TW201938196A - 融合蛋白擴展 - Google Patents

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派翠克 松吉翁
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Abstract

考慮了嵌合分子及分子複合物，其包括一抗體之一Fc部分以及一免疫調節部分及其用途。通常，該嵌合分子包含至少二種免疫效應子，例如，IL-15拮抗劑以及PD-L1結合結構域。預期一腫瘤細胞或一免疫機能健全細胞可暴露於該嵌合分子，以經由一抗體依賴性細胞調節的細胞毒性增加腫瘤細胞裂解的有效性。

Description

融合蛋白擴展
本發明之領域為重組蛋白，尤其是具有免疫調節功能的嵌合蛋白。
背景描述包括可助於理解本發明之資訊。這並非承認本文提供的任何資訊為現有技術或與當前請求保護之發明相關，或者具體或隱含地引用之任何出版物為現有技術。
本文中的所有出版物專利申請案皆透過引用方式併入，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請案被具體並單獨地指出透過引用方式併入。如果併入之引用文獻中術語的定義或用法與本文提供之術語的定義不一致或相反，則適用本文提供之術語的定義，且在該引用文獻中該術語的定義不適用。
功能性與有效的T細胞反應對於針對傳染病及癌症的治療性免疫反應是極為重要的。然而，在某些情況下，例如慢性病毒感染或癌症，可透過受損細胞施加的某些免疫抑制機制而抑制各種免疫機能健全細胞的活性/反應。例如，T細胞可能失去其增殖能力，產生效應子分子以裂解目標細胞。最近，發現程式性死亡配體-1 (programmed death ligand-1, PD-L1)/程式性死亡-1 (programmed death-1, PD-1)相互作用顯著促成持久性抗原刺激設定中缺乏T細胞反應性，例如在癌症及慢性傳染病。因此，PD-1/PD-L1相互作用的干擾 (例如，使用抗體或針對目標進行沉默化)被認為是增強癌症免疫療法的一種有希望的治療方法。在這種情況下，應當理解的是PD-L1被許多癌細胞向上調節。
例如，透過mRNA電穿孔，由在人類單核細胞衍生的樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)中瞬時表現PD-1 (sPD-1)或PD-L1 (sPD-L1)的可溶性細胞外部分以將負共刺激PD-1/PD-L1途徑的抑制作為目標，如Gene Therapy (2014年) 21, 262–271所述。在這些方法中，誘導多功能T細胞而不誘導調節性T細胞 (regulatory T cells, Tregs)。據推測，相對高濃度的PD-1及/或PD-L1提供了對PD-1/PD-L1途徑的充分干擾，進而誘導一陽性T細胞反應。類似地，如美國專利US8574872中所述，將串聯的PD-L1細胞外結構域教導為用於治療癌症的一種治療劑。更具體地，該’872專利公開了包含PD-1或PD-L1的細胞外結構域的多聚體分別對其配體PD-L1或PD-1具有高拮抗活性，刺激淋巴細胞的增殖，並增強它們的細胞毒性。雖然這種可溶形式以及多聚體傾向於降低可能由以PD-1及PD-L1為目標的傳統抗體所引起的不良免疫反應之機會，但血清半衰期可能顯著降低。而且，這種可溶形式及多聚體難以由一重組來源中分離。
其他已知的治療分子包括那些其中表面活性蛋白D (Surfactant Protein D, SP-D)作為多複製數的CD40L與其他TNF超級家族配體 (例如，4-1BBL、OX40L、GITRL)的支架，如美國專利US7300774中所述。然而，這種構築通常難以產生及純化，且可能具有抗原性。在使用免疫刺激分子的其他方法中，OX40L、CD80、4-1BBL，以及GITRL的單複製與人類免疫球蛋白的Fc部分融合，並作為癌症裂解物的佐劑 (參見Clin Cancer Res . 2012 Sep 1; 18(17): 4657–4668；或美國專利US8268788，或US8207130)。然而，這些構築的生物活性通常僅在作為佐劑時才明顯。
因此，仍然需要有改進的組合物及方法來治療癌症，尤其是使用基於PD-1/PD-L1的免疫逃避的癌症。
本發明之主題涉及各種免疫調節嵌合蛋白組合物以及用於癌症免疫治療之方法，其中多聚體免疫效應子偶合或存在於包含一抗體的一Fc部分的一融合蛋白中。
於本發明主題之一方面，本案發明人考慮了一種嵌合分子，其包含一抗體的一Fc部分以及一免疫調節部分，其中該免疫調節部分包含至少二個免疫效應子。最典型地，該Fc部分包含一IgG的一部分，而該免疫效應子包含PD-L1、一PD-L1結合劑、PD-1、一PD-1結合劑、PD-L2、一PD-L2結合劑、4-1BB、OX40L，及/或GITRL 4-1BB、OX40L，及/或GITRL的至少一部分 (且最常為細胞外部分)。於某些具體實施例中，該免疫效應子為串聯排列，且於其他具體實施例中，該免疫效應子存在於該嵌合分子的二個不同部分。
還進一步考慮該嵌合分子還可包括一細胞激素受體，或一與該細胞激素受體結合的細胞激素或細胞激素類似物。在這種情況下，一或多種免疫效應子可共價結合該細胞激素受體、該細胞激素、該細胞激素類似物，及/或該Fc部分。在需要目標的情況下，該嵌合分子可以進一步包含可與該細胞激素受體、該細胞激素、該細胞激素類似物，及/或該Fc部分共價結合的一親和部分(例如，單鏈可變片段 (single-chain variable fragment, scFv)。
此外，應當理解的是，二個嵌合分子的Fc部分可以，例如，透過該Fc部分中的半胱胺酸殘基的一個雙硫鍵連結，進而形成一類抗體嵌合分子複合物。如將容易理解的是，這種複合物中的第一及第二嵌合分子可相同或不同。
於本發明主題之另一方面，本案發明人還考慮了一種藥物組合物，其包括如本文所述之嵌合分子或嵌合分子複合物，通常與藥學上可接受的載體 (例如，配製用於注射的載體)組合。然後，此類組合物可進一步包括一種或多種細胞激素，檢查點抑制劑，及/或一化學治療劑。
因此，由不同角度觀之，本案發明人還考慮了一種治療一被診斷患有癌症的個人之方法，其中將本文提供之藥物組合物施用於該個人。此外，該個人可進一步接受化學治療，尤其是可按照節拍器式計劃提供的低劑量化學療法。另外及/或可替代地，該個人還可接受ALT803，一種細胞激素，及/或一檢查點抑制劑作為治療的一部分。因此，本案發明人還考慮將該嵌合分子或該嵌合分子複合物用於治療一癌症。
於本發明主題之又一方面，本案發明人考慮了一重組免疫球蛋白複合物。該重組免疫球蛋白複合物包括一Fc結構域，其具有第一及第二Fc部分，該第一及第二Fc部分與分別具有相應的第一及第二目標識別結構域的第一及第二細胞激素結合結構域分別偶合。該第一及第二細胞激素結合結構域與該第一及第二細胞激素偶合。最佳地，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個被配置為結合PD-L1。於某些具體實施例中，該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為IL-15Rα，或一修飾的IL-15Rα，其增加或減少與IL-15Rβ或IL-15Rγ的相互作用。
於某些具體實施例中，至少一種該細胞激素為IL-15。於其他具體實施例中，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個係選自由下列所組成之群組：一PD-L1抗體、一PD-L1抗體的Fab片段，以及與PD-L1結合的單鏈可變片段(scFv)。另外，於某些具體實施例中，該蛋白質複合物係經由該Fc結構域與一載體蛋白偶合。在此類具體實施例中，該載體蛋白係選自下列：蛋白A、蛋白G、蛋白Z、白蛋白，以及重折疊白蛋白。
本發明主題之又一方面包括一種調節一免疫機能健全細胞中基因表現之方法。在該方法中，提供了一種重組免疫球蛋白複合物，其包含一Fc結構域，其具有第一及第二Fc部分，該第一及第二Fc部分與分別具有第一及第二目標識別結構域的第一及第二細胞激素結合結構域分別偶合。該第一及第二細胞激素結合結構域與第一及第二細胞激素偶合。最佳地，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個被配置為結合PD-L1。然後，該重組免疫球蛋白複合物與該免疫機能健全細胞，較佳為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞，以及自然殺手細胞中的至少一種接觸，其劑量及時間表有效調節基因表現，較佳以使至少二個基因的mRNA表現增加或減少至少二倍，更佳以使至少三個基因的mRNA表現增加或減少至少三倍。
較佳地，該第一及第二Fc部分形成一個二聚體。 於某些具體實施例中，該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為IL-15Rα及/或一修飾的IL-15Rα，其增加或減少與IL-15Rβ或IL-15Rγ的相互作用。於某些具體實施例中，至少一種該細胞激素為IL-15。於其他具體實施例中，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個係選自由下列所組成之群組：一PD-L1抗體、一PD-L1抗體的Fab片段，以及與PD-L1結合的單鏈可變片段(scFv)。另外，於某些具體實施例中，該蛋白質複合物係經由該Fc結構域與一載體蛋白偶合。在此類具體實施例中，該載體蛋白係選自下列：蛋白A、蛋白G、蛋白Z、白蛋白，以及重折疊白蛋白。
於本發明主題之又一方面，本案發明人考慮了一種治療一患有一腫瘤的患者的該腫瘤之方法。於該方法中，提供了一種重組免疫球蛋白複合物，其包含一Fc結構域，其具有第一及第二Fc部分，該第一及第二Fc部分與分別具有第一及第二目標識別結構域的第一及第二細胞激素結合結構域分別偶合。該第一及第二細胞激素結合結構域與第一及第二細胞激素偶合。最佳地，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個被配置為結合PD-L1。然後，該方法繼續將該重組免疫球蛋白複合物預暴露於該腫瘤的一免疫機能健全細胞以及一腫瘤細胞中的至少一種，其中該重組免疫球蛋白複合物細胞的預暴露增加抗體依賴性細胞對該腫瘤的細胞毒性之有效性。
較佳地，該第一及第二Fc部分形成一個二聚體。於某些具體實施例中，該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為IL-15Rα及/或一修飾的IL-15Rα，其增加或減少與IL-15Rβ或IL-15Rγ的相互作用。於某些具體實施例中，至少一種該細胞激素為IL-15。於其他具體實施例中，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個係選自由下列所組成之群組：一PD-L1抗體、一PD-L1抗體的Fab片段，以及與PD-L1結合的單鏈可變片段(scFv)。另外，於某些具體實施例中，該蛋白質複合物係經由該Fc結構域與一載體蛋白偶合。在此類具體實施例中，該載體蛋白係選自下列：蛋白A、蛋白G、蛋白Z、白蛋白，以及重折疊白蛋白。
本案發明人考慮了將該重組免疫球蛋白複合物預暴露於腫瘤細胞及/或免疫機能健全細胞，較佳為一初始自然殺手(nature killer, NK)細胞以及一遺傳修飾的自然殺手細胞中的至少一種。於某些具體實施例中，僅將免疫機能健全細胞預暴露於該重組免疫球蛋白複合物。於其他具體實施例中，僅將腫瘤細胞預暴露於該重組免疫球蛋白複合物。於其他具體實施例中，免疫機能健全細胞與腫瘤細胞皆預暴露於該重組免疫球蛋白複合物。於那些具體實施例中，該免疫機能健全細胞較佳在接觸該腫瘤之前預暴露於該重組免疫球蛋白蛋白複合物至少12小時，且該腫瘤細胞較佳在接觸該免疫機能健全細胞之前預暴露於該重組免疫球蛋白複合物至少30分鐘。任選地，在此類具體實施例中，該免疫機能健全細胞在接觸該預暴露的腫瘤細胞之前預先暴露於一CD-16拮抗劑。於某些具體實施例中，該腫瘤細胞預暴露於一EGFR拮抗劑。
任選地，該方法可進一步包括對該患者施用一TGF-β拮抗劑、一IL-8拮抗劑，以及一化學激活素中的至少一種的步驟，該化學激活素可為CXCL14。較佳地，該預暴露的免疫機能健全細胞增加IFN-γ、TGF-α、IL-6以及IL-8中至少一種的分泌。
由不同角度觀之，本案發明人還考慮了增加一患有一腫瘤之患者的免疫療法的有效性之方法。於該方法中，提供了一種重組免疫球蛋白複合物，其包含一Fc結構域，其具有第一及第二Fc部分，該第一及第二Fc部分與分別具有第一及第二目標識別結構域的第一及第二細胞激素結合結構域分別偶合。該第一及第二細胞激素結合結構域與第一及第二細胞激素偶合。最佳地，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個被配置為結合PD-L1。然後，該方法繼續將該重組免疫球蛋白複合物預暴露於該腫瘤的一免疫機能健全細胞以及一腫瘤細胞中的至少一種，其中該重組免疫球蛋白複合物細胞的預暴露增加抗體依賴性細胞對該腫瘤的細胞毒性之有效性。
較佳地，該第一及第二Fc部分形成一個二聚體。 於某些具體實施例中，該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為IL-15Rα及/或一修飾的IL-15Rα，其增加或減少與IL-15Rβ或IL-15Rγ的相互作用。於某些具體實施例中，至少一種該細胞激素為IL-15。於其他具體實施例中，該第一及第二目標識別結構域中的至少一個係選自由下列所組成之群組：一PD-L1抗體、一PD-L1抗體的Fab片段，以及與PD-L1結合的單鏈可變片段(scFv)。另外，於某些具體實施例中，該蛋白質複合物係經由該Fc結構域與一載體蛋白偶合。於此類具體實施例中，該載體蛋白係選自下列：蛋白A、蛋白G、蛋白Z、白蛋白，以及重折疊白蛋白。
本案發明人考慮了將該重組免疫球蛋白複合物預暴露於腫瘤細胞及/或免疫機能健全細胞，較佳為一初始自然殺手細胞以及一遺傳修飾的自然殺手細胞中的至少一種。於某些具體實施例中，僅將免疫機能健全細胞預暴露於該重組免疫球蛋白複合物。於其他具體實施例中，僅將腫瘤細胞預暴露於該重組免疫球蛋白複合物。於其他具體實施例中，免疫機能健全細胞與腫瘤細胞皆預暴露於該重組免疫球蛋白複合物。於那些具體實施例中，該免疫機能健全細胞較佳在接觸該腫瘤之前預暴露於該重組免疫球蛋白蛋白複合物至少12小時，且該腫瘤細胞較佳在接觸該免疫機能健全細胞之前預暴露於該重組免疫球蛋白複合物至少30分鐘。任選地，在此類具體實施例中，該免疫機能健全細胞在接觸該預暴露的腫瘤細胞之前預先暴露於一CD-16拮抗劑。於某些具體實施例中，該腫瘤細胞預暴露於一EGFR拮抗劑。
此外，本案發明人還考慮上述重組免疫球蛋白複合物用於調節一免疫機能健全細胞的基因表現、用於治療一患有該腫瘤之患者的腫瘤，以及用於增加一患有一腫瘤之患者的免疫療法的有效性之用途。
由以下較佳實施例的詳細描述以及附圖中，本發明主題之各種目的、特徵、方面，以及優點將變得更加明顯。
本案發明人現在發現，透過調節T細胞或自然殺手細胞基因表現及/或透過使腫瘤細胞對抗體調節的細胞調節的細胞毒性(antibody-mediated cell-mediated cytotoxicity, ADCC)敏感，可以顯著改善免疫療法，特別是基於T細胞或自然殺手細胞的針對腫瘤細胞的免疫療法。基因表現及/或敏感化的這種調節可以透過在腫瘤細胞/免疫機能健全細胞上不活化或結合PD-L1及/或其他上調/表現的蛋白質同時提供IL15刺激作用來達成。
由不同角度觀之，本案發明人發現可以產生各種重組蛋白及/或蛋白質複合物，其具有一個或多個與在腫瘤細胞/免疫機能健全細胞上的PD-L1及/或其他上調/表現的蛋白質結合的目標識別結構域，使得該重組蛋白及/或蛋白質複合物特異性捕獲、抑制，或不活化PD-L1或、及/或其他上調/表現的蛋白質。PD-L1及/或其他上調/表現的蛋白質在腫瘤細胞/免疫機能健全細胞上的抑制與一IL15刺激作用結合被認為引發免疫機能健全細胞的活化及/或使該腫瘤細胞對抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)的敏感化。
如本文所用，術語“腫瘤”係指，並且可與一種或多種癌細胞、癌組織、惡性腫瘤細胞，或惡性腫瘤組織互換使用，其可於一人體的一或多個解剖位置中被放置或發現。如本文所用，術語“結合”係指，並且可以與術語“識別”及/或“檢測”互換使用，二個分子之間的相互作用具有高親和力且KD 等於或小於10-3 M、10-4 M、10-5 M、10-6 M，或等於或小於10-7 M。如本文所用，術語“提供(動詞)”或“提供(動名詞)”係指並包括製造、生成、放置，使能使用，或使能準備使用的任何行為。
嵌合分子
因此，本案發明人考慮了一個發明主題涉及由這種嵌合分子形成的各種嵌合分子及複合物。最典型地，該嵌合分子將包括至少一個抗體的一Fc部分以及一免疫調節部分，其中該免疫調節部分包含至少二個免疫效應子。由於存在Fc部分，本文考慮之嵌合分子將能夠透過一雙硫鍵相互結合，如抗體中常見者，因此形成的嵌合分子複合物可包含相同或不同的嵌合分子。
應該特別理解的是，相較於其中這些效應子以單複製數存在的實體相比，本文考慮的多聚體免疫效應子將具有顯著增加的生物活性。此外，並且如以下更詳細地描述者，免疫效應子的更高複製數也可提供額外的效果，特別是在有PD-L1及PD-1的情況。更進一步地，由於存在有利地刺激抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)的Fc部分，考慮的嵌合分子及其複合物可提供額外的治療效果。此外，當該嵌合分子中存在IL15或IL15受體部分時，這些部分將另外吸引並活化T細胞及自然殺手細胞。因此，應當理解的是，該嵌合分子及其複合物將具有多種治療效果，且在某些情況下甚至可以被視為內源性抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)的刺激物。
圖 1A-K 說明了考慮的嵌合分子及複合物的各種示例性構型。例如，在圖 1A 中，一抗體的一Fc部分的N端與一免疫調節部分的C端共價偶合，該免疫調節部分被配置為四種免疫效應子的串聯序列。在該構築中沒有使用間隔物部分。例如，這種構築可用於製備一嵌合分子 (或分子複合物)，其中四種免疫效應子為共刺激物配體，例如4-1BB、OX40L，及/或GITRL，且其中Fc部分來自一人類IgG。應當注意的是，並非所有免疫效應子都需要在一單鏈中，但該免疫效應子可與該Fc部分的N-及C-端連接，如圖 1B 所示。在需要或空間需求時，該免疫效應子也可以透過一具有通常柔性的連接子分開，例如，一(G4 S)3 連接子、一G8 連接子、一G6 連接子，一(EAAAK)n 連接子，其中n = 1-3、一PAPAP連接子，或一GFLG連接子，如圖 1C 中示意性所示。於此，該免疫效應子透過一第一連接子彼此偶合，並透過一第二連接子偶合至該Fc部分。於該構築中，一額外的親和部分 (例如，單鏈可變片段(scFv))也偶合至該Fc部分的另一端，以使該嵌合分子能夠以一特定目標為標的。
當該嵌合分子被設計為包括與一IL15受體的α鏈相關的該IL15或IL15超促效劑 (例如，IL15的N72D突變體)時，可以設計所考慮的嵌合分子，如圖 1D-G 的示例性結構所示。此處，該抗體的該Fc部分與該IL15受體的α鏈共價結合，且至少一個免疫效應子與該IL15受體的α鏈共價結合。使用IL15與該IL15受體的α鏈的特異性結合，包含IL15與至少一種免疫效應子的另一種嵌合分子可以 (通常非共價地)偶合到嘎嵌合分子上，如圖 1D 中示例性顯示的。值得注意的是，這種分子將提供該Fc部分與該IL15/IL15受體的益處，以及透過免疫調節部分的所需免疫調節作用。還應注意的是，該免疫效應子不需為串聯的，而是可以位於該嵌合分子的不同部分，如圖 1E 所示。或者，一或多個親和部分可以與多個免疫效應子一起實施，如圖 1F 所示，其中多個可能不同的親和部分用於標的，且在圖 1G 中，多個免疫效應子與一個親和部分一起使用。
如在該技術領域具有通常技藝之人(person having ordinary skill in the art, PHOSITA)將容易理解的，二個相同或不同的Fc部分可以連接以形成嵌合分子複合物，如在圖 1H-K 中所示的同型二聚體中示意性所描繪的，以及圖 1J 中所示的異二聚體。當然，應當理解的是，圖 1A-G 中所示的嵌合分子的可能組合比圖 1H-K 中所示的那些更多，且本文明確考慮了所有可能之組合。
更具體而言，於本發明主題構築示例性方面，一嵌合分子複合物可由二個相同的嵌合分子形成，其中每個嵌合分子包括一人類IgG的一Fc部分。與該Fc部分共價偶合的是該IL-15受體 (或其IL-15結合片段)的α受體鏈，且一單鏈可變片段(scFv)部分或一免疫效應子共價結合於其上。最佳地，在使用一單鏈可變片段(scFv)的情況下，該單鏈可變片段(scFv)部分對PD-L1具有結合親和力。另一方面，在使用免疫效應子的情況下，該免疫效應子為PD-L1，較佳以至少二個、三個或四個複製數存在。在該實施例中，該IL15受體的α受體鏈進一步結合與一單鏈可變片段(scFv)部分或一免疫效應子共價結合的IL15 (或IL15超促效劑)。如上所述，在使用一單鏈可變片段(scFv)的情況下，該單鏈可變片段(scFv)部分對PD-L1具有結合親和力。另一方面，在使用免疫效應子的情況下，該免疫效應子為PD-L1，較佳以至少二個、三個或四個複製數存在。
這種示例性構築被認為具有幾個顯著的優點。當該構築具有一結合PD-L1的單鏈可變片段(scFv)時，該構築特異性地以表現PD-L1的癌細胞作為目標，作為保護自身免受抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)或免疫機能健全細胞的細胞毒性攻擊之手段。此外，該IL-15或IL-15超促效劑的存在將有利地吸引並活化T細胞及自然殺手細胞，而Fc部分的存在則促進抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)。此外，應當理解的是，這種構築特別有益於腫瘤的治療，其(還)不會表現PD-L1作為防禦機制。在這種治療中，第一步包括誘導針對腫瘤的免疫反應 (例如，放射、化學治療，及/或基於細胞或疫苗類型的新表位治療)。在第二步中，當該腫瘤現在透過下調免疫機能健全細胞 (例如，T細胞)來嘗試逃避免疫反應，現在施用該嵌合分子並特異性地以那些嘗試免疫逃避的細胞為目標。
類似地，在腫瘤細胞透過活化該PD-1/PD-L1途徑而具有或即將逃避免疫反應的情況下，可以施用具有多個複製數的PD-L1或PD-1作為免疫效應子的嵌合分子。再次地，這種治療劑不僅透過干擾該PD-1/PD-L1途徑提供所需效果，而且還吸引並活化T細胞及自然殺手細胞，而Fc部分的存在促進抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)。由不同角度觀之，應當理解的是，該嵌合分子及複合物中組成分的生物學效應將透過多種免疫效應子的存在而被放大。在至少一些情況下，效果也可以反轉為，例如，與PD-L1相反。 PD-L1通常由癌細胞呈現為一種抑制性共刺激分子。然而，已顯示較高量的，尤其是PD-1及PD-L1的細胞外部分干擾PD-1/PD-L1訊息傳遞。因此，以PD-1/PD-L1訊息傳遞為目標的系統可包括多聚體PD-L1及/或多聚體PD-1部分作為免疫效應子或包括一以PD-L1為目標並結合PD-L1的親和部分 (例如，單鏈可變片段(scFv)等)。 在那樣的情況下，該親和部分也將作為一免疫效應子，因為PD-1/PD-L1訊息傳遞被中斷。
當然，應當理解的是，所考慮的化合物、組合物，以及方法不必限於其中Fc部分是從人類IgG獲得的化合物、組合物，以及方法。實際上，認為所有已知的Fc部分以及其他抗體片段 (例如，Fab、Fab’、F(ab)2 等)適用於本文，因此包括形成IgG、IgM、IgE，以及IgA的Fc部分。此外，在不需要抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)或其他Fc依賴性反應的情況下，可以對Fc部分進行遺傳修飾以消除抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)。然而，通常較佳為Fc部分將包括足夠的序列以允許 (i) 透過雙硫鍵形成二聚體， (ii) 結合蛋白A或蛋白G，及/或 (iii) 結合Sudlow-II白蛋白的結構域，特別是重折疊的白蛋白 (可以裝載例如一紫杉烷的藥物)。因此，本案發明人還明確考慮了本文所述之所有嵌合分子複合物，其中二個Fc部分具有連接 (通常透過一雙硫鍵)，以及其中Fc部分已與另一蛋白質結合的所有組合物 (例如，白蛋白、蛋白質A、蛋白質G等)。
同樣地，對於特定的免疫效應子，預期所有蛋白質分子被認為適合調節 (上調及/或下調)一免疫反應，通常透過與一共刺激途徑 (活化或抑制)的一種或多種配體或受體的特異性相互作用。例如，特別較佳的免疫效應子包括4-1BBL、OX40L，及/或GITRL。此外，特別較佳的免疫效應子包括PD-1、PD-L1、PD-1的結合物、PD-L1的結合物，以及PD-L2，與PD-L2的結合物。關於這些免疫效應子，特別較佳為這些效應子限於細胞外結構域 (或可溶形式及/或剪接變體)，但保留調節活性。例如，人類PD-L1的細胞外結構域包括對PD-1具有完整結合活性的胺基酸1-238。類似地，在鼠PD-L1中，胺基酸1-237表示對PD-1具有保留的結合活性的細胞外部分。進一步關於免疫效應子的數量及排列，預期該嵌合分子包含至少二個，或至少三個，或至少四個免疫效應子，其可以是串聯排列，或以其他方式分佈在該嵌合分子上。 由不同角度觀之，預期免疫效應子的數量至少使得一複數個效應子的免疫修飾活性大於單個效應子的免疫修飾活性，不論它們的具體排列如何。例如，四個OX40配體可以連續 (串聯)排列在一Fc的N端，而於其他方面，二個4-1BB配體可存在於一嵌合分子複合物的二個不同部分(例如，一個與IL-15受體α鏈共價結合，另一個與IL15共價結合，其中IL15與IL-15受體α鏈結合等)。或者，預期該嵌合分子上的二個免疫效應子可為二種不同的免疫效應子，其可線性排列或分開分佈。例如，一Fc的N端可與一個OX40配體以及一個4-1BB配體偶合，該配體透過一連接子線性或依序地放置 (例如，由一單個核酸序列編碼)。於另一實施例中，Fcs的N端之一可與一或多個OX40配體偶合，而Fcs的N端的另一個可以與一或多個4-1BB配體偶合。
PD-L1的合適實施例包括人類PD-L1以及各種哺乳動物的相應配體，包括黑猩猩、食蟹猴、小鼠、大鼠、豚鼠、狗，以及豬。特別是，人類PD-L1可具有被鑑定為GenBank登錄號NP_0054862或NP_0054862.1的一胺基酸序列，而鼠PD-L1可具有被鑑定為GenBank登錄號NP_068693或NP_068693.1的一胺基酸序列。同樣地，人類PD-L1 cDNA被鑑定為GenBank登錄號NM_014143、NM_014143.1或NM_014143.2，而小鼠PD-L1 cDNA被鑑定為GenBank登錄號NM_021893、NM_021893.1或NM_021893.2。
當該嵌合分子包括該IL-15受體的α-鏈時，認為所有形式的此類受體都適用於本文。然而，特別較佳的形式將保留結合IL-15或IL-15超級促效劑的能力並且僅呈現α-鏈。在該IL-15受體α鏈與一已知的Fc部分之間存在各種融合構築 (例如，Oncotarget, Vol. 7, No. 13, 2016, p.16130-16146)且所有製備這種構築的方式都被認為適用於本文。同樣地，本領域已知有許多IL-15及IL-15超級促效劑 (參見例如，J Immunol 2009; 183:3598-3607)，且再次地，所有這些都被認為適用於本文。
此外，在該嵌合分子包括一親和部分的情況下，較佳為該親和部分是一單鏈可變片段(scFv)並結合一腫瘤相關抗原、一腫瘤特異性抗原，或一患者及腫瘤特異性新表位 (較佳為與患者配對的MHC)。於本發明主題之其他方面，該單鏈可變片段(scFv)還可以結合於該患者腫瘤中過表現的胜肽或蛋白質。或者，合適的親和部分還可包括透過親和力成熟 (例如，使用噬菌體展示)或透過RNA展示獲得的蛋白質。最典型的是，該親和部分將形成該嵌合分子的多胜肽的一部分。
嵌合分子的一個特別較佳的具體實施例包括一重組免疫球蛋白複合物，其具有一或多個如圖 2A 所示之PD-L1結合結構域。該重組免疫球蛋白複合物包括具有二個Fc部分的一Fc結構域，每個Fc部分與一細胞激素結合結構域偶合。較佳地，該二個Fc部分中的每一個包括一疏水界面以彼此相互作用以形成一個二聚體。該疏水界面包括至少10個胺基酸、至少15個胺基酸、至少20個胺基酸、至少25個胺基酸，類似於人類免疫球蛋白G的Fc結構域。或者，可以對該二個Fc部分中的至少一個進行基因改造，使得該單個Fc部分可以穩定且可溶，而不與另一個Fc部分形成二聚體。
每個該Fc部分通常與該Fc部分的N端的細胞激素結合結構域偶合，而且每個該細胞激素結合結構域與一配體 (一細胞激素分子)結合。考慮了任何合適的細胞激素結合結構域，包括，但不限於，介白素-15 (IL-15)結合蛋白 (例如，IL-15受體α的全長或一IL-15結合基序等)、CD25 (IL-2結合蛋白)、IL-4受體α、IL-13受體α，或IL-21受體α。當然，較佳的細胞激素為細胞激素結合結構域的相應高親和力配體，例如，IL-15針對一IL-15受體α的全長或IL-15結合基序，以及IL-2針對CD25。於某些具體實施例中，該細胞激素結合結構域直接與Fc部分的N端偶合。於其他具體實施例中，該細胞激素結合結構域經由一連接子或一間隔基與Fc部分的N端偶合，該連接子或間隔基通常為3-30個胺基酸，較佳為5-20個胺基酸，更佳為5-15個胺基酸。本案發明人考慮較佳富含甘胺酸的序列 (例如，gly-gly-ser-gly-gly等)以在Fc部分與該細胞激素結合結構域之間提供結構靈活性，尤其是當該細胞激素結合結構域體積龐大且可能為附近的其他域造成空間障礙。本案發明人還考慮於某些具體實施例中，該細胞激素結合結構域以及與其結合的細胞激素中的至少一個可以被透過高親和力蛋白質-蛋白質相互作用偶合的其他分子對取代。例如，該分子對可包括酶 (較佳為無活性酶)-胜肽基質，或一毒素受體-無活性毒素 (例如，重組融合毒素)。
於某些具體實施例中，可以修飾該細胞激素結合結構域以增加細胞激素結合於該結合結構域的生物學效應。例如，當該細胞激素結合結構域為IL-15受體α (IL-15Rα)，且該細胞激素為IL-15時，該IL-15Rα：IL-15複合物可以與一膜結合的IL-15受體β以及IL-15受體γ反式相互作用以在表現IL-15受體β以及IL-15受體γ的細胞中引發IL-15調節的訊息傳遞級聯反應。因此，本案發明人考慮可以修飾一部分IL-15Rα，進而可以增強IL-15Rα：IL-15與IL-15受體β或IL-15受體γ之間的相互作用。特別較佳的細胞激素為一超級促效劑形式，特別是與ALT-80組合。
本案發明人考慮一或多個細胞激素結合結構域，更佳為每個該細胞激素結合結構域與一或多個結合基序偶合，該結合基序被配置為結合PD-L1。於某些具體實施例中，該細胞激素結合結構域直接與PD-L1結合基序偶合。於其他具體實施例中，該細胞激素結合結構域經由一連接子或一間隔基與PD-L1結合基序偶合，該連接子或間隔基通常在3-30個胺基酸之間，較佳在5-20個胺基酸之間，更佳在5-15個胺基酸之間。類似於該Fc部分與該細胞激素結合結構域之間的偶合，較佳為富含甘胺酸的序列 (例如，gly-gly-ser-gly-gly等)作為一連接子或一間隔基以提供該細胞激素結合結構域(或細胞激素)與該目標識別結構域之間的結構靈活性，特別是當一或多個目標識別結構域體積龐大並且可能對其他目標識別結構域造成空間障礙時。
考慮了可以與該重組免疫球蛋白複合物的細胞激素結合結構域連接而不造成顯著的空間障礙或功能缺陷的任何合適的PD-L1結合基序。因此，合適的PD-L1結合基序包括一完整的PD-L1抗體、一PD-L1抗體的一部分 (例如，Fab結構域之一或二個Fab結構域等)，一與PD-L1結合的單鏈可變片段(單鏈可變片段(scFv))。於某些具體實施例中，該重組免疫球蛋白複合物的二個細胞激素結合結構域可以與二種不同類型的PD-L1結合基序相關聯 (例如，具有PD-L1抗體的Fab結構域以及具有與PD-L1結合的單鏈可變片段(scFv)的另一個等)。於其他具體實施例中，還預期該重組免疫球蛋白複合物的二個細胞激素結合結構域可與相同類型的PD-L1結合基序結合。
可以使用各種已知方法製備預期的分子及複合物。例如，預期該嵌合分子複合物可以在適當構築的核酸 (DNA或RNA)的幾種哺乳動物、酵母，或甚至細菌細胞中表現。較佳地，該重組免疫球蛋白複合物的組成分可由一種或多種重組核酸編碼。例如，該重組核酸可包括至少二個核酸區段 (一序列元件)：一第一核酸區段，在一單個閱讀框中編碼一Fc部分、一細胞激素結合結構域，以及一PD-L1結合基序；以及一第二核酸區段，在一單個閱讀框中編碼一細胞激素以及另一個目標識別結構域 (較佳為一種PD-L1結合基序)。於其他實例中，該二個核酸區段在相同的閱讀框中，使得二個核酸區段可以轉譯為在相同啟動子下具有二個胜肽區段的單個蛋白質。在這種情況下，本案發明人考慮該第一及第二核酸區段以一間隔基序列隔開 (例如，編碼至少10個胺基酸、15個胺基酸、20個胺基酸等的一連接子或一間隔基的核酸序列)。於其他具體實施例中，該二個核酸區段可以分別轉錄為二個不同的胜肽。於其他具體實施例中，該二個核酸區段存在於一相同的閱讀框中，但是被編碼2A型自切割胜肽 (2A)的核酸序列分開。如本文所用，2A自切割胜肽 (2A)係指可以提供稱為“停止-去除”或“停止-攜帶”的轉譯效應的任何胜肽序列，使得相同mRNA片段中的二個次片段可被轉譯為二種獨立且不同的胜肽。考慮了任何合適類型的2A胜肽序列，包括豬鐵士古病毒-1 2A胜肽 (porcine teschovirus-1 2A, P2A)，明脈扁刺蛾β四體病毒2A胜肽 (thosea asigna virus2A, T2A)、馬鼻炎A病毒2A胜肽 (equine rhinitis A virus 2A, E2A)、口蹄疫病毒2A胜肽 (foot and mouth disease virus 2A, F2A)，細胞質多角體病毒 (BmCPV 2A)，以及家蠶軟化症病毒 (flacherie virus, BmIFV 2A)。
最佳地，該嵌合分子將表現為一單一多胜肽鏈。然而，該嵌合分子複合物的各個組成分也可以單獨表現，然後於表現後融合在一起。除了其它優點之外，由於該Fc部分的存在及其與某些蛋白質 (例如，蛋白質A或G)特異性並緊密結合或與白蛋白中的Sudlow II結構域結合的能力，大幅簡化了預期的嵌合分子的純化。當形成複合物時，預期第一及第二嵌合分子可分開製備。
或者或另外，該嵌合分子可進一步與一錨分子偶合，使得該嵌合分子可透過一錨分子偶合至一載體分子。例如，當該載體蛋白為白蛋白時，該錨分子可為任何合適大小的疏水胜肽或醣脂 (例如，長度為至少10個胺基酸、15個胺基酸、20個胺基酸、30個胺基酸等)，適合於Sudlow的白蛋白位點I及II之一或該白蛋白的任何其他疏水區域。其他預期的載體分子包括，但不限於，一奈米顆粒 (例如，量子點、金奈米顆粒、磁性奈米顆粒、奈米管、聚合物奈米顆粒、樹枝狀大分子等)，或一珠粒 (例如，聚苯乙烯珠、乳膠珠，dynabead等)。較佳地，該奈米顆粒及/或珠粒的尺寸小於1 μm，較佳小於100 nm。
將嵌合分子預暴露於免疫機能健全細胞及 / 或腫瘤細胞
本案發明人發現以嵌合分子 (FP-809，具有IL-15超級促效劑的Fc結構域的一嵌合分子 (ALT-803)且與二個與PD-L1結合的單鏈可變片段(scFv)融合，如圖2A所示)處理或暴露於該嵌合分子的免疫機能健全細胞，可以在該免疫機能健全細胞中觸發增殖、活化，及/或差異基因表現。如本文所用，免疫機能健全細胞係指在識別或存在腫瘤細胞時可引發免疫反應的任何免疫細胞。因此，該免疫機能健全細胞較佳包括T細胞 (例如，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、調節性T細胞 (Tregs)等)、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、抗原呈現細胞 (例如，樹突細胞等)。
例如，如圖 2B-C 所示，CD4+ 與CD8+ T細胞在暴露於FP-809後顯著增殖。在該實驗中，來自二個健康供體的CD4及CD8 T細胞用於具有結合於培養盤的抗CD3抗體的增殖測定。在增加濃度的FP-809存在下將T細胞加入到測定中，其中FP-809的濃度處於生理學或生理學上可接受的範圍內。倍數變化代表未處理 (0 ng/ml)，抗CD3刺激的T細胞的變化。FP-809的添加以劑量依賴性方式顯著增加CD4 T細胞 (約3倍，圖2B)以及CD8 T細胞 (約多於4倍，圖2C)的增殖。
此外，CD4+ 及CD8+ T細胞在暴露於FP-809時顯示出基因表現的顯著變化。將來自二個健康供體的CD4及CD8 T細胞與或不與FP-809一起作用24小時，然後使用770個免疫相關基因的nCounter PanCancer免疫分析組進行RNA分離以進行NanoString分析。如圖3A-B中的熱圖所示，來自二個不同供體的CD4+ 細胞 (圖3A)顯示一組基因的一致向上調節(至少二倍)(以紅色顯示)以及另一組基因的一致向下調節 (至少二倍)(以藍色顯示)。如表 1 所示，列出在CD4及CD8 T細胞中差異表現的示例性基因，在以圖2A的嵌合分子處理後，在770個基因中，相較於未處理/未暴露的CD4+ 和CD8+ T細胞，約8.2% (63個基因)，3.6% (28個基因)，0.1% (1基因)在CD4+ 細胞中分別顯示至少2倍，至少3倍，至少10倍的變化，以及約6.4% (49個基因)，2.2% (17個基因)，0.3% (2個基因)分別顯示在CD8+ 細胞中分別至少2倍，至少3倍，至少10倍變化。此外，暴露於FP-809的CD4+ 及CD8+ T細胞也顯示出幾種細胞激素的增加。從二個健康供體分離CD4+ 及CD8+ T細胞。將分離的細胞與MDA-MB-231新抗原特異性T細胞株一起與或不與濃度為37.5 ng/ml的FP-809作用24小時。處理及未處理的樣品之間的細胞濃度保持一致，濃度為1×106 個細胞/ml。收集上清液，透過一多重測定法分析細胞分泌的細胞激素濃度。如表 2 所示，在至少一個CD4+ T細胞樣品中，四種不同細胞激素IFN-γ、TGF-α、IL-6以及IL-8的量均顯著增加，從至少2.5倍 (IL -8)至超過700倍 (IFN-γ)。然而，細胞激素的這種增加在CD8+ T細胞以及MDA-MB-231新抗原特異性T細胞株中並不明顯。

表 1

表 2
本案發明人還發現自然殺手細胞中的基因表現也可以透過暴露於FP-809來調節，且自然殺手細胞表面上的一些標記物蛋白表現也可以在暴露於FP-809時被調節。圖 4 顯示了幾種在以FP-809處理的自然殺手細胞中表現顯著不同的標記物蛋白。於該實驗中，將健康供體自然殺手細胞與或不與FP-809一起作用24小時，然後染色用於多色流式細胞儀。表 3 顯示FP-809處理後表現增加或減少的標記物 (列出了以圖2A的嵌合分子處理後表現增加或減少的示例性標記物)。例如，雖然小於0.2%的未處理的自然殺手細胞表現4-1BB蛋白，但是在暴露於FP-809 24小時後，幾乎10% (9.91%)的自然殺手細胞表現4-1BB蛋白。對於其他實例，雖然超過28%的未處理的自然殺手細胞表現CD122 (IL-2Rβ)，但以FP-809處理的自然殺手細胞中僅2%表現CD122，表示CD122的表現透過FP-809處理顯著下調。圖4B-E所示為四種表現型自然殺手標記物的代表性柱狀圖，顯示了未處理細胞 (藍色輪廓)以及FP-809處理細胞 (紅色陰影)之間表現的變化。一些標記物蛋白在未處理的自然殺手細胞以及處理的自然殺手細胞之間的表現程度上沒有顯示出顯著差異，那些標記物包括NKG2A、NKp46、CD158a、CD16、CD40L、FAS-L，以及2B4。

表 3
與CD4+ 及/或CD8+ T細胞類似，自然殺手細胞在暴露於FP-809時顯示出差異基因表現。使用具有770個免疫相關基因的nCounter PanCancer免疫概況分析組，在RNA分離用於NanoString分析之前，將健康供體自然殺手細胞與或不與FP-809一起作用24小時。如圖 5 中的熱圖所示，來自二個不同供體的自然殺手細胞顯示出一致的上調 (在一組基因中顯示至少約2倍或更多 (1.67倍-5倍) (以紅色顯示)，以及一致的下調 (在另一組基因中至少約為二倍或更多 (1.67倍-5倍) (以藍色顯示)。如表 4 所示 (列出在自然殺手細胞中差異表現的示例性基因，在以圖2A的嵌合分子處理後)，在自然殺手細胞中的770個基因中，約21.4% (165個基因)，12.1% (93個基因)，5.2% (40個)基因分別顯示出至少2倍，至少3倍，至少10倍的變化。

表 4
此外，暴露於FP-809的自然殺手細胞也顯示出幾種細胞激素的增加。從二個健康供體分離自然殺手細胞，並在有或沒有濃度為37.5 ng/ml的FP-809的情況下作用24小時。處理及未處理的樣品之間的細胞濃度保持一致，濃度為1×106 個細胞/ml。收集上清液，透過一多重測定法分析細胞分泌的細胞激素濃度。如表 5 所示，以FP-809處理的二個供體的自然殺手細胞顯示四種不同細胞激素IFN-γ、TGF-α、IL-6，以及IL-8的量從幾乎至少2倍增加 (IL-8)至超過500倍 (IFN-γ)。
表 5
本案發明人考慮當暴露於FP-809時阻斷PD-L1活性作為腫瘤細胞中的配體及/或誘導自然殺手細胞的活化及/或細胞激素釋放可以在腫瘤細胞接觸自然殺手細胞時增加自然殺手細胞的腫瘤細胞裂解。 於第一個實驗中，如圖6A中示意性描述的，將自然殺手細胞預先暴露或與FP-809一起以0-60 ng/ml的遞增劑量作用24小時，然後洗滌以減少FP-809到腫瘤細胞的直接作用。然後，將預暴露 (或處理過)的自然殺手細胞與腫瘤細胞共作用 (接觸)。所有腫瘤裂解測定 (如圖6-7中所述)使用作為目標進行：H441 (肺癌，99.1% PD-L1+ )、CaSki (子宮頸癌，78.7% PD-L1+ )，以及MDA-MB-231 (乳癌，66.5% PD-L1+ )，於有多個供體的10：1效應子：目標(E:T)比下。每個實驗顯示一個代表性供體的結果。如圖6B-D所示，透過將自然殺手細胞預暴露於FP-809，顯著增加了三種不同類型腫瘤細胞的細胞裂解百分比。
接下來，本案發明人檢查了僅將腫瘤細胞暴露於FP-809是否可能影響自然殺手細胞的細胞裂解。於該實驗中，如圖6E中示意性描述的，將自然殺手細胞在沒有FP-809的情況下預作用24小時並洗滌。將腫瘤細胞 (H441、CaSki、MDA-MB-231)暴露於IgG1對照組 (灰線)或FP-809 (藍線)，濃度高達5 ng/ml，持續30分鐘，然後與洗滌的自然殺手細胞共培養。如圖6F-H所示，透過將這些腫瘤細胞預暴露於FP-809，顯著增加了三種不同類型腫瘤細胞的細胞裂解百分比。
然後，本案發明人檢查了FP-809對腫瘤細胞增加細胞裂解的作用是否為透過自然殺手細胞中CD-16調節的訊息傳遞途徑誘導抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)。於該實驗中，如圖6I中示意性描述的，將自然殺手細胞在沒有FP-809的情況下預作用24小時並洗滌。然後，在裂解測定之前，以抗CD16 抗體 (25 μg/ml、50μg/ml，或100 μg/ml)處理自然殺手細胞2小時。在與抗CD16抗體處理的自然殺手細胞共培養之前，將腫瘤細胞暴露於無單株抗體 (MAb)對照組、IgG1對照組，或濃度為約7.5 ng/ml的FP-809，持續30分鐘。如圖6J-L所示，雖然FP-809增加了所有三種腫瘤細胞類型中的細胞裂解百分比，但以抗CD16抗體處理自然殺手細胞顯著降低了FP-809的作用。針對圖6J-K，以抗CD16抗體以25 μg/ml的濃度處理的自然殺手細胞。針對圖6L，以更高濃度的抗CD16抗體 (25 μg/ml、50 μg/ml，或100 μg/ml)處理自然殺手細胞，並將MDA-MB-231細胞暴露於濃度為10 ng/ml的FP-809。
表 6 總結了具有或不具有針對自然殺手細胞的抗CD16抗體處理的三種不同腫瘤細胞株中的細胞裂解百分比，其清楚地顯示針對自然殺手細胞的抗CD16抗體處理可降低FP-809對細胞裂解的作用。具有或不具有抗CD16阻斷 (25 μg/ml，2小時)的自然殺手細胞對三種靶腫瘤細胞株的裂解百分比。在不存在單株抗體、IgG1 (7.5 ng/ml)或FP-809 (1.8、3.75，或7.5 ng/ml)的情況下進行腫瘤裂解測定。顯示的結果為每組三重複的平均裂解百分比 (標準偏差)。 以其他捐獻者觀察到類似的結果。例如，對於H441細胞，以7.5 ng/ml FP-809處理，細胞裂解百分比從2% (無單株抗體)增加至41.5%。抗CD16阻斷可以基本上抑制細胞裂解的這種增加，使得細胞裂解百分比僅增加至17.1%，這比沒有抗CD16阻斷低約2.5倍。

表 6
本案發明人進一步研究了FP-809對自然殺手細胞及腫瘤細胞的預暴露是否可以對細胞裂解提供協同效應。於第一個實驗中，如圖7A中示意性描述的，在洗滌之前24小時將自然殺手細胞預先暴露或與FP-809一起作用。將腫瘤細胞暴露於IgG1對照組或FP-809 30分鐘，然後與預暴露的自然殺手細胞共培養，以10: 1 E:T比例進行裂解測定。如圖7B-D所示，FP-809預先暴露於自然殺手細胞或腫瘤細胞可以增加細胞裂解百分比。重要的是，相較於僅自然殺手細胞或僅腫瘤細胞暴露於FP-809，FP-809預先暴露於自然殺手細胞以及腫瘤細胞可進一步提高細胞裂解百分比 (例如，在H441細胞中從35%或60%升至78%等)，表示FP-809預先暴露於自然殺手細胞以及腫瘤細胞對於由自然殺手細胞造成的腫瘤細胞的細胞裂解產生協同作用。
更進一步地，本案發明人檢查了FP-809對自然殺手細胞增加抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)的作用是否可以透過可治療腫瘤細胞的其他抗腫瘤試劑來增強。如表 7 所示，透過多色流式細胞儀以平均螢光強度 (mean fluorescence intensity, MFI) 測量PD-L1與EGFR的蛋白質表現程度，以確定這些蛋白質的表現百分比。本案發明人發現，所有三種類型的腫瘤細胞 (H441、CaSki、MDA-MB-231)中的大多數在細胞表面上顯示PD-L1及/或EGFR表現，表示以此類蛋白質作為目標可有效針對腫瘤細胞。

表 7
於第一個實驗中，如圖7E中示意性描述的，在洗滌前將自然殺手細胞預先暴露或與FP-809一起作用24小時。在添加自然殺手細胞之前，將腫瘤細胞暴露於IgG1對照組或西妥昔單抗(Cetuximab)30分鐘。本案發明人發現，如圖7F-H所示，相較於僅以FP-809預先暴露於自然殺手細胞以及僅對腫瘤細胞進行西妥昔單抗治療的樣品，在接觸FP-809預暴露的自然殺手細胞之前對腫瘤細胞的西妥昔單抗處理進一步增加了細胞裂解百分比(例如，在H441細胞中，從35% (僅FP-809暴露於自然殺手細胞)或僅20% (僅對腫瘤細胞進行西妥昔單抗治療)上升至56%等)，表示西妥昔單抗對腫瘤細胞的治療可以透過預先暴露於FP-809的自然殺手細胞對腫瘤細胞的細胞裂解產生協同作用。
然後，本案發明人進一步確定FP-809作為抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)的有效活化劑或由抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)調節的細胞裂解是否可以有效地在體內治療腫瘤。如圖8A中示意性所示，將健康小鼠移植4T1乳癌，其為可移植的腫瘤細胞株，其具有高度致瘤性及侵入性，並且可以自發地從乳腺中的原發性腫瘤轉移到多個遠端部位。在移植後11天及15天以FP-809處理4T1移植的小鼠，並且在第27天 (第二次FP-809處理後12天)，檢查4T1移植小鼠的肺組織以查看轉移的腫瘤組織的數量。如圖8B所示，本案發明人發現，相較於未處理的對照組，FP-809處理後肺中轉移組織的數量顯著減少 (P = 0.0088)。
嵌合分子複合物用於治療患者腫瘤之用途
本案發明人還進一步考慮了包含嵌合分子複合物之化合物及組合物可施用於患有腫瘤的患者以增加針對腫瘤的免疫反應，尤其是針對腫瘤的抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)，進而可以降低腫瘤大小及/或腫瘤的轉移率可以降低。如本文所用，術語“施用”係指直接及間接施用本文考慮之化合物及組合物，其中直接施用通常由醫療保健專業人員 (例如，醫生、護士等)進行，而間接施用通常包括提供或製備可供醫療保健專業人員直接給藥的化合物及組合物之步驟。
預期於某些具體實施例中，嵌合分子及複合物將以適於注射治療有效量的製劑施用。治療有效量可以為奈克 (ng)量至100 mg，例如10 ng至50 mg，10μg至10 mg。共溶劑或洗滌劑可用於增加製劑的儲存穩定性及溶解度。另外或可替代地，可使用混合相或雙相液體系統。最佳地，將嵌合分子複合物配製成即用型液體。然而，預期嵌合分子複合物也可以配製成乾燥形式，用於透過凍乾或冷凍乾燥重建。
於某些具體實施例中，該嵌合分子組合物或製劑可以透過全身注射給藥，包括皮下注射，表皮下注射，或靜脈內注射。於其他具體實施例中，在全身注射可能不是有效的情況下 (例如，對於腦腫瘤等)，預期透過腫瘤內注射施用製劑。
關於製劑施用的劑量及時間表，預期劑量及/或時間表可以根據取決於嵌合分子或分子複合物的類型、疾病的類型以及預後 (例如，腫瘤類型、大小、位置)、患者的健康狀況 (例如，包括年齡、性別等)而變化。雖然它可以變化，但可以選擇並調節劑量及方案，使得製劑不會對宿主正常細胞提供任何顯著的毒性作用，但足以誘導針對腫瘤細胞的抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)。因此，於較佳的具體實施例中，可以基於預定閾值確定施用製劑的最佳或期望條件。例如，預定閾值可以是從活化的自然殺手細胞釋放的細胞激素 (例如，IFN-γ、IL-10、IL-13等)的預定局部或全身濃度。因此，通常調節給藥條件以使細胞激素的濃度至少局部或全身地增加至少20%、至少30%、至少50%、至少60%、至少70%。或者，可以基於腫瘤大小或腫瘤細胞的定期觀察來調整製劑施用的劑量及時間表，以使腫瘤尺寸減小至少10%、至少20%、至少30%，或至少40 %，於14天內、28天內，或2個月內等。
於某些具體實施例中，特別是在該嵌合分子組合物包括FP-809的情況下，本案發明人考慮可以較低劑量腫瘤內施用該組合物至敏感腫瘤細胞至抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)，然後以較高劑量腫瘤內施用以活化CD4+ 、CD8+ T細胞及/或自然殺手細胞以引發針對腫瘤細胞的免疫反應。在此類具體實施例中，該較高劑量可以比該較低劑量高出至少50%、至少2倍、至少3倍、至少5倍。
或者，本案發明人還考慮了免疫機能健全細胞 (CD4+ 、CD8+ T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞)可以離體預暴露於嵌合分子組合物 (較佳包括FP-809)或以離體處理，然後施用患者以治療腫瘤。於此類具體實施例中，為了減少任何同種異體移植物的排斥，較佳免疫機能健全細胞為自體細胞，使其從患者中分離，或者是從患者的前體細胞生長的細胞。然而，還預期該免疫機能健全細胞衍生自任何永生化細胞株 (通常在施用前照射)。
例如，對於自然殺手細胞，自然殺手細胞可透過某些特徵及生物學特性而容易地被鑑定，例如特定表面抗原的表現，包括人類自然殺手細胞的CD56及/或CD16，細胞表面上缺乏α/β或γ/δ TCR複合物，透過活化特定的細胞溶解機制而能夠結合併殺死不能表現“自身” MHC/HLA抗原的細胞，殺死腫瘤細胞或表現針對自然殺手活化受體的配體的其他疾病細胞的能力，以及釋放稱為細胞激素的蛋白質分子的能力，這些細胞激素刺激或抑制免疫反應。使用本領域熟知的方法，這些特徵及活性中的任何一種都可用於鑑定及/或分離自然殺手細胞。當然，應當注意的是，合適的宿主細胞，特別是自然殺手細胞係從診斷患有腫瘤的患者獲得，或者從已經建立的細胞株獲得，如以下進一步所詳述的。
關於自然殺手T細胞，自然殺手T細胞代表一異質細胞群，其可基於數種分子標記物 (例如，Vα24等)的存在及/或它們對配體的反應性 (例如，CD1d限制性的，對α-半乳糖神經醯胺 (α-GalCer)的反應性等)而分為三類。於一具體實施例中，可使用針對Vα24的抗體或針對Vα24-Jα18的抗體來分離通常表現Vα24-Jα18型T細胞受體的人類第I型自然殺手T細胞。於其他具體實施例中，可以使用CD1d分子的一部分 (較佳為負責對自然殺手T細胞受體的高親和力的部分)， 與一脂質抗原偶合的CD1d分子的一部分(例如，由外來生物產生的任何脂質抗原、營養物質，或從患者產生的可與CD1d結合的自身脂質等)，或與一胜肽(例如，p99等)偶合的CD1d分子的一部分，來進行人類第I型及第II型自然殺手T細胞 (通常為CD1d限制性細胞)的分離。一旦分離，透過自然殺手T細胞的離體擴增可進一步增加分離並富集的自然殺手T細胞群。自然殺手T細胞的離體擴增可用任何合適的材料以任何合適的方法進行，該材料可以在7-21天內將自然殺手T細胞擴增至少10倍，較佳至少100倍。例如，可以將分離及富集的自然殺手T細胞置於包含一種或多種活化條件的細胞培養基 (例如，AIMV® 培養基、RPMI1640® 等)中。該活化條件可包括添加任何可刺激自然殺手T細胞生長的分子、誘導自然殺手T細胞的細胞分裂，及/或刺激自然殺手T細胞的細胞激素釋放，其可進一步擴增自然殺手T細胞。因此，該活化分子包括一種或多種在任何所需濃度(例如，至少10 U/ml、至少50 U/ml、至少100 U/ml)的細胞激素 (例如，IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-12、IL-12、IL-15、IL-18，以及IL-21，較佳為人類重組IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-12、IL-12、IL-15、IL-18，以及IL-21等)，T細胞受體抗體 (例如，抗CD2、抗CD3、抗CD28、α-TCR-Vα24+抗體，較佳為固定於珠粒上等)、一醣脂 (例如，α-GlcCer、β-ManCer、GD3等)，一與CD1偶合的醣脂 (例如，CD1d等)等。
關於T細胞，T細胞可為CD4+ 及/或CD8+ T細胞，其可以是對患者而言尚未與抗原接觸的初始T細胞或考慮同種異體的。相較於自然殺手細胞或自然殺手T細胞，淋巴細胞內T細胞的頻率通常較高 (例如，周圍血單核細胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中CD4+ T細胞為25-60%，PBMC中CD8+ T細胞為5-30%)，並考慮使用標記物 (例如，CD3、CD4、CD8等)分離T細胞 (CD3+ )或T細胞亞型 (CD4+ 或CD8+ )的任何合適方法，包括螢光活化細胞分選法 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS)，以及任何下拉分析。
然而，還預期自然殺手細胞、自然殺手T細胞、T細胞也可為異源自然殺手細胞、自然殺手T細胞、T細胞。例如，較佳的自然殺手細胞可包括永生化自然殺手細胞 (通常在施用前照射)，而且此類永生化自然殺手細胞包括NK92細胞，其可經遺傳工程改造以實現一種或多種特定目的。例如，自然殺手細胞為具有CD16的重組高親和力變體 (例如，V158變體)的NK92細胞。此外，亦為較佳的NK92細胞進一步經遺傳修飾以在內質網中表現IL-2，使得自然殺手細胞的細胞毒性在低氧條件 (例如，腫瘤微環境)下保持活性。一種較佳類型的自然殺手細胞包括來自NantKwest的市售haNK細胞 (9920 Jefferson Blvd.Culver City, CA 90232)。
任選地，來自患者的分離的免疫機能健全細胞可進一步離體擴增。自然殺手細胞或自然殺手T細胞的離體擴增可用任何合適的材料以任何合適的方法進行，該材料可以在7-21天內將自然殺手T細胞擴增至少10倍，較佳至少100倍。例如，可以將自然殺手細胞或自然殺手T細胞置於包含一種或多種活化條件的細胞培養基 (例如AIMV® 培養基，RPMI1640® 等)中。活化條件可包括添加任何可刺激自然殺手細胞或自然殺手T細胞生長的分子、誘導自然殺手細胞或自然殺手T細胞的細胞分裂，及/或刺激自然殺手細胞或自然殺手T細胞的細胞激素釋放，其可進一步擴增自然殺手細胞或自然殺手T細胞。預期活化條件可根據離體擴增及活化的時間而變化。例如，可以使用在培養基中添加的各種活化分子 ，包括細胞激素 (例如，IL-2、IL-15等)、單株抗體 (例如，針對CD3的鼠單株抗體 (OKT3TM )等)，或使用與活化細胞的細胞及細胞間的相互作用(例如，K562細胞，其為一種衍生自一患有慢性骨髓性白血病的急性芽球危象並伴有BCR-ABL1 易位的患者的細胞株等)來進行自然殺手細胞擴增。
關於自然殺手T細胞，自然殺手T細胞的離體擴增及活化可以使用內源性自然殺手T細胞受體的活化劑或針對該內源性自然殺手T細胞受體的組成分的抗體來進行，然後透過重組核酸的敲入來去除該內源性自然殺手T細胞。然而，在透過重組核酸的敲入以去除該內源性自然殺手T細胞後，預期內源性自然殺手T細受體的活化劑或抗該內源性自然殺手T細胞受體組成分的抗體可能無法用於有效的離體擴張及活化。
因此，如果在將該重組核酸導入該自然殺手T細胞之前進行離體擴增及活化，則該活化分子可包括T細胞受體抗體 (例如，抗CD2、抗CD3、抗CD28、α-TCR-Vα24+抗體，較佳固定在珠粒上等)、一醣脂 (例如，α-GlcCer、β-ManCer、GD3 等)、一與CD1偶合的醣脂 (例如，CD1d等)。在將該重組核酸引入該自然殺手T細胞後，該活化分子可包括一種或多種以任何所需濃度 (例如，至少10 U/ml、至少50 U/ml、至少100 U/ml)的細胞激素 (例如，IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-12、IL-12、IL- 15、IL-18，以及IL-21，較佳為人類重組IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-12、IL-12、IL-15、IL-18，以及IL-21等)。於某些具體實施例中，該活化條件可包括以自體或同種異體周圍血單核細胞 (PBMC)飼養細胞培養分離的與富集的自然殺手T細胞。
此外，本案發明人還考慮自然殺手T細胞的離體擴增可以針對特定類型的自然殺手T細胞進行擴增，這是透過以不同類型的醣脂 (例如，α-GlcCer、β-ManCer、GD3等)處理該自然殺手T細胞來達成，而這些醣脂可觸發具有釋放不同細胞激素特徵的自然殺手T細胞。例如，可用細胞外α-GlcCer離體處理自然殺手T細胞以將擴增的自然殺手T細胞誘導至一特定類型：產生IFN-γ的自然殺手T細胞。針對其他實施例，可用細胞外β-ManCer離體處理自然殺手T細胞以將擴增的自然殺手T細胞誘導至另一種特定類型：具有TNF-α、iNOS依賴性抗腫瘤活性的自然殺手T細胞。
關於活化條件，預期提供活化條件的劑量及時間表可以根據自然殺手細胞或自然殺手T細胞的初始數量以及自然殺手細胞或自然殺手T細胞的狀況而變化。於某些具體實施例中，一單劑量的細胞激素 (例如，100 U/ml)可以使用至少3天、至少5天、至少7天、至少14天、至少21天。於其他具體實施例中，細胞激素的劑量可在擴增期間增加或減少 (例如，前3天為200 U/ml，接下來的14天為100 U/ml，或前3天為100 U/ml，接下來的14天為200 U/ml等)。還預期在離體擴增期間可以組合或分開使用不同類型的細胞激素 (例如，前3天使用IL-15而接下來3天使用IL-18，或以IL-15與IL-18的組合持續使用14天等)。
然後可以使這種分離且任選的擴增/活化的免疫機能健全細胞離體與嵌合分子組合物 (例如FP-809)接觸。以該嵌合分子組合物離體處理該免疫機能健全細胞的劑量及方案可以根據嵌合分子組成的類型以及免疫機能健全細胞的類型而變化。例如，當該嵌合分子為FP-809，該免疫機能健全細胞為自然殺手細胞及/或T細胞 (CD4+ 、CD8+ )時，在對該患者施用該免疫機能健全細胞之前，可以濃度在1 ng/ml-100 ng/ml、3 ng/ml-70 ng/ml、5 ng/ml-60 ng/ml的任何生理範圍內的FP-809來處理自然殺手細胞及/或T細胞 (CD4+ 、CD8+ )至少6小時、至少12小時、至少24小時、至少2天。於某些具體實施例中，可以在將細胞施用於患者之前確定離體FP-809治療的有效性，透過進一步分離預暴露或處理的免疫機能健全細胞的一部分以確定基因表現及/或蛋白質表現程度，或透過測定細胞培養基中分泌的細胞激素含量。例如，FP-809可以一定濃度及一段時間對自然殺手細胞進行處理，使得自然殺手細胞分泌的IFN-γ的量與未處理的自然殺手細胞相比增加至少50倍、至少100倍、至少200倍，或甚至500倍。
預期離體的，預暴露的 (經處理的)免疫機能健全細胞可以配製在任何藥學上可接受的載體 (例如，作為無菌可注射組合物)中，以細胞數量為至少1×103 個細胞/ml，較佳為至少1×105 個細胞/ml，更佳為至少1×106 個細胞/ml，以及每劑量單位至少1 ml，較佳為至少5 ml，更佳為至少20 ml。然而，替代製劑也被認為適用於本文，且本文考慮了所有已知的給藥途徑及方式。於某些具體實施例中，細胞組合物可包含均質的預暴露 (處理的)免疫機能健全細胞 (例如，預暴露的自然殺手細胞)。於其他具體實施例中，該細胞組合物可包含異質的預暴露 (處理的)免疫機能健全細胞 (例如，預暴露的自然殺手細胞以及CD4+ T細胞)。還預期該細胞組合物可包含在不同條件下預暴露於嵌合分子組合物的免疫機能健全細胞的混合群組。例如，該細胞組合物可包括二組混合在一起的自然殺手細胞，其中一組自然殺手細胞以5 ng/ml的濃度預暴露於FP-809 24小時，另一組自然殺手細胞則以30 ng/ml的濃度預暴露於FP-809 18小時，且二組細胞的比例為至少1：1、至少2：1、至少3：1、至少5：1，或至少1：2、至少1：3，或至少1：5。
抗癌藥物與預先暴露的免疫機能健全細胞之共同施用
較佳地，向該癌症患者施用預先暴露的免疫機能健全細胞可伴隨腫瘤內或全身施用一種或多種嵌合分子組合物、一抗癌藥物或另一種癌症療法。例如，腫瘤內注射包含FP-809的製劑可以伴隨以任何方式施用預先暴露的免疫機能健全細胞，以引起增加抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)對腫瘤細胞的協同作用。於這些實施例中，FP-809製劑可以在對患者施用預先暴露的免疫機能健全細胞之前至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少6小時前施用，使得預先暴露的免疫機能健全細胞可使腫瘤細胞對抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)敏感，進而增加該腫瘤細胞的裂解。然而，還預期該FP-809製劑可以與預先暴露的免疫機能健全細胞混合以進行腫瘤內施用。
另外或可替代地，腫瘤內或全身注射抗癌藥物可以伴隨以任何方式施用預先暴露的免疫機能健全細胞以引起增加抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)對腫瘤細胞的協同作用。考慮了任何合適的抗癌藥物，包括基於胜肽的、基於抗體的、基於核酸的，以及基於非胜肽的分子，其可以與免疫機能健全細胞偶合，而不會對細胞的預期活性產生實質性干擾 (例如，識別抗原等)，並且在細胞外環境 (以及可能的輕微酸性環境，例如腫瘤微環境)中沒有實質性的細胞毒性損失。因此，特別較佳的抗癌藥物可包括免疫刺激細胞激素、免疫刺激化學激活素、放射增敏藥物，或化學治療藥物。例如，該抗癌藥物可包括一種或多種免疫刺激分子 (例如，CD30L、CD40L、ICOS-L、OX40L、4-1BBL、GITR-L等)、免疫刺激細胞激素 (例如，IL- 2、IL-12、IL-15、IL-15超促效劑 (ALT803)、IL-21、IPS1，以及LMP等)，及/或檢查點抑制劑 (例如，抗體或CTLA-4的結合分子 (尤其是針對CD8+ 細胞)、PD-1 (特別是針對CD4+ 細胞)、TIM1受體、2B4，以及CD160等)。
於其他實施例中，該抗癌藥物可為MDSC抑制劑中的一種或多種，其包括MDSC募集抑制劑、MDSC擴增抑制劑、MDSC分化抑制劑，及/或MDSC活性抑制劑。MDSC募集抑制劑可包括一種或多種群落刺激因子1受體 (colony-stimulating factor 1 receptor, CSF-R)，顆粒性白血球群落刺激因子 (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)，C-C基序化學激活素配體2 (C-C motif chemokine ligand 2, CCL2)，或C-X-C化學激活素受體第4型(C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4)的一種或多種拮抗劑。該拮抗劑可包括與該目標分子結合的小分子抑制劑、抗體或其片段，與該目標分子結合的單鏈可變片段 (scFv)分子，或任何其它合適的結合分子。例如，CSF-R的拮抗劑可包括小分子抑制劑 (例如，Pexidartinib等)或一種或多種針對CSF-R的單株抗體 (例如，艾美珠單抗(Emactuzumab)、A MG820、imc-CS4、MCS110等)。或者或另外，可透過施用吉西他濱(gemcitabine)、胺基二磷酸鹽、舒尼替尼(sunitinib)，或塞來昔布(celecoxib)來抑制腫瘤中MDSCs的擴增，並且以紫杉烷、薑黃素或，維生素D3來抑制腫瘤中MDSCs的分化。此外，透過施用阿米洛利(amiloride)、CpG、COX2抑制劑、PDE-5抑制劑，或PGE2抑制劑可以抑制腫瘤中的MDSC活性。
另外或可替代地，該抗癌藥物可為一CXCR1抑制劑及/或一CXCR2抑制劑。本領域已知有各種這樣的抑制劑，且合適的抑制劑為各種2-胺基-3-雜芳基-喹喔啉 (參見例如，Bioorg Med Chem. 2003 Aug 15;11(17):3777-90)、6-氯-3-[[[(2,3-二氯苯基)胺基]羰基]胺基]-2-羥基苯磺醯胺 (SB332235)，或N -(2-溴苯基)-N’ -(7-氰基-1H -苯並三唑-4-基)尿素 (SB265610)。如果需要具有更高特異性的抑制劑，可以使用SCH-527123以及SCH-479833，其將分別選擇性地抑制CXCR2以及CXCR1 (參見例如，Clin Cancer Res . 2009 Apr 1; 15(7):2380-6)。當然，應當理解的是，該CXCR1/2途徑活性也可被一種或多種干擾訊息傳遞鏈元件的藥劑所抑制。在又一實施例中，可以使用reparixin (也稱為repertaxin，參見例如，Biol Pharm Bull . 2011;34(1):120-7)抑制IL-8受體 (包括CXCR1/2)的活化，或者可透過阻斷訊息傳遞途徑中的一種或多種元件來抑制通過CXCR1/2的IL-8調節的訊息傳遞級聯反應。因此，抑制劑還可透過以PI3激酶、pAkt，或mTOR為目標以抑制CXCR1訊息傳遞，及/或以RhoGTP酶、RacGTP酶，以及Ras、Raf、Mek，或pErk為目標以抑制CXCR2訊息傳遞，而將CXCR1及2訊息傳遞途徑作為目標。由於IL-8訊息傳遞也至少間接影響MDSCs，因此預期至少一些上述藥劑會降低MDSC對腫瘤環境的活性或募集。
此外，該抗癌藥物可為抑制該腫瘤細胞的EMT或逆轉該腫瘤細胞的EMT過程，或甚至促進腫瘤細胞的上皮細胞間質轉變 (mesenchymal to epithelial transition, MET)的試劑。例如，在EMT過程期間，TGF-β誘導FGF受體2的同種型轉換 (例如，從同種型IIIb轉變為IIIc)，且預期抑制腫瘤細胞中的TGF-β活性 (例如，使用顯性失活形式的TGF-βRII，針對TGF-β1與β2的單株抗體，包括拉德利木單抗(lerdelimumab)以及美替木單抗(metelimumab)等，可以減少或禁止FGF受體2的同種型轉換，進而防止腫瘤細胞的EMT。於又一實施例中，可透過施用8-溴-cAMP、紫杉醇，或腺苷3’,5’-環狀單磷酸鹽、N6-苯甲醯基-鈉鹽，其活化蛋白激酶A (PKA)，以進行體外誘導上皮細胞間質轉變(MET)。還可透過施用編碼重組E-鈣黏蛋白的重組病毒或抑制N-鈣黏蛋白表現的調節RNA來刺激E-鈣年蛋白過表現並降低N-鈣黏蛋白表現以誘導腫瘤細胞的上皮細胞間質轉變(MET)。此外，腫瘤細胞的上皮細胞間質轉變(MET)也可透過EGFR抑制及/或下調Snail、Slug、Zeb-1、Zeb-2，及/或N-鈣黏蛋白來誘導 (例如，使用siRNA、miRNA、shRNA，或其他減少轉錄後表現的調節性小分子等)。
還預期抗癌藥物可包括免疫抑制細胞的其他抑制劑，可與結合分子及/或細胞毒性免疫細胞同時施用，或者在施用結合分子及/或細胞毒性免疫細胞之前施用。特別考慮的試劑包括RP-182以抑制或殺死M2巨噬細胞、吉西他濱、順鉑，及/或環磷醯胺以減少或抑制調節性T細胞 (Tregs)。
對於其他實施例，較佳且合適的抗癌藥物可包括使用治療性α及/或β發射體的位點特異性放射性同位素治療。合適的α發射體包括錒-225 (225 Ac, 10天)、砈-211 (211At，7.2小時)，鉍-212 (212 Bi, 1小時)、鉍-213 (213 Bi, 45.6分鐘)、鐳-223 (223 Ra, 11.4天)、錒-225 (225 Ac, 10.0天)以及釷-227 (227 Th, 18.7天)，而合適的β發射體包括鎢-188 (188 W, 69.4天)、釔-90 (90 Y, 64.1小時)、銅-67 (67 Cu, 61.8小時)、銅-64 (64 Cu, 12.7小時)，錸-186 (186 Re, 70天)、鍶-90 (90 Sr, 28.8年)，以及鎦-177 (177 Lu, 160.4天)。於一些實施例中，歐傑發射器(auger emitters)可以在有限的情況下使用。合適的歐傑發射器包括鎵-67 (67 Ga)、碘-123 (123 I)，以及碘-125 (125 I)。α及/或β發射器 (有時是歐傑發射器)可以耦合到胜肽載體 (例如，腫瘤特異性胜肽等)或加載到生物相容性奈米顆粒上 (例如，膠體金顆粒、量子點、光敏金奈米顆粒、磁性奈米顆粒，以及基於聚合物的聚合物奈米顆粒以及奈米級脂質體等)。
雖然抗癌藥物施用的劑量及時間表可以根據抗癌藥物的類型而變化，但是預期在這些實施例中，抗癌藥物製劑可以在對患者施用預暴露的免疫機能健全細胞之前至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少6小時施用，使得腫瘤細胞可以透過由預暴露的免疫機能健全細胞使該腫瘤細胞預先對抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)敏感，進而增加該腫瘤細胞的裂解。然而，還預期該抗癌藥物製劑可與預先暴露的免疫機能健全細胞混合以進行腫瘤內施用。
對於本領域技術人員應當為顯而易見的是，除了已經描述的那些之外，在不悖離本文之發明構思下，還可進行更多的修改。因此，除了所附之申請專利範圍的範圍之外，本發明的主題不受限制。此外，在解釋說明書及申請專利範圍時，所有術語應以符合上下文之最廣泛的方式進行解釋。特別是，術語“包括(comprises)”以及“包括(comprising)”應被解釋為以非排他性的方式指元素、組件或步驟，指示所引用之元件、組件或步驟可以與未明確引用的其他元素、組件或步驟一起存在、或使用，或組合。如本文的描述及隨後的申請專利範圍中所使用的，除非上下文另有明確說明，“一”、“一個”以及“該”的含義包括複數指示物。此外，如在本文的描述中所使用的，除非上下文另有明確規定，否則“在...中”的含義包括“在…中”以及“在…上”。凡說明書聲明涉及選自由A、B、C ... 以及N所組成之群組中的至少一種某物，該內文應該被解釋為僅需該群組中的一個元素，而非A加N，或B加N等。
圖 1A-K 說明了根據本發明主題之示例性嵌合分子及嵌合分子複合物((A)-(K))。
圖 2A 說明了另一種示例性嵌合分子之示意圖，該嵌合分子具有與IL-15超促效劑偶合或融合的PD-L1結合結構域。
圖 2B-C 分別顯示了以圖2A之嵌合分子處理後CD4+ 或CD8+ T細胞增殖的圖。
圖 3A-B 分別顯示了以圖2A之嵌合分子處理後CD4與CD8 T細胞基因表現的熱圖。
圖 4 所示為四種表現型NK標記物的柱狀圖，顯示以圖2A之嵌合分子處理後表現的變化。
圖 5 所示為以圖2A之嵌合分子處理後自然殺手細胞中基因表現的熱圖。
圖 6A 所示為以圖2A之嵌合分子預曝露之示意圖。
圖 6B-D 所示為在以如圖2A所述之嵌合分子預暴露後三種不同腫瘤細胞株H441 (肺癌)、CaSki (子宮頸癌)，以及MDA-MB-231 (乳癌)中腫瘤細胞裂解的圖。
圖 6E 所示為以圖2A之嵌合分子預暴露之示意圖。
圖 6F-H 所示為在以如圖6E所述之嵌合分子預暴露後三種不同腫瘤細胞株H441 (肺癌)、CaSki (子宮頸癌)，以及MDA-MB-231 (乳癌)中腫瘤細胞裂解的圖。
圖 6I 所示為以圖2A之嵌合分子進行的另一種預暴露之示意圖。
圖 6J-L 所示為在以如圖6I所述之嵌合分子預暴露後三種不同腫瘤細胞株H441 (肺癌)、CaSki (子宮頸癌)，以及MDA-MB-231 (乳癌)中腫瘤細胞裂解的圖。
圖 7A 所示為以圖2A之嵌合分子進行的另一種預暴露之示意圖。
圖 7B-D 所示為在以如圖7A所述之嵌合分子預暴露後三種不同腫瘤細胞株H441 (肺癌)、CaSki (子宮頸癌)，以及MDA-MB-231 (乳癌)中腫瘤細胞裂解的圖。
圖 7E 所示為以圖2A之嵌合分子進行的另一種預暴露之示意圖。
圖 7F-H 所示為以如圖7E所述之嵌合分子預暴露後三種不同腫瘤細胞株H441 (肺癌)、CaSki (子宮頸癌)，以及MDA-MB-231 (乳癌)中腫瘤細胞裂解的圖。
圖 8A 所示為對一患有轉移性癌症的患者施用圖2A之嵌合分子的方案。
圖 8B 所示為在如圖8A所示之方案中對該患者施用圖2A之嵌合分子後肺轉移減少的圖。

Claims (20)

  1. 一種重組免疫球蛋白複合物，包括： 一Fc結構域，具有第一及第二Fc部分，該第一及第二Fc部分與分別具有第一及第二目標識別結構域的第一及第二細胞激素結合結構域偶合； 其中該第一及第二細胞激素結合結構域與一第一及第二細胞激素偶合；以及 其中該第一及第二目標識別結構域中的至少一個被配置為結合PD-L1。
  2. 如申請專利範圍第1項之蛋白複合物，其中該第一及第二Fc部分形成一二聚體。
  3. 如申請專利範圍第1項之蛋白複合物，其中該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為IL-15Rα。
  4. 如申請專利範圍第1項之蛋白複合物，其中該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為修飾的IL-15Rα，該修飾的IL-15Rα降低與IL-15Rβ或IL-15Rγ的相互作用。
  5. 如申請專利範圍第1項之蛋白複合物，其中該第一及第二細胞激素中的至少一個為IL-15。
  6. 如申請專利範圍第1項之蛋白複合物，其中該第一及第二目標識別結構域中的至少一個係選自由下列所組成之群組：一PD-L1抗體、一PD-L1抗體的Fab片段，以及與PD-L1結合的單鏈可變片段(single-chain variable fragment, scFv)。
  7. 如申請專利範圍第1項之蛋白複合物，其中該蛋白質複合物係經由該Fc結構域與一載體蛋白偶合。
  8. 如申請專利範圍第7項之蛋白複合物，其中該載體蛋白係選自由下列所組成之群組：蛋白A、蛋白G、蛋白Z、白蛋白，以及重折疊白蛋白。
  9. 一種調節一免疫機能健全細胞中基因表現之方法，包括： 提供一重組免疫球蛋白複合物，包括： 一Fc結構域，具有第一及第二Fc部分，該第一及第二Fc部分與分別具有第一及第二目標識別結構域的第一及第二細胞激素結合結構域偶合； 其中該第一及第二細胞激素結合結構域與一第一及第二細胞激素偶合；以及 其中該第一及第二目標識別結構域中的至少一個被配置為結合PD-L1。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該第一及第二Fc部分形成一二聚體。
  11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為IL-15Rα。
  12. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該第一及第二細胞激素結合結構域中的至少一個為修飾的IL-15Rα，該修飾的IL-15Rα降低與IL-15Rβ或IL-15Rγ的相互作用。
  13. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該至少一種細胞激素為IL-15。
  14. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該第一及第二目標識別結構域中的至少一個係選自由下列所組成之群組：一PD-L1抗體、一PD-L1抗體的Fab片段，以及與PD-L1結合的單鏈可變片段(scFv)。
  15. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該蛋白質複合物係經由該Fc結構域與一載體蛋白偶合。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該載體蛋白係選自由下列所組成之群組：蛋白A、蛋白G、蛋白Z、白蛋白，以及重折疊白蛋白。
  17. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該免疫機能健全細胞為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞，以及自然殺手細胞中的至少一種。
  18. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該基因表現被調節以使至少二個基因的mRNA表現增加至少二倍。
  19. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該基因表現被調節以使至少三個基因的mRNA表現增加至少三倍。
  20. 如申請專利範圍第1至8項任一項之重組免疫球蛋白複合物用於調節一免疫機能健全細胞的基因表現或用於治療一患有一腫瘤之患者的該腫瘤或用於增加一患有一腫瘤之患者的免疫療法的有效性之用途。
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