KR20160145802A - 요법에 사용하기 위한 키메라 항원 수용체 (car) 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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KR20160145802A
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car
cell
antigen
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로렌스 제이.엔. 쿠퍼
힐러리 기번스 카루소
사이먼 올리바레스
소니 앙
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보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

항원의 상승된 수준을 발현시키는 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CAR-발현 T 세포가 제공된다. 마찬가지로, 항원(예를 들면, 암세포)의 상승된 수준을 발현시키는 세포를 CAR T-세포 요법으로 특이적으로 표적화하는 방법이 제공된다.

Description

요법에 사용하기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 이의 제조 방법{CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CAR) FOR USE IN THERAPY AND METHODS FOR MAKING THE SAME}
본원은 미국 가출원 제61/983,103호(2014년 4월 23일에 출원) 및 미국 가출원 제61/983,298호(2014년 4월 23일에 출원)의 우선권 이점을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다.
서열 목록의 도입
11 KB (Microsoft Windows®로 측정됨)이고, 2015년 4월 23일에 작성된 "UTFC.P1238WOST25.txt" 명칭의 파일에 함유된 서열 목록은 전자 신청에 의해 본 명세서에 제출되었고, 본원에 참조로 인용된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 의학, 면역학, 세포 생물학 및 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 특정 국면에서, 본 발명의 분야는 면역요법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 구현예는 표적 항원의 발현이 상승된 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 CAR-발현 T 세포의 생산에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
임상 등급 T 세포의 효능은 우수한 (i) 종양 관련 항원(TAA)의 인식, (ii) 주입 후 지속성, (iii) 종양 부위로 이동할 가능성, 및 (iv) 종양 미세 환경 내에서 이펙터 기능을 재활용하는 능력에 대한 잠재력을 갖는 생물학적 샘플을 유전자 조작하기 위해 유전자 요법을 면역요법과 조합함으로써 개선될 수 있다. 이러한 유전자 요법과 면역요법의 조합은 이러한 종양 특이적 T 세포의 주입으로부터 고도의 B-세포 악성종양 이점을 갖는 환자 및 B-혈통 항원에 대한 T 세포의 특이성을 재지시할 수 있다(참조: Jena 등, 2010; Till 등, 2008; Porter 등, 2011; Brentjens 등, 2011; Cooper 등, 2012; Kalos 등, 2011; Kochenderfer 등, 2010; Kochenderfer 등, 2012; Brentjens 등, 2013). 인간에의 적용을 위해 유전자 조작된 T 세포의 유전자 조작에의 대부분의 접근법은 키메라 항원 수용체(CAR)의 안정한 발현을 위해 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 사용했다(참조: Jena 등, 2010; Ertl 등, 2011; Kohn 등, 2011). 이 접근법은, 현재의 적정 제조 기준(cGMP)에 준거하고 있지만, 생산 설비의 제한된 수로부터 임상 등급 재조합 바이러스의 제조 및 방출에 의존하고 있기 때문에 고가일 수 있다.
CAR T-세포 기반 치료의 하나의 단점은, 표적 항원이 또한 정상적인 비병변 조직에서 발현될 때오프-타겟 효과의 가능성이다. 따라서, 정상 조직에 대한 부작용을 감소시키면서 질환 세포의 특이적 표적화를 제공하는 새로운 CAR T-세포 요법이 필요하다.
발명의 요약
본원에 기재된 특정 구현예는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포가 항원을 과발현시키는 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다는 발견에 기초하고 있다. 따라서, 일부 국면에서, CAR T 세포의 세포독성 활성은 저수준의 항원 발현을 갖는 세포에 대한 세포독성 효과를 최소화하면서 고수준의 항원 발현을 갖는 의도된 표적 세포(예: 암 세포)에만 집중될 수 있다. 특히, 중간 수준의 표적 친화성을 갖는 CAR을 사용함으로써, 항원 발현 수준이 높은 세포에 선택적으로 세포독성인 CAR T 세포가 생성될 수 있었다는 것이 밝혀졌다. 임의의 특정 메커니즘에 결부되지 않고, 관찰된 효과는 세포 표적화를 촉진하기 위한 CAR T 세포에 의한 다가 항원 결합에 기인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CAR의 발현 수준은 세포의 오프-타겟 세포독성을 감소시키도록 선택된 CAR T 세포에서 조정될 수 있다.
따라서, 제1 구현예에서, 항원에서 표적화된 발현 CAR을 포함하는 유전자도입 세포(예: 단리된 유전자도입 세포)가 제공되고, 상기 CAR은 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는다. 추가의 구현예에서, 항원에서 표적화된 발현 CAR을 포함하는 유전자도입 T 세포가 제공되고, 상기 T 세포는 단지 T 세포에 의한 항원의 다가 결합시 상당한 세포독성 활성을 나타낸다. 한 국면에서, 구현예의 단리된 세포는 T 세포 또는 T-세포 전구세포이다. 또 다른 국면에서, 세포는 인간 세포와 같은 포유동물 세포이다.
추가의 구현예에서, (a) 항원에 결합하는 발현 CAR을 포함하는 CAR T 세포를 선택하는 단계를 포함하여, 대상체에서 항원을 발현시키는 세포를 선택적으로 표적화하는 방법으로서, 상기 CAR T 세포가 다음을 갖는, 방법이 제공된다: (i) 단지 T 세포에 의한 항원의 다가 결합시 세포독성 활성; 및/또는 (ii) 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는 CAR; 및 (b) 항원의 상승된 발현을 갖는 세포를 선택적으로 표적화하는 T-세포 반응을 제공하기 위해 대상체에 선택된 CAR T 세포의 유효량을 투여하는 단계. 따라서, 특정 국면에서, 구현예의 방법은 질환 세포 상의 상승된 수준의 항원 발현과 관련된 질환의 치료 방법으로서 추가로 정의된다. 예를 들면, 구현예의 방법은 암 또는 자가면역 질환과 같은 과증식성 질환 치료용 또는 바이러스, 세균 또는 기생충 감염과 같은 감염 치료용으로 사용될 수 있다.
여전히 추가의 구현예에서, (a) 항원에 결합하는 발현된 CAR을 포함하는 CAR T 세포를 선택하는 단계로서, 상기 CAR T 세포가 (i) 단지 T 세포에 의한 항원의 다가 결합시 세포독성 활성; 및/또는 (ii) 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는 CAR을 포함하는, 단계; 및 (b) 혼합된 세포 집단을 접촉시키는 단계로서, 상기 집단이 항원의 상승된 발현을 갖는 세포를 선택적으로 표적화하기 위해 선택된 CAR T 세포와 함께 상이한 수준의 항원을 발현시키는 세포를 포함하는, 단계를 포함하는, 혼합된 세포 집단에서 항원을 발현시키는 세포를 선택적으로 표적화하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 특정 국면에서, 혼합된 세포 집단은 항원 및 항원의 상승된 발현을 갖는 암 세포를 발현시키는 비암 세포를 포함한다. 일부 국면에서, 항원의 상승된 수준은 다음과 같은 발현 수준을 의미할 수 있다: 적어도 약 CAR T 세포에 의해 표적화된 세포에서 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000배 더 높다.
추가의 구현예에서, (a) 항원에 결합하는 CAR을 발현시키는 복수의 CAR T 세포를 수득하는 단계로서, 상기 복수의 세포가 (i) 항원에 대해 상이한 친화성을 갖는 (또는 항원에 대해 상이한 온/오프 비율을 갖는) CAR 및/또는 (ii) 세포에서 상이한 수준으로 발현되는(즉, 세포 표면에 상이한 수준으로 존재하는) CAR을 포함하는, 단계; (b) 항원을 발현시키는 대조군 세포 및 항원의 상승된 수준을 발현시키는 표적 세포에 대한 세포의 세포독성 활성을 평가하는 단계; 및 (c) 표적 세포에 대해 선택적으로 세포독성인 CAR T 세포를 선택하는 단계를 포함하는, CAR T 세포를 선택하는 방법이 제공된다. 추가의 국면에서, 구현예의 방법은 선택된 CAR T 세포 또는 선택된 T 세포의 집단을 확장시키고/시키거나 뱅킹하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 구현예의 방법은 상기 구현예의 선택된 CAR T 세포의 유효량으로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 특정 국면예서, 복수의 CAR T 세포를 수득하는 단계는 항원에 결합하는 CAR을 발현시키는 CAR T 세포의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, CAR T 세포의 라이브러리는 CAR에서 랜덤 또는 유전자조작 점 돌연변이를 포함할 수 있다(예를 들면, 이에 의해, CAR에 대한 친화성 또는 온/오프 비율을 조절한다). 추가의 국면에서, CAR T 세포의 라이브러리는 CAR의 발현의 다양한 수준을 제공하는 상이한 프로모터 요소의 조절하에 CAR을 발현시키는 세포를 포함한다.
또 다른 구현예에서, EGFR 항원에서 표적화된 발현된 CAR을 포함하는 유전자도입 세포(예, 단리된 유전자도입 세포)가 제공되고, 상기 CAR은 다음을 갖는다: 니모투주맙의 CDR 서열(참조: 예를 들면, 서열번호: 1 및 서열번호: 2) 또는 세툭시맙의 CDR 서열(참조: 예를 들면, 서열번호: 3 및 서열번호: 4). 일부 국면에서, 상기 구현예의 세포는 다음과 같은 CDR 또는 항원 결합 부분을 갖는 발현된 CAR 서열을 포함하는 인간 T 세포이다: 서열번호: 1 및 서열번호: 2. 추가의 국면에서, 상기 구현예의 세포는 다음과 같은 CDR 또는 항원 결합 부분을 갖는 발현된 CAR 서열을 포함하는 인간 T 세포이다: 서열번호: 3 및 서열번호: 4.
상기 구현예의 국면은 CAR에 의해 결합되는 항원에 관한 것이다. 일부 국면에서, 항원은 암 세포, 자가면역 세포 또는 바이러스, 세균 또는 기생충에 의해 감염된 세포에서 상승된 항원이다. 특정 국면에서, 항원은 CD19, CD20, ROR1, CD22, 암 배아 항원, 알파페토프로테인, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 전립선-특이적 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, HER2/Neu, 엽산 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII 또는 VEGFR2이다. 일부 특정 국면에서, 항원은 GP240, 5T4, HER1, CD-33, CD-38, VEGFR-1, VEGFR-2, CEA, FGFR3, IGFBP2, IGF-1R, BAFF-R, TACI, APRIL, Fn14, ERBB2 또는 ERBB3이다. 일부 추가의 국면에서, 항원은 성장 인자 수용체, 예를 들면, EGFR, ERBB2 또는 ERBB3이다.
구현예의 특정 국면은 항원에 결합하고 항원에 대해 약 2nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는 선택된 CAR (또는 CAR을 포함하는 선택된 세포)에 관한 것이다. 예를 들면, 일부 국면에서, CAR은 항원에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20nM 이상의 Kd를 갖는다. 또 다른 국면에서, CAR은 항원에 대해 약 5nM 내지 약 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50nM의 Kd를 갖는다. 또 다른 국면에서, CAR은 항원에 대해 약 5nM 내지 500nM, 5nM 내지 200nM, 5nM 내지 100nM 또는 5nM 내지 50nM의 Kd를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, "CAR의 Kd"에 대한 참조는 CAR을 형성하기 위해 사용된 모노클로날 항체에 대해 측정된 Kd를 의미할 수 있다.
일부 국면에서, 구현예의 선택된 CAR은 CAR 분자당 2, 3, 4개 이상의 항원 분자에 결합할 수 있다. 일부 국면에서, 선택된 CAR의 항원 결합 도메인의 각각은 항원에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20nM 이상의 Kd를 갖는다. 또 다른 국면에서, 선택된 CAR의 항원 결합 도메인의 각각은 항원에 대해 약 5nM 내지 약 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50nM의 Kd를 갖는다. 또 다른 국면에서, 선택된 CAR의 항원 결합 도메인의 각각은 항원에 대해 약 5nM 내지 500nM, 5nM 내지 200nM, 5nM 내지 100nM 또는 5nM 내지 50nM의 Kd를 갖는다.
구현예의 일부 국면에서, 구현예에 따라 사용하기 위한 선택된 CAR은 EGFR에 결합하는 CAR이다. 예를 들면, CAR은 니모투주맙의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 국면에서, 구현예의 CAR은 니모투주맙의 모두 6개의 CDR을 포함한다(다음과 같이 제공됨: 서열번호: 5-10). 일부 국면에서, CAR은 다음과 같은 항원 결합 부분을 포함한다: 서열번호: 1 및 서열번호: 2. 일부 국면에서, CAR은 다음과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다: 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2. 또 다른 국면에서, 구현예에 따라 사용하기 위한 CAR은 니모투주맙의 CDR 서열을 포함하지 않는다.
추가의 구현예에서, 선택된 CAR 및 적어도 제2 발현 도입유전자, 예를 들면, 발현된 멤브레인-결합 IL-15을 포함하는 단리된 세포가 제공된다. 예를 들면, 일부 국면에서, 멤브레인-결합 IL-15는 IL-15와 IL-15Rα 사이에 융합 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 제2 도입유전자는 RNA 또는 DNA (예: 여분의 염색체 또는 에피솜 벡터)에 의해 코딩된다. 특정 국면에서, 세포는 (예를 들면, 트랜스포손 반복 서열에 의해 인접되는 DNA를 코딩하는) 세포의 게놈에 통합된 멤브레인-결합 IL-15를 코딩하는 DNA를 포함한다. 특정 국면에서, 구현예의 세포 (예: 멤브레인-결합 사이토카인을 발현시키는 인간 CAR T 세포)는 질환을 갖는 대상체를 치료하거나 (또는 대상체에 면역 반응을 제공하기 위해) 사용될 수 있고, 여기서 질환 세포는 항원의 상승된 수준을 발현시킨다.
일부 국면에서, 구현예의 방법은 선택된 CAR 및, 일부 경우에, 트랜스포사제를 코딩하는 DNA (또는 RNA)로 T 세포를 형질감염시키는 단계에 관한 것이다. 세포를 형질감염시키는 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있지만, 특정 국면에서, 매우 효율적인 형질감염 방법, 예를 들면, 전기천공 또는 바이러스 형질도입이 사용된다. 예를 들면, 핵산은 뉴클레오펙션 장치를 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 형질감염 단계는 유전독성을 유발하고/하거나 치료된 대상체에서 바이러스 서열을 함유하는 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스로 세포를 감염시키거나 형질도입하는 단계를 포함하지 않다.
구현예의 특정 국면은 선택된 CAR을 코딩하는 발현 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계에 관한것이다. CAR의 발현 벡터의 광범위한 범위는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 본원에서 추가로 상세화된다. 예를 들면, 일부 국면예서, CAR 발현 벡터는 DNA 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 선형 발현 벡터 또는 에피솜이다. 특정 국면에서, 벡터는 프로모터, 인핸서, 폴리-A 신호 및/또는 하나 이상의 인트론과 같은 CAR의 발현을 촉진하는 서열과 같은 부가적 서열을 포함한다. 바람직한 국면에서, CAR 코딩 서열은 트랜스포사제의 존재가 코딩 서열을 형질감염 세포의 게놈으로 통합되는 것을 가능하게 하도록 트랜스포손 서열에 의해 인접된다.
상기 상세화된 바와 같이, 특정 국면에서, 세포는 형질감염 세포의 게놈으로 CAR 코딩 서열의 통합을 촉진하는 트랜스포사제로 추가로 형질감염된다. 일부 국면예서, 트랜스포사제는 DNA 발현 벡터로서 제공된다. 그러나, 바람직한 국면에서, 트랜스포사제는 트랜스포사제의 장기간 발현이 유전자도입 세포에서 발생하지 않도록 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공된다. 임의의 트랜스포사제 시스템이 구현예에 따라서 사용될 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 트랜스포사제는 연어과-유형 Tc1-형 트랜스포사제(SB)이다. 예를 들면, 트랜스포사제는 "슬리핑 뷰티(Sleeping beauty)" 트랜스포사제일 수 있고, 다음을 참조한다: 참조: 예를 들면, U.S. 특허 제6,489,458호, 본원에 참조로 인용된다.
또 다른 국면에서, 구현예의 선택된 CAR T 세포는 T 세포의 증식을 자극하는 멤브레인-결합 사이토카인의 발현을 위한 발현 벡터를 추가로 포함한다. 특히, 이러한 사이토카인을 포함하는 선택된 CAR T 세포는 사이토카인 발현에 의해 제공된 시뮬레이션 때문에 항원 제시 세포를 갖는 생체외 배양물을 거의 또는 전혀 갖지 않고 증식시킬 수 있다. 마찬가지로, 이러한 CAR T 세포는 심지어 CAR에 의해 인식된 다량의 항원이 존재하지 않을 때 (예를 들면, 진정 중인 암 환자 또는 최소 잔류 질환을 갖는 환자의 경우에서와 같이) 생체내 증식할 수 있다. 일부 국면에서, CAR T 세포는 사이토카인의 표면 발현을 제공하기 위해 Cγ 사이토카인 및 요소(예: 막관통 도메인)의 발현을 위한 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함한다. 예를 들면, CAR 세포는 IL-7, IL-15 또는 IL-21의 멤브레인 결합 버전을 포함할 수 있다. 일부 국면에서, 사이토카인은 사이토카인 코딩 서열과 사이토카인을 위한 수용체의 융합에 의해 멤브레인에 속박된다. 예를 들면, 세포는 IL-15-IL-15Rα 융합 단백질의 발현을 위한 벡터를 포함할 수 있다. 또 다른 국면에서, 멤브레인 결합 Cγ 사이토카인을 코딩하는 벡터는 CAR 세포 또는 염색체외 벡터(예: 및 에피솜 벡터)의 게놈에 통합된 벡터와 같은 DNA 발현 벡터이다. 또 다른 국면에서, 멤브레인-결합 Cγ 사이토카인은 CAR 세포 중의 사이토카인의 발현 (및 이에 의해 CAR 세포의 증식)이 프로모터 활성을 유도하거나 억제함으로써 조절될 수 있도록 유도성 프로모터(예: 약물 유도성 프로모터)의 조절하에 있다.
구현예의 국면은 선택된 CAR의 발현을 위한 T 세포 또는 T 세포 전구세포를 수득함에 관한 것이다. 일부 국면에서, 세포는 조직 은행과 같은 제3 자로부터 수득된다. 추가의 국면에서, T 세포 또는 T-세포 전구세포를 포함하는 환자의 세포 샘플이 사용된다. 예를 들면, 일부 경우에, 샘플은 제대혈 샘플, 말초혈 샘플(예: 단핵 세포 분획) 또는 다능성 세포를 포함하는 대상체의 샘플이다. 일부 국면에서, 대상체의 샘플은 유도 다능성 줄기(iPS) 세포를 생성하기 위해 배양할 수 있고, 이러한 세포는 T 세포를 생성하기 위해 사용된다. 세포 샘플은 대상체로부터 직접 배양될 수 있거나 사용 전에 동결보존될 수 있다. 일부 국면에서, 세포 샘플을 수득하는 단계는 세포 샘플을 수집하는 단계를 포함한다. 다른 국면에서, 샘플은 제3 자에 의해 수득된다. 또 다른 국면에서, 대상체의 샘플은 샘플 중의 T 세포 또는 T-세포 전구세포를 정제하거나 농축시키기 위해 처리될 수 있다. 예를 들면, 샘플은 구배 정제, 세포 배양 선택 및/또는 세포 분류(예: 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해)를 실시할 수 있다.
일부 국면에서, 구현예의 방법은 항원 제시 세포(APC)를 수득하고, 제조하거나 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들면, 일부 국면에서, 항원 제시 세포는 목적하는 항원을 발현시키거나 항원이 부하된 수지상 세포와 같은 수지상 세포를 포함한다. 추가의 국면에서, 항원 제시 세포는 목적하는 항원을 나타내는 인공 항원 제시 세포를 포함할 수있다. 예를 들면, 인공 항원 제시 세포는 불활성화된(예: 조사된) 인공 항원 제시 세포(aAPC)일 수 있다. 이러한 aAPC의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 본원에 추가로 상세화된다.
따라서, 일부 국면에서, 구현예의 유전자도입 CAR 세포는 CAR 세포 집단을 확대하기 위해 제한된 시간 동안 항원 제시 세포(예: 불활성화 aAPC)와 함께 생체외 공배양된다. CAR 세포를 항원 제시 세포와 함께 공배양하는 단계는, 예를 들면, 인터류킨-21 (IL-21) 및/또는 인터류킨-2 (IL-2)를 포함하는 배지에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 공배양은 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 또는 약 1:1 내지 약 1:3의 CAR 세포 대 APC의 비로 수행된다. 예를 들면, CAR 세포와 APC의 공배양은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비일 수 있다.
일부 구현예에서, 선택된 CAR 세포의 배양을 위한 APC는 CAR 세포의 성장을 향상시키기 위해 특정 폴리펩타이드를 발현시키도록 유전자조작된다. 예를 들면, APC는 (i) 유전자도입 CAR 세포 상에서 발현된 CAR에 의해 표적화된 항원; (ii) CD64; (ii) CD86; (iii) CD137L; 및/또는 (v) APC의 표면에서 발현된, 멤브레인 결합 IL-15를 포함할 수 있다. 일부 국면에서, APC는 APC의 표면에서 발현된 CAR-결합 항체 또는 이의 단편을 포함한다(참조: 예를 들면, 국제 PCT 특허 공보 WO/2014/190273, 본원에 참조로 인용됨). 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 APC는 감염성 물질에 대해 시험하고 감염성 물질을 함유하지 않음을 확인하고/하거나 시험하여 불활성이고 비증식성임을 확인한다.
APC 상의 확대는 배양물 중의 CAR 세포의 수 또는 농도를 증가시키지만, 이 진행은 노동 집약적이고 고가이다. 또한, 일부 국면에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 가능한 한 단시간에 유전자도입 CAR 세포를 재주입해야 한다. 따라서, 일부 국면에서, 선택된 CAR 세포의 생체외 배양은 14일 이하, 7일 이하 또는 3일 이하 동안이다. 예를 들면, 생체외 배양(예: APC의 존재하의 배양)은 유전자도입 CAR 세포의 하나의 집단 배가 미만 동안 수행될 수 있다. 또 다른 국면에서, 유전자도입 세포는 APC의 존재하에 생체외 배양되지 않는다.
또 다른 국면에서, 구현예의 방법은 세포를 집단에 투여하거나 접촉시키기 전(예를 들면, 세포의 형질감염 후 또는 세포의 생체외 확대 후)에 선택된 CAR-발현 T 세포를 위한 세포 집단을 농축시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 농축 단계는, 예를 들면, CAR 또는 CAR-결합 항체에 의해 결합된 항원을 사용하여 세포를 분류하는 단계(예를 들면, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해)를 포함할 수 있다. 또 다른 국면에서, 농축 단계는 비-T 세포의 고갈 또는 CAR 발현이 부족한 세포의 고갈을 포함한다. 예를 들면, CD56+ 세포는 배양 집단으로부터 고갈될 수 있다. 또 다른 국면에서, CAR 세포의 샘플은, 세포가 대상체에 투여될 때, 보존된다(또는 배양물에 유지된다). 예를 들면, 샘플은 이후 확대 또는 분석을 위해 냉동 보존될 수 있다.
특정 국면에서, 구현예의 유전자도입 CAR 세포는 내인성 T-세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위해 불활성화된다. 예를 들면, T 세포는 내인성 알파/베타 T-세포 수용체(TCR)의 발현을 제거하기 위해 유전자조작될수 있다. 특정 구현예에서, CAR+ T 세포는 TCR의 발현을 제거하기 위해 유전적으로 변형된다. 일부 국면에서, CAR-발현 T 세포에서 내인성 T-세포 수용체의 파괴가 존재한다. 예를 들면, 일부 경우에, 내인성 TCR(예: α/β 또는 γ/δ TCR)은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 결실되거나 불활성화된다. 특정 국면예서, CAR-발현 T 세포 중 T-세포 수용체 αβ-쇄는, 예를 들면, 아연 핑거 뉴클레아제를 사용함으로써 녹-아웃된다.
본원에서 추가로 상세화된 바와 같이, 구현예의 CAR 세포는 광범위한 범위의 질환 및 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본질적으로, 특정 항원의 향상된 발현을 포함하는 임의의 질환은 CAR 세포를 항원에서 표적화함으로써 치료될 수 있다. 예를 들면, 자가면역 질환, 감염증 및 암은 구현예의 방법 및/또는 조성물로 치료될 수 있다. 이들은 원발성, 전이성, 재발성, 치료 민감성, 치료 난치성 암(예: 화학난치성 암)과 같은 암을 포함한다. 암은 혈액암, 폐암, 뇌암, 결장암, 전립선암, 유방암, 간암, 신장암, 위암, 자궁경부암, 난소암, 고환암, 뇌하수체암, 식도암, 비장암, 피부암, 골암 등등일 수 있다(예: B-세포 림프종 또는 흑색종). 특정 국면에서, 구현예의 방법은 확산 고유 뇌교 신경교종과 같은 신경교종의 치료 방법으로서 추가로 정의된다. 암 치료의 경우에, CAR 세포는 전형적으로 암 세포 항원 (또한 종양 관련 항원(TAA)으로서 공지됨), 예를 들면, EGFR을 표적화한다.
구현예의 공정은 다음을 위한 CAR+ T 세포를 제조하기 위해(예를 들면, 임상 시험을 위해) 사용될 수 있다: 다양한 종양 항원(예: CD19, ROR1, CD56, EGFR, CD123, c-met, GD2). 이 기술을 사용하여 생성된 CAR+ T 세포는 백혈병(AML, ALL, CML), 감염증 및/또는 고형 종양을 갖는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 구현예의 방법은 세포 증식성 질환, 진균, 바이러스, 세균 또는 기생충 감염증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 표적화될 수 있는 병원체는, 제한 없이, 플라스모듐(Plasmodium), 트리파노솜, 아르페르길루스 ( Aspergillus ), 칸디다(Candida), HSV, RSV, EBV, CMV, JC 바이러스, BK 바이러스 또는 에볼라 병원체를 포함한다. 구현예의 CAR 세포에 의해 표적활될 수 있는 항원의 추가의 예는, 제한 없이, CD19, CD20, 암 배아 항원, 알파페토프로테인, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, HER2/Neu, ERBB2, 엽산 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23,CD30, CD56, c-Met, 메오텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 또는 VEGFR2를 포함한다. 특정 국면에서, 구현예의 방법은 CD19 또는 HERV-K-발현 세포의 표적화에 관한 것이다. 예를 들면, HERV-K 표적화 CAR 세포는 모노클로날 항체 6H5의 scFv 서열을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다. 또 다른 국면에서, 구현예의 CAR은 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 또는 이의 조합과 같은 사이토카인과 접합되거나 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 또는 T-세포 전구세포를 발현시키는 CAR의 집단으로부터 세포의 유효량을 제공하는 단계를 포함하는, 의학적 상태를 갖는 개체를 치료하는 방법이 제공된다(예: 표적 항원의 상승된 발현 수준을 갖는 세포를 선택적으로 사멸시키는 T-세포를 발현시키는 CAR) 대상체에게. 일부 국면에서, 세포는 개체에게 한번 이상 투여할 수 있다(예: 2, 3, 4, 5회 이상). 추가의 국면에서, 세포는 개체에게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 떨어져 투여된다. 특정 구현예에서, 게체는 암, 예를 들면, 림프종, 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 또는 B 세포 관련 자가면역 질환을 갖는다.
추가의 구현예에서, EGFR에서 표적화된 발현된 CAR을 포함하는 단리된 유전자도입 세포(예: T-세포 또는 T-세포 전구세포)가 제공된다. 예를 들면, CAR은 니모투주맙의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 국면에서, 구현예의 세포는 니모투주맙의 모두 6개의 CDR을 포함하는 CAR을 포함한다(다음으로 제공된다: 서열번호: 5-10). 일부 국면에서, CAR은 다음의 항원 결합 부분을 포함한다: 서열번호: 1 및 서열번호: 2. 추가의 국면에서, CAR은 다음과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다: 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 2. 또 다른 국면에서, 구현예의 세포는 니모투주맙의 CDR 서열을 포함하지 않는 CAR을 포함한다. 일부 국면에서, 구현예의 단리된 유전자도입 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 추가의 관련된 구현예에서, 유전자도입 인간 T-세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR 양성 암을 대상체의 치료 방법이 제공되고, 상기 T-세포는 EGFR에서 표적화된 발현 CAR을 포함하고 서열번호: 5-10의 CDR 서열을 포함한다.
추가의 구현예에서, 세툭시맙의 CDR 서열을 포함하는 발현 CAR을 포함하는 단리된 유전자도입 세포(예:T-세포 또는 T-세포 전구세포)가 제공된다. 예를 들면, 일부 국면에서, 구현예의 세포는 세툭시맙의 모두 6개의 CDR을 포함하는 CAR을 포함한다(다음으로 제공된다: 서열번호: 11-16). 일부 국면에서, CAR은 다음의 항원 결합 부분을 포함한다: 서열번호: 3 및 서열번호: 4. 추가의 국면에서, CAR은 다음과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다: 서열번호: 3 및/또는 서열번호: 4. 또 다른 국면에서, 구현예의 세포는 세툭시맙의 CDR 서열을 포함하지 않는 CAR을 포함한다. 일부 국면에서, 구현예의 단리된 유전자도입 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 추가의 관련된 구현예에서, EGFR에서 표적화된 발현 CAR을 포함하고 다음의 CDR 서열을 포함하는 유전자도입 인간 T-세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR을 갖는 대상체의 치료 방법이 제공된다: 서열번호: 11-16.
본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 특허청구범위에서 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 특허청구범위에서 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 단어 "a" 또는 "an"은 1개 또는 1개 이상을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 특허청구범위에서 "또 하나의" 또는 "추가의"는 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 특허청구범위에서, 용어 "약"은, 값이 장치, 값을 결정하기 위해 사용된 방법, 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변동을 위한 오차의 고유 변동을 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당해 기술 분야의 숙련가에게 자명해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시로써 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
도면의 간단한 설명
도 1a-b. 항-CD3와 함께 부하된 인공 항원 제시 세포를 사용한 인간 1차 T 세포의 수치 확대. (a) K562 클론 4의 표현형을 항-CD3(OKT3)을 발현시키기 위해 부하하고, 유동 세포 분석법에 의해 측정된 100그레이로 조사했다. (b) 저밀도의 OKT3-적재 aAPC (10개의 T 세포 대 1개의 aAPC) 또는 고밀도의 OKT3-부하 K562 (1개의 T 세포 대 2개의 aAPC)로 자극 후 CD3+ T 세포의 수치 확대. 추론된 세포수는 자극 주기 전 T 세포의 총 수에 자극 주기 후 배 확대를 곱하여 계산했다. 데이터는 평균 ± SD, n=6, **** p<0.0001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 2a-d. 저밀도 aAPC 상에서 확대된 T 세포는 높은 비율의 CD8+ T 세포를 함유한다. (a) 절밀도 aAPC (10개의 T 세포 대 1개의 aAPC)로 확대된 T 세포는 2개의 자극 주기 후 유동 세포 분석법에 의해 측정된 바와 같이 고밀도 aAPC (1개의 T 세포 대 2개의 aAPC)로 확대된 T 세포보다 상당히 많은 CD8+ T 세포와 상당히 적은 CD4+ T 세포를 함유한다. 데이터는 평균, n=6, *** p<0.001, **** p<0.0001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (b) 저밀도 aAPc 및 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포의 CD4/CD8 비의 차이는 저밀도 aAPC로 확대될 때 CD4+ T 세포의 감소된 배 확대에 기인한다. 데이터는 평균 ± SD, n=6, **** p<0.0001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (c) 저밀도 aAPc 및 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포의 CD4/CD8 비의 차이는 세포 생존율의 차이에 기인하지 않는다. 세포 생존율은 두 자극 주기 후 아넥신 V 및 PI 염색을 위해 유동 세포 분석법에 의해 결정되었고, 여기서 아넥신 Vneg PIneg 세포는 살아있는 세포로 간주된다. 데이터는 평균 ± SD, n=3으로 제시된다. (d) CD4+ T 세포는 자극이 고밀도 aAPC보다 저밀도 aAPC였을 때 증식이 덜하다. Ki-67은 두 자극 주기 후 세포상 증식의 마커로서 세포내 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 3개의 독립적인 공여체의 대표적인 히스토그램이 제시된다.
도 3. 저밀도 또는 고밀도 aAPC로 자극된 T 세포에서 시차 유전자 발현. 저밀도 또는 고밀도 aAPC로 자극된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 사이의 시차유전자 발현은 2개의 자극 주기 후 mRNA 종의 다중 디지털 프로파일에 의해 측정된다. 중요한 상향조절 또는 하향조절 전사물은 2/3 공여체 및 p<0.01에서 전사 수준의 1.5배 초과 차이로 결정되었다. 데이터는 배 차이, n=3의 열 지도로 제시된다.
도 4a-c. 저밀도 aAPC로 확대된 T 세포는 더욱 중앙-메모리 표현형 T 세포를 갖는다. (a) 저밀도 또는 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포의 메모리 마커 분석은 두 자극 주기 후 CCR7 및 CD45RA에 대한 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 게이트화 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 중 세포 집단은 다음과 같이 정의되었다: 이펙터 메모리 = CCR7negCD45RAneg, 중앙 메모리 = CCR7+CD45RAneg, 천연 = CCR7+CD45RA+, 이펙터 메모리 RA = CCR7negCD45RA+. 데이터는 평균 ± SD, n=3,* p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (b) 두 자극 주기 후 T 세포 중 그랜자임 및 퍼포민을 위한 세포내 염색은 CD4+ 및 CD8+ 게이트화 T 세포 집단에서 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, *p<0.05, *** p<0.001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (c) PMA/이오노마이신에 의한 자극 후 사이토카인 생산은 CD4+ 및 CD8+ 게이트화 T 세포 집단에서 유동 세포 분석법에 의한 두 자극 주기 후 T 세포에서 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, *p<0.05, *** p<0.001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 5. aAPC 상의 T 세포의 수치 확대 후 TCR Vα의 다양성. 저밀도 또는 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포 중 TCR Vα의 다양성은 mRNA 종의 디지털 다중화 프로파일링에 의해 측정되었고, 각 TCR Vα의 상대적 풍부함은 전체 TCR Vα 전사물의 비율로서 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD, n=3으로 제시된다.
도 6. aAPC 상의 T 세포의 수치 확대 후 TCR Vβ의 다양성. 저밀도 또는 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포 중 TCR Vβ의 다양성은 분류된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 mRNA 종의 디지털 다중화 프로파일링에 의해 측정되었고, 각 TCR Vα의 상대적 풍부함은 전체 TCR Vα 전사물의 비율로서 계산되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=3으로 제시된다.
도 7. aAPC 상의 수치 확대 후 CDR3 서열의 다양성. TCR Vβ 쇄의 CDR3 서열은 ImmunoSEQ 플랫폼 상에서 고-처리량 서열에 의해 결정되었다. 수치 확대 전 각각의 독특한 서열의 수는 저밀도(10개의 T 세포 대 1개의 aAPC) 또는 고밀도(1개의 T 세포 대 2개의 aAPC) aAPC로 수치 확대 후 동일 서열의 수에 대해 플롯팅했다. 데이터는 선형 회귀로 적합화하였고, 기울기를 측정하였다. 데이터는 두 개체 공여체를 대표한다.
도 8a-d. aAPC로 수치 확대된 T 세포로 RNA 전송의 최적화. (a) aAPC로 확대 후 각종 프로그램으로 전기천공된 T 세포에서 GFP RNA의 발현 및 생존율. GFP의 중앙 형광 강도는 유동 세포 분석법에 의해 결정하였다. 생존율은 PI 염색 및 유동 세포 분석법으로 결정하였다. 데이터는 두 개체 공여체를 대표한다. (b) 자극의 1, 2 또는 3주기 후 저밀도 aAPC(10개의 T 세포 대 1개의 aAPC)로 확대된 T 세포에서 GFP RNA의 발현 및 생존율. GFP를 발현시키는 T 세포의 비율은 유동 세포 계측볍으로 결정하였다. 생존율은 PI 염색 및 유동 세포 분석법으로 결정하였다. 데이터는 두 개체 공여체를 대표한다. (c) 각종 프로그램으로 전기천공 후 두 자극 주기 동안 10개의 T 세포 대 1개의 aAPC의 aAPC 밀도로 자극된 T 세포의 GFP RNA의 발현 및 생존율. GFP를 발현시키는 T 세포의 비율은 유동 세포 계측볍으로 결정하였다. 생존율은 PI 염색 및 유동 세포 분석법으로 결정하였다. 데이터는 두 개체 공여체를 대표한다. (d) 10개의 T 세포 대 1개의 aAPC의 밀도의 aAPC, RNA 없이 전기천공된 모형 및 RNA와 함께 전기천공된 모형으로 두 자극 주기 후 CD4+ 및 CD8+ 게이트화 T 세포에서 유동 세포 분석법에 의해 측정된 메모리 마커 CCR7 및 CD45RA의 발현. 데이터는 평균 ± SD, n=3으로 제시된다.
도 9a-b. DNA 및 RNA 변형에 의한 CAR의 개략도. (a) SB 트랜스포손/트랜스포사제를 사용한 전기천공에 의한 T 세포의 DNA 변형. 정상 공여체 PBMC는 T 세포의 분획에서 안정한 CAR 발현을 야기하기 위해 CAR을 함유하는 SB 트랜스포손 및 SB11 트랜스포사제로 전기천공한다. IL-21 (30 ng/mL) 및 IL-2 (50 U/mL)의 존재하에 aAPC를 발현시키는 γ-조사된 항원에 의한 자극은 경시적으로 CAR+ T 세포를 선별하여 5개 자극 사이클 후 >85% CAR+ T 세포를 야기하고, T 세포는 CAR-매개 기능에 대해 평가한다. (B) RNA 전기전달에 의한 T 세포의 변형. 정상 공여체 PBMC는 γ-조사된 항-CD3 (OKT3) 적재된 K562 클론 4 aAPC로 자극했다. 제2 자극 후 3 내지 5일에, T 세포는 RNA 전기전달 후 24시간에 >95% CAR+ T 세포를 야기하기 위해 RNA로 전기천공하고, T 세포는 CAR-매개 기능에 대해 평가했다.
도 10a-e. DNA 및 RNA로 변형된 세툭스-CAR+ T 세포의 표현형. (a) RNA-변형 및 DNA-변형 T 세포에서 CAR 발현의 중앙 형광 강도는 CD4+ 및 CD8+ 게이트화 T-세포 집단에서 CAR의 IgG 영역의 유동 세포 분석법에 의해 결정된다. 데이터는 평균 ± SD, n=8로서 나타낸다. (b) RNA-변형 및 DNA-변형 T 세포 중의 CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단의 비율은 CAR+ 게이트화 T 세포 중의 CD4 및 CD8에 대한 유동 세포 분석법에 의해 결정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=8로서 나타낸다. (c) 메모리 마커 CCR7 및 CD45RA의 발현은 CD4+ 및 CD8+ 게이트화 T-세포 집단에서 유동 세포 분석법으로 결정했다. 메모리 집단은 다음과 같이 정의되었다: 이펙터 메모리 = CCR7negCD45RAneg, 중앙 메모리 = CCR7+CD45RAneg, 천연 = CCR7+CD45RA+, 이펙터 메모리 RA = CCR7negCD45RA+. 데이터는 평균 ± SD, n=3, **** p<0.0001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (d) CD4+ 및 CD8+ 게이트화 T-세포 집단에서 유동 세포 분석법으로 결정된 억제성 수용체 PD-1 및 복제성 노화 CD57의 마커의 발현. 데이터는 평균 ± SD, n=3, ** p<0.01, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (e) CD4+ 및 CD8+ 게이트화 T-세포 집단에서 유동 세포 분석법에 의한 세포내 사이토카인 염색에 의한 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현. 데이터는 평균 ± SD, n=3으로 제시된다.
도 11a-c. DNA-변형 CAR+ T 세포는 RNA-변형 CAR+ T 세포보다 많은 사이토카인을 생성하고, 약간 더 세포독성을 나타낸다. (a) DNA-변형 (5 자극 주기 후) 및 RNA-변형 CAR+ T 세포(RNA 전송 후 24시간)의 사이토카인 생산은 CD8+ 게이트화 T 세포에서 표적 또는 PMA/이오노마이신을 사용한 4시간 배양 후 세포내 염색 및 유동 세포 분석법에 의해 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (b) DNA-변형(5 자극 주기 후) 및 RNA-변형 CAR+ ￢T 세포(RNA 전송 후 24시간)의 특이적 세포독성은 표준 4시간 크롬 방출 검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, *p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (c) 10:1 이펙터:표적 비에서 RNA-변형 CAR+ T 세포에 의한 A431의 특이적 세포독성은 CAR의 중앙 형광 강도에 대해 플롯팅했다. 선형 회귀는 데이터에 적합화하여 0, p=0.4798의 기울기와 유의하게 상이하지 않은 기울기=0.0237±0.030의 기울기를 수득하였다.
도 12a-c. T 세포의 RNA-변형에 의한 세툭스-CAR의 일시적 발현. (a) CAR의 발현은 T 세포에 첨가된 사이토카인 또는 자극 없는 CAR의 IgG 부분의 유동 세포 분석법에 의해 매일 측정했다. 데이터는 3개의 독립적 공여체를 대표한다. (b) CAR의 발현은 RNA 전송 후 24시간에 IL-2 (50 U/mL) 및 IL-21 (30 ng/mL) 첨가 후 CAR의 IgG 부분의 유동 세포 분석법에 의해 매일 측정했다. 데이터는 3개의 독립적 공여체를 대표한다. (c) CAR의 발현은 RNA 전송 후 24시간에 tEGFR+ EL4 세포의 첨가 후 CAR의 IgG 부분의 유동 세포 분석법에 의해 매일 측정했다. 데이터는 3개의 독립적 공여체를 대표한다.
도 13a-c. RNA 변형에 의한 세툭스-CAR의 일시적 발현은 사이토카인 생산 및 EGFR-발현 세포에 대한 세포독성을 감소시킨다. (a) IFN-γ의 생산은 표적 또는 PMA/이오노마이신으로 4시간 배양 후 RNA 전송 후 24시간 및 120시간에 DNA-변형 및 RNA-변형 CD8+ T 세포에서 세포내 염색 및 유동 세포 분석법에 의해 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (b) DNA-변형 및 RNA-변형 T 세포의 특이적 세포독성은 RNA 전송 후 24시간 및 120시간에 표준 크롬 방출 검정으로 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (c) RNA 전송 후 24시간으로부터 RNA 전송 후 120시간까지의 DNA-변형 및 RNA-변형 T 세포의특이적 세포독성의 변화는 이펙터 대 표적 비 10:1에서 표준 크롬 방출 검정에 의해 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 14a-d. 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포의 수치 확대. (a) 유동 세포 분석법으로 결정된 γ-조사된 tEGFR+ K562 클론 27의 표현형. (b) 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포의 수치 확대. 각 자극 주기 전, CD3+CAR+ T 세포의 비율은 유동 세포 분석법으로 결정하였다. 추론된 세포수는 자극 주기 후 배 확대에 자극된 CAR+ T 세포의 수를 곱하여 계산했다. 데이터는 평균 ± SD, n=7로서 제시된다 (c) CD3+ T 세포 중 CAR의 발현은 CAR의 전기천공 후 24시간 및 CAR의 IgG 부분에 대한 유동 세포 분석법에 의해 확대 28일 후에 결정하였다. 데이터는 평균, n=7로서 제시된다. (d) CAR 발현의 중앙 형광 강도는 확대 28일 후 CAR의 IgG 부분에 대한 유동 세포 분석법에 의해 결정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=7로서 제시된다
도 15a-c. 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 표현형이 유사하다. (a) 확대 28일 후 전체 T-세포 집단 중의 CD4 및 CD8 T 세포의 비율은 게이트화 CD3+CAR+ 세포 상에서 유동 세포 분석법으로 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=7로서 제시된다 (b,c) T-세포 확대 28일 후 T-세포 메모리 및 분화 마커의 발현은 게이트화 CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단에서 유동 세포 분석법으로 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=4로서 제시된다.
도 16a-f. 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 CAR의 친화성 독립적 유발을 통해동등하게 활성화된다. (a) 모노클로날 항체를 차단하는 EGFR의 존재하에 EGFR+ A431에 반응하는 IFN-γ의 생산. CAR+ T 세포는 항체를 차단하는 항-EGFR를 갖는 A431 또는 아이소타입 대조군과 함께 공배양하였고, IFN-γ 생산은 세포내 유동 세포 분석법으로 측정했다. 생산 비율은 차단되지 않은 CD8+ T 세포 생산에 대해 게이트화 CD8+ T 세포에서 IFN-γ의 평균 형광 강도로서 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, *** p<0.001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (b) 항원에 대해 음성인 세포주에 대해 EL4 세포 상에서 tEGFR (상부 패널) 및 CAR-L (하부 패널)의 발현의 대표적인 히스토그램. EGFR 발현의 밀도는 정량적 유동 세포 분석법에 의해 결정하였다. (c) CD19+, tEGFR+ 또는 CARL+ EL4 세포와 함께 공배양 후 게이트화 CD8+CAR+ T 세포에 의한 IFN-γ의 생산은 세포내 염색 및 유동 세포 분석법으로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD, n=4, ** p<0.01, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (d) CD19+, EGFR+, 또는 CARL+ EL4 세포와 함께 공배양 후 30분에 게이트화 CD8+ CAR+ T 세포에서 포스플로우 세포 분석법에 의한 p38 및 Erk1/2의 인산화. 데이터는 평균 ± SD, n=2, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (e) 표준 4시간 크롬 방출 검정에 의해 측정된 CD19+, EGFR+ 및 CARL+ EL4 세포의 특이적 용해. 데이터는 평균 ± SD, n=4, **** p<0.0001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (f) 장기간 공배양에서 T 세포 대 EL4 세포의 상대적 비율. T 세포 대 EL4 세포를 함유하는 공배양물의 분획은 반응성 항체를 교차하는 비-종을 사용하여 각각 사람 및 뮤린 CD3에 대한 유동 세포 분석법에 의해 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=4, ** p<0.01, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 17a-c. 니모 CAR T 세포의 활성화 및 기능적 반응은 EGFR 발현의 밀도에 의해 영향을 받는다. a) 유동 세포 분석법에 의해 측정된 A431, T98G, LN18, U87 및 NALM-6 세포주 상의 EGFR 발현의 대표적인 히스토그램. 세포당 분자의 수는 정량적 유동 세포 분석법에 의해 결정된다. 데이터는 3개의 복제물을 대표한다. b) A431, T98G, LN18, U87 및 NALM-6 세포주와의 공배양에 반응하는 CD8+CAR+ T 세포에 의한 IFN-γ의 생산은 CD8+ 세포 상에서 게이트화된 세포내 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=4, *** p<0.001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. C. CAR+ T 세포에 의한 A431, T98G, LN18, U87 및 NALM-6의 특이적 용해는 표준 4시간 크롬 방출 검정에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=4, **** p<0.0001, ** p<0.01, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 18a-e. 니모-CAR+ T 세포의 기능의 활성화는 직접 및 긍정적으로 EGFR 발현 밀도와 상관된다. (a) 일련의 4개의 U87-유래 종양 세포주(U87, U87low, U87med 및 U87high) 상의 EGFR 발현의 대표적인 히스토그램은 유동 세포 분석법에 의해 측정된다. 세포당 분자의 수는 정량 유동 세포 분석법으로 결정되었다. 데이터는 삼중 실험을 대표한다. (b) 5분, 45분 및 120분 동안 U87 또는 U87high와 공배양 후 게이트화 CD8+ T 세포에서 Erk1/2 및 p38의 인산화는 포스플로우 세포 분석법에 의해 측정했다. 데이터는 평균 형광 강도 ± SD, n=2로서 제시된다. (c) EGFR의 수준을 증가시키면서 U87 세포주와의 공배양 45분 후 게이트화 CD8+ T 세포에서 Erk1/2 및 p38 MAP 키나제 패밀리 구성원의 인산화는 포스포플로우 세포 분석법에 의해 측정했다. 데이트는 평균 형광 강도 ± SD, n=4, **** p<0.0001, *** p<0.001, ** p<0.01, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (d) EGFR의 수준을 증가시키면서 U87 세포주와의 공배양에 대응하여 게이트화 CD8+ CAR+ T 세포에 의한 IFN-γ 및 TNF-α의 생산은 세포내 염색 및 유동 세포 분석법에 의해 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=4, **** p<0.0001, *** p<0.001, ** p<0.01, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (e) EGFR의 수준을 증가시키면서 CAR+ T 세포에 의한 U87 세포주의 특이적 용해는 표준 4시간 크롬 방출 검정으로 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=5, **** p<0.0001, ** p<0.01, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 19a-b. 상호작용 시간을 증가시키면 낮은 EGFR 밀도에 대응하여 니모-CAR+ T-세포 기능을복원하지 않는다. (a) IFN-γ의 생산은 CD8+ 게이트화 세포에서 상이한 배양 기간 후 U87 또는 U87high에 의한 자극 후 세포내 염색 및 유동 세포 분석법에 의해 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=3으로 제시된다. (b) 세툭스-CAR+ 또는 니모-CAR+ T 세포와의 공배양 후 잔류하는 U87 및 U87high 세포의 분획. U87 세포주는 E:T 비 1:5에서 삼중으로 CAR+ T 세포와 함께 공배양했다. 현탁액 T 세포는 부착 표적 세포로부터 분리하고, 부착 분획은 트리판 블루 배제로 계수했다. 생존율은 [공배양후 수거된 세포 수]/[T 세포 부재 세포 수]*100으로서 계산했다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, *** p<0.001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다
도 20a-b. T 세포 상의 CAR 밀도를 증가시키면 저밀도 EGFR에 대한 니모-CAR+ T 세포의 감도를 복원하지 않는다. a) SB 시스템을 통한 RNA 전송 및 전통적인 DNA 전기천공에 의해 변형된 T 세포에서 CAR 발현의 대표적인 히스토그램. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 대표한다. b) 낮은 및 높은 항원 밀도에 대응하여 RNA 전기전달에 의해 CAR을 과발현시키는 T 세포에서 IFN-γ의 생산. IFN-γ의 생산은 U87 또는 U87high 표적 세포에 의한 자극 후 CD8+ 게이트화 세포에서 세포내 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=2로서 제시된다.
도 21a-c. 니모-CAR+ T 세포는 세툭스-CAR+ T 세포보다 정상적인 신장 상피 세포 상의 기초 EGFR 수준에 대응하여 낮은 활성을 갖는다. (a) 유동 세포 분석법에 의해 측정된 HRCE 상의 EGFR의 발현의 대표적인 히스토그램. 세포당 분자의 수는 정량적 유동 세포 분석법에 의해 결정된다. 데이터는 3개의 복제물을 대표한다. (b) HRCE와의 공배양에 대응하여 CD8+CAR+ T 세포에 의한 IFN-γ 및 TNF-α의 생산은 CD8+ 세포 상에 게이팅된 세포내 염색 및 유동 세포 분석법에 의해 측정된다. 데이터는 평균 ± SD, n=4, ** p<0.01, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (c) CAR+ T 세포에 의한 HRCE의 특이적 용해는 표준 4시간 크롬 방출 검정으로 측정했다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, **** p<0.0001, *** p<0.001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 22a-b. 세툭스-CAR+ T 세포는 니모-CAR+ T 세포보다 자극 후 덜 증식하지만, AICD에 대한 경향은 증가되지 않는다. (a) U87 또는 U87high에 의한 자극 후 CD8+CAR+ T 세포의 증식은 CD8+ 세포 상에 게이팅된 Ki-67에 대한 세포내 유동 세포 분석법에 의해 측정했다. 데이터는 평균 형광 강도 ± SD, n=4, ** p<0.01, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다. (b) U87 또는 U87high에 의한 자극 후 T 세포의 생존율은 CD8+ 세포 상에 게이팅된 아넥신 V 및 7-AAD에 대한 유동 세포 분석법으로 측정했다. 살아있는 세포의 비율은 아넥신 Vneg 7-AADneg의 비율에 의해 결정되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=4, *** p<0.001, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 23a-c. 세툭스-CAR+ T 세포는 CAR의 향상된 하향조절을 입증한다. (a) U87 또는 U87high와의 공배양 동안(E:T 1:5) CAR의 표면 발현은 CAR의 IgG 부분에 대한 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 잔류하는 CAR 비율은 [공배양물 중의 %CAR+] / [비자극 배양물 중의 %CAR+] x 100으로서 계산되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, ** p<0.01로서 제시된다. * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트) (b) CD8+ 게이트화 T 세포에서 U87 또는 U87high와 공배양 24시간 후 유동 세포 분석법에 의해 결정된 CAR의 세포내 및 표면 발현의 대표적인 히스토그램. 데이터는 3개의 독립적 공여체를 대표한다. (c) EGFR+ EL4 또는 CAR-L+ EL4와 공배양 동안(E:T 1:1) CAR의 표면 발현은 CAR의 Fc 부분에 대한 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 잔류하는 CAR 비율은 [공배양물 중의 %CAR+] / [비자극 배양물 중의 %CAR+] x 100으로서 계산되었다. 데이터는 평균, n=2, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 24. 세툭스-CAR+ T 세포는 항원에 의한 재시도에 대한 반응이 감소된다. U87 또는 U87high와의 24시간 배양 후, CAR+ T 세포는 U87 또는 U87high로 재시도했고, IFN-γ CAR+ T 세포의 생산은 CD8+ 세포 상에 게이팅된 세포내 염색 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 데이터는 평균 ± SD, n=3, *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05, 이원 ANOVA (터키 후-테스트)로서 제시된다.
도 25a-b. 동물 모델 및 치료 스케쥴의 개략도. (A) 가이드 스크류 배치의 개략도 오른쪽 전두엽에 가이드 스크류를 삽입하기 위해 1-mm 홀을 관상 봉합으로부터 1mm, 시상 봉합으로부터 2.5mm에 뚫는다. (B) 치료 스케쥴의 타임라인. 가이드-스크류는 연구 0일째로 지정된 종양 주입 14일 이상 전에 마우스의 오른쪽 전두엽에 이식된다. 종양은 T-세포 치료 개시 1일 전에 BLI에 의해 영상화했다. CAR+ T 세포는 3주 동안 매주 가이드-스크류를 통해 두개내에 투여했다. 종양 성장은 마우스가 적극적으로 치료를 받는 동안 T-세포 치료 전후에, 이어서 나머지 치료 전반에 걸쳐 매주 BLI로 평가하였다.
도 26a-c. T-세포 치료에 앞서 U87med 및 CAR+ T-세포 표현형의 생착. (a) 종양 주입 4일 후, 종양은 D-루시페린 주입 및 10분 배양 후 BLI로 영상화했다. (b) 마우스는 4일째 BLI 광속 측정에 의해 결정된 상대적 종양 부담을 균일하게 분배하기 위해 3개의 그룹으로 나누었다. (c) 4개의 자극 주기를 통해 확대된 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 유동 세포 분석법에 의해 CAR 발현 및 CD4/CD8 비에 대해 평가되었다.
도 27a-b. 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 U87med 두개내 이종이식편의 성장을 억제한다. (a) 일련의 BLI는 종양의 상대적 크기를 평가했다. (b) 종양의 일련의 BLI에 의해 평가된 상대적 종양 성장. 배경 발광(회색 음영)은 종양이 없는 마우스의 BLI에 의해 정의되었다. 세툭스-CAR+ T 세포 (n=7, p<0.01)에 의해 무치료 대 치료(n=7) 및 니모-CAR+ T 세포 (n=7, p<0.05)에 의해 무치료 대 치료(n=7)된 마우스 사이의 BLI의 유의차, 18일째, 이원 ANOVA (시닥(Sidak’s) 후-테스트).
도 28a-b. 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포로 치료된 U87med 두개내 이종이식편을 포함하는 마우스의 생존율. (a) T-세포 치료 7일 이내에 2개의 독립적 실험으로부터 U87med-ffLuc-mKate 두개내 이종이식편을 갖는 마우스의 생존율. 미처리 마우스(14/14 생존)에 대한 세툭스-CAR+ T 세포 처리된 마우스 8/14 생존)의 생존율의 상당한 감소가 맨텔-콕스 로그-랭크 시험, p=0.0006에 의해 결정되었다. (b) 무치료, 세툭스-CAR+ T 세포 또는 니모-CAR+ T 세포를 수용한 U87med-ffLuc-mKate 두개내 이종이식편을 갖는 마우스의 생존율. 니모-CAR+ T 세포 치료 그룹에서 생존율의 상당한 연장은 맨텔-콕스 로그-랭크 시험, p=0.0269에 의해 결정되었다.
도 29a-c. T-세포 치료에 앞서 U87 및 CAR+ T-세포 표현형의 생착. (a) 종양 주입 4일 후, 종양은 D-루시페린 주입 및 10분 배양 후 BLI로 영상화했다. (b) 마우스는 4일째 BLI 광속 측정에 의해 결정된 상대적 종양 부담을 균일하게 분배하기 위해 3개의 그룹으로 나누었다. (c) 4개의 자극 주기를 통해 확대된 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 유동 세포 분석법에 의해 CAR 발현 및 CD4/CD8 비에 대해 평가되었다.
도 30a-b. 니모-CAR+ T 세포가 아니라 세툭스-CAR+ T 세포가 U87 두개내 이종이식편의 성장을 억제한다. (a) 일련의 BLI는 종양의 상대적 크기를 평가한다. (b) 종양의 일련의 BLI에 의해 평가된 상대적 종양 성장. 세툭스-CAR+ T 세포(n=6, p<0.01)에 의해 무처리 대 처리(n=6) 마우스 사이에 BLI의 유의차는 25일째, 이원 ANOVA (시닥 후-테스트)에 도달했다.
도 31. 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포로 처리된 U87 두개내 이종이식편을 포함하는 마우스의 생존율. 무치료, 세툭스-CAR+ T 세포 또는 니모-CAR+ T 세포를 수용한 U87-ffLuc-mKate 두개내 이종이식편을 갖는 마우스의 생존율. 세툭스-CAR+ T 세포 치료 그룹의 생존율의 유의한 연장은 맨텔-콕스 로그-랭크 시험, p=0.0150에 의해 결정되었다.
도 32. CAR+ T 세포 치료를 위한 항원의 레퍼토리를 안전하게 확대하기 위한 전략의 요약. 전략은 3개의 주요 범주로 구분된다: (i) 약물 유도 자살에 의한 CAR 발현 또는 일시적 CAR 발현을 제한하고, (ii) 저산소 영역에서의 발현을 제한하거나 호밍 수용체를 공발현시켜 CAR을 종양 부위에서 표적화하고, (iii) 종양을 인식하기 위해 두 항원을 필요로 하는 신호를 분할하고, 정상 조직에서 활성화를 방지하기 위해 억제성 CAR을 발현시키거나 높은 항원 밀도로 조건부 활성화된 CAR을 발현시킴으로써 CAR의 활성화를 제한한다.
도 33a-f. 작제된 플라스미드의 벡터 맵. (a) 세툭시맙-유래 CAR 트랜스포손. 다음과 같이 주석이 달린다: HEF-1α/p: 인간 신장 인자-1α의 프로모터; BGH: 소 성장 호르몬 폴리 아데닐화 서열; IR/DR: 역방 반복/직접 반복; ColE1: 복제의 최소 이. 콜라이 기원; Kan/R: 칸나마이신 내성 유전자; Kan/p: 칸나마이신 내성 유전자의 프로모터. (b) 니모투주맙-유래 CAR 트랜스포손. 다음과 같이 주석이 달린다: HEF-1α/p: 인간 신장 인자-1α의 프로모터; BGH: 소 성장 호르몬 폴리 아데닐화 서열; IR/DR: 역방 반복/직접 반복; ColE1: 복제의 최소 이. 콜라이 기원; Kan/R: 칸나마이신 내성 유전자; Kan/p: 칸나마이신 내성 유전자의 프로모터. (c) 세툭시맙-유래 CAR/pGEM-A64 플라스미드. 다음과 같이 주석이 달린다: amp/R: 암피실린 내성 유전자, SpeI: 선형화를 위한 제한 부위. (d) 니모투주맙-유래 CAR/pGEM-A64 플라스미드. 다음과 같이 주석이 달린다: amp/R: 암피실린 내성 유전자, SpeI: 선형화를 위한 제한 부위. (e) tEGFR-F2A-네오 트랜스포손. 다음과 같이 주석이 달린다: HEF-1α/p: 인간 신장 인자-1α의 프로모터; BGH: 소 성장 호르몬 폴리 아데닐화 서열; F2A: 자기-절단가능한 펩티드 F2A; 네오/r: 네오마이신 내성 유전자; IR/DR: 역방 반복/직접 반복; ColE1: 복제의 최소 이. 콜라이 기원; Kan/R: 칸나마이신 내성 유전자; Kan/p: 칸나마이신 내성 유전자의 프로모터. (f) CAR-L 트랜스포손. 다음과 같이 주석이 달린다: HEF-1α/p: 인간 신장 인자-1α의 프로모터; 제오신 R: 제오마이신 내성 유전자; BGH: 소 성장 호르몬 폴리 아데닐화 서열; IR/DR: 역방 반복/직접 반복; ColE1: 복제의 최소 이. 콜라이 기원; Kan/R: 칸나마이신 내성 유전자; Kan/p: 칸나마이신 내성 유전자의 프로모터.
도 34. pLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158A의 벡터 맵. 주석은 다음과 같다: B1: 게이트웨이 공여체 부위 B1; effLuc: 강화된 반딧불 루시페라제; T2A: T2A 리보솜 슬립 부위; mKateS158A: 강화된 mKate 적색 형광 단백질; B2: 게이트웨이 공여체 부위 B2, HBV PRE: B형 간염 번역후 조절 요소; HIV SIN LTR: HIV 자기-불활성화 긴 말단 반복; ampR: 암피실린 내성; LTR: 긴 말단 반복; HIV cPPT: HIV 중앙 폴리퓨린 관.
도 35. 정량적 유동 세포 분석법을 위해 MFI를 ABC에 관련시키기 위한 표준 곡선. 포화량의 항-EGFR-PE로 배양 후, 공지된 항체 결합능을 갖는 미소구 비드 표준 샘플을 유동 세포 분석기 상에서 획득했다. 표준 곡선은 유동 세포 분석법에 의해 획득된 측정 평균 형광 강도에 대해 공지된 항체 결합능을 플롯팅함으로써 생성되었다.
상세한 설명
I. 구현예의 국면
A. RNA 변형에 의한 EGFR -특이적 CAR의 일시적 발현
RNA 전송에 의한 CAR의 일시적 발현은 정상 조직 발현을 갖는 항원에 대해 지시된 CAR T 세포요법의 장기간 온-표적, 오프-조직 독성의 가능성을 감소시키기 위해 제안되었다. RNA 전송 전에 T 세포의 수치 확대는 환자 주입에 필요한 임상적으로 관련된 T 세포수를 수득하기 위해 매력적이다. 본 발명자들은 항-CD3 항체, OKT3이 적재된 aAPC 상에서 공배양함으로써 항원-특이성과 무관하게 T 세포의 수치 확대를 검토했다. 배양물 중의 항원 제시 세포(예: aAPC) 대 T 세포의 비를 변경하면 생성되는 T 세포 집단의 표현형을 변경시킨다. 저밀도의 aAPC(10개의 T 세포 대 1개의 aAPC)로 확대된 T 세포는 aAPC로 확대된 T 세포에 비해 CD8+ T 세포의 증가된 비율, 중앙 메모리 표현형 T 세포의 증가된 존재, IFN-γ 및 TNF-α의 감소된 생산, IL-2의 증가된 생산 및 확대 후 TCR 다양성의 잠재적으로 적은 클론 손실과 관련되었다. 저밀도 aAPC로 확대된 T 세포는 더욱 RNA 전기전달할 수 있어서 RNA 전사물의 높은 발현 및 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포보다 전기전달 후 향상된 T-세포 생존율을 입증했다.
T-세포 발현을 위해 aAPC 사용의 잠재적인 이점은 접착 분자 LFA-3 및 ICAM-1의 발현에 의한 T 세포와의 안정한 상호작용을 형성하는 능력이다(참조: Suhoski 등, 2007; Paulos 등, 2008). 추가로, aAPC는 공자극 분자의 목적하는 배열을 발현시키기 위해 비교적 용이하게 변경할 수 있다. 따라서, 수치 T-세포 확대를 위한 aAPC는 채택된 T-세포 요법을 위한 최적의 T-세포 표현형을 달성하기 위해 T-세포 확대를 위한 공자극 분자의 다양한 조합을 평가하기 위한 플랫폼을 제공한다. aAPC의 변경 이외에, 본 발명자들은 생성되는 T-세포 집단의 표현형에 대한 T 세포 배양물 중의aAPC의 밀도의 영향을 기재했다. CD8+ T 세포 또는 세포독성 T 세포는 흔히 항종양 면역요법을 위한 이상적 T-세포 집단으로서 간주된 반면, 증거는, CD8+ T 세포가 최적의 항종양 반응 및 메모리 형성을 달성하기 위해 생체내 CD4+ T-세포 보조를 필요로 한다는 것을 시사한다(참조: Kamphorts 등, 2013; Bourgeois 등, 2002; Sun 등, 20013). 그러나, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 이상적 비는 비공지된다(참조: Muranski 등, 2009). 선택된 면역요법을 위한 T 세포에서 CD4/CD8 비를 왜곡하기 위해 확대 배양물 중의 aAPC의 밀도를 변경함으로써, 그들이 환자 또는 유전자 변형 T 세포로부터 단리된 TIL이든지에 관계없이, 이러한 문제는 임상 시험에서 해결될 수 있다. 최후로, 배양물 중의 aAPC의 밀도를 감소시키면 고밀도의 aAPC로 확대된 T 세포보다 중앙 메모리 표현형(CCR7+CD45RAneg)을 갖는 더 많은 T 세포를 유도한다. 중앙 메모리 표현형 T 세포의 증강된 지속성의 이점은 종양 항원에 대해 단지 일시적으로 재지시된 RNA 변형 T 세포로 확장될 수 없지만, T 세포의 지속성은 T-세포 요법의 항종양 효능을 향상시키는 것으로 나타났다(참조: Kowolik 등, 2006; Robbins 등, 2004; Stephan 등, 2007; Wu 등, 2013). 따라서, 저밀도 aAPC에 의한 생체외 확대는 안정하게 유전자 변형 T 세포 또는 TIL을 증강된 지속성을 위한 중앙 메모리 표현형으로 재프로그램화하기 위해 사용될 수 있다.
생체외 확대된 T 세포에서 RNA 변형에 의한 CAR의 발현은 항원의 CAR 인식을 통해 T 세포의 비바이러스 DNA 변형 및 확대에 의한 CAR의 발현보다 더 가변적인 것으로 밝혀졌다. 상이한 밀도에서 CAR의 발현은, 이전에 보고된 바와 같이, 특정의 임계값 이하 낮은 CAR 발현이 표적의 특이적 용해에 대해 부정적인 영향을 갖는다는 것을 기대하는 것이 타당하지만, 표적을 특이적을 용해하는 T 세포의 능력에 영향을 미치지 않았다(참조: Weijtens 등, 2000). 다른 것은 RNA의 용량이 도입유전자 발현 수준을 결정하도록 T 세포의 RNA 변형에 의한 CAR의 조정가능한 발현을 기재한다(참조: Rabinovich 등, 2006; Yoon 등, 2009; Barrett 등, 2011). 현재 연구에서 T 세포의 RNA 변형은 동일량의 RNA를 사용하여 수행되었고, 따라서 이는 RNA 용량을 변경함으로써 CAR 발현의 변동성을 고려하지 않는다. 대신에, 공여체 사이의 변동성이 전기전달 후 CAR 발현 강도의 차이를 설명할 가능성이 있다. RNA 전송 이전에 T-세포 확대를 위한 현재 기재된 프로토콜은 RNA 흡수에 대한 특정 공여체로부터의 T 세포의 감도를 변경하는데 역할을 할 수 있고, 전기전달에서 RNA 양을 증가시키면 이러한 공여체에서 CAR의 발현을 증가시킬 수 있다. 비교적 높은 양의 RNA를 전송함으로써 CAR의 고발현은 연장된 시간 동안 연장된 CAR 발현 및 CAR-매개 활성을 유도할 수 있다(참조: Barrett 등, 2011). RNA 전송으로부터 연장된 CAR 발현은, 특히 T 세포의 자극이 CAR 발현의 손실을 촉진하는 것으로 보이기 때문에, 항종양 활성에 유익할 수 있다. 그러나, CAR의 발현을 연장시키면 정상 조직 독성을 감소시키면서 항종양 활성을 최대화하는 최적의 발현 기간을 결정하기 위해 CAR 발현의 최적화를 필요로 하는 정상 조직 항원에 대응하여 T-세포 활성을 또한 증가시킬 수 있다.
T 세포의 RNA-변형은 이전 보고와 유사하게 RNA의 전기전달에 앞서 생체외 확대된 T 세포에서 발견된 이펙터 메모리 및 중앙 메모리 T 세포의 비율을 변경하지 않는다(참조: Schaft 등, 2006). 비교적 낮은 aAPC 밀도, 10개의 T 세포 대 1개의 aAPC에서 확대된 T 세포만이 다양한 전기천공 조건에도 불구하고 상당한 독성 없이 효율적인 RNA 전사물 흡수가 가능했다. 이러한 T 세포의 집단은 또한 IFN-γ 및 TNF-α, 및 세포독성 이펙터 분자 그랜자임 B 및 퍼포린의 생산이 감소된 T 세포와 중앙 메모리 표현형(CCR7+CD45RAneg)의 상당한 비율을 입증했다. 그 결과, RNA-변형 T 세포는 DNA-변형 T 세포보다 상당히 많은 중앙 메모리 표현형 T 세포를 함유하고, EGFR-발현 세포에 대응하여 IFN-γ 및 TNF-α 생산의 감소 및 낮은 E:T 비에서 약간 덜 특이적 용해를 입증했다. 따라서, RNA-변형을 위한 전구세포 T 세포 집단은 RNA 전송 후 CAR-매개 T 세포 기능에 강한 영향을 미치고, RNA-변형 T 세포의 감소된 사이토카인 생산 및 약간 덜 특이적 용해는 T 세포의 세포독성 가능성이 단명이고, 중앙 메모리 T 세포 집단의 증강된 지속성이 유익할 수 없는 생체내 모델에서 감소된 항종양 효능으로 번역할 수 있다. 이펙터 메모리 표현형 T 세포의 더 상당한 비율을 입증한 1개의 T 세포 대 2개의 aAPC에서 확대된 T 세포의 RNA-변형은 DNA-변형 CAR+ T 세포와 유사하고, 결과적으로 IFN-γ 및 TNF-α의 높은 생산 능력이 바람직하다. RNA 전송 이전에 사이토카인의 첨가는 생존율을 향상시킬 수 있고, 추가의 전기천공 프로그램은 RNA를 이러한 T 세포로 효율적으로 전송할 수 있다.
RNA 전송을 통해 T 세포에 도입된 세툭스-CAR은 일시적으로 발현되었고, 발현의 손실은 EGFR-발현 세포주의 첨가를 통해 사이토카인 IL-2 및 IL-21 및 항원-자극의 첨가를 포함하여 T 세포에의 자극에 의해 촉진되었다. CAR 발현의 손실과 동시에, RNA-변형 T 세포는 종양 세포 및 정상 인간 신장 세포를 포함하는 EGFR-발현 세포주에 대해 감소된 세포독성을 입증했다. RNA-변형 T 세포의 사용을 위한 하나의 우려는 경시적으로 종양을 표적화하는 이들의 본질적으로 감소된 능력은 안정하게 변형된 T 세포에 비해 감소된 항종양 효능을 유도할 것이라는 것이다. 중피종의 뮤린 모델의 치료를 위해 RNA 전송에 의해 메소텔린-특이적 CAR을 발현시키기 위해 변형된 T 세포의 복수의 주입은, 격주에, 종양내 주입이 종양 성장의 억제를 입증하지만, 치료 중단 후 종양은 재발된다는 것을 입증했다(참조: Zhao 등, 2010). 생체내 다발성 백혈병 뮤린 모델의 치료는 CD19에 특이적인 RNA-변형 CAR+ T 세포는 단일 주입 후 항종양 활성을 갖는 반면, 종양은 흔히 CAR 분해와 일치하는 시간 후 재발된다는 것을 입증한다(참조: Barrett 등, 2011). 대조적으로, 메소텔린-특이적 CAR을 안정하게 발현시키는 T 세포의 단일 종양내 주입은 우수한 항종양 활성을 매개하고, 대부분의 마우스를 경화시킬 수 있었다. RNA-변형 T 세포 투여의 최적화는, 후속적 주입 전 잔류성 CARneg T 세포를 제거하기 위한 사이클로포스파미드와 칭량된 분할 투여 섭생의 조합이 질환 부담을 조절하는데 더욱 효과적이었고, 안정하게 변형된 T 세포에서의 항종양 효능과 유사했다는 것을 입증했다(참조: Barrett 등, 2013). 따라서, 투여 섭생을 최적화하면 RNA-변형 T 세포의 항종양 활성을 향상시킬 수 있다.
B. CAR + T 세포는 EGFR 밀도에 기초하여 정상 세포로부터 악성 세포를 구별할 수 있다
세툭스-CAR+ T 세포는 정상 조직 항원을 인식할 수 있고, 이는 온-표적, 오프-조직 독성을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 CAR의 일시적 발현을 통해 온-표적, 오프-조직 독성을 제어하는 방법으로서 RNA 종으로서 CAR의 발현을 조사했다. CAR 발현은 일시적이고 CAR의 분해 후 정상 조직 EGFR에 대한 세포독성의 가능성을 감소시켰지만, 이는 CAR의 상당한 분해 전 정상 조직 EGFR의 인식시 즉시 T-세포 이펙터 기능 가능성을 언급하지 않았다. 추가로, CAR 발현을 제한함으로써, T 세포는 CAR 분해 후 EGFR-발현 종양에 비반응성이도록 하고, 항종양 활성을 지속시킬 가능성은 이 접근법에 의해 손상된다. 따라서, 항종양 활성을 손상시키지 않고 유해한 온-표적, 오프-조직 독성을 제한하는 정상 조직의 존재하에 CAR 활성을 제어하는 메커니즘이 조사되었다.
내인성 T 세포 활성화는 TCR의 친화성 및 MHC를 통해 제시된 펩티드의 밀도 둘 다에 의존한다 (참조: Hemmer 등, 1998; Viola 등, 1996; Gottschalk 등, 2012; Gottschalk 2010). T 세포는 이펙터 기능의 유발에 필요한 특정 임계값을 능가하는 TCR을 통해 누적 신호에 의해 활성화된다(참조: Hemmer 등, 1998; Rosette 등, 2001; Viola 등, 1996). 높은 친화성 TCR의 경우, 비교적 낮은 항원 밀도가 T 세포 반응을 유발하는데 충분하지만; 낮은 친화성 TCR은 유사한 이펙터 T 세포 반응을 달성하기 위해 높은 항원 밀도를 필요로 했다(참조: Gottschalk 등, 2012). 많은 종양은 그들의 정상 조직 발현보다 더 높은 밀도에서 TAA를 과발현시킨다(참조: Barker 등, 2001; Lacunza 등, 2010; Hirsch 등, 2009). 신경교종에서 EGFR의 증폭 및 과발현은 EGFR이 정상 조직에 비해 신경교종에서 과발현되고, 과발현은 등급 IV 신경교아종이 최고 밀도의 EFGR을 발현시키도록 종양 등급과 상관될 때 이러한 관계를 강조한다(참조: Smith 등, 2001; Hu 등, 2013; Galanis 등, 1998). 따라서, 본 발명자들은 EGFR-특이적 CAR-변형 T 세포가 CAR의 결합 친화성을 감소시킴으로써EGFR 밀도에 기초하여 정상 세포로부터 악성 세포를 구별할 수 있는지를 결정한다.
항원 특이성을 부여하는 세툭스-CAR의 부분은 고친화성(Kd=1.9x10-9)을 특징으로 하는 모노클로날 항체 세툭시맙의 scFv 부분으로부터 유도된다(참조: Talavera 등, 2009). 따라서, 본 발명자들은 세툭시맙과 매우 중복성 에피토프 및 10배 낮은 해리 상수(Kd=2.1x10- 8)를 공유하고, 59배 감소된 결합 상수를 특징으로 하는 모노클로날 항체 니모투주맙으로부터 CAR을 생성했다(참조: Talavera 등, 2009; Garrido 등, 2011; Adams 등, Zuckier 등, 2000). 감소된 결합 속도 및 전반적인 친화성의 후속적인 감소는 EGFR이 고밀도에서 발현될 경우에만 발생하는 EGFR의 2가 인식의 요건을 부과한다. 따라서, 니모투주맙으로부터 유도된 CAR은 T 세포가 EGFR 발현 밀도에 기초하여 정상 조직으로부터 악성 조직을 구별할 수 있도록 한다.
CLL 및 ALL에서 최근 임상적 성공은 CD19-CAR+ T-세포 요법에 대한 완전한 종양 반응을 갖는 환자에서 지속적인 B-세포 무형성증을 주의하지만, 이 독성은 CD19가 혈통 제한 항원이기 때문에 허용가능한 것으로 간주되고, B 세포 무형성증은 고도의 림프종이 설정에서 허용가능한 독성으로 간주된다(참조: Grupp 등, 2013; Porter 등, 2011). CAR-변형 T 세포로 HER2 및 CAIX를 표적화하는 임상 시도에서 심각한 부작용은 혈통 및 종양 제한 항원을 초월하여 안전하게 표적화가능한 항원의 범위를 확장하기 위해 정상 조직 항원 발현에 대해 CAR T-세포 활성을 제어할 필요성을 강조한다(참조: Lamers 등, 2013; Morgan 등, 2010). 비정상적으로 발현된 TAA는 신경교아종에서 EGFR 발현과 같이 정상 조직에 비해 종양에서 흔히 과발현된다(참조: Smith 등, 2001; Hu 등, 2013; Galanis 등, 1998). 본 발명자들은 높은 항원 밀도에 대응하여 적합한 이펙터 기능을 유지시키면서 정상 조직에 대한가능성을 최소화하기 위해 낮은 항원 밀도에 반응하는 능력이 감소된 EGFR에 특이적인 CAR을 개발했다. 이는 세툭시맙에 비해 결합 동태가 감소된, 매우 중복성 에피토프를 갖는 모노클로날 항체인 니모투주맙으로부터 EGFR-특이적 CAR을 개발함으로써 달성되었다(참조: Talavera 등, 2009; Garrido 등, 2011). 세툭스-CAR+ T 세포는 낮은 및 높은 EGFR 밀도를 표적화할 수 있는 반면, 니모-CAR+ T 세포는 항원 밀도에 대한 T-세포 활성을 조정할 수 있었고, 반응은 표적 세포에서 발현된 EGFR 밀도에 의존하였다. 니모-CAR+ T 세포는 종양 세포 및 정상 신장 세포 상의 낮은 EGFR 밀도에 대응하여 세툭스-CAR+ T 세포에 비해 감소된 활성을 입증하지만, 그들은 고밀도 EGFR 밀도에 대응하여 등가의 재지시된 특이성 및 기능을 가능하게 하였다. CAR 친화성은 항원 도전 후 증식에 영향을 미치고, 세툭스-CAR+ T 세포는 항원 도전후 니모-CAR+ T 세포외 비교할 경우 손상된 증식을 입증하지만, 활성화 유도 세포사(AICD)에 대한 증가된 경향은 아니다. 추가로, CAR 친화성은 항원과의 상호작용 후 T-세포 표면으로부터 CAR의 하향조절에 영향을 미친다. 세툭스-CAR은 높은 EGFR 밀도와의 상호작용 후, 세포 표면으로부터 니모-CAR보다 더 빠르고 연장된 하향조절을 나타냈다. 세툭스-CAR+ T 세포는 하향조절된 CAR 또는 세툭스-CAR+ T 세포의 잠재적인 기능적 소모의 결과일 수 있는 항원에 의한 재도전에 반응하는 능력이 손상되었다(참조: James 등, 2010; Lim 등, 2002).
CAR 기능에 대한 scFv의 영향을 기술하는데 있어서 문제는 T-세포 기능을 최고로 예측하는 내인성 TCR 결합의 생화학적 변수를 둘러싼 상당한 논쟁으로부터 기인한다. TCR 결합의 동역학은 다음 방정식에 의해 기재될 수 있다:
Figure pct00001
해리 상수 Kd가 해리 속도(koff)와 결합 속도(kon)의 비와 동일하도록(14). 해리 상수(Kd) 및 해리 속도(koff) 둘 다가 pepMHC의 TCR 인식 후 T-세포 기능의 중요한 결정인자로서 보고되었지만, 이러한 두 변수는 흔히 강하게 상관되고, 따라서 T-세포 기능에 대한 이들 각각의 영향을 분리하는 것은 어렵다(참조: Kersh 등, 1998; McKeithan T.W. 1995; Nauerth 등, 2013). T-세포 유발의 동태 교정 모델은, 충분히 긴 체류 시간이 T-세포 신호전달 및 활성화를 유발하는데 필요하도록 koff가 T-세포 기능에 영향을 미친다고 주장한다. 이는 최적 체류 시간의 윈도우를 포함하도록 보정되었고, 여기서 연장된 체류 시간은 단일 pepMHC 복합체에 의한 복수의 TCR의 일련의 유발 능력을 손상시킴으로써 T-세포 활성화에 유해할 수 있다(참조: Kalergis 등, 2001). 그러나, 이러한 모델은 기능적 T-세포 반응을 생성할 수 있는 매우 짧은 체류 시간 상호작용의 보고와 모순된다(참조: Govern 등, 2010; Tian 등, 2007; Aleksic 등, 2010; Gottschalk 등, 2012). Kd와 koff 값 사이의 고도의 상관도를 감소시키고, kon 값의 동적 범위를 확장시킴으로써 이전 데이터세트 바이어스를 감소시키는 것을 목표로 하는 최근 분석은 T-세포 유발의 T-세포 격리 모델에 포함되는 T-세포 활성화에 대한 kon의 기여도에 중요한 역할을 발견했고, 여기서 T-세포 기능은 결합 속도, 해리 속도 및 이들 상대적 멤브레인에서 TCR 및 pepMHC의 확산 사이의 수학적 관계로부터 유래되는 T-세포 격리 기간과 직접 상관된다(참조: Tain 등, 2007; Aleksic 등, 2010). 흥미롭게도, kon이 낮아짐에 따라, TCR 및 pepMHC은 재결합 전에 그들의 상대적 멤브레인에서 확산할 수 있고, 따라서 상호작용 지속 기간은 koff 값으로 감소한다. 대조적으로, kon이 높아짐에 따라, TCR은 체류 시간을 확장하기 위해 신속하게 재결합할 수 있고, 상호작용의 지속 기간 및 생성되는 T-세포 기능은 Kd에 의해 최고로 예측된다. 이러한 지속적인 논쟁은 다른 것들에 비해 기능의 우수한 지표로서 결합의 하나의 생화학적 매개변수에 의존하는 범용 모델에 대해 T-세포 기능적 친화성의 주의를 제어하는 TCR 친화성 성분의 역할을 정의한다. 대신, 이는 결합 및 해리 속도 뿐만 아니라 기능적 반응을 정의하는 표적 세포 멤브레인을 통해자유롭게 이동하는 항원의 밀도의 조합일 가능성이 있다.
내인성 TCR 반응은 일반적으로 CAR 특이성을 유도하기 위해 사용된 모노클로날 항체의 결합보다 훨씬 낮은 친화성으로서 기재된다(참조: Stone 등, 2009). 그러나, TCR 결합 친화성을 측정하기 위해 사용된 SPR 기술은 전형적으로 3차원으로 수행되고, T 세포와 항원 제시 세포의 생리학적 상호작용을 요약하지 않고, 여기서, 두 결합 파트너는 이들 각각의 멤브레인에 격리되어 격리된 세포내 공간 및 적절한 분자 배향에 기인하는 결합 가능성을 증가시킨다(참조: Huppa 등, 2010). 2D로 TCR 결합 동태의 측정은 TCR 결합이 증가된 결합 속도 및 감소된 해리 속도를 특징으로 하는 3D 측정으로 시사된 것보다 친화성이 높다는 것을 시사한다(참조: Huang 등, 2010; Robert 등, 2012). 그러나, ICAM-1 또는 LFA-1과 같은 다른 리간드/수용체 쌍의 결합 동태는 3D 또는 2D 검정으로 취한 친화성 측정치의 차이를 나타내지 않았다. 흥미롭게도, 세포골격 중합의 삭제는 2D로 수행된 측정치를, 항원에 대한 T 세포 결합을 향상시키는데 있어서 동적 세포 및 세포골격 공정의 역할을 강조하는 3D로 수행된 측정치로 감소시킨다(참조: Robert 등, 2012). 유사한 세포골격 상호작용 또는 CAR의 결합 친화성의 향상이 발생하는지는 현재 공지되지 않았고, 따라서, CAR의 scFv 도메인의 결합 친화성에 대해 수행된 가정이 3D 검정에서 모노클로날 항체 친화성의 측정치로부터 직접 수행될 수 있는지의 여부는 불분명하다. 또한, 다수의 인자가 MHC 및 TCR 나노클러스터에 대한 공동수용체 결합 및 T 세포 활성화 이전 및 후에 T-세포 표면에서 마이크로클로스터의 형성과 같은 전반적인 T 세포 결합 친화성을 향상시키는데 기여한다(참조: Holler 등, 2003; Schamel 등, 2005; Schamel 등, 2013; Kumar 등, 2011; Yokosuka 등, 2010). CAR이 T 세포 표면에서 올리고머 형태로 발현될 수 있는 것으로 나타났지만, CAR과 내인성 T 세포 신호전달 복합체의 관련 정도는 불명확하다. 단지 CD3-ζ를 통해 신호전달하는 제1 세대 CAR의 보고는 CAR-의존 T-세포 활성화를 달성하기 위해 내인성 CD3-ζ과의 결합을 위한 요건을 입증하는 반면, 막관통 CD28 및 세포내 CD28 및 CD3-ζ를 통해 신호전달하는 제2 세대 CAR은 내인성 TCR-CD3 복합체가 T 세포 표면으로부터 제한되는 경우 CAR-의존 활성화 능력에 차이가 없음을 입증한다(참조: Bridgeman 등, 2010; Torikai 등, 2012). 따라서, CAR과 내인성 TCR 신호전달 기기의 결합은 CAR 구성에 의존할 수 있다.
CAR 설계에서 scFv 친화성의 역할을 다루는 특정 연구는 제한되고, 해리 상수, Kd의 기여도에 초점을 맞춘다 6배 낮은 Kd를 갖는 것에 비해 ROR1-특이적 CAR를 사용한, 따라서 높은 친화성을 갖는 최근 연구는 증가된 Kon 및 감소된 koff 둘 다로부터 발생되고, 더 높은 친화성 ROR-1특이적 CAR이 AICD에 대한 증가된 경향 없이 사이토카인의 생산 및 특이적 용해를 포함하는 시험관내 T-세포 기능을 증가시켰다는 것을 입증했다(참조: Hudecek 등, 2013). 추가로 고친화성 ROR-1-특이적 CAR+ T 세포는 우수한 생체내 항종양 활성을 매개했다. 유사하게, 세툭스-CAR+ T 세포의 보다 높은 친화성은 AICD에 대한 경향을 증가시키지 않고, 감소된 EGFR 밀도에 대응하여 사이토카인의 생산 및 특이적 용해를 포함하는 T-세포 기능을 증가시켰다. 그러나, 광범위한 범위의 Kd 값을 갖는 친화성 성숙된 HER2-특이적 모노클로날 항체의 패널로부터 유도된 일련의 CAR의 이전 연구는, 친환성 임계값이 존재하고, 이 이하에서 CAR-의존 T-세포 활성화되는 손상되었지만; 이 임계값 이상에서, HER2의 다양한 수준에 대응하여 T 세포의 활성화는 증가된 친화성으로 향상되지 않았다는 것을 밝혀냈다(참조: Chmielewski 등, 2004). 대조적으로, 본 연구는 항원 밀도에 기초하는 표적에 대한 고친화성 CAR 및 저친화성 CAR의 상이한 능력을 동정했다. 보다 높은 친화성 세툭스-CAR+ T 세포는 니모-CAR+ T 세포에 비해 감소된 EGFR 밀도에 대응하여 증가된 사이토카인 생산 및 특이적 용해에 관련되었다. 한편, 니모-CAR은 세툭스-CAR에 비해 낮은 친화성을 갖고, 니모-CAR의 Kd 값은 친화성 임계값 이상, 이전 연구에 의해 이펙터 기능을 가질 것으로 예측된 범위 내였다. 내인성 TCR을 사용한 연구와 유사하게, 이들 결과는, CAR 친화성의 설명은 해리 상수에 의해 단독으로 기재되어서는 안된다는 것을 나타내고, 개별적 해리 및 결합 속도가 CAR 설계를 위해 고려되어야 한다는 것을 지지한다.
연구 사이에 CAR 기능에 대한 친화성의 영향 사이의 모순은 해리 상수 Kd를 구성하는 생화학적매개변수 koff 및 kon의 명확한 관계에 의해 설명될 수 있다. HER2-특이적 CAR은 kon 값의 최소한의 보정과 함께 주로 koff와 상이한 광범위한 범위의 Kd 값을 나타내는 항체로부터 유도되었다(참조: Chmielewski 등, 2004). 따라서, 보다 높은 친화성 상호작용은 결합 속도를 증가시키지 않았지만, 항원과의 상호작용 지속기간은 증가시켰다. 대조적으로, ROR-1-특이적 CAR 및 세툭스-CAR의 보다 높은 친화성은 둘 다 결합의 증가된 결합 속도에 의해 영향을 받았다. ROR-1-특이적 CAR을 유도하기 위해 사용된 보다 높은 친화성 모노클로날 항체는 보다 높은 친화도가 증가된 결합 속도 및 증가된 상호작용 지속 기간 둘 다에 의해 특성화되도록 증가된 kon 및 감소된 koff 둘 다의 기여도로부터 6배 낮은 Kd를 가졌다(참조: Hudecek 등, 2013). 세툭시맙과 니모투주맙 사이의 Kd의 10배 차이는, 세툭시맙이 니모투주맙에 비해 결합 속도를 크게 향상시키고, 대부분 더 높은 친화성 상호작용과 대조적으로, 보다 짧은 상호작용 지속 기간을갖도록 세툭시맙의 kon에서 59배 증가 및 koff에서 5.3x 증가에 의해 주로 영향을 받는다(참조: Talavera 등, 2009). 따라서, CAR 설계의 scFv 도메인의 해리 속도보다 오히려 결합 속도를 변경하면 T-세포 기능에 대한 더 큰 영향을 가질 수 있다.
이전 연구는, 최소 CAR 밀도가 T-세포 활성화에 필요하고, 이 이하에서 T-세포 활성화는 폐기된다는 것을 확립했다(참조: James 등, 2010). 그러나, 충분히 높은 항원 발현은 이 요건을 완화시키고, CAR이 저밀도에서 발현될 때 CAR-의존 T-세포 활성화를 달성할 수 있다(참조: James 등, 2010). CAR 발현 밀도, 항원 밀도 및 CAR 친화성과 CAR+ T 세포 기능에 대한 영향 사이의상호작용은 고친화성 및 저친화성 HER-특이적 CAR를 사용하는 연구에서 평가했다. 이 연구는, 낮은 항원 밀도에 대응하여 낮은 CAR 밀도를 갖는 T 세포의 감소된 T-세포 기능이 T 세포가 보다 높은 친화성 HER2-특이적 CAR을 발현시킬 경우에만 명백했다는 것을 보고했다(참조: Turatti 등, 2007). 그러나, CAR이 고밀도에서 발현된 경우, CAR-매개 세포독성은 친화성 또는 항원 밀도와 관계없었다. 저자는 일련의 유발을 유도하기 위한 실패에 저밀도를 발현시킬 때 낮은 HER2 밀도에 대한 고친화성 CAR의 감소된 반응을 들었다. CAR이 내인성 TCR로서 연속적으로 유발하지 않는다는 것이 보고되었지만(참조: James 등, 2010), 이것은 CAR-특이적이고, 상이한 막관통 영역, 엔도도메인 및 scFv 친화성이 연속적으로 유발하는 능력에 영향을 미칠 수 있다는 것이 가능하다. 본 발명자들은 낮은 항원 밀도에서 초기 반응에서의 세툭스-CAR+ T 세포에서 어떤 결함도 관찰하지 않았지만, EGFR+ aAPC에 대한 반복적 자극을 통해 발췌된 CAR 발현 수준은 최적의 CAR 밀도를 위해 선택할 수 있고, T 세포는 확장에 실패하는 CAR의 차선 수준을 발현시키고 따라서 레퍼토리로부터 탈락한다. 대조적으로, 본 발견은, 보다 낮은 친화성의 니모-CAR+ T 세포가 낮은 항원 발현에 대한 감소된 감도를 입증하지만, 니모-CAR의 증가하는 밀도는 낮은 항원에 대한 니모-CAR+ T 세포 감도를 복원하지 않았고, 따라서 상이한 메커니즘에 의해 조절될 가능성이 있음을 시사하다.
저밀도에서 CAR의 발현이 항원에 대한 감도를 감소시킬 수 있지만, 주로 저밀도에서 발현된 CAR이 모든 수준의 항원에 대해 감소된 감도를 입증하고 따라서 감소된 항종양 활성에 대한 잠재력을 입증하기 때문에, 이는 생체내에서 높은 항원 밀도를 선택적으로 표적화하는 최적의 전략일 것 같지는 않다(참조: James 등, 2010; Weijtens 등, 2000). 추가로, CAR은 일정 수의 CAR/항원으로부터 T-세포 표면으로부터 하향조절한다(참조: James 등, 2010). 따라서, 저밀도에서 CAR을 발현하는 T 세포는 T-세포 활성화를 달성하기 위한 최소 밀도 이하의 하향조절에 더 민감하다.
이 연구에서, 결합의 감소된 결합 속도에 기인하여 세툭스-CAR에 비해 낮은 친화성을 가질 것으로 예측된 니모-CAR은 낮은 EGFR 밀도를 갖는 정상 신장 세포에 대응하여 EGFR 발현 밀도 및 감소된 활성과 직접 상관되는 T-세포 활성화를 매개했다. 추가로, 니모-CAR+ T 세포는 세툭스-CAR+ T 세포에 비해 증강된 증식 및 감소된 CAR 하향조절을 나타냈다. 니모-CAR+ T 세포에 의해 신경교아종 상의 EGFR을 표적화하는 것은 온-표적, 오프-조직 독성에 대한 가능성을 감소시키면서 항종양 활성을 매개할 가능성을 갖는다.
C. 두개내 신경교종 모델에서 세툭스 -CAR+ 및 니모 -CAR+ T 세포의 생체내 항종양 효능
신경교아종과 같은 일부 종양은 정상 조직 발현에 비해 고밀도에서 EGFR을 과발현시키고, 결합 친화성을 감소시키기 위해 CAR의 scFv 도메인을 변경하면 우선적으로 높은 EGFR 밀도의 존재하에 T 세포를 활성화시키지만, 낮은 EGFR 밀도의 존재하에서 T 세포 활성을 감소시킬 수 있다고 가정했다. 세툭스-CAR 및 니모-CAR은 세툭스-CAR이 5.3배 더 낮은 해리 상수, 및 따라서 59배 더 높은 결합 속도를 특징으로 하는 더 높은 친화성을 갖도록 상이한 친화성 및 결합 동태로 EGFR 상에서 중복 에피토프를 결합한다. 시험관내 연구는 또한 세툭스-CAR이 외인성 사이토카인의 부재하에 항원에 대응하여 감소된 증식, EGFR을 결합하는 CAR의 scFv 도메인 및 EGFR의 밀도에 의존한 CAR의 향상된 하향조절, 및 항원에 의한 재도전에 대응하여 손상된 사이토카인 생산을 가졌다는 것을 입증했다.
두개내 신경교종 이종이식편의 치료에서 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포의 효능의 평가는 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포가 모두 중간 EGFR 밀도를 발현시키는 U87med에 대한 항종양 활성을 매개할 수 있지만, 세툭스-CAR+ T 세포만이 내인적으로 낮은 EGRF 밀도를 갖는 U87에 대한 항종양 활성을 입증했음을 입증함으로써 시험관내 결론을 지지했다.
일부 연구는, 고친화성 TCR 상호작용이 우수한 생체내 활성을 유도할 수 있음을 입증했다(참조: Nauerth 등, 2013; Zhong 등, 2013); 그러나, 시험관내 T-세포 활성이 항상 생체내 효능을 반영하지 않는다는 것이 입증되었다(참조: Chervin 등, 2013; Janicki 등, 2008). 시험관내 고효능을 갖는 고친화성 T 세포는 감소된 신호전달, 확대 및 T-세포 매개 기능을 특징으로 하는 생체내 반응을 약화시킨 것으로 나타났다(참조: Corse 등, 2010). 유사하게, 저친화성 상호작용은 면역 반응의 각 단계에 존재하는 보다 적은 T 세포를 유도하는 생체내 T-세포 확대를 축소한 것으로 입증되었다(참조: Zehn 등, 2009). 항종양 효능에서 TCR 친화성의 역할을 평가하는 모델은, 고친화성 TCR 상호작용이 감소된 종양 존재 및 손상된 세포 용해 기능을 특징으로 하는 항종양 기능을 손상시킨다는 것을 입증했다(참조: Chervin 등, 2013; Engels 등, 2012; Janicki 등, 2008). 따라서, 중간 친화성을 갖는 T 세포가 고친화성 T 세포에 비해 종양 성장을 양호하게 제어할 수있다고 시사되어 왔다(참조: Corse 등, 2010; Janicki 등, 2008). 이러한 관찰을, 세툭스-CAR+ T 세포가 외인성 사이토카인의 부재하에 자극될 때 증식 능력을 저하시키고, 항원과의 결합 후 CAR 하항조절을 강화시키고, 항원에 의한 재도전에 반응하는 능력을 감소시킨다는 시험관내 관찰과 조합하면, 세툭스-CAR+ T 세포는 생체내 항종양 효능을 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 니모-CAR+ T 세포에 대한 손상된 항종양 효능을 관찰하지 않았지만; 종양내 주입 후 CAR+의 죽음은 후속되지 않았고, 따라서, 생체내 확대의 차이는 평가되지 않았다. CAR+ T 세포의 종양내 주입은 항종양 활성을 평가할 때 종양에 대해 가정에서 CAR+ T 세포의 이질적 능력의 혼란 변수를 피하기 위해 선택되었지만; 세툭스-CAR+ T 세포가 종양 주변에서의 체류에 기인하여 종양 침투를 감소시킬 수 있음이 가능하다.
니모-CAR+ T 세포 치료는 정상 신장 상피 세포 상에서 측정된 EGFR 밀도보다 약 2배 더 높은 U87 상의 낮은 EGFR 밀도에 대응하여 종양 부담을 상당히 감소시키거나 미처리 마우스에 비해 마우스의 생존을 향상시키지 않았다(도 18 및 도 21). 대조적으로, 세툭스-CAR+ T 세포는 저밀도 EGFR 밀도로 3/6 마우스에서 종양 제어 및 연장된 생존을 입증했다. 니모-CAR+ T 세포 치료는 매우 낮은 EGFR 밀도를 갖는 정상 조직에 대해 세포독성 가능성을 감소시킬 수 있고, 그들은 또한 낮은 EGFR 밀도를 발현시키는 종양 이탈 변이체의 가능성을 갖는다. 그러나, 신경교아종의 실질적인 불균일성에 기인하여, 단일 표적이 특정 환자 내의 종양 세포 모두에서 발현되는 것은 어렵다(참조: Little 등, 2012; Szerlip 등, 2012). HER2-특이적 CAR+ T 세포에 의한 실험적 신경교아종 모델의 치료는 또한 HER2null 종양 세포의 이탈을 입증했다(참조: Ahmed 등, 2010; Hegde 등, 2013). 환자 종양의 프로파일링은 특정 종양 중 최대 세포수를 표적화하기 위한 항원의 조합을 동정할수있고, CAR+ T 세포에 의한 복수의 항원의 표적화는 단일 특이성을 갖는 CAR+ T 세포의 치료의 치료 효능을 향상시키는 것으로 나타났다(참조: Hegde 등, 2013). 균일한 EGFR 밀도를 갖는 U87을 사용한 생체내 실험은 환자 종양에서 항원 불균일성을 요약하지 않고, 따라서, 상이한 특이성의 CAR+ T 세포와 함께 세툭스-CAR+ T 세포 또는 니모-CAR+ T 세포의 평가는 생체내 종양 불균일성을 잘 요약할 수 있는 환자로부터 유래된 신경교아종 시험편에 대해 평가할 수 있다(참조: Ahmed 등, 2010).
예기치 않게, 세툭스-CAR+ T 세포는 T 세포 치료 7일 이내에 상당한 독성을 나타냈고, T-세포 주입 7일 이내에 6/14 마우스가 사망한다. 이전에, EGFR-특이적 CAR은 종양을 포함하지 않는 마우스에 T-세포 주입 후 48시간에 간 효소의 측청에 의해 검출가능한 생체내 독성을 전혀 갖지 않는 것으로 보고되었다(참조: Zhou 등, 2013). 이 CAR이 뮤린 항체로부터 유래되었기 때문에, EGFR-특이적 CAR이 정상 조직 상에서 뮤린 EGFR을 인식할 것 같지는 않다. 추가로, 항원의 부재하에 독성의 측정은, 이들 세포가 활성화되고, 증식하고, 측정가능한 독성에 모두 기여할 수 있는 종양 용해에 대응하여 사이토카인을 생성하므로, 종양 상의 항원을 발현시키는 환자에서 생리적 CAR+ T-세포 활성화를 복제하지 않는다(참조: Barrett 등, 2014). 사실, 본 연구에서, 적은 항원 종양을 포함하거나 종양을 전혀 포함하지 않는 세툭스-CAR+ T 세포를 사용한 마우스의 치료는 검출가능한 독성을 유도하지 않았다(도 4), 관찰된 T-세포 독성에 대한 생체내 T-세포 활성화의 역할을 강조한다.
세툭시맙이 뮤린 EGFR을 인식하지 않기 때문에, 온-표적, 오프-조직 독성은 세툭스-CAR+ T 세포-관련 독성의 원인이 아닐 것이다(참조: Mutsaers 등, 2009). 이 모델에서 세툭스-CAR 매개 독성의 가능한 메커니즘은 특이성의 손실을 유도하는 고친화성 TCR의 결합력을 향상시키기 위해 CD8 공수용체 결합의 기여에서 기재된 바와 같이, T 세포 활성화 또는 가능하게는 클러스터링, 면역 시냅스 형성 또는 항원-특이성을 감소시키는 T-세포의 세포골격과의 결합에 기인하는 세툭스-CAR의 강화된 결합력으로부터 생성되는 사이토카인-관련 독성을 포함한다(참조: Stone 등, 2013).
요약하면, 니모-CAR+ T 세포는 두개내 동소성 이종이식편 모델에서 세툭스-CAR+ T 세포와 관련된 T-세포 관련 독성 없이 항종양 활성 및 더 높은 친화성의 세툭스-CAR+ T 세포에 필적할 만한 향상된 생존을 입증한다. 대조적으로, 니모-CAR+ T 세포가 아니라 세툭스-CAR+ T 세포가 낮은 EGFR 밀도를 갖는 종양에 대해 항종양 활성을 입증한다. 이러한 발견은, 니모-CAR+ T 세포가 낮은 EGFR 밀도에 대응하여 활성을 감소시킨다는 시험관내 관찰과 일치한다.
D. 안전하게 CAR + T-세포 요법을 위한 항원의 레퍼토리를 확대
CAR+ T 세포의 안정성을 달성하기 위해 개발된 방법은 다음 3개의 주요 전략으로 분류될 수 있다: (i) CAR+ T 세포를 종양 조직에 제한하고, (ii) CAR 발현/T 세포 지속성을 제한하고, (iii) CAR-매개 T 세포 활성화를 종양에 제한한다(도 32). CCR2, CCR4 및 CXCR2와 같은 종양의 부위에 가정에서 T 세포 중 CAR과 호밍 분자의 공발현은, CAR+ T 세포를 종양의 부위에 격리한다고 기재되어 있다(참조: Peng 등, 2010; Moon 등, 2011; Di Stasi 등, 2009). CAR+ T 세포는 호밍 수용체 없는 CAR+ T 세포와 비교할 때 종양 조직에서 농축되는 반면, 호밍 수용체를 발현시키는 CAR+ T 세포의 몇 퍼센트가 종양으로 효율적으로 귀소하지 않고, 따라서, 정상 조직을 표적화할 수 있는지는 불명확하다. 마찬가지로, 종양에 의해 분비된 케모카인은 또한 조직 외상 및 치료 동안 정상 조직에서 분비될수 있다. 따라서, 이러한 치료를 외과수술, 화학요법 및 방사선과 같은 다른 치료 양식과 조합하면 치료 동안 비특이적으로 손상된 정상 조직에 T 세포를 유인하는 위험일 것이다. 일반적으로 많은 종양에서 저산소 상태로 우선적으로 발현되는 CAR의 개발은 산소 정상 상태 조직을 표적화하기 위해 CAR 발현 및 용량을 제한하기 위해 CAR을 산소-의존성 분해 도메인에 융합시킴으로써 달성되었다(참조: Chan 등, 2005). 저산소 상태에서 정상 산소 상태로 이동하는 T 세포에서 CAR의 분해가 수분 내지 수시간이 소요될 수 있기 때문에, 온-표적, 오프-조직 독성이 CAR 분해 전에 발생할 수 있는 것이 가능하다. 또한, 많은 종양의 중심이 저산소 상태인 반면, 충분한 혈관신생 말초 종양 영역은 CAR-매개 T- 세포 활성으로부터 주변 영역을 보호하는 CAR을 분해하기에 충분한 산소 농도를 가질 수 있다(참조: Vartanian 등, 2014).
시간적으로 CAR+ T 세포 존재를 제한하기 위한 전략은 T 세포의 자살 유전자 변형, 예를 들면, 일식적인 RNA 종으로서 CAR의 발현, 및 T-세포 사망을 초래하는 이량체화의 화학적 유도제(CID)에 의해 특이적으로 활성화된 iCaspase9 자살 스위치의 도입을 포함한다(참조: Zhao 등, 2010; DiStassi 등, 2011; Budde 등, 2013; Barrett 등, 2011; Barrett 등, 2013). 두 방법은 높은 침투도를 갖고, 약물 전달 또는 경시적 RNA 도입유전자 발현의 손실에 의해 아폽토시스의 유도 후 CAR+ T 세포의 거의 완전한 폐기를 초래한다. 두 전략이 영구적으로 CAR+ T 세포를 제거하기 때문에, 그들은 또한 정상 조직을 보호하면서 종양에 대한 치료 효능을 제한한다. 이러한 전략의 하나의 제한은 CAR 감소 또는 T 세포 제거 전에 정상 세포에 대한 강력한 활성이 존재하고, 독성의 단기간 제한이 없다는 것이다. T-세포 요법의 심각한 부작용은 임상 증상의 발병으로부터 급속하게 진행할 수 있고, 따라서 CAR+ T-세포 주입 순간부터 정상 조직을 보호하기 위한 전략을 갖는 것이 바람직하다(참조: Grupp 등, 2013; Porter 등, 2011).
이중-특이적 상보성 CAR은 신호전달 도메인을 해리시키고 두 특이성을 갖는 두 키메라 수용체를 발현시킴으로써 종양에서만 서로 발현된 두 항원의 공발현에 대응하여 선택성 활성화를 달성하였다. 이러한 전략에서, 완전 활성화 및 T 세포 기능이 단지 항원에 의한 공발현에 의해 CAR와 CCR의 동시 결합으로 달성되도록 하나의 특이성은 제1 세대 CAR을 발현시키기 위해 CD3ζ에 융합시키고, 상이한 상보성 특이성은 키메라 공자극 수용체(CCR)라 칭명되는 공자극 엔도도메인에 융합시킨다(참조: Wilkie 등, 2014; Lanitis 등, 2013; Kloss 등, 2013). 이 접근법은 유방암 치료를 위해 HER2 및 MUC1을 향해, 전립선암 치료를 위해 PSMA 및 PSCA를 향해, 난소암 치료를 위해 메소텔린 및 α-폴레이트 수용체를 향해 재지시된 특이성을 갖는 CAR 및 CCR의 상이한 쌍으로 안내되었다. 초기 연구는, T-세포 활성화 및 용해 기능이 CCR 활성화의 부재하에 제1 세대 CAR 발현을 통해표적을 발현시키는 단일 항원에 대해 발생할 수 있다는 것을 입증했다. 이 세포독성은 제2 세대 CAR을 사용하여 관찰된 것보다 낮지만, 단일 항원을 발현시키는 정상 조직을 표적화하는 CAR의 일부 잔류 위험이 여전히 존재한다(참조: Wilkie 등, 2014; Lanitis 등, 2013). 이 제한을 극복하는 하나의 전략은 단일 항원 및 독성에 의해 활성화될 때 거의 T 세포 기능이 단지 CCR의 결찰에 의해 구조되게 하지 않도록 차선 친화성을 갖는 제1 세대 CAR을 개발하는 것이다(참조: Kloss 등, 2013). 그러나, 이 전략은 종양 항원에 대한 T 세포 감도를 둔화시킴으로써 기능한다. 이 전략은 단일 항원 발현 조직의 인식 및 표적화를 방지하지만, 이에 의해 잠재적으로 정상 조직 독성은 감소되고, 이는 또한 항종양 활성을 감소시킨다. 추가로, 효율적인 T-세포 활성화 및 종양 제거를 위해 발현되는 두 항원에 대한 요건은 CAR 활성화할 수 있는 종양의 분획을 감소시키고 종양 이탈 변이체의 개발 가능성을 증가시킨다.
PD-1 신호전달 엔도도메인에 대한 종양에서가 아니라 정상 조직 위에서만 발견된 항원에 대한 억제성 CAR (iCAR) 융합 특이성은 정상 조직 항원의 결합에 대응하여 T-세포-매개 사멸 및 사이토카인 생산을 상당히 억제할 수 있다(참조: Fedorov 등, 2013). 인상적으로, T-세포 기능의 iCAR 억제는 가역적이고, T 세포는 종양 항원과 만남시 후속적인 기능적 생산 반응할 수 있다. 이러한 전략의 성공은 CAR, iCAR 및 두 항원의 화학량론에 의존한다. 따라서, 정상 조직 독성이, iCAR 발현 또는 항원이 압도적인 CAR/종양 항원 발현의 존재하에 불충분한 경우, 발생할 수 있었다는 것을 예측하는 것이 타당하다. 이 화학량론 매개변수는 평가하고, 이 전략이 성공하기 위해 항원의 각 세트에 대해 엄격히 제어해야 한다.
종양 조직 상의 높은 EGFR 밀도에 대응하여 T-세포 세포독성을 매개하면서, 정상 조직 상의 EGFR의 저밀도에 대응하여 CAR+ T 세포의 활성화를 완화시키기 위해 CAR 설계에 사용된 scFv의 친화성에 기초하여 종양의 부위에서 T-세포 활성화를 제어하는 방법이 본원에 기재된다. 이 방법의 이점은 (i) 정상 조직 독성의 감소가 종양에 대응하여 완화된 활성에 관련되지 않고, (ii) T 세포의 활성화/억제는 발현의 화학량론 및 상대적 수용체에 대한 결합이 엄격하게 제어되어야 하는 복수의 항원의 인식을 필요로 하지 않는다는 것이다. 추가로, T 세포 활성화를 위한 복수의 항원을 필요로 하면 효율적으로 표적화될 종양의 비율을 추가로 감소시킨다. T-세포 온-표적, 오프-조직 독성을 제한하는 방법 중 어떤 것도 서로 배타적이지 않고, 복수의 전략의 조합은 정상 조직 파괴의 회피를 향상 제공할 수 있다.
E. 임상적 의미
신경교아종 환자는 암 면역요법을 위한 EGFR에 특이적인 T 세포의 안전성의 초기 평가를 위한 이상적인 환자 집단일 수 있다. EGFR은 신경교아종 환자의 40 내지 50%에서 과발현된다(참조: Parsons 등, 2008; Hu 등, 2013). 추가로, EGFR 발현은 정상 뇌 조직에서 보고되지 않는다(참조: Yano 등, 2003). EGFR이 정상 상피 표면에서 광범위하기 때문에, 종양 절제 후 T 세포의 강내 전달은 CNS의 외측 상피 표면과의 상호작용 가능성을 최소화하면서 항종양 잠재성을 최대화할 수 있다. 신경교아종 환자에서 초기 안전성 평가 후, EGFR-특이적 CAR+ T 세포 요법을 유방, 난소, 폐, 두경부, 결장직장 및 신장 세포 암종을 포함하는 다른 EGFR-발현 악성종양으로 확장시키는 것이 가능할 수 있다(참조: Hynes 등, 2005).
T 세포의 RNA 변형을 통한 CAR의 일시적 발현이 CAR+ T 세포의 제한된 존재에 기인하여 감소된 항종양 효능을 초래할 수 있지만, 특히 칭량된 초기 중량으로 RNA-변형 T 세포의 복수의 주입은, 고도의 백혈병 뮤린 모델에서 RNA 전송에 의해 변형된 CD19 CAR+ T 세포로 이미 입증된 바와 같이, 이러한 잠재력 제한을 극복할 수 있다(참조: Barrett 등, 2013). RNA 발현에 의해 전송된 메소텔린 특이적 CAR을 사용한 임상 시험은 반복된 CAR 주입에 대응하여 CAR 잔기에 특이적인 IgE 항체 반응의 발생에 기인하는 아나필락시스의 가능성을 입증하지만, CAR+ T 세포 주입과 21일 동안 완료될 치료 사이 10일 이하에 의한 투여 전략이 IgG 항체의 IgE 항체로의 아이소타입 스위칭을 회피하기 위해 제안되었고, 현재 평가되고 있다(참조: Maus 등, 2013). 이러한 도전에도 불구하고, 임상 적용에서 CAR을 발현시키는 RNA 변형의 다수의 매력적인 이점이 존재한다. 먼저, T 세포의 RNA-변형은 도입유전자의 게놈 통합을 포함하지 않고, 따라서 CAR+ T 세포 요법의 임상전 개발 기간을 단축시킬 수 있는 규제 승인에 덜 귀찮은 공정에 대한 잠재력을 갖는다. 또한, RNA 전송에 의한 CAR-변형 T 세포의 생성은 T 세포의 DNA-변형에 필요한 바와 같은 생체외 배양 시간의 약 절반에 >90% CAR+ T 세포를 초래하는 슬리핑 뷰티 트랜스포손/트랜스포사제 시스템을 사용하는 DNA-변형보다 훨씬 더 빠르다. 규제 승인 공정의 속도 및 생체외 제조 시간을 향상시키면 새로운 CAR+ T 세포 요법이 병원에서 점점 더 빨라지게 하고, 실험대에서 침상까지(from bench-to-bedside) 통신 시간을 빠르게 하고 다시 임상적 적용을 위한 이러한 요법의 미세한 조정에서 향상된 효율을 중재할 수 있게 할 수 있었다.
RNA-변형은 또한 안전성의 추가의 척도로서 영구적으로 통합된 CAR을 평가하기 전에 CAR 구조의 안전성 프로파일을 결정하기 위해 환자에서 광범위하게 발현된 정상 조직 항원, 예를 들면, EGFR에 특이적인 일시적으로 변형된 T 세포를 시험하기 위한 플랫폼을 제공할 수 있다. 세툭스-CAR이 낮은 EGFR 밀도에 대응하여 T-세포 활성화 및 용해 활성을 입증하기 때문에, 세툭스-CAR을 영구적으로 발현시키는 T 세포의 DNA-변형은 정상 조직 독성의 고위험에 기인하여 실행가능한 임상 전략일 가능성이 없다. 그러나, RNA 전송에 의해 변형된 니모-CAR+ T 세포의 초기 임상 평가는 장기간 정상조직 독성 문제를 완화시키기 위한 일시적인 CAR 발현의 추가의 안전성 특징으로 정상 조직 독성을 매개하는 니모-CAR+ T 세포의 능력을 결정할 수 있다.
저밀도 EGFR에 대한 세포독성을 매개하는 니모-CAR+ T 세포의 감소된 능력은 정상조직 독성을 감소시키도록 기능하지만, 이는 또한 저밀도에서 EGFR을 발현시키는 종양 이탈 변이체의 성장 가능성을 증가시키는 저밀도 EGFR을 발현시키는 종양에 대한 유효성을 감소시킬 수 있다. 이와 대조적으로, EGFR 발현의 모든 수준에 대한 세툭스-CAR+ T 세포의 특이적 용해활성은 종양 이탈 변이체를 발현시키는 낮은 EGFR의 성장 위험을 감소시킬 수 있지만, 낮은 EGFR 발현을 갖는 정상 조직에 대한 잠재적 독성의 희생으로 그렇게 한다. 또한, 세툭스-CAR+ T 세포는 아마도 향상된 사이토카인 생산 또는 국소 염증의 유도에 기인하여 EGFR의 중간 밀도를 발현시키는 두개내 U87의 치료에서 입증된 바와 같이, EGFR을 발현시키는 정상 조직의 표적화와 독립적으로 어느 정도의 T-세포 관련 독성을 매개하는 것으로 나타난다. 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포 사이의 관계는 유전자-변형 T 세포 요법의 안전성과 효능 사이에 달성되어야 하는 균형을 강조한다. 어떤 전략이 양호한 임상 결과를 갖는지를 선택하면, 증가된 독성의 위험이 있지만 더 큰 종양 제어 가능성을 갖는 세툭스-CAR+ T 세포 또는 감소된 독성의 위험이 있지만, 종양 이탈 변이체의 개발 가능성을 갖는 니모-CAR+ T 세포는 간단한 해결책을 갖지 않는다. 이 균형에 대처하기 위한 하나의 잠재적 임상 전략은 낮은 EGFR-발현 종양 세포를 제거하기 위해 RNA에 의해 변형된 세툭스-CAR+ T 세포의 다수 주입과 조합된 높은 EGFR-발현 종양 변이체의 안정한 제어를 위해 DNA로 변형된 니모-CAR+ T 세포를 주입하는 것일 수 있다.
II. 정의
용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들면, 인공 T-세포 수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 의미할 수 있고, 특정 면역 이펙터 세포 위에 인공 특이성을 이식하는 유전자조작된 수용체를 포함한다. CAR은 T 세포 위에 모노클로날 항체의 특이성을 부여하고, 이에 의해, 예를 들면, 입양 세포 요법에서 사용하기 위해 다수의 특정 T 세포가 생성되도록 하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 세포의 특이성을, 예를 들면, 종양 관련 항원에 지시한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정 국면에서, CAR은 CD3-제타 막관통 도메인 및 엔도도메인에 융합된 모노클로날 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편(scFv)의 융합을 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체(예: 펩티드)의 리간드로부터 또는 패턴-인식 수용체, 예를 들면, 덱틴으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, B-계통 분자, CD19에 특이적인 CAR을 사용함으로써 T 세포의 특이성을 재지시함으로써 악성 B 세포를 표적화할 수 있다. 특정 구현예에서, 항원-인식 도메인의 간격은 활성화-유도 세포사를 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 및/또는 OX40과 같은 추가의 공자극 신호전달을 위한 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 분자는 프로드럭의 첨가시 T 세포를 조건부로 제거하는 유전자 생성물, 호밍 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 영상화하기 위한(예: 양전자 방출 단층 촬영용) 공자극성 분자, 리포터 유전자를 포함하여 CAR과 공발현될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "T-세포 수용체 (TCR)"는, 일부 세포에서, TCR이 감마 및 델타 (γ/δ) 쇄로 이루어지지만, 알파(α) 및 베타(β) 쇄의 헤테로다이머로 구성된 T 세포 상의 단백질 수용체를 의미한다. 일부 구현예에서, TCR은, 예를 들면, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 메모리 T 세포, 조절 T 세포, 천연 킬러 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하는 TCR을 포함하는 임의의 세포 상에서 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 일반적으로 체액성 면역 반응 및/또는 B 및/또는 T 림프구의 생산을 유도하는 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "종양-관련 항원" 및 "암 세포 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 각 경우에, 상기 용어는 암 세포에 의해 특이적으로 또는 우선적으로 발현되는 단백질, 당단백질또는 탄수화물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체를 치료하거나 대상체에서 세포를 선택적으로 표적화하는과 관련하여 구 "이를 필요로 하는"은 표적 항원 (또는 표적 항원의 상승된 수준)을 발현시키는 세포의 선택적 사멸의 덕을 볼 수 있는 질환 상태를 갖는 대상체를 의미한다. 일부 국면에서, 질환 상태는 대상체에서 비암성 세포에 비해 표적 항원의 상승된 수준을 발현시키는 암일 수 있다. 예를 들면, 암은 대상체에서 비암성 세포에 비해 EGFR의 상승된 수준을 발현시키는 신경교종일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, CAR T-세포 또는 CAR T-세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관하여 구 "유효량"은, 대상체에게 투여된 경우, CAR에 의해 결합된 표적 항원을 발현시키는 (또는 의 상승된 수준을 발현시키는) 세포를 사멸시키기에 충분한 CAR T-세포의 양을 의미한다.
III. 키메라 항원 수용체
본원에 기재된 구현예는 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 생성 및 동정을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 면역원성(hCAR)을 감소시키기 위해 인간화된다.
일부 구현예에서, CAR는 하나 이상의 항원 사이에 공유 스페이서로 구성된 에피토프를 인식할 수 있다. 덱틴-1과 같은 패턴 인식 수용체는 탄수화물 항원에 대한 특이성을 도출하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역, 모노클로날 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 영역은 scFv이다. 다른 구현예에서, 수용체 또는 세포상 표적에 결합하는 펩티드(예: 사이토카인)는 CAR의 결합 영역에서 scFv 영역을 위한 가능성으로 포함되거나 scFv 영역을 치환할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, CAR은 복수의 scFv 영역 및/또는 다른 표적화 단백질을 코딩하는 복수의 벡터로부터 생성될 수 있다. 상보성 결정 인자(CDR)는 항원을 보완하고, 따라서 그 특정 항원에 대한 이의 특이성을 갖는 수용체를 제공하는 항원 수용체(예: 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견된 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각 폴리펩티드 쇄는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체는 전형적으로 두 개의 폴리펩티드 쇄로 구성되기 때문에, 항원과 접촉될 수 있는 각항원 수용체에 대해 6개의 CDR이 존재하고 - 각각의 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 면역글로불린 및 T-세포 선택성과 관련되는 대부분의 서열 변동에 일반적으로 CDR에서 발견되기때문에, 이러한 영역은 때로 초가변 도메인으로서 칭명된다. 이들 중에서, CDR3은 VJ (중쇄 및 TCR αβ 쇄의 경우 VDJ) 영역의 재조합에 의해 코딩될 때 최대 가변성을 나타낸다.
구현예를 통해 생성된 CAR-코딩 핵산은 인간 환자를 위한 세포 면역요법을 향상시키기 위해 1개 이상의 인간 유전자 또는 유전자 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전장 CAR cDNA 또는 코딩 영역은 본원에 기재된 방법을 통해 생성될 수 있다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 다음에 기재된 것들과 같은 특정 인간 모노클로날 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다: U.S. 특허 7,109,304, 본원에 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, scFv는 인간 항원 특이적 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv 영역은 인간 세포에서의 발현을 위해 인간 코돈 사용빈도를 위해 최적화된서열에 의해 코딩된 항원-특이적 scFv이다.
CAR의 항원-결합 도메인의 배열은 디아바디 또는 다량체와 같은 다중결합일 수 있다. 다량체는 디아바디로서 칭명될 수 있는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 교차 쌍형성에 의해 형성될수 있다. CAR의 힌지 영역은 일부 구현예에서 단축되거나 배제될 수 있다(즉, 단지 항원 결합도메인, 막관통 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 생성한다). 힌지의 다양성은 예를 들면, 표 1에 제시된 바와 같이, 본 구현예와 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 유지된 제1 시스테인을 갖거나, 또는 프롤린 또는 세린 치환에 의해 돌연변이되거나 또는 제1 시스테인까지 절단될 수 있다. Fc 부분은 구현예에 따라 CAR을 생성하기 위한 항원-결합 영역으로서 사용된 scFv로부터 결실될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 영역은 Fc 도메인 중 하나만, 예를 들면, 인간 면역글로불린으로부터 CH2 또는 CH3 도메인을 코딩할 수 있다. 하나는 또한 이량체화 및 올리고머화를 향상시키기 위해 변형된 인간 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 8 내지 14개 아미노산 펩티드(예: 12개 AA 펩티드), CD8α의 부분 또는 IgG4 Fc를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD8 알파와 같은 올리고머화를 촉진하는 도메인을 사용하여 세포 표면으로부터 현탁될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체(mAb) 클론 2D3에 의해 인식되는 도메인을 사용하여 세포 표면으로부터 현탁될 수 있다(예를 들면, 다음 문헌에 기재된 mAb 클론 2D3: Singh 등, 2008).
CAR의 엔도도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 CAR을 포함하는 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중의 적어도 하나의 활성화를 유발하거나 촉진시킬 수 있다. 예를 들면, 엔도도메인은, 예를 들면, 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성과 같은 T 세포의 이펙터 기능을 촉진시킬 수 있다. 순수한, 메모리 또는 메모리-유형 T 세포에서 이펙터 기능은 항원-의존성 증식을 포함할 수 있다. 용어 "세포내 신호전달 도메인" 또는 "엔도도메인"은 이펙터 기능 신호를 형질도입하고/하거나 세포가 특수한 기능을 실행하도록 지시할 수 있는 CAR의 부분을 의미한다. 전체 세포내 신호전달 도메인이 CAR에 포함될 수 있지만, 일부 경우에, 엔도도메인의 절단 부분이 포함될 수 있다. 일반적으로, 엔도도메인은 절단된 엔도도메인을 포함하고, 여기서 절단된 엔도도메인은 세포에서이펙터 기능 신호를 형질도입하는 능력을 유지시킨다
일부 구현예에서, 엔도도메인은 T-세포 수용체의 제타 쇄 또는 임의의 이의 동족체(예: 에타, 델타, 감마 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호전달 분자의 조합, 예를 들면, CD3ξ 및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40, 및 이의 조합 뿐만 아니라 다른 유사 분자 및 단편을 포함한다. 활성화 단백질 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분, 예를 들면, FcγRIII 및 FcRI이 사용될 수 있다. 이러한 대안의 막관통 및 세포내 도메인의 예는 다음에서 찾을 수 있다: 예를 들면, Gross 등 (1992), Stancovski 등 (1993), Moritz 등 (1994), Hwu 등 (1995), Weijtens 등 (1996), and Hekele 등 (1996), 이는 전문이 본원에 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, 엔도도메인은 인간 CD3ξ 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
항원-특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호전달-도메인은 바람직하게는 막관통 도메인에 의해 연결된다. CAR에 포함될 수 있는 막관통 도메인은, 예를 들면, 인간 IgG4 Fc 힌지 및 Fc 영역, 인간 CD4 막관통 도메인, 인간 CD28 막관통 도메인, 막관통 인간 CD3ξ-도메인, 또는 시스테인 돌연변이 인간 CD3ξ-도메인, 또는, 예를 들면, CD16 및 CD8 및 에리트로포이에틴 수용체와 같은 인간 막관통 신호전달 단백질로부터의 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인의 예는, 예를 들면, 표 1에 제공된다.
일부 구현예에서, 엔도도메인은, 예를 들면, 변형된 CD28 세포내 신호전달 도메인, 또는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, 또는 4-1BB (CD137) 공자극 수용체와 같은 공자극 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ξ에 의해 개시된 기본 신호 둘 다, 인간 공자극 수용체에 의해 제공된 추가의 신호는 생체내 지속성 및 입양 면역요법의 치료 성공을 향상시키는 것을 보조할 수 있는 형질전환 T 세포를 보다 효과적으로 활성화시키기 위해 CAR에 포함될 수 있다. 표 1에 언급된 바와 같이, 엔도도메인 또는 세포내 수용체 신호전달 도메인은CD3의 제타 쇄를 단독으로 또는 다음과 같은 Fcγ RIII 공자극 신호전달 도메인과 함께 포함할 수 있다: 예를 들면, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, 4-1BB. 일부 구현예에서, 엔도도메인은 하나 이상의 TCR 제타 쇄의 일부 또는 모두, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2R베타/CD122, IL-2R알파/CD132, DAP10, DAP12 및 CD40을 포함한다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4개 이상의 세포질 도메인이 엔도도메인에 포함될 수 있다. 예를 들면, 일부 CAR에서, 함께 융합된 적어도 둘 또는 세 개의 신호전달 도메인은 추가 또는 상승 효과를 초래할 수 있다는 것이 관찰되었다.
일부 국면에서, CAR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 핵산 세그먼트 및 발현 카세트가 생성될 수 있다. 다양한 벡터가 사용될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 T 세포와 같은 면역으로 CAR을 코딩하는 DNA의 전달이 가능하게 할 수 있다. CAR 발현은, 예를 들면, MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터 또는 유비퀴틴 프로모터와 같은 규제된 진핵생물 프로모터의 조절하에 할 수 있다. 또한, 벡터는, 다른 이유가 없다면, 그들의 시험관내 조작을 촉진하기 위해 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 DNA 주형으로부터 시험관내 전사된 mRNA로부터 발현될 수 있다.
키메라 항원 수용체 분자는 재조합체이고, 모두 항원을 결합하고 이들의 세포질 테일에 존재하는 면역수용체 활성화 모티프(ITAM's)를 통해 활성화 신호를 형질도입하는 이들의 능력에 의해 구별된다. (예를 들면, 단일 쇄 항체(scFv)로부터 생성된) 항원-결합 잔기를 이용하는 수용체 작제물은 그들이 HLA-독립 양식으로 표적 세포 표면에서 천연 항원에 결합할 수 있다는 "보편적"인 추가의 이점을 제공한다. 예를 들면, scFv 작제물은 CD3 복합체 제타 쇄(ξ), Fc 수용체 감마 쇄 및 스카이 티로신 키나제의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 융합될 수 있다(참조: Eshhar 등, 1993; Fitzer-Attas 등, 1998). CTL에 의한 종양 인식 및 용해를 포함하는 재지시된 T 세포 이펙터 메커니즘은 다수의 뮤린 및인간 항원-scFv: 시스템으로 기재되어 있다(참조:Eshhar 등, 1997; Altenschmidt 등, 1997; Brocker 등, 1998).
항원 결합 영역은, 예를 들면, 인간 또는 비인간 scFv로부터 기인할 수 있다. 뮤린 모노클로날 항체와 같은 비인간 항원 결합 영역을 사용하는 경우 하나의 가능한 문제는 인간 이펙터 기능의 감소 및 종양 괴상을 침투하는 능력의 감소이다. 또한, 비인간 모노클로날 항체는 외래 단백질로서 인간 숙주에 의해 인식될 수 있고, 따라서 이러한 외래 항체의 반복 주사는 유해한 과민성 반응을 유도하는 면역 반응의 유도로 이어질 수 있다. 뮤린 기반 모노클로날 항체의 경우, 이 효과는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응으로서 칭명되어왔다. 일부 구현예에서, CAR에 인간 항체 또는 scFv 서열을 포함시키면 일부 뮤린 항체와 비교하여HAMA 반응을 거의 또는 전혀 초래할 수 없다. 유사하게, CAR에 인간 서열의 포함은 수령자에 존재하고 HLA에 기초하여 처리된 항원을 인식할 수 있는 내인성 T 세포에 의해 면역-매개 인식 또는 제거 위험을 감소시키거나 피하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 다음을 포함한다: a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막관통 도메인, c) 힌지 영역 및 d) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인 및 막관통 도메인은 힌지 영역을 코딩하는 벡터 및 항원 결합 영역을 코딩하는 벡터와 (예를 들면, 트랜스포손 지시된 상동성 재조합을 통해) 융합될 수 있는 단일 벡터에 의해 엔도도메인으로 코딩된다. 다른 구현예에서, 세포내 신호전달 영역 및 막관통 영역은 (예를 들면, 트랜스포손 지시된 상동성 재조합을 통해) 융합된 두 개의 별도의 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로서 칭명되기도 하는 CAR의 항원-특이적 부분은 종양 관련 항원을 선택적으로 표적화한다. 종양 관련 항원은 그것이 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 한 임의의 종류일 수 있다. 구현예를 통해 생성된 CAR로 표적화될 수 있는 종양 관련 항원의 예는 다음을 포함한다: 예를 들면, CD19, CD20, 알 배아 항원, 알파페토프로테인, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피성 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, 덱틴-1 등. 일부 구현예에서, CAR의 항원 특이적 부분은 scFv이다. 종양 표적화 scFv의 예는 표 1에 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은, 예를 들면, 소량의 종양 관련 항원이 존재할 경우 지속성을 향상시키기 위해 멤브레인-결합 사이토카인과 공발현될 수 있다. 예를 들면, CAR은 멤브레인-결합 IL-15와 공발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 다음과 같은 세포내 종양 관련 항원: 예를 들면, HA-1, 서비빈, WT1 및 p53은 CAR로 표적화될 수 있다. 이는 HLA의 문맥에서 세포내 종양 관련 항원으로부터 기재된 처리 펩티드를 인식하는 범용 T 세포 상에서 발현된 CAR에 의해 달성될 수 있다. 또한, 범용 T 세포는 HLA의 문맥에서 세포내 처리 종양 관련 항원을 인식하는 T-세포 수용체 쌍을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
구현예에 따라서 사용하기 위한 표적 항원의 추가의 예는, 제한 없이, CD19, CD20, ROR1, CD22 암 배아 항원, 알파페토프로테인, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 전립선-특이적 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, HER2/Neu, 엽산 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, GP240, CD-33, CD-38, VEGFR-1, VEGFR-2, CEA, FGFR3, IGFBP2, IGF-1R, BAFF-R, TACI, APRIL, Fn14, ERBB2 또는 ERBB35T4, MUC-1, 및 EGFR을 포함한다. 특정의 특이적 국면에서, 구현예의 선택된 CAR은 CDR 또는 다음에 나타낸 바와 같은 니모투주맙의 항원 결합 부분을 포함한다: 서열번호: 1-2. 예를 들면, CAR은 다음을 포함할 수 있다: VL CDR1 RSSQNIVHSNGNTYLD (서열번호: 5); VL CDR2 KVSNRFS (서열번호: 6); VL CDR3 FQYSHVPWT (서열번호: 7); VH CDR1 NYYIY (서열번호: 8); VH CDR2 GINPTSGGSNFNEKFKT (서열번호: 9) 및 VH CDR3 QGLWFDSDGRGFDF (서열번호: 10), 다음을 참조한다: 예를 들면, Mateo 등, 1997, 본원에 참조로 인용된다. 추가의 특정 국면에서, 구현예의 CAR은 CDR 또는 다음에 나타낸 바와 같은 세툭시맙의 항원 결합 부분을 포함한다: 서열번호: 3-4. 예를 들면, CAR은 다음을 포함할 수 있다: VL CDR1 RASQSIGTNIH (서열번호: 11); VL CDR2 ASEIS (서열번호: 12); VL CDR3 QQNNNWPTT (서열번호: 13); VH CDR1 NYGVH (서열번호: 14); VH CDR2 VIWSGGNTDYNTPFTS (서열번호: 15) 및 VH CDR3 ALTYYDYEFAY (서열번호: 16), 다음을 참조한다: 예를 들면, 국제 (PCT) 특허 공보. WO2012100346, 본원에 참조로 인용된다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 국면에서, 항원에 결합하는 선택된 CAR은 항원에 대해 약 2nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖고, 여기서 선택된 CAR을 포함하는 T-세포는 항원을 발현시키는 표적 세포(예: 암 세포)에 대한 세포독성을 나타낸다. 예를 들면, 일부 국면에서, CAR은 항원에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20nM 이상의 Kd를 갖고, 선택된 CAR을 포함하는 T-세포는 항원을 발현시키는 표적 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 또 다른 국면에서, CAR은 항원에 대해 약 5nM 내지 약 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50nM의 Kd를 갖는다. 또 다른 국면에서, CAR은 항원에 대해 약 5nM 내지 500nM, 5nM 내지 200nM, 5nM 내지 100nM 또는 5nM 내지 50nM의 Kd를 갖고, 선택된 CAR을 포함하는 T-세포는 항원을 발현시키는 표적 세포에 대한 세포독성을 나타낸다.
일부 국면에서, 구현예의 선택된 CAR은 CAR 분자당 2, 3, 4개 이상의 항원 분자에 결합할 수 있고, 선택된 CAR을 포함하는 T-세포는 항원을 발현시키는 표적 세포(예: 암 세포)에 대한 세포독성을 나타낸다. 일부 국면에서, 선택된 CAR의 항원 결합 도메인의 각각은 항원에 대해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20nM 이상의 Kd를 갖고, 선택된 CAR을 포함하는 T-세포는 항원을 발현시키는 표적 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 또 다른 국면에서, 선택된 CAR의 항원 결합 도메인의 각각은 항원에 대해 약 5nM 내지 약 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50nM의 Kd를 갖고, 선택된 CAR을 포함하는 T-세포는 항원을 발현시키는 표적 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 또 다른 국면에서, 선택된 CAR의 항원 결합 도메인의 각각은 항원에 대해 약 5nM 내지 500nM, 5nM 내지 200nM, 5nM 내지 100nM 또는 5nM 내지 50nM의 Kd를 갖고, 선택된 CAR을 포함하는 T-세포는 항원을 발현시키는 표적 세포에 대한 세포독성을 나타낸다.
CAR에 의해 인식될 수 있는 병원체는 본질적으로 임의의 종류의 병원체일 수 있지만, 일부 구현예에서, 병원체는 진균, 세균 또는 바이러스이다. 예시적인 바이러스 병원체는 아데노바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), JC 바이러스, BK 바이러스, HSV, HHV 패밀리 바이러스, 피코르나바이러스과, 헤르페스바이러스과, 헤파드나바이러스과, 플라비바이러스과, 레트로바이러스, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 파포바이러스과, 폴리오마바이러스, 라브도바이러스 및 토가바이러스과 패밀리의 것들을 포함한다. 예시적인 병원성 바이러스는 천연두, 인플루엔자, 유행성 이하선염, 홍역, 수두, 에볼라 및 풍진의원인이다. 예시적인 병원성 진균은 칸디다(Candida), 아스페르길루스( Aspergillus ), 크립토코쿠스( Cryptococcus ), 히스토플라스마 (Histoplasma), 뉴모시스티스 ( Pneumocystis ) 및 스타키보트리스(Stachybotrys)를 포함한다. 예시적인 병원성 세균은 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 슈도모나스( Pseudomonas ), 시겔라 ( Shigella ), 캠필로박터 (Campylobacter), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 헬리코박터( Helicobacter ), 이. 콜리 (E. coli ), 리케차(Rickettsia), 바실러스 (Bacillus), 보르데텔라 (Bordetella), 클라미디아( Chlamydia ), 스피로헤타(Spirochetes), 및 살로넬라(Salmonella)를 포함한다. 일부 구현예에서, 병원체 수용체 덱틴-1은 아스페르길루스와 같은 진균의 세포벽 상의 탄수화물 구조를 인식하는 CAR을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, CAR은 바이러스 감염 및 병리를 중단하는 바이러스 결정인자(예: CMV 및 에볼라로부터 당단백질)를 인식하는 항체에 기초하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 노출된 DNA 또는 CAR을 코딩하는 적합한 벡터는 대상체의 T 세포에 도입될 수 있다(예: 암 또는 다른 질환을 갖는 인간 환자로부터 수득된 T 세포). 노출된 DNA를 사용하는 전기천공에 의해 T 세포를 적합하게 형질감염시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 다음을 참조한다: 예를 들면, U.S. 특허 제 6,410,319호. 노출된 DNA는 일반적으로 발현에 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 구현예의 키메라 수용체를 코딩하는 DNA를 의미한다. 일부 구현예에서, 노출된 DNA의 사용은 구현예의 방법을 통해 생성된 CAR을 발현시키는 T 세포를 생성하는데 필요한 시간을 감소시킬 수 있다.
또는, 바이러스 벡터(예: 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)는 키메라 작제물을 T 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 대상체의 T 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 CAR을 코딩하는 벡터는 일반적으로 대상체의 T 세포에서 비복제되어야 한다. 바이러스를 기초로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있고, 여기서 세포에서 유지된 바이러스의 카피수는 세포의 생존능력을 유지시키기에 충분히 낮다. 예시적인 벡터는 pFB-네오 벡터 (STRATAGENE®) 뿐만 아니라 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기초하는 벡터를 포함한다.
형질감염되거나 형질도입된 T 세포가 목적하는 규제로 목적하는 수준에서 표면 멤브레인 단백질로서 CAR을 발현시킬 수 있다는 것이 확립되면, 키메라 수용체가 목적하는 신호 유도를 제공하기 위해 숙주 세포에서 기능적인지의 여부를 결정할 수 있다. 후속적으로, 형질도입된 T 세포는 대상체에서 항종양 반응을 활성화하기 위해 대상체에게 재도입되거나 투여될 수 있다. 투여를 촉진하기 위해, 형질되입된 T 세포는 약제학적 조성물로 제조될 수 있거나, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 적합한 담체 또는 희석제와 함께 생체내 투여하기에 적합한 이식체로 제조될 수 있다. 이러한 조성물 또는 이식체를 제조하기 위한 수단은 당해 기술 분야에 기재되어 있다(참조: 예를들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)). 적절한 경우, CAR을 발현시키는 형질도입된 T 세포는 이들의 각각의 투여 경로에 통상적인 방식으로 반고체 또는 액체 형태의 제제, 예를 들면, 캡슐, 용액, 주사제, 흡입제 또는 에어로졸로 제형화될 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 수단은 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를방지하거나 최소화하기 위해 또는 조성물의 시간 제한 방출을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 키메라 수용체를 발현시키는 세포를 유효하게 하는 약제학적으로 허용되는 형태가 바람직하게 사용된다. 따라서, 바람직하게 형질도입된 T 세포는 행크스 균형 염 용액과 같은 균형 염 용액, 또는 생리 식염수를 함유하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
IV. 구현예와 관련된 방법 및 조성물
특정 국면에서, 본원에 기재된 구현예는 T 세포를 hCAR을 코딩하는 DNA 작제물을 함유하는 발현 벡터로 형질감염시킨 다음, 임의로, 세포를 항원 양성 세포, 재조합 항원 또는 세포 증식을 일으키는 수용체에 대한 항체로 자극함을 포함하는 항원-특이적 재지시 T 세포를 제조하고/하거나 확대시키는 방법을 포함한다.
또 하나의 국면에서, 전기천공, 또는 노출된 DNA를 사용하는 다른 비바이러스성 유전자 전송(예를 들면, 소노포레이션에 제한되지 않는다)에 의해 T 세포를 안정하게 형질감염시키고 재지시하는 방법이 제공된다. 대부분의 연구자들은 T 세포에 이종 유전자를 운반하기 위해 바이러스 벡터를 사용했다. 노출된 DNA를 사용함으로써, 재지시된 T 세포를 생성하는데 필요한 시간이 감소될 수 있다. "노출된 DNA"는 발현에 적절한 배향으로 발현 카세트 또는 벡터에 함유된 키메라 T-세포 수용체(cTCR)를 코딩하는 DNA를 의미한다. 구현예에 따르는 전기천공 방법은 키메라 TCR (cTCR)을 발현시키고 이들의 표면으로 운반하는 안정한 형질감염체를 생성한다.
특정 국면에서, T 세포는 1차 인간 T 세포, 예를 들면, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC), G-CSF로 자극 후 수집된 PBMC, 골수 또는 제대혈로부터 유래된 T 세포이다. 조건은 mRNA 및 DNA와 전기천공의 사용을 포함한다. 형질감염 후, 세포는 즉시 주입될 수 있거나 또는 저장될 수 있다. 특정 국면에서, 형질감염 후, 세포는 세포로 유전자 전송 후 약 1, 2, 3, 4, 5일 이상 이내에 벌크 집단으로서 수일, 수주 또는 수 개월 동안 생체외 증식될 수 있다. 추가의 국면에서, 형질감염 후, 형질감염체는 클로닝되고, 클론은 단일 통합되거나 에피솜 유지된발현 카세트 또는 플라스미드의 존재를 입증하고, 키메라 수용체의 발현은 생체외 확대된다. 확대용으로 선택된 클론은 표적 세포를 발현시키는 CD19를 특이적으로 인식하고 용해시키는 능력을 입증한다. 재조합 T 세포는 IL-2, 또는 통상적인 감마-쇄에 결합하는 다른 사이토카인에 의한 자극으로 확대될 수 있다(예: IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 및 기타). 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포에 의한 자극으로 확대될 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에서 CD3를 교차 연결하는 OKT3과 같은 항체로 확대될 수 있다. 제조합 T 세포의 부분집합은 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에서 CD52에 결합하는 Campath와 같은 항체로 확대될 수 있다. 추가의 국면에서, 유전적으로 변형된 세포는 냉동보존될 수 있다.
주입 후 T-세포 증식(생존)은 다음에 의해 평가될 수 있다: (i) CAR에 특이적인 프라이머를 사용한 q-PCR; (ii) CAR에 특이적인 항체를 사용한 유동 세포 분석법; 및/또는 (iii) 가용성 TAA.
본원에 기재된 구체예는 또한 재지시된 면역 T 세포를 사용하여 CD19-특이적 세포-표면 에피토프로 B 세포를 포함하는 B-세포 악성 종양 또는 장애의 표적화에 관한 것이다. 악성 B 세포는, B 세포가 T 세포를 위한 면역자극성 항원 제시 세포로서 기능할 수 있기 때문에, 재시된 T 세포를 위한 우수한 표적이다. 인간 또는 인간화 CAR을 포함하는 공여체-유래된 CD19-특이적 T-세포를 사용하는 입양 요법의 항종양 활성을 지지하는 전임상 연구는 (i) CD19+ 표적의 재지시된 사멸, (ii) CD19+ 표적/자극 세포와 함께 배양 후 사이토카인의 재지시된 분비/발현, 및 (iii) CD19+ 표적/자극 세포와 함께 배양 후 지속된 증식을 포함한다.
특정 구현예에서, CAR 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들면, 암 또는 감염을 앓는 개체에 전달된다. 이어서, 세포는 각각의 암 또는 병원성 세포를 공격하도록 개체의 면역계를 향상시킨다. 일부 경우에, 개체는 항원-특이적 CAR T-세포의 1회 이상의 용량이 제공된다. 개체에 항원-특이적 CAR T-세포의 2회 이상의 용량이 제공되는 경우, 투여 사이의 지속 기간은 개체에서 증식을 위한 시간을 허용하기에 충분해야 하고, 특정 구현예에서, 투여 사이의 지속 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상이다.
키메라 항원 수용체 둘 다를 포함하도록 변형되고 기능적 TCR이 부족한 동종이계 T 세포의 공급원은 임의의 종류일 수 있지만, 특정 구현예에서, 세포는, 예를 들면, 제대혈, 말초혈, 인간 배아 줄기 세포, 또는 유도된 다능성 줄기 세포의 뱅크로부터 수득된다. 치료 효과를 윈한 적합한 용량은, 예를 들면, 바람직하게는 일련의 투여 주기로 용량당 적어도 105 또는 약 105 내지 약 1010 세포일 것이다. 예시적인 투여 섭생은 0일째에 적어도 약 105 세포에서 시작하여, 예를 들면, 환자내 용량 점증 방식 개시의 수주 이내에 약 1010 세포의 표적 용량까지 점증적으로 증가시키는 점증 용량의 4개의 1주 투여 주기로 이루어진다. 적합한 투여 방식은 정맥내, 피하, 강내(예를 들면, 저장소-접근 장치에 의해), 복강내, 및 종양 괴상에 직접 주사를 포함한다
구현예의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 암을 치료하는데 유용한 다른 충분히 확립된 제제와 함께 사용될 수 있다. 단독으로 또는 다른 제제와 함께 전달되는지와 상관 없이, 구현예의 약제학적 조성물은 특정 효과를 달성하기 위해 다양한 경로를 통해 포유동물, 특히 인간 신체의 다양한 부위에 전달될 수 있다. 당업자는, 하나 이상의 경로가 투여에 사용될 수 있지만, 특정 경로가 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
구현예의 조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 여기서 각 투여 단위, 예를 들면, 주사액은 소정량의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성제와 적합한 조합으로 함유한다. 본원에 사용된 용어 단위 투여 형태는 인간 및 동물 대상체를 위한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고, 각 단위는 단독으로 또는 다른 활성제와 함께, 적절한 경우, 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 조합하여 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된, 구현예의 조성물의 소정량을 함유한다. 구현예의 신규 단위 투여 형태는 특정 대상체에서 약제학적 조성물과 관련된 약력학에 의존한다.
바람직하게는, 단리된 형질도입 T 세포의 유효량 또는 충분한 수가 조성물에 존재하고, 장기간 특이적 항종양 반응이 이러한 치료 부재시 다르게 발생하는 것보다 종양의 크기를 감소시키거나 종양 성장 또는 재성장을 제거하기 위해 확립되도록 대상체에 도입된다. 바람직하게는, 대상체에 재도입된 형질도입 T 세포의 양은 형질도입된 T 세포가 존재하지 않는 다른 동일한 조건과 비교하는 경우 종양 크기에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 감소를 유발한다.
따라서, 투여된 형질도입 T 세포의 양은 투여 경로를 고려해야 하고, 형질도입된 T 세포의 충분한 수가 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 도입되도록 할 정도여야 한다. 또한, 본원에 기재된 조성물에 포함된 각 활성제의 양(예: 접촉되는 각 세포당 양 또는 특정 체중당 양)은 상이한 적용에서 변할 수 있다. 일반적으로, 형질도입된 T 세포의 농도는 바람직하게는 치료될 대상체에서 적어도 약 1 × 106 내지 약 1 × 109의 형질도입된 T 세포, 더욱 더 바람직하게는 약 1 × 107 내지 약 5 × 108의 형질도입된 T 세포를 제공하기에 충분해야 하지만, 그 이상, 예를 들면, 5 × 108 세포 초과, 또는 그 이하, 예를 들면, 1 × 107 세포 미만의 임의의 적합한 양이 사용될 수 있다. 투여 스케쥴은 충분히 확립된 세포 기초 요법에 기초할 수 있다(참조: 예를 들면, Topalian and Rosenberg, 1987; U.S. 특허 제 4,690,915호), 또는 교호 연속 주입 전략이 사용될 수 있다.
이러한 값들은 구현예의 방법을 최적화할 때 의사에 의해 사용되는 형질도입된 T 세포의 범위의일반적인 지침을 제공한다. 본원에서 이러한 범위의 열거는 특정 적용에서 보증된 바와 같이, 성분의 보다 많거나 보다 적은양의 사용을 결코 배제하지 않는다. 예를 들면, 실제 용량 및 스케쥴은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 병용하여 투여되는지의 여부에 따라 또는 CAR-발현 세포에서 개체간 차이에 따라 변할 수 있다(예: 표적 항원에 대한 CAR 결합 친화성). 당업자는 특정 상황의 긴급성에 따라서 임의의 필요한 조정을 용이하게 수행할 수 있다.
V. 항원 제시 세포
일부 경우에, APC는 CAR-기반 치료 조성물 및 세포 요법 제품을 제조하는데 유용하다. 구현예에 따라 사용하기 위한 APC는 수지상 세포, 대식세포 및 인공 항원 제시 세포를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 항원 제시 시스템의 제조 및 사용에 관한 일반적 지침의 경우, 다음을 참조한다: 예를 들면, U.S. 특허 제 6,225,042호, 제6,355,479호, 제6,362,001호 및 제6,790,662호; U.S. 특허 출원 공보 제 2009/0017000호 및 제2009/0004142호; 및 국제 공보 제 WO2007/103009호).
APC는 CAR을 발현시키는 T 세포를 확대하기 위해 사용될 수 있다. 종양 항원과 접하는 동안, 항원 제시 세포에 의해 T 세포에 전달된 신호는 T-세포 프로그래밍 및이들의 후속적인 치료 효능에 영향을 미칠 수 있다. 이는 T 세포에 제공된 신호에 대해 최적의 제어를 가능하게 하는 인공 항원 제시 세포를 개발하려는 노력을 자극했다(참조: Turtle 등, 2010). 목적하는 항체 또는 항원 이외에, APC 시스템은 또한 적어도 하나의 외인성 보조 분자를 포함할수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합이 사용될 수 있다. 보조 분자는 공자극 분자 및 접착 분자와 같은 보조 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 공자극 분자는 T 세포의 표면 위의 CD28 및/또는 CTLA-4 분자에 결합함으로써, 다음에 영향을 미칠 수 있는 CD70 및 B7.1 (또한 B7 또는 CD80이라 칭명됨)을 포함한다: 예를 들면, T-세포 확대, Th1 분화, 단기간 T-세포 생존, 및 인터류킨 (IL)-2와 같은 사이토카인 분비(참조: Kim 등, 2004). 접착 분자는, 예를 들면, 세포-대-세포 또는 세포-대-매트릭스 접촉을 촉진하는 셀렉틴과 같은 탄수화물 결합 당단백질, 인테그린과 같은 막관통 결합 당단백질, 캐드헤린과 같은 칼슘 의존성 단백질, 및 단일-통과 막관통 면역글로불린 (Ig) 상과 단백질, 예를 들면, 세포내 접착 분자 (ICAM)를 포함할 수 있다. 예시적인 접착 분자는 LFA-3 및 ICAM, 예를 들면, ICAM-1을 포함한다. 공자극 분자 및 접착 분자를 포함하는 예시적 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한기술, 방법 및 시약은 다음에 예시되어 있다: 예를 들면, U.S. 특허 제 6,225,042호, 제6,355,479호, 및 제6,362,001호.
aAPC로 되도록 선택된 세포는 바람직하게는 세포내 항원-처리, 세포내 펩티드 수송, 및/또는 세포내 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자-펩티드 부하에 있어 결핍을 갖거나, 변온성(즉, 포유동물 세포주보다 온도 도전에 덜 민감함)이거나, 또는 결핍 및 변온 특성 둘 다를 포함한다. 바람직하게는, aAPC로 되도록 선택된 세포는 또한 세포에 도입된 분자 성분을 보조하는, 외인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자에 대한 적어도 하나의 내인성 대응물 (예: 상기한 바와 같은 내인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및/또는 내인성 보조 분자)을 발현시키는 능력이 부족하다. 또한, aAPC는 바람직하게 aAPC를 생성하기 위해 이들의 변형 전에 세포에 의해 포함된 결핍 및 변온 특성을 유지시킨다. 예시적인 aAPC는 항원 처리와 관련된 수송체(TAP)-결핍 세포주, 예를 들면, 곤충 세포주를 구성하거나 이로부터 유도된다. 예시적인 변온성 곤충 세포주는 초파리 세포주, 예를 들면, 슈나이더 2 세포주이다(예: Schneider, J.m 1972). 슈나이더 2 세포의 제조, 성장 및 배양을 위한 예시적 방법은 다음에 제공된다: U.S. 특허 제 6,225,042호, 제6,355,479호, 및 제6,362,001호.
APC는 동결-해동 주기에 적용할 수 있다. 예를 들면, APC는 APC를 함유하는 적합한 용기를 동결이 신속하게 발생되도록 적합한 양의 액체질소, 고체 이산화탄소(드라이 아이스) 또는 유사한 저온 물질을 접촉시킴으로써 동결될 수 있다. 이어서, 동결된 APC는 저온 재료로부터 APC의 제거 및 주위 실온 상태에의 노출에 의해 또는 미지근한 수욕 또는 따뜻한 손이 짧은 해동 시간을 촉진하기 위해 사용되는 촉진된 해동 공정에 의해 해동시킨다. 추가로, APC는 동결되고, 해동시키기 전에 장기간 저장할 수 있다. 동결된 APC는 또한 해동시킨 다음, 추가로 사용하기 전에 동결건조시킬 수 있다. 동결-해동 절차에 유해하게 영향을 미칠 수 있는 보존제, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 다른 보존제가 유리하게는 동결-해동 주기를 겪는 APC를 함유하는 배지로부터 부재하거나, 또는, 예를 들면, 본질적으로 이러한 보존제가 없는 배지에 APC를 전송시킴으로써 본질적으로 제거된다.
다른 구현예에서, 이종 핵산 및 aAPC에 내인성인 핵산은 본질적으로 불활성화 후 핵산의 어떠한세포 성장, 복제 또는 발현이 발생되지 않도록 가교결합에 의해 불활성화될 수 있다. 예를 들면, aAPC는 외인성 MHC 및 보조 분자의 발현, aAPC의 표면 상에서 이러한 분자의 제시 및 선택된 펩티드 또는 펩티드들과 함께 제시된 MHC 분자의 부하 이후의 시점에서 불활성화된다. 따라서, 이러한 불활성화되고 선택된 펩티드 부하된 aAPC는 본질적으로 증식하거나 복제할 수 없도록 하면서, 선택된 펩티드 제시 기능을 유지할 수 있다. 가교결합은 또한 aAPC의 항원 제시 세포 기능을 실질적으로 감소시키지 않고 본질적으로 오염성 미생물, 예를 들면, 세균 및 바이러스가 없는 aAPCS를 초래할 수 있다. 따라서, 가교결합은 aAPC를 사용하여 개발된 세포 요법 제품의 안전성에 관한 우려를 경감시키는것을 보조하면서 aAPC의 중요한 APC 기능을 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 가교결합 및 aAPC에 관련된 방법에 대해, 예를 들면, 다음을 참조한다: U.S. 특허 출원 공보 제 20090017000호, 이는 본원에 참조로 인용된다.
VI. 키트
본원에 기재된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 동종이계 CAR T-세포는 세포를 확대하기에 적합한 시약, 예를 들면, 배지, 항원 제시 세포(예: aAPC), 성장 인자, 항체(예를 들면, CAR T-세포를 분류하거나 특성화하기 위해) 및/또는 CAR 또는 트랜스포사제를 코딩하는 플라스미드를 또한 포함할 수 있는 키트에 제공된다.
비제한적인 예에서, 키메라 수용체 발현 작제물, 키메라 수용체 발현 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 발현 작제물의 형질감염을 위한 세포, 및/또는 발현 작제물의 형질감염을 위한 동종이계 세포를 수득하기 위한 하나 이상의 기기(이러한 기기는 주사기, 피펫, 겸자 및/또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 장치일 수 있다).
일부 구현예에서, 내인성 TCR α/β 발현을 제거하기 위한 발현 작제물, 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약 및/또는 CAR+ T 세포가 키트에 제공된다. 일부 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제(들)를 코딩하는 발현 작제물이 포함된다.
일부 국면에서, 키트는 세포의 전기천공을 위한 시약 또는 장치를 포함한다.
키트는 구현예의 하나 이상의 적합하게 분액화된 조성물 또는 구현예의 조성물을 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매체 중 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 성분이 배치되고, 바람직하게는 적절하게 분액화될 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가의 성분이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 구현예의 키트는 또한 전형적으로 키메라 수용체 작제물 및 상업적인 판매를 위해 근접하게 밀폐되는 임의의 다른 시약 용기를 포함할 것이다. 이러한 용기는, 예를 들면, 목적하는 바이알이 유지되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
VII. 실시예
다음 구체적이고 비제한적인 실시예는 단순히 예시로서 해석되어야 하고, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하지 않는다. 추가의 정교화 없이, 당업자는 본원의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 이용할 수 있는 것으로간주된다. 본원에 인용된 모든 공보는 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. URL 또는 다른 이러한 식별자 또는 주소가 참조되는 경우, 이러한 식별자는 변할 수 있고, 인터넷 상의 특정 정보는 왕래할 수 있지만, 등가의 정보는 인터넷 검색으로 발견될 수 있는 것으로 이해된다. 이에 대한 참조는 이러한 정보의 가용성 및 대중 전파를 증명한다.
실시예 1 - 재료 및 방법
플라스미드
세툭시맙 -유래 CAR 트랜스포손. 세툭시맙-유래 CAR은 다음으로 구성되어 있다: 인간 GMCSFR2 신호 펩티드 (아미노산 1-22; NP_758452.1)로부터의 신호 펩티드, 세툭시맙의 가변 경쇄 (PDB:1YY9_C) 표저 링커(AAE37780.1), 세툭시맙의 가변 중쇄 (PDB:1YY9_D), 인간 IgG4 (아미노산 161-389, AAG00912.1), 인간 CD28 막관통 및 신호전달 도메인 (아미노산 153-220, NP_006130) 및 인간 CD3-ζ 세포내 도메인 (아미노산 52 내지 164, NP_932170.1). GMCSFR2, 가변 경쇄, 표저 링커, 가변 중쇄 및 부분적 IgG4의 서열은 최적화된 인간 코돈이었고, GeneART (Regensburg, Germany)에 의해 0700310/pMK로서 생성되었다. 인간 신장 인자 1-알파(HEF1α) 프로모터의 제어하에 이미 기재된 CD19CD28mZ(CoOp)/pSBSO는 SB 트랜스포손을 위한 골격으로서 선택되었다. 0700310/pMK 및 이미 기재된 CD19CD28mZ/pSBSO (93, 94)는 NheI 및 XmnI 제한 효소에 의한이중 소화를 겪었다. CAR 삽입물 및 트랜스포손 골격은 150V에서 45분 동안 작동하는 0.8% 아가로스 겔 중의 아가로스겔 전기영동에 의해 각각 1.3 kb 및 5.2 kb의 DNA 단편으로서 동정되었고, 자외선 노광하에 가시화를 위해 브롬화에티듐으로 염색하였다. 밴드를 절제하여 정제하고(Qiaquick Gel Extraction kit, Qiagen, Valencia, CA), 이어서, T4 DNA 리가제(Promega, Madison, WI)를 사용하여 삽입물 대 골격의 몰 비 3:1로 결찰시켰다. 37 ℃에서 12 내지 16시간 동안 배양된 칸나마이신-함유 한천 플레이트 상에서 TOP10 화학적 적격 세균 (Invitrogen, Grand Island, NY)의 열 충격 형질전환 및 선택은 트랜스포손 골격을 위한 양성 세균 클론을 동정하였다. 6개의 클론은 37 ℃에서 8시간 동안 칸나마이신 선택과 함께 TB 배지에서 미니-배양을 위해 선택되었다. 미니-배양물로부터 DNA의 제조는 MiniPrep 키트 (Qiagen)를 통해 수행되었고, 제한 효소에 의한 후속적 분석 소화 및 아가로스 겔 전기영동에 의한 단편 크기의 분석은 CetuxCD28mZ (CoOp)/pSBSO에 양성인 클론을 동정하였다(도 33a). 양성 클론은 칸나마이신 항생제 선택과 함께 TB 배지 중의 큰 배양물에서 1;1000 접종하고, 37 ℃에서 16시간 동안 진탕기 상에서 로그-상 성장이 달성될 때까지 배양했다. DNA는 EndoFree Maxi Prep 키트 (Qiagen)를 사용하여 세균으로부터 단리시켰다. DNA의 분광광도계 분석은 1.8 내지 2.0 사이를 판독하는 OD260/280에 의해 순도를 확인했다.
니모투주맙 -유래 CAR 트랜스포손. 니모투주맙-유래 CAR은 다음으로 구성되어 있다: 인간 GMCSFR2 신호 펩티드 (아미노산 1-19, NP_001155003.1)로부터의 신호 펩티드, 니모투주맙의 가변 경쇄 (PDB:3GKW_L) 표저 링커 (GenBank: AAE37780.1), 니모투주맙의 가변 중쇄 (PDB:3GKW_H), 인간 IgG4 (아미노산 161-389, AAG00912.1), 인간 CD28 막관통 및 신호전달 도메인 (아미노산 153-220, NP_006130), 및 인간 CD3-ζ 세포내 도메인 (아미노산 52 내지 164, NP_932170.1). GMCSFR2, 가변 경쇄, 표저 링커, 가변 중쇄 및 부분적 IgG4의 서열은 최적화된 인간 코돈이었고, GeneART에 의해 0841503/pMK로서 생성되었다. 08541503/pMK 및 이전에 기재된 CD19CD28mZ/pSBSO (참조: Singh 등, 2013; Singh 등, 2008)은 NheI 및 XmnI 제한 효소에 의한 이중 소화를 겪었고, 플라스미드 NimoCD28mZ(CoOp)/pSBSO의 결찰, 형질전환, 대규모 증폭 및 정제(도 33b)가 상기한 바와 같이 수행되었다.
SB11 트랜스포사제. The hyperactive SB11 transposase under control of CMV 프로모터 (Kan-CMV-SB11)의 조절하의 활동 과다 SB11 트랜스포사제는 이미 기재된 바와 같이 사용되었다(참조: Singh 등, 2008; Davies 등, 2010).
pGEM / GFP /A64. 64 A-T 염기 쌍 및 SpeI 부위에 이어 T7 프로모터의 조절하의 GFP는 GFP RNA를 시험관내 전사하기 위해 사용했다. pGEM/GFP/A64의 클로닝은 이미 기재되어 있다(참조: Boczkowski 등, 2000).
세툭시맙 -유래 CAR/ pGEM -A64. 세툭시맙-유래 CAR은 CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO 및 CD19CD28mZ(CoOp)/pSBSO-MCS의 NheI 및 XmnI 이중 소화에 의해 중간 벡터, pSBSO-MCS로 클로닝되었다. 세툭스-CAR 삽입물 및 pSBSO-MCS 골격은 전기영동 후 아가로스 겔로부터 추출에 의해 단리되었고, CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO의 생성에서 기재된 바와 같이, 결찰되고, 형질전환되고 대규모로 증폭되었다 CetuxCD28mZ(CoOp)는 인공 폴리-A 테일 64 뉴클레오타이드 길이로 RNA를 시험관내 전사하기 위한 T7 프로모터의 조절하에 세툭스-CAR을 배치하기 위해 pGEM/GFP/A64 플라스미드로 클로닝했다. CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO-MCS는 37 ℃에서 NheI 및 EcoRV로 소화시킨 반면, pGEM/GFP/A64는 37 ℃에서 XbaI에 이어, 25ºC에서 SmaI로 순차적으로 소화시켰다. 소화된 세툭스-CAR 삽입물 및 pGEM/A64 골격은 150V에서 45분 동안 작동하는 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분리하고, 브롬화에티듐 염색 및 자외선 노광에 의해 가시화하였다 단편을 겔로부터 절제하고, Qiaquick 겔 추출(Qiagen)에 의해 정제하고, 3:1 삽입물 대 벡터 몰 비에서 T4 DNA 리가제 (Promega)를 사용하여 결찰시키고, 16ºC에서 밤새 배양했다. Dam -/- C2925 화학적 적격 세균 (Invitrogen)은 열 충격으로 형질전환시키고, pGEM/A64 골격을 함유하는 클론의 선택을 위해 암피실린-함유 한천 상에서 37 ℃에서 밤새 배양했다. 8개 클론을 암피실린 항생제 선택과 함께 TB 배지에서의 접종에 의한 소규묘 DNA 증폭을 위해선택하고, 37 ℃에서 8시간 동안 진탕기 상에서 배양했다. DNA의 정제는 MiniPrep 키트 (Qiagen) 및 분석적 제한 효소 소화를 사용하여 수행하였고, 후속적인 전기영동은 이 클론이 올바른 결찰 생성물, CetuxCD28mZ/pGEM-A64를 발현시키는지를 결정한다(도 33c). 암피실린을 함유하는 TB에서 1:1000 접종된 양성 클론을 선택했다. 37 ℃에서 18시간 배양 후, DNA는 EndoFree 플라스미드 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제했다. 분광광도계 분석은 1.8 내지 2.0의 OD260/280 비율로 고품질 DNA를 확인했다.
니모투주맙 -유래 CAR/ pGEM -A64. NimoCD28mZ(CoOp)/pSBSO는 37 ℃에서 NheI, 50 ℃에서 SfiI로 순차적으로 소화시킨 반면, pGEM/GFP/A64는 37 ℃에서 XbaI, 50 ℃에서 SfiI로 순차적으로 소화시켰다. NimoCD28mZ(CoOp)는 인공 폴리 A 테일 64 뉴클레오티드 길이로 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 프로모터의 제어하에 니모-CAR을 배치하기 위해 pGEM/GFP/A64 플라스미드로 클로닝했다. 소화된 니모-CAR 삽입물 및 pGEM/A64 골격은 150V에서 45분 동안 작동하는 0.8% 아가로스 겔중의 전기영동에 의해 분리하고, 브롬화에티듐 염색 및 가시광선 노광에 의해 가시화했다. 단편은 겔로부터 절제하고, Qiaquick 겔 추출 (Qiagen)에 의해 정제하고, 3:1 삽입물 대 벡터 몰 비로 T4 DNA 리가제 (Promega)를 사용하여 결찰시키고, 16ºC에서 밤새 배양했다. Dam-/- C2925 화학적 적격 세균 (Invitrogen)은 열 충격으로 형질전환시키고, pGEM/A64 골격을 함유하는 클론을 선택을 위해 암피실린 함유 한천 상에서 37 ℃에서 밤새 배양했다. 8개 클론을 암피실린 항생제 선택과 함께 TB 배지에서의 접종에 의한 소규묘 DNA 증폭을 위해선택하고, 37 ℃에서 8시간 동안 진탕기 상에서 배양했다. DNA의 정제는 MiniPrep 키트 (Qiagen) 및 분석적 제한 효소 소화를 사용하여 수행하고, 후속적전기영동은 이 클론이 올바른 결찰 생성물, NimoCD28mZ/pGEM-A64을 발현시켰는지를 결정했다(도 33d). 암피실린을 함유하는 TB에서 1:1000 접종된 양성 클론을 선택했다. 37 ℃에서 18시간 배양 후, DNA는 EndoFree 플라스미드 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제했다. 분광광도계 분석은 1.8 내지 2.0의 OD260/280 비율로 고품질 DNA를 확인했다.
절단된 EGFR 트랜스포손. 절단된 EGFR은 자기-절단가능한 펩티드 서열 F2A를 통해 네오마이신 내성 유전자에 연결된 SB 트랜스포손으로 클로닝했다. 세포외 및 막관통 도메인, 0909312 ErbB1/pMK-RQ만을 함유하는 인간 EGFR (수탁 NP_005219.2)의 코돈-최적화 절단 형태는 GeneArt (Regensburg, Germany)에 의해 합성했다. ErbB1/pMK-RQ는 37 ℃에서 NheI 및 SmaI로 소화시킨 반면, tCD19-F2A-Neo/pSBSO는 사이에 정제 단계(Qiaquick 겔 추출 키트, Qiagen)를 사용하여 37 ℃에서 NheI에 이어, 37 ℃에서 NruI로 순차적으로 소화시켰다. tEGFR 삽입물 및 F2A-Neo/pSBSO 골격은 150V에서 45분 동안 작동하는 0.8% 아가로스 겔 상의겔 전기영동에 의해 분리했다. 예측된 크기의 밴드는 단리시키고(Qiaquick 겔 추출 키트, Qiagen), 16ºC에서 T4 DNA 리가제 (Promega)로 밤새 결찰시켰다. TOP10 화학적 적격 세포(Invitrogen)는 결찰 생성물로 열-충격 형질전환시키고, 칸나마이신을 함유하는 한천 상에서 밤새 배양했다. 5개 클론은 8시간 동안 칸나마이신을 함유하는 TB 중의 배양으로 소규모 DNA 증폭을 위해 접종했다. Mini Prep 키트 (Qiagen) 및 후속적인 분석적 제한 효소 소화에 의한 DNA 정제는 tErbB1-F2A-Neo/pSBSO에 양성인 클론을 동정했다(도 33e). 양성 클론은 37 ℃에서 16시간 동안 진탕기 상의 배양에서 대규모 DNA 증폭을 위해 1:1000으로 배양물에 접종했다. 로그-상 성장 세균으로부터 DNA의 정제는 EndoFree 플라스미드 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행하였고, 분광광도법은 1.8 내지 2.0를 판독하는 OD 260/280에 의해 DNA 순도를 확인했다.
CAR-L 트랜스포손 . 이미 기재된 2D3 하이브리도마 (94)는 CAR-L의 scFv 서열을 유도하기 위해 사용했다. 간단하게, RNA는 제조업자의 지침에 따라 RNeasy Mini 키트 (Qiagen)에 의해 하이브리도마로부터 추출시켰다. Superscript III 제1 스트랜드 키트 (Invitrogen)를 통한 역전사는 cDNA 라이브러리를 생성했다. FR1 영역을 위한 축퇴 프라이머를 사용하는 PCR은 후속적으로 TOPO TA 벡터로 결찰되었던 마우스 가변 중쇄 및 경쇄를 증폭시켰다. CAR-L은 다음과 같이 코돈 최적화된 서열로서 작제되었다: 인간 GMCSFR 신호 펩티드 (아미노산 1-22; NP_758452.1)에 이어, 2D3-유래 scFv는 인간 CD8α 세포외 도메인 (아미노산 136-182; NP_001759.3) 및 인간 CD28의 막관통 및 세포내 도메인 (아미노산 56-123; NP_001230006.1)에 융합되었고, CD3ζ의 인간 세포내 도메인에서 종결한다(아미노산 48-163; NP_ 000725.1). CAR-L 단백질은 GeneArt에서 합성된 다음, 절제되고, CAR-L-2A-Zeo로 지정된 제오마이신 내성 유전자에 융합된 자기-절단가능한 2A 펩티드를 갖는 SB 트랜스포손으로 결찰되었다(도 33f)(참조: Rushworth 등, 2014).
세포주: 전파 및 변형
모든 세포주는 다르게 언급되지 않는 한, 5% CO2, 95% 습도 및 37 ℃에서 10% 열 불활성화된 소태아 혈청(FBS)(HyClone, ThermoScientific) 및 2mM 글루타맥스-100 (Gibco, Life Technologies)이 보충된 완전 배지 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(Life Technologies, Grand Island, NY)에서 유지시켰다. 접착 세포주는 통상적으로 70 내지 80% 합류점까지 배양한 다음, 0.05% 트립신-EDTA (Gibco)로 해리 후 1:10 통과시켰다. 세포주의 동일성은 제조업자의 지침에 따라서(Applied Biosystems, cat# 4322288) AmpF_STR 식별자 키트를 사용하여 STR DNA 지문에 의해 확인되었다. STR 프로파일은 공지된 ATCC 지문 (ATCC.org), 및 세포주 통합 분자 인증 데이터베이스 (CLIMA) 버젼 0.1.200808과 비교했다(bioinformatics.istge.it/clima/의 월드 와이드 웹 상)(Nucleic Acids Research 37:D925-D932 PMCID: PMC2686526). STR 프로파일은 공지된 DNA 지문과 일치했다.
OKT3 -부하 K562 클론 4. K562 클론 4는 펜실베니아 대학의 칼 준 의학 박사로부터 선물로서 받았고, 이미 기재된 바와 같았다(참조: Suhoski 등, 2007; Paulos 등, 2008). 클론 4는 tCD19, CD86, CD137L, CD64 및 멤브레인 IL15-GFP 융합 단백질을 발현시키도록 변형되고, PACT하에 전임상 및 임상 연구를 위한 작업 세포 뱅크로서 제조되었다. K562 클론 4는 CD64 고친화성 Fc 수용체에 대한 결합을 통해 항-CD3 항체, OKT3을 발현시키도록 제조될 수 있다. K562 클론 4 상에 OKT3을 부하하기 위해, 세포는 1x106 세포/mL의 밀도로 1x 20% N-아세틸시스테인과 함께 X-VIVO 혈청 부재 배지(Lonza, Cologne, Germany)에서 밤새 배양했다. 이 단계는 OKT3의 최적 결합을 위해 Fc 수용체를 명확하게 한다. 다음 날, 세포를 세척하고, 1x 20% N-아세틸시스테인과 함께 X-VIVO 배지에 1x106 세포/mL로 재현탁시키고, 조사하여 100 Gy를 달성한다. 세포를 세척하고, PBS에 1x106 세포/mL로 재현탁시키고, OKT3 (eBioscience, San Diego, CA)을 1mg/mL의 농도로 첨가하고, 4 ℃에서 30분 동안 롤러 상에서 배양한다. 세포를 다시 세척하고, 유동 세포 분석법으로 공자극 분자 및 OKT3의 발현을 확인하게 위해 염색하고, 냉동보관했다.
tEGFR + K562 클론 27. K562 클론 27은 펜실베니아 대학 칼 준 의학박사의 선물인 K562 클론 9로부터 유래되었다. K562 클론 9는 이미 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입되었다(참조: Suhoski 등, 2007; Paulos 등, 2008), tCD19, CD86, CD137L 및 CD64를 발현시키기 위해. 클론 27은 멤브레인 한계 IL15-IL15Rα 융합 단백질을 안정하게 발현시키도록 클론 9로부터 변형되었다(참조: Hurton, L. V., 2014), SB 형질감염을 통해, 희석 제한으로 클론화하고, 유동 세포 분석법에 의해 모든 도입유전자의 고발현을 갖는 것으로 확인했다. K562 클론 27은 tErbB1-F2A-Neo/pSBSO의 SB 형질감염에 의해 절단된 EGFR을 발현시키도록 변형되었다. EGFR을 발현시키는 K562 클론 27은 PE-표지된 EGFR-특이적 항체(BD Biosciences, Carlsbad, CA, cat# 555997) 및 항-PE 비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 함께 배양된 다음, 자기 컬럼(Miltenyi Biotec)을 통한 유동으로 비표지 세포로부터 분리되었다. 자기 선택 후, tEGFR+ K562 클론 27은 높은 EGFR 발현을 유지시키기 위해 1mg/mL G418 (Invivogen, San Diego, CA)의 존재하에 배양했다.
EL4, CD19 + EL4, tEGFR + EL4, 및 CAR-L + EL4. EL4는 ATCC로부터 입수했고, SB 비바이러스성 유전자 변형에 의해 tCD19-F2A-네오, tEGFR-F2A-네오 또는 CAR-L-F2A-네오를 발현시키도록 변형되었다. EL4는 제조업자의 지침에 따라서 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucelofector)(Lonza) 및 기본 마우스 T 세포 키트(Lonza)를 사용하여 전기천공시켰다. 간단하게, 2x106 EL4 세포를 90xg에서 10분 동안 원심분리시키고, 3μg의 트랜스포손(tCD19-F2A-네오, tEGFR-F2A-네오 또는 CAR-L-2A-제오) 및 2ug의 SB11 트랜스포사제와 함께 100uL 기본 마우스 T 세포 완충제에 재현탁시키고, 아막사 프로그램 X-001을 사용하여 전기천공시켰다. 전기천공 후, 세포를 즉시 키트(Lonza)가 제공된, 예열되고 보충된 기본 마우스 T 세포 배지로 옮겼다. 다음 날, 1mg/mL의 G418을 도입유전자를 발현시키도록 변형된 EL4 세포를 선택하기 위해 첨가했다. 발현은 변형 7일 후 유동 세포 분석법으로 확인했다.
U87, U87low , U87med , 및 U87high. U87, 공식적으로 지정된 U87MG는 ATCC (Manassas, VA)로부터 입수했다. U87low 및 U87med는 제조업자의 지침에 따라서 아막사 뉴클레오펙터 및 세포주 뉴클레오펙터 키트 T(Lonza, cat#VACA-1002)를 사용하여 tErbB1-F2A-네오/pSBSO 및 SB11을 사용하는 전기천공에 의해 EGFR을 과발현시키기 위해 생성했다. 간단하게, U87 세포는 80% 합류점까지 배양한 다음, 0.05% 트립신-EDTA (Gibco)에서 해리에 의해 수거하고, 자동하 세포 카운터 (Cellometer, Auto T4 Cell Counter, Nexcelcom, Lawrence, MA)를 사용하는 트립판 블루 배제를 통해 계수했다. 1x106 U87 세포는 3 μg의 tErbB1-F2A-네오/pSBSO 트랜스포손 및 2μg의 SB11 트랜스포사제의 존재하에 100μL의 세포주 키트 T 전기천공 완충체에 현탁시키고, 큐벳으로 옮기고, 프로그램 U-029를 통해 전기천공시켰다. 전기천공 직후에, 세포를 6-웰 플레이트로 옮기고, 완전 DMEM 배지에서 회수할 수 있었다. 다음 날, 0.35mg/mL의 G418 (Invivogen)을 도입유전자 발현을 위해 선택하기 위해 첨가했다. 적어도 1x106 세포로 증식 후, EGFR 발현을 평가하기 위해 유동 세포 분석법을 실행했다. 전기천공된 U87 세포는 비변형 U87에 비해 EGFR 발현의 완만한 증가를 입증하였고, U87low로서 지정되었다. U87med 세포를 생성하기 위해, U87 세포는 제조업자의 지침에 따라서 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 tErbB1-F2A-네오 및 SB11과 함께 리포펙타민-전송했다. 다음 날, 0.35mg/mL의 G418을 네오마이신 내성을 위해 선택하기 위해 배양물에 첨가했다. 상당 수로 세포 증식 후, 유동 세포 분석법은 U87에 비해 서로 배타적인 중간 또는 높은 EGFR 과발현을 갖는 두-피크 집단을 나타냈다. 세포는 최고 피크의 상위 50%를 분류하는 항-EGFR-PE 및 FACS로 염색했다. 세포가 70% 이하의 합류점에 도달할 때 조심스러운 서브 클로닝 및 유동 세포 분석법을 통상적으로 실행하여 세포가 EGFR 발현을 유지시킴을 보장했다. U87high는 wtEGFR을 과발현시키는 U87-172b 세포이고, 올리버 뵐거 박사(Oliver Boelger, Ph.D)로부터의 일종의 선물이었다.
U87- ffLuc - mKate 및 U87med - ffLuc - mKate. U87 및 U87med 세포는 ffLuc-mKate 도입유전자를 발현시키기 위해 렌티바이러스 형질 도입시켰다(도 34), 상기한 프로토콜과 유사하다(참조: Turkman 등, 2011). 간단하게, 293-METR 포장 세포는 제조업자의 지침에 따라서 리포펙타민 2000 (Invitrogen)의 존재하에 pcMVR8.2, VSV-G 및 pLVU3GeffLuc-T2AmKates158A로 형질감염시켰다. 48시간 후, 바이러스형 입자(VLP)를 수거하고, 100kDa NMWL 필터 상에서 농축시켰다(참조: Millipore, Billerica, MA). U87 및 U87med를 형질도입하기 위해, 세포를 70 내지 80% 합류점까지 6 웰 플레이트에 플레이팅한 다음, ffLucmKate VLP를 8μg/mL의 폴리브렌과 함께 첨가했다. 플레이트를 1800rpm에서 1.5시간 동안 원심분리한 다음, 6시간 동안 배양했다. 배양 후, 상청액을 제거했다. 형질도입 후 24시간에, 세포는 합류점에 도달했고, 계대배양하고, FACS는 중간 수준의 ffLuc-mKate를 발현시키는 세포를 분류했다.
인간 신장 피질 상피 세포( HRCE ). HRCE는 건강한 개체의 근위 및 원위 신 세뇨관으로부터 취한 것으로 기재된, Lonza로부터 입수했고, 재조합 인간 상피 성장 인자 (rhEGFR), 에피네프린, 인슐린, 트리요오도티로닌, 하이드로코르티손, 트랜스페린, 10% 열-불활성화 FBS (HyClone), 및 2mM 글루타맥스-100 (Gibco)이 보충된 완전 신장 성장 배지(Lonza, cat# CC-3190)에서 배양했다. HRCE는 시험관내 유한 수명을 갖고, 따라서 모든 검정은 10개 미만 집단 배가가 수행된 세포로 실행했다. 세포를 70 내지 80% 합류점까지 배양한 다음, 0.05% 트립신-EDTA (Gibco)에 의해 분리하고, 신선한 완전 신장 성장 배지에서 1:5 통과시켰다.
NALM -6, T98G , LN18 및 A431. NALM-6, T98G, LN18 및 A431은 모두 ATCC로부터 입수했고, 세포주에 대해 상기한 바와 같이 배양했다.
T 세포 변형 및 배양. 말초혈 단핵 세포는 걸프 해안 지역 혈액 뱅크의 건강한 공여체로부터 입수했고, 피콜-페이크 (GE Healthcare, Milwaukee, WI)에 의해 단리시키고, 동결보존했다. 모든 T 세포 배양물은 10% FBS (HyClone) 및 2mM 글루타맥스(Gibco)가 보충된 완전 RPMI-1640 (HyClone)에 유지시켰다.
SB 트랜스포손 / 트랜스포사제를 사용한 전기천공. SB 전기천공은 상기한 바와 같이 수행했다(참조: Singh 등, 2008). PBMC는 전기천공 날에 해동시키고, 사이토카인 비함유 배지 완전 RPMI-1640에서 1x106 세포/mL의 밀도로 2시간 동안 휴지시켰다. 휴지 기간 후, 세포를 200xg에서 8분 동안 원심분리한 다음, 배지에 재현탁시키고, 자동화 세포 카운터(Cellometer, Auto T4 Cell Counter, Nexcelcom)를 사용하는 트리판 블루 배제에 의해 계수했다. PBMC를 다시 원심분리하고, 인간 T 세포 전기천공 완충제(Lonza, cat# VPA-1002)에 2x108/mL로 재현탁시킨 다음, 100μL의 모든 현탁액을 15μg의 트랜스포손(세툭스- 또는 니모-CAR) 및 5μg의 SB11 트랜스포사제와 혼합하고, 전기천공 큐벳으로 옮기고, 비자극 인간 T 세포를 위한 프로그램 U-014를 사용하여 아막사 뉴클레오펙터(Lonza)를 통해 전기천공시켰다. 전기천공 후, 세포를 즉시 20% 열-불활성화된 FBS (HyClone) 및 2mM 글루타맥스-100 (Gibco)이 보충된 페놀 비함유 RPMI로 밤새 회수하기 위해 옮겼다. 다음 날, 세포는 트랜스포손의 일시적 발현을 결정하기 위해 (CAR 발현을 결정하기 위한) CD3 및 Fc에 대해 유동 세포 분석법으로 분석했다.
CAR + T 세포의 자극 및 배양. 전기천공 후 24시간에, 세포를 2개의 CAR+ T 세포:1개의 aAPC의 비로 100 Gy-조사된 EGFR+ K562 클론 27 인공 항원 제시 세포(aAPC)로 자극했다. T 세포는 유동 세포 분석법에 의한 CAR 발현의 평가 후 7 내지 9일 마다 재자극시켰다. 배양 기간 전반에 걸쳐, T 세포는 2 내지 3일 마다 배양하기 위해 첨가된 30ng/mL의 IL-21(Peprotech, Rocky Hill, NJ)을 수용했다. IL-2 (Aldeleukin, Novartis, Switzerland)는 2 내지 3일 마다 50U/mL로 제2 자극 주기 후 배양물에 첨가했다. 14일 째에, 배앵물은 배양물에 존재하는 CD3negCD56+ 세포로서 지정된 NK 세포의 존재에 대해 평가했다. NK 세포가 세포 집단의 >10%를 나타내면, NK 세포 고갈은 NK 세포를 CD56-특이적 자기 비드(Miltenyi Biotec)로 표지하고 LS 컬럼(Miltenyi Biotec) 상에서 분류함으로써 수행된다. CAR+ T 세포를 함유함을 통한 음의 유동에 대한 유동 세포 분석법은 배양물로부터 NK 세포 부분집합의 상공적인 고갈을 확인했다. 배양물은 CAR이 일반적으로 5회 자극 주기 후 CD3+ T 세포의 >85% 상에서 발현될 때의 기능에 대해 평가했다.
RNA의 시험관내 전사. 세툭스CD28mZ/pGEM-A64, 니모CD28mZ/pGEM-A64 또는 GFP/pGEM-A64는 시험관내 RNA 전사를 위한 선형 주형을 제공하기 위해 37 ºC에서 4시간 동안 SpeI로 소화시켰다. 주형의 완전한 선형화는 0.8% 아가로스 겔에서의 아가로스 겔 전기영동 및 단일 밴드의 존재에 의해 확인했고, 잔류하는 소화는 QiaQuick PCR 정제(Qiagen)로 정제하고, 0.5μg/μL의 농도를 달성하기 위해 저용적으로 용출시켰다. 시험관내 전사 반응은 제조업자의 프로토콜에 따라서 T7 mMACHINE mMESSAGE Ultra (Ambion, Life Technologies, cat# AM1345)를 사용하여 수행하고, 37 ℃에서 2시간 동안 배양했다. mRNA의 전사 후, DNA 주형은 1 유닛/μg DNA 주형으로 공급된 Turbo DNAse를 첨가하여 분해하고, 37 ℃에서 추가로 30분 동안 배양했다. 전사된 RNA는 RNeasy Mini 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 농도 및 순도 (OD 260/280 값 = 2.0-2.2)는 분광광도법으로 결정하고, -80 ℃에서 단일-해동 분액으로 동결시켰다. RNA 생성물의 품질은 1xMOPS 작동 완충제에서 80분 동안 75V에서 포름알데히드-함유 아가로스 겔(1% 아가로스, 10% 10x MOPS 작동 완충제, 6.7% 포름알데히드) 상의 겔 전기영동 및 단일 묘사 밴드의 가시화에 의해 평가했다.
폴리클로날 T-세포 확대. 항원에 독립적인 T 세포의 수치 확대는 CD3의 가교결합을 통해 증식성 자극을 전달하는 OKT3이부하된 100 Gy-조사된 K562 클론 4를 사용한 배양으로 달성되었다. aAPC는 다음 밀도로 첨가했다: 10:1 또는 1:2 T 세포: aAPC, 7 내지 10일 마다, 50U/mL의 IL-2는 2 내지 3일 마다 첨가했다. 배지 변화는 0.5-2x106 세포/mL이 밀도로 T 세포를 유지시키기 위한 배양 전반에 걸쳐 수행했다.
T 세포로 RNA 전기 전달. T 세포는 상기한 바와 같은 100 Gy-조사된 OKT3-부하 K562 클론 4에 의한 공배양으로 RNA 전송 전 3 내지 5일 자극을 겪었다. 전기 전달 이전에, T 세포를 수거하고, 자동화 세포 카운터 (Cellometer, Auto T4 Cell Counter, Nexcelcom)를 사용하는 트리판 블루 배제에 의해 계수했다. 세포의 제조 동안, RNA는 -80 ℃ 동결기로부터 제거하고, 얼음에서 해동시켰다. T 세포는 90xg에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액은 세포 펠렛의 파괴 없이 안전한 제거를 보장하기 위해 조십스럽게 흡인시켰다. T 세포는 P3 제1 세포 4D-뉴클레오펙터 완충제(Lonza, cat # V4XP-3032)에 1x108/mL의 농도로 현택시키고, 20μL의 각 T 세포 현탁액을 3μg의 시험관내 전사된 RNA와 혼합한 다음, 뉴클레오펙터 큐벳 스트립 (Lonza, cat # V4XP-3032)으로 옮겼다. 세포를 프로그램 DQ-115를 사용하여 아막사 4D 뉴클레오펙터 (Lonza)에서 전기천공한 다음, 큐벳에서 15분까지 휴지되도록 했다. 휴지 기간 후, 2 mM 글루타막스-100 (Gibco) 및 20% 열-불활성화된 FBS (HyClone)가 보충된 따듯한 회수 배지, 페놀 비함유 RPMI 1640 (HyClone)을 큐벳에 첨가하고, 세포를 회수 배지를 함유하는 6 웰 플레이트에 완만하게 옮기고, 조직 배양물 배양기로 옮겼다. 4시간 후, 50U/mL의 IL-2 및 30ng/mL의 IL-21을 T 세포에 첨가했다. RNA 전송 후 4 내지 24시간에, T 세포는 Fc에 대한 유동 세포 분석법에 의해 CAR의 발현에 대해 분석했다. 모든 기능적 검정은 RNA 전송 후 24시간에 수행했다.
면역염색 및 유동 세포 분석법
획득 및 분석. 유동 세포 분석법 데이터는 FACS 칼리버 (BD Biosciences, San Jose, CA) 상에서 수집하고, CellQuest 소프트웨어(버전 3.3, BD Biosciences)를 사용하여 획득했다. 유동 세포 분석법 데이터의 분석은 FlowJo 소프트웨어 (버전 x.0.6, TreeStar, Ashland, OR)를 사용하여 수행했다.
표면 면역염색 및 항체. 1x106 세포까지의 면역염색은 다음과 같은 희석으로 다음과 같은 염료(다르게 기재되지 않는 한)에 접합된 모노클로날 항체로 수행했다: 플루오레세인 (FITC, 1:25), 피고에리트린 (PE, 1:40), 시아닌 염료에 접합된 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCPCy5.5, 1:25), 알로피코시아닌 (APC, 1:40), 알렉사플루오르488 (1:20), 알렉사플루오르647 (1:20). 모든 항체는 다르게 언급되지 않는 한 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)로부터 구입했다. 다음에 특이적인 항체가 사용되었다: CD3 (클론 SK7), CD4 (클론 RPA-T4), CD8 (클론 SK1), CD19 (HIB19), CD27 (클론 L128), CD28 (클론 L293), CD45RA (클론 HI100), CD45RO (클론 HI100), CD56 (클론 B159), CD62L (클론 DREG-56), CCR7 (클론 GD43H7, Biolegend, San Diego, CAR PerCPCy5.5 희석됨 1:45), EGFR (클론 EGFR.1, PE 희석됨 1:13.3), Fc (CAR을 검출하기 위해, 클론 HI10104, Invitrogen), IL15 (클론 34559, R&D Systems, Minneapolis, MN, PE 희석됨 1:20), 뮤린 F(ab’)2 (K562 상에 부하된 OKT3을 검출하기 위해, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, cat# 115-116-072, PE 희석됨 1:100), TNF-α (클론 mAb11, PE 희석됨 1:40) 및 IFN-γ (클론 27, APC 희석됨 1:66.7), pErk1/2 (클론 20A, AlexaFluor 647), pp38 (클론 36/p38, PE) 및 Ki-67 (클론 B56, FITC, 1:20, BD Biosciences). 표면 분자는 4 ℃ 어둠 속에서 30분 동안 FACS 완충제 (PBS, 2% FBS, 0.5% 나트륨 아지드)에서 염색했다.
정량적 유동 세포 분석법. 정량적 유동 세포 분석법은 양자 단순 세포상 폴리스티렌 비드 (Bangs Laboratories, Fishers, IN)를 사용하여 수행했다. 5개 비드 집단이 제공되는데, 4개의 집단은 증가하는 양의 항-뮤린 IgG, 따라서 공지된 항체 결합 능력 (ABC)을 갖고, 하나는 블랭크 집단이다. EGFR-PE (BD Biosciences, cat#555997)는 표적 세포의 면역염색과 동시에 포화된 농도로(1:3 희석, 제조업자의 권장당) 비드와 함께 배양했다. 미소구에 대한 EGFR-PE 결합의 MFI는 선형 회귀가 QuickCal 데이터 분석 프로그램 (버전 2.3, Bangs Laboratories)을 사용하여 적합화된 표준 곡선을 생성하기 위해 사용했다(도 35). 표적 세포에 EGFR-PE 결합의 측정된 MFI를 적용하면, 선형 회귀로의 더 작은 양의 배경 자동형광이 세포당 발현된 EGFR 분자의 평균 수를 수득했다.
세포내 사이토카인 염색 및 유동 세포 분석법. T 세포는 GolgiStop 희석된 4000x (BD Biosciences)의 존재하에 4 내지 6시간 동안 1:1의 비율로 표적 세포와 공배양시켰다. 비자극 T 세포는 음성 대조군으로서 기능하는 반면, 1000x 희석된 PMA/이오노마이신 및 브레펠딘 A(BD Biosciences)를 함유하는 백혈구 활성화 칵테일로 처리된 T 세포는 양성 대조군으로서 기능한다. EGFR-특이적 모노클로날 항체(클론 LA1, Millipore)는 CAR 및 EGFR 상호작용의 상호작용을 차단하기 위해 사용했다. 세포내 사이토카인 염색은 4 ℃ 어둠 속에서 20분 동안 Cytofix/Cytoperm 완충제(BD Biosciences)에서 고정/투과에 이어, 4 ℃ 어둠 속에서 30분 동안 1x Perm/세척 완충제(BD Biosciences)에서 세포내 사이토카인의 염색에 의해 표면 면역염색 후 수행하였다. 사용된 항체는 TNF-α (BD Biosciences, 클론 mAb11, PE 희석됨 1:40) 및 IFN-γ (BD Biosciences, 클론 27, APC 희석됨 1:66.7)였다. 세포내 사이토카인 염색 후, 세포는 샘플이 FACS 칼리버 상에서 획득될 때까지 0.5% 파라포름알데히드(CytoFix, BD Biosciences)로 고정시켰다.
유동 세포 분석법에 의한 인산화 측정. T 세포는 다르게 지시되지 않는 한, 45분 동안 1:1의 비율로 표적 세포와 공배양시켰다. 활성화 후, T 세포는 300xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액은 경사 제거했다. T 세포를 용해시키고, 20용적의 1x PhosFlow 용해/고정 완충제(BD Biosciences)를 첨가하여 고정시키고, 37 ℃로 예열하고, 37 ℃에서 10분 동안 배양했다. 원심분리 후, T 세포는 와동시키면서 빙냉 PhosFlow Perm III 완충제 (BD Biosciences)의 첨가로 투과성이었고, 어둠 속에서 20분 동안 얼음 위에서 배양했다. 배양 후, 세포를 FACS 완충제로서 세척하고, 100μL 염색 용액에 재현탁시켰다. 염색 용액은 모두 동일 비로 존재하는 CD4 (클론 SK3, FITC), CD8 (클론 SK1, PerCPCy5.5), pErk1/2 (클론 20A, AlexaFluor 647), pp38 (클론 36/p38, PE) 및 FACS 완충제에 대한 항체로 구성되어 있고, 어둠 속에서 실온에서 20분 동안 배양했다. 세포는 0.5% 파라포름알데히드로 고정시키고, 24시간 이내에 유동 세포 분석법으로 분석했다.
생존율 염색. 아넥신 V (BD Biosciences) 및 7-AAD (BD Biosciences)의 염색은 세포 생존율을 결정하기 위해 사용하였고, 어둠 속에서 실온에서 20분 동안 CD4 또는 CD8을 염색하면서 1x 아넥신 결합 완충제에서 수행하였다. 생존 세포의 비율은 CD4 또는 CD8 게이트화 T 세포 집단 중의 %아넥신Vneg7-AADneg로서 결정되었다.
세포상 증식 마커 Ki -67을 위한 염색. 증식 마커 Ki-67은 세포내 유동 세포 분석법으로 측정했다. T 세포는 36시간 동안 1:5의 비로 부착 표적 세포와 함께 공배양한 다음, T 세포는 상청액을 제거하고 300xg에서의 원심분리에 의해 배양물로부터 수거했다. 이어서, T 세포를 고정시키고, 고속으로 와동시키면서 빙냉 70% 에탄올의 적가로 투과성으로 하였다. 이어서, T 세포를 염색 전에 2 내지 24시간 동안 -20 ℃에서 저장했다. 세포는 어둠 속에서 30분 동안 실온에서 100μL의 FACs 완충제에서 Ki-67 (클론 B56, FITC, 1:20, BD Biosciences), CD4 (클론 RPA-T4) 및 CD8 (클론 SK1)로 염색한 직후에 유동 세포 분석법으로 분석했다.
T-세포 기능 분석
CAR 하향조절. CAR+ T 세포 및 표적을 수거하고, 자동 세포 카운터(Cellometer, Auto T4 Cell Counter, Nexcelcom)를 사용하는 트리판 블루 배제로 계수한 다음, 12-웰 플레이트에서 1:1 비율로 혼합하고, 개별적인 웰은 T 세포 상에서 CAR 표면 발현을 측정하기 위해 각 시점에서 수거했다. 하향조절용 음성 대조군은 자극 없이 플레이팅된 T 세포였다. CD3, CD4 및 CD8 발현에 의한 T 세포의 염색 및 Fc에 의한 CAR의 공염색은 유동 세포 분석기 상에서 분석했다. CAR의 하향조절 퍼센트는 [자극 후 CAR 발현]/[자극 없는 CAR 발현] x 100으로서 계산되었다.
2차 활성화 및 사이토카인 생산. CAR+ T 세포 및 부착 표적을 수거하고, 자동화 세포 카운터 (Cellometer, 자동 T4 세포 카운터, Nexcelcom)를 사용하는 트리판 블루 배제로 계수한 다음, 12-웰 플레이트에서 1:1의 비로 혼합했다. 공배양 24시간 후, T 세포를 상청액을 제거하고 부착 세포를 PBS로 세척하여 배양물로부터 수거했다. T 세포를 300xg에서 5분 동안 회전시킨 다음, 배지에 재현탁시키고, 자동 세포 카운터 (Cellometer, 자동 T4 세포 카운터, Nexcelcom)를 사용하는 트리판 블루 배제로 계수했다. T 세포는 1:1 비율로 표적 및 상기한 바와 같은 세포내 사이토카인 생산 분석으로 자극시켰다.
장기간 세포독성 검정. 검정 개시 직전 날, 부착 U87 및 U87high 세포를 수거하고, 계수하고, 40,000 표적 세포를 완전DMEM 중의 6-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고, 조직 배양물 배양기에서 밤새 배양했다. 검정 날에, CAR+ T 세포를 수거하고, 트리판 블루 배제로 계수하고, 플레이팅된 표적세포에 1:5 E:T 비로 첨가했다. 음성 대조군 웰은 T 세포가 첨가되지 않았다. 각 검정 시점에서, T 세포는 상청액을 경사 제거하고, 웰을 PBS로 세척하여 제거했다. 부착 웰은 0.05% 트리판-EDTA (Gibco)에 의해 웰로부터 해리시켰다. 현미경 검사는 웰로부터 세포의 완전한 분리를 육안으로 보장하기 위해 수행하였다. 수거된 세포를 스핀 다운시키고, 100μL의 배지에 재현탁시킨 다음, 혈구계를 사용하는 트리판 블로 배제로 계수했다. 생존 세포의 퍼센트는 [T 세포 공배양 후 세포수]/[어떤 T 세포 공배양 없는 세포수] x 100로서 계산되었다.
크롬 방출 검정. 특정 세포독성은 상기한 바와 같이 표준 4시간 크롬 방출 검정을 통해 평가했다(참조: Singh 등, 2008). 표적 세포를 수거하고, 자동화 세포 카운터(Cellometer, Auto T4 Cell Counter)를 사용하는 트리판 블루 배제로 계수했다. 250,000 이상의 세포를 분액화한 다음, 300xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 경사 제거하였다. 이어서, 0.1 μCi의 51Cr을 각 표적에 첨가하고, 37 ℃에서 조직 배양물 배양기에서 1 내지 1.5시간 동안 배양했다. 웰당 100,000개 T 세포를 3회 플레이팅하고, 1:2 비율로 연속 희석하여 96-웰 V-기저 플레이트(Corning, Corning, NY)에서 20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1 및 1.25:1의 최종 이펙터 대 표적(E:T) 비를 수득하고, 조직 배양물 배양기에 배치시켰다. 최소 크롬 방출 제어를 위해 배지만을 행에 배치시켰다. 크롬으로 표지화 후, 표적을 10mL의 PBS로 3회 세척한 다음, 125,000 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시키고, 철저히 혼합하고, 100μL를 각 행에 첨가하고, 모든 T-세포 함유 행, 최소 방출 행 및 최대 방출 행을 포함했다. 플레이트를 300xg에서 3분 동안 원심분리했다. 원심분리 후, 100μL의 0.1% 트리톤 X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 최대 방출 행에 첨가하고, 플레이트를 4시간 동안 조직 배양물 배양기에 배치시켰다. 배양 후, 플레이트를 이어서 세포 펠렛을 파괴하지 않고 50μL의 상청액의 조심스러운 제거로 수거하고, LumaPlate-96 (Perkin-Elmer, Waltham, MA)으로 옮기고, 밤새 건조시켰다. 다음 날, 플레이트를 Top-Seal (Perkin-Elmer)로 밀봉시키고, 섬광은 TopCount NXT (Perkin-Elmer) 상에서 측정했다. 특이적 용해 퍼센트는 [(51Cr 방출 - 최소) / (최대- 최소)] x 100으로서 계산되었고, 여기서 최대 및 최소 값은 각 삼중에 대해 평균화했다.
고처리량 유전자 발현 및 CDR3 서열분석
mRNA 전사물의 직접 영상화에 의한 유전자 발현의 분석. mRNA 분자의 직접 영상화 및 정량화는 상기한 바와 같이(319-322) 수행했다. 확대 전 또는 후에 세포는 각각 CD4 및 CD8 자기 비드와 함께 배양하고 (Miltenyi Biotec), LS 컬럼 상에서 분류함으로써 CD4 및 CD8 발현에 대해 긍정적으로 분류했다. 유동 세포 분석법을 사용하여 CD4 및 CD8 분리 집단의 순도를 확인했다. 1x106 T 세포를 165μL의 RLT 완충제(Qiagen)에 용해시키고, -80 ℃에서 단일-해동 분액으로 동결시켰다. RNA 용해물을 해동시키고, 65ºC에서 12시간 동안 다중 표적 특이적 색상 코드화 리포터 및 비오티닐화 포획 프로브로 하이브리드화했다. 목적하는 림프구 특이적 mRNA 전사물을 동정하였고, RefSeq 수탁으로부터 생성된 두 코드세트는 리포터 및 포획 프로브 쌍, 림프구 코드세트, 및 TCR Vα 및 Vβ 코드세트를 생성하기 위해 사용했다. 림프구 코드세트는 다음과 같은 유전자에 대한 프로브를 함유했다: ABCB1; ABCG2; ACTB; ADAM19; AGER; AHNAK; AIF1; AIM2; AIMP2; AKIP1; AKT1; ALDH1A1; ANXA1; ANXA2P2; APAF1; ARG1; ARRB2; ATF3; ATM; ATP2B4; AXIN2; B2M; B3GAT1; BACH2; BAD; BAG1; BATF; BAX; BCL10; BCL11B; BCL2; BCL2L1; BCL2L1; BCL2L11; BCL2L11; BCL6; BCL6B; BHLHE41; BID; BIRC2; BLK; BMI1; BNIP3; BTLA; C21orf33; CA2; CA9; CARD9; CASP1; CAT; CBLB; CCBP2; CCL3; CCL4; CCL5; CCNB1; CCND1; CCR1; CCR2; CCR4; CCR5; CCR6; CCR7; CD160; CD19; CD19R-scfv; CD19RCD28; CD2; CD20-scfv 루툭시맙); CD226; CD244; CD247; CD27; CD274; CD276; CD28; CD300A; CD38; CD3D; CD3E; CD4; CD40LG; CD44; CD45R-scfv; CD47; CD56R-scfv; CD58; CD63; CD69; CD7; CD80; CD86; CD8A; CDH1; CDK2; CDK4; CDKN1A; CDKN1B; CDKN2A; CDKN2C; CEBPA; CFLAR; CFLAR; CHPT1; CIITA; CITED2; CLIC1; CLNK; c-MET-scfv; CREB1; CREM; CRIP1; CRLF2; CSAD; CSF2; CSNK2A1; CTGF; CTLA4; CTNNA1; CTNNB1; CTNNBL1; CTSC; CTSD; CX3CL1; CX3CR1; CXCL10; CXCL12; CXCL9; CXCR1; CXCR3; CXCR4; DAPL1; DEC1; DECTIN-1R; DGKA; DOCK5; DOK2; DPP4; DUSP16; EGFR-scfv (NIMO CAR); EGLN1; EGLN3; EIF1; ELF4; ELOF1; ENTPD1; EOMES; EPHA2; EPHA4; EPHB2; ETV6; FADD; FAM129A; FANCC; FAS; FASLG; FCGR3B; FGL2; FLT1; FLT3LG; FOS; FOXO1; FOXO3; FOXP1; FOXP3; FYN; FZD1; G6PD; GABPA; GADD45A; GADD45B; GAL3ST4; GAS2; GATA2; GATA3; gBAD-1R-scfv; GEMIN2; GFI1; GLIPR1; GLO1; GNLY; GSK3B; GZMA; GZMB; GZMH; HCST; HDAC1; HDAC2; HER2-scfv; HERV-K 6H5-scfv; HLA-A; HMGB2; HOPX; HOXA10; HOXA9; HOXB3; HOXB4; HPRT1; HRH1; HRH2; 인간 CD19R-scfv; ICOS; ICOSLG; ID2; ID3; IDO1; IFNA1; IFNG; IFNGR1; IGF1R; IKZF1; IKZF2; IL10; IL10RA; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL15; IL15RA; IL17A; IL17F; IL17RA; IL18; IL18R1; IL18RAP; IL1A; IL1B; IL2; IL21R; IL22; IL23A; IL23R; IL27; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL4; IL4R; IL5; IL6; IL6R; IL7R; IL9; IRF1; IRF2; IRF4; ITCH; ITGA1; ITGA4; ITGA5; ITGAL; ITGAM; ITGAX; ITGB1; ITGB7; ITK; JAK1; JAK2; JAK3; JUN; JUNB; KIR2DL1; KIR2DL2; KIR2DL3; KIR2DL4; KIR2DL5A; KIR2DS1; KIR2DS2; KIR2DS3; KIR2DS4; KIR2DS5; KIR3DL1; KIR3DL2; KIR3DL3; KIR3DS1; KIT; KLF10; KLF2; KLF4; KLF6; KLF7; KLRAP1; KLRB1; KLRC1; KLRC2; KLRC3; KLRC4; KLRD1; KLRF1; KLRG1; KLRK1; LAG3; LAIR1; LAT; LAT2; LCK; LDHA; LEF1; LGALS1; LGALS3; LIFR; LILRB1; LOC282997; LRP5; LRP6; LRRC32; LTA; LTBR; LYN; MAD1L1; MAP2K1; MAPK14; MAPK3; MAPK8; MBD2; MCL1; MIF; MMP14; MPL; MTOR; MXD1; MYB; MYC; MYO6; NANOG; NBEA; NCAM1; NCL; NCR1; NCR2; NCR3; NCRNA00185; NEIL1; NEIL2; NFAT5; NFATC1; NFATC2; NFATC3; NFKB1; NOS2; NOTCH1; NR3C1; NR4A1; NREP; NRIP1; NRP1; NT5E; OAZ1; OPTN; P2RX7; PAX5; PDCD1; PDCD1LG2; PDE3A; PDE4A; PDE7A; PDK1; PDXK; PECAM1; PHACTR2; PHC1; POLR1B; POLR2A; POP5; POU5F1; PPARA; PPP2R1A; PRDM1; PRF1; PRKAA2; PRKCQ; PROM1; PTGER2; PTK2; PTPN11; PTPN4; PTPN6; PTPRK; RAB31; RAC1; RAC2; RAF1; RAP1GAP2; RARA; RBPMS; RHOA; RNF125; RORA; RORC; RPL27; RPS13; RUNX1; RUNX2; RUNX3; S100A4; S100A6; SATB1; SCML1; SCML2; SEL1L; SELL; SELPLG; SERPINE2; SH2B3; SH2D2A; SIT1; SKAP1; SKAP2; SLA2; SLAMF1; SLAMF7; SLC2A1; SMAD3; SMAD4; SNAI1; SOCS1; SOCS3; SOD1; SOX13; SOX2; SOX4; SOX5; SPI1; SPN; SPRY2; STAT1; STAT3; STAT4; STAT5A; STAT5B; STAT6; STMN1; SYK; TAL1; TBP; TBX21; TBXA2R; TCF12; TCF3; TCF7; TDGF1; TDO2; TEK; TERF1; TERT; TF; TFRC; TGFA; TGFB1; TGFB2; TGFBR1; 티미딘 키나제; TIE1; TLR2; TLR8; TNF; TNFRSF14; TNFRSF18; TNFRSF1B; TNFRSF4; TNFRSF9; TNFSF10; TNFSF11; TNFSF14; TOX; TP53; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TSC22D3; TSLP; TXK; TYK2; TYROBP; UBASH3A; VAX2; VEGFA; WEE1; XBP1; XBP1; YY1AP1; ZAP70; ZBTB16; ZC2HC1A; ZEB2; ZNF516. TCR Vα 및 Vβ 코드세트는 다음과 같은 유전자에 대한 프로브를 함유했다: TRAV1-1; TRAV1-2; TRAV2; TRAV3; TRAV4; TRAV5; TRAV6; TRAV7; TRAV8-1; TRAV8-2; TRAV8-3; TRAV8-6; TRAV9-1; TRAV9-2; TRAV10; TRAV11; TRAV12-1; TRAV12-2; TRAV12-3; TRAV13-1; TRAV13-2; TRAV14; TRAV16; TRAV17; TRAV18; TRAV19; TRAV20; TRAV21; TRAV22; TRAV23; TRAV24; TRAV25; TRAV26-1; TRAV26-2; TRAV27; TRAV29; TRAV30; TRAV34; TRAV35; TRAV36; TRAV38-1; TRAV38-2; TRAV39; TRAV40; TRAV41; TRBV2; TRBV3-1; TRBV4-1; TRBV4-2; TRBV4-3; TRBV5-1; TRBV5-4; TRBV5-5; TRBV5-6; TRBV5-8; TRBV6-1; TRBV6-2; TRBV6-4; TRBV6-5; TRBV6-6; TRBV6-8; TRBV6-9; TRBV7-2; TRBV7-3; TRBV7-4; TRBV7-6; TRBV7-7; TRBV7-8; TRBV7-9; TRBV9; TRBV10-1; TRBV10-2; TRBV10-3; TRBV11-1; TRBV11-2; TRBV11-3; TRBV12-3; TRBV12-5; TRBV13; TRBV14; TRBV15; TRBV16; TRBV18; TRBV19; TRBV20-1; TRBV24-1; TRBV25-1; TRBV27; TRBV28; TRBV29-1; TRBV30. 하이브리드화 후, 샘플을 nCounter 프렙(NanoString Technologies, Seattle, WA)에서 처리하고, nCounter 디지털 분석기(NanoString Technologies)에서 분석했다. 광범위한 범위의 RNA 발현 수준을 회전하는 참조 유전자가 동정되었다: ACTB, G6PD, OA21, POLR1B, RPL27, RPS13, 및 TBP 및 데이터를 정규화하는데 사용되었다. 포지티브-, 네가티브- 및 하우스-키핑 유전자에 대한 정규화는 nCounter RCC 수집기(버전 1.6.0, NanoString Technologies)를 사용하였다. 디지털 유전자 발현 프로파일링을 위해 개잘된 통계 시험은 샘플 쌍 사이의 유전자의 시차적 발현을 결정하기 위해 사용되었다(참조: O’Connor 등, 2012; Audic 등, 1997). 정규화 후, 림프구 코드세트에서 중요한 시차적 유전자 발현은 이미 기재된 바와 같이 p<0.01과 적어도 2/3 쌍에서 1.5를 초과하는 배율 변화의 조합에 의해 동정되었다(참조: O’Connor 등, 2012). 시차적 RNA 전사물을 위한 정규화된 값의 열-맵핑은 계층적 클러스터링 및 TreeView 소프트웨어, 버전 1.1에 의해 수행되었다(참조: Eisen 등, 1998). 정규화 후, TCR Vα 및 Vβ의 퍼센트는 이미 기재된 바와 같이 카운트 데이터로부터 유도되었다(참조: Zhang 등, 2012).
고처리량 CDR3 심층-서열분석. TCRβ CDR3 영역을 증폭시키고, 1x106 T 세포(Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit, Qiagen)로부터 추출되고, 상기한 바와 같이 ImmunoSEQ 플랫폼(Adaptive Technologies, Seattle, WA) 상에서 수행된 DNA로부터 서열분석했다(참조: Robins 등, 2009).
두개내 신경교종 이종이식편 뮤린 모델에서 T 세포의 생체 평가
모든 동물 실험은 승인된 동물 프로토콜 ACUF 11-11-13131하에 MD 앤더슨 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침 및 규정하에 수행되었다. 사용된 모든 마우스는 7 내지 8주령 암컷 NOD.Cg-PrkdcscidIL2Rγtm1Wjl/Sz 균주(NSG)(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)였다.
가이드- 스크류의 이식. 7 내지 8주령 마우스를 0.1mL/10g으로 투여된 케타민/크실라진 칵테일(10mg/mL 케타민, 0.5mg/mL 크실라진)을 사용하여 마취시켰다. 가이드-스크류의 이식은 상기한 바와 같이 수행했다(참조: Lal 등, 2000) 일단 자극에 무반응이면, 두부의 수술 영역은 털을 면도하여 제조하고, 포비돈-요오드(요오드 원소와 복합된 폴리비닐피롤리돈) 살균 용액으로 처리했다. 수술 무균 기술을 사용하여, 두개골의 중앙으로부터 아래로 1cm 절개를 수행했다. 개구부는 견고한 원형 압력을 사용하여 드릴(DH-0, Plastics One)로부터 1mm 연장하여 1mm 드릴 비트(DH#60, Plastics One, Roanoke, VA)를 사용하여 제조했다. 중앙에 0.50mm의 개구부를 갖고 축 직경이 1.57mm인 가이드-스크류(Plastics One, cat # C212SG)를 스크류드라이버(SD-80, Plastics One)를 사용하여 드릴 부위에 삽입했다. 절개 부위를 봉합하고, 마우스는 수술후 진통제로서 0.1mL/10g으로 투여되는 0.01mg/mL 부프레노르핀을 제공했다. 완전한 이동성이 회복될 때까지 마우스는 저전력 열원 상의 수술로부터 회수했다.
U87- ffLucm -Kate 또는 U87med - ffLuc - mKate 종양 세포의 이식. 마우스는 상기한 바와 같이 두개내 종양이 확립되기 전 2 내지 3주 동안 가이드-스크류 이식으로부터 회수했다(참조: Lal 등, 2000). U87-ffLuc-mKate 또는 U87med-ffLuc-mKate는 실온에서 세포 해리 완충제, 효소 비함유 PBS (Gibco)에 의한 10분 배양 후 조직 배양 용기로부터 해리시켰다. 세포는 혈구계를 사용하는 트립판 블루 배제로 계수하고, 200xg에서 8분 동안 원심분리했다. 원심분리 후, 세포를 멸균 PBS에 최종 농도 50,000 세포/μL로 재현탁시켰다. 마우스를 이소플루란(2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로-에탄)으로 마취시키고, 상기한 바와 같이 절개용으로 제조했다. 마우스가 수술 준비를 받는 동안, 무딘 바늘이 장착된 26게이지 10μL 해밀턴 주사기(Hamilton Company, Reno, NV cat# 80300)는 주사기의 말단으로부터 2.5mm에 플라스틱 가드를 배치하고 250,000 세포를 함유하는 세포 현탁액 5 μL를 부하하여 제조했다. 절개 부위를 개방한 후, 주사기를 가이드 스크류 개구부에 삽입하고, 세포를 일정한 느린 압력으로 주입했다. 주입 완료 후, 주사기를 추가의 30초 동안 소정의 위치에 유지시켜 두개내 압력이 발산되도록 한 다음, 서서히 제거했다. 절개부를 봉합하고, 마우스는 이소플루란 노출로부터 제거했다. 이식 날은 연구 0일째로서 지정된다. 1일 및 4일째에, 성공적인 종양 생착을 보증하기 위해 상기한 바와 같이 비침습적 생물발광 이미징을 통해 영상화했다. 이어서, 마우스를 상대적 종양 플럭스를 균일하게 분배하기 위해 3 그룹으로 나눈 다음, 세툭스-CAR+ T-세포 치료, 니모-CAR+ T-세포 치료 및 무치료를 수용하도록 무작위로 할당했다.
U87- ffLuc - mKate 또는 U87med - ffLuc - mKate의 비침습성 생물발광 이미징. 두개내 신경교종을 비침습적 및 연속적으로 영상화하고, 상대적 종양 부담의 척도로서 사용했다. 215μg의 D-루시페린 칼륨 염(Caliper Life Sciences, Perkin-Elmer)의 피하 주사 후 10분에, 종양 플럭스(양자/s/cm2/스테라디안)는 크세노겐 스펙트럼(Caliper Life Sciences, Perkin-Elmer) 및 리빙 이미지 소프트웨어(버전 2.50, Caliper Life Sciences, Perkin-Elmer)을 사용하여 측정하였다. 종양 플럭스는 마우스의 전체 두개 영역을 포함하는 목적하는 묘사 영역에서 측정하였다.
두개내 확립된 U87- ffLuc - mKate 또는 U87med - ffLuc - mKate 신경교종으로 CAR + T 세포의 전달. 두개내 신경교종 이종이식편의 치료는 종양 확립 5일째에 개시하고, 총 3개의 T 세포 주입 동안매주 계속했다. 완료된 3 자극 주기를 갖는 CAR+ T 세포는 유동 세포 분석법에 의해 >85% CAR-발현성인 것으로 확인된 다음, 생존 세포는 자동화 세포 카운터(Cellometer, Auto T4 Cell Counter, Nexcelcom)를 사용하는 트리판 블루 배제로 계수했다. CAR+ T 세포를 300xg에서 5분 동안 회전시키고, 0.6x106/μL의 농도로 멸균 PBS에 재현탁시켰다. 마우스는 상기한 바와 같이 두개 절개용으로 준비하고, 이소플루란 노출에 의해 마취시켰다. 마우스를 준비하는 동안, 무딘 바늘이 장착된 26게이지, 10μL 해밀턴 주사기(Hamilton Company, cat# 80300)는 플라스틱 가드를 주사기 말단으로부터 2.5mm에 배치하고, 3x106 T 세포를 함유하는 5μL의 세포 현탁액을 부하하여 제조했다. 주사기는 가이드-스크류에 삽입하고 두개내 공간으로 2.5mm 연장하고, 느린 일정한 압력으로 주입했다. 주사기를 비운 후, 이는 추가의 30초 동안 소정의 위치에 유지시켜 두개내 압력이 발산되도록 하였다. 주사 후, 절개부는 밀폐 봉합하고, 마우스는 이소플루란 노출로부터 제거하였다.
마우스의 생존 평가. 마우스는, 그들이 진행형 체중 감소(체질량의 >25%), 급속한 체중 감소(48시간 이내에 체질량의 >10% 감소) 또는 뒷다리 마비, 또는 다음 질병의 임상적 증상 중 임의의 두 개를 나타낼 때 희생시켰다: 운동실조, 구부리는 자세, 불규칙한 호흡 속도, 노출된 종양의 궤양 또는 1.5cm를 초과하는 감지가능한 종양 직경.
통계
모든 통계 분석은 GraphPad 프리즘, 버전 6.03으로 수행하였다. 공여체-매칭된 이원 ANOVA에 의한 사이토카인 생산, 생존율, 증식, 및 표면 표현형, 세포 확대의동역학, 장기간 세포독성 및 크롬 방출 검정의 유동 세포 분석법 및 다중 비교을 위한 터키의 후-테스트를 포함하는 모든 시험관내 세포 배양 실험의 통계 분석. 기능과 항원 밀도의 상관관계는 선형 경향을 위한 후-테스트를 갖는 일원 ANOVA로 수행하였다. 종양의 생체내 생물발광 이미징의 분석은 반복 측정과 다중 비교를 위한 시닥의 후-테스트를 갖는 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 동물 생존 데이터의 통계 분석은 로그-랭크 (Mantel-Cox) 시험에 의해 수행하였다. 발견의 유의성은 다음과 같이 정의된다: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p <0.0001.
실시예 2 - 항-CD3이 부하된 인공 항원 제시 세포에 의한 T 세포의 수치 확대
DNA 통합에 의해 달성된 안정한 CAR 발현을 통한 항원-의존성 자극은 CAR+ T 세포를 임상적으로 실현가능한 수치로 수치 확대하기 위해 사용될 수 있다. RNA 전송을 통해 CAR 발현의 일시적 특성은 CAR의 RNA 전송 이전에 달성되는 임상적으로 실현가능한 수치로의 T 세포의 수치 확대를 필요로 한다. 항원에 독립적인 T 세포를 수치 확대하는 aAPC의 능력을 결정하기 위해, 항-CD3 (OKT3)을 고친화성 Fc 수용체 CD64의 안정한 발현을 통해 K562 상에 부하시켰다(도 1a). K562는 또는 CD86, 41BB-L, 및 추가의 T-세포 공자극을 위한 멤브레인 결합 IL-15를 발현시켰다. T 세포 확대를 자극하기 위해 공배양에서 aAPC 밀도의 영향을 결정하기 위해, 건강한 인간 공여체로부터 유래하는 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 IL-2의 존재하에 저밀도, 10개의 T 세포 대 1개의 aAPC (10:1) 또는 고밀도, 1개의 T 세포 대 2개의 aAPC (1:2)로 γ-조사된 aAPC와 함께 공배양했다. T 세포는 9일 후 aAPC로 재자극하였다. aAPC 첨가의 두 주기 후, T 세포는 aAPC로 10:1 및 1:2 자극될 때 수치적으로 확대되지만; aAPC의 고밀도(1:2)를 갖는 T 세포가 통계적으로 우수한 수치 확대를 달성했다 (10:1 = 1083 ± 420 배 확대, 1:2 = 1891 ± 376 배 확대, 평균 ± S.D., n=6) (p<0.0001)(도 1b).
저밀도의 aAPC로 확대된 T 세포는 더 많은 aAPC로 확대된 T 세포보다 높은 비율의 CD8+ T 세포를 함유했다(10:1 = 53.9 ± 11.6% CD8, 1:2 = 28.1 ± 16.2% CD8, 평균 ± S.D., n=6) (p<0.001)(도 2a). CD8+ T 세포는 aAPC의 어느 하나의 비로 자극될 때 T 세포의 유사한 배 확대를 입증하지만, CD4+ T 세포는 더 적은 aAPC로 자극될 때 열등한 배 확대를 입증했다 (10:1 = 369 ± 227 CD4+ 배 확대, 1:2 = 1267 ± 447 CD4+ 배 확대, 평균 ± S.D., n=6) (p<0.0001)(도 2b). 감소된 배 확대가 더 적은 aAPC를 갖는 배양물에서 증가된 CD4+ T 세포사에 기인했는지를 결정하기 위해, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 아넥신 V 및 요오드화프로피듐(PI)으로 염색하고, 세포 생존율을 결정하기 위해 유동 세포 분석법으로 분석했다. 저밀도 또는 고밀도 aAPC로 자극될 때 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 생존 세포의 비율의 차이는 없었다(도 2c). CD4+ T 세포의 감소된 배 확대가 감소된 증식 속도에 기인했는지를 결정하기 위해, T 세포는 세포내 Ki-67 발현을 위한 aAPC로 자극 후 9일 동안 염색하고, 유동 세포 분석법으로 분석했다. CD8+ T 세포는 저밀도 또는 고밀도의 aAPC로 자극될 때 유사한 증식을 입증했지만, CD4+ T 세포는 고밀도 aAPC보다 저밀도 aAPC로 자극될 때 감소된 증식을 입증했다(도 2d). 이러한 데이터는, 저밀도의 aAPC로 T 세포를 자극하면, 저밀도의 aAPC에 대응하여 CD4+ T 세포의 감소된 증식에 기인하는 CD8+ T 세포의 증가된 비율을 특징으로 하는, 고밀도의 aAPC로 자극된 T 세포보다 적은 전체 T 세포 확대를 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 3 - 저밀도 aAPC로 확대된 T 세포는 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포보다 더 많은 메모리형 표현형을 입증한다
저밀도 또는 고밀도 aAPC에 의한 확대가 T-세포 표현형에 영향을 미쳤는지를 결정하기 위해, mRNA 전사물(림프구-특이적 코드세트)의 패널의 발현은 nCounter 분석(Nanostring Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 다중 디지털 프로파일링에 의해 분석했다. 유의한 시차적 유전자 발현은 저밀도(10:1 T 세포:aAPC) 또는 고밀도(1:2 T 세포:aAPC) aAPC로 확대된 분류된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 p<0.01 및 1.5를 초과하는 배수 변화에 의해 결정되었다. 고밀도 aAPC로 확대된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 CD4+ T 세포 중 CD38 및 그랜자임 A 및 CD8+ T 세포 중의 CD38 및 NCAM-1와 같은 T-세포 활성화와 관련된 유전자의 증가된 발현을 입증했다(도 3). 대조적으로, 저밀도 aAPC로 확대된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 Wnt 신호전달 경로 전사 인자 Lef1 및 Tcf7, CCR7, CD28, 및 IL7Rα를 포함하여 중앙 메모리 또는 천연 T 세포와 관련된 유전자의 증가된 발현을 나타냈다(참조: Gattinoni 등, 2009; Gattinoni 등, 2012).
저밀도 또는 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포의 시차적 표현형을 추가로 평가하기 위해, T 세포는 유동 세포 분석법에 의해 표현형 마커에 대해 분석하고, CCR7 및 CD45RA의 공발현에 의해 부분집합을 평가하였고, 여기서 CCR7+CD45RA+는 천연 표현형을 나타내고, CCR7+CD45RAneg는 중앙 메모리 표현형을 나타내고, CCR7negCD45RAneg는 이펙터 메모리를 나타내고, CCR7negCD45RA+는 CD45RA+ 이펙터 메모리 표현형을 나타낸다(참조: Geginat 등, 2003). 저밀도 aAPC로 확대로 CD4+ T 세포는 이펙터 메모리 표현형(10:1=61.9 ± 9.1%, 1:2= 92.1 ± 3.9%, 평균 ± S.D., n=3) (p<0.05)를 갖는 T 세포를 상당히 적게 함유하지만, 더 많은 중앙 메모리 표현형(10:1=36.5 ± 9.4%, 1:2=13.6 ± 2.4%, 평균 ± S.D., n=3) (p<0.05) T 세포를 함유??다(도 4a). 유사하게, 저밀도 aAPC로 확대된 CD8+ T 세포는 이펙터 메모리 표현형(10:1=66.1 ±12.5%, 1:2=89.1 ± 1.7%, 평균 ± S.D., n=3) (p<0.05), 그러나 더 많은 중앙 메모리 표현형(10:1=32.3 ± 11.7%, 1:2=6.5 ± 2.8%, 평균 ± S.D., n=3) (p<0.05)을 갖는 T 세포를 상당히 적게 함유했다. 저밀도 aAPC로 자극된 상당히 적은 CD4+ T 세포는 그랜자임 B(p<0.001)를 생성하고, 저밀도 aAPC로 자극된 보다 적은 CD8+ T 세포는 그랜자임 B(p<0.05) 또는 퍼포린(p<0.001)을 생성한다(도 4b). PMA/이오노마이신으로 자극될 때, 저밀도 및 고밀도 aAPC로 확대된 CD4+ T 세포는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 동등한 생산을 입증했지만, 저밀도 aAPC로 자극된 CD8+ T 세포는 상당이 적은 IFN-γ (p<0.001) 및 TNF-α (p<0.05)의 생산, 그러나 더 많은 IL-2 (p<0.05)의 생산을 입증했다(도 4c). 종합적으로, 이러한 데이터는, 저밀도 aAPC로 확대된 T 세포는 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포와 비교하여 중앙 메모리 표현형을 갖는 T 세포의 비율 증가, 이펙터 분자 그랜자임 B 및 퍼포린의 생산 감소, 및 이펙터 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 생산 감소를 함유한다.
실시예 4 - T 세포의 수치 확대는 TCRαβ 다양성에서 최소의 변화를 초래한다
TCRα 및 TCRβ 다양성은 저밀도 및 고밀도 aAPC에 의한 확대 전후에 nCounter 분석(Nanostring Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 다중 디지털 프로파일링에 의해 프로파일링하였고, 전체 T-세포 집단의 비율로서 각 TCRα 및 TCRβ 쇄의 상대적 풍부함을 계산했다. 저밀도 및 고밀도 aAPC에 의한 생체외 확대 후, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 다양한 TCRα 및 TCRβ 대립유전자를 발현시켜, 생성되는 집단이 올리고클로날 TCRα 및 TCRβ 레퍼토리를 유지시켰음을 나타낸다(도 5 및 도 6). 저밀도 및 고밀도의 aAPC에 의한 확대 전후에 T 세포 중의 TCRβ 쇄에서 ImmunoSEQ 플랫폼(Adaptive TCR Technologies, Seattle, WA)을 사용하는 CDR3 영역의 고처리량 서열분석은 생체외 확대가 T 세포의 클로날 조성의 변화를 초래했는지를 결정하기 위해 수행하였다. 확대 전후의 개별적 CD3 서열의 상대적 계수를 플롯팅하고, 선형 회귀에 적합화했다. 확대 전후의 CDR3 서열의 수가 동일하였다면, 선형 회귀의 기울기는 1.0일 것으로 기대될 것이다. 저밀도 aAPC로 확대된 T 세포에서, 선형 회귀의 기울기는 0.75 ± 0.001인 반면, 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포에서, 선형 회귀의 기울기는 0.29 ± 0.003이었다(도 7). 이는, 저밀도 aAPC로 확대된 T-세포 집단이 고밀도 aAPC로 확대된 T 세포보다 입력 T-세포 집단으로부터 더 많은 CD3 서열을 유지시킨다는 것을 나타낸다. 요약하면, T 세포의 생체외 확대는 저밀도 및 고밀도 aAPC로 확대되었을 때 올리고클로날 T-세포 집단을 초래하지만, 저밀도 aAPC로 확대된 T 세포는 확대 후 적은 클로날 손상을 입증할 수 있다.
실시예 5 - aAPC로 수치 확대된 T 세포로 RNA 전송
전기 전달에 의해 RNA를 수용하는 저밀도 및 고밀도 aAPC로 자극된 T 세포의 능력을 결정하기위해, 그린 형광 단백질(GFP)를 코딩하는 시험관내 전사된 RNA는 aAPC로 자극 후 4일 동안 자극된 T 세포에 대해 제조업자 권장된 프로그램인 프로그램 EO-115를 포함하는 다양한 전기천공 프로그램을 사용하는 아막사 뉴클레오펙터 4D 형질감염 시스템(Lonza, Cologne, Germany)을 사용하여 전기전달하였다. GFP의 평균 형광 강도(MFI) 대 PI 염색에 의해 결정된 T 세포의 생존율의 플롯팅은 RNA 전송 후 GFP 발현과 T-세포 생존율 사이의 역 상관관계를 나타냈다. 저밀도 aAPC로 자극된 T 세포와 비교하면, 고밀도 aAPC로 자극된 T 세포는 RNA 전송에의한GFP의 발현 감소 및 시험된 모든 전기천공 프로그램에 대응하여 생존율 감소 둘 다를 입증했다(도 8a). 그 결과, 저밀도 aAPC(10개의 T 세포 대 1개의 aAPC)로 자극된 T 세포는 모든 추가의 실험에 사용되었다. RNA 전송 이전의 T-세포 수치 확대가 주입을 위한 임상적으로 관련된 T-세포 수를 달성하기 위해 바람직하기 때문에, 전기전달에 의해 RNA 전사물을 수용하기 위해 9일 동안 모든 aAPC의 반복 첨가로 자극의 복수의 라운드를 경험하는 T 세포의 능력을 평가했다. 자극의 각각의 연속적 라운드에서, RNA 전기전달 후 GFP의 발현은 감소되었다(도 8b, 좌측 패널). 그러나, 자극의 두 라운드 후, T 세포는 단일 라운드의 자극 또는 3 라운드의 자극을 경험한 T 세포와 비교하여 전기전달 후 향상된 생존율을 입증했다(도 8b, 우측 패널). 따라서, 10개의 T 세포 대 1개의 aAPC에 의한 2 라운드의 자극의 자극 프로토콜은 RNA 전사물 전사의 추가의 최적화를 위해 선택했다. RNA가 세포에 대해 덜 독성이고 DNA보다 많은 세포 유형으로 더 용이하게 전송되기 때문에(165), RNA 전송 효율은 자극된 T 세포 EO-115를 위한 제조업자 권장 전기천공 프로그램의 강도를 감소시킴으로써 T-세포 생존율을 손상시키지 않고 향상시킬 수 있었다. GFP를 발현시키는 세포의 비율 대 PI 염색으로 결정된 생존율을 플롯팅함으로써, 프로그램은, 전기천공 후 24시간에 약 100%의 GFP 발현 및 전기천공되지 않은 T 세포, 프로그램 DQ-115와 우사한 T-세포 생존율을 초래했음을 확인했다(도 8c). T-세포 표현형은 RNA의 전기전달이 T 세포 표현형을 변경하는지를 결정하기 위해 최적의 프로토콜에 의한 전기천공 후 평가했다. RNA 전사물을 사용하거나 사용하지 않는 전기천공 후 T-세포 표현형에서는 어떤 변화도 검출되지 않았다(도 8d). 따라서, 플랫폼은 T-세포 생존율을 손상시키지 않고 RNA 전사물의 고발현을 초래하는 aAPC와의 공배양을 통해 수치 확대 후 T 세포로 RNA 전송을 위해 개발되었다.
실시예 6 - DNA 또는 RNA 전송에 의해 변형된 CAR 발현 및 표현형 T 세포
CAR의 발현 및 RNA 및 DNA 변형에 의해 제조된 CAR+ T 세포의 기능을 비교하기 위해, EGFR-특이적 CAR은 임상적으로 이용가능한 항-EGFR 모노클로날 항체인 세툭시맙의 scFv로부터 개발하였다. 세툭시맙의 scFv를 세툭스-CAR이라 칭명되는 제2 세대 CAR을 형성하기 위해, IgG4 힌지 영역, CD28 막관통 및 세포질도메인, 및 CD3-ζ 세포질 도메인에 융합시키고, 영구적인 DNA 통합을 위한 슬리핑 뷰티 트랜스포손에서 뿐만 아니라 RNA 전사물의 시험관내 전사를 위한 pGEM/A64 벡터 중의 T7 프로모터하에 발현시켰다. T 세포의 RNA-변형은 제2 자극 후 4일 동안 OKT3-부하된 K562 aAPC로 2회 자극된 T 세포로 시험관내 전사된 세툭스-CAR을 전기전달함으로써 달성되었다(도 9a). CAR 발현은 전기전달 후 24시간에 평가했다. 안정한 DNA 통합을 위해, SB 트랜스포손에서 발현된 세툭스-CAR은 인간 제1 T 세포에서 SB11 트랜스포사제로 전기천공시키고, 트랜스포손으로부터 CAR을 정제하고, 역전된 TA에서 숙주 T-세포 게놈에 삽입하는 절단-및-페이스트 효소를 반복한다. γ-조사된 EGFR+ K562 aAPC에 의한 반복적 자극은 경시적으로 CAR-발현 T 세포의 선택적 확대를 유도하고, T 세포는 7일 마다 반복적 aAPC 첨가의 5 주기로 이루어진 28일 후 CAR 발현에 대해 평가했다(도 9b). CAR의 IgG4 힌지 영역에 대해 유동 세포 분석법에 의해 측정된 바와 같이 CD4+ 및 CD8+에서 RNA-변형 및 DNA-변형에 의한 세툭스-CAR의 발현은 통계적으로 상이하지 않았지만(p>0.05), RNA-변형은 발현 강도에서 더 큰 변화를 초래했다(도 10a). 세툭스-CAR-발현 T 세포 중, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 RNA 또는 DNA로 변형된 T 세포 사이에서 통계적으로 상이하지 않았지만, RNA-변형된 CAR+ T 세포보다 DNA-변형된 세포에 존재하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율에서 더 큰 변화가 존재했다(도 10b).
RNA-변형 또는 DNA-변형에 의해 세툭스-CAR을 발현시키는 T-세포 집단의 표현형을 비교하기 위해, 표현형 마커는 유동 세포 분석법으로 분석했다. CD4+ RNA-변형된 CAR+ T 세포는 CD4+ DNA-변형된 CAR+ T 세포보다 중앙 메모리 표현형을 갖는 T 세포를 상당히 많이 갖지만(CCR7+CD45RAneg)(DNA-변형됨=6.6 ± 1.9%, RNA-변형됨=49.6 ± 3.0%, 평균 ± S.D., n=3) (p<0.0001), 이펙터 메모리 표현형을 갖는 T 세포는 상당히 적게 갖는다(CCR7negCD45RAneg) (DNA-변형됨=89.8 ± 2.6%, RNA-변형됨=48.1 ± 3.3%, 평균 ± S.D., n=3) (p<0.0001) (도 10c). 유사하게, CD8+ RNA-변형된 CAR+ T 세포는 CD8+ DNA-변형된 CAR+ T 세포보다 중앙 메모리 표현형을 갖는 T 세포를 상당히 더 갖지만(DNA-변형됨=10.4 ± 4.9%, RNA-변형됨=32.8 ± 4.2%, 평균 ± S.D., n=3) (p<0.001), 이펙터 메모리 표현형을 갖는 T 세포는 상당히 적게 갖는다(DNA-변형됨=83.5 ± 5.4%, RNA-변형됨=51.1 ± 6.6%, 평균 ± S.D., n=3) (p>0.0001). RNA에 의해 변형된 CD4+ 세툭스-CAR+ T 세포는 또한 CD4+ 세툭스-CAR+ T 세포보다 억제성 수용체 프로그래밍된 사망 수용체 1(PD-1)의 상당히 높은 발현을(p<0.01), 그러나 T-세포 서열의 마커, CD57의 유사한 낮은 발현을 입증했다(도 10d). CD8+ 세툭스-CAR+ T 세포는 낮은 수준의 PD-1 및 CD57을 발현시켰고, RNA-변형된 및 DNA-변형된 CAR+ T 세포의 인지가능한 차이는 없었다. 최종적으로, 세포독성 분자 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현은 세툭스-CAR의 DNA 또는 RNA 전송에 의해 변형된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 유사했다(도 10e). 요약하면, RNA 전송이 CAR 발현 강도의 변동성을 증가시켰지만, CAR+ T 세포의 RNA-변형 및 DNA-변형은 CAR의 유사한 발현 수준을 유도했다. RNA-변형된 T 세포는 더 많은 중앙 메모리 표현형 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 더 적은 이펙터 메모리 표현형 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 발현시켰고, DNA-변형된 T 세포보다 CD4+ CAR+ T 세포에 대한 억제성 수용체 PD-1의 더 높은 발현을 가졌다.
실시예 7 - DNA-변형된 CAR + T 세포는 더 많은 사이토카인을 생성하고, RNA-변형된 CAR + T 세포보다 약간 더 세포독성을 나타낸다
RNA-변형 또는 DNA-변형 CAR+ T 세포의 사이토카인 생산은 절단된 EGFR, tEGFR+ EL4, 또는 무관계 항원, CD19, 및 인간 교아종 세포주 U87, T98G, LN18 및 인간 표피암 세포주 A431을 포함하는 EGFR+ 세포주를 발현시키도록 변형된 마우스 T 세포 림프종 세포주 EL4에 대응하여 평가하였다. RNA 전송에 의해 변형된 더 적은 CD8+ CAR+ T 세포가 모든 EGFR-발현세포주에 대응하여 IFN-γ를 생성했다(도 11a, 좌측 패널). 적은 수의 RNA-변형 T 세포가 PMA/이오노마이신에 의한 항원-독립적 자극에 대응하여 IFN-γ를 생성하기 때문에, 감소된 IFN-γ 생산이 사이토카인을 생성하기 위한 RNA-변형에 의해 CAR을 발현시키는 T 세포의 감소된 용량보다 항원에 대한 CAR의 감소된 감도에 기인할 가능성은 없다. DNA-변형 CAR+ T 세포가 또한 T 세포 자극의 부재하에 IFN-γ의 높은 배경 생산을 입증하였다는 것이 주시되었다. 유사하게, DNA-변형 CD8+ CAR+ T 세포보다 적은 수의 RNA-변형 CD8+ CAR+ T 세포는 T98G, LN18, A431으로부터의 EGFR-특이적 자극 및 PMA/이오노마이신으로부터의 항원-독립적 자극에 대응하여 TNF-α를 생산했다(도 11a, 우측 패널).
RNA-변형 CAR+ T 세포가 DNA-변형 CAR+ T 세포에 비해 사이토카인을 생성하는 능력의 감소를 입증했기 때문에, RNA-변형 및 DNA-변형 T 세포의 세포독성을 비교하여 DNA-변형 CAR+ T 세포에 비해 RNA-변형 CAR+ T 세포의 세포독성 가능성을 결정하였다. CD19+ EL4 세포에 대응하여, 높은 이펙터 대 표적 비(E:T = 20:1)에서, RNA-변형 CAR+ T 세포는 DNA-변형 CAR+ T 세포보다 상당히 더 많은 배경 용해를 입증했지만(p<0.05), RNA-변형 및 DNA-변형 CAR+ T 세포는 배경 사멸의 낮은 수준을 가졌다(도 11b) . 유사하게, RNA-변형 및 DNA-변형 CAR+ T 세포는 B-세포 림프종 세포주, NALM-6에 대한 배경 용해의 낮고 동등한 수준을 입증했다. tEGFR+ EL4 및 A431에 대응하여, RNA-변형 또는 DNA-변형 CAR+ T 세포에 의해 매개된 세포독성의 인지가능한 차이가 없었다. 3개의 신경교종 세포주 U87, T98G 및 LN18에 대응하여, DNA-변형 CAR+ T 세포는 단지 낮은 E:T 비에서 검출된 RNA-변형 CAR+ T 세포에 비해 약간 증가된 세포독성을 입증했다. RNA-변형 T 세포가 공여체로부터 공여체까지 CAR 발현에서 DNA-변형 T 세포보다 많은 가변성을 갖기 때문에, A431의 특이적 용해에 대한 CAR 발현의 영향은, CAR 발현의 중간 형광 강도에 의해 결정된 바와 같이, 평가했다. CAR 발현의 중간 형광 강도는 A431의 특이적 용해에 대해 플롯팅하고, 관계의 선형 회귀는 0과유의하게 상이하지 않은 기울기를 수득하고, 따라서 CAR 발현과 특이적 용해 사이에서 검출된 유의한 경향을 나타내지 않았다(기울기 =0.0237±0.030, p=0.4798) (도 11c). 요약하면, 이러한 발견은, DNA-변형 CAR+ T 세포가 RNA-변형 CAR+ T 세포에 비해 이펙터 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 생산이 상당히 증가되었고, 낮은 E:T 비로 존재할 때 약간 더 세포독성을 입증할 수 있고, RNA-변형 CAR+ T 세포에서 CAR 발현의 변동성이 표적의 특이적 용해에 상당히 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
실시예 8 - T 세포의 RNA 변형에 의한 세툭스-CAR의 일시적 발현
RNA 전송에 의한 CAR 발현의 안정성을 결정하기 위해, T 세포는 RNA 전송에 의해 CAR를 발현시키도록 변형되었고, CAR 발현은 유동 세포 분석법에 의해 경시적으로 측정했다. RNA 전송 후, T 세포에 대한 세툭스-CAR의 발현은 경시적으로 감소되었고, 전기전달 후 96시간에, CAR은 낮은 수준에서 발현시켰다(도 12a). RNA 전사물이 T 세포 증식 동안 딸 세포 사이에서 분할되기 때문에, T 세포 증식의 자극은 RNA-변형에 의해 발현된 CAR의 손실을 촉진시켜야 한다. CAR 발현 수준에 대한 사이토카인 자극의 효과를 결정하기 위해, 외인성 IL-2 및 IL-21은 RNA 전송 후 24시간에 RNA-변형 CAR+ T 세포 배양물에 첨가하고, CAR 발현은 유동 세포 분석법에 의해 모니터링했다. CAR+ T 세포의 IL-1 및 IL-21에 의한 자극은 CAR 발현의 손실을 촉진시켰다(도 12b). 72시간 후, CAR 발현은 RNA-변형 T 세포 상에서 낮았고, 전송 후 96시간에, T 세포는 검출가능한수준에서 CAR을 더 이상 발현시키지 않았다. RNA 전송 후 tEGFR+ EL4에 의한 RNA-변형 CAR+ T 세포의 자극은 CAR 발현의 손실을 더욱 더 촉진시켰다(도 12c). CAR은 tEGFR+ EL4 첨가 후 24시간(RNA 전송 후 48시간)에 tEGFR+ EL4의 첨가 전 RNA-변형 CAR+ T 세포에서 높은 수준에서 검출된 반면, CAR 발현은 낮았다. 종합적으로, 이러한 데이터는, RNA 전송에 의한 CAR 발현은 RNA 전송 후 120시간까지 낮은 수준에서 검출가능하게 일시적이지만, 사이토킨 또는 항원의 인식을 통한 T 세포의 자극이 CAR 발현의 손실을 촉진시켰음을 나타낸다.
실시예 9 - RNA 변형에 의한 세툭스 -CAR의 일시적 발현은 사이토카인 생산 및 EGFR-발현 세포에 대한 세포독성을 감소시킨다
RNA 전송에 의해 세툭스-CAR을 발현시키도록 변형된 T 세포의 활성은 EGFR-발현 세포에 대응하여 T 세포의 활성에 대한 CAR 발현의 손실의 효과를 결정하기 위해 RNA 전송 후 24 및 120시간에 측정했다. RNA-변형 T 세포는 RNA 전송 후 24시간 및 120시간에 평가될 때 PMA/이오노마이신 자극에 의한 IFN-γ의 동등한 생산성을 입증한 반면, RNA 전송 후 24시간에 T 세포에 의한 tEGFR+ EL4에 대응하여 IFN-γ의 생산은 RNA 전송 후 120시간에 폐기되었다(24 hrs=14.2 ± 2.5%, 120 hrs=1.1 ± 0.03%, mean ± S.D., n=3) (p=0.012)(도 13a). 대조적으로, DNA-변형 CAR+ T 세포는 평가된 두 시점에서 tEGFR+ EL4에대응하여 IFN-γ의 동등한 생산성을 입증했다(24시간=40.3 ± 9.6%, 120시간=48.6 ± 10.0%, 평균 ± S.D., n=3) (p=0.490). 유사하게, 특정 세포독성은 EGFR을 발현시키는 인간 정상 신장 상피 세포(HRCE) 및 표피암 세포주 A431에 대해 측정했다. RNA-변형 및 DNA-변형 CAR+ T 세포는 A431의 동등한 특이적 용해, 및 높은 이펙터 대 표적 비(20:1 및 10:1, p>0.05)에서 통계적으로 동등한 HRCE에 대한 유사한 세포독성을 입증했다(도 13b). 다른 세포주에 의한 관찰과 유사하게, DNA-변형 CAR+ T 세포는 낮은 E:T 비(5:1, p<0.05; 2.5:1, p<0.01, 1.25:1, p<0.05)에서 RNA-변형 CAR+ T 세포보다 약간 더 높은 HRCE의 특이적 용해를 매개했다. 그러나, RNA 전송 후 120시간에, RNA-매개된 T 세포의 CAR 발현이 폐기되면, DNA-변형 T 세포는 평가된 모든 E:T 비에서 A431 및 HRCE에 대응하여 상당히 더 높은 특이적 용해를 매개했다(A431, 모든 E:T 비, p<0.0001; HRCE, 모든 E:T 비, p<0.0001). DNA-변형 T 세포는 각 시점에서 HRCE의 특이적 용해에서 어떤 변화도 없음을 입증한 반면(10:1 E:T 비, 24시간=45.5 ± 8.0%, 120시간=51.6 ± 7.8%, p>0.05, n=3), RNA-변형 T 세포는 RNA 전송 후 120시간까지 HRCE의 특이적 용해를 상당히 감소시켰다(10:1 E:T 비, 24시간=39.5 ± 5.9%, 120시간=19.8 ± 10.2%, 평균 ± S.D., n=3)(도 13c). 이러한 데이터는 DNA-변형 T 세포가 아니라 RNA-변형 T 세포의 활성이 EGFR-발현 표적에 대응하여 CAR 발현의 손실에 의해 감소된다는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 세툭스-CAR + 및 니모-CAR + T 세포는 표현형이 유사하다
니모-CAR로 지정된, 니모투주맙으로부터 유래된 제2 세대 CAR은 니모투주맙의 scFv을 세툭스-CAR과 동일한 구성으로 IgG4 힌지 영역, CD28 막관통 도메인 및 CD28 및 CD3ζ 세포내 도메인과 융합시킴으로써 슬리핑 뷰티 트랜스포손에서 생성되었다. 세툭스-CAR 및 니모-CAR은 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서 SB11 트랜스포사제에 의한 각 트랜스포손의 전기천공에 의해 1차 인간 T 세포에서 발현되었다. 세툭스-CAR 또는 니모-CAR의 안정한 통합을 갖는 T 세포는 γ-조사된 tEGFR+ K562 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 의한 매주 반복 자극에 의해 선택적으로 증식되었다(도 14a). 두 CAR은 aAPC와 공배양 28일에 걸쳐 CAR+ T 세포의 약 1000배 확대를 매개하여 거의 모두 CAR을 발현시키는 T 세포를 수득한다(세툭스-CAR=90.8±6.2%, 니모-CAR=90.6±6.1%; 평균±SD, n=7)(도 14b 및 14c). CAR을 발현시키는 세툭스-CAR 및 니모-CAR+ T 세포의 비율은 수치 확대 28일 후 통계적으로 유사했다(p=0.92, 스튜던츠 양측 t-테스트). 중간 형광 강도로 나타낸 CAR 발현의 밀도는 유동 세포 분석법으로 측정하였고, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포 집단 사이에서 통계적으로 유사했다(세툭스-CAR=118.5±25.0 A.U., 니모-CAR=112.6±21.2 A.U.; 평균±SD, n=7) (p=0.74)(도 14d).
T-세포 기능에 대한 CAR scFv의 영향을 결정하기 위해, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포의 전기천공 및 증식은 표현형이 유사한 T -세포 집단을 유도하도록 확립되었다. 각 공여체는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 가변 비를 수득하지만(표 1), 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포 사이의 CD4/CD8 비의 통계적 차이는 없었다(p=0.44, 스튜던츠 양측 t-테스트)(도 15a). 분화 마커 CD45RO, CD45RA, CD28, CD27, CCR7 및 CD62L의 발현은 통계적으로 유의하지 않았고(p>0.05), 이종 T-세포 집단을 나타낸다(도 18b). 마찬가지로, 노화 CD57 및 KLRG1 및 억제성 수용체 프로그램화 사망 수용체 1(PD-1)의 마커는 낮고, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T-세포 집단 사이에서 통계적으로 상이하지 않은 것으로 밝혀졌다(p>0.05)(도 15c). 전체적으로, 이러한 발견은, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포가 전기천공 및 증식 후, CAR 발현을 포함하여 직접 비교를 가능하게 하는 검출가능한 표현형 차이를 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
표 1. 세툭스 -CAR + 및 니모 CAR + T 세포에서 CD4 및 CD8 세포의 비율.
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확대 28일 후, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포에서 CD4 및 CD8의 발현은 유동 세포 분석법으로 결정하였다. 7개의 독립적 공여체로부터의 데이터.
실시예 11 - 세툭스 -CAR + 및 니모 -CAR + T 세포는 CAR-의존성 T-세포 활성화를 위한 동등한 능력을 갖는다
세툭스-CAR 및 니모-CAR이 EGFR에 의한 자극에 대응하여 기능적이었음을 확인하기 위해, CAR+ T 세포는 고수준의 EGFR, 약 1x106 분자 EGFR/세포를 발현시키는 것으로 보고되어 있는 A431 표피암 세포주와 함께 배양했다(참조: Garrido 등, 2011). 세툭스- 및 니모- CAR+ T 세포는 EGFR에 대한 결합을 차단하는 항-EGFR 모노클로날항체의 존재하에 감소된 A431과의 공배양 동안 IFN-γ를 생성했다(도 16a). 세툭스-CAR 및 니모-CAR이 동등하게 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 확인하기 위해, scFv 도메인과 독립적인 두 CAR에 의해 인식될 수 있는 표적을 생성시켰다. 이는 고정된 마우스 T 세포주 EL4 상의 CAR(CAR-L)의 IgG4 영역에 특이적인 활성화 항체의 scFv 영역을 발현시킴으로써 달성되었다(참조: Rushworth 등, 2014). CAR-L+ EL4에 의한 T 세포의 활성화는 tEGFR을 발현시키는 EL4 세포주에 의한 활성화와 비교했다. 정량적 유동 세포 분석법은 EL4 상에서 발현된 tEGFR의 밀도를 측정하기 위해 수행하였다. 이 방법에서, 형광성 항체로 표지된 공지된 항체 결합능을 갖는 미소구의 형광 강도는 유동 세포 분석법에 의해 측정되고, 공지된 항체 결합능과 평균 형광 강도(MFI) 사이의 선형 관계를 정의하는 표준 곡선을 유도하기 위해 사용되었다. 이어서, 표준 곡선은 동일한 형광 항체로 표지된 미지의 샘플의 평균 형광 강도로부터 항원의 평균 밀도를 도출하기 위해 사용될 수 있다. tEGFR+ EL4는 비교적 낮은 밀도, 약 45,000 분자/세포로 tEGFR을 발현시켰다(도 16b). 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ CD8+ T 세포는 CAR-L+ EL4에 대응하여, CAR-의존성 활성에 대한 동등한 능력을 나타내는 통계적으로 유사한 양의 IFN-γ를 입증했다(p>0.05)(도 16c). 세툭스-CAR+ T 세포는 EGFR+에 대응하여 IFN-γ를 생성한 반면, 니모-CAR+ T 세포로부터 인지가능한 IFN-γ 생산은 없었다(도 16c), 이는 낮은 항원 밀도에 대응하여 T 세포 활성화에 영향을 미치는 CAR의 scFv의 친화성과 일치한다. 사이토카인 생산을 측정하는 것 이외에, CD8+ T 세포는 T-세포 활성화의 하류 분자 Erk1/2 및 p38의 인산화에 대해 분석했다. CAR-L+ EL4에 대응하여 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포 사이에서 Erk1/2 (p>0.05) 또는 p38 (p>0.05)의 인산화에서 통계적 차이는 없었다(도 16d). 세툭스-CAR+ T 세포는 tEGFR+ EL4에 대응하여 Erk1/2 및 p38의 인산화를 나타낸 반면, 니모-CAR+ T 세포는 어느 하나의 분자를 인지가능하게 인산화하는데 실패했다. 유사하게, 세툭스-CAR 및 니모-CAR 둘 다가 CAR-L+ EL4에 대한 동등한 특이적 용해를 입증했다(10:1 E:T 비, 세툭스-CAR=64.5±6.7%, 니모-CAR=57.5±12.9%, 평균±SD, n=4)(p>0.05). 세툭스-CAR+ T 세포는 비특이적 표적 CD19+EL4에 비해 tEGFR+ EL4에 대응하여 상당한 특이적 용해를 입증한 반면(tEGFR+EL4=57.5±9.4%, tCD19+EL4=17.3±13.0, 평균±SD, n=4) (p<0.0001), 니모-CAR+ T 세포에 의한 tEGFR+ EL4의 상당한 용해는 없었다(tEGFR+EL4=21.2±16.9%, CD19+EL4=12.3±13.0, 평균±SD, n=4)(p>0.05) (도 16e). 내인성의 저친화성 T 세포 반응은 이펙터 기능을 달성하기 위해 항원과의 더 긴 상호작용을 필요로 할 수 있다(참조: Rosette 등, 2001), 따라서, t EGFR+ 및 CAR-L+ EL4 세포의 성장을 제어하는 CAR+ T 세포의 능력은 T 세포를 EL4와 1:1의 비율로 혼합하고 연장된 공배양에 대해 T 세포 대 EL4 세포의 비율을 평가함으로써 평가하였다. 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포는 5일 후 공배양물 중의 CAR-L+ EL4 세포의 낮은 비율에 의해 입증된 바와 같이 CAR-L+ EL4의 성장을 동등하게 제어했다(p>0.05)(도 16f). 세툭스-CAR+ T 세포는 tEGFR+EL4의 성장을 제어하여 5일 후 공배양물 중 10% 미만의 tEGFR+ EL4를 초래했다. 니모-CAR+ T 세포는 tEGFR+ EL4 세포 성장을 덜 제어할 수 있어서 세툭스-CAR+T 세포와의 공배양보다 더 유의하게(p<0.01) 5일후 공배양물의 80%를 차지하는 tEGFR+ EL4를 초래했다. 따라서, tEGFR+ EL4 상의 낮은 tEGFR 밀도에 대한 니모-CAR+ T 세포에 의한 감소된 반응은 불충분한 활성화 시간에 기인할 가능성은 없다. 요약하면, 이러한 데이터는, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포가 EGFR에 대한 기능적 특이성을 갖고, CAR-의존성, scFv-독립적 자극에 의해 동등하게 활성화될 수 있다는 것을 입증한다. 세툭스-CAR+ T 세포는 tEGFR+ EL4 상의 낮은 tEGFR에 대응하여 특이적 활성화할 수 있었지만; 이러한 EGFR 발현 밀도는 사이토카인을 생성하고, 하류 분자 Erk1/2 및 p38을 인산화하거나 특정 용해를 개시하는 니모-CAR+ T 세포의 활성화를 위해 충분하지 않았다.
실시예 12 - 니모 -CAR + T 세포의 활성화 및 기능적 반응은 표적 세포 상의 EGFR 발현 밀도에 의해 영향을 받는다
세툭스-CAR+ 및 니모- CAR+ T 세포의 활성화에 대한 EGFR 발현 밀도의 영향을 조사하기 위해, T-세포 기능을 EGFR 발현 밀도 범위를 갖는 세포주에 대해 비교했다: NALM-6, U87, LN18, T98G, 및 A431. 먼저, EGFR 발현 밀도는 정량적 유동 세포 분석법으로 평가했다(도 17a). B-세포 백혈병 세포주 NALM-6은 어떤 EGFR도 발현시키지 않았다. 인간 교아종 세포주 U87은 저밀도(약 30,000분자/세포)에서 EGFR을 발현시켰다. 모두 인간 교아종 세포주인 LN18 및 T98G는 중간 밀도(각각, 약 160,000 및 약 205,000 분자/세포)에서 EGFR을 발현시켰고, A431은 이전 보고와 유사하게 고밀도(약 780,000분자/세포)에서 EGFR을 발현시키는 것으로 밝혀졌다(참조: Garrido 등, 2011). 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ CD8+ T 세포는 높은 EGFR 밀도(p>0.05)를 갖는 A431 및 중간 EGFR 밀도(p>.05)를 갖는 LN18에 대응하여 통계적으로 유사한 IFN-γ 생산성을 입증했다. 그러나, 니모-CAR+ T 세포는 중간 EGFR 밀도(p<0.001)를 갖는 T98G 및 낮은 EGFR 밀도(p<0.001)를 갖는 U87에 대응하여 세툭스-CAR+ T 세포에 비해 감소된 IFN-γ 생산성을 입증했다(도 17b). 유사하게, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 A431 세포 (5:1 E:T 비, p>0.05) 및 T98G 세포 (5:1 E:T 비, p>0.05)의 통계적으로 동등한 용해를 입증한 반면, 니모-CAR+ T 세포는 LN18 세포 (5:1 E:T 비, p<0.05)의 특정 용해를 위한 일부 감소된 능력 및 U87 세포 (5:1 E:T 비, p< 0.01)의 특정 용해를 위한 감소된 능력을 입증했다(도 17c). 이러한 데이터는, 니모-CAR+ T 세포의 활성화가 EGFR 발현 밀도에 의해 영향을 받는다는 것을 지지한다. 그러나, 상이한 세포상 배경의 문맥에서 EGFR 밀도에 대한 기능을 평가하는 것은, 상이한 세포주가 T-세포 활성화 및 T-세포 매개된 용해에 대한 감수성에 대해 상이한 경향을 가질 수 있기 때문에, 이상적이지 않다.
실시예 13 - 니모 -CAR + T 세포의 기능의 활성화는 EGFR 발현 밀도와 직접 긍정적으로 상관된다
동계 세포상 배경 상의 EGFR 발현 밀도의 영향을 결정하기 위해, EFGR의 가변 밀도를 발현시키는 일련의 U87 세포주를 개발했다: 비변형된, 부모 U87 (약 30,000 분자의 EGFR/세포), U87low (130,000 분자의 EGFR/세포), U87med (340,000 분자의 EGFR/세포), 및 U87high (630,000 분자의 EGFR/세포)(도 18a). scFv-의존성 CAR 자극 후 Erk1/2 및 p38의 인산화를 비교하기 위해, U87 및 U87high 자극 후 니모-CAR+ T 세포와 세툭스-CAR+ T 세포 사이에 인산화 반응 속도의 차이가 없었음을 확인했다. 두 CD8+ CAR+ T 세포는 상호작용 후 45분에 Erk1/2 및 p38의 피크 인산화를 입증했고, 인산화는 상호작용 후 120분까지 감소하기 시작했다(도 18b). 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포 사이의 인산화 반응 속도의 인지가능한 차이는 없었고, 장래의 실험은 모든 장래의 실험을 위한 상호작용 후 45분에 Erk1/2 및 p38의 인산화를 평가했다. 세툭스-CAR+ CD8+ T 세포는 모두 4개의 U87 세포주에 대응하여 Erk1/2 및 p38을 인산화하였고, EGFR 발현 밀도와 어떤 상관관계를 나타내지 않았다(선형 경향을 위한 후-테스트에 의한 일원 ANOVA; Erk1/2, p=0.88; p38, p=0.09)(도 18c). 대조적으로, 니모-CAR+ CD8+ T 세포에 의한 Erk1/2 및 p38의 인산화는 EGFR 발현 밀도와 직접 상관된다(선형 경향을 위한 후-테스트에 의한 일원 ANOVA, Erk1/2 p = 0.0030 및 p38 p=0.0044). 니모-CAR+ T 세포가, 심지어 U87high 상의 높은 EGFR 밀도에 대응하여, 세툭스-CAR+ T 세포보다 상당히 낮은 Erk1/2 및 p38의 인산화를 입증했다(Erk1/2, p<0.0001; p38, p<0.01)는 것이 주시되었다. 유사하게, 세툭스-CAR+ CD8+ T 세포는 U87, U87low, U87med 및 U87high에 대응하여 IFN-γ 및 TNF-α를 생성하였고, 생산은 EGFR 발현 밀도와 상관되지 않았다(선형 경향을 위한 후-테스트에 의한 일원 ANOVA; IFN-γ, p = 0.5703 및 TNF-α, p=0.6189)(도 18d). 대조적으로, 니모-CAR+ CD8+ T 세포는 EGFR 발현 밀도와 직접 상관되어 IFN-γ 및 TNF-α를 생성했다(선형 경향을 위한 후-테스트에 의한 일원 ANOVA; IFN-γ, p = 0.0124 및 TNF-α, p=0.0006). 세툭스-CAR+ CD8+ T 세포는 U87 (IFN-γ, p<0.0001; TNFα, p<0.01) 또는 U87low (IFN-γ, p<0.001; TNFα, p<0.01)에 의한 자극에 대응하여 니모-CAR+ CD8+ T 세포보다 상당히 더 많은 사이토카인을 생성했지만, 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포는 U87med (IFN-γ, p>0.05; TNFα, p>0.05) 또는 U87high (IFN-γ, p>0.05; TNFα, p>0.05)에 의한 자극에 대응하여 통계적으로 유사한 사이토카인 생산을 입증했다. 마찬가지로, 세툭스-CAR+ T 세포는 니모-CAR+ T 세포보다 상당히 더 많은 U87 (10:1 E:T 비, p<0.0001) 및 U87low (10:1 E:T 비, p<0.05)의 용해를, 그러나 통계적으로 유사한 U87med (10:1 E:T 비, p>0.05) 및 U87high (10:1 E:T 비, p>0.05)의 특이적 용해를 입증했다(도 18e). 요약하면, 이러한 데이터는, 니모-CAR+ T 세포의 활성화가 표적 상의 EGFR 발현 밀도와 직접 상관된다는 것을 나타낸다. 그 결과, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 높은 EGFR 밀도에 대응하여 동등한 T-세포 활성화를 입증하지만, 니모-CAR+ T 세포는 낮은 EGFR 밀도에 대응하여 상당히 감소된 활성화를 입증한다.
내인성의 저친화성 T 세포 반응은 이펙터 기능을 획득하기 위해 항원과의 더 긴 상호작용을 필요로 할 수 있기 때문이다(참조: Rossette 등, 2001), 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포 사이의 T-세포 활성에서 관찰된 차이는 니모-CAR+ T 세포를 위한 유사한 요건에 기인하지 않았다는 것이 확인되었다. CAR+ T 세포와 표적의 상호작용의 연장은 사이토카인 생산을 실질적으로 증가시키지 않았고, 세툭스-CAR+와 니모-CAR+ CD8+ T 세포 사이의 사이토카인 생산의 관계를 변화시키지 않았다(도 19a. 유사하게, 경시적으로 U87 및 U87high의 성장을 제어하는 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포의 능력을 평가했고, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포가 통계적으로 유사한 U87high의 성장을 제어하는 능력을 입증하여 CAR+ T 세포의 부재하에 성장된 대조군에 비해 세포수의 80% 감소를 초래했다(p>0.05)는 것이 밝혀졌다. 세툭스-CAR+ T 세포는 내인적으로 낮은 EGFR 발현으로 U87의 성장을 제어하여 CAR+ T 세포의 부재하에 성장된 대조군에 비해 세포수의 40% 감소를 초래했다. 그러나, 니모-CAR+ T 세포는 세포수의 뚜렷한 감소 없이 U87 성장의 상당히 낮은 제어를 입증했다(p<0.001)(도 19b). 이러한 데이터는, U87 상의 낮은 EGFR에 대응하여 니모-CAR+ T 세포 활성은 T 세포와 표적의 상호작용 시간을 증가시킴으로써 향상되지 않아, 니모-CAR+ T 세포의 감소된 활성이 T 세포를 활성화시키기 위한 장기간 상호작용의 요건에 기인하는 것을 어렵게 한다는 것을 나타낸다.
최소 밀도 이상의 CAR의 발현은 CAR-의존성 T 세포 활성화에 필요하고, CAR 발현 밀도의 증가가 항원에 대한 CAR의 감도에 영향을 미치는 것으로 나타나났다(참조: Weijtens 등, 2000; Turatti 등, 2007). 따라서, 보다 높은 밀도로 니모-CAR을 발현시키는 것이 낮은 EGFR 밀도의 인식을 향상시키는지를 결정하기 위해, 인간 1차 T 세포에서 세툭스-CAR 및 니모-CAR을 과발현시키고자 했다. 전기천공 형질감염에 DNA의 부하는 세포에 대한 DNA의 독성에 기인하여 제한되지만, RNA의 전달은 비교적 무독성이고, 전달된 CAR RNA 전사물의 양을 증가시킴으로써 더 쉽게 과발현시킬 수 있다. 따라서, 세툭스-CAR 및 니모-CAR은 RNA 종으로서 시험관내 전사되었고, 인간 1차 T 세포에 전기전달되었다. RNA 전달은 공여체 적합화된 DNA-변형 T 세포와 비교한 경우 CAR의 2 내지 5배 증가된 발현을 초래했다(도 20a). CAR의 발현은 니모-CAR+ T 세포가 U87 상의 낮은 EGFR 밀도에 더 민감하도록 하지 않았고, 세툭스-CAR 및 니모-CAR은 U87high에 대응하여 유사한 사이토카인 생산성을 입증했다(도 20b). 이는, 니모-CAR+ T 세포 상 CAR 밀도의 증가는 낮은 EGFR 밀도에 대한 감도를 증가시키지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 14 - 니모 -CAR + T 세포는 정상 신장 상피 세포 상의 기초 EGFR 수준에 대응하여 활성을 감소시킨다
니모-CAR+ T 세포가 정상 세포 상의 낮은 기초 EGFR 수준에 대응하여 활성화를 감소시키는지를 결정하기 위해, 니모-CAR+ T 세포의 활성은 정상 인간 신장 피질 상피 세포, HRCE에 대응하여 평가했다. HRCE는 U87를 포함하는 종양 세포주 상의 발현 미만으로 세포당 EGFR의 약 15,000 분자를 발현시킨다(도 21a). 세툭스-CAR+ T 세포는 HRCE에 대응하여 IFN-γ 및 TNF-α를 생성하는 반면, 니모-CAR+ T 세포는 HRCE에 대응하여 상당히 적은 IFN-γ 또는 TNF-α를 생성했다(IFN-γ, p<0.05; TNF-α, p<0.01)(도 21b). 사실, 니모-CAR+ T 세포는 자극 없이 배경 생산 이상의 IFN-γ 또는 TNF-α의 중요한 생산을 입증하지 않았다(IFN-γ, p>0.05; TNF-α, p>0.05). 니모-CAR+ T 세포는 HRCE에 대응하여 세툭스-CAR+ T 세포에 의해 실행된 50% 미만의 특이적 용해를 나타냈고(세툭스-CAR=81.1±4.5%, 니모-CAR=30.4±16.7%, 평균±SD, n=3), 이는 상당히 낮았다(10:1 E:T 비, p<0.001)(도 21c). 이러한 발견은, 니모-CAR+ T 세포가 매우 낮은 EGFR 밀도를 갖는 세포에 대응하여 T-세포 기능을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 15 - 세툭스 -CAR + T 세포는 니모 -CAR + T 세포보다 자극 후 덜 증식시키지만, AICD에 대한 경향을 증가시키지 않는다
결합 친화성 및 항원 밀도에 의해 영향을 받는 내인성 TCR 신호의 강도는 항원 자극에 대응하여T 세포의 증식에 영향을 미칠 수 있다(참조: Gottschalk 등, 2012; Gottschalk 등, 2010). 항원에 의한 자극 후 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포의 증식성 반응을 평가하기 위해, Ki-67의 세포내 발현은 외인성 사이토카인의 부재하에 U87 또는 U87high와의 공배양 2일 후 유동 세포 분석법으로 측정하였다. U87 상의 낮은 EGFR 밀도에 대응하여, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 통계적으로 유사한 증식을 입증했다(p>0.05)(도 22a). U87high에 대응하여, 니모-CAR+ T 세포는 세툭스-CAR+에 비해 증가된 증식을 입증하였고(p<0.01), 이는 U87 및 U87high에 대응하여 증식의 임의의 통계적 차이는 나타내지 않았다(p>0.05).
CAR의 친화성 또는 항원 밀도가 AICD를 경험하는 CAR+ T 세포의 경향을 증가시키는지를 결정하기 위해, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 외인성 사이토카인의 부재하에 U87 또는 U87high와 공배양하였고, 아넥신 V 및 7-AAD 염색에 의한 T-세포 생존율을 평가했다. U87에 대응하여, 세툭스-CAR+ T는 비자극된 세툭스-CAR+ T 세포와 비교하여 생존율의 감소를 나타내지만, 니모-CAR+ T 세포는 임의의 인지가능한 생존율의 변화를 나타내지 않았다(도 22b). U87high에 대응하여, 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 비자극된 CAR+ T 세포에 비해 생존율의 통계적으로 유사한 감소를 입증했다(p>0.05). It was noted that U87high로 자극된 세툭스-CAR+ T 세포는 U87로 자극된 세툭스-CAR+ T 세포에 비해 생존율의 임의의 통계적 차이를 나타내지 않았다(p>0.05)는 것이 주목되었다. 이러한 데이터는, 니모-CAR의 활성이 항원 밀도에 의존한다는 이전 데이터를 지지하여, 항원 밀도가 세툭스-CAR+ T 세포가 아니라 니모-CAR+ T 세포에 대한 AICD의 유도에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 그러나, 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포 활성화할 수 있는 높은 항원 밀도에 대응하여, CAR의 scFv 도메인의 친화성은 AICD의 유도에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않는다.
실시예 16 - 세툭스 -CAR + T 세포는 CAR의 향상된 하향조절을 입증한다
내인성 TCR은 항원과의 상호작용 후 하향조절될 수 있고, 하향조절 정도는 TCR 결합 강도에 의해 영향을 받는다(참조: Cai 등, 1997). 유사하게, CAR은 항원과의 상호작용 후 하향조절될 수 있지만, CAR 하향조절에 대한 친화성의 효과는 공지되어 있지 않다(참조: James 등, 2008; James 등, 2010). 따라서, 이는 세툭스-CAR+ T 세포가 항원-유도 하향조절에 대해 더 높은 경향을 갖는지를 결정하고자 했다. 이를 달성하기 위해, 세툭스-CAR+T 세포 및 니모-CAR+ T 세포는 U87 또는 U87high와 공배양하고, 비자극된 대조군에 대해 CAR 발현을 모니터링했다. U87 상의 낮은 EGFR 밀도에 대응하여, 세툭스-CAR 발현은 상호작용 12시간 후 니모-CAR보다 상당히 낮았다(세툭스-CAR=68.0±27.8%, 니모-CAR=126.5±34.9%, 평균±SD, n=3) (p<0.05)(도 23a, 좌측 패널). 저밀도 EGFR와의 상호작용 48시간까지, 세툭스-CAR은 T-세포 표면으로 반환되고, 세툭스-CAR 및 니모-CAR은 T 세포의 통계적으로 유사한 비율로 발현시켰다(세툭스-CAR=95.5±40.7, 니모-CAR=94.4±11.8%, 평균±SD, n=3) (p>0.05). U87high 상의 높은 EGFR 밀도에 대응하여, 세툭스-CAR의 발현은 니모-CAR에 비해 상당히 감소되었고, 이는 상호작용 12시간 후 인지가능한 하향조절을 나타내지 않았다(세툭스-CAR=37.4±11.5%, 니모-CAR=124.4±15.3%, 평균±SD, n=3)(p<0.01)(12시간, p<0.01; 24시간, p<0.01; 48시간, p<0.05)(도 23a, 우측 패널). 그러나, 낮은 EGFR 밀도에 의한 자극과 대도적으로, 세툭스-CAR은 상호작용 48시간 후 표면 발현을 회복하지 않고, 니모-CAR 발현에 비해 통계적으로 감소되어 잔류했다(세툭스-CAR=42.6±5.9%, 니모-CAR=95.7±11.6%, 평균±SD, n=3)(p<0.05). 세툭스-CAR 및 니모-CAR은 둘 다, 세툭스-CAR이 T-세포로부터 감소된 경우에 조차, 자극 후 세포내로 검출되어 감소된 CAR 발현이 유전적으로 비변형된 T 세포가 아니라 CAR의 내재화에 기인하였음을 나타낸다(도 23b). CAR-L+ EL4에 의한 CAR-의존성, scFv-독립적 자극에 대응하여, 세툭스-CAR 및 니모-CAR은 약 20%의 완만하고 통계적으로 유사한 하향조절을 나타냈다(도 23c). 이전 결과와 유사하게, 세툭스-CAR는 tEGFR+ EL4에 대응하여 약간의 하향조절을 나타낸 반면, 니모-CAR은 인지가능한 하향조절을 나타내지 않았다. 요약하면, 이러한 데이터는, 세툭스-CAR이 CAR의 scFv 도메인과 항원 및 항원 밀도의 상호작용에 의존하는 니모-CAR에 비해 더 빠르고 장기적인 하향조절을 입증한다는 것을 보여준다.
실시예 17 - 세툭스 -CAR + T 세포는 항원에 의한 재도전에 대한 반응을 감소시킨다
내인성 CD8+ T 세포 반응에서 이전 자극의 강도는 항원에 의한 재도전시 T-세포 반응과 상관될 수 있다(참조: Lim 등, 2002). 따라서, 항원 재도전에 반응하는 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포의 능력을 평가했다. CAR+ T 세포는 24시간 동안 U87 또는 U87high와 공배양한 다음, 수거하고, U87 또는 U87high로 재도전하여 IFN-γ의 생산성을 평가했다. U87 및 U87high에 의한 초기 도전 후, 세툭스-CAR+ T 세포는 U87 및 U87high 둘 다에 의한 재도전에 대응하여 IFN-γ의 생산성을 감소시켰다(도 24) 그러나, U87 및 U87high에 의한 초기 도전 후, 니모-CAR+ T 세포는 U87 및 U87high에 의한 재도전에 대응하여 IFN-γ의 생산성을 유지시켰다. 그 결과, 니모-CAR+ T 세포는 U87에 대응하여 통계적으로 유사한 IFN-γ 생산성을 입증하였고(p>0.05), U87high에 의한 재도전에 대응하여 통계적으로 많은 IFN-γ를 입증했다(U87에 의한 초기 도전, p<0.001; U87high에 의한 초기 도전 p<0.01). 이는 초기 도전에 대응하는 IFN-γ 생산성과 대조적이고, 여기서 니모-CAR+ T 세포는 U87(p<0.05)에 대응하여 적은 IFN-γ를 생산하고, U87high (p>0.05)에 대응하여 통계적으로 유사한 IFN-γ 생산성을 입증한다. 따라서, 니모-CAR+ T 세포는 항원을 인식하고 반응하는 이들의 능력을 유지시키는 반면, 세툭스-CAR+ T 세포는 항원과의 후속적인 만남에 반응하는 능력을 감소시키고, 이는 적어도 부분적으로 CAR의 하향조절에 기인할 가능성이 있고, 초기 항원 노출 후 세툭스-CAR+ T 세포의 기능적 소모에 대한 증가된 경향을 나타낼 수 있다.
실시예 18 - NSG 마우스에서 U87 세포를 사용하는 두개내 신경교종 모델의 확립
생체내 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포의 항종양효능을 평가하기 위해, 생물발광(BLI)에 의한 상대적 종양 부담의 일련의 비침습성 이미징을 위한 반딧불 루시페라제(ffLuc) 리포터를 발현하도록 변형된 U87의 두개내 신경교종 이종이식편을 확립했다. 이전에 기재된 가이드-스크류 방법은 정확한 좌표로 종양 및 T 세포의 지시된 주입을 위해 채택했다(참조: Lal 등, 2000). 가이드 스크류를 NOD/Scid/IL2Rg-/- (NSG) 마우스의 두개골의 오른쪽 전두엽에 이식하고 마우스를 2주 동안 회수했다(도 25a). T-세포 치료 및 BLI에 의한 상대적 종양 부담의 평가를 통한 가이드 스크류 이식으로부터의 타임라인이 다음에 도시된다: 도 25b. 강제된 tEGFR의 발현을 통해 내생적으로 낮은 EGFR 또는 중간 EGFR 발현을 갖는 250,000 U87 세포를 가이드 스크류의 중심을 통해 2.5mm의 깊이로 주입했다. 마우스는 종양 부담을 평가하기 위해 T-세포 치료에 앞서 영상화하였고, 마우스는 3개의 그룹으로 균일하게 분배하기 위해 계층화했다: 무치료, 세툭스-CAR+ T 세포 또는 니모-CAR+ T 세포를 수용하는 마우스. 종양 주입 후 5일에, 4x106 T 세포의 초기 용량을 가이드 스크류의 중심을 통해 주입했다. 후속적인 T 세포는 전체 3개의 T-세포 용량에 대해 매주 가이드 스크류를 통해 투여했다. 각 T-세포 치료 후 6일에 BLI의 측정을 사용하여 상대적 종양 부담을 평가했다. 치료 후, 마우스는 24시간 동안 체질량의 5%를 초과하는 급격한 체중 감소, 체질량의 25% 이상의 점진적인 체중 감소, 또는 운동 실조, 호급곤란 및 뒷다리-사지 마비를 포함하는 질병의 명백한 임상적 징후를 포함하는 말단 시점 기준에 대해 평가했다. 종점 기준이 충족되었을 때 마우스를 희생시켜 임박한 동물 사망을 시사하고, 무치료를 수용한 마우스에 대한 세툭스-CAR+ T 세포 처리된 마우스 및 니모-CAR+ T 세포 처리된 마우스의 생존율을 평가했다.
실시예 19 - 니모 -CAR + T 세포는 세툭스 -CAR + T 세포와 유사한 완만한 EGFR 밀도를 갖지만, T-세포 관련 독성은 없는 이종이식편의 성장을 억제한다
U87med의 주입 후 4일에, 마우스를 종양 부담을 평가하기 위해 BLI에 의해 영상화했다(도 26a). 마우스를 상대적 종양 부담을 균일하게 분배하기 위해 3 그룹으로 분배한 다음, 무작위로 치료에할당했다: 무치료, 세툭스-CAR+ T 세포 또는 니모-CAR+ T 세포(도 26b). T-세포 치료 날에, 3라운드의 자극 및 EGFR+ aAPC 상의 수치 확대를 경험한 CAR+ T 세포를 유동 세포 분석법으로 표현형화하여 CAR의 발현 및 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비를 결정하였다(도 26c). CAR 발현은 세툭스-CAR+ T 세포와 니모-CAR+ T 세포 사이에서 유사했다(각각, 92% 및 85%). 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 함유했지만, 세툭스-CAR+ T 세포는 니모-CAR+ T 세포보다 약 20% 더 적은 CD8+ T 세포를 함유했다(각각, 31.8% 및 51.2%). 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포는 둘 다 BLI에 의해 검정된 바와 같이 종양 성장을 억제할 수 있었다(18일; 세툭스-CAR, p<0.01 및 니모-CAR, p<0.05)(도 27a,b). 종양 성장을 제어하는 세툭스-CAR+ T 세포와 니모-CAR+ T 세포의 능력사이에 차이는 없었다(p>0.05). BLI에 의해 평가된 감소된 종양 부담은 치료를 받지 않은 모든 마우스가 질환에 굴복했을 때 종양 주입 후 100일 지나 세툭스-CAR+ T 세포로 처리된 3/7 마우스 및 니모-CAR+ T 세포로 처리된 4/7 마우스에서 증명되었다.
세툭스-CAR+ T-세포 처리된 마우스는 두 독립 실험으로부터 T-세포 치료 7일 이내에6/14 마우스의 사망을 유도하는 상당한 독성을 나타냈다(p=0.0006)(도 28a). 결국, 세툭스-CAR+ T-세포 치료는 가능하게는 T-세포 치료 직후 조기 사망에 기인하여 및 미처리된 마우스와 비교하여 생존율을 통계적으로 향상시키지 않았다(미처리 생존 기간의 중앙값 = 88일, 세툭스-CAR 생존 기간의 중앙값 = 105일, p=0.19)(도 28b). 흥미롭게도, 생존 곡선은 변곡점을 도시하고, 이전에 세툭스-CAR+ T-세포 치료는 미처리 마우스와 비교하여 감소된 생존율을 초래했고, 이후에, 초기 T-세포 독성에 생존한 마우스는 향상된 생존율을 나타낸다. 단지 초기 T-세포 관련 독성에 생존한 마우스를 고려할 때, 세툭스-CAR+ T 세포는 미처리 마우스에 비해 3/4 마우스에서 향상시킨다(p=0.0065). 대조적으로, 니모-CAR+ T 세포는 효과적인 종양 회귀를 중재하고, 임의의 주목된 독성 없이 마우스의 4/7에서 생존을 연장한다(미처리 생존 기간의 중앙값 = 88일, 니모-CAR 생존 기간의 중앙값 = 158일, p=0.0269). 이러한 결과는, 세툭스-CAR+ T 세포 및 니모-CAR+ T 세포가 중간 항원 밀도로 종양의 성장을 제어하는데 효과적이지만, 세툭스-CAR+ T 세포는 T-세포 치료 직후 주목할 만한 독성을 입증한다.
실시예 20 - 니모 -CAR+ T 세포가 아니라 세툭스 -CAR+ T 세포가 낮은EGFR 밀도로 이종이식편의 성장을 억제한다
마우스는 U87을 주입한 다음, 4일 후 상대적 종양 부담을 BLI로 평가했다(도 29a). 상대적 종양 부담은 3개의 그룹으로 균일하게 분배한 다음, 무작위로 치료에 할당했다: 무치료, 세툭스-CAR+ T 세포 또는 니모-CAR+ T 세포(도 29b). T 세포 치료일에, 3라운드의 자극 및 EGFR+ aAPC 상의 수치 확대를 경험한 CAR+ T 세포는 CAR의 발현 및 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비를 결정하기 위해 표현형화했다(도 29c). CAR 발현은 세툭스-CAR+ T 세포와 니모-CAR+ T 세포 사이에서 유사했다(각각, 92% 및 85%). 세툭스-CAR+ 및 니모-CAR+ T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 함유했지만, 세툭스-CAR+ T 세포는 니모-CAR+ T 세포보다 약 20% 더 적은 CD8+ T 세포를 함유했다(각각, 31.8% 및 51.2%).
마우스는 T-세포 치료를 받았고, 종양은 이미 기재된 바와 같이 BLI로 평가했다(도 25b). 세툭스-CAR+ T 세포에 의한 마우스의 치료는 미처리된 마우스와 비교하여 종양 부담의 상당한 감소를 초래했다(25일, p< 0.01)(도 30a 및 30b). 대조적으로, 니모-CAR+ T 세포에 의한 치료는 미처리된 마우스와 비교하여 종양 부담을 유의하게 감소시키지 않았다(니모-CAR, p>0.05). 세툭스-CAR+ T 세포로 처리된 마우스의 종양 부담의 감소는 일시적이었지만, T-세포치료의 중지 후, 종양은 성장을 재개했다.
세툭스-CAR+ T 세포 처리는 무치료를 수용한 마우스와 비교하여 3/6 마우스에서 생존을 상당히 연장시켰다(미처리 생존 기간 중앙값 = 38.5일, 세툭스-CAR 생존 기간 중앙값 = 53일, p=0.0150)(도 31). 대조적으로, 니모-CAR+ T 세포에 의한 치료는 생존율을 유의하게 향상시키지 ?訪年?(미처리 생존 기간의 중앙값 38.5일, 니모-CAR 생존 기간의 중앙값 46일, p=0.0969). 이러한 데이터는, 세툭스 CAR T 세포가 낮은 항원 밀도에 대해 효과적인 반면, 니모-CAR+ T 세포는 저밀도 EGFR 발현을 효율적으로 인식하지 않는다는 것을 나타낸다.
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참조문헌
참조문헌은 그들이 예시적인 절차 또는 본원에 기재된 것들에 보충적인 다른 세부 사항을 제공하는 정도로, 구체적으로 본원에 참조로 인용된다.
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Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Ala 210 <210> 4 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 4 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro 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sequence <400> 6 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 7 Phe Gln Tyr Ser His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 8 Asn Tyr Tyr Ile Tyr 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 9 Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 10 Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 11 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 1 5 10 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 12 Ala Ser Glu Ile Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 13 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 14 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 15 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 1 5 10 15 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 16 Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10

Claims (91)

  1. 항원에 대해 표적화된 발현된 키메라 T-세포 수용체(CAR)를 포함하는 단리된 유전자도입 세포로서, 상기 CAR이 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는, 단리된 유전자도입 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인, 단리된 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항원이 CD19, CD20, ROR1, CD22 암 배아 항원, 알파페토프로테인, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 전립선-특이적 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, HER2/Neu, 엽산 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메오텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, HER2-HER3 조합 또는 HER1-HER2 조합인, 단리된 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 항원이 GP240, 5T4, HER1, CD-33, CD-38, VEGFR-1, VEGFR-2, CEA, FGFR3, IGFBP2, IGF-1R, BAFF-R, TACI, APRIL, Fn14, ERBB2 또는 ERBB3인, 단리된 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항원이 성장 인자 수용체인, 단리된 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 항원이 EGFR, ERBB2 또는 ERBB3인, 단리된 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR이 항원에 대해 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20nM 이상의 Kd를 갖는, 단리된 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR가 항원에 대해 약 5nM 내지 약 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50nM의 Kd를 갖는, 단리된 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR가 항원에 대해 약 5nM 내지 50nM의 Kd를 갖는, 단리된 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항원이 EGFR인, 단리된 세포.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR이 다음의 CDR 서열을 포함하는, 단리된 세포: 서열번호: 5-10.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR이 다음의 항원의 항원 결합 부분을 포함하는, 단리된 세포: 서열번호: 1 및 서열번호: 2.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR을 코딩하는 DNA가 상기 세포의 게놈에 통합되는, 단리된 세포.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 CAR을 코딩하는 DNA가 트랜스포손 반복 서열에 인접하는, 단리된 세포.
  15. 약제학적으로 허용되는 담체 중의 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 따르는 단리된 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 따르는 약 1x103 내지 1x108의 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 청구항 1에 따르는 유전자도입 세포의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여, 질환을 앓고 있는 인간 대상체에 T-세포 반응을 제공하는 방법.
  18. 항원에 대해 표적화된 발현된 키메라 T-세포 수용체(CAR)를 포함하는 단리된 유전자도입 세포로서, 상기 CAR이 세툭시맙의 CDR 서열을 포함하는, 단리된 유전자도입 세포.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 CAR이 다음의 항원 결합 부분을 포함하는, 세포: 서열번호: 3 및 서열번호: 4.
  20. 다음 단계를 포함하여, CAR T 세포를 선택하는 방법:
    (a) 항원에 결합하는 CAR을 발현시키는 복수의 CAR T 세포를 수득하는 단계로서, 상기 복수의 세포가 다음을 포함하는, 단계:
    (i) 항원에 대한 상이한 친화성을 갖는 CAR; 또는
    (ii) 세포에서 상이한 수준으로 발현되는 CAR;
    (b) 상기 항원을 발현시키는 대조군 세포 상 및 대조군 세포에 비해 항원의 상승된 수준을 발현시키는 표적 세포 상에서 상기 세포의 세포독성 활성을 평가하는 단계: 및
    (c) 표적 세포에 대해 선택적으로 세포독성인 CAR T 세포를 선택하는 단계.
  21. 청구항 20에 있어서, CAR T 세포의 확장된 집단을 생성하기 위해 상기 선택된 CAR T 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. EGFR에 대해 표적화된 발현된 키메라 T-세포 수용체(CAR)를 포함하는 단리된 유전자도입 인간 T 세포로서, 상기 CAR이 니모투주맙의 CDR 서열을 포함하고, 여기서 VL CDR1은 다음을 포함하는, 단리된 유전자도입 인간 T-세포: RSSQNIVHSNGNTYLD (서열번호: 5); VL CDR2는 다음을 포함한다: KVSNRFS (서열번호: 6); VL CDR3은 다음을 포함한다: FQYSHVPWT (서열번호: 7); VH CDR1은 다음을 포함한다: NYYIY (서열번호: 8); VH CDR2는 다음을 포함한다: GINPTSGGSNFNEKFKT (서열번호: 9), VH CDR3은 다음을 포함한다: QGLWFDSDGRGFDF (서열번호: 10), 상기 T-세포는 EGFR-발현 암 세포에 대한 세포독성을 나타낸다.
  23. 청구항 22의 단리된 유전자도입 인간 T-세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 청구항 22에 따르는 유전자도입 인간 T-세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, EGFR 양성 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.
  25. EGFR에 대해 표적화된 발현된 키메라 T-세포 수용체(CAR)를 포함하는 단리된 유전자도입 인간 T-세포로서, 상기 CAR이 세툭시맙의 CDR 서열을 포함하고, 여기서 VL CDR1은 다음을 포함하는, 단리된 유전자도입 인간 T-세포: RASQSIGTNIH (서열번호: 11); VL CDR2는 다음을 포함한다: ASEIS (서열번호: 12); VL CDR3은 다음을 포함한다: QQNNNWPTT (서열번호: 13); VH CDR1은 다음을 포함한다: NYGVH (서열번호: 14); VH CDR2는 다음을 포함한다: VIWSGGNTDYNTPFTS (서열번호: 15); VH CDR3은 다음을 포함한다: ALTYYDYEFAY (서열번호: 16), 상기 T-세포는 EGFR-발현 암 세포에 대한 세포독성을 나타낸다.
  26. 청구항 25의 단리된 유전자도입 인간 T-세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 청구항 25에 따르는 유전자도입 인간 T-세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, EGFR 양성 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.
  28. 다음 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 항원을 발현시키는 세포를 선택적으로 표적화하는 방법:
    (a) 상기 항원에 결합하는 발현된 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 배양하는 단계로서, 상기 CAR T 세포가 다음을 포함하는, 단계:
    (i) 단지 상기 T 세포에 의한 상기 항원의 다가 결합시 세포독성 활성; 또는
    (ii) 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는 CAR; 및
    (b) 배양된 CAR T 세포의 유효량을 대상체에게 투여하여 상기 항원의 발현이 상승된 세포를 선택적으로 표적화하는 T-세포 반응을 제공하는 단계.
  29. 다음을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 항원을 발현시키는 세포를 선택적으로 표적화하는 방법:
    (a) 상기 항원에 결합하는 발현된 CAR를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 선택하는 단계로서, 상기 CAR T 세포는 다음을 갖는, 단계:
    (i) 단지 상기 T 세포에 의한 상기 항원의 다가 결합시 세포독성 활성; 또는
    (ii) 상기 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는 CAR; 및
    (b) 상기 선택된 CAR T 세포의 유효량을 상기 대상체에게 투여하여 항원의 발현이 상승된 세포를 선택적으로 표적화하는 T-세포 반응을 제공하는 단계.
  30. 다음을 포함하여, 그것을 위해 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법:
    항원의 발현이 상승된 암 세포를 선택적으로 표적화하는 T-세포 반응을 제공하기 위해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 CAR T 세포가 항원에 결합하는 발현된 CAR을 포함하고, 상기 CAR T 세포가 다음을 포함하는, 단계:
    (i) 단지 상기 T 세포에 의한 상기 항원의 다가 결합시 세포독성 활성; 또는
    (ii) 상기 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는 CAR.
  31. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 CD19, CD20, ROR1, CD22 암 배아 항원, 알파페토프로테인, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 전립선-특이적 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, HER2/Neu, 엽산 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메오텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, HER2-HER3 조합 또는 HER1-HER2 조합인, 방법.
  32. 청구항 30에 있어서, 상기 항원이 GP240, 5T4, HER1, CD-33, CD-38, VEGFR-1, VEGFR-2, CEA, FGFR3, IGFBP2, IGF-1R, BAFF-R, TACI, APRIL, Fn14, ERBB2 또는 ERBB3인, 방법.
  33. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 성장 인자 수용체인, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 항원이 EGFR, ERBB2 또는 ERBB3인, 방법.
  35. 청구항 28 또는 29 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 발현시키는 상기 세포가 상기 항원을 발현시키는 비암 세포 및 상기 항원의 발현이 상승된 암 세포를 포함하는, 방법.
  36. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 상기 항원에 대해 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20nM 이상의 Kd를 갖는, 방법.
  37. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 상기 항원에 대해 약 5nM 내지 약 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50nM의 Kd를 갖는, 방법.
  38. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 상기 항원에 대해 약 5nM 내지 50nM의 Kd를 갖는, 방법.
  39. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 EGFR인, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 CAR이 니모투주맙의 CDR 서열을 포함하는, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 CAR이 다음의 항원 결합 부분을 포함하는, 방법: 서열번호: 1 및 서열번호: 2.
  42. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 또는 배양된 CAR T 세포가 내인성 T-세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위해 불활성화되는, 방법.
  43. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 또는 배양된 CAR T 세포가 멤브레인-결합 Cγ 사이토카인을 코딩하는 발현된 핵산을 추가로 포함하는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 멤브레인-결합 Cγ 사이토카인이 멤브레인-결합 IL-7, IL-15 또는 IL-21인, 방법.
  45. 청구항 43에 있어서, 상기 멤브레인-결합 Cγ 사이토카인이 IL-15-IL-15Rα 융합 단백질인, 방법.
  46. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 또는 배양된 CAR T 세포가 CAR을 코딩하는 통합된 DNA를 포함하는, 방법.
  47. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 또는 배양된 CAR T 세포가 CAR을 코딩하는 외인성 mRNA를 포함하는, 방법.
  48. 청구항 46에 있어서, CAR을 코딩하는 상기 통합된 DNA가 트랜스포손 반복체에 인접하는, 방법.
  49. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, CAR T 세포를 선택하거나 배양하는 단계가 T 세포 또는 T-세포 전구세포를 항원에 대해 약 5nM 내지 약 500nM의 Kd를 갖는 선택된 CAR을 코딩하는 DNA로 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 세포의 게놈에 상기 선택된 또는 배양된 CAR을 코딩하는 DNA를 통합하기에 유효한 트랜스포사제 및 트랜스포손 반복체에 의해 인접된 상기 선택된 또는 배양된 CAR을 코딩하는 DNA로 상기 세포를 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 트랜스포사제가 mRNA로서 제공되는, 방법.
  52. 청구항 50에 있어서, 상기 트랜스포사제가 폴리펩티드 또는 발현가능한 RNA로서 제공되는, 방법.
  53. 청구항 50에 있어서, 상기 트랜스포사제가 연어과-유형 Tc1-형 트랜스포사제(SB)인, 방법.
  54. 청구항 28에 있어서, 상기 CAR T 세포를 배양하거나 선택하는 단계가 항원 제시 세포의 존재하에 상기 CAR T 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 청구항 28에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  56. 청구항 28에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 상기 CAR T 세포의 발현을 자극하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 포함하는, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 aAPC가 유전자도입 K562 세포인, 방법.
  58. 청구항 56에 있어서, 상기 aAPC가 (i) 상기 유전자도입 CAR 세포 상에서 발현된 CAR에 의해 표적화된 항원; (ii) CD64; (ii) CD86; (iii) CD137L; 및/또는 (v) 상기 aAPC의 표면에서 발현된 멤브레인-결합 IL-15를 포함하는, 방법.
  59. 청구항 56에 있어서, 상기 aAPC가 상기 aAPC의 표면에서 발현된 CAR-결합 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  60. 청구항 56에 있어서, 상기 aAPC가 T 세포를 활성화시키거나 공자극하는 추가의 분자를 포함하는, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 추가의 분자가 멤브레인-결합 Cγ 사이토카인을 포함하는, 방법.
  62. 청구항 54에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 불활성화되는, 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 조사되는, 방법.
  64. 청구항 54에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 시험되고, 감염성 물질을 함유하지 않는 것으로 확인되는, 방법.
  65. 청구항 54에 있어서, 상기 CAR T 세포를 항원 제시 세포의 존재하에 배양하는 단계가 상기 유전자도입 CAR 세포를 IL-21 및/또는 IL-2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  66. 청구항 54에 있어서, 상기 CAR T 세포를 항원 제시 세포의 존재하에 배양하는 단계가 상기 세포를 약 10:1 내지 약 1:10 (CAR T 세포 대 항원 제시 세포)의 비로 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 청구항 28에 있어서, 상기 유전자도입 세포를 배양하는 단계가 7, 14, 21, 28, 35 또는 42일 이하 동안인, 방법.
  68. 청구항 49에 있어서, 상기 T 세포 또는 T-세포 전구세포가 세포 뱅크로부터 입수되는, 방법.
  69. 청구항 49에 있어서, 상기 T 세포 또는 T-세포 전구세포가 대상체의 샘플로부터 입수되는, 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 샘플이 단핵 세포 분획인, 방법.
  71. 청구항 69에 있어서, 상기 샘플이 동결보존된 샘플인, 방법.
  72. 청구항 69에 있어서, 상기 샘플이 제대혈로부터 유래되는, 방법.
  73. 청구항 69에 있어서, 상기 샘플이 대상체의 말초혈 샘플인, 방법.
  74. 청구항 69에 있어서, 상기 샘플이 T 세포의 아집단인, 방법.
  75. 청구항 49에 있어서, 상기 T 세포 또는 T-세포 전구세포를 형질감염시키는 단계가 선택된 CAR을 코딩하는 DNA를 상기 세포로 전기천공시키는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 청구항 49에 있어서, 상기 T 세포 또는 T-세포 전구세포를 형질감염시키는 단계가 상기 세포를 상기 선택된 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 선택하거나 배양하는 단계가 상기 투여 단계 이전에 CAR T 세포를 정제하거나 농축시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 상기 농축 단계가 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 포함하는, 방법.
  79. 청구항 77에 있어서, 상기 농축 단계가 선택된 CAR T 세포의 분류 단계를 포함하는, 방법.
  80. 청구항 77에 있어서, 상기 농축 단계가 상자성 비드 상에서 선택된 CAR T 세포의 분류 단계를 포함하는, 방법.
  81. 청구항 79에 있어서, CAR-발현 세포의 분류 단계가 CAR-결합 항체의 사용을 포함하는, 방법.
  82. 청구항 77에 있어서, 상기 농축 단계가 CD56+ 세포의 고갈을 포함하는, 방법.
  83. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계 전에 상기 CAR T 세포의 샘플을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  84. 청구항 28에 있어서, 상기 대상체가 세포 증식성 질환을 앓고 있는, 방법.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 세포 증식성 질환이 자가면역 질환이고, 상기 CAR이 자가면역 세포에서 상승된 수준으로 발현되는 항원에 결합하는, 방법.
  86. 청구항 84에 있어서, 상기 세포 증식성 질환이 암인, 방법.
  87. 청구항 30에 있어서, 상기 대상체가 이전 항암 요법을 겪은, 방법.
  88. 청구항 87에 있어서, 상기 대상체가 진정 상태에 있는, 방법.
  89. 청구항 87에 있어서, 상기 대상체가 검출가능한 암 세포를 포함하지만 암의 증상은 함유하지 않는, 방법.
  90. 청구항 86에 있어서, 상기 암이 신경교종인, 방법.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 신경교종이 확산 고유 뇌교 신경교종인, 방법.
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