WO2023128733A1 - 감마-델타 t 세포의 증식 배양 방법 - Google Patents

감마-델타 t 세포의 증식 배양 방법 Download PDF

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WO2023128733A1
WO2023128733A1 PCT/KR2023/000082 KR2023000082W WO2023128733A1 WO 2023128733 A1 WO2023128733 A1 WO 2023128733A1 KR 2023000082 W KR2023000082 W KR 2023000082W WO 2023128733 A1 WO2023128733 A1 WO 2023128733A1
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medium
culture
cell
finasteride
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윤정호
남재국
김정훈
류미현
김다정
이민희
현승주
유한욱
박미선
이연택
정나현
조효제
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주식회사 이뮤노맥스
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ T cells, and more particularly, to a method for producing ⁇ T cells, which comprises proliferating and culturing ⁇ T cells based on androgen signal transduction inhibition.
  • T cells a type of lymphocyte, are the main axis of adaptive immunity along with B cells. T cells are generated through the maturation of precursors made from hematopoietic cells in the thymus. T cells consist of a majority of ⁇ T cell receptor (TCR)-expressing ⁇ T cells and a minority of ⁇ T cells expressing ⁇ T-cell receptor circulating in the thymus and peripheral lymphoid tissue.
  • TCR ⁇ T cell receptor
  • ⁇ T cells present in epithelial tissue show quite different aspects, and in some areas, ⁇ T cells occupy most or all of them
  • Non-Patent Document 2 ⁇ T cells present in these epithelial tissues show limited or constant expression of T cell receptors, which is different from T cells present in lymphoid tissues.
  • ⁇ T cells are T cells that are first created in the thymus and migrate to other parts of the body, most of which migrate to skin, intestines, lungs, and epithelial tissues before birth (Non-Patent Document 3). Although ⁇ T cells do not have a diversity of T-cell receptors, they recognize and respond to various biological damages applied to epithelial tissues, but little is known about self-antigens that induce these responses. Activated ⁇ T cells are known to regulate inflammation, destroy cells whose cell morphology has changed, and improve wound healing (Non-Patent Document 3). In addition, according to recent research results, ⁇ T cells are known to act as regulators to maintain and restore homeostasis of tissues exposed to external environmental stimuli (Non-Patent Document 1).
  • ⁇ T cells are present in a very small percentage of around 0.5 to 5% in human peripheral blood, and are known to be functionally involved in both immune responses of adaptive immunity and innate immunity. ⁇ T cells, which play an important role in the immune response, are known to respond to 'Phosphoantigen' produced by cancer cells or bacteria.
  • TCR ⁇ T cells arise earlier than TCR ⁇ T cells in the thymus, and have limited TCR diversity for several antigens, including phosphoantigens, but evoke an immune response faster than TCR ⁇ T cells, inducing an innate-like immune response.
  • ⁇ T cells have a stronger anticancer effect through cytolysis, especially like ⁇ T cells, but are prone to graft-versus-host disease (GVHD) against cells expressing non-self MHC. Unlike ⁇ T cells, which are the main cause of .
  • ⁇ T cells are a promising candidate cell group for anticancer immune cell therapy, and treatment with Interleukin-2 (IL-2) and Zoledronic acid (ZA, ZOL) causes ⁇ T cells to specifically proliferate. Since its discovery, its therapeutic effect in various cancers has been demonstrated through preclinical and clinical trials. The development of cancer immunotherapy, including semicongruent transplantation using ⁇ T cells and amplification of ⁇ T cells with zoledronic acid and interleukin-2, is expected to maximize treatment efficacy for patients with intractable high-risk groups.
  • IL-2 Interleukin-2
  • ZOL Zoledronic acid
  • ⁇ T cells Most of the ⁇ T cells present in the body exist in a very small percentage of around 0.5 to 5% in the peripheral blood, and since a large amount of activated ⁇ T cells are required to actually use ⁇ T cells for therapeutic purposes, A method for culturing isolated ⁇ T cells in vitro in large quantities is being actively researched.
  • a method using not only zoledronic acid and IL-2, which were previously used for cell proliferation/activity, but also IL-15 Patent Documents 1 and 2), PHA (phytohaemagglutinin), TGF- ⁇ , and concanavalin A , A method using amphotericin B, etc.
  • Patent Documents 3 to 6 has been developed, but this is a modification and development of IL-2, which has been used for a long time, to find a new proliferative substance, and it is technological or improved. I can't suggest how to do it.
  • cases in which ⁇ T cells are amplified using feeder cells have also been reported.
  • feeder cells a specific cancer cell line rather than normal cells is transformed or transduced and used for mass proliferation of ⁇ T cells (Non-Patent Document 6).
  • This method is not suitable for ensuring safety, which is important for clinical applications, and has a limitation in that it produces ⁇ T cells endowed with priming specificity for specific cancer cells.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method for obtaining TCR ⁇ T cells by proliferating and culturing in large quantities.
  • a medium containing 5 ⁇ -reductase inhibitor Finasteride as an active ingredient when cultured in a medium containing 5 ⁇ -reductase inhibitor Finasteride as an active ingredient, it was confirmed that growth of ⁇ T cells was increased and cell yield was improved, and the present invention was completed.
  • Patent Document 1 US Patent Registration 11,135,245 B
  • Patent Document 2 European Patent Registration 3,154,567 B
  • Patent Document 3 US Patent Registration 10,370,452 B
  • Patent Document 4 US Patent Registration 10,557,117 B2
  • Patent Document 5 WO2020-172555
  • Patent Document 6 US Patent Publication 2019-0175650 A
  • Non-Patent Document 1 Jameson J., Havran W.L., Immunol. Rev., 215:114-22., 2007
  • Non-Patent Document 2 Allison J.P., Havran W.L., Annu. Rev. Immunol., 9:679-705, 1991
  • Non-Patent Document 3 Komori H.K., Meehan T.F., Havran W.L., Curr. Opin. Immunol., 18(5):534-8, 2006
  • Non-Patent Document 4 (Non-Patent Document 4) Arthuritz D., Marischen, L., Oberg, H.-H., Holtmeier, W.; Wesch, D. Int. Arch. Allergy Immunol., 137, 73-81, 2005
  • Non-Patent Document 5 Sharma A., Zumwalde N.A., Gumperz, J., In Advanced Structural Safety Studies; Humana Press Inc.: New York, NY, USA, pp. 57-72, 2019
  • Non-Patent Document 6 Tan W.K., Tay J.C.K., Zheng J., Zheng M., Wang S., J. Immunol Sci., 2(3): 6-12, 2018
  • An object of the present invention is to provide a method for producing ⁇ T cells capable of improving cell yield by increasing the growth of ⁇ T cells.
  • Another object of the present invention is to provide a medium composition for inducing and culturing ⁇ T cells capable of improving the growth and cell yield of ⁇ T cells.
  • the present invention provides a method for producing ⁇ T cells comprising the following steps:
  • PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • the present invention also provides a medium composition for inducing and culturing ⁇ T cells containing (i) zoledronic acid, (ii) IL-2, and (iii) a 5 ⁇ -reductase inhibitor or an androgen receptor antagonist. do.
  • Figure 1 shows the results of comparative analysis of the proliferation rate and survival rate of ⁇ T cells during a 14-day culture period when ⁇ T cells were cultured using male donor-derived peripheral blood mononuclear cells, and the basic culture components and Finasteride were continuously treated by concentration. It is shown
  • Figure 2 shows the results of comparative analysis of the proliferation rate and viability of ⁇ T cells during a 14-day culture period when ⁇ T cells were cultured using female donor-derived peripheral blood mononuclear cells, and the basic culture components and Finasteride were continuously treated by concentration. it is shown
  • Figure 3 shows the results of confirming the ⁇ T cell proliferation and survival rate according to Finasteride and IL-15 treatment using male donor-derived peripheral blood mononuclear cells.
  • Figure 4 shows the results of confirming the proliferation and viability of ⁇ T cells according to Finasteride and IL-15 treatment using female donor-derived peripheral blood mononuclear cells. This is the result of comparative analysis of the ⁇ T cell proliferation and viability (A) of female donors treated with IL-15 continuously for 14 days of culture and the increased number of ⁇ T cells compared to the control group (B) after 14 days of culture.
  • Figure 5 shows the results of confirming the ⁇ T cell proliferation and survival rate according to Finasteride (10 nM) and cytokine mixture treatment using male donor-derived peripheral blood mononuclear cells
  • A is the ⁇ T cell proliferation rate and survival rate for 14 days
  • B shows the result of analyzing the ratio of cultured ⁇ T cells and ⁇ T cells.
  • Figure 6 shows the results of confirming ⁇ T cell proliferation and viability according to Finasteride (10 nM) and cytokine mixture treatment using male donor-derived peripheral blood mononuclear cells
  • A is the number of ⁇ T cells after 14 days of culture shows the result of comparative analysis
  • B shows the result of analyzing the ratio of ⁇ T cells compared to the control group after 14 days of culture by flow cytometry.
  • Figure 7 shows the results of confirming the ⁇ T cell proliferation and survival rate according to Finasteride (0.01 nM) and cytokine mixture treatment using female donor-derived peripheral blood mononuclear cells
  • A is the ⁇ T cell proliferation rate and survival rate for 14 days
  • B shows the result of analyzing the ratio of cultured ⁇ T cells and ⁇ T cells.
  • Figure 8 shows the results of confirming ⁇ T cell proliferation and viability according to Finasteride (0.01 nM) and cytokine mixture treatment using female donor-derived peripheral blood mononuclear cells
  • A is the number of ⁇ T cells after 14 days of culture shows the result of comparative analysis
  • B shows the result of analyzing the ratio of ⁇ T cells compared to the control group after 14 days of culture by flow cytometry.
  • Figure 9A is the result of comparative analysis of the number of ⁇ T cells on day 14 after continuous treatment with Finasteride for 7 days, 10 days, and 14 days from the start of culture using peripheral blood mononuclear cells of healthy donors
  • B is The result of analyzing the ratio of ⁇ T cells and ⁇ T cells treated with the above culture method and cultured for up to 14 days is shown.
  • the present invention relates to a method for producing ⁇ T cells comprising the following steps;
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • Zoledronic acid used in the present invention is a drug of the bisphosphonates family, and is effective against Paget's disease, metastatic breast cancer, parathyroid gland tumors, multiple myeloma, and the like. It is used in the treatment of hypercalcemia caused by cancer.
  • Zoledronic acid has a similar structure to endogenous pyrophosphate that regulates blood calcium concentration, but unlike existing bisphosphonates (Clodronate, Etidronate, Tiludronate, etc.), it has an imidazole ring containing nitrogen, so it is an aggregate material. It has a very strong effect of inhibiting bone resorption.
  • Zoledronic acid inhibits the reabsorption of calcium into the blood by chelating with calcium of hydroxyapatite, a bone matrix component.
  • osteoclasts promote bone resorption by interfering with the prenylation of Guanine nucleotide-binding proteins (G-Protein) in osteoclasts.
  • G-Protein Guanine nucleotide-binding proteins
  • Zoledronic acid is rapidly absorbed into the bone from the blood and stored in the bone, and because of its long half-life in the bone, a single intravenous injection can sustain bone resorption.
  • blood bisphosphonates have a very short half-life of 0.5-2 hours and are excreted through the kidneys without being metabolized, so dose adjustment is required for patients with renal impairment.
  • '5-alpha reductase (5 ⁇ -Reductase)' is a biocatalyst that reduces testosterone, a male hormone, to dihydrotestosterone (DHT). 3) exists.
  • An abnormality in type 1 causes a decrease in bone weight and muscle mass, and an abnormality in type 2 causes typical intersex symptoms. If type 3 is abnormal, cell growth and vision (eyes) are abnormal, and testosterone, androstenedione, and progesterone production are reduced.
  • 5 ⁇ -reductase inhibitors reduce the amount of activated substrate by inhibiting the conversion of the substrate to its active form, thereby slightly increasing the substrate level.
  • the mechanism of inhibition of 5 ⁇ -reductase involves binding of NADPH to the enzyme followed by a substrate.
  • Specific substrates include testosterone, progesterone, androstenedione, epitestosterone, cortisol, aldosterone, and deoxycorticosterone.
  • Type I and II are testosterone to dihydrotestosterone (DHT), progesterone to 5 ⁇ -dihydroprogesterone (5 ⁇ -DHP), and deoxycorticosterone is reduced to dihydrodeoxycorticosterone (DHDOC).
  • 'Finasteride' used in the present invention is a 5-alpha reductase inhibitor that inhibits conversion of testosterone to an active form of dihydrotestosterone.
  • Dihydrotestosterone an active form of testosterone, is known to be involved in hair loss and benign prostatic hyperplasia. Therefore, 5-alpha reductase inhibitors that inhibit the production of dihydrotestosterone in tissues are used as a treatment for prostatic hyperplasia and are also used for preventing and treating hair loss.
  • the 5 ⁇ -reductase inhibitor is Finasteride, Dutasteride, Epristeride, Alphatradiol, Saw Palmetto extract, etc. It can be used, but is not limited thereto.
  • the androgen receptor antagonist may be Bicalutamide, Flutamide, Nilutamide, etc., but is not limited thereto.
  • the '5 ⁇ -reductase inhibitor' used in the present invention is preferably finasteride.
  • the medium may be characterized in that it further contains costimulatory molecules, and the costimulatory molecules that may be included in the culture medium in the present invention are peripheral cell membrane proteins expressed in activated antigen presenting cells (APCs).
  • a ligand may be used, for example, 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, ⁇ 3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, or a combination thereof.
  • phorbol 12-myristate-13-acetate TAA
  • mezerein staphylococcal enterotoxin A
  • streptococcal protein A amphotericin B or a combination thereof
  • ⁇ TCR, ⁇ TCR, ⁇ TCR, ⁇ TCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1 BB (CD137), OX40 (CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122 , GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, accessory molecule-1 (DNAM-1), SLAM, antibodies or ligands to coxsackie virus and adenovirus receptors or combinations thereof, preferably CD80 , 4-1BB, CD86 or CD276 can be used, but is not limited to CD80 used in the examples of the present invention, and other costimulatory molecules are also for the purpose of the present invention to
  • the concentration of the co-stimulatory molecule used for culturing ⁇ T cells of the present invention in the medium is 1 to 2,000 nM, specifically 5 to 1,000 nM, more specifically 10 to 500 nM, and the concentration of the cytokine in the medium is 1 to 1,000 nM.
  • the cytokine that may be included in the culture medium may be one or more selected from interleukins.
  • Interleukin is a generic term for proteinaceous bioactive substances produced by cells in charge of immunity, and interleukins usable in the present invention include interleukin-2 (IL) -2), interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15), and interleukin-18 (IL-18).
  • IL-15, and IL-18 are not limited thereto, and it is apparent to those skilled in the art that other cytokines can be used without limitation as long as they meet the purpose of the present invention.
  • TCR ⁇ T cells in the mass proliferation culture of TCR ⁇ T cells, Finasteride, an androgen signaling inhibitor, is used, and zoledroic acid and IL-2 are treated at the same time.
  • IL-15 and IL-18 cytokines are additionally
  • CD80 costimulatory molecules when CD80 costimulatory molecules are used together, TCR ⁇ T cell mass proliferation is possible with higher efficiency.
  • a cell concentration of 0.4 x 106 to 3.0 x 106 cells/mL should be maintained during the total culture period.
  • ⁇ T cells can be mass-proliferated and cultured by statically culturing ⁇ T cells while maintaining the above conditions.
  • the method for culturing ⁇ T cells is as follows:
  • step (c) above a step of additionally collecting the large amount of ⁇ T cells may be included.
  • Reaction vessels that can be used for stationary culture in the present invention include 24-well plates (Well-plate), 12-well plates (Well-plate), and 6-well plates (Well-plate), shaking flasks (Shaking flask) ), T25-flask, T75-flask, T175-flask and T225-flask, Disposable cell culture bag, etc.
  • any reaction vessel that can be easily adopted by a person skilled in the art may be used.
  • 'Appropriate culture conditions' in the present invention means static culture of cells in a 37°C 5% CO2 incubator.
  • the 'constant culture period' in the present invention means a period of about 2 to 5 days in which ⁇ T cells proliferate to a certain ratio or a certain number of cells.
  • 'constant ratio' or 'constant cell number' refers to the number of cells at a concentration of 0.4 x 10 6 to 3.0 x 10 6 cells/mL in which ⁇ T cells are proliferated during a given culture period.
  • 're-induction means that after a certain culture period has elapsed, the culture solution containing the cells is re-suspended by using a micropipette or a corrological pipette to re-suspend the aggregated cells, and the cell culture medium and the cytokine mixture (Cytokine mixture) mix) to re-induce ⁇ T cell proliferation.
  • the 'cytokine mixture' in the present invention is a mixture of IL-15 and IL-18 cytokines, CD80 co-stimulator, and additional active ingredients that are additionally added after re-induction during the culture period to induce re-induction and cell proliferation. means additives.
  • Finasteride a 5 ⁇ -reductase inhibitor
  • Dutasteride Epristeride, Alfatradiol, Saw Palmetto extract, etc.
  • Androgen Receptor Antagonist ARA
  • Bicalutamide, Flutamide, Nilutamide and the like are also included as active ingredients.
  • the basic culture medium used in the present invention is Gibco CTS OpTmizer T cell Expansion Serum Free Media (Thermo-Fisher Scientific, Cat# A1048501), but is not limited thereto, Gibco CTS AIM-V medium used for culturing immune cells including T cells, (Thermo-Fisher Scientific) LymphoONE T cell Expansion XFM (Takara), X-VIVO 10, -15, & -20 Hematopoietic Cell Medium (Lonza), PRIME-SV T cell Expansion XSFM (Fujifilm-Irvine Scientific), RPMI-1640 Conventional T cell culture media such as medium can be used.
  • Gibco CTS OpTmizer T cell Expansion Serum Free Media Gibco CTS OpTmizer T cell Expansion Serum Free Media
  • Gibco CTS AIM-V medium used for culturing immune cells including T cells, (Thermo-Fisher Scientific) LymphoONE T cell Expansion XFM
  • Finasteride used in the present invention may be contained in the ⁇ T cell induction and culture medium at a concentration of 0.001 to 100 nM, preferably 0.001 to 50 nM, and the The optimum concentration may vary depending on whether the peripheral blood mononuclear cells used for inducing and culturing ⁇ T cells are male or female.
  • the ⁇ T cell induction and culture medium preferably contains 1-50 nM of Finasteride, more preferably It is preferable to contain 1-20 nM of Finasteride.
  • the ⁇ T cell induction and culture medium preferably contains 0.001 to 10 nM of Finasteride, more preferably It is preferable to contain 0.001 to 1 nM of Finasteride.
  • the culture of ⁇ T is preferably carried out for a total of 3 to 21 days, more preferably 7 to 14 days.
  • cells having a ratio of ⁇ T cells of 90% or more among the total cultured cells can be obtained on the 14th day of culture.
  • the present invention provides a medium composition for inducing and culturing ⁇ T cells containing (i) zoledronic acid, (ii) IL-2, and (iii) a 5 ⁇ -reductase inhibitor or an androgen receptor antagonist. It is about.
  • the 5 ⁇ -reductase inhibitor is Finasteride, Dutasteride, Epristeride, Alphatradiol, Saw Palmetto extract, etc. It can be used, but is not limited thereto.
  • the androgen receptor antagonist may be Bicalutamide, Flutamide, Nilutamide, etc., but is not limited thereto.
  • the '5 ⁇ -reductase inhibitor' used in the present invention is preferably finasteride.
  • the medium may be characterized in that it further contains costimulatory molecules, and the costimulatory molecules that may be included in the culture medium in the present invention are peripheral cell membrane proteins expressed in activated antigen presenting cells (APCs).
  • a ligand may be used, for example, 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, ⁇ 3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, or a combination thereof.
  • phorbol 12-myristate-13-acetate TAA
  • mezerein staphylococcal enterotoxin A
  • streptococcal protein A amphotericin B or a combination thereof
  • ⁇ TCR, ⁇ TCR, ⁇ TCR, ⁇ TCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, Antibodies or ligands to GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, accessory molecule-1 (DNAM-1), SLAM, coxsackie virus and adenovirus receptors or combinations thereof may be used, preferably CD80, 4-1BB, CD86 or CD276 can be used, but is not limited to CD80 used in the examples of the present invention, and other costimulatory molecules for the purpose of the present invention can
  • the concentration of the co-stimulatory molecule used for culturing ⁇ T cells of the present invention in the medium is 1 to 2,000 nM, specifically 5 to 1,000 nM, more specifically 10 to 500 nM, and the concentration of the cytokine in the medium is 1 to 1,000 nM.
  • the cytokine that may be included in the culture medium may be one or more selected from interleukins.
  • Interleukin is a generic term for proteinaceous bioactive substances produced by cells in charge of immunity, and interleukins usable in the present invention include interleukin-2 (IL) -2), interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15), and interleukin-18 (IL-18).
  • IL-15, and IL-18 are not limited thereto, and it is apparent to those skilled in the art that other cytokines can be used without limitation as long as they meet the purpose of the present invention.
  • Example 1 Confirmation of ⁇ T cell proliferation and survival rate in healthy peripheral blood according to finasteride concentration
  • hPBMC Human Peripheral Blood Mononuclear Cell
  • 25 mL of 1X DPBS and 25 mL of blood were added to four 50 mL conical tubes of 100 cc of blood from a healthy donor collected by a medical professional and put in a heparin tube.
  • 15 mL Lymphoprep (Axis Shield, UK) was carefully dispensed vertically so as not to touch the wall as much as possible, and the diluted blood was slowly added to the 50 mL conical tube containing the Lymphoprep solution along the wall.
  • the conical tube was placed in a centrifuge and centrifuged at 800 xg (1,890 rpm) for 20 minutes at room temperature.
  • the white buffy coat layer between Lymphoprep and plasma layer was recovered and transferred to a new 50 mL conical tube (3-4 pieces), 1,500 rpm (500 xg), 10 minutes , and centrifuged under room temperature conditions.
  • Cells divided into 3-4 50 mL conical tubes were dissolved in 45 mL of 1X DPBS and collected in one 50 mL conical tube. Cells collected in one tube were centrifuged twice at 1,250 rpm (350 xg) for 10 minutes at room temperature.
  • Culture medium was added to 1.0 x 10 7 cell stock to a final volume of 10 mL so that the cell concentration was 1.0 x 10 6 cells/mL, pipetting 2-3 times, and 1.0 mL of the cells was dispensed as Day0 sample. After the culture, the remaining cells were dispensed into frozen vials at 1.0 x 10 7 cells, stored frozen in a nitrogen tank (LN 2 Tank), and then thawed and used if necessary.
  • LN 2 Tank nitrogen tank
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells isolated in 1-1 contained 3 ⁇ M Zoledronic acid and 10 3 IU/mL IL-2, which are basic components of ⁇ T cell culture, and active ingredients After continued treatment with 0.01 nM and 10 nM of Finasteride, respectively, the cells were cultured for 14 days, and the activation and proliferation rates of ⁇ T cells were compared.
  • OpTmizer medium (Themo-Fisher Scientific, USA) was suspended. The cell number was measured and centrifuged at 400 xg, 25°C for 4 minutes. The cell pellet obtained by centrifugation was suspended in 5 mL of complete OpTmizer medium (10% fetal bovine serum + OpTmizer medium, cOpTmizer) to measure the number of cells, and then diluted with cOpTmizer medium to a concentration of 1.0 x 10 6 cells/mL. .
  • complete OpTmizer medium (10% fetal bovine serum + OpTmizer medium, cOpTmizer
  • a total of 1.0 x 10 6 cells (final 1 mL) were seeded in one well in a 24-well plate.
  • 0.01 nM and 10 nM Finasteride, 3 ⁇ M zoledronic acid, and IL-2 (10 3 IU/mL) were added and cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for 3 days.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette, and the same amount of cOpTmizer culture medium and 0.01 nM and 10 nM of Finasteride and IL-2 (10 3 IU/ mL) was additionally added and cultured for 2 days in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured. Based on the cell culture in culture, the same amount of cOpTmizer culture medium and 0.01 nM and 10 nM of Finasteride and IL-2 (10 3 IU/mL) were additionally added for re-induction, and cultured in a 37°C CO 2 incubator. .
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL cortical pipette, and the cell number was measured.
  • IL-2 (10 3 IU/mL) is added to the additionally added cOpTmizer culture medium, and the temperature is 37°C CO It was cultured for 3 days in 2 incubators.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL hyperlogical pipette, and the number of cells was measured. Based on the cells in culture, the cell concentration was diluted with cOpTmizer culture medium to a cell concentration of 0.4 x 10 6 cells. IL-2 (10 3 IU/mL) was added to the additionally added cOpTmizer culture medium and cultured for 2 days in a 37°C CO 2 incubator.
  • IL-2 (10 3 IU/mL) was additionally added to the same amount of cOpTmizer culture medium and additionally added cOpTmizer culture medium based on the cell culture medium in culture, and cultured in a 37°C CO 2 incubator. did
  • Example 1 the composition and ratio of cells, including ⁇ T cells and ⁇ T cells, were measured using the antibodies in Table 1 on the first day, day 5, day 7, day 10, and day 14 of culture using a Fortessa-X20 flow cytometer (BD Bioscience). It was analyzed using flow cytometry).
  • peripheral blood mononuclear cells isolated from male and female donors were treated with Finasteride at concentrations of 0 nM, 0.01 nM, and 10 nM and cultured for 14 days.
  • the proliferation rate of ⁇ T cells was increased at high concentrations of Finasteride (FIG. 1), and in the case of female donors, the proliferation rate of ⁇ T cells at low concentrations of Finasteride, as opposed to male donors, was increased. increased (FIG. 2).
  • Example 2 ⁇ T cell proliferation and survival rate in peripheral blood mononuclear cells according to finasteride and IL-15 treatment
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • Finasteride an active ingredient, was added to the basic components of ⁇ T cell culture (3 ⁇ M Zoledronic acid (ZA) and 10 3 IU/mL IL-2) from male donors.
  • 10 nM or 0.01 nM to female donors were continuously treated for up to 7 days, and 0.8 nM IL-15 was continuously treated, and cultured for a total of 14 days, and the activation and proliferation rates of ⁇ T cells were compared.
  • Frozen peripheral blood mononuclear cells were thawed in a 37° C. constant temperature water bath and then suspended in 9 mL of OpTmizer medium (cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA) containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS). The cell number was measured and centrifuged at 400 xg, 25°C for 4 minutes. The cell pellet obtained by centrifugation was suspended in 5 mL cOpTmizer medium to measure the number of cells, and then diluted to a concentration of 1.0 x 10 6 cells/mL.
  • OpTmizer medium cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • a total of 1.0 x 10 6 cells (final 1 mL) were seeded in one well in a 24-well plate.
  • 10 nM and 0.01 nM of Finasteride 3 ⁇ M of zoledronic acid (ZA), IL-2 (10 3 IU/mL), and 0.8 nM of IL-15 were administered to males and females, respectively. was added and cultured for 3 days in a 37°C CO 2 incubator.
  • ZA zoledronic acid
  • IL-2 10 3 IU/mL
  • 0.8 nM of IL-15 were administered to males and females, respectively. was added and cultured for 3 days in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured. Based on the cell culture medium in culture, the same amount of cOpTmizer culture medium, IL-2 (10 3 IU/mL), and 10 nM, 0.01 nM Finasteride and 0.8 nM IL-15 for men and women, respectively, were additionally added, and 37°C CO 2 Cultivated in an incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL cortical pipette and the number of cells was measured.
  • IL-2 (10 3 IU/mL) and 0.8 nM IL-15 are added to the additionally added cOpTmizer culture medium. was further added and cultured for 3 days in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL pipette, and the number of cells was measured.
  • the cells were diluted with cOpTmizer culture medium so that the cell concentration was 0.4 x 10 6 cells/mL based on the cells in culture.
  • the additionally added cOpTmizer culture medium was cultured in a 37°C CO 2 incubator with the addition of IL-2 (10 3 IU/mL) and 0.8 nM IL-15.
  • IL-2 (10 3 IU/mL) and 0.8 nM IL-15 were additionally added to the same amount of cOpTmizer culture medium based on the cell culture medium in culture and cultured in a 37°C CO 2 incubator. did
  • IL-2 (10 3 IU/mL) and 0.8 nM IL-15 were additionally added to half of the cOpTmizer culture medium based on the cell culture medium in culture, and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • Example 2 the composition and ratio of cells including ⁇ T cells and ⁇ T cells were measured using the antibodies in Table 1 on the first day, day 5, day 7, day 10, and day 14 of culture using a Fortessa-X20 flow cytometer (BD Bioscience). It was analyzed using flow cytometry).
  • Example 3 ⁇ T cell proliferation and viability in healthy peripheral blood according to finasteride and IL-15, IL-18, and CD80 treatment
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • ⁇ T cell culture basic components (3 ⁇ M Zoledronic acid and 10 3 IU/mL IL-2) were added with 10 nM each of male and female active ingredients, respectively.
  • a single treatment with 0.01 nM Finasteride on the starting day of culture, a single treatment with 6 nM IL-18, an additional component, and continuous treatment with 100 nM CD80 and 0.8 nM IL-15 for a total of 14 days to activate ⁇ T cells and Proliferation rates were compared.
  • Frozen peripheral blood mononuclear cells were thawed in a 37° C. constant temperature water bath and then suspended in 9 mL OpTmizer medium (cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS). The cell number was measured and centrifuged at 400 xg, 25°C for 4 minutes. The cell pellet obtained by centrifugation was suspended in 5 mL cOpTmizer medium (Themo-Fisher Scientific, USA) to measure the number of cells, and then diluted to a cell concentration of 1.0 x 10 6 /mL using cOpTmizer medium.
  • a total of 1.0 x 10 6 cells were dispensed at 1 mL per well in a 24-well plate.
  • male donors were treated with finasteride, an active ingredient, at a concentration of 10 nM and female donors at a concentration of 0.01 nM, and 3 ⁇ M zoledronic acid (ZA) and IL-2 (10 3 IU/mL) were administered.
  • ZA zoledronic acid
  • IL-2 10 3 IU/mL
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured.
  • the same amount of cOpTmizer culture medium, IL-2 (10 3 IU/mL), 100 nM CD80 and 0.8 nM IL-15 were additionally added and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured. After 5 days from the start of culture, the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured. Based on the cell culture in culture, the same amount of cOpTmizer culture medium, IL-2 (10 3 IU/mL), 100 nM of CD80 and 0.8 nM of IL-15 were additionally added and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured. Based on the cell culture medium in culture, half of the cOpTmizer culture medium, IL-2 (10 3 IU/mL), 100 nM CD80 and 0.8 nM IL-15 were additionally added and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL pipette and the cell number was measured. After diluting with cOpTmizer culture medium so that the cell concentration is 0.4 x 10 6 cells/mL based on the cells in culture, IL-2 (10 3 IU/mL), 100 nM CD80 and 0.8 nM IL-15 was additionally added and cultured for 3 days in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL pipette and the cell number was measured. After diluting with the same amount of cOpTmizer culture medium based on the cell culture medium in culture, IL-2 (10 3 IU/mL), 100 nM CD80, and 0.8 nM IL-15 were further added to the additionally added cOpTmizer culture medium, and 37 °C CO 2 It was cultured for 2 days in an incubator.
  • IL-2 (10 3 IU/mL), 100 nM CD80, and 0.8 nM IL-15 were additionally added to the same amount of cOpTmizer culture medium and additionally added cOpTmizer culture medium based on the cell culture medium in culture, and 37°C CO 2 Cultivated in an incubator.
  • Example 3 the composition and ratio of cells including ⁇ T cells and ⁇ T cells were measured using the antibodies in Table 1 on the starting day, day 3, day 4, day 5, day 6, day 7, day 10 and day 14. Analysis was performed using a BD Bioscience Fortessa-X20 flow cytometer.
  • Example 4 Proliferation and viability of ⁇ T cells in healthy peripheral blood according to finasteride treatment period
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • Frozen peripheral blood mononuclear cells were thawed in a 37° C. constant temperature water bath and then suspended in 9 mL OpTmizer medium (cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS). The cell number was measured and centrifuged at 400 xg, 25°C for 4 minutes. The cell pellet obtained by centrifugation was suspended in 5 mL cOpTmizer medium (Themo-Fisher Scientific, USA) to measure the number of cells, and then diluted with cOpTmizer medium to a concentration of 1.0 x 10 6 cells/mL.
  • cOpTmizer Themo-Fisher Scientific, USA
  • a total of 1.0 x 10 6 cells were dispensed at 1 mL per well in a 24-well plate.
  • 10 nM Finasteride, 3 ⁇ M zoledronic acid (ZA), and 100 ⁇ L IL-2 (10 3 IU/mL) were added and cultured in a 37°C CO 2 incubator for 4 days.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette, and the same amount of cOpTmizer culture medium based on the cell culture medium and 10 nM Finasteride and IL-2 (10 3 IU/mL) was additionally added and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette and the number of cells was measured. Based on the cell culture medium in culture, 10 nM Finasteride and IL-2 (10 3 IU/mL) were additionally added to the same amount of cOpTmizer culture medium and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL cortical pipette and the number of cells was measured. After diluting with cOpTmizer culture medium so that the cell concentration is 0.4 x 10 6 cells/mL based on the cells in culture, 10 nM Finasteride and IL-2 (10 3 IU/mL) were added to the additional cOpTmizer culture medium. ) was added and cultured for 3 days in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL pipette and the cell number was measured. After diluting with cOpTmizer culture medium so that the cell concentration is 0.4 x 10 6 cells/mL based on the cells in culture, 10 nM Finasteride and IL-2 (10 3 IU/mL) were added to the additional cOpTmizer culture medium. ) was added and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • the aggregated cells were resuspended using a 1000P micropipette or a 10 mL pipette and the number of cells was measured.
  • Peripheral blood mononuclear cells from healthy donors were isolated, and ⁇ T cell culture basic components were continuously treated with high-concentration Finasteride for 7, 10, and 14 days, respectively, and ⁇ T cell activation and proliferation rates were compared for 14 days.
  • the group continuously treated with Finasteride for up to 7 days increased the proliferation rate of ⁇ T cells by 1.5 times compared to the control group, and the proliferation rate increased by more than 1.1 times compared to the group continuously treated with Finasteride for up to 10 days or 14 days. This increased. There was no significant difference in viability compared to the control group, and continuous treatment with high concentrations of Finasteride did not affect cell viability.
  • the ⁇ T cell ratio was about 70% when cultured for 7 days, and it was confirmed that more than 90% of the cells were ⁇ T cells when cultured for 10 days.
  • Table 2 summarizes the ⁇ T cell proliferation rates by the components added in each Example.
  • ⁇ T cells with high cell killing ability and cell viability can be produced in a short period of time with high purity and high efficiency in a clinically friendly method. , there is an advantage of increasing the productivity of allogeneic ⁇ T cell immunotherapeutic agents.

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Abstract

본 발명은 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 기존에 알려진 일반적인 γδ T 세포 배양 방법이나 지지세포를 이용한 배양 방법에 비하여, 임상 친화적인 방법으로 높은 세포 살해능 및 세포 생존율을 갖는 γδ T 세포를 고순도 및 고효율로 단기간에 생산할 수 있어, 동종 γδ T 세포 면역치료제의 생산성을 증대시킬 수 있는 장점이 있다.

Description

감마-델타 T 세포의 증식 배양 방법
본 발명은 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 안드로젠 신호 전달 억제를 기반으로 하여 γδ T 세포를 증식 배양하는 것을 특징으로 하는 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
림프구의 일종인 T 세포는 B 세포와 함께 적응성 면역의 주축이다. T 세포는, 조혈 모세포(Hematopoietic cell)에서 만들어진 전구체가 흉선(Thymus)에서 성숙하는 과정을 거쳐 생성된다. T 세포는 흉선과 말초 림프조직(Peripheral lymphoid tissue)을 순환하는 αβ T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)를 발현하는 대다수의 αβ T 세포와 γδ T 세포 수용체를 발현하는 소수의 γδ T 세포로 구성된다(비특허문헌 1).　상피조직에 존재하는 γδ T 세포(tissue-resident γδ T cells)는 상당히 다른 양상을 보여, 어느 부위에서는 γδ T 세포가 대부분 또는 전부를 차지하기도 한다(비특허문헌 2). 이러한 상피조직에 존재하는 γδ T 세포는 림프조직에 존재하는 T 세포와는 다른 특징인 제한적이거나 일정한 T 세포 수용체 발현 양상을 보인다.
γδ T 세포는 흉선에서 만들어져 가장 먼저 다른 부위로 이동하는 T 세포로 대부분 피부, 장, 폐와 상피조직으로 출생 이전에 이동한다(비특허문헌 3). γδ T 세포는 T-세포 수용체의 다양성을 가지고 있지는 않지만 상피조직에 가해진 여러 가지의 생물학적 손상을 인지하여 반응하나, 이러한 반응을 유도하는 자가 항원에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 활성화된 γδ T 세포는 염증을 조절하고, 세포의 형질이 변화한 세포를 파괴하며, 상처의 치유를 향상시키는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 3). 또한 최근의 연구 결과에 의하면 γδ T 세포는 외부환경의 자극에 노출된 조직의 항상성(Homeostasis)을 유지, 복원하는 조절자 역할을 한다고 알려져 있다(비특허문헌 1).
γδ T 세포는 사람의 말초혈액 내에 0.5~5% 내외의 매우 적은 비율로 존재하며, 기능적으로는 적응성 면역(Adaptive immunity)과 선천성 면역(Innate immunity)의 두 가지 면역 반응에 모두 관여한다고 알려져 있다. 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 γδ T 세포는, 암세포나 박테리아가 생성하는 '인산항원(Phosphoantigen)'에 반응하는 것으로 알려졌다.
사람의 γδ T 세포는 두 가지 주요 아형(Subset)의 TCR 사슬이 Vδ1 사슬 또는 Vδ2 사슬이 존재하고(비특허문헌 4), 혈액 내에 존재하는 대부분의 γδ T 세포는 Vδ2 사슬을 가지고 있고, Vγ9 사슬과 한 쌍을 이루어 존재한다. TCR γδ T 세포는 흉선에서 TCR αβ T 세포보다 먼저 발생하며, 인산항원을 비롯한 몇 가지의 항원에 대한 제한된 TCR 다양성을 가지나 TCR αβ T 세포보다 더 빠르게 면역반응을 일으켜 innate-like 면역반응을 유도한다. γδ T 세포는 특히 αβ T 세포와 마찬가지로 세포용해(Cytolysis)를 통한 보다 더 강력한 항암효과를 가지지만, non-self MHC를 발현하는 세포에 대해서 이식편대숙주질환 (graft-versus-host disease; GVHD)를 일으키는 주원인인 αβ T 세포와는 달리 MHC 제한도 없고, 이식편대숙주질환도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 5).
따라서 γδ T 세포는 항암 면역 세포 치료에 유력한 후보 세포군이며, 인터류킨-2(Interleukin-2, IL-2)와 졸레드론산(Zoledronic acid, ZA, ZOL)을 처리하면 γδ T 세포가 특이적으로 증식함이 밝혀진 이래 다양한 암에서 치료 효과가 전임상 및 임상시험에 의하여 입증되고 있다. γδ T 세포를 이용한 반 일치이식 및 졸레드론산과 인터류킨-2로 γδ T 세포의 증폭을 포함한 암 면역치료법의 개발로 난치성 고위험군 환자의 치료 효능 극대화가 기대되고 있다.
체내에 존재하는 대부분의 γδ T 세포는 말초혈액 내에 0.5~5% 내외의 매우 적은 비율로 존재하고, 실제로 γδ T 세포를 치료 용도로 이용하기 위해서는 활성화된 γδ T 세포가 다량 필요하기 때문에, 혈액에서 분리한 γδ T 세포를 체외에서 대량으로 배양하는 방법이 활발하게 연구가 진행되고 있다. γδ T 세포의 배양에는 기존 세포 증식/활성에 사용하였던 졸레드론산과 IL-2뿐만 아니라 IL-15를 이용하는 방법(특허문헌 1~2), PHA(phytohaemagglutinin), TGF-β, 콘카나발린 A, 암포테리신 B 등을 이용하는 방법(특허문헌 3~6) 등이 개발된 바 있으나, 이는 예전부터 사용되어 오던 IL-2 사용에 대한 변형 및 발전 형태로 새로운 증식 물질을 찾은 것이고, 획기적이거나 개선된 방법을 제시하지는 못하고 있다. 또한, 지지세포(Feeder cell)로 사용하여 γδ T 세포를 증폭시킨 사례도 보고되고 있다. 지지세포를 사용할 경우 정상 세포가 아닌 특정 암세포주를 형질변환 또는 형질도입하여 γδ T 세포의 대량 증식에 이용하고 있다(비특허문헌 6).
이러한 방법은 임상 적용에 중요한 안전성을 보장하기에 적합하지 않은 방법이고, 특정 암세포에 대한 프라이밍(Priming) 특이성이 부여된 γδ T 세포를 생산한다는 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 TCR γδ T 세포를 대량으로 증식 배양하여 수득하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 사람의 말초혈액 단핵세포에서 분리한 미분화된 T 세포를 기존에 알려진 자극제인 졸레드론산 및 IL-2 이외에 유효성분으로 5α-환원 효소 억제제인 Finasteride를 포함하는 배지에서 배양하는 경우, γδ T 세포의 성장이 증가되고 세포 수득률이 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 1) 1. 미국 등록특허 11,135,245 B
(특허문헌 2) 2. 유럽 특허등록 3,154,567 B
(특허문헌 3) 3. 미국 등록특허 10,370,452 B
(특허문헌 4) 4. 미국 등록특허 10,557,117 B2
(특허문헌 5) 5. WO2020-172555
(특허문헌 6) 6. 미국 공개특허 2019-0175650 A
비특허문헌
(비특허문헌 1) Jameson J., Havran W.L.,　Immunol. Rev., 215:114-22., 2007
(비특허문헌 2) Allison J.P., Havran W.L.,　Annu. Rev. Immunol., 9:679-705, 1991
(비특허문헌 3) Komori H.K., Meehan T.F., Havran W.L., Curr. Opin. Immunol., 18(5):534-8, 2006
(비특허문헌 4) Kabelitz D., Marischen, L., Oberg, H.-H., Holtmeier, W.; Wesch, D. Int. Arch. Allergy Immunol., 137, 73-81, 2005
(비특허문헌 5) Sharma A., Zumwalde N.A., Gumperz, J., In Advanced Structural Safety Studies; Humana Press Inc.: New York, NY, USA, pp. 57-72, 2019
(비특허문헌 6) Tan W.K., Tay J.C.K., Zheng J., Zheng M., Wang S., J. Immunol Sci., 2(3): 6-12, 2018
발명의 요약
본 발명의 목적은 γδ T 세포의 성장이 증가되어, 세포 수득률을 향상시킬 수 있는 γδ T 세포의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 γδ T 세포의 성장 및 세포 수득률을 향상시킬 수 있는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 γδ T 세포의 제조 방법을 제공한다:
(a) 말초혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC)를 (i) 졸레드론산(zoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 배지에서 배양하여 γδ T 세포를 유도 및 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 γδ T 세포를 수득하는 단계.
본 발명은 또한, (i) 졸레드론산(zoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물을 제공한다.
도 1은 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여 γδ T 세포를 배양 시, 기본 배양 성분과 Finasteride를 농도 별로 지속 처리하였을 때 14일 배양 기간 동안 γδ T 세포의 증식률과 생존율을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여 γδ T 세포를 배양 시, 기본 배양 성분과 Finasteride를 농도 별로 지속 처리하였을 때 14일 배양 기간 동안 γδ T 세포의 증식률과 생존율을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride와 IL-15 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 고농도 (10 nM)의 Finasteride를 7일까지 지속 처리하고, IL-15를 14일 배양 기간 동안 지속 처리하여 남성 공여자의 γδ T 세포 증식 및 생존율(A)과 배양 14일 후 대조군 대비 증가된 γδ T 세포 수(B)를 비교 분석한 결과이다.
도 4는 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride와 IL-15 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 저농도 (0.01 nM)의 Finasteride를 7일까지 지속 처리하고, IL-15를 14일 배양 기간 동안 지속 처리하여 여성 공여자의 γδ T 세포 증식 및 생존율(A)과 배양 14일 후 대조군 대비 증가된 γδ T 세포 수(B)를 비교 분석한 결과이다.
도 5는 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(10 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일간의 γδ T 세포 증식률과 생존률을 비교한 결과를 나타낸 것이고, B는 배양한 γδ T 세포 및 αβ T 세포의 비율 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 남성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(10 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일 배양 후, γδ T 세포 수를 비교 분석한 결과를 나타낸 것이고, B는 14일 배양 후, 대조군 대비 γδ T 세포의 비율을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(0.01 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일 간의 γδ T 세포 증식률과 생존율을 비교한 결과를 나타낸 것이고, B는 배양한 γδ T 세포 및 αβ T 세포의 비율 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 여성 공여자 유래 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride(0.01 nM)와 사이토카인 혼합액 처리에 따른 γδ T 세포 증식 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 14일 배양 후, γδ T 세포 수를 비교 분석한 결과를 나타낸 것이고, B는 14일 배양 후, 대조군 대비 γδ T 세포의 비율을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 A는 건강한 공여자의 말초혈액 단핵세포를 이용하여, Finasteride를 배양 시작일로부터, 7일, 10일, 14일간 지속적으로 처리하고, 14일 γδ T 세포 수를 비교 분석한 결과이고, B는 상기의 배양 방법으로 처리하여 14일까지 배양한 γδ T 세포 및 αβ T 세포의 비율 분석한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 말초혈액 단핵세포로부터 γδ T 세포를 단기간에 폭발적으로 증식시키기 위한 방법을 개발하고자 하였으며, 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제 등의 안드로젠 억제제가 함유된 혈청 배지에서 말초혈액 단핵세포를 배양하는 경우, γδ T 세포의 증식율 및 생존율을 높일 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음 단계를 포함하는 γδ T 세포의 제조 방법에 관한 것이다;
(a) 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 (i) 졸레드론산(zoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 배지에서 배양하여 γδ T 세포를 유도 및 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 γδ T 세포를 수득하는 단계.
본 발명에서 사용되는 졸레드론산은 비스포스포네이트(Bisphosphonates) 계열의 약물로서 파제트씨 병(Paget's disease)이나 전이성 유방암 (Metastatic Breast Cancer), 부갑상선 종양(Parathyroid Gland Tumors), 다발성골수종(Multiple Myeloma) 등의 암으로 인한 고칼슘 혈증(Hypercalcemia)의 치료에 사용된다. 졸레드론산은 혈중 칼슘 농도를 조절하는 내인성 피로인산(pyrophosphate)과 유사한 구조이면서 기존의 비스포스포네이트(Clodronate, Etidronate, Tiludronate 등)와는 달리 질소를 함유한 이미다졸환(Imidazole ring)을 가지고 있기 때문에 골 재흡수(Bone resorption)를 억제하는 효력이 매우 강한 특징이 있다. 졸레드론산은 골 기질 성분인 수산화인 석회(Hydroxyapaptite)의 칼슘(Calcium)과 킬레이트(Chelate) 함으로써 칼슘이 혈중으로 재흡수되는 것을 억제한다. 또한 파르네실 이인산 합성 효소(Farnesyl diphosphate synthase)를 억제함으로써 파골세포(Osteoclast)에 있는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질(Guanine nucleotide-binding proteins, G-Protein)의 prenylation을 방해하여 골 재흡수를 촉진시키는 파골세포의 세포사멸(Apoptosis)를 유도하여 파골세포를 감소시킴으로써 혈중 칼슘 농도를 조절하게 된다. 졸레드론산은 혈중에서 뼈 속으로 신속하게 흡수되어 뼈에 저장되며, 골 내 반감기가 길어서 1회의 정맥 주입으로 골 재흡수 작용을 지속시킬 수 있다. 그러나 혈중의 비스포스포네이트는 반감기가 0.5-2시간으로 매우 짧으며, 대사되지 않은 채로 신장을 통해 배설되므로 신장 손상 환자에 대해서는 용량 조절이 필요하다.
본 발명에서 '5-알파 환원효소 (5α-Reductase)'는 남성 호르몬인 테스토스테론(Testosterone)을 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)으로 환원시키는 생체 촉매이고, 1형(Type 1)에서 3형(Type 3)까지 존재한다. 1형에 이상이 생기면 뼈 무게와 근육의 양이 줄어들고, 2형에 이상이 생기면 전형적인 인터섹스(Intersex) 증상을 일으킨다. 3형에 이상이 생기면 세포 성장과 시각(눈)에 이상이 생기며 테스토스테론(Testosterone), 안드로스틴디온(Androstenedione), 프로게스테론(Progesterone) 생성이 줄어든다.
5α-환원 효소 억제제는 기질을 활성화 형태로 전환을 억제하여 활성화된 기질의 양을 감소시키고 이로 인해 기질의 수치가 약간 상승한다고 알려져 있다. 5α-환원 효소의 억제 기전은 NADPH가 효소에 결합한 후 기질이 뒤따르는 것을 포함한다. 특정 기질에는 테스토스테론, 프로게스테론, 안드로스텐디온, 에피테스토스테론, 코티솔, 알도스테론, 디옥시코르티코스테론 등이 있다.
Substrate + NADPH + H+ →5α-Substrate + NADP+
5α-환원 효소 이성질체(5α-reductase isoform) Type I 및 II는 테스토스테론(Testosterone)을 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)으로, 프로게스테론을 5α-디히드로프로게스테론 (5α-DHP)으로, 디옥시코르티코스테론을 디히드로디옥시코르티코스테론(DHDOC)으로 환원시킨다.
본 발명에서 사용되는 'Finasteride'는 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론의 활성화 형태로 전환되는 것을 억제하는 5-알파 환원효소 억제제이다. 테스토스테론의 활성화 형태인 디하이드로테스토스테론은 탈모 및 전립선비대증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 조직 중의 디하이드로테스토스테론의 생성을 억제하는 5-알파 환원효소 억제제는 전립선비대증 치료제로 사용되고 있으며 탈모의 예방 및 치료에도 사용되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드(Dutasteride), 에프리스테라이드(Epristeride), 알파트라디올(Alfatradiol), 소팔메토 추출물(Saw Palmetto extract) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비칼루타미드(Bicalutamide), 풀루타미드(Flutamide), 니루타미드(Nilutamide) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 '5α-환원효소 억제제'는 바람직하게는 피나스테라이드(Finasteride)를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서 배양 배지에 포함될 수 있는 공동 자극 분자는 활성화된 항원전달세포(APC)에서 나타나는 주변부 세포막 단백질로, T 세포의 표면 막 단백질과 상호작용으로 APC와 T 세포 사이의 MHC-TCR 신호전달을 증가시키거나 감소시키는 공동 자극 신호를 만들 수 있는 세포의 표면 막 단백질의 총칭으로, 공동 자극 분자로 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 일 예로는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합. 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합,αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1 BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 CD80, 4-1BB, CD86 또는 CD276를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 사용한 CD80에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 공동 자극 분자도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능함은 자명하다.
본 발명의 γδ T 세포 배양을 위해 사용되는 공동 자극 분자의 배지 내 농도는 1~2,000 nM, 구체적으로는 5~1,000 nM 더욱 구체적으로는 10~500 nM이며, 사이토카인의 배지 내 농도는 1~2,000 IU, 구체적으로는 10~1,000 IU, 더욱 구체적으로는 약 20~400 IU이다.
본 발명에서 배양 배지에 포함될 수 있는 사이토카인은 인터류킨 류에서 선택된 하나 이상일 수 있는데, 인터류킨은 면역 담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용 가능한 인터류킨으로는 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-15(IL-15) 및 인터류킨-18(IL-18)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 인터류킨은 IL-2, IL-15, IL-18로 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능함은 자명하다.
본 발명은, TCR γδ T 세포의 대량 증식 배양에 있어서, 안드로젠 신호전달 억제제인 Finasteride를 사용하면서 동시에, 졸레드로산과 IL-2를 처리하며, 상기 방법에서 추가적으로 IL-15, IL-18 사이토카인 그리고 CD80 보조 자극 분자를 더불어 함께 사용하면, 더 높은 효율로 TCR γδ T 세포 대량 증식이 가능하다. 이때, 총 배양기간 동안 0.4 x 106 ~ 3.0 x 106 cells/mL 세포 농도가 유지되어야 한다. 상기 조건을 유지하면서 γδ T 세포를 정치 배양하는 것으로 γδ T 세포를 대량 증식 배양할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, γδ T 세포 배양방법은 다음과 같다:
(a) γδ T 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵세포 배양액을 자극한 후 정치 배양하는 단계;
(b) 상기 정치 배양된 세포 배양액을 일정 기간 경과한 후, 일정 세포 비율로 희석하여 정치 배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양액 내 γδ T 세포 수가 일정 시점에 도달하였을 때 상기 정치 배양된 세포가 포함된 배양액을 재유도시킨 후, 추가 성분이 첨가된 배양 배지를 첨가하여 정치 배양하는 단계.
상기의 (c) 단계 이후, 추가적으로 대량 수득된 γδ T 세포를 수집하는 단계가 포함될 수 있다.
본 발명에서 정치배양을 위해 사용될 수 있는 반응용기는 24-웰 플레이트(Well-plate), 12-웰 플레이트(Well-plate), 및 6-웰 플레이트(Well-plate), 셰이킹 플라스크(Shaking flask), T25-플라스크(T-flask), T75-플라스크(T-flask), T175-플라스크(T-flask) 및 T225-플라스크(T-flask), 일회용 세포 배양 백(Disposable cell culture bag) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 채택 가능할 수 있는 어떠한 반응용기라도 사용될 수 있다.
본 발명에서의 '적절한 배양 조건'은 37℃ 5% CO2 배양기(Incubator)에서 세포를 정치 배양하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 '일정 배양 기간'은 γδ T 세포가 증식이 되어 일정 비율 또는 일정 세포 수가 되는 2~5일 내외의 기간을 의미한다.
본 발명에서의 '일정 비율' 또는 '일정 세포 수'는 일정 배양 기간 동안 γδ T 세포가 증식이 되어 일정 배양 기간 내에 0.4 x 106 ~ 3.0 x 106 cells/mL 농도의 세포 수를 의미한다.
본 발명에서의 '재유도'은 일정 배양 기간이 경과한 후, 세포를 포함한 배양액을 마이크로파이펫 또는 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고, 세포 배양 배지와 사이토카인 혼합액(Cytokine mix)를 추가로 첨가하여 γδ T 세포 증식을 재유도하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 '사이토카인 혼합액'은 배양 기간 동안 재유도 후, 추가로 첨가하여 재유도 및 세포 증식을 유도하는 IL-15, IL-18 사이토카인과 CD80 공동 자극인자, 추가 유효 성분을 혼합한 첨가물을 의미한다.
본 발명에서 유효 성분으로 5α-환원 효소 억제제인 Finasteride를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니고, Dutasteride, Epristeride, Alfatradiol와 Saw Palmetto extract 등과 안드로겐 수용체 길항제(Androgen Receptor Antagonist, ARA)인 Bicalutamide, Flutamide, Nilutamide 등도 유효 성분으로 포함한다.
본 발명에서 사용한 기본 배양 배지로 Gibco CTS OpTmizer T cell Expansion Serum Free Media (Thermo-Fisher Scientific, Cat# A1048501) 이에 한정되는 것이 아니고, T 세포를 포함한 면역세포 배양에 사용되고 있는 Gibco CTS AIM-V medium, (Thermo-Fisher Scientific) LymphoONE T cell Expansion XFM(Takara), X-VIVO 10, -15, & -20 Hematopoietic Cell Medium(Lonza), PRIME-SV T cell Expansion XSFM(Fujifilm-Irvine Scientific), RPMI-1640 배지와 같은 통상의 T 세포 배양 배지가 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 피나스테라이드(Finasteride)는 γδ T 세포 유도 및 배양 배지에 0.001~100 nM의 농도로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.001~50 nM로 함유될 수 있으며, 첨가되는 피나스테라이드(Finasteride)의 농도는 γδ T 세포 유도 및 배양에 사용되는 말초혈액 단핵세포의 유래가 남성인지 여성인지에 따라 최적 농도가 달라질 수 있다.
본 발명에서 γδ T 세포 유도 및 배양에 사용되는 말초혈액 단핵세포가 남성 유래인 경우, γδ T 세포 유도 및 배양 배지는 1~50 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1~20 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 γδ T 세포 유도 및 배양에 사용되는 말초혈액 단핵세포가 여성 유래인 경우, γδ T 세포 유도 및 배양 배지는 0.001~10 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.001~1 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, γδ T의 배양은 총 3~21일간 수행하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 7~14일간 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 γδ T의 유도 및 배양 방법에 따르면, 배양 14일째에 총 배양 세포 중 γδ T 세포의 비율이 90% 이상인 세포를 수득할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (i) 졸레드론산(zoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드(Dutasteride), 에프리스테라이드(Epristeride), 알파트라디올(Alfatradiol), 소팔메토 추출물(Saw Palmetto extract) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비칼루타미드(Bicalutamide), 풀루타미드(Flutamide), 니루타미드(Nilutamide) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 '5α-환원효소 억제제'는 바람직하게는 피나스테라이드(Finasteride)를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서 배양 배지에 포함될 수 있는 공동 자극 분자는 활성화된 항원전달세포(APC)에서 나타나는 주변부 세포막 단백질로, T 세포의 표면 막 단백질과 상호작용으로 APC와 T 세포 사이의 MHC-TCR 신호전달을 증가시키거나 감소시키는 공동 자극 신호를 만들 수 있는 세포의 표면 막 단백질의 총칭으로, 공동 자극 분자로 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 일 예로는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합. 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합,αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 CD80, 4-1BB, CD86 또는 CD276를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 사용한 CD80에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 공동 자극 분자도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능함은 자명하다.
본 발명의 γδ T 세포 배양을 위해 사용되는 공동 자극 분자의 배지 내 농도는 1~2,000 nM, 구체적으로는 5~1,000 nM 더욱 구체적으로는 10~500 nM이며, 사이토카인의 배지 내 농도는 1~2,000 IU, 구체적으로는 10~1,000 IU, 더욱 구체적으로는 약 20~400 IU이다.
본 발명에서 배양 배지에 포함될 수 있는 사이토카인은 인터류킨 류에서 선택된 하나 이상일 수 있는데, 인터류킨은 면역 담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용 가능한 인터류킨으로는 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-15(IL-15) 및 인터류킨-18(IL-18)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 인터류킨은 IL-2, IL-15, IL-18로 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능함은 자명하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 해당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. Finasteride 농도에 따른 건강한 말초혈액 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율 확인
1-1. 말초혈액 단핵세포 (Human Peripheral Blood Mononuclear Cell, hPBMC) 분리
전문의료인이 채혈하여 헤파린 튜브에 담은 건강 공여자의 혈액 100 cc를 4개의 50 mL 코니칼 튜브에 1X DPBS 25 mL, 혈액 25 mL을 넣어 주었다. 새로운 50 mL 코니칼 튜브에 15 mL Lymphoprep(Axis Shield, 영국)을 벽면에 최대한 묻지 않도록 조심스럽게 수직 분주하고, 희석한 혈액을 Lymphoprep 용액이 담긴 50 mL 코니칼 튜브에 벽면을 따라 천천히 위에 얹어 주었다. 상기 코니칼 튜브를 원심분리기에 넣고 800 x g(1,890 rpm), 20분, 실온으로 원심분리하였다. 4개의 층으로 분리된 혈액층에서, Lymphoprep과 혈장 층 사이에 있는 하얀색의 buffy coat 층을 회수하여 새 50 mL 코니칼 튜브(3~4개)에 옮겨 담고, 1,500 rpm(500 x g), 10분, 실온 조건으로 원심분리하였다. 50 mL 코니칼 튜브 3~4개에 나뉜 세포들을 1X DPBS 45 mL에 풀어준 후 50 mL 코니칼 튜브 한 개에 모았다. 한 튜브로 모은 세포를 1,250 rpm(350 x g), 10분, 실온 조건으로 총 2번의 원심분리하였다. 세포 농도가 1.0 x 106 cells/mL이 되도록 1.0 x 107개의 세포 stock에 최종 부피가 10 mL이 되도록 배양 배지를 첨가하여 2~3회 파이펫팅 후, 세포 중 1.0 mL을 Day0 샘플로 분주하여 배양을 진행하고 남은 세포는 1.0 x 107개의 세포로 동결 바이알에 분주하여 질소탱크(LN2 Tank)에 동결 보관 후 필요할 경우 해동하여 사용하였다.
1-2. Finasteride 농도에 따른 말초혈액 단핵세포의 γδ T 세포 증식률 및 생존율
1-1에서 분리된 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 γδ T 세포 배양 기본 성분인 3 μM 졸레드론산(Zoledronic acid)과 103 IU/mL IL-2를 포함하고, 유효성분으로 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride를 지속 처리한 후, 총 14일간 배양하여 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.
동결된 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 열불활성화 우태아혈청(Heat inactivation Fetal Bovine Serum(FBS), Gibco, 미국)이 10% 포함된 9 mL OpTmizer 배지(Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 complete OpTmizer 배지(10% 우태아혈청 + OpTmizer 배지, cOpTmizer) 5 mL에 현탁하여 세포 수를 측정한 후, cOpTmizer 배지로 1.0 x 106 cells/mL 농도로 희석하였다.
24-well plate에 총 1.0 x 106개의 세포(최종 1 mL)를 1개의 well에 시딩(seeding)하였다. γδ T 세포를 자극 및 분화를 유도하기 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride와 3 μM 졸레드론산, IL-2(103 IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 3일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고, 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride 및 IL-2(103 IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 2일간 배양하였다.
재유도 2일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride와 IL-2(103 IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 6일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 각각 0.01 nM 및 10 nM의 Finasteride와 IL-2(103 IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용 또는 10 mL 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 106개의 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 후, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용 또는 10 mL 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 106개의 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석하였다. 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 2일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 12일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용 또는 10 mL 서로로지컬 파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 실시예 1에서 αβ T 세포 및 γδ T 세포를 포함한 세포의 구성 및 비율은 표 1의 항체를 사용하여 배양 시작일, 5일차, 7일차, 10일차와 14일차에 BD Bioscience 사의 Fortessa-X20 유세포분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, Finasteride를 0 nM, 0.01 nM, 10 nM의 농도로 남성 공여자와 여성 공여자에서 분리한 말초혈액 단핵세포에 처리하여 14일간 배양한 결과, 남성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해 고농도의 Finasteride에서 γδ T 세포의 증식률이 증가하였고(도 1), 여성 공여자의 경우 남성 공여자와는 반대로 저농도의 Finasteride에서 γδ T 세포의 증식률이 증가하였다(도 2).
Figure PCTKR2023000082-appb-img-000001
실시예 2. Finasteride와 IL-15 처리에 따른 말초혈액 단핵세포 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율
건강한 공여자에서 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본 성분(3 μM Zoledronic acid(ZA)와 103 IU/mL IL-2)에 유효성분인 Finasteride를 남성 공여자에게 10 nM 또는, 여성 공여자에게 0.01 nM 농도로 7일까지 지속적으로 처리, 0.8 nM IL-15는 지속적으로 처리하며, 총 14일간 배양하여 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.
동결되어 있는 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 OpTmizer 배지(cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA) 9 mL에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 5 mL cOpTmizer 배지에 현탁하여 세포 수를 측정한 뒤, 1.0 x 106 cells/mL 농도로 희석하였다.
24-well plate에 총 1.0 x 106개의 세포(최종 1 mL)를 1개의 well에 시딩(seeding) 하였다. γδ T 세포를 자극 및 분화를 유도하기 위해 남성, 여성 각각 10 nM 및 0.01 nM의 Finasteride와 3 μM 졸레드론산(ZA), IL-2(103 IU/mL), 0.8 nM의 IL-15를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 3일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(103 IU/mL) 및 남성, 여성 각각 10 nM 및 0.01 nM Finasteride와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 2일간 배양하였다.
재부유 2일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(103 IU/mL) 및 남성, 여성 각각 10 nM, 0.01 nM Finasteride와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 6일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의cOpTmizer 배양 배지에 남성, 여성 각각 10 nM, 0.01 nM Finasteride, IL-2(103 IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 106 cells/mL이 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 다음, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해준 다음, 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 106 cells/mL이 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석하였다. 추가로 넣어준 cOpTmizer 배양 배지는 IL-2(103 IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 12일 후, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로하여 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
다음 날, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL)와 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 준 다음, 세포 수를 측정하였다. 실시예2에서 αβ T 세포 및 γδ T 세포를 포함한 세포의 구성 및 비율은 표 1의 항체를 사용하여 배양 시작일, 5일차, 7일차, 10일차 및 14일차에 BD Bioscience 사의 Fortessa-X20 유세포분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 남성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해 γδ T 세포의 증식률이 1.26배(126%) 증가하였고(도 3), 여성 공여자의 경우 남성 공여자와는 다르게 γδ T 세포의 증식률(도 4)에는 큰 차이가 나지 않았다.
실시예 3. Finasteride와 IL-15, IL-18, CD80 처리에 따른 건강한 말초혈액 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율
건강한 공여자에서 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본성분(3 μM Zoledronic acid와 103 IU/mL IL-2)에 유효 성분인 남성, 여성 각각 10 nM, 0.01 nM Finasteride 로 배양 시작일에 단회 처리, 추가 성분인 6 nM IL-18을 배양 시작일에 단회 처리, 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15는 지속적으로 처리하며 총 14일간 배양하여 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.
동결되어 있는 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 9 mL OpTmizer 배지(cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심 분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 5 mL cOpTmizer 배지(Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하여 세포 수를 측정한 뒤 cOpTmizer 배지를 이용하여 1.0 x 106/mL 세포 농도로 희석하였다.
24-well plate에 총 1.0 x 106개의 세포를 한 well당 1 mL씩 분주하였다. γδ T 세포 자극 및 분화를 유도하기 위해 유효 성분인 Finasteride를 남성 공여자는 10 nM, 여성 공여자는 0.01 nM 농도로 처리하고, 3 μM 졸레드론산(ZA), IL-2(103 IU/mL), 100 nM의 CD80, 0.8 nM의 IL-15와 6 nM의 IL-18를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 3일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(103 IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 4일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 시작일로부터 5일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(103 IU/mL), 100 nM의 CD80과 0.8 nM의 IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 6일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 절반의cOpTmizer 배양 배지와 IL-2(103 IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 106 cells/mL이 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 후, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 후, 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 2일간 배양하였다.
배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 추가 첨가된 cOpTmizer 배양 배지에 IL-2(103 IU/mL), 100 nM CD80과 0.8 nM IL-15를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 실시예3에서 αβ T 세포 및 γδ T 세포를 포함한 세포의 구성 및 비율은 표 1의 항체를 사용하여 배양 시작일, 3 일차, 4일차, 5일차, 6일차, 7일차, 10일차와 14일차에 BD Bioscience 사의 Fortessa-X20 유세포분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 남성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해, Finasteride(10nM), IL-15, IL-18 및 CD80를 추가로 첨가한 실험군의 γδ T 세포의 증식률이 약 1.45배 증가하였다. 배양 14일째 세포의 비율은 95% 이상이 γδ T 세포이고 2~3% 정도의 αβ T 세포의 비율을 확인하였다.
또한, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 여성 공여자의 경우 IL-2와 ZA만 처리한 대조군(Control)에 비해 Finasteride(0.01nM), IL-15, IL-18 및 CD80를 추가로 첨가한 실험군의 γδ T 세포의 증식률이 약 3.8배(380%) 증가하였다.
실시예 4. Finasteride 처리 기간에 따른 건강한 말초혈액 내의 γδ T 세포 증식률 및 생존율
건강한 공여자에서 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본 성분(3 μM Zoledronic acid와 103 IU/mL IL-2)에 유효 성분인 10 nM Finasteride를 기간 별로 배양 시작일, 7, 10, 14일까지 지속 처리하였다. 이를 총 14일간 배양하였을 때, γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.
동결되어 있는 말초혈액 단핵세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 9 mL OpTmizer 배지(cOpTmizer, Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하였다. 세포 수를 측정하고, 400 x g, 25℃에서 4분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 5 mL cOpTmizer 배지(Themo-Fisher Scientific, USA)에 현탁하여 세포 수 측정한 뒤 cOpTmizer 배지로 1.0 x 106 cells/mL 농도로 희석하였다.
24-well plate에 총 1.0 x 106개의 세포를 한 well당 1 mL씩 분주하였다. γδ T 세포 자극 및 분화를 유도하기 위해 10 nM Finasteride와 3 μM 졸레드론산(ZA), 100 μL IL-2(103 IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 4일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 4일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와 재유도를 위해 10 nM Finasteride와 IL-2(103 IU/mL)을 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 5일 후, 1000P 마이크로파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(103 IU/mL)을 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
다음 날, 배양 중인 세포 배양액 기준으로 절반의 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(103 IU/mL)를 추가로 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 7일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 106 cells/mL 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 다음, 추가로 넣어 준 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(103 IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
배양 시작일로부터 10일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다. 배양 중인 세포를 기준으로 세포의 농도가 0.4 x 106 cells/mL 세포 농도가 되도록 cOpTmizer 배양 배지로 희석한 다음, 추가로 넣어 준 cOpTmizer 배양 배지에 10 nM Finasteride와 IL-2(103 IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 12일째, 배양 중인 세포 배양액을 기준으로 동일 양의 cOpTmizer 배양 배지와10 nM Finasteride, IL-2(103 IU/mL)를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
배양 시작일로부터 14일 후, 1000P 마이크로파이펫 또는 10 mL 서로로지컬파이펫을 이용하여 응집된 세포를 재부유해 주고 세포 수를 측정하였다.
건강한 공여자의 말초혈액 단핵세포를 분리하여 γδ T 세포 배양 기본 성분에 고농도의 Finasteride를 7일, 10일, 14일까지 각각 지속적으로 처리하였으며, 14일간 γδ T 세포의 활성화 및 증식률을 비교하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, Finasteride를 7일까지 지속 처리한 그룹이 대조군에 비해 1.5배 정도 γδ T 세포 증식률이 증가하였고, 10일 또는 14일까지 지속 처리한 그룹에 비해 1.1배 이상 증식률이 증가하였다. 생존율(Viability)은 대조군 대비 큰 차이는 없었고, 고농도의 Finasteride를 지속적으로 처리하여도 세포의 생존율에는 영향을 미치지 않았다. γδ T 세포 비율은 7일간 배양하였을 때 70% 정도의 비율을 나타내었으며, 10일간 배양하였을 때 90 % 이상의 세포가 γδ T 세포인 것으로 확인되었다.
IL-2 및 ZA 함유 배지를 대조군으로 하여, 각 실시예에서 추가한 성분에 의한 γδ T 세포 증식율을 표 2에 정리하였다.
표 2에 나타난 바와 같이, finasteride 첨가 시에 γδ T 세포의 증식율이 대조군에 비하여 증가하였으며, IL-15와 사이토카인 믹스(IL-15, IL-18 및 CD80) 첨가 시에 γδ T 세포의 증식율은 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2023000082-appb-img-000002
본 발명에 따르면, 기존에 알려진 일반적인 γδ T 세포 배양 방법이나 지지세포를 이용한 배양 방법에 비하여, 임상 친화적인 방법으로 높은 세포 살해능 및 세포 생존율을 갖는 γδT 세포를 고순도 및 고효율로 단기간에 생산할 수 있어, 동종 γδ T 세포 면역치료제의 생산성을 증대시킬 수 있는 장점이 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (22)

  1. 다음 단계를 포함하는 γδ T 세포의 제조 방법;
    (a) 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 (i) 졸레드론산(zoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 배지에서 배양하여 γδ T 세포를 유도 및 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 γδ T 세포를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드(Dutasteride), 에프리스테라이드(Epristeride), 알파트라디올(Alfatradiol) 및 소팔메토 추출물(Saw Palmetto extract)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비칼루타미드(Bicalutamide), 풀루타미드(Flutamide) 및 니루타미드(Nilutamide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합, 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합,αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1 BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 CD80, 4-1BB, CD86 및 CD276으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배지는 IL-4, IL-7. IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 IL-23으로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배지는 IL-12, IL-15 및 IL-18로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포가 남성 유래인 경우, 상기 배지는 1~50 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포가 여성 유래인 경우, 상기 배지는 0.001~10 nM의 피나스테라이드(Finasteride)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 배양은 3~21일간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 배양 14일째에 총 세포 중 γδ T 세포의 비율이 90% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. (i) 졸레드론산(zoledronic acid), (ii) IL-2, 및 (iii) 5α-환원효소 억제제 또는 안드로겐 수용체 길항제를 함유하는 γδ T 세포 유도 및 배양용 배지 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드(Dutasteride), 에프리스테라이드(Epristeride), 알파트라디올(Alfatradiol) 및 소팔메토 추출물(Saw Palmetto extract)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 안드로겐 수용체 길항제는 비칼루타미드(Bicalutamide), 풀루타미드(Flutamide) 및 니루타미드(Nilutamide)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 5α-환원효소 억제제는 피나스테라이드(Finasteride) 인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 배지는 공동 자극 분자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 5A6.E9, Bl, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2, 또는 이들의 조합, 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인(mezerein), 스타필로코커스 장독소 A(SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 이들의 조합, αTCR, βTCR, γTCR, δTCR, CD277, CD28, CD46, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FceRIg, CD1, CD16, CD161, DNAX, 보조 분자-1(DNAM-1), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 공동 자극 분자는 CD80, 4-1BB, CD86 및 CD276으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  21. 제14항에 있어서, 상기 배지는 IL-4, IL-7. IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 IL-23으로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 배지는 IL-12, IL-15 및 IL-18로 구성되는 군에서 선택되는 사이토카인을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
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