CN117915932A - 通用受体免疫细胞疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于基于通用免疫受体细胞的疗法的方法。

Description

通用受体免疫细胞疗法

本申请要求于2021年7月28日提交的AU 2021902320的优先权，所述文献的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于基于通用免疫受体细胞的疗法的方法。

背景技术

尽管基于嵌合免疫的细胞疗法(如嵌合抗原受体(CAR)T细胞)作为血癌的细胞免疫疗法取得了成功，但这些疗法可能会出现独特的并发症，从而可能限制治疗效果。主要毒性可以从可治疗的B细胞发育不全到更严重的细胞因子释放综合征和神经毒性不等。此外，到目前为止，常规免疫细胞疗法对治疗实体瘤的疗效有限。这是由于许多因素造成的，包含免疫抑制肿瘤微环境(TME)、细胞运输效率低下和抗原表达异质性。在实体恶性肿瘤和血液恶性肿瘤的情况下，由于肿瘤逃逸而复发是常见的。这些都是目前细胞免疫疗法中未满足的需求，可以通过表达通用免疫受体的免疫细胞来解决。

通用免疫受体(UIR)由两个离散组分构成：(i)标准的胞内细胞信号传导结构域，其类似于具有胞外衔接蛋白(如SpyCatcher)的常规CAR，以及(ii)与衔接蛋白(如SpyTAG)缀合的靶向抗体(WO 2017/112784)。然后，靶向抗体可以充当免疫桥梁，用于靶向肿瘤抗原和SpyCatcher受体上的胞外衔接子，从而引发抗原特异性细胞应答。通过将CAR的抗原识别结构域从胞内信号传导结构域解耦成离散组分，然后可以用相同的UIR靶向一种或多种不同的抗原以克服免疫逃逸或肿瘤异质性，在施用后进行剂量调整或停药以调节UIR免疫细胞功能，从而进一步增加过继性免疫疗法的安全性。

需要改进基于通用免疫受体细胞的疗法，以便更加有效地和可靠地治疗如癌症等疾病，同时最大限度地减少当前(例如CAR T)疗法遇到的常见问题。

发明内容

本发明提供了用于通过通用免疫受体系统有效治疗受试者的方法。重组免疫细胞(如CAR T细胞)的持久性可以通过短暂休息来实现，这会导致表观遗传重塑。在本发明的情况下，这是通过标记结合剂的定期给药和停止给药来实现的。

一方面，本发明提供了一种治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的方法，所述方法包括

i)向所述受试者施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后的七天内向所述受试者施用所述分子至少两次，

iii)在步骤ii)之后的至少约21天分析所述受试者对所述治疗的应答性，以及

iv)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

另一方面，本发明提供了一种刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的方法，所述方法包括

i)向所述受试者施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后的七天内向所述受试者施用所述分子至少两次，

iii)在步骤ii)之后的至少约21天分析所述受试者对所述治疗的应答性，以及

iv)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

在一实施例中，所述分子不与步骤i)中的通用免疫受体结合。

在一实施例中，所述分子与步骤i)中的通用免疫受体结合。

在一实施例中，所述分子在步骤ii)中被施用两次。在一实施例中，所述分子在步骤i)之后的第3天和第6天施用。

在一实施例中，所述分子在步骤ii)中被施用三次。在一实施例中，所述分子在步骤i)之后的第1天、第4天和第6天施用。

在一实施例中，在步骤ii)之后的约21天与约49天之间分析受试者对治疗的应答性。在一实施例中，在步骤ii)之后的至少约21天分析受试者对治疗的应答性。在一实施例中，在步骤ii)之后的至少约49天分析受试者对治疗的应答性。

在一实施例中，步骤ii)包括在步骤i)之前向受试者施用分子至少一次，并在步骤i)之后的七天内施用至少两次。在一实施例中，步骤ii)包括在步骤i)之前向受试者施用分子两次，并在步骤i)之后的七天内施用至少两次。

在一实施例中，步骤(ii)包括以下给药方案之一：

(a)在施用步骤i)的免疫细胞之后的七天内，在24-48小时窗口内给药，并任选地重复给药；

(b)在施用步骤i)的免疫细胞之后的七天内，每24小时给药一次；

(c)在施用步骤i)的免疫细胞之后的七天内，定期给药，包括在给定的窗口内暂停治疗，在下一个窗口内恢复治疗，并且在下一个窗口内暂停治疗。

在以上(a)、(b)或(c)中的任一项中，步骤i)中施用的UIR细胞可以是未武装的或预先武装的。

在另一实施例中，所述分子以不同剂量施用。在一实例中，不同剂量为约0.75mg/m²的剂量、约15mg/m²的剂量和约75mg/m²的剂量。在另一实施例中，不同剂量可以包括以下中的任何一种或多种：约0.25mg/m²、约0.5mg/m²、约0.75mg/m²、约1mg/m²、约2.5mg/m²、约5.0mg/m²、约7.5mg/m²、约10mg/m²、约12.5mg/m²、约15.0mg/m²、约17.5mg/m²、约20mg/m²、约22.5mg/m²、约25mg/m²、约35mg/m²、约45mg/m²、约55mg/m²、约65mg/m²、约70mg/m²、约75mg/m²、约80mg/m²、约85mg/m²、约90mg/m²、约95mg/m²或更高。在另一实施例中，剂量可以介于约0.25mg/m²至2.0mg/m²之间、介于约0.5mg/m²至1.5mg/m²之间或介于约0.5mg/m²至1.0mg/m²之间。在另一实施例中，剂量可以介于约5mg/m²至25mg/m²之间、介于约10mg/m²至20mg/m²之间或介于约12mg/m²至17mg/m²之间。在另一实施例中，剂量可以介于约50mg/m²至100mg/m²之间、介于约60mg/m²至90mg/m²之间或介于约70mg/m²至80mg/m²之间。

在另一实施例中，对于约1.6的体表面积(BSA)，施用于受试者的分子的不同剂量包括约0.25mg、约24mg或约120mg。在另一实例中，对于约1.6的BSA，施用于受试者的分子的不同剂量包括以下中的任一种：0.1mg、约0.15mg、约0.25mg、约0.35mg、约0.45mg、约0.6mg、约12mg、约16mg、约20mg、约24mg、约28mg、约32mg、约36mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg或更高。在另一实施例中，施用于受试者的分子的不同剂量包括介于约0.1mg至2.0mg之间、介于约0.2mg至1.5mg之间或介于约0.2mg至0.75mg之间。在另一实施例中，施用于受试者的分子的不同剂量包括介于约4mg至36mg之间、介于约12mg至32mg之间或介于约20mg至28mg之间。在另一实施例中，分子的不同剂量包括介于约60mg至160mg之间、介于约80mg至140mg之间或介于约100mg至130mg之间。

在一实施例中，步骤iv)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体可以或可以不与包括与步骤i)的分子结合相同抗原的结构域的分子共价结合。在另一实施例中，步骤iv)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体可以或可以不与包括与步骤i)的分子结合不同抗原的结构域的分子共价结合。

在一实施例中，所述分子包括和与疾病相关的多于一种抗原结合的结构域。在一实施例中，所述分子包括和与疾病(优选地为癌症)相关的两种抗原结合的结构域。在另一实施例中，所述分子包括和与疾病(优选地为癌症)相关的三种抗原结合的结构域。

另一方面，本发明提供了一种治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的方法，所述方法包括

i)向所述受试者施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于约14天与约28天之间，以及

iii)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

另一方面，本发明提供了一种刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的方法，所述方法包括

i)向所述受试者施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于约14天与约28天之间，以及

iii)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

在上述方面的实施例中，所述分子不与步骤i)中的通用免疫受体结合。

在上述方面的实施例中，所述分子与步骤i)中的通用免疫受体结合。

在上述方面的实施例中，所述分子在步骤i)之后每三天施用一次。

在上述方面的实施例中，所述分子在步骤i)之后的21天每三天施用一次。

在上述方面的实施例中，在步骤ii)完成的7天内、5天内、3天内或1天内分析受试者对治疗的应答性。

在一实施例中，步骤ii)包括在施用步骤i)的免疫细胞之前向受试者施用分子至少一次，并在步骤i)之后每两天或三天施用一次，持续介于约14天与约28天之间。在一实施例中，步骤ii)包括在步骤i)之前向受试者施用分子两次，并在步骤i)之后每两天或三天施用一次，持续介于约14天与约28天之间。

在一实施例中，刺激对肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答包括增加受试者体内的细胞因子水平，优选地增加干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-2(IL-2)中的一者或多者或全部的水平。

在一实施例中，步骤iii)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体可以或可以不与包括与步骤i)的分子结合相同抗原的结构域的分子共价结合。在另一实施例中，步骤iii)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体可以或可以不与包括与步骤i)的分子结合不同抗原的结构域的分子共价结合。

在一实施例中，所述分子包括和与疾病相关的多于一种抗原结合的结构域。在一实施例中，所述分子包括和与疾病相关的两种抗原结合的结构域。在另一实施例中，所述分子包括和与疾病相关的三种抗原结合的结构域。

在一实施例中，治疗增加了受试者的生存期。在一实施例中，当与未接受治疗的受试者相比时，生存期增加。在一实施例中，当与未接受治疗的受试者相比时，生存期增加了3个月、6个月、9个月、12个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月或更长时间。

在一实施例中，受试者已被诊断为患有或疑似患有疾病，如癌症、感染或炎性疾病。因此，在一实施例中，本文所描述的方法包括将受试者诊断为患有或疑似患有疾病，如癌症、感染或炎性疾病的步骤。

在一实施例中，所述方法或用途进一步包括施用另外的治疗剂，任选地选自由以下组成的组：化学疗法、放射疗法、外科手术、骨髓移植、药物疗法、冷冻消融或射频消融。

在一实施例中，通用免疫受体包括与胞外铰链区结合的SpyCatcher或SpyTag胞外结合结构域，所述胞外铰链区进而与跨膜结构域结合，所述跨膜结构域进而与免疫细胞受体胞内信号传导结构域结合。

在一实施例中，通用免疫受体胞内信号传导结构域进一步包括共刺激分子。

在一实施例中，SpyCatcher胞外结合结构域与胞外铰链结构域结合。在替代性实施例中，SpyTag胞外结合结构域与胞外铰链结构域结合。

在一实施例中，所述分子包括SpyCatcher或SpyTag和结构域。

在一实施例中，结构域选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、scFv、蛋白质支架、肽、配体、寡核苷酸、适体、肿瘤抗原、自身抗原、病毒抗原以及其任何组合。在一实施例中，所述结构域是抗体或抗体片段。

在一实施例中，所述分子包括SpyTag。在一实施例中，所述分子包括SpyCatcher。

在替代性实施例中，以上提及的SpyTyg是SnoopTag，并且以上提及的SpyCatcher是SnoopCatcher。

在一实施例中，所述分子是包括与胞外结合结构域结合的第一结构域以及和与疾病相关的抗原结合的第二结构域的多肽。在一实施例中，所述分子进一步包括作为标记剂的第三结构域。

在一实施例中，所述分子以以下剂量施用于受试者：约0.25mg/m²、约0.5mg/m²、约0.75mg/m²、约1mg/m²、约2.5mg/m²、约5.0mg/m²、约7.5mg/m²、约10mg/m²、约12.5mg/m²、约15.0mg/m²、约17.5mg/m²、约20mg/m²、约22.5mg/m²、约25mg/m²、约35mg/m²、约45mg/m²、约55mg/m²、约65mg/m²、约70mg/m²、约75mg/m²、约80mg/m²、约85mg/m²、约90mg/m²、约95mg/m²或更高。在另一实施例中，施用于受试者的分子的剂量介于约0.25mg/m²至2.0mg/m²之间、介于约0.5mg/m²至1.5mg/m²之间或介于约0.5mg/m²至1.0mg/m²之间。在另一实施例中，施用于受试者的分子的剂量介于约5mg/m²至25mg/m²之间、介于约10mg/m²至20mg/m²之间或介于约12mg/m²至17mg/m²之间。在另一实施例中，施用于受试者的分子的剂量介于约50mg/m²至100mg/m²之间、介于约60mg/m²至90mg/m²之间或介于约70mg/m²至80mg/m²之间。优选地，施用于受试者的分子的剂量为约0.75mg/m²、约15mg/m²或约75mg/m²。

在一实施例中，对于约1.6的体表面积(BSA)，所述分子以以下剂量施用于受试者：0.1mg、约0.15mg、约0.25mg、约0.35mg、约0.45mg、约0.6mg、约12mg、约16mg、约20mg、约24mg、约28mg、约32mg、约36mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg或更高。在另一实施例中，施用于受试者的分子的剂量介于约0.1mg至2.0mg之间、介于约0.2mg至1.5mg之间或介于约0.2mg至0.75mg之间。在另一实施例中，施用于受试者的分子的剂量介于约4mg至36mg之间、介于约12mg至32mg之间或介于约20mg至28mg之间。在另一实施例中，施用于受试者的分子的剂量介于约60mg至160mg之间、介于约80mg至140mg之间或介于约100mg至130mg之间。优选地，施用于受试者的分子的剂量为约0.25mg、约24mg或约120mg。技术人员将理解如何计算不同BSA的等效剂量。

在一实施例中，免疫细胞是T细胞、NK细胞、树突状细胞、髓系细胞、巨噬细胞、干细胞或其组合。

在一实施例中，T细胞是CD3+T细胞。在一实施例中，T细胞是细胞毒性T细胞、γδT细胞、T调控性细胞或iNKT细胞。

在一实施例中，本文所描述的方法提供了CD4+和/或CD8+T细胞的富集。在另一实施例中，至少约10％的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，至少约20％的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，至少约30％的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，至少约40％的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，至少约50％的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，至少约60％的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，约10％与约60％之间的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，约10％与约50％之间的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，约10％与约40％之间的免疫细胞是CD8+细胞。在一实施例中，约10％与约30％之间的免疫细胞是CD8+细胞。

在另一实施例中，本文所描述的方法提供了CD45RO+CD45RA-T效应记忆细胞的富集。在另一实施例中，本文所描述的方法包括CD45RA+CD45RO-T中央记忆细胞的富集。

在本发明提供了施用包括与分子共价结合的通用免疫受体的免疫细胞的实施例中，所述方法增加了脾脏和/或肿瘤中的CD8+通用免疫受体细胞。

在一实施例中，所述细胞是自体细胞。在替代性实施例中，所述细胞是同种异体的。

在一实施例中，所述疾病是癌症、感染或炎性疾病。

可以使用本发明治疗的癌症的实例包含但不限于：肾细胞癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、急性髓系白血病(AML)或淋巴瘤。

在一实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一实施例中，所述受试者是人。

本发明进一步提供了一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的药物，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后的七天内将向所述受试者施用所述分子至少两次，其中在所述七天后的至少21天将分析所述受试者对所述治疗的应答性，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复所述治疗。

还提供了包括通用免疫受体的免疫细胞，其用于治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后的七天内将向所述受试者施用所述分子至少两次，其中在所述七天后的至少21天将分析所述受试者对所述治疗的应答性，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复所述治疗。

还提供了一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的药物，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后的七天内将向所述受试者施用所述分子至少两次，其中在所述七天后的至少21天将分析所述受试者对所述治疗的应答性，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复所述治疗。

还提供了包括通用免疫受体的免疫细胞，其用于刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后的七天内将向所述受试者施用所述分子至少两次，其中在所述七天后的至少21天将分析所述受试者对所述治疗的应答性，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复所述治疗。

还提供了一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的药物，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后将每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于14天与28天之间，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复所述治疗。

还提供了包括通用免疫受体的免疫细胞，其用于治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后将每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于14天与28天之间，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复所述治疗。

还提供了一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的药物，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后将每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于14天与28天之间，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复所述治疗。

还提供了包括通用免疫受体的免疫细胞，其用于刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答，其中所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后将每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于14天与28天之间，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复所述治疗。

另一方面，本发明提供了一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6提供的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的一者或两者至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的HER2受体结合。

另一方面，本发明提供了一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ IDNO:7和/或SEQ ID NO:10提供或作为SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9提供的氨基酸序列，或具有与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的EGFRvIII受体结合。

另一方面，本发明提供了一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ IDNO:11和/或SEQ ID NO:14提供或作为SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13提供的氨基酸序列，或具有与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的IL-13Ra2受体结合。

另一方面，本发明提供了一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ IDNO:15和/或SEQ ID NO:16提供的氨基酸序列，或与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的CD33受体结合。

另一方面，本发明提供了一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ IDNO:17和/或SEQ ID NO:18提供的氨基酸序列，或与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的C型凝集素样(CLL1)受体结合。

另一方面，本发明提供了一种分离的和/或外源性多核苷酸，其编码本发明的多肽。

在另外的方面，本发明提供了一种载体，所述载体包括本发明的多核苷酸。

在又另一方面，本发明提供了一种分离的转基因细胞，其包括本发明的多核苷酸和/或本发明的载体。在一实施例中，所述细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。

在又另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括免疫细胞，所述免疫细胞包括通用免疫受体，所述通用免疫受体可以或可以不与包括和与疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合。在一实施例中，所述结构域包括以下中的一者或多者或全部：SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18，或与其至少90％相同的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种产生本发明的多肽的方法，所述方法包括培养本发明的细胞，并从所述细胞或培养基中纯化所述多肽。

在一实施例中，在存在免疫细胞激活剂，优选地IL-2、抗CD3抗体或抗CD28抗体的情况下培养细胞。在另一实施例中，免疫细胞激活剂增加Tim-3和/或PD-1的表达。在又另一实施例中，至少约30％的免疫细胞是Tim-3和/或PD-1阳性的。

除非另有明确说明，否则本文中的任何实施例在进行必要的修改后应被视为适用于任何其它实施例。

本发明的范围不受本文所描述的具体实施例的限制，所述具体实施例旨在仅用于例示的目的。如本文所描述，功能等效的产物、组合物和方法显然在本发明的范围内。

贯穿本说明书，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应被视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即，一个和多个)。

在下文中通过以下非限制性实例并参考附图来描述本发明。

附图说明

图1至5-给药方案实例。

图6-结合剂的给药方案调节体内功能性UIR的表达。(A)‘未武装的’OmniCAR T细胞(仅FLAG+)和‘经武装的’OmniCAR T细胞(FLAG+IgG+)的表达。(B)通过IgG MFI在武装有浓度增加的抗体结合剂的CD8+FLAG+或CD4+FLAG+CAR T细胞中检测到的‘经武装的’OmniCAR受体。(C)由与MDA-MB231-HER2肿瘤共培养24小时的武装有浓度增加的结合剂的OmniCAR T细胞产生细胞因子IFNγ、TNF和IL-2。(D)示出了在过继转移后第1天或第7天从血液中分离的T细胞上的武装OmniCAR受体％的FACS图。(E)对于每3-4天给药不同剂量的结合剂的组，转移后第1天来自血液的CD8+FLAG+CAR T细胞的IgG+％。(F)对于每3-4天给药不同剂量的结合剂的组，转移后第1天血液中的武装IgG+FLAG+OmniCAR T细胞的计数。

图7-结合剂的给药方案调节体内T细胞记忆表型、扩增和持久性。(A)治疗方案示意图，低剂量＝1ug，高剂量＝25ug。根据治疗计划1-3，用单剂量1000-2000万未武装的或预先武装的OmniCAR T细胞治疗预处理的荷瘤小鼠，并进一步给予抗体结合剂。(B)转移后第1天每uL血液中CD8+FLAG+细胞的计数。(C)转移后第7天血液中在OmniCAR T细胞上染色的IgG的MFI。(D)对于未转导组与未武装的OmniCAR组，转移后第7天每uL血液中CD8+T细胞的总数。(E)CD45RO+CD45RA-(T效应记忆)或CD45RA+CD45RO-(T中央记忆)群体的记忆表型。显示为平均值±SEM的数据。

图8-结合剂的给药方案调节体内抗肿瘤功效。(A)用预先武装的OmniCAR T细胞处理并给予高剂量结合剂的小鼠的肿瘤生长曲线。(B)在疗法终点提取脾脏或(C)肿瘤，并对CD8+FLAG+OmniCAR T细胞进行计数。(D)来自终点肿瘤的CD8+FLAG+OmniCAR TIL的TIM3+PD1+群体％。(E)确定急性髓系白血病(AML)小鼠模型中肿瘤负荷随时间变化的生物发光成像。给予NSG小鼠500万个KG-1细胞，并且在CAR-T转移后的第3天、第6天和第9天给予动物未经处理(对照)或预先武装的OmniCAR-T细胞和25ug的CD33和CLL-1结合剂。显示为平均值±SEM的数据。

图9-结合剂的给药方案和特定设计调节OmniCAR抗原非依赖性信号传导或抗原依赖性信号传导。(A)72小时后未经刺激或经刺激的(OKT3)T细胞的TIM3表达，以CD8+FLAG+(上部)的％或CD4+FLAG+(下部)的％表示。(B)72小时后未经刺激或经刺激的(OKT3)T细胞的PD-1表达(左侧)，以CD8+FLAG+(上部)的％或CD4+FLAG+(下部)的％表示。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，^****p<0.0001，数据显示为平均值±SEM。

图10-顺序地或同时靶向多种肿瘤抗原的节拍给药。(A)U251MG-HER2(GFP)和U251MG-EGFRviii(mCherry)肿瘤的混合肿瘤培养物计数。(B)与混合肿瘤培养物共培养的抗HER2武装的OmniCAR T细胞。(C)与混合肿瘤培养物共培养的抗EGFRviii武装的OmniCART细胞。(D)在共培养后20小时，在添加(HER2LT切换)或不添加(无切换)抗HER2结合剂的情况下，与混合肿瘤培养物共培养的抗EGFRviii武装的OmniCAR T细胞。显示为平均值±SD的数据。(E)(上部)三种结合剂在同一OmniCAR T细胞样品上的表达直方图(下部)。同一OmniCAR T细胞产物上每个双重组合中结合剂表达的FAC图。(F)小鼠血清中HER2和EGFRvIII抗体结合剂的存在的确定。

图11-OmniCAR与常规CAR T细胞中调节记忆和抗肿瘤功能能力的抗原非依赖性强直性信号传导模型。(A)涵盖时间、剂量调节或多结合剂组合策略的节拍给药的示意图。(B)强直性信号传导的抗原非依赖性调节、记忆表型与功能/抗肿瘤能力之间相互关系的模型。

序列表符号说明

SEQ ID NO:1-SpyCatcher通用免疫受体氨基酸序列

SEQ ID NO:2-编码SpyCatcher通用免疫受体的核苷酸序列

SEQ ID NO:3-具有N端信号的标准Her2-SpyTag结合剂

SEQ ID NO:4-具有N端信号的短半衰期Her2-SpyTag结合剂

SEQ ID NO:5-不具有N端信号的标准Her2-SpyTag结合剂

SEQ ID NO:6-不具有N端信号的短半衰期Her2-SpyTag结合剂

SEQ ID NO:7-EGFRvIII重链氨基酸序列

SEQ ID NO:8-具有SpyTag氨基酸序列的EGFRvIII重链

SEQ ID NO:9-EGFRvIII轻链氨基酸序列

SEQ ID NO:10-具有SpyTag氨基酸序列的EGFRvIII轻链

SEQ ID NO:11-IL-13Ra2重链氨基酸序列

SEQ ID NO:12-具有SpyTag氨基酸序列的IL-13Ra2重链

SEQ ID NO:13-IL-13Ra2轻链氨基酸序列

SEQ ID NO:14-具有SpyTag氨基酸序列的IL-13Ra2轻链

SEQ ID NO:15-CD33重链氨基酸序列

SEQ ID NO:16-具有SpyTag氨基酸序列的CD33轻链氨基酸序列

SEQ ID NO:17-CLL1重链氨基酸序列

SEQ ID NO:18-具有SpyTag氨基酸序列的CLL1轻链氨基酸序列

具体实施方式

一般技术和定义

除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、基于细胞的免疫治疗、分子遗传学、蛋白质化学和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

除非另有说明，否则本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中进行了描述和解释：如J.Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》,约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)(1984)；J.Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbour Laboratory Press)(1989)；T.A.Brown(编辑),《基本分子生物学：实用方法(Essential Molecular Biology:A Practical Approach)》,第1卷和第2卷,IRL出版社(IRL Press)(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:APractical Approach)》,第1-4卷,IRL出版社(1995和1996)；以及F.M.Ausubel等人(编辑),《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(Greene Pub.Associates)和威利国际科学出版公司(Wiley-Interscience)(1988，包含迄今为止的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编辑)《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,冷泉港实验室,(1988)；以及J.E.Coligan等人(编辑),《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》,约翰威利父子出版公司(包含迄今为止的所有更新)。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两个含义或任一含义提供明确支持。

如本文所使用的，除非相反地说明，否则术语约是指指定值的+/-10％，更优选地+/-5％，更优选地+/-1％。

贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或变体(如“comprises”或“comprising”)应被理解为暗示包括一个所陈述的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其它要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组。

如本文所使用的，术语“受试者”可以是任何动物。在一个实施例中，动物是脊椎动物。例如，动物可以是哺乳动物、禽类、脊索动物、两栖动物或爬行动物。示例性受试者包含但不限于人、灵长类动物、家畜(例如，羊、牛、鸡、马、驴、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养野生动物(例如，狐狸、鹿)。在一个实施例中，哺乳动物是人。在一实施例中，本发明的方法用于兽医用途。

如本文所使用的，术语“治疗(treating或treatment)”是指由医学专业人员直接治疗受试者(例如，通过向受试者施用治疗剂)，或通过至少一方(例如，医生、护士、药剂师或药物销售代表)实现的间接治疗，这是通过提供呈任何形式的指示，其(i)指示受试者根据要求保护的方法自我治疗(例如，自我施用药物)或(ii)指示第三方根据要求保护的方法治疗受试者。术语“治疗(treating或treatment)”的含义还涵盖预防或减轻待治疗的疾病，例如通过在疾病的足够早期阶段施用治疗剂来预防或减缓其进展。

如本文所使用的，术语“受试者对治疗有应答但疾病仍可检测到”是指可检测到的疾病减少(如至少减少75％、至少减少50％或至少减少25％)(如肿瘤负荷减少)，但疾病仍存在。用于检测可以用本发明的方法治疗的疾病的方法是本领域众所周知的，并且包含成像(如PET、PET_SPECT和MRI)、细胞检测和病原体检测技术。

如本文所使用的，“细胞因子释放综合征”(CRS)是指以发热和多器官功能障碍为特征的急性全身炎症综合征，这与嵌合抗原受体细胞疗法、治疗性抗体和单倍同一性同种异体移植相关。

多肽可以通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性程度(同一性％)或通过与一个参考氨基酸序列的同一性百分比大于另一参考氨基酸序列来定义。多肽与参考氨基酸序列的同一性％通常通过GAP分析(Needleman和Wunsch,1970；GCG程序)确定，其中参数为空位产生罚分＝5并且空位延伸罚分＝0.3。查询序列的长度为至少100个氨基酸，并且GAP分析在至少100个氨基酸的区域内比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度为至少250个氨基酸，并且GAP分析在至少250个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在参考氨基酸序列的整个长度上比对两个序列。

关于定义的多肽，应当理解，比本文提供的那些更高的同一性％数字将涵盖优选实施例。因此，在适用的情况下，根据最小同一性％数字，优选的是，多肽包括与相关指定的SEQ ID NO至少91％，更优选地至少92％，更优选地至少93％，更优选地至少94％，更优选地至少95％，更优选地至少96％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％，更优选地至少99.1％，更优选地至少99.2％，更优选地至少99.3％，更优选地至少99.4％，更优选地至少99.5％，更优选地至少99.6％，更优选地至少99.7％，更优选地至少99.8％，并且甚至更优选地至少99.9％相同的氨基酸序列。在一实施例中，对于上文列出的范围中的每个范围，同一性％不包含100％，即氨基酸序列与指定的SEQ ID NO不同。

如本文所使用的，术语“组合疗法”、“联合施用”或“共施用”等意指涵盖对单个受试者施用所选的治疗剂，并且意指包含其中所述药剂通过相同或不同施用途径或在相同或不同时间施用的治疗方案。

通用免疫受体

如本文所使用的，“通用免疫受体”或“UIR”是一种嵌合抗原受体系统，其中免疫细胞重组表达蛋白质，所述蛋白质包括与胞外铰链区结合的胞外结合结构域，所述胞外铰链区进而与跨膜结构域结合，所述跨膜结构域进而与免疫细胞受体胞内信号传导结构域结合。所述系统进一步包括可溶性分子，所述可溶性分子包括与胞外结合结构域结合的第一结构域以及和与疾病相关的抗原(如癌细胞表面的癌抗原)结合的第二结构域。如本文所使用的，术语“通用免疫受体”可以指与胞外结合结构域结合(也称为经武装的)或不结合(也称为未武装的)的分子。当第一结构域结合胞外结合结构域时，用于本发明的UIR形成共价键。

用于本发明的通用免疫受体的实例是SpyTag/SpyCatcher系统(WO 2017/112784)。术语“SpyTag/SpyCatcher系统”涵盖系统的每个版本，如版本1(US 9,547,003)、版本2(WO 2018/197854)和版本3(WO 2020/183198)。作为另一实例，用于本发明的通用免疫受体是SnoopTag/SnoopCatcher系统(Veggiani等人，2016；WO 2016/193746)。

术语“嵌合抗原受体”或可替代地本发明上下文中的“CAR”是指一种多肽，当其在免疫细胞中时，一旦分子与胞外结合结构域(例如癌细胞)共价结合，所述多肽就会为细胞提供对靶细胞的特异性，并产生胞内信号。

CAR(UIR)可以用于产生免疫细胞，如T细胞、树突状细胞或自然杀伤(NK)细胞，其对选定的靶标具有特异性。用于产生CAR的合适构建体描述于US 5,843,728；US 5,851,828；US 5,912,170；US 6,004,811；US 6,284,240；US 6,392,013；US 6,410,014；US 6,753,162；US 8,211,422；和WO9215322中。替代性CAR构建体的特征在于可以属于连续几代。第一代CAR通常由对抗原具有特异性的抗体的单链可变片段组成，例如包括与特异性抗体的VH连接的VL，通过柔性接头，例如通过CD8a铰链结构域和CD8a跨膜结构域连接到CD3C或FcRy或scFv-FcRy的跨膜和胞内信号传导结构域(参见例如US 7,741,465；US 5,912,172；和US 5,906,936)。第二代CAR将一种或多种共刺激分子，如CD28、CD28z、OX40(CD134)或4-1BB(CD137)的胞内结构域并入到胞内域内，例如scFv-CD28/OX40/4BB-CD3(参见例如US 8,911,993；US 8,916,381；US 8,975,071；US 9,101,584；US 9,102,760；US 9,102,761)。第三代CAR包含共刺激胞内域的组合，如CD3C-链、CD97、GDI la-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB或CD28信号结构域，例如scFv-CD28-4 BB-CD3C或scFv-CD28-OX40-CD3Q(参见例如US 8,906,682；US 8,399,645；US 5,686,281；WO 2014134165；和WO2012079000)。在一些实施例中，可以通过在抗原特异性T细胞中表达CAR来协调共刺激，在共刺激的情况下，所述抗原特异性T细胞被选择以使得在例如与专业抗原呈递细胞上的抗原相互作用后被激活和扩增。可以在免疫细胞上提供另外的工程化受体，例如，以提高T细胞攻击的靶向性和/或将副作用降至最低。

本领域技术人员将意识到“抗体”通常被认为是包括由一个或多个多肽链组成的至少一个可变区的蛋白质，例如，包括V_L的多肽和/或包括V_H的多肽。抗体通常还包括恒定结构域，其中一些恒定结构域可以排列成恒定区，在重链的情况下，所述恒定区包含恒定片段或片段可结晶(Fc)区。V_H和V_L相互作用以形成包括抗原结合位点的Fv，所述抗原结合位点能够特异性地结合一种或几种密切相关的抗原。通常，哺乳动物中的轻链是κ轻链或λ轻链，而哺乳动物中的重链是α、δ、ε、γ或μ。抗体可以属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或亚类。术语“抗体”还涵盖人源化抗体、灵长类化抗体、人抗体和嵌合抗体。

术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换地用于指基本上完整形式的抗体，而不是抗体的抗原结合片段。具体地说，完全抗体包含具有包含Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如，人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。

如本文所使用的，术语“抗体片段”包含保留与靶抗原结合能力的抗体片段，例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv片段、抗体的其它抗原结合子序列，并且可以包含通过修饰完全抗体产生的片段或使用重组DNA技术重新合成的片段以及从IgG以外的抗体获得的对应片段。这些抗体片段是使用常规程序获得的，如J.Goding,《单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)》,第98-118页(纽约学术出版社1983)中描述的蛋白水解片段化程序，以及本领域技术人员已知的其它技术。以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

合适的抗体或抗原结合片段包含但不限于IgG、IgA、IgM、IgE、单克隆抗体、Fab'、rIgG(半抗体)、f(ab')2、纳米抗体、嵌合抗体、scFv、scFv多聚体、单结构域抗体或单结构域融合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体样分子是单克隆抗体或其抗原结合片段。如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。

在一实施例中，分子是多肽。在一实施例中，分子是由单个开放阅读框编码的单个多肽链。

在一实施例中，所述分子进一步包括作为标记剂的第三结构域。在一些实施例中，标记剂选自由以下组成的组：myc-tag、FLAG-tag、His-tag、HA-tag、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP))、荧光团(例如四甲基罗丹明(TRITC)、异硫氰酸荧光素(FITC))、二硝基酚、紫罗兰素叶绿素蛋白复合物、绿色荧光蛋白、藻红蛋白(PE)、组氨酸、生物素、链霉亲和素、亲和素、辣根过氧化物酶、棕榈酰化、亚硝酰化、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白、放射性同位素以及用于放射性同位素标记的任何类型的化合物，包含1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTP A)和1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)。

包括和与疾病相关的抗原结合的结构域的分子可以通过本领域已知的任何方式产生。在一个实施例中，从表达分子的重组细胞中产生并纯化分子。在另一实施例中，分子是合成的。

制备表达UIR的细胞的方法

细胞来源

在扩增和可能的基因修饰或其它修饰之前，可以从受试者中获得包括免疫细胞，如T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞(NK)或其组合或由其组成的细胞群体。可以从多个来源获得免疫细胞，包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。

在本公开的某些实施例中，免疫细胞(例如，T细胞)可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(如Ficoll^TM分离)从受试者收集的血液单元获得。在一个优选实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、树突状细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施例中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆级分，并且任选地，将细胞放置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一个实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在替代性实施例中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。

在没有钙的情况下，初始的激活步骤可能导致激活放大。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域的人员已知的方法来完成，如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器巴克斯特公司CytoMate或Haemonetics公司细胞保存器5(Haemonetics Cell Saver 5))。在洗涤之后，可以将细胞重新悬浮于多种生物相容性缓冲液中，例如，不含Ca、不含Mg PBS、勃脉力A(PlasmaLyte A)或具有或不具有缓冲液的其它盐水溶液中。可替代地，可以去除单采术样品的不期望组分并且将细胞直接重新悬浮于培养基中。

应认识到，本申请的方法可以利用包括5％或更少，例如2％的人AB血清的培养基条件，并且使用已知的培养基条件和组合物，例如Smith等人(2015)中所描述的培养基条件和组合物。

在一个实施例中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞，例如通过PERCOLL^TM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离T细胞。

本文所描述的方法可以包含例如选择免疫细胞例如，T细胞的特定亚群体，其是T调控性细胞耗竭的群体。例如，可以使用例如本文所描述的阴性选择技术等方法获得CD25+耗竭的细胞群体。优选地，T调控性耗竭的细胞的群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。

在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2从群体中去除T调控性(T_REG)细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施例中，抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与底物，例如，珠粒缀合，或以其它方式涂覆在底物，例如，珠粒上。在一个实施例中，抗CD25抗体或其片段与如本文所描述的底物缀合。

不希望受特定理论的束缚，在单采术前或制备表达UIR的细胞产品期间，降低受试者的免疫细胞的负调节因子水平(例如，减少不期望的免疫细胞的数量，例如T_REG细胞)可以降低受试者复发的风险。例如，耗竭T_REG细胞的方法是本领域中已知的。降低T_REG细胞的方法包含但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所描述的抗GITR抗体)、CD25耗竭以及其组合。

在一些实施例中，制备方法包括在制备表达UIR的细胞之前减少(例如，耗竭)T_REG细胞的数量。例如，制备方法包括在制备表达UIR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产品之前，使样品，例如单采术样品接触抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段，或CD25结合配体)，以耗竭T_REG细胞。

用于刺激的细胞也可以在洗涤步骤之后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群体中的粒细胞和在一定程度上去除单核细胞而提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在此上下文中将是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS、或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖的培养基、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％勃脈力A(Plasmalyte-A)、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或含有例如Hespan和勃脈力A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并且以液氮储存罐的气相形式储存。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃下或在液氮中的立即不受控冷冻。

在某些实施例中，如本文所描述将冷冻保存的细胞解冻和清洗，并且在使用本发明的方法激活之前在室温下静置一小时。

在本发明的上下文中，还设想了在可能需要如本文所描述的扩增的细胞之前的时间段从受试者采集血液样品或单采术产品。因此，可以在任何必要的时间点收集要扩增的细胞来源，并且分离和冷冻期望的细胞，如T细胞，以供以后用于将受益于免疫细胞疗法的许多疾病或病状的免疫细胞疗法，例如本文所描述的。在一个实施例中，血液样品或单采物取自一般健康的受试者。在某些实施例中，从有患上疾病的风险但尚未患上疾病的一般健康受试者中采集血液样品或单采物，并且分离和冷冻所关注细胞以供以后使用。在某些实施例中，T细胞可以被扩增、冷冻并在以后时间使用。在某些实施例中，如本文所描述，在特定疾病诊断后不久，但在任何治疗前，从患者收集样品。在另外的实施例中，在任何数量的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，所述治疗模式包含但不限于用药剂如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和放射疗法进行治疗。

制备表达UIR的细胞的方法

在一实施例中，本发明的方法包含通过将编码UIR的载体或核酸引入到细胞中来制备表达UIR的细胞。将基因引入到细胞中并进行表达的方法在本领域是已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包含磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是众所周知的(参见例如Sambrook,《分子克隆：实验室手册》,第1-4卷,冷泉港实验室出版社)。将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。

用于将所关注多核苷酸引入到宿主细胞中的生物方法包含使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体已成为用于将基因插入到哺乳动物，例如，人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等(参见例如，US 5,350,674和US 5,585,362)。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包含胶分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒以及包含水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体的基于脂质的系统。用作体外和体内递送媒剂的示例性胶态系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。以现有技术靶向递送核酸的其它方法是可用的，如用靶向纳米颗粒或其它适合的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。

一种示例性非病毒递送媒剂是脂质体。考虑使用脂质调配物将核酸引入到宿主T细胞中(体外、离体或体内)。在另一实施例中，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质缔合的核酸包封在脂质体的含水内部、散布在脂质体的脂质双层、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子连接至脂质体、捕获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为脂质中的悬浮液而含有、含有微团或与微团复合、或以其它方式与脂质缔合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物分不限于溶液中的任何具体结构。例如，所述组合物可以按以下存在：双层结构、微团或“塌陷”结构。所述组合物还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或性状并不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂质或合成脂质的脂肪物质。例如，脂质包含在细胞质中天然存在的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃的化合物以及其衍生物(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、和醛)的类别。适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K实验室(K&KLaboratories)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring公司(Calbiochem-Behring)获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从埃文蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)获得。脂质于氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是涵盖由封闭的脂质双层或聚集体的生成而形成的各种单层和多层脂质媒剂的通用术语。脂质体可以表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性培养基的囊泡结构。

多层脂质体具有由水性介质分隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量的水溶液中时，磷脂会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991)。然而，还涵盖在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可能呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。

不管用于将外源性核酸引入宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种分析。此类测定包含例如本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所描述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明的范围内的药剂。

培养和扩增免疫细胞的方法

通常可以使用如例如在以下文献中描述的方法来激活和扩增如T细胞等免疫细胞：US 6,352,694；US 6,534,055；US 6,905,680；US 6,692,964；US 5,858,358；US 6,887,466；US 6,905,681；US 7,144,575；US 7,067,318；US 7,172,869；US 7,232,566；US 7,175,843；US 5,883,223；US 6,905,874；US 6,797,514；US 6,867,041；以及US20060121005。

通过本文所公开的方法扩增T细胞可以使细胞倍增约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及介于两者之间的任何和所有整体整数或部分整数。在一个实施例中，T细胞的扩增范围是约20倍到约50倍。

在一实施例中，将细胞培养约7天至约14天或约7天至约10天。

通常，免疫细胞，例如T调控性细胞耗竭细胞的群体可以通过与和刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞的表面上的共刺激分子的配体附接的表面接触来扩增。具体地，T细胞群体可以如本文所述被刺激，如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触或通过与和钙离子载体结合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触。对于辅助分子在T细胞表面的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，可以将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包含可以用作本领域通常已知的其它方法的9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松市的Diaclone公司(Diaclone,Besancon,France)(Berg等人,1998；Haanen等人,1999；Garland等人,1999)。

适于免疫细胞培养的条件包含适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(龙沙公司(Lonza)))，所述培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包含血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF、TNF-a或本领域的技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包含但不限于：表面活性剂、血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂(诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包含RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo20、Optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，其无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包含于实验培养物，而不包含于待注入受试者体内的细胞培养物。靶细胞保持处于支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO₂)。

US 5,199,942中描述了用于造血干细胞和祖细胞的体外扩增的方法，所述方法可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于任何特定的体外细胞扩增方法。简而言之，免疫细胞(例如，T细胞)的体外培养和扩增包括：(1)从哺乳动物的外周血液采集物或骨髓外植体中收集CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)体外扩增此类细胞。除了在US 5,199,942中描述的细胞生长因子外，其它因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-试剂盒配体也可以用于细胞的培养和扩增。

免疫细胞

如本文所使用的，短语“免疫细胞”是指在识别抗原时能够影响或诱导免疫应答的细胞。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。所述细胞对于所施用的受试者可以是自体的或同种异体的。

用于本发明的干细胞的实例包含但不限于造血干细胞/祖细胞和诱导性多能干细胞。

如本文所使用的，短语“细胞毒性活性”是指免疫细胞，如NK细胞破坏活细胞的能力。

如本文所使用的，术语“免疫应答”在本领域中具有其普通含义，并且包含体液免疫和细胞免疫两者。免疫应答可以表现为以下一种或多种：抗原抗体的发展、抗原特异性T细胞的扩增、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的增加、抗肿瘤或抗肿瘤抗原迟发型超敏(DTH)应答的发展、病原体的清除、病原体和/或肿瘤生长和/或扩散的抑制、肿瘤的缩小、转移的减少或消除、复发时间的延长、无病原体或无肿瘤生存期的延长以及生存期的延长。免疫应答可以由以下一种或多种方式介导：B细胞激活、T细胞激活、自然杀伤细胞激活、抗原呈递细胞(例如，B细胞、DC、单核细胞和/或巨噬细胞)激活、细胞因子产生、趋化因子产生、特异性细胞表面标志物表达，具体地共刺激分子的表达。免疫应答可以通过体液应答、细胞应答、Th1或Th2应答或其组合来表征。在一实施例中，免疫应答是先天免疫应答。

T细胞

在一些实施例中，免疫细胞是T细胞，例如UIR-T细胞。T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起关键作用的淋巴细胞类型。其可以通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其它淋巴细胞，如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)区分开。存在T细胞的几个亚群，每个亚群都具有不同的功能。

在一实施例中，T细胞是或包含中央记忆(T_CM)T细胞。TCM细胞在淋巴结中游走，从而提供针对已知病原体的中枢免疫监视，但尚未被描述为进行原代组织免疫监视。在一实施例中，使用本发明的方法产生的T_CM细胞包含CD45RO+CD62L+T细胞，优选地CD45RO+CD62L^hi T细胞。此类细胞也可能是CCR7+。

在一实施例中，T细胞是或包含中央记忆干细胞(T_SCM)T细胞。T_SCM细胞是一种罕见的记忆淋巴细胞的亚群，具有类似干细胞的自我更新能力和多潜能能力，以重构整个记忆和效应亚群。在一实施例中，T_SCM细胞包含CD27⁺CD95⁺T细胞。

如本文所使用的，调控性T细胞(T_REG)或其变体是指对维持免疫耐受至关重要的T细胞的群体。其主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并且抑制在胸腺中逃避阴性选择过程的自动反应性T细胞。目前已描述了两大种类的CD4+T_REG细胞-Foxp3+和Foxp3-。

γδ(gamma delta)T细胞是“非常规”T细胞的原型，并且表示外周血中相对较小的T细胞亚群。其通过由γ和δ链组成的异二聚体T细胞受体(TCR)的表达来定义。这使其有别于表达αβTCR的CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。

iNKT(不变NKT)细胞被分类为先天样淋巴细胞，当抗原与TCR结合时，所述先天样淋巴细胞迅速分泌Th1或Th2细胞因子。活化的iNKT细胞可以通过募集、活化或调节NK细胞、DC、B细胞和T细胞的应答来调节适应性免疫应答。

在一实施例中，T细胞是原初T细胞。如本文所使用的，术语“原初T细胞”是指已经成熟并由胸腺释放但尚未遇到其对应抗原的T细胞群体。换句话说，原初T细胞处于介于成熟与激活之间的阶段。原初T细胞通常通过以下表征：L-选择素(CD62L)和C-C趋化因子受体7型(CCR7)的表面表达；不存在激活标志物CD25、CD44或CD69；并且不存在记忆CD45RO同种型。它们还表达由亚单元IL-7受体-α(CD127)和共同γ链(CD132)组成的功能IL-7受体。

缺乏功能性内源性T细胞受体(TCR)的T细胞可以例如进行工程化使其表面不表达任何功能性TCR，进行工程化使其不表达包括功能性TCR的一个或多个亚基，或进行工程化使其表面产生很少的功能性TCR。可替代地，T细胞可以例如通过表达TCR的亚基中的一个或多个亚基的突变或截短形式来表达显著受损的TCR。术语“显著受损的TCR”意指此TCR不会在宿主中引发不利免疫反应。

本文所描述的T细胞可以例如被工程化为使得其不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以被工程化为使得细胞表面表达HLA，例如HLA 1类和/或HLA II类，被下调。在一些实施例中，T细胞可能缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLAII类。

缺乏功能性TCR和/或HLA的表达的经修饰的T细胞可以通过任何合适的方式获得，包含敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包含使用siRNA、shRNA、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。

自然杀伤细胞

在一些实施例中，免疫细胞是自然杀伤细胞。自然杀伤(NK)细胞是CD56 CD3大颗粒淋巴细胞，其可以杀死感染和转化的细胞，并且构成先天免疫系统的关键细胞亚群。与细胞毒性CD8+T淋巴细胞不同，NK细胞无需事先致敏即可对肿瘤细胞产生细胞毒性，并且还可以根除MHC-I阴性细胞。在一实施例中，NK细胞是CD3-CD56+CD7+CD127-NKp46+T-bet+Eomes+。在一实施例中，细胞毒性NK细胞是CD56^dim CD16+。

树突状细胞

在一些实施例中，免疫细胞是树突状细胞。树突状细胞是一组异质性的专门的抗原呈递细胞，在骨髓中起源于CD34+干细胞并且表达主要组织相容性复合体(MHC)II类分子。成熟的树突状细胞能够刺激、激活和扩增效应免疫细胞，如T细胞和NK细胞。树突状细胞疗法在本领域是众所周知的(参见Sabado等人,2017年)。简而言之，树突状细胞可以从患者体内分离，暴露于疾病特异性抗原，例如癌症特异性抗原，或者经基因修饰以表达UIR或疾病特异性抗原，并且然后再输注回致敏、激活和扩增效应免疫细胞，例如T细胞的患者体内。

髓系细胞

在一些实施例中，免疫细胞是髓系细胞。粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞代表白细胞的亚群，统称为髓系细胞。所述细胞通过血液和淋巴系统循环，并且通过各种趋化因子受体迅速募集到损伤和感染的组织部位。在组织内，所述细胞被激活进行吞噬并分泌炎性细胞因子，由此在保护性免疫中发挥重要作用。髓系细胞疗法是本领域已知的疗法，并且可用于治疗癌症、感染或疾病。例如，已知髓系细胞在肿瘤基质中大量存在，并且这些细胞的存在可能影响许多癌症类型患者结果。简而言之，髓系细胞可以从患者体内分离，暴露于疾病特异性抗原，例如癌症特异性抗原，或者经基因修饰以表达UIR或疾病特异性抗原，并且然后再输注回致敏、激活和扩增效应免疫细胞，例如T细胞的患者体内。

巨噬细胞

巨噬细胞是涉及检测、吞噬和破坏细菌和其它有害生物体的专门细胞。另外，其还可以向T细胞呈递抗原，并通过释放激活其它细胞的分子(称为细胞因子)来引发炎症。

表达UIR的细胞疗法

UIR细胞疗法是一种细胞疗法，在所述细胞疗法中，免疫细胞(例如，T细胞)经基因修饰以表达UIR，并且将表达UIR的细胞(例如，UIR-T细胞)输注给有需要的受体。输注的细胞能够杀死受体中表达UIR的靶标的患病细胞。与抗体疗法不同，经UIR修饰的免疫细胞(例如，UIR-T细胞)能够在体内复制，产生使得可以实现对肿瘤的持续控制的长期持久性。在各个实施例中，在向患者施用UIR细胞之后，向患者施用的UIR细胞或其后代在患者体内持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

在一实施例中，当向受试者施用时，UIR细胞被预先武装。更具体地，在向受试者施用前，细胞已经在一定条件下暴露于分子，使得所述分子与UIR共价结合，因此当施用所述细胞时能够与靶细胞(如癌细胞)结合。

在一实施例中，当向受试者施用时，UIR细胞未被预先武装。更具体地，在向受试者施用前，细胞未在一定条件下暴露于分子，使得所述分子与UIR共价结合。在此实施例中，为了使细胞具有功能，还向受试者施用分子以使细胞在体内武装。

在一个实施例中，施用预先武装的UIR细胞，随后每3天，如在第1天、第4天和第6天施用分子，持续约21天。

在一实施例中，施用预先武装的UIR细胞，随后每周两次，如在第3天和第6天施用分子，随后休息约21天。

在一实施例中，施用未武装的UIR细胞，随后每周两次，如在第3天和第6天施用分子，随后休息约21天。

在一实施例中，施用预先武装的UIR细胞，随后每周三次，如在第1天、第4天和第6天施用分子，随后休息约21天。

在一实施例中，施用未武装的UIR细胞，随后每周三次，如在第1天、第4天和第6天施用分子，随后休息约49天。

本发明可以在多个周期中进行。例如，在如本文所定义的第一个周期后，分析受试者以确定所述受试者是否对疗法有应答。如果受试者对治疗有应答，但疾病仍是可检测的，则受试者可以经受第二周期的疗法。此外，如果在第二周期后受试者对治疗有应答，但疾病仍是可检测的，则受试者可以经受第三周期的疗法，依此类推。

在一实施例中，受试者在确定其是否对疗法有应答之前休息。在一实施例中，受试者休息持续约21天。在一实施例中，受试者休息持续约28天。在一实施例中，受试者休息持续约35天。在一实施例中，受试者休息持续约42天。在一实施例中，受试者休息持续约49天。

本发明还包含一种细胞疗法，在所述细胞疗法中，例如通过体外转录RNA修饰免疫细胞(例如，T细胞)，以使其瞬时表达UIR，并且将UIR-T细胞输注至有需要的受体。所输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在各个实施例中，向患者施用UIR-T细胞之后，向患者施用的免疫细胞(例如，UIR-T细胞)的存在时间少于一个月，例如三周、两周、一周。不希望受到任何特定理论的束缚，UIR-T细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动免疫应答或被动免疫应答，或者可替代地可以是直接免疫应答相对于间接免疫应答。

当本发明考虑用于刺激受试者中针对肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的方法时，设想由UIR-T细胞引发的免疫应答，无论是主动免疫应答或被动免疫应答，或者是直接免疫应答相对于间接免疫应答，都足以治疗受试者的癌症。

如上所述，体外程序在本领域是众所周知的，并且上文也有描述。简而言之，从哺乳动物(例如，人)分离细胞，并且用表达UIR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。表达UIR的细胞(例如，UIR-T细胞)可以向哺乳动物受体施用以提供治疗性益处。哺乳动物受体可以是人，并且表达UIR的细胞相对于受体可以是自体的。可替代地，相对于受体而言，细胞可以是同种异体的、同基因的或异基因的。

如本文所描述的，本发明的UIR细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群体组合施用。免疫细胞可以单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分，如IL-2、IL-15、或其它细胞因子或细胞群体组合施用。简而言之，药物组合物可以包括如本文所描述的免疫细胞与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可以包括缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。在一些实施例中，调配在所公开的方法中使用的组合物以静脉内施用。

包括本文所描述的细胞的药物组合物可以以10⁴到10⁹个细胞/kg体重，如10⁵到10⁶个细胞/kg体重(包含那些范围内的所有整数值)的剂量施用。还可以按这些剂量多次施用细胞组合物。细胞可以通过使用免疫疗法中已知的输注技术来施用(参见例如，Rosenberg等人,1988)。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗容易地确定。

包括本文所描述的分子(结合剂)的药物组合物可以以例如介于0.5mg/kg至5mg/kg之间的剂量施用。

在某些实施例中，可以期望向受试者施用激活的免疫细胞，并且随后重新抽血(或进行单采术)，从中激活和扩增免疫细胞，并且向患者重新输注这些激活的和扩增的T细胞。此过程可以每隔几周执行多次。在某些实施例中，可以抽取10cc到400cc的血液来激活免疫细胞。在某些实施例中，通过抽取20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液来激活免疫细胞。使用此多次抽血/多次重新输注方案可以用于选出某些免疫细胞的群体。

组合疗法

免疫细胞，如本发明的UIR-T细胞，或根据本发明的方法产生的免疫细胞可以与选自由以下组成的组的一种或多种另外的治疗活性组分共调配和/或共施用：PRLR拮抗剂(例如，抗PRLR抗体或PRLR的小分子抑制剂)、EGFR拮抗剂(例如，抗EGFR抗体[例如，西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])、另一EGFR家族成员，如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗ErbB2[例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)或T-DM1]、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性小分子抑制剂)、cMET拮抗剂(例如，抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如，抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如，维莫非尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如，抗PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)或苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)等)、PDGF配体抑制剂(例如，抗PDGF-A、-B、-C或-D抗体、适配体、siRNA等)、VEGF拮抗剂(例如，VEGF-陷阱，如阿柏西普(aflibercept)，参见例如US 7,087,411(本文也称为“VEGF抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼(pazopanib)))、DLL4拮抗剂(例如，US2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如，US2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如，抗FOLH1抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如，抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如，抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如，抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如，抗CA9抗体)、尿斑素拮抗剂(例如，抗尿斑素[例如，抗UPK3A]抗体)、MUC16拮抗剂(例如，抗MUC16抗体)、Tn抗原拮抗剂(例如，抗Tn抗体)、CLEC12A拮抗剂(例如，抗CLEC12A抗体)、TNFRSF17拮抗剂(例如，抗TNFRSF17抗体)、LGR5拮抗剂(例如，抗LGR5抗体)、单价CD20拮抗剂(例如，单价抗CD20抗体，如利妥昔单抗(rituximab))、PD-1抗体、PD-L1抗体、CD3抗体、CTLA-4抗体等。可以与本发明的UIR-T细胞有益地组合施用的其它药剂包含例如他莫昔芬(tamoxifen)、芳香化酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包含小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18)或其相应受体结合的抗体。

本发明包含包括本文所描述的任何免疫细胞，如UIR-T细胞与一种或多种化学治疗剂组合的组合物和治疗调配物。化学治疗剂的实例包含：烷化剂类，如塞替派和环磷酰胺(Cytoxan.TM.)；磺酸烷基酯类，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如，苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylomelamine)；氮芥类，例如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，例如，卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如，甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如，二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如，氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如，安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如，卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如，亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.TM.；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，紫杉醇(Taxol.TM.，新泽西州普林斯顿大学的百时美施贵宝肿瘤学(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.))和多西紫杉醇(Taxotere.TM.；法国Aventis Antony)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如，顺铂和卡铂(carboplatin)；长春碱；铂(platinum)；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸(retinoic acid)；埃斯波霉素；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在此定义中还包含其起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素类包含例如他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通)和抗雄激素类如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

可以按任何方便的方式(包含通过注射、输血或植入)来施用所公开的治疗剂中的任一种。本文所描述的组合物可以通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内施用。在一些实施例中，通过i.v.注射施用所公开的组合物。也可以将组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。

如本领域普通技术人员将理解的，上述细胞和/或分子将以治疗有效量向受试者施用。如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的治疗剂的足够量，其将在某种程度上缓解或预防正在治疗的疾病或病状的症状中的一个或多个症状的恶化。结果可能是减少或预防疾病的迹象、症状或病因的进展，或生物系统的任何其它期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是在没有过度不良副作用的情况下提供临床上显著减少的疾病症状所需的治疗剂的量。

术语“治疗有效量”包含例如预防有效量。治疗剂的“有效量”是在没有过度不良副作用的情况下有效实现期望的药理学效果或治疗改进的量。应当理解，“有效量”或“治疗有效量”可以因受试者而不同，这是由于受试者的年龄、体重、总体状况、所治疗的病状、所治疗的病状的严重程度以及处方医师的判断中的任一种的化合物的代谢变化。

利用常规实验(包含但不限于剂量递增临床试验)确定此类治疗有效量被认为完全属于所属领域的技能范围内。可以使用如剂量递增研究等技术来确定在任何个体病例中的合适的“有效量”。

当组合中使用多于一种治疗剂时，每种治疗剂的“治疗有效量”可以指单独使用时具有治疗效果的治疗剂的量，或者可以指由于与一种或多种另外的治疗剂组合使用而具有治疗效果的减少量。

治疗方法

本发明的或使用本发明产生的免疫细胞，例如UIR-T细胞尤其可用于治疗、预防和/或改善疾病或病症。例如，本发明的UIR-T细胞可用于治疗癌症、感染或炎性疾病。作为另一实例，通过本发明的方法产生的树突状细胞可以用作树突状细胞疫苗(参见例如Datta等人,2014年)，以用于治疗例如癌症、感染(如细菌或病毒感染)或自身免疫性疾病(如糖尿病)等。作为另外的实例，NK细胞，如NK-UIR细胞可以用于治疗癌症(参见例如Liu等人,2021年)。

UIR细胞可以用于治疗在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖道、肌肉、骨、皮肤和附属结构、结缔组织、脾脏、免疫系统、血液形成细胞和骨髓、肝脏和泌尿道以及如眼等特殊感觉器官中产生的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施例中，本发明的UIR细胞用于治疗以下癌症中的一种或多种癌症：肾细胞癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如，具有MET扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病或淋巴瘤。

在一实施例中，本发明的UIR细胞用于治疗白血病，例如急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病。在一实施例中，白血病是低CD33+未成熟细胞占主导地位的急性髓系白血病。

在另一实施例中，本发明的UIR细胞用于治疗淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤。非霍奇金氏淋巴瘤的类型包含弥漫大B细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或外周T细胞淋巴瘤。在一实施例中，淋巴瘤是具有低水平的CD19和/或CD20的弥漫大B细胞淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。

经武装的通用免疫受体可以结合的抗原的实例包含但不限于CD19、CD20、ROR1、CD22癌胚抗原、α-甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-l lRa、k链、l链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。

在本文所描述的治疗方法的上下文中，免疫细胞，如UIR细胞可以作为单一疗法(即，作为唯一的治疗剂)或与一种或多种另外的治疗剂(其实例在本文别处描述)组合(组合疗法)施用。

在一个实施例中，受试者有风险患上癌症(例如，癌症)。如果受试者患癌症的风险高于对照群体的风险，则所述受试者就有风险。对照群体可以包含从普通群体中随机选择的一名或多名未患过癌症或没有癌症家族史的受试者(例如，按年龄、性别、种族和/或民族进行匹配)。如果发现与癌症相关的“风险因素”与所述受试者相关，则受试者可以被认为有风险患上癌症。风险因素可以包含与给定病症相关的任何活动、特征、事件或属性，例如，通过对受试者群体进行统计或流行病学研究得出的结果。因此，即使鉴定潜在风险因素的研究未具体包含受试者，受试者也可以被归类为有风险患癌症。

在一个实施例中，受试者有风险患上癌症，并且在癌症的症状发作之前或之后施用细胞或组合物。在一个实施例中，所述细胞或组合物在癌症的症状发作之前施用。在一个实施例中，所述细胞或组合物在癌症的症状发作之后施用。在一个实施例中，本发明的所述细胞或组合物以减轻或减少有风险的受试者的癌症的症状中的一种或多种症状的剂量施用。

在一实施例中，受试者已被诊断为患有或疑似患有疾病或病症，如癌症、感染或炎性疾病。在一实施例中，本文所描述的方法包括将受试者诊断为患有或疑似患有疾病或病症，如癌症、感染或炎性疾病的步骤。

如本文所使用的诊断是指确定受试者或患者需要用本发明的免疫细胞进行治疗。根据本文所描述的方法诊断的疾病或病症的类型可以是本领域已知的或本文所描述的任何类型。

在一实施例中，鉴定或诊断需要用本发明的免疫细胞治疗的受试者的步骤包括确定受试者患有癌症，并且可以包含评估以下中的一种或多种或全部：

-血液概况分析；

-细胞活检抽吸物或组织活检；

-成像，如计算机断层扫描(CT)扫描、骨扫描、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)扫描、超声波和X射线；

-体格检查。

可以用NK细胞治疗的疾病的实例包含但不限于癌症(例如，黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌和肝癌)和感染，如病毒感染(例如，HSV、肝炎病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、黄病毒和HIV-1感染)、细菌感染(例如，分枝杆菌(Mycobacteria)、李斯特菌(Listeria)和葡萄球菌(Staphylococcus)感染)和原生动物感染(例如，疟原虫(Plasmodium)感染)和真菌感染(例如，曲霉菌属(Aspergillus)感染)。

炎性疾病的实例包含但不限于抗生素抗性微生物感染、特发性肺纤维化和阿尔茨海默氏病。

对于本技术人员是明显的，受试者的癌症的症状的“减轻”将与同样患有癌症但未接受用本文所描述的方法治疗的另一受试者相对比。这并不一定需要对两个受试者进行并排比较。而是可以依靠群体数据。例如，对未接受用本文所描述的方法治疗的癌症的患者群体(任选地，与经治疗的受试者类似的群体，例如，年龄、体重、种族)进行评估，并且将平均值与用本文所描述的方法治疗的受试者或受试者群体的结果进行比较。

在一个实施例中，本发明的免疫细胞和方法用于增加患有疾病或病症，如癌症、感染或炎性疾病的受试者的生存期。在设想生存期时，可以使用卡普兰-迈耶方法(Kaplan-Meier method)进行生存期分析。卡普兰-迈耶方法根据生命时间数据估计生存期函数，并且可以用于测量患者在治疗后存活一定时间的分数。生存期函数的卡普兰-迈耶方法的图是一系列幅度递减的水平步长，当采集足够大的样品时，这些步长接近所述群体的真正生存期函数。假设连续不同采样观测值(“点击”)之间的生存期函数值是恒定的。卡普兰-迈耶曲线的重要优点是所述方法可以在观察到最终结果之前考虑样品中的“删截的”数据损失(例如，如果患者退出研究)。在图中，小的竖直勾号标记表示损失，其中患者的数据已被删截。当没有截断或删截发生时，卡普兰-迈耶曲线等同于经验分布。

在统计学中，对数秩测试(也称为Mantel-Cox测试)是比较两组患者的生存期分布的假设检验。这是一种非参数测试，并且适合在数据被右删截时使用。这广泛用于临床试验中，以在测量发生时建立新药物相较于对照组的功效。对数秩测试统计比较了两组在每个观察到的事件时间时的危险函数估计值。这是通过以下来构建的：在每个观察到的事件时间时计算其中一个组中观察到的和预期的事件数量，并且然后将这些数量相加，以获得存在事件的所有时间点的总体汇总。对数秩统计可以递送作为比较两组的Cox比例风险模型的评分测试。因此，所述对数秩统计渐近地等同于基于所述模型的似然比检验统计。

实例

实例1-通用免疫受体

产生了一种SpyCatcher通用免疫受体，其从N端至C端依次具有由SEQ ID NO:2提供的多核苷酸序列编码的CD8a前导序列、SpyCatcher v003、CD8a铰链、CD8a跨膜结构域、CD28z共刺激结构域和CD3z胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:1)。

SEQ ID NO:1–SpyCatcher通用免疫受体。第一加下划线的区段是CD8前导序列，第二加下划线的区段是SpyCatcher，第三加下划线的区段是CD8a铰链区，随后是CD8a跨膜结构域，第四加下划线的区段是CD8a跨膜结构域，随后是CD28z共刺激结构域(不包括此区段的C端ID)，第五加下划线的区段是CD3z胞内信号传导结构域MALPVTALLLPLALLLHAARPGSVT TLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVET AAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHTASTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSIDRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

SEQ ID NO:2–编码SEQ ID NO:1的SpyCatcher通用免疫受体的多核苷酸。atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgggatccGTGACAACACTGAGCGGACTGTCTGGCGAGCAAGGCCCTTCTGGCGATATGACCACCGAAGAGGATAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGCGCGACGAGGACGGCAGAGAACTTGCTGGCGCTACCATGGAACTGAGAGACAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCTGACGGCCACGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGCTACGAAGTGGCCACACCTATCGAGTTCACCGTGAACGAGGATGGCCAAGTGACCGTGGATGGCGAAGCTACAGAAGGCGACGCCCATACAgctagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccatcgatagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa

此外，产生了两种与Her2结合的SpyTag结合分子。一种称为标准Her2结合剂，其包括N端信号肽、与Her2结合的抗体可变结构域、抗体恒定结构域、接头和SpyTag(SEQ ID NO:3)。另一种称为短半衰期结合剂，其具有赋予较短半衰期的抗体恒定结构域(SEQ ID NO:4)。在表达和处理后，N端信号肽被去除，使得所施用的分子缺少此肽(分别为SEQ ID NO:5和6)。

SEQ ID NO:3–具有N端信号序列的标准Her2结合剂(带SpyTag的重链)。第一加下划线的区段是N端信号序列，随后是与Her2结合的抗体可变结构域，第二加下划线的区段是抗体恒定结构域，随后是接头，并且第三加下划线的区段是Spytag。MAWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRG VPHIVMVDAYKRYK

SEQ ID NO:4–具有N端信号序列的短半衰期Her2变体(带SpyTag的重链)。第一加下划线的区段是N端信号序列，随后是与Her2结合的抗体可变结构域，第二加下划线的区段是短半衰期抗体恒定结构域，随后是接头，并且第三加下划线的区段是Spytag。

MAWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRGVPHIVMVDAYKRYK

SEQ ID NO:5–无N端信号序列(抗Her2-ST)的标准Her2结合剂(带SpyTag的重链)。

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRGVPHIVMVDAYKRYK

SEQ ID NO:6–无N端信号序列的短半衰期Her2变体(带SpyTag的重链)。EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSRGVPHIVMVD AYKRYK

与每种结合剂相关的DNA序列首先被重新合成为包含SpyTag序列的多核苷酸，然后将其克隆到转染级无内毒素质粒(例如pAb20-hCL-1)中。然后将其瞬时转染到许可细胞系如TunaCHO中，然后在DMEM/F12中培养14天，并且然后使用蛋白A纯化、尺寸排除色谱法和超高效液相色谱法纯化结合剂。使用质谱法进行同一性确认。已经开发和合成了另外的结合剂，并且根据本文的SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18公开了所述另外的结合剂。

实例2–细胞转染和扩增

将多形核细胞或富集的T细胞的制剂用CD3/CD28珠激活，持续24小时，然后在存在逆转录蛋白或凝聚胺的情况下用编码SpyCatcher构建体的慢病毒转导另外24小时，随之添加50IU/mL的重组IL-2。CD3/CD28珠将在连续培养7天后被取出，并且T细胞将被培养另外7天。转导效率将基于细胞表面上SpyCatcher的表达来确定，并且T细胞数量和表型将使用库尔特计数器(Coulter Counter)并通过多参数流式细胞术来确定。

实例3–UIR-T细胞的节拍给药

为了确定节拍给药对UIR-T细胞持久性和活性的影响，将对免疫缺陷NOD-SCID-γ(NSG)小鼠注射2-5x10⁶ MCF7或SKBR3乳腺癌细胞(通过乳腺脂肪垫或皮下注射)。将每隔一天测量肿瘤生长。在肿瘤注射后5-10天之后或当肿瘤达到20-30mm³时，这些小鼠将用0.5-1Gy的全身照射进行预处理。在同一天，所述小鼠将每3天静脉注射预先武装的UIR T细胞(200μL PBS中的1x10⁷ UIR T细胞)和抗Her2-ST(带SpyTag的抗Her 2结合剂或短半衰期版本)，持续21天(图1)，浓度为每只小鼠介于12.5μg至50μg之间。每个给药周期持续21天。

间歇性给药ST结合剂对持久性和UIR-T活性的影响也将在28天给药方案中进行评估，在所述给药方案中，当肿瘤大小达到20-30mm³(第0天)时，将施用预先武装的UIR T细胞，并且在第一周(例如在第3天和第6天)以每只小鼠介于12.5μg至50μg之间的浓度施用抗Her2-ST(或短半衰期版本)两次，随后休息21天(图2)。

体内武装和间歇性给药ST结合剂对UIR-T持久性和细胞毒性的影响也将在另一个28天给药方案中进行评估，在所述给药方案中，当肿瘤大小达到20-30mm³(第0天)时，将施用未武装的UIR T细胞，并且在第一周(例如在第3天和第6天)以每只小鼠介于12.5μg至50μg之间的浓度施用抗Her2-ST(或短半衰期版本)三次，随后休息21天(图3)。

体内武装和间歇性给药ST结合剂对UIR-T持久性和细胞毒性的影响也将在另一个28天给药方案中进行评估，在所述给药方案中，当肿瘤大小达到20-30mm³(第0天)时，将施用未武装的UIR T细胞，并且在第一周(例如在第1天、第4天和第7天)以每只小鼠介于12.5μg至50μg之间的浓度施用抗Her2-ST(或短半衰期版本)三次，随后休息21天(图4)。

体内武装和间歇性给药ST结合剂对UIR-T持久性和细胞毒性的影响也将在更长的56天给药方案中进行评估，在所述给药方案中，当肿瘤大小达到20-30mm³(第0天)时，将施用未武装的UIR T细胞，并且在第一周(例如在第1天、第4天和第7天)以每只小鼠介于12.5μg至50μg之间的浓度施用抗Her2-ST(或短半衰期版本)三次，随后休息49天(图5)。

实例4–UIR-T细胞抗肿瘤功效和给药

材料和方法

细胞系和小鼠模型

人乳腺癌细胞系MDA-MB231来源于ATCC并且用于接种NOD-SCIDγ(NSG)小鼠。定期对每个细胞系进行PCR分析以验证系是支原体阴性。将所有肿瘤细胞系均在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM(美国纽约格兰德岛的生命技术公司吉博科公司、生命技术公司(Gibco,Life Technologies,Grand Island,New York,USA))中培养。将细胞在37℃、含10％CO₂的湿润培养箱中生长。其它细胞系包含从美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC(ATCC,Manassas,VA,USA))获得的逆转录病毒和慢病毒包装系HEK293gp、PA317和GP+E86。将GP+E86、PA317、HEK293T和HEK293gp维持在与上文所描述的肿瘤细胞培养基相同的培养基中。

第3代慢病毒产生

使用第3代慢病毒包膜、包装和转移质粒，并来源于Addgene公司(Addgene)。转移质粒是pULTRA质粒的经修饰的变体。在接种2300万HEK293T包装细胞前，将T175烧瓶预先包被有聚-D-赖氨酸(50ug/mL)并洗涤。24小时后，按照制造商的说明使用Lipofectamine3000试剂用1:1:1:1摩尔比的质粒转染细胞。在转染后第1天、第2天和第3天收集病毒上清液，过滤(0.45uM)并用来自塔卡拉生物公司(Takara Bio)的Lenti-X-Concentrator试剂浓缩，之后在-80℃下冷冻等分试样。

人PBMC的慢病毒转导

通过用1:1比率的PBS稀释来处理新鲜供体人PBMC，之后通过Ficoll分离进行分离。将白细胞从血清和红细胞中分离，并在另外的红细胞裂解之前收集。裂解后，用OKT3(30ng/mL)、600IU的人IL-2和完全RPMI(10％FCS、丙酮酸钠、glutamax、NEAA、HEPES和青霉素/链霉素)培养基以100万个细胞/mL的细胞浓度激活细胞最少48小时。激活后，用600IUIL-2以100万个T细胞/mL重新接种经激活的T细胞，之后添加1MOI功能滴度的慢病毒和慢增强试剂(1:400)。将细胞充满培养基和IL-2并培养最少72小时。

流式细胞术

将收集的细胞首先用FACS缓冲液洗涤，并且然后在冰上用荧光团缀合的抗体染色30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤至少两次，之后重新悬浮于FACS缓冲液中并对珠(20uL，约20,000个珠)进行计数。对于胞内或核内染色，将经染色的细胞按照制造商的说明分别使用BD生物科学公司(BD Biosciences)或eBioscience试剂盒进一步固定和渗透。然后将经固定和渗透的细胞在室温下进一步染色荧光团缀合的抗体30分钟，之后用perm/wash缓冲液洗涤至少两次，并且最后与计数珠一起重新悬浮于perm/wash缓冲液中。将经染色的样品在BD FACSymphony、FACSFortessa或LSR(BD生物科学公司)上获得。靶细胞群体的数量的计算方法是：样品中的输入珠的数量/珠事件×靶向群体的事件。

CAR T细胞和肿瘤细胞的共培养

为了用OKT3(1:1000)直接激活人CAR T细胞，将平底96孔板在37℃下预包被至少1小时。为了肿瘤共培养，将CAR T细胞和肿瘤细胞在200μL补充的RPMI培养基中以不同的E:T比率与50,000个肿瘤细胞/孔在平底96孔板中共培养。将细胞在37℃和5％CO2下共培养24-72小时。

Incucyte杀伤测定

首先转导肿瘤细胞以表达与用于HER2的荧光标志物GFP或用于EGFRvIII的荧光标志物mCherry连接的靶抗原。将肿瘤以5000个细胞/孔接种在384孔板中过夜，然后用制造商所提供的推荐浓度的胱天蛋白酶3/7染料将不同比率的CAR T细胞添加到每个孔中。然后将板添加到位于5％CO₂、37℃培养箱内的incucyte机器中，每1-4小时成像一次，持续共24-72小时。在Incucyte分析软件上分析图像。

细胞因子产生的定量

通过流式细胞珠阵列(CBA)分析(BD生物科学公司)分析收集的上清液。将12.5μL的上清液转移至V型底96孔板。将含有每种经测试的细胞因子的标准物的半连续稀释液平板接种，其中最高浓度为5000pg/mL。根据制造商的说明，将0.25μL珠/细胞因子/孔的含有细胞因子特异性珠的捕获混合物分别用BD珠缓冲液制成12.5μL/孔(人)，并添加到每个孔中。然后将板在室温下温育至多1小时。制备与用于小鼠或人细胞因子的PE检测抗体混合物的珠相同体积的珠，并将所述珠添加到每个孔中。将板再次在室温下在黑暗中温育至多1小时。最后，将细胞用所提供的洗涤缓冲液洗涤至少两次，之后将细胞重新悬浮于75-100μL的洗涤缓冲液中，并在BD FacsVerse(贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson))上分析，并在FCAP软件(BD生物技术公司)上处理数据。

OmniCAR T细胞的‘武装’和‘预先武装’，抗体结合剂的剂量安排

未武装的OmniCAR T细胞不具有与spyCatcher受体CAR结合的靶向抗体结合剂，并且不能与肿瘤抗原结合，并且因此不能激活和杀死肿瘤细胞。通过在T细胞培养基(<10^e6/mL)中向OmniCAR T细胞中添加总浓度为100nM的抗体结合剂来‘武装’OmniCAR T细胞，并在37摄氏度下在5％CO2中温育约30分钟，将形成功能spyCatcher:spyTAG受体。‘预先武装的’OmniCAR T细胞是指在过继转移之前或在体外/小鼠体内离体武装的CAR T细胞。抗体在过继转移前被洗掉。

荷瘤小鼠的过继转移和处理

向NSG小鼠注射经转导以在皮下表达人HER2抗原的2-5x106 MDA-MB231乳腺癌细胞。肿瘤建立后，接着对小鼠进行0.5gy全身照射的预处理方案，之后进行过继转移OmniCART细胞，每只小鼠每24小时补充有4剂量的25,000IU的IL-2。基于节拍给药方案，通过肿瘤内、静脉内或腹膜内递送结合剂(图11A)。

肿瘤浸润免疫子集的分析

为了检查肿瘤浸润性CAR T细胞表型，对小鼠实施安乐死并去除肿瘤或脾脏。用补充有1mg/mL的IV型胶原酶(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和0.02mg/mL DNA酶(西格玛-奥德里奇公司)的DMEM对肿瘤进行机械消化和酶促消化30分钟，并在37℃下持续振荡。然后将肿瘤单细胞悬浮液通过70μm过滤器过滤，之后等分用于流式细胞术染色。在染色前，脾脏也被机械消化并通过70μm过滤器过滤。

结果

结合剂的给药方案调节体内功能UIR的表达

使用上文所描述的方案使用第3代慢病毒产生OmniCAR T细胞，并使用抗FLAG抗体检测非抗原特异性OmniCAR受体的转导效率和表达(图6A)。‘未武装的’OmniCAR T细胞缺乏抗体结合剂组分，并且因此无法与肿瘤抗原结合以引发抗肿瘤应答。当所述全长抗体结合剂自发地与OmniCAR受体形成复合物时，添加抗人IgG抗体可以检测到全长抗体结合剂，这使得‘经武装的’OmniCAR T细胞对其相应的靶抗原具有完全功能(图6A)。

对应于CD8+FLAG+and CD4+FLAG+CAR T细胞两者上‘经武装的’OmniCAR受体的增加的表达，与针对人HER2抗原的浓度增加的抗体结合剂一起温育会导致抗IgG检测增加(图6B)。与经武装的受体的表达增加相关，当与用HER2转导的乳腺癌细胞系MDA-MB231(MDA-MB231-HER2)共培养时，从3个单独的供体产生的OmniCAR T细胞被激活并分泌浓度增加的功能细胞因子IFNγ、TNF和IL-2(图6C)。OmniCAR T细胞也可以在过继转移到NSG小鼠体内后进行武装。为此目的，将1000-2000万个OmniCAR T细胞转移到NSG小鼠体内，每3天以增加的浓度给药抗体结合剂。在转移后第1天和第7天收集血液，并在两个时间点检测到表达水平与增加的结合剂剂量浓度相对应的‘经武装的’FLAG+CAR T细胞(图6D)。在疗法后第1天，较高剂量的结合剂导致经武装的受体的检测增加(图6E)以及经武装的OmniCAR T细胞的早期扩增和数量增加(图6F)。类似地，在第7天，经武装的受体的表达(MFI)与结合剂的增加的剂量相对应(图6D)。

结合剂给药方案调节体内T细胞记忆表型、扩增和持久性

为了进一步研究OmniCAR疗法的治疗功效，向NSG小鼠注射人MDA-MB231-HER2乳腺癌细胞。一旦建立肿瘤，就用OmniCAR T细胞和不同剂量和给药方案的抗HER2抗体结合剂处理小鼠(图7A)。与先前的观察一样，更高剂量的抗体结合剂导致小鼠外周CD8+FLAG+OmniCAR T细胞的早期扩增(图7B)。结合剂的剂量>5ug/小鼠导致‘经武装的’OmniCAR受体的更高表达，这与荷瘤小鼠或非荷瘤小鼠中结合剂的剂量一致，或者与>1周的给药间隔期一致(图7C)。

调节剂量和给药策略也可以调节体内OmniCAR T细胞的记忆表型，并且在荷瘤小鼠和非荷瘤小鼠的背景下观察到此效应(图7D)。低浓度的结合剂导致CD45RO+CD45RA-T效应子记忆亚群的更高的％高于单独预先武装的情况，而高浓度的结合剂导致CD45RA+CD45RO-T中央记忆亚群的更高的％，这似乎是抗原非依赖性的(图7D)。事实上，在高剂量处理组中，在第7天观察到的外周经转移的OmniCAR T细胞的大部分扩增是抗原非依赖性的，这表明OmniCAR T细胞的扩增是与来自OmniCAR受体的调节信号传导连接的内在特征(图7E)。

结合剂的给药方案调节体内抗肿瘤功效

与对扩增和功能的观察一致，与未经处理的小鼠相比，用预先武装的OmniCAR T细胞和高剂量的抗体结合剂处理的小鼠可以介导抗肿瘤效果，从而导致总体上缩小的肿瘤大小(图8A)。在研究的终点，从小鼠身上分离出脾脏和肿瘤。如所预期的，高结合剂剂量处理导致脾脏移植减少(图8B)。同样地，此模式翻译成在肿瘤中检测到的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的数量(图8C)。由于增加的功能OmniCAR受体表达，更高剂量的结合剂还可以驱动增加的抗原特异性信号传导，从而导致TIM3+PD1+CD8+FLAG+CAR TIL的增加的％(图8D)。

所提出的方案的效果也在急性髓系白血病(AML)的模型中进行了测试。进行生物发光成像以确定AML的小鼠模型中随时间变化的肿瘤负荷。给予NSG小鼠500万个KG-1细胞，并且在CAR-T转移后的第3天、第6天和第9天给予动物未经处理(对照)或预先武装的OmniCAR-T细胞和25ug的CD33和CLL-1结合剂。当与对照组相比时，在CAR-T转移后的第3天、第6天和第9天，在用预先武装的OmniCAR-T细胞和25ug的CD33和CLL-1结合剂处理的小鼠中观察到对肿瘤生长的显著影响(图8E)。

给药方案或结合剂的特异性设计调节OmniCAR抗原非依赖性信号传导或抗原依赖性信号传导

与常规CAR T细胞或未经转导的T细胞相比，OmniCAR在过继转移后驱动CAR T细胞卓越增殖的内在能力先前已被证明是抗原非依赖性的(图7D)。为了研究所涉及的潜在机制，在体外直接比较OmniCAR T细胞与未经转导的或常规CAR T细胞的激活、增殖或检查点T细胞标志物的表达水平。当与未经转导的或常规CAR T细胞相比时，在存在IL-2的情况下共培养>72小时而无刺激后，CD8和CD4(分别为未武装的或经武装的OmniCAR T细胞)两者均上调了激活标志物TIM3的表达(图9A)。

重要的是，与其未武装的T细胞相比，CD8和CD4武装的OmniCAR T细胞两者表达Tim3的水平更高(图9A)。当用OKT3(αCD3)刺激>72小时时，所有CD8+组均上调Tim3至相似水平，尽管未武装的或经武装的OmniCAR T细胞的总体表达水平更高(图9A)。有趣的是，与常规CAR T细胞相比，未武装的或经武装的CD4+OmniCAR T细胞两者的Tim3表达都显著更高，从而表明当用OKT3刺激时激活水平更高(图9A)。虽然第二晚期检查点受体PD-1在没有刺激的情况下在体外不高表达，但其在刺激的情况下上调，而不是通过在CD8+组级分中武装(图9B)。然而，PD-1在CD4+级分中的表达明显，未武装的和经武装的CD4+OmniCAR T细胞表达更高水平的PD-1，未经刺激的细胞中的武装导致甚至更高的PD-1表达(图9B)。PD-1在经刺激的CD4+OmniCAR T细胞中继续升高，尽管与未武装的相比，经武装的OmniCAR T细胞降低了PD-1，从而表明CD4+T细胞中来自经武装的OmniCAR受体的信号传导可能减少(图9B)。

总之，未武装的或经武装的OmniCAR受体分别对未经刺激或经刺激的CD8或CD4级分具有独特的信号传导作用，从而突出了在过继转移后差异调节OmniCAR T细胞产物的不同级分的应用。CD8和CD4级分之间复杂的相互作用可能会驱动经转移的OmniCAR T细胞的卓越增殖。

顺序地或同时靶向多种肿瘤抗原的节拍给药

OmniCAR平台的优势是可以通过连续或同时给药不同的抗体结合剂来靶向多种肿瘤抗原。人胶质母细胞瘤细胞系U251MG被修饰以单独表达人HER2或突变型EGFRvIII受体。在混合肿瘤共培养物中，U251MG-HER2和U251MG-EGFRvIII两者均具有稳定的生长动力学(图10A)。当OmniCAR T细胞针对人HER2抗原单独进行武装时，在混合的肿瘤共培养中仅消除了表达HER2的U251MG-HER2细胞(图10B)。类似地，当OmniCAR T细胞针对突变型EGFRvIII抗原单独进行武装时，在混合的肿瘤共培养物中仅消除了表达EGFRvIII的U251MG-EGFRvIII细胞(图10C)。最后，为了证明抗原切换至不同的靶标，在混合的肿瘤测定中共培养靶向EGFRvIII的OmniCAR T细胞，并在20小时后添加100nM的HER2结合剂(图10D)。直到添加HER2结合剂，仅有表达EGFRvIII的肿瘤被消除，但在添加HER2结合剂后，CAR T细胞杀伤转切换至表达HER2的肿瘤，从而表明抗原的快速有效靶向顺序地进行(图10D)。为了同时靶向多种肿瘤抗原，OmniCAR T细胞可以同时武装有多于一种的抗体结合剂，其中3种或更多种不同的结合剂的表达和共表达水平相当(图10E)。最终，HER2和EGFRvIII抗体结合剂的存在可以在其施用2周之后在小鼠的血清中被检测到(图10F)。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面取得了广泛成功，并正在进行治疗多种实体瘤的临床试验。然而，存在若干个与独特的毒性和随后的复发有关的挑战需要解决。通用免疫受体是一种快速兴起的过继免疫疗法的武装形式，所述通用免疫受体具有通过提高的安全性和减少的副作用(输注后打开/关闭CAR应答)以及靶向多种肿瘤抗原以克服导致肿瘤复发的肿瘤逃逸机制(如抗原损失或抗原异质性)来应对这些挑战的潜力。另外地，与目前临床上的常规CAR疗法相比，通用CAR T细胞可能具有更大的多功能性、更低的成本和现成的应用潜力。因此，图11A中突出显示的节拍给药策略可以赋予OmniCAR T细胞不仅能够在体外和体内调节抗原特异性功能UIR表达的能力，还能够调节体内T细胞记忆分化、扩增和持久性的能力。

通过暂时调节给药方案，通过离散、连续或定期给药，或通过调节剂量浓度(图11A)，有可能直接或间接调节抗原非依赖性强直性信号传导和抗原依赖性CAR信号传导的强度，从而导致维持最佳的T细胞记忆子集、T细胞激活和抗肿瘤功能(图11B)。OmniCAR平台的内在特性是用于调节抗原非依赖性强直性信号传导的能力，所述能力在高于具有刚性架构、以及因此固定的强直性信号传导水平的常规CAR T细胞的水平下提高了安全性、抗肿瘤活性和T细胞扩增(图11B)。还可以靶向多种抗原，使所述抗原能够在抗原靶标之间快速有效地顺序切换，或者武装有多于一种的抗原结合剂以快速有效同时靶向多种肿瘤抗原(图10A-E)。总之，这些发现支持节拍给药作为一种策略，所述策略与OmniCAR UIR平台的灵活性协同组合，以微调过继转移后的抗肿瘤治疗应答。

本领域的技术人员将理解的是，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如在特定实施例中示出的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施例应当在所有方面都被视为是说明性的而非限制性的。

本文所讨论和/或引用的所有公开以其整体并入本文。

关于已包含在本说明书中的文件、法令、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于为本发明提供上下文的目的。这不应视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其在本申请的每个权利要求的优先权日期之前就已经存在。

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Claims (63)

1.一种治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的方法，所述方法包括

i)向所述受试者施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后的七天内向所述受试者施用所述分子至少两次，

iii)在步骤ii)之后的至少21天分析所述受试者对所述治疗的应答性，以及

iv)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

2.一种刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的方法，所述方法包括

i)向所述受试者施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后的七天内向所述受试者施用所述分子至少两次，

iii)在步骤ii)之后的至少约21天分析所述受试者对所述治疗的应答性，以及

iv)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分子不与步骤i)中的所述通用免疫受体结合。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分子与步骤i)中的所述通用免疫受体结合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中，所述分子被施用两次。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分子在步骤i)之后的第3天和第6天施用。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述分子在步骤i)之后施用三次。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分子在步骤i)之后的第1天、第4天和第6天施用。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤i)之后的21天与49天之间分析所述受试者对所述治疗的应答性。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述治疗包括在步骤i)之前向所述受试者施用所述分子至少一次，并在步骤i)之后的七天内施用至少两次。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述治疗包括在步骤i)之前向所述受试者施用所述分子两次，并在步骤i)之后的七天内施用至少两次。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述分子以不同剂量施用，优选地以介于约0.25mg/m²至2.0mg/m²之间的剂量、介于约5mg/m²至25mg/m²之间的剂量、以及介于约50mg/m²至100mg/m²之间的剂量施用。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤iv)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体能或不能与包括与步骤i)的所述分子结合相同抗原的结构域的分子共价结合。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤iv)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体能或不能与包括与步骤i)的所述分子结合不同抗原的结构域的分子共价结合。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述分子包括和与所述疾病相关的多于一种抗原、优选地与所述疾病相关的两种抗原结合的结构域。

16.一种治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的方法，所述方法包括

i)施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于14天与28天之间，以及

iii)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

17.一种刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的方法，所述方法包括

i)向所述受试者施用包括通用免疫受体的免疫细胞，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，

ii)在步骤i)之后每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于约14天与约28天之间，以及

iii)如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复步骤i)和ii)。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述分子不与步骤i)中的所述通用免疫受体结合。

19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述分子与步骤i)中的所述通用免疫受体结合。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述分子在步骤i)之后每三天施用一次。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述分子在步骤i)之后的21天内每三天施用一次。

22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述分子在步骤i)之前向所述受试者施用至少一次，并且在步骤i)之后每两天或三天施用一次，持续介于约14天与约28天之间。

23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述分子在步骤i)之前向所述受试者施用两次，并且在步骤i)之后每两天或三天施用一次，持续介于约14天与约28天之间。

24.根据权利要求2或17所述的方法，其中刺激对肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答包括增加所述受试者体内的细胞因子水平，优选地增加干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-2(IL-2)中的一者或多者或全部的水平。

25.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体能或不能与包括与步骤i)的所述分子结合相同抗原的结构域的分子共价结合。

26.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括施用通用免疫受体，所述通用免疫受体能或不能与包括结构域并且与步骤i)的所述分子结合不同抗原的分子共价结合。

27.根据权利要求16至26中任一项所述的方法，其中所述分子包括和与所述疾病相关的多于一种抗原、优选地与所述疾病相关的两种抗原结合的结构域。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中当与未接受所述治疗的受试者相比时，所述治疗增加了所述受试者的生存期。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其进一步包括将所述受试者诊断为患有或疑似患有疾病或癌症的步骤。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其进一步包括施用另外的治疗剂，所述另外的治疗剂任选地选自由以下组成的组：化学疗法、放射疗法、外科手术、骨髓移植、药物疗法、冷冻消融或射频消融。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述通用免疫受体包括与胞外铰链区结合的SpyCatcher或SpyTag胞外结合结构域，所述胞外铰链区进而与跨膜结构域结合，所述跨膜结构域进而与免疫细胞受体胞内信号传导结构域结合。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述通用免疫受体胞内信号传导结构域进一步包括共刺激分子。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述SpyCatcher胞外结合结构域与所述胞外铰链结构域结合。

34.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述SpyTag胞外结合结构域与所述胞外铰链结构域结合。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述分子包括SpyCatcher或SpyTag和所述结构域。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述结构域选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、scFv、蛋白质支架、肽、配体、寡核苷酸、适体、标记剂、肿瘤抗原、自身抗原、病毒抗原以及其任何组合。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述分子包括SpyTag。

38.根据权利要求35所述的方法，其中所述分子包括SpyCatcher。

39.根据权利要求1至11或13至38中任一项所述的方法，其中所述分子以介于约0.25mg/m²至2.0mg/m²之间的剂量、介于约5mg/m²至25mg/m²之间的剂量、以及介于约50mg/m²至100mg/m²之间的剂量施用。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、树突状细胞、髓系细胞、巨噬细胞、干细胞或其组合。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述T细胞是CD3+T细胞。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述T细胞是细胞毒性T细胞、γδT细胞、T调控性细胞或iNKT细胞。

43.根据权利要求40所述的方法，其中约10％至约50％的所述免疫细胞是CD8+细胞。

44.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法提供CD45RO+CD45RA-T效应记忆细胞的富集和/或CD45RA+CD45RO-T中央记忆细胞的富集。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述细胞是自体细胞。

46.根据权利要求1、3至16或18至45中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症、感染或炎性疾病。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是肾细胞癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、急性髓系白血病(AML)或淋巴瘤。

48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

50.一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的药物，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后的七天内将向所述受试者施用所述分子至少两次，其中在所述七天后的至少21天将分析所述受试者对所述治疗的应答性，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复所述治疗。

51.一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的药物，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后的七天内将向所述受试者施用所述分子至少两次，其中在所述七天后的至少21天将分析所述受试者对所述治疗的应答性，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复所述治疗。

52.一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于治疗受试者的将受益于免疫细胞疗法的疾病的药物，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后将每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于14天与28天之间，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述疾病仍能检测到，则重复所述治疗。

53.一种包括通用免疫受体的免疫细胞的用途，其用于制备用于刺激对受试者体内的肿瘤的通用免疫受体介导的免疫应答的药物，其中所述通用免疫受体能或不能与包括和与所述肿瘤相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中在施用所述细胞之后将每两天或三天向所述受试者施用所述分子，持续介于14天与28天之间，并且其中如果所述受试者对所述治疗有应答但所述肿瘤仍能检测到，则重复所述治疗。

54.一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6提供的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的一者或两者至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的HER2受体结合。

55.一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:10提供或作为SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9提供的氨基酸序列，或与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的EGFRvIII受体结合。

56.一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:14提供或作为SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13提供的氨基酸序列，或与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的IL-13Ra2受体结合。

57.一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16提供的氨基酸序列，或与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的CD33受体结合。

58.一种基本上纯化和/或重组的多肽，其包括作为SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18提供的氨基酸序列，或与其至少90％相同的氨基酸序列，其中所述多肽能够与包括SpyCatcher的蛋白质共价结合并与癌细胞上的C型凝集素样(CLL1)受体结合。

59.一种分离的和/或外源性多核苷酸，其编码根据权利要求54至58中任一项所述的多肽。

60.一种载体，其包括根据权利要求59所述的多核苷酸。

61.一种分离的转基因细胞，其包括根据权利要求59所述的多核苷酸和/或根据权利要求60所述的载体。

62.一种产生权利要求59的多肽的方法，所述方法包括培养根据权利要求61所述的细胞，并从所述细胞或培养基中纯化所述多肽。

63.一种药物组合物，其包括免疫细胞，所述免疫细胞包括通用免疫受体，所述通用免疫受体能或不能与包括和与疾病相关的抗原结合的结构域的分子共价结合，其中所述结构域包括以下中的一者或多者或全部：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18，或与其至少90％相同的氨基酸序列。