TW202039832A - γδＴ細胞及其用途 - Google Patents

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拉庫瑪 加內桑
伊克巴爾 格魯瓦爾
桑賈亞 辛格
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美商健生生物科技公司
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Abstract

所提供者係自人類周邊血液單核細胞(PBMC)擴增並單離γδ T細胞之方法。亦提供單離γδ T細胞、CAR-γδ T細胞，及其使用之方法。

Description

γδ T細胞及其用途
本發明係關於γδ T細胞之擴增和單離及γδ T細胞表現嵌合抗原受體用於過繼性T細胞療法(adoptive T cell therapy)之用途。
以目標特異性(target-specific)的方式特異性嚙合及殺死腫瘤細胞的T細胞之基因工程在為癌症患者建立新的治療選項方面已有結果，稱為經工程改造之T細胞療法(engineered T cell therapy)。此靶向一般係藉由用編碼嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的重組DNA分子對患者衍生之T細胞進行基因操作而形成。CAR係合成受體，其包含連接至連接肽之胞外靶向結構域、跨膜(transmembrane,TM)結構域、及一或多個胞內傳訊結構域。傳統上，胞外結構域由對給定的腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen,TAA)或細胞表面目標具有特異性的抗體之單鏈Fv片段(single chain Fv fragment,scFv)組成。該胞外scFv結構域賦予CAR之腫瘤特異性，而該傳訊結構域在TAA/目標嚙合時活化T細胞。將這些經工程改造之T細胞(CAR-T cell)重新輸注至癌症患者，其中彼等特異性嚙合並殺死表現該CAR之TAA目標的細胞(Maus et al.,Blood.2014 Apr 24；123(17)：2625-35；Curran and Brentjens,J Clin Oncol.2015 May 20；33(15)：1703-6)。
自體的、患者特異性CAR-T療法已成為一種對癌症，特別是對於CD19-陽性血液惡性疾病之強大且潛在有療效的療法。然而，CAR-T技術之發展及其廣泛應用由於許多關鍵缺點而部分受限，其包括a)實體腫瘤中無效的抗腫瘤反應、b)過繼性轉移CAR T細胞對免疫抑制型腫瘤微環境(immunosuppressive tumor microenviromment,TME)之有限的滲透及易感性、c)CAR-T細胞在體內之持久性不佳、d)患者中嚴重的不良事件，其包括細胞激素釋放症候群(cytokine release syndrome,CRS)及由CAR-T所介導之移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease,GVHD)、及e)製造所需之時間。
為避免現行CAR-T方法的主要問題，應開發替代的CAR-T策略。
在一個大致態樣中，所提供者係一種自人類周邊血液單核細胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)擴增並單離γδ T細胞之方法。該等方法包含(a)獲得人類PBMC；(b)使人類PBMC在包含唑來膦酸、介白素-2(IL-2)、及介白素-15(IL-15)之培養基中培養以擴增該等γδ T細胞；及(c)單離該等γδ T細胞。在某些實施例中，該唑來膦酸之濃度係約1μM至約20μM。在某些實施例中，唑來膦酸之濃度係約5μM。
在某些實施例中，該IL-2之濃度係約50IU/mL至約5000IU/mL。該IL-2之濃度可係例如約100IU/mL至約1000IU/mL。在某些實施例中，該IL-2係重組人類IL-2(recombinant human IL-2,rhIL-2)。
在某些實施例中，該IL-15之濃度係約1ng/mL至約100ng/mL。該IL-15之濃度可係例如約10ng/mL。在某些實施例中，該IL-15係重組人類IL-15(recombinant human IL-15,rhIL-15)。
在某些實施例中，該γδ T細胞係Vγ9Vδ2 T細胞。在某些實施例中，該等γδ T細胞係藉由流動式細胞測量術、磁性分離、及負向選擇來單離。
亦提供藉由本發明之方法所產生之單離γδ T細胞。
亦提供生成嵌合抗原受體(CAR)-γδ T細胞之方法。該等方法包含(a)獲得本發明之單離γδ T細胞；(b)使該γδ T細胞與編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸接觸，該CAR包含(i)胞外結構域；(ii)跨膜結構域；及(iii)胞內傳訊結構域，其中該CAR可選地進一步包含位於胺基端的信號肽及連接該胞外結構域和該跨膜結構域的鉸鏈區，且其中使該γδ T細胞與編碼該CAR的該核酸接觸生成CAR γδ T細胞。
在某些實施例中，該CAR包含(i)胞外結構域，其包含抗原結合結構域及/或抗原結合片段；(ii)跨膜結構域，其包含CD8α跨膜結構域；(iii)胞內傳訊結構域，其包含CD3ζ或4-1BB胞內結構域；(iv)信號肽，其包含CD8α信號肽；及(v)鉸鏈區，其包含CD8α鉸鏈區。
在某些實施例中，該CAR包含(i)該跨膜結構域，其具有與SEQ ID NO：1至少90%同一性的胺基酸序列；(ii)該胞內結構域，其具有與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少90%同一性的胺基酸序列；(iii)該信號肽，其具有與SEQ ID NO：4至少90%同一性的胺基酸序列；及(iv)該鉸鏈區，其具有與SEQ ID NO：5至少90%同一性的胺基酸序列。
在某些實施例中，該胞外結構域包含特異性結合腫瘤抗原的抗原結合結構域及/或抗原結合片段。
在某些實施例中，該CAR包含選自由SEQ ID NO：22至29組成之群組的胺基酸序列。
亦提供藉由本發明之方法所產生之CAR-γδ T細胞。
在某些實施例中，所提供者係一種醫藥組成物，其包含本發明之CAR-γδ T細胞及醫藥上可接受之載劑。
亦提供治療或預防有需要之對象的疾病或病況之方法。該等方法包含投予治療有效量的本發明之醫藥組成物。在某些實施例中，該疾病或病況係癌症。該癌症可係例如選自實體癌症(solid cancer)或液體癌症(liquid cancer)。該癌症可係但不限於選自由下列組成之群組的癌症：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌(bladder urothelial carcinoma)、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及其他實體腫瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、霍奇金氏淋巴瘤/疾病(Hodgkin’s lymphoma/disease,HD)、急性淋巴球性白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)、及其他液體腫瘤。
在某些實施例中，該疾病或病況係自體免疫疾病。該自體免疫疾病可係但不限於選自由下列組成之群組的自體免疫疾病：脫髮、類澱粉變性症、僵直性脊椎炎、Castleman氏病(CD)、乳糜瀉、克隆氏病(Crohn’s disease)、子宮內膜異位、纖維肌痛、腎小球性腎炎、格雷氏病(Graves’ disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、IgA腎病、狼瘡、萊姆病(lyme disease)、梅尼爾氏病(Meniere’s disease)、多發性硬化症、猝睡症、嗜中性球減少症、乾癬、乾癬性關節炎、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮症、第1型糖尿病、潰瘍性結腸炎、及白斑症。
亦提供產生包含CAR-γδ T細胞的醫藥組成物之方法，其中該等方法包含將本發明之CAR-γδ T細胞與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
前述發明內容以及下文中本申請案之較佳實施例的實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。然而應理解的是，本申請案並不受限於圖式中所示確切實施例。
前述發明內容以及下文中本申請案之較佳實施例的實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。然而應理解的是，本申請案並不受限於圖式中所示確切實施例。
〔圖1〕顯示總PBMC中Vγ9+ γδ T細胞之分佈。總PBMC經Fc阻斷並用抗TCR Vγ9及Vδ2抗體染色。代表性FACS圖顯示在總PBMC中活Vγ9+、Vγ9+Vδ2+、及Vδ2+ γδ T細胞之頻率(frequency)。
〔圖2A〕至〔圖2C〕顯示自整個PBMC，Zol選擇性地擴增Vγ9+ γδ T細胞。整個PBMC係在於不同時間點補充有rhIL-2+rhIL-15或Zol+rhIL-2+rhIL-15之完整RPMI(+10%FBS+1xPen/Strep)中培養至多14天。圖2A顯示用於識別TCR Vγ9+ γδ T細胞的流動式細胞測量術圈選策略(gating strategy)。圖2B顯示FACS圖，其表示在Zol不存在或存在之情況下培養14天的整個PBMC中Vγ9+細胞之頻率。圈選的細胞表示在總PBMC中Vγ9+細胞之頻率。圖2C顯示用rhIL-2+rhIL-15或用Zol+rhIL-2+rhIL-15培養8、12、及14天的整個PBMC中Vγ9+細胞之絕對數目。淺色及深色條分別表示在含有rhIL-2+rhIL-15及Zol+rhIL-2+rhIL-15之完整RPMI培養基中培養的PBMC。此處所表示係來自二個捐贈者HPU-06517及HPU-11073的累積數據。
〔圖3A〕至〔圖3C〕顯示休眠及經活化之Vγ9+ γδ T細胞之表型。將休眠及經Zol活化之Vγ9+ γδ T細胞用CD45RA、CD27、CD69、CD44、PD1、Tim-3、2B4、Lag3、及CTLA-4進行表面染色。圖3A顯示來自新鮮PBMC(左)及經Zol活化(右)之Vγ9+ γδ T細胞之分化圖。每個象限中的數字表示對應於該圈選的該群體之頻率。圖3B顯示新鮮及經活化之Vγ9+ γδ T細胞之活化及效應圖。測量CD44及CD69之表面表現，同時在細胞內描繪顆粒酶B(Granzyme B)及穿孔蛋白(Perforin)。圖3C顯示在新鮮及經活化之Vγ9+ γδ T細胞上的PD1、Tim-3、2B4、Lag3、及CTLA-4表現。每個FACS圖中的數字表示針對各別抗體的中間螢光強度(median fluorescence intensity,MFI)值。實心黑色封閉直方圖表示用於各別染色的FMO對照組。空心直方圖顯示在Vγ9+ γδ T細胞上各別標記之表現。
〔圖4〕顯示經由負向選擇增濃γδ T細胞。將第14天培養的γδ T細胞使用EasySep人類γδ T細胞單離套組經由負向選擇增濃。代表性直方圖顯示TCRαβ及TCRγδ在增濃之前(左)及增濃之後(右)之頻率。圈選中的數字係指在總細胞中該等細胞頻率。
〔圖5A〕及〔圖5B〕顯示用CAR mRNA轉染的增濃δγ T細胞之細胞存活力及轉染效率。將第14天之增濃γδ T細胞在Neon轉染系統上用GFP、或I3RB135_LH、或I3RB135-HL CAR mRNA電穿孔(1400V，脈寬20ms，1脈衝)。圖5A顯示代表性FACS圖，其說明在總δγ T細胞中活細胞之頻率(上排)及在總活δγ T細胞中GFP+細胞(下排，左圖)或CD123+細胞(下排，中及右圖)之頻率。圖5B，在沒有轉染系統之情況下將第14天之增濃γδ T細胞用GFP、或I3RB135 LH、或I3RB135-HL CAR mRNA培養且顯示代表性FACS圖，其說明在總γδ T細胞中活細胞之頻率(上排)及在總活γδ T細胞中GFP+細胞(下排，左圖)或CD123+細胞(下排，中及右圖)之頻率。
〔圖6A〕至〔圖6E〕顯示CAR轉染γδ T細胞之細胞毒性圖。將第14天之增濃γδ T細胞用EGFP或各種腫瘤靶向CAR mRNA構建體電穿孔(1400V，20ms，1脈衝)。將用CellTrackerTM Green CMFDA Dye標記之目標表現腫瘤細胞細胞系(Wt)與用CellTrackerTM Orange CMRA Dye標記之目標切除同基因剔除腫瘤細胞系(KO)以1：1的比例混合且在不同ET比率下與經CAR轉染之γδ T細胞共培養。在共培養20小時之後，腫瘤細胞的細胞毒性係藉由用7-AAD染色測量。圖6A顯示γδ CAR T細胞對TAA表現性細胞系之選擇性細胞毒性的示意圖。圖6B顯示BCMA γδ CAR-T細胞所介導之對BCMA表現性目標細胞系的選擇性細胞毒性。圖6C顯示GPRC5D γδ CAR-T細胞所介導之對GPRC5D表現性H929細胞系的選擇性細胞毒性。圖6D顯示CD33 γδ CAR-T細胞所介導之對CD33表現性目標細胞系的選擇性細胞毒性。圖6E顯示抗CD123 γδ CAR-T細胞所介導之對CD123+表現性目標細胞系的選擇性細胞毒性同時不傷害CD123-細胞。
〔圖7〕顯示抗腫瘤相關抗原(TAA)CAR-T構建體之示意圖，其由抗原特異性單鏈Fv(scFv)、接著可撓性絞鏈序列、及跨膜區段(來自人類CD8)組成。細胞質區係由4-1BB及CD3ζ組成。
各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。在本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或其類似者的論述，目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。
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除非以其他方式說明，在本文中描述之任何數值諸如濃度或濃度範圍應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此，數值一般包括記載值之±10%。例如，濃度1mg/mL包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同樣地，濃度範圍1%至10%(w/v)包括0.9%(w/v)至11%(w/v)。如本文中所使用，明示使用之數值範圍包括所有可能的子範圍、在該範圍內之所有個別數值，包括在該等範圍內之整數及數值之分數，除非上下文以其他方式清楚指示。
除非以其他方式指示，在一系列元件之前的用語「至少(at least)」應理解為係指該序列中的每一元件。所屬技術領域中具有通常知識者將認可或僅使用例行實驗即可確定本文所述之本發明的特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲涵蓋於本發明中。
如本文中所使用，用語「包含(comprises、comprising)」、「包括(includes、including)」、「具有(has、having)」、或「含有(contains、containing)」或彼等之任何其他變體將被理解為隱含包括所述整體或整體之群，但不排除任何其他整體或整體之群，且意欲為非排他性或開放式的。例如，包含表列元件之組成物、混合物、過程、方法、物品、或設備未必局限於僅該些元件，但可包括未明示表列或為該組成物、混合物、過程、方法、物品、或設備所固有之其他元件。再者，除非明示相反說明，「或(or)」係指包括性的「或」而非排他性的「或」。例如，下列任一者皆滿足條件A或B：A為 真(或存在)且B為偽(或不存在)、A為偽(或不存在)且B為真(或存在)、及A及B兩者皆為真(或存在)。
如本文中所使用，多個所述元件之間的聯合用語「及/或(and/or)」係理解為涵蓋個別及組合選項兩者。例如，其中兩個元件係藉由「及/或」結合，第一選項係指第一元件在沒有第二元件的情況下之適用性。第二選項係指第二元件在沒有第一元件的情況下之適用性。第三選項係指第一及第二元件一起的適用性。這些選項之任一者應理解為落入該含義內，並因此滿足如本文中所使用之用語「及/或」之要求。該等選項之多於一者的並行適用性亦應理解為落入該含義內，並因此滿足用語「及/或」之要求。
如本文中所使用，用語「由...組成(consists of)」、或諸如「由...組成(consist of或consisting of)」之變體，如在整個說明書及申請專利範圍中所使用，指示包括任何所述整體或整體之群組，但不能將額外的整體或整體之群組加入所指定之方法、結構、或組成物中。
如本文中所使用，用語「基本上由...組成(consists essentially of)」、或諸如「基本上由...組成(consist essentially of或consisting essentially of)」之變體，如在整個說明書及申請專利範圍中所使用，指示包括任何所述整體或整體之群組，並可選地包括任何所述整體或整體之群組，其不會實質上改變所指定之方法、結構、或組成物之基本或新穎性質。參見M.P.E.P.§ 2111.03。
如本文中所使用之「對象(subject)」意指任何動物，較佳的是哺乳動物，最佳的是人類。如本文中所使用的用語「哺乳動物(mammal)」，其涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物之實例包括(但不限於)牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、兔、天竺鼠、猴、人類等，更佳的是人類。
亦應理解的是，在本文中使用之用語「約(about)」、「大約(approximately)」、「通常(generally)」、「實質上(substantially)」、及類似用語當用於較佳發明之組分的尺寸或特徵時，指示所述尺寸/特徵並非嚴格邊界或參數，且不排除將為所屬技術領域中具有通常知識者所理解的彼等之功能上相同或類似的微小變化。在最小限度上，包括數值參數之該等指稱將包括使用所屬技術領域中已接受之數學及工業原理(例如，四捨五入、測量或其他系統誤差、製造公差等)不會改變最低有效數位(least significant digit)之變化。
在二或更多個核酸或多肽序列(例如，CAR多肽及編碼其之CAR多核苷酸)之上下文中，用語「同一(identical)」或「同一性(identity)」百分比係指當進行比較及比對以達最大對應性時，如使用下列序列比較演算法之一者或藉由目視檢查測量，二或更多個序列或子序列係相同的、或具有指定百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸。
為進行序列比較，一般將一個序列當作參考序列，並使測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列輸入電腦中，指定子序列座標(若有需要)，並指定序列演算法程式參數。序列比較演算法接著基於指定程式參數，計算(多個)測試序列相對於參考序列之序列同一性百分比。
序列比較之最佳比對可例如藉由以下進行：局部同源性演算法(Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2(4)：482-489(1981))、同源性對比演算法(Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48(3)：443-453(1970))、相似性搜尋法(Pearson & Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448(1988))、藉由這些演算法的電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA、及TFASTA)、或藉由目視檢查(大致參見Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.,eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,(1995 Supplement)(Ausubel))。
適合用於判定序列同一性及序列相似性百分比之演算法的實例係BLAST及BLAST 2.0演算法，其係描述於Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。執行BLAST分析之軟體由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)供大眾使用。此演算法涉及首先藉由在查詢序列中識別長度為W之短字組而識別高分序列對(HSP)，其在與資料庫序列中具有相同長度之字組排比時匹配或滿足某個正值閾值評分T。T係指鄰近字組評分閾(neighborhood word score threshold)(Altschul et al.，如前述)。此等初始的鄰近字組命中作用為種子而啟動搜尋以發現含有其等之較長HSP。接著將字組命中沿著各序列向兩方向延伸，只要可增加累積排比評分便繼續進行。
針對核苷酸序列，累積評分係使用參數M(匹配殘基對之獎勵評分(reward score)；總是>0)及N(錯配殘基之罰分；總是<0)來計算。針對胺基酸序列，使用評分矩陣以計算累積評分。字組命中在各方向之延伸在下列情況下停止：累積排比評分自其最大達成值下滑X之數量時；累積評分因為累積一或多個負分殘基排比而變成零或以下時；或達到任一序列之末端時。BLAST演算法參數W、T、及X判定排比之敏感度及速度。BLASTN程式(針對核苷酸序列)使用以下作為預設值：字組長度(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4、及兩股之比較。針對胺基酸序列，BLASTP程式使用以下作為預設值：字組長度(W)為3、期望值(E)為10、及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
除了計算序列同一性百分比之外，BLAST演算法亦執行兩序列間之相似性的統計分析(參見例如，Karlin & Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。其中一種由BLAST演算法所提供之相似性量度係最小總和機率(smallest sum probability,P(N))，其提供兩核苷酸或胺基酸序列之間隨機發生匹配之機率的指標。舉例而言，如在測試核酸與參考核酸之比較中，最小總和機率小於約0.1、更佳地小於約0.01、且最佳地小於約0.001，則將該核酸視為與參考序列相似。
二個核酸序列或多肽係實質上同一的進一步指示在於第一核酸編碼之多肽及第二核酸編碼之多肽具有如下所述之免疫交叉反應性。因此，例如當二個肽只有保守性取代之差異時，多肽一般係實質上與第二多肽同一。二個核酸序列係實質上同一的另一個指示在於二個分子在嚴謹條件下彼此雜交。
如本文中所使用，用語「單離(isolated)」意指生物組分(諸如核酸、肽、蛋白質、或細胞)已經與該組分所天然出現於內之生物體中的其他生物組分(即其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質、細胞、及組織)實質上分離、與該等其他生物組分分開產生、或自該等其他生物組分純化出來。已「單離(isolated)」之核酸、肽、蛋白質、及細胞因而包括藉由標準純化方法及本文中所述之純化方法所純化之核酸、肽、蛋白質、及細胞。「單離(isolated)」核酸、肽、蛋白質、及細胞可為組成物之一部分且仍為單離，只要該組成物並非該核酸、肽、蛋白質、及細胞之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、肽及蛋白質以及化學合成之核酸。
如本文中所使用，用語「多核苷酸(polynucleotide)」同義地稱為「核酸分子(nucleic acid molecule)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核酸(nucleic acid)」，係指任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可為未經修 飾之RNA或DNA、或經修飾之RNA或DNA。「多核苷酸(polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或(更典型地)雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混成分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。
如本文中所使用，用語「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。
如本文中所使用，用語「宿主細胞(host cell)」係指包含本發明之核酸分子之細胞。「宿主細胞(host cell)」可為任何類型的細胞，例如初代細胞(例如γδ T細胞)、培養中之細胞、或來自細胞系之細胞。在一個實施例中，「宿主細胞」是用本發明之核酸分子轉染之細胞。在另一個實施例中，「宿主細胞」是此一經轉染之細胞之後代或潛在後代。細胞的後代可能因為例如發生在後繼世代或核酸分子整合至宿主細胞基因體時可能發生的突變或環境影響，而與親代細胞同一或不同一。
如本文所使用，用語「表現(expression)」係指基因產物之生物合成。該用語涵蓋將基因轉錄成RNA。該用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多 肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。經表現之CAR可在宿主細胞之細胞質之內、進入胞外環境(諸如細胞培養物之生長培養基)、或錨定至細胞膜。
如本文中所使用，用語「肽(peptide)」、「多肽(polypeptide)」、或「蛋白質(protein)」可指包含胺基酸之分子且可被所屬技術領域中具有通常知識者辨識為蛋白質。本文中使用用於胺基酸殘基的習知一個字母或三個字母代碼。用語「肽(peptide)」、「多肽(polypeptide)」、及「蛋白質(protein)」在本文中可以互換使用以指任何長度之胺基酸的聚合物。聚合物可係線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可被非胺基酸間隔。該用語亦涵蓋具有經天然修飾或插入修飾的胺基酸聚合物；例如雙硫鍵的形成、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分接合。該定義中亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)的多肽、以及所屬技術領域中已知的其他修飾。
在本文中描述之肽序列係根據通常慣例書寫，其中肽之N端區域寫在左側，且C端區域寫在右側。雖然已知胺基酸具有異構形式，但除非以其他方式明示指示，否則以L型胺基酸表示。
如本文中所使用，用語「免疫細胞(immune cell)」或「免疫效應細胞(immune effector cell)」係指參與免疫反應，例如促進免疫效應反應的細胞。免疫細胞之實例包括T細胞、B細胞、天然殺手(natural killer,NK)細胞、肥大細胞、及骨髓衍生之吞噬細胞。根據具體實施例，該經工程改造之免疫細胞係T細胞(例如γδ T細胞)，且因為彼等係經工程改造以表現本發明之CAR所以被稱為CAR-T細胞(例如CAR γδ T細胞)。
如本文中所使用，用語「經工程改造之免疫細胞(engineered immune cell)」係指已藉由以DNA或RNA形式對該細胞之總基因材料添加額外 的基因材料來進行基因修飾之免疫細胞，亦稱為免疫效應細胞。根據本文中之實施例，經工程改造之免疫細胞已經基因修飾以表現根據本發明之CAR構建體。
擴增及純化γδ T細胞之方法
本文中所提供者係基於γδ T細胞之同種異體現成的CAR-T細胞產品。使用γδ T細胞能夠開發高品質的產品，其結合δγ T細胞固有的通用性(versatile nature)與彼等高效地溶細胞功能以減少腫瘤逃逸(tumor escape)之風險。此方法可有助於減少由CRS/GVHD所介導之副作用並預防長期的自體免疫，同時提供優異之療效，特別是在實體腫瘤中。γδ在血液中有豐富的T細胞，其具有良好之分選標記且可藉由良好定義之配體輕易地活化並大量擴增。由於γδ T細胞之辨識與MHC無關，γδ T細胞不會參與GVHD，且沒有同種異體辨識之風險，所以γδ T細胞可作為CAR-T之同種異體來源以用於更廣大的患者群體。現成的產品可具有數種優勢，其包括一致的品質、細胞可經分選以用於100%轉導、對劑量大小沒有限制、降低成本、並為患者的啟始治療節省大量時間。
根據特定態樣，本發明提供自人類周邊血液單核細胞(PBMC)擴增並單離γδ T細胞之方法。在一個大致態樣中，該等方法包含(a)獲得人類PBMC；(b)使人類PBMC在包含唑來膦酸、介白素-2(IL-2)、及介白素-15(IL-15)之培養基中培養以擴增該等γδ T細胞；及(c)單離該等γδ T細胞。在某些實施例中，該γδ T細胞係Vγ9Vδ2 T細胞。
亦提供藉由本發明之方法所產生之單離γδ T細胞，其包括單離Vγ9Vδ2 T細胞。
在某些實施例中，唑來膦酸之濃度係約1μM至約20μM。唑來膦酸之濃度可係約3μM至約18μM、約5μM至約16μM、約7μM至約14μM、約9μM至約12μM。唑來膦酸之濃度可例如係約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20μM。在某些實施例中，唑來膦酸之濃度係約5μM。
在某些實施例中，該IL-2之濃度係約50IU/mL至約5000IU/mL。IL-2之濃度可係例如約50IU/mL至約4000IU/mL、約50IU/mL至約3000IU/mL、約50IU/mL至約2000IU/mL、約50IU/mL至約1000IU/mL、約50IU/mL至約500IU/mL、約50IU/mL至約250IU/mL、約100IU/mL至約5000IU/mL、約100IU/mL至約4000IU/mL、約100IU/mL至約3000IU/mL、約100IU/mL至約2000IU/mL、約100IU/mL至約1000IU/mL、約100IU/mL至約500IU/mL、約250IU/mL至約5000IU/mL、約250IU/mL至約4000IU/mL、約250IU/mL至約3000IU/mL、約250IU/mL至約2000IU/mL、約250IU/mL至約1000IU/mL、約500IU/mL至約5000IU/mL、約500IU/mL至約4000IU/mL、約500IU/mL至約3000IU/mL、約500IU/1mL至約2000IU/mL、約500IU/mL至約1000IU/mL、約1000IU/mL至約5000IU/mL、約1000IU/mL至約4000IU/mL、約1000IU/mL至約3000IU/mL、約1000IU/mL至約2000IU/mL、約2000IU/mL至約5000IU/mL、約2000IU/mL至約4000IU/mL、約2000IU/mL至約3000IU/mL、或介於其間之任何濃度。在某些實施例中，IL-2之濃度係50、100、250、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或5000IU/mL。在某些實施例中，該IL-2係重組人類IL-2(recombinant human IL-2,rhIL-2)。
在某些實施例中，該IL-15之濃度係約1ng/mL至約100ng/mL。IL-15之濃度可係約1ng/mL至約90ng/mL、約1ng/mL至約80ng/mL、約1 ng/mL至約70ng/mL、約1ng/mL至約60ng/mL、約1ng/mL至約50ng/mL、約1ng/mL至約40ng/mL、約1ng/mL至約30ng/mL、約1ng/mL至約20ng/mL、約1ng/mL至約10ng/mL、約10ng/mL至約100ng/mL、約10ng/mL至約90ng/mL、約10ng/mL至約80ng/mL、約10ng/mL至約70ng/mL、約10ng/mL至約60ng/mL、約10ng/mL至約50ng/mL、約10ng/mL至約40ng/mL、約10ng/mL至約30ng/mL、約10ng/mL至約20ng/mL、約25ng/mL至約100ng/mL、約25ng/mL至約90ng/mL、約25ng/mL至約80ng/mL、約25ng/mL至約70ng/mL、約25ng/mL至約60ng/mL、約25ng/mL至約50ng/mL、約25ng/mL至約40ng/mL、約50ng/mL至約100ng/mL、約50ng/mL至約90ng/mL、約50ng/mL至約80ng/mL、約50ng/mL至約70ng/mL、約50ng/mL至約60ng/mL、或介於其間之任何值。該IL-15之濃度可係例如約10ng/mL。在某些實施例中，該IL-15係重組人類IL-15(recombinant human IL-15,rhIL-15)。
亦提供生成嵌合抗原受體(CAR)-γδ T細胞之方法。該等方法包含(a)獲得本發明之單離γδ T細胞；(b)使該γδ T細胞與編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸接觸，該CAR包含(i)胞外結構域；(ii)跨膜結構域；及(iii)胞內傳訊結構域，其中該CAR可選地進一步包含位於胺基端的信號肽及連接該胞外結構域和該跨膜結構域的鉸鏈區，且其中使該γδ T細胞與編碼該CAR的該核酸接觸生成CAR-γδ T細胞。
因此，在某些實施例中，單離γδ T細胞可包含編碼CAR之單離多核苷酸或包含編碼CAR之單離多核苷酸的載體。包含單離多核苷酸及/或載體之免疫細胞可稱為「經工程改造之免疫細胞」。較佳的是，該等經工程改造之免疫細胞係衍生自人類(在進行重組前係人類來源的)。經工程改造之免疫細胞可係例如T細胞，且具體而言係藉由本文中所述之方法單離的γδ T細胞。在某些實施例中，γδ T細胞係藉由本文中所述之方法單離的Vγ9Vδ2 T細胞。
γδ T細胞，包括Vγ9Vδ2 T細胞可使用本文中所述之方法擴增及單離。免疫細胞可額外藉由所屬技術領域中已知之方法，包括市售可得的方法(參見例如Rowland Jones et al.,Lymphocytes：A Practical Approach,Oxford University Press,NY(1999))單離。免疫細胞或其前驅物的來源包括但不限於周邊血液(例如周邊血液單核細胞(PBMC))、臍帶血、骨髓、或其他來源的造血細胞。可採用各種技術分離細胞以單離或增濃所欲之免疫細胞。例如，可使用負向選擇方法以移除不是所欲免疫細胞的細胞。此外，可使用正向選擇方法以單離或增濃所欲免疫細胞或其前驅物，或可採用正向及負向選擇方法之組合。若要單離特定類型的細胞，例如特定T細胞，則可使用各種細胞表面標記或標記之組合(例如CD3、CD4、CD8、CD34)以分離細胞。在某些實施例中，該等γδ T細胞係藉由流動式細胞測量術、磁性分離、及負向選擇來單離。
在本發明之治療方法中，γδ T細胞對彼等所投予之對象可係自體的或非自體的。自體細胞係自要投予重組表現CAR的經工程改造之免疫細胞的對象中單離。替代地，可使用來自不是對象之非自體捐贈者的同種異體細胞。在非自體捐贈之情況下，將該等細胞針對人類白血球抗原(human leukocyte antigen,HLA)進行分型及匹配以判定適當的相容性程度。對於自體及非自體細胞，可選地可將該等細胞凍存直至準備使用。
根據具體實施例，製造經工程改造之免疫細胞之方法包含轉染或轉導自個體單離的免疫效應細胞，使得該等免疫效應細胞表現根據本發明之實施例的一或多種CAR。製備用於免疫療法的免疫細胞之方法係描述於例如WO2014/130635、WO2013/176916、及WO2013/176915，其等係以引用方式併入本文中。可用於製備經工程改造之免疫細胞的個別步驟係揭示於例如WO2014/039523、WO2014/184741、WO2014/191128、WO2014/184744、及WO2014/184143中，其係以引用方式併入本文中。
在一具體實施例中，免疫效應細胞(諸如γδ T細胞)係經本發明之CAR基因修飾(例如用包含編碼CAR之核酸的病毒載體轉導)，然後在體外活化及擴增。在各種實施例中，T細胞可在基因修飾之前或之後使用如下列中所述之方法活化並擴增以表現CAR，例如US6352694、US6534055、US6905680、US6692964、US5858358、US6887466、US6905681、US7144575、US7067318、US7172869、US7232566、US7175843、US5883223、US6905874、US6797514、US6867041、US2006/121005中，其係以引用方式併入本文中。T細胞可在體外或體內擴增。大致而言，本發明之T細胞可藉由與具有刺激CD3/TCR複合物相關信號的試劑及刺激T細胞表面上之共同刺激分子的配體附接其上的表面接觸而擴增。作為非限制性實例，T細胞群體可如本文中所描述者進行刺激，諸如藉由與抗CD3抗體、或其抗原結合片段、或固定於表面上之抗CD2抗體接觸，或藉由與鈣離子載體結合的蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)接觸、或藉由CAR本身之活化。針對T細胞表面上輔助分子之共同刺激，使用結合輔助分子之配體。舉例而言，T細胞群體可與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞之增殖的條件下接觸。適於T細胞培養的條件包括例如可含有增殖及存活所必需之因子的適當培養基(例如最低必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 5(Lonza))，該等因子包括血清(例如胎牛血清或人類血清)、細胞介素(諸如IL-2、IL-7、IL-15、及/或IL-21)、胰島素、IFN-γ、GM-CSF、TGFβ、及/或所屬技術領域中具有通常知識者已知的用於細胞生長之任何其他添加劑。在其他實施例中，T細胞可使用諸如在US6040177、US5827642、及WO2012129514中所述者之方法，用餵養細胞(feeder cell)及適當的抗體和細胞介素活化並刺激以增殖，該等文獻係以引用方式併入本文中。
嵌合抗原受體(CAR)
如本文中所使用，用語「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」(CAR)係指一種重組多肽，其包含至少特異性結合至抗原或目標的胞外結構域、跨膜結構域、及胞內T細胞受體活化傳訊結構域。CAR之胞外結構域與目標細胞表面上的目標抗原之嚙合導致CAR之群集並將活化刺激物遞送至該含有CAR之細胞。CAR重導向了免疫效應細胞之特異性且觸發增殖、細胞介素生產、吞噬作用、及/或可以主要組織相容性(MHC)非依賴性之方式介導目標抗原表現細胞之細胞死亡的分子之生產。
如本文中所使用，用語「信號肽(signal peptide)」係指在新生CAR蛋白之胺基端(N端)處的前導序列，其共譯地或後譯地將新生蛋白導向至內質網且隨後表面表現。
如本文中所使用，用語「胞外抗原結合結構域(extracellular antigen binding domain)」、「胞外結構域(extracellular domain)」、或「胞外配體結合結構域(extracellular ligand binding domain)」係指位於細胞膜外側且能夠結合至抗原、目標、或配體的CAR部分。
如本文中所使用，用語「鉸鏈區(hinge region)」係指連接CAR蛋白之兩個相鄰結構域，例如胞外結構域及跨膜結構域的CAR部分。
如本文中所使用，用語「跨膜結構域(transmembrane domain)」係指延伸穿過細胞膜並將CAR錨定至細胞膜的CAR部分。
如本文中所使用，用語「胞內T細胞受體活化傳訊結構域(intracellular T cell receptor-activating signaling domain)」、「細胞質傳訊結構域(cytoplasmic signaling domain)」、或「胞內傳訊結構域(intracellular signaling domain)」係指位於細胞膜內側且能夠轉導效應信號的CAR部分。
如本文中所使用，用語「刺激分子(stimulatory molecule)」係指由提供(多個)初級細胞質傳訊序列的T細胞所表現之分子，該等初級細胞質傳訊序列針對T細胞傳訊路徑之至少一些態樣以刺激方式調節T細胞受體(T cell receptor,TCR)複合物之初級活化。刺激分子包含二種不同類別的細胞質傳訊序列：起始抗原依賴性初級活化者(稱為「初級傳訊結構域(primary signaling domain)」)、及以抗原非依賴性之方式起作用以提供二級的共同刺激信號者(稱為「共同刺激傳訊結構域(co-stimulatory signaling domain)」)。
在某些大致態樣中，本文中所提供者係生成嵌合抗原受體(CAR)γδ T細胞之方法。該等方法可包含(a)獲得本發明之單離γδ T細胞；(b)使該γδ T細胞與編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸接觸，該CAR包含(i)胞外結構域；(ii)跨膜結構域；及(iii)胞內傳訊結構域，其中該CAR可選地進一步包含位於胺基端的信號肽及連接該胞外結構域和該跨膜結構域的絞鏈區，且其中使該γδ T細胞與編碼該CAR的該核酸接觸生成CAR γδ T細胞。
在某些實施例中，胞外結構域包含抗原結合結構域及/或抗原結合片段。在某些實施例中，胞外結構域包含與選自由SEQ ID NO：6至13所組成之群組的胺基酸序列至少90%同一性的胺基酸序列，較佳的是選自由SEQ ID NO：6至13所組成之群組的胺基酸序列。
在某些實施例中，抗原結合片段係Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈可變片段(scFv)、微小抗體(minibody)、雙體抗體(diabody)、單結構域抗體(single-domain antibody,sdAb)、輕鏈可變結構域(light chain variable domain,VL)、或駱駝抗體之可變結構域(VHH)。
在某些實施例中，抗原結合片段係單鏈可變片段(scFv)。scFv可係例如選自由SEQ ID NO：14至21所組成之群組的胺基酸序列。
在某些實施例中，抗原結合結構域及/或抗原結合片段可例如特異性地結合腫瘤抗原。可基於由待治療對象所展現之腫瘤及/或癌症的類型選擇用於被抗體或抗原結合片段結合的任何適合腫瘤抗原。
在某些實施例中，CAR之胞外結構域係以位於胺基端的信號肽為先導。任何適合的信號肽皆可用於本發明中。信號肽可例如係衍生自天然、合成、半合成、或重組來源。根據一個實施例，信號肽係人類CD8α信號肽、人類CD3δ信號肽、人類CD3ζ信號肽、人類GMCSFR信號肽、人類4-1BB信號肽、或其衍生物。根據具體實施例，信號肽係人類CD8α信號肽。人類CD8α信號肽包含與SEQ ID NO：4至少90%同一性的胺基酸序列，較佳的是SEQ ID NO：4之胺基酸序列。信號肽可在CAR之易位期間或在CAR之完成易位之後，藉由信號肽酶切割以生成不含信號肽的成熟CAR。
在某些實施例中，CAR可進一步包含連接胞外結構域及跨膜結構域的鉸鏈區。鉸鏈區的功能為將胞外結構域移離經工程改造之免疫細胞的表面，以使細胞/細胞能夠適當的接觸，從而結合至目標或抗原及活化(Patel et al.,Gene Therapy 6：412-9(1999))。任何適合的鉸鏈區皆可用於本發明之CAR中。鉸鏈區可係衍生自天然、合成、半合成、或重組來源。根據具體實施例，CAR之鉸鏈區係來自CD8α肽的鉸鏈區。在具體實施例中，鉸鏈區包含與SEQ ID NO：5至少90%同一性的胺基酸序列，較佳的是SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
本發明之CAR包含跨膜結構域。任何適合的跨膜結構域皆可用於本發明之CAR中。跨膜結構域可係衍生自天然、合成、半合成、或重組來源。根據一些實施例，跨膜結構域係來自肽的跨膜結構，該等肽選自由下列組成之群組：CD8α肽、CD28肽、CD4肽、CD3ζ肽、CD2肽、4-1BB肽、OX40肽、ICOS肽、CTLA-4肽、PD-1肽、LAG-3肽、2B4肽、BTLA肽、GMCSFR肽、及類似者。在具體實施例中，跨膜結構域係CD8α跨膜結構域。CD8α跨膜 結構域可包含與SEQ ID NO：1至少90%同一性的胺基酸序列，較佳的是SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
本發明之CAR包含胞內傳訊結構域。任何適合的胞內結構域皆可用於本發明之CAR中。在具體實施例中，使用全部胞內傳訊結構域。在其他具體實施例中，使用轉導效應子或信號的傳訊結構域之截短部分。根據本發明之實施例，胞內傳訊結構域生成信號，其促進含有CAR之細胞(例如CAR-T細胞)之免疫效應功能，包括但不限於增殖、活化、及/或分化。在具體實施例中，該等信號促進例如CAR-T細胞之溶細胞活性、輔助活性、及/或細胞介素分泌。根據一些實施例，CAR之胞內傳訊結構域包含下列之傳訊結構域：Fcγ受體(FcγR)、Fcε受體(FcεR)、Fcα受體(FcαR)、初生Fc受體(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66δ、CD79α、CD79β、CD80、CD86、CD278(亦稱為ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC複合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3β、C3δγ、C3δ、及Zap70。根據一些實施例，胞內傳訊結構域係選自於由下列組成之群組的傳訊結構域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79α、CD79β、及CD66δ。在具體實施例中，胞內結構域係CD3ζ或4-1BB胞內結構域。CD3ζ或4-1BB胞內結構域可包含分別與SEQ ID NO：2或3至少90%同一性的胺基酸序列，較佳的是分別為SEQ ID NO：2或3之胺基酸序列。
根據具體實施例，胞內傳訊結構域進一步包含一或多個共同刺激傳訊結構域。共同刺激結構域可例如包含選自下列肽之傳訊結構域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF-R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配體/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配體/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配體/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、戴克丁-1/CLEC7A(Dectin-1/CLEC7A)、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配體/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA Class I、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function associated antigen,LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配體/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1、及VLA-6。在某些實施例中，共同刺激結構域係選自由下列一或多個的共同刺激結構組成之群組：CD28、4-1BB(CD137)、CD27、 OX40、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、CD83、及與CD83特異性結合的配體。
在某些實施例中，該CAR包含選自由SEQ ID NO：22至29組成之群組的胺基酸序列。
抗體結合片段
抗體
本發明大致上係關於CAR構建體，其包含抗原結合片段。抗原結合片段可係例如特異性結合腫瘤抗原之抗體或其抗原結合片段。本發明之抗原結合片段具備一或多種所欲的功能性質，包括但不限於對腫瘤抗原具有高親和性結合、對腫瘤抗原具有高特異性、刺激補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)的能力、抗體依賴性細胞性吞噬作用(antibody-dependent phagocytosis,ADPC)、及/或對細胞表現腫瘤抗原具有抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(antibody-dependent cellular-mediated cytotoxicity,ADCC)、及當單獨投予或與其他抗癌療法組合投予時，在有需要的對象及動物模型中抑制腫瘤生長的能力。
抗原結合片段可係例如特異性結合腫瘤抗原之抗體或其抗原結合片段。可基於由待治療對象所展現之腫瘤及/或癌症的類型選擇用於被抗體或抗原結合片段結合的任何適合腫瘤抗原。適合的抗原包括但不限於間皮素(mesothelin,MSLN)、前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)、前列腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen,PCSA)、碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX,CAIX)、B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen， BCMA或BCM)、G蛋白質偶合受體家族C第5群成員D(G-protein coupled receptor family C group 5 member D,GPRC5D)、介白素-1受體輔助蛋白(Interleukin-1 receptor accessory protein,IL1RAP)、δ樣3(delta-like 3,DLL3)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、上皮醣蛋白-2(epithelial glycoprotein-2,EGP 2)、上皮醣蛋白-40(epithelial glycoprotein-40,EGP-40)、上皮黏著分子(epithelial adhesion molecule,EpCAM)、葉酸結合蛋白(folate-binding protein,FBP)、胎兒乙醯膽鹼受體(fetal acetylcholine receptor,AChR)、葉酸受體α及β(FRα及β)、神經節苷脂G2(ganglioside G2,GD2)、神經節苷脂G3(ganglioside G3,Gd3)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2/ERB2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、表皮生長因子受體vIII(epidermal growth factor receptor vIII,EGFRvIII)、ERB3、ERB4、人類端粒酶反轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、介白素13受體次單元α-2(interleukin-13 receptor subunit alpha-2,IL-13Rα2)、k輕鏈、激酶插入域受體(kinase insert domain receptor,KDR)、路易士A(Lewis A,CA19.9)、路易士Y(Lewis Y,LeY)、L1細胞黏著分子(L1 cell adhesion molecule,LICAM)、黑色素瘤相關抗原(黑色素瘤家族A1(melanoma-associated antigen 1，MAGE-A1))、黏蛋白-16(mucin-16,Muc-16)、黏蛋白1(mucin 1,Muc-1)、NKG2D配體、癌症睪丸抗原(cancer-testis antigen,NY-ESO-1)、腫瘤胎抗原(oncofetal antigen,h5T4)、腫瘤相關醣蛋白72(tumor-associated glycoprotein 72,TAG-72)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血管內皮生長因子受體R2(vascular endothelial growth factor R2,VEGF-R2)、威爾姆斯腫瘤(Wilms tumor protein,WT-1)、第1型酪胺酸蛋白激酶 跨膜受體(type 1 tyrosine-protein transmembrane receptor,ROR1)、B7-H3(CD276)、B7-H6(Nkp30)、硫酸軟骨蛋白多糖-4(chondroitin sulfate proteoglycan-4,CSPG4)、DNAX輔助分子(DNAX accessory molecule,DNAM-1)、肝配蛋白A型受體2(ephrin type A receptor 2,EpHA2)、纖維母細胞相關蛋白(fibroblast associated protein,FAP)、Gp100/HLA-A2、磷脂肌醇聚糖3(glypican 3,GPC3)、HA-1H、HERK-V、IL-11Rα、潛伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP1)、神經細胞黏著分子(neural cell-adhesion molecule,N-CAM/CD56)、及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體(trail receptor,TRAIL R)。
如本文中所使用，用語「抗體(antibody)」係以廣義的方式使用，並包括免疫球蛋白或抗體分子，抗體分子包括人類、人源化、複合物、及嵌合抗體和抗體片段，其係單株或多株。大致上，抗體是對特定抗原展現出結合特異性之蛋白質或肽鏈。抗體結構係熟知的。免疫球蛋白可分為五大類(即，IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM)，取決於重鏈恆定域胺基酸序列。IgA及IgG係進一步被細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。因此，本發明之抗體可以是五大類或對應子類中之任一者。較佳的是，本發明之抗體是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。脊椎動物物種的抗體輕鏈可分為兩種截然不同類型(即κ及λ)中之一者，此係基於其恆定域的胺基酸序列。因此，本發明之抗體可含有κ或λ輕鏈恆定域。根據具體實施例，本發明之抗體包括來自大鼠或人類抗體之重鏈及/或輕鏈恆定區。除了重鏈及輕鏈恆定域之外，抗體含有抗原結合區，其係由輕鏈可變區及重鏈可變區構成，該輕鏈可變區及重鏈可變區各含有三個結構域(即互補決定區1至3；CDR1、CDR2、及CDR3)。輕鏈可變區域替代地稱為LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且重鏈可變區域替代地稱為HCDR1、HCRD2、及HCDR3。
如本文中所使用，用語「單離抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如，特異性結合至特定腫瘤抗原的單離抗體實質上不含不結合至該腫瘤抗原的抗體)。此外，單離抗體實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
如本文中所使用，用語「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上均質的抗體之群體獲得之抗體，即，除了可能少量存在之可能天然發生之突變以外，構成該群體之個別抗體係相同的。本發明之單株抗體可藉由融合瘤方法、嗜菌體展示技術、單淋巴球基因選殖技術、或藉由重組DNA方法製備。例如，單株抗體可藉由融合瘤生產，該融合瘤包括獲自基因轉殖非人類動物(諸如基因轉殖小鼠或大鼠)的B細胞，該B細胞具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因的基因體。
如本文中所使用，用語「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指抗體片段諸如例如雙體抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、雙硫鍵穩定性Fv片段(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、雙硫鍵穩定性雙體抗體(ds雙體抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、單結構域抗體(single domain antibody,sdAb)、scFv二聚體(雙價雙體抗體)、由包含一或多個CDR之抗體的一部分形成之多特異性抗體、駱駝單結構域抗體、微小抗體、奈米抗體、結構域抗體、雙價結構域抗體、輕鏈可變結構域(light chain variable domain,VL)、駱駝抗體之可變結構域(VHH)、或任何其他結合至抗原但不包含完整抗體結構之抗體片段。抗原結合片段能夠結合至親本抗體(parent antibody)或親本抗體片段所結合之相同抗原。
本文中所使用，用語「單鏈抗體(single-chain antibody)」係指所屬技術領域中習知之單鏈抗體，其包含由約15至約20個胺基酸之短肽(例如連接肽)連接的重鏈可變區及輕鏈可變區。
本文中所使用之用語「單結構域抗體(single domain antibody)」係指所屬技術領域中習知之單結構域抗體，其包含重鏈可變區及重鏈恆定區或其僅包含重鏈可變區。
如本文中所使用，用語「人類抗體(human antibody)」係指由人類產生之抗體或使用所屬技術領域中已知之任何技術製造之具有對應於由人類產生之抗體的胺基酸序列之抗體。此人類抗體之定義包括完整或全長抗體、其片段、及/或包含至少一個人類重鏈及/或輕鏈多肽的抗體。
如本文中所使用，用語「人源化抗體(humanized antibody)」係指經修飾以增加與人類抗體之序列同源性的非人類抗體，使得抗體之抗原結合性質得以保留但其在人體內之抗原性減小。
本文中所使用之用語「嵌合抗體(chimeric antibody)」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列係衍生自二或更多個物種之抗體。輕鏈及重鏈二者之可變區通常對應具有所欲特異性、親和性及能力之衍生自一個哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗體可變區，然而恆定區對應衍生自另一個哺乳動物物種(例如人類)的抗體序列以避免在該物種引發免疫反應。
如本文中所使用，用語「多特異性抗體(multispecific antibody)」係指包含複數個免疫球蛋白可變域序列之抗體，其中複數個中之第一免疫球蛋白可變域序列具有對第一表位之結合特異性，且複數個中之第二免疫球蛋白可變域序列具有對第二表位之結合特異性。在一實施例中，第一及第二表位係在相同抗原例如相同蛋白質(或多聚體蛋白質的次單元)上。在一實施例中，第一及第二表位重疊或實質上重疊。在一實施例中，第一及第二表位不重疊或實質上不重疊。在一實施例中，第一及第二表位係在不同抗原例如不同蛋白質(或多聚體蛋白質的不同次單元)上。在一實施例中，多特異性抗體 包含第三、第四、或第五免疫球蛋白可變域。在一實施例中，多特異性抗體係雙特異性抗體分子、三特異性抗體分子、或四特異性抗體分子。
如本文中所使用，用語「雙特異性抗體(bispecifc antibody)」係指結合不多於兩種表位或兩種抗原之多特異性抗體。雙特異性抗體之特徵在於具有對第一表位的結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列、及具有對第二表位的結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。在一實施例中，第一及第二表位係在相同抗原例如相同蛋白質(或多聚體蛋白質的次單元)上。在一實施例中，第一及第二表位重疊或實質上重疊。在一實施例中，第一及第二表位係在不同抗原例如不同蛋白質(或多聚體蛋白質的不同次單元)上。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列、以及對第二表位具有結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性之半抗體或其片段、以及對第二表位具有結合特異性之半抗體或其片段。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性之scFv或其片段、以及對第二表位具有結合特異性之scFv或其片段。在一實施例中，第一表位係位於腫瘤抗原上且第二表位係位於PD-1、PD-L1、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD3、及/或其他腫瘤相關免疫抑制因子或表面抗原上。
如本文中所使用，「特異性結合至腫瘤抗原(specifically binds to a tumor antigen)」的抗原結合結構域或抗原結合片段係指以1×10-7M或更小、較佳的是1×10-8M或更小、更較佳的是5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小、或1×10-10M或更小之KD結合腫瘤抗原的抗原結合結構域或抗原結合片段。用語「KD」係指解離常數，此常數獲自Kd對Ka之比例(即Kd/Ka)，並以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用本揭露所屬技術領域中之方法判定。例如，抗原結合結構域或抗原結合片段之KD可藉由使用表面電 漿共振(諸如藉由使用生物感測器系統，例如Biacore®系統)、或藉由使用生物層干涉技術(諸如Octet RED96系統)判定。
抗原結合結構域或抗原結合片段之KD值愈小，抗原結合結構域或抗原結合片段結合至目標抗原的親和性愈高。
根據具體態樣，本發明係關於一種CAR構建體，其包含抗原結合片段，其中該抗原結合片段係特異性結合腫瘤抗原的抗體或抗原結合片段。抗原結合片段可係例如係Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈可變片段(scFv)、微小抗體、雙體抗體、單結構域抗體(sdAb)、輕鏈可變結構域(VL)、或駱駝抗體之可變結構域(VHH)。
多核苷酸、載體、及宿主細胞
在另一大致態樣中，本發明係關於一種單離核酸，其編碼本發明之嵌合抗原受體(CAR)。所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解的是，可以改變(例如，置換、刪除、插入等)CAR之編碼序列而不改變該蛋白質之胺基酸序列。因此，所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，可改變編碼本發明之CAR的核酸序列而不改變該蛋白質之胺基酸序列。
在另一大致態樣中，本發明係關於一種載體，其包含本發明之CAR。鑒於本揭露，可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何載體，諸如質體、黏質體、噬菌體載體、或病毒載體。在一些實施例中，載體是重組表現載體，諸如質體。該載體可包括建立表現載體之習知功能的任何元件，例如啟動子、核糖體結合元件、終止子、增強子、篩選標記、及複製起點。啟動子可係組成型、誘導型、或阻抑型啟動子。許多能夠將核酸遞送至細胞之表現載體係所屬技術領域中已知的，且可在本文中用於在細胞中產生CAR。習知選殖技術或人工基因合成可以用於生成根據本發明之實施例的重組表現載體。
在另一大致態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含本發明之載體及/或編碼本發明之CAR的單離核酸。鑒於本揭露，所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何宿主細胞可以用於重組表現本發明之CAR。適合的宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞、或細菌細胞。在一些實施例中，宿主細胞係大腸桿菌TG1或BL21細胞(用於表現例如CAR、scFv、或sdAb)、CHO-DG44或CHO-K1細胞、或HEK293細胞(用於表現例如全長IgG抗體)。根據具體實施例，重組表現載體係藉由習知方法(諸如化學轉染、熱休克、或電穿孔)轉型成宿主細胞，其中該重組表現載體被穩定地整合至宿主細胞基因體中，使得重組核酸有效表現。
醫藥組成物
在另一大致態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含本發明之單離多核苷酸、本發明之單離多肽、本發明之宿主細胞、及/或本發明之經工程改造之免疫細胞、及醫藥上可接受之載劑。如本文中使用，用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」意指包含本發明之單離多核苷酸、本發明之單離多肽、本發明之宿主細胞、及/或本發明之經工程改造之免疫細胞、以及醫藥上可接受之載劑的產品。本發明之多核苷酸、多肽、宿主細胞、及/或經工程改造之免疫細胞、及包含彼等之組成物亦可用於製造用於本文中提及之治療應用的藥劑。
本文中所使用之用語「載劑(carrier)」係指任何賦形劑、稀釋劑、填充料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、脂質體包封、或其他所屬技術領域中已知用於醫藥配方之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。本文中所使用之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」係指不干擾根據 本發明之組成物的有效性或根據本發明之組成物的生物活性之非毒性材料。根據鑒於本揭露之具體實施例，任何適合用於多核苷酸、多肽、宿主細胞、及/或經工程改造之免疫細胞的醫藥上可接受之載劑皆可用於本發明。
醫藥活性成分與醫藥上可接受之載劑的配方係所屬技術領域中已知，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(例如第21版(2005)、及任何之後的版本)。額外成分之非限制性實例包括：緩衝劑、稀釋劑、溶劑、張力調節劑、保存劑、穩定劑、及螯合劑。一或多種醫藥上可接受之載劑可用於配製本發明之醫藥組成物。
使用方法
在另一大致態樣中，本發明係關於一種治療有需要之對象的疾病或病況之方法。該等方法包含向該有需要之對象投予治療有效量的本發明之經工程改造之免疫細胞及/或醫藥組成物。在某些實施例中，該疾病或病況係癌症。癌症可係例如實體或液體癌症。癌症可係例如選自由下列組成之群組的癌症：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌(bladder urothelial carcinoma)、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及其他實體腫瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、霍奇金氏淋巴瘤/疾病(Hodgkin’s lymphoma/disease,HD)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其他液體腫瘤。
根據本發明之實施例，醫藥組成物包含治療有效量的單離多核苷酸、單離多肽、宿主細胞、及/或經工程改造之免疫細胞。如本文中所使用，用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指活性成分或組分在對 象中引起所欲生物或醫學反應之量。治療有效量可以憑經驗且以常規方式參考所述目的來判定。
如本文中參照本發明之單離多核苷酸、單離多肽、宿主細胞、經工程改造之免疫細胞、及/或醫藥組成物所使用之治療有效量意指該單離多核苷酸、該單離多肽、該宿主細胞、該經工程改造之免疫細胞、及/或該醫藥組成物調節了有需要之對象的免疫反應之量。
根據具體實施例，治療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多個下列效應之療法之量：(i)減少或改善待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的嚴重性；(ii)減少所欲治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的持續期間；(iii)預防所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的進展；(iv)造成所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的消退；(v)預防所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的發展或發生；(vi)預防所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的復發；(vii)減少具有所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的對象的住院；(viii)減少具有所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的對象的住院期長度；(ix)增加具有所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的對象的存活；(xi)抑制或減少對象的所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀；及/或(xii)增強或改善另一療法的(多種)疾病預防或治療效應。
治療有效量或劑量可根據各種因子變化，諸如所欲治療之疾病、病症或病況、投予手段、標靶部位、對象之生理狀態(包括例如年齡、體重、健康)、對象係人類抑或動物、其他投予藥物、及治療係疾病預防性抑或治療性。治療劑量經最佳地滴定以最佳化安全性及療效。
根據具體實施例，本文所述之組成物係配製成適用於對象的預期投予途徑。例如，本文中所述之組成物可配製成適用於靜脈內、皮下、或肌內投予。
本發明之細胞及/或本發明之醫藥組成物可以所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何便利方式投予。舉例而言，本發明之細胞可藉由氣溶膠吸入、注射、攝食、輸血、植入、及/或移植投予至對象。包含本發明之細胞的組成物可經動脈(transarterially)、皮下、皮內、腫瘤內、節間內(intranodally)、髓內(intramedullary)、肌內、胸腔內(intrapleurally)、藉由靜脈(i.v.)注射、或腹膜內投予。在某些實施例中，本發明之細胞可在對象有接受或沒有接受淋巴細胞清除(lymphodepletion)之情況下投予。
包含本發明之表現本發明之CAR細胞之醫藥組成物可以無菌液體製劑提供，一般具有細胞懸浮液、或可選地為乳液、分散液或類似者的等滲水溶液，其一般經緩衝至選定的pH。組成物可包含適用於細胞之完整性及存活力、及適合用於投予細胞組成物的載劑，例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、及類似者。
可根據需要藉由使本發明之細胞以適量的適當溶劑與各種其他成分合併來製備無菌可注射溶液。此類組成物可包括醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑(諸如無菌水、生理食鹽水、葡萄糖、右旋糖、或類似者)，其適合用於與細胞組成物一起使用並用於投予至諸如人類之對象。用於提供細胞組成物之適合的緩衝劑係所屬技術領域中所熟知。使用的任何媒劑、稀釋劑、或添加劑係與保持本發明之細胞的完整性及存活力相容。
本發明之細胞及/或本發明之醫藥組成物可以任何生理上可接受之媒劑投予。包含本發明之細胞的細胞群體可包含純化的細胞群體。所屬技術領域中具有通常知識者可使用各種已知方法輕易判定細胞群體中的細胞。在包 含本發明之經基因修飾之細胞的細胞群體中的純度範圍可係自約50%至約55%、自約55%至約60%、自約60%至約65%、自約65%至約70%、自約70%至約75%、自約75%至約80%、自約80%至約85%、自約85%至約90%、自約90%至約95%、或自約95%至約100%。劑量可由所屬技術領域中具有通常知識者輕易調整，例如降低純度可能需要增加劑量。
本發明之細胞通常以基於對投予該等細胞及/或包含該等細胞之醫藥組成物的對象每公斤體重之細胞數(個細胞/kg)的劑量投予。大致而言，細胞劑量係在約104至約1010個細胞/kg體重之範圍內，例如約105至約109、約105至約108、約105至約107、或約105至約106，取決於投予之模式及位置。大致上，在全身性投予之情況下所使用的劑量係高於在腫瘤及/或癌症之區域中投予本發明之免疫細胞的區域性投予的劑量。例示性劑量範圍包括但不限於1×104至1×108、2×104至1×108、3×104至1×108、4×104至1×108、5×104至6×108、7×104至1×108、8×104至1×108、9×104至1×108、1×105至1×108、1×105至9×107、1×105至8×107、1×105至7×107、1×105至6×107、1×105至5×107、1×105至4×107、1×105至4×107、1×105至3×107、1×105至2×107、1×105至1×107、1×105至9×106、1×105至8×106、1×105至7×106、1×105至6×106、1×105至5×106、1×105至4×106、1×105至4×106、1×105至3×106、1×105至2×106、1×105至1×106、2×105至9×107、2×105至8×107、2×105至7×107、2×105至6×107、2×105至5×107、2×105至4×107、2×105至4×107、2×105至3×107、2×105至2×107、2×105至1×107、2×105至9×106、2×105至8×106、2×105至7×106、2×105至6×106、2×105至5×106、2×105至4×106、2×105至4×106、2×105至3×106、2×105至2×106、2×105至1×106、3×105至3×106個細胞/kg、及類似者。此外，該劑量可經調整 以考量投予單一劑量還是投予多次劑量。可基於各個對象的個別因子精確判定何種劑量被認為係有效劑量。
如本文中所使用，用語「治療(treat、treating、及treatment)」皆意欲指改善或逆轉至少一個與癌症有關的可測量物理參數，該物理參數未必可在對象中覺察，但可係在對象中可覺察的。用語「治療」亦可指造成疾病、病症、或病況消退、預防疾病、病症、或病況進展、或至少延緩疾病、病症、或病況之進展。在一具體實施例中，「治療」係指減輕一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀、預防一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的發展或開始、或減少一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的持續期間，該疾病、病症、或病況諸如腫瘤或更加的是癌症。在一具體實施例中，「治療」係指預防疾病、病症、或病況之復發。在一具體實施例中，「治療」係指增加具有疾病、病症、或病況之對象的存活。在一具體實施例中，「治療」係指排除對象之疾病、病症、或病況。
實施例
本發明提供以下非限制性實施例。
實施例1係一種自人類周邊血液單核細胞(PBMC)擴增並單離γδ T細胞之方法，該方法包含：
a.獲得人類PBMC；
b.使該等人類PBMC在包含唑來膦酸、介白素-2(IL-2)、及介白素-15(IL-15)之培養基中培養以擴增該γδ T細胞；及
c.單離該等γδ T細胞。
實施例2係如實施例1之方法，其中該唑來膦酸之該濃度係約1μM至約20μM。
實施例3係如實施例2之方法，其中該唑來磷酸之濃度係約5μM。
實施例4係如實施例1至3中任一者之方法，其中該IL-2之濃度係約50IU/mL至約5000IU/mL。
實施例5係如實施例4之方法，其中該IL-2之濃度係約100IU/mL至約1000IU/mL。
實施例6係如實施例1至5中任一者之方法，其中該IL-2係重組人類IL-2(rhIL-2)。
實施例7係如實施例1至6中任一者之方法，其中該IL-15之濃度係約1ng/mL至約100ng/mL。
實施例8係如實施例7之方法，其中該IL-15之濃度係約10ng/mL。
實施例9係如實施例1至8中任一者之方法，其中該IL-15係重組人類IL-15(rhIL-15)。
實施例10係如實施例1至9中任一者之方法，其中該γδ T細胞係Vγ9Vδ2 T細胞。
實施例11係如實施例1至10中任一者之方法，其中該γδ T細胞係藉由流動式細胞測量術、磁性分離、及負向選擇來單離。
實施例12係藉由如實施例11之方法所產生之單離γδ T細胞。
實施例13係一種生成嵌合抗原受體(CAR)-γδ T細胞之方法，該方法包含：
a.獲得實施例12之單離γδ T細胞；
b.使該γδ T細胞與編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸接觸，該CAR包含：
i.胞外結構域；
ii.跨膜結構域；及
iii.胞內傳訊結構域，其中該CAR可選地進一步包含位於胺基端的信號肽及連接該胞外結構域和該跨膜結構域的鉸鏈區，且其中使該γδ T細胞與編碼該CAR的該核酸接觸生成CAR γδ T細胞。
實施例14係如實施例13之方法，其中該CAR包含：
i.胞外結構域，其包含抗原結合結構域及/或抗原結合片段；
ii.跨膜結構域，其包含CD8α跨膜結構域；
iii.胞內傳訊結構域，其包含CD3ζ或4-1BB胞內結構域；
iv.信號肽，其包含CD8α信號肽；及
v.鉸鏈區，其包含CD8α鉸鏈區。
實施例15係如實施例14之方法，其中該CAR包含：
i.該跨膜結構域，其具有與SEQ ID NO：1至少90%同一性的胺基酸序列；
ii.該胞內結構域，其具有與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少90%同一性的胺基酸序列；
iii.該信號肽，其具有與SEQ ID NO：4至少90%同一性的胺基酸序列；及
iv.該鉸鏈區，其具有與SEQ ID NO：5至少90%同一性的胺基酸序列。
實施例16係如實施例14或15之方法，其中該胞外結構域包含特異性結合腫瘤抗原的抗原結合結構域及/或抗原結合片段。
實施例17係如實施例13至16中任一者之方法，其中該CAR包含選自由SEQ ID NO：22至29組成之群組的胺基酸序列。
實施例18係藉由實施例13至17中任一者之方法所產生之CAR-γδ T細胞。
實施例19係一種醫藥組成物，其包含如實施例18之CAR-γδ T細胞及醫藥上可接受之載劑。
實施例20係一種治療或預防有需要之對象的疾病或病況之方法，該方法包含投予治療有效量的如實施例19之醫藥組成物。
實施例21係如實施例20之方法，其中該疾病或病症係癌症。
實施例22係如實施例21之方法，其中該癌症係選自實體癌症或液體癌症。
實施例23係如實施例22之方法，其中該癌症係選自由下列組成之群組：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及其他實體腫瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、霍奇金氏淋巴瘤/疾病(Hodgkin’s lymphoma/disease,HD)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其他液體腫瘤。
實施例24係如實施例20之方法，其中該疾病係自體免疫疾病。
實施例25係如實施例24之方法，其中該自體免疫疾病係選自由下列組成之群組：脫髮、類澱粉變性症、僵直性脊椎炎、Castleman氏病(CD)、乳糜瀉、克隆氏病(Crohn’s disease)、子宮內膜異位、纖維肌痛、腎小球性腎炎、格雷氏病(Graves’ disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、IgA腎病、狼瘡、萊姆病(lyme disease)、梅尼爾氏病(Meniere’s disease)、多發性硬 化症、猝睡症、嗜中性球減少症、乾癬、乾癬性關節炎、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮症、第1型糖尿病、潰瘍性結腸炎、及白斑症。
實施例26係一種產生包含CAR-γδ T細胞的醫藥組成物之方法，其中該等方法包含使如實施例18之CAR-γδ T細胞與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
實例
材料和方法
試劑及抗體
Figure 108143349-A0202-12-0041-1
Figure 108143349-A0202-12-0042-2
Figure 108143349-A0202-12-0043-3
細胞培養
將Kasumi-3細胞在RPMI+20% FBS+1x青黴素-鏈黴素中培養。每3天繼代細胞。簡言之，自燒瓶收集Kasumi-3細胞且以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，且將細胞以5×105個細胞/mL之密度播種回新鮮培養基中。
自整個PBMC中選擇性擴增Vγ9陽性γδ T細胞
在第0天，將一小瓶的冷凍PBMC解凍，並將其添加至在50mL錐形離心管中之49mL溫熱的完整RPMI(RPMI+10%FBS+1x Pen/Strep))以稀釋冷凍的培養基。將PBMC以1500 RPMI離心5分鐘。藉由使PBMC再懸浮於35ml的完整RPMI培養基(RPMI+10%FBS+1xPen/Strep)中將PBMC洗滌一次。將細胞沉澱物再懸浮於完整RPMI培養基中然後計數細胞。
替代地，藉由密度梯度離心自全血樣本中單離PBMC，且藉由使用血球計來計數細胞。在完整RPMI培養基中將該細胞計數調整至1.0×106個細胞/1.0mL。
同時，製備γδ T細胞培養基(RPMI-10%；RPMI補充有10%FBS，1x Pen/Strep)補充有重組人類IL-2(rhIL-2)至最終濃度為1000IU/mL；重組人類rhIL-15至最終濃度為10ng/mL；及唑來膦酸(Zol)至最終濃度為5μM。將細胞密度用所製備之γδ T細胞培養基調整至1×106個細胞/mL。
在T-25燒瓶中將4×106個細胞播種在4mL培養基中。在第2天，將4mL的新鮮γδ T細胞培養基添加至該T-25燒瓶中，該培養基補充有濃度為800IU/mL的rhIL-2及濃度為20ng/mL的rhIL-15(rhIL-2及rhIL-15之最終濃度分別係400IU/mL及10ng/mL)。
在第5天，將細胞以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，且將細胞沉澱物再懸浮於25mL的完整RPMI培養基中，該完整RPMI培養基補充有最終濃度為100IU/mL的rhIL-2及最終濃度為10ng/mL的rhIL-15。將細胞轉移至T-75燒瓶中，並在整個擴增規程中將細胞密度維持在1×106個細胞/mL或約1×106個細胞/mL。
在第8天及第11天，若細胞密度太高，則將細胞以1500rpm旋轉沉降5分鐘。將細胞在25ml的完整RPMI培養基中分成1：2比例，該完整RPMI培養基補充有最終濃度為100IU/mL的rhIL-2及最終濃度為10ng/mL的rhIL-15。
γδ T細胞之單離及增濃
γδ T細胞之單離及增濃係使用EasySepTM人類δγ T細胞單離套組(Stem cell Technologies；Vancouver,Canada)，根據製造商說明書來進行。
自整個PBMC單離γδ T細胞。
解凍冷凍的PBMC並將其添加至在50mL錐形離心管中之49mL溫熱的完整RPMI培養基中以稀釋冷凍的培養基。將PBMC以1500rpm離心5分鐘，且將PBMC用完整RPMI培養基(RPMI+10%FBS+1x Pen/Strep)洗滌一次。將細胞沉澱物再懸浮於1mL的Easy Sep緩衝液中，且藉由使用血球計來計數細胞。
自培養的PBMC單離及增濃γδ T細胞
採集細胞然後以1500rpm離心5分鐘。藉由使細胞再懸浮於純RPMI(無FBS、或Pen/Strep)培養基中將細胞洗滌一次，且以1500rpm離心5分鐘。將細胞沉澱物再懸浮於1mL的Easy Sep緩衝液中，且藉由使用血球計來計數細胞。在5mL聚苯乙烯圓底試管中，將細胞數在1mL的Easy Sep緩衝液中調整至50×106個細胞。
將50μL的生物素化調配混合物(cocktail)添加至再懸浮的細胞中。將細胞混合且在室溫下培養10分鐘。在培養期結束之前，將磁性粒子渦流震盪30秒以使彼等均勻分散。在培養期之後，將50μL的磁性粒子添加至1mL的再懸浮的細胞中。混合細胞懸浮液且在室溫下培養5分鐘。在培養期之後，將1.5mL的Easy Sep緩衝液添加至含有細胞的試管中。藉由上下溫和混合細胞使細胞再懸浮，且將試管置入磁鐵中並在室溫下培養5分鐘。在培養期結束時，藉由以一個連續動作倒轉磁鐵(含試管)收集含有增濃細胞懸浮液的培養基。
向增濃細胞懸浮液添加37μL的經渦流震盪之磁性粒子，且將該細胞懸浮液混合並在室溫下培養5分鐘。將含有細胞懸浮液的試管置入磁鐵中並在室溫下培養5分鐘。藉由使細胞懸浮液轉移入新的15mL試管中收集增濃細胞。然後將10mL的完整RPMI培養基添加至試管中，且將細胞以1500rpm離心5分鐘。將細胞藉由添加10mL的完整RPMI培養基再洗滌一次，且以1500rpm離心5分鐘。將細胞沉澱物再懸浮於1mL的完整RPMI培養基中，且藉由使用血球計來計數細胞。增濃細胞之純度係在流動式細胞儀上藉由用TCR γδ、TCR αβ、及Vγ9抗體染色細胞確認。
γδ T細胞之表型剖析
表面表型剖析
收集新鮮或培養的PBMC，用FACS緩衝液(PBS+2%FBS)洗滌一次，且使用血球計來計數。將2×106個新鮮PBMC或經0.5×106個Zol+rhIL-2+rhIL-15或rhIL-2+rhIL-15擴增之細胞在96孔V型底部培養盤以1500rpm離心15分鐘。丟棄上清液，並將細胞沉澱物再懸浮於100μL的含有0.5μL的Live/Dead可固定紫色死亡細胞染色劑(Live/Dead fixable violet dead cell stain)的PBS中，且將細胞在室溫下培養20分鐘。將細胞以1500rpm離心5分鐘，且將細胞沉澱物用200μL的FACS緩衝液(PBS+2%FBS)洗滌一次。將細胞沉澱物再懸浮於含有5μL人類Trustain Fc阻斷劑之100μL的FACS緩衝液(PBS+2%FBS)中，且將細胞在黑暗中在4℃下培養20分鐘。在培養之後，將細胞以1500rpm離心5分鐘。
替代地，將1×106個細胞在含有100μL的PBS(該PBS含有Live/Dead可固定紫色死亡細胞染色劑(0.5μL)及Human Trustain Fc阻斷劑(5μL)兩者)之96孔V型底部培養盤中在黑暗中在4℃下培養。在培養之後，將細胞以1500rpm離心5分鐘，且將細胞用800μL的FACS緩衝液(PBS+2%FBS)洗滌一次。細胞係藉由在100μL的含抗體擴增反應混合劑(antibodies master mix)之FACS緩衝液中在4℃下培養30分鐘染色。在培養期之後，將細胞以1500rpm離心5分鐘，且將細胞用200μL的FACS緩衝液洗滌兩次並將其再懸浮於100μL的FACS緩衝液中。在流動式細胞儀(Novocyte)上取得細胞。
胞內效應分子剖析
將一百萬個新鮮PBMC或第8天之經Zol活化之PBMC在100μL的PBS中培養，該PBS含有0.5μL LIVE/DEAD可固定紫色死亡細胞染色劑及5μL Fc阻斷劑。將細胞在4℃下在黑暗中培養20分鐘。在培養期之後，將細胞以 1500rpm離心5分鐘，且藉由使細胞再懸浮於200μl的FACS緩衝液(PBS+2%FBS)中將細胞洗滌一次。
細胞係在100μL體積中藉由用針對Vγ9、Vδ2具有特異性之抗體在黑暗中在4℃下培養30分鐘來表面染色。在培養期之後，將100μL的FACS緩衝液(PBS+2% FBS)添加至細胞，並將細胞以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，且藉由使細胞沉澱物再懸浮於200μL的FACS緩衝液中將細胞洗滌兩次。將細胞以1500rpm離心5分鐘，且丟棄上清液。
藉由使細胞沉澱物再懸浮於100μL BD Cytofix/Cytoperm緩衝液中將細胞固定並將該細胞懸浮液在黑暗中在4℃下培養15分鐘。在培養期之後，將細胞以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，且將細胞藉由使細胞沉澱物再懸浮於200μL的1x BD Perm/Wash中來洗滌。將細胞以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，且將細胞沉澱物再懸浮於100μL的含有抗胞內抗原(顆粒酶B、穿孔素)之抗體的1x Perm/Wash中。將細胞懸浮液在黑暗中在4℃下培養30分鐘。在培養期之後，藉由添加150μL的1xBD Perm/Wash將細胞以1500rpm離心5分鐘。藉由使該細胞沉澱物再懸浮於200μL的1x BD Perm/Wash中將細胞再洗滌一次，且將細胞以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，且將細胞沉澱物再懸浮於100μL的FACS緩衝液(PBS+2%FBS)中。在Novocyte流動式細胞儀上取得細胞。
在Kasumi-3細胞上CD123表現之偵測
將五萬個Kasumi-3細胞在100μL的FACS緩衝液(1xPBS+2%FBS)中染色。將細胞以1500rpm離心5分鐘，且丟棄上清液。將抗人類CD123抗體及各個同型以2μg/mL於FACS緩衝液(1xPBS+2%FBS)中之濃度添加至細胞中。保留樣本的等分試樣未染色。將細胞在黑暗中在4℃下培養30分 鐘。培養後，將細胞以1500rpm離心5分鐘並用FACS緩衝液(1x PBS+2%FBS)洗滌以移除任何未結合的抗體。將洗滌步驟再重複一次(總共給予兩次洗滌)，且藉由使該染色的細胞在冰上再懸浮於100μL的BD Cytofix中15分鐘將染色的樣本固定。在培養期之後，將細胞用FACS緩衝液洗滌一次且再懸浮於FACS緩衝液中。在流動式細胞儀(BD FACS Calibur)上取得染色的細胞，接著藉由Flow Jo(版本10.3)分析。基於同型對照進行圈選。
電穿孔mRNA進入經活化T之細胞中
整個PBMC
收集在含有Zol+rhIL-2+rhIL-15的完整RPMI培養基中培養8天的PBMC且以1500rpm離心5分鐘。藉由將細胞沉澱物再懸浮於35mL的培養基中之方式，將該等細胞用純RPMI培養基(無FBS或Pen/Strep)來洗滌。將細胞以1500rpm離心5分鐘，將細胞沉澱物再懸浮於5mL的完整RPMI培養基中，且藉由使用血球計來計數細胞。
將1×106個細胞在1.5mL的艾本德管(Eppendorf tube)中在室溫下以1400rpm離心5分鐘，且丟棄上清液。將細胞沉澱物再懸浮於來自Neon轉染套組(Thermo Fisher Scientific)的緩衝液T中(2×105個細胞/9μL緩衝液T)。將1μL的GFP mRNA(濃度1μg/μL)添加至細胞懸浮液中，且藉由移液該細胞懸浮上下二次將該細胞懸浮液溫和地混合。
自Neon微量吸管盒取出微量吸管且將Neon微量吸管溫和地上下壓按以移除任何被捕捉的空氣來製備Neon微量吸管(10μL吸管)。將10μL的細胞懸浮液(9μL的細胞懸浮液+1μL之mRNA)緩慢吸入Neon微量吸管中。在此同時，藉由添加3.5mL的電解質緩衝液(緩衝液E)來製備Neon管。將含 有細胞懸浮液的Neon微量吸管緩慢置入含有電解質緩衝液的Neon管中。將Neon管(含有Neon微量吸管)置入Neon基座(Neon docking station)中。
電穿孔係在指定的電壓、脈寬、及脈衝次數之情況下進行。在電穿孔之後立即自Neon管中移出Neon微量吸管(含有細胞懸浮液及mRNA)且將細胞添加至含有0.5mL的預溫熱RPMI培養基之48孔培養盤中，該RPMI培養基含有10%FBS，不含抗生素。將培養盤溫和搖動以確保孔中細胞之均勻分布，且將培養盤在潮濕的CO2培養箱中在37℃下培養。在培養2小時、4小時、及24小時之後，將含有細胞之培養基取1/10體積，且在Novocyte流動式細胞儀上判定GFP螢光。
增濃γδ T細胞
收集用Zol+rhIL-2+rhIL-15培養14天的整個PBMC且以1500rpm離心5分鐘。藉由用35mL的純RPMI培養基使細胞沉澱物再懸浮來洗滌細胞。將細胞以1500rpm離心5分鐘。γδ將T細胞經由負向選擇增濃(如上文所述)。將細胞用完整RPMI培養基(RPMI+10%FBS+1xPen/Strep)洗滌一次，且將細胞以1500rpm離心5分鐘。將細胞沉澱物溫和地再懸浮於來自Neon轉染套組(Thermo Fisher Scientific)的緩衝液T中(2×105個細胞/9μL緩衝液T)。將1μL的GFP/CAR mRNA(GFP mRNA濃度為1μg/μL，CAR mRNA濃度為1.4μg/μL)添加至細胞懸浮液。藉由移液該細胞懸浮液上下二次將細胞懸浮液溫和混合。
自Neon微量吸管盒取出微量吸管且將Neon微量吸管溫和地上下壓按以移除任何被捕捉的空氣來製備Neon微量吸管(10μL吸管)。將10μL的細胞懸浮液(9μL的細胞懸浮液+1μL之mRNA)緩慢吸入Neon微量吸管中。在此同時，藉由添加3.5mL的電解質緩衝液(緩衝液E)來製備Neon管。將含 有細胞懸浮液的Neon微量吸管緩慢置入含有電解質緩衝液的Neon管中，且將該Neon管(含有Neon微量吸管)置入Neon基座中。
電穿孔係在1400V、20ms脈寬、及1脈衝下進行。在電穿孔之後立即自Neon管中移出Neon管尖(含有細胞懸浮液及mRNA)且將細胞添加至含有0.5mL的預溫熱RPMI培養基之48孔培養盤中，該RPMI培養基含有10% FBS，不含抗生素。將培養盤溫和搖動以確保孔中細胞之均勻分布。將培養盤在潮濕的CO2培養箱中在37℃下培養。作為無電穿孔對照，將1μL的mRNA(GFP或CAR)添加至含有2×105增濃γδ T細胞之9μL的緩衝液T中。將細胞添加至含有0.5mL的預溫熱RPMI培養基之48孔培養盤中，該RPMI培養基含有10% FBS，不含抗生素。將培養盤溫和搖動以確保孔中細胞之均勻分布。將培養盤在潮濕的CO2培養箱中在37℃下培養。細胞存活力(藉由測量對Live/Dead染色陰性的細胞)及轉染效率(藉由測量GFP+細胞之頻率)係在2小時、20小時、及40小時之後藉由取1/10體積(50μL)的含有細胞之培養基判定。在電穿孔之後將細胞休眠40小時且將其使用作為用於細胞毒性實驗的效應細胞。
CAR轉染γδ T細胞介導的細胞毒性檢定
用CFSE標記目標細胞(Kasumi-3)
收集Kasumi-3細胞且用純RPMI培養基洗滌一次。計數細胞且將細胞之密度調整至1×106個細胞/mL。將細胞再懸浮於1mL的0.5μM CFSE於1xPBS中且在室溫(RT)下培養8分鐘，並伴隨偶爾的混合。加入1mL的FBS以停止標記反應。將細胞在完整RPMI培養基(RPMI+10%FBS+1xPen/Strep)中洗滌兩次。使用血球計來計數細胞且根據ET比(ET ratio)將細胞密度在100μL體積中調整。
製備效應(CAR-gd T細胞)細胞
γδ T細胞係自在含有Zol+rhIL-2+rhIL-15的完整RPMI培養基(RPMI+10%FBS+1xPen/Strep)中培養14天的總PBMC中增濃。γδ T細胞純度係在增濃後藉由流動式細胞測量術藉由用TCR γδ、TCR αβ、TCR Vγ9單株抗體將細胞染色來評估。
嵌合抗原受體(CAR)mRNA電穿孔係用Neon電穿孔系統在1400V、20ms脈寬、及1脈衝下在增濃δγ T細胞上執行。在電穿孔之後，將γδ細胞休眠24小時及40小時。在休眠期之後，將γδ細胞(效應細胞)用於細胞毒性實驗。
效應對目標比
將10,000個目標細胞添加至各孔(在100μL體積的完整RPMI培養基中)。添加100μL體積的於完整RPMI培養基中之10,000個CAR/GFP轉染增濃γδ T細胞，且將細胞在37℃及5% CO2下培養指定的時間點。
取得及分析
針對表面表型剖析實驗，在總細胞的FSC-H對SSC-H上進行細胞最初圈選。自總細胞中將活細胞圈選入。藉由在FSC-A對FSC-H參數圈選自活細胞排除雙聯體(doublet)。由此，藉由圈選Vγ9+細胞進行表面剖析。針對細胞毒性檢定，染色細胞係在分別帶有Cell Quest Pro(版本6.0)/novo表現軟體之BD FACS Calibur/Novocyte儀器上取得。資料係用Flow Jo(版本10.3)經由通用資料夾轉移至桌面。首先圈選CFSE陽性細胞以識別目標細胞。在CFSE陽性細胞內，死亡細胞經識別為7-AAD+ FSClow細胞。所設定之圈選係基於CFSE未染色及7-AAD未染色細胞。為計算CAR轉導γδ T細胞特異性溶解，從包含 GFP或I3RB135_LH或I3RB135_HL mRNA電穿孔的γδ T細胞之孔中所獲得之細胞溶解值中減去自發性目標細胞溶解值。
結果
實例1：γδ T細胞亞群在整個新鮮PBMC中之分佈。
為識別總PBMC中TCR Vγ9+Vδ2+細胞頻率，將細胞用抗TCR Vγ9及TCR Vδ2抗體染色。流動式細胞測量術分析顯示Vγ9陽性細胞主要與Vδ2配對，且這些細胞之頻率在總PBMC中係在1.8%附近(圖1)。
實例2：自總PBMC刺激及擴增Vγ9 + 細胞。
為選擇性擴增Vγ9+ γδ T細胞，將整個PBMC在富含rhIL-2+rhIL-15+Zol的完整RPMI培養基(RPMI+10%FBS+1xPen/Strep)中培養。作為對照組，將PBMC在僅含有rhIL-2+rhIL-15的完整RPMI培養基(RPMI+10%FBS+1xPen/Strep)中培養基。在總PBMC中Vγ9+細胞之頻率係在培養期之第0天(在新鮮PBMC中)、第8天、第14天判定。為計算在總PBMC中Vγ9+細胞之頻率，總活PBMC經初步圈選、排除雙聯體、然後圈選Vγ9+細胞(圖2A)。相較於在第0天在總PBMC中Vγ9+細胞之頻率，在培養期的第8天、12天、及14天，只有在Zol之存在下觀察到Vγ9+細胞之大幅且選擇性的擴增(圖2B及圖2C)。
實例3：休眠及經活化T之Vγ9 + γδ T細胞的表型
為了解休眠與經活化T之Vγ9+ γδ T細胞之間的表型差異，將新鮮PBMC及第8天之經Zol活化之PBMC用抗TCRγδ,Vγ9抗體染色以初步識別Vγ9+ γδ T細胞。在用不同標記(CD45RA,CD27)剖析Vγ9+ γδ T細胞後，休眠 Vγ9+ γδ T細胞主要顯示中樞記憶(CD27+CD45RA-)及效應子記憶(CD27- CD45RA-)表型。然而經Zol活化之Vγ9+ γδ T細胞僅顯示效應子記憶(CD27- CD45RA-)表型(圖3A)。與此一致的是，休眠Vγ9+ γδ T細胞(來自新鮮PBMC)顯示活化表型(CD44表面表現)，伴隨明顯的胞內顆粒酶B及穿孔素表現(圖3B)。同樣地，經Zol活化之Vγ9+ γδ T細胞顯示在彼等表面上明顯的CD44表現及胞內顆粒酶B及穿孔蛋表現(圖3B)。有趣的是，休眠Vγ9+ γδ T細胞沒有顯示CD69(早期活化標記)之任合表面表現。然而，部分(28%)的經Zol活化之Vγ9+ γδ T細胞確實顯示在彼等表面上存在CD69(圖3B)。
在用各種抑制性受體將Vγ9+ γδ T細胞染色後，休眠Vγ9+ γδ T細胞顯示沒有PD1、Tim-3、及CTLA-4之表面表現。另一方面，經活化T之Vγ9+ γδ T細胞顯示在細胞表面上Tim-3之明顯的上調。然而，在經活化T之Vγ9+細胞上，PD1及CTLA-4表現相較於休眠Vγ9+ γδ T細胞似乎沒有改變。有趣的是，大部分休眠Vγ9+ γδ T細胞在彼等表面上表現2B4且實際上所有Vγ9+ γδ T細胞在用Zol活化後在彼等表面上皆表現2B4(圖3C)。
實例4：負向選擇以耗盡αβ T細胞
γδ T細胞係自第14天之Zol+rhIL-2+rhIL-15培養物中經由負向選擇使用EasySep人類γδ T細胞單離套組濃縮。γδ T細胞濃縮去除了殘留的TCRαβ T細胞污染物(圖4)。用最佳化電穿孔參數(1400V、20ms脈寬、及1脈衝)將CAR mRNA轉染入γδ T細胞。
實例5：CAR-T之設計及構建
CAR-T構建體由抗原特異性單鏈Fv(scFv)部份組成，該部份以可撓的人類CD8鉸鏈序列錨定在膜上。人類CD8之單向跨膜結構域，接續的共刺激部份(4-1BB)及傳訊結構域(CD3ζ)亦係構建體之一部分(圖7)。
實例6：CAR轉導γδ T細胞之細胞毒性
為了分析CAR介導的γδ T細胞細胞毒性，將經CFSE標記之目標(Kasumi-3)細胞與來自培養第14天的CAR轉染γδ T細胞(效應子)以1：1之效應子對目標(ET)比共培養24小時。作為對照組，經CFSE標記之目標(Kasumi-3)細胞亦與GFP轉染γδ T細胞以1：1之效應子對目標(ET)比培養。在電穿孔之後，將細胞休眠40小時期間。
在細胞休眠期間藉由在轉染後2、20、及40小時分別測量彼等排除LIVE/DEAD染色及EGFP表現的能力來取得這些細胞的細胞存活力及轉染效率(圖5A及圖5B)。細胞存活力在電穿孔後2小時接近96%且在電穿孔後40小時下降到60%附近。轉染效率(EGFP+細胞的%)在電穿孔後2小時係在35%且在20小時略微增加至42%。作為轉染對照組，藉由添加CAR/GFP mRNA來類似地處理γδ T細胞且保留未轉染之彼等(圖5A，右)。
在目標(Kasumi-3)細胞上的CD123表現係藉由使用市售可得之抗CD123抗體分析。藉由用1μg的CD123生物素化純化蛋白探測細胞來測量CAR表面表現。使用鏈黴親和素PE/Cy7以標記生物素化蛋白。未觀察到在CAR轉染γδ T細胞上的PE/Cy7信號，其可能由於CD123純化蛋白之生物素化失效或其他技術原因所致。
將目標抗原表現細胞(諸如針對CD123的Kasumi-3、針對GPRC5D的H929細胞、針對CD33的KG1細胞)及目標剔除細胞或非目標表現性細胞(諸如針對CD123的K562)用CFSE標記以在流動式細胞量術分析期間 將彼等識別為CFSE+。共培養期後，添加7-AAD以分析7-AAD+CFSE+細胞之百分比作為細胞毒性的量度。減去用未轉染γδ T細胞觀察到的基礎細胞毒性(basal cytotoxicity)以獲得由在γδ T細胞上CAR表現所介導之特異性細胞毒性。用mRNA構建體轉染的γδ T細胞觀察到最大的細胞毒性為自60%至~70%的範圍(圖6B至圖6E)。
所屬技術領域中具有通常知識者將領會的是，能夠對以上所述的實施例進行變更而不違背其廣義的發明概念。因此，應了解本發明並未受限於揭示之具體實施例，而是意欲涵蓋如本實施方式所定義之屬於本發明之精神及範疇內的修改。
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a跨膜結構域
<400> 1
Figure 108143349-A0202-12-0056-4
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 z胞內結構域
<400> 2
Figure 108143349-A0202-12-0056-5
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-IBB胞內結構域
<400> 3
Figure 108143349-A0202-12-0057-6
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a信號結構域
<400> 4
Figure 108143349-A0202-12-0057-7
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a鉸鏈結構域
<400> 5
Figure 108143349-A0202-12-0057-8
<210> 6
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GC5B81_LH胞外結構域
<400> 6
Figure 108143349-A0202-12-0058-9
Figure 108143349-A0202-12-0059-10
<210> 7
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GC5B81_HL胞外結構域
<400> 7
Figure 108143349-A0202-12-0059-11
Figure 108143349-A0202-12-0060-12
<210> 8
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_HL胞外結構域
<400> 8
Figure 108143349-A0202-12-0060-13
Figure 108143349-A0202-12-0061-14
<210> 9
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_LH胞外結構域
<400> 9
Figure 108143349-A0202-12-0062-15
Figure 108143349-A0202-12-0063-16
<210> 10
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_LH胞外結構域
<400> 10
Figure 108143349-A0202-12-0063-17
Figure 108143349-A0202-12-0064-18
<210> 11
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_HL胞外結構域
<400> 11
Figure 108143349-A0202-12-0064-19
Figure 108143349-A0202-12-0065-20
<210> 12
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_LH胞外結構域
<400> 12
Figure 108143349-A0202-12-0066-21
Figure 108143349-A0202-12-0067-22
<210> 13
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_HL胞外結構域
<400> 13
Figure 108143349-A0202-12-0067-23
Figure 108143349-A0202-12-0068-24
<210> 14
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GC5B81_LH scFv
<400> 14
Figure 108143349-A0202-12-0068-25
Figure 108143349-A0202-12-0069-26
<210> 15
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GC5B81_HL scFv
<400> 15
Figure 108143349-A0202-12-0069-27
Figure 108143349-A0202-12-0070-28
<210> 16
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_HL scFv
<400> 16
Figure 108143349-A0202-12-0071-29
Figure 108143349-A0202-12-0072-30
<210> 17
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_LH scFv
<400> 17
Figure 108143349-A0202-12-0072-31
Figure 108143349-A0202-12-0073-32
<210> 18
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_LH scFv
<400> 18
Figure 108143349-A0202-12-0073-33
Figure 108143349-A0202-12-0074-34
<210> 19
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_HL scFv
<400> 19
Figure 108143349-A0202-12-0074-35
Figure 108143349-A0202-12-0075-36
<210> 20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_LH scFv
<400> 20
Figure 108143349-A0202-12-0076-37
Figure 108143349-A0202-12-0077-38
<210> 21
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_HL scFv
<400> 21
Figure 108143349-A0202-12-0077-39
Figure 108143349-A0202-12-0078-40
<210> 22
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GC5B81_LH CAR
<400> 22
Figure 108143349-A0202-12-0078-41
Figure 108143349-A0202-12-0079-42
Figure 108143349-A0202-12-0080-43
<210> 23
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GC5B1_HL CAR
<400> 23
Figure 108143349-A0202-12-0080-44
Figure 108143349-A0202-12-0081-45
Figure 108143349-A0202-12-0082-46
<210> 24
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_HL CAR
<400> 24
Figure 108143349-A0202-12-0082-47
Figure 108143349-A0202-12-0083-48
Figure 108143349-A0202-12-0084-49
<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_LH CAR
<400> 25
Figure 108143349-A0202-12-0085-50
Figure 108143349-A0202-12-0086-51
Figure 108143349-A0202-12-0087-52
<210> 26
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_LH CAR
<400> 26
Figure 108143349-A0202-12-0087-53
Figure 108143349-A0202-12-0088-54
Figure 108143349-A0202-12-0089-55
<210> 27
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_HL CAR
<400> 27
Figure 108143349-A0202-12-0089-56
Figure 108143349-A0202-12-0090-57
Figure 108143349-A0202-12-0091-58
<210> 28
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_LH CAR
<400> 28
Figure 108143349-A0202-12-0091-59
Figure 108143349-A0202-12-0092-60
Figure 108143349-A0202-12-0093-61
<210> 29
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_HL CAR
<400> 29
Figure 108143349-A0202-12-0094-62
Figure 108143349-A0202-12-0095-63
Figure 108143349-A0202-12-0096-64
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> GC5B81_LH CAR
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Figure 108143349-A0202-12-0096-65
Figure 108143349-A0202-12-0097-66
<210> 31
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GC5B81_HL CAR
<400> 31
Figure 108143349-A0202-12-0097-67
Figure 108143349-A0202-12-0098-68
<210> 32
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_HL CAR
<400> 32
Figure 108143349-A0202-12-0098-69
Figure 108143349-A0202-12-0099-70
<210> 33
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMB69_LH CAR
<400> 33
Figure 108143349-A0202-12-0099-71
Figure 108143349-A0202-12-0100-72
<210> 34
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_LH CAR
<400> 34
Figure 108143349-A0202-12-0100-73
Figure 108143349-A0202-12-0101-74
<210> 35
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> I3RB135_HL CAR
<400> 35
Figure 108143349-A0202-12-0101-76
Figure 108143349-A0202-12-0102-77
<210> 36
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_LH CAR
<400> 36
Figure 108143349-A0202-12-0102-78
Figure 108143349-A0202-12-0103-79
<210> 37
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33B904_HL CAR
<400> 37
Figure 108143349-A0202-12-0103-80
Figure 108143349-A0202-12-0104-81

Claims (26)

  1. 一種自人類周邊血液單核細胞(PBMC)擴增並單離γδ T細胞之方法，該方法包含：
    a.獲得人類PBMC；
    b.使該等人類PBMC在包含唑來膦酸(zoledronic acid)、介白素-2(IL-2)、及介白素-15(IL-15)之培養基中培養以擴增該γδ T細胞；及
    c.單離該等γδ T細胞。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該唑來膦酸之濃度係約1μM至約20μM。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該唑來膦酸之濃度係約5μM。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中該IL-2之濃度係約50IU/mL至約5000IU/mL。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該IL-2之濃度係約100IU/mL至約1000IU/mL。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該IL-2係重組人類IL-2(rhIL-2)。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之方法，其中該IL-15之濃度係約1ng/mL至約100ng/mL。
  8. 如請求項7所述之方法，其中該IL-15之濃度係約10ng/mL。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之方法，其中該IL-15係重組人類IL-15(rhIL-15)。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之方法，其中該γδ T細胞係Vγ9Vδ2 T細胞。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中該等γδ T細胞係藉由流動式細胞測量術、磁性分離、及負向選擇單離。
  12. 一種單離γδ T細胞，其藉由如請求項11所述之方法產生。
  13. 一種生成嵌合抗原受體(CAR)-γδ T細胞之方法，該方法包含：
    a.獲得如請求項12所述之單離γδ T細胞；
    b.使該γδ T細胞與編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸接觸，該CAR包含：
    i.胞外結構域；
    ii.跨膜結構域；及
    iii.胞內傳訊結構域，
    其中該CAR可選地進一步包含位於胺基端的信號肽及連接該胞外結構域和該跨膜結構域的鉸鏈區，且
    其中使該γδ T細胞與編碼該CAR的該核酸接觸生成CAR γδ T細胞。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該CAR包含：
    i.胞外結構域，其包含抗原結合結構域及/或抗原結合片段；
    ii.跨膜結構域，其包含CD8α跨膜結構域；
    iii.胞內傳訊結構域，其包含CD3ζ或4-1BB胞內結構域；
    iv.信號肽，其包含CD8α信號肽；及
    v.鉸鏈區，其包含CD8α鉸鏈區。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該CAR包含：
    i.該跨膜結構域，其具有與SEQ ID NO：1至少90%同一性的胺基酸序列；
    ii.該胞內結構域，其具有與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少90%同一性的胺基酸序列；
    iii.該信號肽，其具有與SEQ ID NO：4至少90%同一性的胺基酸序列；及
    iv.該鉸鏈區，其具有與SEQ ID NO：5至少90%同一性的胺基酸序列。
  16. 如請求項14或15所述之方法，其中該胞外結構域包含特異性結合腫瘤抗原的抗原結合結構域及/或抗原結合片段。
  17. 如請求項13至16中任一項所述之方法，其中該CAR包含選自由SEQ ID NO：22至29組成之群組的胺基酸序列。
  18. 一種CAR-γδ T細胞，其藉由如請求項13至17中任一項所述之方法產生。
  19. 一種醫藥組成物，其包含如請求項18所述之CAR-γδ T細胞及醫藥上可接受之載劑。
  20. 一種治療或預防有需要之對象的疾病或病況之方法，該方法包含投予治療有效量的如請求項19所述之醫藥組成物。
  21. 如請求項20所述之方法，其中該疾病或病況係癌症。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該癌症係選自實體癌症或液體癌症。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該癌症係選自由下列組成之群組：肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱泌尿上皮癌、轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、子宮內膜 癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、及其他實體腫瘤、及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、霍奇金氏淋巴瘤/疾病(Hodgkin’s lymphoma/disease,HD)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)、及其他液體腫瘤。
  24. 如請求項20所述之方法，其中該疾病或病況係自體免疫疾病。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該自體免疫疾病係選自由下列組成之群組：脫髮、類澱粉變性症、僵直性脊椎炎、Castleman氏病(CD)、乳糜瀉、克隆氏病(Crohn’s disease)、子宮內膜異位、纖維肌痛、腎小球性腎炎、格雷氏病(Graves’ disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、IgA腎病、狼瘡、萊姆病(lyme disease)、梅尼爾氏病(Meniere’s disease)、多發性硬化症、猝睡症、嗜中性球減少症、乾癬、乾癬性關節炎、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮症、第1型糖尿病、潰瘍性結腸炎、及白斑症。
  26. 一種產生包含CAR-γδ T細胞的醫藥組成物之方法，其中該等方法包含使如請求項18所述之CAR-γδ T細胞與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
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