TW201925464A

TW201925464A - 用於活化、修飾和擴增γδＴ細胞治療癌症和相關惡性腫瘤的方法

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Publication number: TW201925464A
Application number: TW107141995A
Authority: TW
Inventors: 莫尼克達奧; 梅林達瑪塔; 亞歷山德拉諾維卡; 陽尼克布里亞德; 史蒂芬華特
Original assignee: 美商英麥提克斯股份有限公司
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2019-07-01
Also published as: DE102017127984B4; US11690872B2; JP7258364B2; AU2018372206A1; CA3083595A1; EA202091333A1; KR20200090233A; MX2020005503A; US20240115609A1; SG11202004910SA; EP3717634A1; CN111727242A; JP2021503959A; DE102017127984A1; WO2019104269A1; WO2019104269A9; US20190175650A1

Abstract

本公開內容涉及 T 細胞的擴增和活化。一方面，本公開內容涉及可用於轉基因表達的 γδT 細胞的擴增和活化。另一方面，本公開內容涉及 γδT 細胞的擴增和活化，同時消耗 α-和/或 β-TCR 陽性細胞。本公開內容還提供了包含擴增的γδ T細胞和消耗或減少的 α-和/或 β-TCR 陽性細胞的 T 細胞群。本公開還提供了使用所公開 T 細胞群的方法。

Description

用於活化、修飾和擴增γδT細胞治療癌症和相關惡性腫瘤的方法

本公開內容涉及 T 細胞的擴增和活化。一方面，本公開內容涉及可用於轉基因表達的 γδT 細胞的擴增和活化。另一方面，本公開內容涉及 γδT 細胞的擴增和活化，同時消耗 α-和/或 β-TCR 陽性細胞。本公開內容還提供了包含擴增的 γδT 細胞和消耗或減少的 α-和/或 β-TCR 陽性細胞的 T 細胞群。本公開還提供了使用所公開 T 細胞群的方法。

γδ T 細胞代表表達 γδ TCR 而非 αβ TCR的T細胞子集。γδ T 細胞可分為兩個主要子集：與組織結合的 Vδ2 陰性細胞和外周循環中的 Vδ2 陽性細胞，更具體地說是 Vγ9δ2。兩個子集已被證明都具有抗病毒和抗腫瘤活性。與常規表達 αβ TCR 的細胞不同，表達 γδ TCR 的細胞識別其靶標而不依賴於經典的 MHC I 和 II。與自然殺傷 (NK) T 細胞相似，γδ T 細胞表達NKG2D，其結合於非經典 MHC 分子，即，存在於受應激細胞和/或腫瘤細胞上的 MHC I 類多肽相關序列 A (MICA) 和 MHC I 類多肽相關序列 B (MICB)。γδ TCR 識別多種配體，例如，應激和/或腫瘤相關的磷酸抗原。γδ T 細胞透過多種機制（即 TRAIL、FasL、穿孔素和顆粒酶分泌）介導其靶標的直接細胞溶解。此外，表達 CD16 的γδ T 細胞增強抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)。

γδ Τ 細胞（外周血中可能通常僅存在 1% 至 5% 的量）的一個問題是不能確保有足以用於醫學治療的 γδ Τ 細胞的純度和數量，尤其是因為只收集少量血液，然後活化和/或增殖其中的細胞。增加患者採集血液量以確保足以用於醫學治療的 γδ Τ 細胞的純度和數量也帶來了一個問題，即它給患者帶來了很大的負擔。

迄今為止，使用自體 Vγ9δ2 T 細胞的臨床試驗可能使用 Vγ9δ2 T 細胞擴增方案，該方案是用雙膦酸鹽（即唑來膦酸鹽和帕米膦酸鹽）和 100 U/ml IL-2 處理 PBMC 14 天。該過程最多在 14 天內可使總 Vγ9δ2 T 細胞增加 100 倍；此後，擴增率降低，這與細胞死亡的增加相一致。因此，傳統 Vγ9δ2 擴增方案可能無法產生足夠數量的細胞以符合商業上可行的同種異體產品。

美國專利 7,749,760 描述了含有雙膦酸鹽、白細胞介素 2 (IL-2) 和白細胞介素 18 (IL-18) 的 Vγ9Vδ2 T 細胞增殖劑。

美國專利 8,962,313 描述了透過向分離的外周血中添加疾病抗原並在含有白細胞介素的培養基中培養所得的組合來同時增殖疾病抗原特異性細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 和γδ T細胞的方法。

WO2014/072446 描述了使用γδ T細胞活化劑和 IL-33 的組合誘導γδ T細胞的無 IL-2 增殖的方法，其用於治療感染、癌症、自身免疫性以及其他疾病。

WO2016/166544 描述了 γδ T細胞可在磷酸抗原異戊烯焦磷酸 (IPP) 的存在下擴增，並且可在培養步驟中提供細胞因子以促進 γδ T細胞的增殖並維持外周血單核細胞的細胞表型。

美國專利 2011/0158954 描述了一種製備 γδ T細胞群的方法，其中該方法包括在 (a) 纖連蛋白、纖連蛋白片段或其混合物和 (b)γδ T細胞活化因子存在下培養含有 γδ T細胞的細胞群的步驟。

美國專利 2016/0175358 描述了在收集的 γδ T細胞上表達的細胞表面標誌物的陽性和/或陰性選擇可用於直接從各種來源分離 γδ T細胞，例如：外周血樣本、臍帶血樣本、腫瘤、腫瘤活組織檢查、組織、淋巴，或來自受試者的上皮樣本。基於 CD4、CD8、TCRα、TCRβ、TCRδ 和其他合適的細胞表面標誌物的陽性或陰性表達，可以從複雜樣本中分離γδ T細胞。

仍然需要能夠製備足夠數量的γδ T細胞作為商業上可行的治療產品的方法。申請專利範圍中描述的實施方案提供了該技術問題的解決方案。

一方面，本公開內容提供了活化和/或擴增γδ T細胞的方法，包括從人受試者的血液樣本中分離γδ T細胞，在存在氨基二膦酸鹽和細胞因子化合物或組合物的情況下活化分離的γδ T細胞，並且在不存在氨基二膦酸鹽和存在細胞因子化合物或組合物的情況下擴增活化的γδ T細胞。

一方面，本申請涉及擴增和活化γδ T細胞的方法，包括從人受試者的外周血單核細胞 (PBMC) 中分離γδ T細胞，其中分離包括使 PBMC 與抗-α 和抗-β T 細胞受體 (TCR) 抗體（例如，生物素或磁珠綴合的抗-αβ TCR 抗體）接觸，從 PBMC 中消耗 α-和/或 β-TCR 陽性細胞，例如，透過使用鏈黴抗生物素蛋白-微珠或磁體，在至少一種含有氨基二膦酸鹽和/或磷酸抗原的化合物和至少一種包含人重組白細胞介素2 (IL-2) 和/或人重組白細胞介素 15 (IL-15)（例如，單獨的 IL-2、單獨的 IL-15、或 IL-2 和 IL-15 的組合）的細胞因子存在的情況下活化分離的γδ T細胞，並且在不存在至少一種化合物和存在至少一種細胞因子的情況下擴增活化的γδ T細胞。

另一方面，本公開內容涉及擴增和活化γδ T細胞的方法，包括從人受試者的白細胞分離術中分離γδ T細胞，其中分離包括使白細胞分離產物與抗-α 和抗-β T 細胞受體 (TCR) 抗體（例如，生物素或磁珠綴合的抗-αβ TCR 抗體）接觸，從 PBMC 中例如透過使用鏈黴抗生物素蛋白-微珠或磁體消耗 α-和/或 β-TCR 陽性細胞，在至少一種含有氨基二膦酸鹽和/或磷酸抗原的化合物和至少一種包含 IL-2和/或 IL-15 的細胞因子存在的情況下活化分離的γδ T細胞，並且在不存在至少一種化合物和存在至少一種細胞因子的情況下擴增活化的γδ T細胞。

再一方面，本公開內容提供了活化和擴增γδ T細胞的方法，包括從人受試者的血液樣本中分離γδ T細胞，在存在氨基二膦酸鹽、Toll 樣受體 2 (TLR2) 配體和基本上由 IL-2 和 IL-15 組成的細胞因子組合物的情況下活化分離的γδ T細胞，並且在不存在氨基二膦酸鹽和存在所述細胞因子組合物的情況下擴增活化的γδ T細胞。

一方面，本公開內容提供了透過利用本文描述的方法活化 T 細胞的方法。另一方面，本公開內容提供了透過利用本文描述的方法擴增 T 細胞的方法。再一方面，本公開內容提供了透過利用本文描述的方法活化和擴增 T 細胞的方法。

一方面，分離的γδ T細胞是在存在唑來膦酸、TLR2 配體和由 IL-2 和 IL-15 組成的細胞因子組合物的情況下活化。另一方面，細胞因子組合物由 IL-2 或 IL-15 組成。一方面，本文描述的方法為體外方法。

一方面，γδ T細胞分離自受試者（例如人受試者）的白細胞分離產物，例如， LeukoPak®。另一方面，γδ T 細胞不是從外周血單核細胞 (PBMC)（例如臍帶血）中分離的。一方面，血液樣本包含外周血單核細胞 (PBMC) 和/或白細胞分離產物。

另一方面，α-和/或 β-TCR 陽性細胞包括 αβ T 細胞和天然殺傷 T (NKT) 細胞。

再一方面，氨基二膦酸鹽可能是唑來膦酸鹽、帕米膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、伊班膦酸鹽、英卡膦酸鹽、氯膦酸鹽、依替膦酸鹽或奈立膦酸鹽、其鹽和/或其水合物。再一方面，本文所述方法中使用的唯一氨基二膦酸鹽是唑來膦酸鹽。

另一方面，磷酸抗原可能是 (E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸鹽 (HMBPP)、類異戊二烯焦磷酸鹽（法呢基焦磷酸鹽 (FPP)、香葉基香葉基焦磷酸鹽 (GGPP)、異戊烯焦磷酸鹽 (IPP) 或二甲基烯丙基二磷酸酯 (DMAPP)）。

本公開內容還提供了在存在氨基二膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 的情況下活化γδ T細胞。再一方面，活化是在氨基二膦酸鹽和 IL-2 或氨基二膦酸鹽和 IL-15 存在的情況下進行的。

一方面，活化是在磷酸抗原、IL-2 和 IL-15 存在的情況下或磷酸抗原和 IL-15 存在的情況下進行的。

另一方面，氨基二膦酸鹽是唑來膦酸。

另一方面，磷酸抗原是 IPP。

另一方面，氨基二膦酸鹽的濃度可以為約 0.1 µM 至約 500 µM、約 0.1 µM 至約 400 µM、約 0.1 µM 至約 300 µM、約 0.1 µM 至約 200 µM、約 0.1 µM 至約 100 µM、約 0.5 µM 至約 100 µM、約 1 µM 至約 500 µM、約 1 µM 至約 400 µM、約 1 µM 至約 300 µM、約 1 µM 至約 200 µM、約 1 µM 至約 100 µM、約 1 µM 至約 90 µM、約 1 µM 至約 80 µM、約 1 µM 至約 70 µM、約 1 µM 至約 60 µM、約 1 µM 至約 50 µM、約 1 µM 至約 40 µM、約 1 µM 至約 30 µM、約 1 µM 至約 20 µM、約 1 µM 至約 15 µM、約 1 µM 至約 10 µM、約 1 µM 至約 9 µM、約 1 µM 至約 8 µM、約 1 µM 至約 7 µM、約 1 µM 至約 6 µM、約 1 µM 至約 5 µM、約 2 µM 至約 5 µM、約 3 µM 至約 5 µM、約 2 µM 至約 5 µM、約 2 µM 至約 10 µM、約 3 µM 至約 8 µM 或約 4 µM 至約 6 µM。

另一方面，氨基二膦酸鹽的濃度可以為約 0.1 μM 至約 100 μM 或約 1 μM 至約 100 μM。另一方面，氨基二膦酸鹽的濃度可以是約 5μM。

另一方面，分離的γδ T細胞在活化期間的接種密度為約 0.01 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約1 x 10⁷ 個細胞/cm² 、約0.1 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.25 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約4 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約3 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.6 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.7 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.8 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約0.9 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約1 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2 x 10⁶ 個細胞/cm² 或約1.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約2 x 10⁶ 個細胞/cm² 。

另一方面，分離的γδ T細胞在活化期間的接種密度為約 0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 3 x 10⁶ 個細胞/cm² 。

一方面，在活化和/或擴增期間 IL-2 的濃度為約 10 IU/ml 至約1000 IU/ml、約 10 IU/ml 至約500 IU/ml、約 10 IU/ml 至約400 IU/ml、約 10 IU/ml 至約300 IU/ml、約 10 IU/ml 至約200 IU/ml、約 10 IU/ml 至約150 IU/ml、約 10 IU/ml 至約100 IU/ml、約 20 IU/ml 至約100 IU/ml、約 30 IU/ml 至約100 IU/ml、約 40 IU/ml 至約100 IU/ml、約 50 IU/ml 至約100 IU/ml、約 75 IU/ml 至約125 IU/ml、約 20 IU/ml 至約80 IU/ml、約 25 IU/ml 至約100 IU/ml 或約 50 IU/ml 至約150 IU/ml。

另一方面，在活化和/或擴增期間 IL-2 的濃度為約 50 IU/ml 至約 100 IU/ml。另一方面，在活化和/或擴增期間 IL-15 的濃度為約 10 ng/ml 至約1 µg/ml、約 10 ng/ml 至約500 ng/ml、約 10 ng/ml 至約400 ng/ml、約 10 ng/ml 至約300 ng/ml、約 10 ng/ml 至約200 ng/ml、約 10 ng/ml 至約150 ng/ml、約 10 ng/ml 至約100 ng/ml、約 20 ng/ml 至約100 ng/ml、約 30 ng/ml 至約100 ng/ml、約 40 ng/ml 至約100 ng/ml、約 50 ng/ml 至約100 ng/ml、約 60 ng/ml 至約100 ng/ml、約 20 ng/ml 至約80 ng/ml、約 30 ng/ml 至約60 ng/ml 或約 50 ng/ml 至約120 ng/ml。

另一方面，在活化和/或擴增期間 IL-15 的濃度為約 50 ng/ml 至約 100 ng/ml。

本公開內容進一步提供了在存在濃度為約 1μM 至約 100μM 的唑來膦酸、濃度為約 10 IU/ml 至約 200 IU/ml 的 IL-2 和濃度為約10 – 500 ng/ml 的 IL-15 的情況下活化的各方面情況。再一方面，擴增是在存在濃度為約 10 IU/ml 至約 100 IU/ml 的 IL-2 和/或濃度為約 50 – 200 ng/ml 的 IL-15 的情況下進行。

另一方面，細胞因子可包括 IL-7、IL-18 和/或 IL-21。一方面，本文描述的方法排除了擴增、活化或擴增和活化期間出現 IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9 和/或 IL-23 中的一種或多種。

再一方面，至少一種化合物還包括 Toll 樣受體 2 (TLR2) 配體。

一方面，TLR2 配體選自兩性黴素 B、L-茶氨酸、單寧和多酚組成的組。

另一方面，TLR2 配體是兩性黴素 B。

再一方面，至少一種化合物還包括 N-乙醯半胱氨酸 (NAC) 和/或穀氨醯胺/谷氨酸。

一方面，NAC 的濃度為約 1 mM 至約 10 mM、約 2 mM 至約 8 mM、約 0.5 mM 至約 5 mM 或約 0.5 mM 至約 2.5 mM。

另一方面，至少一種化合物還包含 COX-2 抑制劑。

再一方面，COX-2 抑制劑是布洛芬。

一方面，在存在 N-乙醯半胱氨酸 (NAC) 和/或穀氨醯胺/谷氨酸的情況下進一步擴增。

一方面，NAC 的濃度為約 1 mM 至約 10 mM。

一方面，活化持續時間不超過約 7 天、約 10 天、約 12 天、約 14 天、約 16 天或約 20 天。

一方面，活化持續時間為 1 天至約 10 天、1 天至約 9 天、1 天至約 8 天、1 天至約 7 天、1 天至約 6 天、1 天至約 5 天、1 天至約 4 天、約 2 天至約 10 天、約 2 天至約 8 天、約 2 天至約 7 天、約 3 天至約 7 天或約 4至約 6 天。

另一方面，活化持續時間為約 1 天至約 7 天。

一方面，擴增持續時間大於約 7 天、約 10 天、約 12 天、約 14 天、約 16 天、約 20 天、約 22 天、約 24 天、約 26 天、約 28 天或約 30 天。一方面，擴增持續時間為約 7 天至約 30 天、約 7 天至約 25 天或約 10 天至約 20 天。

一方面，擴增期間γδ T細胞的細胞密度為約 0.1 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.25 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 4 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 3 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.6 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.7 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.8 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 0.9 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2 x 10⁶ 個細胞/cm² 、約 1 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2 x 10⁶ 個細胞/cm² 或約 1.5 x 10⁶ 個細胞/cm² 至約 2 x 10⁶ 個細胞/cm² 。

另一方面，用於擴增的細胞因子可進一步包括 IL-18、IL-21 和 IL-7。

一方面，本申請涉及透過本文所述任一方面的方法製備的擴增和活化γδ T細胞群。

另一方面，本申請涉及增強γδ T細胞中病毒轉導效率的方法，包括用重組病毒載體轉導透過第一至第十六方面中任一方法製備的擴增和活化γδ T細胞。

另一方面，病毒載體是逆轉錄病毒載體。

另一方面，病毒載體是 γ-逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。

再一方面，病毒載體表達 CD8 和 αβ-TCR。

一方面，本申請涉及透過本公開的方法製備的改造γδ T細胞。

一方面，本申請涉及透過本公開的方法製備的擴增γδ T細胞群，其中擴增γδ T細胞的濃度為至少約 1 x 10⁵ 個細胞/ml、至少約 1 x 10⁶ 個細胞/ml、至少約 1 x 10⁷ 個細胞/ml、至少約 1 x 10⁸ 個細胞/ml 或至少約 1 x 10⁹ 個細胞/ml。

一方面，本申請涉及一種治療癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的透過本公開內容的方法製備的改造γδ T細胞。

一方面，癌症選自由急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質癌、AIDS 相關癌症、AIDS 相關淋巴瘤、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、神經母細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤（如：小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性膠質瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、視覺通路和下丘腦膠質瘤）、乳腺癌、支氣管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原發性未知癌、中樞神經系統淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、結腸癌、皮膚 T 細胞淋巴瘤、結締組織增生性小圓細胞瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖細胞腫瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸道基質瘤、膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝細胞癌（肝癌）、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌（如：非小細胞和小細胞肺癌）、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤、原發灶隱匿的轉移性鱗狀頸癌、口腔癌、多發性內分泌腫瘤徵候群、骨髓增生異常徵候群、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、胰腺癌、胰腺癌胰島細胞、副鼻竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、松果體星形細胞瘤、松果體生殖細胞瘤、垂體腺瘤、胸膜肺母細胞瘤、漿細胞瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、攝護腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、默克爾細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、T 細胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、滋養細胞腫瘤（妊娠）、原發部位未知癌、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症和威爾姆斯瘤組成的組。

一方面，癌症是黑色素瘤。

同種異體 T 細胞療法可能基於遺傳改造同種異體γδ T細胞以表達外源 TCR。除了透過異位 TCR 的特異性腫瘤識別之外，γδ T 細胞可能具有針對如本文所述多種腫瘤類型的活性。

一方面，本公開內容涉及 T 細胞的擴增和/或活化。另一方面，本公開內容涉及在不存在結合於 γδ TCR 的特異性表位的試劑（例如，針對 γδ TCR的抗體）的情況下，擴增和/或活化γδ T細胞。另一方面，本公開內容涉及可用於轉基因表達的 γδT 細胞的擴增和/或活化。

本公開內容還涉及γδ T細胞的擴增和活化，同時消耗 α-和/或 β-TCR 陽性細胞。本公開內容還提供了包含擴增的γδ T細胞和消耗或減少的 α-和/或 β-TCR 陽性細胞的 T 細胞群。本公開還提供了使用所公開 T 細胞群的方法。

一方面，本文提供了用於生產大規模藥品生產品質管制規範 (GMP) 級 TCR 改造 Vγ9δ2 T 細胞的方法。

在不存在飼養細胞的情況下，向純化的γδ T細胞中添加 IL-18 增強了γδ T細胞的擴增，IL-2 的表面高親和力受體（CD25 或 IL-2Ra）的量明顯增加。此外，兩性黴素 B（一種 Toll 樣受體 2 (TLR2) 配體）可活化γδ T細胞、CD8⁺ T 細胞和 NK 細胞，並增強 CD25（高親和力 IL-2Rα）表面表達的檢測。總之，這些觀察結果強調了 IL-2 信號傳導在 Vγ9δ2 T 細胞的唑來膦酸鹽介導活化和擴增中的關鍵作用。因此，為了透過 IL-2 信號傳導最大化 IL-2 對於γδ T細胞增殖的可用性（或最小化由於大量 αβ T 細胞而隔離 IL-2），本公開的方法可能包括使用抗-αβTCR 市售 GMP 試劑消耗來自正常 PBMC 的 αβ T 細胞。由於重組 IL-18 目前不能作為市售 GMP 試劑提供，本公開的方法可能在培養物中補充低劑量兩性黴素 B 以增加 CD25 表面表達量以增強 IL-2 結合和信號傳導，因而可以增強活化/擴張期間 IL-2 的反應性。此外，可以加入 IL-15，因為 IL-15 已被證明可增加 IPP 處理的 Vγ9δ2 T細胞的增殖和存活。

圖 13 顯示了過繼同種異體 T 細胞療法的方法，其可遞送「現成的」T 細胞產物，例如，γδ T 細胞產物，用於快速治療其腫瘤中表達受關注靶標的特定癌症的合格患者。這種方法可能包括從健康供體收集γδ T細胞，透過病毒轉導受關注外源基因（如外源性 TCR）進行γδ T細胞改造，再進行細胞擴增，收集擴增的改造γδ T細胞，這些細胞在輸注入患者之前可冷凍保存為「現成的」 T 細胞產品。因此，該方法可消除個人化 T 細胞製造的需要。

為了分離γδ T細胞，一方面，γδ T細胞可從受試者或受試者的複雜樣本中分離。一方面，複雜樣本可能是外周血樣本、臍帶血樣本、腫瘤、幹細胞前體、腫瘤活組織檢查物、組織、淋巴，或來自直接接觸外部環境的受試者的上皮部位樣本或源自幹前體細胞的樣本。γδ T 細胞可能直接從受試者的複雜樣本中分離，例如，透過用流式細胞術技術分選表達一種或多種細胞表面標誌物的γδ T細胞。野生型γδ T細胞可表現出許多可與γδ T細胞相關的抗原識別、抗原呈遞、共刺激和黏附分子。一種或多種細胞表面標誌物，例如，特異性 γδ TCR、抗原識別、抗原呈遞、配體、黏附分子或共刺激分子可用於從複雜樣本中分離野生型γδ T細胞。與γδ T細胞相關或由其表達的各種分子可用於從複雜樣本中分離γδ T細胞。另一方面，本公開內容提供了分離 Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+ 細胞或其任意組合的混合群體的方法。

例如，可從受試者中收集外周血單核細胞，例如，採用血液成分分離機包括 Ficoll-Paque™ PLUS (GE Healthcare) 系統或其他合適的裝置/系統。例如，可採用流式細胞術技術從收集的樣本中純化γδ T細胞或所需的γδ T細胞亞群。臍帶血細胞也可在受試者出生期間從臍帶血中獲得。

在收集的 γδ T細胞上表達的細胞表面標誌物的陽性和/或陰性選擇可用於直接自外周血樣本、臍帶血樣本、腫瘤、腫瘤活組織檢查、組織、淋巴或來自受試者上皮樣本分離 γδ T細胞或表達相似細胞表面標誌物的γδ T細胞群。例如，可以基於 CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCR α、TCR β、TCR α、TCR δ、NKG2D、CD70、CD27、CD30、CD16、CD337 (NKp30)、CD336 (NKp46)、OX40、CD46、CCR7 和其他合適的細胞表面標誌物的陽性或陰性表達從複雜樣本中分離γδ T細胞。

一方面，γδ T 細胞可從體外培養的複雜樣本中分離。另一方面，在沒有預先消耗特定細胞群（例如，單核細胞、αβ T 細胞、B 細胞和 NK 細胞）的情況下可活化和擴增全部的 PBMC 群。另一方面，可以先產生富集的γδ T細胞群，然後進行彼等之特異性活化和擴增。另一方面，可以在不存在天然或改造 APC 的情況下進行γδ T細胞的活化和擴增。另一方面，可以使用固定的γδ T細胞有絲分裂原（包括 γδ TCR 特異性抗體）和其他 γδ TCR 活化劑（包括凝集素）對來自腫瘤樣本的γδ T細胞進行分離和擴增。另一方面，可以在沒有γδ T細胞有絲分裂原（包括 γδ TCR 特異性抗體）和其他 γδ TCR 活化劑（包括凝集素）的情況下對來自腫瘤樣本的γδ T細胞進行分離和擴增。

一方面，γδ T細胞分離自受試者（例如人受試者）的白細胞分離術。另一方面，γδ T 細胞不是從外周血單核細胞 (PBMC) 中分離的。

圖 14 顯示了根據本公開內容實施方案的γδ T細胞製造。該過程可能包括從白細胞分離術產物中收集或獲得白細胞或 PBMC。白細胞分離術可能包括從供體收集全血並使用血液成分分離機分離組分。血液成分分離機分離出所需的血液組分，並將其餘部分返回供體的血液循環。例如，可以使用血液成分分離設備收集白細胞、血漿和血小板，並將紅細胞和中性粒細胞返回供體的血液循環。市售白細胞分離術產品可用於該程序。另一種方法是從血沉棕黃層獲得白細胞。為了分離血沉棕黃層，從供體獲得抗凝全血並離心。離心後，將血液分離成血漿、紅細胞和血沉棕黃層。血沉棕黃層是位於血漿和紅細胞層之間的層。與血沉棕黃層收集相比，白細胞分離術收集可以獲得更高的純度和顯著增加的單核細胞含量。白細胞分離術可能獲得的單核細胞含量通常比血沉棕黃層獲得的單核細胞含量高 20 倍。為了富集單核細胞，可能需要使用 Ficoll 梯度進行進一步分離。

為了從 PBMC 中消耗 αβ T 細胞，可透過磁分離將表達 αβ TCR 的細胞與 PBMC 分離，例如，使用塗覆有抗 αβ TCR 抗體的 CliniMACS® 磁珠，然後冷凍保存αβ TCR-T 細胞消耗的PBMC。為了製造「現成的」T 細胞產品，可將冷凍保存的 αβ TCR-T 細胞消耗的PBMC 解凍，且在存在氨基二膦酸鹽和/或異戊烯焦磷酸鹽 (IPP) 和/或細胞因子（例如白細胞介素2 (IL-2)、白細胞介素15 (IL-15) 和/或白細胞介素18 (IL-18)）和/或其他活化劑（例如，Toll 樣受體2 (TLR2) 配體）的情況下，以小/中等規模（例如，在 24 至 4-6 孔板或 T75/T175 燒瓶中）或大規模（例如，在 50ml-100 升袋中）活化 1-10 天，例如 2-6 天。

一方面，分離的γδ T細胞可以應對與一種或多種抗原接觸而快速擴增。一些γδ T細胞（例如 Vγ9Vδ2+ T 細胞）可以在組織培養期間應對與一些抗原（如：異戊烯基-焦磷酸酯、烷基胺和代謝物或微生物提取物）接觸而在體外快速擴增。刺激的γδ T細胞可以表現出許多可以促進從複雜樣本中分離γδ T細胞的抗原呈遞、共刺激和黏附分子。複雜樣本中的γδ T細胞可以用至少一種抗原在體外刺激 1 天、2 天、3 天、4 天、5 天、6 天、7 天或其他合適的時間段。用合適的抗原刺激γδ T細胞可以在體外擴增γδ T細胞群。

可用於在體外刺激複雜樣本中γδ T細胞擴增的抗原非限制性實例可包括異戊烯-焦磷酸鹽，例如異戊烯焦磷酸鹽 (IPP)、烷基胺、人微生物病原體代謝物、共生細菌代謝物、甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸 (2M3B1PP)、(E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸鹽 (HMB-PP)、焦磷酸乙酯 (EPP)、法呢基焦磷酸鹽 (FPP)、二甲基烯丙基磷酸鹽 (DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸鹽 (DMAPP)、乙基三磷酸腺苷 (EPPPA)、香葉基焦磷酸鹽 (GPP)、香葉基香葉基焦磷酸鹽 (GGPP)、異戊烯基三磷酸腺苷 (IPPPA)、磷酸單乙基酯 (MEP)、焦磷酸單乙酯 (MEPP)、3-甲醯基-1-丁基-焦磷酸鹽 (TUBAg 1)、X-焦磷酸鹽 (TUBAg 2)、3-甲醯基-1-丁基-尿苷三磷酸鹽 (TUBAg 3)、3-甲醯基-1-丁基-去氧胸苷三磷酸 (TUBAg 4)、單乙基烷基胺、烯丙基焦磷酸鹽、巴豆醯基焦磷酸鹽、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸鹽、巴豆醯基-γ-尿苷三磷酸鹽、烯丙基-γ-尿苷三磷酸鹽、乙胺、異丁胺、仲丁胺、異戊胺和含氮二膦酸鹽。

可以使用本文所述的活化和共刺激劑進行γδ T細胞的活化和擴增，以觸發特異性γδ T細胞增殖和持久性群體。一方面，來自不同培養物的γδ T細胞的活化和擴增可以實現不同的克隆或混合多克隆群體亞群。另一方面，不同的激動劑可用於鑒定提供特異性 γδ 活化信號的藥劑。另一方面，提供特異性 γδ 活化信號的試劑可以是針對 γδ TCR 的不同單克隆抗體 (MAb)。另一方面，可以使用伴隨共刺激劑以幫助觸發特異性γδ T細胞增殖而不誘導細胞能量和細胞凋亡。這些共刺激劑可包括與 γδ 細胞上表達的受體結合的配體，如NKG2D、CD161、CD70、JAML、DNAX 輔助分子-1 (DNAM-1)、ICOS、CD27、CD137、CD30、HVEM、SLAM、CD122、DAP 和 CD28。另一方面，共刺激劑可以是對 CD2 和 CD3 分子上的獨特表位具特異性的抗體。當在 αβ 或γδ T細胞上表達時，CD2 和 CD3 可具有不同的構象結構。另一方面，CD3 和 CD2 的特異性抗體可導致γδ T細胞的不同活化。

在γδ T細胞改造之前，可以離體擴增γδ T細胞群。可用於促進體外γδ T細胞群擴增的試劑非限制性實例可能包括抗 CD3 或抗 CD2、抗 CD27、抗 CD30、抗 CD70、抗 OX40 抗體、IL-2、IL-15、IL-12、IL-9、IL-33、IL-18 或 IL-21、CD70（CD27 配體）、植物血凝素 (PHA)、刀豆蛋白 A (ConA)、商陸 (PWM)、蛋白質花生凝集素 (PNA)、大豆凝集素 (SBA)、扁豆凝集素 (LCA)、豌豆凝集素 (PSA)、蝸牛凝集素 (HPA)、蠶豆凝集素 (VGA) 或其他能夠刺激 T 細胞增殖的合適有絲分裂原。

透過γδ T細胞的基因改造可以增強γδ T細胞識別廣譜抗原的能力。一方面，可以改造γδ T細胞以提供識別體內選擇抗原的通用同種異體療法。γδ T 細胞的基因改造可能包括穩定整合表達腫瘤識別部分的構建體（例如：αβ TCR、γδ TCR、嵌合抗原受體 (CAR)（其將抗原結合和 T 細胞活化功能組合為單一的受體）、其抗原結合片段或淋巴細胞活化結構域）至分離γδ T細胞的基因組，細胞因子（IL-15、IL-12、IL-2、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9、IL-23、IL1β），以在體外和體內增強 T 細胞增殖、存活和功能。分離γδ T細胞的基因改造還可能包括從分離γδ T細胞的基因組中的一個或多個內源基因中（例如，MHC 基因座）刪除或破壞基因表達。

一方面，病毒是指天然存在的病毒以及人造病毒。根據本公開一些實施方案的病毒可能是包膜病毒或無包膜病毒。細小病毒（例如 AAV）是無包膜病毒的實例。在一優選實施方案中，病毒可能是包膜病毒。在優選實施方案中，病毒可能是逆轉錄病毒，特別是慢病毒。可以促進真核細胞病毒感染的病毒包膜蛋白可能包括經來自水皰性口炎病毒 (VSV-G)、修飾的貓內源性逆轉錄病毒 (RD114TR) 和修飾的長臂猿白血病病毒 (GALVTR) 的包膜糖蛋白 (GP) 假型化的 HIV-1 衍生慢病毒載體 (LV)。這些包膜蛋白可以有效地促進其他病毒的進入，例如細小病毒，包括腺相關病毒 (AAV)，從而證明它們的廣泛效率。例如，可使用其他病毒包膜蛋白，包括莫洛尼鼠白血病病毒 (MLV) 4070 env（如 Merten et al.,J. Virol. 79:834-840, 2005 一文中所述；其透過引用併入本文）、RD114 env (SEQ ID NO: 2)、嵌合包膜蛋白 RD114pro 或 RDpro（透過用 HIV-1 基質/衣殼 (MA/CA) 切割序列取代 RD114 的 R 肽切割序列構建的 RD114-HIV嵌合體，如 Bell et al.Experimental Biology and Medicine 2010; 235:1269–1276 一文中所述；其透過引用併入本文）、桿狀病毒 GP64 env（如 Wang et al. J.Virol. 81:10869-10878, 2007 一文中所述；其透過引用併入本文）或 GALV env（如 Merten et al., J.Virol. 79:834-840, 2005 一文中所述；其透過引用併入本文）或其衍生物。
RD114TR

RD114TR 是嵌合包膜糖蛋白，其由貓白血病病毒 RD114 的細胞外和跨膜結構域和雙嗜性小鼠白血病病毒包膜的細胞質尾部 (TR) 構成。RD114TR 假型載體可介導基因有效轉移入人造血祖細胞和 NOD/SCID 再生細胞中。Di Nunzio et al.,Hum.Gene Ther :811-820 (2007) 一文的內容透過引用整體併入本文。RD114 假型載體還可以在大型動物模型中介導有效的基因轉移。(Neff et al.,Mal. Ther. 2:157-159 (2004); Hu et al.,Mal.Ther :611-617 (2003) 和 Kelly et al.,Blood Cells, Molecules, & Diseases 30:132-143 (2003)) 各參考文獻的內容透過引用整體併入本文。

本公開可內容可能包括具有與 SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 5 的氨基酸序列至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 98%、至少約 99% 或 100% 序列同一性的 RD114TR 變體。例如，可能使用與 RD114TR (SEQ ID NO: 1) 具有約 96% 序列同一性的 RD114TR 變體 (RD114TRv1 (SEQ ID NO: 5))。一方面，本公開內容提供了具有修飾氨基酸殘基的 RD114TR 變體。修飾的氨基酸殘基可能選自氨基酸插入、刪除或取代。一方面，本文描述的取代是保守氨基酸取代。也就是說，RD114TR 的氨基酸可以被具有相似性質的其他氨基酸取代（保守變化，例如，相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞 α-螺旋結構或 3-片結構的傾向）。保守取代的非限制性實例可見，例如， Creighton (1984)Proteins. W.H. Freeman and Company，其內容透過引用整體併入。

另一方面，本公開內容可能包括與 SEQ ID NO: 1、2、3、4 或 5 的氨基酸序列具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 98%、至少約 99% 或 100% 序列同一性的變體。

一方面，保守取代可能包括由 Dayhoff 在「The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5」,Natl.Biomedical Research 中所述的取代，其內容透過引用整體併入本文。例如，一方面，屬於以下組之一的氨基酸可彼此交換，因此構成保守交換：第 1 組：丙氨酸 (A)、脯氨酸 (P)、甘氨酸 (G)、天冬醯胺 (N)、絲氨酸 (S)、蘇氨酸 (T)；第 2 組：半胱氨酸 (C)、絲氨酸 (S)、酪氨酸 (Y)、蘇氨酸 (T)；第 3 組：纈氨酸 (V)、異亮氨酸 (I)、亮氨酸 (L)、甲硫氨酸 (M)、丙氨酸 (A)、苯丙氨酸 (F)；第 4 組：賴氨酸 (K)、精氨酸 (R)、組氨酸 (H)；第 5 組：苯丙氨酸 (F)、酪氨酸 (Y)、色氨酸 (W)、組氨酸 (H)；和第 6 組：天冬氨酸 (D)、谷氨酸 (E)。

一方面，保守氨基酸取代可包括用相同類別中的另一個取代氨基酸，例如，(1) 非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；(2) 不帶電的極性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3) 酸性：Asp、Glu；和 (4) 鹼性：Lys、Arg、His。其他保守氨基酸取代也可以按如下進行：(1) 芳香族：Phe、Tyr、His；(2) 質子供體：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；和 (3) 質子受體：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln（參見美國專利號 10106805）。

另一方面，保守取代可以根據表 A 進行。用於預測蛋白質修飾耐受性的方法可參加，例如，Guo et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA , 101(25):9205-9210 (2004)，其內容透過引用整體併入。
表 A

一方面，RD114TR 假型逆轉錄病毒載體在轉導後約 10 天的轉基因表達為約 20% 至約 60%、約 30% 至約 50% 或約 35% 至約 45%。一方面，轉導後 10 天 RD114TR 假型逆轉錄病毒載體的轉基因表達為約 20% 至約 60%、約 30% 至約 50% 或約 35% 至約 45%，而在相同條件下轉導後 10 天 VSV-G 假型載體的轉基因表達為約 5% 至約 25%、約 2% 至約 20%、約 3% 至約 15% 或約 5% 至約 12%。再一方面，轉導後 10 天 RD114TR 假型逆轉錄病毒載體的轉基因表達為約 40%，而轉導後 10 天 VSV-G 假型載體的轉基因表達為約 3.6%。

再一方面，RD114TR 假型逆轉錄病毒載體在轉導後約 5 天的轉基因表達為約 20% 至約 50%、約 15% 至約 30% 或約 20% 至約 30%。一方面，在相同條件下，轉導後 5 天 RD114TR 假型逆轉錄病毒載體的轉基因表達為約 20% 至約 50%、約 15% 至約 30% 或約 20% 至約 30%，而轉導後 5 天 VSV-G 假型載體的轉基因表達為約 10% 至約 20%、約 15% 至約 25% 或約 17.5% 至約 20%。再一方面，轉導後 5 天 RD114TR 假型逆轉錄病毒載體的轉基因表達為約 24%，而轉導後 5 天 VSV-G 假型載體的轉基因表達為約 19%。

另一方面，轉導後 10 天 RD114TR 假型逆轉錄病毒載體的轉基因表達為轉導後 10 天 VSV-G 假型載體的轉基因表達的約 2 倍、約 3 倍、約 4 倍、約 5 倍或約 10 倍、約 11 倍或約 12 倍或更多。

一方面，本公開內容提供了使用具有 RD114TR 假型（例如，SEQ ID NO: 1）的逆轉錄病毒來轉導 T 細胞的方法。另一方面，與具有 VSV-G 假型（例如，SEQ ID NO: 3）的逆轉錄病毒相比，具有 RD114TR 假型（例如，SEQ ID NO: 1）的逆轉錄病毒可更有效地轉導 T 細胞。另一方面，RD114TR 包膜用於假型化慢病毒載體，然後該載體用於以極高的效率轉導 T 細胞。

可用各種方法產生改造γδ T細胞。例如，編碼包含腫瘤識別或其他類型識別部分的表達盒的多核苷酸可透過轉座子/轉座酶系統或基於病毒的基因轉移系統（例如，慢病毒或逆轉錄病毒系統）或其他合適的方法，如：轉染、電穿孔、轉導、脂質轉染、磷酸鈣 (CaPO4)、納米改造物質（如 Ormosil），病毒傳遞方法，包括腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺相關病毒或其他合適的方法穩定地引入γδ T細胞。許多病毒方法已用於人基因治療，例如 WO 1993020221 中描述的方法，其內容透過引用整體併入本文。可用於改造γδ T細胞的病毒方法的非限制性實例可包括 γ-逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒或腺病毒相關病毒方法。

圖 14 顯示了活化 T 細胞可以透過用病毒載體（例如：RD114TR γ-逆轉錄病毒載體和 RD114TR 慢病毒載體）轉導，將受關注外源基因（例如：針對特定癌抗原的 αβ TCR 和 CD8）表達到分離γδ T細胞中來進行改造。病毒載體還可含有轉錄後調控元件 (PRE)，例如：土撥鼠 PRE (WPRE)，以透過增加細胞核和細胞質 mRNA 水準來增強轉基因的表達。還可使用一種或多種調節元件，包括小鼠 RNA 轉運元件 (RTE)、猿猴逆轉錄病毒 1 型 (SRV-1) 的組成型轉運元件 (CTE) 和人熱休克蛋白 70 的5' 非翻譯區 (Hsp70 5′UTR)，和/或與 WPRE 組合使用以增加轉基因表達。轉導可以進行一次或多次以實現小規模（例如 24 至 4-6 孔板）或中/大規模的穩定轉基因表達 1/2 至 5 天，例如 1 天。

RD114TR是嵌合糖蛋白，其含有與鼠白血病病毒的細胞質尾 (TR) 融合的貓內源病毒 (RD114) 的細胞外和跨膜結構域。一方面，轉導後 10 天 RD114TR 假型逆轉錄病毒載體的轉基因表達相對於 VSV-G 假型載體更高。

還可以使用其他病毒包膜蛋白，例如 VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、嵌合包膜蛋白 RD114pro、桿狀病毒 GP64 env 或 GALV env 或其衍生物。

一方面，改造（或轉導）的γδ T細胞可以離體擴增而不受抗原呈遞細胞或氨基二膦酸鹽的刺激。本公開的抗原反應性改造 T 細胞可以離體和體內擴增。另一方面，本公開內容的改造γδ T細胞的活性群體可以離體擴增，而無需抗原呈遞細胞、抗原肽、非肽分子或小分子化合物（例如，氨基二膦酸鹽）的抗原刺激，但是使用某些抗體、細胞因子、有絲分裂原或融合蛋白，例如：IL-17 Fc 融合、MICA Fc 融合和 CD70 Fc 融合。可用於擴增γδ T細胞群抗體實例可能包括抗 CD3、抗 CD27、抗 CD30、抗 CD70、抗 OX40、抗 NKG2D 或抗CD2 抗體，細胞因子的實例可能包括 IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-18、IL-9、IL-7 和/或 IL-33，有絲分裂原的實例可能包括CD70（人 CD27 的配體）、植物血凝素 (PHA)、刀豆蛋白 A (ConA)、商陸有絲分裂原 (PWM)、蛋白質花生凝集素 (PNA)、大豆凝集素 (SBA)、扁豆凝集素 (LCA)、豌豆凝集素 (PSA)、蝸牛凝集素 (HPA)、蠶豆凝集素 (VGA) 或其他能夠刺激 T 細胞增殖的合適有絲分裂原。另一方面，改造γδ T細胞群可在少於 60 天、少於 48 天、36天、少於 24 天、少於 12 天或少於 6 天內擴增。

另一方面，本公開內容提供了用於離體擴增用於過繼轉移療法的改造γδ T細胞群的方法。本公開內容的改造γδ T細胞可離體擴增。本公開內容的改造γδ T細胞可在體外擴增而不經 APC 活化或不與 APC 和氨基磷酸鹽共培養。

另一方面，γδ T細胞群體可在體外擴增少於36 天、少於 35 天、少於 34 天、少於 33 天、少於 32 天、少於 31 天、少於 30 天、少於 29 天、少於 28 天、少於 27 天、少於 26 天、少於 25 天、少於 24 天、少於 23 天、少於 22 天、少於 21 天、少於 20 天、少於 19 天、少於 18 天、少於 17 天、少於 16 天、少於 15 天、少於 14 天、少於 13 天、少於 12 天、少於 11 天、少於 10 天、少於 9 天、少於 8 天、少於 7 天、少於 6 天、少於 5 天、少於 4 天或少於 3 天。

圖 14 顯示了轉導或改造的γδ T細胞的擴增可在存在細胞因子（例如：IL-2、IL-15、IL-18 等）的情況下以小/中等規模（例如：燒瓶/G-Rex）或大規模（例如：50ml-100 升袋）進行 7-35 天，例如 14-28 天。然後可將擴增轉導的 T 細胞產物冷凍保存為「現成的」T 細胞產物，用於輸注到患者體內。
治療方法

可以給予含有本文所述的改造γδ T細胞的組合物用於預防性和/或治療性治療。在治療應用中，藥物組合物可以以足以治癒或至少部分阻止疾病或病症症狀的量給予已患有疾病或病症的受試者。還可給予改造γδ T細胞以減少病症發展、發生或惡化的可能性。用於治療用途的有效量改造γδ T細胞群可能根據疾病或病症的嚴重程度和病程、先前療法、受試者的健康狀況、體重和/或對藥物的反應和/或治療醫師的判斷而不同。

本公開內容的改造γδ T細胞可用於治療需要治療病症（例如，本文所述的癌症）的受試者。

用γδ T細胞治療受試者病症（例如，疾病）的方法可能包括給予受試者治療有效量的改造γδ T細胞。本公開內容的γδ T細胞可以以各種方案（例如，時間、濃度、劑量、治療之間的間隔和/或製劑）施用。在接受本公開的改造γδ T細胞之前，還可以用，例如，化學療法、放射療法或兩者的組合對受試者進行預處理。在施用於受試者之前，改造的γδ T細胞群還可經冷凍或冷凍保存。改造的γδ T細胞群可包括表達相同、不同或相同和不同腫瘤識別部分組合的兩種或更多種細胞。例如，改造的γδ T細胞群可包括幾種不同的改造γδ T細胞，其被設計用於識別不同抗原或相同抗原的不同表位。

本公開內容的γδ T細胞可用於治療各種病症。一方面，本公開內容的改造γδ T細胞可用於治療癌症，包括實體瘤和惡性血液病。癌症的非限制性實例包括：急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質癌、AIDS 相關癌症、AIDS 相關淋巴瘤、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、神經母細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤（如：小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性膠質瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、視覺通路和下丘腦膠質瘤）、乳腺癌、支氣管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原發性未知癌、中樞神經系統淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、結腸癌、皮膚 T 細胞淋巴瘤、結締組織增生性小圓細胞瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖細胞腫瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸道基質瘤、膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝細胞癌（肝癌）、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌（如：非小細胞和小細胞肺癌）、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤、原發灶隱匿的轉移性鱗狀頸癌、口腔癌、多發性內分泌腫瘤徵候群、骨髓增生異常徵候群、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、胰腺癌、胰腺癌胰島細胞、副鼻竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、松果體星形細胞瘤、松果體生殖細胞瘤、垂體腺瘤、胸膜肺母細胞瘤、漿細胞瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、攝護腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、默克爾細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、T 細胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、滋養細胞腫瘤（妊娠）、原發部位未知癌、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症和威爾姆斯瘤。

一方面，本公開內容的改造γδ T細胞可用於治療傳染病。另一方面，本公開內容的改造γδ T細胞可用於治療傳染病，傳染病可由病毒引起。再一方面，本公開內容的改造γδ T細胞可用於治療免疫疾病，例如，自體免疫疾病。

可以在病症臨床發作之前、發作期間和發作之後向受試者提供本公開內容的γδ T細胞治療。在疾病臨床發作後 1 天、1 週、6 個月、12 個月或 2 年後，可向受試者提供治療。在疾病臨床發作後可能提供給受試者治療超過 1 天、1 週、1 個月、6 個月、12 個月、2 年、3 年、4 年、5 年、6 年、7 年、8 年、9 年、10 年或更長時間。在疾病臨床發作後可能提供給受試者治療少於 1 天、1 週、1 個月、6 個月、12 個月或 2 年。治療還可能包括在臨床試驗中治療人。治療可包括向受試者施用包含本公開內容的改造γδ T細胞的藥物組合物。

另一方面，向受試者施用本公開內容的改造γδ T細胞可以調節受試者體內內源性淋巴細胞的活性。另一方面，向受試者施用改造γδ T細胞可以向內源性 T 細胞提供抗原並且可增強免疫應答。另一方面，記憶 T 細胞可以為 CD4+ T 細胞。另一方面，記憶 T 細胞可以為 CD8+ T 細胞。另一方面，向受試者施用本公開內容的改造γδ T細胞可活化另一種免疫細胞的細胞毒性。另一方面，其他免疫細胞可以為 CD8+ T 細胞。另一方面，其他免疫細胞可以為天然殺傷 T 細胞。另一方面，向受試者施用本公開內容的改造γδ T細胞可抑制調節性 T 細胞。另一方面，調節性 T 細胞可以為 FOX3+ Treg 細胞。另一方面，調節性 T 細胞可以為 FOX3- Treg 細胞。其活性可透過本公開內容的改造γδ T細胞調節的細胞非限制性實例可能包括：造血幹細胞；B 細胞；CD4；CD8；紅血球；白血球；樹突細胞，包括樹突抗原呈遞細胞；白細胞；巨噬細胞；記憶 B 細胞；記憶 T 細胞；單核細胞；自然殺傷細胞；中性粒細胞；T 輔助細胞；和 T 殺傷細胞。

在大多數骨髓移植期間，環磷醯胺與全身照射組合可常規用於防止受試者免疫系統對移植體的造血幹細胞 (HSC) 產生排斥。一方面，可以進行供體骨髓與白細胞介素-2 (IL-2) 離體孵育以增強供體骨髓中殺傷性淋巴細胞的產生。白細胞介素-2 (IL-2) 是野生型淋巴細胞生長、增殖和分化所必需的細胞因子。目前關於將γδ T細胞過繼轉移到人體中的研究可能需要共同施用γδ T細胞和白細胞介素-2。然而，低劑量和高劑量的 IL-2 都可能具有高度的毒性副作用。IL-2 毒性可在多個器官/系統中表現出來，最顯著的是心臟、肺、腎和中樞神經系統。另一方面，本公開內容提供了用於向受試者施用改造γδ T細胞而不共同施用天然細胞因子或其修飾形式（例如 IL-2、IL-15、IL-12、IL-21）的方法。另一方面，改造的γδ T細胞可以在不與 IL-2 共同施用的情況下施用於受試者。另一方面，改造的γδ T細胞可以在程序期間施用於受試者，例如，骨髓移植而不共同施用 IL-2。
給藥方法

可以以任何順序或同時向受試者施用一種或多種改造的γδ T細胞群。如果同時施用，多種改造的γδ T細胞可以為單次統一形式提供，例如：靜脈內注射，或以多種形式提供，例如，多次靜脈內輸注、皮下注射、注射或丸劑。改造的γδ T細胞可以一起包裝或分開包裝在單個包裝中或在多個包裝中。可以以多劑量給予一種或所有改造的γδ T細胞。如果不是同時施用，多次劑量之間的時間間隔可能為大約一週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或大約一年。另一方面，改造的γδ T細胞可以在施用於受試者後在受試者體內擴增。可以冷凍改造γδ T細胞以提供細胞以相同的細胞製劑進行多次治療。本公開內容的改造γδ T細胞和包含該細胞的藥物組合物可以包裝為套件。套件可包括改造γδ T細胞和包含該細胞的組合物的使用說明書（例如，書面說明書）。

另一方面，治療癌症的方法包括向受試者施用治療有效量的改造γδ T細胞，其中所述給藥治療癌症。在另一實施方案中，治療有效量的改造γδ T細胞可以施用至少約 10 秒、30 秒、1 分鐘、10 分鐘、30 分鐘、1 小時、2 小時、3 小時、4 小時、5 小時、6 小時、12 小時、24 小時、2 天、3 天、4 天、5 天、6 天、1 週、2 週、3 週、1 個月、2 個月、3 個月、4 個月、5 個月、6 個月或 1 年。另一方面，治療有效量的改造γδ T細胞可以施用至少一週。另一方面，治療有效量的改造γδ T細胞可以施用至少二週。

本文所述的改造γδ T細胞可以在疾病或病症發生之前、發生期間或發生之後施用，並且施用含有改造γδ T細胞的藥物組合物的時間可能不同。例如，改造的γδ T細胞可以用作預防劑，並且可以連續給予有病症或疾病傾向的受試者，以減少疾病或病症發生的可能性。可以在症狀發作期間或發作之後盡可能快地給予受試者改造的γδ T細胞。改造γδ T細胞可以在症狀發作後立即、症狀發作的前 3 小時內、症狀發作的前 6 小時內、症狀發作的前 24 小時內、症狀發作的 48 小時內或症狀發作後的任何一段時間內給予。初始施用可透過任何實用的途徑，例如：透過本文描述的任何途徑使用本文描述的任何製劑給予。另一方面，本公開內容的改造γδ T細胞可以是靜脈內施用。一種或多種劑量的改造γδ T細胞可在癌症、傳染病、免疫疾病、敗血症或骨髓移植開始後儘快施用，並持續一段治療免疫疾病所需的時間，例如，從約 24 小時到約 48小時、從約 48 小時到約 1 週、從約 1 週到約 2 週、從約 2 週到約 1 個月、從約 1 個月到約 3 個月。對於癌症治療，可以在癌症發作後數年和其他治療之前或之後施用一劑或多劑量的改造γδ T細胞。另一方面，改造的γδ T細胞可以施用至少約 10 分鐘、30 分鐘、1 小時、2 小時、3 小時、4 小時、5 小時、6 小時、12 小時、24 小時、至少 48 小時、至少 72 小時、至少 96 小時、至少 1 週、至少 2 週、至少 3 週、至少 4 週、至少 1 個月、至少 2 個月、至少 3 個月、至少 4 個月、至少 5 個月、至少 6 個月、至少 7 個月、至少 8 個月、至少 9 個月、至少 10 個月、至少 11 個月、至少 12 個月、至少 1 年、至少 2 年、至少 3 年、至少 4 年或至少 5 年。每個受試者的治療時間可能不同。
保存

一方面，γδ T細胞可以在冷凍介質中配製並置於低溫儲存裝置（例如：液氮冷凍器（-196℃）或超低溫冷凍器（-65℃、-80℃、-120℃ 或 -150℃）中長期儲存至少約 1 個月、2 個月、3 個月、4 個月、5 個月、6 個月、1 年、2 年、3 年或至少 5 年。冷凍培養基可以含有二甲基亞碸 (DMSO) 和/或氯化鈉 (NaCl) 和/或右旋糖和/或硫酸葡聚糖和/或羥乙基澱粉 (HES) 以及生理pH緩衝劑，以將 pH 保持在約 6.0 至約 6.5、約 6.5 至約 7.0、約 7.0 至約 7.5、約 7.5 至約 8.0 或約 6.5 至約 7.5 之間。冷凍保存的γδ T細胞可以解凍並透過用本文所述的抗體、蛋白質、肽和/或細胞因子刺激進行進一步加工。冷凍保存的γδ T細胞可以解凍並用本文所述的病毒載體（包括逆轉錄病毒、腺相關病毒 (AAV) 和慢病毒載體）或非病毒手段（包括 RNA、DNA，例如轉座子和蛋白質）進行基因修飾。可以進一步冷凍保存修飾的γδ T細胞以產生至少約 1、5、10、100、150、200、500 個小瓶量的細胞庫，細胞濃度為至少約 10¹ 、10² 、10³ 、10⁴ 、10⁵ 、10⁶ 、10⁷ 、10⁸ 、10⁹ 或至少10¹⁰ 個細胞/mL 冷凍介質。冷凍保存的細胞庫可以保留其功能並且可以解凍並進一步刺激和擴增。另一方面，可以在合適的封閉容器（例如：細胞培養袋和/或生物反應器）中刺激和擴增解凍的細胞，以產生大量細胞作為同種異體細胞產物。冷凍保存的γδ T細胞可以在低溫儲存條件下維持其生物學功能至少約 6 個月、7 個月、8 個月、9 個月、10 個月、11 個月、12 個月、13 個月、15 個月、18 個月、20 個月、24 個月、30 個月、36 個月、40 個月、50 個月或至少約 60 個月。另一方面，製劑中不使用防腐劑。冷凍保存的γδ T細胞可以解凍並作為同種異體現成的細胞產物輸注到多個患者中。

一方面，本文所述的改造γδ T細胞可能存在於組合物中，含量為至少 1×10³ 個細胞/ml、至少 2×10³ 個細胞/ml、至少 3×10³ 個細胞/ml、至少 4×10³ 個細胞/ml、至少 5×10³ 個細胞/ml、至少 6×10³ 個細胞/ml、至少 7×10³ 個細胞/ml、至少 8×10³ 個細胞/ml、至少 9×10³ 個細胞/ml、至少 1×10⁴ 個細胞/ml、至少 2×10⁴ 個細胞/ml、至少 3×10⁴ 個細胞/ml、至少 4×10⁴ 個細胞/ml、至少 5×10⁴ 個細胞/ml、至少 6×10⁴ 個細胞/ml、至少 7×10⁴ 個細胞/ml、至少 8×10⁴ 個細胞/ml、至少 9×10⁴ 個細胞/ml、至少 1×10⁵ 個細胞/ml、至少 2×10⁵ 個細胞/ml、至少 3×10⁵ 個細胞/ml、至少 4×10⁵ 個細胞/ml、至少 5×10⁵ 個細胞/ml、至少 6×10⁵ 個細胞/ml、至少 7×10⁵ 個細胞/ml、至少 8×10⁵ 個細胞/ml、至少 9×10⁵ 個細胞/ml、至少 1×10⁶ 個細胞/ml、至少 2×10⁶ 個細胞/ml、至少 3×10⁶ 個細胞/ml、至少 4×10⁶ 個細胞/ml、至少 5×10⁶ 個細胞/ml、至少 6×10⁶ 個細胞/ml、至少 7×10⁶ 個細胞/ml、至少 8×10⁶ 個細胞/ml、至少 9×10⁶ 個細胞/ml、至少 1×10⁷ 個細胞/ml、至少 2×10⁷ 個細胞/ml、至少 3×10⁷ 個細胞/ml、至少 4×10⁷ 個細胞/ml、至少 5×10⁷ 個細胞/ml、至少 6×10⁷ 個細胞/ml、至少 7×10⁷ 個細胞/ml、至少 8×10⁷ 個細胞/ml、至少 9×10⁷ 個細胞/ml、至少 1×10⁸ 個細胞/ml、至少 2×10⁸ 個細胞/ml、至少 3×10⁸ 個細胞/ml、至少 4×10⁸ 個細胞/ml、至少 5×10⁸ 個細胞/ml、至少 6×10⁸ 個細胞/ml、至少 7×10⁸ 個細胞/ml、至少 8×10⁸ 個細胞/ml、至少 9×10⁸ 個細胞/ml、至少 1×10⁹ 個細胞/ml 或更多、從約 1×10³ 個細胞/ml 至約至少 1×10⁸ 個細胞/ml、從約 1×10⁵ 個細胞/ml 至約至少 1×10⁸ 個細胞/ml 或從約 1×10⁶ 個細胞/ml 至約至少 1×10⁸ 個細胞/ml。

為了開發可存活的同種異體 T 細胞產物，例如，其可以被改造以表達腫瘤抗原特異性 TCR，例如嵌合 CD8α-CD4tm/細胞內蛋白（圖12A 和 12B），本公開內容的實施方案可能包括可以最大限度地提高γδ T細胞產量，同時最大限度地減少最終同種異體產物中存在殘留 αβ T 細胞的方法。例如，本公開內容的實施方案可能包括透過消耗 αβ T 細胞並用分子（例如：兩性黴素 B、N-乙醯半胱氨酸 (NAC)（或高劑量穀氨醯胺/谷氨酸）、IL-2和/或IL-15 補充生長培養物來擴增和活化γδ T細胞的方法。

一方面，根據本公開內容的一個方面，本文描述的方法可以用於產生自體或同種異體產物。

透過參考以下實施例可以更好地理解本發明，這些實施例不用來限制申請專利範圍的範圍。
實施例
實施例 1
加工白細胞分離術產物

白細胞分離術產品（例如 LeukoPak®）可處理如下：LeukoPak® 袋的一端可以用酒精棉簽擦拭並用剃刀刀片切開以排入燒瓶中。用 Hank 溶液將體積稀釋至約 500 ml 之間，然後等分到 16-29 個容量為 50 ml 的試管中，每管 30 ml。試管可以 400 g 離心30 分鐘，不制動、不加速。可以吸出白色液體，可以填充新的 50 ml 試管至一半並用 25 ml PBS 填滿。該過程可以再重複 2 次，總共洗滌 3 次。在最後一次洗滌之前使用血球計數器計數細胞。產量可以是1×10⁸ 個細胞/管，共 30-60 管。
實施例 2
消耗 αβ T 細胞

圖 1A 顯示了從 PBMC 中消耗 αβ T 細胞。將 ficoll 處理後的PBMC 與生物素綴合的 αβ TCR 抗體一起孵育，然後根據製造商的方案與鏈黴抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然後使樣本通過 LS 管柱以富集表達 αβ TCR 的細胞。管柱流出液表示 αβ TCR 消耗的部分。過夜培養後，富含 αβ TCR 的部分和 αβ TCR 消耗的部分用螢光染料綴合的 αβ TCR 抗體與 Vγ9 抗體染色，然後進行流式細胞術分析。資料顯示，雖然富含 αβ TCR 部分幾乎不含 (0%) Vγ9δ2 細胞，但在 αβ TCR 消耗的部分幾乎富集所有 Vγ9δ2 細胞 (45%)。

類似地，來自白細胞分離術產物的細胞可與生物素綴合的 αβ TCR 抗體一起孵育，然後根據製造商的方案與鏈黴抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然後使樣本通過 LS 管柱以富集表達 αβ TCR 的細胞。管柱流出液表示 αβ TCR 消耗的部分。過夜培養後，將 αβ TCR 消耗的部分用螢光染料綴合的 αβ TCR 抗體與 γδ TCR 抗體染色，然後進行流式細胞術分析。圖 1E 顯示，雖然白細胞分離產物中的起始細胞含有最少的 (4.14%) Vγ9δ2 細胞，但幾乎所有 Vγ9δ2 細胞在αβ TCR 消耗的部分富集 (95.5%)。一方面，使用前述方法，Vγ9δ2 細胞可富集超過約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。

圖 1B 和 1C 顯示了 Vγ9δ2 T 細胞產物中最少的殘留 αβ T 細胞。使用生物素化抗 αβ TCR 抗體/鏈黴抗生物素蛋白微珠從正常供體（供體 A、供體 B、供體 C、供體 12 和供體 13）的 PBMC 中消耗 αβ T 細胞。將 αβ T 細胞消耗的 PBMC 與唑來膦酸鹽/IL-2/IL-15 一起培養 14 天，然後用各自的螢光染料綴合抗體（例如，抗-αβ TCR 抗體和抗-γδ TCR 抗體）進行細胞表面染色，透過 CD3 亞門控評估殘留的 αβ T 細胞和富集的γδ T細胞。這些結果顯示，αβ T 細胞消耗的γδ T細胞富集，即 90.1%（供體 A）、78.6%（供體 B）、28.9%（供體 C）、89%（供體 12）和 74%（供體 13）。此外，αβ T 細胞消耗的γδ T細胞含有最少量的殘餘 αβ T 細胞，即 0.02%（供體 A）、0.05%（供體 B）、0.2%（供體 C）、0.4%（供體 12）和 1%（供體 13）。殘留 αβ T 細胞最少很重要，這是因為，例如，在半相合造血幹細胞移植 (HSCT) 中，0.2-0.6% 的殘留 αβT 細胞不會導致慢性移植物抗宿主病 (GVHD)，因此，使這些 αβ T 細胞消耗的γδ T細胞成為安全的同種異體產物。

圖 1D 顯示 Vγ9δ2 細胞的細胞因子譜。在收穫細胞之前，用 Golgi Stop/Plug（即，蛋白質轉運抑制劑）處理用唑來膦酸鹽/IL-2/IL-15 培養的 αβ　 T 細胞消耗的PBMC 6 個小時。對細胞進行表面 Vδ2 染色，然後固定並通透化。使用針對 TNF-α、IL-17a 和 IFN-γ 的螢光染料綴合抗體進行 TNF-α、IL-17a 和 IFN-γ 細胞內染色。這些結果顯示 TNF-α、IL-17a 和 IFN-γ 分別在 12%、0.2% 和 4% 的 Vγ9δ2 細胞中表達。IL-15 介導的 IL-17 定型抑制由少量產生 IL-17 的 Vγ9δ2 T 細胞顯示，例如 0.2%。
實施例 3
αβ T 細胞消耗的 PBMC 的活化和擴增

在不定型失能的情況下，最大程度的 T 細胞活化、增殖和存活可能需要三種信號：透過 TCR 引發的信號 1、透過共刺激分子引發的信號 2 和透過生長因子信號傳導引發的信號 3。

圖2 和 3 分別顯示了根據本公開內容的實施方案的活化步驟和擴增步驟。活化步驟和擴增步驟可以是兩個連續的步驟。例如，在活化步驟期間（圖 2），可能存在氨基二膦酸鹽（例如，唑來膦酸鹽 (ZA)）或磷酸抗原（例如，IPP）和細胞因子（例如，IL-2 和/或 IL-15）。而在擴增步驟期間（圖 3），細胞因子可能在沒有氨基二膦酸鹽或磷酸抗原（如：IPP）的情況下繼續存在。活化步驟（圖 2）可以在前 14 天期間發生，此時加入氨基二膦酸鹽或磷酸抗原（例如IPP）並且不洗去。擴增步驟（圖 3）可以從第 15 天開始，因為在第 14 天結束時，可以透過除去含有氨基二膦酸鹽或磷酸抗原（例如 IPP）的所有培養基，並用無氨基二膦酸鹽或磷酸抗原（例如 IPP）存在的含有細胞因子的培養基替換來收集活化細胞。相反，用於 Vγ9δ2 唑來膦酸鹽介導的生產的常規方案通常將第 1-14 天稱為活化/擴增期，這是因為在這樣的條件下，細胞不能在第 14 天之後保持存活。在本公開內容中，第 1-14 天被稱為活化步驟，這是因為存在氨基二膦酸鹽（例如，唑來膦酸鹽或磷酸抗原，例如 IPP），第 15 天以後被稱為擴增步驟，這是因為在超過常規的 14 天過程外細胞可以保持存活和擴增。

圖 2 顯示了透過氨基二膦酸鹽誘導的 γδ TCR/IPP 相互作用引發的信號 1 以活化Vγ9δ2 T 細胞進行增殖，氨基二膦酸鹽可包括帕米膦酸、阿侖膦酸、唑來膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其鹽和/或其水合物；或磷酸抗原，例如：(E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸鹽 (HMBPP)、類異戊二烯焦磷酸鹽（法呢基焦磷酸鹽 (FPP)、香葉基香葉基焦磷酸鹽 (GGPP)、異戊烯焦磷酸鹽 (IPP) 和二甲基烯丙基二磷酸酯 (DMAPP)）。例如，唑來膦酸鹽（唑來膦酸 (ZA) 或 Zometa）抑制單核細胞 (Mo) 中的甲羥戊酸途徑，導致磷酸抗原（如 IPP）積聚展示在單核細胞上 (ZA-Mo)，從而透過 PKC 信號傳導活化 γ9δ2 TCR/CD3 和誘導增殖，從而作為信號 1。IPP 本身也可以透過與 γ9δ2 TCR 結合直接作用於γδ T細胞，從而避免了對單核細胞的需要。

圖 2 還顯示透過共刺激分子例如，兩性黴素 B（FDA 批准的安必素），即 TLR2 配體引發的信號 2。例如，兩性黴素 B 可以透過兩種潛在的機制刺激γδ T細胞。首先，作為信號 2 的兩性黴素 B 可以作為共刺激分子作用於γδ T細胞，共刺激γδ T細胞活化、增殖和 IFN-γ 產生，並降低 Vδ2 T 細胞對 αβ T 細胞的免疫抑制活性。兩性黴素 B 還可以作為 CD25 的增強子，CD25 是 IL-2 的高親和力受體 (IL-2Rα)，從而增加對 IL-2 的反應性，以透過信號 3 刺激增殖。其次，兩性黴素 B 作為信號 3，可作用於單核細胞 (ZA-Mo)，促進 IL-18 的分泌，這可增強 CD25 的表達且支持中樞記憶 T 細胞，促進 IL-15 的分泌，從而增強效應子 Vγ9δ2 T 細胞的產生和阻斷 IL-17 定型細胞。兩性黴素 B 的合適替代物可能包括天然提取物，例如：來自茶葉的L-茶氨酸、來自蘋果的單寧和來自蔓越莓和香菇的多酚。

用共刺激分子（如 CD86 和 41BBL）補充Vγ9δ2 培養物增強了它們的增殖。本公開內容的實施方案可能包括使用 αβ T 細胞消耗的 PBMC 或 αβ T 細胞消耗的白細胞分離產物，其中骨髓細胞可以是主要的細胞群。骨髓細胞攝取唑來膦酸鹽，其抑制甲羥戊酸途徑，導致 IPP 積累，IPP 可表達為分泌形式或以骨髓細胞上的膜結合形式呈現。骨髓細胞也是優異的抗原呈遞細胞，在不同的分化階段表達各種共刺激分子。

此外，γδ T 細胞自身也可以表達各種共刺激分子。因此，在唑來膦酸鹽治療期間，可以以高細胞密度培養 αβ消耗的 PBMC 或 αβ T 細胞消耗的白細胞分離產物，以促進存在於骨髓細胞以及擴增的γδ T細胞上的共刺激分子的參與，從而增強 Vγ9δ2 T 細胞的活化、增殖和存活。例如，可以將外源性 IL-2（10-1000 U/ml，優選為 20-500 U/ml，更優選為 50-100 U/ml）加入到αβ消耗的 PBMC 或 αβ T 細胞消耗的白細胞分離產物中，其中 CD4 輔助 T 細胞（分泌 IL-2）是 αβ T 細胞消耗的細胞，以在活化和擴增期間維持存活和增殖。外源性 IL-15（10-1000 ng/ml，優選為 20-500 ng/ml；更優選為 50-100 ng/ml）可用於高細胞密度培養，以透過抑制產生 IL-17 的 Vγ9δ2 T 細胞的發展以最大活化 Vγ9δ2，如圖 1D（中圖）所示，從而增強γδ T細胞增殖，促進幼稚 Vγ9δ2 T 細胞分化為效應細胞。因此，高密度培養利用 γδ-γδ T 細胞（在γδ T 細胞上表達 CD28、CD86、CD83、CD80）之間的相互共刺激作用。例如，與 CD86 和/或 CD80 相互作用的 CD28 共刺激分子可以增強γδ T細胞的存活和增殖。

為了確定細胞密度對 T 細胞表型和細胞死亡的影響，在存在唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 的情況下活化 14 天後，在不存在唑來膦酸鹽的情況下，使用穩態細胞因子（例如，IL-2 和 IL-15），以高密度（如，2 x 10⁶ 個細胞/ml）和低密度（如，0.5 x 10⁶ 個細胞/ml）擴增 T 細胞，然後進行 T 細胞標誌物分析。圖 4A 顯示了免疫表型標誌物，例如 CD122、CD80、CD83、CD86、CD95 和 CD95L 在 Vγ9δ2 T 細胞上不受細胞密度影響，因為在高密度和低密度培養時，Vγ9δ2 T 細胞標誌物表達之間沒有顯著差異。然而，圖 4B 顯示了與低密度相比 (51%)，高密度擴增期間細胞死亡顯著降低 (20%)。這些結果表明，以高密度（例如，至少 1 x 10⁶ 個細胞/ml）擴增 Vγ9δ2 T 細胞可透過減少細胞死亡來促進細胞存活。

圖 5 顯示包含兩性黴素 B 可增加表達 CD25（或 IL-2Rα）的 Vδ2（即 Vγ9δ2）T 細胞的百分比。簡言之，在第 0 天，在補充有唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 的活化培養基中培養 αβ 消耗的 PBMC。48 小時後，加入兩性黴素 B，再過 48 小時，收集細胞，對 CD3+/Vδ2 T 細胞上的 CD25（或 IL-2Rα）表面表達進行基於流式細胞術的分析。這些結果表明，與未處理的 αβ 消耗 PBMC 相比 (0.55%)，唑來膦酸鹽、IL-2 和IL-15處理使表達 CD25 的 Vδ2 T 細胞的百分比增加至 16%。然而，將兩性黴素 B 加入唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 使 Vδ2 T 細胞的百分比從16%（不使用兩性黴素 B）增加至 29%（使用兩性黴素 B）。這些結果表明，兩性黴素 B 可以透過信號 2 和 3 進一步擴增由唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 擴增和活化的 Vδ2 T 細胞。

圖 6 顯示了使用唑來膦酸鹽 (Zometa) 在確定培養基中的γδ T細胞擴增，確定培養基中含有 IL-2、IL-15 和兩性黴素 B。對於供體 20，γδ T 細胞絕對數量從第 0 天到第 17 天、從第 0 天到第 22 天以及從第 0 天到第 29 天的倍數增加分別為 3,350 倍、11,060 倍和 31,666 倍。類似地，對於供體 21，γδ T 細胞絕對數量從第 0 天到第 17 天、從第 0 天到第 22 天以及從第 0 天到第 29 天的倍數增加分別為 4,633 倍、12,320 倍和 32,833 倍。相比之下，如上所述，經典Vγ9δ2 T 細胞擴增方案充其量只能在 14 天內使總Vγ9δ2 T 細胞增加 100 倍，此後，擴增率降低，這可能是細胞死亡增加引起的。一方面，使用前述方法，與第 0 天相比，第 29 天擴增後γδ T細胞絕對數量的倍數增加可以為約 1000 倍至約 40,000 倍、約 3000 倍至約 35,000 倍、約 5000 倍至約 35,000 倍、約 6000 倍至約 35,000 倍、約 7000 倍至約 35,000 倍、約 8000 倍至 30,000 倍、約 10,000 倍至約 35,000 倍、約 15,000 倍至約 35,000 倍、約 20,000 倍至約 35,000 倍、約 25,000 倍至約 35,000 倍、約 30,000 倍至約 35,000 倍、大於約 10,000 倍、大於約 15,000 倍、大於約 20,000 倍、大於約 25,000 倍、大於約 30,000 倍、大於約 40,000 倍或大於約 40,000 倍。

中性粒細胞（血液中最豐富的白細胞）可以抑制γδ T細胞的生長和存活。因此，中性粒細胞的去除或失活可促進γδ T細胞的生長和存活。為了實現這一目的，可以使用中性蛋白酶（如：蛋白酶 3、彈性蛋白酶和組織蛋白酶 G）透過蛋白水解切割 IL-2 和調節丁酸菌素3A1 (CD277) 來抑制 (1) 中性粒細胞增殖，(2) 細胞因子產生，和 (3)γδ T細胞的細胞毒性。此外，如在多微生物膿毒症小鼠中觀察到的，施用穀氨醯胺和/或 N-乙醯半胱氨酸 (NAC) 可減少了中性粒細胞的數量並增加γδ T細胞的百分比。此外，正如在 LPS 誘導的急性肺損傷大鼠中所觀察到的，補充穀氨醯胺可降低γδ T細胞的凋亡率，部分是透過增強谷胱甘肽 (GSH)（一種抗氧化劑）合成，從而減少自由基的破壞性影響，即，端粒侵蝕。基於這些觀察結果，如圖 2 和 3 所示，本公開內容的實施方案還可包括用高劑量穀氨醯胺/谷氨酸（或低劑量 N-乙醯半胱氨酸 (NAC)，例如 1-10 mM，優選為 2.5-7 mM）補充培養物以抵抗自由基介導的損傷並維持γδ T細胞複製潛力，從而最大化培養擴增。NAC 或高劑量穀氨醯胺/谷氨酸可維持高 GSH 細胞內水準並抵消培養物中單核細胞和中性粒細胞產生的高自由基（活性氧 (ROS)）。此外，如圖 2 所示，布洛芬（環氧化酶-2 (COX-2) 抑制劑）可以抵消單核細胞 (ZA-Mo) 中兩性黴素 B 介導的 COX-2 活化，從而限制與單核細胞共培養過程中攝護腺素 E2 (PGE2) 的積累。也可以使用其他 COX-2 抑制劑，例如，伐地考昔、羅非考昔、塞來昔布。
實施例 4
用 RD114TR 假型逆轉 錄病毒載體對 V γ 9 δ 2 T 細胞進行 TCR 改造

圖 7 顯示了病毒轉導到 Vγ9δ2 T 細胞中的時間表。新鮮的白細胞消耗 αβ T 細胞，並在存在 IL-2 和 IL-15 的情況下用唑來膦酸鹽活化至少 1 天或最多 7 天。使用表達 αβ TCR和/或 CD8 的病毒上清液，可以在活化後 24 至 168 小時內轉導γδ T細胞。

為了確定透過本公開內容的方法製備的 Vγ9δ2 T 細胞是否適合用表達不同包膜蛋白的病毒進行病毒轉染，對表達綠色螢光蛋白 (GFP) 的 γ-逆轉錄病毒（例如，長臂猿白血病病毒 (GALV) 假型 (SEQ ID NO:4) 、RD114TR 假型 (SEQ ID NO:1)）和表達 GFP 的慢病毒（例如，VSV-G 假型（例如，SEQ ID NO: 3)）轉導至這些 Vγ9δ2 T 細胞的效率進行了測試。此外，測試用 VSV-G 和 RD114TR 假型化的表達 CD8α 的慢病毒 (LV) 轉導至 Vγ9δ2 T 細胞的效率。

圖 8A 顯示，轉導後第 5 天，GALV 假型的 GFP 表達為12%，RD114TR 假型為 34%，VSV-G 假型為 46%。然而，轉導後第 10 天，RD114TR 假型維持 GFP 表達為40%，而 GALV 假型和 VSV-G 假型的 GFP 表達分別降低至 7% 和 3.6%。這些結果表明，RD114TR-假型 γ-逆轉錄病毒可能是唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 擴增的 Vγ9δ2 T 細胞中穩定基因表達的最佳基因遞送方法。

圖 8B 顯示，轉導後第 4 天，當用 RD114TR 假型化的 LV 轉導 Vγ9δ2 T 細胞時，Vγ9δ2 T 細胞上的 CD8α 表達範圍為 63.2%（使用 2.18 μl LV）至 95.8%（使用 35 μl LV）。另一方面，當用 VSV-G 假型化的 LV 轉導 Vγ9δ2 T 細胞時，Vγ9δ2 T 細胞上的 CD8α 表達範圍為17.9%（使用 2.18 μl LV）至 31.2%（使用35 μl LV）。儘管 VSV-G 是最常用的包膜，RD114TR 常用於假型 γ-逆轉錄病毒，但這些結果表明，RD114TR 假型慢病毒不僅可用於轉導 Vγ9δ2 T 細胞，而且對 Vγ9δ2 T 細胞的轉導效率高於 VSV-G 假型慢病毒。
實施例 5
改造表達 αβ -TCR 和 CD8 αβ 的γδ T 細胞

本公開的改造γδ T細胞可用於治療需要治療病症的受試者。為了改造表達特異性結合於 TAA/MHC 複合體的 αβ-TCR 的γδ T細胞，產生了表達 αβ-TCR 的 γ-逆轉錄病毒（αβ-TCR 病毒）。因為γδ T細胞可能不表達 CD8，因此，除了 αβ-TCR 之外，γδ T 細胞可能需要 CD8 以識別靶細胞（例如，癌細胞）細胞膜上的 TAA/MHC-I 複合體。為此，產生了表達 CD8 的 γ-逆轉錄病毒（CD8 病毒）。

為了確定用改造 γ-逆轉錄病毒轉導 Vγ9δ2 T 細胞的轉導效率，在補充有 IL-2 和 IL-15 的確定培養基中，用 MOI 為 3 的 αβ-TCR 病毒和/或 CD8 病毒轉導唑來膦酸鹽活化的 Vγ9δ2 T 細胞。透過用 TAA/MHC-PE dextramer（或陰性對照物 NYESO-PE dextramer）染色，然後進行CD3、CD8α 和 Vδ2 染色，在轉導後 96 小時測量轉導效率。在 MacsQuant 上採集後，對 CD3 群體進行了門控分析。

可以在存在轉導增強子的情況下進行轉導，以透過物理性地減少帶負電的細胞和病毒粒子之間的靜電排斥並因此增加細胞-病毒體相互作用來提高轉導效率。為此，在用編碼 CD8αβ 的逆轉錄病毒進行γδ T細胞轉導期間測試了兩種轉導增強子。測試了 RetroNectin®（塗覆在平板上的纖連蛋白片段）和 VectoFusin-1®（可溶性陽離子肽）。圖 9A 顯示，雖然 RetroNectin® 有更高的轉導效率（平均 49.7%），但 VectoFusin-1® 也能夠以 27.5% 的平均轉導效率轉導γδ T細胞。

圖 9B 顯示，與陰性對照 NYESO-PE dextramer 染色相比（即，單獨用 αβ-TCR病毒 (1.6%) 以及用 αβ-TCR 病毒和 CD8 病毒一起轉導 (2%)），透過 TAA/MHC-PE dextramer 染色鑒定了 71% 單獨用 αβ-TCR 病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞和49% 用 αβ-TCR 病毒和 CD8 病毒一起轉導的Vγ9δ2 T細胞。這些結果表明，特異性結合 TAA/MHC 複合體的 αβ-TCR 易於呈遞在用 αβ-TCR 病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞的細胞表面上。此外，與空白組（無病毒）(4%) 和單獨用 αβ-TCR 病毒轉導 (4.4%) 相比，透過 CD8α 染色鑒定了 7.6% 單獨用 CD8 病毒轉導的 Vγ9δ2 T細胞和 6.8% 用 αβ-TCR 病毒和 CD8 病毒一起轉導的Vγ9δ2 T 細胞。這些資料顯示透過唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 介導的活化和擴增製備的 Vγ9δ2 T 細胞可用於透過病毒轉導表達 TAA 特異性 TCR 和 CD8。

為了確定病毒轉導後 Vα9δ2 T 細胞的倍數擴增，Vα9δ2 T 細胞 (GD) 或αβ T 細胞 (AB) 用 αβ-TCR 病毒 (TCR) 和/或 CD8 病毒 (CD8) 進行轉導，然後測量從轉導後第 7 天到第 21 天的倍數擴增。圖 10 顯示，在沒有轉導的情況下，Vγ9δ2 T 細胞（GD 空白組）（1,040 倍）通常比 αβ T 細胞（AB 空白組）（289 倍）具有更高的倍數擴增。單獨用 αβ-TCR 轉導後，Vγ9δ2 T 細胞 (GD + TCR) 的倍數擴增為 517 倍，高於 αβ T 細胞 (AB + TCR)（211 倍）。在用 CD8 單獨 (GD + CD8) 或 CD8 + αβ-TCR (GD + CD8 + TCR) 轉導後，Vγ9δ2 T 細胞分別具有 620 倍和 540 倍的擴增。這些結果表明，Vγ9δ2 T 細胞通常比 αβ T 細胞具有更好的細胞擴增能力，並且更適用於病毒轉導。

透過用 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒轉導 Vγ9δ T 細胞，產生表達 αβ-TCR 的 Vγ9δ2 T 細胞，其中 αβ-TCR 特異性結合於 TAA/MHC 複合體。圖 11A 顯示，與無病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞（空白組）相比，34.9% 用 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒 (αβ-TCR + CD8) 轉導的 Vγ9δ2 T 細胞被 TAA/MHC-dextramer (TAA/MHC-dex) 和抗 CD8 抗體 (CD8) 染色陽性，表明產生了在細胞表面上表達 αβ-TCR 和 CD8αβ的 Vγ9δ2 T 細胞（αβ-TCR + CD8αβ 改造的 Vg9d2 T 細胞）。

為了確定改造 Vγ9δ2T 細胞的溶細胞活性，將 αβ-TCR +CD8αβ 改造的 Vγ9δ2 T 細胞暴露於靶細胞，例如：A375 細胞系，這是在細胞表面上呈遞 TAA/MHC 複合體的人惡性黑色素瘤細胞系。四種功能測定：(1) CD107a 脫粒，(2) IFN-γ釋放，(3) 6 小時後 A375 細胞的凋亡，和 (4) 長期共培養後改造γδ T細胞對 A375 的細胞毒性作用。

CD107a 脫粒測定的原理基於透過顆粒依賴性途徑殺死靶細胞，所述途徑利用位於細胞毒性細胞的細胞質內的預先形成的裂解顆粒。圍繞這些顆粒的脂質雙層含有溶酶體相關的膜糖蛋白 (LAMP)，包括 CD107a (LAMP-1)。透過 T 細胞受體複合體識別靶細胞後，細胞凋亡誘導蛋白（如：顆粒酶和穿孔素）被快速釋放到免疫突觸中，該過程稱為脫粒。因此，跨膜蛋白 CD107a 暴露於細胞表面並可被特異性單克隆抗體染色。圖 11B 顯示，與沒有病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞（空白組）相比，23.1% 用靶細胞（例如 A375 細胞）孵育的 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞 (αβ-TCR + CD8) 透過抗-CD107a 抗體染色陽性，表明當暴露於 A375 細胞時，αβ-TCR + CD8αβ 改造的Vg9d2 T 細胞透過脫粒具有細胞溶解性。

當 T 細胞的 TCR 特異性結合於細胞表面抗原呈遞細胞的肽/MHC複合體時，IFN-γ 釋放測定透過釋放的 IFN-γ 水準測量細胞介導的對抗原呈遞細胞（例如，A375 細胞）的應答。圖 11C 顯示，與沒有病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞（空白組）相比，19.7% 用 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞 (αβ-TCR + CD8) 被抗-IFN-γ 抗體染色陽性，表明當暴露於 A375 細胞時，αβ-TCR + CD8αβ 改造的 Vγ9δ2 T 細胞透過釋放 IFN-γ 具有細胞溶解性。

透過門控非 CD3 T 細胞（即，A375 細胞）的凋亡，在暴露於 A375 細胞後 24 小時評估細胞溶解活性。透過用活/死染料染色收穫的培養物來評估細胞凋亡。圖 11D 顯示，與沒有病毒轉導的 Vγ9δ2 T 細胞（空白組）相比，αβ-TCR +CD8αβ 改造的 Vγ9δ2 T 細胞 (αβ-TCR + CD8) 誘導 70% 的 A375 細胞凋亡，表明 αβ-TCR + CD8αβ 改造的 Vγ9δ2 T 細胞透過殺死 A375 細胞而具有細胞溶解性。

在 84 小時共培養測定期間還即時評估細胞溶解活性。將未轉導的和 αβTCR+CD8αβ 轉導的γδ T細胞與靶陽性 A375-RFP 腫瘤細胞共培養，效應細胞與靶標比例為3：1。透過 IncuCyte® 活細胞分析系統 (Essen BioScience) 即時評估靶陽性 A375-RFP 腫瘤細胞的裂解。單獨的腫瘤細胞和未轉導的和 αβTCR 轉導的 αβ T 細胞分別用作陰性和陽性對照。如圖 11E 所示，雖然由於γδ T細胞的內在抗腫瘤特性，未轉導γδ T細胞顯示出細胞毒性，但是，αβTCR+CD8αβ 轉導的γδ T細胞與 αβTCR 轉導的 αβ T 細胞相比具有相似的細胞毒性，表明 αβTCR+CD8αβ 轉導的γδ T細胞可經改造以靶向於並殺死腫瘤細胞。

這些資料表明，透過本公開內容的方法產生的改造 Vγ9δ2 T 細胞具有功能，並且可用於以 TAA 肽特異性方式殺死靶細胞（例如：癌細胞）。

一方面，本文所述的能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的 TAA 肽包括，例如，美國專利公開號 20160187351、美國專利公開號 20170165335、美國專利公開號 20170035807、美國專利公開號 20160280759、美國專利公開號 20160287687、美國專利公開號 20160346371、美國專利公開號 20160368965、美國專利公開號 20170022251、美國專利公開號 20170002055、美國專利公開號 20170029486、美國專利公開號 20170037089、美國專利公開號 20170136108、美國專利公開號 20170101473、美國專利公開號 20170096461、美國專利公開號 20170165337、美國專利公開號 20170189505、美國專利公開號 20170173132、美國專利公開號 20170296640、美國專利公開號 20170253633 和美國專利公開號 20170260249 所述的 TAA 肽，本文所述的這些專利公開內容和序列表透過引用整體併入本文。
實施例 6
改造表達嵌合分子的γδ T 細胞

可以改造γδ T細胞以表達嵌合腫瘤識別部分，該部分含有衍生自 NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244 (2B4)、DNAM-1 和 NKp80 的配體結合結構域，或抗腫瘤抗體，如抗 Her2neu 或抗 EGFR 和從 CD3-ζ、Dap10、CD28、4-IBB 和 CD40L 獲得的信號傳導結構域。在一些實施例中，嵌合受體結合於 MICA、MICB、Her2neu、EGFR、間皮素、CD38、CD20、CD19、PSA、RON、CD30、CD22、CD37、CD38、CD56、CD33、CD30、CD138、CD123、CD79b、CD70、CD75、CA6、GD2、甲胎蛋白 (AFP)、癌胚抗原 (CEA)、CEACAM5、CA-125、MUC-16、5T4、NaPi2b、ROR1、ROR2、5T4、PLIF、Her2/Neu、EGFRvIII、GPMNB、LIV-1、糖脂F77、成纖維細胞活化蛋白、PSMA、STEAP-1、STEAP-2、c-met、CSPG4、Nectin-4、VEGFR2、PSCA、葉酸結合蛋白/受體、SLC44A4、Cripto、CTAG1B、AXL、IL-13R、IL-3R、SLTRK6、gp100、MART1、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、NYESO-1、上皮腫瘤抗原 (ETA)、MAGEA 家族基因（如：MAGE3A、MAGE4A）、KKLC1、突變 ras、βraf、p53、MHC I 類鏈相關分子A (MICA) 或MHC I 類鏈相關分子B (MICB)、HPV 或 CMV。

可用於轉導γδ T細胞的其他改造病毒可包括兩種病毒以分別表達 αβ TCR 和嵌合 CD8/CD4。或者，單一病毒中可能包括 TAA 特異性 αβTCR 和嵌合 CD8/CD4（具有截短的集落刺激因子 1 受體 (CSF1R)）。

圖 12A 顯示了，例如，CD8/CD4 嵌合受體-T2A-截短的 CSF1R，其中 CD8α 細胞外結構域可能與 CD4 跨膜和細胞內結構域連接。CD8α 是結合於 MHC I 分子的 α3 結構域所必需的，其中 CD8β 對於棕櫚醯化很重要，因此，提供了適當 CD8 募集至脂筏以與 TCR 複合體相互作用。另一方面，CD4以單體起作用並且可以定位於脂筏，與 CD8 細胞內結構域類似，CD4 細胞內結構域可以募集淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶 (Lck)，其分別可以與 T 輔助細胞和細胞毒性 T 細胞上的 CD4 和 CD8 共同受體的細胞質尾部相互作用，以輔助來自 TCR 複合體的信號傳導。因此，代替表達 CD8α 和 CD8β，可以產生可以結合於 MHC I 分子並定位於脂筏的嵌合 CD8/CD4 蛋白。截短的 CSF1 受體 (CSF1R) 細胞內催化結構域可以與嵌合 CD8/CD4 蛋白下游連接，當不再需要嵌合 CD8/CD4 蛋白的功能時用作殺傷開關。CSF1R 不在 T 細胞上表達，並且在骨髓細胞中最豐富。因此，關閉 CSF1R 細胞內催化結構域介導的信號傳導對 T 細胞（如γδ T 細胞）的影響最小。如要關閉 CSF1R 信號傳導，可以使用多種酪氨酸激酶抑制劑，例如 R7155、CYC11645、Ki20227、GW2580、BLZ945、PLX5622 和 PLX3397。其他受體可用作殺傷開關，包括但不限於截短的 TNFR2、截短的 ESR1 和/或 ESR1/Fas 信號傳導，其可活化雌激素受體以誘導 Fas 介導的 T 細胞死亡。

CSF1 可以促進 M1（經典活化的巨噬細胞）至 M2（其他活化的巨噬細胞）極化。在腫瘤微環境中，CSF1 可以將腫瘤相關巨噬細胞 (TAM) 從 M1 型極化為 M2 型。這可能不是所希望的，因為 M1 型 TAM 比 M2 型 TAM 具有更多的殺腫瘤活性。為了利用 CSF1 在腫瘤微環境中的存在，驅動 T 細胞功能/持久性並降低 CSF1 使 TAM 極化的可用性，結合 CSF1 的 CSF1R細胞外結構域可包括於嵌合 CD8/CD4 蛋白中。

圖 12B 顯示，例如，CD8/CD4 嵌合受體-T2A-CSF1R/41BB 嵌合受體，其中 CSF1R 細胞外結構域與嵌合 CD8/CD4 蛋白下游連接，使 CSF1R 細胞外結構域可以結合並隔離 CSF1 遠離巨噬細胞，從而減少 M1 到 M2 的極化。透過提供共刺激分子，例如 41BB，該融合蛋白可以促進 T 細胞（例如γδ T細胞）的存活和擴增。

本公開內容的優點可包括 (1) 使用γδ T細胞來引發針對甲羥戊酸依賴性腫瘤的細胞毒性；(2) 使用γδ T細胞作為同種異體細胞，改造以在有或沒有內源性 γδ TCR 刪除的情況下表達腫瘤抗原特異性嵌合抗原受體 (CAR) 或 αβ-TCR；(3) 透過與各種形式的抗體或 T 細胞接合者 (T-cell engager) 共同給予，使用γδ T細胞作為同種異體免疫細胞以治療免疫受損癌症患者；(4) 使用γδ T細胞增強癌症疫苗樹突狀細胞的成熟；(5) 使用γδ T細胞作為抗原呈遞細胞，以增強細胞毒性 CD8 T 細胞的活化。

本專利說明書中引用的所有參考文獻均透過引用併入本文，如同每篇參考文獻被具體和單獨地指出透過引用併入。任何參考文獻的引用均為其在申請日之前的公開內容，不應解釋為認可本公開內容無權憑藉之前的發明而先於此類參考文獻。

應當理解，上述每個元素或者兩個或更多個元素一起也可以在與上述類型不同的其他類型方法中找到有用的應用。在無進一步分析的情況下，前述內容同樣充分地揭示本公開的要點，其他人可以透過應用當前知識，容易地將其適用於各種應用場合而不會遺漏從現有技術觀點來看公平構成所附請求項中闡述的本公開的通用或具體方面基本特點的特徵。前述實施方案僅作為示例呈現；本公開內容的範圍僅透過以下請求項進行限制。

無

圖 1A 顯示了根據本公開實施方案從 PBMC 中消耗 αβ T 細胞。將 PBMC 與生物素綴合的 αβ TCR 抗體一起孵育，然後根據製造商的方案與鏈黴抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然後使樣本通過 LS 管柱以富集表達 αβ TCR 的細胞。管柱流出液表示 αβ TCR 消耗的部分。過夜培養後，富含 αβ TCR 的部分和αβ TCR 消耗的部分用螢光染料綴合的 αβ TCR 抗體與 Vγ9 抗體染色，然後進行流式細胞術分析。

圖1B 和 1C 顯示了根據本公開內容實施方案的 Vγ9δ2 T 細胞產物中的最小殘留 αβ T 細胞。使用市售的生物素化抗 αβ T 抗體/鏈黴抗生物素蛋白微珠從正常供體（供體 A、供體 B 和供體 C）（圖 1B）和（供體 12 和供體 13）（圖 1C）的 PBMC 中消耗 αβ　 T 細胞。將 αβ T 細胞消耗的 PBMC 與唑來膦酸鹽/IL-2/IL-15 一起培養 14 天，然後用各自的螢光染料綴合抗體（例如，抗-αβ TCR 抗體和抗-γδ TCR 抗體）進行細胞表面染色，透過 CD3 亞門控評估殘留的　αβ T 細胞和富集的γδ T細胞。

圖 1D 顯示了根據本公開實施方案的 Vγ9δ2 T 細胞的細胞因子譜。在細胞收穫之前，用 Golgi Stop/Plug（即，蛋白質轉運抑制劑）處理 Vγ9δ2 細胞 6 小時。對細胞進行表面 Vδ2 染色，然後固定並通透化。使用針對 TNF-α、IL-17a 和 IFN-γ 的螢光染料綴合抗體進行 TNF-α、IL-17a 和 IFN-γ 細胞內染色。

圖 1E 顯示了根據本公開另一實施方案從白細胞分離產物（例如，LeukoPak®）中消耗 αβ T 細胞。來自白細胞分離產物的包括樹突細胞和祖細胞的白細胞可以與生物素綴合 αβ TCR 抗體一起孵育，然後與鏈黴抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然後使樣本通過 LS 管柱以富集表達 αβ TCR 的細胞。管柱流出液表示 αβ TCR 消耗的部分。過夜培養後，將 αβ TCR 消耗的部分用螢光染料綴合 αβ TCR 抗體與 γδ TCR 抗體染色，然後進行流式細胞術分析。

圖 2 顯示了分子對活化根據本公開實施方案的 Vγ9δ2 T 細胞的影響。在活化步驟期間，可能存在氨基二膦酸鹽（例如，唑來膦酸鹽 (ZA)）或磷酸抗原（例如，IPP）和細胞因子（例如，IL-2 和/或 IL-15）。

圖 3 顯示了分子對擴增根據本公開實施方案的 Vγ9δ2 T 細胞的影響。在擴增步驟期間，細胞因子可能在沒有氨基二膦酸鹽或磷酸抗原 (IPP) 的情況下繼續存在。

圖 4A 顯示了根據本公開實施方案的擴增期間細胞密度對 T 細胞標誌物的影響。在存在唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 的情況下活化 14 天後，在不存在唑來膦酸鹽的情況下，使用穩態細胞因子（例如，IL-2 和 IL-15），以高密度（如，2 x 10⁶ 個細胞/ml）和低密度（如，0.5 x 10⁶ 個細胞/ml）擴增Vγ9δ2 T 細胞。分析 T 細胞標誌物，例如：CD122、CD80、CD83、CD86、CD95 和 CD95L。

圖 4B 顯示了根據本公開實施方案的擴增期間細胞密度對細胞死亡的影響。在存在唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 的情況下活化 14 天後，在不存在唑來膦酸鹽的情況下，使用穩態細胞因子（例如，IL-2 和 IL-15），以高密度（如，2 x 10⁶ 個細胞/ml）和低密度（如，0.5 x 10⁶ 個細胞/ml）擴增 T 細胞。測量細胞死亡。

圖 5 顯示了根據本公開內容一個實施方案，兩性黴素 B 對表達 IL-2Rα 的 Vδ2 T 細胞的影響。在第 0 天，在補充有唑來膦酸鹽、IL-2 和 IL-15 的活化培養基中培養 αβ 消耗的 PBMC。48 小時後，加入兩性黴素 B，再過 48 小時，收集細胞，對 CD3 +/Vδ2 T 細胞上的 CD25（或 IL-2Rα）表面表達進行基於流式細胞術的分析。

圖 6 顯示了根據本公開內容的一個實施方案，唑來膦酸鹽 (Zometa) 對細胞擴增的影響。使用唑來膦酸鹽 (Zometa) 在含有 IL-2、IL-15 和兩性黴素 B 的確定培養基中擴增γδ T細胞。

圖 7 顯示了根據本公開內容的一個實施方案，病毒轉導到 Vγ9δ2 T 細胞中的時間表。第 1 天，新鮮 PBMC 消耗 αβ T 細胞並在存在 IL-2 和 IL-15 的情況下用唑來膦酸鹽活化；24 小時後（第 2 天），使用各自的病毒上清液以 MOI 為 1.5 轉導細胞；第 7 天（即，轉導後第 5 天）透過流式細胞術評估 GFP 轉基因表達以評估轉導效率；第 12 天（即，轉導後第 10 天）評估持續的轉基因表達。

圖 8A 顯示了使用根據本公開內容的一個實施方案的 γ-逆轉錄病毒載體在 Vγ9δ2 T 細胞中的病毒轉基因表達。在轉導後第 5 天和第 10 天，測試表達不同包膜蛋白的病毒，例如：表達綠色螢光蛋白 (GFP) 的γ-逆轉錄病毒（例如，長臂猿白血病病毒 (GALV) 假型（例如，SEQ ID NO: 4）、RD114TR 假型 (SEQ ID NO: 1) 和表達 GFP 的慢病毒（例如，VSV-G 假型（例如，SEQ ID NO: 3)）轉導至 Vγ9δ2 T 細胞的效率。

圖 8B 顯示了根據本公開內容的一個實施方案，病毒轉基因（例如，CD8α）在 RD114TR 或 VSV-G 假型化慢病毒載體轉導的 Vγ9δ2 T 細胞中的表達。

圖 9A 顯示了在轉導過程中使用不同的轉導增強子（RetroNectin® 對比 Vectofusin-1）用 CD8αβ 轉導γδ T細胞。在存在 RetroNectin®（塗覆在平板上的纖連蛋白片段）或 VectoFusin-1®（可溶性陽離子肽）的情況下，用編碼 CD8αβ 的逆轉錄病毒轉導從 3 個供體（供體 1、供體 2 和供體 3）獲得的γδ T細胞，然後進行流式細胞術以確定 CD8αβ+ 細胞的百分比。

圖 9B 顯示了使用根據本公開內容一個實施方案的改造病毒對 Vγ9δ2 T 細胞的轉導效率。Vγ9δ2 T 細胞用無病毒的情況下進行轉導（空白組）或單獨用 αβ-TCR 病毒、單獨用 CD8 病毒或用 αβ-TCR 病毒 + CD8 病毒進行轉導。將轉導的細胞與 TAA/MHC-PE dextramer、抗 CD8 抗體或 NYESO-PE dextramer（陰性對照）一起孵育，然後進行流式細胞術分析。

圖 10 顯示了使用根據本公開內容一個實施方案的改造病毒轉導 Vγ9δ2 T 細胞的倍數擴增。Vα9δ2 T 細胞 (GD) 或αβ T 細胞 (AB) 在無病毒的情況下（空白組）、用 αβ-TCR 病毒 (TCR)、CD8 病毒 (CD8) 或用 CD8 + TCR 進行轉導，然後測量從轉導後第 7 天到第 21 天的倍數擴增。

圖 11A 顯示了根據本公開實施方案的改造 Vγ9δ2 T 細胞。在無病毒的情況下（空白組）或用 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒 (αβ-TCR + CD8) 轉導的 Vγ9δ2 T 細胞與 TAA/MHC 複合體一起孵育，然後進行流式細胞術分析以檢測與 TAA/MHC 複合體結合的 Vγ9δ2 T 細胞。

圖 11B 顯示了對根據本公開實施方案的改造 Vg9d2 T 細胞的功能評估。在無病毒的情況下（空白組）或用 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒 (αβ-TCR + CD8) 轉導的 Vγ9δ2 T 細胞與靶細胞一起孵育，然後進行流式細胞術分析以檢測凋亡標誌物 CD107a。

圖 11C 顯示了對根據本公開另一實施方案的改造 Vg9d2 T 細胞的功能評估。在無病毒的情況下（空白組）或用 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒 (αβ-TCR + CD8) 轉導的 Vγ9δ2 T 細胞與靶細胞一起孵育，然後進行流式細胞術分析以檢測 IFN-γ 釋放。

圖 11D 顯示了對根據本公開實施方案的改造 Vg9d2 T 細胞的溶細胞活性。在無病毒的情況下（空白組）或用 αβ-TCR 逆轉錄病毒和 CD8αβ 逆轉錄病毒 (αβ-TCR + CD8) 轉導的 Vγ9δ2 T 細胞與靶細胞一起孵育，然後進行流式細胞術分析以檢測凋亡細胞。

圖 11E 顯示了對根據本公開實施方案的改造γδ T細胞的長期溶細胞活性。在 84 小時共培養測定期間即時評估細胞溶解活性。靶陽性 A375-RFP 腫瘤細胞不經 T 細胞（腫瘤細胞）或用未轉導細胞（αβ T 細胞和γδ T細胞）、用 αβ-TCR 病毒和 CD8αβ 病毒轉導的 αβT 細胞（αβTCR + αβT 細胞）或用 αβ-TCR 病毒和 CD8αβ 病毒轉導的γδ T細胞（αβTCR+γδ T細胞）進行孵育，然後進行 IncuCyte® 活細胞分析以測量靶細胞生長。

圖 12A 顯示了對根據本公開內容實施方案的改造病毒的示意圖。CD8/CD4 嵌合受體-T2A-截短的 CSF1R 含有與 CD4 跨膜和細胞內結構域連接的 CD8α 細胞外結構域。

圖 12B 顯示了對根據本公開內容實施方案的改造病毒的示意圖。CD8/CD4 嵌合受體-T2A-CSF1R/41BB 嵌合受體含有連接在嵌合 CD8/CD4 蛋白下游的 CSF1R 細胞外結構域。

圖 13 顯示了根據本公開內容實施方案的同種異體 T 細胞療法。同種異體 T 細胞療法可能包括從健康供體收集γδ T細胞，透過病毒轉導受關注的外源基因（如外源性 TCR）進行γδ T細胞改造，再進行細胞擴增，收集擴增的改造γδ T細胞，這些細胞在輸注入患者之前可冷凍保存為「現成的」 T 細胞產品。

圖 14 顯示了根據本公開內容實施方案的 γδ T細胞製造。γδ T 細胞的製造可能包括收集或獲得白細胞或 PBMC（例如，白細胞分離術產物），從 PBMC 或白細胞分離術產物中消耗 αβ T細胞，然後活化、轉導和擴增γδ T細胞。

國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
無

國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無

Claims

一種活化和擴增γδ T細胞的體外方法，包括從人體受試者的血液樣本中分離γδ T細胞，在存在氨基二膦酸鹽、人重組白細胞介素2 (IL-2) 和人重組白細胞介素15 (IL-15) 的情況下活化所述分離的γδ T細胞，和在不存在氨基二膦酸鹽和存在人重組白細胞介素2 (IL-2) 和人重組白細胞介素15 (IL-15) 的情況下擴增所述活化的γδ T細胞。
根據請求項1的方法，其中所述γδ T細胞從白細胞分離術人樣本中分離。
根據請求項1或2的方法，其中所述氨基二膦酸鹽包括帕米膦酸、阿侖膦酸、唑來膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其鹽和/或其水合物。
根據請求項1至3任一項中所述的方法，其中所述氨基二膦酸鹽是唑來膦酸。
根據請求項1至4任一項中所述的方法，其中活化存在唑來膦酸和由IL-2和IL-15組成的細胞因子組合物。
根據請求項1至5任一項中所述的方法，其中所述活化進一步存在 Toll 樣受體2 (TLR2) 配體。
根據請求項6的方法，其中所述 TLR2 配體選自兩性黴素 B、L-茶氨酸、單寧和多酚組成的組。
根據請求項1至7任一項中所述的方法，其中所述活化進一步存在 N-乙醯半胱氨酸 (NAC)。
根據請求項1至8任一項中所述的方法，其中所述活化進一步存在 COX-2 抑制劑。
根據請求項9的方法，其中所述 COX-2 抑制劑是布洛芬。
根據請求項1至10任一項中所述的方法，其中活化存在唑來膦酸，濃度為約 1 μM 至約 10 μM。
根據請求項1至11任一項中所述的方法，其中活化存在 IL-2，濃度為約 10 IU/ml 至約 100 IU/ml
根據請求項1至10任一項中所述的方法，其中活化存在濃度為約 1 μM 至約 100 μM 的唑來膦酸、濃度為約 10 IU/ml 至約 200 IU/ml 的 IL-2 和濃度為約10 – 500 ng/ml 的 IL-15。
根據請求項1至10任一項和請求項13 中所述的方法，其中擴增存在濃度為約 10 IU/ml 至約 100 IU/ml 的 IL-2 和/或濃度為約 50 – 200 ng/ml 的 IL-15。
一種透過請求項1至14任一項所述的方法製備的擴增γδ T細胞群，其中所述擴增γδ T細胞的密度為至少約 1 x 10⁵ 個細胞/ml、至少約 1 x 10⁶ 個細胞/ml、至少約 1 x 10⁷ 個細胞/ml、至少約 1 x 10⁸ 個細胞/ml 或至少約 1 x 10⁹ 個細胞/ml。
一種治療癌症的方法，其包括向有此需要的患者給予有效量的請求項15所述的改造γδ T細胞。
根據請求項16的方法，其中所述癌症選自肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宮癌、梅克爾細胞癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、結直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、腎癌、白血病、卵巢癌、食道癌、腦癌、胃癌和攝護腺癌組成的組。
根據請求項17的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
一種活化和擴增γδ T細胞的體外方法，包括從人體受試者的外周血單核細胞 (PBMC) 中分離γδ T細胞，其中所述分離包括使所述 PBMC 與抗 α 和抗 β T 細胞受體 (TCR) 抗體接觸，消耗所述 PBMC 中的 α-和/或 β-TCR 陽性細胞，在存在氨基二膦酸鹽、人重組白細胞介素2 (IL-2) 和人重組白細胞介素15 (IL-15) 的情況下活化所述分離的γδ T細胞，和在不存在氨基二膦酸鹽和存在人重組白細胞介素2 (IL-2) 和人重組白細胞介素15 (IL-15) 的情況下擴增所述活化的γδ T細胞。
根據請求項1至19中任一項所述的方法，還包括用重組病毒載體轉導所述活化的γδ T細胞。
根據請求項20所述的方法，其中所述病毒載體是逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺相關病毒 (AAV) 或轉座子。
根據請求項20或21所述的方法，其中所述病毒載體是慢病毒載體。
根據請求項20至22任一項中所述的方法，其中所述病毒載體包含與編碼包膜蛋白的 SEQ ID NO:1 具有至少 95% 同一性的 RD114TR 基因。
根據請求項20至23任一項所述的方法，其中所述病毒載體編碼 CD8 和/或 αβ-TCR。
根據請求項20至24任一項中所述的方法，其中所述轉導在存在轉導增強子的情況下進行。
根據請求項25的方法，其中所述轉導增強子是 RetroNectin® 或 VectoFusin-1®。
一種透過請求項14至20中任一項所述的方法製備的改造γδ T細胞。
一種透過請求項1至14和請求項19至26中任一項所述的方法製備的擴增和活化的γδ T細胞群。
根據請求項1至14和請求項19至26中任一項所述的方法，進一步包括磷酸抗原，所述磷酸抗原選自由 (E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸鹽 (HMBPP)、類異戊二烯焦磷酸鹽（法呢基焦磷酸鹽 (FPP)、香葉基香葉基焦磷酸鹽 (GGPP)、異戊烯焦磷酸鹽 (IPP) 和二甲基烯丙基二磷酸酯 (DMAPP)）組成的組。