KR20230113055A

KR20230113055A - 인간 자연살해세포의 체외 배양과 활성화를 위한 칵테일 배지첨가 조성물

Info

Publication number: KR20230113055A
Application number: KR1020220009483A
Authority: KR
Inventors: 김미란; 박동욱; 박춘호
Original assignee: 주식회사 한국씨알오
Priority date: 2022-01-21
Filing date: 2022-01-21
Publication date: 2023-07-28

Abstract

본 발명은 인간 자연살해세포의 체외 배양과 활성화를 위한 칵테일 배지첨가 조성물에 관한 것으로, (a) 배양 과정 개시 내지 2일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 식물성 렉틴(lectin)을 세포 배양배지에 첨가하고, (b) 2일차 내지 7일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-15(IL-15)를 상기 배지에 반복적으로 첨가하며, (c) 7일차 내지 9일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-18(IL-18)을 상기 배지에 반복적으로 첨가하며, (d) 9일차 내지 14일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-21(IL-21)과 폴리페놀(polyphenol)을 상기 배지에 반복적으로 첨가하며, (e) 14일차에 배양을 종료하고 자연살해 세포를 수득하는 과정을 포함한다.

Description

인간 자연살해세포의 체외 배양과 활성화를 위한 칵테일 배지첨가 조성물{Cocktail medium-added composition for in vitro culture and activation of human natural killer cells}

본 발명은 인간의 자연살해세포를 체외에서 증폭하기 위한 배지첨가 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자연살해세포를 이용한 세포치료제 생산에 있어서 세포수와 항암 활성을 획기적으로 증가시키는 배양기술 개발에 관한 것이다.

암을 치료하기 위해 외과적인 수술, 방사선 치료, 화학요법, 표적 화합물 등 여러가지 치료법이 개발되어 왔으나, 다양한 부작용이 보고되면서 최근 환자의 면역기능을 이용한 면역치료법이 개발되고 있다. 특히, 대량 생산 및 동결이 가능한 자연살해세포를 이용한 면역치료법이 활발히 연구되고 있다. 자연살해세포(Natural Killer Celll)은 종으로 체내 골수, 비장, 말초 림프절 및 말초 혈액에 분포하며, 말초혈 림프구(peripheral blood lymphocyte)의 약 10% 정도를 차지하며, 선천성 면역반응에 중요한 역할을 한다. 자연살해세포는 세포 표면에 여러 수용체를 발현하는데 이들 수용체는 세포 흡착, 세포 살해능력의 활성화, 또는 세포 살해능력의 억제에 관여한다. 하지만, 정상인의 체내에 존재하는 대부분의 자연살해세포는 비활성화 상태로 존재한다. 따라서, 암을 제거하기 위해서는 활성화된 자연살해세포가 필요하다. 또한, 암환자의 체내에 존재하는 자연살해세포의 경우, 암세포의 면역회피 기전에 의해 자연살해세포의 기능적 결함이 존재한다. 따라서, 자연살해세포를 치료제로서 이용하기 위해서는 자연살해세포를 활성화시키는 것이 매우 중요하다. 또한, 체내에 존재하는 자연살해세포의 세포수는 한정되어 있으므로, 정상인의 혈액 또는 환자의 혈액의 자연살해세포를 대량으로 증식시키는 기술의 개발이 매우 중요하다. 하지만 현재 자연살해 세포의 체외 활성화와 증폭을 위한 배지성분 중에서 인터루킨-2(IL-2)외의 다른 성분들이 상세히 알려져 있지 않아 제한적으로 이용되고 있으며 많은경우에 외국산 전용배지를 수입하여 사용하고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 새로이 고안된 자연살해세포 활성화와 증폭을 위한 조성물로서 기존의 인터루킨- 2 외에 인터루킨- 12, 인터루킨- 15, 인터루킨- 18, 인터루킨- 21 및 식물유래 폴리페놀과 렉틴을 다양하게 배합한 복합성분으로 자연살해세포 관련 연구 및 세포치료제 제조시에 효율적인 배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

인간의 전혈로부터 분리된 말초혈액단액세포(PBMC)를 무혈청배지에서 배양하여 자연살해세포를 활성화하고 증폭하는 과정에서 인터루킨- 2와 더불어 인터루킨- 12, 인터루킨- 15, 인터루킨- 18, 인터루킨- 21을 조합한 칵테일 조성물을 배양의 여러단계에서 배지에 첨가한다. 또한 자연살해세포의 면역기능조절 효능을 가지는 식물성 렉틴과 폴리페놀을 배양초기와 후반기에 칵테일에 첨가하여 세포의 활성화 및 세포수의 확장을 극대화 할 수 있다.

본 발명의 자연살해세포 배양용 칵테일 배지첨가 조성물은 기존의 사용되고 있는 단일 사이토카인이 아니라 자연살해세포 활성기능을 다진 다양한 사이토카인을 조합하므로 안정적으로 세포를 증식시킬 수 있는 최적의 배지 조성을 만들 수 있다.

또한 본 발명은 사이토카인과 더불어 자연세포를 활성화시키는 안전하고 제조비용이 저렴한 식물유래의 단백질 및 저분자물질을 첨가하였다. 따라서 값비싼 재조합 단백질 사용량을 줄일 수 있어서 세포치료제 제조비용을 낮출 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 칵테일 배지첨가 조성물을 이용해 자연살해 세포를 배양하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 배양하여 수득한 NK-cell의 종양 살해능을 확인한 결과이다.

본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명은 일 관점에서, 자연살해 세포(Natural killer cell, NK cell)를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 말초혈 림프구(PBL; peripheral blood lymphocyte)의 존재하에 배양하는 공정을포함하는, 자연살해 세포의 증식방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 자연살해 세포 증식방법은, 특별히 제한되지는 않지만 예를 들어, 이하와 같은 공정을 포함하여 수행될 수 있다:

(a) 배양 과정 개시 내지 2일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 식물성 렉틴(lectin)을 세포 배양배지에 첨가하고,

(b) 2일차 내지 7일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-15(IL-15)를 상기 배지에 반복적으로 첨가하며,

(c) 7일차 내지 9일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-18(IL-18)을 상기 배지에 반복적으로 첨가하며,

(d) 9일차 내지 14일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-21(IL-21)과 폴리페놀(polyphenol)을 상기 배지에 반복적으로 첨가하며,

(e) 14일차에 배양을 종료하고 자연살해 세포를 수득하는 과정

상기 배양액에는 자가 말초혈 림프구 세포를 불활성화시켜 지지세포(feeder cell)로 추가하여 줄 수 있다.

자연살해 세포 (Natural killer cell, NK cell)는 정상인 혈액 내에 약 10~15% 가량 존재하며, 비자기(non-self)와 반응할 때 높은 살해능을 가진다. 각종 virus에 감염된 세포나 세균 침투, 혹은 비정상 세포의 생성에 있어, NK cell은 비특이적으로 즉각적으로 반응하여 이물질을 제거한다. 그러나, 체내에 존재하는 NK cell의 수는 그다지 많지 않고, 치료적 효과를 보이기 위해 필요한 유효 NK cell의 수는 매우 많아야 하므로, 효과적인 NK cell 증식 방법에 대한 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

자연살해 세포를 증식시키는 방법은 크게 두 가지로 생각할 수 있다. NK cell 만을 순수하게 분리한 다음 지지세포(feeder cell)을 사용하면서 적절한 자극을 주어 증폭하는 방법이 있고, 전체 말초혈 림프구 세포(PBL; peripheral blood lymphocyte) 또는 말초혈 단핵구 세포(PBMC; peripheral blood mononuclear cell)에서 NK cell을 선택적으로 증폭하여 상대적으로 많은 NK cell을 얻는 방법이 있다.

자연살해 세포의 분리를 거치지 않고 PBL로부터 자연살해 세포를 선택적으로 증폭시키는 방법으로 얻어진 세포는 순수 자연살해 세포군에 비하여 세포 살해능이 떨어지고, 순수한 자연살해 세포만이 아닌 T cell도 존재하기 때문에, 자가 MHC 분자에 의하여 자기 (self)와 비자기 (non-self)를 인식하는 T cell을 제거하지 않는 한 자가이식에 한정될 수 밖에 없는 문제점이 있다.

본 발명은, 전자의 분리된 자연살해 세포(NK cell)을 증폭하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 증식 방법도 지지 세포(feeder cell)을 사용함을 특징으로 한다.

말초 혈액으로부터 자연살해 세포를 분리하는 방법은 당업자에게 공지되어 있는 통상의 방법을 사용할 수 있고, 시판되어 있는 것을 구입하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 Rosettesep NK cell enrichment cocktail (Stemcell technologies, 15065)을 구입하여 사용하였다.

한편, "Feeder cell(배양보조세포)"이란, 분열증식하지 못하게 하였으나 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 세포의 증식을 돕는 세포로서, 최초에 이식한 세포를 '지지세포'라고 한다. 본 발명에서는 'feeder cell'을 지지세포라는 용어로 사용하기도 한다.

본 발명에서 사용하는 지지세포(feeder cell)로서는, 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 림프구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 림프구 세포(PBL), T-cell, B-cell, 또는 단핵구(monocyte) 등을 들 수 있다. 가장 바람직하게는 자기 말초혈 림프구 세포(PBL)를 사용할 수 있다.

상기 지지세포로 이용되는 자기 말초혈 림프구 세포는 불활성화시켜 사용함으로써 안전성을 확보한다. 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 불활성화시킨 지지세포(feeder cell)는 분리된 T-세포(purified T cell)를 포함한다.

본 발명과 같이 지지 세포를 사용하는 증식 방법은 자연살해 세포를 순수 분리한 후 증식시키는 방법으로, 이후에도 계속 순수 자연살해세포만 증식하게 할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 증식방법은, 자연살해 세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

CD3 항체란, T 세포 수용체(TCR)과 회합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 반응하는 단백질로서, CD3 분자는 TCR과 비교하여 세포내 영역이 길고 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당하고 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 항-CD3 항체의 예로서는, OKT-3, UCHT1, HIT3a 등을 들 수 있고, 바람직하게는 OKT-3 항체이다.

인터루킨(Interleukin, IL) 단백질이란 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당세포가 생간하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로, 사이토카인(cytokine) 내의 일 군의 분자종을 가리킨다.

본 발명에서 사용할 수 있는 인터루킨 단백질의 예로서는, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 등을 들 수있다.

주지된 바와 같이 IL-2는 T 세포가 항원을 인식하여 활성화될 때 만들어지는 분자량 14 ~ 17 kDa의 당단백질(glycoprotein)로서, T 세포 밖으로 분비된 다음, IL-2를 생산한 T 세포 자신과 반응하여 해당 T 세포의 성장을 촉진하게 된다. IL-2는 또한 NK 세포에 작용하여 성장을 촉진하고 NK 세포의 살해능력을 강화하며, B 세포에 작용하여 그 성장을 촉진하기도 한다. L-글루타민은 면역세포 배양을 위한 영양분으로 작용하는 성분이고, 세포배양용배지는 부유세포배양용 기본배지로서 공지된 상태의 것을 사용할 수 있다.

렉틴(lectic)은 림프구증식을 자극하는 것으로 알려진 단백질로서 배양 초기 취약한 상태의 자연살해 세포를 안정화하는 작용을 한다.

본 발명의 배양방법은 AIM-V media, RIMI1640, CellGro SCGM, X-VIVO20과 같은 통상의 동물세포배양용 배지에 인간 말초혈로부터 분리한 NK cell 및 PBL를 가하고, 이 배양물에 항 CD3항체 및 인터루킨 단백질을 첨가하여 배양한다. 본 발명의 일 구체예에서는 OKT-3 항체와 IL-2를 첨가하여 배양하였다. 첨가하는 OKT-3 항체의 농도는 0.1~100 ng/ml 바람직하게는 약 10 ng/ml을 사용하고, IL-2의 농도는 10~2000 U/ml 바람직하게는 약 500U/ml을 사용한다

또한, 여기에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양할 수도 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, PBMC로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합 등 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 자연살해 세포를 현저히 증식시킬 수 있는 최적의 자연살해 세포의 배양 농도를 제공한다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 하나의 태양을 보다 구체적으로 기술하면, 우선 분리한 자연살해세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 말초혈 림프구 세포의 존재하에 배양하는 공정; 상기 배양물에서 항-CD3 항체를 제거하는 공정; 및 상기 항-CD3 항체가 제거된 배양액을 인터루킨 단백질이 함유된 배지에 첨가하여 추가 배양하는 공정을 포함한다.

이 때, 항-CD3 항체가 제거된 배양액을 인터루킨 단백질이 함유된 배지에 첨가하여 추가 배양함에 있어서, 배지에 접종(seeding)하는 자연살해세포의 농도가 증식률에 큰 영향을 끼친다.

바람직하게는, 자연살해세포가 1 × 10⁵ 내지 1 × 10⁶cells/well의 농도로 접종되는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 1 × 10⁵ 내지 3 × 10⁶ cells/well의 농도가 좋다. 특히, 2 × 10⁵ cells/well의 농도로 접종한 경우, 배양후 14일에 약 900배의 증식율을 보이는 것을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명에서는 자연살해 세포를, 적정 농도로, 지지세포를 사용하면서 OKT-3 항체와 같은 항 CD3항체와 IL-2와같은 인터루킨 단백질을 동시에 처리함으로써, 지지세포만 사용하거나 OKT-3 항체 자극만 사용한 기존 연구에비하여 고순도의 자연살해세포를 단기간에 더욱 폭발적으로 증식시킬 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 수득한 자연살해세포에 관한 것이다. 상기 방법에 따라 증식 배양된 자연살해세포의 표면형 특성을 이하에 설명한다.

정상인 말초혈액 분리한 초기 NK cell은 90% 이상이 CD3-/CD56+의 표면형을 가지고 있다. 이를 본 발명의 방법에 따라서 증식 배양시키면, 7일 경에는 CD3+ T cell이 상대적으로 줄어들고 CD3-/CD56+ NK cell이 더 많게 되며, 배양일로부터 10경에는 거의 모든 CD3+ T cell은 사라지고 95%이상의 세포 모두가 CD16을 발현하는 활성화된 NK 세포이다. 즉, CD16+의 표면형을 가지는 고순도의 자연살해세포를 단기간에 증식하여 수득할 수 있다.

따라서, 임상 적용이 가능한, 다량의 활성화된 NK cell을 이용하여 종양치료나 종양의 발생원이 되는 것으로 상정되고 있는 바이러스 감염세포의 제거에 유효한 세포치료제를 제조할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 지지세포(Feeder cell) 준비 및 자연살해세포(NK cell)의 분리

(1) 지지세포(Feeder cell) 준비

정상인의 말초혈액 20 ml을 채혈하여, 채혈액 5 ml을 15 ml conical 튜브에 넣었다. 생리식염수 5 ml을 혈액에 추가로 더 넣고 파이펫으로 고르게 섞어주었다. 새로운 15ml conical 튜브에 피콜(ficoll) (GE healthcare, Uppsala, 17-1440-03)을 5 ml 넣고, 피콜이 들어있는 15 ml 튜브에 상기 섞어준(희석된) 혈액을 조심스럽게 얹은 다음, 2000 rpm으로 상온에서 30분간 원심 분리(한일, 한국, Union32-R)하였다.

피콜과 플라즈마(plasma) 사이에 생긴 면역세포층을 취하여 새로운 15 ml conical 튜브에 옮겨 담은 후, HBSS를 10 ml까지 채우고 세포를 고르게 섞고 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액은 진공흡입(suction)하여깨끗이 제거하였다. 다시 HBSS 10 ml를 첨가하고 원심분리하는 과정을 반복하였다.

세포배양액 (hAB serum (Sigma, H4522)이 5% 포함된 AIM-V media (Invitrogen, 12055091)을 1 ml 넣고 세포를 풀어준 후, 상기 세포 용액 중 10 ㎕를 마이크로튜브로 옮기고 트립판 블루(trypan blue) (Gibco) 90 ㎕를 넣어 파이펫으로 잘 섞고, 트립판 블루 (Gibco, 15250-061) 염색약으로 염색하여 역상 현비경(inverted microscope)(Olympus, CK2-TRC-2)을 이용하여 세포수가 5 × 10⁶ cell/ml이 되도록 세포배양액을 넣어 희석하였다.

FACS 분석을 위하여 1 ml의 세포를 5 ml 튜브에 옮겨 담고, 나머지 세포는 2000cGy의 감마(gamma) 선을 조사하여 불활성화 시켜(gamma-irradiatior, MDS Nordion, Gammacell 3000 Elan) 지지세포(feeder cell)를 준비하였다.

(2) NK cell 분리

앞서 정상인으로부터 채혈한 혈액 중 15 ml을 새로운 50ml conical 튜브에 옮겨 담고, Rosettesep NK cell enrichment cocktail (Stemcell technologies, 15065) 750 ㎕ 을 첨가한 후, 상온에서 20분간 서서히 회전시키며 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 혈액에 15 ml 생리식염수를 추가하여 잘 섞어주었다.

새로운 15 ml conical 튜브 3개에 각각 피콜을 5 ml씩 넣고, 피콜이 들어있는 15 ml conical 튜브에 상기 생리식염수를 섞어둔 혈액 10 ml씩을 조심스럽게 넣은 후, 2000 rpm으로 상온에서 30분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝나면, 피콜과 자가혈장액 사이의 자연살해세포층을 모두 취하여 새로운 15 ml conical 튜브에 옮겨넣고, HBSS로 10 ml까지 채우고, 1500 rpm으로 10분간 추가로 원심 분리하였다. 상층액을 깨끗이 제거하고, 다시 HBSS를 10 ml까지 채우고 세포를 잘 풀어준 후, 1200rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 진공으로 상층액을 제거하고 세포배양액을 1 ml 넣어 세포를 잘 풀어주었다.

세포희석액 중 10 ㎕를 마이크로튜브에 옮기고 40 ㎕의 트립판블루를 넣어 파이펫으로 잘 섞은 다음 트립판블루

로 염색하여 세포수를 측정하면서, 세포수가 1 × 10⁶ cells/ml이 되도록 세포배양액으로 희석하였다.

(3) 분리된 초기 NK-cell의 특성

상기 분리된 NK cell에 anti-human CD3-FITC와 anti-human CD56-APC antibody를 염색(staining)하여 표면형을 분석하였다. 그 결과, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 초기 분리된 세포의 90% 이상이 CD3-/CD56+인 NK cell임을 확인하였다.

실시예 2: 분리한 자연살해 세포의 배양

초기 세포는 12-well plate (Falcon)에 배양하였다. 실시예 1-(1)에서 준비된 지지세포 500 ㎕를 well에 넣고,실시예 1-(2)에서 분리한 자연살해세포 500 ㎕를 지지세포가 들어있는 well에 추가로 넣었다.

세포가 들어있는 각 well에 500 U/ml 농도의 IL-2 (Norvatis) 사이토카인과 OKT-3 항체 (ebioscience, 16-0037) 10 ng/ml, 겨우살이 추출 렉틴 10 ㎍/ml을 넣어주고, 플레이트를 조심스럽게 흔들어 세포와 사이토카인을 고르게 섞었다.

플레이트는 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 2일간 배양하였고, 이 때, 어떠한 배양액이나 사이토카인도 첨가하지 않았다.

배양일로부터 2일째 되는 날, 세포가 들어있는 모든 well을 파이펫팅하여 15 ml conical 튜브에 세포를 수거하였다. 세포가 제거된 각 well에 세포배양액을 각 1 ml씩 넣고 남은 세포를 깨끗이 수거하고, 수거한 세포는1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액은 깨끗이 진공흡입하여 OKT-3 항체를 제거하였다.

남은 세포는 세포배양액 2 ml를 넣고 희석하였고, 희석된 세포 10 ㎕를 취하여 micro튜브에 넣고 trypan blue 용액 90 ㎕와 잘 섞어 trypanblue로 염색하여 세포수를 측정하였다. 2 × 10⁵ cells/well이 되도록 세포배양액을 넣어 희석하였다.

그리고, IL-2와 IL-15을 500 U/ml의 농도로 첨가하고, 세포와 고루 섞은 후, 12-well 플레이트에 2 × 10⁵ cells/well로 세포를 접종하였다. 상기 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 5일간 더 배양하였다.

배양일로부터 7일째 되는 날, 세포가 들어있는 모든 well을 파이펫팅하여 15 ml conical 튜브에 세포를 수거하였다. 세포가 제거된 각 well에 세포배양액을 각 1 ml씩 넣고 남은 세포를 깨끗이 수거하고, 수거한 세포는1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액은 깨끗이 진공흡입하여 배양액을 제거하였다.

그리고, IL-2와 IL-18을 500 U/ml의 농도로 첨가하고, 세포와 고루 섞은 후, 12-well 플레이트에 2 × 10⁵ cells/well로 세포를 접종하였다. 상기 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 2일간 더 배양하였다.

배양일로부터 9일째 되는 날, 세포가 들어있는 모든 well을 파이펫팅하여 15 ml conical 튜브에 세포를 수거하였다. 세포가 제거된 각 well에 세포배양액을 각 1 ml씩 넣고 남은 세포를 깨끗이 수거하고, 수거한 세포는1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액은 깨끗이 진공흡입하여 배양액을 제거하였다.

그리고, IL-2와 IL-24을 500 U/ml의 농도로 첨가하고, 식물성 폴리페놀 40㎍을 첨가하여 세포와 고루 섞은 후, 12-well 플레이트에 2 × 10⁵ cells/well로 세포를 접종하였다. 상기 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 5일간 더 배양하였다.

이 때, OKT-3 항체를 제거한 다음날부터 최초 배양일로부터 14일까지 500 U/ml의 IL-2가 첨가되어있는 세포배양액을 1 ml씩 넣어주었다.

실시예 3: 배양된 NK-cell의 세포살해능 평가(Cr-release assay)

(1) Effector cell 준비

자연살해세포 배양 14일째 일부 세포를 수거하여, 1200 rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 2 ml 세포 배양액을 넣어 희석하였다. 세포 수가 3 × 10⁶ cells/ml이 되도록 세포 배양액을 첨가하여 희석한 후, Effector : Target cell (E:T) ratio = 30:1로 조정하였다.

상기 준비된 세포 중 1ml을 취하여 새로운 튜브에 넣고, 세포배양액을 2 ml 더 첨가하여 잘 섞어주면서Effector : Target cell (E:T) ratio = 10:1로 맞추었다. 또한, 세포 중 500 ㎕를 취하여 새로운 튜브에 넣고, 세포배양액을 4.5 ml 더 첨가하여 잘 섞어주면서, Effector : Target cell (E:T) ratio = 3:1로 조정하였다.

96-well plate에 각 target에 대하여 3 well/ratio가 되도록 상기 특정 비율로 조정된 자연살해세포를 100㎕씩넣어주었다.

(2) Target cell 준비

80% confluency가 되어있는 acute lymphoblastic leukemia cell line인 CEM과 chronic myelogenous leukemia (CML) cell line인 K562를 준비하여, 상기 두 cell line을 수거한 후, 15 ml conical 튜브에 담고, 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 5 ml 세포배양액을 넣어 세포를 희석하혔다. 세포수를 측정하고,

1x106 세포만큼 새로운 15 ml 튜브에 옮겨 담았다. 옮겨진 세포에 세포배양액을 10 ml이 되도록 넣은 후, 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 FBS 25 ㎕를 넣어 세포를 희석한 후, Cr-51 (Perkin Elmer)을 100 ㎕씩 첨가하였다.

튜브를 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 1시간 방치한 후, 세포를 꺼내어 세포배양액을10 ml까지 채우고 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 같은 방법으로 두 번 더세척하였다. 세척이 끝난 세포는 세포 배양액을 10 ml 넣고 파이펫으로 고르게 희석하였다.

(3) 살해능 측정

희석된 cell line을, 앞서 준비한 effector cell이 들어있는 바닥이 둥근 (U-bottom) 96-well plate (FALCON)에 target 당 100 ㎕씩 추가로 넣어주었다. 각 target에 대한 spontaneous control로, effector cell이 없는 3개 well에 target cell 100㎕를 넣어주고, 세포배양액을 100㎕ 넣어주었다. 각 target에 대한 maximum control로 effector cell이 없는 3개 well에 target cell 100㎕를 넣어주고, 1% triton X-100이 포함된 PBS를 100 ㎕넣어, 4시간 동안 배양하였다.

그 후, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 가라앉히고, 5 ml test 튜브에 상층액을 100㎕씩 옮겨 담고, gamma-counter (COBRA)를 이용하여 gamma-ray를 측정하였다. 다음 공식을 이용하여 세포독성(cytotoxicity)을 계산하였다.

cytotoxicity = (effector+target cpm - spontaneous cpm) / (maximum cpm - spontaneous cpm)

그 결과, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 두 cell line간의 세포독성은 달랐지만, 두 종류 target cell에서 모두에서 최대 70% 이상의 높은 세포독성을 나타내었다.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기의 과정을 거쳐 배양하는 인간 자연살해세포의 체외 배양과 활성화를 위한 칵테일 배지첨가 조성물.
(a) 배양 과정 개시 내지 2일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 식물성 렉틴(lectin)을 세포 배양배지에 첨가하고,
(b) 2일차 내지 7일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-15(IL-15)를 상기 배지에 반복적으로 첨가하며,
(c) 7일차 내지 9일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-18(IL-18)을 상기 배지에 반복적으로 첨가하며,
(d) 9일차 내지 14일차까지 유효 농도의 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-21(IL-21)과 폴리페놀(polyphenol)을 상기 배지에 반복적으로 첨가하며,
(e) 14일차에 배양을 종료하고 자연살해 세포를 수득하는 과정
제1항에 있어서,
상기 배양배지에 지지세포(feeder cell)를 더 첨가하여 주는 것인 인간 자연살해세포의 체외 배양과 활성화를 위한 칵테일 배지첨가 조성물.
제2항에 있어서,
상기 지지세포는 분열증식을 억제시킨 말초혈 림프구 세포가 분리된 T 세포(purified T cell)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 증식 방법.
제1 인터루킨으로서, IL-2;
제2 인터루킨으로서, IL-12, IL-15 IL-18 및 IL-21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상;
항-CD3 항체로서, OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 인간 자연살해세포의 체외 배양과 활성화를 위한 칵테일 배지첨가 조성물.
제4항에 있어서,
겨우살이 추출 렉틴 및 식물성 폴리페놀을 더 포함하는 인간 자연살해세포의 체외 배양과 활성화를 위한 칵테일 배지첨가 조성물.