KR20240043774A

KR20240043774A - 범용 수용체 면역 세포 요법

Info

Publication number: KR20240043774A
Application number: KR1020247006654A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 엘. 야토미-클라크; 레베카 림; 필립 케이. 다시; 다니엘 에이. 셸리; 케빈 세크
Original assignee: 프레션트 테라퓨틱스 엘티디
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2024-04-03
Also published as: IL310386A; CA3227128A1; CN117915932A; AU2022316596A1; WO2023004461A1

Abstract

본 발명은 범용 면역 수용체 세포 기반 요법을 위한 방법에 관한 것이다.

Description

범용 수용체 면역 세포 요법

본 출원은 2021년 7월 28일에 출원된 AU 2021902320에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

혈액암에 대한 세포 면역요법으로서 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포와 같은 키메라 면역 기반 세포 요법의 성공에도 불구하고, 이러한 요법은 치료 효능을 제한할 수 있는 독특한 합병증이 있을 수 있다. 주요 독성은 치료 가능한 B 세포 무형성증으로부터 보다 심각한 사이토카인 방출 증후군 및 신경독성까지 다양할 수 있다. 더욱이, 기존의 면역 세포 요법은 지금까지 고형 종양을 치료하는 데 제한적인 효능을 보여왔다. 이는 면역억제성 종양 미세환경(TME), 비효율적인 세포 이동 및 항원 발현 이질성을 포함한 다수의 요인에 기인한다. 고형 및 혈액학적 악성 종양 둘 모두의 맥락에서, 종양 탈출로 인한 재발이 흔하다. 이들은 모두 면역 세포를 발현하는 범용 면역 수용체를 통해 해결할 수 있는 세포 면역요법에서 현재 충족되지 않은 요구사항이다.

범용 면역 수용체(UIR)는 (i) 세포외 어댑터 단백질(예컨대 SpyCatcher)을 갖는 기존 CAR과 유사한 표준 세포내 세포 신호전달 도메인 및 (ii) 어댑터 단백질(예컨대 SpyTAG)에 접합된 표적 항체의 두 가지 개별 구성요소로 구성된다(WO 2017/112784). 이어서, 표적 항체는 종양 항원과 SpyCatcher 수용체 상의 세포외 어댑터를 표적으로 하는 면역학적 가교 역할을 하여 항원 특이적 세포 반응을 유도할 수 있다. CAR의 항원 인식 도메인을 세포내 신호전달 도메인으로부터 개별 구성요소로 분리함으로써, 이어서 면역 탈출 또는 종양 이질성을 극복하기 위해 동일한 UIR로 하나 이상의 여러 상이한 항원을 표적으로 하고 투여 후 UIR 면역 세포 기능을 조절하기 위해 용량 조정 또는 철회를 수행하여 입양 면역요법의 안전성을 더욱 증가시킬 수 있다.

현재, 예를 들어, CAR T 요법에서 직면하는 일반적인 문제를 최소화하면서 암과 같은 질환을 보다 효과적이고 신뢰할 수 있도록 치료하기 위해 개선된 범용 면역 수용체 세포 기반 요법이 필요하다.

본 발명은 범용 면역 수용체 시스템을 갖는 대상체를 효과적으로 치료하기 위한 방법을 제공한다. CAR T 세포와 같은 재조합 면역 세포의 지속성은 일시적인 휴지를 통해 달성될 수 있으며, 이는 후성유전학적 리모델링을 초래한다. 본 발명의 경우, 이는 태그된 결합제의 주기적인 투여 및 투여의 중단을 통해 달성된다.

일 양태에서, 본 발명은 면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는, 단계,

ii) 단계 i) 이후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 분자를 투여하는 단계,

iii) 단계 ii) 이후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석하는 단계, 및

iv) 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계

를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는, 단계,

iii) 단계 ii) 이후 적어도 약 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석하는 단계, 및

iv) 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계

를 포함한다.

일 실시양태에서, 분자는 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합되지 않는다.

일 실시양태에서, 분자는 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합된다.

일 실시양태에서, 단계 ii)에서 분자는 2회 투여된다. 일 실시양태에서, 분자는 단계 i) 이후 3일 및 6일차에 투여된다.

일 실시양태에서, 단계 ii)에서 분자는 3회 투여된다. 일 실시양태에서, 분자는 단계 i) 이후 1일, 4일 및 6일차에 투여된다.

일 실시양태에서, 단계 ii) 이후 약 21일 내지 약 49일 동안, 대상체를 치료에 대한 반응성에 대해 분석한다. 일 실시양태에서, 단계 ii) 이후 약 21일 동안, 대상체를 치료에 대한 반응성에 대해 분석한다. 일 실시양태에서, 단계 ii) 이후 약 49일 동안, 대상체를 치료에 대한 반응성에 대해 분석한다.

일 실시양태에서, 단계 ii)는 단계 i) 이전에 적어도 1회 그리고 단계 i) 이후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 ii)는 단계 i) 이전에 2회 그리고 단계 i) 이후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 분자를 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 단계 (ii)는 하기 투여 용법 중 하나를 포함한다:

(a) 단계 i)의 면역 세포 투여 후 7일 이내에 24 내지 48시간 윈도우 내에 투여하고, 선택적으로 반복;

(b) 단계 i)의 면역 세포 투여 후 7일 이내에 24시간마다 투여;

(c) 단계 i)의 면역 세포 투여 후 7일 이내에 주어진 윈도우에서 치료를 일시 중지하고, 다음 윈도우에서 치료를 재개하고, 다음 윈도우에서 치료를 일시 중지하는 것을 포함하는 주기적인 투여.

상기 (a), (b) 또는 (c) 중 어느 하나에서, 단계 i)에서 투여된 UIR 세포는 비무장(unarmed) 또는 사전 무장(prearmed)될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 분자는 상이한 용량으로 투여된다. 한 예에서, 상이한 용량은 약 0.75 mg/m²의 용량, 약 15 mg/m²의 용량, 및 약 75 mg/m²의 용량이다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 용량은 약 0.25 mg/m², 약 0.5 mg/m², 약 0.75 mg/m², 약 1 mg/m², 약 2.5 mg/m², 약 5.0 mg/m², 약 7.5 mg/m², 약 10 mg/m², 약 12.5 mg/m², 약 15.0 mg/m², 약 17.5 mg/m², 약 20 mg/m², 약 22.5 mg/m², 약 25 mg/m², 약 35 mg/m², 약 45 mg/m², 약 55 mg/m², 약 65 mg/m², 약 70 mg/m², 약 75 mg/m², 약 80 mg/m², 약 85 mg/m², 약 90 mg/m², 약 95 mg/m² 이상 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용량은 약 0.25 mg/m² 내지 2.0 mg/m², 약 0.5 mg/m² 내지 1.5 mg/m², 또는 약 0.5 mg/m² 내지 1.0 mg/m²일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용량은 약 5 mg/m² 내지 25 mg/m², 약 10 mg/m² 내지 20 mg/m², 또는 약 12 mg/m² 내지 17mg/m²일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용량은 약 50 mg/m² 내지 100 mg/m², 약 60 mg/m² 내지 90 mg/m², 또는 약 70 mg/m² 내지 80 mg/m²일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 상이한 용량은 약 1.6의 체표면적(BSA)의 경우, 약 0.25 mg, 약 24 mg 또는 약 120 mg을 포함한다. 또 다른 예에서, 약 1.6의 BSA의 경우, 대상체에게 투여되는 분자의 상이한 용량은 약 0.1 mg, 약 0.15 mg, 약 0.25 mg, 약 0.35 mg, 약 0.45 mg, 약 0.6 mg, 약 12 mg, 약 16 mg, 약 20 mg, 약 24 mg, 약 28 mg, 약 32 mg, 약 36 mg, 약 80 mg, 약 90 mg, 약 100 mg, 약 110 mg, 약 120 mg, 약 130 mg, 약 140 mg, 약 150 mg 이상 중 어느 하나를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 상이한 용량은 약 0.1 mg 내지 2.0 mg, 약 0.2 mg 내지 1.5 mg, 또는 약 0.2 mg 내지 0.75 mg을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 상이한 용량은 약 4 mg 내지 36 mg, 약 12 mg 내지 32 mg, 또는 약 20 mg 내지 28 mg을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 분자의 상이한 용량은 약 60 mg 내지 160 mg, 약 80 mg 내지 140 mg, 또는 약 100 mg 내지 130 mg을 포함한다.

일 실시양태에서, 단계 iv)는 단계 i)의 분자와 동일한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 iv)는 단계 i)의 분자와 상이한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 분자는 질환과 관련된 하나 초과의 항원에 결합하는 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 분자는 질환, 바람직하게는 암과 관련된 2개의 항원에 결합하는 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 분자는 질환, 바람직하게는 암과 관련된 3개의 항원에 결합하는 도메인을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

ii) 단계 i) 이후 약 14일 내지 약 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 분자를 투여하는 단계, 및

iii) 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계

를 포함한다.

iii) 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계

를 포함한다.

상기 양태의 일 실시양태에서, 분자는 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합되지 않는다.

상기 양태의 일 실시양태에서, 분자는 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합된다.

상기 양태의 일 실시양태에서, 분자는 단계 i) 이후 3일마다 투여된다.

상기 양태의 일 실시양태에서, 분자는 단계 i) 이후 약 21일 동안 3일마다 투여된다.

상기 양태의 일 실시양태에서, 대상체는 단계 ii) 완료 후 7일 이내, 5일 이내, 3일 이내 또는 1일 이내에 치료에 대한 반응성에 대해 분석된다.

일 실시양태에서, 단계 ii)는 단계 i)의 면역 세포를 투여하기 전에 적어도 1회 대상에게 분자를 투여하고, 단계 i) 이후 약 14일 내지 약 28일 동안 2일 또는 3일마다 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 단계 ii)는 단계 i) 이전에 2회 그리고 단계 i) 이후 약 14일 내지 약 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 분자를 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하는 단계는 대상체에서 사이토카인 수준을 증가시키는 단계, 바람직하게는 인터페론-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터루킨-2(IL-2) 중 하나 이상 또는 전부의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 단계 iii)은 단계 i)의 분자와 동일한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 iii)은 단계 i)의 분자와 상이한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 분자는 질환과 관련된 하나 초과의 항원에 결합하는 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 분자는 질환과 관련된 2개의 항원에 결합하는 분자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 분자는 질환과 관련된 3개의 항원에 결합하는 도메인을 포함한다.

일 실시양태에서, 치료는 대상체의 생존율을 증가시킨다. 일 실시양태에서, 생존율은 치료를 받지 않는 대상체와 비교했을 때 증가한다. 일 실시양태에서, 생존율은 치료를 받지 않은 대상체와 비교했을 때 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96개월 이상 증가한다.

일 실시양태에서, 대상체는 암, 감염 또는 염증성 질환과 같은 질환을 앓고 있는 것으로 진단되었거나 앓고 있는 것으로 의심된다. 따라서, 일 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 암, 감염 또는 염증성 질환과 같은 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 진단하는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 방법 또는 용도는 선택적으로 화학요법, 방사선요법, 수술, 골수 이식, 약물 요법, 냉동절제술 또는 고주파 절제술로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

일 실시양태에서, 범용 면역 수용체는 세포외 힌지 영역에 결합된 SpyCatcher 또는 SpyTag 세포외 결합 도메인을 포함하고, 이는 차례로 면역 세포 수용체 세포내 신호전달 도메인에 결합되는 막관통 도메인에 차례로 결합된다.

일 실시양태에서, 범용 면역 수용체 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자를 추가로 포함한다.

일 실시양태에서, SpyCatcher 세포외 결합 도메인은 세포외 힌지 도메인에 결합된다. 대안적인 실시양태에서, SpyTag 세포외 결합 도메인은 세포외 힌지 도메인에 결합된다.

일 실시양태에서, 분자는 SpyCatcher 또는 SpyTag 및 도메인을 포함한다.

일 실시양태에서, 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, 단백질 스캐폴드, 펩타이드, 리간드, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 종양 항원, 자가 항원, 바이러스 항원, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 도메인은 항체 또는 항체 단편이다.

일 실시양태에서, 분자는 SpyTag를 포함한다. 대안적인 실시양태에서, 분자는 SpyCatcher를 포함한다.

대안적인 실시양태에서, 상기 언급된 SpyTyg는 SnoopTag이고, 상기 언급된 SpyCatcher은 SnoopCatcher이다.

일 실시양태에서, 분자는 세포외 결합 도메인에 결합하는 제1 도메인 및 질환과 관련된 항원에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드이다. 일 실시양태에서, 분자는 표지제인 제3 도메인을 추가로 포함한다.

일 실시양태에서, 분자는 약 0.25 mg/m², 약 0.5 mg/m², 약 0.75 mg/m², 약 1 mg/m², 약 2.5 mg/m², 약 5.0 mg/m², 약 7.5 mg/m², 약 10 mg/m², 약 12.5 mg/m², 약 15.0 mg/m², 약 17.5 mg/m², 약 20 mg/m², 약 22.5 mg/m², 약 25 mg/m², 약 35 mg/m², 약 45 mg/m², 약 55 mg/m², 약 65 mg/m², 약 70 mg/m², 약 75 mg/m², 약 80 mg/m², 약 85 mg/m², 약 90 mg/m², 약 95 mg/m² 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 0.25 mg/m² 내지 2.0 mg/m², 약 0.5 mg/m² 내지 1.5 mg/m², 또는 약 0.5 mg/m² 내지 1.0 mg/m²이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 5 mg/m² 내지 25 mg/m², 약 10 mg/m² 내지 20 mg/m², 또는 약 12 mg/m²내지 17mg/m²이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 50 mg/m² 내지 100 mg/m², 약 60 mg/m² 내지 90 mg/m², 또는 약 70 mg/m² 내지 80 mg/m²이다. 바람직하게는, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 0.75 mg/m², 약 15 mg/m² 또는 약 75 mg/m²이다.

일 실시양태에서, 체표면적(BSA)이 약 1.6인 경우, 분자는 약 0.1 mg, 약 0.15 mg, 약 0.25 mg, 약 0.35 mg, 약 0.45 mg, 약 0.6 mg, 약 12 mg, 약 16 mg, 약 20 mg, 약 24 mg, 약 28 mg, 약 32 mg, 약 36 mg, 약 80 mg, 약 90 mg, 약 100 mg, 약 110 mg, 약 120 mg, 약 130 mg, 약 140 mg, 약 150 mg 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 0.1 mg 내지 2.0 mg, 약 0.2 mg 내지 1.5 mg, 또는 약 0.2 mg 내지 0.75 mg이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 4 mg 내지 36 mg, 약 12 mg 내지 32 mg, 또는 약 20 mg 내지 28 mg이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 60 mg 내지 160 mg, 약 80 mg 내지 140 mg, 또는 약 100 mg 내지 130 mg이다. 바람직하게는, 대상체에게 투여되는 분자의 용량은 약 0.25 mg, 약 24 mg 또는 약 120 mg이다. 숙련가는 상이한 BSA에 대한 등가 용량을 계산하는 방법을 이해할 것이다.

일 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 대식세포, 줄기 세포 또는 이들의 조합이다.

일 실시양태에서, T 세포는 CD3+ T 세포이다. 일 실시양태에서, T 세포는 세포독성 T 세포, 감마 델타 T 세포, T 조절 세포 또는 iNKT 세포이다.

일 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 강화를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 면역 세포의 적어도 약 10%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 적어도 약 20%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 적어도 약 30%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 적어도 약 40%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 적어도 약 50%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 적어도 약 60%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 약 10% 내지 약 60%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 약 10% 내지 약 50%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 약 10% 내지 약 40%는 CD8+ 세포이다. 일 실시양태에서, 면역 세포의 약 10% 내지 약 30%는 CD8+ 세포이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 CD45RO+CD45RA-T 이펙터 기억 세포의 강화를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 D45RA+CD45RO-T 중심 기억 세포의 강화를 포함한다.

일 실시양태에서, 본 발명이 분자에 공유 결합된 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 투여를 제공하는 경우, 방법은 비장 및/또는 종양에서 증가된 CD8+ 범용 면역 수용체 세포를 제공한다.

일 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 대안적인 실시양태에서, 세포는 동종이계이다.

일 실시양태에서, 질환은 암, 감염 또는 염증성 질환이다.

본 발명을 사용하여 치료할 수 있는 암의 예에는 신세포 암종, 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 교모세포종, 악성 신경교종, 골육종, 결장직장암, 위암, 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 활막 육종, 갑상선암, 유방암, 흑색종, 백혈병, 급성 골수 백혈병(AML) 또는 림프종이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

일 실시양태에서, 대상체는 포유류이다. 일 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본 발명은 면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환 치료용 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도를 추가로 제공하며, 여기서 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 투여될 것이며, 7일 후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석할 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복된다.

또한, 면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포가 제공되며, 여기서 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 투여될 것이며, 7일 후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석할 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복된다.

또한, 대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도가 제공되며, 여기서 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 투여될 것이며, 7일 후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석할 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복된다.

또한, 대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포가 제공되며, 여기서 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 투여될 것이며, 7일 후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석할 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복된다.

또한, 면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환 치료용 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도가 제공되며, 여기서 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 14일 내지 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여될 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복된다.

또한, 면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포가 제공되며, 여기서 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 14일 내지 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여될 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복된다.

또한, 대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도가 제공되며, 여기서 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 14일 내지 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여될 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우 치료가 반복된다.

또한, 대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포가 제공되며, 여기서 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 14일 내지 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여될 것이며, 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6으로 제공된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6 중 하나 또는 둘 모두와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 HER2 수용체에 결합할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 7 및/또는 서열 번호: 10으로 제공되거나 서열 번호: 8 및/또는 서열 번호: 9로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 EGFRvIII 수용체에 결합할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 11 및/또는 서열 번호: 14로 제공되거나 서열 번호: 12 및/또는 서열 번호: 13으로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 IL-13Ra2 수용체에 결합할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 15 및/또는 서열 번호: 16으로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 CD33 수용체에 결합할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 17 및/또는 서열 번호: 18로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 C형 렉틴-유사(CLL1) 수용체에 결합할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는, 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 벡터를 포함하는 단리된 트랜스제닉 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포 또는 포유동물 세포이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 도메인은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 중 하나 이상 또는 전부, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 세포를 배양하는 단계 및 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 세포는 면역 세포 활성화제, 바람직하게는 IL-2, 항-CD3 항체 또는 항-CD28 항체의 존재 하에 배향된다. 또 다른 실시양태에서, 면역 세포 활성화제는 Tim-3 및/또는 PD-1의 발현을 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 면역 세포의 적어도 약 30%는 Tim-3 및/또는 PD-1 양성이다.

본원의 모든 실시양태는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 임의의 다른 실시양태에 필요한 변경을 가하여 적용되는 것으로 간주될 것이다.

본 발명은 단지 예시의 목적으로 의도된 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 명백히 본 발명의 범위 내에 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질 조성, 단계의 그룹 또는 물질 조성의 그룹에 대한 언급은 이러한 단계, 물질 조성, 단계의 그룹 또는 물질 조성의 그룹 중 하나 및 복수(즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 간주될 것이다.

본 발명은 이하에서 이하의 비제한적인 실시예에 의해 그리고 첨부된 도면을 참조하여 설명된다.

도 1 내지 5 - 투여 일정의 예.
도 6 - 결합제의 투여 용법은 생체내에서 기능적 UIR 발현을 조절한다. (A) '비무장된' OmniCAR T 세포(FLAG+만) 및 '무장된' OmniCAR T 세포(FLAG+IgG+)의 발현. (B) 증가하는 농도의 항체 결합제로 무장한 CD8+ FLAG+ 또는 CD4+ FLAG+ CAR T 세포에서 IgG MFI에 의해 검출된 '무장된' OmniCAR 수용체. (C) MDA-MB231-HER2 종양과 24시간 동안 공동배양된 증가하는 농도의 결합제로 무장된 OmniCAR T 세포에 의한 사이토카인 IFNγ, TNF 및 IL-2 생산. (D) 입양 전달 후 1일 또는 7일차 혈액으로부터 단리된 T 세포에서 % 무장된 OmniCAR 수용체를 나타내는 FACS 플롯. (E) 3 내지 4일마다 다양한 용량의 결합제를 투여한 그룹에 대한 전달 후 1일차 혈액으로부터 CD8+ FLAG+ CAR T 세포의 % IgG+. (F) 3 내지 4일마다 다양한 용량의 결합제를 투여한 그룹에 대한 전달 후 1일차 혈액 내 무장된 IgG+ FLAG+ OmniCAR T 세포 수.
도 7 - 결합제의 투여 용법은 생체내에서 T 세포 기억 표현형, 확장 및 지속성을 조절한다. (A) 치료 용법의 개략도, 저용량 = 1 ug, 고용량 = 25 ug. 사전 조절된 종양 보유 마우스에게 1,000만 내지 2,000만 개의 비무장 또는 사전무장된 OmniCAR T 세포를 단일 용량으로 처리하고, 치료 계획 1-3에 따라 항체 결합제를 추가로 투여하였다. (B) 전달 후 1일차 CD8+ FLAG+ 세포/uL의 혈액 수. (C) 전달 후 7일차 혈액으로부터 OmniCAR T 세포에 대한 IgG 염색의 MFI. (D) 비형질도입된 OmniCAR 그룹과 비무장된 OmniCAR 그룹에 대한 전달 후 7일차 총 CD8+ T 세포/uL의 혈액의 수. (E) CD45RO+CD45RA-(T 이펙터 기억) 또는 CD45RA+CD45RO-(T 중앙 기억) 집단의 기억 표현형. 데이터는 SEM± 평균으로 나타낸다.
도 8 - 결합제의 투여 용법은 생체내에서 항종양 효능을 조절한다. (A) 사전 무장된 OmniCAR T 세포로 처리하고 고용량의 결합제를 투여한 마우스에 대한 종양 성장 곡선. (B) 비장 또는 (C) 종양을 치료 종말점에서 추출하고 CD8+FLAG+ OmniCAR T 세포를 계수하였다. (D) 종말점에서 종양으로부터 CD8+FLAG+ OmniCAR TIL의 %TIM3+PD1+ 집단. (E) 급성 골수성 백혈병(AML)의 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부담을 결정하기 위한 생물발광 영상. NSG 마우스에게 500만 개의 KG-1 세포를 투여하고, 동물을 처리하지 않은 상태로 두거나(대조군) CAR-T 이식 후 3일차, 6일차 및 9일차 사전 무장된 OmniCAR-T 세포와 25 ug의 CD33 및 CLL-1 결합제를 투여하였다. 데이터는 SEM± 평균으로 나타낸다.
도 9 - 결합제의 투여 용법 및 특정 설계는 OmniCAR 항원 독립적 신호전달 또는 항원 의존적 신호전달을 조절한다. (A) CD8+FLAG+(상단)의 % 또는 CD4+FLAG+(하단)의 %에 의한 서브세트 72시간 후 자극되지 않거나 자극된(OKT3) T 세포의 TIM3 발현. (B) 7CD8+FLAG+(상단)의 % 또는 CD4+FLAG+(아래)의 %에 의한 서브세트 72시간 후 자극되지 않거나 자극된(OKT3) T 세포의 PD-1 발현(좌측). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, 데이터는 SEM± 평균으로 나타낸다.
도 10 - 여러 종양 항원을 순차적으로 또는 동시에 표적화하기 위한 규칙적인 투여. (A) U251MG-HER2(GFP) 및 U251MG-EGFRviii(mCherry) 종양의 혼합 종양 배양 수. (B) 혼합 종양 배양물과 공동배양된 항-HER2 무장된 OmniCAR T 세포. (C) 혼합 종양 배양물과 공동배양된 항-EGFRviii 무장된 OmniCAR T 세포. (D) 공동배양 후 20시간에 항-HER2 결합제를 추가하거나(HER2LT 전환) 추가하지 않고(전환 없음) 혼합 종양 배양물과 공동배양된 항-EGFRviii 무장된 OmniCAR T 세포. 데이터는 SD± 평균으로 나타낸다. (E) (상단) 동일한 OmniCAR T 세포 샘플에서 3개의 결합제 발현에 대한 히스토그램(하단). 동일한 OmniCAR T 세포 생성물에 대한 각 이중 조합에서 결합제 발현에 대한 FAC 플롯. (F) 마우스의 혈청에서 HER2 및 EGFRvIII 항체 결합제의 존재 여부 결정.
도 11 - 기억 및 항종양 기능 능력을 조절하기 위한 OmniCAR 대 기존 CAR T 세포의 항원 독립적 긴장성 신호전달 모델. (A) 시간적, 용량 조절 또는 다중 결합제 조합 전략을 포함하는 규칙적인 투여의 개략도. (B) 긴장성 신호전달의 항원 독립적 조절, 기억 표현형 및 기능적/항종양 능력 간의 상호 관계 모델.

서열 목록의 핵심

서열 번호: 1 - SpyCatcher 범용 면역 수용체 아미노산 서열

서열 번호: 2 - SpyCatcher 범용 면역 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호: 3 - N-말단 신호를 갖는 표준 Her2-SpyTag 결합제

서열 번호: 4 - N-말단 신호를 갖는 짧은 반감기 Her2-SpyTag 결합제

서열 번호: 5 - N-말단 신호가 없는 표준 Her2-SpyTag 결합제

서열 번호: 6 - N-말단 신호가 없는 짧은 반감기 Her2-SpyTag 결합제

서열 번호: 7 - EGFRvIII 중쇄 아미노산 서열

서열 번호: 8 - SpyTag 아미노산 서열을 갖는 EGFRvIII 중쇄

서열 번호: 9 - EGFRvIII 경쇄 아미노산 서열

서열 번호: 10 - SpyTag 아미노산 서열을 갖는 EGFRvIII 경쇄

서열 번호: 11 - IL-13Ra2 중쇄 아미노산 서열

서열 번호: 12 - SpyTag 아미노산 서열을 갖는 IL-13Ra2 중쇄

서열 번호: 13 - IL-13Ra2 경쇄 아미노산 서열

서열 번호: 14 - SpyTag 아미노산 서열을 갖는 IL-13Ra2 경쇄

서열 번호: 15 - CD33 중쇄 아미노산 서열

서열 번호: 16 - SpyTag 아미노산 서열을 갖는 CD33 경쇄 아미노산 서열

서열 번호: 17 - CLL1 중쇄 아미노산 서열

서열 번호: 18 - SpyTag 아미노산 서열을 갖는 CLL1 경쇄 아미노산 서열

발명의 상세한 설명

일반 기술 및 정의

달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 (예를 들어, 세포 배양, 세포 기반 면역요법, 분자 유전학, 단백질 화학 및 생화학에서) 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다.

달리 지시되지 않는 한, 본 발명에서 이용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 그러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley 및 Sons (1984), J. Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover 및 B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), 및 F.M. Ausubel 등 (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow 및 David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan 등 (편집자) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함)과 같은 출처의 문헌 전반에 걸쳐 기술되고 설명되어 있다.

용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 두 의미 또는 두 의미 중 하나에 대한 명시적인 지지를 제공하는 것으로 간주되어야 한다.

본원에 사용된 바와 같이, 약이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한, 지정된 값의 +/- 10%, 보다 바람직하게는 +/- 5%, 보다 바람직하게는 +/- 1%를 지칭한다.

본 명세서 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어, 또는 "포함하다" 또는 "포함하다"와 같은 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 동물일 수 있다. 일 실시양태에서, 동물은 척추동물이다. 예를 들어, 동물은 포유류, 조류, 척색동물, 양서류 또는 파충류일 수 있다. 예시적인 대상체는 인간, 영장류, 가축(예를 들어, 양, 소, 닭, 말, 당나귀, 돼지), 반려동물(예를 들어, 개, 고양이), 실험실 테스트 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니피그, 햄스터), 포획된 야생 동물(예를 들어, 여우, 사슴)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 포유류는 인간이다. 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 수의학적 사용을 위한 것이다.

본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 (i) 청구된 방법(예를 들어, 약물 자가 투여)에 따라 대상체에게 자가 치료를 지시하거나, (ii) 청구된 방법에 따라 대상체를 치료하도록 제3자에게 지시하는 지침을 모든 형태로 제공함으로써 의료 전문가에 의한 대상체의 직접적인 치료(예를 들어, 대상체에게 치료제를 투여함으로써) 또는 적어도 한 당사자(예를 들어, 의사, 간호사, 약사 또는 제약 영업 담당자)에 수행되는 간접적인 치료를 둘 모두 지칭한다. "치료하는" 또는 "치료"라는 용어의 의미에는, 예를 들어, 질환의 진행을 예방하거나 늦추기 위해 질환의 충분히 초기 단계에 치료제를 투여함으로써 치료될 질환을 예방 또는 감소시키는 것도 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, "대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능하다"라는 용어는 질환(예컨대 종양 부하의 감소)의 검출 가능한 감소(예컨대 적어도 75% 감소, 적어도 50% 감소 또는 적어도 25% 감소)를 지칭하지만 질환은 여전히 존재한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 질환을 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 영상화(예컨대 PET, PET_SPECT 및 MRI), 세포 검출 및 병원체 검출 기술을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "사이토카인 방출 증후군"(CRS)은 키메라 항원 수용체 세포 요법, 치료 항체 및 반일치 동종이계 이식과 관련된 발열 및 다발성 장기 기능장애를 특징으로 하는 급성 전신 염증성 증후군을 지칭한다.

폴리펩타이드는 참조 아미노산 서열에 대한 그의 아미노산 서열의 동일성(% 동일성)의 정도에 의해, 또는 다른 참조 아미노산 서열보다 하나의 참조 아미노산 서열에 대해 더 큰 동일성(%)을 가짐으로써 정의될 수 있다. 참조 아미노산 서열에 대한 폴리펩타이드의 % 동일성은 전형적으로 간격 생성 페널티 = 5 및 간격 확장 페널티 = 0.3의 파라미터를 사용하여 GAP 분석(Needleman and Wunsch, 1970; GCG 프로그램)에 의해 결정된다. 쿼리 서열(query sequence)은 적어도 100개 아미노산 길이이며 GAP 분석은 적어도 100개 아미노산 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더욱 더 바람직하게는, 쿼리 서열은 적어도 250개 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 250개 아미노산의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더욱 더 바람직하게는, GAP 분석은 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 두 서열을 정렬한다.

정의된 폴리펩타이드와 관련하여, 본원에 제공된 것보다 더 높은 % 동일성 수치가 바람직한 실시양태를 포함할 것이라는 것이 이해될 것이다. 따라서, 적용 가능한 경우, 최소 % 동일성 수치를 고려하여, 폴리펩타이드가 관련 지명된 서열 번호와 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 적어도 99.1%, 보다 바람직하게는 적어도 99.2%, 보다 바람직하게는 적어도 99.3%, 보다 바람직하게는 적어도 99.4%, 보다 바람직하게는 적어도 99.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99.6%, 보다 바람직하게는 적어도 99.7%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8%인 아미노산 서열, 보다 더 바람직하게는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 일 실시양태에서, 상기 나열된 범위 각각에 대하여, % 동일성은 100%를 포함하지 않으며, 즉, 아미노산 서열은 지명된 서열 번호와 상이하다.

본원에 사용된 용어 "조합 요법", "조합 투여된" 또는 "공동 투여" 등은 선택된 치료제를 단일 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 의미하며, 제제가 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 또는 동일하거나 상이한 시간에 투여되는 치료 용법을 포함하도록 의도된다.

범용 면역 수용체

본원에 사용된 바와 같이, "범용 면역 수용체" 또는 "UIR"은 면역 세포가 세포외 힌지 영역에 결합된 세포외 결합 도메인을 포함하는 단백질을 재조합적으로 발현하는 키메라 항원 수용체 시스템이며, 이는 차례로 면역 세포 수용체 세포내 신호전달 도메인에 결합되는 막관통 도메인에 결합한다. 시스템은 세포외 결합 도메인에 결합하는 제1 도메인 및 질환과 관련된 항원(예컨대 암세포 표면의 암 항원)에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 가용성 분자를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "범용 면역 수용체"는 세포외 결합 도메인에 결합된(무장이라고도 지칭됨) 또는 결합되지 않은(비무장이라고도 지칭됨) 분자를 지칭할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 UIR은 제1 도메인이 세포외 결합 도메인과 결합할 때 공유 결합을 형성한다.

본 발명에 사용하기 위한 범용 면역 수용체의 예는 SpyTag/SpyCatcher 시스템(WO 2017/112784)이다. "SpyTag/SpyCatcher 시스템"이라는 용어는 버전 1(US 9,547,003), 버전 2(WO 2018/197854) 및 버전 3(WO 2020/183198)과 같은 시스템의 각 버전을 포함한다. 또 다른 예로서, 본 발명에 사용하기 위한 범용 면역 수용체는 SnoopTag/SnoopCatcher 시스템(Veggiani 등, 2016; WO 2016/193746)이다.

본 발명의 맥락에서 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"이라는 용어는 면역 세포에 있을 때 분자가 결합된 세포외 결합 도메인, 예를 들어, 암세포에 공유 결합되면 표적 세포에 대한 특이성을 세포에 제공하고 세포내 신호 생성을 제공하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

CAR(UIR)은 선택된 표적에 특이적인 T 세포, 수지상 세포 또는 자연 살해(NK) 세포와 같은 면역 세포를 생성하는 데 사용할 수 있다. CAR을 생성하기 위한 적합한 작제물은 US 5,843,728; US 5,851,828; US 5,912,170; US 6,004,811; US 6,284,240; US 6,392,013; US 6,410,014; US 6,753,162; US 8,211,422; 및 WO9215322에 기재되어있다. 대체 CAR 작제물은 연속적인 세대에 속하는 것으로 특성화될 수 있다. 1세대 CAR은 전형적으로 항원에 특이적인 항체의 단일-사슬 가변 단편으로 이루어지며, 예를 들어, 유연한 링커에 의해 연결된 특정 항체의 VH에 연결되고, 예를 들어, CD8a 힌지 도메인 및 CD8a 막관통 도메인에 의해 CD3C 또는 FcRy 또는 scFv-FcRy 중 하나의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결되는 VL을 포함한다(예를 들어, US 7,741,465; US 5,912,172; 및 US 5,906,936 참조). 2세대 CAR은 엔도도메인, 예를 들어, scFv-CD28/OX40/4 BB-CD3 내에 CD28, CD28z, OX40 (CD134) 또는 4-1BB(CD137)와 같은 하나 이상의 공동자극 분자의 세포내 도메인을 통합한다(예를 들어, US 8,911,993; US 8,916,381; US 8,975,071; US 9,101,584; US 9,102,760; US 9,102,761 참조). 3세대 CAR은 CD3C-사슬, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB 또는 CD28 신호전달 도메인, 예를 들어, scFv-CD28-4 BB-CD3C 또는 scFv-CD28-OX40-CD3Q와 같은 공동자극 엔도도메인의 조합을 포함한다(예를 들어, US 8,906,682; US 8,399,645; US 5,686,281; WO2014134165; 및 WO2012079000 참조). 일부 실시양태에서, 공동자극은, 예를 들어, 공동자극을 통해 전문적인 항원-제시 세포에서 항원과 상호작용한 후 활성화되고 확장되도록 선택된 항원-특이적 T 세포에서 CAR을 발현함으로써 조정될 수 있다. 예를 들어, T-세포 공격의 표적화를 개선하고/하거나 부작용을 최소화하기 위해 추가로 조작된 수용체가 면역 세포에 제공될 수 있다.

당업자는 "항체"가 일반적으로 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 적어도 하나의 가변 영역, 예를 들어, V_L을 포함하는 폴리펩타이드 및/또는 V_H를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 단백질로 간주된다는 것을 인식할 것이다. 항체는 또한 일반적으로 불변 도메인을 포함하며, 그 중 일부는 중쇄의 경우, 불변 단편 또는 단편 결정성(Fc) 영역을 포함하는 불변 영역으로 배열될 수 있다. V_H와 V_L은 상호작용하여 하나 또는 몇 개의 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 Fv를 형성한다. 일반적으로 포유류로부터의 경쇄는 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이고, 포유류로부터의 중쇄는 α, δ, ε, γ 또는 μ이다. 항체는 모든 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 하위부류일 수 있다. 용어 "항체"는 또한 인간화 항체, 영장류화 항체, 인간 항체 및 키메라 항체를 포함한다.

용어 "전장 항체", "온전한 항체" 또는 "전체 항체"는 항체의 항원 결합 단편과 대조되는 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 포함한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 야생형 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "항체 단편"은 표적 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 단편, 항체의 다른 항원-결합 하위서열을 포함하고, 전체 항체의 변형에 의해 생성된 것들 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 새로 합성된 것들, 및 IgG 이외의 항체로부터 얻어진 상응하는 단편을 포함할 수 있다. 이들 항체 단편은 문헌(J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N.Y. Academic Press 1983))에 기재된 바와 같은 단백질분해 단편화 절차와 같은 통상적인 절차를 사용할뿐만 아니라 당업자에게 알려진 다른 기술에 의해 얻어진다. 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 스크리닝된다.

적합한 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG, IgA, IgM, IgE, 단클론 항체, Fab', rIgG(절반 항체), f(ab')2, 나노바디, 키메라 항체, scFv, scFv 다량체, 단일 도메인 항체 또는 단일 도메인 융합 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체-유사 분자는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제조를 지칭한다. 단클론 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

일 실시양태에서, 분자는 폴리펩타이드이다. 일 실시양태에서, 분자는 단일 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 단일 폴리펩타이드 사슬이다.

일 실시양태에서, 분자는 표지제인 제3 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지제는 myc-태그, FLAG-태그, His-태그, HA-태그, 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)), 형광단(예를 들어, 테트라메틸로다민(TRITC), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)), 디니트로페놀, 페리디닌 엽록소 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린(PE), 히스티딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 아비딘, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼라닌 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질, 방사성 동위원소 및 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTA) 및 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)을 포함하는 방사성동위원소 표지에 사용되는 모든 유형의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 일 실시양태에서, 분자는 분자를 발현하는 재조합 세포로부터 생성되고 정제된다. 또 다른 실시양태에서, 분자는 합성된다.

UIR-발현 세포를 제조하는 방법

세포 공급원

확장 및 가능한 유전자 변형 또는 기타 변형에 앞서, 면역 세포, 예컨대 T 세포, 수지상 세포, 대식세포, 자연 살해(NK) 세포 또는 이들의 조합물을 포함하거나 이들로 이루어진 세포 집단을 대상체로부터 얻을 수 있다. 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함한 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다.

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같이 당업자에게 알려진 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 바람직한 일 실시양태에서, 개체의 순환하는 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 얻어진다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 수지상 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 포함한다. 일 실시양태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거할 수 있고, 선택적으로, 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣을 수 있다. 일 실시양태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 대안적인 실시양태에서, 세척 용액에는 칼슘이 결여되어 있고, 마그네슘이 결여될 수 있거나, 2가 양이온이 전부는 아니더라도 많이 결여될 수 있다.

칼슘이 없는 상태에서 초기 활성화 단계는 활성화를 확대될 수 있다. 당업자라면 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 세척 단계는 제조사의 지시에 따라 반자동 "플로우-스루(flow-through)" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같이 당업자에게 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는, 예를 들어, Ca-비함유, Mg-비함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액을 포함하거나 포함하지 않은 기타 식염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁시킬 수 있다.

본 출원의 방법은 인간 AB 혈청을 5% 이하, 예를 들어 2% 포함하는 배양 배지 조건을 이용할 수 있고, 알려진 배양 배지 조건 및 조성물, 예를 들어, 문헌 (Smith 등 (2015))에 기재된 것들 사용할 수 있는 것으로 인식된다.

일 실시양태에서, T 세포는, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 용출에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.

본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, T 조절 세포가 고갈된 집단인 T 세포의 특정 하위집단의 선택을 포함할 수 있다. 예를 들어, CD25+ 고갈 세포 집단은, 예를 들어, 본원에 기재된 음성 선택 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, T 조절 고갈 세포 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.

일 실시양태에서, T 조절(TREG) 세포, 예를 들어, CD25+ T 세포는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드인 IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드는 기질, 예를 들어, 비드에 접합되거나, 그렇지 않으면 기질, 예를 들어, 비드 상에 코팅된다. 일 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 이의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 기질에 접합된다.

특정 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 성분채집술 전 또는 UIR-발현 세포 생성물의 제조 동안 대상체에서 면역 세포의 음성 조절인자 수준을 감소시키면(예를 들어, TREG 세포와 같은 원치 않는 면역 세포의 수를 감소시키면) 대상체의 재발 위험을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, T_REG 세포를 고갈시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. T_REG 세포를 감소시키는 방법은 사이클로포스파마이드, 항-GITR 항체(본원에 기재된 항-GITR 항체), CD25-고갈, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 제조 방법은 UIR-발현 세포를 제조하기 전에 TREG 세포의 수를 감소시키는(예를 들어, 고갈시키는) 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은 샘플, 예를 들어, 성분채집술 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체(또는 이의 단편 또는 CD25-결합 리간드)와 접촉시켜, 예를 들어, UIR-발현 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포) 생성물의 제조 전에 TREG 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다.

자극을 위한 세포는 세척 단계 후에 동결될 수도 있다. 이론에 얽매이지 않기를 바라지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구와 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당업계에 알려져 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 31.25% 혈장-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO 또는 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적절한 세포 동결 배지를 포함하여, 이어서 세포를 분당 1°의 속도로 -80℃까지 동결하고, 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 저장한다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결뿐만 아니라 다른 제어된 동결 방법을 사용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 동결보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척하고, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화하기 전에 실온에서 1시간 동안 휴지시킨다.

또한, 본 발명의 맥락에서 고려되는 것은, 본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수도 있는 시기 이전의 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집물 생성물을 수집하는 것이다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 어느 시점에서든 수집할 수 있고, 원하는 세포, 예컨대 T 세포는, 본원에 기재된 것과 같은 면역 세포 요법으로부터 이득을 얻을 수 있는 임의의 수의 질환 또는 병태에 대한 면역 세포 요법에 나중에 사용하기 위해 단리 및 냉동될 수 있다. 일 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 특정 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 질환 발생의 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되고, 관심 세포를 나중에 사용하기 위해 단리하고 동결시킨다. 특정 실시양태에서, T 세포는 확장되고 동결되고 나중에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 실시양태에서, 세포는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 기타 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228 및 조사와 같은 제제를 사용한 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집술로부터 단리된다.

UIR-발현 세포 제조 방법

일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 UIR을 암호화하는 벡터 또는 핵산을 세포 내로 도입함으로써 UIR-발현 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 유전자를 세포 내로 도입하고 발현하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press 참조). 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위해 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.

관심 있는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법에는 DNA 및 RNA 벡터의 사용이 포함된다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어, 인간 세포에 유전자를 삽입하는 데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 기타 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, US 5,350,674 및 US 5,585,362 참조).

폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템이 포함된다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포체)이다. 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 서브미크론 크기 전달 시스템을 이용한 폴리뉴클레오티드의 전달과 같은 종래 기술의 표적화된 핵산 전달의 다른 방법도 이용 가능하다.

예시적인 비-바이러스 전달 비히클은 리포솜이다. 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해(시험관내, 생체외 또는 생체내) 지질 제형을 사용하는 것이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 결합되거나, 지질에 현탁액으로 함유되거나, 미셀과 함유되거나 복합되거나, 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 내의 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 그들은 이중층 구조, 미셀 또는 "접힌" 구조로 존재할 수 있다. 그들은 또한 단순히 용액에 산재되어 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성된 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질에는 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 그들의 유도체를 함유하는 화합물 부류가 포함된다. 사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma Aldrich로부터 입수할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories로부터 입수할 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 입수할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은, 예를 들어, Avanti Polar Lipids, Inc.로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올의 지질 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발하기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단층 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

다중층 리포솜은 수성 매질로 분리된 다중 지질층을 가지고 있다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 닫힌 구조가 형성되기 전에 자가 재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(Ghosh 등, 1991). 그러나, 용액 내에서 정상적인 소포 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물도 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 취하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체도 고려된다.

외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 그렇지 않으면 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정에는 서던(Southern) 및 노던(Northern) 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 "분자 생화학적" 검정; 예를 들어, 본 발명의 범위에 속하는 제제를 확인하기 위해 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴(Western) 블롯) 또는 본원에 기재된 검정에 의해 특정 펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.

면역 세포를 배양하고 확장하는 방법

T 세포와 같은 면역 세포는, 예를 들어, US 6,352,694; US 6,534,055; US 6,905,680; US 6,692,964; US 5,858,358; US 6,887,466; US 6,905,681; US 7,144,575; US 7,067,318; US 7,172,869; US 7,232,566; US 7,175,843; US 5,883,223; US 6,905,874; US 6,797,514; US 6,867,041; 및 US 20060121005에 기재된 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.

본원에 개시된 방법으로 T 세포를 확장하면 세포를 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배 이상, 그리고 그 사이의 임의의 모든 정수 또는 부분 정수로 증식할 수 있다. 일 실시양태에서, T 세포는 약 20배 내지 약 50배 범위로 확장된다.

일 실시양태에서, 세포는 약 7일 내지 약 14일, 또는 약 7일 내지 약 10일 동안 배양된다.

일반적으로, 면역 세포의 집단, 예를 들어, T 조절 세포 고갈 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드에 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉 등에 의해 본원에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에 있는 보조 분자를 공동자극하기 위해, 보조 분자를 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에, T 세포의 집단을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 사용할 수 있다. 항-CD28 항체의 예에는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)이 포함되며 당업계에 일반적으로 알려진 다른 방법처럼 사용될 수 있다(Berg 등, 1998; Haanen 등, 1999; Garland 등, 1999).

면역 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF, 및 TNF-a 또는 당업자에게 알려진 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지(1640) 또는, X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제에는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 배지에는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 첨가된 옵티마이저(Optimizer)가 포함될 수 있으며, 무혈청이거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인이 보충되어 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되며 대상체에 주입될 세포의 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 및 5% CO₂) 하에 유지된다.

조혈 줄기 및 전구 세포의 생체외 확장을 위한 절차는 US 5,199,942에 기재되어 있으며, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법이 당업계에 알려져 있으므로, 본 발명은 세포의 생체외 확장의 임의의 특정 방법에 한정되지 않는다. 간단히 말해서, 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 생체외 배양 및 확장은 다음을 포함한다: (1) 말초 혈액 수확물 또는 골수 체외이식편으로부터 포유류로부터 CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 이러한 세포를 생체외로 확장시키는 것. US 5,199,942에 기재된 세포 성장 인자에 추가하여, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자가 세포의 배양 및 확장에 사용될 수 있다.

면역 세포

본원에 사용된 바와 같이, "면역 세포"라는 문구는 항원의 인식 시 면역 반응에 영향을 미치거나 유도할 수 있는 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 수지상 세포 또는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 세포는 이들이 투여되는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계일 수 있다.

본 발명에 유용한 줄기 세포의 예에는 조혈 줄기/전구 세포 및 유도 만능 줄기 세포가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "세포독성 활성"이라는 문구는 NK 세포와 같은 면역 세포가 살아있는 세포를 파괴하는 능력을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 당업계에서 통상적인 의미를 가지며, 체액성 면역과 세포성 면역을 둘 모두를 포함한다. 면역 반응은 항-항원 항체의 발생, 항원-특이적 T 세포의 확장, 종양 침윤-림프구(TIL)의 증가, 항종양 또는 항종양 항원 지연-유형 과민증(DTH) 반응의 발생, 병원체의 제거, 병원체 및/또는 종양 성장 및/또는 확산의 억제, 종양 감소, 전이의 감소 또는 제거, 재발 시간 증가, 병원체 또는 종양 없는 생존 시간 증가, 및 생존 시간 증가 중 하나 이상으로 나타날 수 있다. 면역 반응은 B-세포 활성화, T-세포 활성화, 자연 살해 세포 활성화, 항원 제시 세포(예를 들어, B 세포, DC, 단핵구 및/또는 대식세포)의 활성화, 사이토카인 생산, 케모카인 생산, 특이적 세포 표면 마커 발현, 특히, 보조-자극 분자의 발현 중 하나 이상에 의해 매개될 수 있다. 면역 반응은 체액성, 세포성, Th1 또는 Th2 반응, 또는 이들의 조합을 특징으로 할 수 있다. 일 실시양태에서, 면역 반응은 선천성 면역 반응이다.

T 세포

일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예를 들어, UIR-T 세포이다. T 세포 또는 T 림프구는 세포-매개 면역에서 중심 역할을 하는 림프구의 일종이다. 이들은 세포 표면에 T-세포 수용체(TCR)가 존재한다는 점에서 B 세포 및 자연 살해 세포(NK 세포)와 같은 다른 림프구와 구별될 수 있다. T 세포에는 각각 고유한 기능을 가진 여러 서브세트가 있다.

일 실시양태에서, T 세포는 중앙 기억(T_CM) T 세포이거나 이를 포함한다. T_CM 세포는 림프절을 순찰하여 알려진 병원체에 대한 중앙 면역 감시를 제공하지만 1차 조직 면역감시를 수행하는 것으로 설명되지 않았다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 T_CM 세포는 CD45RO+ CD62L+ T 세포, 바람직하게는 CD45RO+ CD62L^hi T 세포를 포함한다. 이러한 세포는 CCR7+일 수도 있다.

일 실시양태에서, T 세포는 중심 기억 줄기 세포(T_SCM) T 세포이거나 이를 포함한다. T_SCM 세포는 줄기 세포와 같은 자가 재생 능력과 기억 및 이펙터 서브세트의 전체 스펙트럼을 재구성하는 다능성 능력을 부여받은 기억 림프구의 희귀한 서브세트이다. 일 실시양태에서, T_SCM 세포는 CD27+ CD95+ T 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 조절 T 세포(T_REG) 또는 이의 변형은 면역 관용의 유지에 중요한 T 세포 집단을 지칭한다. 이들의 주요 역할은 면역 반응이 끝날 무렵 T 세포-매개 면역을 차단하고 흉선에서 음성 선택 과정을 벗어난 자가 반응성 T 세포를 억제하는 것이다. CD4+ T_REG 세포의 두 가지 주요 부류인 Foxp3+ 및 Foxp3-이 설명되었다.

감마 델타(γδ) T 세포는 '비통상적' T 세포의 원형이며 말초 혈액에서 T 세포의 상대적으로 작은 서브세트를 나타낸다. 이들은 γ 사슬과 δ 사슬로 구성된 이종이합체 T-세포 수용체(TCR)의 발현에 의해 정의된다. 이는 αβ TCR을 발현하는 CD4+ 보조 T 세포 및 CD8+ 세포독성 T 세포와 구별된다.

iNKT(불변 NKT) 세포는 항원이 TCR과 결합할 때 즉시 Th1 또는 Th2 사이토카인을 분비하는 선천성 유사 림프구로 분류된다. 활성화된 iNKT 세포는 NK 세포, DC, B 세포 및 T 세포 반응의 동원, 활성화 또는 조절을 통해 적응 면역 반응을 조절할 수 있다.

일 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "나이브 T 세포"는 성숙되어 흉선에 의해 방출되었으나 아직 상응하는 항원과 조우하지 않은 T 세포 집단을 지칭한다. 즉, 나이브 T 세포는 성숙과 활성화 사이의 단계에 있다. 나이브 T 세포는 일반적으로 L-셀렉틴(CD62L) 및 C-C 케모카인 수용체 유형 7(CCR7)의 표면 발현; 활성화 마커 CD25, CD44 또는 CD69의 부재; 및 기억 CD45RO 이소형의 부재를 특징으로 한다. 이들은 또한 IL-7 수용체-α, CD127 및 공통-γ 사슬 CD132로 이루어진 기능성 IL-7 수용체를 발현한다.

기능성 내인성 T 세포 수용체(TCR)가 결여된 T 세포는, 예를 들어, 그 표면에 어떠한 기능성 TCR도 발현하지 않도록 조작되거나, 기능성 TCR을 포함하는 하나 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작되거나, 그 표면에 기능성 TCR을 거의 생성하지 않도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는, 예를 들어, TCR의 서브유닛 중 하나 이상의 돌연변이 또는 절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. "실질적으로 손상된 TCR"이라는 용어는 이 TCR이 숙주에서 불리한 면역 반응을 유발하지 않는다는 것을 의미한다.

본원에 기재된 T 세포는, 예를 들어, 그 표면에 기능적 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 T 세포는, 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 부류 1 및/또는 HLA 부류 II가 하향조절되도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 기능성 TCR 및 기능성 HLA, 예를 들어, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II가 결여될 수 있다.

기능성 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 하나 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR) 전사-활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription-activator like effector nuclease)(TALEN) 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제(zinc finger endonuclease)(ZFN)를 사용하여 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.

자연 살해 세포

일부 실시양태에서, 면역 세포는 자연 살해 세포이다. 자연 살해(NK) 세포는 CD56 CD3 대형 과립형 림프구로, 감염 및 형질전환된 세포를 사멸시킬 수 있으며 선천성 면역계의 중요한 세포 서브세트를 구성한다. 세포독성 CD8+ T 림프구와 달리, NK 세포는 사전 감작 없이 종양 세포에 대해 세포독성을 일으키며 MHC-I 음성 세포를 박멸할 수도 있다. 일 실시양태에서, NK 세포는 CD3-CD56+ CD7+CD127-NKp46+T-bet+Eomes+이다. 일 실시양태에서, 세포독성 NK세포 CD56^dim CD16+이다.

수지상 세포

일부 실시양태에서, 면역 세포는 수지상 세포이다. 수지상 세포는 CD34+ 줄기 세포의 골수에서 유래하고 주요 조직적합성 복합체(MHC) 부류 II 분자를 발현하는 특수 항원 제시 세포의 이종 그룹이다. 성숙한 수지상 세포는 T 세포 및 NK 세포와 같은 이펙터 면역 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장할 수 있다. 수지상 세포 요법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌(Sabado 등, 2017) 참조). 간단히 말해서, 수지상 세포는 환자로부터 단리되어, 질환-특이적 항원, 예를 들어, 암 특이적 항원에 노출되거나, UIR 또는 질환 특이적 항원을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있으며, 이어서, 환자에게 다시 주입되어 이펙터 면역 세포, 예를 들어, T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장한다.

골수 세포

일부 실시양태에서, 면역 세포는 골수 세포이다. 과립구, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포는 총칭하여 골수 세포로 불리는 백혈구의 하위그룹을 나타낸다. 이들은 혈액과 림프계를 순환하며 다양한 케모카인 수용체를 통해 조직 손상 및 감염 부위에 빠르게 동원된다. 조직 내에서 그들은 식세포작용과 염증성 사이토카인의 분비를 위해 활성화되어 보호 면역에 중요한 역할을 한다. 골수 세포 요법은 당업계에 알려져 있으며, 암, 감염 또는 질환의 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 골수 세포는 종양 기질에 풍부한 것으로 알려져 있으며 이러한 세포의 존재는 많은 암 유형에서 환자 예후에 영향을 미칠 수 있다. 간단히 말해서, 골수 세포는 환자로부터 단리되거나, 암 특이적 항원과 같은 질환-특이적 항원에 노출되거나, UIR 또는 질환 특이적 항원을 발현하도록 유전적으로 변형된 다음, 환자에게 다시 주입하여 이펙터 면역 세포, 예를 들어, T 세포를 프라이밍, 활성화 및 확장한다.

대식세포

대식세포는 박테리아 및 기타 유해 유기체의 검출, 식세포작용 및 파괴에 관여하는 특수 세포이다. 또한, T 세포에 항원을 제시하고 다른 세포를 활성화하는 분자(사이토카인으로 알려짐)를 방출하여 염증을 일으킬 수 있다.

UIR-발현 세포 요법

UIR 세포 요법은 면역 세포(예를 들어, T 세포)가 UIR을 발현하도록 유전적으로 변형되고 UIR-발현 세포(예를 들어, UIR-T 세포)가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입하는 세포 요법의 일종이다. 주입된 세포는 수용자에서 UIR의 표적을 발현하는 병든 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, UIR-변형 면역 세포(예를 들어, UIR-T 세포)는 생체내에서 복제할 수 있어 지속적인 종양 제어를 유발할 수 있다. 다양한 실시양태에서, UIR 세포는 환자에게 투여되거나, 그 자손은 UIR-세포를 환자에게 투여한 후 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 환자에서 지속된다.

일 실시양태에서, 대상체에게 투여될 때, UIR 세포는 사전 무장된다. 보다 구체적으로, 세포가 대상체에게 투여되기 전에 UIR과 공유 결합하도록 하는 조건 하에 분자에 노출되었으며, 따라서 투여될 때 표적 세포(예컨대 암 세포)와 결합할 수 있다.

일 실시양태에서, 대상체에게 투여될 때, UIR 세포는 사전 무장되지 않는다. 보다 구체적으로, 세포는 대상체에게 투여되기 전에 UIR과 공유 결합하도록 하는 조건 하에 분자에 노출되지 않았다. 이 실시양태에서, 세포가 기능하도록 하기 위해, 분자는 또한 세포가 생체내에서 무장되도록 대상체에게 투여된다.

일 실시양태에서, 사전 무장된 UIR 세포를 투여한 후, 분자를 약 21일 동안 3일마다, 예컨대 1일, 4일 및 6일차에 투여한다.

일 실시양태에서, 사전 무장된 UIR 세포를 투여한 후, 분자를 주 2회, 예컨대 3일 및 6일차에 투여하고, 이어서 약 21일의 휴지가 이어진다.

일 실시양태에서, 비무장 UIR 세포를 투여한 후, 분자를 주 2회, 예컨대 3일 및 6일차에 투여하고, 이어서 약 21일의 휴지가 이어진다.

일 실시양태에서, 사전 무장된 UIR 세포를 투여한 후, 분자를 주 3회, 예컨대 1일, 4일 및 6일차에 투여하고, 이어서 약 21일의 휴지가 이어진다.

일 실시양태에서, 비무장 UIR 세포를 투여한 후, 분자를 주 3회, 예컨대 1일, 4일 및 6일차에 투여하고, 이어서 약 49일의 휴지가 이어진다.

본 발명은 다수의 주기로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 제1 주기 이후, 대상체가 요법에 반응했는지를 결정하기 위해 대상체를 분석한다. 대상체가 치료에 반응하지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 대상체는 요법의 제2 주기를 거칠 수 있다. 더욱이, 제2 주기 이후, 대상체가 치료에 반응하지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 대상체는 요법의 제3 주기 등을 거칠 수 있다.

일 실시양태에서, 대상체는 그들이 치료에 반응했는지를 결정하기 전에 휴지를 취한다. 일 실시양태에서, 대상체는 약 21일 동안 휴지를 취한다. 일 실시양태에서, 대상체는 약 28일 동안 휴지를 취한다. 일 실시양태에서, 대상체는 약 35일 동안 휴지를 취한다. 일 실시양태에서, 대상체는 약 42일 동안 휴지를 취한다. 일 실시양태에서, 대상체는 약 49일 동안 휴지를 취한다.

본 발명은 또한 면역 세포(예를 들어, T 세포)가, 예를 들어, 시험관내에서 전사된 RNA에 의해 변형되어 UIR을 일시적으로 발현하고 UIR-T 세포가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 세포 요법의 일종을 포함한다. 주입된 세포는 수용자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양일 실시양태에서, 환자에게 투여된 면역 세포(예를 들어, UIR-T 세포)는 UIR-T 세포를 환자에게 투여한 후 1개월 미만, 예를 들어, 3주, 2주, 1주일 동안 존재한다. 임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않고, UIR-T 세포에 의해 유발된 항종양 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있거나, 대안적으로 직접 면역 반응 대 간접 면역 반응에 기인한 것일 수 있다.

본 발명이 대상체의 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 고려하는 경우, 능동 또는 수동 면역 반응, 또는 직접 대 간접 면역 반응이든 상관없이, UIR-T 세포에 의해 유발된 면역 반응은 대상체에서 암을 치료하기에 충분하다고 예상된다.

상기 언급된 바와 같이, 생체외 절차는 당업계에 잘 알려져 있고, 상기 설명되어 있다. 간단히 말해서, 세포는 포유류(예를 들어, 인간)로부터 단리되고, UIR을 발현하는 벡터로 유전적으로 변형(즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염)된다. UIR-발현 세포(예를 들어, UIR-T 세포)는 치료적 이점을 제공하기 위해 포유동물 수용자에게 투여될 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, UIR-발현 세포는 수용자에 대해 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자와 관련하여 동종이계, 동계(syngeneic) 또는 이종(xenogeneic)일 수 있다.

본 발명의 UIR 세포는 단독으로 투여될 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 면역 세포는 단독으로 투여될 수 있거나, 희석제 및/또는 IL-2, IL-15, 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하게 말해서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에 기재된 바와 같은 면역 세포를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트랜스, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타치온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 개시된 방법에 사용하기 위한 조성물은 일부 실시양태에서 정맥내 투여용으로 제형화된다.

본원에 기재된 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여, 10⁴ 내지 10⁹개 세포/kg 체중, 예컨대 10⁵ 내지 10⁶개 세포/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다. 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, Rosenberg 등, 1988 참조). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본원에 기재된 분자(결합제)를 포함하는 약제학적 조성물은, 예를 들어, kg당 0.5 mg 내지 5 mg의 투여량으로 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 활성화된 면역 세포를 대상체에게 투여한 다음, 혈액을 다시 채취하고(또는 성분채집술을 수행하고), 이로부터 면역 세포를 활성화 및 확장하고, 이러한 활성화 및 확장된 세포를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정은 몇 주마다 여러 번 수행할 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 또는 100 cc의 채혈로부터 활성화된다. 이 다중 채혈/다중 재주입 프로토콜을 사용하면 특정 면역 세포 집단을 선택하는 역할을 할 수 있다.

조합 요법

본 발명의 면역 세포, 예컨대 UIR-T 세포, 또는 본 발명의 방법에 의해 생성된 면역 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 치료 활성 성분(들)과 공동-제형화되고/되거나 이와 조합하여 투여될 수 있다: PRLR 길항제(예를 들어, 항-PRLR 항체 또는 PRLR의 소분자 억제제), EGFR 길항제(예를 들어, 항-EGFR 항체[예를 들어, 세툭시맙 또는 파니투무맙] 또는 EGFR의 소분자 억제제[예를 들어, 게피티닙 또는 엘로티닙]), 또 다른 EGFR 계열 구성원의 길항제, 예컨대 Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4(예를 들어, 항-ErbB2[예를 들어, 트라스투주맙 또는 T-DM1], 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체, 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 소분자 억제제), cMET 길항제(예를 들어, 항-cMET 항체), IGF1R 길항제(예를 들어, 항-IGF1R 항체), B-raf 억제제(예를 들어, 베무라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-알파 억제제(예를 들어, 항-PDGFR-알파 항체), PDGFR-베타 억제제(예를 들어, 항-PDGFR-베타 항체 또는 소분자 키나제 억제제, 예컨대, 이마티닙 메실레이트 또는 수니티닙 말레이트), PDGF 리간드 억제제(예를 들어, 항-PDGF-A, -B, -C, 또는 -D 항체, 압타머, siRNA 등), VEGF 길항제(예를 들어, VEGF-Trap, 예컨대 애플리버셉트(aflibercept), 예를 들어, US 7,087,411 참조(본원에서 "VEGF-억제 융합 단백질"로도 지칭됨), 항-VEGF 항체(예를 들어, 베바시주맙), VEGF 수용체의 소분자 키나제 억제제(예를 들어, 수니티닙, 소라페닙 또는 파조파닙)), DLL4 길항제(예를 들어, REGN421과 같은 US 2009/0142354에 개시된 항-DLL4 항체), Ang2 길항제(예를 들어, H1H685P와 같은 US 2011/0027286에 개시된 항-Ang2 항체), FOLH1 길항제(예를 들어, 항-FOLH1 항체), STEAP1 또는 STEAP2 길항제(예를 들어, 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP2 항체), TMPRSS2 길항제(예를 들어, 항-TMPRSS2 항체), MSLN 길항제(예를 들어, 항-MSLN 항체), CA9 길항제(예를 들어, 항-CA9 항체), 유로플라킨 길항제(예를 들어, 항-유로플라킨[예를 들어, 항-UPK3A] 항체), MUC16 길항제(예를 들어, 항-MUC16 항체), Tn 항원 길항제(예를 들어, 항-Tn 항체), CLEC12A 길항제(예를 들어, 항-CLEC12A 항체), TNFRSF17 길항제(예를 들어, 항-TNFRSF17 항체), LGR5 길항제(예를 들어, 항-LGR5 항체), 1가 CD20 길항제(예를 들어, 리툭시맙과 같은 1가 항-CD20 항체), PD-1 항체, PD-L1 항체, CD3 항체, CTLA-4 항체 등. 본 발명의 UIR-T 세포와 조합하여 유익하게 투여될 수 있는 다른 제제는, 예를 들어, 타목시펜, 아로마타제 억제제, 및 사이토카인 억제제를 포함하며, 이는 소분자 사이토카인 억제제 및 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18과 같은 사이토카인, 또는 이들 각각의 수용체에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 하나 이상의 화학요법제와 조합하여 본원에 기재된 UIR-T 세포와 같은 임의의 면역 세포를 포함하는 조성물 및 치료 제형을 포함한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파미드(Cytoxan.TM.); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로수레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스테인; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 디포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.TM; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀(Taxol.TM., Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(Taxotere.TM; Aventis Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벤빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미놉테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 이 정의에는, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)을 포함하는 항-에스트로겐, 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 포함된다.

임의의 개시된 치료제의 투여는 주사, 수혈, 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. 조성물은 또한 종양, 림프절, 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.

당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 기재된 세포 및/또는 분자는 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 치료되는 질환 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화하거나 악화를 방지할 수 있는 충분한 양의 치료제가 투여되는 것을 지칭한다. 그 결과 질환의 징후, 증상 또는 원인의 감소 또는 그 진행의 방지, 또는 생물학적 시스템의 다른 원하는 변경이 될 수 있다. 예를 들어, 치료 용도를 위한 "유효량"은 과도한 부작용 없이 질환 증상의 임상적으로 유의한 감소를 제공하는 데 필요한 치료제의 양이다.

용어 "치료학적 유효량"은, 예를 들어, 예방학적 유효량을 포함한다. 치료제의 "유효량"은 과도한 부작용 없이 원하는 약리학적 효과 또는 치료 개선을 달성하는 데 효과적인 양이다. "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 임의의 대상체의 연령, 체중, 일반적인 상태, 치료되는 병태, 치료되는 병태의 중증도, 및 처방 의사의 판단의 화합물 대사의 변화로 인해 대상체마다 달라질 수 있는 것으로 이해된다.

통상적인 실험(용량 증량 임상 시험을 포함하지만 이에 제한되지 않음)에 의해 이러한 치료학적 유효량을 결정하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 "유효량"은 용량 증량 연구와 같은 기술을 사용하여 결정될 수 있다.

하나 이상의 치료제가 조합하여 사용되는 경우, 각 치료제의 "치료학적 유효량"은 그 자체로 사용될 때 치료학적으로 유효할 수 있는 치료제의 양을 지칭할 수 있거나, 하나 초과의 추가적인 치료제와의 조합에 의해 치료학적으로 유효한 감소된 양을 지칭할 수 있다.

치료 방법

본 발명의 면역 세포 또는 이를 사용하여 생성된 면역 세포, 예를 들어 UIR-T 세포는 특히 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 UIR-T 세포는 암, 감염 또는 염증성 질환의 치료에 유용하다. 또 다른 예로서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 수지상 세포는, 예를 들어, 암, 감염(예컨대, 박테리아 또는 바이러스 감염) 또는 자가면역 질환(예컨대 당뇨병)을 치료하기 위한 수지상 세포 백신으로서 사용될 수 있다(예를 들어, Datta 등, 2014) 참조). 추가 예로서, NK-UIR 세포와 같은 NK 세포는 암을 치료하는 데 사용할 수 있다(예를 들어, Liu 등, 2021 참조).

UIR 세포는 뇌 및 수막, 구인두, 폐 및 기관지, 위장관, 남성 및 여성의 생식관, 근육, 뼈, 피부 및 부속 기관, 결합 조직, 비장, 면역 체계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 요로, 및 특수 감각 기관, 예컨대 눈에서 발생하는 원발성 및/또는 전이성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 UIR-세포는 하기 암들 중 하나 이상을 치료하는 데 사용된다: 신세포 암종, 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 악성 신경교종, 골육종, 결장직장암, 위암(예를 들어, MET 증폭을 수반하는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 활막 육종, 갑상선암, 유방암, 흑색종, 백혈병 또는 림프종.

일 실시양태에서, 본 발명의 UIR-세포는 백혈병, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병을 치료하는 데 사용된다. 일 실시양태에서, 백혈병은 낮은 CD33+ 모세포가 우세한 급성 골수성 백혈병이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 UIR-세포는 림프종, 예를 들어, 호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종을 치료하는 데 사용된다. 비호지킨 림프종 유형에는 미만성 거대 B-세포 림프종, 역형성 거대-세포 림프종, 버킷 림프종, 림프구성 림프종, 맨틀 세포 림프종 또는 말초 T 세포 림프종이 포함된다. 일 실시양태에서, 림프종은 CD19 및/또는 CD20 수준이 낮은 미만성 거대 B 세포 림프종 또는 비호지킨 림프종이다.

무장한 범용 면역 수용체가 결합할 수 있는 항원의 예로는 CD 19, CD20, ROR1, CD22암배아 항원, 알파태아단백, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피 종양 항원, 전립선-특이적 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, HER2/Neu, 엽산 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gpl20, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메오텔린, GD3, HERV-K, IL-l lRa, k 사슬, l 사슬, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII 또는 VEGFR2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 기재된 치료 방법의 맥락에서, UIR-세포와 같은 면역 세포는 단일요법(즉, 유일한 치료제로서)으로 투여되거나 하나 이상의 추가적인 치료제(이의 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있음)와 조합하여(조합 요법) 투여될 수 있다.

일 실시양태에서, 대상체는 암(예를 들어, 암)이 발생할 위험이 있다. 대상체가 대조군 집단보다 암 발생 위험이 더 높은 경우 위험에 처한다. 대조군 집단은 암을 앓지 않았거나 암의 가족력이 있는 일반 집단(예를 들어, 연령, 성별, 인종 및/또는 민족에 따라 일치)으로부터 무작위로 선택된 하나 이상의 대상체를 포함할 수 있다. 암과 관련된 "위험 인자"가 해당 대상체와 관련된 것으로 밝혀지면 대상체가 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 위험 인자에는, 예를 들어, 대상체 집단에 대한 통계적 또는 역학적 연구를 통해 주어진 장애와 관련된 모든 활동, 특성, 사건 또는 속성이 포함될 수 있다. 따라서, 근본적인 위험 인자를 확인하는 연구에 대상체가 구체적으로 포함되지 않았더라도 대상체는 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 분류될 수 있다.

일 실시양태에서, 대상체는 암이 발생할 위험이 있고, 세포 또는 조성물은 암 증상의 발병 전 또는 후에 투여된다. 일 실시양태에서, 세포 또는 조성물은 암 증상의 발병 전에 투여된다. 일 실시양태에서, 세포 또는 조성물은 암 증상의 발병 후에 투여된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 조성물은 위험에 처한 대상체에서 암의 증상 중 하나 이상을 완화 또는 감소시키는 용량으로 투여된다.

일 실시양태에서, 대상체는 암, 감염 또는 염증성 질환과 같은 질환 또는 장애를 앓는 것으로 진단되었거나 이를 앓는 것으로 의심된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체가 암, 감염 또는 염증성 질환과 같은 질환 또는 장애를 앓거나 앓는 것으로 의심되는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.

본원에 사용된 진단은 대상체 또는 환자가 본 발명의 면역 세포를 사용한 치료를 필요로 한다는 결정을 의미한다. 본원에 기재된 방법에 따라 진단된 질환 또는 장애의 유형은 당업계에 알려져 있거나 본원에 기재된 임의의 유형일 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 면역 세포를 사용한 치료를 필요로 하는 대상체를 확인하거나 진단하는 단계는 대상체가 암을 앓고 있다는 결정을 포함하고, 다음 중 하나 이상 또는 모두에 대한 평가를 포함할 수 있다:

- 혈액 프로파일링;

- 세포 생검 흡인 또는 조직 생검;

- 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔, 골 스캔, 자기 공명 영상(MRI), 양전자 방출 단층 촬영(PET) 스캔, 초음파 및 X선과 같은 영상 촬영;

- 신체 검사.

NK 세포를 사용하여 치료할 수 있는 질환의 예로는 암(예를 들어, 흑색종, 전립선암, 유방암, 간암) 및 감염, 예컨대 바이러스 감염(예를 들어, HSV, 간염 바이러스, 인간 거대세포 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스 및 HIV-1에 의한 감염), 세균 감염(예를 들어, 미코박테리아(Mycobacteria), 리스테리아(Listeria) 및 스타필로코커스(Staphylococcus)에 의한 감염) 및 원생동물 감염(예를 들어, 플라스모듐(Plasmodium)에 의한 감염) 및 진균 감염(예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus)에 의한 감염)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

염증성 질환의 예로는 항생제 내성 미생물 감염, 특발성 폐섬유증 및 알츠하이머병이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

당업자에게 명백하게 알 수 있듯이, 대상체에서 암 증상의 "감소"는 또한 암을 앓고 있지만 본원에 기재된 방법으로 치료를 받지 않은 다른 대상체와 비교될 것이다. 이는 반드시 두 대상체를 나란히 비교할 필요는 없다. 오히려 집단 데이터를 신뢰할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법으로 치료를 받지 않은 암을 앓고 있는 대상체의 집단(선택적으로, 치료받은 대상체와 유사한 대상체의 집단, 예를 들어, 연령, 체중, 인종)을 평가하고, 평균값을 본원에 기재된 방법으로 치료받은 대상체 또는 대상체 집단의 결과와 비교한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 면역 세포 및 방법은 암, 감염 또는 염증성 질환과 같은 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 생존을 향상시키기 위해 사용된다. 생존을 고려하는 경우 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 생존 분석을 수행할 수 있다. 카플란-마이어 방법은 수명 데이터로부터 생존 함수를 추정하고 치료 후 일정 시간 동안 생존하는 환자의 비율을 측정하는 데 사용할 수 있다. 생존 함수의 카플란-마이어 방법의 플롯은 크기가 감소하는 일련의 수평 단계로, 충분히 큰 샘플을 채취할 때 해당 집단의 실제 생존 함수에 접근한다. 연속적인 구별되는 샘플링된 관찰("클릭") 간의 생존 함수 값은 일정하다고 가정된다. 카플란-마이어 곡선의 중요한 이점은 이 방법이 최종 결과가 관찰되기 전에(예를 들어, 환자가 연구를 중단하는 경우) 샘플로부터 "중도 절단된(censored)" 데이터 손실을 고려할 수 있다는 것이다. 플롯에서, 작은 수직 눈금선(tick-mark)은 환자 데이터가 중도 절단된 손실을 나타낸다. 잘림 또는 중도 절단이 발생하지 않는 경우 카플란-마이어 곡선은 경험적 분포와 동일하다.

통계에서 로그 순위 테스트(Mantel-Cox 테스트로도 알려져 있음)은 두 환자 그룹의 생존 분포를 비교하기 위한 가설 테스트이다. 이는 비모수적 테스트이며 데이터가 올바르게 중도 절단된 경우에 사용하기에 적절하다. 이는 측정이 사건 발생 시점일 때 대조군과 비교하여 신약의 효능을 확립하기 위해 임상 시험에서 널리 사용된다. 로그-순위 테스트 통계량은 관측된 각 사건 시간에 두 그룹의 위험 함수 추정치를 비교한다. 관찰된 각 사건 시간에 그룹 중 하나에서 관찰된 사건 수와 예상 사건 수를 계산한 다음, 이를 추가하여 사건이 있는 모든 시점에 걸쳐 전반적인 요약을 얻음으로써 구성된다. 로그-순위 통계량은 두 그룹을 비교하는 Cox 비례 위험 모델에 대한 점수 테스트로서 유도될 수 있다. 따라서, 해당 모델을 기반으로 하는 우도비 테스트 통계량과 점근적으로 동일하다.

실시예

실시예 1 - 범용 면역 수용체

CD8a 리더, SpyCatcher v003, CD8a 힌지, CD8a 막관통 도메인, CD28z 공동-자극 도메인 및 서열 번호: 2로 제공된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 CD3z 세포내 신호전달 도메인(서열 번호: 1)을 갖는 SpyCatcher 범용 면역 수용체가 N- 내지 C-말단 순서로 생성되었다.

서열 번호: 1 - SpyCatcher 범용 면역 수용체. 첫 번째 밑줄이 그어진 섹션은 CD8 리더이고, 두 번째 밑줄이 그어진 섹션은 SpyCatcher이고, 세 번째 밑줄이 그어진 섹션은 CD8a 힌지이고 이어서 CD8a 막관통 도메인이 있고, 네 번째 밑줄이 그어진 섹션은 CD8a 막관통 도메인이고 이어서 CD28z 공동자극 도메인이 있고(이 섹션의 C-말단 ID 제외), 다섯 번째 밑줄이 그어진 섹션은 CD3z 세포내 신호전달 도메인이다.

MALPVTALLLPLALLLHAARPGSVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHTASTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSIDRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

서열 번호: 2 - 서열 번호: 1의 SpyCatcher 범용 면역 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgggatccGTGACAACACTGAGCGGACTGTCTGGCGAGCAAGGCCCTTCTGGCGATATGACCACCGAAGAGGATAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGCGCGACGAGGACGGCAGAGAACTTGCTGGCGCTACCATGGAACTGAGAGACAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCTGACGGCCACGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGCTACGAAGTGGCCACACCTATCGAGTTCACCGTGAACGAGGATGGCCAAGTGACCGTGGATGGCGAAGCTACAGAAGGCGACGCCCATACAgctagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccatcgatagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa

더욱이, Her2에 결합하는 2개의 SpyTag 결합 분자가 생성되었다. 하나는 N-말단 신호 펩타이드, Her2에 결합하는 항체 가변 도메인, 항체 불변 도메인, 링커 및 SpyTag(서열 번호: 3)를 포함하는 표준 Her2 결합제로 명명되었다. 짧은 반감기 결합제로 명명된 다른 하나는 더 짧은 반감기를 부여하는 항체 불변 도메인을 갖는다(서열 번호: 4). 발현 및 처리 후, N-말단 신호 펩타이드는 투여된 분자에 이 펩타이드(각각 서열 번호 5 및 6)가 결여되도록 제거된다.

서열 번호: 3 - N-말단 신호 서열을 갖는 표준 Her2 결합제(SpyTagged 중쇄). 첫 번째 밑줄이 그어진 섹션은 N-말단 신호 서열이고, 이어서 Her2에 결합하는 항체 가변 도메인이 있고, 두 번째 밑줄이 그어진 섹션은 항체 불변 도메인이고, 이어서 링커가 있고, 세 번째 밑줄이 그어진 섹션은 Spytag이다.

MAWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRGVPHIVMVDAYKRYK

서열 번호: 4 - N-말단 신호 서열을 갖는 짧은 반감기 Her2 변이체(SpyTagged 중쇄). 첫 번째 밑줄이 그어진 섹션은 N-말단 신호 서열이고, 이어서 Her2에 결합하는 항체 가변 도메인이고, 두 번째 밑줄이 그어진 섹션은 짧은 반감기 항체 불변 도메인이고, 이어서 링커가 있고, 세 번째 밑줄이 그어진 섹션은 Spytag이다.

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서열 번호: 5 - N-말단 신호 서열(항-Her2-ST)이 없는 표준 Her2 결합제 (SpyTagged 중쇄).

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서열 번호: 6 - N-말단 신호 서열이 없는 짧은 반감기 Her2 변이체(SpyTagged 중쇄).

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각 결합제와 관련된 DNA 서열은 먼저 SpyTag 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 새로 합성된 다음, 형질감염 등급의 내독소가 없는 플라스미드(예를 들어, pAb20-hCL-1)로 클로닝되었다. 이어서, 이를 TunaCHO와 같은 허용 세포주에 일시적으로 형질감염시킨 다음, DMEM/F12에서 14일 동안 배양하고, 이어서 결합제를 단백질 A 정제, 크기 배제 크로마토그래피 및 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제한다. 질량 분석법을 사용하여 동일성 확인을 수행하였다. 추가적인 결합제가 개발되어 합성되었으며, 본원의 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 따라 개시되어 있다.

실시예 2 - 세포 형질감염 및 확장

다형핵 세포 또는 농축된 T 세포의 제제는 24시간 동안 CD3/CD28 비드로 활성화된 다음, 추가 24시간 동안 레트로넥틴 또는 폴리브렌의 존재 하에 SpyCatcher 작제물을 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입되고, 그 후 50 IU/mL의 재조합 IL-2가 추가될 것이다. CD3/CD28 비드는 7일의 연속 배양 후 제거될 것이고, T 세포는 추가로 7일 동안 배양될 것이다. 형질도입 효율은 세포 표면에서 SpyCatcher의 발현을 기반으로 결정될 것이고, T 세포 수와 표현형은 쿨터 카운터(Coulter Counter) 및 다중-파라미터 유세포분석을 사용하여 결정될 것이다.

실시예 3 - UIR-T 세포의 규칙적인 투여

UIR-T 세포 지속성 및 활성에 대한 규칙적인 투여의 영향을 결정하기 위해, 면역결핍 NOD-SCID-감마(NSG) 마우스에 2-5x10⁶ MCF7 또는 SKBR3 유방암 세포를 주사할 것이다(유방 지방 패드 또는 피하 주사를 통해). 종양 성장은 2일마다 측정된다. 종양 주사 후 5-10일 후 또는 종양이 20-30 mm³에 도달하면, 이 마우스는 0.5-1 Gy의 전신 방사선 조사로 사전 컨디셔닝될 것이다. 같은 날, 마우스당 12.5 μg 내지 50 μg의 농도로 21일 동안 3일마다 항-Her2-ST(SpyTagged 항-Her 2 결합제 또는 짧은 반감기 버전)와 함께 사전 무장된 UIR T 세포(200 μL PBS의 1x10⁷ UIR T 세포)를 정맥 주사한다(도 1). 각 투여 주기는 21일 동안 지속된다.

ST-결합제의 간헐적 투여가 지속성 및 UIR-T 활성에 미치는 영향은 또한 종양 크기가 20-30 mm³에 도달할 때(0일) 사전 무장된 UIR T 세포가 투여될 것이고 항-Her2-ST(또는 짧은 반감기 버전)가 마우스당 12.5 μg 내지 50 μg의 농도로 첫 주에 2회(예를 들어, 3일 및 6일차에) 투여된 후 21일간의 휴지 기간을 갖는 28일 투여 프로토콜에서 평가될 것이다(도 2).

ST-결합제의 생체내 무장 및 간헐적 투여가 UIR-T 지속성 및 세포독성에 미치는 영향은 또한 종양 크기가 20-30 mm³에 도달할 때(0일) 비무장 UIR T 세포가 투여될 것이고 항-Her2-ST(또는 짧은 반감기 버전)가 마우스당 12.5 μg 내지 50 μg의 농도로 첫 주에 2회(예를 들어, 3일 및 6일차에) 투여된 후 21일간의 휴지 기간을 갖는 또 다른 28일 투여 프로트콜에서 평가될 것이다(도 3).

ST-결합제의 생체내 무장 및 간헐적 투여가 UIR-T 지속성 및 세포독성에 미치는 영향은 또한 종양 크기가 20-30 mm³에 도달할 때(0일) 비무장 UIR T 세포가 투여될 것이고 항-Her2-ST(또는 짧은 반감기 버전)가 마우스당 12.5 μg 내지 50 μg의 농도로 첫 주에 3회(예를 들어, 1일, 4일 및 7일차에) 투여된 후 21일간의 휴지 기간을 갖는 또 다른 28일 투여 프로트콜에서 평가될 것이다(도 4).

ST-결합제의 생체내 무장 및 간헐적 투여가 UIR-T 지속성 및 세포독성에 미치는 영향은 또한 종양 크기가 20-30 mm³에 도달할 때(0일) 비무장 UIR T 세포가 투여될 것이고 항-Her2-ST(또는 짧은 반감기 버전)가 마우스당 12.5 μg 내지 50 μg의 농도로 첫 주에 3회(예를 들어, 1일, 4일 및 7일차에) 투여된 후 49일간의 휴지 기간을 갖는 또 다른 56일 투여 프로트콜에서 평가될 것이다(도 5).

실시예 4 - UIR-T 세포 항종양 효능 및 투여

재료 및 방법

세포주 및 마우스 모델

인간 유방암 세포주인 MDA-MB231은 ATCC로부터 공급되었으며 NOD-SCID 감마(NSG) 마우스를 접종하는 데 사용되었다. 각 세포주에 대한 PCR 분석을 정기적으로 수행하여 해당 세포주가 마이코플라스마 음성임을 확인하였다. 모든 종양 세포주는 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(FBS), 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Gibco, Life Technologies, Grand Island, New York, USA)에서 배양되었다. 세포는 10% CO₂로 37℃의 가습 인큐베이터에서 성장시켰다. 다른 세포주에는 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, USA)에서 입수한 레트로바이러스 및 렌티바이러스 패키징 라인, HEK293gp, PA317 및 GP+E86이 포함되었다. GP+E86, PA317, HEK293T 및 HEK293gp는 상기 기재된 종양 세포 배지와 동일한 배지에서 유지하였다.

3세대 렌티바이러스 생산

3세대 렌티바이러스 외피, 패키징 및 전달 플라스미드가 사용되었으며 Addgene에서 공급되었다. 전달 플라스미드는 pULTRA 플라즈미드의 변형된 변이체였다. T175 플라스크를 폴리-D-라이신(50 ug/mL)으로 사전 코팅하고 2,300만 개의 HEK293T 패키징 세포를 시딩하기 전에 세척하였다. 24시간 후, 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 3000 시약을 사용하여 플라스미드의 1:1:1:1 몰비의 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 바이러스 상등액을 형질감염 후 1일, 2일, 3일차에 수집하고, 여과하고(0.45 uM), Takara Bio의 Lenti-X-농축기 시약으로 농축한 후 분취량을 -80℃에서 동결하였다.

인간 PBMC의 렌티바이러스 형질도입

신선한 공여체 인간 PBMC를 1:1 비율의 PBS로 희석하여 처리한 후 Ficoll 분리로 분리하였다. 백혈구를 혈청 및 적혈구로부터 분리하여 추가 적혈구 용해 전에 수집하였다. 용해 후, 세포를 OKT3(30 ng/mL), 600 IU의 인간 IL-2 및 완전 RPMI(10% FCS, 피루브산나트륨, 글루타맥스, NEAA, HEPES 및 페니실린/스트렙토마이신) 배지로 최소 48시간 동안 세포 농도 100만 세포/mL로 활성화하였다. 활성화 후, 600 IU IL-2로 100만 T 세포/mL로 재시딩한 후 렌티부스트 시약(1:400)과 함께 1MOI 기능적 역가의 렌티바이러스를 추가하였다. 세포에 배지 및 IL-2를 채우고 최소 72시간 동안 배양하였다.

유세포분석

수집된 세포를 먼저 FACS 완충액으로 세척한 다음, 얼음 위에서 30분 동안 형광단-접합 항체로 염색하였다. 세포를 FACS 완충액으로 적어도 2회 세척한 후 FACS 완충액 및 카운트 비드(20 uL, ~20,000개 비드)에 재현탁하였다. 세포내 또는 핵내 염색의 경우, 염색된 세포를 제조업체 지침에 따라 BD Biosciences 또는 eBioscience 키트를 사용하여 추가로 고정하고 투과시켰다. 이어서, 고정 및 투과화 세포를 실온에서 30분 동안 형광단-접합 항체를 추가로 염색한 후 펌/세척 완충액으로 적어도 2회 세척하고 비드를 계산하여 펌/세척 완충액에 최종 재현탁한다. 염색된 샘플은 BD FACSymphony, FACSFortessa 또는 LSR(BD Biosciences)에서 획득하였다. 표적 세포 집단의 수는 샘플/비드 사건의 입력 비드 수 × 표적 집단의 사건을 사용하여 계산하였다.

CAR T 세포 및 종양 세포의 공동배양

OKT3(1:1000)을 사용한 인간 CAR T 세포의 직접적인 활성화를 위해, 평평한 바닥 96웰 플레이트를 37℃에서 적어도 1시간 동안 사전 코팅하였다. 종양 공동배양의 경우, CAR T 세포와 종양 세포를 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 50,000개의 종양 세포/웰과 함께 다양한 E:T 비율로 200 μL 보충된 RPMI 배지에서 공동배양하였다. 세포를 표시된 바와 같이 37℃ 및 5% CO2에서 24-72시간 동안 공동배양하였다.

인큐사이트(Incucyte) 사멸 검정

종양 세포는 먼저 HER2에 대한 형광 마커 GFP 또는 EGFRvIII에 대한 mCherry에 연결된 표적 항원을 발현하기 위해 형질도입되었다. 제조업체가 권장 농도로 제공한 카스파제 3/7 염료를 사용하여 다양한 비율의 CAR T 세포를 각 웰에 첨가하기 전에, 종양을 384웰 플레이트에 밤새 5000개 세포/웰로 시딩하였다. 이어서, 플레이트를 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터 내부에 위치한 인큐사이트 기계에 추가하고 총 24-72시간 동안 1-4시간마다 영상을 촬영하였다. 영상은 인큐사이트 분석 소프트웨어에서 분석된다.

사이토카인 생산의 정량화

수집된 상등액은 CBA(cytometric bead array) 검정(BD Biosciences)으로 분석하였다. 12.5 μL의 상등액을 V-바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 테스트된 각 사이토카인을 함유하는 표준물질의 절반 연속 희석액을 5000 pg/mL의 가장 높은 농도로 도말하였다. 제조업체의 지침에 따라, 0.25 μL 비드/사이토카인/웰의 사이토카인 특이적 비드를 함유하는 포획 칵테일을 BD 비드 완충액을 사용하여 각각 최대 12.5 μL/웰(인간)로 만들고 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 최대 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마우스 또는 인간 사이토카인에 대한 PE 검출 항체 칵테일용 비드와 동일한 부피를 구성하여 각 웰에 추가하였다. 플레이트를 암실에서 실온에서 최대 1시간 동안 다시 인큐베이션하였다. 마지막으로, 세포를 75-100 μL의 세척 완충액에서 재현탁 전에 제공된 세척 완충액으로 적어도 2회 세척하고, BD FacsVerse(Becton Dickinson)에서 분석하고, FCAP 소프트웨어(BD biosciences)에서 데이터를 처리하였다.

OmniCAR T 세포의 '무장' 및 '사전 무장', 항체 결합제의 용량 일정

비무장된 OmniCAR T 세포에는 spyCatcher 수용체 CAR에 결합된 표적 항체 결합제가 없으며 종양 항원에 결합할 수 없으므로 종양 세포를 활성화하고 사멸할 수 없다. T 세포 배지(<10^e6/mL)의 OmniCAR T 세포에 총 100 nM 농도의 항체 결합제를 첨가하고 섭씨 37도에서 5% CO2에서 약 30분 동안 인큐베이션하여 OmniCAR T 세포를 '무장'하면 기능성 spyCatcher:spyTAG 수용체를 형성할 것이다. '사전 무장된' OmniCAR T 세포는 입양 전달 전 또는 신체/마우스 외부에서 생체외로 무장한 CAR T 세포이다. 항체는 입양 전달 전에 씻어낸다.

종양 보유 마우스의 입양 전달 및 치료

NSG 마우스에 인간 HER2 항원을 피하 발현하도록 형질도입된 2-5x106 MDA-MB231 유방암 세포를 주사하였다. 종양이 확립된 후, 마우스는 이어서 24시간마다 마우스당 25,000 IU의 IL-2를 4회 용량이 보충된 OmniCAR T 세포를 입양 전달하기 전에 0.5 gy의 전신 방사선 조사의 사전 컨디셔닝 용법을 받았다. 결합제는 규칙적인 투약 일정에 기초하여 종양내, 정맥내 또는 복강내로 전달되었다(도 11a).

종양-침윤 면역 서브세트 분석

종양 침윤 CAR T 세포 표현형을 조사하기 위해, 마우스를 안락사시키고 종양 또는 비장을 제거하였다. 종양을 1 mg/mL의 콜라게나제 IV형(Sigma-Aldrich) 및 0.02 mg/mL DNAse(Sigma-Aldrich)가 보충된 DMEM을 사용하여 37℃에서 계속 흔들면서 30분 동안 기계적으로 소화시키고 효소적으로 분해시켰다. 이어서, 종양 단일 세포 현탁액을 70 μm 필터를 통해 여과한 후 유세포분석 염색을 위해 분취한다. 또한 비장을 기계적으로 분해하고 염색 전에 70 μm 필터를 통해 여과하였다.

결과

결합제의 투여 용법은 생체내에서 기능성 UIR 발현을 조절한다

OmniCAR T 세포는 상기 기재된 프로토콜을 사용하여 3세대 렌티바이러스를 사용하여 생성되었으며, 비항원 특이적 OmniCAR 수용체의 형질도입 효율 및 발현은 항-FLAG 항체를 사용하여 검출되었다(도 6a). '비무장된' OmniCAR T 세포에는 항체 결합제 성분이 결여되어 종양 항원에 결합하여 항종양 반응을 유도할 수 없다. 항-인간 IgG 항체를 추가하면 OmniCAR 수용체와 자발적으로 복합체를 형성할 때 전장 항체 결합제를 검출할 수 있으며, 그 결과 각각의 표적 항원에 대해 완전히 기능하는 '무장된' OmniCAR T 세포가 생성된다(도 6a).

인간 HER2 항원에 대한 항체 결합제의 농도 증가와 함께 인큐베이션하면 항-IgG에 의한 검출이 증가했으며, 이는 CD8+ FLAG+ 및 CD4+ FLAG+ CAR T 세포 둘 모두에서 '무장된' OmniCAR 수용체의 발현 증가에 해당한다(도 6b). 무장된 수용체의 발현 증가와 관련하여, HER2(MDA-MB231-HER2)로 형질도입된 유방암 세포주 MDA-MB231과 공동배양했을 때 3개의 개별 공여체로부터 생성된 OmniCAR T 세포가 활성화되고 증가하는 농도의 기능성 사이토카인 IFNγ, TNF 및 IL-2를 분비하였다(도 6c). OmniCAR T 세포는 또한 NSG 마우스로 입양 전달 후 무장할 수 있다. 이를 위해 1,000만-2,000만 개의 OmniCAR T 세포를 NSG 마우스에 이식하고 항체 결합제를 3일마다 농도를 증가시켜 투여하였다. 이식 후 1일과 7일차에 혈액을 수집하고, 두 시점 모두에서 '무장된' FLAG+ CAR T 세포를 검출했으며, 발현 수준은 증가된 결합제 투여 농도에 해당한다(도 6d). 요법 후 1일차에 결합제의 투여량이 더 많을수록 무장된 수용체의 검출이 증가하고(도 6e) 무장된 OmniCAR T 세포의 조기 확장 및 수가 증가하였다(도 6f). 유사하게, 7일차에 무장된 수용체의 발현(MFI)은 결합제의 투여량 증가에 해당했다(도 6d).

결합제의 투여 용법은 생체내에서 T 세포 기억 표현형, 확장 및 지속성을 조절한다

OmniCAR 요법의 치료 효능을 추가로 조사하기 위해, NSG 마우스에 인간 MDA-MB231-HER2 유방암 세포를 주사하였다. 종양이 확인되면 마우스를 OmniCAR T 세포와 항-HER2 항체 결합제의 상이한 용량 및 투여 용법으로 치료하였다(도 7a). 이전 관찰과 마찬가지로, 항체 결합제의 투여량이 높을수록 마우스의 주변부에서 CD8+ FLAG+ OmniCAR T 세포가 조기에 확장되었다(도 7b). 마우스당 5 ug 초과의 결합제를 투여하면 '무장된' OmniCAR 수용체가 더 많이 발현되었으며, 이는 종양 또는 비종양 보유 마우스에서 결합제의 투여와 일치하거나 1주일 초과의 투여 사이에 긴 간격을 둔 기간과 일치하였다(도 7c).

용량 및 투여 전략을 조절하면 생체내에서 OmniCAR T 세포의 기억 표현형을 조절할 수도 있으며, 이 효과는 종양 보유 마우스와 비종양 보유 마우스의 맥락에서 관찰되었다(도 7d). 낮은 농도의 결합제는 사전 무장된 단독보다 더 큰 %의 CD45RO+CD45RA-T 이펙터 기억 하위집단을 초래한 반면, 높은 농도의 결합제는 항원-독립적인 것으로 보이는 더 큰 %의 CD45RA+CD45RO-T 중심 기억 하위집단을 초래하였다(도 7d). 실제로, 고용량 치료 그룹에서 말초에 이식된 OmniCAR T 세포의 7일차에 관찰된 확장의 대부분은 항원 독립적이었으며, 이는 OmniCAR T 세포의 확장이 OmniCAR 수용체의 신호전달을 조절하는 것과 연결된 내재적 특징임을 나타낸다(도 7e).

결합제의 투여 용법은 생체내에서 항종양 효능을 조절한다

확장 및 기능에 대한 관찰과 일치하게, 사전 무장된 OmniCAR T 세포와 고용량의 항체 결합제로 처리한 마우스는 처리하지 않은 마우스에 비해 항종양 효과를 매개하여 전반적인 종양 크기를 감소시킬 수 있었다(도 8a). 연구의 종말점에 마우스로부터 비장과 종양이 단리되었다. 예상대로, 높은 결합제 용량 처리로 비장에서의 생착이 감소하였다(도 8b). 마찬가지로, 이 패턴은 종양에서 검출된 종양 침윤 림프구(TIL)의 수로 해석되었다(도 8c). 또한 결합제의 투여량이 높을수록 기능적 OmniCAR 수용체 발현 증가로 인해 항원-특이적 신호전달이 증가하여 TIM3+PD1+ CD8+ FLAG+ CAR TIL의 %가 증가할 수 있다(도 8d).

제안된 용법의 효과는 급성 골수성 백혈병(AML) 모델에서도 테스트되었다. AML의 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부담을 결정하기 위해 생물발광 영상화를 수행하였다. NSG 마우스에 500만 개의 KG-1 세포를 제공하고 동물을 처리하지 않은 상태로 두거나(대조군) CAR-T 이식 후 3일, 6일, 9일차에 사전 무장된 OmniCAR-T 세포와 25 ug의 CD33 및 CLL-1 결합제를 제공하였다. 대조군과 비교했을 때, CAR-T 이식 후 3일, 6일, 9일차에 사전 무장된 OmniCAR-T 세포와 25 ug의 CD33 및 CLL-1 결합제로 처리한 마우스에서 종양 성장에 대한 유의한 효과가 관찰되었다(도 8e).

결합제의 투여 용법 또는 특정 설계는 OmniCAR 항원-독립적 신호전달 또는 항원-의존적 신호전달을 조절한다

기존 CAR T에 비해 입양 전달 후 CAR T 세포의 우수한 증식을 유도하는 OmniCAR의 내재적 능력은 이전에 항원-독립적인 것으로 나타났다(도 7d). 관련된 잠재적 매커니즘을 조사하기 위해, OmniCAR T 세포를 활성화, 증식 또는 체크포인트 T 세포 마커의 발현 수준에 대해 시험관내에서 비형질도입 또는 기존 CAR T 세포와 직접 비교하였다. IL-2의 존재 하에 자극 없이 72시간 초과 동안 공동배양한 후, 비무장 또는 무장된 OmniCAR T 세포인 CD8과 CD4는 둘 모두는 각각 비형질도입 또는 기존 CAR T 세포와 비교할 때 활성화 마커 TIM3의 발현을 상향조절하였다(도 9a).

중요한 것은 CD8 및 CD4 무장된 OmniCAR T 세포 둘 모두 비무장된 대응세포에 비해 더 높은 수준의 Tim3을 발현했다는 것이다(도 9a). 72시간 초과 동안 OKT3(αCD3)으로 자극했을 때, 비무장된 또는 무장된 OmniCAR T 세포 둘 모두 전반적으로 더 높은 발현을 보였지만 모든 CD8+ 그룹은 Tim3을 유사한 수준으로 상향조절하였다(도 9a). 흥미롭게도, 비무장된 및 무장된 CD4+ OmniCAR T 세포 둘 모두 기존 CAR T 세포에 비해 Tim3 발현이 유의하게 더 높았으며, 이는 OKT3으로 자극했을 때 더 높은 수준의 활성화를 나타낸다(도 9a). 두 번째 후기 체크포인트 수용체인 PD-1은 자극 없이 시험관내에서 높게 발현되지 않았지만. 자극에 의해 상향조절되었지만 CD8+ 분획의 무장으로는 상향 조절되지 않았다(도 9b). PD-1의 발현은 CD4+ 분획에서 두드러졌지만, 비무장된 및 무장된 CD4+ OmniCAR T 세포는 더 높은 수준의 PD-1을 발현했으며, 자극되지 않은 세포에서 무장하면 훨씬 더 높은 PD-1 발현을 유도하였다(도 9b). PD-1은 자극된 CD4+ OmniCAR T 세포에서 계속 증가하지만, 무장된 OmniCAR T 세포는 비무장에 비해 PD-1이 감소했으며, 이는 CD4+ T 세포에서 무장된 OmniCAR 수용체의 신호전달이 감소할 수 있음을 나타낸다(도 9b).

종합하면, 비무장된 또는 무장된 OmniCAR 수용체는 각각 자극되지 않거나 자극된 CD8 또는 CD4 분획에 대해 고유한 신호전달 효과를 가지며, 이는 입양 전달 후 OmniCAR T 세포 생성물의 상이한 분획을 차별적으로 조절하기 위한 응용 분야를 강조한다. CD8 분획과 CD4 분획 사이의 복잡한 상호작용은 전달된 OmniCAR T 세포의 우수한 증식을 유도할 수 있다.

여러 종양 항원을 순차적으로 또는 동시에 표적하기 위한 규칙적인 투여

OmniCAR 플랫폼의 이점은 상이한 항체 결합제의 순차적 또는 동시 투여를 통해 여러 종양 항원을 표적화할 수 있다는 것이다. 인간 교모세포종 세포주 U251MG는 인간 HER2 또는 돌연변이 EGFRvIII 수용체를 개별적으로 발현하도록 변형되었다. 혼합 종양 공동배양에서, U251MG-HER2와 U251MG-EGFRvIII는 둘 모두 안정적인 성장 역학을 보였다(도 10a). OmniCAR T 세포가 인간 HER2 항원 단독에 대해 무장되었을 때, U251MG-HER2 세포를 발현하는 HER2만이 혼합 종양 공동배양에서 제거되었다(도 10b). 유사하게, OmniCAR T 세포가 돌연변이 EGFRvIII 항원 단독에 대해 무장되었을 때, U251MG-EGFRvIII 세포를 발현하는 EGFRvIII만이 혼합 종양 공동배양에서 제거되었다(도 10c). 마지막으로, 상이한 표적으로의 항원 전환을 입증하기 위해, OmniCAR T 세포를 표적으로 하는 EGFRvIII을 혼합 종양 검정에서 공동배양하고 20시간 후에 100 nM의 HER2 결합제를 추가하였다(도 10d). HER2 결합제가 추가될 때까지, EGFRvIII 발현 종양만 제거되었지만, CAR T 세포 사멸은 HER2 결합제를 추가한 후 HER2 발현 종양으로 전환되었으며, 이는 순차적으로 항원의 신속하고 효율적인 표적화를 나타낸다(도 10d). 여러 종양 항원을 동시에 표적으로 하기 위해, OmniCAR T 세포는 한 번에 1개 초과의 항체 결합제로 무장할 수 있으며, 3개 이상의 상이한 결합체의 동등한 수준의 발현 및 동시 발현이 가능하다(도 10e). 마지막으로, HER2 및 EGFRvIII 항체 결합제의 존재는 투여 후 2주 후에 마우스의 혈청에서 검출될 수 있다(도 10f).

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 혈액학적 악성 종양 치료에 광범위한 성공을 거두었으며 여러 고형 종양을 치료하기 위한 임상 시험을 진행 중이다. 그러나, 고유한 독성과 후속 재발과 관련하여 해결해야 할 몇 가지 문제가 있다. 범용 면역 수용체는 증가된 안전성 및 감소된 부작용(주입 후 CAR 반응 스위칭 온/오프)을 통해 이러한 문제를 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 종양 재발을 유발하는 종양 탈출 메커니즘(예컨대 항원 손실 또는 항원 이질성)을 극복하기 위해 여러 종양 항원을 표적으로 하는 빠르게 부상하고 있는 arm 형태의 입양 면역요법이다. 또한, 범용 CAR T 세포는 현재 임상에서 사용되는 기존 CAR 요법에 비해 잠재적으로 훨씬 더 큰 다양성, 비용 절감 및 기성 유용성 잠재력을 가질 수 있다. 따라서, 도 11a에 강조된 규칙적인 투여 전략은 시험관내 및 생체내에서 항원 특이적 기능성 UIR 발현의 발현을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 생체내에서 T 세포 기억 분화, 확장 및 지속성을 조절하는 능력을 OmniCAR T 세포에 부여할 수 있다.

개별적, 연속적 또는 주기적 투여를 통해 투여 용법을 일시적으로 조절하거나 투여 농도를 조절함으로써(도 11a), 항원-독립적 긴장성 신호전달 및 항원 의존적 CAR 신호전달의 강도를 직접적으로 또는 간접적으로 조절하여 최적의 T 세포 기억 서브세트, T 세포 활성화 및 항종양 기능을 유지하는 것이 가능하다(도 11b). OmniCAR 플랫폼의 본질적인 특징은 항원 독립적 긴장성 신호전달을 조절하는 능력으로, 이는 경직된 구조로 고정되어 수준의 긴장제 신호전달을 가진 기존 CAR T 세포보다 더 높은 수준에서 향상된 안전성, 항종양 활성 및 T 세포 확장을 유도한다(도 11b). 여러 항원은 또한 항원 표적 간에 신속하고 효율적으로 순차적으로 전환하거나 여러 종양 항원을 동시에 표적으로 하기 위해 하나 초과의 항원 결합제로 무장하는 능력으로 표적화할 수 있다(도 10a 내지 도 10e). 결론적으로, 이러한 발견은 입양 전달 후 항종양 치료 반응을 미세 조정하기 위해 OmniCAR UIR 플랫폼의 유연성과 시너지적으로 결합하는 전략으로 규칙적인 투여를 뒷받침한다.

광범위하게 기재된 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 실시양태에 나타낸 바와 같이 본 발명에 다양한 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 따라서, 본 실시양태는 모든 면에서 예시적이며 제한적인 것이 아닌 것으로 간되어야 한다.

본원에 논의 및/또는 참조된 모든 간행물은 그 전체가 본원에 포함된다.

본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 대한 모든 논의는 단지 본 발명에 대한 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이러한 사항들 중 일부 또는 전부가 선행 기술 기반의 일부를 형성하거나 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재했던 본 발명과 관련된 분야의 일반적인 지식이라는 것을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 된다.

참조문헌

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Claims

면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는, 단계,
ii) 단계 i) 이후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 분자를 투여하는 단계,
iii) 단계 ii) 이후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석하는 단계, 및
iv) 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 방법.
대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는, 단계,
ii) 단계 i) 이후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 분자를 투여하는 단계,
iii) 단계 ii) 이후 적어도 약 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석하는 단계, 및
iv) 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 분자가 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합되지 않는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 분자가 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)에서 분자가 2회 투여되는, 방법.
제5항에 있어서, 분자가 단계 i) 이후 3일 및 6일차에 투여되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 단계 i) 이후 3회 투여되는, 방법.
제7항에 있어서, 분자가 단계 i) 이후 1일, 4일 및 6일차에 투여되는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i) 이후 21일 내지 49일 동안, 대상체를 치료에 대한 반응성에 대해 분석하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 단계 i) 이전에 적어도 1회 그리고 단계 i) 이후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 단계 i) 이전에 2회 그리고 단계 i) 이후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 상이한 용량, 바람직하게는 약 0.25 mg/m² 내지 2.0 mg/m²의 용량, 약 5 mg/m² 내지 25 mg/m²의 용량, 및 약 50 mg/m² 내지 100 mg/m²의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iv)가 단계 i)의 분자와 동일한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iv)가 단계 i)의 분자와 상이한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 질환과 관련된 하나 초과의 항원, 바람직하게는 질환과 관련된 2개의 항원에 결합하는 도메인을 포함하는, 방법.
면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 투여하는 단계로서, 상기 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는, 단계,
ii) 단계 i) 이후 14일 내지 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 분자를 투여하는 단계, 및
iii) 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 방법.
대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는, 단계,
ii) 단계 i) 이후 약 14일 내지 약 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 분자를 투여하는 단계, 및
iii) 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 단계 i) 및 ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 분자가 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합되지 않는, 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 분자가 단계 i)에서 범용 면역 수용체에 결합되는, 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 단계 i) 이후 3일마다 투여되는, 방법.
제20항에 있어서, 분자가 단계 i) 이후 21일 동안 3일마다 투여되는, 방법.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 단계 i) 이전에 적어도 1회 그리고 단계 i) 이후 약 14일 내지 약 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여되는, 방법.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 단계 i) 이전에 2회 그리고 단계 i) 이후 약 14일 내지 약 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여되는, 방법.
제2항 또는 제17항에 있어서, 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하는 단계가 대상체에서 사이토카인 수준을 증가시키는 단계, 바람직하게는 인터페론-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터루킨-2(IL-2) 중 하나 이상 또는 전부의 수준을 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii)이 단계 i)의 분자와 동일한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii)이 단계 i)의 분자와 상이한 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 질환과 관련된 하나 초과의 항원, 바람직하게는 질환과 관련된 2개의 항원에 결합하는 도메인을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 치료를 받지 않은 대상체와 비교했을 때 대상체의 생존율을 증가시키는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 암을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 화학요법, 방사선요법, 수술, 골수 이식, 약물 요법, 냉동절제술 또는 고주파 절제술로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 범용 면역 수용체가 세포외 힌지 영역에 결합된 SpyCatcher 또는 SpyTag 세포외 결합 도메인을 포함하고, 이는 차례로 면역 세포 수용체 세포내 신호전달 도메인에 결합되는 막관통 도메인에 차례로 결합되는, 방법.
제31항에 있어서, 범용 면역 수용체 세포내 신호전달 도메인이 공동자극 분자를 추가로 포함하는, 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, SpyCatcher 세포외 결합 도메인이 세포외 힌지 도메인에 결합되는, 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, SpyTag 세포외 결합 도메인이 세포외 힌지 도메인에 결합되는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 SpyCatcher 또는 SpyTag 및 도메인을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 도메인이 항체, 항체 단편, scFv, 단백질 스캐폴드, 펩타이드, 리간드, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 표지제, 종양 항원, 자가 항원, 바이러스 항원, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제35항에 있어서, 분자가 SpyTag를 포함하는, 방법.
제35항에 있어서, 분자가 SpyCatcher를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 또는 제13항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 약 0.25 mg/m² 내지 2.0 mg/m²의 용량, 약 5 mg/m² 내지 25 mg/m²의 용량, 또는 약 50 mg/m² 내지 100 mg/m²의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 대식세포, 줄기 세포 또는 이들의 조합인, 방법.
제40항에 있어서, T 세포가 CD3+ T 세포인, 방법.
제40항 또는 제41항에 있어서, T 세포가 세포독성 T 세포, 감마 델타 T 세포, T 조절 세포 또는 iNKT 세포인, 방법.
제40항에 있어서, 면역 세포의 약 10% 내지 약 50%가 CD8+ 세포인, 방법.
제40항에 있어서, CD45RO+CD45RA-T 이펙터 기억 세포의 강화 및/또는 CD45RA+CD45RO-T 중심 기억 세포의 강화를 제공하는, 방법.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 자가 세포인, 방법.
제1항, 제3항 내지 제16항 또는 제18항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 암, 감염 또는 염증성 질환인, 방법.
제46항에 있어서, 암이 신세포 암종, 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 교모세포종, 악성 신경교종, 골육종, 결장직장암, 위암, 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 활막 육종, 갑상선암, 유방암, 흑색종, 백혈병, 급성 골수 백혈병(AML) 또는 림프종인, 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유류인, 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환 치료용 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도로서, 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 투여될 것이고, 7일 후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석할 것이고, 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복되는 것인 용도.
대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도로서, 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 7일 이내에 적어도 2회 대상체에게 투여될 것이고, 7일 후 적어도 21일 동안 치료에 대한 반응성에 대해 대상체를 분석할 것이고, 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복되는 것인 용도.
면역 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체의 질환 치료용 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도로서, 범용 면역 수용체는 질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 14일 내지 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여될 것이고, 대상체가 치료에 반응했지만 질환이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복되는 것인, 용도.
대상체에서 종양에 대한 범용 면역 수용체 매개 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포의 용도로서, 범용 면역 수용체는 종양과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있으며, 분자는 세포 투여 후 14일 내지 28일 동안 2일 또는 3일마다 대상체에게 투여될 것이고, 대상체가 치료에 반응했지만 종양이 여전히 검출 가능한 경우, 치료가 반복되는 것인, 용도.
서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6으로 제공된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6 중 하나 또는 둘 모두와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 HER2 수용체에 결합할 수 있는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드.
서열 번호: 7 및/또는 서열 번호: 10으로 제공되거나 서열 번호: 8 및/또는 서열 번호: 9로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 EGFRvIII 수용체에 결합할 수 있는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드.
서열 번호: 11 및/또는 서열 번호: 14로 제공되거나 서열 번호: 12 및/또는 서열 번호: 13으로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 IL-13Ra2 수용체에 결합할 수 있는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드.
서열 번호: 15 및/또는 서열 번호: 16으로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 CD33 수용체에 결합할 수 있는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드.
서열 번호: 17 및/또는 서열 번호: 18로 제공된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 SpyCatcher을 포함하는 단백질에 공유 결합할 수 있고 암 세포 상의 C형 렉틴-유사(CLL1) 수용체에 결합할 수 있는, 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩타이드.
제54항 내지 제58항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는, 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드.
제59항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제59항의 폴리뉴클레오티드 및/또는 제60항의 벡터를 포함하는, 단리된 트랜스제닉 세포.
제59항의 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 제61항의 세포를 배양하는 단계, 및 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
질환과 관련된 항원에 결합하는 도메인을 포함하는 분자에 공유 결합될 수 있거나 결합되지 않을 수 있는 범용 면역 수용체를 포함하는 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 도메인은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 중 하나 이상 또는 전부, 또는 이와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.