역반응이 이루어져 암세포, 감염 세포 또는 병원균의 사멸을 유도함으로써 종양 또는 감염질환으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 질환의 세포 치료제 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분, 예를 들어 치료용 T 세포 또는 기타 공지된 항암제 등과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료” 또는 “치료제”는 “치료 보조” 또는 “치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여” 또는 “투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 전술한 본 발명의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 이종 면역세포 증식 또는 호밍(homing) 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 면역세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 이종 면역세포 증식 또는 호밍(homing) 유도 방법을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 핵산 분자 및 이들이 형질도입된 전능성 줄기세포 유래 면역세포에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어“이종 면역세포(heterogeneous immune cell)”는 줄기세포로부터 분화된 본 발명의 면역세포와 상이한 종류의 면역세포를 의미한다. 구체적으로는, 상기 이종 면역세포는 T 세포 또는 수지상 세포(dendritic cell)이다. 본 발명에 따르면, IL-7 및 CCL19를 동시에 발현하는 면역세포, 구체적으로는 T 세포 이외의 면역세포, 가장 구체적으로는 자연살해세포를 대상체에 주입하여 T 세포의 증식 및 화학 주성을 유도함으로써 병변부로 다량의 내인성 T 세포가 이동하도록 할 수 있다. 용어“화학주성(chemotaxis)”은 화학적 자극에 의해 유도되는 이동성 세포의 양성(자극을 향하는 방향) 또는 음성(자극으로부터 멀어지는 방향) 이동을 의미하며, 구체적으로는 양성 이동을 의미한다. 본 발명에 따르면, T 세포는 IL-7에 의해 증식 및 분화되고 상응하는 화학주성인자인 CCL19에 의해 활성화되어 IL-7 및 CCL19를 발현하는 자연살해세포로 이동함으로써 병변 부위에는 T 세포와 자연살해세포라는 상호 보완적 면역세포로 구성된 비균질 세포군이 형성된다. 이에, 본 발명은 자연살해세포라는 단일종 세포의 치료적 유효량만을 주입하여 상이한 세포군의 병용 투여 효과를 거둘 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 형질전환된 면역세포의 제조방법을 제공한다:
(a) 전능성(pluripotent) 줄기세포에 IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; 또는 이들의 조합을 도입하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 세포를 면역세포로 분화시키는 단계.
본 발명에서 이용되는 핵산 분자, 이들이 도입된 전능성 줄기세포 및 이로부터 분화된 면역세포에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; 또는 이들의 조합을 발현하는 전능성(pluripotent) 줄기세포를 제공한다.
본 발명에서 이용되는 핵산 분자 및 이들이 도입된 전능성 줄기세포에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 IL-7 및/또는 CCL19을 발현하는 전능성 줄기세포, 구체적으로는 유도만능줄기세포(iPSC)는 내인성 T 세포 또는 외부로부터 주입된 T 세포를 증식시키고 병변부로 호밍(homing)시킬 뿐 아니라 무한증식을 통해 치료적 유효량에 쉽게 도달할 수 있으므로, 그 자체로 면역증진활성을 가지는 효율적인 면역 치료용 세포로 작용할 수 있다. 아울러, IL-7 및/또는 CCL19를 발현하는 목적 세포를 수득하기 위한 출발 세포로서 적절한 분화 자극을 가하여 T 세포와 함께 상승적인 상호작용을 할 수 있는 다양한 성체 면역세포, 중간엽 줄기세포 기타 조직 재생을 위한 세포 등을 대량으로 수득하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 IL-7, CCL19 또는 이들의 조합을 발현하는 전능성 줄기세포 유래 면역세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 T 세포 이외의 면역세포, 구체적으로는 자연살해세포의 치료적 유효량만을 주입함으로써 환자의 내인성 T 세포와 주입된 자연살해세포의 상호 보완적 면역 반응으로 인해 다각적이고 상승적인 치료 효과를 거둘 수 있다.
(c) 본 발명의 자연살해세포는 또한 외인성 T 세포와 병용 투여되는 경우에도 이들 상이한 세포군이 병변 부위에 보다 집중적으로 작용하도록 할 수 있다.
(d) 본 발명은 전능성 줄기세포, 구체적으로는 유도만능줄기세포(iPSC)를 출발세포로 하여 면역세포로 분화시킴으로서 필요에 따라 동종(allogenic) 또는 자가(autologous) 세포를 제한 없이 이용할 수 있으며, 무한 증식을 통해 희소가치가 높은 면역치료용 세포 자원을 대량으로 확보하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 음성 대조군 벡터로 사용되는 pEF1-IRES 공벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 IL-7 및 CCL19 유전자가 삽입된 pEF1-IRES 벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 3은 CCL19 및 IL-7 유전자가 삽입된 pEF1-IRES 벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 4는 iPS 세포로부터 NK 세포를 분화시키는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 5는 CCL19 및 IL-7 유전자가 삽입된 iPS 세포로부터 분화된 NK 세포(7 x 19 iNK)에서 CCL19와 IL-7의 발현양을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 6a는 iPS 세포상태(D+0)에서 spin-EB 방식으로 EBs(Embryoid bodies)를 제작하여 분화를 진행한 뒤(D+1), 이후 6일간 조혈모세포(HSC, Hematopoietic stem cell)로의 분화를 유도한 결과를 보여주는 그림이다. 도 6b는, 조혈모세포에서 NK 세포로 28일간 분화를 유도(D+34)시 39.64%의 CD3-CD56+ 세포가 확보됨을 확인한 결과이다. 도 6c는 이후 7일간 추가 분화 유도(D+41)시 CD3-CD56+ 세포가 63.81% 분화됨을 보여주는 그림이다.
도 7은 iPS 세포에서 분화된 NK 세포의 항암 활성을 LDH 어세이를 통해 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 8은 iPS 세포에서 분화된 NK 세포의 CD107a 발현양을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 9는 7 x 19 iNK와 유전자 도입 없는 iNK 세포의 항종양 효과를 비교한 결과를 보여주는 그림으로, HepG2 세포주에 대한 세포 독성 측정 결과(도 9a) 및 HepG2 세포주의 세포자멸사(apoptosis)가 유도됨을 보여주는 FACS 그래프(도 9b)를 각각 나타낸다.
도 10은 7 x 19 iNK 세포에 의한 T 세포 주화성 효과를 보여주는 그림으로, 각 배양 조건에 따라 이동한 T 세포의 배수 변화(fold change)(도 10a), 이동 세포 수(도 10b) 및 이동된 T 세포(도 10c)를 각각 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: IL-7 및 CCL19 발현 벡터의 제작
IL-7 및 CCL19을 발현하는 인간 NK 세포를 제조하기 위한 발현 벡터를 제작하였다. 발현 벡터로는 인간 연장인자 1 알파(EF1α) 프로모터 제어 하의 pEF1a-IRES 이중시스트론 포유동물 발현 벡터(Takara, CAT#631970)를 사용하였다.
벡터 내 삽입하고자 하는 유전자인 IL-7 및/또는 CCL19의 ORF 서열을 코던 최적화하여(각각 서열목록 제3서열 및 제4서열) 합성하였으며, pEF1a-IRES 벡터의 멀티클로닝 사이트 A(MCS A)에는 IL-7 또는 CCL19을, MCS B에는 CCL19 또는 IL-7를 클로닝하였다. 이때, 상기 pEF1a-IRES 벡터는 두 MCS 사이에 IRES(internal ribosome entry site)가 위치하여 두 유전자가 동시 발현될 수 있도록 하였다. 상기 음성대조군 벡터인 공벡터(Empty vector)의 구조는 도 1에, IL-7/CCL19 발현 벡터의 구조는 도 2에, CCL19/IL7 발현 벡터의 구조는 도 3에 각각 나타내었다.
실시예 2: IL-7 및 CCL19 발현 iPS 세포 제작 및 발현의 확인
iPS 세포주는 Thermofisher(CAT#A18945)로부터 구입하였으며, DMEM/F12 (1:100) 혼합 배양액에 마트리젤(Corning®, CAT#354277)을 희석하여 75T 플라스크에 코팅 후 mTeSRTM Plus (CAT#100-0276)과 Y-27632 10uM이 포함된 배양액에서 배양하였다.
IL-7/CCL19 발현 iPS 세포주(이하‘7 x 19 iPS 세포주’) 제작을 위해 1 x 106 cells 밀도로 6-웰 플레이트에 2 mL/well 씩 분주하고 24시간 후 형질주입법(Transfection)을 이용하여 형질전환 7 x 19 iPS 세포주를 만들었다.
LipofectamineTM 3000(Invitrogen, CAT#L3000015)을 이용하여 7 x 19 발현 벡터를 iPS 세포에 주입하였으며, 요약하면 LipofectamineTM 3000 5μL와 함께 1μg DNA(실시예 1에서 제작한 7 x 19 발현벡터 또는 음성대조군 벡터)를 5분 인큐베이션 조건으로 수행하였으며 이후, 50 g/mL G418(Invitrogen, CAT#04727878001)을 처리하여 형질전환된 7 x 19 iPSC 또는 음성대조군(공벡터) 세포주를 선별하였다.
단일세포(single cell clone)로 7 x 19 발현이 안정적으로 지속되는 7 x 19 iPS stable 세포주를 얻기 위해서 4주 동안 50 mg/mL G418이 포함된 배지에서 배양하였고, 이 과정 중에 7 x 19를 분비하는 웰에서 각각의 단일세포를 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴 후 여러 번의 계대 배양을 통해 단일 세포 유래 클론을 만들었고 그 클론 중 지속적으로 7 x 19를 분비하는 클론을 선별하여 7 x 19 iPS stable 세포주를 확보하였다. 확보된 세포주가 7 x 19 유전자 발현을 확인하기 위해 해당 세포주를 24시간 동안 배양하여 IL-7 및 CCL19의 발현양을 측정하였다. 6-웰 플레이트에 배양중인 배지를 수집하여 800g에서 5분간 원심분리를 통해 상층액만을 분리하였으며, 상층액 중 웰당 100mL씩을 IL-7 또는 CCL19 효소결합 면역흡착분석법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA; IL-7, Komabiotech, CAT#k0331215; CCL19, Abcam, CAT#ab100601) 실험에 이용하여 IL-7 또는 CCL19의 발현양을 측정하였다. IL-7 및 CCL19의 면역흡착분석법 실험은 각 제조사의 표준실험방법에 따라 수행하였으며, 450nm 파장에서 최종 수치를 측정하여 표 1에 나타내었다.
| 실험군 | IL-7 분비량 (pg/mL) | CCL19 분비량 (pg/mL) |
| 음성 대조군 세포 | < Min | < Min |
| 7 x 19 iPS stable 세포주 | 3232.0 | 425.39 |
표 1의 결과를 통해 형질전환된 7 x 19 iPS 세포주에서 IL-7과 CCL19를 각각 3232.0 pg/mL과 425.39 pg/mL을 분비하는 것을 확인하였다. 반면 공벡터를 주입한 음성대조군 세포주의 경우 IL-7 및 CCL19이 검출되지 않았다.
실시예 3: iPS 세포 유래 NK 세포의 항암 활성 측정
iPS 세포 유래 NK 세포 및 7 x 19 NK 세포의 항암 활성을 측정하고자, 암세포 사멸 능력을 LDH cytotoxicity assay(Promega, CAT#G1780)를 이용하여 평가하였다. 대조군으로는 공여자의 PBMC로부터 분리 배양한 NK 세포(CD3-, CD56+)를 21일간 5% 인간 혈청(Sigma-Aldrich CAT#H4522)이 포함된 NK MACS(Miltenyi Biotec, CAT#130-114-429)에 배양하였다. 이후 LDH cytotoxicity assay를 수행하기 위해서 10% FBS (Gibco CAT#10099141)가 포함된 RPMI 1640(CAT#A1049101)에 PBNK와 간암세포주인 HepG2 (ATCC CAT#HB8065)를 공배양하였다.
하루동안 배양시킨 표적 세포(HepG2)에 작동 세포(Effecter cell: iPSC 유래 NK, 7x 19 iPSC 유래 NK, PBMC 유래 NK)를 처리하고 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 표적 세포의 Max LDH 값을 측정하기 위해 양성 대조군으로 표적 세포에 에 용해 완충액(9% Triton X-100)을 처리하였고, 음성 대조군으로 배양액 자체의 LDH를 측정하였다. 위 실험 결과를 하기 식 1에 대입하여 작동세포 : 표적 세포 비율별 세포 독성을 도 7에 나타내었다. 도 7의 결과에 따라 iNK cell의 비율이 증가할수록 세포 독성이 증가함을 보였고, PBMC 유래 NK 세포보다 더 높은 세포 독성을 나타냄을 알 수 있었다.
① Experimental = E/T cell (avg.) LDH release - Culture medium background (avg.)
② Target Spontaneous = Target cell spontaneous LDH release (avg.) - Culture medium background (avg.)
③ Effecter Spontaneous = Effecter cell spontaneous LDH release (avg.) - Culture medium background (avg.)
④ Target Maximum = Target cell maximum LDH release (avg.) - Volume correction control (avg.)
[식 1]
세포독성(%) = 
= (①-②-③)/(④-②)
추가로 iPS 세포 유래 NK 세포의 항암 활성도를 측정하기 위해 CD107a 탈과립화(Degranulation) 어세이를 수행하였다. CD107a는 종양세포의 일부에 나타나는 MHC 결핍 표적에 의해 자극된 NK 세포 표면에서 상향 조절되는 NK 세포 기능 활성의 마커이다. NK 세포에서 발현된 CD107a를 검출하기 표적 세포인 K562(ATCC, CAT# CCL-243)와 작동 세포인 말초혈액 유래 NK 세포(PBNK, 공여자혈액)와 iPSC 유래 NK 세포(iNK, 당사 자체제작)을 1:5 비율로 공배양 후 항-CD107a-PE 항체(Invitrogen, CAT#12-1079-42)를 사용하여 CD107a의 발현양을 측정하였다. 표적 세포와 작동 세포를 공배양한 실험군과 대조군에 CD107a-PE 항체를 1시간 동안 처리 후 염색된 CD107a가 소실되는 것을 막기 위해 단백질 수송 억제제인 BD Golgistop (BD Bioscience, CAT#554724)을 1X 처리 후 4시간 동안 반응시켰다. 표적 세포와 공배양된 작동 세포 중 CD3-/CD56+인 세포의 43.4%가 CD107a의 발현양이 증가된 것을 확인 하였고, 이는 비교군(10.9%) 대비 4배 이상 증가된 수치이며, PBNK 유래 NK 세포(8.3%) 보다도 높은 발현양을 확인하였다(도 8).
실시예 4: iPS 세포의 면역세포로의 분화
iPS 세포주를 이용하여 면역세포로의 분화를 유도하였다. 면역세포로 분화를 위해서는 조혈모세포(Hematopoietic Stem Cell, HSC)로 분화(1 단계)를 거쳐 면역세포로 분화(2 단계)를 완료한다. 1 단계 분화를 위해, 6-웰 플레이트 또는 25T 플라스크에 배양된 iPS 세포주를 96-웰 플레이트로 옮기고 spin-EB(300g, 5분)를 만들어 HSC 분화배지(STEMdiff AFEL2, STEMCELL technology CAT#05275)와 함께 분화를 유도하였다. 사용된 분화배지에는 BMP-4 (R&D systems CAT#314-BP-050), VEGF(R&D systems CAT#293-VE-050), SCF(Peprotech CAT#300-07)와 함께 Y-27632를 포함하였고, 6일간 EB(Embryoid Body)의 형태를 관찰하면서 배양하였다. HSC 분화는 HSC의 대표적인 마커인 CD34 발현을 통해 확인하였고, 본 연구의 경우 66% 비율로 HSC로 분화된 것을 확인하였다.
이후 면역세포로 분화를 유도하기 위한 2단계 분화를 위해 HSC 분화배지를 제거하고 IL-3(Peprotech CAT#200-3), IL-7(Peprotech CAT#200-07), IL-15 (Peprotech CAT#200-15), SCF 및 FLT3L(Peprotch CAT#300-19)이 포함된 NK 세포 분화배지로 교체한 다음 6일 동안 배양하여 NK세포의 분화를 유도하였다. 21일 동안 배양한 이후 FACS를 통해 CD3를 발현하지 않으면서 CD56과 CD45를 동시에 발현하는 NK 세포를 선별하였고, iPS 세포주 유래 NK 세포(iNK)를 77%의 비율로 확보하였다(도 4a).
실시예 5: IL-7 및 CCL19 발현 iPS 세포의 면역세포로의 분화
상기 실시예 2에서 제작된 7 x 19 iPS를 출발세포로 하여 실시예 4에서 기술한 과정과 동일한 방법으로 IL-7과 CCL19을 발현하는 NK 세포를 제작하였다(도 4b). 단일클론 7x19 iPS를 선별하여 6개 클론의 RCB를 구축하였으며, 이중 발현이 가장 안정적으로 이루어지는 3종의 7x19 iPSC를 실시예 4의 방법으로 NK 세포(7 x 19 iPSC-dervied NK cell, 7 x 19 iNK)로 분화시켰다. 각 클론별 7 x 19 iNK들의 배양액을 분석하여 IL-7과 CCL19의 발현양을 측정한 결과, 모든 세포에서 안정적으로 IL-7과 CCL19이 분비되고 있음을 확인하였다(도 5). 각 세포는 분화 6일째 83%의 생존률을 보였으며(도 6a),조혈모세포로 분화된 배아체(EB)를 NK 세포로 분화유도함으로써 최종적으로 약 70%의 CD3-CD56+의 NK 세포를 확보하였다.
실시예 6: IL-7 및 CCL19 발현 NK 세포에 의한 T 세포 주화성 및 증식 분석
NK 세포가 분비하는 IL-7 및 CCL19에 따른 T 세포 주화성(chemotaxis) 효과 및 증식 효과를 확인하고자, 12-웰의 트랜스웰(transwell)(Corning, CAT#CLS3421)을 이용하였으며, 챔버의 필터는 5μm의 폴리카보네이트(polycarbonate)를 이용하였다.
HuT78 T 세포주를 이용한 IL-7 x CCL19 NK92 세포 및 음성대조군의 비교
T 세포인 HuT78 세포(ATCC, CAT#TIB-161) 1 x 107 cell을 FBS가 제외되고 1% PS만 첨가된 IMDM(Gibco, CAT#12440053) 배지로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 5 x 106 cells/mL 밀도의 HuT78 세포 100μl를 상기와 동일한 배지를 사용하여 상부 챔버(upper chamber)에 분주하고, 챔버의 하층에는 실시예 2에서 제작한 IL-7/CCL19 NK92 세포주에서 2-3일 동안 배양한 배양액을 분주하였다.
이후, 37℃ 및 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 1일간 배양한 후, 상부 챔버를 제거하고 3일간 추가 배양하였다. 하부 챔버의 세포 수를 측정하기 위해, 웰당 배지 400 μl를 800g에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하여 농축된 샘플을 얻었다. 농축된 샘플 10μl에 Trypan blue 10μl를 1:1 비율로 혼합하여 Countess™ Ⅱ(Invitrogen, CAT#AMQAX1000)로 측정하였고, 400 μl내 총 생존 세포 수로 환산하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 실험군 | 하층 챔버의 세포 수(평균 ± 표준편차) |
| 음성 대조군 세포 | 3,836±276 |
| IL-7 x CCL19 NK92 세포 | 11,989±887 |
PBMC 유래 T 세포를 이용한 IL-7 x CCL19 NK92 세포, CCL19 x IL-7 NK92 세포 및 음성대조군의 비교
말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 분리한 T 세포의 주화성을 확인하기 위해 PBMC에서 T 세포를 EasySepTM Human T cell Isolation Kit(STEMCELL #17951)를 이용하여 분리하였고, 2 x 106 cells/mL 농도의 T 세포를 2% FBS가 포함된 RPMI1640 배지로 희석 후 100μl를 상부 챔버(upper chamber)에 분주하고, 챔버의 하층에는 실시예 2에서 제작한 IL-7 x CCL19 및 CCL19 x IL-7 형질전환 NK92 세포주에서 1일 동안 배양한 배양액을 분주하였다.
이후, 37℃ 및 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 1일간 배양한 후, 상부 챔버를 제거하고 3일간 추가 배양하였다. 하부 챔버의 세포 수를 측정하기 위해, 웰당 배지 500 μl를 800g에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하여 농축된 샘플을 얻었다. 농축된 샘플 10μl에 Trypan blue 10μl를 1:1 비율로 혼합하여 Countess™ Ⅱ로 측정하였고, 총 세포 수로 환산하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| T 세포 종류 | 실험군(n=2) | 하층 챔버로 이동한 T 세포 수 (평균 ± 표준편차, 104 세포) |
| PBMC 유래 T 세포 | 음성 대조군 NK92 세포 | 1.89 ± 0.75 |
| IL-7 x CCL19 NK92 세포 | 9.35 ± 0.53 | |
| CCL19 x IL-7 NK92 세포 | 6.46 ± 0.16 |
표 2 및 표 3에서 보는 바와 같이 음성대조군 공벡터 도입 NK92 세포주 대비 IL-7/CCL19 NK92 세포주 및 CCL19/IL-7 NK92 세포주 처리군에서 하부 챔버로 이동된 T 세포수가 현저하게 많았다. 이를 통해, IL-7 및 CCL19를 분비하도록 형질 전환된 NK92 세포주에 의해 T 세포의 주화성(chemotaxis) 및 이동한 T 세포의 증식 (proliferation) 유도 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 7: 형질전환 NK92 세포주와 이에 의해 이동한 T 세포의 암세포 사멸 효과 및 이와 관련된 분비 인자 측정
HepG2 간암 세포주(ATCC #HB-8065)를 2 x 105 cells/mL 농도로 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 희석시킨 후 0.1mL씩 96-웰 플레이트 각 웰에 분주하여 1일 동안 배양하였다. 전기천공법을 통해 1일간 배양한 형질전환 NK92 세포주가 포함된 0.5mL RPMI1640 배지를 실시예 6과 동일한 방법으로 트랜스웰 챔버 하층으로 옮기고 상부 챔버에는 PBMC에서 분리한 T 세포 2 x 105 cells/0.1mL을 옮겨 1일 동안 T 세포의 이동을 유도하였다. 이때, 하층 챔버에는 1 x 105 개의 CD3/CD28 Dynabeads와 100U IL-2을 첨가하여 이동한 T 세포가 활성화될 수 있도록 하였다. 1일간 배양 후 상부 챔버를 제거하고 HepG2 간암 세포주가 배양중인 96웰 플레이트에 웰당 0.1mL씩 옮긴 후 3일간 더 배양하였다. 그 이후 PBS(Phosphate Buffer Saline)을 이용하여 3회 세척 후 CCK-8 용액이 1% 함유된 10% FBS-RPMI1640배지 0.1mL로 교체 후 2시간 추가 배양하였다. HepG2 간암 세포주의 세포 생존 정도를 측정하기 위해 450nm에서 흡광도를 측정하였고 세포 생존 정도를 [식 2]와 같이 계산하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
[식 2]
또한, 위의 사멸 효과 측정에서 수집한 배지를 이용하여 활성화된 T 세포와 활성화된 NK 세포에서 분비하는 그랜자임(Granzyme)-B(Grz-B) 및 인터페론(Interferon-γ(IFN-γ), TNF(Tumor necrosis factor)-α의 분비량을 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; GrzB, abcam #ab235635; IFN-γ, komabiotech #K0331121; TNF-α, komabiotech #K0331131)을 통해 측정하여 그 결과를 표 5에 나타내었다. 표 4 및 표 5의 각 값은 평균±표준편차로 표시하였다.
| 암세포주 | 실험군 (n=3) | 세포 생존률 |
| HepG2 | 배지 (정상군) | 100.0 ± 7.8 |
| 음성대조군 (공벡터NK92) | 83.8 ± 2.1 | |
| IL-7 x CCL19 NK92 세포 | 33.2 ± 3.3 | |
| CCL19 x IL-7 NK92 세포 | 52.2 ± 3.5 |
| 암세포주 | 실험군 (n=2) | Grz-B (pg/mL) | IFN-γ(pg/mL) | TNF-α(pg/mL) |
| HepG2 | 배지 (정상군) | 592 ± 179 | N.D | N.D |
| 음성대조군 (공벡터 NK92) | 1,259 ± 81 | 8 ± 1 | N.D | |
| IL-7 x CCL19 NK92 세포 | 2,573 ± 450 | 320 ± 28 | 195 ± 37 | |
| CCL19 x IL-7 NK92 세포 | 1,460 ± 466 | 71 ± 3 | 33 ± 10 |
*N.D: Not detected (검출 안됨)
표 4에서 보는 바와 같이 음성대조군인 공벡터를 도입한 NK92 세포주에 비하여 IL-7 x CCL19 NK92 세포주 및 CCL19 x IL-7 NK92 세포주가 포함된 실험군에서 현저히 높은 HepG2 사멸 효과가 확인되었으며, 표 5에서와 같이 HepG2 세포주 사멸 효과와 관련된 인자들 역시 음성대조군 대비 IL-7 x CCL19 NK92 세포주, CCL19 x IL-7 NK92 세포주 시험군에서 더 높은 분비량을 보였다. 이에, IL-7 x CCL19 NK 세포 및 CCL19 x IL-7 NK 세포주 모두 효율적인 항암 치료제로 적용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 8: 7 x 19 iNK 세포의 암세포 사멸 효과
IL-7과 CCL19 유전자를 도입한 iPS 유래 NK 세포(7 x 19 iNK)와 유전자 도입 없는 iNK 세포의 항종양 효과를 인 비트로에서 비교한 결과, HepG2 세포주에 대한 유사한 사멸 효과를 확인하였다(도 9a). 이를 통해 IL-7과 CCL19 유전자의 도입이 iNK 세포의 종양세포에 대한 직접적인 살상 능력 감소를 유발하지 않음을 확인하였다. 따라서 개체의 면역체계를 활용할 수 있는 생체 내 환경에서는 유전자 도입 iNK 세포(7 x 19 iNK)가 유전자 미도입 iNK 세포 대비 더 높은 항종양 효과를 나타낼 것이 기대되었다. 유전자 도입 iNK 세포의 종양세포에 대한 살상 능력을 검증하기 위해 Sytox AADvanced(Dead cell)과 caspase3/7의 발현 분석을 통해 세포괴사(necrosis)와 자연사멸사(apoptosis)를 각각 측정한 결과 HepG2 세포주에 대한 유의한 사멸 효과가 나타남을 확인하였다(도 9b).
실시예 9: 7 x 19 iNK 세포에 의한 T 세포 주화성 효과
iPS 유래 NK 세포가 분비하는 IL-7 및 CCL19에 따른 T 세포 주화성(chemotaxis) 효과를 확인하고자, 5μm의 폴리카보네이트(polycarbonate) 필터가 포함된 12-웰의 트랜스웰(transwell)(Corning, CAT#CLS3421)의 상부 챔버(Upper chamber)에 T 세포를 분주하고, 하부 챔버(Lower chamber)에 세포를 분주하지 않거나(media only) 또는 암세포(HepG2); 7 x 19 iNK + 암세포; 유전자 도입 없는 iNK 세포 + 암세포를 각각 분주한 뒤 T 세포의 이동을 관찰하였다. 그 결과, 하부 챔버에 암세포 또는 암세포와 유전자 도입 없는 iNK 세포를 분주한 경우 대조군 대비 T 세포 이동의 유의한 증가가 관찰되지 않았으나, 암세포와 7 x 19 iNK를 공동 배양한 경우 상부 챔버의 T 세포 이동을 약 2 - 3배 증가시켰다. 또한, 유전자 도입이 없는 iNK 세포 대비 7 x 19 iNK에서 약 1.5 - 3배 수준의 T 세포 이동을 확인하였다(도 10a 및 10b). 아울러, 이동된 T 세포를 광학적으로 직접 확인하기 위해 Cytation5 세포 이미징 리더를 이용하여 이동한 세포를 un-labeled cell count 방식으로 계수하였다(10c, 배율 x 10). 이를 통해 IL-7 및 CCL19 유전자의 도입을 통해 유도만능줄기세포로부터 분화된 NK 세포의 T 세포 이동 유도가 현저히 촉진됨으로써 NK 세포와 이에 의해 리크루팅된 T 세포의 상호 보완적 면역 반응으로 다각적이고 상승적인 종양 살상 효과를 거둘 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (13)
- 전능성(pluripotent) 줄기세포로부터 분화되며, IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; 또는 이들의 조합을 발현하는 면역세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포는 IL-7 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; 또는 이들의 조합을 발현하는 것을 특징으로 하는 면역세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC), 배아생식세포(Embryonic Germ Cell), 배아종양세포(Embryonic Carcinoma Cell) 및 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포 이외의 면역세포인 것을 특징으로 하는 면역세포.
- 제 4 항에 있어서, 상기 T 세포 이외의 면역세포는 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 면역세포.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 면역세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 면역세포를 유효성분으로 포함하는이종 면역세포의 증식 또는 호밍(homing) 유도용 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 이종 면역세포는 T 세포 또는 수지상 세포(dendritic cell)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는 형질전환된 면역세포의 제조방법:(a) 전능성(pluripotent) 줄기세포에 IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; 또는 이들의 조합을 도입하는 단계; 및(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 세포를 면역세포로 분화시키는 단계.
- 제 9 항에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포 이외의 면역세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 T 세포 이외의 면역세포는 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자; 또는 이들의 조합을 발현하는 전능성(pluripotent) 줄기세포.
- 제 12 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC), 배아생식세포(Embryonic Germ Cell), 배아종양세포(Embryonic Carcinoma Cell) 및 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 전능성 줄기세포.
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