JP2022518240A - 養子細胞療法のための標的共刺激を提供する受容体 - Google Patents

Abstract

本発明は、養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用なキメラ共刺激抗原受容体（ＣｏＳｔＡＲ）を含む細胞に関する。ＣｏＳｔＡＲは、定義された抗原への応答を増強する細胞活性のモジュレーターとして作用することができる。本発明はまた、ＣｏＳｔＡＲタンパク質、ＣｏＳｔＡＲをコードする核酸、およびそれらの治療用途を提供する。

Description

関連出願および参照による組込み
２０１９年１月２２日に出願した英国特許出願番号第１９００８５８．０号および２０１９年１２月２０日に出願した米国特許出願番号第６２／９５１，７７０号を参照する。
上記の出願、およびその中でもしくはその実行の間に引用したすべての書類（「出願で引用した書類」）、および出願で引用した書類の中で引用しもしくは参照したすべての書類、および本明細書で引用しもしくは参照したすべての書類（「本明細書で引用した書類」）、および本明細書で引用した書類の中で引用しまたは参照したすべての書類は、本明細書に記述した任意の製品についての、および参照により本明細書に組み込まれた任意の書類における、製造者の指示書、説明書、製品規格書、および製品シートとともに、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において採用することができる。より具体的には、参照したすべての書類は、個別の書類のそれぞれが参照によって組み込まれると具体的かつ個別に指示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。

配列の声明
本出願は、電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる、配列リストを含む。
発明の分野
本発明は、養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用なキメラ共刺激抗原受容体（ＣｏＳｔＡＲ）を含む細胞に関する。ＣｏＳｔＡＲは、定義された抗原への応答を増強する細胞活性のモジュレーターとして作用することができる。本発明はまた、ＣｏＳｔＡＲタンパク質、ＣｏＳｔＡＲをコードする核酸、およびそれらの治療用途を提供する。

自己Ｔ細胞を使用してがんの退縮を媒介する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、初期の臨床試験において大いに期待されてきた。ｅｘ ｖｉｖｏで増殖した腫瘍反応性または腫瘍浸潤性の天然に存在するリンパ球（ＴＩＬ）の使用等のいくつかの一般的なアプローチが行なわれてきた。さらに、Ｔ細胞は定義された腫瘍抗原に向かって再標的化するように遺伝子改変され得る。これは、ペプチド（ｐ）－主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子導入または腫瘍特異的一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）とＴ細胞シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ）との間の合成融合を介して行なうことができ、後者はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称されている。
ＴＩＬおよびＴＣＲの導入は黒色腫を標的とする場合に特に良好であることが証明されており（Rosenberg et al. 2011、Morgan 2006）、一方ＣＡＲ療法はある種のＢ細胞悪性腫瘍の治療において大いに期待されてきた（Grupp et al. 2013）。

白血病におけるＣＡＲ療法の成功は、一部には、それからのシグナルがＣＤ３ζによって提供されるシグナルとシナジー効果を生じて抗腫瘍活性を増強する共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８またはＣＤ１３７）のＣＡＲ構築物への組込みに帰属されてきた。この見解の根拠はＴ細胞の活性化の古典的なシグナル１／シグナル２のパラダイムに関連している。ここでＴＣＲ複合体によって提供されるシグナル１は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、またはＣＤ１３４等の共刺激受容体によって提供されるシグナル２とのシナジー効果を生じて、シグナル１単独の場合に付随する活性化誘起細胞死（ＡＩＣＤ）なしに細胞がクローン性に増殖し、ＩＬ２を産生し、および長期に生存することを可能にする。さらに、シグナル２の関与によって、シグナル１を介して生成したシグナルが増強され、細胞が抗腫瘍応答の間に遭遇するような低結合活性の相互作用により良く応答することが可能になる。
標的共刺激は、非ＣＡＲ系Ｔ細胞療法に有益な影響を有することになる。例えば、共刺激ドメインをキメラＴＣＲに組み込むことによって、ｐＭＨＣに対するＴ細胞の応答が増強されることが示された（Govers 2014）。腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）はその内因性ＴＣＲを利用して腫瘍の認識を媒介するが、内因性ＴＣＲを操作することは可能ではなかった。即ち、腫瘍細胞が発現する共刺激リガンドは極めて少ないので、ＴＩＬは多大の制限を免れない。ＴＩＬの標的共刺激を誘起する能力またはまさに他のいずれの養子Ｔ細胞療法の成果も有益であろう。

新規なＣｏＳｔＡＲおよびＣｏＳｔＡＲを含みまたは発現する細胞は、ＣＡＲ系および非ＣＡＲ系のＴ細胞療法に同様に有益である。本発明は、定義された疾患関連抗原、例えば腫瘍関連抗原との関与に際して新規なキメラ共刺激受容体を発現し、共刺激シグナルをＴ細胞に提供する細胞を使用する。シグナル１およびシグナル２を個別に使用して、操作されたＴ細胞において抗原特異的応答を駆動するいくつかの報告がある（Alvarez-Vallina & Hawkins 1996）。しかし、完全長のＣＤ２８分子を利用したものはない。短縮された形態に対して、ＣＤ２８等の完全長の受容体を使用することには特定の利点がある。完全長のＣＤ２８はダイマーであり、受容体がその天然の形態で機能することを可能にする。キメラ抗原受容体は、モノマーとして発現した場合にはまさに最適に機能することができない（Bridgeman et al. 2010）。本発明は、疾患関連抗原または腫瘍関連抗原等の定義された抗原との関与に際してシグナル２を誘起する標的共刺激受容体をも提供する。完全長のＣＤ２８分子は、受容体のＢ７ファミリーの結合メンバーにおける天然の機能に対して重要なモチーフを含んでいる。これはＢ７によるＣＡＲのライゲーションがＴ細胞の活性化を誘発し得るＣＤ２８受容体およびＣＤ３ζ受容体をタンデムに有するＣＡＲの観点からは潜在的に危険であるが、シグナル２受容体のみを有する受容体については有利な特性がある。

本発明者らは、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を操作してＣｏＳｔＡＲ（共刺激抗原受容体）を発現させ、定義された腫瘍関連抗原との関与に際してＴ細胞の活性化を強化することができることを示した。本発明者らは、操作された細胞が腫瘍関連抗原ＣＥＡとの関与に際してＣｏＳｔＡＲを介してシグナル２を受容することが許容されると、ＩＦＮγおよびＩＬ－２の分泌によって測定したシグナル１マイトゲン（ＯＫＴ３）によるＴ細胞の活性化が増強されることを示した。即ち第１の態様では、本発明は
（ｉ）腫瘍関連抗原特異的ドメイン、例えば一本鎖抗体断片、
（ｉｉ）完全長の共刺激受容体シグナル伝達鎖またはドメイン
を含む組換え共刺激抗原受容体（ＣｏＳｔＡＲ）を提供する。
本発明はまた、
（ｉ）腫瘍関連抗原特異的ドメイン、例えば一本鎖抗体断片、
（ｉｉ）完全長の共刺激受容体シグナル伝達鎖またはドメイン
を含む組換え共刺激抗原受容体を含む細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を含むリンパ球を提供する。

本明細書に記載したＣｏＳｔＡＲは、その指定された腫瘍抗原へのＣｏＳｔＡＲの結合が受容体の活性化をもたらし、共刺激シグナルを提供して、組換えＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または内因性ＴＣＲによって提供される同時並行のシグナル１媒介シグナルを強化するように設計される。腫瘍抗原は、ＣＥＡまたは５Ｔ４等の癌精巣または癌胎児性の抗原のファミリーの分子からのもの等の腫瘍関連抗原であり、一本鎖抗体断片を使用して標的とされ得る。あるいは、腫瘍抗原はＭＨＣを介してペプチドとして提示される抗原であり、ｐＭＨＣ特異的一本鎖抗体断片または一本鎖ＴＣＲを使用して標的とされ得る。
ある特定の実施形態では、シグナル伝達ドメインまたはシグナル伝達鎖は、ＣＤ２、ＣＤ９、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、またはＥｐｈＢ６を含むがこれらに限定されない完全長（シグナルペプチドがないタンパク質配列の全体）の共刺激受容体を含む。共刺激ドメインは、１つの受容体ドメイン単独、または各ドメインが直接もしくは５０アミノ酸長さまでの可撓性リンカーを介して連結されたタンデム状の複数（即ち融合受容体）からなっていてよい。ある特定の実施形態では、シグナル伝達ドメインは完全長の共刺激受容体の断片を含み、断片は二量化に有効である。一本鎖抗体断片をシグナル伝達ドメインに連結するリンカーがあってもよい。存在する場合にはこのリンカーは１～５０アミノ酸長さであってよい。リンパ球は、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇ）、もしくは初代Ｔ細胞を含むＴ細胞、またはＮＫ細胞であってよい。ＣｏＳｔＡＲに加えて、リンパ球、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。

十分な経験を持つ者であれば、シグナルペプチドが成熟タンパク質から切断される正確な点の同定を正確に決定することが困難であることを知ることになる。また予測ソフトウェアを適用することはできるが、成熟タンパク質の上流における配列の人工的なスプライシングはシグナルペプチドのペプチダーゼの新たな部位を創成し、したがって本書における用語「完全長」は、成熟タンパク質のＮ最末端における５アミノ酸までの欠失または変異を有する成熟タンパク質全体を意味しており、これは共刺激ドメインのキメラ受容体への最適のスプライシングのために重要なプロセスである。これは、ＣＤ２８の細胞内ドメインのみが使用されＣＤ８の膜貫通ドメインが利用されたLanitis et al (2013)において使用された配列、および短縮されたＣＤ２８受容体が使用されモチーフＩＥＶに短縮されたKrause et al (1998)における配列等の公開された以前の配列と明らかに異なっている。

第２の態様では、本発明は上および本明細書に記載したＣｏＳｔＡＲをコードする核酸配列を提供する。
第３の態様では、本発明は第２の態様による核酸配列および、存在する場合にはＴＣＲおよび／またはＣＡＲ核酸配列を含むベクターを提供する。
第４の態様では、本発明はＣｏＳｔＡＲをコードする核酸またはベクターをリンパ球に導入するステップを含む、本発明の第１の態様によるリンパ球、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を作成する方法を提供する。
別の態様では、本発明は第３の態様によるベクターまたは第１の態様によるリンパ球（Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む）と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物、ならびにその治療用途を提供する。
第５の態様では、本発明は養子細胞療法における使用のためを含む細胞、例えば第１の態様によるＴ細胞もしくはＮＫ細胞を含むリンパ球、または第３の態様によるベクターを提供する。

第６の態様では、本発明はがんを治療する方法における使用のためを含む第１の態様によるＴ細胞もしくはＮＫ細胞を含むリンパ球、または第３の態様によるベクターを提供する。
第７の態様では、本発明はがんを治療するための医薬の製造における第１の態様によるリンパ球の使用または第３の態様によるベクターの使用を提供する。
第８の態様では、本発明はがんの治療における使用のための第１の態様によるリンパ球、第３の態様によるベクター、または本明細書で開示した医薬組成物を提供する。
一実施形態では、ＣｏＳｔＡＲ受容体は本明細書で定義した完全長のＣＤ２８受容体を含む。一実施形態では、ＣｏＳｔＡＲは、配列番号２で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、ならびに配列番号４で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＣＤ１３７からの細胞内ドメイン、配列番号５で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＣＤ１３４からの細胞内ドメイン、配列番号６で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＣＤ２からの細胞内ドメイン、配列番号７で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＣＤ２９からの細胞内ドメイン、配列番号８で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＧＩＴＲからの細胞内ドメイン、配列番号９で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＩＬ２Ｒγからの細胞内ドメイン、配列番号１０で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＣＤ４０からの細胞内ドメイン、配列番号１１で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＣＤ１５０からの細胞内ドメイン、または配列番号１２で示されるものまたはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアント等のヒトＣＤ２およびヒトＣＤ４０からの細胞内ドメインから選択される他の１つの部分と融合させた腫瘍関連抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、上記の部分の１つのバリアントは、上に列挙した融合配列に関して、１個、２個、３個、４個、もしくは５個、または１０個までのＮ末端アミノ酸残基を欠いている。

例として与えられるが、本発明を特定の実施形態だけに限定するものでない以下の詳細な記載は、付随図と併用して最も良好に理解することができる。

単一の共刺激および融合共刺激ドメイン受容体の構造的組織を示す図。請求項に開示されるＣｏＳｔＡＲ受容体の概略図を示す。１番目に単一の共刺激受容体に基づくＣｏＳｔＡＲ、２番目に第２の共刺激ドメインと融合させた完全長共刺激受容体シグナル伝達ドメインからなる融合ＣｏＳｔＡＲ。 潜在的ＣｏＳｔＡＲ構成のゲノム組織を示す図。図に示すように、および請求項に記載されるように、ＣｏＳｔＡＲは抗原結合性ドメイン、必要に応じたスペーサードメイン、および共刺激ドメインからなる。ＣｏＳｔＡＲは：Ａ）単一の（Ａｉ）または融合（Ａｉｉ）共刺激受容体からなるＣｏＳｔＡＲによりプロモーターから単独で発現させることができ；Ｂ）ＣｏＳｔＡＲの直接染色を可能にするためにＮまたはＣ末端のエピトープタグ（例えばＨｉｓタグ、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）等）と；Ｃ）２Ａ切断配列またはリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して分離されるマーカー遺伝子と一緒に；Ｄ）第２のプロモーターから発現されるマーカー遺伝子と一緒に；Ｅ）２Ａ切断配列またはリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して分離される目的のタンパク質、例えばキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体と一緒に；Ｆ）第２のプロモーターから発現される目的のタンパク質、例えばキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体と一緒に発現させることができる。ＣｏＳｔＡＲおよびマーカー遺伝子／キメラ抗原受容体／Ｔ細胞受容体／目的の他のタンパク質は、いずれかの配向またはお互いに３’（３プライム）もしくは５’（５プライム）側に発現させることができることは、当業者に明らかだろう。 ＬＳ１７４ＴおよびＬｏＶｏ腫瘍提示抗原に応答したＴ細胞中のＣｏＳｔＡＲの機能的活性を示す図。ドナー１（ＡとＤ）、ドナー２（Ｂ）およびドナー３（ＣとＥ）からの正常なドナーＴ細胞集団を、癌胎児性抗原を標的にするＣｏＳｔＡＲを発現させるためにレンチウイルスで工学操作し、導入遺伝子を富化するためにＣＤ３４磁気選択を使用して磁気によって選別した。Ｔ細胞を、野生型の工学操作されていないＣＥＡ＋腫瘍細胞（非活性化腫瘍）、または指示されたエフェクター対標的比の細胞表面固着抗ＣＤ３単鎖抗体断片（活性化腫瘍）を発現するように工学操作したＣＥＡ＋腫瘍細胞と混合し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２を上清中で測定した。データは、ＬＳ１７４Ｔ細胞（Ａ、ＢとＣ）およびＬｏＶｏ（ＤとＥ）を使用して得た。 Ｔ細胞増殖に及ぼすＣｏＳｔＡＲの影響を示す図。５×１０⁵の形質導入および非形質導入Ｔ細胞を、ＩＬ－２の存在下（Ａ）または不在下（Ｂ）で６．２５×１０³の野生型ＬｏＶｏまたはＬｏＶｏ－ＯＫＴ３細胞と混合し、細胞数を３日後に計数した。同じ細胞比での別のアッセイでは、２ドナーからのＴ細胞に増殖色素をロードし、細胞が経た増殖サイクルの数を、フローサイトメトリーを使用して６日後に色素希釈によって決定した。 一次ヒトＴ細胞におけるＣｏＳｔＡＲ融合受容体のＩＬ－２活性を示す図。７人のドナー（対照ＣｏＳｔＡＲが３人のドナーであること以外は）からの正常なドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を、指示されたＣＥＡ－標的化ＣｏＳｔＡＲでレンチウイルスにより形質導入し、ＬｏＶｏ－ＯＫＴ３細胞の存在下で一晩の刺激の後にＩＬ－２生成を調査した。ＩＬ－２陽性細胞の割合は、ＣＤ３４陰性（ＣｏＳｔＡＲ非形質導入）およびＣＤ３４＋（ＣｏＳｔＡＲ形質導入）集団における細胞内フロー染色を使用して決定した。アスタリスクは、対応のあるウィルコクソン符号付順位検定を＊ｐ＜０．０５で使用した、形質導入および非形質導入集団の間の有意差を示す。 一次ヒトＴ細胞におけるＣｏＳｔＡＲ活性の多重パラメーター分析を示す図。正常なドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を、指示されたＣＥＡ－標的化ＣｏＳｔＡＲでレンチウイルスにより形質導入し、ＬｏＶｏ－ＯＫＴ３細胞の存在下で一晩の刺激の後にＩＬ－２生成を調査した。ＩＬ－２（７人のドナー）（図６Ａ）、ＩＦＮγ（７人のドナー）（図６Ｂ）、ｂｃｌ－ｘＬ（５人のドナー）（図６Ｃ）およびＣＤ１０７ａ（６人のドナー）（図６Ｄ）陽性細胞の割合を、ＣＤ３４陰性（ＣｏＳｔＡＲ非形質導入）およびＣＤ３４＋（ＣｏＳｔＡＲ形質導入）集団における細胞内フロー染色を使用して決定した。対照は非特異的ＣＡ１２５標的化ＣｏＳｔＡＲであり、全ての場合に３人のドナーからのものである。ヒートマップは全てのドナーの平均であり、色の強度は規定の条件下の特定のリードアウトに陽性である細胞の百分率に関係する。 一次ヒトＴ細胞におけるＣｏＳｔＡＲ活性の多重パラメーター分析を示す図。正常なドナーＣＤ８＋Ｔ細胞を、指示されたＣＥＡ－標的化ＣｏＳｔＡＲでレンチウイルスにより形質導入し、ＬｏＶｏ－ＯＫＴ３細胞の存在下で一晩の刺激の後にＩＬ－２生成を調査した。ＩＬ－２（７人のドナー）（図６Ａ）、ＩＦＮγ（７人のドナー）（図６Ｂ）、ｂｃｌ－ｘＬ（５人のドナー）（図６Ｃ）およびＣＤ１０７ａ（６人のドナー）（図６Ｄ）陽性細胞の割合を、ＣＤ３４陰性（ＣｏＳｔＡＲ非形質導入）およびＣＤ３４＋（ＣｏＳｔＡＲ形質導入）集団における細胞内フロー染色を使用して決定した。対照は非特異的ＣＡ１２５標的化ＣｏＳｔＡＲであり、全ての場合に３人のドナーからのものである。ヒートマップは全てのドナーの平均であり、色の強度は規定の条件下の特定のリードアウトに陽性である細胞の百分率に関係する。 ＣＤ４０は、ＣＤ２８ベースのＣｏＳｔＡＲからのＩＬ－２生成を増強することを示す図。３人の健康なドナーからの一次ヒトＴ細胞は、形質導入をしないか、または細胞外ドメインがトランケーションされたＣＤ２８（Ｔｒ ＣＤ２８）、完全長ＣＤ２８（ＦＬ ＣＤ２８）もしくはＣＥＡ特異的ｓｃＦｖ（ＭＦＥ２３）を含むＣＤ２８．ＣＤ４０ベースのＣｏＳｔＡＲで形質導入をした。形質導入細胞はＣＤ３４マーカー遺伝子を使用して選択し、分析の前に増量した。Ｔ細胞は８：１のエフェクター対標的比でＯＫＴ３発現ＣＥＡ＋ＬｏＶｏ細胞と２０時間混合し、その後ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２生成を分析した。 ＣｏＳｔＡＲ媒介Ｔ細胞増量に及ぼすシグナル伝達ドメインおよび標的抗原の影響を示す図。Ｔ細胞は、ＣＡ１２５、ＦｏｌＲまたはＣＥＡ特異的ｓｃＦｖもしくはＦｏｌＲ特異的結合性ペプチド（Ｃ７）を含む、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）エピトープ標識ＣＤ２８またはＣＤ２８．ＣＤ４０ベースのＣｏＳｔＡＲで形質導入をした。Ｔ細胞は、ＯＫＴ３発現ＣＡ１２５＋／ＦｏｌＲ＋／ＣＥＡ細胞系ＯＶＣＡＲ３と混合した。形質導入細胞の数は７日おきから最高２１日おきに計数し、各計数の後に新鮮なＯＶＣＡＲ３細胞を加えた。 （Ａ～Ｉ）ＣｏＳｔＡＲ媒介Ｔ細胞増量に及ぼすシグナル伝達ドメインおよび標的抗原の影響を示す図。Ｔ細胞は、ＣＡ１２５、ＦｏｌＲまたはＣＥＡ特異的ｓｃＦｖもしくはＦｏｌＲ特異的結合性ペプチド（Ｃ７）を含む、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）エピトープ標識ＣＤ２８またはＣＤ２８．ＣＤ４０ベースのＣｏＳｔＡＲで形質導入をした。Ｔ細胞は、ＯＫＴ３発現ＣＡ１２５＋／ＦｏｌＲ＋／ＣＥＡ細胞系ＯＶＣＡＲ３と混合した。形質導入細胞の数は７日おきから最高２１日おきに計数し、各計数の後に新鮮なＯＶＣＡＲ３細胞を加えた。 （ＡおよびＢ）ＣＤ４０ベースのＣｏＳｔＡＲは、ＴＣＲ移入モデルにおいてＴ細胞の共刺激を増強することを示す図。３人の健康なドナーからの一次ヒトＴ細胞を、ＣＥＡ特異的ＴＣＲと、ＭＦＥ（白丸または黒丸）またはＣＡ１２５（白四角）特異的ｓｃＦｖを含むＤＹＫＤＤＤＫ標識ＣＤ２８またはＣＤ２８．ＣＤ４０ベースのＣｏＳｔＡＲとで形質導入をした。Ｔ細胞は、１：１のエフェクター対標的比でＣＥＡ＋／ＣＡ１２５－Ｈ５０８細胞と混合し、ＴＣＲ＋／ＣｏＳｔＡＲ＋、ＴＣＲ＋／ＣｏＳｔＡＲ－、ＴＣＲ－／ＣｏＳｔＡＲ＋およびＴＣＲ－／ＣｏＳｔＡＲ集団の中の応答したＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数を決定するために、細胞内サイトカイン染色を実行した。活性における有意差を決定するために、２元配置ＡＮＯＶＡ（テューキーの検定）を実行した：＊ｐ＞０．０５、＊＊ｐ＞０．０１、＊＊＊ｐ＞０．００１、＊＊＊＊ｐ＞０．０００１。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。

共刺激抗原受容体（ＣｏＳｔＡＲ）
以下を含む組換え共刺激抗原受容体（ＣｏＳｔＡＲ）が本明細書で提供される：（ｉ）疾患または腫瘍関連抗原結合性ドメイン；および（ｉｉ）刺激性受容体タンパク質の細胞外リガンド結合性セグメント、および（ｉｉｉ）受容体タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１の細胞内セグメント、および（ｉｖ）必要に応じて、第２の受容体タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２の細胞内セグメント。ある特定の実施形態では、細胞外セグメントおよび第１の細胞内セグメントは、同じ受容体タンパク質のセグメントを含む。ある特定の実施形態では、細胞外セグメントおよび第１の細胞内セグメントは、異なる受容体タンパク質のセグメントを含む。本発明の実施形態では、細胞外セグメントと第１の細胞内セグメントの間に介在膜貫通ドメインがある。必要に応じた第２の細胞内セグメントおよび／または必要に応じた第３の細胞内セグメントを含む実施形態は、細胞内セグメントの間にスペーサーをさらに含むことができる。単純な形では、本発明のＣｏＳｔＡＲは、その同族抗原へのｓｃＦｖの係合および／またはその同族リガンドへのＣＤ２８の係合に依存する共刺激シグナルを伝える完全長ＣＤ２８と融合させた、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。本明細書で使用されるように、「完全長タンパク質」または「完全長受容体」は、受容体タンパク質、例えばＣＤ２８受容体タンパク質を指す。用語「完全長」は、そのシグナルペプチドが切断された後に、成熟受容体タンパク質のＮ末端で最高約５つまたは最高１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸が欠如している受容体タンパク質を包含する。例えば、受容体Ｎ末端シグナルペプチドの特異的切断部位は規定することができるが、正確な切断点の変動が観察された。用語「完全長」は、受容体Ｎ末端シグナルペプチドのアミノ酸の有無を暗示しない。一実施形態では、用語「完全長」（例えば、本発明のある特定の態様による完全長ＣＤ２８）は、そのシグナルペプチドが切断された後に、成熟受容体タンパク質のＮ末端で最高約５つ、例えば１、２、３、４、５、または最高１０個のアミノ酸が欠如しているＮ末端シグナルペプチドが欠如している成熟受容体タンパク質（例えば、本発明のある特定の態様によるＣＤ２８）を包含する。配列番号２は、シグナルペプチドを含む成熟ＣＤ２８タンパク質を示す。上で指摘した通り、本発明の様々な態様による「完全長」ＣＤ２８受容体はシグナルペプチドを含まず、成熟受容体タンパク質のＮ末端で最高約５つ、例えば１、２、３、４、５、または最高１０個のアミノ酸が欠如していてもよい（例えば、Ｎ末端残基Ｎ、Ｋ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶ）。これは、例示的な融合、例えば配列番号４～１２で示される（ボックス領域に示すように、これらは成熟受容体タンパク質のＮ末端で最高約５つ、例えば１、２、３、４、５、または最高１０個のアミノ酸が欠如していてもよいことに留意する）。
ＣｏＳｔＡＲはモジュール形を有し、１つまたは複数のタンパク質から得られる細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを、疾患関連抗原、例えば腫瘍関連抗原に結合する抗体から得られるｓｃＦｖと一緒に含むように構築することができる。

本発明により、一実施形態では、ＣｏＳｔＡＲは疾患関連の、例えば腫瘍関連の抗原受容体、例えば、限定されずに、腫瘍関連抗原特異的ｓｃＦｖ、およびその同族リガンドに結合して細胞内シグナルを提供することが可能である一次共刺激受容体タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、一次共刺激受容体は完全長未満のタンパク質であってよいが、同族リガンドに結合してシグナルを伝達するのに十分である。ある特定の実施形態では、一次共刺激受容体ドメインは、完全長、例えば限定されずに完全長ＣＤ２８である。したがって、抗原特異的結合性ドメインおよびリガンド特異的受容体は、それぞれ同族の抗原およびリガンドに結合することが可能である。図１は、ＣｏＳｔＡＲ構築物の２つの実施形態を表す。両方のＣｏＳｔＡＲは、抗原結合性ドメイン、必要に応じたスペーサー、ならびに細胞外リガンド結合性セグメントおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む完全長共刺激受容体タンパク質を含む。別の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲは抗原結合性ドメイン、必要に応じたスペーサー、共刺激受容体タンパク質の細胞外リガンド結合性部分、膜貫通ドメイン、および第２の異なる共刺激受容体タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、細胞外リガンド結合性部分は、ＣＤ２８トランケーション、例えば、配列番号１３におけるようなアミノ酸ＩＥＶの後のＣ末端ＣＤ２８トランケーションを含み、細胞内シグナル伝達ドメインが続く。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ４０からのものである。細胞外リガンド結合性および細胞内シグナル伝達ドメインを分離する膜貫通ドメインは、限定されずにＣＤ２８、ＣＤ４０からのものであってよい。図１の左の構築物と比較して、図１の右の構築物は、追加の第２の細胞内受容体シグナル伝達ドメインおよび必要に応じたスペーサーをさらに含む。さらなる実施形態では、ＣｏＳｔＡＲは追加の共刺激ドメイン、例えば第３の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができ、この点で、ある特定のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に類似していてよく、それは第１（ＣＤ３ζだけ）、第２（１つの共刺激ドメイン＋ＣＤ３ζ）または第３世代（１つを超える共刺激ドメイン＋ＣＤ３ζ）に分類されている。

本発明のＣｏＳｔＡＲで有益な共刺激受容体タンパク質には、限定されずに、ＣＤ２、ＣＤ９、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）またはＥｐｈＢ６が含まれ、それらはそれらの天然形では、細胞外リガンド結合性ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例えば、ＣＤ２はＴ細胞の表面で見出される細胞接着分子として特徴付けられ、Ｔ細胞活性化のために必要な細胞内シグナルを開始することが可能である。ＣＤ２７は、Ｂ細胞の上でのその発現がＢ細胞における抗原受容体活性化によって誘導されるＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）に属しているＩＩ型膜貫通糖タンパク質として特徴付けられる。ＣＤ２８はＴ細胞の上のタンパク質の１つであり、抗原提示細胞の上のＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）リガンドの受容体である。ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）リガンドはほとんどの白血球で、および一部の非免疫細胞で見出される。ＯＸ４リガンドは多くの抗原提示細胞、例えばＤＣ２（樹状細胞）、マクロファージおよびＢリンパ球の上で発現される。一実施形態では、共刺激受容体タンパク質は、本明細書で規定される完全長ＣＤ２８である。

本発明の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲは、治療活性を有する細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団においてプロモーターの制御下で単独で発現させることができる。あるいは、ＣｏＳｔＡＲは、例えば配列番号３～１２に記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの治療的導入遺伝子と一緒に発現させることができる（成熟受容体タンパク質のＮ末端で最高約５つ、例えば１、２、３、４、５、または最高１０個のアミノ酸が欠如していてもよいことに留意する）。したがって、一態様では、本発明は、成熟受容体タンパク質のＮ末端で最高約５つ、例えば１、２、３、４、５、または最高１０個のアミノ酸が欠如しているそれらの配列の１つを含む、配列番号３～１２のいずれかに示す配列を有するＣｏＳｔａｒ構築物にも関する。好適なＴＣＲおよびＣＡＲ、例えばＨＬＡ－Ａ＊０２－ＮＹＥＳＯ－１特異的ＴＣＲ（Rapoport et al. Nat Med 2015）または抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＤ３ζ融合ＣＡＲ（Kochenderfer et al. J Clin Oncol 2015）は文献で周知であり、それらは骨髄腫またはＢ細胞悪性腫瘍をそれぞれ処置するために首尾よく使用されている。本明細書に記載されるＣｏＳｔＡＲは、任意の公知のＣＡＲまたはＴＣＲと一緒に発現させることができ、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ細胞増量を可能にする調節可能な増殖スイッチ、および抗がん活性のためのＴＣＲまたはＣＡＲの形の従来の活性化機構を細胞に提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載されるＣｏＳｔＡＲならびに腫瘍関連抗原に特異的に結合するＴＣＲおよび／またはＣＡＲを含む養子細胞療法で使用するための細胞を提供する。ＣＤ２８を含む例示的なＣｏＳｔＡＲは、細胞外抗原結合性ドメインならびに配列番号２に示すアミノ酸配列を含む細胞外膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

本明細書で使用される用語「抗原結合性ドメイン」は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異的ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異的抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、または抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を限定されずに含む、抗体断片を指す。抗原結合性ドメインは、親抗体または親抗体断片（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合する同じ抗原に結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、１つまたは複数の異なるヒト抗体からのフレームワーク（ＦＲ）に接がれる特定のヒト抗体からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。

抗原結合性ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および感染性疾患関連抗原を限定されずに含む任意の疾患関連抗原に特異的にすることができる。ある特定の実施形態では、リガンド結合性ドメインは二重特異的である。抗原は、バーキットリンパ種、神経芽細胞腫、黒色腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳がん、前立腺がん、肺癌および結腸がんを含む大部分のヒトがんで同定されている。ＴＡＡには、限定されずに、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２２８、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、葉酸受容体（ＦＲα）、メソテリン、ＣＤ２７６、ｇｐ１００、５Ｔ４、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ－１、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＭＣＳＰ、ＳＭ５－１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰおよびＨＥＲ－２が含まれる。ＴＡＡには、新生抗原、ペプチド／ＭＨＣ複合体およびＨＳＰ／ペプチド複合体もさらに含まれる。

ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは、規定の腫瘍特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するＴ細胞受容体またはその結合性断片を含む。用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞の表面で対になるαβまたはγδ鎖で構成されるヘテロダイマー受容体を指す。各α、β、γおよびδ鎖は、２つのＩｇ様ドメインで構成される：相補性決定領域（ＣＤＲ）を通して抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）と、それに続く連結ペプチドおよび膜貫通（ＴＭ）領域によって細胞膜に固着している定常ドメイン（Ｃ）。ＴＭ領域は、ＣＤ３シグナル伝達器官の不変サブユニットに結合する。Ｖドメインの各々は３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲは、主要組織適合複合体によってコードされるタンパク質（ｐＭＨＣ）に結合している抗原性ペプチドの間の複合体と相互作用する（Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.）。

ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは腫瘍発現タンパク質の天然のリガンドまたはその腫瘍結合性断片を含む。例えば、ＣＤ７１としても知られるトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）は、細胞の鉄ホメオスタシスおよび増殖の鍵調節因子であるホモダイマータンパク質である。ＴｆＲ１は様々な細胞で低いレベルで発現されるが、それは、過剰発現が劣った予後診断と関連付けられている悪性細胞を含む、急増殖する細胞ではより高いレベルで発現される。本発明の一実施形態では、抗原結合性ドメインはトランスフェリンまたはそのトランスフェリン受容体結合性断片を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは規定の腫瘍関連抗原、例えば限定されずにＦＲα、ＣＥＡ、５Ｔ４、ＣＡ１２５、ＳＭ５－１またはＣＤ７１に特異的である。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体であってよい。ある特定のそのような実施形態では、ペプチドは新生抗原である。他の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ペプチド－熱ショックタンパク質複合体である。

本発明の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲの細胞外、膜貫通および細胞内ドメインシグナル伝達ドメインは、配列番号１に示す配列を有する。
本明細書で使用されるように、用語「特異的に結合する」または「に特異的である」は、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下で標的の存在の決定因子である、測定可能で再現可能な相互作用、例えば標的と抗体または抗体部分の間の結合を指す。例えば、標的（エピトープであってよい）に特異的に結合する抗体部分は、他の標的へのその結合より大きな親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続期間で標的に結合する抗体部分である。一部の実施形態では、抗原に特異的に結合する抗体部分は、抗原（例えば細胞表面抗原またはペプチド／ＭＨＣタンパク質複合体）の１つまたは複数の抗原性決定因子と、他の標的への結合親和性の少なくとも約１０倍である結合親和性で反応する。

スペーサードメイン
本発明のＣｏＳｔＡＲは、抗原結合性ドメインと共刺激受容体の間にスペーサー領域を必要に応じて含む。本明細書で使用されるように、用語「スペーサー」は、共刺激タンパク質の外部のリガンド結合性ドメインから抗原結合性ドメインを分離する、ＣｏＳｔＡＲの細胞外構造領域を指す。スペーサーは、標的化抗原および受容体リガンドにアクセスする柔軟性を提供する。ある特定の実施形態では、例えば膜近位のエピトープまたはグリコシル化された抗原を標的にするために、長いスペーサーが用いられる（Guest R.D. et al. The role of extracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immune receptors: evaluation of four different scFvs and antigens. J. Immunother. 2005;28:203-211；Wilkie S. et al., Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1: the evolution of a chimeric antigen receptor. J. Immunol. 2008;180:4901-4909を参照する）。他の実施形態では、例えば膜遠位のエピトープを標的にするために、ＣｏＳｔＡＲは短いスペーサーを有する（Hudecek M. et al., Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 2013;19:3153-3164；Hudecek M. et al., The nonsignalling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer Immunol. Res. 2015;3:125-135を参照）。ある特定の実施形態では、スペーサーはＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４を限定されずに含むＩｇＧヒンジの全部もしくは一部を含むかまたはそれに由来する。「Ｉｇヒンジに由来する」とは、ＩｇＧヒンジに挿入、欠失または突然変異を含むスペーサーを意味する。ある特定の実施形態では、スペーサーは１つまたは複数の抗体定常ドメイン、例えばＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの全部または一部を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインの全部または一部を含むスペーサーでは、ＣＨ２ドメインはＦｃ受容体に結合しないように改変される。例えば、骨髄細胞でのＦｃ受容体結合は、ＣＡＲ Ｔ細胞機能を損なうことが見出されている。ある特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＤ２８、ＣＤ８またはヒンジ領域を含む他のタンパク質からのＩｇ様ヒンジの全部または一部を含む。スペーサーを含む本発明のある特定の実施形態では、スペーサーは長さが１～５０アミノ酸である。

シグナル伝達ドメイン
上記の通り、ある特定の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲは、限定されずにＣＤ２、ＣＤ９、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）またはＥｐｈＢ６の細胞外リガンド結合性および細胞内シグナル伝達部分を含むことができる、完全長一次共刺激受容体を含む。他の実施形態では、共刺激受容体は、例えば前記タンパク質の１つの細胞外リガンド結合性ドメインおよび前記タンパク質のもう１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲのシグナル伝達部分は、単一のシグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲのシグナル伝達部分は第２の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、限定されずにＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）を含む。ある特定の実施形態では、第１および第２の細胞内シグナル伝達ドメインは同じである。他の実施形態では、第１および第２の細胞内シグナル伝達ドメインは異なる。ある特定の実施形態では、共刺激受容体は二量体化が可能である。理論によって縛られることなく、シグナル開始のためにＣｏＳｔＡＲは二量体化するかまたは他のアクセサリー分子と結合すると考えられる。ある特定の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲは膜貫通ドメイン相互作用を通して二量体化するかまたはアクセサリー分子と結合する。ある特定の実施形態では、アクセサリー分子による二量体化または結合は、共刺激受容体の細胞内部分および／または細胞外部分における共刺激受容体相互作用によって支援される。

膜貫通ドメイン
膜貫通の主要な機能はＴ細胞膜にＣｏＳｔＡＲを固着させることであるが、ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインはＣｏＳｔＡＲ機能に影響する。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、完全長一次共刺激受容体ドメインに含まれる。ＣｏＳｔＡＲ構築物が１つの受容体の細胞外ドメインおよび第２の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む本発明の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのそれであってよい。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８またはＩＣＯからのものである。Ｇｕｅｄｅｎ等は、ＩＣＯＳ膜貫通ドメインの使用をＣＡＲ Ｔ細胞持続性および全体的抗腫瘍有効性の増加と関連付けた（Guedan S. et al., Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 2018;3:96976）。一実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞膜にまたがる疎水性のαヘリックスを含む。
本発明によるＣｏＳｔＡＲシグナル伝達ドメインの例は、配列番号３～１２で提供される。

変異体
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体部分または他の部分のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体部分の結合親和性および／または他の生物学的特性を向上させることが望ましいことがある。抗体部分のアミノ酸配列変異体は、抗体部分をコードするヌクレオチド配列に適当な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような改変には、例えば、抗体部分のアミノ酸配列中の残基からの欠失、および／またはそれへの挿入および／またはその置換が含まれる。その最終構築物が所望の特徴、例えば抗原結合性を有する限り、最終構築物に到達するために欠失、挿入および置換の任意の組合せを加えることができる。

一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む抗体の結合性ドメイン部分が提供される。突然変異のための目的の部位には、抗体の結合性ドメインの重鎖および軽鎖可変領域（ＶＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。アミノ酸置換を目的の結合性ドメインに導入することができ、生成物を所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合性または低下した免疫原性についてスクリーニングすることができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は一次共刺激受容体ドメイン（細胞外または細胞内）、二次共刺激受容体ドメインまたは細胞外共受容体ドメインのうちの１つまたは複数に導入することができる。したがって、本発明は、本明細書に特に開示されるＣｏＳｔＡＲタンパク質および構成要素部分、ならびにその変異体、すなわちＣｏＳｔＡＲタンパク質および本明細書に特に開示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する構成要素部分を包含する。特定の配列を指す場合の用語「パーセント類似性」、「パーセント同一性」および「パーセント相同性」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧソフトウェアプログラムＢｅｓｔＦｉｔに示される通りに使用する。他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴまたはＴＢＬＡＳＴＮ（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する）を使用することができる。

特定のアミノ酸配列変異体は、１アミノ酸、２、３、４、５～１０、１０～２０または２０～３０アミノ酸の挿入、付加、置換または欠失によって参照配列から異なってもよい。一部の実施形態では、変異体配列は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの残基が挿入、欠失または置換されている参照配列を含むことができる。例えば、５、１０、１５、最高２０、最高３０または最高４０残基が挿入、欠失または置換されていてもよい。
一部の好ましい実施形態では、変異体は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの保存的置換によって参照配列から異なってもよい。保存的置換は、類似の特性を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを含む。例えば、脂肪族残基は、別の脂肪族残基と置き換えることができ、無極性残基は別の無極性残基と置き換えることができ、酸性残基は別の酸性残基と置き換えることができ、塩基性残基は別の塩基性残基と置き換えることができ、極性残基は別の極性残基と置き換えることができ、または芳香族残基は別の芳香族残基と置き換えることができる。保存的置換は、例えば、以下の群の中のアミノ酸の間で起こることができる：

保存的置換を下の表に示す。

アミノ酸は、共通する側鎖特性によって異なるクラスに分類することができる：ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；ｂ．中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ｅ．鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。

細胞
本発明で使用される細胞は、養子細胞療法で有益である任意のリンパ球、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマ／デルタＴ細胞またはＴ調節細胞であってよい。細胞は、患者にとって同種異系または自家であってよい。
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫で中心的な役割を演ずるタイプのリンパ球である。それらは、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球、例えばＢ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）から区別することができる。下で要約される通り、各種のＴ細胞がある。細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも結びつけられている。ＣＴＬは、それらの表面にＣＤ８分子を発現する。

これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩと関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。調節Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－１０、アデノシンおよび他の分子を通して、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活性化することができ、それは実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫性疾患を阻止する。
記憶Ｔ細胞は、感染症が解消した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらはそれらの同族抗原への再曝露により多数のエフェクターＴ細胞に速やかに増大し、このように、過去の感染症に対する「記憶」を免疫系に提供する。記憶Ｔ細胞は３つのサブタイプを含む：中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であってよい。記憶Ｔ細胞は、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを一般的に発現する。以前はサプレッサーＴ細胞として知られる調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持のために重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞媒介性免疫を停止すること、および胸腺における負の選択の過程から逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス、天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞、が記載されている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺Ｔｒｅｇ細胞としても知られる）は胸腺に生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ⁺）および形質細胞様（ＣＤ１２３⁺）樹状細胞の間の相互作用と関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞から区別することができる。適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、正常な免疫応答の間に生じることができる。
ナチュラルキラー細胞（または、ＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成するタイプの細胞溶解性細胞である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの先天性シグナルへの急速な応答を提供する。ＮＫ細胞（先天性リンパ系細胞の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と規定され、ＢおよびＴリンパ球を生成する共通リンパ球前駆体と区別される第３の種類の細胞を構成する。

ある特定の実施形態では、本発明の治療的細胞は、ＣｏＳｔＡＲを発現するように工学操作される自家細胞を含む。ある特定の実施形態では、本発明の治療的細胞は、ＣｏＳｔＡＲを発現するように工学操作される同種異系細胞を含む。ＣｏＳｔＡＲを発現する自家細胞は、レシピエント同種抗原のＴＣＲ媒介認識のために、移植片対宿主病（ＧＶＤＨ）を回避することにおいて有利である可能性がある。さらに、ＣｏＳｔＡＲレシピエントの免疫系は注入されたＣｏＳｔＡＲ細胞を攻撃し、拒絶を引き起こす可能性がある。ある特定の実施形態では、ＧＶＨＤを予防するため、および拒絶を低減するために、ゲノム編集によって内因性ＴｃＲが同種異系ＣｏＳｔＡＲ細胞から取り出される。

核酸
本発明の態様は、本明細書に記載されるＣｏＳｔＡＲ、ポリペプチドまたはタンパク質（その機能的部分および機能的変異体を含む）のいずれかをコードする本発明の核酸配列を提供する。本明細書で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義であるものである。遺伝子コードの同義性の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードすることができることを、当業者は理解する。さらに、当業者は、ルーチン技術を使用して、ポリペプチドが発現される予定の任意の特定の宿主生物体のコドン利用を反映するために、例えばコドン最適化のために、ここで記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を加えることができることを理解すべきである。本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。それらは、一本鎖または二本鎖であってよい。それらは、それらの中に合成のまたは改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が、当技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート主鎖、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明のために、ポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変することができることを理解すべきである。目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために、そのような改変を実行することができる。

ヌクレオチド配列に関する用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」は、その配列からのまたはそれへの１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失または付加を含む。核酸配列は、配列番号２で示すタンパク質配列またはその変異体をコードすることができる。ヌクレオチド配列は、配列番号１で示すコドン最適化ヒトＣＤ２８核酸配列またはその変異体を含むことができる（図１に表す）。
本発明は、ＣｏＳｔＡＲをコードする核酸配列およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするさらなる核酸配列を含む核酸配列も提供する。
核酸配列には、２つ以上の核酸配列の同時発現を可能にする配列が連結することができる。例えば、構築物は内部プロモーター、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）配列または切断部位をコードする配列を含むことができる。切断部位は、ポリペプチドが生成されるとき、いかなる外部の切断活性も必要とせずにそれが個別のタンパク質に直ちに切断されるように、自己切断性であってよい。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）および２Ａ自己切断ペプチドを含む、様々な自己切断部位が公知である。同時発現配列は、リボソーム内部進入部位配列（ＩＲＥＳ）であってよい。同時発現配列は、内部プロモーターであってよい。

ベクター
一態様では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸構築物を含むベクターを提供する。
そのようなベクターは、それが本発明の第１の態様による１つまたは複数のＣｏＳｔＡＲ、および任意に１つまたは複数の他の目的のタンパク質（ＰＯＩ）、例えばＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように、核酸配列または核酸構築物を宿主細胞に導入するために使用することができる。ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターもしくは合成ｍＲＮＡであってよい。
本発明の核酸は、標準の遺伝子送達プロトコールを使用した核酸免疫化および遺伝子療法のために使用することもできる。遺伝子送達の方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書で完全に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、５，５８０，８５９号、５，５８９，４６６号を参照。

レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、長期の遺伝子導入を達成するのに好適なツールであり、その理由は、それらが導入遺伝子または複数の導入遺伝子の長期の安定した組入れおよび娘細胞におけるその増殖を可能にするからである。ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含むリンパ球をトランスフェクトまたは形質導入させることが可能であってよい。本発明は、本発明の核酸が挿入されるベクターも提供する。ＣｏＳｔＡＲおよび任意にＴＣＲまたはＣＡＲをコードする天然または合成の核酸の発現は、ＣｏＳｔＡＲおよびＴＣＲ／ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその一部を１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結し、この構築物を発現ベクターに組み込むことによって一般的に達成される。

追加のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。一般的に、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターが開始部位の下流の機能的エレメントも含有することが最近示された。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば弾力的であるので、プロモーター機能はエレメントがお互いに対して逆になる場合または移動する場合も保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めるまでに５０ｂｐの間隔まで増加することができる。
好適なプロモーターの１つの例は、前初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結される任意のポリヌクレオチド配列の高レベル発現を促進することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子１α（ＥＦ－１α）である。しかし、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されずに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターを限定されずに含む他の構成的プロモーター配列を使用することもできる。

ベクターは、真核生物細胞における複製および組入れに好適であってよい。一般的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節のために有益なプロモーターを含有する。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載される、国際公開第０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号；および米国特許第６，３２６，１９３号も参照する。一部の実施形態では、構築物は配列番号３～１２に示す通りである（図２に模式的に表される）。一部の実施形態では、核酸は、単一のプロモーターの制御下の複数の導入遺伝子（例えば、ＣｏＳｔＡＲおよびＴＣＲおよび／またはＣＡＲ等）の発現を可能にする多シストロン構築物である。一部の実施形態では、導入遺伝子（例えば、ＣｏＳｔＡＲおよびＴＣＲおよび／またはＣＡＲ等）は自己切断性の２Ａペプチドによって分離される。本発明の核酸構築物で有益な２Ａペプチドの例には、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２ＡおよびＥ２Ａが含まれる。本発明の他の実施形態では、本発明の核酸構築物は、２つのプロモーターを含む多シストロン構築物である；１つのプロモーターはＣｏＳｔＡＲの発現を促進し、他のプロモーターはＴＣＲまたはＣＡＲの発現を促進する。一部の実施形態では、本発明の二重プロモーター構築物は、片方向性である。他の実施形態では、本発明の二重プロモーター構築物は、双方向性である。ＣｏＳｔＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を調査するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを通してトランスフェクトまたは形質導入しようと追求される細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子またはリポーター遺伝子または両方を含有することもできる。

細胞の供与源
増量および遺伝子改変の前に、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞）の供与源が対象から得られる。用語「対象」は、免疫応答を導き出すことができる生物体を含むものである（例えば哺乳動物）。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびこれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含むいくつかの供与源から得ることができる。
一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解させ、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離または向流遠心分離エラトリエーションにより単球を除去することによって、末梢血リンパ球から単離される。

Ｔ細胞、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の特異的亜集団は、正または負の選択技術によってさらに単離することができる。例えば、一態様では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔとの、所望のＴ細胞の正の選択に十分な時間のインキュベーションによって単離される。一態様では、この時間は約３０分である。さらなる態様では、この時間は３０分～３６時間またはそれより長く、その間の全ての整数が含まれる。さらなる態様では、この時間は少なくとも１、２、３、４、５または６時間である。さらに別の好ましい態様では、この時間は１０～２４時間である。一態様では、インキュベーション時間は２４時間である。腫瘍組織からまたは免疫不全の個人から腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合のように他の細胞型と比較してわずかなＴ細胞しかない任意の状況では、Ｔ細胞を単離するためにより長いインキュベーション時間を使用することができる。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させることができる。したがって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単に短くするかもしくは延長することによって、および／またはビーズ対Ｔ細胞比を増加もしくは減少させることによって（本明細書でさらに記載される）、培養開始時またはプロセスの間の他の時点に、Ｔ細胞の亜集団を正にまたは負に優先的に選択することができる。さらに、ビーズまたは他の表面での抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望の時点に、Ｔ細胞の亜集団を正にまたは負に優先的に選択することができる。当業者は、本発明との関連で複数回の選択を使用することもできることを認めるだろう。ある特定の態様では、選択手順を実行し、活性化および増量プロセスにおいて「未選択」細胞を使用することが望ましいかもしれない。「未選択」細胞は、さらなる回の選択にかけることもできる。

負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負に選択される細胞に特異な表面マーカーに向けられる抗体の組合せで達成することができる。１つの方法は、負に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられるモノクローナル抗体の混合を使用する、負の磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を一般的に含む。ある特定の態様では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、ＣＤ１３７、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３、ＣＤ１５０およびＦｏｘＰ３＋を一般的に発現する調節Ｔ細胞を富化するかまたは正に選択することが望ましいかもしれない。あるいは、ある特定の態様では調節Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズまたは他の類似の選択方法によって除去される。
本明細書に記載される方法は、例えば本明細書に記載される負の選択技術を例えば使用する、調節Ｔ細胞除去集団、ＣＤ２５＋除去細胞である免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の特異的亜集団の選択を例えば含むことができる。好ましくは、調節Ｔ除去細胞の集団は、３０％未満、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％のＣＤ２５＋細胞を含有する。

標的抗原に特異的に結合するＣｏＳｔＡＲエフェクター細胞の特異的亜集団は、正の選択技術によって富化することができる。例えば、一部の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原コンジュゲートビーズとの、所望のａｂＴＣＲエフェクター細胞の正の選択に十分な時間のインキュベーションによって富化される。一部の実施形態では、この時間は約３０分である。一部の実施形態では、この時間は３０分～３６時間またはそれより長い（これらの値の間の全ての範囲を含む）。一部の実施形態では、この時間は少なくとも１、２、３、４、５または６時間である。一部の実施形態では、この時間は１０～２４時間である。一部の実施形態では、インキュベーション時間は２４時間である。不均一な細胞集団中に低レベルで存在するエフェクター細胞の単離のために、より長いインキュベーション時間、例えば２４時間の使用は細胞収量を増加させることができる。他の細胞型と比較してわずかなエフェクター細胞しかない任意の状況では、エフェクター細胞を単離するためにより長いインキュベーション時間を使用することができる。当業者は、本発明との関連で複数回の選択を使用することもできることを認めるだろう。

刺激のためのＴ細胞は、洗浄ステップの後に冷凍されてもよい。血漿および血小板を取り除く洗浄ステップの後、細胞は凍結溶液中に懸濁されてもよい。多くの凍結溶液およびパラメーターが当技術分野で公知であり、これに関連して有益であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％ブドウ糖、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％ブドウ糖５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％ブドウ糖、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯを含有する培地、または、例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結媒体の使用を含み、その後細胞は１分につき１度の速度で－８０℃に冷凍され、液体窒素保存タンクの気相の中で保存される。制御された凍結の他の方法、ならびに－２０℃または液体窒素における即時的な無制御の凍結も使用することができる。

同種異系ＣｏＳｔＡＲ
本明細書に記載される実施形態では、免疫エフェクター細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞であってよい。例えば、細胞は同種異系Ｔ細胞、例えば、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩの発現が欠如している同種異系Ｔ細胞であってよい。
機能的内因性ＴＣＲが欠如しているＴ細胞は、例えば、それが表面にいかなる機能的ＴＣＲも発現しないように工学操作することができるか、機能的ＴＣＲを含む１つまたは複数のサブユニットをそれが発現しないように工学操作することができるか（例えば、それがＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンおよび／またはＴＣＲゼータを発現しない（または、その低減した発現を示す）ように工学操作する）、または、それがその表面にごくわずかな機能的ＴＣＲしか生成しないように工学操作することができる。あるいは、Ｔ細胞は、かなり障害のあるＴＣＲを、例えばＴＣＲのサブユニットの１つまたは複数の突然変異またはトランケーション形の発現によって発現することができる。用語「かなり障害のあるＴＣＲ」は、このＴＣＲが宿主で有害な免疫反応を導き出さないことを意味する。

本明細書に記載されるＴ細胞は、例えば、それがその表面に機能的ＨＬＡを発現しないように工学操作することができる。例えば、本明細書に記載されるＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩが下方制御されるように工学操作することができる。一部の態様では、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減するか排除することによって、ＨＬＡの下方制御を達成することができる。
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩが欠如していてもよい。機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現が欠如している改変されたＴ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１つまたは複数のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む任意の好適な手段によって得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用したＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含むことができる。

一部の実施形態では、同種異系細胞は、阻害性分子を発現しないかまたは低レベルで発現する細胞、例えば本明細書に記載される任意の方法によって工学操作される細胞であってよい。例えば、細胞は、例えば免疫エフェクター応答を開始するＣｏＳｔＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる阻害性分子を発現しないかまたは低レベルで発現する細胞であってよい。阻害性分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｇａｌ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータが含まれる。阻害性分子の例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲ発現細胞の性能を最適化することができる。実施形態では、阻害性核酸、例えば本明細書に記載される、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用することができる。

内因性ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
一部の実施形態では、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現は、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡをコードする核酸を標的にするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、および／または本明細書に記載されるＴ細胞中の阻害性分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｇａｌ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ）を使用して阻害することができる。
Ｔ細胞中のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、任意の従来の発現系、例えばレンチウイルス発現系を使用して達成することができる。ＴＣＲの構成要素の発現を下方制御する例示的なｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号に記載される。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を下方制御する例示的なｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７７３号に記載される。

ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用されるように、「ＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ」は、クリスパーのセットまたはそのような反復配列のセットを含む系を指す。本明細書で使用される「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系はＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来する系を指し、それは、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子、および／または本明細書に記載される阻害性分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ）の発現を抑制するかまたはその突然変異を起こさせるために使用することができる。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの概ね４０％および配列決定された古細菌の９０％で見出される。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172。この系は、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝子エレメントへの抵抗性を付与し、獲得免疫の型を提供するタイプの原核生物の免疫系である。Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712；Marragini et al. ( 2008) Science 322: 1843-1845。

Ｔ細胞の活性化および増殖
Ｔ細胞は、一般に例えば米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して活性化し増殖することができる。

一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結合された表面と接触させることによって、増殖させることができる。特に、Ｔ細胞の集団は、本明細書に記載したようにして、例えば抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または表面上に固定された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えばブリオスタチン）との接触によって、刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のためには、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の刺激増殖に適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が含まれ、当技術で一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(l-2):53-63, 1999）。

一部の実施形態では、増殖はフラスコもしくは容器、または当業者には公知のガス透過性容器を使用して実施することができ、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日、約７日～約１４日、約８日～約１４日、約９日～約１４日、約１０日～約１４日、約１１日～約１４日、約１２日～約１４日、または約１３日～約１４日、継続することができる。一部の実施形態では、第２のＴＩＬ増殖は約１４日継続することができる。

ある特定の実施形態では、増殖はインターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下に非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して実施することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激剤には、例えば約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３等の抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ、Ｒａｒｉｔａｎ、Ｎ．Ｊ．またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．から市販）、またはＵＨＣＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから市販）が含まれ得る。ＣｏＳｔＡＲ細胞は、任意にＴ細胞増殖因子、例えば３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２またはＩＬ－１５の存在下で、任意にベクターから発現させることができるがんの抗原部分を含む１つまたは複数の抗原、例えばエピトープ、例えばヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μＭのＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）を含ませることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることができる。その他の好適な抗原には、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、およびＶＥＧＦＲ２、またはこれらの抗原部分が含まれ得る。ＣｏＳｔＡＲ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２を発現している抗原提示細胞にパルスした同じがん抗原で再刺激することによって迅速に増殖させてもよい。あるいは、ＣｏＳｔＡＲ細胞は、例えば照射した自己リンパ球によって、または照射したＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球およびＩＬ－２によって、さらに刺激することができる。一部の実施形態では、刺激は増殖の一部として起こる。一部の実施形態では、増殖は照射した自己リンパ球の存在下で、または照射したＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球およびＩＬ－２によって起こる。

ある特定の実施形態では、細胞培養培地はＩＬ－２を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、もしくは約８０００ＩＵ／ｍＬ、または１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、もしくは８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

ある特定の実施形態では、細胞培養培地はＯＫＴ３抗体を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、または０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、もしくは５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。
ある特定の実施形態では、増殖の間の組合せとしてＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－２１の組合せが採用される。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組合せが、増殖の間に含まれ得る。一部の実施形態では、増殖の間の組合せとして、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１の組合せが採用される。一部の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組合せを含ませることができる。

ある特定の実施形態では、増殖はＩＬ－２、ＯＫＴ－３、および抗原提示フィーダー細胞を含む補完した細胞培養培地の中で実施することができる。
ある特定の実施形態では、増殖培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、もしくは約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、もしくは約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、もしくは約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、もしくは約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
一部の実施形態では、増殖培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、もしくは約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約２０ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、もしくは約１５ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、もしくは約１２ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、もしくは約１０ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、もしくは約５ＩＵ／ｍＬ～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、もしくは約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。

一部の実施形態では、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。一実施形態では、増殖におけるＣｏＳｔＡＲ細胞のＰＢＭＣおよび／または抗原提示細胞に対する比は、約１～２５、約１～５０、約１～１００、約１～１２５、約１～１５０、約１～１７５、約１～２００、約１～２２５、約１～２５０、約１～２７５、約１～３００、約１～３２５、約１～３５０、約１～３７５、約１～４００、もしくは約１～５００、または１～５０と１～３００の間、または１～１００と１～２００の間である。
ある特定の態様では、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナルと共刺激シグナルは、異なるプロトコールによって提供され得る。例えば、それぞれのシグナルを提供する薬剤は、溶液中であってもよく、表面に連結されていてもよい。表面に連結される場合には、薬剤は同一表面に連結されてもよく（即ち「シス」フォーメーションで）、個別の表面に連結されてもよい（即ち「トランス」フォーメーションで）。あるいは、１つの薬剤が表面に連結され、他の薬剤が溶液中にあってもよい。一態様では、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるか、表面に連結される。ある特定の態様では、両方の薬剤が溶液中にあってもよい。一態様では、薬剤は可溶性の形態で、薬剤に結合することになるＦｃ受容体または抗体もしくはその他の結合剤を発現している細胞等の表面に架橋してもよい。これに関して、本発明におけるＴ細胞の活性化および増殖における使用を意図した人工的な抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、例えば米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および第２００６００３４８１０号を参照されたい。

一態様では、２つの薬剤が同一のビーズに、即ち「シス」に、または個別のビーズに、即ち「トランス」に、ビーズに固定される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である。両方の薬剤は等モル量で同一のビーズに共固定化される。一態様では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞の成長のため、ビーズに結合した１：１の比の各抗体が使用される。本発明のある特定の態様では、１：１の比を使用して観察される増殖と比較してＴ細胞の増殖の増大が観察されるような、ビーズに結合した抗ＣＤ３抗体：抗ＣＤ２８抗体の比が使用される。ある特定の態様では、１：１の比を使用して観察される増殖と比較して、約１倍～約３倍の増大が観察される。一態様では、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００およびその間のすべての整数値の範囲である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体より多い抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合される。即ち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１より小さい。本発明のある特定の態様では、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体の抗ＣＤ３抗体に対する比は、２：１より大きい。１つの特定の態様では、ビーズに結合した１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。一態様では、ビーズに結合した１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。さらなる態様では、ビーズに結合した１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。一態様では、ビーズに結合した１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。１つの好ましい態様では、ビーズに結合した１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。一態様では、ビーズに結合した１：３のＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。さらに１つの態様では、ビーズに結合した３：１のＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。

Ｔ細胞またはその他の標的細胞を刺激するために、１：５００～５００：１およびその間の任意の整数値の粒子対細胞の比が使用され得る。当業者には容易に認識されるように、粒子と細胞の比は標的細胞に対する粒子の大きさに依存し得る。例えば、小サイズのビーズは数個の細胞にのみ結合し得るが、大きなビーズは多くの細胞に結合し得る。ある特定の態様では、細胞と粒子の比は１：１００～１００：１およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる態様では、１：９～９：１およびその間の任意の整数値を含む比も、Ｔ細胞を刺激するために使用することができる。Ｔ細胞の刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を連結した粒子とＴ細胞の比は上記のように変動し得るが、ある特定の好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１を含み、１つの好ましい比はＴ細胞あたりの粒子が少なくとも１：１である。一態様では、１：１またはそれ未満の粒子対細胞の比が使用される。１つの特定の態様では、好ましい粒子対細胞の比は１：５である。さらなる態様では、粒子と細胞の比は刺激の日に応じて変動し得る。例えば一態様では、粒子と細胞の比は１日目には１：１～１０：１であり、その後１０日目まで毎日または１日おきにさらなる粒子が細胞に添加され、最終の比が（添加の日における細胞計数に基づいて）１：１～１：１０になる。１つの特定の態様では、粒子と細胞の比は刺激の１日目には１：１であり、刺激の３日目および５日目に１：５に調整される。一態様では、粒子は毎日または１日おきのベースで添加され、最終の比が刺激の１日目に１：１、３日目および５日目に１：５になる。一態様では、粒子と細胞の比は刺激の１日目に２：１であり、刺激の３日目および５日目に１：１０に調整される。一態様では、粒子は毎日または１日おきのベースで添加され、最終の比が刺激の１日目に１：１、３日目および５日目に１：１０になる。当業者であれば、本発明における使用のために種々の他の比も好適であることが認識されよう。特に、比は粒子サイズならびに細胞のサイズおよび型に応じて変動することになる。一態様では、使用のための最も典型的な比は１日目で１：１、２：１、および３：１の近辺である。

本発明のさらなる態様では、Ｔ細胞等の細胞は薬剤でコートされたビーズと組み合わされ、続いてビーズと細胞が分離され、次いで細胞が培養される。代替の態様では、培養に先立って薬剤でコートされたビーズと細胞は分離されず、ともに培養される。さらなる態様では、磁力等の力の印加によってビーズと細胞が最初に濃縮され、細胞表面マーカーのライゲーションの増大がもたらされ、それにより細胞の刺激が誘起される。

ＣｏＳｔＡＲ細胞の調製
ウイルス系および非ウイルス系の遺伝子操作ツールを使用してＣｏＳｔＡＲ Ｔ細胞を産生し、治療用遺伝子の永久的または一時的な発現をもたらすことができる。レトロウイルス系遺伝子送達はよく特徴付けられ成熟した技術であり、ＣＡＲを宿主細胞のゲノムに永久的に一体化するために使用されてきた（Scholler J., e.g. Decade-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T cells. Sci. Transl. Med. 2012;4:132ra53、Rosenberg S.A. et al., Gene transfer into humans-immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. N. Engl. J. Med. 1990;323:570-578）。

非ウイルスＤＮＡトランスフェクション法も使用することができる。例えば、Singhらは、ＣＡＲ Ｔ細胞を操作するために開発され、臨床試験（例えばClinicalTrials.gov: NCT00968760 およびNCT01653717を参照）において使用されているスリーピングビューティ（ＳＢ）トランスポゾンシステムの使用を記載している（Singh H., et al., Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 2008;68:2961-2971）。同じ技術がＣｏＳｔＡＲ細胞を操作するために適用可能である。

トランスジーンを送達するために多種のＳＢ酵素が使用されてきた。Matesは、第１世代のトランスポザーゼと比較してほぼ１００倍の効率増強を有する超活性トランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）を記載している。ＳＢ１００Ｘは、造血幹細胞または前駆細胞を富化したヒトＣＤ３４（＋）細胞において３５～５０％安定な遺伝子導入を支持した（Mates L. et al., Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat. Genet. 2009;41:753-761）。多種のトランスジーンを、マルチシストロン性の単一のプラスミド（例えばThokala R. et al., Redirecting specificity of T cells using the Sleeping Beauty system to express chimeric antigen receptors by mix-and-matching of VL and VH domains targeting CD123+ tumors. PLoS ONE. 2016;11:e0159477）または多種のプラスミド（例えばHurton L.V. et al., Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016;113:E7788-E7797）から送達することができる。そのようなシステムを本発明のＣｏＳｔＡＲとともに使用することができる。

Moritaらは、より大きなトランスジーンを一体化するためのピギーバックトランスポゾンシステムを記載している（Morita D. et al., Enhanced expression of anti-CD19 chimeric antigen receptor in piggyBac transposon-engineered T cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2017;8:131-140）。NakazawaらはＨＥＲ２特異的キメラ抗原受容体を発現するＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を産生するシステムの使用を記載している（Nakazawa Y et al, PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 2011;19:2133-2143）。Manuriらは、ＣＤ－１９特異的Ｔ細胞を産生するシステムを使用した。（Manuri P.V.R. et al., piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 2010;21:427-437）。
トランスポゾン技術は容易で経済的である。１つの潜在的な欠点は、現在採用されている長い増殖プロトコールが、Ｔ細胞の分化、活性の低下、および注入された細胞の持続性の低さをもたらし得ることである。Monjeziらは、高効率の一体化によってこれらの難点を最小化するミニサークルベクターの開発を記載している（Monjezi R. et al., Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 2017;31:186-194）。これらのトランスポゾン技術を、本発明のＣｏＳｔＡＲに使用することができる。

医薬組成物
本発明はまた、本発明のベクターまたはＣｏＳｔＡＲ発現細胞を薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤、および任意に１つもしくは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物とともに含む医薬組成物に関する。
一部の実施形態では、上記のＣｏＳｔＡＲおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれかによるＣｏＳｔＡＲをコードする核酸および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、上記のＣｏＳｔＡＲを発現するエフェクター細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。そのような製剤は、例えば静脈内注入に適した形態であってよい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬学的に親和性の」は、生物学的にまたはその他に望ましくないものでない材料を意味し、例えばその材料は、顕著な望ましくない生物学的影響を惹起することなく、またはその材料が含まれる組成物の他の成分のいずれにも有害な様式で相互作用することなく、患者に投与する医薬組成物に組み込むことができる。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは毒性試験および製造試験の必要な標準に合格しており、および／または米国食品医薬品局が作成した不活性成分のガイドに含まれている。

本発明の一態様は、組換えＣｏＳｔＡＲを発現する改変されたＴ細胞の集団を提供する。好適な集団は上記の方法によって生成され得る。
改変されたＴ細胞の集団は医薬としての使用のためであってよい。例えば、本明細書に記載した改変されたＴ細胞の集団は、がんの免疫療法、例えば養子Ｔ細胞療法において使用し得る。
本発明の他の態様は、がんの治療のための医薬の製造のための本明細書に記載した改変されたＴ細胞の集団の使用、がんの治療のための本明細書に記載した改変されたＴ細胞の集団を提供し、がんの治療の方法は、本明細書に記載した改変されたＴ細胞の集団を、それを必要とする個体に投与するステップを含み得る。
改変されたＴ細胞の集団は自己であってよい。即ち、改変されたＴ細胞は、元々はそれらが引き続いて投与される同じ個体から得られたものである（即ち、ドナーおよびレシピエントの個体は同一である）。個体への投与のための改変されたＴ細胞の好適な集団は、その個体から得られたＴ細胞の初期の集団を準備するステップ、Ｔ細胞を改変してｃＡＭＰ ＰＤＥまたはその断片およびその個体のがん細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現させるステップ、ならびに改変されたＴ細胞を培養するステップを含む方法によって生成され得る。

改変されたＴ細胞の集団は同種であってよい。即ち、改変されたＴ細胞は、元々はそれらが引き続いて投与される個体とは異なる個体から得られたものである（即ち、ドナーおよびレシピエントの個体は異なっている）。ドナーおよびレシピエントの個体は、ＧＶＨＤおよびその他の望ましくない免疫的な影響を避けるためにＨＬＡが一致され得る。レシピエント個体への投与のための改変されたＴ細胞の好適な集団は、ドナー個体から得られたＴ細胞の初期の集団を準備するステップ、Ｔ細胞を改変してレシピエント個体のがん細胞に特異的に結合するＣｏＳｔＡＲを発現させるステップ、ならびに改変されたＴ細胞を培養するステップを含む方法によって生成され得る。
改変されたＴ細胞の投与に続いて、レシピエント個体はレシピエント個体のがん細胞に対するＴ細胞媒介免疫応答を呈する。これはその個体におけるがんの状態に対して有益な効果を有する。

がんの状態は悪性がん細胞の異常な増殖によって特徴付けられ、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、およびＣＬＬ等の白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫等のリンパ腫、ならびに肉腫、皮膚がん、黒色腫、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸直腸がん、頸がん、肝がん、頭頚部がん、食道がん、膵がん、腎がん、副腎がん、胃がん、睾丸がん、胆嚢および胆管のがん、甲状腺がん、胸腺がん、骨のがん、および脳がん等の固形がん、ならびに原発巣不明のがん（ＣＵＰ）を含み得る。
個体内のがん細胞は個体の正常な体細胞からは免疫学的に区別され得る（即ち、がん腫瘍は免疫原性であり得る）。例えば、がん細胞は個体内において、がん細胞によって発現される１つまたは複数の抗原に対して全身的免疫応答を誘発することができる。免疫応答を誘発する腫瘍抗原はがん細胞に特異的であってよく、またはその個体の１つもしくは複数の正常細胞によって共有され得る。
上記の治療に適した個体は哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えばマウス）、イヌ科（例えばイヌ）、ネコ科（例えばネコ）、ウマ科（例えばウマ）、霊長類、類人猿（例えばサルまたはエイプ）、サル（例えばマーモセット、ヒヒ）、エイプ（例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン、ギボン）、またはヒトであってよい。
好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療効果を示すためのモデルとして従来から使用されている哺乳動物（例えばネズミ科、霊長類、ブタ科、イヌ科、またはウサギ科の動物）が採用され得る。

治療の方法
用語「治療有効量」は、個体における疾患または障害を「治療する」ために有効な本明細書で開示したＣｏＳｔＡＲまたはＣｏＳｔＡＲを含む組成物の量を指す。がんの場合には、治療有効量の本明細書で開示したＣｏＳｔＡＲまたはＣｏＳｔＡＲを含む組成物は、がん細胞の数を低減させ、腫瘍の大きさもしくは質量を低減させ、周囲臓器へのがん細胞の浸潤を阻止し（即ち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ）、腫瘍の転移を阻止し（即ち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ）、腫瘍の成長をある程度阻止し、および／またはがんに付随する症状の１つまたは複数をある程度緩和することができる。本明細書で開示したＣｏＳｔＡＲまたはＣｏＳｔＡＲを含む組成物は、存在するがん細胞の成長を防止しおよび／または殺滅することができる程度に、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。一部の実施形態では、治療有効量は増殖阻止量である。一部の実施形態では、治療有効量は患者の無増悪生存率を改善する量である。ウイルス感染のような感染性疾患の場合には、治療有効量の本明細書で開示したＣｏＳｔＡＲまたはＣｏＳｔＡＲを含む組成物は、病原体に感染した細胞の数を低減し、病原体に誘導された抗原の生成もしくは放出を低減し、未感染細胞への病原体の拡散を阻止し（即ち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ）、および／または感染に付随する１つまたは複数の症状をある程度緩和することができる。一部の実施形態では、治療有効量は患者の生存を延長する量である。

本発明の方法における使用のためのＣｏＳｔＡＲを発現するＴ細胞およびＮＫ細胞を含む細胞は、患者自身の末梢血から（自己）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の設定で（同種）、または関係のないドナーからの末梢血から（同種）、ｅｘ ｖｉｖｏで創成され得る。あるいは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、誘起可能な前駆細胞または胚前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ分化によって誘導され得る。これらの場合には、ＣｏＳｔＡＲならびに任意にＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するＴ細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡもしくはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段の１つによって、ＣｏＳｔＡＲならびに任意にＣＡＲおよび／またはＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって、産生される。
本発明のＣｏＳｔＡＲを発現し、かつ任意にＴＣＲおよび／またはＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、血液がんまたは固形腫瘍の治療に使用され得る。

疾患を治療する方法は、本発明のベクターまたはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を含む細胞の治療用途に関する。これに関して、ベクターまたはＴ細胞もしくはＮＫ細胞は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を減少させ、低減し、または改善するために、および／または疾患の進行を遅らせ、低減し、または阻止するために、存在する疾患または状態を有する対象に投与され得る。本発明の方法は、Ｔ細胞に媒介されるがん細胞の殺滅を惹起しまたは促進し得る。本発明によるベクターまたはＴ細胞もしくはＮＫ細胞は、１つまたは複数のさらなる治療剤とともに、患者に投与され得る。１つまたは複数のさらなる治療剤は、患者に共投与され得る。「共投与」は、１つまたは複数のさらなる治療剤と本発明のベクターまたはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を時間的に十分近く投与し、それによりベクターまたはＴ細胞もしくはＮＫ細胞が１つまたは複数のさらなる治療剤の効果を増強し得るようにすること、またはその逆を意味する。これに関し、ベクターまたは細胞を最初に投与し、１つまたは複数のさらなる治療剤を２番目に投与すること、またはその逆ができる。あるいは、ベクターまたは細胞と１つまたは複数のさらなる治療剤とを同時に投与することができる。１つの共投与される有用な治療剤はＩＬ－２である。それは、現在の細胞療法において投与された細胞の活性を強化するためにこれが現在使用されているからである。しかし、ＩＬ－２治療には毒性および耐性の問題が付随している。

既述のように、患者への投与については、ＣｏＳｔＡＲエフェクター細胞は患者にとって同種または自己であり得る。ある特定の実施形態では、同種細胞は、ＧＶＨＤおよび／またはＣｏＳｔＡＲ細胞に対する患者の免疫応答を最小化または防止するために、例えば遺伝子編集によってさらに遺伝子改変される。
ＣｏＳｔＡＲエフェクター細胞は、標的抗原に関連するがんおよび新生物疾患を治療するために使用される。本明細書に記載した方法のいずれかを使用して治療され得るがんおよび新生物疾患には、血管新生されていない腫瘍、まだ実質的に血管新生されていない腫瘍、ならびに血管新生された腫瘍が含まれる。がんは非固形腫瘍（血液系腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫）を含み、または固形腫瘍を含み得る。本発明のＣｏＳｔＡＲエフェクター細胞によって治療されるべきがんの型には、それだけに限らないが、癌腫、芽細胞腫、および肉腫、ならびにある種の白血病またはリンパ性悪性疾患、良性および悪性の腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれる。成人の腫瘍／がんおよび小児の腫瘍／がんも含まれる。
血液系のがんは、血液または骨髄のがんである。血液系（または造血系）のがんには、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤血球性の白血病等）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病等）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（不活性および高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンストロームのマクログロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、および骨髄異形成が含まれる。

固形腫瘍は、通常は嚢胞または液体区域を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍は良性または悪性であり得る。様々な型の固形腫瘍がそれらを形成する細胞の型によって命名されている（肉腫、癌腫、およびリンパ腫等）。肉腫および癌腫等の固形腫瘍の例には、副腎皮質癌、胆管癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、およびその他の肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、エウィング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、胃がん、リンパ系悪性腫瘍、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、幹細胞癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺がん（例えば髄様甲状腺癌および乳頭甲状腺癌）、褐色細胞腫、脂肪腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムズ腫瘍、頸がん（例えば頸癌および前侵襲性頸部異形成）、結腸直腸がん、肛門、肛門管、もしくは肛門直腸のがん、膣がん、陰門のがん（例えば扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、および線維肉腫）、陰茎がん、口腔咽頭がん、食道がん、頭部がん（例えば扁平上皮細胞癌）、頸部がん（例えば扁平上皮細胞癌）、睾丸がん（例えば精上皮腫、奇形腫、胎児性癌、奇形癌、絨毛腫、肉腫、ライディッヒ細胞腫瘍、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、および脂肪腫）、膀胱癌、腎がん、黒色腫、子宮のがん（例えば内膜癌）、尿路上皮がん（例えば扁平上皮細胞癌、移行細胞癌、腺癌、尿管がん、および尿膀胱がん）、ならびにＣＮＳ腫瘍（例えば神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫等）、神経膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られている）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、クラニオファリンジオーマ、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、メナンジオーマ、神経芽腫、網膜芽細胞腫、および脳転移）が含まれる。

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻止有効量」、または「治療量」が指示された場合には、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染もしくは転移の程度、および状態における個人差を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載したＴ細胞を含む医薬組成物は、これらの範囲内のすべての整数値を含んで体重１ｋｇあたり１０⁴～１０⁹細胞、一部の場合には体重１ｋｇあたり１０⁵～１０⁶細胞の用量で投与できることが一般に述べられる。Ｔ細胞組成物はこれらの用量で複数回、投与してもよい。細胞は免疫療法において一般に知られている注入手法を使用して投与することができる（例えばRosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。

組合せ療法
本明細書に記載したＣｏＳｔＡＲを発現している細胞は、他の公知の薬剤および療法と組み合わせて使用してよい。本明細書で使用される場合、「組み合わせて」投与されることは、２つ（またはそれ以上）の異なる治療が、障害による対象の苦痛の経過の間に対象に送達されること、例えば２つまたはそれ以上の治療が、対象がその障害を有していると診断された後、かつその障害が治癒されもしくは除去される前または治療が他の理由によって中止される前に、送達されることを意味する。一部の実施形態では、１つの治療の送達は第２の治療の送達が始まる際にまだ行なわれており、そのため投与に関して重複がある。これは本明細書において「同時」または「並行送達」と称する場合がある。他の実施形態では、１つの治療の送達は、他の治療の送達が始まる前に終わる。いずれの場合の一部の実施形態でも、組合せ投与であるので治療はより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば第２の治療を少なくしても等価の効果が見られ、あるいは、第２の治療は、第１の治療なしに第２の治療が与えられた場合、または第１の治療で類似の状況が見られた場合に見られるよりも大幅に症状を低減する。一部の実施形態では、送達は、症状または障害に関連する他のパラメーターの低減が他の治療なしに１つの治療が送達された場合に観察されるよりも大きくなるようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的よりも大きいことがある。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達されたときにまだ検出可能であるようなものであってよい。

本明細書に記載したＣｏＳｔＡＲ発現細胞と少なくとも１つのさらなる治療剤とは、同時に、同じもしくは個別の組成物中で、または逐次的に、投与することができる。逐次的投与のため、本明細書に記載したＣＡＲ発現細胞を最初に投与し、さらなる薬剤を２番目に投与することができ、投与の順序を逆にすることもできる。
ＣｏＳｔＡＲ療法および／またはその他の治療剤、手順、もしくは手段は、活性な障害の期間の間に、または寛解もしくはより不活性な疾患の期間の間に、投与することができる。ＣｏＳｔＡＲ療法は、他の治療の前に、治療と同時に、治療の後に、または障害の寛解の間に、投与することができる。

組み合わせて投与する場合は、本療法およびさらなる薬剤（例えば第２または第３の薬剤）、またはそのすべては、個別に例えば単独療法として使用するそれぞれの薬剤の量または用量より多く、少なく、または等しい量または用量で投与してよい。ある特定の実施形態では、ＣｏＳｔＡＲ療法、さらなる薬剤（例えば第２または第３の薬剤）、またはそのすべての投与される量または用量は、個別に例えば単独療法として使用するそれぞれの薬剤の量または用量より（例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）少ない。他の実施形態では、所望の効果（例えばがんの治療）をもたらすＣｏＳｔＡＲ療法、さらなる薬剤（例えば第２または第３の薬剤）、またはそのすべての量または用量は、同じ治療効果を達成するために必要な、個別に例えば単独療法として使用するそれぞれの薬剤の量または用量より（例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）少ない。
さらなる態様では、本明細書に記載したＣｏＳｔＡＲ発現細胞は、手術、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６等の免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体療法等の他の免疫切除剤、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに放射線、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載されているようなペプチドワクチンと組み合わせた治療レジメンにおいて使用し得る。

ある特定の例では、本発明の化合物は、他の抗がん剤、抗アレルギー剤、抗吐剤（または抗嘔吐剤）、疼痛軽減剤、細胞保護剤、およびそれらの組合せ等の他の治療剤と組み合わせられる。
一実施形態では、本明細書に記載したＣｏＳｔＡＲ発現細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。例示的な化学療法剤には、アンスラサイクリン（例えばドキソルビシン（例えばリポソーマルドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イフォスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えばアレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ）、代謝拮抗物質（例えば葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えばフルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘起ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えばアクラシノマイシンＡ、グリオトキシン、またはボルテゾミブ）、サリドマイドもしくはサリドマイド誘導体（例えばレナリドマイド）等の免疫調節剤が含まれる。

組合せ療法における使用のために考慮される一般的な化学療法剤には、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダウノルビシン塩酸（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンシトラートリポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドキソルビシン塩酸（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、フルダラビンリン酸（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））が含まれる。

実施形態では、組合せ療法における使用のために考慮される一般的な化学療法剤には、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、ダウノルビシン塩酸（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンシトラートリポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、フルダラビンリン酸（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５－フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ－アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６－メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、ミロタルグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロサン２０とカルムスチンインプラント（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、タモキシフェンシトラート（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、トポテカン塩酸注射用（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が含まれる。
治療は、例えば腫瘍の退縮、腫瘍の質量もしくは寸法の縮小、進行の時間、生存の継続期間、無増悪生存率、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現、および／または活性によって評価することができる。例えば放射線イメージングによる応答の測定を含む、治療の有効性を判定するアプローチを採用することができる。

本発明を以下の非限定的な節においてさらに説明する。
１．腫瘍関連抗原特異的結合ドメインと融合させた完全長の共刺激受容体を含むキメラ共刺激受容体（ＣｏＳｔＡＲ）であって、完全長が、リーダー配列を欠き成熟タンパク質のＮ最末端における５アミノ酸までの欠失または変異を有する成熟タンパク質全体を意味しており、プロセスが共刺激ドメインのキメラ受容体への最適のスプライシングのために重要である、キメラ共刺激受容体。
２．前記共刺激受容体が、ＣＤ２、ＣＤ９、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、またはＥｐｈＢ６の群から選択される、節１に記載のＣｏＳｔＡＲ。
３．共刺激ドメインが、単一の受容体フォーマットと融合させた２つ以上の共刺激受容体ドメインからなり、結合領域が、直接融合であるか、または長さが５０アミノ酸までのリンカー等のリンカー領域を含む、節１または２に概略を示したＣｏＳｔＡＲ融合受容体。

４．前記抗原特異的結合ドメインが、
Ｉ．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、５Ｔ４、メラノトランスフェリン（ＣＤ２２８）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ／ＣＳＰＧ４）、ＣＤ７１、葉酸受容体、もしくはＣＡ１２５を含むがこれらに限定されない腫瘍関連抗原に結合する一本鎖抗体断片、または
ＩＩ．腫瘍特異的ペプチド（ｐ）－主要組織適合性（ＭＨＣ）複合体に結合する一本鎖抗体断片、または
ＩＩＩ．腫瘍特異的ｐＭＨＣ複合体抗原特異的一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）、または
ＩＶ．トランスフェリン等であるがこれに限定されない天然の抗原結合性ポリペプチド、または
Ｖ．抗体に結合するドメイン（例えばＣＤ１６、ＣＤ３２、またはＣＤ６４等であるがこれらに限定されないＦｃ結合ドメイン）、またはその他の抗原認識の間接的な方法
から誘導される、節１～３のいずれか１項に記載のＣｏＳｔＡＲ。

５．マーカー遺伝子（例えばＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）エピトープタグ、ＣＤ３４、ＣＤ１９等）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または養子細胞療法のための免疫療法用の別の受容体等の目的のタンパク質（ＰＯＩ）と融合っせた、節１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
６．前記ポリペプチドと前記目的のタンパク質との間に自己切断性ペプチドを含む、節５に記載の融合タンパク質。
７．Ｉ．節１および２に記載の、例えば配列番号２で示されるもの、もしくはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどのポリペプチドをコードすることができる配列番号１で示されるもの、または
ＩＩ．節５に記載の、例えば配列番号３～１２で示されるもの、もしくはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等のペプチドと融合させた配列番号２に示されるものなどの、融合タンパク質、
などの核酸配列。
８．節７に記載の核酸配列を含むベクター。
９．目的のトランスジーンも含む、節８に記載のベクター。
１０．前記ベクターが標的細胞に形質導入するために使用される場合に、前記標的細胞が、節１に記載のポリペプチドとキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、もしくは免疫療法目的の別の受容体とを共発現するように、目的のトランスジーンが、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、もしくは養子細胞療法のための免疫療法用の別の受容体をコードする、節９に記載のベクター。

１１．節１に記載のポリペプチドを発現する細胞。
１２．節１に概略を示したポリペプチドとＰＯＩを細胞表面で共発現する、節１１に記載の細胞。
１３．節７に記載の核酸配列を含む細胞。
１４．Ｔ細胞である、節１１～１３のいずれか１項に記載の細胞。
１５．節８～１０のいずれか１項に記載のベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップを含む、節１１～１４のいずれか１項に記載の細胞を作成する方法。
１６．ＰＯＩを発現する細胞を選択する方法であって、
Ｉ．節１０に記載のベクターをトランスフェクトまたは形質導入した細胞の表面におけるＰＯＩエピトープの発現を検出するステップ、および
ＩＩ．前記ＰＯＩエピトープを発現すると同定される細胞を選択するステップ
を含む、方法。
１７．ＰＯＩを発現する細胞が富化された、精製された細胞の集団を調製する方法であって、
節１６に記載の方法を使用して、細胞の集団からＰＯＩを発現する細胞を選択するステップを含む、方法。

１８．組織または細胞のドナーから単離された細胞の集団に、ｅｘ ｖｉｖｏで、
Ｉ．節７に記載のベクターを、形質導入またはトランスフェクトするステップ、および
ＩＩ．節１６に記載の方法によって、前記形質導入／トランスフェクトされた細胞の集団から前記ＰＯＩを発現する細胞を選択するステップ
を含む、節１７に記載の方法。
１９．節１に記載のポリペプチドを発現する細胞が富化された、したがって、ＰＯＩを発現する細胞が富化された、細胞集団。
２０．形質導入された細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて追跡する方法であって、前記細胞の表面における節１に記載のポリペプチドの発現を検出するステップを含む、方法。
２１．対象における疾患を治療する方法であって、節１１～１４のいずれか１項に記載の細胞または節１９に記載の細胞集団を対象に投与するステップを含む、方法。
２２．Ｉ．節９に記載のベクターを対象から単離した細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトするステップ、および
ＩＩ．形質導入／トランスフェクトされた細胞を患者に返すステップ
を含む、節２１に記載の方法。

２３．がんを処置するための、節２２に記載の方法。
２４．養子細胞移植における使用のための、節１１～１４のいずれか１項に記載の細胞または節１９に記載の細胞集団。
２５．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号４で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＣＤ１３７からの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
２６．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号５で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＣＤ１３４からの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。

２７．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号６で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＣＤ２からの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
２８．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号７で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＣＤ２９からの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。

２９．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号８で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＧＩＴＲからの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
３０．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号９で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＩＬ２Ｒγからの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。

３１．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号１０で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＣＤ４０からの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
３２．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号１１で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＣＤ１５０からの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。

３３．節４に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインからなるＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、完全長のヒトＣＤ２８からなる融合シグナル伝達ドメイン、および
ＩＩ．配列番号１２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、ヒトＣＤ２およびヒトＣＤ４０からの細胞内ドメイン
と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。

本発明は、以下の非限定的実施例でさらに実証される。
（実施例１）
ＣｏＳｔＡＲを発現するＴ細胞の作製
材料および方法
構築物設計－ＭＦＥ２３ ＣｏＳｔＡＲは、全体のヒトＣＤ２８核酸配列と融合させているオンコスタチンＭ１リーダー配列を有する、ＭＦＥ２３由来の単鎖抗体断片ヌクレオチド配列からなる。ＣｏＳｔＡＲヌクレオチド配列はコドン最適化され、遺伝子はＧｅｎｅｗｉｚ社によって合成された。構築物は、ＸｂａＩおよびＮｈｅＩ部位を通して、ｐＳＦ．Ｌｅｎｔｉ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）にクローニングした。
レンチウイルス作製－レンチウイルス作製は、各プラスミド１０μｇと導入遺伝子を含有するｐＳＦ．Ｌｅｎｔｉレンチウイルスプラスミド１０μｇとを、５０ｍＭ ＣａＣｌ₂を含有する無血清ＲＰＭＩの中で一緒に混合することによって、３プラスミドパッケージングシステム（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して実行した。混合物は、７５ｃｍ²フラスコの中の２９３Ｔ細胞の５０％集密単層に滴下した。トランスフェクションの４８および７２時間後にウイルス上清を収集し、プールし、ＬｅｎｔｉＰａｃレンチウイルス上清濃縮（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）溶液を製造業者の使用説明書通りに使用して濃縮した。レンチウイルス上清を１０倍に濃縮し、４μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）の存在下で一次ヒトＴ細胞を直接的に感染させるために使用した。末梢血単核細胞を正常健康なドナーから単離し、その後製造業者の使用説明書によりＴ細胞活性化および増量ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２４時間活性化し、その後レンチウイルス上清を加えた。

ＣＥＡ．ｈＦｃタンパク質および抗ｈＦｃ－ＰＥ二次抗体と抗ＣＤ３４－ＡＰＣを使用して、または抗ＣＤ３４－ＰＥ抗体だけによって、感染の９６時間後に細胞の形質導入を調査した。次に、１μｇ／ｍｌ ＰＨＡおよび２００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加したＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で×１０のドナーミスマッチ照射ＰＢＭＣフィーダーを１：２０～１：２００比で使用して、細胞をさらに増量した。１４日後に、細胞を以前のように染色し、アッセイで使えるように保存した。
ＣｏＳｔＡＲに陽性または陰性の細胞を野生型またはＯＫＴ３工学操作ＣＥＡ陽性ＬｏＶｏまたはＬＳ１７４Ｔ細胞と混合することによって、機能アッセイを実行した。簡潔には、Ｔ細胞を９６ウェルプレートの中で様々な比のＬｏＶｏ細胞と混合し、ＩＦＮγまたはＩＬ－２をＥＬＩＳＡによって測定した。残りの細胞は、１：１０希釈のＷＳＴ－１試薬（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）と３０分間インキュベートし、その後４５０ｎｍで吸光度を読み取った。細胞傷害％は、以下の式＝１００－（（実験読取値－Ｔ細胞単独）／（腫瘍単独）×１００を使用して決定した。

最初に１×１０⁷細胞数／ｍｌの濃度でＴ細胞に１０μＭ ｅＦｌｕｏｒ４５０増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を３７℃で１０分間ロードし、その後細胞を５容量の冷Ｔ細胞培地と氷上で５分間インキュベートすることによって増殖アッセイを実行した。次に未結合の色素を取り除くために細胞を過度に洗浄し、腫瘍細胞を含有する共培養に加えた。２、６および１０日目に細胞を取り出し、１：２００希釈のＤＲＡＱ７を加え、ＭＡＣＳＱｕａｎｔサイトメーターおよびＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェアを使用して細胞を分析した。
増殖アッセイのための細胞計数は、細胞をウェルから取り出し、抗ＣＤ２ ＰｅｒＣＰ ｅＦｌｕｏｒ７１０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）により暗所で２０分間染色し、続いてＤＲＡＱ７で染色することによって実行し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置を使用して計数した。

結果－一次ヒトＴ細胞は、ＮＨＳＢＴから得得られたバフィーコートから単離した。Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ媒介単離およびＴ細胞の負単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって単離した。単離したＴ細胞は、ヒトＴ細胞活性化および増量ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）で活性化した。細胞を濃縮したレンチウイルス粒子とインキュベートし、数日にわたって増量した。レンチウイルスは、ＭＦＥ．ＣｏＳｔＡＲ．２Ａ．ｔＣＤ３４構築物のＤＮＡ配列を含有した（２Ａ切断配列を通してトランケーションされたヒトＣＤ３４と同時発現される完全長ヒトＣＤ２８と融合させているＭＦＥ２３．ｓｃＦｖ）。首尾よく形質導入された細胞は、材料および方法で概説される照射フィーダーを使用してさらに増量した。ドナー１の形質導入は２２．６９％（１７．１５のＣＤ３４＋／ＣｏＳｔＡＲ＋プラス５．５３％のＣＤ３４－／ＣｏＳｔＡＲ＋）と測定され、ドナー２は２０．７３％と測定され、ドナー３は１３．３４％と測定された。９０％を超えてＣｏＳｔＡＲ陽性であるＴ細胞集団を得るために、抗ＣＤ３４抗体を使用してＣｏＳｔＡＲ発現のために細胞を富化した。
Ｔ細胞活性に及ぼすＣｏＳｔＡＲの影響を試験するために生理的に関連するｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを生成するために、非形質導入および形質導入細胞をＣＥＡ＋腫瘍細胞系ＬｏＶｏおよびＬＳ１７４Ｔに対して試験した。マッチしない腫瘍系に応答したＴ細胞の活性化を可能にするために、フローサイトメトリーを使用して形質導入細胞を可視化するために、ＩＲＥＳエレメントを使用して、合成膜貫通ドメインを通して細胞膜に固着し、ＧＦＰマーカー遺伝子から分断される抗ＣＤ３単鎖抗体断片を発現するように、我々は腫瘍細胞を工学操作した。

ＬｏＶｏおよびＬＳ１７４Ｔの単細胞クローンを、バルクトランスフェクタントから生成した。非形質導入およびＣｏＳｔＡＲ形質導入Ｔ細胞を、様々なエフェクター対標的比で野生型非形質導入またはＯＫＴ３工学操作ＬＳ１７４ＴまたはＬｏＶｏ細胞と混合した。２４時間後に、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ測定のために共培養培地をとった。３人のドナーからのＣｏＳｔＡＲ＋およびＣｏＳｔＡＲ－Ｔ細胞集団から、ＯＫＴ３工学操作ＬＳ１７４Ｔ細胞に応答して活性化依存性ＩＬ－２分泌が観察され、非工学操作腫瘍細胞に応答した形質導入および非形質導入Ｔ細胞からはバックグラウンドＩＬ－２分泌だけが見られた（図３Ａ～Ｃ）。ＯＫＴ３工学操作腫瘍細胞に対するＣｏＳｔＡＲ強化ＩＬ－２分泌は、試験した全ての３人のドナーで見出された。効果は８：１および１６：１のＥ：Ｔ比で最も明白であったが、より高いＥ：Ｔ比ではＩＬ－２分泌は正確に測定するには低すぎた。より低いエフェクター対標的比では、ＩＬ－２分泌は非形質導入細胞から飽和していたようであった。これらの観察はＬｏＶｏ細胞で繰り返され、３人のドナーのうちの２人はＬＳ１７４Ｔに対して試験され、結果は類似していた（図３ＤとＥ）。
Ｔ細胞増量に及ぼすＣｏＳｔＡＲの影響を決定するために、形質導入または非形質導入Ｔ細胞を野生型またはＯＫＴ３－ＧＦＰ工学操作ＬｏＶｏ細胞と混合し、３日後の全細胞数を数えた。ＣｏＳｔＡＲは、ＩＬ－２の存在下（図４Ａ）およびＩＬ－２の不在下（図４Ｂ）で、野生型ＬｏＶｏ細胞でなくＬｏＶｏ－ＯＫＴ３に応答した工学操作Ｔ細胞の生存および／または増殖を強化した。この現象をさらに調査するために、６日間に各集団が経た細胞周期の数を数えるために、増殖色素を使用して２人のドナーからのＴ細胞で細胞増殖分析を実行した（図４ＣとＤ）。非工学操作細胞と比較して、ＬｏＶｏ－ＯＫＴ３に応答して６日間にＣｏＳｔＡＲ工学操作細胞のより大きな割合が５、６または７増殖周期を経たが、ＣｏＳｔＡＲ形質導入および非形質導入細胞は野生型ＬｏＶｏに応答して同じ期間に平均概ね２周期を経た。

Ｎ末端の追加の共刺激ドメインと融合させているＣＤ２８からなる様々な融合受容体を作製した。ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ２９、ＣＤ１３４、ＣＤ１５０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲから得られた共刺激ドメイン、およびＩＬ－２受容体γ鎖（ＩＬ２Ｒγ）からのシグナル伝達ドメインを選択した。誘導可能な共刺激の以前の研究で使用されたものに近い受容体が含まれた。ＣＤ２８（ＩＥＶ）と命名されたこの受容体は、ＣＤ２８のＣ末端モチーフがアミノ酸三つ組「ＩＥＶ」であるようにトランケーションされる。配列がＧｅｎｅｗｉｚによって新規に作製され、２Ａ自己切断ペプチドによって融合ＣｏＳｔＡＲから分離されるＣＤ３４マーカー遺伝子と一緒に、ＥＦ１αプロモーターの下にレンチウイルスベクターの中にクローニングした。ＥａｓｙＳｅｐビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して一次ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化／増量Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化し、その後レンチウイルス粒子を添加した。短い増量期間の後、細胞をＬｏＶｏまたはＬｏＶｏ－ＯＫＴ３細胞と混合し、抗ＣＤ１０７ａ抗体およびブレフェルジンおよびモネンシンが含まれ、１６時間のインキュベーションの後に固定し、マーカー遺伝子（ＣＤ３４）に対する抗体ならびにＩＬ－２、ＩＦＮγおよびｂｃｌ－ｘＬに対する抗体で染色した。分析は、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置およびＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェアを使用して実行した。図５は、ＣＤ３４－（ＣｏＳｔＡＲ非形質導入）およびＣＤ３４＋（ＣｏＳｔＡＲ形質導入）からのＩＬ－２応答を示す。統計分析は、試験した全ての受容体が変異体ＣｏＳｔＡＲ受容体を含むときにＩＬ－２を生成する細胞の割合の有意な増加を誘導することを実証した。３つの他の読取データを同時に測定した：ＩＦＮγ、正常なシグナル１条件下で放出されるが共刺激によって増強されるサイトカイン；ＣＤ１０７ａ、脱顆粒のマーカー；およびｂｃｌ－ｘＬ、共刺激によって上方制御される抗アポトーシスタンパク質。ＣｏＳｔＡＲの組込みは、分析した全てのエフェクター機能を様々な程度で増強した。ＣＤ２８．ＣＤ２およびＣＤ２８．ＣＤ４０融合受容体は、試験した全ての受容体のうちで最も頑強な応答を導き出すようであった（図６を参照する）。

（実施例２）
集団ベースのサイトカイン分泌に及ぼすＣＤ２８およびＣＤ２８．ＣＤ４０ベースのＣｏＳｔＡＲの影響を比較した。３人のドナーからの一次Ｔ細胞を、ＣＤ２８（ＩＥＶ）トランケーションＣｏＳｔＡＲ、完全長ＣＤ２８ ＣｏＳｔＡＲまたはＣＤ２８．ＣＤ４０ ＣｏＳｔＡＲ（配列番号１０に示す完全長ＣＤ２８を有するが、Ｎ末端のＮおよびＫ残基が欠如する）で形質導入したか、非形質導入のままであった。ＣＤ３４マーカー遺伝子を使用してＴ細胞をＣｏＳｔＡＲ発現のために富化し、増量後、細胞をＬｏＶｏ－ＯＫＴ３細胞と混合し、ＩＬ－２分泌をＥＬＩＳＡによって分析した（図７を参照する）。非形質導入細胞は平均して０．８０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２を生成し、ＣＤ２８（ＩＥＶ）および完全長ＣＤ２８ＣｏＳｔＡＲはそれぞれ４．６および５．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２を生成した。しかし、ＣＤ２８．ＣＤ４０は３人のドナーの平均で２９．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２を誘導し、したがって、ＣＤ４０を基本的ＣＤ２８ベースのＣｏＳｔＡＲに組み込むことの明らかな利点を実証する。

次に、Ｔ細胞増量に及ぼすＣｏＳｔＡＲの影響を分析した。７人のドナーからのＴ細胞を、抗ＣＡ１２５（１９６－１４）または葉酸拮抗受容体（ＭＯＶ－１９）ｓｃＦｖ、または葉酸拮抗受容体ペプチド（Ｃ７）抗原結合性ドメインを有するＣＤ２８またはＣＤ２８．ＣＤ４０ ＣｏＳｔＡＲで形質導入した。ミスマッチ対照として抗ＣＥＡ ｓｃＦｖを持つＣＤ２８ ＣｏＳｔＡＲで追加の細胞を形質導入した。次に、細胞を膜結合ＯＫＴ３（ＯｖＣＡＲ－ＯＫＴ３）を発現するように工学操作したＣＡ１２５＋／葉酸受容体＋／ＣＥＡ－細胞系ＯｖＣＡＲ３と混合した。７、１４および２１日後にＴ細胞数を数え、７および１４日目に新鮮なＯｖＣＡＲ－ＯＫＴ３を加えた。抗ＣＡ１２５ ｓｃＦｖを含んでいる細胞の限定的増量が観察されたが（平均増量倍率：ＣＤ２８：１５．１；ＣＤ２８．ＣＤ４０：６９．１）、ｓｃＦｖを有する葉酸受容体を標的にする細胞はＣＤ２８およびＣＤ２８．ＣＤ４０コホートの両方で増量した（平均増量倍率：ＣＤ２８：１８６．７；ＣＤ２８．ＣＤ４０：１２９５．０）。葉酸受容体を標的にするためにＣ７ペプチドを使用したとき、より限定された増量が見られた（平均増量倍率：ＣＤ２８：７１．５；ＣＤ２８．ＣＤ４０：２８．０）。対照のＣＥＡ標的化受容体は、限定された増量を実証した（平均増量倍率：２８．０）。

シグナル１およびシグナル２の相乗効果をより良好に理解するために、Ｔ細胞をＨＬＡ－Ａ＊０２の関連でＣＥＡペプチド（６９１～６９９）を認識するマウスの定常ドメイン改変ＴＣＲ、ならびに細胞表面ＣＥＡタンパク質を標的にするＣＤ２８またはＣＤ２８．ＣＤ４０ ＣｏＳｔＡＲで工学操作した。対照として、細胞をＣＡ１２５特異的ＣＤ２８ ＣｏＳｔＡＲでも形質導入した。Ｔ細胞をＨＬＡ－Ａ＊０２＋／ＣＥＡ＋ Ｈ５０８細胞と混合し、サイトカイン生成は細胞内フローサイトメトリー染色によって分析した。マウスのＴＣＲβ定常ドメインに対する抗体（ＴＣＲ工学操作細胞をマークする）ならびにＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）エピトープタグ（ＣｏＳｔＡＲ工学操作細胞をマークする）を使用して、フローサイトメトリーゲーティングを実行した。したがって、各共培養ウェルでＴＣＲ－／ＣｏＳｔＡＲ－、ＴＣＲ＋／ＣｏＳｔＡＲ－、ＴＣＲ－／ＣｏＳｔＡＲ＋およびＴＣＲ＋／ＣｏＳｔＡＲ＋細胞を分析することが可能であった。次に、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞においてサイトカイン生成を各亜集団でプロットした（図９）。ＣＤ４＋細胞では、ＣＤ２８．ＣＤ４０ ＣｏＳｔＡＲは、ＴＣＲ刺激単独より強くＣＤ１３７およびＴＮＦα生成を増強したが、ＣＤ４＋細胞におけるＴＣＲ応答は、ＣＤ８へのＴＣＲの依存性のために劣っていた。ＣＤ８＋細胞ではより頑強なエフェクター活性がＩＬ－２であり、特にＣＤ１０７ａはＣＤ２８．ＣＤ４０ ＣｏＳｔＡＲ群でより強力な誘導を示した。受容体をより良好に比較するために、ＴＣＲ＋／ＣｏＳｔＡＲ＋群でのエフェクター活性をＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞でプロットした（図１０）。ＣＤ４＋細胞では、ＣＤ１３７の誘導は、ＣＥＡまたはミスマッチ標的化ＣＤ２８ ＣｏＳｔＡＲと比較してＣＤ２８．ＣＤ４０によって有意に増強された。ＣＤ８＋細胞では、ＣＤ１３７の誘導は、ＣＥＡまたはミスマッチ標的化ＣＤ２８ ＣｏＳｔＡＲと比較して有意に増加したが、ＣＤ１０７ａの誘導は対照ＣｏＳｔＡＲと比較して増加した。したがって、ＣＤ２８．ＣＤ４０は広い範囲のモデルおよびエフェクター活性にわたって増強されたエフェクター活性を示す。

参考文献

配列
配列番号１：全体のヒトＣＤ２８ｍＲＮＡ転写物変異体転写物、読取り枠は太字で強調される。
遺伝子座 ＮＭ＿００６１３９ ４９００ｂｐ ｍＲＮＡ 線状 ＰＲＩ ０７－ＯＣＴ－２０１６
定義 Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、転写物変異体１、ｍＲＮＡ。
受託 ＮＭ＿００６１３９
起源

配列番号２：ヒトＣＤ２８タンパク質配列：
Ｉ．シグナルペプチドは太字で強調される（本発明によって使用されるとき、これは配列から欠失してもよい）；および
ＩＩ．膜貫通領域は下線付き；および
ＩＩＩ．細胞外領域はシグナルペプチドと膜貫通領域の間にあり、細胞質領域は膜貫通領域に続く；および
ＩＶ．ボックス領域は成熟タンパク質の最初の５アミノ酸を表し、それは本発明の任意の態様で存在するか、不在であるかまたは突然変異していてもよい。さらに、本発明により使用されるとき、これらの残基（すなわちＮ、Ｋ、Ｉ、ＬまたはＶ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つは配列から欠失してもよい。

下の配列番号３～１２は、ＣｏＳｔＡＲシグナル伝達ドメインの模範配列であり、それは、配列番号２ボックス領域でヒトＣＤ２８タンパク質と融合させてもよい（これは突然変異していても突然変異していなくてもよいが、図の単純さのためにその原形で残した）：
Ｉ．二重下線領域は、ＣＤ２８由来の領域を表す；および
ＩＩ．下線領域は第２の共刺激受容体由来の領域である；および
ＩＩＩ．イタリック体の配列は、第３の共刺激受容体由来の領域である。
ボックス領域は成熟ＣＤ２８タンパク質の最初の５アミノ酸を表し、それは本発明の任意の態様で存在するか、不在であるかまたは突然変異していてもよいことに留意する。さらに、本発明により使用されるとき、これらの残基（すなわちＮ、Ｋ、Ｉ、ＬまたはＶ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つは配列から欠失してもよい。

配列番号３：トランケーションされた細胞質ドメインＣＤ２８変異体

配列番号４：ＣＤ２８．ＣＤ１３７融合

配列番号５：ＣＤ２８．ＣＤ１３４融合

配列番号６：ＣＤ２８．ＣＤ２融合

配列番号７：ＣＤ２８．ＣＤ２９融合

配列番号８：ＣＤ２８．ＧＩＴＲ融合

配列番号９：ＣＤ２８．ＩＬ２Ｒγ融合

配列番号１０：ＣＤ２８．ＣＤ４０融合

配列番号１１：ＣＤ２８．ＣＤ１５０融合

配列番号１２：ＣＤ２８．ＣＤ２．ＣＤ４０融合

配列番号１３：トランケーションされた細胞外ドメインＣＤ２８（ＩＥＶ）変異体

Claims (35)

1. 第１の共刺激受容体の細胞外リガンド結合性断片と、シグナル伝達ドメインに連結された腫瘍関連抗原特異的結合ドメインと融合させた第２の共刺激受容体の細胞内シグナル伝達断片とを含むキメラ共刺激受容体（ＣｏＳｔＡＲ）。
2. 腫瘍関連抗原特異的結合ドメインと融合させた完全長の共刺激受容体を含み、前記共刺激受容体の完全長が、リーダー配列のない成熟タンパク質全体を含み、前記成熟タンパク質が、成熟タンパク質のＮ最末端に５アミノ酸までの欠失または変異を有する、請求項１に記載のＣｏＳｔＡＲ。
3. 腫瘍関連抗原特異的結合ドメインと融合させた完全長の共刺激受容体を含むキメラ共刺激受容体（ＣｏＳｔＡＲ）であって、前記共刺激受容体の完全長が、リーダー配列のない成熟タンパク質全体を含み、且つ前記成熟タンパク質が、成熟タンパク質のＮ最末端に５アミノ酸までの欠失または変異を有する、ＣｏＳｔＡＲ。
4. 前記共刺激受容体が、ＣＤ２、ＣＤ９、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、またはＥｐｈＢ６の群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のＣｏＳｔＡＲ。
5. 共刺激ドメインが、単一の受容体フォーマットと融合させた２つ以上の共刺激受容体ドメインを含むか、またはこれらからなり、結合領域が、直接融合であるか、または長さが５０アミノ酸までのリンカー等のリンカー領域を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のＣｏＳｔＡＲ。
6. 前記抗原特異的結合ドメインが、
   Ｉ．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、５Ｔ４、メラノトランスフェリン（ＣＤ２２８）、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ／ＣＳＰＧ４）、ＣＤ７１、ＳＭ５－１、葉酸受容体、もしくはＣＡ１２５を含むがこれらに限定されない腫瘍関連抗原に結合する一本鎖抗体断片、または
   ＩＩ．腫瘍特異的ペプチド（ｐ）－主要組織適合性（ＭＨＣ）複合体に結合する一本鎖抗体断片、または
   ＩＩＩ．腫瘍特異的ｐＭＨＣ複合体抗原特異的一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）、または
   ＩＶ．トランスフェリン等であるがこれに限定されない天然の抗原結合性ポリペプチド、または
   Ｖ．抗体に結合するドメイン（たとえばＣＤ１６、ＣＤ３２、またはＣＤ６４等であるがこれらに限定されないＦｃ結合ドメイン）、またはその他の抗原認識の間接的な方法
   から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載のＣｏＳｔＡＲ。
7. マーカー遺伝子（たとえばＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）エピトープタグ、ＣＤ３４、ＣＤ１９等）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または養子細胞療法のための免疫療法用の別の受容体等の目的のタンパク質（ＰＯＩ）と融合させた、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
8. 前記ポリペプチドと前記目的のタンパク質との間に自己切断性ペプチドを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
9. Ｉ．請求項１および２に記載の、例えば配列番号２で示されるものもしくはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントをなどのポリペプチドをコードすることができる配列番号１で示されるもの、または
   ＩＩ．配列番号３～１２で示されるものもしくはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント等の、融合タンパク質、
   などの核酸配列。
10. 請求項１０に記載の核酸配列を含むベクター。
11. 目的のトランスジーンも含む、請求項１０に記載のベクター。
12. 前記ベクターが標的細胞に形質導入するために使用される場合に、前記標的細胞が、請求項１に記載のポリペプチドとキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、もしくは免疫療法目的の別の受容体とを共発現するように、目的のトランスジーンが、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または養子細胞療法のための免疫療法用の別の受容体をコードする、請求項１１に記載のベクター。
13. 請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞。
14. 請求項１に記載のポリペプチドとＰＯＩを細胞表面で共発現する、請求項１３に記載の細胞。
15. 請求項１０に記載の核酸配列を含む細胞。
16. Ｔ細胞である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の細胞。
17. 請求項１０～１２のいずれか１項に記載のベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップを含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の細胞を作成する方法。
18. ＰＯＩを発現する細胞を選択する方法であって、
    Ｉ．請求項１０～１２のいずれか１項に記載のベクターをトランスフェクトまたは形質導入した細胞の表面におけるＰＯＩエピトープの発現を検出するステップ、および
    ＩＩ．前記ＰＯＩエピトープを発現していると分かった細胞を選択するステップ
    を含む、方法。
19. ＰＯＩを発現する細胞が富化された、精製された細胞の集団を調製する方法であって、請求項１９に記載の方法を使用して、細胞の集団からＰＯＩを発現する細胞を選択するステップを含む、方法。
20. 組織または細胞のドナーから単離された細胞の集団に、ｅｘ ｖｉｖｏで、
    Ｉ．請求項１０～１２のいずれか１項に記載のベクターを、形質導入またはトランスフェクトするステップ、および
    ＩＩ．請求項１８に記載の方法によって、前記形質導入／トランスフェクトされた細胞の集団から前記ＰＯＩを発現する細胞を選択するステップ
    を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞が富化された、したがって、ＰＯＩを発現する細胞が富化された、細胞集団。
22. 形質導入された細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて追跡する方法であって、前記細胞の表面における請求項１に記載のポリペプチドの発現を検出するステップを含む、方法。
23. 対象における疾患を処置する方法であって、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の細胞または請求項２１に記載の細胞集団を対象に投与するステップを含む、方法。
24. Ｉ．請求項１０～１２のいずれか１項に記載のベクターを対象から単離した細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトするステップ、および
    ＩＩ．形質導入／トランスフェクトされた細胞を患者に返すステップ
    を含む、請求項２４に記載の方法。
25. がんを処置するための、請求項２４に記載の方法。
26. 疾患の処置および／または養子細胞移植における使用のための、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の細胞または請求項２１に記載の細胞集団。
27. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号４で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＣＤ１３７からの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
28. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号５で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＣＤ１３４からの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
29. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号６で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＣＤ２からのの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
30. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号７で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＣＤ２９からの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
31. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号８で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＧＩＴＲからの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
32. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号９で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＩＬ２Ｒγからの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
33. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号１０で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＣＤ４０からの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
34. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号１１で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＣＤ１５０からの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。
35. 請求項６に記載の腫瘍関連抗原結合性ドメインを含むＣｏＳｔＡＲ受容体であって、
    Ｉ．配列番号２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、完全長のヒトＣＤ２８を含むか、またはこれらからなる融合シグナル伝達ドメイン、および
    ＩＩ．配列番号１２で示されるもの、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントなどの、ヒトＣＤ２およびヒトＣＤ４０からの細胞内ドメイン
    と融合させた、ＣｏＳｔＡＲ受容体。

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