KR20230105166A

KR20230105166A - 감마-델타 t 세포의 증식 배양 방법

Info

Publication number: KR20230105166A
Application number: KR1020220000390A
Authority: KR
Inventors: 윤정호; 남재국; 김정훈; 류미현; 김다정; 이민희; 현승주; 유한욱; 박미선; 이연택; 정나현; 조효제
Original assignee: 주식회사 이뮤노맥스
Priority date: 2022-01-03
Filing date: 2022-01-03
Publication date: 2023-07-11
Also published as: WO2023128733A1

Abstract

본 발명은 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 기존에 알려진 일반적인 γδ T 세포 배양 방법이나 지지세포를 이용한 배양 방법에 비하여, 임상 친화적인 방법으로 높은 세포 살해능 및 세포 생존율을 갖는 γδ T 세포를 고순도 및 고효율로 단기간에 생산할 수 있어, 동종 γδ T 세포 면역치료제의 생산성을 증대시킬 수 있는 장점이 있다.

Description

감마-델타 T 세포의 증식 배양 방법{Method for Expansion Culture of γδ T Cell}

본 발명은 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 안드로젠 신호 전달 억제를 기반으로 하여 γδ T 세포를 증식 배양하는 것을 특징으로 하는 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

림프구의 일종인 T 세포는 B 세포와 함께 적응성 면역의 주축이다. T 세포는, 조혈 모세포(Hematopoietic cell)에서 만들어진 전구체가 흉선(Thymus)에서 성숙하는 과정을 거쳐 생성된다. T 세포는 흉선과 말초 림프조직(Peripheral lymphoid tissue)을 순환하는 αβ T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)를 발현하는 대다수의 αβ T 세포와 γδ T 세포 수용체를 발현하는 소수의 γδ T 세포로 구성된다(비특허문헌 1).　상피조직에 존재하는 γδ T 세포(tissue-resident γδ T cells)는 상당히 다른 양상을 보여, 어느 부위에서는 γδ T 세포가 대부분 또는 전부를 차지하기도 한다(비특허문헌 2). 이러한 상피조직에 존재하는 γδ T 세포는 림프조직에 존재하는 T 세포와는 다른 특징인 제한적이거나 일정한 T 세포 수용체 발현 양상을 보인다.

γδ T 세포는 흉선에서 만들어져 가장 먼저 다른 부위로 이동하는 T 세포로 대부분 피부, 장, 폐와 상피조직으로 출생 이전에 이동한다(비특허문헌 3). γδ T 세포는 T-세포 수용체의 다양성을 가지고 있지는 않지만 상피조직에 가해진 여러 가지의 생물학적 손상을 인지하여 반응하나, 이러한 반응을 유도하는 자가 항원에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 활성화된 γδ T 세포는 염증을 조절하고, 세포의 형질이 변화한 세포를 파괴하며, 상처의 치유를 향상시키는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 3). 또한 최근의 연구 결과에 의하면 γδ T 세포는 외부환경의 자극에 노출된 조직의 항상성(Homeostasis)을 유지, 복원하는 조절자 역할을 한다고 알려져 있다(비특허문헌 1).

γδ T 세포는 사람의 말초혈액 내에 0.5~5% 내외의 매우 적은 비율로 존재하며, 기능적으로는 적응성 면역(Adaptive immunity)과 선천성 면역(Innate immunity)의 두 가지 면역 반응에 모두 관여한다고 알려져 있다. 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 γδ T 세포는, 암세포나 박테리아가 생성하는 '인산항원(Phosphoantigen)'에 반응하는 것으로 알려졌다.

사람의 γδ T 세포는 두 가지 주요 아형(Subset)의 TCR 사슬이 Vδ1 사슬 또는 Vδ2 사슬이 존재하고(비특허문헌 4), 혈액 내에 존재하는 대부분의 γδ T 세포는 Vδ2 사슬을 가지고 있고, Vγ9 사슬과 한 쌍을 이루어 존재한다. TCR γδ T 세포는 흉선에서 TCR αβ T 세포보다 먼저 발생하며, 인산항원을 비롯한 몇 가지의 항원에 대한 제한된 TCR 다양성을 가지나 TCR αβ T 세포보다 더 빠르게 면역반응을 일으켜 innate-like 면역반응을 유도한다. γδ T 세포는 특히 αβ T 세포와 마찬가지로 세포용해(Cytolysis)를 통한 보다 더 강력한 항암효과를 가지지만, non-self MHC를 발현하는 세포에 대해서 이식편대숙주질환 (graft-versus-host disease; GVHD)를 일으키는 주원인인 αβ T 세포와는 달리 MHC 제한도 없고, 이식편대숙주질환도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 5).

따라서 γδ T 세포는 항암 면역 세포 치료에 유력한 후보 세포군이며, 인터류킨-2(Interleukin-2, IL-2)와 졸레드론산(Zoledronic acid, ZA, ZOL)을 처리하면 γδ T 세포가 특이적으로 증식함이 밝혀진 이래 다양한 암에서 치료 효과가 전임상 및 임상시험에 의하여 입증되고 있다. γδ T 세포를 이용한 반 일치이식 및 졸레드론산과 인터류킨-2로 γδ T 세포의 증폭을 포함한 암 면역치료법의 개발로 난치성 고위험군 환자의 치료 효능 극대화가 기대되고 있다.

체내에 존재하는 대부분의 γδ T 세포는 말초혈액 내에 0.5~5% 내외의 매우 적은 비율로 존재하고, 실제로 γδ T 세포를 치료 용도로 이용하기 위해서는 활성화된 γδ T 세포가 다량 필요하기 때문에, 혈액에서 분리한 γδ T 세포를 체외에서 대량으로 배양하는 방법이 활발하게 연구가 진행되고 있다. γδ T 세포의 배양에는 기존 세포 증식/활성에 사용하였던 졸레드론산과 IL-2뿐만 아니라 IL-15를 이용하는 방법(특허문헌 1~2), PHA(phytohaemagglutinin), TGF-β, 콘카나발린 A, 암포테리신 B 등을 이용하는 방법(특허문헌 3~6) 등이 개발된 바 있으나, 이는 예전부터 사용되어 오던 IL-2 사용에 대한 변형 및 발전 형태로 새로운 증식 물질을 찾은 것이고, 획기적이거나 개선된 방법을 제시하지는 못하고 있다. 또한, 지지세포(Feeder cell)로 사용하여 γδ T 세포를 증폭시킨 사례도 보고되고 있다. 지지세포를 사용할 경우 정상 세포가 아닌 특정 암세포주를 형질변환 또는 형질도입하여 γδ T 세포의 대량 증식에 이용하고 있다(비특허문헌 6).

이러한 방법은 임상 적용에 중요한 안전성을 보장하기에 적합하지 않은 방법이고, 특정 암세포에 대한 프라이밍(Priming) 특이성이 부여된 γδ T 세포를 생산한다는 한계가 있다.

이에, 본 발명자들은 TCR γδ T 세포를 대량으로 증식 배양하여 수득하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 사람의 말초혈액 단핵세포에서 분리한 미분화된 T 세포를 기존에 알려진 자극제인 졸레드론산 및 IL-2 이외에 유효성분으로 5α-환원 효소 억제제인 Finasteride를 포함하는 배지에서 배양하는 경우, γδ T 세포의 성장이 증가되고 세포 수득률이 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

1. 미국 등록특허 11,135,245 B 2. 유럽 특허등록 3,154,567 B 3. 미국 등록특허 10,370,452 B 4. 미국 등록특허 10,557,117 B2 5. WO2020-172555 6. 미국 공개특허 2019-0175650 A

Jameson J., Havran W.L.,　Immunol. Rev., 215:114-22., 2007 Allison J.P., Havran W.L.,　Annu. Rev. Immunol., 9:679-705, 1991 Komori H.K., Meehan T.F., Havran W.L., Curr. Opin. Immunol., 18(5):534-8, 2006 Kabelitz D., Marischen, L., Oberg, H.-H., Holtmeier, W.; Wesch, D. Int. Arch. Allergy Immunol., 137, 73-81, 2005 Sharma A., Zumwalde N.A., Gumperz, J., In Advanced Structural Safety Studies; Humana Press Inc.: New York, NY, USA, pp. 57-72, 2019 Tan W.K., Tay J.C.K., Zheng J., Zheng M., Wang S., J. Immunol Sci., 2(3): 6-12, 2018

본 발명의 목적은 γδ T 세포의 성장이 증가되어, 세포 수득률을 향상시킬 수 있는 γδ T 세포의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 γδ T 세포의 성장 및 세포 수득률을 향상시킬 수 있는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 γδ T 세포의 제조 방법을 제공한다:

(a) 말초혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC)를 (i) 졸레드론산(zeoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 배지에서 배양하여 γδ T 세포를 유도 및 배양하는 단계; 및

(b) 배양된 γδ T 세포를 수득하는 단계.

본 발명은 또한, (i) 졸레드론산(zeoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 기존에 알려진 일반적인 γδ T 세포 배양 방법이나 지지세포를 이용한 배양 방법에 비하여, 임상 친화적인 방법으로 높은 세포 살해능 및 세포 생존율을 갖는 γδT 세포를 고순도 및 고효율로 단기간에 생산할 수 있어, 동종 γδ T 세포 면역치료제의 생산성을 증대시킬 수 있는 장점이 있다.

도 1은 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여 γδ T 세포를 배양 시, 기본 배양 성분과 Finasteride를 농도 별로 지속 처리하였을 때 14일 배양 기간 동안 γδ T 세포의 증식률과 생존율을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여 γδ T 세포를 배양 시, 기본 배양 성분과 Finasteride를 농도 별로 지속 처리하였을 때 14일 배양 기간 동안 γδ T 세포의 증식률과 생존율을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride와 IL-15 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 고농도 (10 nM)의 Finasteride를 7일까지 지속 처리하고, IL-15를 14일 배양 기간 동안 지속 처리하여 남성 공여자의 γδ T 세포 증식 및 생존율(A)과 배양 14일 후 대조군 대비 증가된 γδ T 세포 수(B)를 비교 분석한 결과이다.
도 4는 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride와 IL-15 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 저농도 (0.01 nM)의 Finasteride를 7일까지 지속 처리하고, IL-15를 14일 배양 기간 동안 지속 처리하여 여성 공여자의 γδ T 세포 증식 및 생존율(A)과 배양 14일 후 대조군 대비 증가된 γδ T 세포 수(B)를 비교 분석한 결과이다.
도 5는 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(10 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일간의 γδ T 세포 증식률과 생존률을 비교한 결과를 나타낸 것이고, B는 배양한 γδ T 세포 및 αβ T 세포의 비율 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(10 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일 배양 후, γδ T 세포 수를 비교 분석한 결과를 나타낸 것이고, B는 14일 배양 후, 대조군 대비 γδ T 세포의 비율을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(0.01 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일 간의 γδ T 세포 증식률과 생존율을 비교한 결과를 나타낸 것이고, B는 배양한 γδ T 세포 및 αβ T 세포의 비율 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(0.01 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일 배양 후, γδ T 세포 수를 비교 분석한 결과를 나타낸 것이고, B는 14일 배양 후, 대조군 대비 γδ T 세포의 비율을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 A는 건강한 공여자의 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride를 배양 시작일로부터, 7일, 10일, 14일간 지속적으로 처리하고, 14일 γδ T 세포 수를 비교 분석한 결과이고, B는 상기의 배양 방법으로 처리하여 14일까지 배양한 γδ T 세포 및 αβ T 세포의 비율 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 말초혈액 단핵세포로부터 γδ T 세포를 단기간에 폭발적으로 증식시키기 위한 방법을 개발하고자 하였으며, 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제 등의 안드로젠 억제제가 함유된 혈청 배지에서 말초혈액 단핵세포를 배양하는 경우, γδ T 세포의 증식율 및 생존율을 높일 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음 단계를 포함하는 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것이다;

(a) 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 (i) 졸레드론산(zeoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 배지에서 배양하여 γδ T 세포를 유도 및 배양하는 단계; 및

(b) 배양된 γδ T 세포를 수득하는 단계.

본 발명에서 사용되는 졸레드론산은 비스포스포네이트(Bisphosphonates) 계열의 약물로서 파제트씨 병(Paget's disease)이나 전이성 유방암 (Metastatic Breast Cancer), 부갑상선 종양(Parathyroid Gland Tumors), 다발성골수종(Multiple Myeloma) 등의 암으로 인한 고칼슘 혈증(Hypercalcemia)의 치료에 사용된다. 졸레드론산은 혈중 칼슘 농도를 조절하는 내인성 피로인산(pyrophosphate)과 유사한 구조이면서 기존의 비스포스포네이트(Clodronate, Etidronate, Tiludronate 등)와는 달리 질소를 함유한 이미다졸환(Imidazole ring)을 가지고 있기 때문에 골 재흡수(Bone resorption)를 억제하는 효력이 매우 강한 특징이 있다. 졸레드론산은 골 기질 성분인 수산화인 석회(Hydroxyapaptite)의 칼슘(Calcium)과 킬레이트(Chelate) 함으로써 칼슘이 혈중으로 재흡수되는 것을 억제한다. 또한 파르네실 이인산 합성 효소(Farnesyl diphosphate synthase)를 억제함으로써 파골세포(Osteoclast)에 있는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질(Guanine nucleotide-binding proteins, G-Protein)의 prenylation을 방해하여 골 재흡수를 촉진시키는 파골세포의 세포사멸(Apoptosis)를 유도하여 파골세포를 감소시킴으로써 혈중 칼슘 농도를 조절하게 된다. 졸레드론산은 혈중에서 뼈 속으로 신속하게 흡수되어 뼈에 저장되며, 골 내 반감기가 길어서 1회의 정맥 주입으로 골 재흡수 작용을 지속시킬 수 있다. 그러나 혈중의 비스포스포네이트는 반감기가 0.5-2시간으로 매우 짧으며, 대사되지 않은 채로 신장을 통해 배설되므로 신장 손상 환자에 대해서는 용량 조절이 필요하다.

본 발명에서 '5-알파 환원효소 (5α-Reductase)'는 남성 호르몬인 테스토스테론(Testosterone)을 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)으로 환원시키는 생체 촉매이고, 1형(Type 1)에서 3형(Type 3)까지 존재한다. 1형에 이상이 생기면 뼈 무게와 근육의 양이 줄어들고, 2형에 이상이 생기면 전형적인 인터섹스(Intersex) 증상을 일으킨다. 3형에 이상이 생기면 세포 성장과 시각(눈)에 이상이 생기며 테스토스테론(Testosterone), 안드로스틴디온(Androstenedione), 프로게스테론(Progesterone) 생성이 줄어든다.

5α-환원 효소 억제제는 기질을 활성화 형태로 전환을 억제하여 활성화된 기질의 양을 감소시키고 이로 인해 기질의 수치가 약간 상승한다고 알려져 있다.⁷⁾ 5α-환원 효소의 억제 기전은 NADPH가 효소에 결합한 후 기질이 뒤따르는 것을 포함한다. 특정 기질에는 테스토스테론, 프로게스테론, 안드로스텐디온, 에피테스토스테론, 코티솔, 알도스테론, 디옥시코르티코스테론 등이 있다.

Substrate + NADPH + H⁺ →5α-Substrate + NADP⁺

5α-환원 효소 이성질체(5α-reductase isoform) Type I 및 II는 테스토스테론(Testosterone)을 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)으로, 프로게스테론을 5α-디히드로프로게스테론 (5α-DHP)으로, 디옥시코르티코스테론을 디히드로디옥시코르티코스테론(DHDOC)으로 환원시킨다.

본 발명에서 사용되는 'Finasteride'는 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론의 활성화 형태로 전환되는 것을 억제하는 5-알파 환원효소 억제제이다. 테스토스테론의 활성화 형태인 디하이드로테스토스테론은 탈모 및 전립선비대증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 조직 중의 디하이드로테스토스테론의 생성을 억제하는 5-알파 환원효소 억제제는 전립선비대증 치료제로 사용되고 있으며 탈모의 예방 및 치료에도 사용되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드(Dutasteride), 에프리스테라이드(Epristeride), 알파트라디올(Alfatradiol), 소팔메토 추출물(Saw Palmetto extract) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비칼루타미드(Bicalutamide), 풀루타미드(Flutamide), 니루타미드(Nilutamide) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 '5α-환원효소 억제제'는 바람직하게는 피나스테라이드(Finasteride)를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서 배양 배지에 포함될 수 있는 공동 자극 분자는 활성화된 항원전달세포(APC)에서 나타나는 주변부 세포막 단백질로, T 세포의 표면 막 단백질과 상호작용으로 APC와 T 세포 사이의 MHC-TCR 신호전달을 증가시키거나 감소시키는 공동 자극 신호를 만들 수 있는 세포의 표면 막 단백질의 총칭으로, 공동 자극 분자로 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 일 예로는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합. 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합,αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1 BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 CD80, 4-1BB, CD86 또는 CD276를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 사용한 CD80에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 공동 자극 분자도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능함은 자명하다.

본 발명의 γδ T 세포 배양을 위해 사용되는 공동 자극 분자의 배지 내 농도는 1~2,000 nM, 구체적으로는 5~1,000 nM 더욱 구체적으로는 10~500 nM이며, 사이토카인의 배지 내 농도는 1~2,000 IU, 구체적으로는 10~1,000 IU, 더욱 구체적으로는 약 20~400 IU이다.

본 발명에서 배양 배지에 포함될 수 있는 사이토카인은 인터류킨 류에서 선택된 하나 이상일 수 있는데, 인터류킨은 면역 담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용 가능한 인터류킨으로는 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-15(IL-15) 및 인터류킨-18(IL-18)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 인터류킨은 IL-2, IL-15, IL-18로 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능함은 자명하다.

본 발명은, TCR γδ T 세포의 대량 증식 배양에 있어서, 안드로젠 신호전달 억제제인 Finasteride를 사용하면서 동시에, 졸레드로산과 IL-2를 처리하며, 상기 방법에서 추가적으로 IL-15, IL-18 사이토카인 그리고 CD80 보조 자극 분자를 더불어 함께 사용하면, 더 높은 효율로 TCR γδ T 세포 대량 증식이 가능하다. 이때, 총 배양기간 동안 0.4 x 10⁶ ~ 3.0 x 10⁶ cells/mL 세포 농도가 유지되어야 한다. 상기 조건을 유지하면서 γδ T 세포를 정치 배양하는 것으로 γδ T 세포를 대량 증식 배양할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, γδ T 세포 배양방법은 다음과 같다:

(a) γδ T 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵세포 배양액을 자극한 후 정치 배양하는 단계;

(b) 상기 정치 배양된 세포 배양액을 일정 기간 경과한 후, 일정 세포 비율로 희석하여 정치 배양하는 단계; 및

(c) 상기 세포 배양액 내 γδ T 세포 수가 일정 시점에 도달하였을 때 상기 정치 배양된 세포가 포함된 배양액을 재유도시킨 후, 추가 성분이 첨가된 배양 배지를 첨가하여 정치 배양하는 단계.

상기의 (c) 단계 이후, 추가적으로 대량 수득된 γδ T 세포를 수집하는 단계가 포함될 수 있다.

본 발명에서 정치배양을 위해 사용될 수 있는 반응용기는 24-웰 플레이트(Well-plate), 12-웰 플레이트(Well-plate), 및 6-웰 플레이트(Well-plate), 셰이킹 플라스크(Shaking flask), T25-플라스크(T-flask), T75-플라스크(T-flask), T175-플라스크(T-flask) 및 T225-플라스크(T-flask), 일회용 세포 배양 백(Disposable cell culture bag) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 채택 가능할 수 있는 어떠한 반응용기라도 사용될 수 있다.

본 발명에서의 '적절한 배양 조건'은 37℃ 5% CO₂ 배양기(Incubator)에서 세포를 정치 배양하는 것을 의미한다.

본 발명에서의 '일정 배양 기간'은 γδ T 세포가 증식이 되어 일정 비율 또는 일정 세포 수가 되는 2~5일 내외의 기간을 의미한다.

본 발명에서의 '일정 비율' 또는 '일정 세포 수'는 일정 배양 기간 동안 γδ T 세포가 증식이 되어 일정 배양 기간 내에 0.4 x 10⁶ ~ 3.0 x 10⁶ cells/mL 농도의 세포 수를 의미한다.

본 발명에서의 '재유도'은 일정 배양 기간이 경과한 후, 세포를 포함한 배양액을 마이크로파이펫 또는 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고, 세포 배양 배지와 사이토카인 혼합액(Cytokine mix)를 추가로 첨가하여 γδ T 세포 증식을 재유도하는 것을 의미한다.

본 발명에서의 '사이토카인 혼합액'은 배양 기간 동안 재유도 후, 추가로 첨가하여 재유도 및 세포 증식을 유도하는 IL-15, IL-18 사이토카인과 CD80 공동 자극인자, 추가 유효 성분을 혼합한 첨가물을 의미한다.

본 발명에서 유효 성분으로 5α-환원 효소 억제제인 Finasteride를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니고, Dutasteride, Epristeride, Alfatradiol와 Saw Palmetto extract 등과 안드로겐 수용체 길항제(Androgen Receptor Antagonist, ARA)인 Bicalutamide, Flutamide, Nilutamide 등도 유효 성분으로 포함한다.

본 발명에서 사용한 기본 배양 배지로 Gibco CTS OpTmizer T cell Expansion Serum Free Media (Thermo-Fisher Scientific, Cat# A1048501) 이에 한정되는 것이 아니고, T 세포를 포함한 면역세포 배양에 사용되고 있는 Gibco CTS AIM-V medium, (Thermo-Fisher Scientific) LymphoONE T cell Expansion XFM(Takara), X-VIVO 10, -15, & -20 Hematopoietic Cell Medium(Lonza), PRIME-SV T cell Expansion XSFM(Fujifilm-Irvine Scientific), RPMI-1640 배지와 같은 통상의 T 세포 배양 배지가 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 피나스테라이드(Finasteride)는 γδ T 세포 유도 및 배양 배지에 0.001~100 nM의 농도로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.001~50 nM로 함유될 수 있으며, 첨가되는 피나스테라이드(Finasteride)의 농도는 γδ T 세포 유도 및 배양에 사용되는 말초혈액 단핵세포의 유래가 남성인지 여성인지에 따라 최적 농도가 달라질 수 있다.

본 발명에서 γδ T 세포 유도 및 배양에 사용되는 말초혈액 단핵세포가 남성 유래인 경우, γδ T 세포 유도 및 배양 배지는 1~50 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1~20 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 γδ T 세포 유도 및 배양에 사용되는 말초혈액 단핵세포가 여성 유래인 경우, γδ T 세포 유도 및 배양 배지는 0.001~10 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.001~1 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, γδ T의 배양은 총 3~21일간 수행하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 7~14일간 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 γδ T의 유도 및 배양 방법에 따르면, 배양 14일째에 총 배양 세포 중 γδ T 세포의 비율이 90% 이상인 세포를 수득할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 (i) 졸레드론산(zeoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서 배양 배지에 포함될 수 있는 공동 자극 분자는 활성화된 항원전달세포(APC)에서 나타나는 주변부 세포막 단백질로, T 세포의 표면 막 단백질과 상호작용으로 APC와 T 세포 사이의 MHC-TCR 신호전달을 증가시키거나 감소시키는 공동 자극 신호를 만들 수 있는 세포의 표면 막 단백질의 총칭으로, 공동 자극 분자로 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 일 예로는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합. 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합,αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 CD80, 4-1BB, CD86 또는 CD276를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 사용한 CD80에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 공동 자극 분자도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능함은 자명하다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. Finasteride 농도에 따른 건강한 말초혈액 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율 확인

1-1. 말초혈액 단핵세포 (Human Peripheral Blood Mononuclear Cell, hPBMC) 분리

전문의료인이 채혈하여 헤파린 튜브에 담은 건강 공여자의 혈액 100 cc를 4개의 50 mL 코니칼 튜브에 1X DPBS 25 mL, 혈액 25 mL을 넣어 주었다. 새로운 50 mL 코니칼 튜브에 15 mL Lymphoprep(Axis Shield, 영국)을 벽면에 최대한 묻지 않도록 조심스럽게 수직 분주하고, 희석한 혈액을 Lymphoprep 용액이 담긴 50 mL 코니칼 튜브에 벽면을 따라 천천히 위에 얹어 주었다. 상기 코니칼 튜브를 원심분리기에 넣고 800 x g(1,890 rpm), 20분, 실온으로 원심분리하였다. 4개의 층으로 분리된 혈액층에서, Lymphoprep과 혈장 층 사이에 있는 하얀색의 buffy coat 층을 회수하여 새 50 mL 코니칼 튜브(3~4개)에 옮겨 담고, 1,500 rpm(500 x g), 10분, 실온 조건으로 원심분리하였다. 50 mL 코니칼 튜브 3~4개에 나뉜 세포들을 1X DPBS 45 mL에 풀어준 후 50 mL 코니칼 튜브 한 개에 모았다. 한 튜브로 모은 세포를 1,250 rpm(350 x g), 10분, 실온 조건으로 총 2번의 원심분리하였다. 세포 농도가 1.0 x 10⁶cells/mL이 되도록 1.0 x 10⁷개의 세포 stock에 최종 부피가 10 mL이 되도록 배양 배지를 첨가하여 2~3회 파이펫팅 후, 세포 중 1.0 mL을 Day0 샘플로 분주하여 배양을 진행하고 남은 세포는 1.0 x 10⁷개의 세포로 동결 바이알에 분주하여 질소탱크(LN₂ Tank)에 동결 보관 후 필요할 경우 해동하여 사용하였다.

1-2. Finasteride 농도에 따른 말초혈액 단핵세포의 γδ T 세포 증식률 및 생존율

1-1에서 분리된 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 γδ T 세포 배양 기본 성분인 3 μM 졸레드론산(Zoledronic acid)과 10³ IU/mL IL-2를 포함하고, 유효성분으로 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride를 지속 처리한 후, 총 14일간 배양하여 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.

동결된 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 열불활성화 우태아혈청(Heat inactivation Fetal Bovine Serum(FBS), Gibco, 미국)이 10% 포함된 9 mL OpTmizer 배지(Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 complete OpTmizer 배지(10% 우태아혈청 + OpTmizer 배지, cOpTmizer) 5 mL에 현탁하여 세포 수를 측정한 후, cOpTmizer 배지로 1.0 x 10⁶ cells/mL 농도로 희석하였다.

24-well plate에 총 1.0 x 10⁶개의 세포(최종 1 mL)를 1개의 well에 시딩(seeding)하였다. γδ T 세포를 자극 및 분화를 유도하기 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride와 3 μM 졸레드론산, IL-2(10³ IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 3일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고, 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride 및 IL-2(10³ IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 2일간 배양하였다.

재유도 2일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride와 IL-2(10³ IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 6일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride와 IL-2(10³ IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용 또는 10 mL 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 10⁶개의 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 후, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용 또는 10 mL 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 10⁶개의 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석하였다. 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 2일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 12일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용 또는 10 mL 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 실시예 1에서 αβ T 세포 및 γδ T 세포를 포함한 세포의 구성 및 비율은 표 1의 항체를 사용하여 배양 시작일, 5일차, 7일차, 10일차와 14일차에 BD Bioscience 사의 Fortessa-X20 유세포분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, Finasteride를 0 nM, 0.01 nM, 10 nM의 농도로 남성 공여자와 여성 공여자에서 분리한 말초혈액 단핵세포에 처리하여 14일간 배양한 결과, 남성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해 고농도의 Finasteride에서 γδ T 세포의 증식률이 증가하였고(도 1), 여성 공여자의 경우 남성 공여자와는 반대로 저농도의 Finasteride에서 γδ T 세포의 증식률이 증가하였다(도 2).

실시예 2. Finasteride와 IL-15 처리에 따른 말초혈액 단핵세포 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율

건강한 공여자에서 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본 성분(3 μM Zoledronic acid(ZA)와 10³ IU/mL IL-2)에 유효성분인 Finasteride를 남성 공여자에게 10 nM 또는, 여성 공여자에게 0.01 nM 농도로 7일까지 지속적으로 처리, 0.8 nM IL-15는 지속적으로 처리하며, 총 14일간 배양하여 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.

동결되어 있는 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 OpTmizer 배지(cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA) 9 mL에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 5 mL cOpTmizer 배지에 현탁하여 세포 수를 측정한 뒤, 1.0 x 10⁶ cells/mL 농도로 희석하였다.

24-well plate에 총 1.0 x 10⁶개의 세포(최종 1 mL)를 1개의 well에 시딩(seeding) 하였다. γδ T 세포를 자극 및 분화를 유도하기 위해 남성, 여성 각각 10 nM 및 0.01 nM의 Finasteride와 3 μM 졸레드론산(ZA), IL-2(10³ IU/mL), 0.8 nM의 IL-15를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 3일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(10³ IU/mL) 및 남성, 여성 각각 10 nM 및 0.01 nM Finasteride와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 2일간 배양하였다.

재부유 2일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(10³ IU/mL) 및 남성, 여성 각각 10 nM, 0.01 nM Finasteride와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 6일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의cOpTmizer 배양 배지에 남성, 여성 각각 10 nM, 0.01 nM Finasteride, IL-2(10³ IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 10⁶cells/mL이 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 다음, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해준 다음, 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 10⁶cells/mL이 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석하였다. 추가로 넣어준 cOpTmizer 배양 배지는 IL-2(10³ IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 12일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로하여 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

다음 날, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 준 다음, 세포 수를 측정하였다. 실시예2에서 αβ T 세포 및 γδ T 세포를 포함한 세포의 구성 및 비율은 표 1의 항체를 사용하여 배양 시작일, 5일차, 7일차, 10일차 및 14일차에 BD Bioscience 사의 Fortessa-X20 유세포분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 남성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해 γδ T 세포의 증식률이 1.26배(126%) 증가하였고(도 3), 여성 공여자의 경우 남성 공여자와는 다르게 γδ T 세포의 증식률(도 4)에는 큰 차이가 나지 않았다.

실시예 3. Finasteride와 IL-15, IL-18, CD80 처리에 따른 건강한 말초혈액 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율

건강한 공여자에서 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본성분(3 μM Zoledronic acid와 10³ IU/mL IL-2)에 유효 성분인 남성, 여성 각각 10 nM, 0.01 nM Finasteride 로 배양 시작일에 단회 처리, 추가 성분인 6 nM IL-18을 배양 시작일에 단회 처리, 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15는 지속적으로 처리하며 총 14일간 배양하여 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.

동결되어 있는 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 9 mL OpTmizer 배지(cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심 분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 5 mL cOpTmizer 배지(Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하여 세포 수를 측정한 뒤 cOpTmizer 배지를 이용하여 1.0 x 10⁶/mL 세포 농도로 희석하였다.

24-well plate에 총 1.0 x 10⁶개의 세포를 한 well당 1 mL씩 분주하였다. γδ T 세포 자극 및 분화를 유도하기 위해 유효 성분인 Finasteride를 남성 공여자는 10 nM, 여성 공여자는 0.01 nM 농도로 처리하고, 3 μM 졸레드론산(ZA), IL-2(10³ IU/mL), 100 nM의 CD80, 0.8 nM의 IL-15와 6 nM의 IL-18를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 3일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(10³ IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 4일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 시작일로부터 5일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(10³IU/mL), 100 nM의 CD80과 0.8 nM의 IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 6일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(10³IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 10⁶cells/mL이 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 후, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 후, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³ IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 2일간 배양하였다.

배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(10³IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 실시예3에서 αβ T 세포 및 γδ T 세포를 포함한 세포의 구성 및 비율은 표 1의 항체를 사용하여 배양 시작일, 3 일차, 4일차, 5일차, 6일차, 7일차, 10일차와 14일차에 BD Bioscience 사의 Fortessa-X20 유세포분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 남성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해, Finasteride(10nM), IL-15, IL-18 및 CD80를 추가로 첨가한 실험군의 γδ T 세포의 증식률이 약 1.45배 증가하였다. 배양 14일째 세포의 비율은 95% 이상이 γδ T 세포이고 2~3% 정도의 αβ T 세포의 비율을 확인하였다.

또한, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 여성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해 Finasteride(0.01nM), IL-15, IL-18 및 CD80를 추가로 첨가한 실험군의 γδ T 세포의 증식률이 약 3.8배(380%) 증가하였다.

실시예 4. Finasteride 처리 기간에 따른 건강한 말초혈액 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율

건강한 공여자에서 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본 성분(3 μM Zoledronic acid와 10³ IU/mL IL-2)에 유효 성분인 10 nM Finasteride를 기간 별로 배양 시작일, 7, 10, 14일까지 지속 처리하였다. 이를 총 14일간 배양하였을 때, γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.

동결되어 있는 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 9 mL OpTmizer 배지(cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 5 mL cOpTmizer 배지(Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하여 세포 수 측정한 뒤 cOpTmizer 배지로 1.0 x 10⁶ cells/mL 농도로 희석하였다.

24-well plate에 총 1.0 x 10⁶개의 세포를 한 well당 1 mL씩 분주하였다. γδ T 세포 자극 및 분화를 유도하기 위해 10 nM Finasteride와 3 μM 졸레드론산(ZA), 100 μL IL-2(10³ IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 4일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 4일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 10 nM Finasteride와 IL-2(10³ IU/mL)을 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 5일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(10³ IU/mL)을 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

다음 날, 배양 중인 세포 배양액 기준으로 절반의 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(10³ IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 10⁶cells/mL 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 다음, 추가로 넣어 준 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(10³ IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다.

배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 10⁶cells/mL 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 다음, 추가로 넣어 준 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(10³ IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 12일째, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와10 nM Finasteride, IL-2(10³ IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다.

배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다.

건강한 공여자의 말초혈액 단핵세포를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본 성분에 고농도의 Finasteride를 7일, 10일, 14일까지 각각 지속적으로 처리하였으며, 14일간 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, Finasteride를 7일까지 지속 처리한 그룹이 대조군에 비해 1.5배 정도 γδ T 세포 증식률이 증가하였고, 10일 또는 14일까지 지속 처리한 그룹에 비해 1.1배 이상 증식률이 증가하였다. 생존율(Viability)은 대조군 대비 큰 차이는 없었고, 고농도의 Finasteride를 지속적으로 처리하여도 세포의 생존율에는 영향을 미치지 않았다. γδ T 세포 비율은 7일간 배양하였을 때 70% 정도의 비율을 나타내었으며, 10일간 배양하였을 때 90 % 이상의 세포가 γδ T 세포인 것으로 확인되었다.

IL-2 및 ZA 함유 배지를 대조군으로 하여, 각 실시예에서 추가한 성분에 의한 γδ T 세포 증식율을 표 2에 정리하였다.

표 2에 나타난 바와 같이, finasteride 첨가 시에 γδ T 세포의 증식율이 대조군에 비하여 증가하였으며, IL-15와 사이토카인 믹스(IL-15, IL-18 및 CD80) 첨가 시에 γδ T 세포의 증식율은 더욱 증가하는 것을 확인하였다.

각 배지 추가 성분에 의한 γδ T 세포 증식율 비교

IL-2 및 ZA 이외 배지 추가성분	남성공여자 유래 (Finasteride 10nM)	여성공여자 유래 (Finasteride 0.01nM)
finasteride (실시예 1)	1.35배 증가	1.15배 증가
finasteride, IL-15 (실시예 2)	1.26배 증가	1.11배 증가
finasteride, IL-15, IL-18, CD80 (실시예 3)	1.45배 증가	3.80배 증가

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 γδ T 세포의 제조 방법;
(a) 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 (i) 졸레드론산(zeoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 배지에서 배양하여 γδ T 세포를 유도 및 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 γδ T 세포를 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드(Dutasteride), 에프리스테라이드(Epristeride), 알파트라디올(Alfatradiol) 및 소팔메토 추출물(Saw Palmetto extract)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비칼루타미드(Bicalutamide), 풀루타미드(Flutamide) 및 니루타미드(Nilutamide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride) 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합. 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합,αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1 BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 CD80, 4-1BB, CD86 및 CD276으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지는 IL-4, IL-7. IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 IL-23으로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 배지는 IL-12, IL-15 및 IL-18로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포가 남성 유래인 경우, 상기 배지는 1~50 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포가 여성 유래인 경우, 상기 배지는 0.001~10 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양은 3~21일간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 배양 14일째에 총 세포 중 γδ T 세포의 비율이 90% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
(i) 졸레드론산(zeoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물.
제14항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드(Dutasteride), 에프리스테라이드(Epristeride), 알파트라디올(Alfatradiol) 및 소팔메토 추출물(Saw Palmetto extract)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제14항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비칼루타미드(Bicalutamide), 풀루타미드(Flutamide) 및 니루타미드(Nilutamide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제14항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride) 인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제14항에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제18항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합. 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합, αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제18항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 CD80, 4-1BB, CD86 및 CD276으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제14항에 있어서, 상기 배지는 IL-4, IL-7. IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 IL-23으로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제21항에 있어서, 상기 배지는 IL-12, IL-15 및 IL-18로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.