KR20200090233A - 암 및 관련된 악성 종양의 치료를 위해 γδ T 세포를 활성화시키고 변형시키고 확장시키는 방법 - Google Patents

암 및 관련된 악성 종양의 치료를 위해 γδ T 세포를 활성화시키고 변형시키고 확장시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 형질도입 유전자 발현에 사용될 수 있는 γδ T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 α- 및/또는 β-TCR 양성 세포를 고갈시키는 동안 γδ T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다. 확장된 γδ T 세포 및 고갈되거나 감소된 α- 및/또는 β-TCR 양성 세포로 구성된 T 세포군 또한 본 발명의 개시에서 제공된다. 본 발명은 개시된 T 세포군을 사용하는 방법 또한 제공한다.

Description

암 및 관련된 악성 종양의 치료를 위해 γδ T 세포를 활성화시키고 변형시키고 확장시키는 방법
관련 출원의 상호 참조
본원은 특허 협력 조약 하의 국제 출원으로서, 2017년 11월 27일자 출원된 미국 가출원 제62/591,041호, 및 2017년 11월 27일자 출원된 독일 출원 제10 2017 127 984.9호를 우선권 주장하며, 그 내용은 그 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된다.
기술분야
본 개시는 T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 개시는 형질도입 유전자 발현에 사용될 수 있는 γδ T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 개시는 α- 및/또는 β-TCR 양성 세포를 고갈시키는 동안 γδ T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다. 확장된 γδ T 세포 및 고갈되거나 감소된 α- 및/또는 β-TCR 양성 세포로 구성된 T 세포군 또한 본 발명의 개시에서 제공된다. 본 개시는 개시된 T 세포군을 사용하는 방법 또한 제공한다.
γδ T 세포는 αβ-TCR 대신 γδ TCR을 발현하는 T 세포의 하위 집합을 나타낸다. γδ T 세포는 두 개의 일차 하위조합인 조직결합된 Vα2-음성 세포 및 말초 순환 Vδ2양성 세포보다 더 구체적으로 Vγ9δ2로 나눌 수 있다. 두 하위조합 모두 항바이러스 및 항종양 활성도를 가진 것으로 나타났다. 전통적인 αβ-TCR 발현 세포와는 달리, γδ TCR 발현 세포는 고전적 MHC I 및 II와 무관하게 자체의 표적을 인식한다. 자연 살해(NK) T 세포와 유사하게, γδ T 세포는 NKG2D를 발현하며, 이것은 비고전적 MHC 분자 즉, 스트레스를 받은 세포 및/또는 종양 세포 상에 존재하는 MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 A(MICA) 및 MHC 클래스 I 폴리펩티드 관련 서열 B(MICB)에 결합한다. γδ TCR은 다양한 리간드, 예를 들어 스트레스 및/또는 종양 관련 인항원을 인식한다. γδ T 세포는 복수의 기전, 즉, TRAIL, FasL, 페르포린 및 그랜자임 분비를 통해 자체 표적의 직접적 세포용해를 매개한다. 그 밖에 γδ T 세포 발현 CD16은 항체 의존 세포가 매개하는 세포독성(ADCC)을 강화한다.
말초 혈액에 일반적으로 단지 1 내지 5%의 양으로 존재할 수 있는 γδ T 세포의 문제는 의학적 치료에 충분한 γδ T 세포의 순도 및 수를 확보할 수 없다는 것이며, 소량의 혈액을 수집한 다음 그로부터 이 세포가 활성화 및/또는 증식되는 경우 특히 그러하다. 의학적 치료에 충분한 γδ Τ 세포의 순도와 수를 확보하기 위해 환자로부터 수집하는 혈액의 양을 증가시키는 것 또한 환자에 대한 커다란 부담을 부가하는 점에서 문제를 제기한다.
오늘 날까지, 자가 Vγ9δ2 T 세포를 사용하는 임상시험은 Vγ9δ2 T 세포 확장 프로토콜을 사용할 수 있으며, 이것은 PBMC 및 비스포스포네이트, 즉 졸레드로네이트 및 파미드로네이트, 그리고 100 U/ml IL-2의 14일 치료이다. 이 과정은 기껏해야 14일 이내에 총 Vγ9δ2 T 세포에 대한 수율의 100배 증가를 제공할 수 있다. 그 이후에는 확장 속도가 감소하며 이는 세포사의 증가에 상응한다. 따라서, 전통적 Vγ9δ2 확장 프로토콜은 상업성이 있는 동종이형 제제로서 적합한 충분한 수의 세포를 생산할 수 없다.
미국 특허번호 7,749,760은 비스포스포네이트, 인터루킨 2(IL-2), 및 인터루킨 18(IL-18)을 포함하는 Vγ9Vδ2 T 세포 증식 제제를 기술한다.
미국 특허번호 8,962,313은 분리된 말초 혈액에 질병 항체 추가, 그리고 인터루킨을 함유하는 배양 배지에서 그에 따른 조합의 배양에 의한 질병 항체 특이적 세포독성 T림프구(CTL) 및 γδ T 세포의 동시 증식 방법을 기술한다.
WO 2014/072446에서는 감염, 암, 자가면역 그리고 기타 질병의 치료용으로 γδ T 세포 활성제와 IL-33의 조합을 사용하여 IL-2가 없는 γδ T 세포의 증식을 유도하는 방법을 기술한다.
WO 2016/166544에서는 γδ T 세포가 인항원 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)의 존재 하에서 확장될 수 있으며, γδ T 세포의 증식을 유도하고 말초 혈액의 단핵 세포의 세포 표현형 유지를 위한 배양 단계에서 시토카인이 제공될 수 있다.
미국 특허번호 2011/0158954는 γδ T 세포군의 생성 방법을 기술하며, 그 방법은 (a) 피브로넥틴, 피브로넥틴 단편 또는 그 혼합물 그리고 (b) γδ T 세포의 활성 인자의 존재 하에서 γδ T 세포를 포함하는 세포군을 배양하는 단계를 포함한다.
미국 특허번호 2016/0175358은 수집된 γδ T 세포 상에 발현된 세포 표면 표지자의 양성 및/또는 음성 선택을 사용하여 다양한 출처(예: 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 종양 생검물, 조직, 림프) 또는 시험대상자의 상피 샘플로부터 γδ T 세포를 직접 분리할 수 있음을 기술한다. γδ T 세포는 CD4, CD8, TCRα, TCRβ, TCRδ 및 기타 적절한 세포 표면 표지자의 양성이나 음성 발현에 근거하는 복합 샘플로부터 분리될 수 있다.
상업성이 있는 치료 제품으로서 충분한 수의 γδ T 세포를 생성할 수 있는 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다. 이 기술적 문제에 대한 해결안이 본 특허 청구 범위에서 특징화된 구현예로 제공된다.
한 양태에서, 본 개시는 인간 시험대상자의 혈액 샘플로부터 γδ T 세포의 분리, 아미노비스포스포네이트 및 시토카인 화합물이나 조성물의 존재 하에서 분리된 γδ T 세포의 활성화 그리고 아미노비스포스포네이트의 부재 그리고 시토카인 화합물이나 조성물의 존재 하에서 활성화된 γδ T 세포의 확장을 포함하는 γδ T 세포의 활성화 및/또는 확장의 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 출원은 인간 시험대상자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 γδ T 세포의 분리(이 때 이 분리는 PBMC를 항-α 및 항-β T 세포 수용체(TCR) 항체(예: 비오틴접합 또는 자기 비드 접합 항-αβ-TCR 항체)와 접촉시키는 것을 포함), PBMC로부터 α- 및/또는 β-TCR 양성세포의 고갈(예를 들어, 스트렙타비딘-마이크로비드나 자석을 사용하여), 아미노비스포스포네이트 및/또는 인항원을 포함하는 적어도 하나의 화합물 및 인간 재조합 인터루킨 2(IL-2) 및/또는 인간 재조합 인터루킨 15(IL-15)(예: IL-2만, IL-15만 또는 IL-2 및 IL-15의 조합)을 포함하는 적어도 하나의 시토카인의 존재 하에서 분리된 γδ T 세포 활성화, 그리고 적어도 하나의 화합물의 부재 그리고 적어도 하나의 시토카인의 존재 하에서 활성화된 γδ T 세포 확장을 포함하는, γδ T 세포의 확장 및 활성화 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 개시는 인간 시험대상자의 백혈구 성분 채집으로부터 γδ T 세포의 분리(이 때 이 분리는 백혈구 성분 채집 산물을 항-α 및 항-β T 세포 수용체(TCR) 항체(예: 비오틴 접합 또는 자기 비드 접합 항-αβ-TCR 항체)와 접촉시키는 것을 포함), 스트렙타비딘-마이크로비드나 자석을 사용하여 PBMC로부터 α- 및/또는 β-TCR 양성세포의 고갈(예를 들어 스트렙타비딘 - 마이크로비드나 자석을 사용하여), 아미노비스포스포네이트 및/또는 인항원을 포함하는 적어도 하나의 화합물 그리고 IL-2 및/또는 IL-15를 포함하는 적어도 하나의 시토카인의 존재 하에서 분리된 γδ T 세포의 활성화, 그리고 적어도 하나의 화합물의 부재 그리고 적어도 하나의 시토카인의 존재 하에서 활성화된 γδ T 세포의 확장을 포함하는, γδ T 세포의 확장 및 활성화 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 시험대상자의 혈액 샘플로부터 γδ T 세포의 분리, 아미노비스포스포네이트, 톨-유사 수용체 2(TLR2) 및 본질적으로 IL-2 및 IL-15로 구성된 시토카인 조성물의 존재 하에서 분리된 γδ T 세포의 활성화, 그리고 아미노비스포스포네이트의 부재하에서 및 상기 시토카인 조성물의 존재 하에서 활성화된 γδ T 세포의 확장을 포함하는 γδ T 세포의 활성화 및 확장의 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시는 여기서 기술된 방법론을 활용한 T 세포의 활성화 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시는 여기서 기술된 방법론을 활용한 T 세포의 확장 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 여기서 기술된 방법론을 활용한 T 세포의 활성화 및 확장 방법을 제공한다.
한 양태에서, 분리된 γδ T 세포의 활성화는 졸레드론산, TLR2 리간드, 그리고 IL-2 및 IL-15로 구성된 시토카인 조성물의 존재 하에서 실시한다. 다른 양태에서, 시토카인 조성물은 IL-2 혹은 IL-15로 구성된다. 한 양태에서, 여기서 기술된 방법들은 시험관 내 방법이다.
한 양태에서, γδ T 세포는 예를 들어 인간 시험대상자인 시험대상자의 백혈구 성분 채집 산물(예: LeukoPak®)로부터 분리된다. 다른 양태에서, γδ T 세포는 제대혈과 같은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리되지 않는다. 한 양태에서, 혈액 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및/또는 백혈구 성분 채집 산물을 포함한다.
다른 양태에서, α- 및/또는 β-TCR 양성 세포는 αβ T 세포와 자연 살해 T(NKT)세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 아미노비스포스포네이트는 졸레드로네이트, 파미드로네이트, 알렌드로네이트, 리세드로네이트, 이반드로네이트, 인카드로네이트, 클로드로네이트, 에티드로네이트 또는 네리드로네이트, 그 염 및/또는 그 수화물일 수 있다. 또 다른 양태에서, 여기서 기술된 방법에서 활용되는 유일한 아미노비스포스포네이트는 졸레드로네이트이다.
다른 양태에서, 인항원은 (E)-4-히드록시-3-메틸-부트-2-에닐 피로포스페이트(HMBPP), 이소프레노이드 피로포스페이트(파르네실 피로포스페이트(FPP), 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP), 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP) 또는 디메틸알릴 디포스페이드(DMAPP)일 수 있다.
본 개시는 또한 아미노비스포스페이트, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 γδ T 세포의 활성화를 제공한다. 또 다른 양태에서, 활성화는 아미노비스포스포네이트 및 IL-2 또는 아미노비스포스포네이트 및 IL-15의 존재 하에서 실시한다.
한 양태에서, 활성화는 인항원, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서, 또는 인항원 및 IL-15의 존재 하에서 실시한다.
다른 양태에서, 아미노비스포스포네이트는 졸레드론산이다.
다른 양태에서, 인항원은 IPP이다.
다른 양태에서, 아미노비스포스포네이트는 약 0.1 μM부터 약 500 μM까지, 약 0.1 μM부터 약 400 μM까지, 약 0.1 μM부터 약 300 μM까지, 약 0.1 μM부터 약 200 μM까지, 약 0.1 μM부터 약 100 μM까지, 약 0.5 μM부터 약 100 μM까지, 약 1 μM부터 약 500 μM까지, 약 1 μM부터 약 400 μM까지, 약 1 μM부터 약 300 μM까지, 약 1 μM부터 약 200 μM까지, 약 1 μM부터 약 100 μM까지, 약 1 μM부터 약 90 μM까지, 약 1 μM부터 약 80 μM까지, 약 1 μM부터 약 70 μM까지, 약 1 μM부터 약 60 μM까지, 약 1 μM부터 약 50 μM까지, 약 1 μM부터 약 40 μM까지, 약 1 μM부터 약 30 μM까지, 약 1 μM부터 약 20 μM까지, 약 1 μM부터 약 15 μM까지, 약 1 μM부터 약 10 μM까지, 약 1 μM부터 약 9 μM까지, 약 1 μM부터 약 8 μM까지, 약 1 μM부터 약 7 μM까지, 약 1 μM부터 약 6 μM까지, 약 1 μM부터 약 5 μM까지, 약 2 μM부터 약 5 μM까지, 약 3 μM부터 약 5 μM까지, 약 2 μM부터 약 5 μM까지, 약 2 μM부터 약 10 μM까지, 약 3 μM부터 약 8 μM까지, 약 4 μM부터 약 6 μM까지의 농도일 수 있다.
다른 양태에서 아미노비스포스포네이트는 약 0.1 μM부터 약 100 μM까지 또는 약 1 μM부터 100 μM까지의 농도일 수 있다. 또 다른 양태에서, 아미노비스포스포네이트는 약 5 μM의 농도일 수 있다.
또 다른 양태에서, 활성화 동안 분리된 γδ T 세포의 파종 밀도는 약 0.01 x 106 세포/cm2부터 약 1 x 107 세포/cm2까지, 약 0.1 x 106 세포/cm2부터 약 5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.25 x 106 세포/cm2부터 약 5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2 부터 약 5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 4 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 3 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 2.5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2 부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.6 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.7 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.8 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.9 x 106 세포/cm2 부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 1 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 또는 약 1.5 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지이다.
다른 양태에서, 활성화 동안 분리된 γδ T 세포의 파종 밀도는 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 3 x 106 세포/cm2까지이다.
한 양태에서, 활성화 및/또는 확장 동안 IL-2의 농도는 약 10 IU/ml부터 약 1000 IU/ml까지, 약 10 IU/ml부터 약 500 IU/ml까지, 약 10 IU/ml부터 약 400 IU/ml까지, 약 10 IU/ml부터 약 300 IU/ml까지, 약 10 IU/ml부터 약 200 IU/ml까지, 약 10 IU/ml부터 약 150 IU/ml까지, 약 10 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지, 약 20 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지, 약 30 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지, 약 40 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지, 약 50 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지, 약 75 IU/ml부터 약 125 IU/ml까지, 약 20 IU/ml부터 약 80 IU/ml까지, 약 25 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지, 또는 약 50 IU/ml부터 약 150 IU/ml까지이다.
다른 양태에서, 활성화 및/또는 확장 동안 IL-2의 농도는 약 50 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지이다. 다른 양태에서, 활성화 및/또는 확장 동안 IL-15의 농도는 약 10 ng/ml부터 약 1 μg/ml까지, 약 10 ng/ml부터 약 500 ng/ml까지, 약 10 ng/ml부터 약 400 ng/ml까지, 약 10 ng/ml부터 약 300 ng/ml까지, 약 10 ng/ml부터 약 200 ng/ml까지, 약 10 ng/ml부터 약 150 ng/ml까지, 약 10 ng/ml부터 약 100 ng/ml까지, 약 20 ng/ml부터 약 100 ng/ml까지, 약 30 ng/ml부터 약 100 ng/ml까지, 약 40 ng/ml부터 약 100 ng/ml까지, 약 50 ng/ml부터 약 100 ng/ml까지, 약 60 ng/ml부터 약 100 ng/ml까지, 약 20 ng/ml부터 약 80 ng/ml까지, 약 30 ng/ml부터 약 60 ng/ml까지, 또는 약 50 ng/ml부터 약 120 ng/ml까지이다.
또 다른 양태에서, 활성화 및/또는 확장 동안 IL-15의 농도는 약 50 ng/ml부터 약 100 ng/ml까지이다.
본 개시는 또한 농도가 약 1 μM부터 약 100 μM인 졸레드론산, 농도가 약 10 IU/ml부터 약 200 IU/ml까지의 IL-2, 그리고 농도가 약 10 내지 500 ng/ml인 IL-15의 존재 하에서 활성화를 실시하는 양태에 대해 제공한다. 또 다른 양태에서, 확장은 농도가 약 10 IU/ml부터 약 100 IU/ml까지의 IL-2 및/또는 농도가 약 50 내지 200 ng/ml인 IL-15의 존재 하에서 실시한다.
다른 양태에서, 시토카인은 IL-7, IL-18 및/또는 IL-21을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 여기서 기술된 방법들은 확장, 활성화 또는 확장 및 활성화 모두 동안 IL-12, IL-7,IL-21, IL-18, IL-19, IL-33, IL-4, IL-9 및/또는 IL-23 중 하나 이상을 제외시킨다.
또 다른 양태에서, 적어도 하나의 화합물은 톨-유사 수용체 2(TLR2) 리간드를 추가로 포함한다.
한 양태에서, TLR2 리간드는 암포테리신 B, L-테아닌, 탄닌 및 폴리페놀로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, TLR2 리간드는 암포테리신 B이다.
또 다른 양태에서, 적어도 하나의 화합물을 N-아세틸 시스테인(NAC) 및/또는 글루타민/글루타맥스를 추가로 포함한다.
한 양태에서, NAC의 농도는 약 1 mM부터 약 10 mM까지, 약 2 mM부터 약 8 mM까지, 약 0.5 mM부터 약 5 mM까지 또는 약 0.5 mM부터 약 2.5 mM까지이다.
다른 양태에서, 적어도 하나의 화합물은 COX-2 억제제를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, COX-2 억제제는 이부프로펜이다.
한 양태에서, 확장은 또한 N-아세틸시스테인(NAC) 및/또는 글루타민/글루타맥스 존재 하에서 실시한다.
한 양태에서, NAC의 농도는 약 1 mM부터 약 10 mM까지이다.
한 양태에서, 활성화의 기간은 약 7일, 약 10일, 약 12일, 약 14일, 약 16일 또는 약 20일 이하이다.
한 양태에서, 활성화의 기간은 약 1일부터 약 10일까지, 약 1일부터 약 9일까지, 약 1일부터 약 8일까지, 약 1일부터 약 7일까지, 약 1일부터 약 6일까지, 약 1일부터 약 5일까지, 약 1일부터 약 4일까지, 약 2일부터 약 10일까지, 약 2일부터 약 8일까지, 약 2일부터 약 7일까지, 약 3일부터 약 7일까지, 또는 약 4일부터 약 6일까지이다.
다른 양태에서, 활성화의 기간은 약 1일부터 약 7일까지이다.
한 양태에서, 확장의 기간은 약 7일, 약 10일, 약 12일, 약 14일, 약 16일, 약 20일, 약 22일, 약 24일, 약 26일, 약 28일 또는 약 30일을 초과한다. 한 양태에서, 확장의 기간은 약 7일부터 약 30일까지, 약 7일부터 약 25일까지, 또는 약 10일부터 약 20일까지이다.
한 양태에서, 확장 동안 γδ T 세포의 세포 밀도는 약 0.1 x 106 세포/cm2부터 약 5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.25 x 106 세포/cm2부터 약 5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 4 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 3 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 2.5 x 106 세포/cm2까지, 약 0.5 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.6 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.7 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.8 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 0.9 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 약 1 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지, 또는 약 1.5 x 106 세포/cm2부터 약 2 x 106 세포/cm2까지이다.
다른 양태에서, 확장에서 사용되는 시토카인은 IL-18, IL-21 및 IL-7을 추가로 포함한다.
한 양태에서, 본 출원은 여기에서 기술된 양태 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 확장되고 활성화된 γδ T 세포의 군집에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 출원은 제1 내지 제16 양태 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된, 확장되고 활성화된 γδ T 세포와 재조합 바이러스 벡터와의 형질도입을 포함하는, γδ T 세포에서 바이러스 형질도입 효율 강화의 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
다른 양태에서, 바이러스 벡터는 γ-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다.
또 다른 양태에서, 바이러스 벡터는 CD8 및 αβ-TCR을 발현한다.
한 양태에서, 본 출원은 본 개시의 방법으로 제조된 조작된 γδ T 세포에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 출원은 본 개시의 방법으로 제조된 확장된 γδ T 세포의 군집에 관한 것으로, 확장된 γδ T 세포의 농도는 적어도 약 1 x 105 세포/ml, 적어도 약 1 x 106 세포/ml, 적어도 약 1 x 107 세포/ml, 적어도 약 1 x 108 세포/ml, 또는 적어도 약 1 x 109 세포/ml이다.
한 양태에서, 본 출원은 투여를 필요로 하는 환자에게 본 개시의 방법으로 제조된, 조작된 γδ T 세포의 유효량의 투여를 포함하는 암 치료의 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 해당 암은 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 에이즈 관련 암, 에이즈 관련 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 신경모세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경아교종, 뇌실막세포종, 수포세포종, 천막위 원시 신경뇌배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경아교종과 같은 뇌종양, 유방암, 기관지 선종, 버킷 림프종, 원발 부위 불명의 암종, 중추신경계 림프종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 결합조직형성 소원형 세포 종양, 자궁내막암, 식도암, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양, 신경아교종, 털세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포(간) 암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 섬세포 암종, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 입술 및 구강암, 지방육종, 간암, 비소세포 및 소세포 폐암과 같은 폐암, 림프종들, 백혈병들, 고분자글로불린혈증, 뼈의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 흑색종들, 중피종, 잠복 원발 종양을 수반한 전이성 편평 경부암, 입 암, 다발성 내분비 종양 증후군, 골수형성이상 증후군, 골수성 백혈병, 비강 및 부비동암, 비인두 암종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 구강암, 구인두암, 골육종/뼈의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피암, 난소 생식세포암, 췌장암, 췌장암 섬세포, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배아종, 뇌하수체 선종, 흉막폐 아세포종, 혈장 세포 종양, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종, 신우 및 요관 이행 세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종, 피부암, 메르켈 세포 피부 암종, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 위암, T 세포 림프종, 인후암, 흉선종, 흉선 암종, 갑상선암, 융모성 종양(임신성), 원발 부위 불명의 암들, 요도암, 자궁암, 질암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 윌름스 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 해당 암이 흑색종이다.
도 1a는 본 개시의 구현예에 따른 PBMC로부터의 αβ T 세포의 고갈을 보여준다. PBMC를 제조사 프로토콜에 따라 비오틴 접합 αβ-TCR 항체와 함께 배양한 다음 스트렙타비딘-마이크로비드와 함께 배양했다. 그런 다음 샘플을 LS 컬럼을 통과시켜 αβ-TCR 발현 세포에 대해 강화했다. 컬럼 통과액은 αβ-TCR이 고갈된 분획을 나타낸다. 하룻밤 동안 배양 후, αβ-TCR 강화된 분획 및 αβ-TCR 고갈된 분획을 플루오로크롬 접합 αβ-TCR 항체 대 Vγ9 항체로 염색한 다음 유세포 분석을 실행했다.
도 1b 및 도 1c는 본 개시의 구현예에 따른 Vγ9δ2 T 세포 제제내 최저 잔류 αβ T 세포를 보여준다. 상업적으로 가용한 αβ 비오틴화 항-αβ-TCR 항체/스트렙타비딘 마이크로비드를 사용하여 정상 공여자(공여자 A, 공여자 B 및 공여자 C)(도 1b) 그리고 (공여자 12 및 공여자 13)(도 1c) PBMC로부터 T 세포가 고갈되었다. αβ T 세포 고갈된 PBMC를 14일 동안 졸레드로네이트/IL-2/IL-15와 배양한 다음 각각의 플로오로크롬 접합 합체(예: 항-αβ-TCR 항체 및 항-γδ TCR 항체)로 염색하며 αβCD3 상에서 서브게이팅으로 잔류 γδ T 세포와 강화된 T 세포를 평가했다.
도 1d는 본 개시의 구현예에 따른 Vγ9δ2 T 세포의 시토카인 프로파일링을 보여준다. Vγ9δ2 세포를 세포 수확 전에 6시간 동안 골지 스톱/플러그(Golgi Stop/Plug)(즉, 단백질 수송 억제제)로 처리했다. 세포를 표면 Vδ2에 대해 염색한 다음 고정 및 투과 처리했다. 세포 내 TNF-α, IL-17a 및 IFN-γ의 염색은 TNF-α, IL-17a 및 IFN-γ에 대한 플루오로크롬 접합 항체를 사용하여 수행했다.
도 1e는 본 개시의 다른 구현예에 따른 백혈구 성분 채집 산물(예: LeukoPak®)로부터 αβ T 세포의 고갈을 보여준다. 백혈구 성분 채집 산물로부터 얻은 수지상 및 전구 세포를 포함하는 백혈구는 비오틴 접합 αβ-TCR 항체와 함께 배양한 다음 스트렙타비딘-마이크로비드와 함께 배양할 수 있다. 다음 샘플을 LS 컬럼을 통해 통과시켜 αβ-TCR 발현 세포에 대해 강화했다. 컬럼 통과액은 αβ-TCR이 고갈된 분획을 나타낸다. 하룻 밤의 배양 후, αβ-TCR 고갈된 분획을 플루오로크롬-접합 αβ-TCR 항체 대 γδ TCR 항체로 염색한 다음 유세포 분석을 실행했다.
도 2는 본 개시의 구현예에 따른 Vγ9δ2 T 세포의 활성화에 대한 분자의 영향을 보여준다. 활성화 단계 동안, 아미노비스포스포네이트(예: 졸레드로네이트(ZA)) 또는 인항원(예: IPP) 그리고 시토카인(예: IL-2 및/또는 IL-15)이 존재할 수 있다.
도 3은 본 개시의 구현예에 따른 Vγ9δ2 T 세포의 확장에 대한 분자의 영향을 보여준다. 확장 단계 동안, 아미노비스포스포네이트나 인항원 혹은 IPP가 없는 상태에서 시토카인이 계속 존재할 수 있다.
도 4a는 본 개시의 구현예에 따른 확장 동안 T 세포 표지자에 대한 세포 밀도의 영향을 보여준다. 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 14일 동안 활성화 이후, Vγ9δ2 T 세포를 고밀도(예: 2 x 106 세포/ml) 그리고 저밀도(예: 0.5 x 106 세포/ml)의 졸레드로네이트의 부재 하에 항상성 시토카인(예: IL-2 및 IL-15)으로 확장시켰다. T 세포 표지자(예: CD122, CD80, CD83, CD86, CD95 및 CD95L)를 분석했다.
도 4b는 본 개시의 구현예에 따른 확장 동안 세포사에 대한 세포 밀도의 영향을 보여준다. 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 14일 동안 활성화 이후, T 세포를 고밀도(예: 2 x 106 세포/ml) 그리고 저밀도(예: 0.5 x 106 세포/ml)의 졸레드로네이트의 부재 하에 항상성 시토카인(예: IL-2 및 IL-15)으로 확장시켰다. 세포사를 측정했다.
도 5는 본 개시의 구현예에 따른 IL-2Rα를 발현하는 Vδ2 T 세포에 대한 암포테리신 B의 영향을 보여준다. 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15로 보충된 활성화 배지에서 αβ-고갈된 PBMC를 제0일에 배양했다. 48시간 후, 암포테리신 B를 첨가하고 48시간 후에 CD3+/Vδ2 T 세포 상에서 CD25(또는 IL-2Rα)의 유세포 기반 분석을 위해 세포를 수확했다.
도 6은 본 개시의 구현예에 따른 세포 확장에 대한 졸레드로네이트(Zometa)의 영향을 보여준다. IL-2, IL-15 및 암포테리신 B를 포함하는 정의된 배지에서 졸레드로네이트(Zometa)를 사용하여 γδ T 세포를 확장시켰다.
도 7은 본 개시의 구현예에 따른 Vγ9δ2 T 세포 안으로 바이러스 형질도입에 대한 시간표를 보여준다. 제1일에, 신선한 PBMC로부터 αβ T 세포를 고갈시킨 후 IL-2 및 IL-15의 존재 하에 졸레드로네이트로 활성화했다. 24시간 이후(제2일에), 1.5의 MOI로 해당 바이러스 상층액을 사용하여 세포가 형질도입되었다. GFP 형질도입유전자 발현을 유세포 측정으로 형질도입 효율에 대해 제7일에(즉, 형질도입 후 제5일) 평가했다. 그리고 제12일에(즉, 형질도입 후 제10일) 지속적 형질도입 유전자 발현을 평가했다.
도 8a는 본 개시의 구현예에 따라 γ-레트로바이러스 벡터를 사용하여 Vγ9δ2 T 세포에서 바이러스 형질도입유전자 발현을 보여준다. 다른 외피 단백질 발현 바이러스들, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 γ-레트로바이러스(예: 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 유사형(예: 서열 식별 번호 4), RD114TR 유사형(서열 식별 번호 1) 그리고 GFP 발현 렌티바이러스(예: VSV-G 유사형(예: 서열 식별 번호 3))를 Vγ9δ2 T 세포 안으로 형질도입 후 제5일 및 제10일에 형질도입 효율에 대한 검사를 했다.
도 8b는 본 지시의 구현예에 따라 RD114TR 또는 VSV-G 유사형 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포에서 바이러스 형질도입 유전자(예: CD8α)의 발현을 보여준다.
도 9a는 형질도입 과정 동안 여러 형질도입 증진제(레트로넥틴® 대 벡토푸진-1®)를 사용하여 CD8αβ에 의한 γδ T 세포의 형질도입을 보여준다. 세 공여자(공여자 1, 공여자 2 및 공여자 3)로부터 얻은 γδ T 세포를 레트로넥틴®(플레이트에 코팅된 피브로넥틴 단편) 또는 벡토푸진-1®(가용 양이온 펩티드)의 존재 하에서 CD8αβ를 인코딩하는 레트로바이러스로 형질도입한 다음 유세포 측정하여 CD8αβ+세포의 백분율(%)을 결정했다.
도 9b는 본 개시의 구현예에 따라 조작된 바이러스에 의한 Vγ9δ2 T 세포의 형질도입 효율을 보여준다. Vγ9δ2 T 세포를 바이러스 없이(모의) 형질도입하거나 αβ-TCR 바이러스만으로, CD8 바이러스만으로 또는 αβ-TCR 바이러스 +CD8 바이러스로 형질도입했다. 형질도입된 세포를 TAA/MHC-PE 덱스트라머, 항-CD8 항체 또는 NYESO-PE 덱스트라머(음성 대조)와 함께 배양한 다음 유세포 분석을 수행했다.
도 10은 본 개시의 구현예에 따라 조작된 바이러스로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포의 배수 확장을 보여준다. Vγ9δ2 T 세포(GD) 또는 αβ T 세포(AB)를 바이러스 없이(모의) αβ-TCR 바이러스(TCR)로, CD8 바이러스(CD8)로 또는 CD8 +TCR로 형질도입한 다음 형질도입 후 제7일부터 제21일까지 배수 확장을 측정했다.
도 11a는 본 개시의 구현예에 따라 조작된 Vγ9δ2 T 세포를 보여준다. 바이러스 없이(모의) 또는 αβ-TCR 레트로바이러스 및 CD8αβ 레트로바이러스(αβ-TCR + CD8)로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포를 TAA/MHC 복합체와 함께 배양한 다음 유세포 분석으로 TAA/MHC 복합체에 결합하는 Vγ9δ2 T 세포를 검출했다.
도 11b는 본 개시의 구현예에 따라 조작된 Vg9d2 T 세포의 기능적 평가를 보여준다. 바이러스 없이(모의) 또는 αβ-TCR 레트로바이러스 및 CD8αβ 레트로바이러스(αβ-TCR + CD8)로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포를 표적 세포와 함께 배양한 다음 유세포 분석으로 세포자멸사 표지자인 CD107a를 검출했다.
도 11c는 본 개시의 다른 구현예에 따라 조작된 Vg9d2 T 세포의 기능적 평가를 보여준다. 바이러스 없이(모의) 또는 αβ-TCR 레트로바이러스 및 CD8αβ 레트로바이러스(αβ-TCR + CD8)로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포를 표적 세포와 함께 배양한 다음 유세포 분석으로 IFN-γ 방출을 검출했다.
도 11d는 본 개시의 구현예에 따라 조작된 Vg9d2 T 세포의 세포용해 활성도를 보여준다. 바이러스 없이(모의) 또는 αβ-TCR 레트로바이러스 및 CD8αβ 레트로바이러스(αβ-TCR + CD8)로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포를 표적 세포와 함께 배양한 다음 유세포 분석으로 세포자멸사 세포를 검출했다.
도 11e는 본 개시의 구현예에 따라 조작된 γδ T 세포의 연장된 세포용해 활성도를 보여준다. 세포용해 활성도를 84시간 공동배양 분석 동안 실시간으로 평가했다. 표적 양성 A375-RFP 종양 세포를 T 세포(종양 세포) 없이 또는 비형질도입된 세포(αβ T 세포 및 γδ T 세포)와 함께, αβ-TCR 바이러스 및 CD8αβ 바이러스(αβ-TCR + αβ T 세포)로 형질도입된 αβ T 세포와 함께, 또는 αβ-TCR 바이러스 및 CD8αβ 바이러스(αβ-TCR + γδ T 세포)로 형질도입된 γδ T 세포와 함께 배양한 다음 IncuCyte® 라이브 세포 분석으로 표적 세포의 성장을 측정했다.
도 12a는 본 개시의 구현예에 따라 조작된 바이러스의 도식을 보여준다. CD8/CD4 키메라 수용체-T2A-절단된 CSF1R은 CD4 막통과 및 세포내 도메인에 연결된 CD8α 세포의 도메인을 포함한다.
도 12b는 본 개시의 구현예에 따라 조작된 바이러스의 도식을 보여준다. CD8/CD4 키메라 수용체-T2A-CSF1R/41BB 키메라 수용체는 키메라 CD8/CD4 단백질로부터 하류에 연결된 CSF1R 세포의 도메인을 포함한다.
도 13은 본 개시의 구현예에 따른 동종 T 세포 요법을 보여준다. 동종 T 세포 요법은 건강한 공여자로부터 γδ T 세포의 수집, 외인성 TCR과 같은 관심 대상의 외인성 유전자의 바이러스 형질도입에 의한 γδ T 세포의 조작, 그 이후 세포 확장, 확장되고 조작된 γδ T 세포의 수확을 포함할 수 있으며, 이 세포는 환자에게 주입하기 전에 "기성품" T 세포 제제로 저온보존할 수 있다.
도 14는 본 개시의 구현예에 따른 γδ T 세포 제조를 보여준다. γδ T 세포 제조는 혈액 세포나 PBMC(예: 백혈구 성분 채집 산물)의 수집이나 획득, PBMC나 백혈구 성분 채집 산물로부터 αβ T 세포의 고갈, 그 다음 γδ T 세포의 활성화, 형질도입 및 확장을 포함할 수 있다.
동종이형 T 세포 요법은 외인성 TCR을 발현하도록 유전적으로 조작하는 동종이형 γδ T 세포에 기반할 수 있다. 자궁외 TCR을 통한 특이적 종양 인식 외에도, γδ T 세포는 여기에서 기술된 다수의 종양 유형에 대한 활성도를 가질 수 있다.
한 양태에서, 본 개시는 T 세포의 확장 및/또는 활성화에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 개시는 γδ TCR에 대한 항체와 같은 γδ TCR에 특이적인 에피톱에 결합하는 제제의 부재하에서 γδ T 세포의 확장 및/또는 활성화에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 개시는 형질도입 유전자 발현에 사용될 수 있는 γδ T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다.
본 개시는 또한 α- 및/또는 β-TCR 양성 세포를 고갈시키는 동안 γδ T 세포의 확장 및 활성화에 관한 것이다. 확장된 γδ T 세포 및 고갈되거나 감소된 α- 및/또는 β-TCR 양성 세포로 구성된 T 세포군 또한 본 발명의 개시에서 제공된다. 본 개시는 개시된 T 세포군을 사용하는 방법 또한 제공한다.
한 양태에서, 우수 의약품 제조 관리 기준(GMP) 등급의 TCR 조작 Vγ9δ2 T 세포의 대규모 생산 방법이 여기에 제공된다.
지지 세포(feeder cell) 부재하에서, 정제된 γδ T 세포에 IL-18의 첨가는 γδ T 세포의 확장을 강화시키며 IL-2(CD25 또는 IL-2Ra)에 대한 표면 고친화도 수용체의 양에 대한 뚜렷한 증가가 동반된다. 더욱이, 암포테리신 B는 톨-유사 수용체 2(TLR2) 리간드로서 γδ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포를 활성화시키며 CD25인 고친화도 IL-2Rα의 표면 발현의 검출을 강화시킨다. 총체적으로 이러한 관찰은 Vγ9δ2 T 세포의 졸레드로네이트 매개 활성화 및 확장에서 IL-2 신호전달의 중대한 역할을 강조한다. 그리하여 IL-2 신호전달을 통한 γδ T 세포 증식을 위해 IL-2의 가용성을 최대화하기 위해(또는 많은 숫자의 αβ T 세포에 의한 IL-2의 격리를 최소화하기 위해), 본 개시의 방법은 상업적으로 가용한 GMP 시약인 항-TCR을 사용한 정상 PBMC로부터 T 세포의 고갈을 포함할 수 있다. 재조합 IL-18이 현재 상용 GMP 시약으로 제공되지 않으므로, 본 개시의 방법들은 낮은 용량의 암포테리신 B로 배양액을 보충하여 CD25 표면 발현을 증가시킴으로 IL-2 결합 및 신호전달을 강화시킬 수 있고 이는 다시 활성화/확장 동안 IL-2 반응성을 강화시킬 수 있다. 또한, IL-15가 IPP로 처리한 Vγ9δ2 T 세포의 증식과 생존을 증가시키는 것으로 나타났기 때문에 IL-15를 첨가할 수 있다.
도 13은 종양에서 관심 대상의 표적을 발현하는 특정 암에 걸린 적합 환자의 신속한 치료를 위해 γδ T 세포와 같은 "기성품" T 세포 제제를 전달할 수 있는 입양 동종 T 세포 요법에 대한 접근방식을 보여준다. 이 접근방식은 건강한 공여자로부터 γδ T 세포의 수집, 외인성 TCR과 같은 관심 대상의 외인성 유전자의 바이러스 형질도입에 의한 γδ T 세포의 조작, 그 이후 세포 확장, 확장되고 조작된 γδ T 세포의 수확을 포함할 수 있으며, 이 세포는 환자에게 주입하기 전에 "기성품" T 세포 제제로 저온보존할 수 있다. 그러므로 이 접근 방식은 개인화 T 세포 제조의 필요를 제거할 수 있다.
한 양태에서, γδ T 세포를 분리하기 위해 γδ T 세포를 시험대상자로부터 또는 시험대상자의 복합 샘플로부터 분리할 수 있다. 한 양태에서, 복합 샘플은 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 줄기 세포 전구체, 종양 생검물, 조직, 림프, 또는 외환경에 직접 접촉하는 시험대상자의 상피 부위나 줄기 전구체 세포로부터 유래할 수 있다. γδ T 세포는 시험대상자의 복합 샘플로부터, 예를 들어 유세포 기법을 사용하여 하나 이상의 세포 표면 표지자를 발현하는 γδ T 세포를 구별하여 직접 분리할 수 있다. 야생형 γδ T 세포는 γδ T 세포와 연관될 수 있는 다수의 항원 인식, 항원 제시, 공동 자극 및 유착 분자를 나타낼 수 있다. 특정 γδ TCR, 항원 인식, 항원 제시 리간드, 유착 분자 또는 공동 자극 분자와 같은 하나 이상의 세포 표면 표지자를 사용하여 복합 샘플로부터 야생형 γδ T 세포를 분리할 수 있다. γδ T 세포와 연관되거나 이에 의해 발현되는 다양한 분자를 사용하여 복합 샘플로부터 γδ T 세포를 분리할 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시는 Vδ1+, Vδ2+, Vδ3+ 세포 또는 이의 모든 조합에 의한 혼합 군집의 분리를 위한 방법을 제공한다.
예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포는 예를 들어 Ficoll-Paque™ PLUS(GE Healthcare) 시스템이나 다른 적절한 기기/장치 등 성분 채집 기계로 시험대상자로부터 수집할 수 있다. γδ T 세포나 γδ T 세포의 바람직한 하위 군집은 예를 들어 유세포 기법을 사용하여 수집된 샘플로부터 정제할 수 있다. 제대혈 세포 또한 시험대상자의 출생 동안 제대혈로부터 얻을 수 있다.
수집된 γδ T 세포 상에 발현된 세포 표면 표지자의 양성 및/또는 음성을 선택하여, 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 종양 생검물, 조직, 펌프 또는 시험대상자의 상피 샘플로부터 얻은 유사한 세포 표면 표지자를 발현하는 γδ T 세포 또는 γδ T 세포의 군집을 직접 분리할 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD44, Kit, TCR α, TCR β, TCR δ, NKG2D, CD70, CD27, CD30, CD16, CD337(NKp30), CD336(NKp46), OX40, CD46, CCR7 및 기타 적합한 세포 표면 표지자의 양성이나 음성 발현에 기반하여 복합 샘플로부터 분리할 수 있다.
한 양태에서, γδ T 세포는 시험관 내 배양된 복합 샘플로부터 분리될 수 있다. 다른 양태에서, 단핵세포, αβ T 세포, B 세포 및 NK 세포와 같은 특정 세포군의 사전 고갈 없이 전체 PBMC 군집을 활성화 및 확장할 수 있다. 다른 양태에서, 강화된 γδ T 세포군은 특정한 활성화 및 확장 이전에 생성될 수 있다. 다른 양태에서, γδ T 세포의 활성화 및 확장은 자연 또는 조작된 APC의 존재 없이 수행할 수 있다. 다른 양태에서, 종양 검체로부터 γδ T 세포의 분리 및 확장을 γδ TCR에 특이적인 항체 등 부동화된 γδ T 세포 미토겐 그리고 렉틴 등 기타 γδ TCR 활성화 제제를 사용하여 수행할 수 있다. 다른 양태에서, 종양 검체로부터 γδ T 세포의 분리 및 확장을 γδ TCR에 특이적인 항체 등 γδ T 세포 미토겐 그리고 렉틴 등 기타 γδ TCR 활성화 제제의 부재하에서 수행할 수 있다.
한 양태에서, γδ T 세포는 예를 들어 인간 시험대상자인 시험대상자의 백혈구 성분 채집으로부터 분리된다. 다른 양태에서, γδ T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리되지 않는다.
도 14는 본 개시의 구현예에 따른 γδ T 세포 제조를 보여준다. 이 공정은 백혈구 성분 채집 산물로부터 백혈구나 PBMC의 수집이나 획득을 포함할 수 있다. 백혈구 성분 채집은 공여자로부터 전혈의 수집과 성분채집기를 사용한 성분의 분리를 포함할 수 있다. 성분채집기는 원하는 혈액 성분을 분리하고 나머지를 공여자의 혈액 순환으로 돌려보낸다. 예를 들어, 백혈구, 혈장 및 혈소판은 성분채집기를 사용하여 수집할 수 있으며, 적혈구와 호중구를 공여자의 혈액 순환으로 돌려보낸다. 상용 백혈구 성분 채집 산물을 이 공정에 사용할 수 있다. 백혈구를 얻는 다른 방식은 연층으로부터 얻는 것이다. 연층을 분리하려면, 공여자로부터 항응고화된 전혈을 얻은 다음 원심분리한다. 원심분리 후, 혈액은 혈장, 적혈구 및 연층으로 분리된다. 연층이란 혈장층과 적혈구층 사이에 위치하는 층이다. 백혈구 성분 채집은 연층 수집으로 성취되는 것보다 순도가 더 높고 단핵 세포 함량이 훨씬 더 증가될 수 있다. 백혈구 성분 채집으로 가능한 단핵 세포 함량은 연층으로 얻는 것보다 대개 20배 더 높을 수 있다. 단핵 세포를 강화하기 위해, 추가 분리를 목적으로 피콜 구배(Ficoll gradient)의 사용이 필요할 수 있다.
PBMC로부터 αβ T 세포를 고갈하려면, 자기 분리로 αβ-TCR-발현 세포를 PBMC로부터 분리할 수 있으며, 예를 들어 αβ-TCR 항체로 도포된 CliniMACS® 자기 비드를 사용한 다음 αβ-TCR-T 세포가 고갈된 PBMC를 저온보존한다. "기성품" T 세포 제제를 제조하려면, 저온보존된 αβ-TCR-T 세포가 고갈된 PBMC를 해동하여 소/중 규모는 예를 들면, 24 ~ 4-6 웰 플레이트 또는 T75/T175 플라스크에서, 대규모의 경우는 예를 들어 50 ml 내지 100 리터 백에서, 아미노비스포스포네이트 및/또는 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP) 및/또는 시토카인(예: 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 15(IL-15), 및/또는 인터루킨 18(IL-18), 및/또는 기타 활성화제(예: 톨-유사 수용체 2(TLR2) 리간드)의 존재 하에서 1 내지 10일(예: 2 내지 6일) 동안 활성화할 수 있다.
한 양태에서, 분리된 γδ T 세포는 하나 이상의 항체와 접촉에 대한 반응으로 신속히 확장할 수 있다. Vγ9Vδ2+ T 세포와 같은 일부 γδ T 세포는 조직 배양 동안 프레닐-피로포스페이트, 알킬 아민 및 대사물 또는 미생물 추출물과 같은 일부 항체와의 접촉에 대한 반응으로 시험관 내에서 급속히 확장될 수 있다. 자극받은 γδ T 세포는 복합 샘플로부터 γδ T 세포의 분리를 원활히 할 수 있는 다수의 항원 제시, 공동 자극 및 유착 분자를 나타낼 수 있다. 복합 샘플 내 γδ T 세포는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 다른 적절한 시간 동안 적어도 하나의 항원으로 시험관 내에서 자극할 수 있다. γδ T 세포를 적절한 항원으로 자극하면 시험관 내에서 γδ T 세포군을 확장시킬 수 있다.
복합 샘플의 γδ T 세포의 확장에 대한 시험관 내 자극에 사용될 수 있는 항원의 비제한적인 예에는, 이소펜테닐 피로포스페이트, 피로포스페이트(IPP)와 같은 페닐-피로포스페이트, 알킬-아민, 인간 미생물 병원체의 대사물, 공생균의 대사물, 메틸-3-부테닐-1-피로포스페이트(2M3B1PP), (E)-4-히드록시-3-메틸-부트-2-에닐 피로포스페이트(HMB-PP), 에틸 피로포스페이트(EPP), 파르네실 피로포스페이트(FPP), 디메틸알릴 포스페이트(DMAP), 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP), 에틸-아데노신 트리포스페이트(EPPPA), 제라닐 피로포스페이트(GPP), 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP), 이소펜테닐-아데노신 트리포스페이트(IPPPA), 모노에틸 포스페이트(MEP), 모노에틸 피로포스페이트(MEPP), 3-포르밀-1-부틸-피로포스페이트(TUBAg 1), X-피로포스페이트(TUBAg 2), 3-포르밀-1-부틸-우리딘 트리포스페이트(TUBAg 3), 3-포르밀-1-부틸-디옥시티미딘 트리포스페이트(TUBAg 4), 모노에틸 알킬아민, 알릴 피로포스페이트, 크로토일 피로포스페이트, 디메틸알릴-γ-우리딘 트리포스페이트, 크로토일-γ-우리딘 트리포스페이트, 알릴-γ-우리딘 트리포스페이트, 에틸아민, 이소부틸아민, sec-부틸아민, 이소-아밀아민 및 질소 함유 비스포스포네이트가 포함될 수 있다.
γδ T 세포의 활성화 및 확장은 특정 γδ T 세포 증식 및 지속성 군집을 유발하기 위하여 여기서 기술된 활성화 및 공동자극 제제를 사용하여 수행할 수 있다. 한 양태에서, 다른 배양액의 γδ T 세포에 대한 활성화 및 확장은 뚜렷한 클론 또는 혼합 다클론성 군집 하위 조합을 성취할 수 있다. 다른 양태에서, 다른 작용제를 사용하여 특정 γδ 활성화 신호를 제공하는 제제를 식별할 수 있다. 다른 양태에서, 특정 γδ 활성화 신호를 제공하는 제제는 γδ TCR를 표적으로 하는 다른 단클론성 항체(MAb)일 수 있다. 다른 양태에서, 세포 에너지의 유도 및 세포자멸사 없이 특정 γδ T 세포 증식의 유발을 돕는 동반 공동자극 제제를 사용할 수 있다. 이러한 공동 자극 제제는 NKG2D, CD161, CD70, JAML, DNAX 보조 분자-1 (DNAM-1), ICOS, CD27, CD137, CD30, HVEM, SLAM, CD122, DAP 및 CD28과 같은 γδ 세포 상에서 발현되는 수용체에 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 공동 자극 제제는 CD2 및 CD3 분자 상의 고유한 에피톱에 특이적인 항체일 수 있다. CD2 및 CD3은 αβ나 γδ T 세포에서 발현될 때 다른 입체형태를 가질 수 있다. 다른 양태에서, CD3 및 CD2에 대한 특이적 항체는 γδ T 세포의 뚜렷한 활성화를 유도할 수 있다.
γδ T 세포 군집은 γδ T 세포의 조작 이전에 생체 외에서 확장될 수 있다. γδ T 세포 군집의 시험관 내 확장을 원활하게 하는데 사용할 수 있는 시약의 비제한적인 예에는 항-CD3 또는 항-CD2, 항-CD27, 항-CD30, 항-CD70, 항-OX40 항체, IL-2, IL-15, IL-12, IL-9, IL-33, IL-18 또는 IL-21, CD70(CD27 리간드), 식물혈구응집소(PHA), 콘카나발린 A(ConA), 억세풀(PWM), 땅콩 단백질 응집소(PNA), 대두 응집소(SBA), 렌스 컬리나리스 응집소(LCA), 피섬 사티범 응집소(PSA), 헬릭스 포마티아 응집소(HPA), 비시아 그라미네아 렉틴(VGA), 또는 T 세포 증식을 자극할 수 있는 다른 적합한 미토겐을 포함할 수 있다.
광범위의 항원을 인식하는 γδ T 세포의 능력은 γδ T 세포의 유전자 조작으로 강화될 수 있다. 한 양태에서, γδ T 세포를 조작하여 선택한 항원을 생체 내 인식하는 보편적 동종이형 요법을 제공할 수 있다. γδ T 세포의 유전자 조작은 αβ-TCR, γδ TCR, 항원 결합 및 T 세포 활성화 기능 모두를 하나의 수용체로 조합하는 키메라 항원 수용체(CAR), 그 항원 결합 단편 또는 림프구 활성화 도메인과 같은 종양 인식 모이어티를 발현하는 구조체를 분리된 γδ T-세포(들)의 게놈인 시토카인(IL-15, IL-12, IL-2. IL-7. IL-21, IL-18, IL-19, IL-33, IL-4, IL-9, IL-23, IL1β)에 안정적으로 통합시켜 T 세포 증식, 생존 및 기능을 생체 외 및 생체 내에서 강화시키는 것을 포함할 수 있다. 분리된 γδ T 세포의 유전자 조작은 MHC 유전자 자리(자리들)와 같은 분리된 γδ T 세포의 게놈에서 하나 이상의 내인성 유전자로부터의 유전자 발현에 대한 삭제나 방해 또한 포함할 수 있다.
한 양태에서, 바이러스는 자연 발생 바이러스 그리고 인공 바이러스 모두를 지칭한다. 본 개시의 일부 구현예에 따른 바이러스는 외피가 있거나 외피가 없는 바이러스일 수 있다. 파보바이러스(AAV 등)는 외피가 없는 바이러스의 예이다. 바람직한 구현예에서, 해당 바이러스는 외피가 있는 바이러스일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 해당 바이러스는 레트로바이러스 그리고 특히 렌티바이러스일 수 있다. 진핵 세포의 바이러스 감염을 촉진시킬 수 있는 바이러스 외피 단백질은 소수포 구내염 바이러스(VSV-G)의 외피 당단백질(GP)로 유사형이 된 HIV-1 유래 렌티 바이러스 벡터(LV), 변형된 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114TR) 및 변형된 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GALVTR)를 포함할 수 있다. 이러한 외피 단백질은 아데노-관련 바이러스(AAV) 등 파보바이러스와 같은 기타 바이러스의 진입을 효율적으로 촉진시킬 수 있으며 그에 따라 광범위한 효율을 잘 나타낸다. 예를 들어, 다른 바이러스 외피가 사용될 수 있으며, 이에는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스(MLV) 4070 env(Merten et al., J. Virol. 79:834-840, 2005 등에서 기술됨; 여기에 참조문헌으로 포함됨), RD114 env(서열 식별 번호 2), 키메라 막 단백질 RD114pro 또는 RDpro(이것은 RD114의 R 펩티드 절단 서열을 HIV-1 매트릭스/캡시드(MA/CA) 절단 서열로 대체하여 구조된 RD114-HIV 키메라임, Bell et al. Experimental Biology and Medicine 2010; 235: 1269-1276 등에서 기술됨; 여기에 참조문헌으로 포함됨), 바큘로바이러스 GP64 env(Wang et al. J. Virol. 81:10869-10878, 2007 등에서 기술됨; 여기에 참조문헌으로 포함됨)또는 GALV env(Merten et al., J. Virol. 79:834-840, 2005 등에서 기술됨; 여기에 참조문헌으로 포함됨) 또는 그 유도체가 포함된다.
RD114TR
RD114TR은 고양이 백혈병 바이러스 RD114의 세포외 및 막통과 도메인 그리고 양생 쥐과 백혈병 바이러스 막의 세포질 꼬리(TR)로 만들어진 키메라 외피 당단백질이다. RD114TR 유사형 벡터는 인간 조혈 전구세포 및 NOD/SCID 재증식 세포 안으로의 효율적인 유전자 이전을 매개할 수 있다. (Di Nunzio et al., Hum. Gene Ther: 811-820 (2007))의 전문이 참조문헌으로 여기에 포함된다. RD114 유사형 벡터는 큰 동물 모형 안으로의 효율적인 유전자 이전도 매개할 수 있다(Neff et al., Mal. Ther. 2:157-159 (2004); Hu et al., Mal. Ther: 611-617 (2003); and Kelly et al., Blood Cells, Molecules, & Diseases 30:132-143 (2003))의 전문이 참조문헌으로 여기에 포함된다.
본 개시는 서열 식별 번호 1 또는 서열 식별 번호 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 RD114TR 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, RD114TR(서열 식별 번호 1)에 대해 약 96% 서열 동일성을 갖는 RD114TR 변이체(RD114TRv1, 서열 식별 번호 5)를 사용할 수 있다. 한 양태에서, 본 개시는 변형된 아미노산 잔기를 갖는 RD114TR 변이체에 대해 제공한다. 변형된 아미노산 잔기는 아미노산 삽입, 결손 또는 치환으로부터 선택될 수 있다. 한 양태에서, 여기서 기술된 치환은 보수적인 아미노산 치환이다. 즉 RD114TR의 아미노산은 유사한 물성을 가진 다른 아미노산으로 대체할 수 있다(유사한 소수성, 친수성, 항원성, α-나선 구조나 β-시트 구조를 형성 또는 파괴하는 경향과 같은 보수적 변경). 보수적 치환의 비제한적 예는 예를 들어 Creighton(1984) 단백질에서 찾을 수 있다. W.H. Freeman and Company의 전문이 참조문헌으로 여기에 포함된다.
한 양태에서, 본 개시는 서열 식별 번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 보수적 치환은 Dayhoff에 의해 "The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5", Natl. Biomedical Research에 기술된 것을 포함할 수 있으며, 이의 전문이 참조문헌으로 여기서 포함된다. 예를 들어, 한 양태에서, 다음 군 중의 하나에 속하는 아미노산들은 서로 교환이 가능하므로 보수적 교환을 성립한다: 1군: 알라닌(A), 프롤린(P), 글리신(G), 아스파라긴(N), 세린(S), 트레오닌(T); 2군: 시스테인(C), 세린(S), 티로신(Y), 트레오닌(T); 3군: 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 알라닌(A), 페닐알라닌(F); 4군: 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H); 5군: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W), 히스티딘(H); 그리고 6군: 아스파르트산(D), 글루탐산(E).
한 양태에서, 보수적 아미노산 치환은 같은 클래스의 다른 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 예를 들어, (1) 비극성: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp; (2) 비전하 극성: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; 및 (4) 염기성: Lys, Arg, His. 다른 보수적 아미노산 치환은 또한 다음과 같이 구성될 수 있다: (1) 방향족: Phe, Tyr, His; (2) 양성자 주개: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp; 및 (3) 양성자 받개: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln(미국 특허 번호 10106805 참고).
다른 양태에서, 보수적 치환은 표 A에 의거하여 이루어질 수 있다. 단백질 변형에 대한 허용의 예측 방법은 예를 들어 다음에서 찾을 수 있으며 그 전문이 참조문헌으로 여기에 포함된다: Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101(25):9205-9210 (2004).
[표 A]
Figure pct00001
한 양태에서, 형질도입 후 약 10일에 RD114TR 유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50%, 또는 약 35% 내지 약 45%이다. 한 양태에서, 형질도입 후 약 10일에 RD114TR-유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은 동일한 조건하에서 약 5% 내지 약 25%, 약 2% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 15% 또는 약 5% 내지 약 12%의 형질도입 후 제10일 VSV-G-유사형 벡터의 형질도입 유전자 발현에 대하여 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50% 또는 약 35% 내지 약 45%이다. 또 다른 양태에서, 형질도입 후 약 10일에 RD114TR-유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은 약 3.6%의 형질도입 후 제10일 VSV-G-유사형 벡터의 형질도입 유전자 발현에 대하여 약 40%이다.
또 다른 양태에서, 형질도입 후 약 5일에 RD114TR-유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은 약 20% 내지 약 50%, 약 15% 내지 30% 또는 약 20% 내지 약 30%이다. 한 양태에서, 형질도입 후 약 5일에 RD114TR-유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은 동일한 조건하에서 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25% 또는 약 17.5% 내지 20%의 형질도입 후 제5일 VSV-G-유사형 벡터의 형질도입 유전자 발현에 대해 약 20% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 30% 또는 약 20% 내지 약 30%이다. 또 다른 양태에서, 형질도입 후 약 5일에 VSV-G-유사형 벡터의 형질도입 유전자 발현이 약 19%인데 비해, 형질도입 후 제5일에 RD114TR-유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은 약 24%이다.
다른 양태에서, 형질도입 후 약 10일에 RD114TR-유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은, 형질도입 후 제10일에 VSV-G-유사형 벡터의 형질도입 유전자 발현에 대하여 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 11배, 또는 약 12배 이상이다.
한 양태에서, 본 개시는 T 세포의 형질도입을 위해 RD114TR 유사형(예: 서열 식별 번호 1)을 갖는 레트로바이러스의 사용 방법을 제공한다. 다른 양태에서, T 세포는 VSV-G 유사형(예: 서열 식별 번호 3)을 갖는 레트로바이러스와 비교해 RD114TR 유사형(예: 서열 식별 번호 1)을 갖는 레트로바이러스에 의해 더 효율적으로 형질도입된다. 다른 양태에서, RD114TR 외피가 렌티벡터를 유사형화하는 데 활용되며, 이것은 그 다음에 T 세포를 우수한 효율로 형질도입하는 데 사용된다.
조작된 γδ T 세포는 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 예들 들어, 종양 인식이 다른 도형의 인식 모이어티를 포함하는 발현 카세트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 트랜스포손/트랜스포사제 시스템 또는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템과 같은 바이러스 기반 유전자 전이 시스템 또는 형질주입, 전기천공, 형질도입, 리포펙션, 인산칼슘(CaPO4), Ormosil과 같은 나노조작 물질, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스 등의 바이러스 전달 방법 또는 다른 적합한 방법으로 γδ T 세포 안으로 안정하게 도입시킬 수 있다. 인간 유전자 요법을 위해 다수의 바이러스 방법이 사용되고 있으며, WO 1993/020221에 그 방법들이 기술되어 있고 그 전문이 여기에 참조문헌으로 포함된다. γδ T 세포의 조작에 사용 가능한 바이러스 방법의 비제한적 예에는 γ-레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 마마 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 방법이 포함될 수 있다.
도 14는 특정 암 항원 및 CD8에 대한 αβ-TCR과 같은 관심 대상의 외인성 유전자를 발현하는 RD114TR γ-레트로바이러스 인자 및 RD114TR 렌티바이러스 인자와 같은 바이러스 인자로 분리된 γδ T 세포 안으로 형질도입하여 조작될 수 있는 활성화된 T 세포를 보여준다. 바이러스 벡터는 핵과 세포질 mRNA 수준을 모두 증가시켜 형질도입 유전자의 발현을 강화하는 Woodchuck PRE(WPRE)와 같은 전사 후 조절 요소(PRE) 또한 함유한다. 쥐 RNA 운반 요소(RTE), 원숭이 레트로바이러스 1 유형(SRV-1)의 구성적 운반 요소(CTE) 및 인간 열충격 단백질 70(Hsp70 5′UTR)의 5' 미번역 영역 등 하나 이상의 조절 요소들 또한 WPRE와 조합하여 형질도입 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 형질도입을 한 번 또는 여러 번 실행하여 소규모(예: 24 내지 4-6 웰 플레이트) 또는 중/대규모로 1/2 내지 5일 동안(예: 1일) 안정한 형질도입 유전자 발현을 성취할 수 있다.
RD114TR은 쥐과 백혈병 바이러스의 세포질 꼬리(TR)에 융합된 고양이 내인성 바이러스(RD114)의 세포외 및 막통과 도메인을 포함하는 키메라 당단백질이다. 한 양태에서, 형질도입 후 10일에 RD114TR-유사형 레트로바이러스 벡터의 형질도입 유전자 발현은 VSV-G 유사형 벡터에 비해 더 높다.
VSV-G env, MLV 4070 env, RD114 env, 키메라 외피 단백질 RD114pro, 바큘로바이러스 GP64 env 또는 GALV env 혹은 이들의 유도체와 같은 기타 바이러스 외피 단백질 또한 사용될 수 있다.
한 양태에서, 조작된(또는 형질도입된) γδ T 세포는 항원 제시 세포나 아미노비스포스포네이트에 의해 자극 없이 생체 외에서 확장될 수 있다. 본 개시의 항원 반응성이 조작된 T 세포는 생체 외 및 생체 내에서 확장될 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시의 조작된 γδ T 세포의 활성 군집은 항원 제시 세포, 항원성 펩티드, 비펩티드 분자나 아미노비스포스포네이트와 같은 소분자 화합물에 의한 항원 자극 없이 그러나 특정 항체, 시토카인, 미토겐 또는 IL-17 Fc 융합, MICA Fc 융합 및 CD70 Fc 융합과 같은 융합 단백질을 사용하여 생체 외에서 확장될 수 있다. γδ T 세포군의 확장에 사용가능한 항체의 예에는 항-CD3, 항-CD27, 항-CD30, 항-CD70, 항-OX40, 항-NKG2D 또는 항-CD2 항체들이 포함될 수 있고, 시토카인의 예에는 IL-2, IL-15, IL-12, IL-21, IL-18, IL-9, IL-7 및/또는 IL-33이 포함될 수 있으며, 미토겐의 예에는 인간 CD70의 리간드인 CD27, 식물혈구응집소(PHA), 콘카나발린 A(ConA), 억세풀(PWM), 땅콩 단백질 응집(PNA), 대두 응집소(SBA), 렌스 컬리나리스 응집소(LCA), 피섬 사티범 응집소(PSA), 헬릭스 포마티아 응집소(HPA), 비시아 그라미네아 렉틴(VGA), 또는 T 세포 증식을 자극할 수 있는 다른 적합한 미토겐이 포함될 수 있다. 한 양태에서, 조작된 γδ T 세포의 군집은 60일 미만, 48일 미만, 36일 미만, 24일 미만, 12일 미만 또는 6일 미만 후에 확장시킬 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시는 입양 전이 요법을 위해 조작된 γδ T 세포의 군집에 대한 생체 외 확장을 위한 방법을 제공한다. 본 개시의 조작된 γδ T 세포는 생체 외에서 확장될 수 있다. 본 개시의 조작된 γδ T 세포는 APC에 의한 활성화 없이 또는 APC 및 아미노포스페이트와의 공동 배양 없이 시험관 내에서 확장시킬 수 있다.
다른 양태에서, γδ T 세포군은 36일 미만, 35일 미만, 34일 미만, 33일 미만, 32일 미만, 31일 미만, 30일 미만, 29일 미만, 28일 미만, 27일 미만, 26일 미만, 25일 미만, 24일 미만, 23일 미만, 22일 미만, 21일 미만, 20일 미만, 19일 미만, 18일 미만, 17일 미만, 16일 미만, 15일 미만, 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만 또는 3일 미만에 시험관 내에서 확장시킬 수 있다.
도 14a는시토카인(예: IL-2, IL-15, IL-18 및 기타)의 존재 하에서 소/중규모(예: 플라스크/G-Rex) 또는 대규모(예: 50 ml 내지 100 리터 백)로 7 내지 35일(예: 14 내지 28일) 동안 형질도입되거나 조작된 γδ T 세포의 확장을 실시할 수 있음을 보여준다. 그런 다음 확장시킨 형질도입된 T 세포 제제는 환자에게의 주입을 위해 "기성품" T 세포 제품으로 저온보존할 수 있다.
치료 방법
여기서 기술되는 조작된 γδ T 세포를 함유하는 조성물은 예방 및/또는 치료용으로 투여할 수 있다. 치료 용도의 경우, 이미 질병이나 질환을 앓는 시험대상자에게 해당 질병이나 질환의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 억제시키는 데 충분한 양의 약학 조성물을 투여할 수 있다. 조작된 γδ T 세포는 또한 질환의 진행, 발생 또는 악화의 가능성을 줄이기 위해 투여할 수 있다. 치료용의 경우, 조작된 γδ T 세포의 군집의 유효량은 질병이나 질환의 중증도 및 진행 과정, 이전 요법, 시험대상자의 건강 상태, 체중 및/또는 약물에 대한 반응 그리고/또는 치료 의사의 판단에 근거하여 다를 수 있다.
본 개시의 조작된 γδ T 세포는 질환, 예를 들어 여기서 기술된 암의 치료가 필요한 시험대상자의 치료에 사용할 수 있다.
시험대상자에서 γδ T 세포로 질환(예: 병)을 치료하는 방법은 조작된 γδ T 세포의 치료적 유효량을 시험대상자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시의 γδ T 세포는 다양한 용법(예: 시기, 농도, 용량, 치료 사이의 간격 및/또는 제형)으로 투여할 수 있다. 시험대상자는 또한 본 개시의 조작된 γδ T 세포를 투여받기 전에, 예를 들어, 화학요법, 방사선 또는 이의 병용으로 전처리를 받을 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 군집은 시험대상자에 대한 투여 전에 동결시키거나 저온보존도 할 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 군집은 동일하거나, 상이하거나, 동일 및 상이한 종양 인식 모이어티의 조합을 발현하는 2개 이상의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 γδ T 세포의 군집은 다른 항원, 또는 같은 항원의 다른 에피톱을 인식하도록 설계된 여러 별개의 조작된 γδ T 세포를 포함할 수 있다.
본 개시의 γδ T 세포는 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 한 양태에서, 고형 종양과 악성 혈액종양 등 암을 치료하는 데 본 개시의 조작된 γδ T 세포를 사용할 수 있다. 암의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 에이즈 관련 암, 에이즈 관련 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 신경모세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경아교종, 뇌실막세포종, 수포세포종, 천막위 원시 신경뇌배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경아교종과 같은 뇌종양, 유방암, 기관지 선종, 버킷 림프종, 원발 부위 불명의 암종, 중추신경계 림프종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 결합조직형성 소원형 세포 종양, 자궁내막암, 식도암, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양, 신경아교종, 털세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포(간) 암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 섬세포 암종, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 입술 및 구강암, 지방육종, 간암, 비소세포 및 소세포 폐암과 같은 폐암, 림프종들, 백혈병들, 고분자글로불린혈증, 뼈의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 흑색종들, 중피종, 잠복 원발 종양을 수반한 전이성 편평 경부암, 입 암, 다발성 내분비 종양 증후군, 골수형성이상 증후군, 골수성 백혈병, 비강 및 부비동암, 비인두 암종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 구강암, 구인두암, 골육종/뼈의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피암, 난소 생식세포암, 췌장암, 췌장암 섬세포, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배아종, 뇌하수체 선종, 흉막폐 아세포종, 혈장 세포 종양, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종, 신우 및 요관 이행 세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종, 피부암, 메르켈 세포 피부암종, 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 위암, T 세포 림프종, 인후암, 흉선종, 흉선 암종, 갑상선암, 융모성 종양(임신성), 원발 부위 불명의 암들, 요도암, 자궁암, 질암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 윌름스 종양.
한 양태에서, 본 개시의 조작된 γδ T 세포는 감염성 질병의 치료에 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시의 조작된 γδ T 세포는 감염성 질병의 치료에 사용될 수 있으며, 감염성 질병은 바이러스에 의해 유발될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시의 조작된 γδ T 세포는 자가 면역 질환과 같은 면역 질병의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시의 γδ T 세포에 의한 치료는 그 상태 해당 질환의 임상적 발병 이전, 도중동안 및 이후에 시험대상자에게 제공될 수 있다. 시험대상자에 대한 치료는 해당 질병의 임상적 발병 이후 1일, 1주, 6개월, 12개월, 또는 2년 이후에 제공될 수 있다. 시험대상자에 대한 치료는 해당 질병의 임상적 발병 이후 1일, 1주, 1개월, 6개월, 12개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 이상 동안 제공될 수 있다. 시험대상자에 대한 치료는 해당 질병의 임상적 발병 이후 1일, 1주, 1개월, 6개월, 12개월, 2년 미만 동안 제공될 수 있다. 치료는 또한 임상 시험에서 인간의 치료를 포함할 수 있다. 치료는 본 개시의 조작된 γδ T 세포를 포함하는 약학 조성물의 시험대상자에 대한 투여를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 시험대상자에 대한 본 개시의 조작된 γδ T 세포의 투여는 시험대상자 체내에서 내인성 림프구의 활성도를 조절할 수 있다. 다른 양태에서, 시험대상자에 대한 본 개시의 조작된 γδ T 세포의 투여는 내인성 T 세포에 대해 항원을 제공할 수 있으며 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 다른 양태에서, 기억 T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있다. 다른 양태에서, 기억 T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다. 다른 양태에서, 시험대상자에 대한 본 개시의 조작된 γδ T 세포의 투여는 다른 면역 세포의 세포 독성을 활성화시킬 수 있다. 다른 양태에서, 다른 면역 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다. 다른 양태에서, 다른 면역 세포는 자연 살해 T 세포일 수 있다. 다른 양태에서, 시험대상자에 대한 본 개시의 조작된 γδ T 세포의 투여는 조절 T 세포를 억제할 수 있다. 다른 양태에서, 조절 T 세포는 FOX3+ Treg 세포일 수 있다. 다른 양태에서, 조절 T 세포는 FOX3- Treg 세포일 수 있다. 본 개시의 조작된 γδ T 세포에 의해 활성도의 조절이 가능한 세포의 비제한적 예는 다음을 포함할 수 있다: 조혈 줄기 세포; B 세포; CD4; CD8; 적혈구; 백혈구; 수지상 항원 제시 세포 등 수지상 세포; 백혈구; 대식세포; 기억 B 세포; 기억 T 세포; 단핵세포; 자연 살해 세포; 호중성 과립구; T-조력자 세포; 및 T-살해 세포.
대부분의 골수 이식 동안, 시험대상자의 면역계에 의한 이식되는 조혈 줄기 세포(HSC)의 거부를 방지하기 위해 시클로포스파미드 및 전신 방사선 조사의 병용이 전통적으로 사용될 수 있다. 한 양태에서, 공여자 골수와 인터루킨-2(IL-2)의 생체 외 배양을 수행하여 골수에 있는 살해 림프구의 생성을 강화시킬 수 있다. 인터루킨-2(IL-2)는 야생형 림프구의 성장 증식 및 분화에 필요할 수 있는 시토카인이다. γδ T 세포의 인간으로 입양 이전에 대한 현재 연구는 γδ T 세포 및 인터루킨-2의 공동투여를 필요로 할 수 있다. 하지만 저용량 및 고용량의 IL-2는 고독성 부작용을 초래할 수 있다. IL-2 독성은 복수의 기관/계에서, 가장 유의하게는 심장, 폐, 신장 및 중추신경계에서 나타날 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시는 자연 시토카인이나 IL-2, IL-15, IL-12, IL-21과 같은 변형된 버전의 공동투여 없이 시험대상자에 대한 γδ T 세포의 투여 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 조작된 γδ T 세포를 IL-2의 공동투여 없이 시험대상자에게 투여할 수 있다. 다른 양태에서, 골수 이식과 같은 시술 동안 조작된 γδ T 세포를 IL-2의 공동투여 없이 시험대상자에게 투여할 수 있다.
투여 방법
하나 또는 복수의 조작된 γδ T 세포군이 어떤 순서로든지 또는 동시에 시험대상자에게 투여될 수 있다. 동시에 투여하는 경우, 복수의 조작된 γδ T 세포군을 정맥내 주사와 같은 단일의 통일된 형태, 또는 복수의 정맥내 주입, s.c. 주사 또는 알약과 같은 복수의 형태로 제공할 수 있다. 조작된 γδ T 세포를 단일 포장으로 또는 복수의 포장으로 함께 또는 따로 포장할 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 하나 또는 모두를 복수의 용량으로 투여하는 것이 가능하다. 동시에 투여하지 않는 경우, 복수 투여 간의 시간 간격은 약 1주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년까지로 다를 수 있다. 다른 양태에서, 조작된 γδ T 세포는 시험대상자에 대한 투여 후 시험대상자의 체내에서 확장할 수 있다. 조작된 γδ T 세포는 동일한 세포 조제를 사용한 복수의 치료를 위해 세포를 제공하도록 동결할 수 있다. 본 개시의 조작된 γδ T 세포 및 동일한 것을 포함하는 약학 조성물을 키트로 포장할 수 있다. 키트에는 조작된 γδ T 세포 및 동일한 것을 포함하는 조성물의 사용에 대한 지시사항(예: 사용설명서)을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 암의 치료 방법은 치료적 유효량의 조작된 γδ T 세포의 시험대상자에 대한 투여를 포함하며, 그 투여는 암을 치료한다. 다른 구현예에서, 치료적 유효량의 조작된 γδ T 세포를 적어도 약 10초, 30초, 1분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 동안 투여할 수 있다. 다른 양태에서 치료적 유효량의 조작된 γδ T 세포를 적어도 1주 동안 투여할 수 있다. 다른 양태에서, 치료적 유효량의 조작된 γδ T 세포를 적어도 2주 동안 투여할 수 있다.
여기서 기술된 조작된 γδ T 세포는 질환이나 질병의 발생 이전, 도중 또는 이후에 투여할 수 있으며, 조작된 γδ T 세포를 함유하는 약학 조성물 투여의 시기는 다를 수 있다. 예를 들어, 조작된 γδ T 세포를 예방용으로 사용할 수 있으며, 질환이나 질병의 발생 가능성을 감소시키기 위해 질병이나 질환에 대한 경향이 있는 시험대상자에게 계속적으로 투여할 수 있다. 조작된 γδ T 세포를 증상의 발생 동안이나 발생 이후 가능한 한 조속히 시험대상자에게 투여할 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 투여는 증상 발생 후 즉시, 증상 발생 후 첫 3시간 이내, 증상 발생 후 첫 6시간 이내, 증상 발생 후 첫 24시간 이내, 증상 발생 후 첫 48시간 이내 또는 증상 발생 후 임의의 기간 이내 즉시 개시할 수 있다. 초기 투여는 여기서 기술된 일체의 조제를 사용하여 여기서 기술된 일체의 경로에 의한 것과 같이 실용적인 일체의 경로를 통할 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시의 조작된 γδ T 세포의 투여는 정맥 내 투여일 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 하나 또는 복수의 용량을, 암, 감염성 질환, 면역 질환, 패혈증의 발병 후 또는 골수 이식과 함께 실행 가능한 한 조속하게, 그리고 면역 질환의 치료를 위해 필요한 시간 동안, 예를 들어 약 24시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 1주, 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 1개월, 약 1개월 내지 약 3개월 동안 투여할 수 있다. 암의 치료를 위해, 조작된 γδ T 세포의 하나 또는 복수의 용량을 암 발병 후 수년 후에 그리고 기타 치료제 투여 전이나 후에 투여할 수 있다. 다른 양태에서, 조작된 γδ T 세포를 적어도 약 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 1주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 동안 투여할 수 있다. 치료 기간은 시험대상자에 따라 달라질 수 있다.
보존
한 양태에서, 동결 배지에서 γδ T 세포를 조제한 다음, 액체 질소 냉동기(-196oC) 또는 초저온 냉동기(-65oC, -80oC, -120oC, 또는 -150oC)에 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 3년 또는 적어도 5년의 장기 보관을 위해 배치할 수 있다. 동결 배지는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 및/또는 염화 나트륨(NaCl), 및/또는 덱스트로스 및/또는 황산 덱스트란 및/또는 히드록시에틸 전분(HES) 그리고 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.5 내지 약 7.0, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.5 내지 약 8.0 또는 약 6.5 내지 약 7.5로 pH를 유지하는 생리적 pH 완충제를 포함할 수 있다. 저온보존된 γδ T 세포를 해동하여 여기서 기술된대로 항체, 단백질, 펩티드 및/또는 시토카인을 사용한 자극으로 더 처리할 수 있다. 저온보존한 γδ T 세포를 해동한 다음 여기서 기술된 바이러스 벡터(레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 렌티바이러스 벡터들) 또는 비바이러스 수단(RNA, DNA(예: 트랜스포손) 및 단백질 등)으로 유전적으로 변형시킬 수 있다. 변경된 γδ T 세포를 추가로 저온보존하여 동결 배지에서 적어도 약 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 적어도 약 1010개 세포/mL의 농도로 적어도 약 1, 5, 10, 100, 150, 200, 500개 바이알의 수량으로 세포 은행을 생성할 수 있다. 저온보존한 세포 은행은 자체의 기능성을 유지할 수 있으며 해동한 다음 추가로 자극 및 확장시킬 수 있다. 다른 양태에서, 해동된 세포를 세포 배양 백 및/또는 생물반응기와 같은 적절한 밀폐 용기에서 자극 및 확장시켜 동종이형 세포 제제로 세포의 수량을 생성할 수 있다. 저온보존한 γδ T 세포는 저온 보관 조건하에서 적어도 약 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 15개월, 18개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 40개월, 50개월 또는 적어도 약 60개월 동안 그 생물적 기능을 유지할 수 있다. 다른 양태에서, 해당 제형에 어떠한 보존제도 사용할 수 있다. 저온보존한 γδ T 세포를 해동하여 동종이형 기성품 세포 제제로 다수의 환자에게 주입할 수 있다.
한 양태에서, 여기서 기술된 γδ T 세포는 적어도 1x103 세포/ml, 적어도 2x103 세포/ml, 적어도 3x103 세포/ml, 적어도 4x103 세포/ml, 적어도 5x103 세포/ml, 적어도 6x103 세포/ml, 적어도 7x103 세포/ml, 적어도 8x103 세포/ml, 적어도 9x103 세포/ml, 적어도 1x104 세포/ml, 적어도 2x104 세포/ml, 적어도 3x104 세포/ml, 적어도 4x104 세포/ml, 적어도 5x104 세포/ml, 적어도 6x104 세포/ml, 적어도 7x104 세포/ml, 적어도 8x104 세포/ml, 적어도 9x104 세포/ml, 적어도 1x105 세포/ml, 적어도 2x105 세포/ml, 적어도 3x105 세포/ml, 적어도 4x105 세포/ml, 적어도 5x105 세포/ml, 적어도 6x105 세포/ml, 적어도 7x105 세포/ml, 적어도 8x105 세포/ml, 적어도 9x105 세포/ml, 적어도 1x106 세포/ml, 적어도 2x106 세포/ml, 적어도 3x106 세포/ml, 적어도 4x106 세포/ml, 적어도 5x106 세포/ml, 적어도 6x106 세포/ml, 적어도 7x106 세포/ml, 적어도 8x106 세포/ml, 적어도 9x106 세포/ml, 적어도 1x107 세포/ml, 적어도 2x107 세포/ml, 적어도 3x107 세포/ml, 적어도 4x107 세포/ml, 적어도 5x107 세포/ml, 적어도 6x107 세포/ml, 적어도 7x107 세포/ml, 적어도 8x107 세포/ml, 적어도 9x107 세포/ml, 적어도 1x108 세포/ml, 적어도 2x108 세포/ml, 적어도 3x108 세포/ml, 적어도 4x108 세포/ml, 적어도 5x108 세포/ml, 적어도 6x108 세포/ml, 적어도 7x108 세포/ml, 적어도 8x108 세포/ml, 적어도 9x108 세포/ml, 적어도 1x109 세포/ml, 약 1x103 세포/ml부터 적어도 1x108 세포/ml까지, 약 1x105 세포/ml부터 적어도 약 1x108 세포/ml 또는 약 1x106 세포/ml부터 약 1x108 세포/ml까지의 양으로 조성물에 존재할 수 있다.
가능한 동종이형 T 세포 제제, 예를 들어 종양 항원 특이적 TCR을 발현하도록 조작가능한(예: 키메라 CD8α-CD4tm/세포 내 단백질(도 12a 및 도 12b)을 개발하기 위해, 본 개시의 구현예들은 γδ T 세포의 수율을 최대화할 수 있으며 최종 동종이형 제제의 잔류 αβ T 세포의 존재를 최소화할 수 있는 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 구현예는 T 세포의 고갈에 의한 γδαβ T 세포의 확장 및 활성화 그리고 암포테리신 B, N-아세틸 시스테인(NAC)(또는 고용량 글루타민/글루타맥스), IL-2 및/또한 IL-15와 같은 분자로 성장 배지의 보충의 방법을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 여기서 기술된 방법을 사용하여 본 개시의 한 양태에 따라 자가 또는 동종 제제를 생산할 수 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참조하여 더 잘 이해할 수 있으며, 이는 본 청구범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
백혈구 성분 채집 산물의 처리
백혈구 성분 채집 산물(예: LeukoPak®)은 다음과 같이 처리할 수 있다: LeukoPak® 백의 한쪽 끝을 알코올 면봉으로 문지른 다음 면도칼 날로 잘라서 플라스크에 흘려 담을 수 있다. 그 부피를 행크 용액으로 약 500 ml까지 희석한 다음 50 ml 용량의 16 내지 29개의 시험관에 시험관 당 30 ml로 분주할 수 있다. 시험관을 제동 및 가속화 없이 400 g에서 30분 동안 회전시킬 수 있다. 백색 액체가 흡입될 수 있으며, 새 50 ml 시험관을 중간 정도까지 채운 다음 25 ml PBS를 그 위에 첨가할 수 있다. 이 절차를 총 3회의 세척 동안 2회 추가로 반복할 수 있다. 마지막 세척 전에 혈구계를 사용하여 세포를 계수할 수 있다. 수율은 시험관당 1x108개 세포가 든 30 내지 60개의 시험관일 수 있다.
실시예 2
αβ T 세포의 고갈
도 1a는 αβ PBMC로부터 T 세포의 고갈을 보여준다. 제조사의 프로토콜에 따라 피콜 후 PBMC를 비오틴-접합 TCR 항체와 함께 배양한 다음 스트렙타비딘-마이크로비드와 배양했다. 그런 다음 샘플을 LS 컬럼을 통과시켜 αβ-TCR-발현 세포를 강화시켰다. 컬럼 통과액은 αβ-TCR이 고갈된 분획을 나타낸다. 하룻밤 동안 배양 후, αβ-TCR 강화된 분획 및 αβ-TCR 고갈된 분획을 플루오로크롬 접합 αβ-TCR 항체 대 Vγ9 항체로 염색한 다음 유세포 분석을 실행했다. 데이터에 따르면, αβ-TCR 강화된 분획은 Vγ9δ2 세포를 포함하지 않는(0%) 반면 거의 모든 Vγ9δ2 세포가 αβ-TCR 고갈된 분획에서 강화됨을(45%) 보여준다.
비슷하게, 백혈구 성분 채집 산물에서 얻어진 세포를 제조사 프로토콜에 따라 비오틴 접합 αβ-TCR 항체와 함께 배양한 다음 스트렙타비딘 마이크로비드와 배양할 수 있다. 그런 다음 샘플을 LS 컬럼을 통과시켜 αβ-TCR 발현 세포에 대해 강화했다. 컬럼 통과액은 αβ-TCR이 고갈된 분획을 나타낸다. 하룻밤 동안 배양 후 αβ-TCR 고갈된 분획을 플루오로크롬 접합 αβ-TCR 항체 대 γδ TCR 항체로 염색한 다음 유세포 분석을 실행했다. 도 1e는 백혈구 성분 채집 산물 내 시작 세포가 최소(4.14%) Vγ9δ2 세포를 포함하는 반면, 거의 모든 Vγ9δ2 세포가 αβ-TCR 고갈된 분획에서 강화되는(95.5%) 것을 보여준다. 한 양태에서, 상기 언급된 방법을 사용하여 Vγ9δ2 세포가 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 넘게 강화될 수 있다.
도 1b 및 도 1c는 αβVγ9δ2T 세포 제제의 최소 잔여 T 세포를 보여준다. αβ 비오틴화 항-αβ-TCR 항체/스트렙타비딘 마이크로비드를 사용하여 정상 공여자(공여자 A, 공여자 B, 공여자 C, 공여자 12 및 공여자 13)의 PBMC로부터 T 세포가 고갈시켰다. αβ T 세포 고갈된 PBMC를 14일 동안 졸레드로네이트/IL-2/IL-15와 배양한 다음 각각의 플로오로크롬 접합 합체(예: 항-αβ-TCR 항체 및 항-γδ TCR 항체)로 염색하며 αβCD3 상에서 서브게이팅으로 잔류 αβ T 세포와 강화된 T 세포를 평가했다. 이 결과에 따르면, αβ T 세포 고갈된 γδ T 세포가 강화되었으며, 즉 90.1%(공여자 A), 78.6%(공여자 B), 28.9%(공여자 C), 89%(공여자 12) 및 74%(공여자 13) 강화되었음을 보여준다. 또한, αβ T 세포 고갈된 γδ T 세포는 최저 잔여 αβ T 세포, 즉 0.02%(공여자 A), 0.05%(공여자 B), 0.2%(공여자 C), 0.4%(공여자 12) 및 1%(공여자 13)를 각각 포함한다. 최저 잔여 αβ T 세포가 중요하며, 이는 예를 들어 반일치 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)에서 αβ 0.2 내지 0.6% 범위의 잔여 T 세포는 만성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 초래하지 않아서 이러한 αβ T 세포 고갈된 γδ T 세포를 안전한 동종이형 제제로 만들기 때문이다.
도 1d는 Vγ9δ2 세포의 시토카인 프로파일링을 보여준다. αβ 졸레드로네이트/IL-2/IL-15와 함께 배양한 T 세포-고갈된 PBMC를 세포 수확 전 6시간 동안 골지 스톱/플러그(Golgi Stop/Plug)(즉, 단백질 운반 억제제)로 처리했다. 세포를 표면 Vδ2에 대해 염색한 다음 고정 및 투과 처리했다. 세포 내 TNF-α, IL-17a 및 IFN-γ의 염색은 TNF-α, IL-17a 및 IFN-γ에 대한 플루오로크롬 접합 항체를 사용하여 수행했다. 이 결과는 TNF-α, IL-17a 및 IFN-γ가 Vγ9δ2 세포의 12%, 0.2% 및 4% 비율로 각각 발현되었음을 보여준다. IL-17 개입에 따른 IL-15 매개 억제는 IL-17을 생성하는 Vγ9δ2 T 세포의 낮은 양(즉, 0.2%)으로 나타난다.
실시예 3
αβ T 세포 고갈된 PBMC의 활성화 및 확장
무반응에 대한 개입 없는 최대의 T 세포 활성화, 증식 및 생존에는 3가지 신호가 필요할 수 있다: TCR을 통해 유도되는 신호 1, 공동 자극 분자를 통해 유도되는 신호 2, 그리고 성장 인자 신호전달을 통해 유도되는 신호 3.
도 2 및 도 3은 본 개시의 구현예에 따른 활성화 단계 및 확장 단계를 각각 보여준다. 활성화 단계 및 확장 단계는 2개의 연속 단계일 수 있다. 예를 들어, 활성화 단계 동안(도 2), 아미노비스포스포네이트(예: 졸레드로네이트(ZA)) 또는 인항원(예: IPP) 그리고 시토카인(예: IL-2 및/또는 IL-15)이 존재할 수 있다. 반면에 확장 단계 동안(도 3), 아미노비스포스포네이트나 인항원(예: IPP)이 없는 상태에서 시토카인이 계속 존재할 수 있다. 활성화 단계(도 2)는 첫 14일 동안 발생할 수 있으며, 이때 아미노비스포스포네이트나 인항원(예: IPP)을 첨가하고 씻어내지 않는다. 확장 단계(도 3)는 제15일부터 시작될 수 있으며, 이는 제14일의 마지막에 아미노비스포스포네이트 또는 인항원(예: IPP)을 함유하는 모든 배지를 제거하고 아미노비스포스포네이트나 인항원(예: IPP)의 부재하에서 배지를 시토카인으로 대체하여 활성화된 세포를 수집할 수 있기 때문이다. 이와 대조적으로, Vγ9δ2 졸레드로네이트-매개 생성의 전통적인 프로토콜은 흔히 제1 내지 14일을 활성화/확장으로 칭하는 데 이것은 그러한 조건하에서 세포가 14일 이후에 생존할 수 없기 때문이다. 본 개시에서는, 제1 내지 14일을 활성화 단계라 칭하며, 이것은 아미노비스포스포네이트(예: 졸레드로네이트) 또는 인항원(예: IPP)이 존재하기 때문이고, 제15일 이후를 확장 단계라 칭하며 이것은 세포가 전통적인 14일 절차 이후 계속 생존하여 확장될 수 있기 때문이다.
도 2는 아미노비스포스포네이트로 유도되는 γδ TCR/IPP 상호작용을 통해 유발되는 신호 1을 보여주며, 이는 팔미드론산, 알렌드론산, 졸레드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 이들의 염 및/또는 이들의 수화물; 또는 인항원(예: (E)-4-히드록시-3-메틸-부트-2-에닐 피로포스페이트(HMBPP), 이소프레노이드 피로포스페이트(파르네실 피로포스페이트(FPP)), 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP), 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP) 및 디메틸알릴디포스페이드(DMAPP)를 포함할 수 있으며 이는 증식을 위해 Vγ9δ2 T 세포를 활성화한다. 예를 들어, 졸레드로네이트(졸레드론산(ZA) 또는 Zometa)가 단핵구(Mo)에서 메발로네이트 경로를 억제함으로써 단핵세포 상에 표시된 IPP와 같은 인항원(ZA-Mo)의 축적을 초래하여, PKC 신호전달을 통해 γ9δ2 TCR/CD3을 활성화하고 증식을 유도함으로 신호 1의 역할을 한다. IPP 자체는 또한 γδ TCR에 결합하여 T 세포에 대해 직접 작용할 수 있으며γ9δ2, 따라서 단핵세포에 대한 필요를 없앤다.
도 2는 또한 암포테리신 B(FDA 승인받은 암비솜)와 같은 공동 자극 분자 즉, TLR2 리간드를 통해 유도되는 신호 2를 보여준다. 예를 들어, 암포테리신 B는 두 가지의 가능한 기전을 통해 γδ T 세포를 자극할 수 있다. 첫째, 신호 2의 역할을 하는 암포테리신 B는 공동자극 분자로 γδ T 세포에 작용하여 γδ T 세포 활성화, 증식 및 IFN-γ 생성을 공동자극하며 T 세포에 대한 Vδ2 T 세포의 면역억제 활성도를 감소시킬 수 있다. 암포테리신 B는 또한 CD25의 증진제 역할을 할 수 있으며, 이는 IL-2(IL-2Rα)의 고친화도 수용체로 IL-2에 대한 반응성을 증가시켜 신호 3을 통해 증식을 자극한다. 둘째, 신호 3의 역할을 하는 암포테리신 B는 단핵세포(ZA-Mo)에 작용하여 IL-18의 분비를 촉진시킬 수 있으며 이것은 CD25 발현을 강화시키고 중앙 기억 T 세포를 선호할 수 있으며, 또한 IL-15의 분비를 촉진시킬 수 있으며 이에 따라 작용기 Vγ9δ2 T 세포의 생성과 IL-17 개입 세포의 차단을 강화시킬 수 있다. 암포테리신 B의 적절한 대용물에는 차의 L-테아닌, 사과의 탄닌 및 크랜베리 및 표고 버섯의 폴리페놀과 같은 자연 추출물이 포함될 수 있다.
CD86 및 41BBL과 같은 공동자극 분자와 함께 Vγ9δ2 배양액을 보충한 결과 그 증식이 강화되었다. 본 개시의 구현예에는 αβ T 세포 고갈된 PBMC 또는 αβ T 세포 고갈된 백혈구 성분 채집 산물이 포함될 수 있으며, 여기서 골수성 세포가 주된 세포군일 수 있다. 골수성 세포는 메발로네이트 경로를 억제하는 졸레드로네이트를 섭취하여 IPP의 축적을 초래하는데, 이것은 분비된 형태로 발현되거나 골수성 세포에 막 결합된 형태로 제시될 수 있다. 골수성 세포는 또한 우수한 항원 제시 세포이며, 분화의 여러 단계에서 다양한 공동자극 분자를 발현한다.
더욱이, γδ T 세포는 또한 다양한 공동자극 분자를 발현할 수 있다. 따라서, αβ 고갈된 PBMC나 αβ T 세포가 고갈된 백혈구 성분 채집 산물을 졸레드로네이트 처리 동안 높은 세포 밀도에서 배양하여 골수성 세포 그리고 확장되는 γδ T 세포 상 모두에 존재하는 공동자극 분자의 참여를 원활하게 할 수 있으며, 그에 따라 Vγ9δ2 T 세포의 활성화, 증식 및 생존이 강화된다. 예를 들어, 외인성 IL-2(10 내지 1000 U/ml, 바람직하게 20 내지 500 U/ml, 더욱 바람직하게 50 내지 100 U/ml)를 CD4 조력자 T 세포(IL-2 분비)가 T 세포 고갈된 세포의 가운데 있는 αβ고갈된 PBMC나 αβ T 세포 고갈된 백혈구 성분 채집 산물에 첨가함으로써 활성화 및 확장 동안 생존과 증식을 유지할 수 있다. 외인성 IL-15(10 내지 1000 ng/ml, 바람직하게 20 내지 500 ng/ml; 더욱 바람직하게 50 내지 100 ng/ml)를 높은 세포 밀도 배양액에 사용하여, 도 1d(중간 패널)에 나온대로 IL-17 생성 Vγ9δ2 T 세포의 발생을 억제하여 Vγ9δ2 활성화를 최대화할 수 있으며, 이로써 γδ T 세포 증식이 강화되고 자연 Vγ9δ2 T 세포의 작용기 세포로의 분화를 촉진시킨다. 그러므로 고밀도 배양액은 T 세포 상에서 CD28, CD86, CD83, CD80을 발현하는 γδ-γδ T 세포들 사이의 상호 공동자극 작용을 이용한다. 예를 들어, CD86 및/또는 CD80과 상호작용하는 CD28 공동자극 분자는 γδ T 세포 생존 및 증식을 강화시킬 수 있다.
T 세포 표현형 및 세포사에 대한 세포 밀도의 영향을 결정하기 위해, 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 14일 동안의 활성화 이후, 고밀도(예: 2 x 106 세포/ml) 및 저밀도(예: 0.5 x 106 세포/ml)의 졸레드로네이트 부재하에서 Vγ9δ2 T 세포를 항상성 시토카인(예: IL-2 및 IL-15)으로 확장시킨 다음 T 세포 표지자 분석을 실행했다. 도 4a는 면역표현형 표지자(예: CD122, CD80, CD83, CD86, CD95 및 CD95L)가 세포 밀도에 의해 Vγ9δ2 T 세포에서 영향을 받지 않았음을 보여주며, 이는 고밀도 및 저밀도에서 배양된 Vγ9δ2 T 세포에서 표지자 발현에 대한 유의한 차이가 없기 때문이다. 하지만 도 4b는 확장 동안 저밀도에서의 세포사(51%)와 비교하여 고밀도에서는 세포사의 상당한 감소(20%)를 보여준다. 이 결과는 고밀도(예: 적어도 1 x 106 세포/ml)에서의 Vγ9δ2 T 세포의 확장이 세포사의 감소로 세포 생존을 촉진시킬 수 있음을 시사한다.
도 5는 암포테리신 B의 포함이 CD25(또는 IL-2Rα)를 발현하는 Vδ2(즉, Vγ9δ2) T 세포의 비율(%)을 증가시킴을 보여준다. 간단히 말하면, 제0일에 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15로 보충시킨 활성화 배지에서 αβ-고갈된 PBMC를 배양했다. 48시간 후, 암포테리신 B를 첨가했으며, 다시 48시간 후 CD3+/Vδ2 T 세포 상의 CD25(또는 IL-2Rα) 표면 발현의 유세포 기반 분석을 위해 세포를 수확했다. 이 결과는 미처리된 αβ 고갈된 PBMC에서 CD25 발현 Vδ2 T 세포의 비율(0.55%)에 비해, 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15의 처리가 그 비율을 16%로 증가시킴을 보여준다. 하지만 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15에 대한 암포테리신 B의 첨가는 Vδ2 T 세포의 비율을 16%(암포테리신 B 없음)에서 29%(암포테리신 B 있음)로 증가시킨다. 이 결과는 암포테리신 B가 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15가 신호 2 및 3을 통해 확장시키고 활성화시킨 Vδ2 T 세포를 더욱 확장시킬 수 있음을 보여준다.
도 6은 IL-2, IL-15 및 암포테리신 B를 포함하는 정의된 배지에서 졸레트로네이트(Zometa)를 사용한 γδ T 세포 확장을 보여준다. 제0일부터 제17일까지, 제1일부터 제22일까지 및 제0일부터 제29일까지 공여자 20의 γδ T 세포의 절대 숫자에 대한 배수 증가는 각각 3,350배, 11,060배 및 31,666배이다. 비슷하게, 제0일부터 제17일까지, 제0일부터 제22일까지 및 제0일부터 제29일까지 공여자 21의 γδ T 세포의 절대 숫자에 대한 배수 증가는 각각 4,633배, 12,320배 및 32,833배이다. 대조적으로, 앞서 언급한 바와 같이 고전적 Vγ9δ2 T 세포 확장 프로토콜은 14일까지 총 Vγ9δ2 T 세포에 대해 단 100배 증가만 가져올 수 있었고, 그 이후 확장 비율이 감소하는데 이는 세포사의 증가에 의한 것일 수 있다. 한 양태에서, 앞서 언급된 방법을 사용한 결과 제0일에 γδ T 세포의 절대 숫자에 비해 제29일에 확장 후 절대 숫자의 배수 증가는 약 1,000배에서 약 40,000배까지, 약 3,000배에서 약 35,000배까지, 약 5,000배에서 약 35,000배까지, 약 6,000배에서 약 35,000배까지, 약 7,000배에서 약 35,000배까지, 약 8,000배에서 약 30,000배까지, 약 10,000배에서 약 35,000배까지, 약 15,000배에서 약 35,000배까지, 약 20,000배에서 약 35,000배까지, 약 25,000배에서 약 35,000배까지, 약 30,000배에서 약 35,000배까지, 약 10,000배 초과, 약 15,000배 초과, 약 20,000배 초과, 약 25,000배 초과, 약 30,000배 초과, 약 40,000배 초과일 수 있다.
호중구(혈액 내 가장 풍부한 백혈구)는 γδ T 세포의 성장과 생존을 약화시킬 수 있다. 그러므로 호중구의 제거나 비활성화는 γδ T 세포의 성장과 생존을 촉진시킬 수 있다. 이를 성취하려면 단백분해효소 3, 엘라스타아제 및 카텝신 G와 같은 호중구 단백분해효소를 사용하여 IL-2의 단백질분해성 절단 및 부티로필린 3A1(CD277)의 조절을 통해 (1) 호중구 증식, (2) 시토카인 생성 및 (3) T 세포의 세포독성을 억제할 수 있다. 그 밖에, 복합균 패혈성 생쥐에서 관찰된 바와 같이, 글루타민 및/또는 N-아세틸 시스테인(NAC)의 투여는 호중구의 숫자를 감소시키고 γδ T 세포의 백분율을 증가시킨다. 또한 LPS 유도 급성 폐 손상 래트에서 관찰된 바와 같이, 글루타민 보충은 γδ T 세포에서 세포자멸사의 비율을 감소시키는데, 이는 부분적으로 항산화제인 글루타치온(GSH) 합성을 강화시켜 자유 라디칼의 손상 영향 즉, 텔로미어 미란을 감소시키기 때문이다. 이러한 관찰에 근거할 때, 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 본 개시의 구현예는 또한 자유 라디칼 매개 손상에 저항하고 T 세포 복제 잠재성을 유지하기 위해 배양액을 고용량 글루타민/글루타막스(또는 저용량 N-아세틸 시스테인(NAC), 예: 1 내지 10 mM, 바람직하게 2.5 내지 7 mM)로 보충하여 배양액 확장을 최대화하는 것을 포함한다. NAC나 고용량 글루타민/글루타막스는 높은 GSH 세포 내 수준을 유지하며 배양액 내 단핵세포와 호중구로부터의 높은 자유 라디칼(반응성 산소 종(ROS)) 생성에 대한 맞균형을 유지할 수 있다. 더욱이, 도 2에서 보는 바와 같이,이부프로펜(시콜로-옥시게나아제-2(COX-2) 억제제)은 단핵세포에서 COX-2(ZA-Mo)의 암포테리신 B-매개 활성화에 대한 길항작용이 가능하므로 단핵세포와의 공동배양 동안 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 축적을 제한할 수 있다. 발데콕시브, 로페콕시브, 셀리콕시브와 같은 다른 COX-2 억제제 또한 사용할 수 있다.
실시예 4
RD114TR 유사형 레트로바이러스 벡터를 사용한 Vγ9δ2 T 세포의 TCR 조작
도 7은 Vγ9δ2 T 세포 내로의 바이러스 형질도입에 대한 시간 표를 보여준다. 신선한 백혈구에서 αβ T 세포를 고갈시킨 다음 IL-2 및 IL-15 존재 하에서 졸레드로네이트를 사용하여 최소 1일이나 최대 7일 동안 활성화시킨다. γδ T 세포는 αβ-TCR 및/또는 CD8을 발현하는 바이러스 상층액을 사용한 활성화 이후 24 내지 168시간 사이에 형질도입시킬 수 있다.
본 개시의 방법으로 제조된 Vγ9δ2 T 세포가 여러 외피 단백질을 발현하는 바이러스에 의한 바이러스 형질도입에 적합한지를 결정하기 위해, 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 γ-레트로바이러스(예: 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 유사형(서열 식별 번호 4) 및 RD114TR 유사형(서열 식별 번호 1)) 및 GFP 발현 렌티바이러스(예: VSV-G 유사형(예: 서열 식별 번호 3))를 사용하여 이러한 Vγ9δ2 T 세포 내로의 형질도입 효율을 시험했다. 또한, VSV-G 및 RD114TR과의 CD8α 발현 렌티바이러스(LV) 유사형을 사용하여 이러한 Vγ9δ2 T 세포 내로의 형질도입 효율을 시험했다.
도 8a는 형질도입 후 5일에 GFP 발현이 GALV 유사형의 경우 12%, RD114TR 유사형의 경우 34% 그리고 VSV-G 유사형의 경우 46%임을 각각 보여준다. 하지만 형질도입 후 10일에는 RD114TR 유사형이 GFP 발현을 40%로 유지한 반면, GALV 유사형 및 VSV-G 유사형의 GFP 발현은 각각 7% 및 3.6%로 감소했다. 이 결과는 RD114TR-유사형 γ-레트로바이러스가 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15-확장 Vγ9δ2 T 세포에서 안정한 유전자 발현을 위한 최적의 유전자 전달 방법일 수 있음을 시사한다.
도 8b는 Vγ9δ2 T 세포를 RD114TR과의 LV 유사형으로 형질도입했을 때, 형질도입 후 4일에 Vγ9δ2 T 세포 상의 CD8α 발현 범위가 63.2%(2.18 μl LV 사용)부터 95.8%(35 μl LV 사용)까지였음을 보여준다. 반면에, Vγ9δ2 T 세포를 VSV-G와의 LV 유사형으로 형질도입했을 때, Vγ9δ2 T 세포 상의 CD8α 발현 범위가 17.9%(2.18 μl LV 사용)부터 31.2%(35 μl LV 사용)까지였다. VSV-G가 가장 흔히 사용되는 외피이며 RD114TR이 γ-레트로바이러스의 유사형화에 일반적으로 사용되기는 하지만, 이 결과는 RD114TR 유사형 렌티바이러스를 Vγ9δ2 T 세포의 형질도입에 사용할 수 있을뿐 아니라 VSV-G 유사형 렌티바이러스보다 Vγ9δ2 T 세포 내로의 형질도입 효율이 더 높음을 보여준다.
실시예 5
αβ-TCR 및 CD8αβ를 발현하는 γδ T 세포의 조작
본 개시의 조작된 γδ T 세포는 질환의 치료를 필요로 하는 시험대상자의 치료에 사용될 수 있다. TAA/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 αβ-TCR을 발현하는 γδ T 세포의 조작을 위해, αβ-TCR 발현 γ-레트로바이러스(αβ-TCR 바이러스)를 생성했다. γδ T 세포가 CD8을 발현하지 않을 수 있으므로, 표적 세포(예: 암 세포)의 세포막에 있는 TAA/MHC-I 복합체를 인식하려면 γδ T 세포는 αβ-TCR 외에 CD8을 필요로 할 수 있다. 이를 위해, CD8 발현 γ-레트로바이러스(CD8 바이러스)를 생성하였다.
조작된 γ-레트로바이러스에 의한 Vγ9δ2 T 세포의 형질도입 효율을 결정하기 위해, 졸레드로네이트 활성화된 Vγ9δ2 T 세포를 IL-2 및 IL-15로 보충한 정의된 배지에서 MOI 3으로 αβ-TCR 바이러스 및/또는 CD8 바이러스로 형질도입했다. 형질도입 효율은 TAA/MHC-PE 덱스트라머(또는 음성 대조 NYESO-PE 덱스트라머)에 의한 염색 그리고 이후의 CD3, CD8α 및 Vδ2 염색에 의해 형질도입 후 96시간에 측정했다. MacsQuant에서의 획득 이후 CD3 군집에서 분석 게이팅을 수행했다.
형질도입은 음전하를 가진 세포와 비리온 사이의 정전기 반발을 물리적으로 감소시켜 세포-비리온 상호작용을 증가시킴으로써 형질도입 효율을 증가시키기 위해 형질도입 증진제 존재 하에 수행할 수 있다. 이 목적을 위해, γδ T 세포 형질도입 도중에 CD8αβ를 인코딩하는 레트로바이러스를 사용하여 두 가지 형질도입 증진제를 시험했다. 레트로넥틴®(플레이트에 코팅된 피브로넥틴 단편) 및 벡토푸진-1®(가용성 양이온 펩티드)을 시험했다. 도 9a는 레트로넥틴®이 더 높은 형질도입 효율(평균 49.7%)을 초래한 반면, 벡토푸진-1® 또한 27.5%의 평균 형질도입 효율로 γδ T 세포를 형질도입할 수 있음을 보여준다.
도 9b는 음성 대조 NYESO-PE 덱스트라머 염색(즉, αβ-TCR 바이러스 단독(1.6%) 및 αβ-TCR 바이러스와 CD8 바이러스 모두(2%)에 의해 형질도입됨)과 비교하여 TAA/MHC-PE 덱스트라머 염색으로 확인 시 αβ-TCR 바이러스 단독에 의해 형질도입된 71% Vγ9δ2 T 세포 그리고 αβ-TCR 바이러스 및 CD8 바이러스 모두에 의해 형질도입된 49% Vγ9δ2 T 세포를 보여준다. 이 결과는 TAA/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 αβ-TCR이 αβ-TCR 바이러스에 의해 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포의 세포 표면 상에 용이하게 제시됨을 나타낸다. 그 밖에 모의(바이러스 없음)(4%) 그리고 αβ-TCR 바이러스 단독(4.4%)으로 형질도입된 것과 비교하여 CD8 바이러스 단독으로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포의 7.6%, 그리고 αβ-TCR 바이러스 및 CD8 바이러스 모두에 의해 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포의 6.8%가 CD8α 염색으로 확인되었다. 이 데이터는 졸레드로네이트, IL-2 및 IL-15 매개 활성화 그리고 확장으로 제조된 Vγ9δ2 T 세포를 바이러스 형질도입에 의해 TAA 특이적 TCR 및 CD8을 발현하는 데 사용할 수 있음을 보여준다.
바이러스 형질도입 후 Vγ9δ2 T 세포의 배수 확장을 결정하기 위해, Vγ9δ2 T 세포(GD) 또는 αβ T 세포(AB)를 αβ-TCR 바이러스(TCR) 및/또는 CD8 바이러스(CD8)로 형질도입한 다음 형질도입 후 7일부터 21일까지 배수 확장을 측정했다. 도 10은 형질도입을 하지 않은 Vγ9δ2 T 세포(GD 모의)(1,040배)가 αβ T 세포(AB 모의)(289배)보다 배수 확장이 일반적으로 더 높음을 보여준다. αβ-TCR 단독으로 형질도입 후, Vγ9δ2 T 세포(GD + TCR)는 517배이며, 이는 αβ T 세포(AB + TCR)(211배)보다 더 높다. CD8 단독(GD + CD8) 또는 CD8 + αβ-TCR(GD + CD8 + TCR)에 의한 형질도입 후, Vγ9δ2 T 세포 확장은 각각 620배 및 540배이다. 이 결과는 Vγ9δ2 T 세포가 일반적으로 바이러스 형질도입과 관련하여 αβ T 세포보다 더 나은 세포 확장 용량이 있음을 나타낸다.
αβ-TCR이 TAA/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 αβ-TCR 발현 Vγ9δ2 T 세포를 αβ-TCR 레트로바이러스 및 CD8αβ 레트로바이러스로 Vγ9δ2 T 세포를 형질도입하여 생성했다. 도 11a는 바이러스 형질도입이 없는 Vγ9δ2 T 세포(모의)와 비교해서, αβ-TCR 레트로바이러스 및 CD8αβ 레트로바이러스(αβ-TCR + CD8)로 형질도입한 Vγ9δ2 T 세포의 34.9%가 TAA/MHC-덱스트라머(TAA/MHC-dex) 및 항-CD8 항체(CD8)에 의한 염색이 양성임을 보여주는 데, 이것은 세포 표면(αβ-TCR +CD8αβ 조작된 Vg9d2 T 세포)에서 αβ-TCR 및 CD8αβ 모두를 발현하는 Vγ9δ2 T 세포의 생성을 나타낸다.
조작된 Vγ9δ2 T 세포의 세포용해 활성도를 결정하기 위해, αβ-TCR +CD8αβ 조작된 Vγ9δ2 T 세포를 표적 세포(예: 세포 표면에 제시된 TAA/MHC(복합체를 갖는 인간 악성 흑색종 세포주인 A375 세포주)에 노출시켰다. 4가지 기능 분석은 (1) CD107a 탈과립화, (2) IFN-γ 방출, (3) 6시간 후 A375 세포의 세포자멸사 및 (4) 장기 공동 배양 후 A375에 대한 γδ T 세포의 세포독성 영향이다.
CD107a의 탈과립화 분석의 원리는 세포독성 세포의 세포질 내에 위치하는 사전형성된 용해 과립을 활용하는 과립 의존 경로를 통한 표적 세포의 살해에 근거한다. 이러한 과립을 둘러싸는 지질 양층은 CD107a(LAMP-1) 등 막 당단백질(LAMP)과 관련된 리소좀을 함유한다. T 세포 수용체 복합체에 의한 표적 세포의 인식 후 신속히 그랜자임 및 페르포린과 같은 세포자멸사 포함 단백질은 탈과립화라고 칭하는 과정인 면역 시냅스로 방출된다. 이로써 막통과 단백질 CD107a가 세포 표면에 노출되며 특정 단클론성 항체로 염색이 가능하게 된다. 도 11b는 바이러스 형질도입이 없는 Vγ9δ2 T 세포(모의)와 비교해서, αβ-TCR 레트로바이러스로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포 그리고 표적 세포(예: A375 세포)와 함께 배양한 CD8αβ 레트로바이러스(αβ-TCR + CD8)의 23.1%가 항-CD107a 항체에 의한 염색이 양성임을 보여주며, 이는 αβ-TCR +CD8αβ 조작된 Vg9d2 T 세포가 A375 세포에 노출되면 탈과립화를 실행하여 세포 용해성임을 나타낸다.
IFN-γ 방출 분석은 T 세포의 TCR이 세포 표면에 있는 항원 제시 세포의 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합할 때, 방출된 IFN-γ의 수준을 통해 항원 제시 세포(예: A375)에 대한 세포 매개 반응을 측정한다. 도 11c는 바이러스 형질도입이 없는 Vγ9δ2 T 세포(모의)와 비교해서, αβ-TCR 레트로바이러스 및 CD8αβ 레트로바이러스(αβ-TCR + CD8)로 형질도입된 Vγ9δ2 T 세포의 19.7%가 항-IFN-γ 항체에 의한 염색의 양성임을 보여주며, 이는 A375 세포에 노출될 때 αβ-TCR +CD8αβ 조작된 Vγ9δ2 T 세포가 IFN-γ를 방출하여 세포용해성임을 나타낸다.
비-CD3 T 세포(즉, A375 세포)의 세포자멸사에 대한 게이팅으로 A375 세포에 대한 노출 후 24시간에 세포용해 활성도를 평가했다. 세포자멸사는 수확된 배양액을 살아 있는/죽은 염료로 염색하여 평가한다. 도 11d는 바이러스 형질도입이 없는 Vγ9δ2 T 세포(모의)와 비교해서, αβ-TCR +CD8αβ 조작된 Vγ9δ2 T 세포(αβ-TCR + CD8)가 A375 세포의 70%에서 세포자멸사를 유도했음을 보여주며, 이는 αβ-TCR +CD8αβ 조작된 Vγ9δ2 T 세포가 A375 세포를 살해하여 세포용해성임을 나타낸다.
세포용해 활성도는 또한 84시간 공동배양 분석 동안 실시간으로 평가했다. 비형질도입된 그리고 αβ-TCR+CD8αβ 형질도입된 γδ T 세포를 3:1의 작용기 대 표적 비율로 표적 양성 A375-RFP 종양 세포와 공동배양했다. 표적 양성 A375-RFP 종양세포의 용해를 IncuCyte® 생세포 분석 시스템(Essen BioScience)으로 실시간으로 평가했다. 종양 세포만 그리고 비형질도입된 및 αβ-TCR 형질도입된 αβ T 세포를 각각 음성 및 양성 대조로 사용했다. 도 11e에서 보는 바와 같이, 비형질도입된 γδ T 세포는 γδ T 세포의 내인성 항종양 성질로 인해 세포독성 잠재력을 보인 반면, αβ-TCR +CD8αβ 형질도입된 γδ T 세포는 αβ-TCR 형질도입된 αβ T 세포와 비교하여 유사한 세포독성 잠재력을 보였으며, 이는 αβ-TCR +CD8αβ 형질도입된 γδ T 세포를 조작하여 종양 세포를 표적하여 살해할 수 있음을 나타낸다.
이 데이터는 본 개시의 방법으로 생성되는 조작된 Vγ9δ2 T 세포가 기능성이며, TAA 펩티드-특이적 방식으로 표적 세포(예: 암 세포)를 살해하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
한 양태에서, 여기서 기술된 방법 및 구현예로 사용이 가능한 여기서 기술된 TAA 펩티드는 예를 들어, 미국 특허 공보 2016/0187351, 미국 특허 공보 2017/0165335, 미국 특허 공보 2017/0035807, 미국 특허 공보 2016/0280759, 미국 특허 공보 2016/0287687, 미국 특허 공보 2016/0346371, 미국 특허 공보 2016/0368965, 미국 특허 공보 2017/0022251, 미국 특허 공보 2017/0002055, 미국 특허 공보 2017/0029486, 미국 특허 공보 2017/0037089, 미국 특허 공보 2017/0136108, 미국 특허 공보 2017/0101473, 미국 특허 공보 2017/0096461, 미국 특허 공보 2017/0165337, 미국 특허 공보 2017/0189505, 미국 특허 공보 2017/0173132, 미국 특허 공보 2017/0296640, 미국 특허 공보 2017/0253633 및 미국 특허 공보 2017/0260249에 기술된 그 TAA 펩티드를 포함하여, 이러한 공보 각각의 내용과 거기에 기술된 서열 목록은 그 전문이 참조문헌으로 여기에 포함된다.
실시예 6
키메라 분자를 발현하는 γδ T 세포의 조작
γδ T 세포는 조작을 통해 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1 및 NKp80또는 항-Her2neu 또는 항-EGFR와 같은 항-종양 항체로부터 유래된 리간드 결합 도메인 그리고 CD3-ζ, Dap 10, CD28, 4-IBB 및 CD40L로부터 얻은 신호전달 도메인을 함유하는 키메라 종양 인식 모이어티를 발현할 수 있다. 일부 실시예에서, 키메라 수용체는 MICA, MICB, Her2neu, EGFR, 메소텔린, CD38, CD20, CD 19, PSA, RON, CD30, CD22, CD37, CD38, CD56, CD33, CD30, CD138, CD123, CD79b, CD70, CD75, CA6, GD2, 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), CEACAM5, CA-125, MUC-16, 5T4, NaPi2b, ROR1, ROR2, 5T4, PLIF, Her2/Neu, EGFRvIII, GPMNB, LIV-1, 당지질F77, 섬유모세포 활성화 단백질, PSMA, STEAP-1, STEAP-2, c-met, CSPG4, Nectin-4, VEGFR2, PSCA, 엽산 결합 단백질/수용체, SLC44A4, Cripto, CTAG1B, AXL, IL-13R, IL-3R, SLTRK6, gp100, MART1, 티로시나제, SSX2, SSX4, NYESO-1, 상피 종양 항원(ETA), MAGEA 계열 유전자(MAGE3A. MAGE4A 등), KKLC1, 돌연변이된 ras, βraf, p53, MHC 클래스 I 사슬-관련 분자 A(MICA) 또는 MHC 클래스 I 사슬-관련 분자 B(MICB), HPV 또는 CMV를 결합시킨다.
γδ T 세포의 형질도입에 사용할 수 있는 기타 조직된 바이러스에는 αβ-TCR 및 키메라 CD8/CD4를 개별적으로 발현하는 2가지 바이러스가 포함될 수 있다. 대안적으로, TAA 특이적 αβ-TCR 및 키메라 CD8/CD4(절단된 집락 자극 인자 1 수용체(CSF1R) 포함)) 모두 단일 바이러스에 포함될 수 있다.
도 12a는 예를 들어 CD8/CD4 키메라 수용체-T2A-절단된 CSF1R을 보여주며, 여기서 CD8α 세포 외 도메인이 CD4 막통과 및 세포 내 도메인에 연결될 수 있다. MHC I 분자의 α3 도메인에 대한 결합에 CD8α가 요구되며, 여기서 CD8β는 팔미토일화에 중요하므로 TCR 복합체와의 상호작용을 위해 CD8의 적절한 모집의 지질 뗏목(lipid raft)에 대한 제공에 중요하다. 반면에 CD4는 단량체로 기능하고 지질 뗏목에 국소화될 수 있으며, CD4 도메인은 CD8 세포 내 도메인과 유사하게, 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(Lck)의 모집이 가능하며, 이 키나제는 T 조력자 세포 및 세포독성 T 세포에서 CD4 및 CD8 공동수용체의 세포질 꼬리와 각각 상호작용하여 TCR 복합체로부터의 신호전달을 도울 수 있다. 그러므로 CD8α 및 CD8β 둘 다 발현하는 대신, MHC I 분자에 결합하여 지질 뗏목에 국소화될 수 있는 키메라 CD8/CD4 단백질이 생성될 수 있다. 키메라 CD8/CD4 단백질이 더 이상 필요하지 않으면, 절단된 CSF1 수용체(CSF1R) 세포 내 촉매 도메인이 살해 스위치로 사용되는 키메라 CD8/CD4 단백질로부터 하류에 연계될 수 있다. CSF1R은 T 세포에서는 발현되지 않으며 골수성 세포에서 가장 풍부하다. 그러므로 CSF1R 세포 내 촉매성 도메인 매개 신호전달을 끄면, T 세포와 같은 γδ T 세포에 대한 최소한의 영향을 미치게 될 것이다. CSF1R 신호전달을 끄기 위해, 다수의 티로신 키나제 억제제(예: R7155, CYC11645, Ki20227, GW2580, BLZ945, PLX5622 및 PLX3397)를 사용할 수 있다. 살해 스위치로 사용될 수 있는 다른 수용체에는 절단된 TNFR2, 절단된 ESR1 및/또는 ESR1/Fas 신호전달이 포함되지만 이에만 제한되지 않으며, 이것들은 에스트로겐 수용체를 활성화하여 T 세포의 Fas-매개사를 유도할 수 있다.
CSF1은 M1(고전적으로 활성화된 대식세포)을 M2(대안적으로 활성화된 대식세포) 분극으로 촉진시킬 수 있다. 종양 미세환경에서, CSF1은 종양 관련 대식세포(TAM)를 M1에서 M2 유형으로 분극화할 수 있다. TAM의 M1 유형은 TAM의 M2 유형보다 종양 살해 활성도가 더 크기 때문에 바람직하지 않을 수 있다. 종양 미세환경에서 CSF1의 존재를 이용하고 T 세포 기능/지속성을 구동하며 CSF1의 가용성을 감소시켜 TAM을 분극화하기 위해, CSF1를 결합하는 CSF1R 세포 외 도메인이 키메라 CD8/CD4 단백질에 포함될 수 있다.
도 12b는 예를 들어, CD8/CD4 키메라 수용체-T2A-CSF1R/41BB 키메라 수용체를 보여주며, 여기서 CSF1R 세포 외 도메인이 키메라 CD8/CD4 단백질로부터 하류에 연계되어 CSF1R 세포의 도메인이 CSF1에 결합하고 CSF1을 대식세포로부터 격리시킬 수 있으며 그 결과 M1에서 M2로의 분극을 감소시킨다. 이 융합 단백질은 예를 들어 41BB와 같은 공동자극 분자를 제공하여 γδ T 세포와 같은 T 세포의 생존 및 확장을 촉진시킬 수 있다.
본 개시의 이점은 다음을 포함할 수 있다: (1) 메발로네이트 의존 종양에 대한 세포독성의 유발을 위한 γδ T 세포의 사용; (2) 내인성 γδ-TCR의 고갈 유무와 관계 없이 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 γδ-TCR을 발현하도록 조작된 동종이형 세포로 γδ T 세포의 사용; γδ(3) 면역 손상된 환자의 치료를 위해 다양한 형태의 항체나 T 세포 관여체를 공동투여하여 동종 면역 세포로서 γδ T 세포의 사용; (4) 암 백신용 수지상 세포의 성숙화 증진을 위한 γδ T 세포의 사용; 및 (5) 세포독성 T 세포의 활성화 강화를 위해 항원 제시 세포로서 CD8 T 세포의 사용.
본 명세서에 인용된 모든 참조는 각 참조가 참조문헌에 의해 구체적으로 그리고 개별적으로 표시되어 포함되는 것과 같이 여기에서 참조문헌에 포함된다. 모든 참조문헌의 인용은 출원일 이전의 개시를 위한 것이며, 본 개시가 이전 발명의 이점에 의해 그러한 참조문헌을 선행할 자격이 없음을 시인하는 것으로 해석해서는 안 된다.
위에 기술된 요소들 각각 또는 두 개 또는 그 이상이 합쳐져 위에 기술된 유형과 차이가 있는 다른 유형의 방법에서 유용한 용도를 찾을 수도 있다. 더 이상의 분석 없이, 위의 내용은 본 개시의 요지를 완전히 밝혀서, 다른 이는 현재의 지식을 응용하여 선행 기술의 측면에서 첨부된 청구범위에 명시된 본 개시의 일방적이거나 구체적인 양태의 필수적 특성을 공정하게 구성하는 특징의 생략 없이 다양한 용도에 그 지식을 용이하게 맞출 수 있다. 상기의 구현예들은 실시예로만 제시되며 본 개시의 범위는 다음 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.
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Thr Pro Cys Leu Ser 435 440 445 Thr Ser Val Phe Asn Gln Thr Arg Asp Phe Cys Ile Gln Val Gln Leu 450 455 460 Ile Pro Arg Ile Tyr Tyr Tyr Pro Glu Glu Val Leu Leu Gln Ala Tyr 465 470 475 480 Asp Asn Ser His Pro Arg Thr Lys Arg Glu Ala Val Ser Leu Thr Leu 485 490 495 Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ile Gly Thr Gly Ser 500 505 510 Thr Ala Leu Ile Lys Gly Pro Ile Asp Leu Gln Gln Gly Leu Thr Ser 515 520 525 Leu Gln Ile Ala Ile Asp Ala Asp Leu Arg Ala Leu Gln Asp Ser Val 530 535 540 Ser Lys Leu Glu Asp Ser Leu Thr Ser Leu Ser Glu Val Val Leu Gln 545 550 555 560 Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Leu Lys Glu Gly Gly Leu Cys 565 570 575 Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys Cys Phe Tyr Ile Asp His Ser Gly Ala 580 585 590 Val Arg Asp Ser Met Lys Lys Leu Lys Glu Lys Leu Asp Lys Arg Gln 595 600 605 Leu Glu Arg Gln Lys Ser Gln Asn Trp Tyr Glu Gly Trp Phe Asn Asn 610 615 620 Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Leu Ser Thr Ile Ala Gly Pro Leu Leu 625 630 635 640 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Gly Pro Cys Ile Ile Asn Lys Leu 645 650 655 Val Gln Phe Ile Asn Asp Arg Ile Ser Ala Val Lys Ile Leu Val Leu 660 665 670 Arg Gln Lys Tyr Gln Ala Leu Glu Asn Glu Gly Asn Leu 675 680 685 <210> 5 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RD114TR fusion protein <400> 5 Met Lys Leu Pro Thr Gly Met Val Ile Leu Cys Ser Leu Ile Ile Val 1 5 10 15 Arg Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Ala Leu Val Gln Lys 20 25 30 Gln His Gly Lys Pro Cys Glu Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Ala 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Ile Gln Gln Val Thr Cys Pro Gly Lys Thr Ala Tyr 50 55 60 Leu Met Thr Asn Gln Lys Trp Lys Cys Arg Val Thr Pro Lys Asn Leu 65 70 75 80 Thr Pro Ser Gly Gly Glu Leu Gln Asn Cys Pro Cys Asn Thr Phe Gln 85 90 95 Asp Ser Met His Ser Ser Cys Tyr Thr Glu Tyr Arg Gln Cys Arg Ala 100 105 110 Asn Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly 115 120 125 Ser Leu Asn Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Gln 130 135 140 Ser Pro Cys Arg Gly Ser Ile Asn Gln Pro Val Cys Trp Ser Ala Thr 145 150 155 160 Ala Pro Ile His Ile Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Lys Arg 165 170 175 Val Trp Thr Val Gln Lys Arg Leu Glu Gln Ile His Lys Ala Met His 180 185 190 Pro Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Leu Pro Lys Val Arg Asp Asp 195 200 205 Leu Ser Leu Asp Ala Arg Thr Phe Asp Ile Leu Asn Thr Thr Phe Arg 210 215 220 Leu Leu Gln Met Ser Asn Phe Ser Leu Ala Gln Asp Cys Trp Leu Cys 225 230 235 240 Leu Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu 245 250 255 Thr Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile 260 265 270 Pro Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu 275 280 285 Ser Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val 290 295 300 Thr Phe Thr Asn Cys Thr Ser Val Ala Asn Val Ser Ser Pro Leu Cys 305 310 315 320 Ala Leu Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr 325 330 335 Tyr Leu Pro Gln Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu 340 345 350 Pro Asp Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala 355 360 365 Ile Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro 370 375 380 Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr 385 390 395 400 Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu 405 410 415 Ile Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp 420 425 430 Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu 435 440 445 Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu 450 455 460 Lys Cys Cys Phe Tyr Ala Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile 465 470 475 480 Arg Thr Leu Gln Glu Glu Leu Gln Lys Arg Arg Glu Ser Leu Ala Ser 485 490 495 Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Phe Leu Pro Tyr Leu Leu Pro 500 505 510 Leu Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Gly Pro 515 520 525 Cys Val Phe Ser Arg Leu Met Ala Phe Ile Asn Asp Arg Leu Asn Val 530 535 540 Val His Ala Met Val Leu Ala Gln Gln Tyr Gln Ala Leu Lys Ala Glu 545 550 555 560 Glu Glu Ala Gln Asp 565

Claims (29)

  1. 인간 시험대상자의 혈액 샘플로부터 γδ T 세포를 분리하는 단계;
    아미노비스포스포네이트, 인간 재조합 인터루킨 2(IL-2) 및 인간 재조합 인터루킨 15(IL-15)의 존재 하에서 분리된 γδ T 세포를 활성화시키는 단계; 및
    아미노비스포스포네이트의 부재, 및 인간 재조합 인터루킨 2(IL-2) 및 인간 재조합 인터루킨 15(IL-15)의 존재 하에서 활성화된 γδ T 세포를 확장시키는 단계
    를 포함하는, γδ T 세포를 활성화시키고 확장시키는 시험관 내 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    γδ T 세포가 인간 샘플의 백혈구 성분 채집으로부터 분리되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    아미노비스포스포네이트가 팔미드론산, 알렌드론산, 졸레드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 이들의 염 및/또는 이들의 수화물을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노비스포스포네이트가 졸레드론산인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 졸레드론산, 및 IL-2 및 IL-15로 구성된 시토카인 조성물의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 추가로 톨-유사 수용체 2(TLR2) 리간드의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    TLR2 리간드가 암포테리신 B, L-테아닌, 탄닌 및 폴리페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 추가로 N-아세틸 시스테인(NAC)의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 추가로 COX-2 억제제의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 COX-2 억제제가 이부프로펜인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 약 1 내지 약 10 μM의 농도의 졸레드론산의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 약 10 내지 약 100 IU/ml의 농도의 IL-2의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화가 약 1 내지 약 100 μM의 농도의 졸레드론산, 약 10 내지 200 IU/ml의 농도의 IL-2, 및 약 10 내지 500 ng/ml의 농도의 IL-15의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제10항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장이 약 10 내지 약 100 IU/ml의 농도의 IL-2, 및/또는 약 50 내지 200 ng/ml의 농도의 IL-15의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 확장된 γδ T 세포의 군집으로서, 확장된 γδ T 세포의 밀도가 약 1 x 105 세포/ml 이상, 약 1 x 106 세포/ml 이상, 약 1 x 107 세포/ml 이상, 약 1 x 108 세포/ml 이상, 또는 약 1 x 109 세포/ml 이상인, 군집.
  16. 제15항의 조작된 γδ T 세포의 효과량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 암의 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    암이 폐암, 소세포 폐암, 흑색종, 간암, 유방암, 자궁암, 메르켈 세포 암종, 췌장암, 담낭암, 담관암, 대장암, 방광암, 비소세포 폐암, 신장암, 백혈병, 난소암, 식도암, 뇌암, 위암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    암이 흑색종인, 방법.
  19. 인간 시험대상자의 말초 혈액 단백 세포(PBMC)로부터 γδ T 세포를 분리하는 단계;
    아미노비스포스포네이트, 인간 재조합 인터루킨 2(IL-2) 및 인간 재조합 인터루킨 15(IL-15)의 존재 하에서 분리된 γδ T 세포를 활성화시키는 단계; 및
    아미노비스포스포네이트의 부재, 및 인간 재조합 인터루킨 2(IL-2) 및 인간 재조합 인터루킨 15(IL-15)의 존재 하에서 활성화된 γδ T 세포를 확장시키는 단계
    를 포함하는, γδ T 세포를 활성화시키고 확장시키는 시험관 내 방법으로서, 상기 분리가 PBMC를 항-α 및 항-β T 세포 수용체(TCR) 항체와 접촉시키고, PBMC로부터 α- 및/또는 β-TCR 양성 세포를 고갈시킴을 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화된 γδ T 세포를 재조합 바이러스 벡터로 형질도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 또는 트랜스포손인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 벡터가 외피 단백질을 인코딩하는 서열 식별 번호 1에 대해 95% 이상의 동일성을 갖는 RD114TR 유전자를 포함하는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 벡터가 CD8 및/또는 αβ-TCR을 인코딩하는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질도입이 형질도입 증진제의 존재 하에서 실시되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    형질도입 증진제가 레트로넥틴 또는 벡토푸진-1인, 방법.
  27. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 조작된 γδ T 세포.
  28. 제1항 내지 제14항 및 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 확장되고 활성화된 γδ T 세포의 군집.
  29. 제1항 내지 제14항 및 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    (E)-4-히드록시-3-메틸-부트-2-에닐 피로포스페이트(HMBPP), 이소프레노이드 피로포스페이트(파르네실 피로포스페이트(FPP)), 제라닐제라닐 피로포스페이트(GGPP), 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP) 및 디메틸알릴디포스페이드(DMAPP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 인항원을 추가로 포함하는 방법.
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WO2023128733A1 (ko) * 2022-01-03 2023-07-06 주식회사 이뮤노맥스 감마-델타 t 세포의 증식 배양 방법

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