JP2021514665A

JP2021514665A - がんおよび感染症を処置するための治療用細胞系および方法

Info

Publication number: JP2021514665A
Application number: JP2020547001A
Authority: JP
Inventors: トーマスジョセフウィッカム，; シヴァンエロール，
Original assignee: ルビウスセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2021-06-17
Also published as: SG11202008261WA; EP3762422A1; RU2020132924A; CN112105723A; CA3093387A1; WO2019173798A1; US11141433B2; US20220088076A1; AU2019232012A1; IL277159A; KR20200140279A; US20190298769A1; MX2020009359A

Abstract

本開示は、例えば、細胞の表面に、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを含むように操作された赤血球系細胞であって、提示される外因性刺激性ポリペプチドが、免疫キラー細胞を刺激するのに十分である、赤血球系細胞に関する。本開示の操作された除核細胞は、それを必要とする対象、例えば、がんまたは感染症、特にＭＨＣクラスＩ提示の下方制御を特徴とするがんまたは感染症を有する対象などにおけるＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する方法において有用である。

Description

関連出願
本出願は、それぞれの内容全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年３月８日出願の米国仮特許出願第６２／６４０，５３０号、２０１８年４月２０日出願の米国仮特許出願第６２／６６０，６５７号、２０１８年６月４日出願の米国仮特許出願第６２／６８０，４９０号、２０１８年６月２９日出願の米国仮特許出願第６２／６９２，４８７号、２０１８年９月１７日出願の米国仮特許出願第６２／７３２，０５０号、および２０１８年１１月８日出願の米国仮特許出願第６２／７５７，７１７号の優先権を主張するものである。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月５日に作成され、１２９２６７−００２２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１２７，９２０バイトである。

ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、免疫系の細胞傷害性エフェクター細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞は標的認識およびシグナル伝達カスケードの異なる機構を有するが、どちらも感染および形質転換された細胞を死滅させるという同様の目的を共有するキラー細胞の型である。腫瘍に対するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞応答を刺激するために、いくつかの戦略が使用されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、現行のがん免疫療法において重大な役割を果たす。いくつかのヒトがんの処置にサイトカイン治療が使用され、その場合、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）またはＴＮＦαなどのサイトカインを用いた処置により、局所的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞活性（例えば、分化および活性化）が増強される。がん患者におけるＮＫ細胞の活性化および増大に対するＩＬ−２投与の効果がいくつかの試験において評価されており、腫瘍の型およびＩＬ−２投与に使用された条件に応じて転帰が混在している。さらに、サイトカインの投与を伴うそのような治療には、潜在的な毒性が伴う。

ＣＤ８＋腫瘍浸潤性リンパ球の量と免疫療法を用いた無増悪生存期間との間の正相関が試験により示されている（例えば、Sharma et al., Science 2015, 348: 56-61を参照されたい）。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を利用して、がんを根絶させる。しかし、ＣＡＲ−Ｔ治療に関する難題の１つは、ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍特異的ではないことである。特に固形腫瘍に関して、ＣＡＲ−Ｔ標的化の安全性に重大な懸念がある（Junghans, Cancer Gene Therapy (2017)24, 89-99）。

現在、ＮＫ細胞を標的化するための最も有望な手法のいくつかは、自己ＮＫ細胞、同種異系ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株およびＣＡＲＮＫ細胞の使用を含む、養子細胞移入を伴う。しかし、これらの手法には、有効性が低いこと、ＧＶＨＤを回避するためにＴ細胞を実質的に枯渇させる必要があること（同種異系細胞に関して）、対象における持続性が低いこと、ならびに多数の細胞を増大および／または製造することが難しいことなどの重大な欠点が伴う。
したがって、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）を治療目的で活用する代替法が当技術分野において依然として必要とされている。

Sharma et al., Science 2015, 348: 56-61 Junghans, Cancer Gene Therapy (2017)24, 89-99

本開示は、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を刺激するように操作された赤血球系細胞（例えば、操作された赤血球系細胞）に関する。詳細には、本発明は、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化および／または増大させるのに十分な１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬまたはこれらの組合せなどを赤血球系細胞の細胞表面に発現させることにより、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を刺激するように操作された赤血球系細胞を提供する。操作された赤血球系細胞は、有核、例えば、赤血球系前駆細胞（例えば、赤血球前駆細胞）の場合もあり、除核赤血球系細胞、例えば、網状赤血球または赤血球の場合もある。本発明は、さらに、これらの操作された赤血球系細胞の、がんを有する対象または感染症を有する対象などのそれを必要とする対象におけるＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化における使用を提供する。

本明細書に提示される操作された赤血球系細胞は、天然に免疫特権を有し、ｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞の刺激を直接媒介し、したがって、免疫キラー細胞の養子細胞移入に付随する不都合が回避されるという、現行の免疫キラー細胞標的化技術よりも有意な利点をもたらす。本発明の操作された赤血球系細胞は、これらの細胞集団にｉｎｖｉｖｏで曝露させるとＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞を両方同時に刺激するように操作することができる。特に、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬまたはこれらの組合せを含む操作された赤血球系細胞により、初代ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の強力な活性化が駆動され、ＮＫ細胞の細胞傷害性が誘導されることは本発明の発見である。ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方をｉｎｖｉｖｏで刺激することは、刺激がｅｘｖｉｖｏで起こり、一般には一度に１つの免疫細胞の集団（例えば、ＮＫ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の刺激に制限される既存の治療に対する重要な革新である。

操作された赤血球系細胞は、多数の異なる刺激性分子を単一の赤血球系細胞において、有意に多い数で提示する、例えば、細胞表面に含む、ならびに刺激性シグナルを赤血球系細胞を介して循環系中を直接、長い循環半減期で送達し、維持し、したがって、免疫キラー細胞を刺激するためのより安全かつより有効な方法がもたらされるという追加的な利点をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載の通り、本発明の操作された赤血球系細胞上の刺激性分子は相乗的に働いて免疫キラー細胞を活性化する。一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞を、転移性がんを含めたがんを処置するために使用する。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびこれらの組合せを含む操作された赤血球系細胞により、ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍成長を有効に遅くし、腫瘍負荷を低減することができることは本発明の発見である。

したがって、第１の態様では、本開示は、免疫キラー細胞を刺激するように操作された除核細胞であって、少なくとも第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含み、外因性刺激性ポリペプチドが、免疫キラー細胞を刺激するのに十分である、除核細胞を提供する。一部の実施形態では、免疫キラー細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、免疫キラー細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、除核細胞は、少なくとも第１の外因性刺激性ポリペプチド、第２の外因性刺激性ポリペプチドおよび第３の外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、４−１ＢＢＬ、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、ＩＬ−１２を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、４−１ＢＢＬを含む。一部の実施形態では、ＭＩＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）およびＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、４−１ＢＢＬ、ＩＦＮα、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＰＶＲおよびＣＤ４８からなる群から選択されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２を含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２を含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ならびに４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２を含み、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１８を含み、第３の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２を含み、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１８を含み、第３の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの外因性ポリペプチドは、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比は、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである。一部の実施形態では、第１および第２の外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、第１、第２および第３の外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。本明細書の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、少なくとも１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドは、操作された除核細胞の表面に存在する。本明細書の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、少なくとも１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドは、膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含む。本明細書の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、除核細胞は、ＮＫ細胞を活性化することができる。本明細書の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、除核細胞は、ＮＫ細胞を増大させることができる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、メモリー様ＮＫ細胞である。本明細書の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、除核細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することができる。本明細書の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、除核細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。本明細書の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、除核細胞は、赤血球系細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、赤血球である。

別の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片およびインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む、操作された除核細胞を提供する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は複合体として存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２９または配列番号３７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは複合体として存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインとリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では融合ポリペプチドは、配列番号３１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、操作された除核細胞は、第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬを含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２を含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットで構成される融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、ＭＩＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）である。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドのうちの１つまたは複数は、操作された除核細胞の表面に存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、免疫キラー細胞を刺激するのに十分である。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比は、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである。一部の実施形態では、操作された除核細胞は、第２の外因性ポリペプチドおよび第３の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、２つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、２つの外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、３つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、３つの外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数は、膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含む。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、免疫細胞を刺激することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キラー免疫細胞である。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、メモリー様ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞を活性化することを含む。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞を増大させることを含む。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、赤血球系細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、赤血球である。

別の態様では、本開示は、少なくとも、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核細胞を提供する。一部の実施形態では、除核細胞は、第２の外因性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、４−１ＢＢＬ、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、ＩｇＧ、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連ポリペプチド（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドのうちの１つまたは複数は、操作された除核細胞の表面に存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、免疫キラー細胞を刺激するのに十分である。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比は、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである。一部の実施形態では、除核細胞は、第３の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、２つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、２つの外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、３つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、３つの外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数は、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含む。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された除核細胞は、免疫細胞を刺激することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キラー免疫細胞である。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、メモリー様ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞を活性化することを含む。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞を増大させることを含む。

別の態様では、本開示は、免疫キラー細胞を刺激する方法であって、免疫キラー細胞を本明細書の態様および実施形態のいずれか１つの操作された除核細胞と、免疫キラー細胞を刺激するのに有効な量で接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、免疫キラー細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、免疫キラー細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、刺激することは、ＮＫ細胞を活性化させることを含む。一部の実施形態では、刺激することは、ＮＫ細胞を増大させることを含む。一部の実施形態では、刺激することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む。一部の実施形態では、刺激することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、接触させることを、ｉｎｖｉｖｏで行う。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、接触させることを、ｅｘｖｉｖｏで行う。本明細書の態様および実施形態の一部の実施形態では、接触させることを、ｉｎｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、方法は、操作された除核細胞を、免疫キラー細胞の活性化を必要とする対象に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、がんを有する。一部の実施形態では、がんは、低ＭＨＣクラスＩ提示を特徴とする。一部の実施形態では、がんは、ＰＤ−１応答性腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは、突然変異負荷が高い腫瘍を含む。一部の実施形態では、対象は、ＭＨＣクラスＩ提示を低減する化学療法剤を用いた処置を受けている。一部の実施形態では、がんは、肺がん、肝細胞がん、黒色腫、およびリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫を含み、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を含む。一部の実施形態では、対象は、感染症を有する。一部の実施形態では、感染症は、ウイルス感染によって引き起こされる。一部の実施形態では、ウイルス感染は、低ＭＨＣクラスＩ提示を特徴とする。一部の実施形態では、ウイルス感染は、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、結核、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、およびサイトメガロウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。

別の態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、本明細書の態様および実施形態のいずれかの操作された除核細胞を、対象におけるがんを処置するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、がんは、低ＭＨＣクラスＩ提示を含む。一部の実施形態では、がんは、ＰＤ−１応答性腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは、突然変異負荷が高い腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは、肺がん、肝細胞がん、黒色腫、およびリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫を含み、リンパ腫はホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫から選択される。

別の態様では、本開示は、対象における感染症を処置する方法であって、対象に、本明細書の態様および実施形態のいずれかの操作された除核細胞を、対象における感染症を処置するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、感染症は、ウイルス感染によって引き起こされる。一部の実施形態では、ウイルス感染は、ＭＨＣＩ提示の下方制御を特徴とする。一部の実施形態では、ウイルス感染は、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、結核、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルスおよびサイトメガロウイルスから選択されるウイルスによって引き起こされる。

別の態様では、本開示は、キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された除核赤血球系細胞であって、２つまたはそれよりも多くの外因性刺激性ポリペプチドをその表面に含み、２つまたはそれよりも多くの外因性刺激性ポリペプチドが、免疫細胞を刺激するのに十分である、除核赤血球系細胞であり、それぞれが外因性刺激性ポリペプチドの１つをコードする２つまたはそれよりも多くの外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を、有核赤血球系細胞の除核および２つまたはそれよりも多くの外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、除核赤血球系細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、リンカーによって連結してＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を形成したＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、操作された除核赤血球系細胞であり、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物をコードする外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を有核赤血球系細胞の除核およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物の産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、リンカーによって連結してＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を形成したＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、第１の外因性刺激性ポリペプチドと、４−１ＢＢＬまたはその断片を含む、第２の外因性刺激性ポリペプチドとを含む操作された除核赤血球系細胞であって、ｉ．第１の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第１の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、ｉｉ．第２の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、ｉｉｉ．有核赤血球系細胞を有核赤血球系細胞の除核ならびに第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、ｉ．リンカーによって連結してＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を形成したＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと、ｉｉ．ＩＬ−１２またはその断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドとを含む操作された除核赤血球系細胞であって、ｉ．第１の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第１の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、ｉｉ．第２の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、ｉｉｉ．有核赤血球系細胞を有核赤血球系細胞の除核ならびに第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、ｉ．４−１ＢＢＬまたはその断片を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと、ｉｉ．ＩＬ−１２またはその断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドとを含む操作された除核赤血球系細胞であって、ｉ．第１の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第１の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、ｉｉ．第２の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、ｉｉｉ．有核赤血球系細胞を有核赤血球系細胞の除核ならびに第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞を提供する。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、導入するステップは、有核細胞に第１の外因性核酸と第２の外因性核酸の両方を含む単一のレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることを含む。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、導入するステップは、有核赤血球系細胞に第１の外因性核酸を含む第１のレンチウイルスベクターと第２の外因性核酸を含む第２のレンチウイルスベクターの両方をトランスフェクトすることを含む。

別の態様では、本開示は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドをその表面に含み、少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を有核赤血球系細胞の除核および少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞を提供する。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性核酸は、ＤＮＡを含む。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、外因性核酸は、ＲＮＡを含む。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、導入するステップは、ウイルスによる形質導入を含む。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、導入するステップは、電気穿孔を含む。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、導入するステップは、リポソーム媒介性移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクション、およびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、導入するステップは、外因性核酸をレンチウイルスベクターのトランスフェクションによって導入することを含む。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ベータ−グロビンプロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）プロモーター、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター、ＣＡＧＣＭＶ最初期エンハンサーおよびニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）、およびヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。

図１Ａは、ＩＬ−１５バリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現するように操作された赤血球系細胞が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共に培養し、未刺激の場合に、ＣＤ８＋細胞の総数における増加を誘導することを示すグラフである。３人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを、３００，０００個の操作された赤血球系細胞と共に培養した。操作された赤血球系細胞なしで培養したＰＢＭＣ（ＲＢＣなし）およびその表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養したＰＢＭＣを、陰性対照として使用した。組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と共に培養したＰＢＭＣを、可溶性ＩＬ−１５に対する比較として使用した。ＣＤ８＋細胞の総数を、５日目に計数した。図１Ａに示される結果は、各々２〜３人のＰＢＭＣドナー（合計で６人の試験した異なるＰＢＭＣドナー）を用いた４つの独立した実験を表している。図１Ｂは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現するように操作された赤血球系細胞が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共に培養し、抗ＣＤ３抗体（ａＣＤ３）で刺激した場合に、ＣＤ８＋細胞の総数における増加を誘導することを示すグラフである。３人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを、０．５μｇ／ｍＬのａＣＤ３プラス３００，０００個または１００，０００個の操作された赤血球系細胞と共に培養した。図１Ｂに示されるグラフ中の２本の棒は、使用した３００，０００個（左）または１００，０００個（右）の操作された赤血球系細胞を示す。操作された赤血球系細胞なしで培養したＰＢＭＣ（ＲＢＣなし）およびその表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養したＰＢＭＣを、陰性対照として使用した。組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と共に培養したＰＢＭＣを、陽性対照として使用した。ＣＤ８＋細胞の総数を、５日目に計数した。図１Ｂに示される結果は、各々２〜３人のＰＢＭＣドナー（合計で６人の試験した異なるＰＢＭＣドナー）を用いた４つの独立した実験を表している。図２Ａは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現するように操作された赤血球系細胞が、精製されたＮＫ細胞と共に培養した場合に、ＮＫ細胞を増大させることができることを示すグラフ（ｉ、ｉｉおよびｉｉｉ）のパネルである。（ｉ）１人のドナー由来の４０，０００個の精製されたＮＫ細胞を二連でプレートし、以下の用量設定で７日間培養した：操作された赤血球系細胞（９００，０００個、３００，０００個、１００，０００個）、ｒｈＩＬ−２（１０００、１００、１０Ｕ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ−１５（１０、１、０．１ｎｇ／ｍＬ）。操作された赤血球系細胞なしで培養したＮＫ細胞（ＲＢＣなし）およびその表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養したＰＢＭＣを、陰性対照として使用した。解析を、７日目に実施した。図２Ａ（ｉｉ）では、ＮＫ細胞を、９００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を使用して、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。図２Ａ（ｉｉｉ）では、ＮＫ細胞を、３００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を使用して、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。同上。同上。図２Ｂは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現するように操作された赤血球系細胞が、ＰＢＭＣと共に培養した場合に、ＮＫ細胞を増大させることができることを示すグラフ（ｉ、ｉｉおよびｉｉｉ）のパネルである。図２Ｂ（ｉ）では、２人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣ（二連でプレートした）を、９００，０００個、３００，０００個または１００，０００個の操作された赤血球系細胞と共に培養した。操作された赤血球系細胞なしで培養したＰＢＭＣ（ＲＢＣなし）およびその表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養したＰＢＭＣを、陰性対照として使用した。フローサイトメトリー解析を、生／死、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞にゲートを適用して、７日目に実施した。図２Ｂ（ｉｉ）では、ＰＢＭＣを、９００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を使用して、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。図２Ｂ（ｉｉｉ）では、ＰＢＭＣ細胞を、３００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を使用して、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。同上。同上。図３Ａは、ｅｘｖｉｖｏ実験の結果を示すグラフであり、強力なＮＫ細胞増大がｅｘｖｉｖｏで観察された。図３Ｂは、ｉｎｖｉｖｏ実験の結果を示すグラフであり、強力なリンパ球増殖が、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ組換えタンパク質とコンジュゲートさせた赤血球系細胞（ｍＲＢＣ）で処置したマウスにおいて観察された。増殖性細胞のマーカーとしてのパーセントＫｉ６７染色によって決定したＮＫ細胞増殖が示されている。図３Ｃは、ｉｎｖｉｖｏ実験の結果を示すグラフであり、強力なリンパ球活性化が、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ組換えタンパク質とコンジュゲートさせた赤血球系細胞（ｍＲＢＣ）で処置したマウスにおいて観察された。活性化された細胞のマーカーとしてのパーセントグランザイムＢ発現によって決定したＮＫ細胞活性化が示されている。図４Ａは、操作された赤血球系細胞の表面上のその天然の三量体コンフォメーションでの４−１ＢＢＬの発現が、高レベルの４−１ＢＢ受容体ならびにＮＦκＢ／Ｌｕｃを発現するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦκＢ活性化によって測定した場合に、高度に強力なＴ細胞活性化を駆動することを示すグラフである。図４Ｂは、４−１ＢＢＬを発現する操作された赤血球系細胞によるＮＦκＢの活性化が調節可能であることを示すグラフである。図５Ａは、操作された赤血球系細胞の表面上のその天然の三量体コンフォメーションでの４１ＢＢＬの発現が、初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化によって測定した場合に、高度に強力なＴ細胞活性化を駆動することを示すグラフである。図５Ｂは、操作された赤血球系細胞の表面上のその天然の三量体コンフォメーションでの４１ＢＢＬの発現が、ＥＬＩＳＡによって測定したＩＦＮγおよびＴＮＦα分泌によって測定した場合に、高度に強力なＴ細胞活性化を駆動することを示すグラフである。図６は、４−１ＢＢＬを発現する赤血球系細胞が、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフである。図７は、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方を発現する操作された赤血球系細胞が、ＣＤ３刺激ありまたはなしで、脾細胞を強力に活性化することを示すグラフである。図８は、４−１ＢＢ−Ｌ、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、または４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方の混合物を発現する２００，０００個の操作された赤血球系細胞と共に各々２００，０００個の細胞でインキュベートしたＮＫ細胞によるＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅を示すグラフである。図９は、４−１ＢＢＬを発現するように調製されたマウス赤血球系細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞およびサブセット（増殖性ＣＤ８＋メモリー細胞；ＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞、グランザイムＢ＋ＣＤ８細胞）のｉｎｖｉｖｏ増殖を示すグラフである。図１０は、４−１ＢＢＬを発現するように調製されたマウス赤血球系細胞が、抗４−１ＢＢｍＡｂ、３Ｈ３とは対照的に、マウスにおいて肝臓毒性を引き起こさないことを示すグラフである。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ；ＳＧＰＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ；ＳＧＯＴ）のレベルを測定した。図１１は、操作された赤血球系細胞の表面上のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの一緒の発現、ならびに操作された赤血球系細胞の表面上の４−１ＢＢＬ単独の発現が、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦκＢ活性化によって測定した場合に、高度に強力なＴ細胞活性化を生じたことを示すグラフである。図１２は、操作された赤血球系細胞の表面上のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの発現が、４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独を発現する操作された赤血球系細胞と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞の両方、およびこれらの細胞のサブセットを強力に増大させることを示すグラフである。図１３Ａおよび図１３Ｃは、マウスＢ１６Ｆ１０肺転移モデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを一緒に提示するように調製されたマウス赤血球系細胞の有効性を示すグラフである。図１３Ｂは、マウスＢ１６Ｆ１０肺転移モデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを一緒に提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置したマウスの肺におけるＮＫ細胞の浸潤を示すグラフである。図１３Ｄは、マウスＢ１６Ｆ１０肺転移モデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを一緒に提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置したマウスの腫瘍中の総ＮＫ細胞計数における増加を示すグラフである。図１３Ｅは、マウスＢ１６Ｆ１０肺転移モデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを一緒に提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置したマウスの腫瘍中の成熟ＮＫ細胞計数における増加を示すグラフである。図１３Ｆは、マウスＢ１６Ｆ１０肺転移モデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを一緒に提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置したマウスの腫瘍中の機能的ＮＫ細胞計数における増加を示すグラフである。図１４は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を発現する、４−１ＢＢＬを発現するまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを共発現する（「ｃｏ」）赤血球系細胞による長期プライミング（８日）後のＰＢＭＣの表現型解析を示すグラフのパネルである。マーカーＫｉ６７、グランザイムＢ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ６９、ＮＫｐ４４および４１ＢＢを表現型読み出しとして使用して、増強されたＮＫ細胞の生存、増大および活性化を示した。図１５は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現する（「ＩＬ−１５ＴＰ」）またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを共発現する（「ＩＬ−１５ＴＰ＋４１ＢＢＬ」）赤血球系細胞で８日間プライミングしたＮＫ細胞が、Ｋ５６２標的に対する増強された細胞傷害性を有することを示すグラフである。Ｋ５６２細胞のパーセント死滅が示されている。図１６は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現する（「ＩＬ−１５ｖ４」）またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを共発現する（「Ｃｏ」）赤血球系細胞で一晩プライミングしたＮＫ細胞が、ＲａｊｉヒトＢリンパ球標的細胞に対する増強されたＡＤＣＣ死滅を有することを示すグラフである。Ｒａｊｉ細胞のパーセント特異的死滅が示されている。図１７Ａは、ＣＴ２６結腸がんマウスモデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを一緒に提示するように調製されたマウス赤血球系細胞の有効性を示すグラフである。図１７Ｂは、ＣＴ２６結腸がんマウスモデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを一緒に提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置したマウスの腫瘍中への増殖性（左）および機能的（右）細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞の浸潤を示す２つのグラフのパネルである。図１８Ａ〜図１８Ｅは、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、抗４−１ＢＢｍＡｂ、３Ｈ３とは対照的に、マウスにおいて肝臓毒性を引き起こさないことを示すグラフのパネルである。血清中の肝臓酵素アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ／ＳＧＰＴ）（図１８Ａ）、肝臓マクロファージ（図１８Ｂ）、肝臓ＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＲＧ１＋細胞（図１８Ｃ）および肝臓浸潤性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）（図１８Ｄ）のレベルを測定した。肝臓染色および炎症スコアもまた決定した（図１８Ｅ）。図１８Ｆは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、可溶性ＩＬ−１５とは対照的に、マウスにおいて肝臓毒性を引き起こさないことを示すグラフのパネルである。同上。同上。図１９は、操作された赤血球系細胞の表面上のＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの発現が、ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、ＩＮＦｇ分泌を相乗的に誘導し（図１９Ａ）、ＣＤ８（図１９Ｂ）、ＣＤ４（図１９Ｃ）、ＮＫ（図１９Ｄ）およびＮＫＴ（図１９Ｅ）細胞の増殖を介して高度に強力な免疫応答を駆動することを示すグラフのパネルである。図２０Ａは、クリック方法論を使用して、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬとコンジュゲートさせた、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方、ならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方と共コンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞のパーセンテージを示すグラフである。これらの細胞を、Ｃｙ５蛍光についてのフローサイトメトリーによって定量化した。図２０Ｂは、マウスＢ１６Ｆ１０肺転移モデルにおける、赤血球系細胞の表面上にＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびそれらの組合せを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞の有効性を示すグラフである。図２０Ｃは、肺転移の数における減少が、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびそれらの組合せを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置したマウスにおける、肺における増加した増殖性および細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞およびＮＫ細胞の浸潤と関連したことを示すグラフのパネルである。図２１は、ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞が、ＭＣ３８（図２１Ａ）およびＢ１６Ｆ１０（図２１Ｂ）マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフのパネルである。図２２は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ならびにＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）とは対照的に、マウスにおいて肝臓毒性を引き起こさないことを示すグラフのパネルである。血清中の肝臓酵素アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）（図２２Ａ）、血清中のインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）（図２２Ｂ）、肝臓重量（図２２Ｃ）および脾臓重量（図２２Ｄ）のレベルを測定した。図２３Ａは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２を提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフである。図２３Ｂは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡまたは組合せを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフである。図２３Ｃは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフである。図２３Ｄは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２を提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて、処置されたマウスの生存を改善したことを示すグラフである。図２３Ｅは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて、処置されたマウスの生存を改善したことを示すグラフである。図２３Ｆは、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５＋ａ−ＰＤ１で処置した腫瘍群におけるＣＤ８Ｔ細胞の増加した浸潤、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡｍＲＢＣ群におけるＮＫ細胞の増加した浸潤、およびＩＬ−１２含有群における、Ｍ１表現型、即ち、古典的に活性化されたマクロファージの抗腫瘍表現型に向かうマクロファージの増加した極性化を示すグラフである。図２４Ａは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを提示するように調製された１ｅ９のマウス赤血球系細胞による処置が、ＭＣ３８マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフである。図２４Ｂは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを提示するように調製された３ｅ８のマウス赤血球系細胞による処置が、ＭＣ３８マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフである。図２４Ｃは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、ＭＣ３８マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示すグラフである。データは、研究において使用した個々のマウスについて示されている。図２４Ｄは、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、ＭＣ３８マウスモデルにおいて腫瘍縮小を誘導することを示すグラフである。データは、研究において使用した個々のマウスについて示されている。図２５Ａは、ＭＣ３８マウスモデルにおける、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置した腫瘍における、ＣＤ４、ＣＤ８Ｔ細胞の増加した浸潤、および古典的に活性化されたマクロファージ（Ｍ１表現型）への増加した極性化を示すグラフである。図２５Ｂは、ＭＣ３８マウスモデルにおける、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置した腫瘍における、ＣＤ４Ｔ細胞よりもＣＤ８へ向かうシフト、および調節性Ｔ細胞の喪失を示すグラフである。図２６Ａ〜図２６Ｄは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、またはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）とは対照的に、マウスにおいて毒性を引き起こさないことを示すグラフのパネルである。体重（図２６Ａ）、肝臓重量（図２６Ｂ）、脾臓重量（図２６Ｃ）、ＷＢＣ数およびヘモグロビンのレベル（図２６Ｄ）における変化を測定した。同上。図２６Ｅ〜図２６Ｆは、ＩＬ−１２を提示するようにコンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞が、組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）とは対照的に、マウスにおいて毒性を引き起こさないことを示すグラフのパネルである。体重（図２６Ｅ）、肝臓重量、脾臓重量、ＷＢＣ、ＲＢＣ数およびヘモグロビンのレベル、ＡＬＴおよびＩＦＮｇ（図２６Ｆ）における変化を測定した。同上。図２７は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、またはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）とは対照的に、マウスにおいて毒性を引き起こさないことを示すグラフのパネルである。酵素ＩＦＮｇ（図２７Ａ）、ＴＮＦａ（図２７Ｂ）のレベルにおける変化を測定し、肝臓酵素ＡＬＴのレベルと比較した。図２８は、Ｋ５６２標的に対する増強された死滅（図２８Ａ）、およびＲａｊｉ細胞標的の増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）死滅（図２８Ｂ）により、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬまたはそれらの組合せを発現するように遺伝子操作されたヒト赤血球系細胞が、ＮＫ細胞の細胞傷害性を誘導することを示すグラフのパネルである。同上。図２９Ａは、抗ＣＤ３と組み合わせた、ＩＬ−１２を含む操作されたヒト除核赤血球系細胞が、ＰＢＭＣからの有意な量のＩＦＮｇ産生を誘導し、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬが最も高いレベルのＩＦＮｇを誘導することを示すグラフである。図２９Ｂは、抗ＣＤ３なしの、ＩＬ−１２を含む操作されたヒト除核赤血球系細胞が、ＰＢＭＣからのＩＦＮｇ産生を誘導したことを示すグラフである。図２９Ｃは、抗ＣＤ３と組み合わせた、４１ＢＢＬ、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ／４−１ＢＢＬを発現する操作されたヒト赤血球系細胞が、ＣＤ４細胞の増殖を誘導したことを示すグラフである。図２９Ｄは、抗ＣＤ３と組み合わせた、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ／４−１ＢＢＬを発現する操作されたヒト赤血球系細胞が、ＣＤ８細胞増殖を中程度に増強したことを示すグラフである。図２９Ｅは、抗ＣＤ３と組み合わせた、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ／４−１ＢＢＬを発現する操作されたヒト赤血球系細胞が、有意なＮＫＴ細胞増殖を誘導したことを示すグラフである。図２９Ｆは、抗ＣＤ３なしの、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現する操作されたヒト赤血球系細胞が、限定的なＣＤ４細胞増殖を誘導したことを示すグラフである。図２９Ｇは、抗ＣＤ３なしの、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ／４−１ＢＢＬを発現する操作されたヒト赤血球系細胞が、ＣＤ８細胞増殖を中程度に増強したことを示すグラフである。図２９Ｈは、抗ＣＤ３なしの、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現する操作されたヒト赤血球系細胞が、ＮＫ細胞の分裂を増強したが、細胞計数は増加させなかったことを示すグラフであり、これは、ＮＫ細胞の適度な増殖のみを示している。ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／４−１ＢＢＬは、大規模なＮＫ細胞増殖を誘導し、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬによる大きく増加した細胞数をもたらし、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ／４−１ＢＢＬの影響を上回った。図２９Ｉは、抗ＣＤ３なしの、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ／４−１ＢＢＬを発現する操作されたヒト赤血球系細胞が、ＮＫＴ細胞に対する中程度の増殖効果を誘導したことを示すグラフである。図２９Ｊは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬを発現する、またはＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ／４−１ＢＢＬを共発現するＲＢＣが、ヒトナイーブＣＤ４細胞のＴｈ１分化を駆動できることを示すグラフである。図３０Ａは、ＩＬ−１２Ｖ２（ＳＭＩＭ１に連結されたＩＬ−１２）が、単独でまたは４−１ＢＢＬと組み合わせたＩＬ−１２Ｖ１（ＧＰＡに連結されたＩＬ−１２）と比較して、細胞表面に有意により高いＩＬ−１２を示すことが観察されたことを示すグラフである。図３０Ｂは、ＳＭＩＭ１を膜ドメインとして使用する場合に、細胞表面上のＩＬ−１２の増加したレベルが、ＮＦκＢシグナル伝達の増強された活性を提供することを示すグラフである。

本開示は、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化および／または増大させるのに十分な刺激性サイトカインなどの１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを赤血球系細胞の細胞表面に発現させることにより、免疫キラー細胞を刺激する（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増大、活性化および／または細胞傷害活性を刺激する）ように操作された赤血球系細胞の開発に基づく。一部の実施形態では、本発明は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＮＫ細胞の強力な活性化を駆動すること、ならびにＮＫ細胞の細胞傷害性を誘導することが見いだされている、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬ、またはこれらの組合せ、例えば、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む操作された赤血球系細胞を提供する。本開示の実施形態によると、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である、または除核細胞である。本明細書に提示される操作された赤血球系細胞は、天然に免疫特権を有し、ｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞）の刺激を直接媒介し、したがって、免疫キラー細胞の養子細胞移入に付随する不都合が回避されるという、現行の免疫キラー細胞標的化技術よりも有意な利点をもたらす。操作された赤血球系細胞は、いくつかの異なる刺激性分子、例えば、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを単一の除核細胞において有意に多い数で提示する、例えば、細胞表面に含むことができる、ならびに刺激性シグナルを赤血球系細胞を介して循環系中を直接、長い循環半減期で送達し、維持し、したがって、免疫キラー細胞を刺激するためのより安全かつより有効な方法がもたらされるという追加的な利点をもたらす。

前述の説明および付随する図に示されている教示の利益を受けるこれらの発明が関係する技術分野の当業者は本明細書に記載の本発明の多くの改変および他の実施形態を容易に思い浮かべるであろう。したがって、本発明は開示されている特定の実施形態に限定されるべきでないこと、および改変および他の実施形態は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されていることが理解されるべきである。本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは、単に一般的かつ記述的な意味で使用されており、限定する目的で使用されているのではない。

定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その内容からそうでないことが明らかでない限り、複数の参照対象を含む。

選択（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組合せを意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量、持続時間などの測定可能な値について言及する場合、指定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、なおより好ましくは±１％、およびさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含し、したがって、そのような変動は開示されている方法の実施に適することを意味する。

本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲はいずれも、記載されている範囲内に入るあらゆる整数値、および適切な場合にはその分率（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むものと理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であるものとし、包括的またはオープンエンドの用語であり、後に続くもの、例えば構成成分の存在を明示し、また、追加的な記載されていない、当技術分野で公知であるまたは本明細書に開示されている構成成分、特色、要素、メンバー、ステップの存在を排除したり妨げたりするものではない。

本明細書で使用される場合、「などの（ｓｕｃｈａｓ）」、「例えば（ｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ）」などの用語は、例示的な実施形態を指し、本開示の範囲を限定するものではない。

別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書には好ましい材料および方法が記載されているが、本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の試験の実施に使用することができる。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化すること」または「ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化」という用語は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の１つまたは複数の細胞応答を引き起こすまたはもたらすプロセス（例えば、シグナル伝達事象）を指す。本明細書で使用される場合、「活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞」とは、活性化シグナルを受け取っており、したがって、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される１つまたは複数の細胞応答を示すＣＤ８＋Ｔ細胞を指す。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは当技術分野で公知であり、また、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させること」または「ＣＤ８＋Ｔ細胞増大」という用語は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が一連の細胞分裂を受け、それにより、細胞数が増大するプロセスを指す。「増大したＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増大によって得られたＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。Ｔ細胞増大を測定するための適切なアッセイは当技術分野で公知であり、また、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞を活性化すること」または「ＮＫ細胞活性化」という用語は、ＭＨＣクラスＩ発現の欠損を有する細胞を死滅させることができるＮＫ細胞を引き起こすまたはもたらすプロセス（例えば、シグナル伝達事象）を指す。本明細書で使用される場合、「活性化されたＮＫ細胞」とは、活性化シグナルを受け取っており、したがって、ＭＨＣクラスＩ発現の欠損を有する細胞を死滅させることができるＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは当技術分野で公知であり、また、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞を増大させること」または「ＮＫ細胞増大」という用語は、ＮＫ細胞が一連の細胞分裂を受け、それにより、細胞数が増大するプロセスを指す。「増大したＮＫ細胞」という用語は、ＮＫ細胞増大によって得られたＮＫ細胞に関する。ＮＫ細胞増大を測定するための適切なアッセイは当技術分野で公知であり、また、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される場合、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」およびその変形は、組成物または作用剤を対象に導入することを指し、組成物または作用剤の同時導入および逐次的導入を含む。「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、例えば、治療的、薬物動態、診断的、研究、プラセボ、および実験的方法を指し得る。「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｅｘｖｉｖｏにおける処置も包含する。組成物または作用剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸、リンパ内、または局部を含めた任意の適切な経路によるものである。投与は、自己投与および他者による投与を含む。投与は、任意の適切な経路によって行うことができる。適切な投与経路により、組成物または作用剤が意図された機能を果たすことが可能になる。例えば、適切な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または作用剤を対象の静脈内に導入することによって投与される。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用され、これだけに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および、所望の抗原結合活性を示す限りは抗体断片を含めた種々の抗体構造を包含する。

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、異常な細胞が制御されずに分裂する疾患を指す。一部の実施形態では、がんは、他の組織に浸潤することができる。１００種を超える異なる型のがんが存在する。大多数のがんの名称はそれらの出発器官または細胞型に由来する−例えば、結腸において始まるがんは結腸がんと称される；皮膚のメラニン細胞において始まるがんは黒色腫と称される。がんの型は、より広範なカテゴリーに群分けすることができる。がんの主要なカテゴリーとしては、癌腫（腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、および移行上皮癌を含めた、内臓を裏打ちするまたは覆う皮膚または組織において始まるがんおよびそのサブタイプを意味する）；肉腫（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合もしくは支持組織において始まるがんを意味する）；白血病（血液形成組織（例えば、骨髄）において出発し、多数の異常な血液細胞の産生および血液中への侵入を引き起こすがんを意味する；リンパ腫および骨髄腫（免疫系の細胞において始まるがんを意味する）；ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）がん（脳および脊髄の組織において始まるがんを意味する）が挙げられる。「骨髄異形成症候群」という用語は、骨髄が十分健康な血液細胞（白血球、赤血球、および血小板）を作らず、血液および／または骨髄中に異常な細胞が存在する、がんの一種を指す。骨髄異形成症候群は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）になる恐れがある。ある特定の実施形態では、がんは、これだけに限定されないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん、骨に広がったがん、脳に広がったがん、肝臓に広がったがん、肺に広がったがん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮体がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん、妊娠性絨毛腫瘍（ＧＴＴ）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎がん、喉頭がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、皮膚がん、中皮腫、男性のがん、奇胎妊娠、口および中咽頭がん、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、前立腺がん、稀ながん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん、子宮がん、膣がん、および外陰がんを含めたがんから選択される。

本明細書で使用される場合、「クリック反応」という用語は、連結生成物の都合のよい生成のために第１の部分と第２の部分を共有結合により連結するために使用される様々な反応を指す。クリック反応は、一般には、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：高速である、特異的である、高収率である、効率的である、自発性である、連結される実体の生体適合性を著しく変更するものではない、反応速度が高い、安定な生成物を生成する、単一の反応生成物の生成に有利である、アトムエコノミーが高い、化学選択的である、モジュラーである、立体選択的である、酸素に対して非感受性である、水に対して非感受性である、純度が高い、クロマトグラフィーによらない方法（例えば、結晶化または蒸留）によって除去することができる無害または比較的無毒性の副産物しか生じない、溶媒を必要としないまたは環境にやさしいもしくは生理的に適合性の溶媒中、例えば、水中、安定な生理的条件下で実施することができる。例としては、アルキン／アジド反応、ジエン／求ジエン体反応、またはチオール／アルケン反応が挙げられる。他の反応を使用することができる。一部の実施形態では、クリック反応は高速であり、特異的であり、かつ高収率である。

本明細書で使用される場合、「クリックハンドル」という用語は、クリック反応で第２のクリックハンドルと反応して、クリックシグネチャーを生じさせることができる化学的部分を指す。複数の実施形態では、クリックハンドルはカップリング試薬に含まれ、カップリング試薬は基質反応性部分をさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、他の細胞に対する種々の効果を有する、細胞によって分泌される小さな可溶性タンパク質物質を指す。サイトカインは、成長、発達、創傷治癒、および免疫応答を含めた多くの重要な生理機能を媒介する。サイトカインは、細胞膜に位置するそれらの細胞特異的受容体に結合することによって作用し、それにより、細胞における別個のシグナルトランスダクションカスケードの開始が可能になり、それにより、標的細胞における生化学的変化および表現型の変化が最終的に導かれる。サイトカインは、局所的に、および放出部位から遠位のどちらでも作用し得る。サイトカインとしては、インターロイキンの多く、ならびにいくつかの造血成長因子を包含するＩ型サイトカイン；インターフェロンおよびインターロイキン−１０を含むＩＩ型サイトカイン；ＴＮＦαおよびリンホトキシンを含む腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）関連分子；インターロイキン１（「ＩＬ−１」）を含む免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー；ならびに、多種多様な免疫および炎症機能において重大な役割を果たす分子のファミリーであるケモカインが挙げられる。細胞の状態に応じて同じサイトカインが細胞に対して異なる効果を有する場合がある。サイトカインは、多くの場合、他のサイトカインの発現を調節し、カスケードを誘発する。サイトカインの非限定的な例としては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３Ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−β、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇｒｏα、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−αが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、ネイティブな形態の化合物（例えば、小分子）またはプロセスを指すものとする。例えば、一部の実施形態では、「内因性」という用語は、生物体内または生物体のゲノム内のその天然の位置にあるネイティブな形態の核酸またはポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「操作された細胞」という用語は、遺伝子改変された細胞またはその後代を指すものとする。一部の実施形態では、操作された細胞（例えば、操作された除核細胞）は、外因性ポリペプチドを細胞の表面に連結する（例えば、クリックケミストリーを使用して）ためのカップリング試薬を使用して作製することができる。

本明細書で使用される場合、「除核」という用語は、核を欠く細胞、例えば、網状赤血球または成熟赤血球（赤血球）を指す。ある実施形態では、除核細胞は、前駆細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、骨髄系共通始原細胞（ＣＭＰ）、巨核球・赤血球始原細胞（ＭＥＰ）、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、後期赤芽球系前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、前赤芽球、初期好塩基性赤芽球、後期好塩基性赤芽球、多染赤芽球、もしくは正染性赤芽球、または人工多能性細胞から、網状赤血球または成熟赤血球への分化を通じて核を失った細胞である。ある実施形態では、除核細胞は、前駆細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、骨髄系共通始原細胞（ＣＭＰ）、巨核球・赤血球始原細胞（ＭＥＰ）、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、後期赤芽球系前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、前赤芽球、初期好塩基性赤芽球、後期好塩基性赤芽球、多染赤芽球、もしくは正染性赤芽球、または人工多能性細胞から網状赤血球または成熟赤血球へのｉｎｖｉｔｒｏ分化を通じて核を失った細胞である。ある実施形態では、除核細胞は、ＤＮＡを欠く。ある実施形態では、除核細胞は、ポリペプチドを発現することができない、例えば、ＤＮＡを転写し、かつ／またはタンパク質に翻訳することができない、例えば、ＤＮＡを転写し、かつ／またはタンパク質に翻訳するために必要な細胞機構を欠く。一部の実施形態では、除核細胞は、赤血球、網状赤血球、または血小板である。

一部の実施形態では、除核細胞は血小板ではなく、したがって、「血小板を含まない除核」細胞（「ＰＦＥ」細胞）である。血小板は核を有さず、この特定の実施形態では、血小板は包含されないことが意図されていることが理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「赤血球系細胞」は、有核赤血球、赤血球前駆細胞（red blood cell precursor）、除核成熟赤血球、および網状赤血球を含む。本明細書で使用される場合、赤血球系細胞は、赤血球系前駆細胞、網状赤血球または赤血球に分化することができる細胞を含み得る。例えば、赤血球系前駆細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、骨髄系共通始原（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー形成細胞、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球・赤血球系始原（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、網状赤血球、赤血球、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球のいずれかを含む。赤血球系細胞の調製物は、これらの細胞またはこれらの組合せのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、赤血球系前駆細胞は、不死細胞または不死化細胞である。例えば、不死化赤芽球細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現し、ＴＰ５３を抑制するようにレトロウイルスによる形質導入を行うことによって生成することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるHuang et al., (2014) Mol. Ther. 22 (2): 451-63に記載されている通り）。さらに、細胞は、自己使用が意図されたものまたは同種異系輸血用の供給源を提供するものであり得る。一部の実施形態では、赤血球系細胞は培養される。ある実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球である。

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、核酸に関して使用される場合、導入遺伝子および組換え核酸を含む。

本明細書で使用される場合、「外因性核酸」という用語は、細胞のネイティブなものではないが、細胞または細胞の前駆体に導入された核酸（例えば、遺伝子）を指す。外因性核酸は、細胞のネイティブな内因性核酸と相同であるまたは同一である領域またはオープンリーディングフレーム（例えば、遺伝子）を含み得る。一部の実施形態では、外因性核酸は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、外因性核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、外因性核酸は、細胞のゲノムに組み込まれている。一部の実施形態では、外因性核酸は、外因性ポリペプチドを産生するための細胞機構によって産生される。一部の実施形態では、外因性核酸は、外因性核酸が導入された細胞またはその細胞の後代である細胞によって保持されない。

本明細書で使用される場合、「外因性ポリペプチド」という用語は、その型の野生型細胞によって産生されないまたは野生型細胞では外因性ポリペプチドを含有する細胞よりも低いレベルで存在するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞内もしくは細胞上に導入された、または外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸を細胞もしくは細胞の前駆体に導入することによって細胞により発現されるようにさせたポリペプチドを指す。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞または細胞の前駆体に導入された外因性核酸によってコードされるポリペプチドであり、当該核酸は、必要に応じて、細胞によって保持されない。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞の表面に化学的または酵素的手段によってコンジュゲートしたポリペプチドである。

本明細書で使用される場合、「外因性刺激性ポリペプチド」という用語は、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞）などの免疫細胞上の同類ポリペプチド（例えば、受容体）に特異的に結合し、それにより、例えば免疫細胞の増殖、活性化、増大などの免疫細胞の刺激を媒介するシグナルをもたらす、操作された赤血球系細胞に含まれる（例えば、細胞内にまたは細胞表面に）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドは、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞を刺激するのに十分である。例示的な外因性刺激性ポリペプチドを、以下により詳細に記載する。

本明細書で使用される場合、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」または「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、転写および翻訳を含めた、ポリペプチドを生じさせるためのプロセスを指す。発現は、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、遺伝子の転写を増大させること（例えば、遺伝子を構成的プロモーターの制御下に置くことによってなど）、遺伝子の翻訳を増大させること、競合遺伝子をノックアウトすること、またはこれらおよび／もしくは他の手法の組合せを含めたいくつかの手法によって増大させることができる。

本明細書で使用される場合、「第１の」、「第２の」および「第３の」などという用語は、外因性刺激性ポリペプチドに関しては、１つよりも多くの型の外因性刺激性ポリペプチドが存在する場合に区別するために便宜上使用される。これらの用語の使用は、明確にそのように規定されていなければ、外因性刺激性ポリペプチドの特定の順序または方向を付与するものではない。

本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、少なくとも６つの（連続した）核酸または少なくとも４つの（連続した）アミノ酸の配列を指し、これは、核酸の場合では特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに、またはアミノ酸の場合ではエピトープの特異的認識を可能にするのに十分な長さであり、最大で全長配列未満の一部である。断片は、選択された核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分に由来してもよい。

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、所与のＲＮＡまたはタンパク質の発現に関連する核酸の任意のセグメントを指すために広範に使用される。したがって、遺伝子は、発現されるＲＮＡ（一般にはポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域、および多くの場合、それらの発現に必要な調節配列を含む。遺伝子は、目的の供給源からのクローニングまたは既知のもしくは予測される配列情報からの合成を含め、種々の供給源から得ることができ、特定の所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。

本明細書で使用される場合、「ＩＬ−１５ＲＡの細胞外部分」という用語は、ＩＬ−１５ＲＡの膜貫通ドメインのアミノ末端側にあり、細胞の外表面に見いだされる、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの部分を指す。ＩＬ−１５ＲＡの細胞外部分は、ＩＬ−１５ＲＡシグナルペプチドを含み得る。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡの細胞外部分は、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列からなる。

本明細書で使用される場合、「ＩＬ−１５ＲＡのｓｕｓｈｉドメイン」という用語は、システイン残基を４つ含む、成熟ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドのアミノ末端のおよそ６０アミノ酸残基の領域を指す。第１のシステイン残基と第３のシステインがジスルフィド結合を形成しており、第２のシステインと第４のシステインがジスルフィド架橋を形成している。ＩＬ−１５ＲＡのｓｕｓｈｉドメインは、ＩＬ−１５の結合に関与する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡのｓｕｓｈｉドメインは、配列番号９のアミノ酸配列からなる。

本明細書で使用される場合、「低ＭＨＣＩ提示」という用語は、細胞（例えば、腫瘍細胞）表面上のＭＨＣＩ分子のレベルが低下していること（例えば、発現の下方制御による）を指す。

本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。核酸分子は、組換え型であってよく、核酸を細胞に導入すれば外因性ポリペプチドを発現させることができる染色体ＤＮＡおよび自己複製性プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む。

以下の用語は、本明細書では、２つまたはそれよりも多くの核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を記載するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウインドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、および（ｅ）「実質的な同一性」。（ａ）「参照配列」という用語は、配列比較のための基礎として使用される配列を指す。参照配列は、指定の配列のサブセットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列。（ｂ）「比較ウインドウ」という用語は、ポリヌクレオチド配列の連続した指定のセグメントを指し、このポリヌクレオチド配列を参照配列と比較することができ、２つの配列を最適にアラインメントするために、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般に、比較ウインドウは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの長さであり、必要に応じて、少なくとも３０個の連続したヌクレオチドの長さ、少なくとも４０個の連続したヌクレオチドの長さ、少なくとも５０個の連続したヌクレオチドの長さ、少なくとも１００個の連続したヌクレオチドの長さ、またはより長いものであり得る。ポリヌクレオチド配列内にギャップを含めることに起因して参照配列との類似性が高くなることを回避するために、一般にはギャップペナルティ（gap penalty）を導入し、マッチの数から差し引くことが当業者には理解される。比較のために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1988)の類似性方法の検索によって；これだけに限定されないが、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／ＧｅｎｅｐｒｏｇｒａｍのＣＬＵＳＴＡＬ；ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含めた、これらのアルゴリズムのコンピュータ化インプリメンテーションによって行うことができる；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988)；Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989)；Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988)；Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8: 155-65 (1992)、およびPearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24: 307-331 (1994)により十分に記載されている。データベース類似性検索のために使用することができるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムとしては、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列に関するＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列に関するＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリ配列に関するＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリ配列に関するＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列に関するＴＢＬＡＳＴＸが挙げられる。Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)を参照されたい。別段の指定のない限り、本明細書に提示される配列同一性／類似性値は、プログラムのＢＬＡＳＴ２．０一式を使用し、デフォルトパラメーターを使用して得られた値を指す。Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、例えば、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした場合に、いくつかの正の値をとる閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たすクエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコア配列対（high scoring sequence pair）（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と称される（Altschul et al., 上記）。これらの最初の近傍ワードヒット（neighborhood word hit）は、それらを含有するより長いＨＳＰを見いだすための検索を開始するためのシードとしての機能を果たす。次いで、ワードヒット（word hit）を、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列に関してはパラメーターＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア（reward score）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア（penalty score）；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを算出するためにスコアリング行列を使用する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ減少した時；１つまたは複数の負スコア残基（negative-scoring residue）アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロまたはそれ未満になった時；またはいずれかの配列の末端に達した時に、各方向へのワードヒット（word hit）の伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸにより、アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）では、デフォルトとしてワード長（word lenght）（Ｗ）１１、期待値（expectation）（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムでデフォルトとしてワード長（word lenght）（Ｗ）３、期待値（expectation）（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、パーセント配列同一性を算出することに加えて、２つの配列間の類似性の統計解析も実施する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってもたらされる類似性の１つの評価基準は最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に生じる確率の指標をもたらす。ＢＬＡＳＴ検索では、タンパク質をランダムな配列としてモデリングすることができると仮定する。しかし、多くの実際のタンパク質は、ホモポリマー路、短期間リピート、または１つもしくは複数のアミノ酸に富む領域であり得るランダムでない配列の領域を含む。そのような低複雑度の領域は、タンパク質の他の領域が完全に異なるにもかかわらず、関連しないタンパク質とアラインメントされる可能性がある。いくつかの低複雑度フィルタープログラムを使用して、そのような低複雑度アラインメントを減少させることができる。例えば、ＳＥＧ（Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17: 149-163 (1993)）およびＸＮＵ（Claverie and States, Comput. Chem., 17: 191-201 (1993)）低複雑度フィルターを単独でまたは組み合わせて使用することができる。（ｃ）「配列同一性」または「同一性」という用語は、２つの核酸またはポリペプチド配列に関しては、本明細書では、指定の比較ウインドウにわたって最大の対応でアラインメントした場合に同じである２つの配列内の残基を指すために使用される。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なる、すなわち、アミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能的性質は変化しないことが認識される。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性を上向きに調整して、置換の保存性を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言える。この調整を行うための手段は当業者に周知である。一般には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、配列同一性のパーセンテージを上昇させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１というスコアが与えられ、非保存的置換にゼロというスコアが与えられる場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）で実行されるMeyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988)のアルゴリズムに従って算出される。（ｄ）本明細書で使用される「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較ウインドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、ここで、２つの配列を最適にアラインメントするために、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。（ｅ）ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、記載されているアラインメントプログラムのうちの１つを使用し、標準のパラメーターを使用して参照配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性および少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。コドンの縮退、アミノ酸の類似性、読み枠の位置決めなどを考慮に入れることにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するためにこれらの値を適切に調整することができることが当業者には認識されよう。これらの目的に関するアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を意味する。ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いとハイブリダイズするかどうかである。しかし、ストリンジェントな条件下で互いとハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号に許容される最大のコドンの縮退を使用して創出された場合に起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指標は、第１の核酸がコードするポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。コドンの縮退を考慮に入れることを含め、遺伝暗号を参照することにより、このタンパク質のヌクレオチド配列に突然変異を行うこともできる。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水または水／油などのエマルション、および種々の型の湿潤剤などの標準の医薬担体のいずれかを含む。この用語は、ヒトを含めた動物での使用に関して米国連邦政府の規制当局によって認可されているまたは米国薬局方に列挙されている作用剤のいずれか、ならびに対象に対して有意な刺激を引き起こさず、投与される作用剤の生物活性および性質を抑止しない任意の担体または希釈剤も包含する。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーにあてはまる。天然に存在するアミノ酸のそのような類似体に必須の本質は、タンパク質に組み入れられた場合に、そのタンパク質が同じタンパク質であるが天然に存在するアミノ酸から完全になるタンパク質によって引き出された抗体に対して特異的に反応性であることである。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、これだけに限定されないが、グリコシル化、脂質の付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰ−リボシル化を含めた修飾も含む。周知であり、上記の通り、ポリペプチドは完全に直鎖状でない場合があることが理解されよう。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝であり得、また、一般に、天然のプロセシング事象および天然には生じないヒトによる操作によってもたらされる事象を含めた翻訳後事象の結果として分枝を伴うまたは伴わない環状であり得る。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセスによって合成することができ、完全合成方法によって合成することもできる。一部の実施形態によると、ペプチドは、任意の長さまたはサイズである。

本明細書で使用される場合、本明細書において「組換え」と称されるポリペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使用してベクターにクローニングすることなどの人工的組換えの方法に依拠する手順によって生成されたものを含めた、組換えＤＮＡの方法体系によって作製されたポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞を刺激する」または「免疫細胞を刺激すること」という用語は、免疫細胞、例えば、キラー免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性化および／または増大などの細胞応答を引き起こすまたはもたらすプロセス（例えば、シグナル伝達事象または刺激を伴う）を指す。一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を刺激することとは、免疫細胞の活性化および／または増大をもたらす刺激またはシグナルをもたらすこと（例えば、ポリペプチドを刺激すること）を指す。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞を刺激するのに十分」という用語は、免疫細胞の細胞応答を促進するシグナル伝達事象または刺激、例えば、外因性刺激性ポリペプチドの量またはレベルを指す。

本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、診断、処置、または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト治療および動物への適用のどちらにも適用可能である。一部の実施形態では、対象は哺乳動物であり、特定の実施形態では、対象はヒトである。

本明細書で使用される場合、「必要とする対象」という句は、文脈および句の使用によりそうでないことが示されている場合を除き、（ｉ）記載の発明に従って、操作された赤血球系細胞（または操作された赤血球系細胞を含む医薬組成物）がこれから投与される、（ｉｉ）記載の発明に従って、操作された赤血球系細胞（または操作された赤血球系細胞を含む医薬組成物）を受けている；または（ｉｉｉ）記載の発明に従って、操作された赤血球系細胞（または操作された赤血球系細胞を含む医薬組成物）を受けた対象を指す。

本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少させる」、「干渉する」、「阻害する」および／または「低減する」という用語（および同様の用語）は、一般に、天然の条件、予測される条件、もしくは平均条件と比べて、または対照条件と比べて、直接または間接的に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を低減する作用を指す。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞を抑制すること」または「免疫細胞を阻害すること」という用語は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される、免疫細胞の１つもしくは複数の細胞応答もしくは活性の阻害もしくは抑制を引き起こすもしくはもたらす、または免疫細胞のアネルギー化もしくは免疫細胞のアポトーシスの誘導をもたらすプロセス（例えば、シグナル伝達事象）を指す。免疫細胞の阻害または抑制を測定するための適切なアッセイは当技術分野で公知であり、また、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される場合、活性薬剤（例えば、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞）の「治療量」、「治療有効量」、「有効量」、または「薬学的有効量」という用語は、意図された処置の利益をもたらすのに十分である量を指すために互換的に使用される。しかし、投与量のレベルは、傷害の型、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の活性薬剤を含めた種々の因子に基づく。したがって、投与量レジメンは広範に変動し得るが、医師が標準の方法を使用して常套的に決定することができる。さらに、「治療量」、「治療有効量」および「薬学的有効量」という用語は、記載の発明の組成物の予防または防止量を含む。記載の発明の予防または防止的適用では、医薬組成物または医薬を、疾患、障害または状態にかかりやすいまたは他の点でそのリスクがある患者に、疾患、障害または状態の生化学的、組織学的および／または行動症状、その合併症、ならびに疾患、障害または状態の発生の間に示される中間の病理学的表現型を含めた疾患、障害または状態のリスクを排除もしくは低減する、重症度を低下させる、または発症を遅延させるのに十分な量で投与する。一般に、最大用量、すなわち、ある医学的判断に従って最も高い安全用量が使用されることが好ましい。「用量」および「投与量」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、その結果が望ましく、有益であると判断をされる処置の成り行きを指す。治療効果は、直接または間接的に、疾患の顕在化を静止すること、低減すること、または排除することを含み得る。治療効果は、直接または間接的に、疾患顕在化の進行を静止すること、低減すること、または排除することも含み得る。

本明細書に記載の任意の治療剤に関して、治療有効量を予備的なｉｎｖｉｔｒｏ試験および／または動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量をヒトデータから決定することもできる。適用される用量を、投与される作用剤の相対的な生物学的利用能および効力に基づいて調整することができる。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大の有効性を実現するために用量を調整することは当業者の能力の範囲内に入る。参照により本明細書に組み込まれるChapter 1 of Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)において見ることができる治療効果の決定に関する一般原則を以下に要約する。

薬物動態の原理により、許容されない有害作用は最小限にして所望の程度の治療有効性を得るために投与量レジメンを改変することの基礎がもたらされる。薬物の血漿中濃度を測定することができ、それが治療域に関連する状況では、投与量の改変に関する追加的なガイダンスを得ることができる。

薬物製品は、同じ活性成分を含有し、強度または濃度、剤形、および投与経路が同一である場合、薬学的等価物であるとみなされる。２つの薬学的に等価の薬物製品は、２つの製品中の活性成分の生物学的利用能の速度および程度が適切な試験条件下で有意に異ならない場合、生物学的同等性であるとみなされる。

本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および／または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、状態を抑止すること、実質的に阻害すること、その進行を緩徐化するもしくは逆転させること、状態の臨床症状を実質的に好転させること、または状態の臨床症状の出現を実質的に防止すること、有益なもしくは所望の臨床結果を得ることを含む。処置することは、さらに、以下のうちの１つまたは複数を実現することを指す：（ａ）障害の重症度を低下させること；（ｂ）処置される障害（複数可）に特有の症状の発生を限定すること；（ｃ）処置される障害（複数可）に特有の症状の悪化を限定すること；（ｄ）以前障害（複数可）を有していた患者における障害（複数可）の再発を限定すること；および（ｅ）以前障害（複数可）に関して無症候性であった患者における症状の再発を限定すること。

薬理的および／または生理的効果などの有益なまたは所望の臨床結果としては、これだけに限定されないが、疾患、障害または状態の素因があり得るが疾患の症状をまだ経験していないまたは示していない対象において疾患、障害または状態が生じることの防止（予防的処置）、疾患、障害または状態の症状の軽減、疾患、障害または状態の程度の減弱、疾患、障害または状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患、障害または状態の蔓延の防止、疾患、障害または状態の進行の遅延または緩徐化、疾患、障害または状態の好転または緩和、およびこれらの組合せ、ならびに処置を受けていない場合に予測される生存と比較した生存の延長が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、元のタンパク質と１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、または他の修飾によって異なるポリペプチドを指す。これらの修飾は、元のタンパク質の生物活性を有意に変化させるものではない。多くの場合、バリアントは、元のタンパク質の生物活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を保持する。バリアントの生物活性が元のタンパク質の生物活性よりも高いこともあり得る。バリアントは、対立遺伝子の変形形態もしくは多型によってなど天然に存在するものであり得る、または故意に操作されたものであり得る。

バリアントのアミノ酸配列は、元のタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一である。多くの実施形態では、バリアントは、元のタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれよりも大きな全体的な配列同一性または類似性を共有する。配列同一性または類似性は、ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、ドットマトリックス解析、または動的プログラミング法などの当技術分野で公知の様々な方法を使用して決定することができる。一例では、配列同一性または類似性を、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム）を使用することによって決定する。バリアントのアミノ酸配列と元のタンパク質のアミノ酸配列は、１つまたは複数の領域において実質的に同一であり得るが、他の領域では異なり得る。バリアントは、断片（例えば、ポリペプチドの生物活性断片）を含み得る。一部の実施形態では、断片は、全長ポリペプチドと比較して、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端の（それぞれ独立に）最大約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、または１００アミノ酸残基を欠き得る。

Ｉ．操作された赤血球系細胞
本開示は、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞および除核細胞を特色とする。一部の実施形態では、除核細胞は、例えば、赤血球系前駆細胞からの分化を通じて核を失った赤血球系細胞である。しかし、全ての除核細胞が赤血球系細胞とは限らず、したがって、本発明に包含される除核細胞は、例えば、血小板も含み得ることが理解されよう。一部の実施形態では、除核細胞は血小板ではなく、したがって、血小板を含まない除核細胞である。本開示のある特定の態様では、赤血球系細胞は、網状赤血球または赤血球（erythrocyte）（赤血球（red blood cell）（ＲＢＣ））である。赤血球は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）を欠くので非自己であること、より長い循環時間を有すること、および多数の産生に適することを含めた、他の細胞と比べていくつかの利点をもたらす。本開示のある特定の態様では、操作された赤血球系細胞は、有核である。

本明細書に提示される操作された赤血球系細胞は、天然に免疫特権を有し、ｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞の刺激を直接媒介し、したがって、免疫キラー細胞の養子細胞移入に付随する不都合が回避されるという、現行の免疫キラー細胞標的化技術よりも有意な利点をもたらす。本発明の操作された赤血球系細胞は、これらの細胞集団にｉｎｖｉｖｏで曝露させるとＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞を両方同時に刺激するように操作することができる。特に、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬまたはこれらの組合せ、例えば、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む操作された赤血球系細胞により、初代ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の強力な活性化が駆動され、ＮＫ細胞の細胞傷害性が誘導されることは本発明の発見である。

一部の態様では、本開示は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を提供する。免疫キラー細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。

一部の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であて、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片とインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された赤血球系細胞は、免疫キラー細胞を含めた免疫細胞を刺激することができる。一部の実施形態では、本開示は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片とインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、第１の外因性刺激性ポリペプチドと、４−１ＢＢＬまたはその断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドとを含む操作された赤血球系細胞を提供する。

一部の態様では、本開示は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片とインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、第１の外因性刺激性ポリペプチドと、インターロイキン（ＩＬ−１２）ポリペプチドまたはその断片を含む、第２の外因性刺激性ポリペプチドとを含む操作された赤血球系細胞を提供する。

一部の態様では、本開示は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）ポリペプチドまたはその断片を含む、第１の外因性刺激性ポリペプチドと、４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む、第２の外因性刺激性ポリペプチドとを含む操作された赤血球系細胞を提供する。

一部の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を提供する。

操作された赤血球系細胞は、多数の異なる刺激性分子を単一の赤血球系細胞において、有意に多い数で提示する、例えば、細胞表面に含む、ならびに刺激性シグナルを赤血球系細胞を介して循環系中を直接、長い循環半減期で送達し、維持し、したがって、免疫キラー細胞を刺激するためのより安全かつより有効な方法がもたらされるという追加的な利点をもたらす。

外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞
本発明の外因性刺激性ポリペプチドは、単独で、または他の外因性刺激性ポリペプチドとの組合せで、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の刺激を媒介するポリペプチドである。一部の実施形態では、赤血球系細胞に含まれる外因性刺激性ポリペプチドは、１つよりも多くの型の免疫キラー細胞を刺激することができる、例えば、本発明の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を刺激することができることが本発明の特色である。

一部の実施形態では、免疫キラー細胞を刺激することとは、免疫キラー細胞の増大を指す。一部の実施形態では、免疫キラー細胞を刺激することとは、免疫キラー細胞の活性化を指す。一部の実施形態では、免疫キラー細胞を刺激することとは、免疫キラー細胞の細胞傷害性の増大を指す。ある特定の実施形態では、免疫キラー細胞を刺激することとは、免疫キラー細胞の増大、活性化および／または細胞傷害性の増大の１つまたは複数の組合せを指す。特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞の細胞表面に発現される１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドは、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞）をｅｘｖｉｖｏで活性化および／または増大させるのに十分である。特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞の細胞表面に発現される１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドは、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞）をｉｎｖｉｖｏで活性化および／または増大させるのに十分である。外因性刺激性ポリペプチドが免疫キラー細胞を刺激するのに十分であるどうかを検出するためのアッセイは本明細書に記載されている。したがって、本開示は、一態様では、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む赤血球系細胞を提供する。

一部の実施形態では、複数の外因性刺激性ポリペプチドは、サイトカイン、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のタンパク質、ＮＫ細胞傷害性誘発受容体リガンド、およびインスリン様増殖因子から選択される。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、表１に示されている。

別段の指定がない限り、本明細書のあらゆる表中のものを含めた本明細書に明記されている配列受託番号は、２０１９年３月８日の時点で最新のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受託番号を参照する場合、配列バリアントの全てが包含される。

サイトカイン
一部の実施形態では、本発明は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、１つまたは複数のサイトカインを含めた、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、赤血球系細胞を提供する。したがって、本開示は、サイトカインの全長、断片、ホモログ、バリアントまたは突然変異体を含めたサイトカインを包含する。サイトカインは、別の細胞の生物学的機能に影響を及ぼすことができるタンパク質を含む。サイトカインの影響を受ける生物学的機能としては、これだけに限定されないが、細胞成長、細胞分化または細胞死を挙げることができる。本開示のサイトカインは、細胞の表面の特定の受容体に結合し、それにより、免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を刺激することができることが好ましい。

好ましいサイトカインとしては、とりわけ、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子ファミリー分子および／またはケモカインが挙げられる。本開示のより好ましいサイトカインとしては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）およびインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の特に好ましいサイトカインは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物である。一部の実施形態では、本開示の特に好ましいサイトカインは、ＩＬ−１２である。当業者は、本明細書に提示される教示を身に付ければ、本発明が、当技術分野で周知であるサイトカイン、ならびに今後発見されるあらゆるサイトカインを包含することを理解されよう。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの）サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片を含む。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質
一部の実施形態では、本発明は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、１つまたは複数のヒト白血球抗原タンパク質を含めた、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、赤血球系細胞を提供する。したがって、本開示は、ＨＬＡタンパク質の全長、断片、ホモログ、バリアントまたは突然変異体を含めた、ＨＬＡタンパク質を包含する。ＨＬＡ遺伝子ファミリーにより、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体として公知の関連するタンパク質の群の作出に関する指示がもたらされる。ＨＬＡは、多くの種に存在する遺伝子ファミリーである主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）のヒトバージョンである。ヒトでは、ＭＨＣ複合体は、第６染色体上ですぐ近くに位置する２００種を超える遺伝子からなる。この複合体中の遺伝子は、３つの基本群：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩにカテゴリー化される。ヒトは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃとして公知の３種の主要なＭＨＣクラスＩ遺伝子を有する。これらの遺伝子から産生されるタンパク質は、ほとんど全ての細胞の表面に存在する。ＨＬＡ遺伝子には多くの可能性のある変形形態があり、いくつかのＨＬＡ遺伝子には同定されたバージョン（対立遺伝子）が数百種あり、そのそれぞれに特定の数字が与えられている（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７など）。密接に関連する対立遺伝子は一緒にカテゴリー化される；例えば、少なくとも４０種の非常に類似した対立遺伝子がＨＬＡ−Ｂ２７の亜型である。

一部の実施形態では、ＨＬＡタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａである。一部の実施形態では、ＨＬＡタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ｃである。一部の実施形態では、ＨＬＡタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ｅである。一部の実施形態では、ＨＬＡタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ｇである。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの）ＨＬＡタンパク質、またはそのバリアントもしくは断片を含む。

ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）
一部の実施形態では、本開示は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、１つまたは複数の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）タンパク質を含めた、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、赤血球系細胞を包含する。したがって、本開示は、ＭＩＣタンパク質の全長、断片、ホモログ、バリアントまたは突然変異体を含めた、ＭＩＣタンパク質を包含する。ＭＩＣタンパク質は、古典的なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子との相同性を示すが、ベータ２ミクログロブリンとは結び付かず、ペプチドとは結合せず、また、正常な循環リンパ球では発現されない。ＭＩＣタンパク質は、活性化ナチュラルキラー細胞受容体ＮＫＧ２Ｄと会合する。

ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）糖タンパク質ＵＬ１６に結合するそれらの能力に基づいて同定された、ＭＨＣクラスＩ関連分子（ＭＩＣ）の新規のファミリーである。ＵＬ１６は、ＭＨＣクラスＩ様分子の別のファミリーのメンバーであるＭＩＣＢとも結合する。ＵＬＢＰおよびＭＩＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および他の免疫エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１０のリガンドであり、この相互作用はＵＬ１６によって遮断され得る。ＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１０と標的細胞において発現されたＵＬＢＰまたはＭＩＣの会合により、ＭＨＣクラスＩ分子のＮＫ細胞による認識によって生じる抑制性シグナルを克服し、ＮＫ細胞傷害性を誘発することができる。ＵＬＢＰは、ＮＫ細胞に対するそれらの効果を、ヤヌスキナーゼ２、シグナル伝達兼転写活性化因子５、細胞外シグナル調節キナーゼマイトジェン活性化プロテインキナーゼおよびＡｋｔ／プロテインキナーゼＢシグナルトランスダクション経路を活性化することによって引き出す。ＵＬＢＰは単独で多数のシグナル伝達経路を活性化し、穏当なサイトカイン産生を誘導するが、ＵＬＢＰは、ＮＫ細胞によるインターフェロン−ガンマの産生に関してはインターロイキン−１２と強力に協同する。

一部の実施形態では、ＭＩＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）である。一部の実施形態では、ＭＩＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）である。一部の実施形態では、ＭＩＣタンパク質は、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）である。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの）ＭＩＣタンパク質、またはそのバリアントもしくは断片を含む。

免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）
一部の実施形態では、本開示は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、１つまたは複数のＩｇＳファミリータンパク質を含めた、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、赤血球系細胞を包含する。したがって、本開示は、ＩｇＳＦスーパーファミリーメンバーの全長、断片、ホモログ、バリアントまたは突然変異体を含めた、ＩｇＳＦスーパーファミリーのメンバーを包含する。免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、細胞の接着、結合および認識プロセスに関連するタンパク質のクラスである。分子は、免疫グロブリンと共有される構造的特色に基づいてこのスーパーファミリーのメンバーにカテゴリー化される；これらは全てが免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを有する。ＩｇＳＦのメンバーは、細胞表面抗原受容体、免疫系の補助受容体および共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、ある特定のサイトカイン受容体ならびに細胞内筋肉タンパク質を含む。ＩｇＳＦのメンバーは、以下の通り分類することができる：抗原受容体（例えば、抗体または免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）；抗原提示分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ）；補助受容体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８）；共刺激分子または抑制性分子（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６）；ナチュラルキラー細胞上の受容体（例えば、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ））；白血球上の受容体（例えば、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ））；ＩＧＳＦＣＡＭ（例えば、ＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１）；サイトカイン受容体；増殖因子受容体；受容体チロシンキナーゼ／ホスファターゼ；ＩｇＧ結合性受容体。

ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質である。ＰＶＲ／ＣＤ１５５は、ＮＫ細胞接着を媒介し、ＮＫ細胞のエフェクター機能を誘発する。ＰＶＲ／ＣＤ１５５は、２つの異なるＮＫ細胞受容体：ＣＤ９６およびＣＤ２２６に結合する。これらの相互作用が細胞間接触部位において蓄積され、それにより、ＮＫ細胞と標的細胞の間の成熟免疫学的シナプスの形成が導かれる。これにより、溶解性顆粒およびＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮγ）の接着および分泌が誘発され、活性化されたＮＫ細胞の細胞傷害性が活性化され得、また、ＮＫ細胞−標的細胞モジュラー交換、およびＮＫ細胞へのＰＶＲ移入も促進され得る。

ポリオウイルス受容体関連２（ＰＶＲＬ２）は、Ｎｅｃｔｉｎ−２としても公知であり、２つのＩｇ様Ｃ２型ドメインとＩｇ様Ｖ型ドメインとを有する単一パスＩ型膜糖タンパク質である。このタンパク質は、接着結合の原形質膜構成成分の１つである。

ＣＤ４８抗原（表面抗原分類４８）は、Ｂリンパ球活性化マーカー（ＢＬＡＳＴ−１）またはシグナル伝達リンパ球性活性化分子２（ＳＬＡＭＦ２）としても公知であり、ヒトではＣＤ４８遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＤ４８は、ＣＤ８４、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９およびＣＤ２４４などのＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）タンパク質を含むＩｇＳＦのＣＤ２サブファミリーのメンバーである。ＣＤ４８は、リンパ球および他の免疫細胞、樹状細胞および内皮細胞の表面に見いだされ、これらの細胞における活性化および分化経路に関与する。

ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）は、ＮＫ、Ｔ、およびＢ細胞において発現される表面分子である。ヒトＮＫ細胞では、ＮＴＢＡは、高表面密度の天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）を発現する細胞においてのみ細胞溶解活性を誘発することができるので、主に共受容体として作用することが示されている。分子クローニングにより、ＮＴＢＡが、ＣＤ２ファミリーへの割り当てを可能にする構造的特色を特徴とするＩｇスーパーファミリーのメンバーであることが明らかになった。

一部の実施形態では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＩｇＧである。一部の実施形態では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＰＶＲ／ＣＤ１５５である。一部の実施形態では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＣＤ４８である。一部の実施形態では、ＩｇＳＦタンパク質は、Ｎｅｃｔｉｎ２である。一部の実施形態では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原である。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの）ＩｇＳＦタンパク質、またはそのバリアントもしくは断片を含む。

ヘパラン硫酸／ヘパラン硫酸プロテオグリカン
一部の実施形態では、本発明は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、１つまたは複数のヘパラン硫酸／ヘパラン（heparin）硫酸プロテオグリカンを含めた、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む赤血球系細胞を提供する。ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、すべての動物組織において見いだされる直鎖多糖である。ヘパラン硫酸は、２つまたは３つのＨＳ鎖が細胞表面または細胞外マトリックスタンパク質の極めて近傍に付着したプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）として存在する。ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、細胞表面上および細胞外マトリックス内に遍在的に分布する糖タンパク質である。それらのヘパラン硫酸部分は、多くの場合、特定の受容体を標的とする細胞外タンパク質の代替付着点である。したがって、ＨＳＰＧは、リガンド−受容体遭遇をモジュレートし、多数の生物学的プロセスに関与する。

分子および細胞に基づく試験により、ヘパラン硫酸がｉｎｖｉｔｒｏにおいて、リンパ球ホーミングに関与するＬ−セレクチン、ケモカイン、およびインテグリンを含めたいくつかの主要な分子に結合することが示されている。リンパ球ホーミングに不可欠である二次リンパ系ケモカインＣＣＬ２１（ＳＬＣとも称される）を含めた大多数のケモカインが、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてヘパラン硫酸またはその高度に硫酸化された類似体ヘパリンに結合する（Lortat-Jacob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 1229-1234）。ヘパラン硫酸と結合したケモカインは、ＣＣＲ６およびＣＣＲ７などのケモカイン受容体によって認識され、それにより、インテグリンが活性化され、それにより、リンパ球の血管外遊出が導かれる（von Andrian and Mempelm, Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 867-878、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのエビデンスにより、ヘパラン硫酸が、リンパ球遊走を促進するためのケモカインのトランスサイトーシス、提示、および勾配形成において機能することが示される。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの）ＨＳ多糖、またはそのバリアントもしくは断片を含む。

ナチュラルキラー細胞傷害性誘発受容体リガンド
一部の実施形態では、本開示は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、１つまたは複数のナチュラルキラー細胞傷害性誘発受容体リガンドを含めた、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、赤血球系細胞を包含する。ＮＫ細胞は、形質転換された細胞の死滅に直接関与するいくつかの天然細胞傷害性受容体（すなわち、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、およびＮＣＲ３、それぞれＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ３０として最もよく知られている）を含む活性化受容体を備えている。ＮＫｐ４４は、休止ＮＫ細胞によっては発現されず、それらの活性化された対応物によってのみ発現される。活性化ＮＫ受容体のリガンドの発現は、現在、病理学的シナリオの指標であると考えられている。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの）ＮＫ細胞傷害性誘発受容体リガンド、またはそのバリアントもしくは断片を含む。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、４−１ＢＢＬ、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＩＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）である。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含むまたはそれからなる外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含むまたはそれからなる外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片を含むまたはそれからなる外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物ポリペプチドまたはその断片を含むまたはそれからなる外因性刺激性ポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される外因性刺激性ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、少なくとも２つの外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むまたはそれからなり、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）およびＣＤ４８からなる群から選択されるポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−２である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１８である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−２１である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＦＮαである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＭＩＣＡである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＭＩＣＢである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＰＶＲである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＣＤ４８である。

ある特定の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２、ならびにＩＬ＿１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬであり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１２であり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡである。

ある特定の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２、ならびにＩＬ−１８およびＩＬ−２１からなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１８であり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１８であり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−２１である。

ある特定の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、少なくとも３つの外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２であり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１８であり、第３の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物である。さらなる実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１２である第１の外因性刺激性ポリペプチド、ＩＬ−１８である第２の外因性ポリペプチド、およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物である第３の外因性刺激性ポリペプチドを含み、赤血球系細胞は、メモリー様ＮＫ細胞を刺激することができる。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２であり、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１８であり、第３の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５である。さらなる実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１２である第１の外因性刺激性ポリペプチド、ＩＬ−１８である第２の外因性ポリペプチド、およびＩＬ−１５である第３の外因性刺激性ポリペプチドを含み、赤血球系細胞は、メモリー様ＮＫ細胞を刺激することができる。

本開示は、別の態様では、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢおよびＩＧＦ−１からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、４−１ＢＢＬ、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、ＩｇＧ、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。

ある特定の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１２である第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２であり、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドである。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２であり、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡである。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２であり、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドである。

複数の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、３種またはそれよりも多く、例えば、少なくとも４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、５０種、１００種、２００種、５００種、または１０００種の外因性刺激性ポリペプチドを含む。複数の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞の集団は、３種またはそれよりも多く、例えば、少なくとも４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、５０種、１００種、２００種、５００種、１０００種、２０００種、または５０００種の外因性刺激性ポリペプチドを含み、ここで、例えば、集団内の異なる操作された赤血球系細胞は異なる外因性刺激性ポリペプチドを含む、または、集団内の異なる操作された赤血球系細胞は、異なる複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

一部の実施形態では、少なくとも２つの外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。別の実施形態では、少なくとも３つの外因性刺激性ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。

アンカー／膜貫通ドメイン
ある特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、赤血球系細胞から放出されない。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、遺伝子操作された赤血球系細胞の表面に存在する、すなわち、外因性刺激性ポリペプチドは、赤血球系細胞膜に付着している。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留する膜貫通ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するポリペプチド配列（例えば、膜貫通ドメイン）は、外因性刺激性ポリペプチド内に存在するポリペプチドとは異種である。例えば、一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するポリペプチド配列は、ＩＬ−１５ポリペプチドおよび／またはＩＬ−１５ＲＡポリペプチド、４−１ＢＢＬポリペプチドまたはＩＬ−１２ポリペプチドとは異種である。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、１型膜タンパク質の膜貫通ドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、１型膜タンパク質は、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）；グリコホリンＢ（ＧＰＢ）；ベイシジン（ＣＤ１４７としても公知）；ＣＤ４４；ＣＤ５８（ＬＦＡ３としても公知）；細胞間接着分子４（ＩＣＡＭ４）；基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ）；ＣＲ１；ＣＤ９９；赤芽球膜関連タンパク質（ＥＲＭＡＰ）；接合部接着分子Ａ（ＪＡＭ−Ａ）；ニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）；ＡＭＩＧＯ２；およびＤＳ細胞接着分子様１（ＤＳＣＡＭＬ１）からなる群から選択される。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、２型膜タンパク質の膜貫通ドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、２型膜タンパク質は、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）；Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）膜貫通；およびＫｅｌｌからなる群から選択される。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するポリペプチド配列は、ＧＰＩ連結膜タンパク質（例えば、その断片）を含む、それからなる、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＧＰＩ連結膜タンパク質は、ＣＤ５９；ＣＤ５５；およびセマフォリン７Ａ（ＳＥＭＡ７Ａ）からなる群から選択される。

特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその膜貫通部分を含む。理論に束縛されることなく、ある特定の実施形態では、ＧＰＡが好ましく、これは、ＧＰＡが、細胞が分化し、成熟するにしたがってＧＰＡを保持することにおいて役割を有する網状赤血球細胞骨格と相互作用する細胞質ドメインを有するからである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、アンカーは、表２に列挙されているアミノ酸配列から選択される。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数は、融合タンパク質である、例えば、内因性赤血球タンパク質またはその断片、例えば、膜貫通タンパク質、例えばＧＰＡまたはその膜貫通断片との融合物である。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数は、二量体形成または多量体形成を促進するドメインと、例えば、必要に応じて二量体形成ドメインを含む第２の融合外因性刺激性ポリペプチドと融合している。一部の実施形態では、二量体形成ドメインは、抗体分子の一部、例えば、ＦｃドメインまたはＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、第１および第２の二量体形成ドメインは、ヘテロ二量体形成を促進するためのノブインホール突然変異（例えば、Ｔ３６６ＹノブおよびＹ４０７Ｔホール）を含む。

リンカー
本発明の外因性刺激性ポリペプチドは、１つまたは複数のリンカーを含み得る。例えば、リンカーは、外因性刺激性ポリペプチドの２つのポリペプチド配列間（例えば、サイトカインポリペプチド配列と膜貫通ドメイン配列の間、外因性刺激性ポリペプチドの２つのサブユニット配列の間（例えば、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットとｐ３５サブユニットの間）、または２つの刺激性ポリペプチドの間（例えば、ＩＬ−１５とＩＬ−１５ＲＡの間））に配置されていてよい。

一部の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸またはそれよりも長いアミノ酸長を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカーは、約５から約２５アミノ酸長の間、約５から約２０アミノ酸長の間、約１０から約２５アミノ酸長の間、または約１０から約２０アミノ酸長の間を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本発明において有用なリンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長を含むまたはそれからなる。好ましい実施形態では、リンカーは、非免疫原性である。

一部の実施形態では、リンカーは、表３に示されているアミノ酸配列から選択される。

一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号７５）を含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカー（配列番号７５）からなり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３３のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３９のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号５１のアミノ酸配列からなる。

当業者に公知の他の適切なリンカーを、例えば、外因性刺激性ポリペプチドと膜貫通ドメインを連結するため、２つの外因性刺激性ポリペプチド（例えば、ＩＬ−１５とＩＬ−１５ＲＡ）を連結するため、または外因性刺激性ポリペプチドのサブユニット（例えば、ＩＬ１２のｐ３０とｐ４０）を連結するために使用することができる。

リーダー配列
一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、リーダー（シグナル）配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、リーダー配列を含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、リーダー配列は、表４に記載されている配列から選択される。

ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む操作された赤血球系細胞
本開示は、別の態様では、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片とインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は複合体として存在する。別の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドはＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分とリンカーによって連結している。

ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片（例えば、ＩＬ−１５受容体結合性断片）を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、シグナルペプチド（下線が引かれている）を含む野生型ヒトＩＬ−１５の未成熟形態を含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する野生型ヒトＩＬ−１５の未成熟形態のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ−１５の成熟形態を含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する野生型ヒトＩＬ−１５の成熟形態のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドの断片は、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個または１６０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドの断片は、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個または１６０個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドの断片またはバリアントは、当技術分野で周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、または免疫共沈降によって測定して、野生型ヒトＩＬ−１５ポリペプチドのＩＬ−１５ＲＡポリペプチドに結合する機能の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドの断片またはバリアントは、当技術分野で周知のアッセイ、例えば、電気移動度シフトアッセイ、ＥＬＩＳＡおよび他のイムノアッセイによって測定して、野生型ヒトＩＬ−１５ポリペプチドのＩＬ−１５媒介性シグナルトランスダクションを誘導する機能の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持する。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、インターロイキン−１５受容体α（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドまたはその断片を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡは、シグナルペプチド（下線が引かれている）を含む野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡの未成熟形態を含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡの未成熟形態のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡの成熟形態を含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する野生型ヒトＩＬ−１５Ｒａの成熟形態のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５Ｒａの膜貫通ドメイン、および必要に応じて野生型ＩＬ−１５Ｒａの細胞内ドメインを欠き得る。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、シグナルペプチド（下線が引かれている）を含む細胞外野生型ヒトＩＬ−１５Ｒａの未成熟形態を含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する細胞外野生型ヒトＩＬ−１５Ｒａの未成熟形態のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、細胞外野生型ヒトＩＬ−１５Ｒａの成熟形態を含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する細胞外野生型ヒトＩＬ−１５Ｒａの成熟形態のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列からなる。

ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドに、受容体の細胞外ドメインのエクソン２内の「ｓｕｓｈｉドメイン」を介して高い親和性で特異的に結合する（Wei et al., J Immunol. 2001; 167: 277-282）。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡのｓｕｓｈｉドメインを含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡのｓｕｓｈｉドメインのバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ−１５Ｒａのまたはそのバリアントのｓｕｓｈｉドメインおよび少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個の追加的なヒトＩＬ−１５ＲＡのアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡのｓｕｓｈｉドメインおよび１３個の追加的なヒトＩＬ−１５ＲＡのアミノ酸を含む：

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの断片は、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個または２００個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの断片は、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個または２００個のアミノ酸を含み、かつ、ｓｕｓｈｉドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡ断片またはバリアントは、当技術分野で周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、免疫共沈降によって測定して、野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡポリペプチドのＩＬ−１５ポリペプチドに結合する機能の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持する。別の好ましい実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡバリアントまたは断片は、当技術分野で周知のアッセイ、例えば、電気移動度シフトアッセイ、ＥＬＩＳＡおよび他のイムノアッセイによって測定して、野生型ヒトＩＬ−１５ＲＡポリペプチドのＩＬ−１５媒介性シグナルトランスダクションを誘導する機能の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持する。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドまたはその断片（例えば、ＩＬ−１５結合性断片）を含む。本明細書に記載のＩＬ−１５ポリペプチドのいずれかを本明細書に記載のＩＬ−１５ＲＡポリペプチドのいずれかと組み合わせて外因性刺激性ポリペプチドを形成することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは複合体として存在する。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体の構成成分は、非共有結合または共有結合（例えば、アミノ酸配列をペプチド結合によって組み合わせることによる）のいずれかを使用して直接融合し得る。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドおよびシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドとシグナルペプチドで構成される融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、表４に記載されているアミノ酸配列を含むまたはそれからなるシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＧＰＡシグナルペプチドを含むまたはそれからなるシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列、ＩＬ−１５ポリペプチド、およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを含むまたはそれからなるリーダー配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリーダー配列、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成熟ヒトＩＬ−１５ポリペプチド、および配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、成熟ヒトＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる柔軟なリンカーによって接続されている。

ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを１つまたは複数のリンカーを使用して組み合わせることができる。本明細書に提示されるリンカーのいずれかを使用することができる。一部の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長またはそれよりも長いペプチドである。特定の実施形態では、リンカーは、ＩＬ−１５のＩＬ−１５ＲＡに結合する能力が保存されるのに十分に長い。他の実施形態では、リンカーは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体のβγＩＬ−１５受容体複合体に結合する能力およびアゴニストとして作用してＩＬ−１５シグナルトランスダクションを媒介する能力が保存されるのに十分に長い。一部の実施形態では、リンカーは、表３に列挙されているアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号７５）を含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカー（配列番号７５）からなり、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）を含む。さらなる特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。

当業者に公知の他の適切なリンカーをＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを連結するために使用することができる。一部の実施形態では、本発明において有用なリンカーは、５アミノ酸長から２５アミノ酸長の間、５〜２０アミノ酸長、１０〜２５アミノ酸長、または１０〜２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、本発明において有用なリンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。好ましい実施形態では、リンカーは、非免疫原性である。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの細胞外領域を含む。例えば、一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドのｓｕｓｈｉドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体もしくは融合ポリペプチドは、赤血球系細胞から放出されない。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチド、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体もしくは融合ポリペプチドは、赤血球系細胞膜に付着している。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するポリペプチド配列（例えば、膜貫通領域）（本明細書では、アンカーまたは膜貫通ドメインと称される）をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するポリペプチド配列は、外因性刺激性ポリペプチド内の別のポリペプチドとは異種である。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するポリペプチド配列は、ＩＬ−１５ポリペプチドおよび／またはＩＬ−１５ＲＡポリペプチドとは異種である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するポリペプチド配列は、ＧＰＡ配列である。

外因性ポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するのに有用な他のポリペプチドは、当業者には公知であり、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５ＲＡ、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む外因性ポリペプチドに包含されることが意図されている。非限定的な例としては、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）、トランスフェリン受容体、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＫｅｌｌおよびＢａｎｄ３、Ｂａｎｄ３アニオン輸送タンパク質、短縮型トランスフェリン受容体およびＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）膜貫通ドメインが挙げられる。

一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、１型膜タンパク質またはその膜貫通部分を含むまたはそれからなる。例えば、一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）；グリコホリンＢ（ＧＰＢ）；ベイシジン（ＣＤ１４７としても公知）；ＣＤ４４；ＣＤ５８（ＬＦＡ３としても公知）；細胞間接着分子４（ＩＣＡＭ４）；基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ）；ＣＲ１；ＣＤ９９；赤芽球膜関連タンパク質（ＥＲＭＡＰ）；接合部接着分子Ａ（ＪＡＭ−Ａ）；ニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）；ＡＭＩＧＯ２；およびＤＳ細胞接着分子様１（ＤＳＣＡＭＬ１）からなる群から選択される１型膜タンパク質またはその膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、２型膜タンパク質またはその膜貫通部分を含むまたはそれからなる。例えば、一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）；Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）膜貫通；およびＫｅｌｌからなる群から選択される２型膜タンパク質またはその膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、アンカーは、ＧＰＩ連結膜タンパク質である。一部の実施形態では、ＧＰＩ連結膜タンパク質アンカーは、ＣＤ５９；ＣＤ５５；およびセマフォリン７Ａ（ＳＥＭＡ７Ａ）からなる群から選択される。

一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその断片（例えば、その膜貫通部分）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、表２に提示されているアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

一部の実施形態では、リンカーは、アンカーまたは膜貫通ドメインと、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドとの間に配置されている。適切なリンカーとしては、限定することなく、表３に提示されている任意のリンカーアミノ酸配列が挙げられる。一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメイン、例えばＧＰＡと、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドとの間のリンカーは、ＨＡリンカーを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むアンカー、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、およびインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカー、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成熟ヒトＩＬ−１５、および配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成熟ヒト細胞外ＩＬ−１５ＲＡを含み、成熟ヒトＩＬ−１５アミノ酸配列と成熟ヒト細胞外ＩＬ−１５ＲＡアミノ酸配列が配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる柔軟なリンカーによって接続されている。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるシグナルペプチド（例えば、ＧＰＡシグナルペプチド）、配列番号４を含むまたはそれからなる成熟ヒトＩＬ−１５、配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる柔軟なリンカー（例えば成熟ヒトＩＬ−１５と成熟ヒト細胞外ＩＬ−１５ＲＡを接続している）、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成熟ヒト細胞外ＩＬ−１５ＲＡ、配列番号３３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー、および配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ）、配列番号４を含むまたはそれからなる成熟ヒトＩＬ−１５、配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる柔軟なリンカー（例えば成熟ヒトＩＬ−１５と成熟ヒト細胞外ＩＬ−１５ＲＡを接続している）、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成熟ヒト細胞外ＩＬ−１５ＲＡ、配列番号３３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー、および配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３７を含むまたはそれからなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列または配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列からなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列からなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列からなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列または配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列からなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列または配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列からなる。

ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬ
操作された赤血球系細胞は、本明細書に記載のＩＬ−１５ポリペプチドおよび／またはＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチド、ならびに１つまたは複数の追加的な外因性刺激性ポリペプチドを含み得る。例えば、操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド）ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含み得る。したがって、本発明は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片（例えば、ＩＬ−１５受容体結合性断片）、およびインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと、４−１ＢＢＬまたはその刺激性断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドとを含む操作された赤血球系細胞も提供する。

本明細書全体を通して使用される通り、一実施形態では、「ＩＬ−１５ポリペプチド断片」または「ＩＬ−１５断片」は、ＩＬ−１５ＲＡに結合するＩＬ−１５断片、すなわち、ＩＬ−１５のＩＬ−１５ＲＡ結合性断片である。本明細書全体を通して使用される通り、一実施形態では、「ＩＬ−１５ポリペプチド断片」または「ＩＬ−１５断片」は、ＩＬ−１５の生物活性を保持するＩＬ−１５断片である。

本明細書全体を通して使用される通り、一実施形態では、「ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド断片」または「ＩＬ−１５ＲＡ断片」は、ＩＬ−１５に結合するＩＬ−１５ＲＡ断片、すなわち、ＩＬ−１５ＲＡのＩＬ−１５結合性断片である。本明細書全体を通して使用される通り、一実施形態では、「ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド断片」または「ＩＬ−１５ＲＡ断片」は、ＩＬ−１５ＲＡの生物活性を保持するＩＬ−１５ＲＡ断片である。

４−１ＢＢＬは、免疫系の細胞の表面に見いだされる受容体のファミリーのメンバーである４−１ＢＢのリガンドである（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＳＦ９）、またはＣＤ１３７としても公知である）。Alderson et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 2219-2227を参照されたい。４−１ＢＢＬと結合した４−１ＢＢは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および樹状細胞において細胞活性化、生存、および分化を促進することが示されている。４−１ＢＢと４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）の結合により、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および樹状細胞（ＤＣ）において細胞活性化、生存、および分化が主に４−１ＢＢシグナル伝達活性を通じて促進されることが実証されている。

ある特定の実施形態では、４−１ＢＢＬは、その天然の三量体形態である。さらなる実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬをその天然の三量体形態で発現し、ここで、天然の三量体形態は操作された赤血球系細胞の有効性および活性のために重要である。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ヒト４−１ＢＢＬ、例えばヒト４−１ＢＢＬの細胞外部分を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４１を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４１からなる。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬポリペプチドおよびリーダー（シグナル）配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬポリペプチドとリーダー配列で構成される融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、リーダー配列は、表４に記載されているアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リーダー配列は、ＧＰＡシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬポリペプチドおよび配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリーダー配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリーダー配列、および配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒト細胞外４−１ＢＢＬを含む。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬポリペプチドを含み、赤血球系細胞膜に付着している。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬポリペプチドおよびポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するアンカーまたは膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、４−１ＢＢＬポリペプチドとは異種である。ある特定の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、ＧＰＡまたはその膜貫通部分を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、ＳＭＩＭ１またはその膜貫通部分を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）、トランスフェリン受容体、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＫｅｌｌまたはＢａｎｄ３、またはそれらの膜貫通部分（例えば、膜貫通ドメイン）を含むまたはそれからなる。４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは、本明細書に記載のアンカーまたは膜貫通ドメインのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは、表２に記載のアンカーまたは膜貫通ドメインを含む。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカー、および４−１ＢＢＬポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカー、および配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる４−１ＢＢＬポリペプチドを含む。

４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは、１つまたは複数のリンカーを含み得る。例えば、外因性刺激性ポリペプチドは、本明細書に提示されるリンカー（例えば、表３に提示されているアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー）のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＧＰＡ（またはその膜貫通部分）、４−１ＢＢＬポリペプチド、およびＧＰＡ（またはその膜貫通部分）と４−１ＢＢＬポリペプチドの間に配置されたリンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列からなるリンカーを含む。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、シグナルペプチド、４−１ＢＢＬポリペプチドおよびアンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、シグナルペプチド、４−１ＢＢＬペプチド、リンカー、およびアンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ）、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるシグナルペプチド、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる４−１ＢＢＬポリペプチド、配列番号３９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー（例えば、４−１ＢＢＬポリペプチドとアンカーの間に配置されたもの）、および配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、４−１ＢＢＬペプチド、リンカー、およびアンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ）、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる４−１ＢＢＬポリペプチド、配列番号３９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー（例えば、４−１ＢＢＬポリペプチドとアンカーの間に配置されたもの）、および配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカーを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列または配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列からなる。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドの組合せにより、相乗的な応答が誘導される（例えば、免疫キラー細胞活性化の間に）。例えば、それぞれがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡまたは４−１ＢＢＬのいずれかを含む外因性刺激性ポリペプチドは、赤血球系細胞において発現されると、一緒に作用して、刺激性ポリペプチドいずれか単独での効果と比較してより頑強な免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性化をもたらし得る。そのような相乗活性は、本明細書に提示される実施例において実証されている。したがって、一部の実施形態では、本発明は、第１および第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡの細胞外部分またはその断片を含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢを含み、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞を相乗活性で刺激する、操作された赤血球系細胞を提供する。一実施形態では、ＩＬ−１５とＩＬ−１５ＲＡは融合タンパク質として、例えば細胞の表面に存在する。

ＩＬ−１５の毒性
一部の態様では、本開示は、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、免疫キラー細胞を刺激することができ、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドと比較して高い治療指数（ＴＩ）を有する操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドと比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い治療指数を有する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドと比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の治療指数を有する。

一部の態様では、本開示は、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドと比較して低い毒性を示す操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、単離されたポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、または４−１ＢＢアゴニスト抗体は、組換え型であるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、単離されたポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、または４−１ＢＢアゴニストポリペプチド（例えば、４−１ＢＢアゴニスト抗体など）は、細胞内、細胞膜内、細胞表面上に含まれず、かつ／または細胞とコンジュゲートしているポリペプチドを指す。

一部の実施形態では、細胞は、等価量の単離されたＩＬ−１５ポリペプチドと比較して低い毒性を示す。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と定量的にまたは機能的に等価の量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と定量的に同じ量（例えば、コピー数または容量モル濃度で）である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。

一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は複合体として存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では融合ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは複合体として存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインとリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含み、必要に応じて、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、毒性は、肝毒性を含む。一部の実施形態では、毒性は、血液毒性を含む。一部の実施形態では、肝毒性は、ＩＦＮｇの血清中レベルの上昇、ＡＬＴの血清中レベルの上昇、肝臓内に浸潤しているマクロファージのレベルの上昇、肝臓内に浸潤しているＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞のレベルの上昇、肝臓重量の増加、肝臓炎症スコアの増加、好中球数の減少、リンパ球数の減少、単球数の減少、およびヘモグロビンレベルの低下からなる群から選択される肝毒性の指標によって測定される。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）の血清中レベルの上昇を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルの上昇を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、肝臓または脾臓内に浸潤しているマクロファージのレベルの上昇を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、肝臓へのＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の浸潤の増加を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、肝臓炎症スコアの増加を含む。組織学的特色の半定量的評価をもたらすために数値スコアを使用することができる。悪性度分類および病期分類を定義して組織学的活性の数値指数をもたらすために組織学的試験が役立ち得る。悪性度分類は、壊死性炎症活動性の強度を説明するために使用する。病期分類は、線維症および構造体系的変更、すなわち、疾患の構造的進行の評価基準である。

一部の実施形態では、肝臓炎症スコアは、Ｉｓｈａｋスコアである。Ｉｓｈａｋスコアは、組織学的悪性度分類および病期分類を利用して、壊死性炎症性特色（門脈周囲または中隔周囲の境界面の肝炎、融合性壊死、限局性（斑状）溶解性壊死、アポトーシスおよび限局性炎症、および門脈炎症）の重症度に応じて０〜６（７段階の病期）の尺度でスコアを割り当てる。Ｉｓｈａｋスコアが高いほど疾患の過程または転帰が一層悪いまたはより重症であることを意味し、これを、肝毒性を定義するための評価基準として使用することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるIshak K et al., 1995；Goodman ZD et al., 2007 J Hepatol.; 47 (4): 598-607を参照されたい）。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、Ｉｓｈａｋスコアによって定義される肝臓の炎症の増大である。

一部の実施形態では、肝毒性のマウスモデルを使用して肝毒性を評価する。一部の実施形態では、毒性のマウスモデルを使用して、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞のいずれかの潜在的毒性を評価することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるNiu et al J Immunology 2007 178: 4194-4213を参照されたい）。簡単に述べると、肝毒性は、これだけに限定されないが、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）肝酵素のレベルの上昇、マクロファージの肝臓への浸潤、ＣＤ８＋Ｔ細胞の肝臓への浸潤、リンパ球減少症、血小板減少症、貧血、ヘモグロビンのレベルの低下、脾腫、リンパ節腫脹、肝腫大、多巣性肝炎、貧血、Ｂ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の輸送の変更、ＮＫ細胞の喪失、ならびに造血性幹細胞の表現型を有する骨髄（ＢＭ）細胞の１０倍の増加を含み得る免疫学的異常の発生によって決定することができる。したがって、一部の実施形態では、マウスモデルを使用して、マウスにおいて操作された赤血球系細胞の投与前および本明細書に記載の操作された赤血球系細胞の投与後の時点（複数可）で以下のうちの１つまたは複数を決定することによって肝毒性を評価する：ＡＬＴ肝酵素のレベルの上昇、マクロファージの肝臓への浸潤、ＣＤ８＋Ｔ細胞の肝臓への浸潤、リンパ球減少症、血小板減少症、貧血、ヘモグロビンのレベルの低下、脾腫、リンパ節腫脹、肝腫大、多巣性肝炎、貧血、Ｂ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の輸送の変更、ＮＫ細胞の喪失、ならびに造血性幹細胞の表現型を有する骨髄（ＢＭ）細胞の１０倍の増加。

一部の実施形態では、血液毒性を、好中球数の減少、リンパ球数の減少、単球数の減少、およびヘモグロビンレベルの低下からなる群から選択される血液毒性の指標によって測定する。一部の実施形態では、血液毒性の指標を全血試料において測定する。一部の実施形態では、血液毒性の指標を血清試料において測定する。一部の実施形態では、血液毒性の指標を血漿試料において測定する。

一部の実施形態では、毒性を体重の減少によって測定する。

一部の実施形態では、細胞の投与後に対象において測定される毒性の指標のレベルを投与前の毒性の指標のレベルと比較する。一部の実施形態では、細胞の投与後に対象において測定される毒性の指標のレベルを閾値または毒性の指標の対照レベルと比較する。

ヒトにおける典型的な肝機能についての正常な血液検査結果は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルが血清１リットル当たり約７〜５５単位であることを含む（例えば、www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/about/pac-20394595を参照されたい）。肝臓が、例えば毒性が原因で損傷を受けると、ＡＬＴが血流中に放出され、そのレベルが上昇する。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルの上昇である。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約５５単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約７５単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約１００単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約２５０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約５００単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約７５０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約１０００単位を超えることである。

ヒトにおける典型的な肝機能についての正常な血液検査結果は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルが血清１リットル当たり約８〜４８単位であることを含む（例えば、www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/about/pac-20394595を参照されたい）。ＡＬＴと同様に、ＡＳＴは、通常は血液中に低レベルで存在し、ＡＳＴレベルの上昇により肝損傷が示される。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約４８単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約６０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約７５単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約１００単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約２５０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約５００単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約７５０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約８００単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＳＴの血清中レベルが血液１リットル当たり約１０００単位を超えることである。

ヒトにおける典型的な肝機能についての正常な血液検査結果は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルが血清１リットル当たり約４５〜１１５単位であることを含む（例えば、www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/about/pac-20394595を参照されたい）。ＡＬＰのレベルが正常よりも高いことにより、肝損傷または疾患が示され得る。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清中レベルの上昇である。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ＡＬＰの血清中レベルが血清１リットル当たり約１１５単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＰの血清中レベルが血液１リットル当たり約１５０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＰの血清中レベルが血液１リットル当たり約２５０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＰの血清中レベルが血液１リットル当たり約５００単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＰの血清中レベルが血液１リットル当たり約７５０単位を超えることである。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、ヒト対象におけるＡＬＰの血清中レベルが血液１リットル当たり約１０００単位を超えることである。

ヒト成体における正常な血液検査結果は、血液１μＬ中のリンパ球が８００個から４，８００個の間であることを含む（例えば、www.medicalnewstoday.com/articles/320987.phpを参照されたい）。リンパ球減少症は、血液中のリンパ球数の異常な減少を有する状態である。リンパ球減少症は、細胞傷害性薬剤の投与によって頻繁に生じる結果である。一部の実施形態では、血液毒性の指標はリンパ球数の減少によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりのリンパ球が約８００個未満というリンパ球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりのリンパ球が約６００個未満というリンパ球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりのリンパ球が約４００個未満というリンパ球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりのリンパ球が約２００個未満というリンパ球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりのリンパ球が約１００個未満というリンパ球数の減少である。

ヒト成体における正常な血液検査結果は、血液１μＬ中の細胞が３９０万個から５６５万個であることを含む（例えば、www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/about/pac-20384919を参照されたい）。赤血球がある特定の化学物質または毒素によって過剰な損傷を受けると赤血球数の減少が起こり得る。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、赤血球数の減少によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約３．９×１０^６個未満という赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約１×１０^６個未満という赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約３×１０^５個であるという赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約１×１０^５個であるという赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約３×１０^４個であるという赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約１×１０^４個であるという赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約３×１０^３個であるという赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約１×１０^３個であるという赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約３×１０^２個であるという赤血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの赤血球が約１×１０^２個であるという赤血球数の減少である。

ヒト成体における正常な血液検査結果は、血液１μＬ中の細胞が３，４００個から９，６００個の間であることを含む（例えば、www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/about/pac-20384919を参照されたい）。白血球減少症は、血液中の白血球（white blood cell）（白血球（leukocyte））数の減少であり、毒性によって誘導され得る（例えば、Xu et al., 2008, Toxicological Sciences. 103 (2): 278-284を参照されたい）。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、白血球数の減少によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約３，４００個未満という白血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約３，０００個未満という白血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約２，５００個未満という白血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約２，０００個未満という白血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約１，５００個未満という白血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約１，０００個未満という白血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約５００個未満という白血球数の減少である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１マイクロリットル当たりの白血球が約１００個未満という白血球数の減少である。

ヒト成体における正常な血液検査結果は、血液１リットル当たり１１６グラムから１６６グラムの間であることを含む（例えば、www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/about/pac-20384919を参照されたい）。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、ヘモグロビンレベルの低下によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約１１６グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約１１０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約１００グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約９０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約８０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約７０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約６０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約５０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約４０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約３０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約２０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、血液１リットル当たり約１０グラム未満というヘモグロビンレベルの低下である。

一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％低い毒性を示す。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの３分の２以下、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下または１０分の１以下の毒性を示す。

一部の実施形態では、細胞は、対象において免疫キラー細胞を刺激することができる。

４−１ＢＢＬの毒性
一部の態様では、本開示は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、免疫キラー細胞を刺激することができ、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体と比較して高い治療指数（ＴＩ）を有する操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高いまたはそれよりも高い治療指数を有する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の治療指数を有する。

一部の態様では、本開示は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、免疫キラー細胞を刺激することができ、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体と比較して低い毒性を示す、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、単離されたポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、または４−１ＢＢアゴニスト抗体は、組換え型であるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、単離されたポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、または４−１ＢＢアゴニストポリペプチド（例えば、４−１ＢＢアゴニスト抗体など）は、細胞内、細胞膜内、細胞表面上に含まれず、かつ／または細胞とコンジュゲートしていないポリペプチドを指す。一部の実施形態では、細胞は、等価量の単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体と比較して低い毒性を示す。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、細胞内に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と等価の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と等価の（例えば、コピー数、重量または容量モル濃度で）単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。

一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、抗体３Ｈ３もしくはその抗原結合性断片、または抗体ウトミルマブもしくはその抗原結合性断片である。

一部の実施形態では、毒性は、肝毒性を含む。一部の実施形態では、毒性は、血液毒性を含む。一部の実施形態では、肝毒性は、ＩＦＮｇの血清中レベルの上昇、ＡＬＴの血清中レベルの上昇、肝臓内に浸潤しているマクロファージのレベルの上昇、肝臓内に浸潤しているＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞のレベルの上昇、肝臓重量の増加、肝臓炎症スコアの増加、好中球数の減少、リンパ球数の減少、単球数の減少、およびヘモグロビンレベルの低下からなる群から選択される肝毒性の指標によって測定される。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）の血清中レベルの上昇を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルの上昇を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、肝臓または脾臓内に浸潤しているマクロファージのレベルの上昇を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、肝臓へのＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の浸潤の増加を含む。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、肝臓炎症スコアの増加を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、肝臓炎症スコアは、Ｉｓｈａｋスコアである。

一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、肝毒性を、肝毒性のマウスモデルを使用して評価する。

一部の実施形態では、細胞の投与後に対象において測定される毒性の指標のレベルを投与前の毒性の指標のレベルと比較する。一部の実施形態では、細胞の投与後に対象において測定される毒性の指標のレベルを閾値または毒性の指標の対照レベルと比較する。一部の実施形態では、毒性の指標は、本明細書に記載の通り、血清中ＡＬＴレベルによって決定される。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、本明細書に記載の通り、ＡＬＴの血清中レベルの上昇である。一部の実施形態では、毒性の指標は、本明細書に記載の通り、血清中ＡＳＴレベルによって決定される。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、本明細書に記載の通り、ＡＳＴの血清中レベルの上昇である。一部の実施形態では、毒性の指標は、本明細書に記載の通り、血清中ＡＬＰレベルによって決定される。一部の実施形態では、肝毒性の指標は、本明細書に記載の通り、ＡＬＰの血清中レベルの上昇である。一部の実施形態では、毒性の指標は、本明細書に記載の通り、リンパ球数によって決定される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、リンパ球数の減少によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、本明細書に記載の通り、赤血球数によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、本明細書に記載の通り、赤血球数の減少によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、本明細書に記載の通り、白血球数によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、本明細書に記載の通り、白血球数の減少によって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、本明細書に記載の通り、ヘモグロビンレベルによって識別される。一部の実施形態では、血液毒性の指標は、ヘモグロビンレベルの低下によって識別される。

一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％低い毒性を示す。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１または少なくとも１０分の１の毒性を示す。

ＩＬ−１５および４−１ＢＢＬの毒性
一部の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬポリペプチドを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む、操作された赤血球系細胞であり、免疫キラー細胞を刺激することができ、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して高い治療指数（ＴＩ）を有する、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い治療指数を有する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の治療指数を有する。

一部の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬポリペプチドを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む、操作された赤血球系細胞であり、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢアゴニストポリペプチド、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して低い毒性を示す、操作された赤血球系細胞を提供する。

一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、等価量の単離された４−１ＢＢアゴニストポリペプチド、等価量の単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して低い毒性を示す。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、細胞内に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と等価の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と等価の（例えば、コピー数、重量または容量モル濃度で）単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、抗体３Ｈ３もしくはその抗原結合性断片、または抗体ウトミルマブもしくはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と定量的にまたは機能的に等価の量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と定量的に同じ量（例えば、コピー数または容量モル濃度で）である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。

一部の実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。

一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は複合体として存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは複合体として存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインとリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含み、必要に応じて、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む。一部の実施形態では融合ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬポリペプチドおよび単離されたＩＬ−１５ポリペプチドよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％低い毒性を示す。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬポリペプチドおよび単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１または少なくとも１０分の１の毒性を示す。

ある特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。

ある特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、抗体または抗体断片、例えば抗体のＦｃ部分を含まない。

核酸配列
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む操作された赤血球系細胞（例えば、操作された赤血球系前駆細胞）を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を使用することによって調製された操作された赤血球系細胞を提供する。例えば、一部の実施形態では、赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチド、例えば成熟ヒトＩＬ−１５を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１３または配列番号１４の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１３の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１４の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１３または配列番号１４の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド（例えば、成熟細胞外ヒトＩＬ−１５ＲＡ）を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１５または配列番号１６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１５の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１５または配列番号１６の核酸配列からなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９または配列番号２０の核酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、リンカー、例えば（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号１２）をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーをコードする核酸配列は、配列番号１７または配列番号１８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーをコードする核酸配列は、配列番号１７の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーをコードする核酸配列は、配列番号１８の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５Ｖ３構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２８の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２８の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２８の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３０の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３０の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ５構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ５構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ５構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３２の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ５構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３２の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ５構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３２の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５Ｖ３．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３６の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３６の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５Ｖ３．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３６の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４．１構築物をコードする核酸配列は、配列番号３８の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３８の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＶ４．１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３８の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬポリペプチド、例えばヒト４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４２の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４２の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４２の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４４の核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４４の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４４の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４４の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列またはその構成成分はコドン最適化されている（例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている）。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド、４−１ＢＢＬポリペプチド、および／またはリンカーをコードする核酸配列はコドン最適化されている。他の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列またはその構成成分はコドン最適化されていない。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチド、４−１ＢＢＬポリペプチド、および／またはリンカーをコードする核酸配列はコドン最適化されていない。

ＩＬ−１２を含む操作された赤血球系細胞
本開示は、別の態様では、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１２ポリペプチドまたはその断片（例えば、ＩＬ−１２受容体結合性断片）を含む、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ｐ４０−ｐ３５融合ポリペプチド（ＩＬ−１２ｐ４０−ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

本明細書全体を通して使用される通り、一実施形態では、ＩＬ−１２断片またはＩＬ−１２ポリペプチド断片は、ＩＬ−１２受容体に結合するＩＬ−１２断片、すなわち、ＩＬ−１２のＩＬ−１２受容体結合性断片を指す。本明細書全体を通して使用される通り、一実施形態では、ＩＬ−１２断片またはＩＬ−１２ポリペプチド断片は、ＩＬ−１２の生物活性を保持するＩＬ−１２断片を指す。

ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を提供する：

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＩＬ−１２ｐ４０のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列からなる。

本開示は、別の態様では、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片を含む、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を提供する：

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＩＬ−１２ｐ３５のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片とインターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片とを含む、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドとＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドは複合体として存在する。別の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドとＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドは融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドはＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドとリンカーによって連結している。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成熟ヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドと配列番号４７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、成熟ヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドとＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドは、リンカー（例えば、柔軟なリンカー）によって接続されている。本明細書に記載のリンカーのいずれかを使用することができる。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号７５）を含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカー（配列番号７５）からなり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一部の実施形態では、リンカーは、表３に記載されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）を含む。さらなる特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、柔軟なリンカー（配列番号１２）によって接続された成熟ヒトＩＬ−１２ｐ４０（配列番号４５）とＩＬ−１２ｐ３５（配列番号４７）とを含む。

当業者に公知の他の適切なリンカーをＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドとＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを連結するために使用することができる。一部の実施形態では、本発明において有用なリンカーは、５から２５アミノ酸長の間、５〜２０アミノ酸長、１０〜２５アミノ酸長、または１０〜２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、本発明において有用なリンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。好ましい実施形態では、リンカーは、非免疫原性である。

ある特定の実施形態では、本発明は、リンカーまたはその断片によって連結したＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドとＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を提供する：

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合のバリアントを含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドの断片は、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個または５１０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドの断片は、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個または５１０個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、断片またはＩＬ−１２ｐ４０のバリアント／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドは、当技術分野で周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、または免疫共沈降によって測定して、野生型ヒトＩＬ−１２のＩＬ−１２受容体に結合する機能の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持する。一部の実施形態では、断片またはＩＬ−１２ｐ４０のバリアント／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドは、当技術分野で周知のアッセイ、例えば、電気移動度シフトアッセイ、ＥＬＩＳＡおよび他のイムノアッセイによって測定して、野生型ヒトＩＬ−１２のＩＬ−１２媒介性シグナルトランスダクションを誘導する機能の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を保持する。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２ポリペプチドおよびシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２ポリペプチドとシグナルペプチドで構成される融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、表４に記載されているアミノ酸配列を含むまたはそれからなるシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＧＰＡシグナルペプチドを含むまたはそれからなるシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むリーダー配列およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）ポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは、赤血球系細胞膜に付着している。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドおよびポリペプチドを赤血球系細胞膜に係留するアンカーまたは膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドとは異種である。ある特定の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、ＧＰＡまたはその膜貫通部分を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、ＳＭＩＭ１またはその膜貫通部分を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、アンカーまたは膜貫通ドメインは、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）、トランスフェリン受容体、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｋｅｌｌ、またはＢａｎｄ３またはその膜貫通部分（例えば、膜貫通ドメイン）を含むまたはそれからなる。ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは、本明細書に記載のアンカーまたは膜貫通ドメインのいずれかを含み得る。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは、表２に記載のアミノ酸配列を含むアンカーまたは膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成熟ヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド、リンカー（例えば、配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる柔軟なリンカー）、およびアンカー配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ）、配列番号４９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカードメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド、および配列番号４７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ）、配列番号４９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカードメイン、配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー（例えば、柔軟なリンカー）、配列番号４５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー（例えば、柔軟なリンカー）、および配列番号４７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカーおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４９を含むまたはそれからなるアンカーおよび配列番号４５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド、および配列番号４７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ）、配列番号４９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカー、配列番号４５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー（例えば、柔軟なリンカー）、および配列番号４７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ＳＭＩＭ１（またはＳＭＩＭ１膜貫通部分）を含むアンカーと連結したＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは、ＧＰＡ（またはＧＰＡ膜貫通部分（例えばＧＰＡ膜貫通ドメイン））を含むアンカーと連結したＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドの細胞表面発現と比べて、細胞表面発現の増大を示す。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列または配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列からなる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列または配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列からなる。

ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ
操作された赤血球系細胞は、本明細書に記載のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチド、および１つまたは複数の追加的な外因性刺激性ポリペプチドを含み得る。例えば、操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド）ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含み得る。したがって、本発明は、インターロイキン−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片、およびインターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片（例えば、ＩＬ−１２ｐ４０−ｐ３５融合ポリペプチド）を含む第１の外因性刺激性ポリペプチド、ならびに、４−１ＢＢＬまたはその刺激性断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞も提供する。

ある特定の実施形態では、４−１ＢＢＬは、その天然の三量体形態である。さらなる実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬをその天然の三量体形態で発現し、ここで、天然の三量体形態は操作された赤血球系細胞の有効性および活性のために重要である。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ヒト４−１ＢＢＬ、例えばヒト４−１ＢＢＬの細胞外部分を含む。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる４−１ＢＢＬポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）ポリペプチド、例えば、配列番号４５を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドおよび配列番号４７を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチド（例えば、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＩＬ−１２ｐ４０−ｐ３５融合ポリペプチド）を含む。

一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ）、配列番号４９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアンカー（例えば、ＳＭＩＭ１アンカー）、配列番号４５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列を含むリンカー、および配列番号４７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒト細胞外４−１ＢＢＬポリペプチド、配列番号３９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるリンカー（例えば、４−１ＢＢＬリンカー）、および配列番号２５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＧＰＡアンカーを含む。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドは、単一の核酸分子によってコードされており、単一の融合ポリペプチドとして最初に発現され、ここで、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドの間にＴ２Ａスキップペプチド（例えば、配列番号６４）が配置されている。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドは、単一の核酸分子によってコードされており、単一の融合ポリペプチドとして最初に発現され、ここで、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドとＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドの間にＴ２Ａスキップペプチド（例えば、配列番号６４）が配置されている。２Ａスキップペプチドまたはエレメント（例えば、Ｔ２Ａ配列）の導入により、２つの別々の外因性刺激性ポリペプチド（４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１２ポリペプチドのいずれかを含む）への翻訳後切断が可能になる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるLiu et al. (2017)Sci. Rep. 7(1): 2193を参照されたい）。ある特定の実施形態によると、翻訳後切断の後、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドは赤血球系細胞表面に係留されている。Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａを含めた多数の２Ａエレメントが当技術分野で公知であり、本明細書に記載の通り使用することができる（例えば、Liu et al. 2017を参照されたい）。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＧＰＡシグナルペプチド（配列番号２１）、４−１ＢＢＬポリペプチド（配列番号４１）、４−１ＢＢＬリンカー（配列番号４０）、ＧＰＡアンカー（配列番号２５）、Ｔ２Ａスキップペプチド（配列番号６４）、ＳＭＩＭ１アンカー（配列番号４９）、リンカー（配列番号１２）、ＩＬ１２ｐ４０ポリペプチド（配列番号４５）、柔軟なリンカー（配列番号１２）、およびＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチド（配列番号４７）を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６２を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６２からなる。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、例えば、５’から３’へ、ＧＰＡシグナルペプチド（配列番号２１）、４−１ＢＢＬポリペプチド（配列番号４１）、４−１ＢＢＬリンカー（配列番号４０）、ＧＰＡアンカー（配列番号２５）、Ｔ２Ａスキップペプチド（配列番号６４）、ＳＭＩＭ１アンカー（配列番号４９）、リンカー（配列番号１２）、ＩＬ１２ｐ４０ポリペプチド（配列番号４５）、柔軟なリンカー（配列番号１２）、およびＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチド（配列番号４７）をコードする、ポリペプチドをコードする核酸を使用することによって調製する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号６２を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号６３を含むまたはそれからなる。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドの組合せにより、相乗的な応答（例えば、免疫キラー細胞活性化の間に）が生じる。例えば、それぞれがＩＬ−１２または４−１ＢＢＬのいずれかを含む外因性刺激性ポリペプチドは、赤血球系細胞において発現されると、一緒に作用して、刺激性ポリペプチドいずれか単独での効果と比較してより頑強な免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性化をもたらし得る。そのような相乗活性は、本明細書に提示される実施例において実証されている。したがって、一部の実施形態では、本発明は、第１および第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬを含み、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞を相乗活性で刺激する、操作された赤血球系細胞を提供する。一実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５を融合タンパク質として、例えば細胞の表面に含む。

別の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、本明細書に記載のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチド、ならびに１つまたは複数の追加的な外因性刺激性ポリペプチドを含み得る。例えば、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡの細胞外部分またはその断片で構成される群からの第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含み得る。したがって、本発明は、インターロイキン−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片、およびインターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片（例えば、ＩＬ−１２ｐ４０−ｐ３５融合ポリペプチド）を含む第１の外因性刺激性ポリペプチド、ならびに、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡの細胞外部分またはその断片（例えば、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物ポリペプチド）を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞も提供する。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドとＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドの組合せにより、相乗的な応答（例えば、免疫キラー細胞活性化の間に）が生じる。例えば、それぞれがＩＬ−１２またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡのいずれかを含む外因性刺激性ポリペプチドは、赤血球系細胞において発現されると、一緒に作用して、刺激性ポリペプチドいずれか単独での効果と比較してより頑強な免疫キラー細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性化をもたらし得る。そのような相乗活性は、本明細書に提示される実施例において実証されている。したがって、一部の実施形態では、本発明は、第１および第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含み、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞を相乗活性で刺激する、操作された赤血球系細胞を提供する。一実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５を融合タンパク質として、例えば細胞の表面に含む。

ＩＬ−１２の毒性
一部の態様では、本開示は、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、免疫キラー細胞を刺激することができ、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドと比較して高い治療指数（ＴＩ）を有する操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い治療指数を有する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドと比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の治療指数を有する。

一部の態様では、本開示は、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドと比較して低い毒性を示す操作された赤血球系細胞を提供する。

一部の実施形態では、単離されたポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、または４−１ＢＢアゴニスト抗体は、組換え型であるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、単離されたポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２ポリペプチド、ＩＬ−１５ポリペプチド、または４−１ＢＢアゴニストポリペプチド（例えば、４−１ＢＢアゴニスト抗体など）は、細胞内、細胞膜内、細胞表面上に含まれず、かつ／または細胞とコンジュゲートしていないポリペプチドを指す。

一部の実施形態では、細胞は、等価量の単離されたＩＬ−１２ポリペプチドと比較して低い毒性を示す。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と定量的にまたは機能的に等価の量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と定量的に同じ量（例えば、コピー数または容量モル濃度で）である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ｐ４０ポリペプチドおよびｐ３５ポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％低い毒性を示す。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの３分の２以下、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下または１０分の１以下の毒性を示す。

ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの毒性
一部の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬポリペプチドを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む、操作された赤血球系細胞であり、免疫キラー細胞を刺激することができ、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して高い治療指数（ＴＩ）を有する、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い治療指数を有する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の治療指数を有する。

一部の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬポリペプチドを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む、操作された赤血球系細胞であり、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢアゴニストポリペプチド、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して低い毒性を示す、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、等価量の単離された４−１ＢＢアゴニストポリペプチド、等価量の単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して低い毒性を示す。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、細胞内に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と等価の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と等価の（例えば、コピー数、重量または容量モル濃度で）単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。

一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と定量的にまたは機能的に等価の量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と定量的に同じ量（例えば、コピー数または容量モル濃度で）である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ｐ４０ポリペプチドおよびｐ３５ポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬポリペプチドおよび単離されたＩＬ−１２ポリペプチドよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％低い毒性を示す。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離された４−１ＢＢＬポリペプチドおよび単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１または少なくとも１０分の１の毒性を示す。

ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の毒性
一部の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２ポリペプチドを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む、操作された赤血球系細胞であり、免疫キラー細胞を刺激することができ、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して高い治療指数（ＴＩ）を有する、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い治療指数を有する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の治療指数を有する。

一部の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２ポリペプチドを含み、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む、操作された赤血球系細胞であり、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して低い毒性を示す、操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、等価量の単離されたＩＬ−１２ポリペプチド、等価量の単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、またはこれらの組合せと比較して低い毒性を示す。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と定量的にまたは機能的に等価の量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と定量的に同じ量（例えば、コピー数または容量モル濃度で）である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。

一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と定量的にまたは機能的に等価の量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と定量的に同じ量（例えば、コピー数または容量モル濃度で）である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞内に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。

一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドおよび単離されたＩＬ−１５ポリペプチドよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％低い毒性を示す。一部の実施形態では、細胞は、対象に投与された際に、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドおよび単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１または少なくとも１０分の１の毒性を示す。

ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする核酸配列
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む操作された赤血球系細胞を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ−１２を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を使用すること（例えば、赤血球系前駆細胞に導入すること）によって調製された操作された赤血球系細胞を提供する。例えば、一部の実施形態では、赤血球系細胞は、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４６の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４６の核酸配列からなる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４８の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ｐ３５ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４８の核酸配列からなる。

特定の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５８の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

特定の実施形態では、核酸配列は、ＩＬ−１２Ｖ１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ＩＬ−１２Ｖ１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５４の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２Ｖ１構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５４の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

特定の実施形態では、核酸配列は、ＩＬ−１２Ｖ２構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ＩＬ−１２Ｖ２構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２Ｖ２構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５６の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

特定の実施形態では、核酸配列は、４−１ＢＢＬ−Ｔ２Ａ−ＩＬ−１２構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、４−１ＢＢＬ−Ｔ２Ａ−ＩＬ−１２構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号６３の核酸配列を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬ−Ｔ２Ａ−ＩＬ−１２構築物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号６３の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＡＦＦＴ、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、または別の適切な方法もしくはアルゴリズムなどの様々な方法およびソフトウェアプログラムを使用して、２つまたはそれよりも多くのペプチドまたは核酸間の相同性を決定することができる。一部の実施形態では、ＦａｓｔＤＢにより、以下のパラメーターに基づいてパーセント同一性を算出する：ミスマッチペナルティ（mismatch penalty）１；ギャップペナルティ（gap penalty）１；ギャップサイズペナルティ（gap size penalty）０．３３；およびジョイニングペナルティ（joining penalty）３０。

有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰでは、前進するペアワイズアラインメントを使用して、関連する配列の群から多数の配列アラインメントを創出する。ＰＩＬＥＵＰではまた、アラインメントを創出するために使用されたクラスタリング関係を示す木をプロットすることもできる。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトのギャップ重みづけ（gap weight）３．００、デフォルトのギャップ長さ重みづけ（gap length weight）０．１０、および重みづけされた末端ギャップを含む。

有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴプログラムの有用な例は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２では、いくつかの検索パラメーターを使用し、その大部分をデフォルト値に設定する。調整可能なパラメーターは以下の値に設定する：オーバーラップスパン（overlap span）＝１、オーバーラップフラクション（overlap fraction）＝０．１２５、ワード閾値（word threshold）（Ｔ）＝１１。ＨＳＰＳおよびＨＳＰＳ２パラメーターは動的値であり、プログラム自体により、特定の配列の構成および目的の配列を検索する特定のデータベースの構成に応じて確立されるが、この値を調整して感度を増大させることができる。

追加的な有用なアルゴリズムは、ギャップ挿入ＢＬＡＳＴである。ギャップ挿入ＢＬＡＳＴでは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定した閾値Ｔパラメーター；ギャップ挿入されていない伸長、電荷ギャップ長ｋ、コスト１０＋ｋを誘発するための２ヒット法；１６に設定したＸｕ、およびアルゴリズムのデータベース検索段階については４０に設定し、出力段階については６７に設定したＸｇを使用する。ギャップが挿入されたアラインメントが約２２ビットに対応するスコアによって誘発される。

追加的な有用なツールは、多数の配列アラインメントのために一般に使用されるコンピュータープログラムのシリーズであるＣｌｕｓｔａｌである。Ｃｌｕｓｔａｌの最近のバージョンとして、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸおよびＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａが挙げられる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列のパーセント同一性の算出のためのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝５である。核酸に関しては、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝４である。

ポリペプチドおよび核酸
一態様では、本開示は、本明細書に記載の単離された外因性刺激性ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、本明細書に記載の外因性刺激性ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドはシグナル配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドはシグナル配列を欠く。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは組換えによって作製される。組換えタンパク質を作製するための方法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の外因性ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））を提供する。一部の実施形態では、核酸は、所望の細胞型（例えば、細菌細胞または哺乳動物細胞）における発現のためにコドン最適化されている。

ポリペプチドコピー数
組換えＤＮＡ技術の使用により、例えば宿主細胞内の核酸分子のコピーの数を操作することによる、トランスフェクトされた核酸分子の発現の調節が改善され得ることが当業者には理解されよう。

本明細書で考察されている通り、一態様では、本開示は、免疫キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞であって、免疫キラー細胞を刺激するのに十分な複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む赤血球系細胞を特色とする。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、少なくとも第１の外因性刺激性ポリペプチド、第２の外因性ポリペプチドおよび第３の外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの外因性ポリペプチドが、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドが、第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比は、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、約５０，０００から約６００，０００コピーの間の第１の外因性ポリペプチド、例えば、約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーの第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、または１５０，０００から２００，０００コピーの間の第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約７５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１２５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１５０，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１７５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２５０，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約３００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約４００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約５００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、約５０，０００から約６００，０００コピーの間の第２の外因性ポリペプチド、例えば、約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーの第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、または１５０，０００〜２００，０００コピーの間の第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約７５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１２５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１５０，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１７５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２５０，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約３００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約４００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約５００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。

本明細書に記載の通り、別の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片とインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、操作された赤血球系細胞を特色とする。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。別の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む、操作された赤血球系細胞を特色とする。別の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含む、操作された赤血球系細胞を特色とする。

上記の態様の一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の追加的な外因性刺激性ポリペプチド（例えば、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）をさらに含む。

上記の態様の一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比は、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、約５０，０００から約６００，０００コピーの間の第１の外因性ポリペプチド、例えば、約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーの第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、または１５０，０００〜２００，０００コピーの間の第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約７５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１２５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１５０，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１７５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２５０，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約３００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約４００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約５００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、約５０，０００から約６００，０００コピーの間の第２の外因性ポリペプチド、例えば、約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーの第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、または１５０，０００〜２００，０００コピーの間の第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約７５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１２５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１５０，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１７５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２５０，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約３００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約４００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約５００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。

本明細書に記載の通り、別の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を特色とする。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、少なくとも第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する。一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比は、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである。一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、約５０，０００から約６００，０００コピーの間の第１の外因性ポリペプチド、例えば、約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーの第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、または１５０，０００〜２００，０００コピーの間の第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約７５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１２５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１５０，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１７５，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２５０，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約３００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約４００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約５００，０００コピーの第１の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、約５０，０００から約６００，０００コピーの間の第２の外因性ポリペプチド、例えば、約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーの第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、または１５０，０００〜２００，０００コピーの間の第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約７５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１２５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１５０，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約１７５，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約２５０，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約３００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約４００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、少なくとも約５００，０００コピーの第２の外因性ポリペプチドを含む。

ｉｎｖｉｖｏ半減期
一部の実施形態では、本明細書に記載の外因性ポリペプチドは、操作された赤血球系細胞または除核細胞の中またはその上に含まれて対象に投与される場合、それ自体で（すなわち、本明細書に記載の細胞上またはその中に含まれずに）投与される対応する外因性ポリペプチドと比較して長期のｉｎｖｉｖｏ半減期を示す。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、それ自体で投与される対応する外因性ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ半減期、またはそれ自体で投与される対応するペグ化バージョンの外因性ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ半減期よりも長いｉｎｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、約２４時間から２４０日間の間（例えば、２４時間、３６時間、４８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、６１日、６２日、６３日、６４日、６５日、６６日、６７日、６８日、６９日、７０日、７１日、７２日、７３日、７４日、７５日、７６日、７７日、７８日、７９日、８０日、８１日、８２日、８３日、８４日、８５日、８６日、８７日、８８日、８９日、９０日、９１日、９２日、９３日、９４日、９５日、９６日、９７日、９８日、９９日、１００日、１０１日、１０２日、１０３日、１０４日、１０５日、１０６日、１０７日、１０８日、１０９日、１１０日、１１１日、１１２日、１１３日、１１４日、１１５日、１１６日、１１７日、１１８日、１１９日、１２０日、１２１日、１２２日、１２３日、１２４日、１２５日、１２６日、１２７日、１２８日、１２９日、１３０日、１３１日、１３２日、１３３日、１３４日、１３５日、１３６日、１３７日、１３８日、１３９日、１４０日、１４１日、１４２日、１４３日、１４４日、１４５日、１４６日、１４７日、１４８日、１４９日、１５０日、１５１日、１５２日、１５３日、１５４日、１５５日、１５６日、１５７日、１５８日、１５９日、１６０日、１６１日、１６２日、１６３日、１６４日、１６５日、１６６日、１６７日、１６８日、１６９日、１７０日、１７１日、１７２日、１７３日、１７４日、１７５日、１７６日、１７７日、１７８日、１７９日、１８０日、１８１日、１８２日、１８３日、１８４日、１８５日、１８６日、１８７日、１８８日、１８９日、１９０日、１９１日、１９２日、１９３日、１９４日、１９５日、１９６日、１９７日、１９８日、９１９日、２００日、２０１日、２０２日、２０３日、２０４日、２０５日、２０６日、２０７日、２０８日、２０９日、２１０日、２１１日、２１２日、２１３日、２１４日、２１５日、２１６日、２１７日、２１８日、２１９日、２２０日、２２１日、２２２日、２２３日、２２４日、２２５日、２２６日、２２７日、２２８日、２２９日、２３０日、２３１日、２３２日、２３３日、２３４日、２３５日、２３６日、２３７日、２３８日、２３９日間、または２４０日間のｉｎｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、１日、２日間、３日間、５日間、１０日間、２５日、５０日間、７５日間、１００日間、１２５日間、１５０日間、１７５日間、２００日間、２２５日間、２３５日間、または２５０日間よりも長いｉｎｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年間、またはそれよりも長いｉｎｖｉｖｏ半減期を有する。

一部の実施形態では、本開示の除核細胞（例えば、網状赤血球、赤血球、または血小板）は、対象に投与された後、少なくとも約１日〜約２４０日間にわたって（例えば、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、６１日、６２日、６３日、６４日、６５日、６６日、６７日、６８日、６９日、７０日、７１日、７２日、７３日、７４日、７５日、７６日、７７日、７８日、７９日、８０日、８１日、８２日、８３日、８４日、８５日、８６日、８７日、８８日、８９日、９０日、９１日、９２日、９３日、９４日、９５日、９６日、９７日、９８日、９９日、１００日、１０１日、１０２日、１０３日、１０４日、１０５日、１０６日、１０７日、１０８日、１０９日、１１０日、１１１日、１１２日、１１３日、１１４日、１１５日、１１６日、１１７日、１１８日、１１９日、１２０日、１２１日、１２２日、１２３日、１２４日、１２５日、１２６日、１２７日、１２８日、１２９日、１３０日、１３１日、１３２日、１３３日、１３４日、１３５日、１３６日、１３７日、１３８日、１３９日１４０日、１４１日、１４２日、１４３日、１４４日、１４５日、１４６日、１４７日、１４８日、１４９日、１５０日、１５１日、１５２日、１５３日、１５４日、１５５日、１５６日、１５７日、１５８日、１５９日、１６０日、１６１日、１６２日、１６３日、１６４日、１６５日、１６６日、１６７日、１６８日、１６９日、１７０日、１７１日、１７２日、１７３日、１７４日、１７５日、１７６日、１７７日、１７８日、１７９日、１８０日、１８１日、１８２日、１８３日、１８４日、１８５日、１８６日、１８７日、１８８日、１８９日、１９０日、１９１日、１９２日、１９３日、１９４日、１９５日、１９６日、１９７日、１９８日、１９９日、２００日、２０１日、２０２日、２０３日、２０４日、２０５日、２０６日、２０７日、２０８日、２０９日、２１０日、２１１日、２１２日、２１３日、２１４日、２１５日、２１６日、２１７日、２１８日、２１９日、２２０日、２２１日、２２２日、２２３日、２２４日、２２５日、２２６日、２２７日、２２８日、２２９日、２３０日、２３１日、２３２日、２３３日、２３４日、２３５日、２３６日、２３７日、２３８日、２３９日間、または２４０日間にわたって循環中に存在する。

免疫キラー細胞の刺激
本明細書に記載の通り、本発明は、例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）およびＮＫ細胞を含めた免疫細胞を刺激することができる操作された赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。免疫細胞の刺激により、正常な細胞機能を増強する、または異常な細胞において正常な細胞機能を開始させることができる。好ましい実施形態では、本発明は、免疫キラー細胞を刺激することができる操作された赤血球系細胞を提供する。刺激することができる免疫キラー細胞としては、例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞が挙げられる。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、メモリー様ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。したがって、本発明は、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を用いた刺激の結果生じる細胞の集団も提供する。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞が１つよりも多くの型の免疫キラー細胞を同時に、例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のうちの１つよりも多くを刺激することができることが本発明の特色である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を刺激することができる。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬ、またはこれらの組合せ、例えば、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡのいずれかを含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞により、初代ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の強力な活性化が誘導され、ＮＫ細胞の細胞傷害性が誘導されることは本発明の発見である。

一部の実施形態では、免疫キラー細胞を刺激することとは、免疫キラー細胞の増大を指す。一部の実施形態では、免疫キラー細胞を刺激することとは、免疫キラー細胞の活性化を指す。一部の実施形態では、免疫キラー細胞を刺激することとは、免疫キラー細胞の細胞傷害性の増大を指す。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ｅｘｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞を刺激するのに十分である。他の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ｉｎｖｉｖｏにおいて免疫キラー細胞を刺激するのに十分である。

ＮＫ細胞の活性化および増大
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ＮＫ細胞を活性化することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ＮＫ細胞を増大させることができる。

脱顆粒／細胞傷害性
ＮＫ細胞の決定的機能的特色には、事前感作を伴わずに細胞標的の「自然死滅」を導くそれらの固有の能力が残っている。

したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ＮＫ細胞を活性化および増大させることができ、したがって、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞によって活性化および増大するＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して高い脱顆粒活性を示す。例えば、脱顆粒活性は、ＣＤ１０７ａ発現を例えばフローサイトメトリーによって決定することによって推定することができる。ＣＤ１０７ａの表面発現は、脱顆粒および細胞傷害性顆粒の放出と密接に相関する。ＣＤ１０７ａ発現によって測定される脱顆粒は、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞の細胞傷害活性と相関する。ＣＤ１０７ａ発現を決定することによって脱顆粒活性を決定する方法は当業者に周知である。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるAlter G, Malenfant J M, Altfeld M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 2004; 294: 15-22を参照されたい。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞を使用することによって得られる増大および活性化されたＮＫ細胞は、例えば脱顆粒活性によって測定して、増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％増大した細胞傷害性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約１００％増大した細胞傷害性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約２００％増大した細胞傷害性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、ｅｘｖｉｖｏで増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約３００％増大した細胞傷害性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、ｅｘｖｉｖｏで増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約４００％増大した細胞傷害性を有する。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞を使用することによって増大および活性化されたＮＫ細胞は、増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％増大した脱顆粒活性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約１００％増大した脱顆粒活性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約２００％増大した脱顆粒活性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、ｅｘｖｉｖｏで増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約３００％増大した脱顆粒活性を有する。一部の実施形態では、増大および活性化されたＮＫ細胞は、ｅｘｖｉｖｏで増大させていないＮＫ細胞と比較して少なくとも約４００％増大した脱顆粒活性を有する。

ＮＫ細胞の成熟化および活性化のマーカー
ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６の発現およびＣＤ３の非存在によって表現型的に特徴付けられ、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}集団およびＣＤ５６^ｄｉｍ集団にさらに細分することができる。ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}集団は、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子−ベータ（ＴＮＦ−Ｂ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を含めた免疫調節性サイトカインを産生する（４）。ＣＤ５６^ｄｉｍサブセットは、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}集団の最終分化した後継であり、細胞溶解性機能の発揮に主に関与する。しかし、ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞は、ＮＫｐ４６もしくはＮＫｐ３０活性化受容体を介した細胞誘発後またはＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５の組合せでの刺激後にサイトカイン、具体的にはＩＦＮγを産生し得る。

一部の実施形態では、ＮＫ細胞の成熟化および／または活性化の種々のマーカーを、例えばフローサイトメトリー法を使用して検出することができる。例えば、ＮＫ細胞の古典的なマーカーは、ＣＤ１６とも称される活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩである。

ＮＫ細胞の活性化により、パーフォリンおよび種々のグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒の放出、ならびにサイトカイン産生、最も顕著にインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）が導かれる。さらに、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）などの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属する死誘導性リガンドの細胞表面での発現により、標的細胞上の細胞死受容体（ＤＲ）、すなわち、Ｆａｓ、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−ＲＩ）、およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−ＲＩＩ）への結合によるカスパーゼ酵素的カスケードの活性化も駆動される。

一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体（例えば、表５に列挙されている活性化受容体）を少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％またはそれよりも大きく上方制御する。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体を少なくとも約７５％上方制御する。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体を少なくとも約１００％上方制御する。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体を少なくとも約２００％上方制御する。

別の実施形態によると、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、抑制性受容体またはケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ７）などの少なくとも１つのＮＫ細胞受容体の発現を下方制御する。例えば、ある特定のＮＫ細胞抑制性受容体は、ＫＩＲ（死滅性抑制性受容体またはＣＤ１５８）と称される。抑制性受容体の非限定的な例は、抑制性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＧＬ１８３、ＫＩＲ２ＤＬ１、Ｌｉｒ−１、ＮＫＢ１、およびＮＫＧ２Ａである。

一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体（例えば、表５に列挙されている抑制性受容体）を少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％またはそれよりも大きく下方制御する。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体を少なくとも約７５％下方制御する。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体を少なくとも約１００％下方制御する。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体を少なくとも約２００％下方制御する。

受容体発現の変化は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）比：
ＭＦＩ_Ｘ日目／ＭＦＩ_０日目
（式中、ｘはＮＫ細胞の増大日数である）
によって算出することができる。

Ｘ日目の試料のＭＦＩは０日目よりも高く、ＭＦＩ比は１よりも高くなり、これにより、その受容体における上方制御の相対的な程度が示される。したがって、ＭＦＩ比が例えば１．５であることは、特定の受容体が５０％上方制御されていることを意味する。ＭＦＩ比の算出は当業者に周知である。

種々のＮＫ細胞活性化受容体または抑制性受容体を以下の表５に示す。

表５における略語：ＡＣＴ、活性化；ＢＡＴ−３、ＨＬＡ−Ｂ関連転写物３；Ｈ、ヒト；ＨＡ、赤血球凝集素；ＨＬＡ、ヒト白血球抗原；ＩＮＨＩＢ、抑制性；ＫＩＲ、キラー免疫グロブリン様受容体；ＫＬＲＧ１、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１；ＬＩＬＲ、白血球免疫グロブリン様受容体；Ｍ、マウス；ＭＨＣ、主要組織適合性遺伝子複合体；ＭＵＬＴ−１、マウスＵＬ１６結合性様転写物−１；ＮＣＲ、天然細胞傷害性受容体；ＮＫ、ナチュラルキラー；ＰＶＲ、ポリオウイルス受容体；ＲＡＥ−１、レチノイン酸初期転写物−１。

ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増大
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化および増大させることができる。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

Ｔ細胞の活性化および増大は、本明細書に記載の様々なアッセイによって測定することができる。例えば、測定することができるＴ細胞活性としては、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、およびＴ細胞の細胞傷害活性が挙げられる。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、増殖アッセイによって測定される。

サイトカイン分泌
本発明の操作された赤血球系細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）またはインターロイキン２（ＩＬ−２）などのサイトカインの分泌を決定することによって評価または測定することができる。一部の実施形態では、ＥＬＩＳＡを使用して、サイトカイン分泌、例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌を決定する。ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技法を使用して、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を用いた刺激に応答して所与のサイトカイン（例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ））を分泌するＴ細胞を検出することができる。Ｔ細胞を操作された赤血球系細胞と一緒に、抗ＩＦＮγ抗体でコーティングしたウェル中で培養する。分泌されたＩＦＮγをコーティングされた抗体によって捕捉し、次いで、発色基質とカップリングした第２の抗体を用いて明らかにする。したがって、局所的に分泌されたサイトカイン分子はスポットを形成し、各スポットが１つのＩＦＮγ分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析した試料中のＩＦＮγ分泌細胞の頻度を決定することが可能になる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびグランザイムＢ分泌リンパ球の検出に関しても記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれるKlinman D, Nutman T. Current protocols in immunology. New York, N.Y：John Wiley & Sons, Inc.; 1994. pp. 6.19.1-6.19.8）。

細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析は、培養上清中のサイトカイン含有量を測定するために使用することができるが、サイトカインを実際に分泌するＴ細胞数に関する情報をもたらすものではない。Ｔ細胞をモネンシンまたはブレフェルジンＡなどの分泌阻害剤で処理した場合、Ｔ細胞は、（例えば、本発明の操作された赤血球系細胞で）活性化されると、サイトカインを細胞質内に蓄積する。リンパ球の固定および透過処理後、細胞内サイトカインを血球計算によって数量化することができる。この技法により、産生されるサイトカイン、これらのサイトカインを産生する細胞の型、および細胞当たりの産生されたサイトカインの数量を決定することが可能になる。

細胞傷害性
本発明の操作された赤血球系細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性をアッセイすることによって評価することができる。

Ｔ細胞の細胞傷害活性は、当業者に公知の任意の適切な技法によって評価することができる。例えば、本発明による操作された赤血球系細胞に曝露させたＴ細胞を含む試料を、妥当な期間後に標準の細胞傷害アッセイで細胞傷害活性についてアッセイすることができる。そのようなアッセイとしては、これだけに限定されないが、当技術分野で公知のクロム放出ＣＴＬアッセイおよびＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）蛍光アッセイを挙げることができる。

増殖／増大
本発明の操作された赤血球系細胞のＴ細胞を増大させる能力を、ＣＦＳＥ染色を使用することによって評価することができる。操作された赤血球系細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、がんなどの疾患または障害に罹患している対象由来のもの）と混合する。細胞増大の最初の速度と比較するために、細胞をＣＦＳＥ染色に供して、操作された赤血球系細胞によりＴ細胞の増殖がどのくらいよく誘導されたかを決定する。ＣＦＳＥ染色では、はるかに多くの定量的エンドポイントがもたらされ、増大した細胞の同時の表現型決定が可能になる。刺激後毎日、一定分量の細胞を各培養物から取り出し、フローサイトメトリーによって分析する。ＣＦＳＥ染色により細胞が高度に蛍光を発するようになる。細胞分裂すると蛍光が半減し、したがって、細胞が分裂する回数が多いほど、蛍光が少なくなる。操作された赤血球系細胞のＴ細胞増殖を誘導する能力を、１回、２回、３回など分裂した細胞の数を測定することによって定量化する。特定の時点で最大数の細胞分裂を誘導する操作された赤血球系細胞を最も強力な増大因子とみなす。

これらの操作された赤血球系細胞によりＴ細胞の長期間にわたる成長がどのくらいよく促進されるかを決定するために、細胞成長曲線を作成することができる。これらの実験は前述のＣＦＳＥ実験と同様に設定されるが、ＣＦＳＥは使用しない。２〜３日の培養ごとに、Ｔ細胞をそれぞれの培養物から取り出し、どのくらい多くの細胞が存在するか、および細胞の平均体積を測定するＣｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して計数する。平均細胞体積は、細胞をいつ再刺激するかに関する最良の予測因子である。一般に、Ｔ細胞は、適正に刺激されると、細胞体積が３倍になる。この体積が最初の芽球の約半分よりも大きく減少したら、対数線形増大を維持するためにＴ細胞を再刺激することが必要であり得る（Levine et al., 1996, Science 272: 1939-1943；Levine et al., 1997, J. Immunol. 159: 5921-5930）。各操作された赤血球系細胞により２０集団倍加が誘導されるのにかかる時間を算出する。各操作された赤血球系細胞のこのレベルのＴ細胞増大を誘導することの相対的差異が、特定の操作された赤血球系細胞を評価する重要な判断基準である。

さらに、各操作された赤血球系細胞によって増大させた細胞の表現型を特徴付けて、特定のサブセットが優先的に増大するかどうかを決定することができる。各再刺激の前に、増大したＴ細胞の分化状態を定義するために、増大しているＴ細胞集団の表現型解析をAppay et al.（2002, Nature Med. 8, 379-385、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって提唱されたＣＤ２７およびＣＤ２８定義ならびにSallusto et al.（1999, Nature 401: 708-712、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって提唱されたＣＣＲ７定義を使用して実施する。肉眼的測定を実施して細胞溶解性潜在性を推定するために、パーフォリンおよびグランザイムＢ細胞内染色を使用することができる。

アポトーシスマーカー
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を使用したＴ細胞の刺激、活性化、および増大により、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでアポトーシスから保護するまたは他のやり方で生存を延長するある特定の重要な分子のＴ細胞における発現を増強する。アポトーシスは、通常、Ｔ細胞における特定のシグナルの誘導に起因する。したがって、本発明の操作された赤血球系細胞により、Ｔ細胞の刺激に起因する細胞死からのＴ細胞の保護をもたらすことができる。したがって、成熟前の死から、または、認識されるＴ細胞成長マーカー、例えばＴ細胞生存のために通常必要であるＢｃｌ−ｘＬ、増殖因子、サイトカイン、もしくはリンフォカインなどの非存在もしくは枯渇から、ならびに、Ｆａｓもしくは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）架橋結合に由来するまたはある特定のホルモンもしくはストレスへの曝露によるものからの保護によるＴ細胞成長の増強も本発明に包含される。

タイリング
ある特定の実施形態によると、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドは、重複するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、複数の外因性刺激性ポリペプチド（例えば、１つまたはそれよりも多く、２つまたはそれよりも多く、３つまたはそれよりも多くなど）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞は、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含み、第１の外因性刺激性ポリペプチドと第２の外因性刺激性ポリペプチドは、少なくとも２アミノ酸の重複するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態によると、重複は２アミノ酸から２３アミノ酸の間であり、例えば、重複は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３アミノ酸である。一実施形態によると、外因性刺激性ポリペプチドは８〜１０アミノ酸長であり、重複は６〜８アミノ酸である。別の実施形態によると、外因性刺激性ポリペプチドは１４〜２０アミノ酸長であり、重複は１２〜１８アミノ酸である。ポリペプチドをこのようにタイリングすることにより、より広範な抗原認識がもたらされる。

ポリペプチドをタイリングするための方法は当技術分野で公知であり、例えば、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に基づく増殖アッセイにおいて試験された１２アミノ酸が重複している１５ｍｅｒポリペプチドの開発および試験について記載されているHarding et al.に記載されている（Molecular Cancer Therapeutics, November 2005, Volume 4, Issue 11、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Sticker et al.により、任意のタンパク質における機能的なＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープを同定するためのヒト細胞に基づく方法が記載されている（J Immunol Methods. 2003 Oct 1; 281 (1-2): 95-108、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

修飾
外因性刺激性タンパク質の１つまたは複数は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に特有の翻訳後修飾を有し得る。一部の実施形態では、外因性刺激性タンパク質の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多く）がグリコシル化されているか、リン酸化されているか、またはその両方である。糖タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏにおける検出を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロットで過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）法の改変版を使用して実現することができる。糖タンパク質の細胞内位置決定を当技術分野で公知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して実現することができる。リン酸化を、リン酸化部位特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって評価することができる。

翻訳後修飾はまた、疎水性基とのコンジュゲーション（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、もしくはグリコシルホスファチジルイノシトール付加）、補助因子とのコンジュゲーション（例えば、リポイル化、フラビン部分（例えば、ＦＭＮもしくはＦＡＤ）、ヘムＣ付着、ホスホパンテテイニル化、もしくはレチニリデンシッフ塩基形成）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ハイプシン形成、アシル化（例えば、Ｏ−アシル化、Ｎ−アシル化、もしくはＳ−アシル化）、ホルミル化、アセチル化、アルキル化（例えば、メチル化もしくはエチル化）、アミド化、ブチリル化、ガンマ−カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ＡＤＰ−リボシル化などのヌクレオチド付加、酸化、リン酸エステル（Ｏ結合）もしくはホスホラミデート（Ｎ結合）形成（例えば、リン酸化もしくはアデニリル化）、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオン化、Ｓ−ニトロシル化、サクシニル化、硫酸化、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ネディレーション、またはアミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミド、エリミニル化（eliminylation）、もしくはカルバミル化）、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化（例えば、プロリン、セリン、アラニン、もしくはメチオニンの）も含む。複数の実施形態では、グリコシル化は、糖タンパク質をもたらす、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリシン、セリン、トレオニン、チロシン、またはトリプトファンへのグリコシル基の付加を含む。複数の実施形態では、グリコシル化は、例えば、Ｏ結合グリコシル化またはＮ結合グリコシル化を含む。

上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。上記の態様および実施形態の一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

操作された赤血球系細胞の集団
一態様では、本発明は、本発明の操作された赤血球系細胞を含む細胞集団、例えば、複数の操作された赤血球系細胞または操作された赤血球系細胞の集団を特色とする。種々の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、主に除核細胞、主に有核細胞、または除核細胞と有核細胞の混合物で構成される。そのような細胞集団では、除核細胞は、網状赤血球、赤血球、または網状赤血球と赤血球の混合物を含み得る。一部の実施形態では、除核細胞は網状赤血球である。一部の実施形態では、除核細胞は赤血球である。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、除核細胞から本質的になる。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、主にまたは実質的に除核細胞で構成される。例えば、一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、少なくとも約８０％またはそれよりも多くが除核細胞で構成される。一部の実施形態では、本明細書に提示される集団は、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９、または約１００％が除核細胞で構成される。一部の実施形態では、本明細書に提示される集団は、約８０％よりも多くが除核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％よりも多くが除核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約８０％から約１００％の間が除核細胞、例えば、約８０％から約９５％の間、約８０％から約９０％の間、約８０％から約８５％の間、約８５％から約１００％の間、約８５％から約９５％の間、約８５％から約９０％の間、約９０％から約１００％の間、約９０％から約９５％の間、または約９５％から約１００％の間が除核細胞で構成される。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約２０％未満が有核細胞で構成される。例えば、複数の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１％、約２％、約３％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約２％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約３％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約４％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約５％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１０％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１５％未満が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、０％から２０％の間が有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約０％から２０％の間が有核細胞、例えば、約０％から１９％の間、約０％から１５％の間、約０％から１０％の間、約０％から５％の間、約０％から４％の間、約０％から３％の間、約０％から２％の間が有核細胞、または約５％から２０％の間、約１０％から２０％の間、または約１５％から２０％の間が有核細胞で構成される。

一部の実施形態では、本開示は、２０％未満が有核細胞および少なくとも８０％が除核細胞で構成される、または１５％未満が有核細胞および少なくとも８５％が有核細胞で構成される、または１０％未満が有核細胞および少なくとも９０％が除核細胞で構成される、または５％未満が有核細胞および少なくとも９５％が除核細胞で構成される、本発明の操作された赤血球系細胞の集団を特色とする。一部の実施形態では、本開示は、約０％が有核細胞および約１００％が除核細胞、約１％が有核細胞および約９９％が除核細胞、約２％が有核細胞および約９８％が除核細胞、約３％が有核細胞および約９７％が除核細胞、約４％が有核細胞および約９６％が除核細胞、約５％が有核細胞および約９５％が除核細胞、約６％が有核細胞および約９４％が除核細胞、約７％が有核細胞および約９３％が除核細胞、約８％が有核細胞および約９２％が除核細胞、約９％が有核細胞および約９１％が除核細胞、約１０％が有核細胞および約９０％が除核細胞、約１１％が有核細胞および約８９％が除核細胞、約１２％が有核細胞および約８８％が除核細胞、約１３％が有核細胞および約８７％が除核細胞、約１４％が有核細胞および約８６％が除核細胞、約８５％が有核細胞および約８５％が除核細胞、約１６％が有核細胞および約８４％が除核細胞、約１７％が有核細胞および約８３％が除核細胞、約１８％が有核細胞および約８２％が除核細胞、約１９％が有核細胞および約８１％が除核細胞、または約２０％が有核細胞および約８０％が除核細胞で構成される、本発明の操作された赤血球系細胞の集団を特色とする。

別の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、主にまたは実質的に有核細胞で構成される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、有核細胞から本質的になる。種々の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団内の有核細胞は、赤血球（erythrocyte）（または完全に成熟した赤血球（red blood cell））前駆細胞である。複数の実施形態では、赤血球系前駆細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）、多分化能骨髄系始原細胞、ＣＦＵ−Ｓ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前正赤芽球、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％が有核細胞で構成される。

本発明の操作された赤血球系細胞の調製中に、いくらかの割合の細胞が外因性ポリペプチドとコンジュゲートしない、または外因性ポリペプチドを発現するように形質導入されない可能性があることが理解されよう。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提示される操作された赤血球系細胞の集団は、操作された赤血球系細胞と改変されていない赤血球系細胞の混合物で構成される、すなわち、集団中のいくらかの割合の細胞が外因性ポリペプチドを含まず、提示せず、発現しない。例えば、操作された赤血球系細胞の集団は、種々の実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が操作された赤血球系細胞で構成され得、集団内の残りの赤血球系細胞は操作されていない。複数の実施形態では、操作された赤血球系細胞の単回単位用量は、種々の実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が操作された赤血球系細胞で構成され得、用量中の残りの赤血球系細胞は操作されていない。

ＩＩ．操作された赤血球系細胞を作製する方法
本開示によって、操作された赤血球系細胞、例えば、除核細胞を作製する種々の方法が考慮される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

一態様では、本開示は、キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された除核細胞であって、複数の外因性刺激性ポリペプチドをその表面に含み、複数の外因性刺激性ポリペプチドが、免疫細胞を刺激するのに十分である、除核細胞であり、それぞれが複数の外因性刺激性ポリペプチドのうち１つまたは複数をコードする１つまたは複数の外因性核酸を、有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を、有核赤血球系細胞の除核および複数の外因性刺激性ポリペプチドのうち１つまたは複数の産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、除核細胞を特徴とする。

別の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む、操作された除核赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を、有核赤血球系細胞の除核およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製されるＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む、除核赤血球系細胞を特徴とする。

別の態様では、本開示は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核赤血球系細胞であって、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を、有核赤血球系細胞の除核および４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される４−１ＢＢＬポリペプチドを含む、除核赤血球系細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、操作された除核赤血球系細胞であって、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ＣＤ４８またはＣＤ１５５のいずれかを含む少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドをその表面に含み、少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を、有核赤血球系細胞の除核および少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、除核赤血球系細胞を特徴とする。

別の態様では、本開示は、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合物を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核赤血球系細胞であって、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合物を含む外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を、有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞を、有核赤血球系細胞の除核およびＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合物を含む外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップとを含むプロセスによって作製される、除核赤血球系細胞を特徴とする。

別の態様では、本開示は、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１２ｐ３５融合物、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、４−１ＢＢＬのいずれかを含む少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドをその表面に含み、少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、有核赤血球系細胞の除核および少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で有核赤血球系細胞を培養するステップとを含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞を特徴とする。

一部の実施形態では、操作された除核赤血球系細胞は、１つより多くの（例えば、２つ、３つまたはそれより多くの）外因性刺激性ポリペプチドをその表面に含み、細胞は、１つより多くの外因性刺激性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれより多くの）外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップ、および有核赤血球系細胞を有核赤血球系細胞の除核および１つより多くの外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップによって作製される。

操作された赤血球系細胞の物理的特徴
一部の実施形態では、本明細書において記載される赤血球系細胞は、本明細書において記載される１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの）物理的特徴、例えば、浸透圧脆弱性、細胞の大きさ、ヘモグロビン濃度またはホスファチジルセリン含量を有する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。理論に捉われようとは思わないが、一部の実施形態では、外因性タンパク質を発現する操作された赤血球系細胞、例えば、除核細胞は、野生型、未処置赤血球系細胞と類似する物理的特徴を有する。対照的に、低浸透圧負荷された赤血球系細胞は、異常な物理的特徴、例えば、浸透圧脆弱性の増大、細胞の大きさの変更、ヘモグロビン濃度の低減または細胞膜の外側のリーフレットでのホスファチジルセリンレベルの増大を示すことがある。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、細胞によって保持されず、精製されなかった、または赤血球系細胞の外側に十分に存在しなかった外因性核酸によってコードされた外因性タンパク質を含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、安定剤を欠く組成物中にある。

浸透圧脆弱性
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、外因性ポリペプチドを含まない単離された無培養赤血球系細胞と同じ浸透圧膜脆弱性を実質的に示す。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％または０．５％のＮａＣｌで５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、その全文で参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例５９の方法を使用してアッセイされ得る。

細胞の大きさ
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば、除核細胞は、野生型、未処置赤血球系細胞のようなおおよその直径または体積を有する。一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、約４、５、６、７または８ミクロンの平均直径を有し、必要に応じて、集団の標準偏差は、１、２または３ミクロン未満である。一部の実施形態では、１つまたは複数の赤血球系細胞は、約４〜８、５〜７または約６ミクロンの直径を有する。一部の実施形態では、赤血球系細胞の直径は、約１ミクロン未満、約２０ミクロンより大きい、約１ミクロンから約２０ミクロンの間、約２ミクロンから約２０ミクロンの間、約３ミクロンから約２０ミクロンの間、約４ミクロンから約２０ミクロンの間、約５ミクロンから約２０ミクロンの間、約６ミクロンから約２０ミクロンの間、約５ミクロンから約１５ミクロンの間または約１０ミクロンから約３０ミクロンの間である。細胞直径を、一部の実施形態では、Ａｄｖｉａ１２０血液学システムを使用して測定する。

一部の実施形態では、赤血球系細胞の平均血球体積の体積は、１０ｆＬ、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬより大きい、または１５０ｆＬより大きい。一部の実施形態では、赤血球系細胞の平均血球体積は、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ未満または２００ｆＬ未満である。一部の実施形態では、赤血球系細胞の平均血球体積は、８０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００または４００〜５００フェムトリットル（ｆＬ）の間である。一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、この段落に示される平均血球体積を有し、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５または２ｆＬ未満である。平均血球体積を、一部の実施形態では、血液学的解析機器、例えば、コールターカウンターを使用して測定する。

ヘモグロビン濃度
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば、除核細胞は、野生型、未処置赤血球系細胞に対して類似したヘモグロビン含量を有する。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％より多いまたは１０％より多い胎児ヘモグロビンを含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８または３０ｐｇ、必要に応じて最大約３０ｐｇの総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルを、一部の実施形態では、その全文で参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例３３のＤｒａｂｋｉｎの試薬方法を使用して決定する。

ホスファチジルセリン含量
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば、除核細胞は、野生型、未処置赤血球系細胞とほぼ同一の細胞膜の外側のリーフレットでのホスファチジルセリン含量を有する。ホスファチジルセリンは、主に、野生型、未処置赤球系細胞の細胞膜の内側のリーフレットにあり、低張負荷は、ホスファチジルセリンを外側リーフレットに分布させることができ、そこで、免疫応答を引き起こし得る。一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、ＡｎｎｅｘｉｎＶ染色について陽性である約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、６、５、４、３、２または１％未満の細胞を含む。ホスファチジルセリン露出は、一部の実施形態では、ＰＳと優先的に結合するＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣについての染色および例えば、その全文で参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例５４の方法を使用するフローサイトメトリーによってＦＩＴＣ蛍光を測定することによって評価される。

他の特徴
一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％（および必要に応じて、最大９０または１００％）のＧＰＡについて陽性である細胞を含む。ＧＰＡの存在を、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出する。

一部の実施形態では、赤血球系細胞を含む細胞の集団は、約１０、５、４、３、２または１％未満の棘状赤血球を含む。

一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核される、例えば、本明細書において記載される治療調製物として使用される赤血球系細胞を含む細胞の集団は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より多く除核される。一部の実施形態では、細胞、例えば、赤血球系細胞は、非機能性である、例えば、不活性化されている核を含有する。

赤血球の単離
成熟赤血球は、例えば、セルウォッシャー、連続フローセルセパレーター、密度勾配分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ免疫磁気枯渇（ＭＡＣＳ）またはこれらの組合せなどの種々の方法を使用して単離され得る（例えば、van der Berg et al., Clin. Chem. 33:1081-1082 (1987); Bar-Zvi et al., J. Biol. Chem. 262:17719-17723 (1987); Goodman et al., Exp. Biol. Med. 232:1470-1476 (2007)を参照されたい）。

赤血球は、簡単な遠心分離によって全血から単離できる（例えば、van der Berg et al., Clin. Chem. 33:1081-1082 (1987)を参照されたい）。例えば、ＥＤＴＡ−抗凝固剤処置全血は、４℃、８００×ｇで１０分間遠心分離できる。血小板の豊富な血漿およびバフィーコートを除去し、赤血球を、等張性生理食塩水溶液（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）を用いて３回洗浄する。

あるいは、赤血球を、種々の分離媒体、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｈｙｐａｑｕｅ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｓｉｇｍａｃｅｌｌまたはそれらの組合せなどを用いる密度勾配遠心分離を使用して単離できる。例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７のある体積を、等しい体積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９の上に層にする。等しい体積の等張性生理食塩水溶液（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）で１：１希釈したＥＤＴＡ−抗凝固剤処置全血を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅの上に層にし、試料を、室温、７００×ｇで３０分間遠心分離する。これらの条件下で、顆粒球は、１０７７／１１１９界面に移動し、リンパ球、他の単核細胞および血小板は、血漿／１０７７界面のままであり、赤血球はペレットになる。赤血球を、等張性生理食塩水溶液で２回洗浄する。

あるいは、赤血球を、Ｐｅｒｃｏｌｌ段階勾配を使用する遠心分離によって単離できる（例えば、Bar-Zvi et al., J. Biol. Chem. 262:17719-17723 (1987)を参照されたい）。例えば、新鮮血液を、７５ｍＭクエン酸ナトリウムおよび３８ｍＭクエン酸を含有する抗凝固溶液と混合し、細胞をＨｅｐｅｓ−緩衝食塩水中で短時間洗浄する。白血球および血小板を、α−セルロースおよびＳｉｇｍａｃｅｌｌ（１：１）の混合物を用いる吸着によって除去する。赤血球を、ＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローターにおける２５００ｒｐｍで１０分間の４５／７５％のＰｅｒｃｏｌｌ段階勾配による遠心分離によって網状赤血球および残存する白血球からさらに単離する。赤血球はペレットで回収されるが、網状赤血球バンドは、４５／７５％界面にあり、残存する白血球バンドは、０／４５％界面にある。Ｈｅｐｅｓ−緩衝食塩水での数回の洗浄によって、Ｐｅｒｃｏｌｌを赤血球から除去する。赤血球の単離のための密度勾配を作製するために使用できる他の材料として、ＯＰＴＩＰＲＥＰ、水中のイオジキサノールの６０％溶液（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ製、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）が挙げられる。

赤血球は、例えば、フローサイトメトリーを使用して網状赤血球から分離できる（例えば、Goodman el al., Exp. Biol. Med. 232:1470-1476 (2007)を参照されたい）。この場合には、細胞を血漿から分離するために全血を遠心分離する（５５０×ｇ、２０分、２５℃）。細胞ペレットを、リン酸緩衝食塩水溶液に再懸濁し、赤血球を白血球から分離するために、例えば、遠心分離（４００×ｇ、３０分、２５℃）によってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（１．０７７密度）でさらに分画する。得られた細胞ペレットを、１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩに再懸濁し、例えば、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）などのＦＡＣＳ機器でサイズおよび粒度に基づいて選別する。

赤血球は、免疫磁気性枯渇によって単離できる（例えば、Goodman, el al., (2007) Exp. Biol. Med. 232:1470-1476を参照されたい）。この場合には、非赤血球を排除するために細胞種特異的抗体を有する磁気ビーズを使用する。例えば、赤血球は、本明細書において記載されるような密度勾配と、それに続く、任意の残存する網状赤血球の免疫磁気性枯渇を使用して、赤血球を他の血液成分の大部分から単離する。細胞を、ヒト抗体血清を用いて、２５℃で２０分間前処置し、次いで、網状赤血球特異的抗原、例えば、ＣＤ７１およびＣＤ３６などに対する抗体を用いて処置する。抗体は、磁気ビーズに直接付着されてもよく、または例えば、抗ＰＥ抗体を有する磁気ビーズが反応するＰＥにコンジュゲートしてもよい。抗体−磁気ビーズ複合体は、例えば、赤血球集団から残存する網状赤血球を選択的に抽出できる。

赤血球はまた、アフェレーシスを使用して単離できる。アフェレーシスのプロセスは、患者またはドナーからの全血の回収、遠心分離または細胞選別を使用する血液成分の分離、１つまたは複数の分離された部分の除去および残存する成分を患者またはドナーへ注入して戻すことを含む。例えば、Ｂａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）製のＡｍｉｃｕｓおよびＡｌｙｘ機器、ＧａｍｂｒｏＢＣＴ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）製のＴｒｉｍａＡｃｃｅｌ機器およびＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）製のＭＣＳ＋９０００機器など、この目的のためにいくつかの機器が現在使用されている。適当な程度の細胞純度を達成するためにさらなる精製方法が必要となる場合がある。

網状赤血球は、未熟赤血球であり、ヒト身体において赤血球のおよそ１％を構成する。網状赤血球は、骨髄において発達し、成熟する。網状赤血球は、ひとたび循環中に放出されると、成熟赤血球への最終分化を迅速に起こす。網状赤血球は、成熟赤血球と同様に、細胞核を有さない。

網状赤血球成熟につれて細胞密度の差に基づいてさまざまな齢の網状赤血球が末梢血から単離され得る。網状赤血球は、種々の密度勾配による分画遠心分離を使用して末梢血から単離され得る。例えば、網状赤血球を単離するためにＰｅｒｃｏｌｌ勾配を使用できる（例えば、Noble el al., Blood 74:475-481 (1989)を参照されたい）。密度１．０９６および１．０５８ｇ／ｍｌの滅菌等張性Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を１０ｍＭトリエタノールアミン、１１７ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルコースおよび１．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の最終濃度に希釈することによって作製する。これらの溶液は、２９５から３１０ｍＯｓｍの間の浸透圧を有する。第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０９６）の例えば５ミリリットルを、滅菌１５ｍｌコニカル遠沈管に添加する。第２のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０５８）の例えば２ミリリットルを、より高密度の第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液の上に層にする。２〜４ミリリットルの全血を、管の頂部に層にする。スイングアウトチューブホルダーを備えた冷却遠心機で、管を２５０×ｇで３０分間遠心分離する。網状赤血球および一部の白血球は、２つのＰｅｒｃｏｌｌ層の間の界面に移動する。界面の細胞を、新規管に移し、５ｍＭグルコース、０．０３ｍＭナトリウムアジドおよび１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。残存する白血球を、サイズ排除カラムでのＰＢＳでのクロマトグラフィーによって除去する。

あるいは、網状赤血球を、免疫磁気性分離アプローチを使用するポジティブ選択によって単離できる（例えば、Brun et al., Blood 76:2397-2403 (1990)を参照されたい）。このアプローチは、成熟前の赤血球に対して、網状赤血球の表面で発現される多数のトランスフェリン受容体を利用する。混合血液細胞集団から網状赤血球を選択的に単離するために、トランスフェリン受容体に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用できる。ヒトを含む種々の哺乳動物種のトランスフェリン受容体に対する抗体は、市販の供給源（例えば、ＡｆｆｉｎｉｔｙＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）から入手可能である。トランスフェリン抗体を、磁気ビーズに直接連結してもよい。あるいは、トランスフェリン抗体を、二次抗体を介して磁気ビーズに間接的に連結してもよい。例えば、ヒトトランスフェリンに対するマウスモノクローナル抗体１０Ｄ２（ＡｆｆｉｎｉｔｙＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を用いてコーティングされた免疫磁気ビーズと混合できる。次いで、免疫磁気ビーズを、白血球が枯渇した赤血球画分とともにインキュベートする。ビーズおよび赤血球を、２２℃で穏やかに混合しながら６０〜９０分間インキュベートし、それに続いて、磁場を使用して網状赤血球が付着しているビーズを単離する。単離された網状赤血球は、例えば、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して磁気ビーズから回収できる。あるいは、網状赤血球を、本明細書において記載される方法を使用するＣＤ３４＋造血幹細胞のｉｎｖｉｔｒｏ成長および成熟から単離できる。

最終分化した除核赤血球は、そのＤＮＡ含量に基づいて他の細胞から分離できる。限定されない例では、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．）などの生体ＤＮＡ色素を用いてまず標識する。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、二本鎖ＤＮＡに結合される青色蛍光を発光する細胞透過性核対比染色である。培養中の未分化前駆体細胞、マクロファージまたは他の有核細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって染色されるが、除核赤血球はＨｏｅｃｈｓｔ陰性である。Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞を、蛍光活性化セルソーターまたは他の細胞選別技術を使用することによって除核赤血球から分離できる。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を、透析または他の適した方法によって単離された赤血球から除去できる。

本明細書において記載されるポリペプチドのためのビヒクル
本明細書における多数の実施形態において、１つまたは複数の（例えば、２つまたはそれより多い）外因性ポリペプチドは、除核赤血球系細胞上または除核赤血球系細胞中に位置しているが、本明細書において記載される任意のポリペプチドまたは外因性ポリペプチドの組合せはまた、別のビヒクル上または別のビヒクル中に位置し得ることは理解される。ビヒクルは、例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはエキソソームを含み得る。例えば、一部の態様では、本開示は、例えば、その表面上に、本明細書において記載される１つまたは複数の物質を含むビヒクル（例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはエキソソーム）を提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数の物質は、表１または８〜１６のいずれかのポリペプチドから選択される物質もしくはその断片もしくはバリアントまたはそれに対する抗体分子を含む。一部の実施形態では、ビヒクルは、本明細書において記載される２つまたはそれより多い物質、例えば、本明細書において記載される物質の任意の対を含む。

一態様では、本明細書において記載される１つまたは複数のポリペプチドは、非細胞送達ビヒクルの表面にロードされる、付着される（例えば、固定またはコンジュゲートされる）および／またはそれに封入される。非細胞性送達ビヒクルは、例えば、ナノ脂質ゲル、ポリマー粒子、アガロース粒子、ラテックス粒子、シリカ粒子、リポソームまたは多重ラメラ小胞であり得る。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、直径約１ｎｍ〜約９００ｎｍのナノ粒子を含むまたはからなる。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、約０．１〜約２０ミクロン（約０．５ミクロン〜約１０ミクロン、例えば、約５ミクロンまたはそれより小さい（例えば、約２．５〜約５ミクロン）など）の平均直径を含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、約１μｍ〜約１０μｍの平均直径を含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、生分解性ポリマーを含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、天然ポリマーを含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、合成ポリマーを含む。代表的なポリマーとして、これだけに限定されないが、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（エステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびＤ，Ｌ−乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）およびそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、アガロース、ラテックスまたはポリスチレンを含む。本明細書において記載されるポリペプチドのうち１つまたは複数は、当技術分野で公知の標準方法を使用して非細胞送達ビヒクルにコンジュゲートされ得る（例えば、Ulbrich et al. (2016) Chem Rev. 116(9): 5338-431を参照されたい）。コンジュゲーションは、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、非細胞送達ビヒクルがリポソームである実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を介してリポソームに付着され得る。ポリペプチドのリポソームへのコンジュゲーションはまた、例えば、チオールとマレイミド基の反応によるチオエステル結合を含み得る。ポリペプチドの非細胞送達ビヒクルへの付着のためのスルフヒドリル基を作出するために、架橋剤が使用され得る（例えば、Paszko and Senge (2012) Curr. Med. Chem. 19(31): 5239-77を参照されたい）。一部の実施形態では、任意の本明細書において提供される治療方法において、本明細書において記載されるポリペプチドのうち１つまたは複数を含む非細胞送達ビヒクルが使用され得る。

細胞の不均一な集団
本明細書における多数の実施形態において、１つまたは複数の（例えば、２つまたはそれより多い）外因性ポリペプチドは、単細胞上または単細胞中に位置しているが、本明細書において記載される任意のポリペプチドまたはポリペプチドの組合せはまた、複数の細胞上に位置し得ることは理解される。例えば、一部の態様では、本開示は、複数のうち第１の細胞が、第１の外因性ポリペプチドを含み、複数のうち第２の細胞が、第２の外因性ポリペプチドを含む、複数の赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、複数の細胞は、２つまたはそれより多い本明細書において記載されるポリペプチド、例えば、本明細書において記載されるポリペプチドの任意の対を含む。一部の実施形態では、集団中の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％または１％未満の細胞は、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドの両方を含む。

膜に被包された細胞
一部の実施形態では、本明細書において記載される除核赤血球系細胞または他のビヒクルは、膜、例えば、半透膜に被包される。一部の実施形態では、膜は、多糖、例えば、アニオン性多糖アルギン酸塩を含む。一部の実施形態では、半透膜は、細胞が通過することを可能にしないが、小分子または高分子、例えば、代謝産物、タンパク質もしくはＤＮＡの通過を可能にする。一部の実施形態では、膜は、その全文で参照により本明細書に組み込まれる、Lienert et al., "Synthetic biology in mammalian cells: next generation research tools and therapeutics" Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 95-107 (2014)に記載されるものである。理論に捉われようとは思わないが、一部の実施形態では、膜は、細胞を免疫系から遮蔽し、および／または複数の細胞を近接して維持し、互いにまたは互いの生成物との相互作用を促進する。

赤血球系前駆細胞
操作された赤血球系前駆細胞ならびに操作された赤血球系前駆細胞、網状赤血球および赤血球を作製する方法が、本明細書において提供される。

多能性幹細胞は、赤血球生成のプロセスによって赤血球を生じさせる。幹細胞は、小さいリンパ球のようであり、赤血球の機能的能力を欠く。幹細胞は、無限分裂の能力、成熟細胞が欠くものを有する。幹細胞から生じる娘細胞の一部は、世代および時間にわたる赤血球の特性を獲得する。骨髄における赤血球系細胞のほとんどは、別個の形態学を有するが、赤血球成熟への関与は、赤血球系統に特有の形態学的特色を獲得していなかった細胞においてさえ見られる。これらの細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで形成するコロニーの種類によって認識される。２つのこのような細胞が認識される。バースト形成性単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）は、幹細胞から生じ、コロニー形成単位−赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）を生じさせる。ＣＦＵ−Ｅは、前正赤芽球、別個の形態学を有する赤血球系細胞の最も未熟なものを生じさせる。ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅは、骨髄細胞の極めて小さい部分を形成する。５種の赤血球前駆体の形態学は、Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｙ染色を用いて染色された骨髄において識別可能である。最も未熟から最も成熟までの５段階は、前赤芽球、好塩基性正赤芽球（初期赤芽球）、多染性正赤芽球（中期赤芽球）、正染性正赤芽球（後期赤芽球）および網状赤血球である。ＢＦＵ−Ｅ（バースト形成単位−赤血球）、ＣＦＵ−Ｅ（赤血球コロニー形成単位）、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球は、系統制限される。

以下の表６には、赤血球系前駆細胞および赤血球の形態学的特色をまとめられている。

正常ヒト赤血球は、ＣＤ３６、単球、血小板および内皮細胞の接着分子を発現する（van Schravendijk MR et al., Blood. 1992 Oct 15;80(8):2105-14）。したがって、一部の実施形態では、ヒト赤血球を同定するために抗ＣＤ３６抗体が使用され得る。

任意の種類の、赤血球に分化可能である当技術分野で公知の細胞、すなわち、任意の赤血球系前駆細胞が、操作された赤血球系前駆細胞を生成するように本明細書において記載される方法に従って修飾され得る。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される方法に従って修飾された赤血球系前駆細胞は、赤血球に分化するプロセスにある細胞である、すなわち、細胞は、哺乳動物赤血球生成の間に存在すると知られている種類のものである。例えば、細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）またはＣＤ３４＋細胞、多能性骨髄系始原細胞、ＣＦＵ−Ｓ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球であり得る。本明細書において提供される修飾された赤血球系前駆細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して、すなわち、赤血球生成を促進すると知られている分子、例えば、本明細書において以下に記載されるＳＣＦ、エリスロポエチン、ＩＬ−３および／またはＧＭ−ＣＳＦを使用して、ｉｎｖｉｔｒｏで操作された網状赤血球または赤血球に分化し得る。あるいは、修飾された赤血球系前駆細胞は、本発明の組成物中で提供され、ｉｎｖｉｖｏで対象への投与の際に赤血球に分化可能である。

一部の実施形態では、赤血球系前駆細胞、例えば、造血幹細胞は、Ｏ陰性ドナーに由来する。一部の実施形態では、赤血球系前駆細胞は、Ａおよび／またはＢ抗原を欠く（例えば、発現もコードもしない）。

培養
本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製するための供給源は、循環赤血球系細胞を含む。適した細胞供給源は、本明細書に記載の通り対象から、必要に応じて、培養および分化された、不死化赤血球細胞系に由来する、または人工多能性幹細胞に由来する、患者由来造血または赤血球系始原細胞から単離できる。細胞培養技術を使用して赤血球を作製する方法は、当技術分野で周知である、例えば、Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071, Huang et al., Mol Ther 2013, epub ahead of print September 3またはKurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890。プロトコールは、得られる細胞が特徴付けられる、増殖因子、出発細胞系、培養期間および形態学的形質に従って変わる。ドナー輸血の代わりとなり得る血液産生のための培養システムもまた、確立されている（Fibach et al. 1989 Blood 73:100）。最近、ＣＤ３４＋細胞が網状赤血球段階に分化し、それに続いて、ヒト対象への輸血に成功した（Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071）。

赤血球系細胞および操作された赤血球系細胞の培養方法が本明細書において提供される。赤血球系細胞は、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071）、人工多能性幹細胞（Kurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890）および胚幹細胞（Hirose et al. 2013 Stem Cell Reports 1:499）を含む造血前駆細胞から培養できる。前駆細胞を拡大および分化させるのに適している成長および分化因子のカクテルは、当技術分野で公知である。適した拡大および分化因子の例として、これだけに限定されないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ２、ＰＩＸＹ３２１および白血病抑制因子（ＬＩＦ）が挙げられる。

赤血球系細胞は、マルチステップ培養プロセスで前駆細胞を規定の因子と接触させることによって、ＣＤ３４＋細胞などの造血前駆細胞から培養できる。例えば、赤血球系細胞は、３ステッププロセスで造血前駆細胞から培養できる。

第１のステップは、培養中の細胞を、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）および０．１〜１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３（ＩＬ−３）と接触させることを含み得る。第１のステップは、必要に応じて、培養中の細胞を、核ホルモン受容体、例えば、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体またはプレグナンｘ受容体と結合し、活性化するリガンドと接触させることを含む。これらの受容体のリガンドとして、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのデキサメタゾンまたは１０ｎＭ〜１００μＭのヒドロコルチゾンなどの副腎皮質ステロイド、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのベータ−エストラジオールなどのエストロゲン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭのヒドロキシプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭの５ａ−ジヒドロプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭの１１−デオキシコルチコステロンなどのプロゲストゲンまたは例えば、１０ｎＭ〜１００μＭの酢酸クロルマジノンなどの合成プロゲスチン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのテストステロン、１０ｎＭ〜１００μＭのジヒドロテストステロンもしくは１０ｎＭ〜１００μＭのアンドロステンジオンなどのアンドロゲンまたは例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのリファンピシン、１０ｎＭ〜１００のハイパーフォリン、１０ｎＭ〜１００μＭのセントジョーンズワート（ヒペリシン）などのプレグナンｘ受容体リガンドまたは例えば、１０ｎＭ〜１００のトコフェロールなどのビタミンＥ様分子などが挙げられる。第１のステップはまた、必要に応じて、培養中の細胞を、インスリン様分子、例えば、１〜５０μ．ｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）または１〜５０μｇ／ｍＬの機械的増殖因子などと接触させることを含み得る。第１のステップは、必要に応じて、培養中の細胞を、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることをさらに含み得る。

第１のステップは、必要に応じて、培養中の細胞を、１種または複数のインターロイキン（ＩＬ）または増殖因子、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−Ｂ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−Ａ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）およびＦｌｔ３リガンドなどと接触させることを含み得る。各インターロイキンまたは増殖因子は、通常、０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。第１のステップはまた、必要に応じて、培養中の細胞を、血清タンパク質または非タンパク質分子、例えば、ウシ胎児血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラズマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）またはヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）などと接触させることを含み得る。

第２のステップは、培養中の細胞を、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）および１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と接触させることを含み得る。第２のステップはまた、必要に応じて、培養中の細胞を、インスリン様分子、例えば、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）または１〜５０μｇ／ｍＬの機械的増殖因子などと接触させることを含み得る。第２のステップは、必要に応じて、培養中の細胞を、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることをさらに含み得る。第２はまた、必要に応じて、培養中の細胞を、血清タンパク質または非タンパク質分子、例えば、ウシ胎児血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラズマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）またはヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）などと接触させることを含み得る。

第３のステップは、培養中の細胞を、１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と接触させることを含み得る。第３のステップは、必要に応じて、培養中の細胞を、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）と接触させることを含み得る。第３のステップは、必要に応じて、培養中の細胞を、インスリン様分子、例えば、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）または１〜５０μｇ／ｍＬの機械的増殖因子などと接触させることをさらに含み得る。第３のステップはまた、必要に応じて、培養中の細胞を、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることを含み得る。第３のステップはまた、必要に応じて、培養中の細胞を、血清タンパク質または非タンパク質分子、例えば、ウシ胎児血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラズマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）またはヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）などと接触させることを含み得る。

一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドを提示する除核細胞を含む操作された赤血球系細胞を拡大および分化させる方法は、操作された赤血球系細胞を、骨髄増殖性受容体（ｍｐｌ）リガンドを含む培地中で培養することを含まない。

培養プロセスは、必要に応じて、当技術分野で公知の方法によって、細胞を、１つまたは複数の遺伝子を活性化またはノックダウンする分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ホルモンまたは小分子と接触させることを含み得る。標的遺伝子は、例えば、これだけに限定されないが、例えば、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＣＭｙｃ、ｈＴＥＲＴ、ｐ５３、ＥＰＯ、ＳＣＦ、インスリン、ＥＰＯ−Ｒ、ＳＣＦ−Ｒ、トランスフェリン−Ｒ、インスリン−Ｒを含む、転写因子、増殖因子または増殖因子受容体をコードする遺伝子を含み得る。

一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、３つの別個の分化段階で、合計２２日間、変動する量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦおよびエリスロポエチンを含有する培養物中に入れる。

一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、３つの別個の分化段階で、合計１４日間、変動する量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦおよびトロンボポエチンを含有する培養物中に入れる。

一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、３つの別個の分化段階で、合計１５日間、変動する量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦおよびＧＣＳＦを含有する培養物中に入れる。

一部の実施形態では、赤血球系細胞を、少なくとも１００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００または１００，０００倍（必要に応じて、最大１００，０００、２００，０００または５００，０００倍）拡大する。細胞数を、一部の実施形態では、自動細胞計数機を使用して測定する。

一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９８％（必要に応じて、最大約８０、９０または１００％）の操作された赤血球系細胞を含む。除核を、一部の実施形態では、核染色を使用するＦＡＣＳによって測定する。一部の実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０％（必要に応じて、最大約７０、８０、９０または１００％）の赤血球系細胞は、外因性ポリペプチドのうち１つまたは複数（例えば、２、３、４つまたはそれより多く）を含む。ポリペプチドの発現を、一部の実施形態では、ポリペプチドに対して標識された抗体を使用して赤血球系細胞によって測定する。一部の実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０％（必要に応じて、最大約７０、８０、９０または１００％）の赤血球系細胞は、除核されており、外因性ポリペプチドのうち１つまたは複数（例えば、２、３、４つまたはそれより多く）を含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、約１×１０^９〜２×１０^９、２×１０^９〜５×１０^９、５×１０^９〜１×１０^１０、１×１０^１０〜２×１０^１０、２×１０^１０〜５×１０^１０、５×１０^１０〜１×１０^１１、１×１０^１１〜２×１０^１１、２×１０^１１〜５×１０^１１、５×１０^１１〜１×１０^１２、１×１０^１２〜２×１０^１２、２×１０^１２〜５×１０^１２または５×１０^１２〜１×１０^１３個の細胞を含む。

一部の実施形態では、培養中に、ｉｎｖｉｔｒｏで赤血球系始原細胞、例えば、造血幹細胞を部分的にのみ分化させ、ｉｎｖｉｖｏで対象へ導入された際に、さらなる分化、例えば、網状赤血球または完全に成熟した赤血球への分化が生じることを可能にすることは、望ましいものであり得る（例えば、Neildez-Nguyen et al., Nature Biotech. 20:467-472 (2002)を参照されたい）。本発明の種々の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏでの成熟および／または分化を、所望の任意の段階で停止できることは理解されよう。例えば、本明細書において別の場所に記載の通り、例えば、インターロイキン３、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、トランスフェリンおよびインスリン増殖因子を含む種々の因子を含有する、例えば、培地中で、単離されたＣＤ３４＋造血幹細胞を、分化の所望の段階に到達するようにｉｎｖｉｔｒｏで拡大できる。得られた操作された赤血球系細胞を、ＣＤ３６およびＧＰＡの表面発現ならびに個々の所望の細胞種に特異的なその他の特徴によって特徴付けることができ、成熟赤血球への最終分化が生じることが許容される対象に注入できる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、赤血球系始原細胞から、除核の前であるがそれを含まない成熟の任意の段階に部分的に拡大し、したがって、有核細胞、例えば、赤血球系前駆細胞のままである。ある特定の実施形態では、得られる細胞は、有核化され、赤血球系統制限されている。ある特定の実施形態では、得られる細胞は、多能性骨髄系始原細胞、ＣＦＵ−Ｓ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球から選択される。除核を含む最終分化ステップは、対象への操作された赤血球系細胞の投与後にのみ生じる、すなわち、このような実施形態では、除核ステップは、ｉｎｖｉｖｏで生じる。別の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、除核の段階を通して、例えば、網状赤血球になるようにｉｎｖｉｔｒｏで拡大および分化させる。操作された赤血球系細胞が網状赤血球（reticuloyctes）の段階へ分化されるこのような実施形態では、赤血球になる最終分化ステップは、対象へ操作された赤血球系細胞を投与した後にのみ生じる、すなわち、最終分化ステップは、ｉｎｖｉｖｏで生じる。別の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、最終分化段階を通して、赤血球になるようにｉｎｖｉｔｒｏ拡大および分化させる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、赤血球系始原細胞、例えば、造血幹細胞から、種々の系統の造血細胞になる、例えば、血小板になるように拡大および分化させることができることはさらに認識されよう。種々の系統の造血細胞、例えば、血小板を成熟および分化させる方法は、当業者には周知である。本明細書に記載の通り、外因性ポリペプチドを発現するこのような操作された血小板は、本発明によって包含されると考えられる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、赤血球系始原細胞、例えば、造血幹細胞から、種々の系統の造血細胞になる、例えば、血小板になるように拡大および分化させることができることはさらに認識されよう。種々の系統の造血細胞、例えば、血小板を成熟および分化させる方法は、当業者には周知である。一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、外因性ポリペプチドを発現するこのような操作された血小板は、本発明によって包含されると考えられる。

一部の実施形態では、本明細書において提供される除核細胞は、血小板である。ｉｎｖｉｔｒｏで血小板を生産する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Wang and Zheng (2016) Springerplus 5(1): 787および米国特許第９，５７４，１７８号を参照のこと）。外因性ポリペプチドを含む血小板を生産する方法は、例えば、各々、その全文で参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／０７３５８７およびＷＯ２０１５／１５３１０２に記載されている。血小板産生は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）とその細胞性受容体ＴＰＯＲ／ＭＰＵｃ−ＭＰＬの間の相互作用によって誘導されるシグナル伝達機序によって幾分か調節される。さらに、複数のサイトカイン（例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｋｉｔリガンドおよびインターフェロン）が、血小板減少性（thrombocytopoietic）活性を有すると示されている。

一部の実施形態では、血小板を造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、人工多能性幹細胞または胚幹細胞から作製する。一部の実施形態では、マルチステップ培養プロセスにおいて前駆細胞を規定の因子と接触させることによって、血小板を産生する。一部の実施形態では、マルチステップ培養プロセスは、造血前駆細胞の集団を、巨核球前駆細胞の集団を産生するのに適した条件下で培養することおよび巨核球前駆細胞の集団を血小板を産生するのに適した条件下で培養することを含む。前駆細胞を拡大および分化させ、血小板を産生するのに適している成長および分化因子のカクテルは、当技術分野で公知である。適した拡大および分化因子の例として、これだけに限定されないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド（ＦＬ）、ＴＰＯ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＩＬ−９が挙げられる。例えば、一部の実施形態では、血小板は、ＣＤ３４^＋ＨＳＣを２〜４×１０^４個細胞／ｍＬで血清不含培地に播種することおよび培養４日目に等体積の培地を添加することによって培地をリフレッシュすることによって産生できる。培養６日目に、細胞を計数し、解析する：１．５×１０^５個細胞を洗浄し、１ｍＬのＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（７．５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−９（１３．５ｎｇ／ｍＬ）を含むサイトカインカクテルを補給した同一培地中に入れて、巨核球分化を誘導する。培養１０日目に、懸濁培養物の約１／４〜約１／２を新鮮培地と置換する。細胞を加湿雰囲気（１０％ＣＯ_２）中、最初の６培養日間を３９℃で、最後の８培養日間を３７℃で培養する。トリパンブルー染色後に生存有核細胞を血球算定器を用いて計数する。培養中の血小板の分化状態は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例４４および４５に記載されるように、フローサイトメトリーまたは定量的ＰＣＲによって評価できる。

その他の特徴
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（例えば、操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞または操作された赤血球系細胞の集団または操作された除核細胞は、内因性ＧＰＡ（Ｃ２３５ａ）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）またはインテグリンアルファ４（Ｃ４９ｄ）のうち１つまたは複数（例えば、すべて）を含む。これらのタンパク質は、例えば、その全文で参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開番号ＷＯ２０１８／００９８３８の実施例１０に記載の通り測定できる。ＧＰＡ陽性細胞およびＢａｎｄ３陽性細胞のパーセンテージは、通常、赤血球系細胞の成熟期間を増大し、インテグリンアルファ４陽性のパーセンテージは、通常、成熟を通じて高いままである。

一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％（必要に応じて、最大９０または１００％）のＧＰＡについて陽性である細胞を含む。ＧＰＡの存在を、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出する。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＧＰＡ^＋（すなわち、ＣＤ２３５ａ^＋）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約５０％から約１００％（例えば、約６０％から約１００％、約６５％から約１００％、約７０％から約１００％、約７５％から約１００％、約８０％から約１００％、約８５％から約１００％、約９０％から約１００％、約９５％から約１００％、約７５％から約９９％、約８０％から約９９％、約８５％から約９９％、約９０％から約９９％、約９５％から約９９％、約７５％から約９５％、約８０％から約９５％、約８５％から約９５％、約９０％から約９５％、約９５％から約９８％）の間のＧＰＡ^＋細胞を含む。ＧＰＡの存在を、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出する。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ７１^＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％）のＣＤ７１^＋細胞を含む。ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ２３３^＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％）のＣＤ２３３^＋細胞を含む。ＣＤ２３３（バンド３）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ４７^＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％）のＣＤ４７^＋細胞を含む。ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ３６⁻（ＣＤ３６陰性）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％）のＣＤ３６⁻（ＣＤ３６陰性）細胞を含む。ＣＤ３６の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ３４⁻（ＣＤ３４陰性）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％）のＣＤ３４⁻（ＣＤ３４陰性）細胞を含む。ＣＤ３４の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ２３５ａ^＋／ＣＤ４７^＋／ＣＤ２３３^＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％）のＣＤ２３５ａ^＋／ＣＤ４７^＋／ＣＤ２３３^＋細胞を含む。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ２３５ａ^＋／ＣＤ４７^＋／ＣＤ２３３^＋／ＣＤ３４⁻／ＣＤ３６⁻細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％）のＣＤ２３５ａ^＋／ＣＤ４７^＋／ＣＤ２３３^＋／ＣＤ３４⁻／ＣＤ３６⁻細胞を含む。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または赤血球系細胞を含む操作された除核細胞の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の棘状赤血球を含む。

一部の実施形態では、赤血球系細胞を含む操作された赤血球系細胞（例えば、本明細書において記載されるような人工抗原提示細胞）の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の棘状赤血球を含む。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満のピレノサイトを含む。

一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核され、例えば、本明細書において記載される治療調製物として使用される赤血球系細胞を含む細胞の集団は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より多く除核される。一部の実施形態では、細胞、例えば、赤血球系細胞は、非機能性である、例えば、不活性化されている核を含有する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

外因性刺激性ポリペプチドの発現
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば、本明細書において記載される除核細胞は、適した単離細胞、例えば、赤血球系細胞、網状赤血球、赤血球系前駆細胞、血小板または血小板前駆体を、本開示の刺激性ポリペプチド（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＦＮα、４−１ＢＢＬ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＰＶＲ／ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＳ、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、ＩｇＧ、ＵＬＢＰ、ＭＩＣ、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＴＢＡ、ＡＩＣＬおよびＩＧＦ−１）をコードする外因性核酸と接触させることによって作製される。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＤＮＡによってコードされ、これが、有核赤血球系前駆細胞または有核血小板前駆体細胞と接触される。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＲＮＡによってコードされ、これが、血小板、有核（nucleate）赤血球系細胞、有核血小板前駆体細胞または網状赤血球と接触される。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、一次血小板、有核赤血球系細胞、有核血小板前駆体細胞、網状赤血球または赤血球と接触される。

外因性刺激性ポリペプチドは、電気穿孔、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルスによる形質導入、機械的膜破壊もしくはその他の方法によって赤血球系細胞中に導入された導入遺伝子から発現できる；電気穿孔、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルスによる形質導入、機械的膜破壊もしくはその他の方法によって細胞中に導入されるｍＲＮＡから発現される外因性ポリペプチド；外部因子、例えば、転写アクチベーター、転写レプレッサーもしくは分泌経路エンハンサーの導入によって天然遺伝子座から過剰発現される外因性ポリペプチド；および／または産生細胞もしくはその他の外部系から合成、抽出または産生され、赤血球系細胞中に組み込まれるポリペプチド。

外因性刺激性ポリペプチド（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＦＮα、４−１ＢＢＬ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＰＶＲ／ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＳ、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、ＩｇＧ、ＵＬＢＰ、ＭＩＣ、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＴＢＡ、ＡＩＣＬおよびＩＧＦ−１）を、遺伝子の単一もしくは複数のコピーのトランスフェクション、ウイルスを用いる形質導入またはＤＮＡもしくはＲＮＡの存在下での電気穿孔によって導入できる。哺乳動物細胞において外因性タンパク質を発現させる方法は、当技術分野で周知である。例えば、造血細胞における外因性因子ＩＸの発現は、ＣＤ３４＋前駆細胞のウイルスによる形質導入によって誘導される、Chang et al., Nat Biotechnol 2006, 24:1017を参照されたい。

一部の実施形態では、１つより多い刺激性ポリペプチド（例えば、２つまたはそれより多い）がある場合には、刺激性ポリペプチドは、単一核酸、例えば、単一ベクター中にコードされる。実施形態では、単一ベクターは、各遺伝子について別個のプロモーターを有し、中央にプロテアーゼ切断部位を有する単一ポリペプチドに最初に転写される２つのタンパク質を有し、その結果、その後のタンパク質分解プロセシングが、２つのタンパク質または任意のその他の適した立体配置をもたらす。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いポリペプチドは、２つまたはそれより多い核酸中にコードされる、例えば、各ベクターは、ポリペプチドうちの１つをコードする。

外因性ポリペプチドを産生するためのＤＮＡ発現ベクターまたはｍＲＮＡなどの核酸を、本明細書に記載の外因性ポリペプチドを産生するのに適している前駆細胞（例えば、赤血球系細胞前駆体または血小板前駆体などの）の中に導入できる。前駆細胞は、元の供給源から単離できる、または本明細書において提供される通り、日常的な組換え技術によって拡大された前駆細胞集団から得ることができる。一部の場合には、発現ベクターを、当技術分野で公知の方法による相同または非相同組換えによって細胞のゲノム中に組み込むことができるように設計できる。

一部の実施形態では、造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードする核酸（単数または複数）と接触させ、細胞が培養において拡大および分化することを可能にする。

一部の実施形態によれば、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを、トランスフェクションのためにプラスミド構築物中にクローニングすることができる。本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を産生するのに適している細胞中に発現ベクターを移すための方法として、これだけに限定されないが、ウイルス媒介性遺伝子導入、リポソーム媒介性トランスファー、形質転換、遺伝子銃、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスならびにレトロウイルスベースのベクターなどのＤＮＡウイルスに基づくベクターの使用などのウイルス媒介性遺伝子導入が挙げられる。遺伝子導入の様式の例として、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ_４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクションおよび細胞マイクロインジェクションが挙げられる。

一部の実施形態によれば、各外因性刺激性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを、赤血球系細胞への組込みのためにレンチウイルスベクタープラスミド中にクローニングできる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、赤血球系細胞への組込みのために単一外因性刺激性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、赤血球系細胞への組込みのために、本明細書に記載の通り、２つ、３つ、４つまたはそれより多い外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態によれば、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを、抗生物質耐性遺伝子などの選択可能な形質をコードするプラスミドＤＮＡ構築物中にクローニングすることができる。一部の実施形態によれば、外因性刺激性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを、赤血球系細胞において各組換えタンパク質を安定に発現するように適応しているプラスミド構築物中にクローニングすることができる。

一部の実施形態によれば、外因性刺激性ポリペプチド配列（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多い外因性ポリペプチド配列）を有するトランスファーベクター、エンベロープベクターおよびパッケージングベクターが、ウイルス産生のために宿主細胞中に各々トランスフェクトされるレンチウイルス系を使用できる。一部の実施形態によれば、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、脂質ベースのトランスフェクションまたは電気穿孔のいずれかによって、レンチウイルスベクターを宿主細胞中にトランスフェクトすることができ、一晩インキュベートする。外因性刺激性ポリペプチド配列が、蛍光リポーターを伴い得る実施形態については、一晩インキュベートした後に、蛍光についての宿主細胞の検査を調べることができる。ウイルス粒子を含む宿主細胞の培養培地を、８〜１２時間毎に２または３回回収し、遠心分離して剥離した細胞および細片を沈降させることができる。次いで、必要に応じて、培養培地を直接使用する、凍結する、または濃縮することができる。

成熟赤血球への分化を可能にする適した条件、例えば、本明細書に記載のｉｎｖｉｔｒｏ培養プロセス下で、外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸のトランスファーの前駆細胞対象を培養できる。得られた赤血球は、成熟赤血球と関連しているタンパク質、例えば、ヘモグロビン、グリコホリンＡならびに標準方法（例えば、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ解析）によって検証および定量化できる外因性刺激性ポリペプチドを提示する。複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む単離された成熟赤血球、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む単離された成熟赤血球ならびにＭＩＣＡ、ＭＩＣＢおよびＩＧＦ−１からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを含む単離された成熟除核赤血球は、本開示の操作された赤血球系細胞の限定されない例である。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、赤血球系前駆細胞を、外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることによって作製する。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、赤血球系前駆細胞と接触されるＲＮＡによってコードされる。

単離された赤血球系前駆細胞を、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを用いてトランスフェクトし、操作された赤血球系細胞を作製できる。メッセンジャーＲＮＡは、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドに対応するコード配列を含有するｃＤＮＡプラスミド構築物のｉｎｖｉｔｒｏ転写から導くことができる。例えば、外因性刺激性ポリペプチドに対応するｃＤＮＡ配列を、特定のＲＮＡポリメラーゼと適合するプロモーター配列を含有するクローニングベクター中に挿入できる。例えば、クローニングベクターＺＡＰＥＸＰＲＥＳＳｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）は、それぞれ、Ｔ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼと適合するＴ３およびＴ７プロモーター配列を含有する。センスｍＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ転写のために、外因性ポリペプチドのコード配列の末端に対応する停止コドン（複数可）の下流の制限部位でプラスミドを線形化する。ｍＲＮＡを、例えば、ＲＮＡＭＡＸＸＨｉｇｈＹｉｅｌｄ転写キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）などの市販のキットを使用して線形ＤＮＡ鋳型から転写する。一部の場合には、５’−ｍ７ＧｐｐｐＧキャップを有するｍＲＮＡを作製することは望ましいものであり得る。そのようなものとして、線形化ｃＤＮＡ鋳型の転写は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）製のｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥＨｉｇｈＹｉｅｌｄＣａｐｐｅｄＲＮＡ転写キットを使用して実施できる。転写は、３７℃で３０分〜４時間、２０〜１００μｌの反応体積で実施できる。転写されたｍＲＮＡを、ＤＮアーゼＩを用いる短時間の処置によって反応ミックスから精製して、線形化ＤＮＡ鋳型を排除し、続いて、塩化リチウム、酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムの存在下、７０％エタノール中で沈殿させる。転写されたｍＲＮＡの完全性は、アガロース−ホルムアルデヒドゲルまたは市販のＮｏｖｅｘプレキャストＴＢＥゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を用いる電気泳動を使用して評価できる。

例えば、リポフェクションおよび電気穿孔を含むさまざまなアプローチを使用して、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡを網状赤血球中に導入できる（van Tandeloo et al., Blood 98:49-56 (2001)）。リポフェクションのために、５μｇのｉｎｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡを、例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）中でカチオン性脂質ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：４比で５〜１５分間インキュベートする。あるいは、例えば、ＤＯＴＡＰ、種々の形態のポリエチレンイミンおよびポリＬ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ；例えば、Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891 (2001)を参照されたい）を含む、さまざまなその他のカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーを、ｍＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクトするために使用できる。得られたｍＲＮＡ／脂質複合体を、細胞（１〜２×１０^６個細胞／ｍｌ）とともに３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、培養に戻す。電気穿孔のために、例えば、５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）中の約５〜２０×１０^６個細胞を約２０μｇのｉｎｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡと混合し、例えば、ＥａｓｙｊｅｃｔＰｌｕｓデバイス（ＥｑｕｉＢｉｏ、Ｋｅｎｔ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）を使用して０．４ｃｍキュベット中で電気穿孔する。一部の場合には、特定のｍＲＮＡの網状赤血球へのトランスフェクションのための有用な条件を決定するために種々の電圧、電気容量および電気穿孔体積を試験することが必要であり得る。一般に、ｍＲＮＡを用いて細胞を効率的にトランスフェクトするために必要な電気穿孔パラメーターは、細胞に対して、ＤＮＡの電気穿孔のために必要なものよりもあまり有害ではないと思われる（van Tandeloo et al., Blood 98:49-56 (2001)）。

あるいは、ペプチド媒介性ＲＮＡ送達戦略を使用して、ｍＲＮＡを赤血球系前駆細胞中にトランスフェクトできる（例えば、Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891 (2001)を参照されたい）。例えば、特に、有糸分裂後一次細胞において、カチオン性脂質ポリエチレンイミン２ｋＤＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）をメリチンペプチド（ＡｌｔａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）と組み合わせて、ｍＲＮＡトランスフェクションの効率を増大することができる。メリチンペプチドを、ジスルフィドクロスリンカー、例えば、ヘテロ二官能性クロスリンカースクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートなどを使用してＰＥＩにコンジュゲートできる。ｉｎｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡをメリチン−ＰＥＩとともに５〜１５分間プレインキュベートして、ＲＮＡ／ペプチド／脂質複合体を形成する。次いで、この複合体を、５％ＣＯ_２加湿環境において血清不含培養培地中で細胞に３７℃で２〜４時間添加し、次いで、除去し、トランスフェクトされた細胞を培養で成長し続けさせる。

一部の実施形態では、適した単離された赤血球系前駆細胞または血小板前駆体細胞を、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることによって操作された赤血球系細胞を作製する。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＤＮＡによってコードされ、これが、有核赤血球系前駆細胞または有核血小板前駆体細胞と接触される。一部の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドは、ＲＮＡによってコードされ、これが、血小板、有核赤血球系細胞または有核血小板前駆体細胞と接触される。

１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを、一過性または安定トランスフェクションおよび遺伝子療法アプローチを含むさまざまなＤＮＡ技術を使用して最終分化前に赤血球系前駆細胞、血小板前駆体または有核赤血球系細胞中に遺伝子導入できる。外因性刺激性ポリペプチドを、成熟赤血球または血小板の表面に、および／または細胞質中に発現させることができる。

１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトするために、ウイルスによる遺伝子導入を使用できる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）などのレンチウイルスおよび泡沫状ウイルスなどのスプーマウイルスを含むいくつかのウイルスを、遺伝子導入媒体として使用できる（例えば、Osten et al., HEP 178:177-202 (2007)を参照されたい）。レトロウイルスは、例えば、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞を効率的に形質導入し、染色体中に組み込まれ、安定遺伝子導入を与える。

１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを、赤血球系前駆細胞、血小板前駆体細胞または有核赤血球系細胞中にトランスフェクトし、成熟赤血球または血小板において発現させ、その後保持し、示すことができる。適したベクターとして、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクター骨格がある（Malik et al., Blood 91:2664-2671 (1998)）。ＭＭＬＶに基づくベクター、発がん性レトロウイルスが、遺伝子療法臨床試験において現在使用されている（Hossle et al., News Physiol. Sci. 17:87-92 (2002)）。例えば、外因性刺激性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ構築物を、標準分子生物学技術を使用してＭＭＬＶベクター骨格において作製できる。構築物を、パッケージング細胞系、例えば、ＰＡ３１７細胞などにトランスフェクトし、ウイルス上清を使用して、プロデューサー細胞、例えば、ＰＧ１３細胞などをトランスフェクトする。ＰＧ１３ウイルス上清を、本明細書に記載の通り、単離され、培養されている、または新たに単離された赤血球系前駆細胞、血小板前駆体または有核赤血球系細胞とともにインキュベートする。操作された赤血球系細胞の表面に位置している場合には、外因性ポリペプチドの発現を、例えば、蛍光標識された外因性刺激性ポリペプチドに対する抗体を用いるＦＡＣＳ解析（蛍光活性化細胞選別）を使用してモニタリングできる。同様の方法を使用して、操作された赤血球系細胞の内側に位置する外因性ポリペプチドを発現させることができる。

必要に応じて、ウイルスベースのアプローチ（Tao et al., Stem Cells 25:670-678 (2007)）を使用して、蛍光追跡分子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などをトランスフェクトできる。強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ）をコードするＤＮＡを含有するエコトロピック（Ecotopic）レトロウイルスベクターを、パッケージング細胞、例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ細胞系（Ｏｒｂｉｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．によって配布される）を使用してパッケージングする。パッケージング細胞系は、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む適切なウイルスパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定に発現する。ウイルス粒子が与えられたＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ細胞から得た上清を使用して、例えば、赤血球系前駆細胞、血小板前駆体または有核赤血球系細胞に形質導入する。一部の場合には、特別にコーティングされた表面、例えば、組換えフィブロネクチンの断片などで形質導入を実施して、レトロウイルス媒介性遺伝子導入の効率を改善できる（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、ＴａｋａｒａＢｉｏＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティングされたプレート中で、レトロウイルスＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ上清および適した補助因子とともにインキュベートする。形質導入を翌日に繰り返すことができる。この場合には、ＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓを発現する細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって評価することができる。形質導入効率を評価するために使用できるその他のリポーター遺伝子として、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびルシフェラーゼならびに低親和性神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ）およびヒト細胞表面ＣＤ２４抗原が挙げられる（Bierhuizen et al., Leukemia 13:605-613 (1999)）。

適した赤血球系細胞、血小板またはその前駆体中に遺伝物質を導入するために非ウイルスベクターを使用して、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製できる。非ウイルス媒介性遺伝子導入は、プラスミドベクターがタンパク質を含有しない、より毒性が少ない、スケールアップすることがより容易である、宿主細胞の優先がないという点でウイルス媒介性遺伝子導入とは異なる。プラスミドベクターの「裸のＤＮＡ」は、ポリペプチドをコードする遺伝物質の細胞への送達においてそれ自体では非効率的であり、したがって、細胞へ入ることを可能にする遺伝子送達方法と組み合わせる。化学的および物理的方法を含むいくつかの送達方法を使用して、非ウイルスベクターを適した赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体中に移すことができる。

１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードする非ウイルスベクターを、カチオン性脂質およびポリマーなどの合成高分子を使用して適した赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体中に導入することができる（Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130 (2005)）。カチオン性リポソームは、例えば、電荷相互作用によってＤＮＡと複合体を形成する。正電荷を有するＤＮＡ／脂質複合体は、負の細胞表面と結合し、エンドサイトーシスによって細胞により取り込まれる。このアプローチを使用して、例えば、造血細胞をトランスフェクトできる（例えば、Keller et al., Gene Therapy 6:931-938 (1999)を参照されたい）。赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体については、プラスミドＤＮＡ（２５〜１００μＬの血清不含培地、例えば、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）中、およそ０．５μｇ）を、カチオン性リポソーム（２５μ．Ｌの血清不含培地中、およそ４μ．ｇ）、例えば、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．ＴＭ．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）と混合し、少なくとも２０分間インキュベートして、複合体を形成させる。ＤＮＡ／リポソーム複合体を、適した赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体に添加し、５〜２４時間インキュベートを可能とし、その時間の後、ポリペプチドの導入遺伝子発現を評価できる。あるいは、その他の市販のリポソームトランスフェクション剤を使用してもよい（例えば、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ．、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）。

必要に応じて、赤血球系細胞前駆細胞、例えば、造血および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を効率的にトランスフェクトするために、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などを使用できる（例えば、Shin et al., Biochim. Biophys. Acta 1725:377-384 (2005)を参照されたい）。ヒト臍帯血からヒトＣＤ３４＋細胞を単離し、２００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子および２０％の熱不活性化ウシ胎児血清を補給したＩｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中で培養する。外因性刺激性ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを、０．８Ｋ〜７５０Ｋで大きさの変動する分岐または直鎖ＰＥＩとともにインキュベートする（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ；Ｆｅｒｍｅｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）。ＰＥＩを、４．２ｍｇ／ｍｌ蒸留水でストック溶液として調製し、ＨＣｌを使用してｐＨ５．０へわずかに酸性化する。ＤＮＡの１μｇが３ｎｍｏｌのリン酸を含有し、ＰＥＩストック溶液の１μｌが１０ｎｍｏｌのアミン窒素を含有するという計算に基づいて、ＤＮＡをＰＥＩと、種々の窒素／リン酸比で室温で３０分間組み合わせることができる。単離されたＣＤ３４＋細胞をＤＮＡ／カチオン性複合体とともに播種し、２８０×ｇで５分間遠心分離し、ポリペプチドの遺伝子発現が評価されるまで培養培地中で４時間またはそれより多くインキュベートする。

プラスミドベクターを、物理的方法、例えば、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃（biolistics）または微粒子銃（particle bombardment）技術（Papapetrou, et al., (2005) Gene Therapy 12:S118-S130）を使用して適した赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体中に導入できる。この場合には、ポリペプチドをコードするＤＮＡが、金粒子上に吸収され、パーティクルガンによって細胞に投与される。このアプローチを、例えば、赤血球系始原細胞、例えば、臍帯血由来の造血幹細胞をトランスフェクトするために使用できる（例えば、Verma et al., Gene Therapy 5:692-699 (1998)を参照されたい）。そのようなものとして、臍帯血を単離し、リン酸緩衝食塩水で３倍希釈する。抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を、二次抗体でコーティングされた磁性マイクロビーズおよび磁性単離システムと組み合わせて使用してＣＤ３４＋細胞を精製する（例えば、ＭｉｌｔｅｎｙｉＭｉｎｉＭａｃＳｙｓｔｅｍ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）。ＣＤ３４＋濃縮細胞を、本明細書に記載の通り培養できる。トランスフェクションのために、ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを、塩化カルシウムおよびスペルミジンを用いる処置によって、粒子、例えば、金ビーズ上に沈殿させる。ＤＮＡによってコーティングされたビーズをエタノールを用いて洗浄した後、ビーズを、例えば、ＢｉｏｌｉｓｔｉｃＰＤＳ−１０００／ＨｅＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して培養細胞中に送達することができる。リポーター遺伝子、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などを使用してトランスフェクションの効率を評価できる。

必要に応じて、電気穿孔方法を使用して、プラスミドベクターを適した赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体中に導入できる。電気穿孔は、細胞膜中に一過性の孔を作出し、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡならびに抗体および薬物を含む種々の分子の細胞への導入を可能にする。そのようなものとして、ＣＤ３４＋細胞を、本明細書に記載の通り、単離し、培養する。電気穿孔の直前に、細胞を２５０×ｇ、室温で１０分間の遠心分離によって単離し、０．２〜１０×１０^６個の生存細胞／ｍｌで電気穿孔緩衝剤、例えば、１．０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補給したＸ−ＶＩＶＯ１０などに再懸濁する。プラスミドＤＮＡ（１〜５０μｇ）を５００μｌの細胞懸濁液とともに、適当な電気穿孔キュベットに添加する。電気穿孔を、例えば、ＥＣＭ６００電気穿孔機（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を２００Ｖ〜２８０Ｖの範囲の電圧および２５〜７０ミリ秒の範囲のパルス長を用いて使用して行うことができる。いくつかの代替電気穿孔機器が市販されており、この目的のために使用できる（例えば、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸＣＥＬＬ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．；ＣｅｌｌｊｅｃｔＤｕｏ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）。あるいは、単離されたＣＤ３４＋細胞の効率的な電気穿孔を以下のパラメーターを使用して実施できる：４ｍｍキュベット、１６００μＦ、５５０Ｖ／ｃｍおよび１×１０^５個細胞／ｍｌの５００μｌの細胞あたり１０μｇのＤＮＡ（Oldak et al., Acta Biochimica Polonica 49:625-632 (2002)）。

適した赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体をトランスフェクトするために、電気穿孔の一形態であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎも使用できる。この場合には、トランスフェクションを、ＤＮＡ（またはその他の試薬）が核に直接輸送されることを可能にし、したがって、細胞質における潜在的分解のリスクを低減する細胞種特異的溶液における電気パラメーターを使用して実施する。例えば、ヒトＣＤ３４細胞ＮＹＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲキット（ＡｍａｘａＩｎｃ．製）を使用して、適した赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体をトランスフェクトできる。この場合には、ヒトＣＤ３４細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液中の１〜５×１０^６個細胞を１〜５μｇのＤＮＡと混合し、生産者によって決定されたような事前にプログラムされた設定を使用してＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ機器でトランスフェクトする。

赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体を、ゲノム中に組み込まれるまで哺乳動物細胞において自己複製できない従来の発現ベクターを用いて非ウイルス的にトランスフェクトできる。あるいは、赤血球系細胞、血小板またはそれらの前駆体を、染色体へ組み込まれずに自己複製性遺伝子単位として宿主核において持続し得るエピソームベクターを用いてトランスフェクトできる（Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130 (2005)）。これらのベクターは、普通、例えば、ＥＢＶ、ヒトポリオーマウイルスＢＫ、ウシ乳頭腫ウイルス−１（ＢＰＶ−１）、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ）およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などの潜在感染の際に細胞において染色体外で複製するウイルスに由来する遺伝エレメントを利用する。非ウイルス遺伝子導入のために哺乳動物人工染色体も使用できる（Vanderbyl et al., Exp. Hematol. 33:1470-1476 (2005)）。

１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を、当技術分野で公知の標準の分子生物学方法、例えば、制限酵素消化、オーバーラップエクステンションＰＣＲおよびＧｉｂｓｏｎアセンブリーによって発現ベクターにアセンブルできる。

外因性核酸は、細胞表面で外因性刺激性ポリペプチドが発現されるように内因性または天然膜タンパク質をコードする遺伝子に融合された、例えば、赤血球系細胞の細胞表面で通常発現されない１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る。例えば、外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性遺伝子を、１型膜タンパク質のリーダー配列の後ろのＮ末端で、２型膜タンパク質のＣ末端で、またはＧＰＩ連結膜タンパク質のＧＰＩ付着部位の上流にクローニングできる。

２つの融合された遺伝子の間に可動性アミノ酸リンカーを導入するために標準クローニング法を使用できる。例えば、可動性リンカーとして、全長抗体からの一本鎖抗体断片の作製においてよく使用されるポリ−グリシンポリ−セリンリンカー、例えば、［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３（Antibody Engineering: Methods & Protocols, Lo 2004）または一本鎖Ａｒｃリプレッサーを作製するために使用されるものなどのａｌａ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｔｈｒポリペプチド（Robinson & Sauer, PNAS 1998）がある。一部の実施形態では、可動性リンカーは、可動性リンカーを有さない等価構築物よりも多くの可動性および立体的自由を有するポリペプチドを提供する。

２つの融合された遺伝子、例えば、ＨＡエピトープタグ−−アミノ酸ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号７８）、ＣＭｙｃタグ−−アミノ酸ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号７９）またはＦｌａｇタグ−−アミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号８０）をコードする核酸配列などの間にエピトープタグを入れることができる。フローサイトメトリー、ウエスタンブロットまたは免疫沈降によるエピトープタグに対する抗体を使用する発現の容易な検出および定量化のために、エピトープタグを使用できる。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドおよび少なくとも１つのその他の異種ポリペプチドを含む。少なくとも１つのその他の異種ポリペプチドは、蛍光タンパク質であり得る。蛍光タンパク質は、形質導入効率を評価するためにリポーターとして使用できる。一部の実施形態では、両方が同一転写物から作製される場合には、蛍光タンパク質を外因性刺激性ポリペプチドの発現レベルを評価するためにリポーターとして使用する。一部の実施形態では、少なくとも１つのその他のポリペプチドは異種であり、機能、例えば、複数の抗原、複数の捕獲標的、酵素カスケードなどを提供する。一部の実施形態では、組換え核酸は、外因性刺激性ポリペプチドをコードする遺伝子および第２の遺伝子を含み、第２の遺伝子は、ウイルス由来Ｔ２Ａ配列（gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct（配列番号８１））によって外因性刺激性ポリペプチドをコードする遺伝子から分離され、２つの成熟タンパク質に翻訳後切断される。

一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団を、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を含むレンチウイルスベクターとともにインキュベートして、操作された赤血球系細胞を作製し、その特定のプラスミドとして、ｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏ、ＰＬＫＯ．１−−ＴＲＣクローニングベクター、ｐＳｉｃｏ、ＦＵＧＷ、ｐＬＶＴＨＭ、ｐＬＪＭ１、ｐＬｉｏｎ１１、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＶＳＶＧ、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．２ｄｖｐｒ、ｐｓＰＡＸ２、ｐＲＳＶ−ＲｅｖおよびｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥを挙げることができる。ベクターを１０、１００、１，０００、１０，０００ｐｆｕで投与し、１２時間インキュベートできる。

ある特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外因性刺激性ポリペプチドとコンジュゲートされる第１の外因性刺激性ポリペプチドを提示する除核細胞である。コンジュゲーションは、化学的または酵素的に達成できる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用を伴って、または伴わずに、外因性抗原提示ポリペプチドと１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドの共有結合によって達成できる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用を伴って、または伴わずに、同時刺激性ポリペプチドおよび結合対メンバーの共有結合によって達成できる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用を伴って、または伴わずに、同時阻害性ポリペプチドおよび結合対メンバーの共有結合によって達成できる。このようなコンジュゲートの形成は、当業者の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための種々の技術は公知であり、特定の技術の選択は、コンジュゲートされる材料によって導かれる。イオン化可能側鎖、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、システイン、ヒスチジンまたはチロシンを含有し、ポリペプチド配列の活性部分中に含有されない、ポリペプチド（ＣまたはＮ末端）へのアミノ酸の添加は、非プロトン化状態において強力な求核剤として働いて、ポリマー、例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性ＰＥＧに付着している反応性基との種々のバイオコンジュゲーション反応に関与する（例えば、Lutolf and Hubbell, Biomacromolecules 2003; 4:713-22, Hermanson, Bioconjugate Techniques, London. Academic Press Ltd; 1996）。

外因性刺激性ポリペプチドの間にその他の分子融合を形成でき、直接または間接コンジュゲーションを含む。外因性ポリペプチドを互いに直接的に、またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートできる。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマーまたは核酸であり得る。ポリマーは、例えば、天然、合成、直鎖または分岐であり得る。外因性刺激性ポリペプチドは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む異種融合タンパク質を含むことができ、融合タンパク質は、互いに直接連結される、または介在するリンカー配列および／または一方の末端もしくは両端のさらなる配列とともにポリペプチドを含む。リンカーとのコンジュゲーションは、共有結合またはイオン結合によるものであり得る。

ある特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外因性刺激性ポリペプチドとの複合体で第１の外因性刺激性ポリペプチドを提示する除核細胞である。他の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。さらなる実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は、複合体として存在する。他のさらなる実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は、融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、リンカー、例えば、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１１）、特に、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）によってＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分に連結される。

本明細書に記載の赤血球系細胞は、外因性刺激性ポリペプチドを細胞と連結するカップリング試薬を使用して製造することもできる。例えば、クリックケミストリーを使用できる。例えば、外因性ポリペプチドが複合体である、またはポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、多量体ポリペプチド、大きなポリペプチド、ｉｎｖｉｔｒｏで誘導体化されたポリペプチド、赤血球系細胞に対して毒性を有し得る、または赤血球系細胞において効率的に発現されない外因性ポリペプチドを発現することが困難である場合に、外因性ポリペプチドを細胞とカップリングするためにカップリング試薬を使用できる。クリックケミストリーおよび赤血球系細胞に機能付与するためのその他のコンジュゲーション方法は、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている。

したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、細胞あたり少なくとも、それより多くの、または約５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００のカップリング試薬ほど多くを含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞を、ａ）第１のカップリング試薬を赤血球系細胞とカップリングし、それによって、医薬品調製物、製品または中間体を作製することを含む方法によって作製する。一実施形態では、方法は、ｂ）例えば、第１のカップリング試薬の第２のカップリング試薬との反応に適した条件下で、細胞を、第２のカップリング試薬にカップリングされた外因性刺激性ポリペプチドと接触させることをさらに含む。実施形態では、２つまたはそれより多い外因性刺激性ポリペプチドが細胞に（例えば、クリックケミストリーを使用して）カップリングされる。実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドが、細胞（例えば、クリックケミストリーを使用して）にカップリングされ、第２の外因性刺激性ポリペプチドは、外因性核酸から発現されたポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、カップリング試薬は、アジドカップリング試薬を含む。一部の実施形態では、アジドカップリング試薬は、アジドアルキル部分、アジドアリール部分またはアジドヘテロアリール部分を含む。例示的アジドカップリング試薬として、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル、アジド酢酸ＮＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル、アジドプロピルアミン、アジド−ＰＥＧ−アミン、アジド−ＰＥＧ−マレイミド、ビス−スルホン−ＰＥＧ−アジドまたはそれらの誘導体が挙げられる。カップリング試薬はまた、アルケン部分、例えば、トランスシクロアルケン部分、オキサノルボルナジエン部分またはテトラジン部分を含み得る。さらなるカップリング試薬は、各々その全文で参照により本明細書に組み込まれるＣｌｉｃｋＣｈｅｍｉｓｔｒｙＴｏｏｌｓ（https://clickchemistrytools.com/）またはLahann, J (ed) (2009) Click Chemistry for Biotechnology and Materials Scienceに見い出すことができる。

別の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドを、共有結合による付着によって赤血球系細胞に付着させて、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチド（例えば、第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチド）を提示する赤血球系（erytrhroid）細胞を含む操作された赤血球系細胞を作製する。例えば、外因性刺激性ポリペプチドを誘導体化し、赤血球系細胞または血小板上の求核剤と反応する求電子性基を含有するカップリング化合物を使用して赤血球系細胞または血小板と結合して、相互結合関係を形成できる。これらの求電子性基を代表するものとして、αβ不飽和カルボニル、アルキルハリドおよびチオール試薬、例えば、置換マレイミドが挙げられる。さらに、カップリング化合物を、アミノ、カルボキシルおよびチロシン基などのポリペプチド中の１つまたは複数の官能基を介して外因性刺激性ポリペプチドにカップリングすることができる。この目的上、カップリング化合物は、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基、芳香族アミノ基および酵素官能基と反応可能なその他の基を含有しなくてはならない。例えば、静電結合によって赤血球系細胞または血小板上に固定化して、操作された赤血球系細胞を作製するために、高電荷を有する外因性刺激性ポリペプチドもまた調製できる。これらの誘導体の例として、ポリリシルおよびポリグルタミル酵素が挙げられるであろう。

誘導体で具体化される反応性基の選択は、固定化のために求電子試薬を赤血球系細胞または血小板上の求核基とカップリングするために使用される反応条件に応じて変わる。制御因子は、赤血球系細胞または血小板との付着によって固定化された外因性刺激性ポリペプチドのカップリングの前にカップリング剤を不活性化しないという望みである。このようなカップリング固定化反応は、いくつかの方法で進行し得る。通常、カップリング剤を使用して、外因性ポリペプチドと赤血球系細胞または血小板の間に架橋を形成できる。この場合には、カップリング剤は、外因性ポリペプチドとの反応を引き起こすことができる官能基、例えば、カルボキシル基を有さなくてはならない。コンジュゲーションのための外因性刺激性ポリペプチドを調製する１つの方法として、外因性ポリペプチドと反応する混合無水物を形成するためのカップリング剤中のカルボキシル基の利用が挙げられ、これでは、混合無水物を形成可能であるアクチベーターが使用される。このようなアクチベーターを代表するものとして、カップリング剤とともに混合無水物をもたらすイソブチルクロロホルメートまたはその他のクロロホルメート、例えば、５，５’−（ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸（ＣＭＢ）またはｍ−マレイミド安息香酸（ＭＢＡ）がある。カップリング剤の混合無水物は、外因性ポリペプチドと反応して、反応性誘導体をもたらし、これは、順に、赤血球系細胞または血小板上の求核基と反応して、外因性刺激性ポリペプチドを固定化できる。

カルボキシル基などの外因性刺激性ポリペプチド上の官能基を、カルボジイミドなどのアクチベーターを用いて活性化できる。その後、アミノ基などの架橋試薬上の官能基が、外因性刺激性ポリペプチド上の活性化された基と反応して、反応性誘導体を形成する。さらに、カップリング剤は、赤血球系細胞または血小板上の適当な求核基と反応して架橋を形成する第２の反応性基を有さなくてはならない。このような反応性基の典型的なものとして、ヨード酢酸などのアルキル化剤、アクリル酸などのαβ不飽和カルボニル化合物、水銀などのチオール試薬、置換マレイミドなどがある。

あるいは、外因性刺激性ポリペプチド上の官能基を活性化して、例えば、赤血球系細胞または血小板上の求核剤と直接反応させて、架橋形成化合物の必要性を取り除くことができる。この目的のために、混合無水物とは識別される、エノールエステルへの外因性ポリペプチド中のカルボキシル基の形成を引き起こすＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋなどの試薬などのアクチベーターを使用する。外因性ポリペプチドのエノールエステル誘導体は、その後、例えば、赤血球系細胞または血小板上の求核基と反応し、外因性刺激性ポリペプチドの固定化を達成し、それによって、操作された赤血球系細胞を作出する。

一部の実施形態では、赤血球系細胞を、外因性刺激性ポリペプチドおよび必要に応じて、ペイロードと接触させることによって、複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を作製し、接触させることは、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒ１ｉ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｌｉ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロテリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９またはＨ抗原（ＣＤ１７３）を含む付着部位を使用して外因性刺激性ポリペプチドを赤血球系細胞とコンジュゲートすることを含まない。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを提示する赤血球系細胞を含み、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドは、細胞上に酵素的にコンジュゲートされる。

特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドを、これだけに限定されないが、二官能性架橋剤、例えば、第一級アミン基を還元チオール基とつなぐＮＨＳエステル−マレイミドヘテロ二官能性クロスリンカーなどを用いる化学的コンジュゲーションを含む、種々の化学的および酵素的手段によって、例えば、赤血球系細胞または血小板の表面にコンジュゲートできる。これらの方法はまた、酵素的戦略、例えば、アクセプター配列ＬＰＸＴＧ（配列番号８２）またはＬＰＸＴＡ（配列番号８３）を含有する１つのポリペプチドを、Ｎ末端ドナー配列ＧＧＧを含有するポリペプチドとつなぐ、ソルターゼ酵素によって媒介されるトランスペプチダーゼ反応なども含む、例えば、Swee et al., PNAS 2013を参照されたい。方法はまた、併用方法、例えば、それぞれ、抗原および細胞上のクリックケミストリーハンドル（アジドおよびアルキン）のソルターゼ媒介性コンジュゲーションと、それに続く、抗原を細胞と化学的に結合するためのシクロ付加反応なども含む、例えば、Neves et al., Bioconjugate Chemistry, 2013を参照されたい。タンパク質のソルターゼ媒介性修飾は、両方ともその全文で参照により本明細書に組み込まれる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５４５および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５５４に記載されている。

一部の実施形態では、タンパク質をアミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、認識エレメント、小分子、脂質、リンカー、標識、エピトープ、抗原、治療剤、毒素、放射性同位元素、粒子または反応性化学基、例えば、クリックケミストリーハンドルを含む部分を含むソルターゼ基質のコンジュゲーションによって修飾する。

望ましい場合には、触媒的結合形成性ポリペプチドドメインを、細胞内または細胞外のいずれかで、例えば、赤血球系細胞もしくは血小板上または赤血球系細胞もしくは血小板中に発現させることができる。Ｓｐｙ０１２８、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されたタンパク質に由来するものを含む、トランスペプチダーゼ、ソルターゼおよびイソペプチダーゼを含む、多数の触媒的結合形成性ポリペプチドが存在する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドのいずれも、ソルターゼを使用して細胞にコンジュゲートしない。

Ｓｐｙ０１２８の自己触媒的イソペプチド結合形成性サブユニット（ＣｎａＢ２ドメイン）をわけることが、互いに対して特異性を有する触媒活性を保持する２つの別個のポリペプチドをもたらすことは実証されている。この系におけるポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと呼ばれる。混合すると、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ＳｐｙＴａｇ上のＡｓｐ１１７とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ上のＬｙｓ３１の間でイソペプチド結合形成を起こす（Zakeri and Howarth, JACS 2010, 132:4526）。反応は、細胞環境と適合し、タンパク質／ペプチドコンジュゲーションに対して高度に特異的である（Zakeri, B.; Fierer, J. O.; Celik, E.; Chittock, E. C.; Schwarz-Linek, U.; Moy, V. T.; Howarth, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012, 109, E690-E697）。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、エラスチン様タンパク質において翻訳後トポロジー修飾に向かわせることがわかっている。例えば、ＳｐｙＴａｇをＮ末端に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをＣ末端に配置することが、環状エラスチン様タンパク質の形成に向かわせる（Zhang et al, Journal of the American Chemical Society, 2013）。

分子ＡがＳｐｙＴａｇに融合され、分子ＢがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合される系が、分子ＡがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合され、分子ＢがＳｐｙＴａｇに融合される系と機能的に等価であるように、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの構成成分を交換することができる。本文書の目的上、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが使用される場合には、相補的分子がその場所で置換され得ることは理解されるべきである。

ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系などの触媒的結合形成性ポリペプチドを使用して、外因性刺激性ポリペプチドを、例えば、赤血球系細胞の表面に付着して、操作された赤血球系細胞を作製することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列を、赤血球系細胞の細胞外表面上に発現させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドを、例えば、１型または３型膜貫通タンパク質、例えば、グリコホリンＡのＮ末端に融合する、２型膜貫通タンパク質、例えば、ＫｅｌｌのＣ末端に融合する、複数回膜貫通タンパク質、例えば、Ｂａｎｄ３の細胞外末端に、もしくは細胞外ループ中にインフレームで挿入する、ＧＰＩ−アクセプターポリペプチド、例えば、ＣＤ５５もしくはＣＤ５９に融合する、脂質鎖によって係留されたポリペプチドに融合する、または末梢膜タンパク質に融合することができる。ＳｐｙＴａｇ融合物をコードする核酸配列を、操作された赤血球系細胞内で発現させることができる。外因性刺激性ポリペプチドを、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＴａｇ融合物を発現する同一赤血球系細胞から、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列を発現させ、分泌させることができる。あるいは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列を、外因性に、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳動物または細胞不含産生系において産生することができる。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると、共有結合が形成され、それが、外因性刺激性ポリペプチドを赤血球系細胞の表面に付着させ、操作された赤血球系細胞を形成する。

一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドを、赤血球系細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下で、グリコホリンＡのＮ末端への融合物として発現させてもよい。同一赤血球系細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下で、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合された外因性刺激性ポリペプチドを発現させることができる。両融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの間でイソペプチド結合が形成され、赤血球系細胞表面と外因性刺激性ポリペプチドの間で共有結合を形成する。

別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドを、赤血球系細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下で、グリコホリンＡのＮ末端への融合物として発現させてもよい。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合された外因性刺激性ポリペプチドを、適した哺乳動物細胞発現系、例えば、ＨＥＫ２９３細胞において発現させることができる。赤血球系細胞でＳｐｙＴａｇ融合ポリペプチドを発現すると、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合ポリペプチドを細胞と接触させることができる。適した反応条件下で、ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの間にイソペプチド結合が形成され、赤血球系細胞表面と外因性刺激性ポリペプチドの間に共有結合が形成される。

ある特定の実施形態では、外因性刺激性ポリペプチドを、操作された赤血球系細胞中に負荷する。一部の実施形態では、例えば、赤血球系細胞または血小板に１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを負荷し、その結果、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドが赤血球系細胞または血小板内に内部移行されることによって操作された赤血球系細胞を作製する。必要に応じて、赤血球系細胞または血小板をペイロード、例えば、治療剤をさらに負荷してもよい。

いくつかの方法を使用して、例えば、赤血球系細胞または血小板に外因性刺激性ポリペプチドを負荷できる。適した方法として、例えば、低張溶解、低張透析、浸透、浸透圧パルス、浸透圧ショック、イオン泳動、電気穿孔、超音波処理、マイクロインジェクション、カルシウム沈殿、膜インターカレーション、脂質媒介性トランスフェクション、洗浄剤処置、ウイルス感染、拡散、受容体媒介性エンドサイトーシス、タンパク質形質導入ドメインの使用、粒子発射、膜融合、凍結解凍、機械的破壊および濾過が挙げられる。任意の１種のこのような方法またはそれらの組合せを使用して、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製できる。

低張溶解のために、例えば、赤血球系細胞を低イオン強度緩衝剤に対して曝露し、それらをバーストさせる。外因性刺激性ポリペプチドは、細胞内に分布する。赤血球系細胞、具体的には、赤血球を、単離された赤血球のペレットに３０〜５０倍体積過剰の５ｍＭリン酸緩衝剤（ｐＨ８）を添加することによって低浸透圧性に溶解できる。得られた溶解した細胞膜を、遠心分離によって単離する。溶解した赤血球膜のペレットを再懸濁し、低イオン強度緩衝剤中で、例えば、３０分間、外因性ポリペプチドの存在下でインキュベートする。あるいは、溶解した赤血球膜を、赤血球系細胞に効率的に負荷するために決定された最良条件に応じて１分程度に短く、または数日程度に長く、外因性ポリペプチドとともにインキュベートすることができる。

あるいは、細胞を膨潤させ、細胞膜中に孔を作出するために低張溶液に対する制御された透析を使用して、赤血球系細胞、具体的には、赤血球に外因性刺激性ポリペプチドを負荷できる（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号、同第５，７５３，２２１号および同第６，４９５，３５１号を参照されたい）。例えば、単離された赤血球のペレットを、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルコースｐＨ７．４に再懸濁し、１０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＮａＨＣＯ_３、２０ｍＭグルコースおよび４ｍＭＭｇＣｌ_２を含有する低イオン強度緩衝剤、ｐＨ７．４に対して透析する。３０〜６０分後、赤血球を外因性ポリペプチドを含有する１６ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４溶液に対してさらに３０〜６０分間さらに透析する。これらの手順のすべてを４℃の温度で実施することが有利であり得る。一部の場合には、透析アプローチによって多量の赤血球系細胞、具体的には、赤血球を負荷することは有益である場合があり、この目的のために設計された特定の装置を使用できる（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号、同第６，１３９，８３６号および同第６，４９５，３５１号を参照されたい）。

負荷された赤血球系細胞、具体的には、赤血球を、生理学的溶液、例えば、０．９％生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、細胞培養培地、血漿またはリンパ液などの存在下で穏やかに加熱することによって再密閉することができる。例えば、破壊された赤血球系細胞、具体的には、赤血球を、例えば、６０℃の温度で１００ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭ塩化ナトリウムの１５０ｍＭの塩溶液中で１〜２分間処置することによって十分に密閉された膜を作製することができる。あるいは、細胞を２５〜５０℃の温度で３０分〜４時間インキュベートしてもよい（例えば、米国特許出願第２００７／０２４３１３７Ａ１号を参照されたい）。あるいは、破壊された赤血球を、５ｍＭアデニン、１００ｍＭイノシン、２ｍＭＡＴＰ、１００ｍＭグルコース、１００ｍＭピルビン酸Ｎａ、４ｍＭＭｇＣｌ２、１９４ｍＭＮａＣｌ、１．６ＭＫＣｌおよび３５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４中、３７℃の温度で２０〜３０分間インキュベートすることによって再密閉することができる（例えば、米国特許第５，７５３，２２１号を参照されたい）。

電気穿孔のためには、例えば、赤血球系細胞または血小板を、細胞膜中に一過性の孔を引き起こす電場に対して曝露し、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドが細胞中に拡散することを可能にする（例えば、米国特許第４，９３５，２２３号を参照されたい）。赤血球系細胞、具体的には、赤血球を、例えば、生理学的および導電性培地、例えば、血小板不含血漿に懸濁し、それに、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを添加する。０．２〜１．０ｍｌの範囲の体積の混合物を、電気穿孔キュベットに入れ、氷上で１０分間冷却する。キュベットを、電気穿孔装置、例えば、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＤｉｖｉｓｉｏｎ、ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ製、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）などに入れる。細胞を、およそ２．４ミリ秒の長さおよびおよそ２．０ｋＶ／ｃｍの場の強度のシングルパルスを用いて電気穿孔する。あるいは、Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓａｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して０．２５．ｍｕ．Ｆで送達される２．２ｋＶのダブルパルスを使用して、赤血球系細胞、具体的には、赤血球の電気穿孔を実施して、６０％を超える負荷能力を達成できる（Flynn et al., Cancer Lett. 82:225-229 (1994)）。キュベットを、氷浴に１０〜６０分間戻し、次いで、３７℃の水浴に入れて、細胞膜の再密閉を誘導する。本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製するために任意の適した電気穿孔方法を使用できる。

超音波処理のためには、赤血球系細胞を、例えば、高強度音波に対して曝露し、細胞膜の一過性の破壊を引き起こし、細胞中へ１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドが拡散することを可能にする。本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製するために任意の適した超音波処理方法を使用できる。

洗浄剤処置のためには、赤血球系細胞を、例えば、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドが拡散し得る孔を作出することによって細胞膜を一過性に損なう穏やかな洗浄剤を用いて処置する。細胞が負荷された後、細胞から洗浄剤を洗浄する。例えば、洗浄剤はサポニンであり得る。本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製するために任意の適した洗浄剤処置方法を使用できる。

受容体媒介性エンドサイトーシスのためには、赤血球系細胞は、例えば、１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドの結合の際、受容体および会合された外因性刺激性ポリペプチドの内部移行を誘導する表面受容体を有し得る。本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製するために任意の適したエンドサイトーシス方法を使用できる。

機械的発射のためには、赤血球系細胞に、例えば、重いまたは電荷を有する粒子、例えば、金マイクロキャリアなどに付着され、細胞膜を越えるように機械的または電気的に加速された１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを照射することができる。微粒子銃は、例えば、ＨｅｌｉｏｓＧｅｎｅＧｕｎ（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して達成できる。本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を作製するために任意の適した微粒子銃方法を使用できる。

濾過のためには、赤血球系細胞または血小板および外因性刺激性ポリペプチドを、細胞より小さい孔の大きさのフィルターを通して押し出すことができ、細胞膜の一過性の破壊を引き起こし、外因性刺激性ポリペプチドが細胞に入ることを可能にする。本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を作製するために任意の適した濾過方法を使用できる。

凍結解凍のためには、赤血球系細胞を数回の凍結解凍サイクルに付し、その結果、細胞膜が破壊される（例えば、米国特許出願第２００７／０２４３１３７Ａ１号を参照されたい）。この場合には、パッケージングされた赤血球のペレット（０．１〜１．０ｍｌ）を、等体積（０．１〜１．０ｍｌ）の１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを含有する等張溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と混合する。細胞および１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドを含有する試験管を液体窒素中に浸漬することによって、赤血球を凍結する。あるいは、試験管を−２０℃または−８０℃の冷凍庫に入れることによって細胞を凍結できる。次いで、細胞を、例えば、２３℃の水浴中で解凍し、負荷を増大するために必要に応じてサイクルを反復する。本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を作製するために任意の適した凍結解凍方法を使用できる。

操作された赤血球系細胞で外因性刺激性ポリペプチドを検出することができる。外因性刺激性ポリペプチドの存在は、標準分子生物学方法、例えば、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ解析を使用して検証し、定量化できる。細胞内環境中に存在する外因性刺激性ポリペプチドは、細胞溶解の際に、または蛍光検出を使用して定量化できる。

ＩＩＩ．使用の方法
本明細書に記載の通り、本発明は、免疫細胞、例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）およびＮＫ細胞を刺激する（simulating）方法を提供する。免疫細胞の刺激は、正常な細胞機能を増強し得る、または異常な細胞において正常な細胞機能を開始し得る。方法は、活性化されるべき免疫細胞を、免疫細胞を刺激するのに有効な量の、本明細書における態様および実施形態のうち任意の１つの操作された赤血球系細胞と接触させることを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。免疫細胞を刺激することとは、免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのキラー免疫細胞の活性化および／または拡大などの細胞反応をもたらすプロセス（例えば、シグナルまたは刺激の提供を含む）を指す。一部の実施形態では、免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのキラー免疫細胞を刺激する方法とは、刺激またはシグナル、例えば、免疫細胞の活性化および／または拡大をもたらす刺激性ポリペプチドの提供を指す。

好ましい実施形態では、本発明は、免疫キラー細胞、例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を刺激する方法であって、免疫キラー細胞を、免疫キラー細胞を刺激するのに有効な量の、本明細書における態様および実施形態のうち任意の１つの操作された赤血球系細胞（例えば、操作された除核細胞）と接触させることを含む方法を提供する。本発明の方法によって刺激することができる免疫キラー細胞として、例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、メモリー様ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、キラー免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を用いて刺激する方法に起因する細胞の集団を提供する。

ある特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞が、キラー免疫細胞のうち１種より多く、例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のうち１種より多くを同時に刺激する方法において使用される。例示的実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を同時に刺激可能である。

一部の実施形態では、免疫キラー細胞を、操作された赤血球系細胞と接触させることを、ｉｎｖｉｖｏで実施する。接触をｉｎｖｉｖｏで実施する場合に、免疫キラー細胞の２つ以上の集団を活性化できることが、本発明の利点である。例えば、接触をｉｎｖｉｖｏで実施する場合に、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方とも、活性化および／または拡大され得る。

別の実施形態では、免疫キラー細胞を、操作された赤血球系細胞と接触させることをｅｘｖｉｖｏで実施する。したがって、一部の実施形態では、１種または複数のナチュラルキラー細胞を、本発明の操作された赤血球系細胞とｅｘｖｉｖｏで接触させる。

ＮＫ細胞を、任意の従来の供給源から得ることができ、末梢血、骨髄、臍帯血、細胞系またはサイトカインによって刺激された末梢血に由来することが好ましい。ＮＫ細胞を、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料から拡大することができる。ＰＢＭＣは、単球およびリンパ球の混合物；顆粒球が分離され除去された血液白血球である。細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を培養する前に、当業者に周知の方法に従って精製し、分離する。細胞傷害性細胞を拡大するための培養条件は、健常個体から得たＰＢＭＣでこれまでに最適化されている（Carlens et al., Hum. Immunol. 2001; 62:1092-1098）。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞を約１００から約１，０００，０００倍の間、または約１，０００から約１，０００，０００倍の間、例えば、１，０００から約１００，０００倍の間に拡大する。

その後、拡大されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象、例えば、免疫細胞刺激を必要とする対象に投与できる。投与は１回または反復して数回実施してもよい。

別の実施形態では、１種または複数のＣＤ８＋Ｔ細胞を本発明の操作された赤血球系細胞とｅｘｖｉｖｏで接触させる。

ｅｘｖｉｖｏＴ細胞活性化および拡大を、Ｔ細胞の単離およびその後の刺激と、それに続くさらなる拡大によって実施できる。拡大の前に、Ｔ細胞の供給源を対象から得る。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織および腫瘍を含むいくつかの供給源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態では、当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞系を使用できる。本発明のある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、任意の数の当業者に公知の技術、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ分離を使用して対象から採取された血液の単位から得ることができる。一部の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞を、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得る。アフェレーシス生成物は、通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球および血小板を含むリンパ球を含有する。一部の実施形態では、アフェレーシスによって集められた細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞をその後の処理ステップにとって適当な緩衝剤または培地中に入れる。本発明の一部の実施形態では、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄する。当業者ならば容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、当業者に公知の方法によって、例えば、半自動「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサー）を、製造業者の使用説明書に従って使用することによって達成できる。洗浄後、細胞をさまざまな生体適合性バッファー、例えば、Ｃａ不含、Ｍｇ不含ＰＢＳに再懸濁できる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁することができる。

別の実施形態では、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ勾配を通した遠心分離によって単球を枯渇させることによって、Ｔ細胞を末梢血リンパ球から単離する。ポジティブまたはネガティブ選択技術によって、Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞をさらに単離することができる。ネガティブに選択される細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮を達成することができる。好ましい方法は、ネガティブに選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、ネガティブ磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。ポジティブまたはネガティブ選択による所望の細胞の集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変えることができる。ある特定の実施形態では、細胞およびビーズの最大接触を確実にするためにビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増大する）ことが、望ましいものであり得る。例えば、一部の実施形態では、２０億個細胞／ｍｌの濃度を使用する。一部の実施形態では、１０億個細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる実施形態では、１億個細胞／ｍｌより多くを使用する。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万個細胞／ｍｌの細胞の濃度を使用する。さらに別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億個細胞／ｍｌの細胞の濃度を使用する。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個細胞／ｍｌの濃度を使用できる。高濃度を使用することは、細胞収率の増大、細胞活性化および細胞拡大をもたらし得る。さらに、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原、例えば、ＣＤ２８ネガティブＴ細胞を弱く発現する可能性がある細胞の、または多数の腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが望ましいものであろう。例えば、高濃度の細胞を使用することで、通常、弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能となる。

ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、約１００から約１，０００，０００倍の間または約１，０００から約１，０００，０００倍の間、例えば、１，０００から約１００，０００倍の間に拡大する。

ｅｘｖｉｖｏ拡大後のＴ細胞の適応度は、そのｉｎｖｉｖｏで機能する能力の優れた予測因子（predicator）である。したがって、ある特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞の、重要な細胞生存遺伝子Ｂｃｌ−ｘＬを誘導する能力も測定される。拡大プロセスの間の培養物におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを使用して、操作された赤血球系細胞のいずれかが、拡大されたＴ細胞に特定の生存上の利点を付与するか否かを決定する。さらに、ｅｘｖｉｖｏ拡大後の細胞のテロメアの長さを測定して、特定の操作された赤血球系細胞が、拡大する細胞の複製能力を保持することにおいてより有効であるか否かを決定できる。

本開示は、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を使用する種々の方法を考慮する。当業者には理解されるであろうが、本明細書において提供される本開示に基づいて、操作された赤血球系細胞の投与の用量およびタイミングを、本明細書に記載の各適用のために特別に合わせることができる。

本発明の操作された赤血球系細胞の投与が、肝臓毒性をもたらさないことが有利である。一部の実施形態では、本発明の外因性ポリペプチドを提示する操作された赤血球系細胞の投与は、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、少ない毒性しかもたらさない（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して少ない肝臓毒性しかもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、少ない肝臓毒性しかもたらさない；またはＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、少ない肝臓毒性しかもたらさない）。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性をもたらす（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性をもたらす、ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性をもたらす、またはＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性をもたらす）。

治療指数（ＴＩまたは治療比）は、毒性を引き起こす量に対する、治療効果を引き起こす治療剤の量の比較である（参照によりその全文で本明細書に組み込まれる、Trevor A et al. (2013). "Chapter 2: Pharmacodynamics". Pharmacology Examination & Board Review (10th ed.). New York: McGraw-Hill Medical. p. 17）。治療指数（ＴＩ）は、医薬品の治療上有効用量と、毒性用量を比較するために使用される。ＴＩは、薬物の相対安全性の声明である。所望の治療反応をもたらすために必要とされる用量に対する毒性をもたらす用量の比である。ＴＩを導き出すために使用される一般的な方法は、ＴＤ５０（毒性用量）およびＥＤ５０（有効用量）を含む５０％用量−反応点を使用することである。

したがって、より高いＴＩを有する薬物は、より低いＴＩを有する薬物よりも安全であると考えられる（例えば、１０のＴＩを有する薬物は、３のＴＩを有する薬物よりも安全であると考えられる）。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、より高い治療指数（ＴＩ）をもたらす（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、より高いＴＩを有する、ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、より高いＴＩを有する、またはＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、より高いＴＩを有する）。一部の実施形態では、治療反応は、腫瘍負荷低減である。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、肝臓毒性のマウスモデルによって決定されるように、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して少ない毒性しかもたらさない（参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる、Niu et al J Immunology 2007 178:4194-4213）（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、少ない肝臓毒性しかもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、少ない肝臓毒性しかもたらさない；またはＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、少ない肝臓毒性しかもたらさない）。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性をもたらす（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性をもたらす、ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性をもたらす、またはＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４１ＢＢ抗体の投与と比較して、少ない肝臓毒性および大きい治療有効性（efficiacy）をもたらす）。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、組換えタンパク質（複数可）の投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＡＬＴのレベルが上昇される場合には、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）肝臓酵素のレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない（すなわち、操作された赤血球系細胞の投与前のレベルと比較して有意な効果がない）（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＡＬＴのレベルが上昇される場合には、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４１ＢＢ抗体の投与と比較して、ＡＬＴのレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＡＬＴのレベルが上昇される場合には、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、ＡＬＴのレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＡＬＴのレベルが上昇される場合には、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４１ＢＢ抗体の投与と比較して、ＡＬＴのレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない）。

一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、組換えタンパク質（複数可）の投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＩＦＮｇのレベルが上昇される場合には、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）のレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない（すなわち、操作された赤血球系細胞の投与前のレベルと比較して有意な効果がない）（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＩＦＮｇのレベルが上昇される場合には、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、ＩＦＮｇのレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＩＦＮｇのレベルが上昇される場合には、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、ＩＦＮｇのレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によってＩＦＮｇのレベルが上昇される場合には、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、ＩＦＮｇのレベルに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない）。

マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の肝臓浸潤は、肝臓毒性における重要な因子であると考えられる。一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、組換えタンパク質（複数可）投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によって浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数が増大される場合には、対応する組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数に対して、より少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない（すなわち、操作された赤血球系細胞の投与前のレベルと比較して有意な効果）（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によって浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数が増大される場合には、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４１ＢＢ抗体の投与と比較して、浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数に対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によって浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数が増大される場合には、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数に対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によって浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数が増大される場合には、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、浸潤マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の数に対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない）。理論に捉われようとは思わないが、操作された赤血球系細胞（例えば、除核された操作された赤血球系細胞）は、血管から骨髄に拡散し、そこで、活性化し、骨髄性細胞を拡大し、順に、肝臓に輸送されて、Ｋｕｐｆｅｒ細胞になり、ＣＤ８細胞を活性化することによって肝臓毒性を引き起こすと考えられる組換えタンパク質（例えば、抗体）とは異なり、血管中に隔離されると考えられる。

ある特定の実施形態では、炎症は、ＡＬＴおよびＩｓｈａｋスコア（参照によりその全文で本明細書に組み込まれる、Ishak K, Baptista A, Bianchi L, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995; 22:696）によって測定できる。一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞の投与は、組換えタンパク質（複数可）の投与前のレベルと比較して、組換えタンパク質（複数可）の投与によって肝臓炎症スコアが増大される場合には、組換えタンパク質（複数可）単独の投与と比較して、または外因性ポリペプチドの標的（例えば、受容体）と結合する抗体などの組換え結合タンパク質単独の投与と比較して、肝臓炎症スコアに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない（すなわち、操作された赤血球系細胞の投与前のスコアと比較して有意な効果がない）（例えば、４−１ＢＢＬを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前スコアに対する肝臓炎症スコアの増大をもたらす、組換え４−１ＢＢＬ単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、投与前スコアに対する肝臓炎症スコアに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；ＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前スコアに対する肝臓炎症スコアの増大をもたらす、組換えＩＬ−１２単独、組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独もしくはそれらの組合せの投与と比較して、投与前スコアに対する肝臓炎症スコアに対してより少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない；またはＩＬ−１２を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の投与は、投与前スコアに対する肝臓炎症スコアの増大をもたらす、組換えＩＬ−１２単独、組換え４−１ＢＢＬ単独、それらの組合せもしくは抗４−１ＢＢ抗体の投与と比較して、投与前スコアに対する肝臓炎症スコアに対して、より少ない効果しかもたらさない、もしくは全く効果をもたらさない）。

上記の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。上記の態様および実施形態のいずれかの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

一部の態様では、本開示は、対象において免疫キラー細胞を刺激する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、免疫キラー細胞を刺激するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、がんを処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象において感染症を処置する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、感染症を処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の投与よりも少ない毒性をもたらす。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量の投与よりも少ない毒性をもたらす。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と等価の（例えば、コピー数、重量またはモル濃度において）単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の有効量と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の有効量と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の有効量と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。

一部の態様では、本開示は、対象において免疫キラー細胞を刺激する方法であって、対象に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、免疫キラー細胞を刺激するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、がんを処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象において感染症を処置する方法であって、対象に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、感染症を処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の実施形態では、前記投与は、対象において、複数の操作された赤血球系細胞に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量に対して同等である単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量の投与よりも少ない毒性をもたらす。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの投与よりも少ない毒性をもたらす。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量の投与よりも少ない毒性をもたらす。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と量的に同じ量（例えば、コピー数またはモル濃度において）である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の有効量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の有効量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。

一部の実施形態では、第１の外因性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は複合体として存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分は融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１２）リンカーを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは複合体として存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインは融合ポリペプチドとして存在する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片は、ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインとリンカーによって連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含み、必要に応じて、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１２）リンカーを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、本開示は、対象において免疫キラー細胞を刺激する方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、免疫キラー細胞を刺激するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、がんを処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象において感染症を処置する方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、感染症を処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの投与よりも少ない毒性をもたらす。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量の投与よりも少ない毒性をもたらす。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と量的に同じ量（例えば、コピー数またはモル濃度において）である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の有効量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、ＩＬ−１２ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の有効量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。

一部の態様では、本開示は、対象において免疫キラー細胞を刺激する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、免疫キラー細胞を刺激するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、がんを処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象において感染症を処置する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１５ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、感染症を処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドまたはそれらの組合せの投与よりも少ない毒性をもたらす。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量またはそれらの組合せの投与よりも少ない毒性をもたらす。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と量的に同じ量（例えば、コピー数またはモル濃度において）である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。

一部の態様では、本開示は、対象において免疫キラー細胞を刺激する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、免疫キラー細胞を刺激するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、がんを処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象において感染症を処置する方法であって、対象に、４−１ＢＢＬポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、感染症を処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドまたはそれらの組合せの投与よりも少ない毒性をもたらす。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量またはそれらの組合せの投与よりも少ない毒性をもたらす。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と量的に同じ量（例えば、コピー数またはモル濃度において）である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じアゴニスト活性を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ生物学的効果を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれる４−１ＢＢＬポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離された４−１ＢＢアゴニスト抗体の量である。

一部の態様では、本開示は、対象において免疫キラー細胞を刺激する方法であって、対象に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、免疫キラー細胞を刺激するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、がんを処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象において感染症を処置する方法であって、対象に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドおよびＩＬ−１２ポリペプチドを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドを含む複数の操作された赤血球系細胞を、感染症を処置するために有効な量で投与することを含み、有効量が対象において毒性を引き起こさない方法を提供する。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において、単離されたＩＬ−１５ポリペプチド、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドまたはそれらの組合せの投与よりも少ない毒性をもたらす。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、有効量の投与は、対象において、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量またはそれらの組合せの投与よりも少ない毒性をもたらす。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と量的に同一の量（例えば、コピー数またはモル濃度において）である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１２ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１２ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ量（例えば、コピー数またはモル濃度において）を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ生物活性を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの等価量は、操作された赤血球系細胞の有効量に含まれるＩＬ−１５ポリペプチドの量と同じ治療効力を有する単離されたＩＬ−１５ポリペプチドの量である。

免疫キラー細胞活性化から恩恵を受ける状態の処置
外因性物質（例えば、ポリペプチド）を含む（例えば、提示する）操作された赤血球系細胞を投与する方法は、例えば、ＷＯ２０１５／０７３５８７およびＷＯ２０１５／１５３１０２に記載されており、各々、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる。

実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与する。処置できる例示的哺乳動物として、制限するものではないが、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、ヒト療法および獣医適用の両方に適用可能である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を患者に、１、２、３、４、５または６カ月毎に投与する。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の用量は、約１×１０^９〜２×１０^９、２×１０^９〜５×１０^９、５×１０^９〜１×１０^１０、１×１０^１０〜２×１０^１０、２×１０^１０〜５×１０^１０、５×１０^１０〜１×１０^１１、１×１０^１１〜２×１０^１１、２×１０^１１〜５×１０^１１、５×１０^１１〜１×１０^１２、１×１０^１２〜２×１０^１２、２×１０^１２〜５×１０^１２または５×１０^１２〜１×１０^１３個の細胞を含む。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、患者に、２週間〜１年、例えば、１カ月〜１年またはそれより長い、例えば、少なくとも２週間、４週間、６週間、８週間、３カ月、６カ月、１年、２年の期間にわたって患者の血流中で投与された赤血球系細胞の機能を維持するのに十分である投薬レジメン（投与の用量および周期性）で投与する。

一部の態様では、本開示は、免疫キラー細胞活性化を必要とする対象へ、免疫キラー細胞を刺激する方法であって、免疫キラー細胞を、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞と免疫細胞を刺激するのに有効な量で接触させることを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、対象は、がんを有すると診断されている。

一部の実施形態では、対象は、感染症を有する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の疾患または状態、例えば、がんまたは感染症を処置するための本明細書に記載の操作された赤血球系細胞の使用を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の疾患または状態、例えば、がんまたは感染症を処置するための医薬の生産のための本明細書に記載の操作された赤血球系細胞の使用を提供する。

がん
一部の態様では、本発明は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に、本明細書に記載の通り、免疫細胞、特に、ＮＫ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのキラー免疫細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞を投与することを含む方法を提供する。操作された赤血球系細胞を、対象にがんを処置するために有効な量で投与する。実施形態では、対象は、がんを有する、および／またはがんと診断されており、したがって、処置を必要としている。

本開示は、ある特定の種類のがんに制限されず、むしろ任意のがんが、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞によって処置されると企図される。ある特定の実施形態では、がんとして、これだけに限定されないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明のがん、骨に転移したがん、脳に転移したがん、肝臓に転移したがん、肺に転移したがん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼のがん、胆嚢がん、胃（gastric）がん、妊娠性絨毛腫瘍（ＧＴＴ）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、咽頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、奇胎妊娠、口および口腔咽頭がん、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、続発性がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃（stomach）がん、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん、子宮がん、膣がんおよび外陰部がんから選択されるがんが挙げられる。

ある特定の実施形態では、処置されるべきがんは、肺がん、肝細胞がん、黒色腫およびリンパ腫から選択される。さらなる実施形態では、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、処置されるべきがんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、肝細胞がんである。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、ホジキンリンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫である。

一部の実施形態では、処置されるべきがんは、固形腫瘍である。固形腫瘍として、これだけに限定されないが、乳がん、膀胱がん、結腸および直腸がん、子宮内膜がん、腎臓（腎細胞）がん、肺がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、脳がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃（stomach）がん、口および口腔がん、神経芽細胞腫、精巣がん、子宮がん、甲状腺がん、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃（stomach）、子宮および髄芽腫および外陰部がんが挙げられる。ある特定の実施形態では、処置されるべき固形腫瘍は、肺がん、肝細胞がんまたは黒色腫である。一部の実施形態では、固形腫瘍は、肺がんである。一部の実施形態では、固形腫瘍は、肝細胞がんである。一部の実施形態では、固形腫瘍は、黒色腫である。

ある特定の実施形態では、処置されるべきがんは、血液がんである。血液がんは、血液、骨髄またはリンパ系に影響を及ぼすがんである。血液がんは、５番目に最も一般的に発生するがんであり、がんによる死亡の２番目に多い原因に相当する。血液がんの最も一般的な形態として、白血病、リンパ腫および骨髄腫が挙げられる。白血病は、骨髄が異常な白血球を過剰産生する場合に発生し、影響を受ける白血球の種類によって分類される：骨髄性またはリンパ性。リンパ腫は、悪性白血球の制御されない成長をもたらし、リンパ節に腫瘍を形成するリンパ系のがんである。リンパ腫は、２つの主な種類：ホジキンと非ホジキンリンパ腫（ＨＬおよびＮＨＬ）に分類される。骨髄腫は、異常な形質細胞（抗体を産生する白血球の１種）が骨髄中に蓄積すると発生する。

白血病は、それらが急性であるか慢性であるか、骨髄性であるか、リンパ性であるかに基づいて４つの主な種類に分類され得る：急性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）。ＡＭＬの最初の処置後多数の患者が寛解（徴候および症状がないこと）を達成するが、一部の患者は、強化処置後でさえもその骨髄中に残存する白血病細胞を有する。これは、「難治性白血病」と呼ばれる。一部の患者は、寛解に到達するが、次いで、骨髄において白血病細胞の戻りがあり、正常血液細胞が減少する。これは、「再発白血病」と呼ばれる。

急性骨髄性白血病またはＡＭＬは、骨髄性芽球の増殖によって特徴付けられる。骨髄性芽球が骨髄にとって代わり、その結果、血小板、赤血球および好中球の産生が最小となる。主に、高齢者の疾患であり、診断の中央値年齢が６８歳である。２０１７年には、米国で、２０，０００より多いＡＭＬの新規症例があり、１０，０００より多い死亡がＡＭＬによって引き起こされた。

標準的な最前線のＡＭＬ処置は、４０年以上変わっていない：強化導入および地固め療法のレジメン。ほとんどの患者が反応するが、大部分は、経時的に再発する。したがって、ＡＭＬを有する多数の若い患者は、造血幹細胞移植またはＨＳＣＴを受け、移植が成功する場合には治癒的であり得る。２０１６年には、米国で３，５００人より多いＡＭＬ患者が、アロＨＳＣＴを受け、欧州では２００人を超える人がこの術式を受けた。

療法に反応し、生存するＡＭＬを有する患者は、造血幹細胞移植へとつながることが多く、患者の３分の２について治癒的であり得る。同種移植後に再発する患者の３分の１については（ＡＭＬ患者のために２０１５年に米国で、３，２３５の同種移植が実施された）、処置選択肢は制限され、ほぼすべての患者が１年のスパン内に死亡する。これらの場合には、患者は、主に、Ｔ細胞機能および抗腫瘍免疫を阻害する免疫チェックポイント関与（ＣＴＬＡ４−Ｂ７およびＰＤ−１−ＰＤＬ−１）のために移植片対腫瘍効果の利益を失う。

最近、ＡＭＬの処置のために、ゲムツズマブオゾガマイシン、抗ＣＤ３３抗体薬物コンジュゲート、ＣＰＸ−３５１、多剤併用化学療法および特定の突然変異を有する患者のために、ミドスタウリンおよびエナシデニブなどのさらなる療法が承認された。これらの療法は奏効率を改善し、より多くの患者が移植につながることを可能にするが、全生存率は低いままである。

ＮＫ細胞および自然免疫系の関与は、ＡＭＬの有効な免疫学的処置および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の潜在的にはその他の関連する血液学的悪性腫瘍の中心と考えられる。骨髄除去および同種移植後、ＮＫ細胞は、回復する第１のリンパ球集団であるが、その死滅機能およびサイトカイン分泌機能は、健康なドナーのＮＫ細胞と比較した場合には制限される。ＮＫ細胞の回復率と機能は、ＨＳＣＴ後の処置成績と関連しており、そのため、ＨＳＣＴ後のＮＫ細胞の数および機能を増大して移植片対白血病効果を刺激することは、ＡＭＬの処置のためにＨＳＣＴを受けている患者において生存を増大する可能性を有する。

したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を活性化して、移植反応および／または全生存期間を改善する意図で、ＡＭＬの処置において、特に、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている患者において使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む操作された赤血球系細胞を、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている患者においてＡＭＬの処置において使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片および４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む操作された赤血球系細胞を、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている患者においてＡＭＬの処置において使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびにＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含む外因性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている患者においてＡＭＬの処置において使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびにＩＬ−１２ポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている患者においてＡＭＬの処置において使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、ＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている患者においてＡＭＬの処置において使用する。

別の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を、再発性または難治性ＡＭＬの処置において使用する。一実施形態では、操作された赤血球系細胞を、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を活性化して、移植反応および全生存期間を改善する意図で、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている患者において再発性または難治性ＡＭＬの処置において使用する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の通りのＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を再発性または難治性ＡＭＬの処置において使用する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の通りのＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片および４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を、再発性または難治性ＡＭＬの処置において使用する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の通りのＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびに４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を、再発性または難治性ＡＭＬの処置において使用する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の通りのＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を、再発性または難治性ＡＭＬの処置において使用する。

実施形態では、ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方を活性化して、移植反応および全生存期間を改善する意図で処置されるべき患者は、同種ＨＳＣＴを受けている、または受ける予定となっている。

ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データセットの最近の解析は、腫瘍のゲノムランドスケープを腫瘍免疫と関連付けており、ネオ抗原負荷をＴ細胞反応の駆動と関係づけ（Brown et al., Genome Res. 2014 May; 24(5):743-50, 2014）、免疫浸潤物と関連する体細胞突然変異を同定する（Rutledge et al., Clin Cancer Res. 2013 Sep 15; 19(18):4951-60, 2013）。Rooney et al.（2015 Jan 15;160(1-2):48-61）は、ネオ抗原およびウイルスは、細胞溶解活性を駆動する可能性が高いことを示唆しており、腫瘍が免疫攻撃に抵抗することを可能にする既知および新規突然変異を示す。したがって、ある特定の実施形態では、処置されるべきがんは、発がん性ウイルスと関連するがんである。発がん性ウイルスの限定されない例として、例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型およびＣ型肝炎（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）およびポリオーマウイルスが挙げられる。他のある特定の実施形態では、がんは、レトロウイルスエピトープが同定されるがんである。ウイルスと関連する、本発明の方法を使用して処置できるがんとして、これだけに限定されないが、子宮頸がん、頭頸部がん、リンパ腫および腎臓明細胞癌が挙げられる。

低いＭＨＣクラスＩ発現を有するがん
がん細胞でのＭＨＣＩ発現は、Ｔ細胞による検出および破壊にとって必要である。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８＋）は、非自己から自己を描写するためにＭＨＣクラスＩ分子による標的細胞上での腫瘍抗原提示を必要とする。腫瘍が宿主免疫応答を逃れる最も一般的な手段のうち１つは、ＭＨＣクラスＩ分子発現の下方調節によるものであり、その結果、腫瘍は、低いＭＨＣＩ発現を有し、それによって任意の内因性または治療用抗腫瘍Ｔ細胞反応を無効にする（Haworth et al., Pediatr Blood Cancer. 2015 Apr; 62(4): 571-576）。ほとんどの場合、腫瘍細胞でのＭＨＣ発現の喪失は、エピジェニック事象およびＭＨＣ遺伝子座の転写の下方調節および／または抗原プロセシング機構によって媒介される。プロセシングされたペプチドがないことは、空のＭＨＣ分子が細胞表面上で安定ではないのでＭＨＣ発現の減少につながる。

種々の成人腫瘍におけるＭＨＣクラスＩ発現が、以下の表７に示されている。種々の小児がんにおけるＭＨＣクラスＩ発現は、以下の表８に示されている。ＭＨＣ発現に関して最も広く研究された小児腫瘍は、神経芽細胞腫であり、これは、特にハイリスク患者において特に低いＭＨＣクラスＩ発現を有する。

ＮＫ細胞は、ＣＴＬと同一の死滅機序を使用して事前感作を伴わずに腫瘍細胞を溶解可能である自然免疫に寄与するリンパ球のサブセットである。サイトカイン分泌および細胞毒性を含むナチュラルキラー反応性は、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）およびナチュラル細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）などの、いくつかの生殖系列によってコードされる抑制性および活性化受容体のバランスによって制御される。標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の存在は、ＮＫ細胞上のＭＨＣクラスＩ特異的受容体、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のそのような抑制性リガンドの１つとして役立つ。ＫＩＲ受容体の関与は、ＮＫ活性化を遮断し、不活性化シグナルを引き起こすことによって連続遭遇に応じる能力を逆説的に保存する。したがって、ＫＩＲがＭＨＣクラスＩと十分に結合できる場合には、この関与は、死滅のためのシグナルを無効にする場合があり、標的細胞が生存することを可能にする。対照的に、ＮＫ細胞が標的細胞上のＭＨＣクラスＩと十分に結合できない場合には、標的細胞の死滅が進行し得る。結果的に、低ＭＨＣクラスＩを発現し、Ｔ細胞媒介性攻撃を逃れることができると考えられる腫瘍は、実際には、代わりに、ＮＫ細胞媒介性免疫応答に対して感受性であり得る。

したがって、ある特定の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞を使用して、低ＭＨＣＩ提示によって特徴付けられるがんを処置する。例えば、本発明の操作された赤血球系細胞を使用して、表７および８に示されるような低ＭＨＣＩ提示によって特徴付けられるがんを処置する。一部の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞を使用して、表７に示されるような低ＭＨＣＩ提示によって特徴付けられるがんを処置する。別の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞を使用して、表８５に示されるような低ＭＨＣＩ提示によって特徴付けられるがんを処置する。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、結腸直腸癌である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、乳腺癌である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、子宮内膜癌である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、子宮頸癌である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、頭頸部癌である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、前立腺癌である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、黒色腫である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、肺癌である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、神経芽細胞腫である。一部の実施形態では、低ＭＨＣＩ提示を有するがんは、ユーイング肉腫／ＰＮＥＴである。

ストレスリガンドの調節を有するがん
他の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞を用いて処置されるべきがんは、ＮＫ受容体関与（活性化または抑制のいずれか）を変更する細胞性ストレスの効果を示す腫瘍によって特徴付けられる。例えば、がん細胞は、一般に、低酸素症、慢性増殖性シグナルによる（すなわち、構成的活性化Ｒａｓ突然変異による）一定状態の細胞性ストレスおよび進行中のゲノム不安定性中に存在する。したがって、多数のがん細胞は、その表面上のキラー活性化受容体（ＫＡＲ）リガンドを上方調節し、それらをＮＫ細胞死滅に対して感受性にする。しかし、ストレスリガンドの調節は、ＮＫ細胞認識を減少するためにがん細胞によって使用される重要なエスケープ機序である。例えば、ストレスリガンドＵＬＢＰ２は、腫瘍細胞において頻繁に過剰発現されるＲＮＡ結合性タンパク質によって抑制され得る。この発がん性タンパク質の、ＵＬＢＰ２ｍＲＮＡとの結合によって、ｍＲＮＡの安定性が低減され、細胞表面上のＵＬＢＰ２レベルが下方調節される。その結果、腫瘍細胞はＮＫ細胞認識から保護される（Schmiedel D, et al. Elife (2016) 5:e13426）。ＮＫ細胞の阻害はまた、神経芽細胞腫ならびに頭頸部癌について示されるようなストレスリガンドＭＩＣＡの可溶性形態によるＮＫＧ２Ｄの遮断によって生じ得る。したがって、一部の実施形態では、本発明は、１つまたは複数のストレスリガンドまたはＫＡＲリガンドのレベルが上方調節されるがんを処置する方法を提供する。理論に捉われようとは思わないが、ＮＫ細胞死滅に対して感受性であるこのようながんは、ＮＫ細胞の数および／または活性の増大に対して特に応答性であることが予想される。別の実施形態では、本発明は、ストレスリガンドのレベルまたは活性が下方調節または阻害されるがん、例えば、ストレスリガンドまたはＫＡＲリガンドのサプレッサーが発現されるがんを処置する方法を提供する。理論に捉われようとは思わないが、サプレッサーの存在のためにＮＫ細胞死滅に対してあまり感受性ではないこのようながんは、ＮＫ細胞の数および／または活性の増大から恩恵を受けることが予想される。

４−１ＢＢアゴニストに対する非反応性によって特徴付けられるがん
他の実施形態では、本発明の操作された赤血球系細胞、例えば、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を用いて処置されるべきがんは、４−１ＢＢアゴニストに対する非反応性によって特徴付けられる。一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニストに対するがんの非反応性は、高用量での毒性、例えば、肝臓毒性によるものである。したがって、本開示は、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞の投与による例えば、４−１ＢＢアゴニストの毒性のために、１種または複数の４−１ＢＢアゴニストに対して非反応性であるがんを有する対象を処置する方法を含む。

一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、当技術分野で公知の通り、任意の４−１ＢＢアゴニスト抗体であり得る。一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、ウトミルマブ（utomilumab）である（例えば、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０３２４３３を参照されたい）。一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、ＩＮＢＲＸ−１０５である（例えば、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７／１２３６５０を参照されたい）。一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、ＡＤＧ１０６である（例えば、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１９／０３６８５５を参照されたい）。一部の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、ウレルマブである（例えば、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／０３５５８４を参照されたい）。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、４−１ＢＢポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびに４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。

チェックポイント阻害に対する反応によって特徴付けられる腫瘍
チェックポイント阻害剤は、がん処置を改革してきたが、その制限は、ますます明らかとなっている。反応は特定の腫瘍の種類に限局され、わずかな患者のみが治癒される。現在、免疫療法における課題は、チェックポイント阻害剤の有効性をより多くの腫瘍の種類にわたって広げること、ならびに反応の速度、深度および持続期間を増大することである。反応を改善し、広げる両方のために、免疫系の両アームを刺激することによって、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞をチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチド、またはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならび４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドおよび４−１ＢＢＬポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびにＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を使用して、その反応性、例えば、チェックポイント阻害剤に対して反応性または非反応性によって特徴付けられるがんを処置する。

免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＣＲ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯおよびＡ２ＡＲは、腫瘍微小環境におけるＴ細胞反応の調節において重要な役割を果たす細胞表面シグナル伝達受容体である。腫瘍細胞は、その発現および活性を上方調節することによってその利益のためにこれらのチェックポイントを利用し、それによって、抗腫瘍免疫応答を逃れるとわかっている。

しかし、一部のヒト腫瘍は、患者の免疫系によって排除され得る。例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系などのチェックポイント分子を標的とする免疫チェックポイント阻害剤が、いくつかの種類のがんにおいて臨床活性を示しており、完全奏効および腫瘍寛解につながる可能性がある。免疫チェックポイント阻害剤は、同時抑制性Ｔ細胞シグナル伝達を撹乱することによって抗腫瘍免疫応答を再活性化する。特に、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体の作用様式は、それぞれ、腫瘍が抗腫瘍免疫応答からの保護として利用してきた、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の阻害によるものである。これらのチェックポイント分子を阻害すること（例えば、アンタゴニスト抗体を用いて）によって、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が、増殖し、腫瘍細胞を破壊することが可能となり得る。しかし、チェックポイント阻害剤を用いる処置を受けているがん患者の大部分は、がんおよび治療介入に応じて１２カ月以内に進行する。ＭＨＣ複合体は、免疫系における重要なつながりであり、Ｔ細胞ががん細胞を認識し、死滅させる方法であるが、ＮＫ細胞の死滅機能も遮断する。チェックポイント阻害剤に対する抵抗の一般的な手段は、Ｔ細胞に対してがんを不可視にするＭＨＣ発現の喪失であるが、結果として、ＮＫ細胞依存性死滅に対して感受性となる。腫瘍細胞でのＭＨＣ提示の下方調節および周囲の領域においてＴ細胞を使い果たすことが、この免疫療法抵抗に寄与する。

したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を、チェックポイント阻害剤に対して反応していた、反応性である、または反応性であるとわかっているがん（例えば、固形腫瘍または血液がん）の処置において使用する。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死−１（ＰＤ−１）またはそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫系チェックポイントを標的とするいくつかの免疫調節剤が、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫および再発性または転移性頭頸部扁平細胞癌を含む複数のがんの処置のための規制当局の承認を受けている。したがって、一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を使用して、ＰＤ−１反応性腫瘍によって特徴付けられるがんを処置する。実施形態では、操作された赤血球系細胞をこのようながんの処置のためのチェックポイント阻害剤と組み合わせて、処置のために投与または使用する。このような方法において適したチェックポイント阻害剤は、本明細書に記載されている。

他の実施形態では、本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を使用して、もはやチェックポイント阻害剤に対して反応しない患者において固形腫瘍を処置する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、単剤療法として単独で使用して、もはやチェックポイント阻害剤に対して反応しない患者において固形腫瘍を処置する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用して、もはやチェックポイント阻害剤に対して反応しない患者において固形腫瘍を処置する。一部の実施形態では、固形腫瘍は、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞癌、膀胱がんおよび頭頸部がんから選択される。

上記で論じた通り、ＭＨＣ複合体は、免疫系における重要なつながりであり、Ｔ細胞ががん細胞を認識し、死滅させる方法であるが、ＮＫ細胞の死滅機能も遮断する。チェックポイント阻害剤に対する抵抗の一般的な手段は、Ｔ細胞に対してがんを不可視にするＭＨＣ発現の喪失であるが、結果として、ＮＫ細胞依存性死滅に対して感受性となる。一部の実施形態では、本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を使用して、ＭＨＣ発現の喪失によりチェックポイント阻害剤療法で進行してしまった患者集団を処置する。

例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２のいずれかを遮断、低減および／もしくは阻害する、ならびに／またはＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断、低減および／もしくは阻害する薬剤（限定されない例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、オプジーボ、ＢＲＩＳＴＯＬＭＹＥＲＳＳＱＵＩＢＢ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬＭＹＥＲＳＳＱＵＩＢＢ）およびＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）のうち１種または複数）と組み合わせて使用できる。一部の実施形態では、本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を、ＣＴＬＡ−４の活性および／またはＣＴＬＡ−４の１つもしくは複数のその受容体（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ−２およびＰＰＰ２Ｒ５Ａ）との結合を遮断、低減および／または阻害する薬剤と組み合わせて使用できる。例えば、一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４の活性を阻害する薬剤は、制限されない例として、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｙｅｒｖｏｙ、ＢＭＳ）および／またはトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）などの抗体である。さらに、本明細書において提供される操作された赤血球系細胞を、例えば、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬＳ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ガレクチン−９、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、ＴＭＩＧＤ２および種々のＢ−７ファミリーリガンド（これだけに限定されないが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６およびＢ７−Ｈ７を含む）などの免疫チェックポイント分子を標的とする１種または複数の遮断抗体と組み合わせて使用できる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて投与する。

本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞を用いる処置は、Ｔ細胞だけでなくＮＫ細胞の活性化も促進するように機能し、それによって、局所適応免疫応答を再活性化し、がんをチェックポイント阻害に対して再感作させ、自然免疫応答の活性化によって腫瘍死滅を相加的または相乗的に増強することができる。

前記の処置の方法の特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびに４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。

前記の処置の方法の特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、インターロイキン−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片およびインターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、インターロイキン−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片およびインターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびにＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。

前記の処置の方法の特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、インターロイキン−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片およびインターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、インターロイキン−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）ポリペプチドまたはその断片およびインターロイキン−１２ｐ３５（ＩＬ−１２ｐ３５）ポリペプチドまたはその断片を含む外因性刺激性ポリペプチドならびに４−１ＢＢＬポリペプチドを含む外因性刺激性ポリペプチドを含む。

高い腫瘍遺伝子変異数を有するがん
腫瘍は、成長するにつれてその遺伝物質に突然変異を蓄積し得る。これらの体細胞突然変異は、細胞分裂の際に新規がん細胞に受け継がれることがある。腫瘍細胞中の獲得された突然変異は、タンパク質の発現を変更し、ネオ抗原の形成をもたらすことがある。腫瘍遺伝子変異数（ＴＭＢ）は、腫瘍細胞によって保持される突然変異の測定値である。ＴＭＢは、さまざまな進行がんにおいて免疫療法に対する反応を予測する新規臨床マーカーである。ＴＭＢは、タンパク質ベースのバイオマーカーとは異なり、腫瘍ゲノムのコーディング領域あたりの突然変異の総数の定量的尺度である。高いレベルのＴＭＢを有する腫瘍ほど、より多くのネオ抗原を発現すると考えられ、これによってより頑強な免疫応答を、したがって、免疫療法に対するより耐久性のある反応を可能にし得る。したがって、一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を使用して、高い遺伝子変異数を有する腫瘍によって特徴付けられるがんを処置する。

血管形成された腫瘍／漏れやすい脈管構造を有する腫瘍
他の実施形態では、本開示の操作された赤血球系細胞を使用して、高度に血管形成された腫瘍を処置する。理論に捉われずに、より大きな血管形成ほど、腫瘍を本開示の操作された赤血球系細胞に対して接近しやすくする。腫瘍血管分布は、例えば、毛細血管間距離（腫瘍酸素化を反映すると考えられる）および微小血管密度（腫瘍血管新生の組織学的評価を提供する）によって測定できる。高度血管性腫瘍は、血管起源の任意の腫瘍、例えば、血管腫、リンパ管腫、血管内皮腫、カポジ肉腫、血管肉腫、血管芽腫であり得る。

他の実施形態では、本開示の操作された赤血球系細胞を使用して、漏れやすい脈管構造を有する腫瘍を処置する。腫瘍中の血管は異常であるという一般的な合意がある。この異常性の１つの顕在化が、欠陥のある、漏れやすい内皮である。血管の漏れやすさは、腫瘍の内部環境およびおそらくは血管新生の速度に影響を及ぼすだけでなく、治療薬の接近も支配する。理論に捉われずに、漏れやすい血管は、本開示の操作された赤血球系細胞へのより多い接近を提供するであろう。

感染症
一部の態様では、本発明は、対象において感染症を処置する方法であって、対象に、免疫細胞、例えば、免疫キラー細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞を投与することを含む方法を提供する。操作された赤血球系細胞を、対象において感染症を処置するために有効な量で投与する。

ある特定の実施形態では、感染症は、ウイルス感染によって引き起こされる。

本発明の操作された赤血球系細胞を用いて処置されるべきウイルス感染として、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、狂犬病ウイルスおよび風疹ウイルスが挙げられる。その他のウイルス標的として、パラミクソウイルス科（例えば、ニューモウイルス、モルビリウイルス、メタニューモウイルス、レスピロウイルスまたはルブラウイルス）、アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス、例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、アルテリウイルス科（例えば、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルスまたはウマ動脈炎ウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、フレボウイルスまたはハンタウイルス）、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルスまたはトロウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラ様ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、ヘパシウイルスまたはフラビウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルスまたはリンホクリプトウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスまたはトゴトウイルス）、パルボウイルス科（例えば、パルボウイルス）、ピコルナウイルス科（Picomaviridae）（例えば、エンテロウイルスまたはヘパトウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、オルソポックスウイルス、トリポックスウイルスまたはレポリポックスウイルス）、レトロウイルス科（例えば、レンチウイルスまたはスプーマウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、リッサウイルス、ノビラブドウイルスまたはベジクロウイルス）およびトガウイルス科（例えば、アルファウイルスまたはルビウイルス）が挙げられる。これらのウイルスの具体例として、ヒト呼吸器コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ〜Ｃ、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス１〜９型が挙げられる。

ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎（hetpatitis）ウイルス（ＨＢＶ）、結核、ヒト免疫不全（immunodeficientcy）ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、乳頭腫ウイルスおよびサイトメガロウイルスから選択されるウイルスによって引き起こされる。

他の実施形態では、ウイルス感染は、ＭＨＣＩ提示の下方調節によって特徴付けられる。ヒトウイルスは、ＣＴＬ溶解をエスケープするためにＭＨＣクラスＩ経路を阻害する多様な機序を使用する。ＭＨＣクラスＩ経路を干渉するタンパク質の例は、アデノウイルスおよびレトロウイルスによってコードされている（Tortorella et al., Annu Rev Immunol. 2000; 18():861-926）。これらとして、アデノウイルスＥ３／１９Ｋおよびヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）Ｎｅｆ遺伝子産物が挙げられる。ヘルペスウイルスは、免疫適格性宿主において持続性の生涯感染を確立しており、すべてではなくともほとんどのヘルペスウイルスが、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を阻害するタンパク質をコードし、これらのタンパク質は、ウイルスがＣＴＬによる検出を逃れることを可能にすることにおいて重要な役割を果たす。これは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）によって例示され、これでは、ウイルスゲノムの独特な短い領域が、ＭＨＣクラスＩ経路を阻害する少なくとも５種のタンパク質（ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６、ＵＳ１０およびＵＳ１１）をコードする。

ＭＩＣＢは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体ＮＫＧ２Ｄのストレス誘導性リガンドであり、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞のＮＫ細胞死滅にとって重要である。ＮＫ細胞死滅の回避の別の例では、ウイルス感染の際にＭＩＣＢ発現が下方調節され、ＮＫＧ２Ｄの結合の減少およびＮＫ細胞による死滅の低減につながる。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＭＩＣＢの下方調節と関連するウイルス疾患を処置する方法であって、ウイルス感染した細胞のＮＫ細胞による死滅が増大される方法を提供する。

ある特定の実施形態では、感染症は、細菌感染によって引き起こされる。

本発明の操作された赤血球系細胞を用いて処置されるべき細菌感染として、これだけに限定されないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｅｏｅａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｏｂａｃｔｅｒｉａｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｐ．、腸内毒素原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、リケッチア、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｑｕｉｎｔａｎａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ、ＰｒｏｔｅｕｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが挙げられる。

対象
本明細書に記載の方法は、これらの方法の恩恵を経験し得る任意の対象で使用するように意図されている。したがって、「対象」、「患者」および「個体」（同義的に使用される）は、ヒトならびに非ヒト対象、特に、飼育化動物を含む。

一部の実施形態では、対象および／または動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジまたは非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジーまたはヒヒである。他の実施形態では、対象および／または動物は、非哺乳動物である。一部の実施形態では、対象および／または動物は、ヒトである。一部の実施形態では、ヒトは、小児のヒトである。他の実施形態では、ヒトは成体のヒトである。他の実施形態では、ヒトは、高齢期のヒトである。他の実施形態では、ヒトは、患者と呼ばれることもある。

ある特定の実施形態では、ヒトは、約０カ月〜約６カ月齢、約６〜約１２カ月齢、約６〜約１８カ月齢、約１８〜約３６カ月齢、約１〜約５歳、約５〜約１０歳、約１０〜約１５歳、約１５〜約２０歳、約２０〜約２５歳、約２５〜約３０歳、約３０〜約３５歳、約３５〜約４０歳、約４０〜約４５歳、約４５〜約５０歳、約５０〜約５５歳、約５５〜約６０歳、約６０〜約６５歳、約６５〜約７０歳、約７０〜約７５歳、約７５〜約８０歳、約８０〜約８５歳、約８５〜約９０歳、約９０〜約９５歳または約９５〜約１００歳のさまざまな年齢を有する。

他の実施形態では、対象は、非ヒト動物であり、したがって、本開示は、獣医使用に関する。具体的な実施形態では、非ヒト動物は、ペットである。別の具体的な実施形態では、非ヒト動物は、家畜動物である。ある特定の実施形態では、対象は、化学療法を受けることができないヒトがん患者である、例えば、患者は、化学療法に対して非反応性である、または化学療法の適した治療域を有するには病気が重すぎる（例えば、あまりに多数の用量−またはレジメン−制限副作用を経験している）。ある特定の実施形態では、対象は、進行性および／または転移性疾患を有しているヒトがん患者である。

一部の実施形態では、対象は、本開示の免疫キラー細胞を刺激するのに十分である複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、免疫キラー細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞を用いる処置のために選択される。一部の実施形態では、対象は、本開示の免疫キラー細胞を刺激するのに十分である複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、免疫キラー細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞を用いるがんの処置のために選択される。一部の実施形態では、対象は、本開示の免疫キラー細胞を刺激するのに十分である複数の外因性刺激性ポリペプチドを含む、免疫キラー細胞を刺激するように操作された赤血球系細胞を用いる感染症の処置のために選択される。

一部の実施形態では、対象は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を用いる処置のために選択され、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、本開示のＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、例えば、４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を用いるがんの処置のために選択され、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、本開示のＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、例えば、４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を用いる感染症の処置のために選択され、第１の外因性刺激性ポリペプチドは、本開示のＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、例えば、４−１ＢＢＬを含む第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む。

一部の実施形態では、対象は、本開示のＭＩＣＡ、ＭＩＣＢおよびＩＧＦ−１からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞を用いる処置のために選択される。

ＩＶ．医薬組成物
本開示は、有効成分として本開示の操作された赤血球系細胞を含む医薬組成物の調製および使用を包含する。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。このような医薬組成物は、対象への投与に適した形態での、少なくとも１種の有効成分（例えば、操作された赤血球系細胞の有効用量）の組合せとして、有効成分単独からなり得る、または医薬組成物は、有効成分および１種もしくは複数の薬学的に許容される担体、１種もしくは複数のさらなる（活性および／または不活性の）成分またはこれらの一部の組合せを含み得る。

本開示の医薬組成物は、処置される（または防止される）べき疾患に対して適当な方法で投与できる。適当な投与量は、臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって左右される。

医薬組成物の投与は、エアゾール吸入、注射、経口摂取、輸血、埋め込みまたは移植によってを含め、任意の従来法で実施できる。本開示の組成物を、患者に皮下に、皮内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与することができる。医薬組成物を、腫瘍またはリンパ節中に直接注入できる。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、有効成分を組み合わせることができ、組み合わせた後に、対象に有効成分を投与するために使用できる化学組成物を意味する。

本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製できる。一般に、このような調製方法は、有効成分を、担体または１種もしくは複数の他の付属成分と関連させ、次いで、必要な場合または望ましい場合には、生成物を所望の単回または複数回用量単位に成形またはパッケージングするステップを含む。

本明細書において提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの倫理的投与に適している医薬組成物に向けられているが、このような組成物は、すべての種類の動物への投与に一般的に適しているということは当業者には理解されよう。組成物を種々の動物への投与にとって適したものにするための、ヒトへの投与に適している医薬組成物の修飾は、十分に理解されており、当業の獣医学の薬理学者ならば、このような修飾をあるとすれば、単に通常の実験を用いて設計および実施できる。本開示の医薬組成物の投与が考慮される対象として、これだけに限定されないが、ヒトおよび他の霊長類、商業的に関連する哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌを含む哺乳動物、商業的に関連する鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウを含む鳥類、養殖魚および観賞魚を含む魚類および甲殻類、例えば、養殖貝類が挙げられる。

本開示の方法において有用である医薬組成物は、経口の、直腸の、膣の、非経口の、局所の、肺の、鼻腔内、病巣内、頬側の、眼の、静脈内、臓器内または別の投与経路に適した製剤で調製、パッケージングまたは販売できる。他の企図される製剤として、投射されるナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含有する再密閉された赤血球および免疫学的ベースの製剤が挙げられる。

本開示の医薬組成物は、単回単位用量として、または複数の単回単位用量としてバルクで調製、パッケージングまたは販売できる。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の別個の量である。有効成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう有効成分の投与量またはこのような投与量の好都合な画分、例えば、このような投与量の２分の１もしくは３分の１などと等しい。

本開示の医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容される担体および任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の同一性、大きさおよび状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変わる。例として、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間の有効成分を含み得る。

本開示の医薬組成物は、有効成分に加えて、１種または複数のさらなる医薬上活性な物質をさらに含み得る。特に企図されるさらなる物質として、制吐剤ならびにシアン化物およびシアン酸スカベンジャーなどのスカベンジャーならびにＡＺＴ、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターロイキン−２、インターフェロン、サイトカインなどが挙げられる。

本開示の医薬組成物の徐放性または持続放出性製剤を、従来技術を使用して作製できる。

本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織を物理的に破損することおよび組織中の破損を通した医薬組成物の投与によって特徴付けられる任意の投与経路を含む。したがって、非経口投与として、これだけに限定されないが、組成物の注射による、外科的切開による組成物の適用による、組織浸透性非外科的創傷を通る組成物の適用などによる医薬組成物の投与が挙げられる。特に、非経口投与は、これだけに限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射および腎臓透析注入技術を含むように企図される。

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水または滅菌等張性生理食塩水と組み合わされた有効成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与に、または連続投与に適した形態で、調製、パッケージングまたは販売できる。注射用製剤は、アンプルでなどの単位投与形で、または防腐剤を含有する複数回用量容器で、調製、パッケージングまたは販売できる。非経口投与用製剤として、これだけに限定されないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペーストおよび埋め込み可能な持続放出性または生分解性製剤を含む。このような製剤は、これだけに限定されないが、懸濁剤、安定化剤または分散剤を含む１種または複数のさらなる成分をさらに含み得る。

医薬組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液または溶液の形態で調製、パッケージングまたは販売できる。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って製剤化でき、有効成分に加えて、本明細書に記載のさらなる成分、例えば、分散剤、湿潤剤または懸濁剤を含み得る。このような滅菌注射用製剤は、例えば、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、水または１，３−ブタンジオールを使用して調製できる。他の許容される希釈剤および溶媒として、これだけに限定されないが、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液および固定油、例えば、合成モノ−またはジ−グリセリドが挙げられる。有用であるその他の非経口投与可能な製剤として、有効成分を、微晶質形態で、リポソーム調製物で、または生分解性ポリマー系の構成成分として含むものが挙げられる。持続放出または埋め込み用組成物は、薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料、例えば、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩を含み得る。

本開示の操作された赤血球系細胞を、動物、好ましくは、ヒトに投与できる。操作された赤血球系細胞を、それによって拡大されるＴ細胞またはＮＫ細胞とともにまたはともなわずに投与する場合には、それらを約１００，０００〜約１０億個細胞の範囲の量で投与でき、細胞は、それを必要とする動物、好ましくは、ヒト患者中に注入される。さらに、投与される正確な投与量は、これだけに限定されないが、動物の種類および処置されている疾患状態の種類、動物の齢および投与経路を含む、任意の数の因子に応じて変わる。

操作された赤血球系細胞を、毎日数回ほどの頻度で動物に投与できる、または１日１回、週に１回、２週に１回、月に１回などの少ない頻度で、もしくはさらに少ない頻度で、例えば、数カ月に１回または年に１回もしくはそれより少なく投与できる。用量の頻度は、当業者には容易に明らかとなり、これだけに限定されないが、処置されている疾患の種類および重症度、動物の種類および齢などといった任意の数の因子に応じて変わるであろう。

操作された赤血球系細胞（またはそれによって拡大されるＴ細胞またはＮＫ細胞）を、種々の他の化合物（多数の他のものの中でも、サイトカイン、化学療法薬、チェックポイント阻害剤および／または抗ウイルス薬）と同時投与できる。あるいは、化合物（複数可）を、操作された赤血球系細胞（またはそれによって拡大されるＴ細胞またはＮＫ細胞）の１時間前、１日前、１週間前、１月前またはそれより長く前に、またはそれらの任意の並べ替えで投与できる。さらに、化合物（複数可）を、操作された赤血球系細胞（またはそれによって拡大されるＴ細胞またはＮＫ細胞）の投与の１時間後、１日後、１週間後、またはそれよりも長く後に、またはそれらの任意の並べ替えで投与できる。頻度および投与レジメンは、当業者には容易に明らかとなり、これだけに限定されないが、処置されている疾患の種類および重症度、動物の齢および健康状態、投与されている化合物（単数または複数）の同一性、種々の化合物および操作された赤血球系細胞（またはそれによって拡大されるＴ細胞またはＮＫ細胞）の投与経路などといった、任意の数の因子に応じて変わるであろう。

さらに、本明細書において提供される本開示に基づいて、操作された赤血球系細胞が哺乳動物に投与される予定である場合には、細胞を、それらが「成長なしの状態」にある、すなわち、細胞が哺乳動物に投与される場合に分裂できないように処置することは、当業者には理解されるであろう。本明細書において別の場所で論じたように、細胞に、それらを哺乳動物中に投与されると成長または分裂できないようにするように照射できる。細胞を、特に、ヒトへ投与されるようにする、成長できないようにするためのハプテン化（haptenization）（例えば、ジニトロフェニルおよび他の化合物を使用する）を含む他の方法は、当技術分野で公知であり、これらの方法は本明細書においてさらには論じない。さらに、一部の本明細書において論じられる分子をコードするプラスミドベクターを用いてトランスフェクトされた操作された赤血球系細胞を使用する第Ｉ相臨床試験において、ｉｎｖｉｖｏで分裂できないようにされている操作された赤血球系細胞の投与の安全性は確立されている。

一部の実施形態では、本開示は、複数の本明細書に記載の操作された赤血球系細胞および医薬担体を含む医薬組成物を特徴とする。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の通りの操作された赤血球系細胞の集団および医薬担体を含む医薬組成物を特徴とする。本明細書において別の場所で記載される通りの、任意の単一の操作された赤血球系細胞、複数の操作された赤血球系細胞または操作された赤血球系細胞の集団は、本発明の医薬組成物中に存在し得るということは理解されるであろう。

一部の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、操作された（すなわち、修飾された）赤血球系細胞および未修飾の赤血球系細胞を含む。例えば、赤血球系細胞（例えば、修飾されたおよび未修飾の赤血球系細胞）の単回単位用量は、種々の実施形態において、約、少なくとも、または多くとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％）、８５％、９０％、９５％または９９％の操作された赤血球系細胞を含む場合があり、組成物中の残りの赤血球系細胞は、操作されていない。

一部の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、操作された除核赤血球系細胞および有核赤血球系細胞を含む。例えば、操作された赤血球系細胞（例えば、除核および有核赤血球系細胞）の単回単位用量は、種々の実施形態において、約または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の除核赤血球系細胞を含む場合があり、組成物中の残りの赤血球系細胞は、有核である。

併用療法
一部の実施形態によれば、本開示は、対象にさらなる物質を投与することをさらに含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、同時投与および／または同時製剤化に関する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって腫瘍を死滅させるモノクローナル抗体と組み合わせて使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載の通りのＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片を含む操作された赤血球系細胞を、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって腫瘍を死滅させるモノクローナル抗体と組み合わせて使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載の通りのＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片およびＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片および４−１ＢＢＬを含む操作された赤血球系細胞を、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって腫瘍を死滅させるモノクローナル抗体と組み合わせて使用する。

腫瘍細胞の表面上の腫瘍選択的抗原を認識する腫瘍特異的ｍＡｂが、毒性分子を標的細胞に方向づけること、標的細胞増殖を阻害すること、免疫細胞のための抑制シグナルを遮断することおよび標的をＡＤＣＣによって死滅させるように免疫細胞を方向付けることを含めた種々の機序によって腫瘍細胞を標的とし、攻撃する。ＡＤＣＣによって機能する腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体の例として、これだけに限定されないが、リツキシマブ、オビヌツズマブ、ジヌツキシマブ、トラスツズマブおよびセツキシマブが挙げられる。例えば、トラスツズマブ（traztuzumab）（Ｒｏｃｈｅ）は、乳がん細胞の表面上に発現されたＨＥＲ−２抗原と結合する。局在ＮＫ細胞が、抗体のＦｃ部分を認識し、ひとたび結合すると、プログラム細胞死（アポトーシス）シグナルを駆動する細胞毒素を標的中に放出する。このような腫瘍特異的ｍＡｂを含む併用療法は、本発明の方法に包含される。

一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の投与は、別の物質と同時投与されると相乗的に作用し、このような物質が単剤療法として使用される場合によく使用される用量よりも低い用量で投与される。

制限するものではないが、がん適用を含む一部の実施形態では、本開示は、さらなる物質としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例として、これだけに限定されないが、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮシクロスホスファミド（cyclosphosphamide）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；エチレンイミンおよびアルトレタミンを含めたメチラメラミン（methylamelamines）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン（sarcodictyin）；スポンギスタチン；クロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ranimnustine）などのニトロソウレア（nitrosureas）；エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１などの抗生物質；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジンなどのピリミジン類似体、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどのアンチアドレナール；フロリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充剤（replenisher）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（aldophosphamide glycoside）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（edatraxate）；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；マイタンシンおよびアンサマイトシン（ansamitocins）などのマイタンシノイド（maytansinoids）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（triaziquone）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（trichothecenes）（例えば、Ｔ−２毒素、ベラキュリン（verracurin）Ａ、ロリジン（roridin）Ａおよびアンギジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂＯｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥクレモフォール不含、パクリタキセルのアルブミンを操作したナノ粒子製剤およびＴＡＸＯＴＥＲＥドセタキセル；クロランブシル（chloranbucil）；ＧＥＭＺＡＲゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥビノレルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンならびに５−ＦＵおよびロイコボリンの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン処置レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；細胞増殖を低減するＰＫＣ−α．、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（タルセバ））およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。さらに、処置の方法は、照射の使用をさらに含み得る。

一部のヒト腫瘍は、患者の免疫系によって排除され得る。例えば、免疫「チェックポイント」分子を標的とするモノクローナル抗体の投与は、完全奏効および腫瘍寛解につながる可能性がある。このような抗体の作用様式は、腫瘍が抗腫瘍免疫応答からの保護として利用してきた、免疫調節性分子の阻害によるものである。これらの「チェックポイント」分子を阻害すること（例えば、アンタゴニスト抗体を用いて）によって、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が、増殖し、腫瘍細胞を破壊することが可能となり得る。

例えば、例として、制限するものではないが、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１を標的とするモノクローナル抗体の投与は、完全奏効および腫瘍寛解につながる可能性がある。このような抗体の作用様式は、腫瘍が抗腫瘍免疫応答からの保護として利用してきた、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１の阻害によるものである。これらの「チェックポイント」分子を阻害すること（例えば、アンタゴニスト抗体を用いて）によって、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が、増殖し、腫瘍細胞を破壊することが可能となり得る。

したがって、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を、免疫「チェックポイント」分子を標的とする１種または複数の遮断抗体と組み合わせて使用できる。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される組成物を、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１などの分子を標的とする１種または複数の遮断抗体と組み合わせて使用できる。例えば、本明細書において提供される組成物を、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２を、ならびに／またはＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断、低減および／もしくは阻害する物質（限定されない例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、オプジーボ、ＢＲＩＳＴＯＬＭＹＥＲＳＳＱＵＩＢＢ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬＭＹＥＲＳＳＱＵＩＢＢ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）のうち１種または複数）と組み合わせて使用できる。一実施形態では、本明細書において提供される組成物を、ＣＴＬＡ−４の活性および／またはＣＴＬＡ−４の１つもしくは複数のその受容体（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ−２およびＰＰＰ２Ｒ５Ａ）との結合を遮断、低減および／または阻害する物質と組み合わせて使用できる。例えば、一部の実施形態では、免疫調節剤は、限定されない例として、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｙｅｒｖｏｙ、ＢＭＳ）および／またはトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）などの抗体である。これらの分子に対する遮断抗体は、例えば、ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ（ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｍｅｒｃｋ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）およびＰｆｉｚｅｒ（ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）から入手することができる。

さらに、本明細書において記載される操作された赤血球系細胞組成物を、例えば、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬＳ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ガレクチン−９、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａおよびＴＭＩＧＤ２ならびに種々のＢ−７ファミリーリガンド（これだけに限定されないが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６およびＢ７−Ｈ７を含む）などの免疫チェックポイント分子を標的とする１種または複数の遮断抗体と組み合わせて使用できる。

Ｖ．キット
本開示は、本開示の操作された赤血球系細胞を含み、必要に応じて、外因性刺激性ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む種々のキットを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。

例示的キットを以下に記載するが、他の有用なキットの内容は、本開示を踏まえると当業者には明らかとなろう。これらのキット各々が、本開示内に含まれる。

一部の実施形態では、キットは、操作された赤血球系細胞を、ＮＫ細胞またはＴ細胞に投与するのに有用なアプリケーターをさらに含む。キット中に含まれる個々のアプリケーターは、例えば、操作された赤血球系細胞を投与するために使用される方法に応じて変わり、このようなアプリケーターは、当技術分野で周知であり、中でも、ピペット、シリンジ、ドロッパーなどを挙げることができる。さらに、実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法を実施するためのキットの使用を説明する説明材料をさらに含む。これらの使用説明書は、本明細書において提供される本開示を単に具体化するものである。

一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体を含む。組成物は、本明細書において別の場所で示されたような適当な量で提供される。さらに、投与経路および投与の頻度は、本明細書において別の場所でこれまでに示された通りである。

キットは、広い大量の分子、これだけに限定されないが、本明細書において示される外因性刺激性ポリペプチドなどを含む操作された赤血球系細胞を包含する。しかし、本明細書において提供される教示を有する当業者ならば、本開示は、分子のこれら、または任意のその他の組合せに決して制限されないことは容易に理解するであろう。むしろ、本明細書において示される組合せは、例示目的であって、それらは、本開示によって包含される組合せを決して制限しない。さらに、キットは、操作された赤血球系細胞に形質導入されるべき各分子が、分子をコードする単離された核酸、分子をコードする核酸を含むベクターおよびそれらの任意の組合せとして提供されるキットを含み、少なくとも２つの分子が連続核酸によってコードされ、および／または同一ベクターによってコードされるキットを含む。

本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願がすべての目的のために参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられている刊行物は、単に本出願の出願日の前のそれらの開示のため提供されている。本明細書に記載の発明者が、事前の開示または任意のその他の理由により、そのような開示に先行する権利がないことを認めると解釈されるべきものは本明細書には何もない。

（実施例１）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質を発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成。
ＩＬ−１５およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合構築物
融合ポリペプチドをコードする種々のＤＮＡ構築物を、以下の表１１に示されるように、赤血球系細胞における発現のために調製した：

ＤＮＡ構築物（Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ３．１またはＶ４．１）を、以下に記載するように、赤血球系細胞における発現のために、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングした。

レンチウイルスベクターの産生
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質遺伝子を、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングした。レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合物遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生する。細胞を、新鮮な培養培地中に配置した。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結した。

ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質は、本明細書でＩＬ−１５ＴＰとも呼ばれる。

赤血球系細胞の増大および分化
正常ヒトドナー由来の動員された末梢血細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞を、ＡｌｌＣｅｌｌｓＩｎｃ．から凍結状態で購入した。増大／分化手順は、３つの段階を含む。第１段階では、解凍したＣＤ３４＋赤血球系前駆体を、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、組換えヒト組換えヒト幹細胞因子および組換えヒトインターロイキン３を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓＭＤＭ培地中で培養した。第２段階では、赤血球系細胞を、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換え幹細胞因子、ヒト組換えエリスロポエチンおよびＬ−グルタミンを補充したＩｓｃｏｖｅ’ｓＭＤＭ培地中で培養した。第３段階では、赤血球系細胞を、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト組換えエリスロポエチンおよびヘパリンを補充したＩｓｃｏｖｅ’ｓＭＤＭ培地中で培養した。培養物を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で維持した。

赤血球系前駆細胞の形質導入
赤血球系前駆細胞を、上記培養プロセスのステップ１の間に形質導入した。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと組み合わせた。感染を、室温で９０分間にわたって２０００ｒｐｍでプレートをスピンさせるスピノキュレーション（spinoculation）によって達成した。スピノキュレーション後、細胞を、３７℃で一晩インキュベートした。

抗体結合
ＰＥ標識された抗ＩＬ−１５−ＲＡ抗体（例えば、抗ＩＬ−１５ＲＡ抗体（ＪＭ７Ａ４）（ａｂ９１２７０）、ＡｂＣａｍ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡの発現を検証した。抗体の結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定した。ゲートを、染色された形質導入されていない細胞に基づいて設定した。

（実施例２）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞は、総ＣＤ８＋細胞における増加をｉｎｖｉｔｒｏで誘導する。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントＩＬ−１５ｖ３（配列番号２７）、ＩＬ−１５ｖ４（配列番号２９）およびＩＬ−１５ｖ５（配列番号３１）を含む赤血球系細胞を、概して実施例１に記載したように調製した。

３人のドナー由来の１００，０００個の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、３００，０００個の操作された赤血球系細胞と共に培養した。操作された赤血球系細胞なしで培養したＰＢＭＣ（ＲＢＣなし）およびその表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養したＰＢＭＣを、陰性対照として使用した。図１Ａは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現するように操作された赤血球系細胞が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共に培養し、未刺激の場合に、ＣＤ８＋細胞の総数における増加を誘導することを示すグラフである。組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と共に培養したＰＢＭＣを、可溶性ＩＬ−１５に対する比較として使用した。ＣＤ８＋細胞の総数を、５日目に計数した。図１Ａに示される結果は、各々２〜３人のＰＢＭＣドナー（合計で６人の試験した異なるＰＢＭＣドナー）を用いた４つの独立した実験を表している。

次のセットの実験において、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現する操作された赤血球系細胞を、ＰＢＭＣと共に培養し、抗ＣＤ３抗体（ａＣＤ３）で刺激した。３人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを、０．５μｇ／ｍＬのａＣＤ３プラス３００，０００個または１００，０００個の赤血球系細胞と共に培養した。操作された赤血球系細胞なしで培養したＰＢＭＣ（ＲＢＣなし）およびその表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養したＰＢＭＣを、陰性対照として使用した。組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と共に培養したＰＢＭＣを、陽性対照として使用した。図１Ｂは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現するように操作された赤血球系細胞をＰＢＭＣと共に培養し、ａＣＤ３で刺激した場合に、ＣＤ８＋細胞の総数における増加が誘導されることを示すグラフである。図１Ｂに示されるグラフ中の２本の棒は、使用した３００，０００個（左）または１００，０００個（右）の操作された赤血球系細胞を示す。ＣＤ８＋細胞の総数を、５日目に計数した。図１Ｂに示される結果は、各々２〜３人のＰＢＭＣドナー（合計で６人の試験した異なるＰＢＭＣドナー）を用いた４つの独立した実験を表している。

この実施例からの結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞が、刺激の存在下または非存在下で、総ＣＤ８＋細胞における増加を誘導することを示している。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞は、刺激の存在下および非存在下の両方で、ＨＡ含有対照赤血球と比較して、ＣＤ８＋細胞のより高い誘導をもたらす。

（実施例３）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞は、ＮＫ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで増大させる。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントＩＬ−１５ｖ３、ＩＬ−１５ｖ４およびＩＬ−１５ｖ５を含む赤血球系細胞を、概して実施例１に記載したように調製した。

ＮＫ細胞増大に対するＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントの影響を試験した。図２Ａは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現するように操作された赤血球系細胞が、精製されたＮＫ細胞と共に培養した場合に、ＮＫ細胞を増大させることができることを示すグラフ（ｉ、ｉｉおよびｉｉｉ）のパネルである。図２Ａ（ｉ）では、ＮＫ細胞を、操作された赤血球系細胞なしで培養した（ＲＢＣなし）。その表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養したＮＫ細胞を、対照として使用した。１人のドナー由来の４０，０００個の精製されたＮＫ細胞を二連でプレートし、以下の用量設定で７日間培養した：操作された赤血球系細胞（９００，０００個、３００，０００個、１００，０００個）、ｒｈＩＬ−２（１０００、１００、１０Ｕ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ−１５（１０、１、０．１ｎｇ／ｍＬ）。解析を、７日目に実施した。図２Ａ（ｉｉ）では、ＮＫ細胞を、９００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を考慮に入れて、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。図２Ａ（ｉｉｉ）では、ＮＫ細胞を、３００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を考慮に入れて、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。

図２Ｂは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントｖ３、ｖ４およびｖ５を発現する操作された赤血球系細胞が、ＰＢＭＣと共に培養した場合に、ＮＫ細胞を増大させることができることを示すグラフ（ｉ、ｉｉおよびｉｉｉ）のパネルである。図２Ｂ（ｉ）では、２人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを取得し、二連でプレートした。細胞を、陰性対照として、操作された赤血球系細胞なしで培養した（ＲＢＣなし）、またはその表面上にＨＡエピトープタグのみを発現する赤血球系細胞と共に培養した。２人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを取得し、二連でプレートした。細胞を、９００，０００個、３００，０００個または１００，０００個の操作された赤血球系細胞と共に培養した。フローサイトメトリー解析を、生／死、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞にゲートを適用して、７日目に実施した。図２Ｂ（ｉｉ）では、ＰＢＭＣを、９００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を考慮に入れて、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。図２Ｂ（ｉｉｉ）では、ＰＢＭＣ細胞を、３００，０００個の操作された赤血球と共に培養し、これらの細胞上に発現されたコピー数を考慮に入れて、細胞に提示された総ＩＬ−１５コピー数を計算した（Ｘ軸上に示される）。

この実施例からの結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡバリアントを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞が、精製されたＮＫ細胞集団からまたはＰＢＭＣからＮＫ細胞を増大させることができることを示している。ｖ３およびｖ４の活性を比較すると、ｖ３およびｖ４は、同じコピー数で異なる活性を示すことが示された。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞は、ＨＡ含有対照赤血球と比較して、高濃度および低濃度の両方で、より高いＮＫ細胞増大をもたらす。さらに、用量応答が、バリアントｖ４およびｖ５について見られる。

（実施例４）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現するように調製された赤血球系細胞は、ＮＫ細胞をｉｎｖｉｖｏで活性化する。
ｅｘｖｉｖｏでのＮＫ細胞増大に対する、細胞表面上にヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞の影響を試験した。マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ＩＬ−１５−ＲＡ−Ｆｃとコンジュゲートさせた（赤血球系細胞を官能化するためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質は、ＩＬ−１５鎖に融合した受容体のｓｕｓｈｉドメインを含む（本明細書の表１０に示されるタンパク質構築物を参照のこと）。

最初に、１人のドナー由来の４０，０００個の精製されたＮＫ細胞（ＡｓｔｓｒｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）を二連でプレートし、ＲＢＣの用量設定（９０００００個、３０００００個、１０００００個）と共に７日間培養した。７日後、試料を、フローサイトメトリーを用いて解析して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−である生細胞を見ることによって、培養物中のＮＫ細胞の相対量を推定した。図３Ａに示されるように、その表面にＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒを提示するように調製された赤血球系細胞は、強力なＮＫ細胞増大をｅｘｖｉｖｏで促進する。

次に、ｉｎｖｉｖｏでのＮＫ細胞活性化に対する、その表面にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞の影響を試験した。ＩＬ−１５−ＲＡ−Ｆｃ赤血球系細胞および対照赤血球系細胞を、Ｃ５７／Ｂ６マウスに静脈内注射した。脾臓を注射の３日後に収集し、単一細胞懸濁物になるように処理し、フローサイトメトリーを使用してＫｉ６７およびグランザイムＢについて染色した。

図３Ｂに示されるように、強力なリンパ球増殖が、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現するように調製された赤血球系細胞（ｍＲＢＣ）で処置したマウスにおいて観察された。増殖性細胞のマーカーとしてのパーセントＫｉ６７染色によって決定したＮＫ細胞増殖が示される。さらに、図３Ｃに示されるように、強力なリンパ球活性化が、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製された赤血球系細胞（ｍＲＢＣ）で処置したマウスにおいて見出された。活性化された細胞のマーカーとしてのパーセントグランザイムＢ発現によって決定したＮＫ細胞活性化が示される。

この実施例で示された結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞が、ＮＫ細胞の増殖および活性化をｉｎｖｉｖｏで誘導することを示している。

（実施例５）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞は、腫瘍成長をｉｎｖｉｖｏで緩徐化させる。
黒色腫についてのＢ１６Ｆ１０マウスモデル系を使用して、腫瘍成長に対する、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むマウス赤血球系細胞（ＩＬ−１５ＲＢＣ）の影響を試験する。皮下注射すると、Ｂ１６は、５〜１０日で触知可能な腫瘍を形成し、１４〜２１日で１×１×１ｃｍの腫瘍にまで成長する。Ｂ１６マウスモデル系は、Overwijk and Restifo（Curr Protoc Immunol. 2001 May; CHAPTER: Unit-20.1、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）によって記載されている。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡとコンジュゲートさせる（赤血球系細胞を官能化するためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質を、本明細書の表１０に示される構築物で、ＩＬ−１５鎖に融合した受容体のｓｕｓｈｉドメインとして発現させる。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを、フローサイトメトリーを使用して定量化する。

最初に、６〜１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^５のＢ１６細胞／マウスを皮下接種する。腫瘍がおよそ１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、動物に、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示する赤血球系細胞、または対照としてのＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡなしの赤血球系細胞もしくは食塩水を投薬する。動物に投薬するために、平均１ｅ９のＩＬ−１５ＲＢＣを、１用量当たり、２ｕｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡに相当する細胞１つ当たり平均５０，０００個のＩＬ−１５／ＲＡ分子で、１用量ごとに投与する。

動物の重量および状態を毎日記録し、腫瘍を、１週間に３回測定する。腫瘍を、各腫瘍を２つの次元で測定することによって、１週間に３回測定する。腫瘍体積を、以下の標準式を使用して計算する：（Ｌ×Ｗ^２）／２。平均腫瘍重量および平均の標準誤差を、各時点において各群について計算する。

さらに、体重を毎日記録する。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算する。

食塩水および未処置対照と比較した、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む調製された赤血球系細胞の抗腫瘍活性を、腫瘍体積および／または腫瘍重量における経時的な変化を評価することによって決定する。

（実施例６）
４−１ＢＢＬを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成。
４−１ＢＢＬ構築物
ＤＮＡ構築物を、以下の表１２に示されるように、赤血球系細胞における発現のために調製した：

レンチウイルスベクターの産生
４−１ＢＢＬ遺伝子構築物を、表１２に示されるように構築した。遺伝子を、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングした。レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および４−１ＢＢＬ遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生した。細胞を、新鮮な培養培地中に配置した。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結した。

赤血球系前駆細胞の形質導入
赤血球系前駆細胞を、上記培養プロセスのステップ１の間に形質導入した。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと組み合わせた。感染を、室温で９０分間にわたって２０００ｒｐｍでプレートをスピンさせるスピノキュレーションによって達成した。スピノキュレーション後、細胞を、３７℃で一晩インキュベートした。

抗体結合
ＰＥ標識された抗４−１ＢＢＬ抗体（例えば、精製された抗ヒト４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における４−１ＢＢＬの発現を検証した。抗体の結合を、ＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定した。ゲートを、染色された形質導入されていない細胞に基づいて設定した。

（実施例７）
操作された赤血球系細胞の表面上の４−１ＢＢＬの発現は、Ｔ細胞活性化をｉｎｖｉｔｒｏで駆動する。
４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞を、実施例６に記載したように調製した。

Ｔ細胞活性化に対する、操作された赤血球系細胞の表面上の４−１ＢＢＬ発現の影響を、細胞内ＮＦκＢシグナル伝達がヒトＴ細胞系であるＪｕｒｋａｔ細胞を使用して測定される、標準的なｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験した。形質導入されていないＲＢＣ（ＵＴＲＲＢＣ）は、活性タンパク質を発現するように操作されていない対照ＲＢＣである。図４Ａに示されるように、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬは、強力なＴ細胞活性化を駆動し、４−１ＢＢ／ＮＦκＢ／Ｌｕｃを過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞のルシフェラーゼ活性によって測定した場合に、ＮＦκＢ経路の８０〜１００倍の活性化を刺激する。対照的に、４−１ＢＢアゴニスト性ｍＡｂ（α−４−１ＢＢＡｂ）は、二次抗体と架橋結合させた場合、限定的な６倍のＮＦκＢ活性化を刺激する。α−４−１ＢＢＡｂ単独または二次抗体単独をＪｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートした場合、ＮＦκＢ活性化は誘導されなかった。類似の結果が、対照ＲＢＣをＪｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートした場合に得られた。この実験は、４−１ＢＢ−Ｌを含む操作された赤血球系細胞が、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体α−４−１ＢＢＡｂおよび未処置対照と比較して、＞１５倍高いＮＦκＢ活性化を誘導することを示している。

別の実験では、赤血球系細胞を、漸増量の４−１ＢＢ−ＬｍＲＮＡでトランスフェクトし、４−１ＢＢ−Ｌ発現を測定した（図４Ｂ）。細胞１つ当たりの４−１ＢＢＬ分子のコピー数は、ｘ軸上に示される。５０，０００個の４−１ＢＢＬを含む操作された赤血球系細胞を、Ｊｕｒｋａｔ細胞と共に共培養した。細胞を６時間後に収集し、ルシフェラーゼ活性を決定した。図４Ｂは、４−１ＢＢＬを含む操作された赤血球系細胞によるＮＦκＢの活性化が調節可能であることを示している。

従って、図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、表面上に４−１ＢＢＬを発現するように操作された操作された赤血球系細胞上の４−１ＢＢＬタンパク質のコピー数を増加させると、活性化について用量応答が生じる。従って、赤血球系細胞は、最大のＴ細胞活性化を確実にするために、４−１ＢＢＬを発現するように操作され得る。

次に、初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化を測定した。３人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを、ＣＴＦＲで標識し、４−１ＢＢ−Ｌを含む操作された赤血球系細胞（「ＲＢＣ−４−１ＢＢＬ」）、対照ＲＢＣ（「ＲＢＣ−ＣＴＬ」）、α−４−１ＢＢＡｂ単独または二次抗体と共にインキュベートした。ＲＢＣは、５０，０００個の細胞、２５，０００個の細胞または１２，５００個の細胞で存在した。α−４−１ＢＢＡｂ濃度は、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの範囲であった。５日目に、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の相対量を、ＣＴＦＲ希釈を使用して評価した。上清を収集し、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの量を、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬは、初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、強力に増殖するように、また、ヒト免疫応答の中核をなす活性化されたＴ細胞によって放出される２つのサイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生によって測定されるように活性化されるように、刺激した。ＲＢＣ−４１ＢＢＬは、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞における４〜６倍および２〜３倍の増加、ならびにＩＦＮγおよびＴＮＦα産生における最大で３倍の増加によって測定されるような、顕著なＴ細胞活性化を刺激する。対照的に、４−１ＢＢアゴニスト性ｍＡｂ（α−４−１ＢＢＡｂ）は、いずれの測定可能な増殖も刺激せず、Ｔ細胞の最小の活性化のみを刺激した。理論に束縛されることは望まないが、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬの強力なＴ細胞刺激活性は、抗原提示細胞とＴ細胞との間に形成される免疫シナプスを刺激する、細胞表面上のその天然の三量体コンフォメーションでの４−１ＢＢＬの高い発現に起因すると考えられる。

併せて考えると、この実施例で示された結果は、ＲＢＣの表面上のその天然の三量体コンフォメーションでの４−１ＢＢＬの発現が、４−１ＢＢ／ＮＫｆＢ／ＬｕｃＪｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦκＢ活性化ならびに初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増殖および活性化によって測定した場合に、高度に強力なＴ細胞活性化を駆動することを示している。

（実施例８）
４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、転移性黒色腫マウスモデルにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する。
Ｂ１６Ｆ１０肺転移マウスモデルを使用して、がん患者における改善および持続された臨床奏効率にとって重要である、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞下位集団、例えば、増殖性ＣＤ８＋メモリーＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞およびグランザイムＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激に対する、マウス４−１ＢＢＬを含むマウス赤血球系細胞の影響を試験した。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、マウス４−１ＢＢＬとコンジュゲートさせた（赤血球系細胞を官能化するためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）。マウス４−１ＢＢＬタンパク質を、本明細書の表１０に示される構築物で発現させた。

その天然の三量体コンフォメーションの４−１ＢＢＬとコンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞（ＲＢＣ−４−１ＢＢＬ）は、その細胞表面上におよそ１５０，０００コピーの４−１ＢＢＬを含み、これは、４−１ＢＢＬを発現するように調製されたヒト赤血球系細胞の２分の１であるが、強いＴ細胞活性化および増殖を刺激するのに十分である。図９に示される結果は、ｍＲＢＣ−４−１ＢＢＬが強力なＴ細胞活性化および増殖を刺激するのに十分であることを示しており、それは、ｍＲＢＣ−４−１ＢＢＬが、１５倍高い用量の３Ｈ３抗マウス４−１ＢＢアゴニスト性モノクローナル抗体（ａ４−１ＢＢｍＡｂ）と類似のレベルの、ｉｎｖｉｖｏでのＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖を駆動したからであるが、これは、三量体４−１ＢＢＬの細胞提示がより強力であることを示している。陰性対照であるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および活性タンパク質を発現しないマウス対照ＲＢＣ（ｍＲＢＣ−ＣＴＲＬ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏ増殖を刺激しなかった。

（実施例９）
４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、腫瘍成長をｉｎｖｉｖｏで緩徐化させる。
結腸癌についてのＭＣ３８同系マウスモデル系を使用して、腫瘍成長に対する、マウス４−１ＢＢＬを含むマウス赤血球系細胞の影響を試験した。ＭＣ３８は、市販の結腸癌マウスモデルである（例えば、Selby et al. (2016) PLoS ONE 11(9): e0161779を参照のこと；ＡｌｔｏｇｅｎＬａｂｓ；ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、組換えマウス４−１ＢＢＬタンパク質とコンジュゲートさせた（赤血球系細胞を官能化するためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）。マウス４−１ＢＢＬタンパク質を、本明細書の表１０に示される構築物で発現させた。

腫瘍がおよそ１００ｍｍ^３の体積に達した時点で、動物に、４−１ＢＢＬを提示する赤血球系細胞、または対照としての４−１ＢＢＬなしの赤血球系細胞もしくは食塩水を投薬した。動物に投薬するために、平均１ｅ９の４−１ＢＢＬＲＢＣを、１用量当たり、１〜３μｇまたはおよそ０．０５〜０．１５ｍｇ／ｋｇの４−１ＢＢ−Ｌに相当する細胞１つ当たり平均２０，０００〜６５，０００個の４−１ＢＢＬ分子で、マウス１匹当たり１用量ごとに投与した。

動物の重量および状態を毎日記録し、腫瘍を、各腫瘍を２つの次元で測定することによって、１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下の標準式を使用して計算した：（Ｌ×Ｗ^２）／２。平均腫瘍重量および平均の標準誤差を、各時点において各群について計算した。

さらに、体重を毎日記録した。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算した。

未処置対照と比較した、４−１ＢＢＬを含む調製された赤血球系細胞の抗腫瘍活性を、腫瘍体積および／または腫瘍重量における経時的な変化を評価することによって決定した。結果は図６に示され、４−１ＢＢＬを含む調製された赤血球系細胞が、未処置対照と比較して、腫瘍体積における経時的な増加を低減させたことを実証している。

（実施例１０）
マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬの毒性の欠如
肝臓毒性のマウスモデルを使用して、マウスＲＢＣ−４−１−ＢＢＬの毒性の欠如または忍容性を評価した（例えば、Niu et al (2007) J. Immunology 178:4194-4213を参照のこと）。図１０に示されるように、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬの好ましい忍容性が、実施例８に記載した前臨床研究において使用したのと同じ投薬スケジュールに従って観察された。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）肝臓酵素のレベルは、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬの投与後に、有意には上昇しなかった。対照的に、これらの肝臓酵素の有意な上昇が、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体３Ｈ３の投与後に観察された。これは、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬでｉｎｖｉｖｏで観察されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の強力な刺激には、他の４−１ＢＢアゴニストの投与と関連した肝臓毒性が伴わないことを示している。

（実施例１１）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成。
レンチウイルスベクターの産生
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬ遺伝子を構築した。１つのベクターがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの遺伝子を含み、別のベクターが４−１ＢＢＬの遺伝子を含むように、各遺伝子を、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＭＳＣＶプロモーター配列の制御下にあるマルチクローニングサイト中にクローニングした。レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターおよび４−１ＢＢＬ遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞を共トランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生した。細胞を、新鮮な培養培地中に配置した。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結した。

あるいは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬ遺伝子を構築し、単一のベクターがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を含むように、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＭＳＣＶプロモーター配列の制御下にあるマルチクローニングサイト中にクローニングした。レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ遺伝子および４−１ＢＢＬ遺伝子の両方を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞を共トランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生した。細胞を、新鮮な培養培地中に配置した。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結した。

抗体結合
ＰＥ標識された抗ＩＬ−１５−ＲＡ抗体（例えば、抗ＩＬ−１５ＲＡ抗体（ＪＭ７Ａ４）（ａｂ９１２７０）、ＡｂＣａｍ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡの発現を検証した。ＰＥ標識された抗４−１ＢＢＬ抗体（例えば、精製された抗ヒト４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における４−１ＢＢＬの発現を検証した。抗体の結合を、ＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定した。ゲートを、染色された形質導入されていない細胞に基づいて設定した。

（実施例１２）
操作された赤血球系細胞の表面上のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの発現は、Ｔ細胞活性化をｉｎｖｉｔｒｏで駆動する。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含むヒト赤血球系細胞を、実施例１１に記載したように調製した。

Ｔ細胞活性化に対する、操作された赤血球系細胞の表面上のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの発現の影響を、細胞内ＮＦκＢシグナル伝達がヒトＴ細胞系であるＪｕｒｋａｔ細胞を使用して測定される、標準的なｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験した。形質導入されていないＲＢＣ（ＵＴＲＲＢＣ）は、活性タンパク質を発現するように操作されていない対照ＲＢＣである。図１１に示されるように、ＲＢＣ−ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ−４−１ＢＢＬは、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬについて観察されたＴ細胞活性化のレベル（図４Ａ）と類似の、強力なＴ細胞活性化を駆動する。４−１ＢＢアゴニスト性ｍＡｂ（α−４−１ＢＢＡｂ）を二次抗体と架橋結合させた場合、限定的なＮＦκＢ活性化が見られた。α−４−１ＢＢＡｂ単独または二次抗体単独をＪｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートした場合、ＮＦκＢ活性化は誘導されなかった。この実験は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢ−Ｌを含む操作された赤血球系細胞が、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体α−４−１ＢＢＡｂおよび未処置対照と比較して、強力なＮＦκＢ活性化を誘導したことを示している。図１１にまた示されるように、赤血球系細胞を、漸増量のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢ−Ｌでトランスフェクトし、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬ発現を測定した。細胞１つ当たりのＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢ−Ｌのコピー数は、ｘ軸上に示される。図１１は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む操作された赤血球系細胞によるＮＦκＢの活性化が調節可能であることを示している。

（実施例１３）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを発現するように操作された赤血球系細胞は、ＣＤ３刺激ありまたはなしで、脾細胞を強力に活性化する。
マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質と、および４−１ＢＢＬとコンジュゲートさせた（赤血球系細胞を官能化するためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）。

脾細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む、免疫機能を有する種々の細胞集団からなる。脾細胞を、３匹のナイーブマウスから単離した。１５０，０００個の脾細胞を、４−１ＢＢＬ単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬの両方のいずれかを含むか、またはタンパク質を含まない１ｅ^７のクリックされた細胞；マウス４−１ＢＢアゴニスト抗体３Ｈ３（１ｕｇ／ｍＬ）または組換えヒトＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかと共に、３７度で２日間共インキュベートした。脾細胞を、抗ＣＤ３（ａＣＤ３）ありまたはなしで処置した。ａＣＤ３を使用して、脾細胞Ｔ細胞集団を刺激した。ａＣＤ３刺激の非存在下では、活性は、ＮＫ細胞活性化に帰せられ得る。上清中の産生されたＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡによって測定した。インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）サイトカイン分泌を、脾細胞活性化の尺度として使用した。

図７に示されるように、ａＣＤ３で刺激した場合、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞は、単独または組み合わせた組換えヒトＩＬ−１５またはマウス４−１ＢＢアゴニスト抗体３Ｈ３と比較して、優れた応答を示した。図７にまた示されるように、ａＣＤ３刺激を使用しなかった場合、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡと４−１ＢＢＬとの間には高い相乗作用が存在し、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞は、組換えヒトＩＬ−１５と比較して優れた応答を示す。ＣＤ３刺激の非存在下では、観察された影響がＮＫ細胞活性化の結果であったと結論づけることができる。

活性化されたＮＫ細胞の存在を確認するために、ＩＦＮγ染色を実施した。脾細胞を単離し、ブレフェルジンＡの存在下で３７℃で４時間にわたって、ＰＭＡ／イオノマイシン（２ｕｇ／ｍＬ）で刺激した。インキュベーション後、細胞をスピンダウンし、ＰＢＳ中で洗浄し、その後、室温（ＲＴ）で１５分間にわたって細胞表面染色を実施した。次いで、細胞を洗浄し、１５分間固定し、透過処理緩衝剤中でＲＴで３０分間にわたって、ＩＦＮγについて染色した。ＩＦＮγの存在によって、ＮＫ細胞の活性化が確認された。

（実施例１４）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞は、総ＣＤ８＋細胞における増加を誘導する。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含むヒト赤血球系細胞を、概して実施例１１に記載したように調製した。

ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびこれらの細胞の重要なサブセットの増大に対する、細胞表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む操作された除核細胞の影響を決定した。特に、細胞増大に対する、細胞表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方を含む操作された赤血球系細胞の影響を、単一のアゴニストを含む操作された赤血球系細胞のものと比較し、４−１ＢＢＬ（ＲＢＣ−４−１−ＢＢＬ）またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質（ＲＢＣ−ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）のいずれかを試験した。図１２に示されるように、Ｔ細胞受容体刺激の存在下（＋ａＣＤ３刺激）では、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の６倍よりも大きい増大が、５日間の共培養後に観察され、これは、α−４−１ＢＢＡｂ、組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）、α−４−１ＢＢＡｂおよびｒｈ１Ｌ−１５の組合せ、ならびにＲＢＣ−ＣＴＲＬに引けをとらなかった。抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞刺激の非存在下（ａＣＤ３刺激なし）では、８日間の培養後に、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞およびＮＫ細胞の両方を増大させることにおいて、およそ９倍の、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せの相乗効果が存在し、これは、α−４−１ＢＢＡｂ、ｒｈＩＬ−１５、α−４−１ＢＢＡｂおよびｒｈＩＬ−１５の組合せ、ＲＢＣ−ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡならびにＲＢＣ−４−１ＢＢよりも有意に高かった。

併せて考えると、この実施例で示された結果は、表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む操作された除核細胞が、ＮＦκＢ活性化、ならびにＣＤ８＋メモリーＴ細胞およびＮＫ細胞の増大によって測定した場合に、高度に強力なＴ細胞活性化を駆動することを示している。さらに、４−１−ＢＢＬ単独またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質単独のいずれかを含む操作された赤血球系細胞と比較して、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの組合せは、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞およびＮＫ細胞を増大させることにおいて、相乗効果をもたらした。

（実施例１５）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、肺転移をｉｎｖｉｖｏで低減させる。
黒色腫についてのＢ１６Ｆ１０転移性マウスモデル系（その全体が参照により本明細書に組み込まれるKubo et al. (2017) Cancer Immunology Research 5(9): 1-9）を使用して、転移性成長に対する、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびマウス４−１ＢＢＬを含むマウス赤血球系細胞（ＩＬ−１５／ＲＡ４−１ＢＢＬＲＢＣ）の影響を試験した。このモデルでは、腫瘍細胞を静脈内注射して肺における転移を樹立し、次いで、マウスを、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置した。皮下注射すると、Ｂ１６は、５〜１０日で触知可能な腫瘍を形成し、１４〜２１日で１×１×１ｃｍの腫瘍にまで成長した。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡとコンジュゲートさせるか、マウス４−１ＢＢＬとコンジュゲートさせるか、またはヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびマウス４−１ＢＢＬの両方と共コンジュゲートさせた（赤血球系細胞を官能化するためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを、フローサイトメトリーを使用して定量化した。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質を、本明細書の表１０に示される構築物で、ＩＬ−１５鎖に融合した受容体のｓｕｓｈｉドメインとして発現させた。マウス４−１ＢＢＬタンパク質を、本明細書の表１０に示される構築物で発現させた。

最初に、７週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^５のＢ１６Ｆ１０細胞／マウスを静脈内接種した。次いで、種々の実験において、動物に、以下を静脈内（ＩＶ）投薬した：４−１ＢＢＬを提示する、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示する、もしくは４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方を提示する赤血球系細胞；抗ＰＤ１モノクローナル抗体単独（αＰＤ−１ｍＡｂ）；αＰＤ−１（ＩＰ）と組み合わせてＩＶ投与される４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示する赤血球系細胞；腹腔内（ＩＰ）投与される４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示する赤血球系細胞；マウス４−１ＢＢアゴニスト抗体（３Ｈ３）；または対照としての４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡなしの赤血球系細胞（ｍＲＢＣ−ＣＴＬ）。動物に投薬するために、平均１ｅ９の赤血球系細胞を、１用量当たり０．２ｍｇ／ｋｇの４−１ＢＢＬに相当する細胞１つ当たり平均１００，０００個の分子の４１ＢＢＬ単独および０．１２ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡに相当する細胞１つ当たり６０，０００個の分子のＩＬ−１５ＲＡ単独で、または、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞については、それぞれ０．１〜０．１２ｍｇ／ｋｇおよび０．０６〜０．０８ｍｇ／ｋｇに相当する５０，０００〜６０，０００個の分子の４１ＢＢＬおよび３０，０００〜４０，０００個の分子のＩＬ−１５−ＲＡで、１用量ごとに投与した。アゴニスト性４１ＢＢ抗体（３Ｈ３）を、２．５ｍｇ／ｋｇで投薬した。動物に、接種の１日、５日および８日後に、ｍＲＢＣまたは３Ｈ３を投薬した。

動物の重量および状態を毎日記録した。接種の１４日後に、動物を屠殺し、肺を収集した。肺転移を、立体鏡を使用して評価した。

転移の数を、２週間後に決定した。さらに、体重を毎日記録した。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算した。処置したマウスの灌流肺内の免疫浸潤物を、フローサイトメトリーによって測定した。ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）浸潤を、ＣＤ４５＋免疫細胞内の全細胞のパーセントとして報告した。

図１３Ａに示されるように、単剤治療としてｉ．ｖ．投与した、その表面上にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬの両方を提示するように調製されたマウス赤血球系細胞は、ｍＲＢＣＣＴＲＬ、ｍＲＢＣ４−１ＢＢＬおよびｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡで個々に処置したマウスと比較して、マウスにおける腫瘍負荷を低減させ、それにより、赤血球系細胞の細胞表面上に４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方を含むことによって達成され得る潜在的な相乗作用が示された。ｍＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡで達成された腫瘍負荷における低減は、４１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体３Ｈ３で達成されたものと有意には異ならなかった。さらに、肺転移の数におけるこの減少は、図１３Ｂに示されるように、肺中へのＮＫ細胞浸潤における有意な増加とも関連した（ｐ＝０．０２）。

別の類似の研究の結果が図１３Ｃに示される。動物に投薬するために、平均１ｅ９の赤血球系細胞を、１用量当たり、細胞１つ当たり平均２５，０００個の分子の４−１ＢＢＬおよび細胞１つ当たり平均４５，０００個の分子のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡで投与したことを除いて、この研究は、上記のように実施した。図１３Ｃで見られるように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせてｉ．ｖ．投与された場合、陰性対照ＰＢＳおよびｍＲＢＣＣＴＲＬ、ならびに抗ＰＤ１抗体単独で処置したマウスと比較して、マウスにおける腫瘍負荷を有意に低減させた。マウス４−１ＢＢアゴニスト抗体３Ｈ３は、単剤治療としては活性でなかった。この研究では、ｉ．ｖ．投与されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬを提示するマウス赤血球系細胞の曝露は、以前の単剤治療研究のおよそ３分の１であったので、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞は、単剤治療としては活性でなかった（上記および図１３Ａ）。しかし、血液中でのより高い曝露および／または他の臓器（例えば、リンパ節）中への分布が生じたことにおそらくは起因して、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞は、腹腔内、即ちｉ．ｐ．投与した場合に、肺転移を低減させることにおいて、単剤治療としてこの研究において高度に有効であった。

さらなる実験では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬを提示するように調製された赤血球系細胞の薬力学的影響を、腫瘍中へのＮＫ細胞浸潤の定量化によって、Ｂ１６Ｆ１０モデルにおいて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０細胞を皮下接種した。腫瘍がおよそ５０立方ミリメートルの体積に達した時点で、動物をランダム化し、１日目、４日目および８日目に、１×１０^９のｍＲＢＣ−ｍ４−１ＢＢＬ、ｍＲＢＣ−ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡまたはｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬを静脈内投薬した。さらなる群は、陰性対照として機能する２００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を受けた。本明細書では、この実施例に上記したように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質を、（表１０に示される構築物で）ＩＬ−１５鎖に融合した受容体のｓｕｓｈｉドメインとして発現させた。

細胞１つ当たりの分子の評価により、ｍＲＢＣ−ｍ４−１ＢＢＬが細胞１つ当たり１５０，０００個の分子を発現し、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡが細胞１つ当たり９０，０００個の分子を発現し、ｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬが細胞１つ当たり７０，０００個の分子のｍ４−１ＢＢＬおよび５０，０００個の分子のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現したことが示された。１１日目に、腫瘍を収集し、消化し、腫瘍細胞懸濁物を、フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞の量、ならびにＮＫ成熟化および分化マーカーについて解析した。

図１３Ｄ〜Ｆに示されるように、ｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬは、ＰＢＳ処置した対照マウスと比較して、腫瘍中の総ＮＫ細胞計数における増加をもたらした（ｐ＝０．０１３、図１３Ｄ）。さらなる解析により、対照マウスと比較した場合の、最終分化したＮＫ細胞およびグランザイムＢ＋ＮＫ細胞の総数における増加によって実証されるように、ｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬ処置したマウスにおけるＮＫ細胞が、より成熟し（ｐ＝０．０１３；図１３Ｅ）、高度に機能的であった（ｐ＝０．００８；図１３Ｆ）ことが実証された。ｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬの影響は、ｍＲＢＣ−ｍ４１ＢＢＬおよびｍＲＢＣ−ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの影響よりも顕著であった。これらの知見は、ｍ４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むマウス代理産物が、マウスにおいて高度に機能的であり、腫瘍中へのＮＫ細胞浸潤をもたらし得ることを示している。

（実施例１６）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、ＮＫ細胞の増大および活性化を示す表現型マーカーをｉｎｖｉｔｒｏでモジュレートする。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４、成熟細胞外ＩＬ−１５ＲＡを含む）を含む赤血球系細胞を、概して実施例１に記載したように調製した。４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞を、概して実施例６に記載したように調製した。

凍結された末梢血単核球（ＰＢＭＣ；Ａｓｔａｒｔｅ）を解凍し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に再懸濁し、９６ウェル丸底プレート中に１ウェル当たり１００，０００個の細胞でプレートした。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４；成熟細胞外ＩＬ−１５ＲＡを発現する）を含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞を、変動する量（ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡについては２５０，０００個の細胞または５００，０００個の細胞、４−１ＢＢＬについては５００，０００個の細胞）で添加した。培養物を８日間インキュベートし（長期プライミング）、次いで、以下の抗体：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＴＲＡＩＬ（ＲＩＫ−２）、４１ＢＢ（４Ｂ４−１）、ＮＫｐ４４（Ｐ４４−８）およびＫＬＲＧ１（１４Ｃ２Ａ０７）、ならびに死細胞を標識するためのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｑｕａＤｙｅを使用して、フローサイトメトリーによる解析のために染色した。細胞内染色のために、細胞を固定し、Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過処理し、Ｋｉ６７（Ｂ５６、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＧＺＭＢ（ＧＢ１１ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）について染色した。細胞を、フローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）によって解析した。

この実験の結果は、図１４に示される。ＮＫ細胞の長期（８日）プライミング後、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む、４１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞（「ｃｏ」）が、ＨＡを含む対照赤血球系細胞と共に培養したＮＫ細胞と比較して、培養物中での８日間の後に、ＮＫ細胞回復を増強することが見出された。ＮＫ細胞の生存、増大および活性化についての表現型読み出しとして使用したマーカーのパネルの解析からの結果もまた、図１４に示される。各マーカーについて得られた結果は、以下に記載される。

Ｋｉ６７：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、ＨＡを含む対照赤血球系細胞と共に培養したＮＫ細胞と比較して、Ｋｉ６７染色によって測定した場合に、ＮＫ細胞増殖を増強した。

グランザイムＢ：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫ細胞におけるＮＫ細胞傷害性のマーカーであるグランザイムＢ発現の増加した割合およびレベルをもたらした（ＧＺＭＢについて陽性のＮＫ細胞におけるＧＺＭＢについてのフローサイトメトリー染色の相対的強度を示す、上の一番右のパネルを参照のこと）。

ＴＲＡＩＬ：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫ細胞活性化のマーカーであり、ＴＲＡＩＬ−リガンド含有細胞についての死誘導性リガンドであるＴＲＡＩＬ含有ＮＫ細胞の増加した割合をもたらした。ＴＲＡＩＬ発現は、ＩＬ−１５刺激で増加することが報告されており、これは、これらの操作された赤血球系細胞が、ＩＬ−１５トランス提示（transpresentation）の効果を再現していることを示唆している。

ＣＤ６９：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＣＤ６９含有ＮＫ細胞の増加した割合をもたらした。ＣＤ６９は、リンパ球における初期活性化のマーカーである。

ＮＫｐ４４：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫｐ４４含有細胞の増加した割合をもたらした。ＮＫｐ４４は、活性化されたＮＫ細胞上で排他的に発現され、一部のウイルス感染細胞および腫瘍細胞の死滅を促進し得る。

４１ＢＢ：４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫ細胞上の増加した４１ＢＢ発現をもたらした。４１ＢＢは、ＮＫ細胞およびＴ細胞上の活性化マーカーである。

まとめると、表現型マーカーのパネルの解析からの結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方を含む赤血球系細胞が、ＮＫ細胞の生存、増大および活性化をｉｎｖｉｔｒｏで増強したことを実証した。

（実施例１７）
４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞は、腫瘍細胞死滅をｉｎｖｉｔｒｏで誘導する。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ５、ＩＬ−１５ＲＡｓｕｓｈｉドメイン）を含む赤血球系細胞
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ５、ＩＬ−１５ＲＡｓｕｓｈｉドメインを含む）を含む赤血球系細胞を、概して実施例１に記載したように調製した。４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞を、概して実施例６に記載したように調製した。ＮＫ細胞によるＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅を、（ｉ）４−１ＢＢＬ含有赤血球系細胞、（ｉｉ）ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ含有赤血球系細胞；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ含有赤血球系細胞および４−１ＢＢＬ含有赤血球系細胞の混合物、の各々について試験した。簡潔に述べると、２０，０００個の精製されたＮＫ細胞（ＡｓｔａｒｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、各々２０００００個の、４−１ＢＢＬもしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡまたは４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方の混合物を含む２００，０００個のＲＢＣと共に、１６時間インキュベートした。さらに、１つの処置群では、２０，０００個のＮＫ細胞を、５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ−１５と共にインキュベートした。１６時間のインキュベーション後、２０，０００個のＫ５６２細胞を、培養物に４時間添加した。これらの細胞は、ＮＫ細胞の標的細胞集団として機能した。生Ｋ５６２細胞の計数を、フローサイトメトリーによって測定した。パーセント死滅を、対照と比較した生きたパーセントに基づいて計算した。結果は図８に示される。図８に示されるように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、ＮＫ細胞による最も高いパーセント死滅を示した。

ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４、成熟細胞外ＩＬ−１５ＲＡ）および４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞
さらなる研究を、上記のように実施したが、このとき、（ｉ）異なるＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、特に、ｓｕｓｈｉドメインではなく成熟細胞外ＩＬ−１５ＲＡを含むＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡｖ４を使用した、および（ｉｉ）赤血球系細胞を、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを共発現するように操作した。Ｋ５６２ヒトＣＭＬ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅に対する、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞によるＮＫ細胞の長期（８日）プライミングおよび短期（一晩）プライミングの両方の影響を試験した。これらの実験のために、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む、４−１ＢＢＬを含むならびに４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む赤血球系細胞を、それぞれ、概して実施例１、実施例６および実施例１１に記載したように調製した。

（ｉ）長期プライミング
長期プライミングのために、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌを使用して新鮮な血液から単離し、ＮＫ細胞を、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＨｕｍａｎＮＫＮｅｇａｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎキットを使用してさらに富化した。次いで、５ｅ５のＮＫ細胞を、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む３ｅ６の赤血球系細胞と共に、２４ウェルプレート中で８日間培養した。対照として、ＮＫ細胞を、０．１、１または１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共に培養した。

８日後、細胞を、以下の抗体：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＣＤ５６（５．１Ｈ１１）、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＴＲＡＩＬ（ＲＩＫ−２）、４１ＢＢ（４Ｂ４−１）およびＮＫｐ４４（Ｐ４４−８）、ならびに死細胞を標識するためのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｑｕａＤｙｅを使用して、フローサイトメトリーによる解析のために染色した。細胞内染色のために、細胞を固定し、Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過処理し、Ｋｉ６７（Ｂ５６、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＧＺＭＢ（ＧＢ１１ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）について染色した。細胞を、フローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）によって解析した。ＮＫ細胞の生存、増大および活性化についての表現型読み出しとして使用したマーカーのパネルの解析からの結果は、実施例１６で見出されたものと類似であった（データ示さず）。簡潔に述べると、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、ＨＡを含む対照赤血球系細胞と共に培養したＮＫ細胞と比較して、Ｋｉ６７染色によって測定した場合に、ＮＫ細胞増殖を増強した。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫ細胞におけるＮＫ細胞傷害性のマーカーであるグランザイムＢ発現の増加した割合およびレベルをもたらした。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫ細胞活性化のマーカーであり、ＴＲＡＩＬ−リガンド含有細胞についての死誘導性リガンドであるＴＲＡＩＬ含有ＮＫ細胞の増加した割合をもたらした。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＣＤ６９含有ＮＫ細胞の増加した割合をもたらした。ＣＤ６９は、リンパ球における初期活性化のマーカーである。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫｐ４４含有細胞の増加した割合をもたらした。ＮＫｐ４４は、活性化されたＮＫ細胞上で排他的に発現され、一部のウイルス感染細胞および腫瘍細胞の死滅を促進し得る。４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、対照ＨＡで観察されたものと比較して、ＮＫ細胞上の増加した４１ＢＢ発現をもたらした。４１ＢＢは、ＮＫ細胞およびＴ細胞上の活性化マーカーである。従って、表現型マーカーの解析からの結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方を含む赤血球系細胞が、ＮＫ細胞の生存、増大および活性化を増強したことを実証した。

ＮＫとＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡを含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞との共培養物から、ＮＫ細胞を、ＨｕｍａｎＮＫ陰性選択キットを使用して再精製した。Ｋ５６２細胞を用いた死滅アッセイのために、Ｋ５６２標的細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＦａｒＲｅｄで標識し、２０，０００個の細胞を、変動する比率（１：１または５：１の赤血球系：標的）で、精製されたＮＫと共にプレートし、４時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷上でＣＤ５６（クローン）、ＣＤ３（クローン）、生／死（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）によって解析して、生きた標的の数を決定した。特異的死滅を、（「Ｋ５６２＋ＮＫ」条件における％死Ｋ５６２標的細胞）−（「Ｋ５６２のみ」条件における％死Ｋ５６２標的細胞）として計算し、自発的標的細胞死を求めた。

結果は図１５に示される。図１５は、特異的死滅としてプロットした、２人のＰＢＭＣドナーについての平均パーセント死滅を示し、このとき、Ｅ：Ｔ（エフェクター（ＮＫ）：標的（腫瘍））細胞比は５：１であった。図１５に示されるように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞でプライミングしたＮＫ細胞は、対照ＨＡと比較して、Ｋ５６２標的細胞に対する増強された細胞傷害性を有する。図８に示される結果と同様に、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）＋４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、可溶性ＩＬ−１５またはＩＬ−２でプライミングしたＮＫ細胞で観察されたものと匹敵する、ＮＫ細胞による最も高いパーセント死滅を示した。Ｅ：Ｔ細胞比を１：１とした場合に得られた結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）および４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞でプライミングしたＮＫ細胞が、対照ＨＡと比較して、Ｋ５６２細胞に対する増加した細胞傷害性を有することを同様に示したが、より少ない全体的死滅が観察され、標的死滅は、可溶性ＩＬ−１５またはＩＬ−２でプライミングしたＮＫ細胞で見られたものほど大きくはなかった（データ示さず）。

（ｉｉ）短期プライミング
短期プライミングのために、凍結された精製されたＮＫ細胞（Ａｓｔａｒｔｅ）を解凍し、培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｅｐを含むＲＰＭＩ）中に再懸濁し、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む２ｅ５の赤血球系細胞と共に、９６ウェルＵ底プレート中に１ウェル当たり２ｅ４または１ｅ５でプレートした。対照として、ＮＫ細胞を、単独でまたはｒｈＩＬ−１５（実験に依存して０．１、１または１０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共にプレートした。さらに、対照ウェルを、赤血球系細胞のみで構成した。細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃で一晩（１６〜２０時間の間）インキュベートした。

Ｋ５６２細胞を用いた死滅アッセイのために、Ｋ５６２細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＦａｒＲｅｄで標識し、２０，０００個の標的細胞を、５：１のＥ：Ｔ比で、ＮＫ細胞、ＮＫならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む、４−１ＢＢＬを含むもしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞、または対照としての赤血球系細胞のみの一晩培養物を含むウェルに添加し、４時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷上でＣＤ５６（クローン）、ＣＤ３（クローン）、生／死（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）によって解析して、生きた標的の数を決定した。特異的死滅を、（「Ｋ５６２＋ＮＫ」条件における％死Ｋ５６２標的細胞）−（「Ｋ５６２のみ」条件における％死Ｋ５６２標的細胞）として計算し、自発的標的細胞死を求めた。結果（データ示さず）は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞で一晩プライミングしたＮＫ細胞が、対照または４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞（各々およそ４０％の死滅）と比較して増強されているが、ｒｈＩＬ−１５でプライミングしたＮＫ細胞（少なくとも９０％の死滅）よりは低い、Ｋ５６２標的に対する細胞傷害性（およそ６０％の死滅）を有することを示している。

併せて考えると、この実施例の結果は、単独でまたは４−１ＢＢＬと一緒にＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞が、細胞１つ当たり基準でのＮＫ細胞の細胞傷害性を増強すること、つまり、ＮＫ細胞がより増大されるだけでなく、得られた個々のＮＫ細胞自体がより活性であることを実証している。

（実施例１８）
４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞は、ＡＤＣＣ死滅をｉｎｖｉｔｒｏで誘導する。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）を含む、４−１ＢＢＬを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｖ４）および４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞によるＮＫ細胞の短期（一晩）プライミングを、上記実施例１７に記載したように実施した。

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイのために、Ｒａｊｉ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＦａｒＲｅｄで標識し、次いで、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２０ＩｇＧ１（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（「アイソ」、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、Ｒａｊｉ細胞を洗浄し、２０，０００個の細胞を、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞ならびに４−１ＢＢＬを含む、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むもしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞、または操作された赤血球系細胞のみの一晩培養物を含むウェルに添加し、４時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷上でＣＤ５６（クローン）、ＣＤ３（クローン）、生／死（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）によって解析して、生きた標的の数を決定した。特異的死滅を、（「Ｒａｊｉ＋ＮＫ」条件における％死Ｒａｊｉ標的）−（「Ｒａｊｉのみ」条件における％死Ｒａｊｉ標的）として計算し、自発的標的細胞死を求めた。

図１６に示されるように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞で一晩プライミングしたＮＫ細胞は、４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞または対照で一晩プライミングしたＮＫ細胞と比較して、Ｒａｊｉ細胞の増加したパーセント死滅を実証した。従って、これらの結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含むまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４１ＢＢＬを含む赤血球系細胞が、Ｒａｊｉ細胞標的の増強されたＡＤＣＣ死滅をもたらすことを実証しており、これは、これらの赤血球系細胞が、細胞１つ当たり基準でのＮＫ細胞の細胞傷害性を増強すること、つまり、ＮＫ細胞がより増大されるだけでなく、得られた個々のＮＫ細胞自体がより活性であることを示している。

（実施例１９）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞は、結腸がんマウスモデルにおける腫瘍負荷をｉｎｖｉｖｏで低減させる。
結腸がんについてのＣＴ２６同系マウスモデル系を使用して、腫瘍負荷に対する、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびマウス４−１ＢＢＬを含むマウス赤血球系細胞の影響を試験した。ＣＴ２６は、市販のマウス結腸癌モデルである（その全体が参照により本明細書に組み込まれるZhang et al., Clin Exp Metastasis. 2013 Oct; 30(7): 10.1007/s10585-013-9591-8）。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（「ＩＬ−１５ＴＰ」）および４−１ＢＢＬと共コンジュゲートさせた（即ち、同じ細胞上にコンジュゲートさせたＩＬ−１５ＴＰおよび４−１ＢＢＬの両方）（赤血球系細胞を官能化するためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に対する優先権を主張する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２に記載されている）。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質を、本明細書の表１０に示される構築物で、ＩＬ−１５鎖に融合した受容体のｓｕｓｈｉドメインとして発現させた。マウス４−１ＢＢＬタンパク質を、本明細書の表１０に示される構築物で発現させた。

腫瘍がおよそ５０ｍｍ^３の体積に達した時点で、動物に、静脈内（ＩＶ）投与される４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（「ＩＬ−１５ＴＰ」）を提示するマウス赤血球系細胞、腹腔内（ＩＰ）投与される抗ＰＤ１モノクローナル抗体単独（αＰＤ−１ｍＡｂ；１５０μｇ）、またはＩＰ投与されるαＰＤ−１と組み合わせてＩＶ投与される４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（「ＩＬ−１５ＴＰ」）を提示するマウス赤血球系細胞、を投薬した。４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡなしのマウス赤血球系細胞を、対照として使用した（「ｍＲＢＣ−ＣＴＲＬ」）。動物に投薬するために、平均１ｅ９の赤血球系細胞を、１用量当たり、細胞１つ当たり平均３０，０００個の分子のｍ４−１ＢＢＬおよび細胞１つ当たり平均３５，０００個の分子のＩＬ−１５ＴＰで、投与した。

動物の重量および状態を毎日記録し、腫瘍を、各腫瘍を２つの次元で測定することによって、１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下の標準式を使用して計算した：（Ｌ×Ｗ^２）／２。平均腫瘍重量および平均の標準誤差を、各時点において各群について計算した。体重を毎日記録した。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算した（示される処置日数は、所望の腫瘍体積が観察された日から開始する）。腫瘍保有マウスから脾臓および腫瘍を採取し、両方の組織由来の細胞懸濁物を、１１日目に、フローサイトメトリーによる解析のために生成した。増殖性ＣＤ８Ｔ細胞（Ｋｉ６７＋）および機能的ＣＤ８Ｔ細胞（グランザイムＢ＋）の総数を解析した。

対照と比較した、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示する調製されたマウス赤血球系細胞の抗腫瘍活性を、腫瘍体積および／または腫瘍重量における経時的な変化を評価することによって決定した。図１７Ａ（示されるデータは、１３日目のものであり、各点は、１匹のマウス中の腫瘍を示す）に示されるように、単剤治療としてまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせてｉ．ｖ．投与した、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞は、ＣＴ２６結腸がんマウスモデルにおける腫瘍負荷を低減させた。４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するマウス赤血球系細胞と抗ＰＤ１抗体との組合せによる処置は、調製された赤血球系細胞または抗ＰＤ１抗体単独のいずれかと比較して、安定疾患または腫瘍退縮を有するマウスのより高い数を生じた。さらに、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡによる腫瘍成長阻害には、増殖性ＣＤ８Ｔ細胞および細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍浸潤における１．７倍の増加が伴った（図１７Ｂ）。

（実施例２０）
ｉｎｖｉｖｏでのＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含むマウス赤血球系細胞の毒性の欠如。
肝臓毒性のマウスモデルを使用して、マウスＲＢＣ−４−１−ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの毒性の欠如または忍容性を評価した（その全内容が参照により本明細書に組み込まれるNiu et al J Immunology 2007 178:4194-4213）。簡潔に述べると、６〜１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、以下を投薬した：４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するマウス赤血球系細胞（１ｅ９の細胞）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡなしのマウス赤血球系細胞、１５０μｇの抗ＰＤ１抗体、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するマウス赤血球系細胞（１ｅ９の細胞）および１５０ｕｇの抗ＰＤ１抗体、あるいは対照としての、５０ｕｇもしくは２００ｕｇの３Ｈ３抗体、または食塩水。動物の重量および状態を毎日記録した。投薬を、１日目、４日目、８日目および１１日目に実施し、最終屠殺を１８日目に実施した。肝臓および血清を収集し、マクロファージおよびＣＤ８の浸潤についての解析を、単一細胞懸濁物への肝臓の消化および処理の後の肝臓に対して実施した。さらに、血清中の肝臓トランスアミナーゼＡＬＴのレベルを定量化した。

図１８に示されるように、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ／１５／ＩＬ−１５ＲＡの好ましい忍容性が観察された。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）肝臓酵素のレベルは、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの投与後に、有意には上昇しなかった。対照的に、この肝臓酵素の有意な上昇が、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体３Ｈ３の投与後に観察された。マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および特にＣＤ８＋／Ｅｏｍｅｓ＋／ＫＬＧＲ１＋Ｔ細胞の肝臓浸潤は、４−１ＢＢＬ誘導される肝臓毒性にとって重要であると考えられる。予想したように、これらの集団の全ての増加した肝臓浸潤が、４−１ＢＢアゴニスト抗体３Ｈ３による処置後に観察された。重要なことに、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの投与後に、これらの集団のいずれの増加した肝臓浸潤も存在しなかった。これらの結果は、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡでｉｎｖｉｖｏで観察されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の強力な刺激には、他の４−１ＢＢアゴニストの投与とは関連していた肝臓毒性が伴わないことを示している。理論に束縛されることは望まないが、ＲＢＣ−４１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡは、４−１ＢＢアゴニスト抗体とは異なり、血管中に隔離されると考えられ、この４−１ＢＢアゴニスト抗体は、血管から骨髄へと拡散することによって肝臓毒性を引き起こすと考えられ、そこで骨髄性細胞を活性化および増大させ、骨髄性細胞は次に、肝臓に移動してクッパー細胞になり、ＣＤ８細胞を活性化する。本明細書に示されるデータは、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡが骨髄由来の単球を刺激しないことを示唆しており、これは、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡへの曝露が限定的である骨髄において活性化が生じるという仮説と一致している。従って、本明細書で提供される４−１ＢＢＬを提示するＲＢＣは、他の４−１ＢＢアゴニストを超える顕著な治療的利点を提供する。

例えば、実施例１５では、マウスにおいて肝毒性を生じた用量レベルと等価な用量レベルでの４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体の投与後に達成された腫瘍負荷低減は、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡで達成された腫瘍負荷低減と有意には異ならなかった。同様に、実施例１９では、マウスにおいて肝毒性を生じた用量レベルと等価な用量レベルでの４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体の投与後に達成された抗腫瘍活性は、マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡで達成された腫瘍負荷低減と有意には異ならなかった。マウスＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡは、マウスにおいて肝臓毒性を生じなかったので、この観察は、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡが、がん患者において、アゴニスト性４−１ＢＢ抗体を超える改善された治療指数または改善されたリスク−ベネフィットを有し得ることを支持している。

上記解析に加えて、肝臓Ｈ＆Ｅ染色切片を病理学者が評価し、炎症スコアを割り当てた。これらの結果により、増加した炎症スコアによって見られるように、３Ｈ３群について、肝臓病理における有意な増加が明らかになった（図１８Ｅ）。重要なことに、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ群は、ｍＲＢＣ−ＣＴＲＬまたはＰＢＳ対照群と比較して、増加した炎症の徴候も増加した毒性の徴候も示さなかった。３Ｈ３群について、病理報告は、性質が主にリンパ球性であるように見える顕著な血管周囲浸潤物を記載した。

併せて考えると、示されたデータは、ＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡが十分に忍容され、安全性の懸念を全く生じなかったことを示している。４１ＢＢＬおよびＩＬ−１５ＴＰを使用したにもかかわらずに毒性が欠如する機構は、循環に制限されるＲＢＣ−４−１ＢＢＬ＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの体内分布であり得、従って、細胞は、肝臓毒性カスケードを開始すると示唆されるプロセスである、骨髄中の骨髄性細胞との相互作用ができず、他の４−１ＢＢアゴニストを超える顕著な治療的利点が提供される。

（実施例２１）
ＩＬ−１２を発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成。
ＩＬ−１２構築物
ＤＮＡ構築物を、以下の表１３に示されるように、赤血球系細胞における発現のために調製した：

レンチウイルスベクターの産生
ＩＬ−１２遺伝子構築物（表１３に示されるＶ１またはＶ２）を構築した。遺伝子を、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングした。レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＩＬ−１２遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生した。細胞を、新鮮な培養培地中に配置した。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結した。

抗体結合
ＰＥ標識された抗ＩＬ−１２抗体（例えば、精製された抗ヒトＩＬ−１２−ｐ７０（クローン２０Ｃ２））の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＩＬ−１２の発現を検証した。抗体の結合を、ＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定した。ゲートを、染色された形質導入されていない細胞に基づいて設定した。

（実施例２２）
ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成。
レンチウイルスベクターの産生
ＩＬ−１２（表１３に示されるＶ１またはＶ２）および４−１ＢＢＬ遺伝子を構築した。１つのベクターがＩＬ−１２の遺伝子を含み、１つのベクターが４−１ＢＢＬの遺伝子を含むように、遺伝子を、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングした。レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＩＬ−１２遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターおよび４−１ＢＢＬ遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞を共トランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生した。細胞を、新鮮な培養培地中に配置した。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結した。

あるいは、１つのベクターがＩＬ−１２の遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を含むように、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ遺伝子を構築することができ、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングすることができることが認識される。その場合、レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＩＬ−１２遺伝子および４−１ＢＢＬ遺伝子の両方を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞を共トランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生する。細胞を、新鮮な培養培地中に配置する。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集する。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結する。

赤血球系細胞の増大および分化
正常ヒトドナー由来の動員された末梢血細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞を、実施例２１に記載したように、増大および分化させた。

抗体結合
ＰＥ標識された抗ＩＬ−１２抗体（例えば、抗ＩＬ−１２抗体（ＩＬ−１２−ｐ７０（クローン２０Ｃ２））の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＩＬ−１２の発現を検証した。ＰＥ標識された抗４−１ＢＢＬ抗体（例えば、精製された抗ヒト４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における４−１ＢＢＬの発現を検証した。抗体の結合を、ＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定した。ゲートを、染色された形質導入されていない細胞に基づいて設定した。

図３０Ａに示されるように、ＩＬ−１２Ｖ２（ＳＭＩＭ１に連結されたＩＬ−１２）は、単独のまたは４−１ＢＢＬと組み合わせたＩＬ−１２Ｖ１（ＧＰＡに連結されたＩＬ−１２）と比較して、細胞表面において有意により高いＩＬ−１２を示すことが観察された。細胞表面上のＩＬ−１２のこの増加したレベルは、ＳＭＩＭ１を膜ドメインとして使用する場合の、赤血球系細胞の表面上の４−１ＢＢＬの増加したコピー数という予想されなかった利点、および従って、予想された増強された活性もまた提供する（図３０Ｂ）。

（実施例２３）
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質およびＩＬ−１２を発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成。
レンチウイルスベクターの産生
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ（Ｖ４．１）融合タンパク質およびＩＬ−１２遺伝子を構築した。１つのベクターがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの遺伝子を含み、１つのベクターがＩＬ−１２の遺伝子を含むように、遺伝子を、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングした。レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターおよびＩＬ−１２遺伝子を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞を共トランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生した。細胞を、新鮮な培養培地中に配置した。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集した。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結した。

あるいは、１つのベクターがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの遺伝子およびＩＬ−１２の遺伝子を含むように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ融合タンパク質およびＩＬ−１２遺伝子を構築することができ、ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの、ＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨのマルチクローニングサイト中にクローニングすることができることが認識される。その場合、レンチウイルスを、ｐＰＡＣＫＨ１（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子の両方を含むｐＣＤＨレンチウイルスベクターで細胞を共トランスフェクトすることによって、２９３Ｔ細胞において産生する。細胞を、新鮮な培養培地中に配置する。ウイルス上清を、培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集する。上清を収集し、濾過し、−８０℃でアリコートで凍結する。

抗体結合
ＰＥ標識された抗ＩＬ−１５−ＲＡ抗体（例えば、抗ＩＬ−１５ＲＡ抗体（ＪＭ７Ａ４）（ａｂ９１２７０）、ＡｂＣａｍ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡの発現を検証した。ＰＥ標識された抗ＩＬ−１２抗体（例えば、精製された抗ヒトＩＬ−１２抗体（ＩＬ−１２−ｐ７０（クローン２０Ｃ２））の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＩＬ−１２の発現を検証した。抗体の結合を、ＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定した。ゲートを、染色された形質導入されていない細胞に基づいて設定した。

（実施例２４）
ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せを含む操作された赤血球系細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫおよびＮＫＴ細胞のＩＦＮγ応答および増殖の相乗的誘導を引き起こす。
ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（Ｖ４．１）を含む赤血球系細胞およびＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（Ｖ４．１）を含む赤血球系細胞を、それぞれ、実施例２１、１および２３に記載したように調製した。

初代ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の増殖および活性化を測定した。３人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを、ＣＴＦＲで標識し、ＩＬ−１２を含む（「ＲＢＣ−ＩＬ−１２」）、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む（「ＲＢＣ−ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ」）、およびＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む（「ＲＢＣ−ＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ」）操作された赤血球系細胞、対照ＲＢＣ（「ＲＢＣ−ＣＴＲＬ」）ならびに培地対照（「培地ＣＴＲＬ」）と共にインキュベートした。ＲＢＣは、４００，０００個の細胞、２００，０００個の細胞または１００，０００個の細胞で存在した。８日目に、活発に分裂しているＣＤ８、ＣＤ４、ＮＫおよびＮＫＴのパーセンテージを、ＣＴＦＲ希釈を使用して評価した。上清を収集し、ＩＦＮγの量を、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。図１９Ａ〜Ｅに示されるように、ＲＢＣ−ＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡは、初代ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫおよびＮＫＴ細胞を、強力に増殖するように、また、活性化された細胞によって放出されるＩＦＮγサイトカインの産生によって測定されるように活性化されるように、刺激した。ＲＢＣ−ＩＬ−１２およびＲＢＣ−ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡは、これらの細胞の、いくらかの測定可能な増殖および活性化を刺激した。しかし、ＲＢＣ−ＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡは、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の増殖の、かなりより大きい刺激、一部の例では相乗的な刺激、ならびにＩＦＮγ産生における劇的な増加を示した。併せて考えると、この実施例で示された結果は、ＲＢＣの表面上のＲＢＣ−ＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの発現が、初代ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の高度に相乗的かつ強力な活性化を駆動したことを示している。

（実施例２５）
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬおよびそれらの組合せを含む赤血球系細胞は、肺転移をｉｎｖｉｖｏで低減させる。
黒色腫についてのＢ１６Ｆ１０転移性マウスモデル系（例えば、Kubo et al. (2017)を参照のこと）を使用して、転移性成長に対する、細胞表面上に、単独または組合せのいずれかでマウスＩＬ−１２、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質およびマウス４−１ＢＢＬを提示するマウス赤血球系細胞の影響を試験した。このモデルでは、腫瘍細胞を静脈内注射して肺における転移を樹立し、次いで、マウスを、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡもしくは４−１ＢＢＬのいずれか単独を提示するように調製されたマウス赤血球系細胞、または以下の組合せを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置した：ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ＩＬ−１２／ＩＬ−１５ＲＢＣ）、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ（ＩＬ−１２／４−１ＢＢＬＲＢＣ）、ならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬ（ＩＬ−１５／４−１ＢＢＬＲＢＣ）。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬとコンジュゲートさせるか、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方ならびにＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方と共コンジュゲートさせた。これらの細胞を、Ｃｙ５蛍光についてのフローサイトメトリーによって定量化した（図２０Ａ）。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質、マウス４−１ＢＢＬタンパク質およびマウスＩｌ−１２タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書の表１０に提供される。

最初に、７週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^５のＢ１６Ｆ１０細胞／マウスを静脈内接種した。次いで、動物に、以下を静脈内（ＩＶ）投薬した：ＩＬ−１２を提示する赤血球系細胞；ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示する赤血球系細胞；４−１ＢＢＬを提示する赤血球系細胞；ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方を提示する赤血球系細胞；ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを提示する赤血球系細胞；ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを提示する赤血球系細胞；腹腔内（ＩＰ）投与される組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）；腹腔内（ＩＰ）投与される組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質；腹腔内（ＩＰ）投与されるマウス４−１ＢＢアゴニスト抗体（３Ｈ３）；または対照としてのＩＬ−１２もＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡも４−１ＢＢＬもなしの赤血球系細胞（ｍＲＢＣ−ＣＴＲＬ）。動物に投薬するために、平均１ｅ９の赤血球系細胞を、１用量当たり０．１４ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１２に相当する細胞１つ当たり平均３０，０００個の分子のＩＬ−１２単独、１用量当たり０．２２ｍｇ／ｋｇの４−１ＢＢＬに相当する細胞１つ当たり１２０，０００個の分子の４−１ＢＢＬ単独、および１用量当たり０．１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡに相当する細胞１つ当たり６０，０００個の分子のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独；またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞については、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０３ｍｇ／ｋｇに相当する２０，０００個の分子のＩＬ−１２および２０，０００個の分子のＩＬ−１５−ＲＡ；ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞については、両方の０．１ｍｇ／ｋｇに相当する２０，０００個の分子のＩＬ−１２および４０，０００個の分子の４−１ＢＢＬ；または４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞については、それぞれ０．１１ｍｇ／ｋｇおよび０．０７ｍｇ／ｋｇに相当する６０，０００個の分子の４−１ＢＢＬおよび４０，０００個の分子のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡで、１用量ごとに投与した。アゴニスト性４１ＢＢ抗体（３Ｈ３）を、２．５ｍｇ／ｋｇで投薬した。動物に、接種の１日、４日および８日後に、赤血球系細胞または３Ｈ３を投薬した。

動物の重量および状態を毎日記録した。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算した。接種の１４日後に、動物を屠殺し、肺を収集した。肺転移の数を、顕微鏡を使用して評価した。さらに、肺組織を、単一細胞懸濁物になるように処理し、Ｋｉ６７およびグランザイムＢについて染色し、フローサイトメトリーを使用して試験した。

図２０Ｂに示されるように、単剤治療としてｉ．ｖ．投与した、その表面上にＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せまたはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの組合せまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの組合せを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞は、ｍＲＢＣＣＴＲＬと比較して、マウスにおける腫瘍負荷を有意に低減させ、これらの分子を個々に提示する赤血球系細胞、即ち、ｍＲＢＣＩＬ−１２、ｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびｍＲＢＣ４−１ＢＢＬと比較して、より高い有効性を示した。このデータは、細胞表面上にタンパク質のこれらの組合せを含む赤血球系細胞を投与することによって治療利益が達成され得ることを示した。ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの組合せで達成された腫瘍負荷における低減は、ＩＬ−１２または４−１ＢＢＬ単独で達成されたものよりも有意に良好であり、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せで達成された腫瘍負荷における低減は、４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独で達成されたものよりも有意に良好であった。

さらに、図２０Ｃに示されるように、肺転移の数における減少は、肺中の増殖性細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増加した浸潤と関連した（ｐ＝０．０００２）。

（実施例２６）
ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞は、腫瘍成長をｉｎｖｉｖｏで緩徐化させる。
結腸癌についてのＭＣ３８同系マウスモデル系ならびに黒色腫についてのＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長（例えば、固形腫瘍成長）に対する、細胞表面上にマウスＩＬ−１２を提示するマウス赤血球系細胞の影響を試験した。
マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびマウス４−１ＢＢＬ、マウスＩＬ−１２およびマウス４−１ＢＢＬ、またはマウスＩＬ−１２およびヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡのいずれかと共コンジュゲートさせた。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質、マウス４−１ＢＢＬタンパク質およびマウスＩｌ−１２タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書の表１０に提供される。

腫瘍がおよそ１００ｍｍ^３の体積に達した時点（およそ７〜１０日）で、動物に、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬ（ｍＲＢＣＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ＋４−１ＢＢＬ）、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ（ｍＲＢＣＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬ）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｍＲＢＣＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）のいずれかを提示するいずれかの赤血球系細胞；これらのタンパク質なしの赤血球系細胞（ｍＲＢＣＣＴＲＬ）；または対照としての４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体３Ｈ３を投薬した。投薬を、１日目、４日目および８日目に実施した（示される処置日数は、所望の腫瘍体積が観察された日から開始する）。動物に投薬するために、平均１ｅ９のＲＢＣを、１用量当たり、以下のような細胞１つ当たりの分子の平均数で、マウス１匹当たり１用量ごとに投与した：ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞については、各々について０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０３ｍｇ／ｋｇに相当する２０，０００個の分子のＩＬ−１２および２０，０００個の分子のＩＬ−１５−ＲＡ；ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞については、それぞれ０．１４ｍｇ／ｋｇおよび０．１５ｍｇ／ｋｇに相当する３０，０００個の分子のＩＬ−１２および８０，０００個の分子の４−１ＢＢＬ；ならびに４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞については、それぞれ０．１５ｍｇ／ｋｇの４−ＢＢＬおよび０．０９ｍｇ／ｋｇに相当する８０，０００個の分子の４−１ＢＢＬおよび５０，０００個の分子のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ。

動物の重量および状態を毎日記録した。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算した。腫瘍を、各腫瘍を２つの次元で測定することによって、１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下の標準式を使用して計算した：（Ｌ×Ｗ^２）／２。平均腫瘍重量および平均の標準誤差を、各時点において各群について計算した。

未処置対照と比較した、ＩＬ−１２を含む調製された赤血球系細胞（即ち、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの組合せまたはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せのいずれかを提示する赤血球系細胞）の抗腫瘍活性を、腫瘍体積および／または腫瘍重量における経時的な変化を評価することによって決定した。図２１Ａおよび２１Ｂに示される結果は、ＩＬ−１２を含む調製された赤血球系細胞が、未処置対照と比較して、腫瘍進行を経時的に顕著に低減させたことを実証している。さらに、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを含む調製された赤血球系細胞は、ＭＣ３８マウスモデル系において、３Ｈ３と比較して、腫瘍体積の進行を有意に低減させた。

（実施例２７）
ｉｎｖｉｖｏでのＩＬ−１２を含むマウス赤血球系細胞の毒性の欠如。
黒色腫についてのＢ１６Ｆ１０転移性マウスモデル系（Kubo et al., 2017；その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、マウスＲＢＣ−ＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびＲＢＣ−ＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬの毒性の欠如または忍容性を評価した。肝臓毒性を評価するためのこの実験では、種々のＲＢＣ、マウスモデルおよびＲＢＣ投薬スケジュールは、実施例２５に記載したとおりであった。

実施例２５に記載したように、６〜１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を静脈内接種して肺における転移を樹立し、次いで、マウスに、以下を投薬した：ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するマウス赤血球系細胞（ｍＲＢＣＩＬ１２＋Ｌ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）（１Ｅ９の細胞）、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを提示するマウス赤血球系細胞（ｍＲＢＣＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬ）（１Ｅ９の細胞）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬなしのマウス赤血球系細胞（ｍＲＢＣＣＴＲＬ）（１Ｅ９の細胞）、または対照としての３μｇのｒＩＬ−１２。

動物の重量および状態を毎日記録した。投薬を、１日目、４日目および８日目に実施し、最終屠殺を１０日目に実施した。肝臓、脾臓および血清を収集し、血清中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）肝臓酵素およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）のレベルを定量化した。

図２２に示されるように、好ましい忍容性が、組換えＩＬ１２と比較して、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡとまたはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬと共コンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞について観察された。脾臓および肝臓の重量ならびにＡＬＴおよびＩＦＮｇのレベルは、調製されたマウス赤血球系細胞の投与後に、有意には上昇しなかった。対照的に、脾臓および肝臓の重量ならびにＡＬＴおよびＩＦＮｇのレベルは、ｒＩＬ−１２の投与後に、有意に上昇した。実施例２５および２６の結果と併せて考えると、データは、ＩＬ−１２を含むマウス赤血球系細胞が、ｒＩＬ−１２が投与される場合に観察される毒性なしに、固形腫瘍の成長および転移を低減させることにおいて効果的であることを示している。

理論に束縛されることは望まないが、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方またはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方を含む赤血球系細胞の毒性の欠如は、血管中での細胞の隔離、即ち、循環に制限されることに起因すると仮説が立てられる。この制限により、細胞は、肝臓毒性カスケードを開始すると示唆されているプロセスである、骨髄中の骨髄性細胞との相互作用ができなくなる。本明細書に示されるデータは、ＩＬ−１２を提示する赤血球系細胞が、骨髄由来の単球を刺激せず、従って、これらの細胞がｒＩＬ−１２を超える顕著な治療的利点を提供することを示唆している。

（実施例２８）
単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／ＩＬ−１５を含む赤血球系細胞は、腫瘍成長をｉｎｖｉｖｏで阻害する。
黒色腫についてのＢ１６Ｆ１０腫瘍モデル系を使用して、腫瘍成長に対する、単独でまたはヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡと組み合わせてマウスＩＬ−１２を含むマウス赤血球系細胞の影響を試験した。このモデルでは、Ｂ１６Ｆ１０細胞をマウス中に皮下注射して、約７日間で触知可能な腫瘍を形成させ、抗ＰＤ１抗体なしまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物（ＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）のいずれかを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞で処置した。皮下注射すると、Ｂ１６Ｆ１０細胞は、５〜１０日で触知可能な腫瘍を形成し、１４〜２１日で１×１×１ｃｍの腫瘍にまで成長した。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、ヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独とコンジュゲートさせるか、マウスＩＬ−１２単独とコンジュゲートさせるか、またはヒトＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびマウスＩＬ−１２の両方と共コンジュゲートさせた。細胞とコンジュゲートさせたＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよびＩＬ−１２の量を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質、マウス４−１ＢＢＬタンパク質およびマウスＩｌ−１２タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書の表１０に提供される。

腫瘍がおよそ１００ｍｍ^３の体積に達した時点（およそ７〜１０日）で、動物に、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（αＰＤ−１ｍＡｂ）ありもしくはなしで、ＩＬ−１２単独（ｍＲＢＣＩＬ−１２）、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物単独（ｍＲＢＣＩＬ−１５）、ならびにＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方（ｍＲＢＣＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）のいずれかを提示するいずれかの赤血球系細胞；または対照としての、これらのタンパク質なしのいずれかの赤血球系細胞（ｍＲＢＣＣＴＲＬ）、４μｇの組換えＩＬ−１２、５μｇの組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ならびに組換えＩＬ−１２および組換えＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物の両方を投薬した。投薬を、１日目、４日目および８日目に実施した（示される処置日数は、所望の腫瘍体積が観察された日から開始する）。動物に投薬するために、平均３ｅ８または１ｅ９の赤血球系細胞を、１用量当たり、以下のような細胞１つ当たりの分子の平均数で、マウス１匹当たり１用量ごとに投与した：ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞については、それぞれ０．３ｍｇ／ｋｇおよび０．１５ｍｇ／ｋｇに相当する７０，０００個の分子のＩＬ−１２および８０，０００個の分子のＩＬ−１５／ＩＬ−１５−ＲＡ；ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞については、０．１７ｍｇ／ｋｇに相当する３５，０００個の分子のＩＬ−１２；およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞については、０．０７ｍｇ／ｋｇに相当する４０，０００個の分子のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ。

動物の重量および状態を毎日記録した。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算した。腫瘍を、各腫瘍を２つの次元で測定することによって、１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下の標準式を使用して計算した：（Ｌ×Ｗ^２）／２。平均腫瘍重量および平均の標準誤差を、各時点において各群について計算した。腫瘍を、１１〜１２日目に収集し、組織を酵素的に消化して、組織解離器を使用して均一な細胞懸濁物を取得した。次いで、細胞を染色し、免疫プロファイリングのために、様々な異なる抗体を使用するフローサイトメトリーによって解析した。Ｍ１細胞（活性化されたマクロファージ）を、ＣＤ４５＋、ＣＤ８−、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｃ低／−かつＭＨＣクラスＩＩ＋の生細胞集団として定義した。Ｍ２細胞を、Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣクラスＩＩ陰性の生細胞集団として定義した。Ｍ１細胞は抗腫瘍細胞であり、Ｍ２細胞（免疫抑制性）は、腫瘍促進性細胞である。マウス生存もまた、処置後最大で３０日間モニタリングした。

未処置対照と比較した、ＩＬ−１２を含む調製された赤血球系細胞（即ち、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せを提示する赤血球系細胞）の抗腫瘍活性を、腫瘍体積および／または腫瘍重量における経時的な変化を評価することによって決定した。図２３Ａ〜Ｃに示される結果は、ＩＬ−１２を含む調製された赤血球系細胞が、未処置対照と比較して、腫瘍進行を経時的に顕著に低減させたことを実証している。ＩＬ−１２単独またはＩＬ−１５と共にＩＬ−１２を含む調製された赤血球系細胞は、腫瘍体積の進行を有意に低減させ、これは、ａ−ＰＤ１と組み合わせるとさらに改善された。１ｅ９の細胞による処置は、３ｅ８の細胞による処置よりも、腫瘍阻害についてより有効であることが観察された。さらに、図２３Ｄ〜Ｅは、ａ−ＰＤ１と組み合わせた、ＩＬ−１２単独またはＩＬ−１５と共にＩＬ−１２を含む調製された赤血球系細胞が、未処置対照と比較して、処置の３０日後まで、マウスの改善された生存を示すことを実証している。ａ−ＰＤ１処置の非存在下では、改善された生存が、対照ｍＲＢＣを受けたマウスと比較して観察された。興味深いことに、ＩＬ−１５と共にＩＬ−１２を含む赤血球系細胞による処置は、３ｅ８の細胞の用量でマウスの生存を有意に改善した。ｒＩＬ−１２およびｒ−ＩＬ−１２＋ｒＩＬ−１５処置群で観察された体重の劇的な減少とは対照的に、ｍＲＢＣで処置した群のいずれについても、体重における変化は観察されなかった（データ示さず）。

さらに、図２３Ｆは、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５＋ａ−ＰＤ１で処置した腫瘍群におけるＣＤ８Ｔ細胞の増加した浸潤、およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡｍＲＢＣ群におけるＮＫ細胞の増加した浸潤を実証している。ＩＬ−１２含有群は、Ｍ１表現型、即ち、古典的に活性化されたマクロファージの抗腫瘍表現型に向かってマクロファージを極性化することも観察された。ｒＩＬ−１２とは対照的に、ＩＬ−１２含有群は、高レベルの免疫抑制性ＩＬ−１０を誘導しなかった（データ示さず）。

（実施例２９）
単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞、またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞、またはＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む赤血球系細胞は、腫瘍成長をｉｎｖｉｖｏで阻害する。
結腸癌についてのＭＣ３８同系マウスモデル系を使用して、腫瘍成長に対する、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬを提示するように調製されたマウス赤血球系細胞の影響を試験した。

マウス赤血球系細胞を、クリック方法論を使用して、マウス４−１ＢＢＬとコンジュゲートさせるか、ＩＬ−１２とコンジュゲートさせるか、または４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２の両方と共コンジュゲートさせた。細胞とコンジュゲートさせた４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２の量を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合タンパク質、マウス４−１ＢＢＬタンパク質およびマウスＩｌ−１２タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書の表１０に提供される。

腫瘍がおよそ１００ｍｍ^３の体積に達した時点（およそ７〜１０日）で、動物に、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（αＰＤ−１ｍＡｂ）ありまたはなしの、ＩＬ−１２単独（ｍＲＢＣＩＬ−１２）、４−１ＢＢＬ単独（ｍＲＢＣ４−１ＢＢＬ）、もしくはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方（ｍＲＢＣＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬ）のいずれかを提示する赤血球系細胞；または対照としての、これらのタンパク質なしの赤血球系細胞（ｍＲＢＣＣＴＲＬ）、もしくは４μｇの組換えＩＬ−１２、５０μｇのアゴニスト４１ＢＢ抗体（クローン３Ｈ３）、もしくは組換えＩＬ−１２および４１ＢＢアゴニスト抗体（３Ｈ３）の両方を投薬した。投薬を、１日目、４日目および８日目に実施した（示される処置日数は、所望の腫瘍体積が観察された日から開始する）。動物に投薬するために、平均３ｅ８または１ｅ９の赤血球系細胞を、１用量当たり、以下のような細胞１つ当たりの分子の平均数で、マウス１匹当たり１用量ごとに投与した：ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞については、それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇに相当する１００，０００個の分子のＩＬ−１２および１８０，０００個の分子の４−１ＢＢＬ；ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞については、０．３ｍｇ／ｋｇに相当する７０，０００個の分子のＩＬ−１２；および４−１ＢＢＬを含む赤血球系細胞については、０．１３ｍｇ／ｋｇに相当する７０，０００個の分子の４−１ＢＢＬ。

動物の重量および状態を毎日記録した。体重における変化を、１日目に記録した体重と比較して、各マウスについて計算した。腫瘍を、各腫瘍を２つの次元で測定することによって、１週間に３回測定した。腫瘍体積を、以下の標準式を使用して計算した：（Ｌ×Ｗ^２）／２。平均腫瘍重量および平均の標準誤差を、各時点において各群について計算した。腫瘍を、１１〜１２日目に収集し、組織を酵素的に消化して、組織解離器を使用して均一な細胞懸濁物を取得した。次いで、細胞を染色し、様々な異なる抗体を使用するフローサイトメトリーによって解析して、免疫プロファイリングを見た。Ｍ１およびＭ２細胞を、上記実施例２８に記載した通りに定義した。腫瘍退縮を、開始時点の腫瘍サイズと比較した、腫瘍サイズにおけるパーセント変化を計算することによって決定した。

未処置対照と比較した、ＩＬ−１２を含む調製された赤血球系細胞（即ち、ＩＬ−１２単独またはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの組合せを提示する赤血球系細胞）の抗腫瘍活性を、腫瘍体積および／または腫瘍重量における経時的な変化を評価することによって決定した。図２４Ａ〜Ｄに示される結果は、ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞が、未処置対照と比較して、腫瘍進行を経時的に顕著に低減させたことを実証している。さらに、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを含む調製された赤血球系細胞は、腫瘍体積の進行を有意に低減させた。図２４Ｄは、ＩＬ−１２単独またはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方を含む赤血球系細胞で処置したマウスが、未処置対照と比較して、腫瘍の縮小を示したことをさらに実証している。腫瘍サイズにおける低減は、マウスをαＰＤ−１ｍＡｂでも処置した場合には激化した。全体として、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方を含む調製された赤血球系細胞は、この結腸がんマウスモデルにおいて腫瘍を効果的に阻害し、これは、αＰＤ−１ｍＡｂと組み合わせて投与した場合にさらに激化した。

さらに、図２５Ａの結果は、腫瘍中への異なる免疫細胞の浸潤を実証している。ＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤は、ｍＲＢＣ−ＩＬ１２およびαＰＤ−１ｍＡｂ、またはＩＬ１２および４−１ＢＢＬａ−ＰＤ１で処置したマウスの腫瘍において観察された。ＣＤ８＋細胞の浸潤は、ＩＬ−１２群（即ち、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１２／４−１ＢＢＬ、またはＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）の全てで処置したマウスの腫瘍において観察され、増加した浸潤が、ｍＲＢＣＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬおよびαＰＤ−１ｍＡｂにおいて観察された。古典的に活性化されたマクロファージ（Ｍ１表現型）への極性化は、ｍＲＢＣＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬで処置したマウスおよびｍＲＢＣ−ＩＬ−１２で処置したマウスにおいて観察された。特に、αＰＤ−１ｍＡｂの投与は、このＭ１極性化を抑制した。図２５Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞へ向かうシフト、およびＩＬ−１２で処置したマウス群の全てにおける、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を超える調節性Ｔ細胞の喪失をさらに実証している。ｍＲＢＣで処置したマウスの生存は、処置の２０日後まで、腫瘍阻害の有効性と直接相関することが観察された（データ示さず）。

この実施例で上記した方法を使用するさらなる実験を実施して、ｉｎｖｉｖｏの腫瘍成長に対する、単独でまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた、ＩＬ−１２単独またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方を含む赤血球系細胞の影響を決定した。これらの結果は、ＩＬ−１２を含む赤血球系細胞の投与が、コンジュゲートしたタンパク質を欠如する対照赤血球系細胞（即ち、ｍＲＢＣＣＴＲＬ）の投与と比較して、腫瘍進行を経時的に顕著に低減させたことを実証した。さらに、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む調製された赤血球系細胞は、腫瘍体積の進行を有意に低減させた。これらの結果は、ＩＬ−１２単独またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む調製された赤血球系細胞が、未処置対照と比較して、腫瘍縮小を示し、この効果が、マウスを抗ＰＤ１抗体で処置した場合にさらに増加したことをさらに実証した。全体として、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む調製された赤血球系細胞は、有効な腫瘍阻害を示し、これは、αＰＤ−１ｍＡｂと組み合わせて投与された場合にさらに改善された（データ示さず）。

（実施例３０）
ｉｎｖｉｖｏでのＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡまたはＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬを含むマウス赤血球系細胞の毒性の欠如。
毒性のマウスモデルを使用して、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（ｍＲＢＣ−ＩＬ−１２＋ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）、またはＩＬ１２および３−１ＢＢＬ（ｍＲＢＣ−ＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬ）とコンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞の毒性の欠如または忍容性を評価した。毒性を評価するためのこの実験では、種々のｍＲＢＣおよびｍＲＢＣ投薬スケジュールは、実施例２０に記載した通りであった。毒性の評価を、概して実施例２０に記載したように実施した。

一般に、実施例２０に記載したように、６〜１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、以下を投薬した：ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを提示するマウス赤血球系細胞（ｍＲＢＣＩＬ１２＋Ｌ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ）（１Ｅ９、３ｅ８および１ｅ８の細胞）、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬを提示するマウス赤血球系細胞（ｍＲＢＣＩＬ−１２＋４−１ＢＢＬ）（１Ｅ９、３ｅ８および１ｅ８の細胞）；または対照としての、ＩＬ−１２もＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡも４−１ＢＢＬもなしのマウス赤血球系細胞（ｍＲＢＣＣＴＲＬ）（１Ｅ９、３ｅ８および１ｅ８の細胞）、組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）、組換えＩＬ−１５（ｒＩＬ−１５）、アゴニスト４−１ＢＢ抗体（３Ｈ３）、もしくはｒＩＬ−１２および３Ｈ３の組合せ。

動物の重量および状態を毎日記録した。投薬を、１日目、４日目、８日目および１１日目に実施し、最終屠殺を１８日目に実施した。肝臓、脾臓、血液および血清を収集した。血清中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）肝臓酵素のレベルを定量化した。血清中のサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、ＴＮＦａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３のレベルを、サイトカインビーズアッセイ（ＣＢＡ）を使用して定量化した。ビーズを、分析物特異的抗体（ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を含む）とコンジュゲートさせ、血清と共にインキュベートした。検出抗体を添加し、蛍光を、フローサイトメトリーによって定量化および解析した。全血球計数もまた実施した。

図２６Ａ〜２６Ｃに示されるように、好ましい忍容性が、対照と比較して、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、またはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬと共コンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞について観察された。試験したｍＲＢＣ組合せのいずれにおいても、体重、脾臓重量または肝臓重量における変化は観察されなかった。しかし、体重減少が、ｒＩＬ−１２を受けた全ての群において観察された。同様に、脾臓および肝臓の重量における劇的な増加が、ｒＩＬ−１２処置群において観察された。図２６Ｄは、ｒＩＬ−１２処置したマウスが、低レベルのヘモグロビンを伴う貧血、リンパ球減少症、好中球減少症、および好酸球の喪失によって特徴付けられる白血球（ＷＢＣ）数の喪失を示したことを実証している。対照的に、ｍＲＢＣ処置を受けた群では、細胞計数における主要な変化は観察されなかった。さらに、ｒＩＬ−１２処置マウスは、ＩＬ−１２を含むｍＲＢＣを投与したマウスと比較して、低レベルのリンパ球および赤血球、ならびに高レベルのＡＬＴ（１４日目および１８日目に検出された）を示した（データ示さず）。

さらに、図２７Ａ中の結果は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方またはＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方と共コンジュゲートさせたｍＲＢＣを受けたマウスが、３日目および１０日目に、血清中のＩＦＮｇレベルを増加させ、これが、各投薬の２日後に迅速に減少したことを実証している。従って、ｍＲＢＣ処置は、制御されたＩＦＮｇ応答を誘導し、これは、処置後に撤回することが可能である。対照的に、ｒＩＬ−１２で処置したマウスは、早くも３日目に、劇的により高いＡＬＴおよびＩＦＮｇレベルを示し、これは、研究の全体を通じて低下しなかった。類似のレベルのＡＬＴおよびＩＦＮｇが、１８日目に観察された（データ示さず）。図２７Ｂに示されるように、ＩＦＮｇレベルとは対照的に、ＴＮＦａレベルは、各用量で上昇し続けた。しかし、ｍＲＢＣで処置したマウスは、ｒＩＬ−１２で処置したマウスと比較して、ＴＮＦａレベルのより低い増加を有した。さらに、ｍＲＢＣで処置したマウスでは、ＩＬ−１０産生に対する主要な影響は観察されなかったが、ＩＬ−１０は、ｒＩＬ−１２で処置した動物の血清中で検出された（データ示さず）。

さらなる実験を実施して、ＩＬ１２単独とコンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞の毒性の欠如を試験し確認した。図２６Ｅ〜Ｆに示されるように、類似の好ましい忍容性が、ｒＩＬ−１２と比較して、ＩＬ−１２とコンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞で処置したマウスにおいて観察された。ＩＬ−１２とコンジュゲートさせた赤血球系細胞で処置したマウスのいずれにおいても、体重、脾臓重量または肝臓重量における変化は観察されなかった。しかし、体重減少が、ｒＩＬ−１２を受けたマウスの全ての群において観察された。同様に、脾臓および肝臓の重量における劇的な増加が、ｒＩＬ−１２で処置したマウスにおいて観察された。図２６Ｆは、ｒＩＬ−１２処置マウスが、ＩＬ−１２とコンジュゲートさせたマウス赤血球系細胞で処置したマウスと比較して、低レベルのヘモグロビンを伴う貧血、ＷＢＣ数の喪失、低レベルのリンパ球および赤血球、高レベルのＡＬＴ（１４日目および１８日目に検出された）ならびに高レベルのＩＦＮｇ（１０日目に検出された）を示したことをさらに実証している。

これらの結果は、単独でまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡもしくは４−１ＢＢＬと組み合わせてＩＬ−１２を含むマウス赤血球系細胞が、ｒＩＬ−１２、ｒＩＬ−１５または３Ｈ３の投与と関連する毒性なしに、固形腫瘍の成長および転移を低減させることにおいて効果的であることを実証している。

（実施例３１）
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬ、またはそれらの組合せを遺伝的に含む遺伝子操作された除核赤血球系細胞は、ＮＫ細胞の細胞傷害性を誘導する。
ＩＬ−１２単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独（Ｖ４．１）、４−１ＢＢＬ単独、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（Ｖ４．１）の組合せ、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの組合せ、もしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの組合せを含むヒト除核赤血球系細胞によるヒトＮＫ細胞の短期（一晩）プライミングを、実施例１７に以前に記載したように実施した。簡潔に述べると、凍結されたＮＫドナー細胞を、５：１の比（１００，０００個のＮＫ細胞＋５００，０００個のＲＢＣ細胞、４０，０００個のＮＫ細胞＋２００，０００個のＲＢＣ細胞）で、除核赤血球系細胞（ＲＢＣ）と共に一晩インキュベートした。次の日、２０，０００個のＣＴＦＲ標識したＫ５６２標的細胞を、５：１および２：１のＥ：Ｔ比で、ＮＫ細胞およびＲＢＣ細胞と４時間接触させた。染色を、ＧＰＡＰＥ、ＣＤ５６ＰＥ−Ｃｙ７、固定可能な生存性色素（fixable viability dye）（ＡｍＣｙａｎ）、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＦａｒＲｅｄ（標的）を用いて実施し、試料を、フローサイトメトリーを使用して解析した。さらなる表現型決定を、２：１のＥ：Ｔ比でＧｚｍＢ、ＰａｃＢｌｕｅおよびＣＤ６９ＢＶ６０５を使用して実施した。

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを、実施例１８に記載したように実施した。簡潔に述べると、１００，０００個または４０，０００個のＮＫ細胞を、５：１および２：１のＥ：Ｔ比で、Ｒａｊｉ標的細胞と接触させた。Ｒａｊｉ細胞をＣＴＦＲ標識し、抗ＣＤ２０またはアイソタイプ抗体のいずれかで事前処理し、４時間インキュベートした。次いで、細胞を、ＣＤ１６についてさらに染色した。

図２８Ａに示される結果は、ＩＬ−１２単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せ、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの組合せもしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの組合せを含むヒト除核赤血球系細胞で一晩プライミングしたＮＫ細胞が、５：１のＮＫ：標的比において、ｒｈＩＬ−１５でプライミングしたＮＫ細胞（少なくとも９０％の死滅）と匹敵する、Ｋ５６２標的細胞に対する増強された細胞傷害性（およそ８０％〜９０％の死滅）を示したことを実証している。従って、これらの分子を含む除核赤血球系細胞は、細胞１つ当たり基準でのＮＫ細胞の細胞傷害性を増強した、即ち、ＮＫ細胞がより増大されただけでなく、得られた個々のＮＫ細胞集団はより活性（例えば、より細胞傷害性）であった。

図２８Ｂに示されるように、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独を含むまたはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方もしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方を含む除核赤血球系細胞で一晩プライミングしたＮＫ細胞は、ＩＬ−１２単独、４−１ＢＢＬ単独またはタンパク質なし（対照）を含む除核赤血球系細胞で一晩プライミングしたＮＫ細胞と比較して、Ｒａｊｉ細胞に対する増加した細胞傷害性を実証した。細胞傷害性は、５：１のＥ：Ｔ比において最も顕著であり、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの組合せを含む除核赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬ単独またはＩＬ−１２単独のいずれかを含む細胞と比較して、増強された細胞傷害性を示さなかった。従って、ＡＤＣＣの増強は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡによって駆動されるようである。従って、これらの結果は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方もしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方を含む除核赤血球系細胞が、Ｒａｊｉ細胞標的の細胞１つ当たり基準での、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を増強したことを実証している。

（実施例３２）
抗ＣＤ３抗体刺激ありまたはなしの、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、４−１ＢＢＬまたはそれらの組合せを含む操作されたヒト赤血球系細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫならびにＮＫＴ細胞のＩＦＮｇ応答ならびに増殖を誘導する。
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の増殖および活性化に対する、ＩＬ−１２単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（Ｖ４．１）単独、４−１ＢＢＬ単独、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ（Ｖ４．１）の両方、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方もしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方を含むヒト除核赤血球系細胞の影響を、抗ＣＤ３抗体刺激ありまたはなしで評価した。簡潔に述べると、３人のドナー由来の１００，０００個のＰＢＭＣを、ＣＴＦＲで標識し、ＩＬ−１２単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、４−１ＢＢＬ単独、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの組合せ、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの組合せもしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの組合せを含むいずれかの除核赤血球系細胞と共にインキュベートした；あるいは対照として、ＰＢＭＣを、外因性タンパク質を欠如する除核赤血球系細胞（ＵＮＴ）と共にインキュベートし、または培地と接触させた（培地）。４００，０００個、２００，０００個または１００，０００個のいずれかの除核赤血球系細胞を使用した。５日目または８日目に、活発に分裂しているＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のパーセンテージを、ＣＴＦＲ希釈を使用して評価した。上清を収集し、ＩＦＮγの量を、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。実験を、５日目のアッセイとしては抗ＣＤ３処置と組み合わせた０．５ｕｇ／ｍＬで、または８日目のアッセイとしては抗ＣＤ３抗体処置なしで実施した。

図２９Ａに示されるように、抗ＣＤ３抗体刺激と組み合わせた、ＩＬ−１２を含む除核赤血球系細胞による処置は、ＰＢＭＣによる有意な量のＩＦＮｇ産生を誘導したが、抗ＣＤ３抗体刺激と組み合わせた、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方を含む除核赤血球系細胞による処置は、ＰＢＭＣによる最も高いレベルのＩＦＮｇ産生を誘導した。抗ＣＤ３抗体刺激の非存在下では、ＩＬ−１２を含む除核赤血球系細胞のみが、ＰＢＭＣによるＩＦＮｇ産生を誘導した（図２９Ｂを参照のこと）。さらに、抗ＣＤ３抗体で刺激したＰＢＭＣでは、４１ＢＢＬ単独、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方のいずれかを含む除核赤血球系細胞による処置は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（図２９Ｃを参照のこと）。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は、４−１ＢＢＬによって駆動されるようである。

図２９Ｄは、抗ＣＤ３抗体と、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬのいずれかを含む除核赤血球系細胞との組合せで処置したＰＢＭＣが、中程度に増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞増殖（細胞計数におけるおよそ５倍の増加）を示したことを示している。このＣＤ８＋Ｔ細胞の倍の変化は、他の除核赤血球系細胞で処置したＰＢＭＣよりも、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む除核赤血球系細胞で処置したＰＢＭＣにおいてより可変性であった。さらに、抗ＣＤ３抗体と、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬのいずれかを含む除核赤血球系細胞との組合せで処置したＰＢＭＣは、有意なＮＫＴ細胞増殖を示したが、これも４−１ＢＢＬによって駆動される可能性が高い（図２９Ｅを参照のこと）。ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含む除核赤血球系細胞によるＰＢＭＣの処置は、中程度のＮＫＴ細胞増殖を誘導したが、これは、ＩＬ−１２単独を含む除核赤血球系細胞でＰＢＭＣを処置した場合に観察されたＮＫＴ細胞増殖を上回らなかった。

図２９Ｆに示されるように、抗ＣＤ３抗体で刺激しなかったＰＢＭＣでは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方を含む除核赤血球系細胞のみが、限定的なＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘導した。さらに、図２９Ｇに示されるように、これもまた抗ＣＤ３抗体で刺激しなかったＰＢＭＣでは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む除核赤血球系細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を中程度に増強した（およそ１０〜２０％の分裂）。ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方を含む除核赤血球系細胞によるＰＢＭＣの処置は、ＮＫ細胞の分裂を増強したが（およそ５０〜６０％）、細胞計数は増加させず、これは、ＮＫ細胞の適度な増殖のみを示している（図２９Ｈを参照のこと）。しかし、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬのいずれかを含む除核赤血球系細胞によるＰＢＭＣの処置は、大規模なＮＫ細胞増殖を誘導した。最後に、抗ＣＤ３抗体で刺激しなかったＰＢＭＣでは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬを含む除核赤血球系細胞は、ＮＫＴ細胞に対する中程度の増殖効果を誘導した。

併せて考えると、この実施例で示された結果は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬのいずれかを含む除核赤血球系細胞が、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の強力な活性化を誘導したことを実証した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞の活性化は、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体で刺激した場合には、さらに増強された。

さらなる実験において、ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズを使用する陰性選択を使用して、ＰＢＭＣから単離した。精製されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１２単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、４−１ＢＢＬ単独、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方もしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方のいずれかを含む除核赤血球系細胞と共にインキュベートした；あるいは、対照として、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、（ＵＮＴ）と接触させ、または培地と接触させた（培地）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でも刺激し、接触を、１：５の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞：操作された赤血球系細胞）で５日間実施した。培地上清中のＩＦＮｇレベルを、ＥＬＩＳＡを使用して解析した。図２９Ｊ中に３人の異なるＰＢＭＣドナーからの平均として示されるデータは、ＩＬ−１２単独、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ単独、４−１ＢＢＬ単独、またはＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡの両方、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬの両方もしくはＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡおよび４−１ＢＢＬの両方を含む除核赤血球系細胞が、ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１分化を誘導できたことを実証している。

Claims

免疫キラー細胞を刺激するように操作された除核細胞であって、少なくとも第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび第２の外因性刺激性ポリペプチドを含み、前記外因性刺激性ポリペプチドが、前記免疫キラー細胞を刺激するのに十分である、除核細胞。
前記免疫キラー細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１に記載の除核細胞。
前記免疫キラー細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１に記載の除核細胞。
少なくとも第１の外因性刺激性ポリペプチド、第２の外因性刺激性ポリペプチドおよび第３の外因性刺激性ポリペプチドを含む、請求項１に記載の除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、４−１ＢＢＬ、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、ＩＬ−１２を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、４−１ＢＢＬを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記ＭＩＣタンパク質が、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）およびＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）からなる群から選択される、請求項５に記載の除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含み、前記第２の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、４−１ＢＢＬ、ＩＦＮα、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＰＶＲおよびＣＤ４８からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含み、前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが４−１ＢＢＬを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡを含み、前記第２の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１２を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１２を含み、前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１、ＩＬ−１２および４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ならびに４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物からなる群から選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１２を含み、前記第２の外因性ポリペプチドがＩＬ−１８を含み、前記第３の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を含む、請求項４に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１２を含み、前記第２の外因性ポリペプチドがＩＬ−１８を含み、前記第３の外因性刺激性ポリペプチドがＩＬ−１５を含む、請求項４に記載の除核細胞。
少なくとも１つの外因性ポリペプチドが、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが、前記第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、前記第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドと前記第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比が、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１および前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが融合ポリペプチドとして存在する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記第１、前記第２および前記第３の外因性刺激性ポリペプチドが融合ポリペプチドとして存在する、請求項４に記載の除核細胞。
少なくとも１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドが操作された除核細胞の表面に存在する、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の除核細胞。
少なくとも１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドが、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記膜貫通ドメインが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその膜貫通部分を含む、請求項２５に記載の除核細胞。
前記膜貫通ドメインが、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含む、請求項２５に記載の除核細胞。
ＮＫ細胞を活性化することができる、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の除核細胞。
ＮＫ細胞を増大させることができる、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記ＮＫ細胞が、メモリー様ＮＫ細胞である、請求項２８または２９に記載の除核細胞。
ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することができる、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の除核細胞。
ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させることができる、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、メモリーＴ細胞である、請求項３１または３２に記載の除核細胞。
赤血球系細胞である、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の除核細胞。
前記赤血球系細胞が網状赤血球である、請求項３４に記載の除核細胞。
前記赤血球系細胞が赤血球である、請求項３４に記載の除核細胞。
第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核細胞であって、前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドまたはその断片とインターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５ＲＡ）ポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、操作された除核細胞。
前記ＩＬ−１５ポリペプチドと前記ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分が複合体として存在する、請求項３７に記載の操作された除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが融合ポリペプチドを含む、請求項３７または３８に記載の操作された除核細胞。
前記ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片が、前記ＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とリンカーによって連結している、請求項３７から３９までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む、請求項４０に記載の操作された除核細胞。
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む、請求項４０または４１に記載の操作された除核細胞。
前記融合ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３９から４２までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記融合ポリペプチドが、配列番号２９または配列番号３７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３９から４２までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインとを含む、請求項３７に記載の操作された除核細胞。
前記ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片と前記ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインが複合体として存在する、請求項４５に記載の操作された除核細胞。
前記ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片と前記ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインが融合ポリペプチドとして存在する、請求項４５または４６に記載の操作された除核細胞。
前記ＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片が、前記ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合性ドメインとリンカーによって連結している、請求項４５から４７までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む、請求項４８に記載の操作された除核細胞。
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカー（配列番号１２）を含む、請求項４８または４９に記載の操作された除核細胞。
前記融合ポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の操作された除核細胞。
前記融合ポリペプチドが、配列番号３１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の操作された除核細胞。
第２の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む、請求項３７に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、４−１ＢＢＬを含む、請求項５３に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、配列番号４１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、配列番号４３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２を含む、請求項５３に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットを含む融合ポリペプチドを含む、請求項５７に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、配列番号３７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７または５８に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、配列番号５５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５７または５８に記載の操作された除核細胞。
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される１つまたは複数の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む、請求項３７から６０までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記ＭＩＣタンパク質が、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）である、請求項６１に記載の操作された除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数が、前記操作された除核細胞の表面に存在する、請求項３７から６２までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドが、免疫キラー細胞を刺激するのに十分である、請求項３７から６３までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する、請求項３７から６４までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが、前記第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する、請求項５３から６０までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、前記第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する、請求項５３から６０までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドと前記第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比が、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである、請求項５３から６０までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
第２の外因性ポリペプチドおよび第３の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む、請求項３７に記載の操作された除核細胞。
２つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、前記２つの外因性刺激性ポリペプチドが融合ポリペプチドとして存在する、請求項５３から６９までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
３つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、前記３つの外因性刺激性ポリペプチドが融合ポリペプチドとして存在する、請求項５３から６９までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数が、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項３７から７１までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記膜貫通ドメインが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその膜貫通部分を含む、請求項７２に記載の操作された除核細胞。
前記膜貫通ドメインが、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含む、請求項７２に記載の除核細胞。
免疫細胞を刺激することができる、請求項３７から７４までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記免疫細胞が、キラー免疫細胞である、請求項７５に記載の操作された除核細胞。
前記キラー免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項７６に記載の操作された除核細胞。
前記ＮＫ細胞が、メモリー様ＮＫ細胞である、請求項７７に記載の操作された除核細胞。
前記キラー免疫細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項７６に記載の操作された除核細胞。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、メモリーＴ細胞である、請求項７９に記載の操作された除核細胞。
前記免疫細胞を刺激することが、前記免疫細胞を活性化することを含む、請求項７５に記載の操作された除核細胞。
前記免疫細胞を刺激することが、前記免疫細胞を増大させることを含む、請求項７５に記載の操作された除核細胞。
赤血球系細胞である、請求項３７から８２までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記赤血球系細胞が網状赤血球である、請求項８３に記載の操作された除核細胞。
前記赤血球系細胞が赤血球である、請求項８３に記載の操作された除核細胞。
少なくとも、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核細胞。
第２の外因性ポリペプチドをさらに含む、請求項８６に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、４−１ＢＢＬ、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）、ＣＤ４８、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｇ、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＣｐＧ、ＩｇＧ、ＵＬ１６結合性タンパク質（ＵＬＢＰ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連ポリペプチド（ＭＩＣ）、Ｂ７−Ｈ６、ＮｋＰ４４Ｌ、Ｎｅｃｔｉｎ２、ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）、活性化誘導性Ｃ型レクチン（ＡＩＣＬ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項８７に記載の操作された除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数が操作された除核細胞の表面に存在する、請求項８６から８８までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドが、免疫キラー細胞を刺激するのに十分である、請求項８６から８９までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドが、１０^４、１０^５、または１０^６よりも多いコピー数で存在する、請求項８６に記載の操作された除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが、前記第２の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する、請求項８７または８８に記載の操作された除核細胞。
前記第２の外因性刺激性ポリペプチドが、前記第１の外因性刺激性ポリペプチドのコピー数よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％以下よりも多い、または２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍以下よりも多いコピー数で存在する、請求項８７または８８に記載の操作された除核細胞。
前記第１の外因性刺激性ポリペプチドと前記第２の外因性刺激性ポリペプチドの存在量の比が、重量でまたはコピー数で、約１：１、約２：１から１：２まで、約５：１から１：５まで、約１０：１から１：１０まで、約２０：１から１：２０まで、約５０：１から１：５０まで、または約１００：１から１：１００までである、請求項８７または８８に記載の操作された除核細胞。
第３の外因性刺激性ポリペプチドをさらに含む、請求項８７に記載の操作された除核細胞。
２つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、前記２つの外因性刺激性ポリペプチドが融合ポリペプチドとして存在する、請求項８７から９４までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
３つの外因性刺激性ポリペプチドを含み、前記３つの外因性刺激性ポリペプチドが融合ポリペプチドとして存在する、請求項８７から９５までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記外因性刺激性ポリペプチドの１つまたは複数が、膜貫通ドメインを含む、請求項８６から９７までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記膜貫通ドメインが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）またはその膜貫通部分を含む、請求項９８に記載の操作された除核細胞。
前記膜貫通ドメインが、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはその膜貫通部分を含む、請求項９８に記載の操作された除核細胞。
免疫細胞を刺激することができる、請求項８６から１００までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞。
前記免疫細胞が、キラー免疫細胞である、請求項１０１に記載の操作された除核細胞。
前記キラー免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１０２に記載の操作された除核細胞。
前記ＮＫ細胞が、メモリー様ＮＫ細胞である、請求項１０３に記載の操作された除核細胞。
前記キラー免疫細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１０２に記載の操作された除核細胞。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、メモリーＴ細胞である、請求項１０５に記載の操作された除核細胞。
前記免疫細胞を刺激することが、前記免疫細胞を活性化することを含む、請求項１０１に記載の操作された除核細胞。
前記免疫細胞を刺激することが、前記免疫細胞を増大させることを含む、請求項１０１に記載の操作された除核細胞。
免疫キラー細胞を刺激する方法であって、前記免疫キラー細胞を、請求項１から１０８までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞と、前記免疫キラー細胞を刺激するのに有効な量で接触させることを含む方法。
前記免疫キラー細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１０９に記載の方法。
前記免疫キラー細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１０９に記載の方法。
前記刺激することが、前記ＮＫ細胞を活性化させることを含む、請求項１１０に記載の方法。
前記刺激することが、前記ＮＫ細胞を増大させることを含む、請求項１１０に記載の方法。
前記刺激することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項１１１に記載の方法。
前記刺激することが、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を増大させることを含む、請求項１１１に記載の方法。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、メモリーＴ細胞である、請求項１１１に記載の方法。
前記接触させることを、ｉｎｖｉｖｏで行う、請求項１０９から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
前記接触させることを、ｅｘｖｉｖｏで行う、請求項１０９から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
前記接触させることを、ｉｎｖｉｔｒｏで行う、請求項１０９から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
前記操作された除核細胞を、免疫キラー細胞の活性化を必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
前記対象が、がんを有する、請求項１２０に記載の方法。
前記がんが、低ＭＨＣクラスＩ提示を特徴とする、請求項１２１に記載の方法。
前記がんが、ＰＤ−１応答性腫瘍を含む、請求項１２１に記載の方法。
前記がんが、突然変異負荷が高い腫瘍を含む、請求項１２１に記載の方法。
前記対象が、ＭＨＣクラスＩ提示を低減する化学療法剤を用いた処置を受けている、請求項１２２に記載の方法。
前記がんが、肺がん、肝細胞がん、黒色腫、およびリンパ腫から選択される、請求項１２１に記載の方法。
前記がんがリンパ腫を含み、前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を含む、請求項１２１に記載の方法。
前記対象が、感染症を有する、請求項１２０に記載の方法。
前記感染症が、ウイルス感染によって引き起こされる、請求項１２８に記載の方法。
前記ウイルス感染が、低ＭＨＣクラスＩ提示を特徴とする、請求項１２９に記載の方法。
前記ウイルス感染が、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、結核、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、およびサイトメガロウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１２９に記載の方法。
対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に請求項１から１０８までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞を前記対象におけるがんを処置するのに有効な量で投与することを含む方法。
前記がんが、低ＭＨＣクラスＩ提示を含む、請求項１３２に記載の方法。
前記がんが、ＰＤ−１応答性腫瘍を含む、請求項１３２に記載の方法。
前記がんが、突然変異負荷が高い腫瘍を含む、請求項１３２に記載の方法。
前記がんが、肺がん、肝細胞がん、黒色腫、およびリンパ腫から選択される、請求項１３２に記載の方法。
前記がんがリンパ腫を含み、前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項１３２に記載の方法。
対象における感染症を処置する方法であって、前記対象に請求項１から１０８までのいずれか一項に記載の操作された除核細胞を前記対象における感染症を処置するのに有効な量で投与することを含む方法。
前記感染症が、ウイルス感染によって引き起こされる、請求項１３８に記載の方法。
前記ウイルス感染が、ＭＨＣＩ提示の下方制御を特徴とする、請求項１３９に記載の方法。
前記ウイルス感染が、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、結核、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルスおよびサイトメガロウイルスから選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１３９に記載の方法。
キラー細胞である免疫細胞を刺激するように操作された除核赤血球系細胞であって、２つまたはそれよりも多くの外因性刺激性ポリペプチドを前記操作された除核赤血球系細胞の表面に含み、前記２つまたはそれよりも多くの外因性刺激性ポリペプチドが、前記免疫細胞を刺激するのに十分である、除核赤血球系細胞であり、
それぞれが前記外因性刺激性ポリペプチドの１つをコードする２つまたはそれよりも多くの外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、
前記有核赤血球系細胞を、前記有核赤血球系細胞の除核および前記２つまたはそれよりも多くの外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップと
を含むプロセスによって作製される、除核赤血球系細胞。
第１の外因性刺激性ポリペプチドを含む操作された除核赤血球系細胞であって、前記第１の外因性刺激性ポリペプチドが、リンカーによって連結してＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を形成したＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む、操作された除核赤血球系細胞であり、
前記ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物をコードする外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、
前記有核赤血球系細胞を前記有核赤血球系細胞の除核および前記ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物の産生に適した条件下で培養するステップと
を含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞。
ｉ．リンカーによって連結してＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を形成したＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと、
ｉｉ．４−１ＢＢＬまたはその断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドと
を含む操作された除核赤血球系細胞であって、
ｉ．前記第１の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第１の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、
ｉｉ．前記第２の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸を前記有核赤血球系細胞に導入するステップと、
ｉｉｉ．前記有核赤血球系細胞を前記有核赤血球系細胞の除核ならびに前記第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび前記第２の外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップと
を含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞。
ｉ．リンカーによって連結してＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物を形成したＩＬ−１５ポリペプチドまたはその断片とＩＬ−１５ＲＡポリペプチドの細胞外部分またはその断片とを含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと、
ｉｉ．ＩＬ−１２またはその断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドと
を含む操作された除核赤血球系細胞であって、
ｉ．前記第１の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第１の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、
ｉｉ．前記第２の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸を前記有核赤血球系細胞に導入するステップと、
ｉｉｉ．前記有核赤血球系細胞を前記有核赤血球系細胞の除核ならびに前記第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび前記第２の外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップと
を含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞。
ｉ．４−１ＢＢＬまたはその断片を含む第１の外因性刺激性ポリペプチドと、
ｉｉ．ＩＬ−１２またはその断片を含む第２の外因性刺激性ポリペプチドと
を含む操作された除核赤血球系細胞であって、
ｉ．前記第１の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第１の外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、
ｉｉ．前記第２の外因性刺激性ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸を前記有核赤血球系細胞に導入するステップと、
ｉｉｉ．前記有核赤血球系細胞を前記有核赤血球系細胞の除核ならびに前記第１の外因性刺激性ポリペプチドおよび前記第２の外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップと
を含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞。
前記導入するステップが、前記有核細胞に前記第１の外因性核酸と前記第２の外因性核酸の両方を含む単一のレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることを含む、請求項１４３から１４６までのいずれか一項に記載の操作された除核赤血球系細胞。
前記導入するステップが、前記有核赤血球系細胞に前記第１の外因性核酸を含む第１のレンチウイルスベクターと前記第２の外因性核酸を含む第２のレンチウイルスベクターの両方をトランスフェクトすることを含む、請求項１４３から１４６までに記載の操作された除核赤血球系細胞。
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ融合物、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドを操作された除核赤血球系細胞の表面に含み、
前記少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドをコードする外因性核酸を有核赤血球系細胞に導入するステップと、
前記有核赤血球系細胞を前記有核赤血球系細胞の除核および前記少なくとも１つの外因性刺激性ポリペプチドの産生に適した条件下で培養するステップと
を含むプロセスによって作製される、操作された除核赤血球系細胞。
前記外因性核酸がＤＮＡを含む、請求項１４２から１４９までのいずれか一項に記載の方法。
前記外因性核酸がＲＮＡを含む、請求項１４２から１４９までのいずれか一項に記載の方法。
前記導入するステップが、ウイルスによる形質導入を含む、請求項１４２から１４９までのいずれか一項に記載の方法。
前記導入するステップが、電気穿孔を含む、請求項１４２から１４９までのいずれか一項に記載の方法。
前記導入するステップが、リポソーム媒介性移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクション、およびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む、請求項１４２から１４９までのいずれか一項に記載の方法。
前記導入するステップが、前記外因性核酸をレンチウイルスベクターのトランスフェクションによって導入することを含む、請求項１４２から１４９までのいずれか一項に記載の方法。
前記レンチウイルスベクターが、ベータ−グロビンプロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）プロモーター、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター、ＣＡＧＣＭＶ最初期エンハンサーおよびニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）、およびヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１５４または１５５に記載の方法。