TW202216751A - 用於過繼細胞療法之提供靶向共刺激之受體 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種適用於過繼細胞療法(ACT)之嵌合共刺激抗原受體(CoStAR)及包含該CoStAR之細胞。該CoStAR可作為增強對指定抗原之反應的細胞活性調節劑。本發明亦提供CoStAR蛋白質、編碼該CoStAR之核酸、及其治療性用途。

Description

用於過繼細胞療法之提供靶向共刺激之受體

本發明係關於一種適用於過繼細胞療法(ACT)之嵌合共刺激抗原受體(CoStAR)及包含該CoStAR之細胞。該CoStAR可充當增強對指定抗原之反應的細胞活性調節劑。本發明亦提供CoStAR蛋白質、編碼該CoStAR之核酸及其治療性用途。

使用自體T細胞介導癌症消退之過繼細胞療法(ACT)已在早期臨床試驗中顯示出有很大的前景。已採用若干通用方法，諸如使用離體擴增的天然產生之腫瘤反應性或腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)。另外，T細胞可經基因修飾以使其再靶向明確腫瘤抗原。此可經由肽(p)-主要組織相容複合體(MHC)特異性T細胞受體(TCR)之基因轉移或腫瘤特異性單鏈抗體片段(scFv)與T細胞傳訊域(例如CD3ζ)之間的合成融合來進行，T細胞傳訊域稱為嵌合抗原受體(CAR)。

當靶向黑色素瘤時，TIL及TCR轉移已證實尤其良好(Rosenberg等人2011；Morgan 2006)，而CAR療法已在某些B細胞惡性病之治療中顯示出有很大的前景(Grupp等人2013)。

共刺激信號適用於實現穩定的CAR T細胞擴增、功能、持久性及抗腫瘤活性。CAR療法在白血病中之成功部分地歸因於共刺激域(例如CD28或CD137)併入至CAR構築體中，來自CAR構築體之信號與由CD3ζ提供之信號協同作用以增強抗腫瘤活性。此觀測結果之基礎係關於T細胞活化之經典信號1/信號2模範。此處，由TCR複合體提供之信號1與由共刺激受體(諸如CD28、CD137或CD134)提供之信號2協同作用，以允許細胞經歷純系擴增、IL-2產生及長期存活，而沒有與單獨的信號1相關的活化誘導之細胞死亡(AICD)。此外，信號2之參與增強經由信號1產生之信號，使得細胞對低親合力相互作用(諸如在抗腫瘤反應期間遇到的彼等相互作用)反應更佳。

靶向共刺激將對非基於CAR之T細胞療法具有有益作用。舉例而言，已顯示出將共刺激域併入至嵌合TCR中會增強T細胞對pMHC之反應(Govers 2014)。雖然腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)利用其內源性TCR介導腫瘤識別，但不可能對內源性TCR進行工程改造。因此，因為腫瘤細胞表現極少共刺激配位體，TIL受到實質性限制。誘導TIL或實際上任何其他過繼T細胞療法產物之靶向共刺激的能力將為有益的。

本申請案中任何文獻之引用或鑑別並非承認此類文獻可用作本發明之先前技術。

本發明提供新穎嵌合共刺激抗原受體(CoStAR)及包含或表現CoStAR之細胞，其有益於基於CAR之T細胞療法及類似的非基於CAR之T細胞療法。本發明使用表現新穎嵌合共刺激受體之細胞以在與明確的疾病相關(例如腫瘤相關)抗原接合時向T細胞提供共刺激信號。

已存在若干已使用分離信號1及信號2驅動經工程改造之T細胞中之抗原特異性反應的報導(Alvarez-Vallina及Hawkins 1996)。然而，無一者利用全長CD28分子。相對於截短形式，使用全長受體(諸如CD28)存在特定優勢。全長受體能夠二聚，使得受體能夠以其天然形式起作用，實際上，嵌合抗原受體在表現為單體時不能最佳地起作用(Bridgeman等人2010)。

在一實施例中，本發明之CoStAR在與指定抗原(諸如疾病相關或腫瘤相關抗原)接合時誘導信號2。全長CD28分子含有對於其在受體之B7家族之結合成員中之天然功能至關重要的基元；但其自串聯攜載CD28及CD3ζ受體之CAR之視角來看可能很危險，其中由B7進行之CAR連接可觸發T細胞活化，存在對單獨具有信號2受體之受體有利的品質。在一態樣中，本發明提供一種靶向嵌合共刺激受體(CoStAR)，其包含可操作地連接至跨膜域、第一傳訊域及CD40傳訊域或其傳訊片段之細胞外抗原結合域。本發明人已發現，包含CD40傳訊域之共刺激受體呈現新穎且改良的活性概況。

在本發明之某些實施例中，CD40傳訊域包含SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25。在某些實施例中，CD40傳訊片段包含以下，由以下組成或基本上由以下組成：SH3基序(KPTNKAPH (SEQ ID NO:26)、PTNKAPHP (SEQ ID NO:118)或PTNKAPH(SEQ ID NO:119)、TRAF2基序(PKQE (SEQ ID NO:27)、PKQET (SEQ ID NO:120)、PVQE (SEQ ID NO:28)、PVQET (SEQ ID NO:121)、SVQE (SEQ ID NO:29)、SVQET (SEQ ID NO:122))、TRAF6基序(QEPQEINFP (SEQ ID NO:30)或QEPQEINFP (SEQ ID NO:123))、PKA基序(KKPTNKA (SEQ ID NO:31)、SRISVQE (SEQ ID NO:32)或其組合，或該CD40傳訊片段為全長CD40細胞內域在某些實施例中，CD40傳訊域之SH3、TRAF2、TRAF6或PKA基序中之一或多者發生突變。在某些實施例中，CD40傳訊域之SH3、TRAF2、TRAF6或PKA基序中之一或多者存在於多個複本中。

在某些實施例中，CoStAR之第一傳訊域包含受體之傳訊域或傳訊片段，該受體諸如腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)受體，包括(但不限於) CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137 (41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6。在某些實施例中，CoStAR包含CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137 (41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6。在實施例中，其中第一傳訊域包含CD40傳訊域，因此CoStAR包含兩個CD40傳訊域之元件。

在某些實施例中，CoStAR包含受體之第二傳訊域或傳訊片段，該受體諸如腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)受體，包括(但不限於) CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137 (41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6。第一傳訊域或傳訊片段、CD40傳訊域或傳訊片段，及第二傳訊域或傳訊片段可呈任何次序。例示性實施例包括(但不限於) CoStAR，其包含CD28、CD137及CD40傳訊域、CD28、CD134及CD40傳訊域、CD28、CD2及CD40傳訊域、CD28、GITR及CD40傳訊域、CD28、CD29及CD40傳訊域，或CD28、CD150及CD40傳訊域。

在某些實施例中，本發明之CoStAR經工程改造為不提供信號1。因此，在某些實施例中，本發明之CoStAR不包含信號1傳訊域。在某些實施例中，本發明之CoStAR不包含CD3ζ傳訊域。

在某些實施例中，本發明之CoStAR經工程改造以在能夠在抗原結合時提供信號1之細胞中提供信號2 (例如T細胞受體在抗原接合時提供信號1)。在某些實施例中，當抗原在目標細胞表面上時，本發明之CoStAR經工程改造以在細胞中回應於CoStAR進行之抗原特異性結合提供信號2。在某些實施例中，當抗原可溶且不連接至目標細胞表面時，本發明之CoStAR經工程改造而不在細胞中回應於CoStAR進行之抗原特異性結合提供信號2。

在某些實施例中，本發明之CoStAR之細胞外結合域藉由連接子及/或間隔子可操作地連接至跨膜域。在某些實施例中，連接子包含約5至約20個胺基酸。在某些實施例中，連接子包含AAAGSGGSG (SEQ ID NO: 8)。

在某些實施例中，本發明之CoStAR包含可操作地將細胞外結合域連接至跨膜域之間隔子且包含約10至約250個胺基酸。在某些實施例中，間隔子包含CD8或CD28之細胞外序列或其片段。在某些實施例中，CoStAR包含第二細胞外結合域。在某些實施例中，第二結合域包含來自CD8或CD28之細胞外配位體結合域。在某些實施例中，間隔子包含一或多個免疫球蛋白域或免疫球蛋白恆定區。在某些實施例中，間隔子包含SEQ ID NO: 13之一或多個免疫球蛋白域或一免疫球蛋白恆定區。

在某些實施例中，本發明之CoStAR之跨膜域包含TNFRSF蛋白之跨膜域。在某些實施例中，本發明之CoStAR之跨膜域包含CD28或CD8之跨膜域。在某些實施例中，本發明之CoStAR之跨膜域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之跨膜序列。

本發明之CoStAR適用於刺激針對所選標靶之免疫反應。在某些實施例中，本發明之CoStAR包含結合至腫瘤相關抗原之細胞外結合域。在某些實施例中，本發明之CoStAR包含結合至腫瘤微環境相關抗原之細胞外結合域。在某些實施例中，CoStAR包含兩個或更多個細胞外結合域。在某些實施例中，細胞外結合域結合至CD70、CD146、FOLR1、癌胚抗原(CEA)、5T4、黑素轉鐵蛋白(mellanotransferrin) (CD228)、Her2、EGFR、GPC3、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP/CSPG4)、CD71、EPCAM、SM5-1、葉酸受體或CA125、PDL-1、PD-1、CD155 PD-1、間皮素、或腫瘤特異性肽(p)-主要組織相容(MHC)複合體，或腫瘤特異性pMHC複合體抗原特異性單鏈T細胞受體(scTCR)或運鐵蛋白，或抗體或抗原結合蛋白。

在其中結合域結合於PDL1之某些實施例中，CoStAR包含SEQ ID NO: 6。在其中細胞外結合域結合於CEA之某些實施例中，CoStAR包含SEQ ID NO: 5。在其中細胞外結合域結合於FOLR1之某些實施例中，CoStAR包含SEQ ID NO: 4。在其中結合域結合於CD155、CD112或CD113之某些實施例中，CoStAR包含SEQ ID NO: 7。

根據本發明，細胞外結合域可包含(但不限於) scFv、肽、抗體之抗原結合部分、抗體重鏈、目標受體之配位體或受體之配位體結合部分。

在某些實施例中，本發明之CoStAR包含CD3ζ傳訊域，其例如位於C端處。

在某些實施例中，本發明之CoStAR包含N端信號肽。

在本發明之一態樣中，提供一種編碼本發明之CoStAR之核酸。核酸可經最佳化，例如經密碼子最佳化以表現於宿主細胞中。在非限制性實施例中，核酸經密碼子最佳化以表現於人類細胞中。

在本發明之一態樣中，提供編碼本發明之CoStAR且能夠表現本發明之CoStAR的載體。

在本發明之一態樣中，提供一種表現本發明之CoStAR之細胞。在某些實施例中，細胞表現結合於FOLR1之CoStAR。在其他實施例中，細胞表現結合於CA125之CoStAR。

在一態樣中，本發明提供一種表現對FOLR1具有特異性之CoStAR的細胞，其中當CoStAR與目標細胞表面上之FOLR1反應或結合時而非當CoStAR與可溶性FOLR1結合或反應時，細胞經活化。在一實施例中，細胞為表現對由目標細胞表現之腫瘤相關抗原具有特異性之T細胞受體或其他受體的T細胞或TIL。

在其他實施例中，細胞表現對PDL1具有特異性之CoStAR。在其他實施例中，細胞表現對CEA具有特異性之CoStAR。在某些實施例中，細胞表現兩種或更多種本發明之CoStAR。在一特定實施例中，細胞表現結合於FOLR1之CoStAR及結合於CA125之CoStAR，諸如(但不限於)抗FOLR1.CD28.CD40及抗CA125.41BB.CD40。在一特定實施例中，細胞表現結合於FOLR1之CoStAR及結合於PDL1之CoStAR，諸如(但不限於)抗FOLR1.CD28.CD40及PD1.CD28.CD40。

在某些實施例中，經工程改造以表現本發明之CoStAR之細胞包含α-β T細胞、γ-δ T細胞、T調節細胞、TIL、NKT細胞或NK細胞。在某些實施例中，經工程改造以表現本發明之CoStAR之細胞共同表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。

在一態樣中，本發明提供一種製造表現CoStAR之細胞之方法，其包含用編碼本發明之CoStAR且能夠表現本發明之CoStAR之載體轉導或轉染細胞。

本發明提供一種製備表現本發明之CoStAR之細胞群體之方法，其藉由轉導或轉染細胞、偵測CoStAR之表現及富集、擴增及/或選擇表現CoStAR之細胞進行。

在一態樣中，本發明提供一種藉由投與表現本發明之CoStAR之細胞群體來治療受試者之疾病的方法。

在一態樣中，本發明提供一種製備TIL之方法，其包含：解聚經切除腫瘤以獲得改進之經切除腫瘤產物；藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養改進之經切除腫瘤產物來進行第一擴增從而產生第一TIL群體；藉由用另外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)培養第一TIL群體來進行第二擴增從而產生第二TIL群體；及收集及/或超低溫保存第二TIL群體，其中該方法包含轉染或轉導TIL以表現本發明之CoStAR。在一實施例中，腫瘤包含卵巢腫瘤。在一實施例中，腫瘤包含腎腫瘤。在一實施例中，腫瘤包含肺腫瘤。

因此，本發明之目標為本發明內不涵蓋任何先前已知的產品、製造該產品的製程，或使用該產品的方法，使得申請人保留權利且特此揭示任何先前已知產品、製程或方法的免責聲明。另外應注意，本發明不希望在本發明之範疇內涵蓋不符合USPTO (35 U.S.C. §112，第一段)或EPO (EPC之第83章)之書面說明及實現要求的任何產品、製造該產品之製程或使用該產品之方法，使得申請人保留權利且特此揭示任何先前所述產品、製造該產品之製程或使用該產品之方法的免責聲明。本發明之實踐遵循Art. 53(c) EPC以及Rule 28(b)及(c) EPC可為有利的。明確地保留明確地放棄作為本申請案之譜系中或任何其他譜系中或任何第三方之任何先前所申請的申請案中申請人之任何一或多個所授予專利之主題的任何實施例的所有權利。本文中之任何內容不應被視作承諾。

應注意，在本發明中且尤其在申請專利範圍及/或段落中，諸如「包含(comprises/comprised/comprising)」及其類似者之術語可具有美國專利法中賦予其之含義；例如其可意謂「包括(includes/included/including)」及其類似者；且諸如「基本上由……組成(consisting essentially of/consists essentially of)」之術語具有美國專利法中賦予其之含義，例如其允許不明確列舉要素，但排除先前技術中所發現或影響本發明之基本或新穎特徵的要素。

此等及其他實施例揭示於以下實施方式中或自以下實施方式為顯而易見的且涵蓋於以下實施方式中。

相關申請案及以引用的方式併入

本申請案主張2020年7月17日申請之美國專利申請案第63/053,494號及2021年7月16日申請之美國專利申請案第63/222,913號之優先權，該等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。

參考2019年1月22日申請之GB專利申請案第1900858.0號、2019年12月20日申請之美國專利申請案第62/951,770號、2020年1月20日申請之國際申請案PCT/GB2020/050120及2020年7月17日申請之美國臨時專利申請案63/053,498。

前述申請案，及其中或在其審查期間所引用之所有文獻(「申請案引用文獻」)，及申請案引用文獻中所引用或參考之所有文獻，及本文中所引用或參考之所有文獻(「本文引用文獻」)，及本文引用文獻中所引用或參考之所有文獻，以及本文中或以引用方式併入本文中之任何文獻中所提及之任何產品的任何製造商說明書、描述、產品規格及產品介紹，皆以引用之方式特此併入本文中，且可用於本發明之實踐。更特定而言，所有參考文獻均以引用方式併入，其併入程度如同各個別文獻經特定且個別指示以引用方式併入一般。

本發明人已發現，包含CD40傳訊域之共刺激受體呈現新穎且改良的活性概況。可藉由選擇受體蛋白之細胞內域連接至CD40傳訊域，及/或藉由選擇CD40傳訊域中之元件連接至受體蛋白之細胞內域來調節活性概況。本文提供重組共刺激抗原受體(CoStAR)，其包含：(i)疾病或腫瘤相關抗原結合域；(ii)包含受體蛋白之細胞內傳訊域之第一細胞內區段；及(iii) CD40受體蛋白或其信號轉導片段之第二細胞內傳訊域。視情況，CoStAR包含刺激性受體蛋白之細胞外區段。在某些實施例中，刺激性受體蛋白之細胞外區段能夠結合配位體。在某些實施例中，刺激性受體蛋白之細胞外區段經截短且不與配位體結合。在某些實施例中，刺激受體蛋白之細胞外區段用作可調節長度間隔子，使得疾病或腫瘤相關抗原結合域遠離表現其之細胞表面定位，例如以形成更佳免疫突觸。在某些實施例中，刺激性受體蛋白之細胞外區段及第一細胞內區段包含相同受體蛋白區段。在某些實施例中，細胞外區段及第一細胞內區段包含不同受體蛋白區段。CoStAR包含位於疾病或腫瘤抗原結合域與第一細胞內域之間的介入跨膜域。當存在刺激性受體蛋白之細胞外區段時，跨膜域插入細胞外區段與第一細胞內傳訊域之間。

如本文所用，「全長蛋白」或「全長受體」係指受體蛋白，諸如CD28受體蛋白。術語「全長」涵蓋如下受體蛋白：一旦其信號肽裂解，其在成熟受體蛋白之N端處缺乏至多約5個或至多10個胺基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸。舉例而言，雖然受體N端信號肽之特異性裂解位點可經限定，但已觀測到準確裂解點之可變性。術語「全長」並不暗示受體N端信號肽之胺基酸的存在或不存在。在一個實施例中，術語「全長」(例如根據本發明之某些態樣的全長CD28或全長CD40細胞內域)涵蓋缺乏N端信號肽之成熟受體蛋白(例如根據本發明之某些態樣的CD28)，一旦其信號肽已裂解，其在成熟受體蛋白之N端處缺乏至多約5個，例如1、2、3、4、5個或至多10個胺基酸。如上文所提及，根據本發明之各種態樣的「全長」CD28受體或其他受體或腫瘤抗原結合域不包括信號肽且在成熟受體蛋白之N端(例如N端殘基N、K、I、L及/或V)處可能缺乏至多約5個，例如1、2、3、4、5個或至多10個胺基酸。此顯示於例示性融合物(例如SEQ ID No. 4-12)中(應注意，此等融合物在成熟受體蛋白之N端處可能缺乏至多約5個，例如1、2、3、4、5個或至多10個胺基酸，如加框區域中所示)。

CoStAR具有模組化形式且可經構築以包含自一或多種蛋白質獲得之細胞外域、跨膜域及細胞內結構域，以及自結合於疾病相關抗原(例如腫瘤相關抗原)之抗體獲得的scFv。

根據本發明，在一個實施例中，CoStAR包含疾病相關(例如腫瘤相關)抗原受體，諸如(但不限於)腫瘤相關抗原特異性scFv，及能夠結合至其同源配位體且提供細胞內信號之初級共刺激受體蛋白。在某些實施例中，初級共刺激受體可小於全長蛋白，但足以結合同源配位體且轉導信號。在某些實施例中，初級共刺激受體域為全長的，諸如(但不限於)全長CD28。因此，抗原特異性結合域及配位體特異性受體均能夠分別結合同源抗原及配位體。本文提供之胺基酸序列提供若干CoStAR構築體之實施例。此等包括CoStAR構築體，該等構築體包含抗原結合域、視情況選用之間隔子、包含細胞外配位體結合區段或其片段的視情況選用之共刺激受體蛋白及細胞內CD40傳訊域。在另一實施例中，CoStAR包含抗原結合域、視情況選用之間隔子、共刺激受體蛋白之細胞外配位體結合部分、跨膜域及所選共刺激受體蛋白之細胞內傳訊域以及細胞內CD40傳訊域。在某些實施例中，細胞外配位體結合部分包含CD28截短，例如在胺基酸IEV之後的C端CD28截短，然後是細胞內傳訊域。在某些實施例中，細胞內傳訊域來自CD40。分離細胞外配位體結合域與細胞內傳訊域之跨膜域可以來自(但不限於) CD28、CD40。在另外的實施例中，CoStAR可包含另外的共刺激域，例如第三細胞內共刺激傳訊域，且就此而言可類似於某些嵌合抗原受體(CAR)，其已分類為第一代(僅CD3ζ)、第二代(一個共刺激域+CD3ζ)或第三代(超過一個共刺激域+CD3ζ)。

適用於本發明之CoStAR的共刺激受體受體蛋白包括(但不限於)CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137(41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6，其以天然形式包含細胞外配位體結合域及細胞內信號轉導域。舉例而言，CD2表徵為在T細胞表面上發現之細胞黏附分子且能夠起始T細胞活化所需之細胞內信號。CD27表徵為屬於TNFR超家族(TNFRSF)之II型跨膜醣蛋白，其在B細胞上之表現由B細胞中之抗原受體活化誘導。CD28為T細胞上之一種蛋白質且為抗原呈現細胞上CD80 (B7.1)及CD86 (B7.2)配位體之受體。CD137 (4-1BB)配位體見於大部分白細胞及一些非免疫細胞上。OX40配位體表現於許多抗原呈現細胞(諸如DC2 (樹突狀細胞)、巨噬細胞及B淋巴球)上。在一個實施例中，共刺激受體蛋白為如本文所定義之全長CD28。

CD40為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族之成員且數種同功異型物係由替代性剪接產生。其配位體CD154 (亦稱為CD40L)為主要表現於經活化T細胞上之蛋白質。為供參考，人類CD40同功異型物1蛋白質序列係載於GenBank寄存編號NP_001241.1中，包括信號肽(胺基酸1-20)、跨膜域(胺基酸194-215)及細胞質域(胺基酸216-277) (SEQ ID NO: 22)。CD40受體傳訊涉及轉接蛋白，其包括(但不限於) TNF受體相關因子(TRAF)，且CD40細胞質域包含傳訊組分，包括擬合SH3基序(KPTNKAPH或PTNKAPHP或PTNKAPH)、TRAF2基序(PKQE、PKQET、PVQE、PVQET、SVQE、SVQET)、TRAF6基序(QEPQEINF或QEPQEINFP)及PKA基序(KKPTNKA、SRISVQE)的胺基酸序列。本發明進一步包括經工程改造之傳訊域，諸如經工程改造之CD40傳訊域，其包含TRAF結合胺基酸序列。結合至TRAF1、TRAF2、TRAF3及TRAF5之經工程改造之傳訊域可包含主要共同序列(P/S/A/T)X(Q/E)E或次要共同序列PXQXXD，且可鑑別於TNFR家族成員(諸如但不限於CD30、Ox40、4-1BB及EBV致癌蛋白LMP1)中或自其獲得。(參見例如Ye, H等人， The Structural Basis for the Recognition of Diverse Receptor Sequences by TRAF2. Molecular Cell, 1999; 4(3):321-30. doi: 10.1016/S1097-2765(00)80334-2; Park HH, Structure of TRAF Family: Current Understanding of Receptor Recognition. Front. Immunol. 2018; 9:1999. doi: 10.3389/fimmu.2018.01999; Chung, J.Y.等人， All TRAFs are not created equal: common and distinct molecular mechanisms of TRAF-mediated signal transduction. Journal of Cell Science 2002; 115:679-688)。

本文中所揭示之實例展現在CoStAR中將CD40作為共刺激傳訊域進行操作，且進一步展現，細胞介素及趨化介素表現概況係藉由傳訊域選擇改變。在某些實施例中，CoStAR之共刺激CD40傳訊域促進促發炎細胞介素(例如，IL2、TNFα)。在某些實施例中，CoStAR之共刺激CD40傳訊域減少免疫抑制細胞介素(例如，IL-5、IL-10)。與第一受體傳訊域在沒有CD40傳訊域或片段之情況下的活性相比，可以觀測到CD40傳訊域或片段與第一受體傳訊域組合的共刺激活性，該第一受體傳訊域諸如(但不限於) CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6。就此而言，相較於僅第一傳訊域，本發明之CD40傳訊域(包括傳訊片段，其包含特定因子結合位點或其中特定因子結合位點突變)與共刺激第一傳訊域組合能夠促進或抑制特定細胞介素及/或趨化介素之相對表現。(參見例如Ahonen, CL等人， The CD40-TRAF6 axis controls affinity maturation and the generation of long-lived plasma cells. Nat Immunol. 2002; 3: 451-456; Mackey MF等人， Distinct contributions of different CD40 TRAF binding sites to CD154-induced dendritic cell maturation and IL-12 secretion. Eur J Immunol. 2003; 33: 779-789; Mukundan等人， TNF receptor-associated factor 6 is an essential mediator of CD40-activated proinflammatory pathways in monocytes and macrophages. J Immunol. 2005; 174: 1081-1090)。

在某些實施例中，本發明之CoStAR包含實質上全部CD40共刺激域。在某些實施例中，本發明之CoStAR包含兩個或更多個CD40共刺激域。在某些實施例中，本發明之CoStAR包含CD40共刺激域傳訊組分或基序，包括(但不限於) SH3基序(KPTNKAPH)、TRAF2基序(PKQE、PVQE、SVQE)、TRAF3基序、TRAF6基序(QEPQEINFP)或PKA基序(KKPTNKA，SRISVQE)以及兩個或更多個、或三個或更多個、或四個或多個此類組分或基序，其可在多個複本中且按任何次序排列。在某些實施例中，本發明之CoStAR包含CD40共刺激域及CD40共刺激域傳訊組分或基序。在某些實施例中，SH3基序、TRAF2基序及TRAF6基序足以調節促發炎及/或免疫抑制細胞介素。在某些實施例中，添加彼等基序之串疊複本及/或使某些基序突變放大此等效應。

在某些實施例中，一或多種共刺激域傳訊組分或基序之選擇係由其中表現CoStAR之細胞及/或與傳訊組分或基序更緊密相關之所需共刺激活性，或避免與傳訊組分或基序更緊密相關之共刺激活性來引導。

在某些實施例中，除了CD40共刺激域或其傳訊組分或基序、或兩個或更多個此類域或組分或基序或其組合之外，CoStAR傳訊域亦包含另一全長共刺激域或其傳訊組分，其來自(但不限於) CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137 (41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6。

為供參考，人類CD28蛋白質序列係載於GenBank寄存編號NP_006130.1中，包括信號肽(胺基酸1-18)、細胞外域(胺基酸19-152)、跨膜域(胺基酸153-179)及細胞質域(胺基酸180-200)。細胞外域包括免疫球蛋白型域(胺基酸21-136)，其含有構成抗原結合位點之胺基酸及形成均二聚體界面之胺基酸。細胞外域包括可經糖基化之若干天冬醯胺殘基，且細胞內域包含經磷酸化之絲胺酸及酪胺酸殘基。

作為參考，人類CD8 α鏈蛋白質序列係GenBank寄存編號NP_001139345.1所載，包括信號肽(胺基酸1-21)、細胞外域(胺基酸22-182)、跨膜域(胺基酸183-203)及細胞質域(胺基酸204-235)。細胞外域包括免疫球蛋白型域(胺基酸28-128)，其含有構成抗原結合位點之胺基酸及形成均二聚體界面之胺基酸。細胞外域包括可經糖基化之若干天冬醯胺殘基，且細胞內域包含經磷酸化之絲胺酸及酪胺酸殘基。

為供參考，人類IgG4恆定區序列係載於UniProtKB/Swiss-Prot:寄存編號P01861.1中，包括CH1 (胺基酸1-98)、鉸鏈(胺基酸99-110)、CH2 (胺基酸111-220)、CH3 (胺基酸221-327)。CH2區包括胺基酸177處之天冬醯胺，其經糖基化且與Fc受體及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)相關。

為供參考，人類CD137 (4-1BB)，另一TNFR超家族成員之蛋白質序列係GenBank寄存編號NP_001552.2所載，包括信號肽(胺基酸1-23)、胞外域(胺基酸24-186)、跨膜域(胺基酸187-213)及細胞質域(胺基酸214-255)。表現於抗原呈現細胞上之CD137L配位三聚體結合於CD137導致T細胞反應性及存活所涉及之受體三聚及信號級聯活化(Li等人， Limited Cross-Linking of 4-1BB by 4-1BB Ligand and the Agonist Monoclonal Antibody Utomilumab. Cell Reports 2018; 25:909-920)。已報導CD137與傳訊轉接子TRAF-2及TRAF-1之共免疫沈澱以及相互作用之結構基礎(Ye, H等人，Molecular Cell, 1999; 4(3):321-30)。

為供參考，人類CD134 (OX40)蛋白質序列係載於GenBank寄存編號NP_003318.1中，包括信號肽(胺基酸1-28)、細胞外域(胺基酸29-214)、跨膜域(胺基酸215-235)及細胞質域(胺基酸236-277)。此受體已展示為經由其與轉接蛋白TRAF2及TRAF5之相互作用活化NF-κB，且研究表明此受體促進細胞凋亡抑制劑BCL2及BCL2lL1/BCL2-XL之表現。

人類T細胞表面抗原CD2具有至少兩種同功異型物。為供參考，人類CD2同功異型物1蛋白質序列係由NP_001315538.1所載，包括信號肽(胺基酸1-24)、細胞外域(胺基酸25-235)、跨膜域(胺基酸236-261)及細胞質域(胺基酸262-377)。人類CD2同功異型物2蛋白質序列係由NP_001758.2所載。

為供參考，人類CD357 (GITR)同功異型物-1蛋白質序列係由GenBank寄存編號NP_004186.1所載，包括信號肽(胺基酸1-25)、細胞外域(胺基酸26-162)、跨膜域(胺基酸163-183)及細胞質域(胺基酸184-241)。

為供參考，人類CD29 (β1整合素)蛋白質序列係由GenBank寄存編號NP_596867所載，包括信號肽(胺基酸1-20)、細胞外域(胺基酸21-728)、跨膜域(胺基酸729-751)及細胞質域(胺基酸752-798)。

人類CD150 (SLAM)蛋白質序列具有數種同功異型物。除CD150之跨膜形式(mCD150)以外，造血譜系之細胞表現編碼CD150之分泌形式(sCD150)的mRNA，該sCD150缺乏30個胺基酸之整個跨膜區。為供參考，人類SLAM同功異型物b係GenBank寄存編號NP_003028.1所載，包括信號肽(胺基酸1-20)、細胞外域(胺基酸21-237)、跨膜域(胺基酸238-258)及細胞質域(胺基酸259-335)。人類SLAM同功異型物a係GenBank寄存編號NP_001317683.1所載。

在本發明之實施例中，CoStAR可在具有治療活性之治療性細胞群體(例如腫瘤浸潤性淋巴球(TIL))中之啟動子的控制下經單獨表現。或者，CoStAR可連同治療性轉殖基因(諸如嵌合抗原受體(CAR)及/或T細胞受體(TCR))一起表現，例如，如SEQ ID NO: 67-79中所描述(應注意，在成熟受體蛋白之N端處可能缺乏至多約5個，例如1、2、3、4、5個或至多10個胺基酸)。因此，在一個態樣中，本發明亦係關於具有如SEQ ID NO: 67-79中之任一者中所示之序列的CoStAR構築體，包括此等序列中的在成熟受體蛋白之N端處缺乏至多約5個，例如1、2、3、4、5個或至多10個胺基酸)中之一個序列。適合的TCR及CAR在文獻中已係熟知的，例如HLA-A*02-NYESO-1特異性TCR (Rapoport等人Nat Med 2015)或抗CD19scFv.CD3ζ融合CAR (Kochenderfer等人 J Clin Oncol 2015)，其分別已成功地用於治療骨髓瘤或B細胞惡性病。本文所描述之CoStAR可用任何已知CAR或TCR表現，由此提供具有可調節的生長開關的細胞，以允許細胞在活體外或活體內擴增，且針對抗癌活性提供呈TCR或CAR形式之習知活化機制。因此，本發明提供一種用於過繼細胞療法之細胞，其包含如本文所描述之CoStAR及特異性結合於腫瘤相關抗原之TCR及/或CAR。包含CD28之例示性CoStAR包括細胞外抗原結合域以及細胞外跨膜域及細胞內傳訊域。

如本文所用之術語「抗原結合域」係指包括但不限於以下之抗體片段：雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定性雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、由包含一或多個CDR之抗體的一部分形成之多特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體、二價域抗體或結合於抗原但不包含完整抗體結構之任何其他抗體片段。抗原結合域能夠結合至與親本抗體或親本抗體片段(例如親本scFv)所結合相同之抗原。在一些實施例中，抗原結合片段可包含接枝至來自一或多種不同人類抗體之構架(FR)的來自特定人類抗體之一或多個互補決定區(CDR)。

可使抗原結合域對任何疾病相關抗原具有特異性，包括(但不限於)腫瘤相關抗原(TAA)及傳染病相關抗原。在某些實施例中，配位體結合域為雙特異性的。已在大部分人類癌症中鑑別出抗原，包括伯基特淋巴瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、腎細胞癌、乳癌、前列腺癌、肺癌及結腸癌。TAA包括(但不限於) CD19、CD20、CD22、CD24、CD33、CD38、CD123、CD228、CD138、BCMA、GPC3、CEA、葉酸受體(FRα)、間皮素、CD276、gp100、5T4、GD2、EGFR、MUC-1、PSMA、EpCAM、MCSP、SM5-1、MICA、MICB、ULBP及HER-2。TAA進一步包括新抗原、肽/MHC複合體及HSP/肽複合體。

在某些實施例中，抗原結合域包含結合至所定義之腫瘤特異性肽MHC複合體之T細胞受體或其結合片段。術語「T細胞受體」或「TCR」係指由T細胞表面上配對的αβ或γδ鏈構成之異二聚體受體。各α、β、γ及δ鏈由兩個Ig樣域構成：經由互補決定區(CDR)賦予抗原識別之可變域(V)，隨後為藉由連接肽及跨膜(TM)區錨定至細胞膜的恆定域(C)。TM區與CD3傳訊設備之恆定次單位結合。V域中之每一者具有三個CDR。此等CDR與結合至由主要組織相容複合體(pMHC)編碼之蛋白質的抗原肽之間的複合體相互作用(Davis及Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402；Davis等人(1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544；Murphy (2012), xix, 第868頁)。

在某些實施例中，抗原結合域包含腫瘤表現之蛋白質或其腫瘤結合片段的天然配位體。非限制性實例為與PDL1結合之PD1。另一實例為運鐵蛋白受體1 (TfR1)，亦稱為CD71，亦即均二聚蛋白，其為細胞鐵恆定及增殖之關鍵調節因子。雖然TfR1在廣泛多種細胞中以低水準表現，但其在快速增殖性細胞(包括過度表現已與不良預後相關之惡性細胞)中以較高水準表現。在本發明之一實施例中，抗原結合域包含運鐵蛋白或其運鐵蛋白受體結合片段。

在某些實施例中，抗原結合域對所定義腫瘤相關抗原(諸如但不限於FRα、CEA、5T4、CA125、SM5-1或CD71)具有特異性。在某些實施例中，腫瘤相關抗原可為腫瘤特異性肽-MHC複合體。在某些此類實施例中，肽為新抗原。在其他實施例中，腫瘤相關抗原為肽-熱休克蛋白複合體。

在各種實施例中，本發明提供一種CoStAR，其包含

i.結合於癌胚抗原(CEA)之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

ii.結合於CEA之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列，及CD40傳訊域。

iii.結合於CEA之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD137傳訊域及CD40傳訊域。

iv.結合於CEA之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD134傳訊域及CD40傳訊域。

v.結合於CEA之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD2傳訊域及CD40傳訊域。

vi.結合於CEA之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、GITR傳訊域及CD40傳訊域。

vii.結合於CEA之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD29傳訊域及CD40傳訊域。

viii.結合於CEA之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD150傳訊域及CD40傳訊域。

ix.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

x.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列，及CD40傳訊域。

xi.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD137傳訊域及CD40傳訊域。

xii.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD134傳訊域及CD40傳訊域。

xiii.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD2傳訊域及CD40傳訊域。

xiv.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、GITR傳訊域及CD40傳訊域。

xv.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD29傳訊域及CD40傳訊域。

xvi.結合於CEA之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD150傳訊域及CD40傳訊域。

xvii.結合於CEA之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

xviii.結合於CEA之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子，及CD40傳訊域。

xix.結合於CEA之scFv，包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD137傳訊域及CD40傳訊域。

xx.結合於CEA之scFv，包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD134傳訊域及CD40傳訊域。

xxi.結合於CEA之scFv，包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD2傳訊域及CD40傳訊域。

xxii.結合於CEA之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、GITR傳訊域及CD40傳訊域。

xxiii.結合於CEA之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD29傳訊域及CD40傳訊域。

xxiv.結合於CEA之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD150傳訊域及CD40傳訊域。

xxv.結合於CEA之scFv，包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、第一CD40傳訊域及第二CD40傳訊域。

xxvi.結合於CEA之scFv，包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、第一CD40傳訊域及第二經突變CD40傳訊域。

xxvii.結合於PDL1之結合域、CD28之短間隔子及跨膜序列、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

xxviii.結合於PDL1之結合域、CD28之短間隔子及跨膜序列，及CD40傳訊域。

xxix.結合於CD155、CD112或CD113之結合域、CD28跨膜域、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

xxx.結合於CD155、CD112或CD113之結合域、CD28跨膜域及CD40傳訊域。

xxxi.結合於CEA之scFv、結合於PDL1之結合域、CD28之短間隔子及跨膜序列、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

xxxii.結合於CEA之scFv、結合於PDL1之結合域、CD28之短間隔子及跨膜序列，及CD40傳訊域。

xxxiii.結合於CEA之scFv、結合於CD155、CD112或CD113之結合域、CD28之短間隔子及跨膜序列、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

xxxiv.結合於CEA之scFv、結合於CD155、CD112或CD113之結合域、CD28之短間隔子及跨膜序列，及CD40傳訊域。

在各種實施例中，本發明提供一種CoStAR，其包含i至xxxiv中任一者之間隔子、跨膜及傳訊域結構且結合於FOLR1。

在各種實施例中，本發明提供一種CoStAR，其包含

i.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

ii.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列，及CD40傳訊域。

iii.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD137傳訊域及CD40傳訊域。

iv.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD134傳訊域及CD40傳訊域。

v.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD2傳訊域及CD40傳訊域。

vi.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、GITR傳訊域及CD40傳訊域。

vii.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD29傳訊域及CD40傳訊域。

viii.結合於FOLR1之scFv、CD28之間隔子及跨膜序列、CD150傳訊域及CD40傳訊域。

ix.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD28傳訊域及CD40傳訊域。

x.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列，及CD40傳訊域。

xi.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD137傳訊域及CD40傳訊域。

xii.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD134傳訊域及CD40傳訊域。

xiii.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD2傳訊域及CD40傳訊域。

xiv.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、GITR傳訊域及CD40傳訊域。

xv.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD29傳訊域及CD40傳訊域。

xvi.結合於FOLR1之scFv、CD8之間隔子及跨膜序列、CD150傳訊域及CD40傳訊域。

xvii.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD28傳訊域，及CD40傳訊域。

xviii.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子，及CD40傳訊域。

xix.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD137傳訊域及CD40傳訊域。

xx.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD134傳訊域及CD40傳訊域。

xxi.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD2傳訊域及CD40傳訊域。

xxii.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、GITR傳訊域及CD40傳訊域。

xxiii.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD29傳訊域及CD40傳訊域。

xxiv.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、CD150傳訊域及CD40傳訊域。

xxv.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、第一CD40傳訊域及第二CD40傳訊域。

xxvi.結合於FOLR1之scFv、包含IgG4恆定區及CD28跨膜序列之間隔子、第一CD40傳訊域及第二經突變CD40傳訊域。

如本文中所用，術語「特異性結合」或「對...具有特異性」係指可量測及可再現相互作用，諸如標靶與抗體或抗體部分之間的結合，其在非均質分子(包括生物分子)群體存在下決定標靶之存在。舉例而言，特異性結合於標靶(其可為抗原決定基)之抗體部分係與標靶結合之親和力、親合力、容易性及/或持續時間大於其結合至其他標靶之抗體部分。在一些實施例中，特異性結合於抗原之抗體部分與抗原(例如細胞表面抗原或肽/MHC蛋白質複合體)之一或多個抗原決定子反應所用的結合親和力係其針對其他標靶之結合親和力的至少約10倍。 間隔子

本發明之CoStAR視情況包含抗原結合域與共刺激受體之間的間隔區。如本文所用，術語「間隔子」係指CoStAR之細胞外結構區，其將共刺激蛋白之抗原結合域與外部配位體結合域分離。間隔子提供接取所靶向抗原及受體配位體之靈活性。在某些實施例中，採用長間隔子例如靶向近膜抗原決定基或經糖基化之抗原(參見Guest R.D.等人，The role of extracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immune receptors: evaluation of four different scFvs and antigens. J. Immunother. 2005;28:203-211; Wilkie S.等人，Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1: the evolution of a chimeric antigen receptor. J. Immunol. 2008;180:4901-4909)。在其他實施例中，CoStAR具有短間隔子，例如以靶向遠膜抗原決定基(參見Hudecek M.等人，Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 2013;19:3153-3164; Hudecek M.等人，The nonsignalling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer Immunol. Res. 2015;3:125-135)。在某些實施例中，間隔子包含IgG鉸鏈之全部或一部分或衍生自IgG鉸鏈，包括(但不限於) IgG1、IgG2或IgG4。「衍生自Ig鉸鏈」意指在IgG鉸鏈中包含插入、缺失或突變之間隔子。在某些實施例中，間隔子可以包含一或多個抗體恆定域之全部或一部分，諸如(但不限於) CH2及/或CH3域。在某些實施例中，在包含CH2域之全部或一部分之間隔子中，CH2域經修飾以免結合於Fc受體。舉例而言，已發現骨髓細胞中之Fc受體結合會削弱CAR T細胞功能性。在某些實施例中，間隔子包含來自CD28、CD8或包含鉸鏈區之其他蛋白質之Ig樣鉸鏈的全部或一部分。在包含間隔子之本發明之某些實施例中，間隔子之長度為1及50個胺基酸。

在非限制性實施例中，間隔子上包含基本上全部細胞外域，例如CD28細胞外域(亦即約胺基酸19、20、21或22至約胺基酸152)，或另一種蛋白質(包括但不限於另一TNFR超家族成員)之細胞外域。在一實施例中，間隔子包含細胞外域之一部分，例如CD28細胞外域之一部分，且可缺乏全部或大部分Ig域。在另一實施例中，間隔子包括CD28之胺基酸約141至約152，而不包括CD28細胞外結構域之其他部分。在另一實施例中，間隔子包括CD8之胺基酸約128至約182，但不包括CD8細胞外域之其他部分。 連接子

在某些實施例中，CoStAR細胞外域包含連接子。連接子包含用於連接域(例如結合域)與間隔子或跨膜域之短運轉胺基酸。為了結合配位體之靈活性，配位體結合域通常將藉由包含約5至25個胺基酸之柔性連接子(諸如AAAGSGGSG (SEQ ID NO:7)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:62))連接至間隔子或跨膜域。在某些實施例中，CoStAR包含藉由連接子且在無間隔子之情況下直接接合至跨膜域之結合域。在某些實施例中，CoStAR包含藉由間隔子且在無藉由SEQ ID NO:58及59例示之連接子的情況下直接接合至跨膜域之結合域。 傳訊域

如上文所論述，在某些實施例中，CoStAR包含全長初級共刺激受體，其可包含(但不限於) CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137 (41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6的細胞外配位體結合部分及細胞內傳訊部分。在其他實施例中，共刺激受體包含嵌合蛋白，例如包含前述蛋白質中之一者的細胞外配位體結合域及前述蛋白質中之另一者的細胞內傳訊域。在某些實施例中，CoStAR之傳訊部分包含單一傳訊域。在其他實施例中，CoStAR之傳訊部分包含第二細胞內傳訊域，諸如(但不限於)：CD2、CD27、CD28、CD40、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAM)。在某些實施例中，第一及第二細胞內傳訊域相同。在其他實施例中，第一及第二細胞內傳訊域不同。在某些實施例中，共刺激受體能夠二聚。在不受理論束縛之情況下，認為CoStAR與其他輔助分子二聚或締合以引發信號。在某些實施例中，CoStAR經由跨膜域相互作用與輔助分子二聚或締合。在某些實施例中，藉由共刺激受體之細胞內部分及/或細胞外部分中之共刺激受體相互作用輔助與輔助分子二聚或締合。 跨膜域

儘管跨膜之主要功能係將CoStAR錨定於T細胞膜中，但在某些實施例中，跨膜域影響CoStAR功能。在某些實施例中，跨膜域由全長初級共刺激受體域構成。在其中CoStAR構築體包含一種受體之細胞外域及第二受體之細胞內傳訊域的本發明之實施例中，跨膜域可為細胞外域或細胞內域之跨膜域。在某些實施例中，跨膜域來自CD4、CD8α、CD28或ICOS。Gueden等人的具有增加之CAR T細胞存留及總體抗腫瘤功效之ICOS跨膜域的相關使用(Guedan S.等人，Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 2018;3:96976)。在一實施例中，跨膜域包含跨越細胞膜之疏水性α螺旋。

在一實施例中，跨膜域包含CD28跨膜域之自約胺基酸153至約胺基酸179的胺基酸。在另一實施例中，跨膜域包含CD8跨膜域之自約胺基酸183至約胺基酸203的胺基酸。在某些實施例中，本發明之CoStAR在跨膜域與傳訊域之間可包括若干胺基酸。舉例而言，在本文所描述之一個構築體中，CD8跨膜域與傳訊域之連接包含CD8細胞質域之若干胺基酸(例如，CD8之胺基酸204至210)。 變異體

在一些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體部分或其他部分之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良抗體部分之結合親和力及/或其他生物特性。抗體部分之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入至編碼該抗體部分之核苷酸序列中或藉由肽合成製備。此類修飾包括例如在抗體部分之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。

在一些實施例中，提供包含一或多個胺基酸取代、缺失或插入之抗體結合域部分。所關注之突變變化位點包括抗體結合域重鏈及輕鏈可變區(PR)及構架(FR)。可將胺基酸取代引入至所關注之結合域中且針對所需活性(例如保持/改良之抗原結合或降低之免疫原性)篩選產物。在某些實施例中，胺基酸取代可引入至初級共刺激受體域(細胞外或細胞內)、次級共刺激受體域或細胞外共受體域中之一或多者中。因此，本發明涵蓋本文中特定揭示之CoStAR蛋白質及組分以及其變異體，亦即CoStAR蛋白質及組分與本文特定揭示之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性。當參考特定序列時，使用術語「相似度一致性」、「百分比一致性」及「同源性百分比」，如University of Wisconsin GCG software program BestFit中所闡述，可使用其他演算法，例如BLAST、psiBLAST或TBLASTN (其使用Altschul等人的方法，(1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410)、FASTA (其使用Pearson及Lipman的方法(1988) PNAS USA 85:2444-2448)。

特定胺基酸序列變異體可與參考序列相差1個胺基酸、2、3、4、5至10、10至20或20至30個胺基酸之插入、添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異序列可包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個插入、缺失或取代之殘基的參考序列。舉例而言，5、10、15、至多20、至多30或至多40個殘基可經插入、缺失或取代。

在一些較佳實施例中，變異體可與參考序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個保守取代。保守取代涉及用具有類似特性之不同胺基酸置換胺基酸。舉例而言，脂族殘基可經另一脂族殘基置換，非極性殘基可經另一非極性殘基置換，酸性殘基可經另一酸性殘基置換，鹼性殘基可經另一鹼性殘基置換，極性殘基可經另一極性殘基置換或芳族殘基可經另一芳族殘基置換。保守取代可例如在以下群組內之胺基酸之間進行：

保守取代展示於下表中。

原始殘基	例示性取代	較佳取代
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸	Leu
Leu (L)	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸	Leu

胺基酸可根據共同的側鏈特性分成不同類別：a.疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；b.中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； c.酸性：Asp、Glu；d.鹼性：His、Lys、Arg；e.影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代將引起此等類別中之一者之成員換成另一個類別。 細胞

本發明中使用之細胞可為適用於過繼細胞療法之任何淋巴細胞，諸如T細胞或自然殺手(NK)細胞、NKT細胞、γ/δ T細胞或T調節細胞。細胞對於患者可為同種異體或自體的。

T細胞或T淋巴細胞為在細胞介導之免疫性中起中心作用的淋巴細胞類型。其與其他淋巴細胞(諸如B細胞及自然殺手細胞(NK細胞))之區別可在於細胞表面上存在T細胞受體(TCR)。存在各種類型之T細胞，如以下概述。細胞毒性T細胞(TC細胞或CTL)破壞經病毒感染之細胞及腫瘤細胞，且亦涉及移植排斥反應。CTL在其表面處表現CD8分子。

此等細胞藉由結合至與存在於所有成核細胞之表面上的I類MHC締合之抗原來識別其標靶。經由IL-10、腺苷及由調節T細胞分泌之其他分子，CD8+細胞可不活化為無反應狀態，其預防自體免疫疾病，諸如實驗性自體免疫性腦脊髓炎。

記憶T細胞為在感染消退之後長期存留之抗原特異性T細胞之子集。其在再次暴露於其同源抗原後快速擴增成大量效應T細胞，因此為免疫系統提供針對過去感染之「記憶」。記憶T細胞包含三種亞型：中樞記憶T細胞(TCM細胞)及兩種類型效應記憶T細胞(TEM細胞及TEMRA細胞)。記憶細胞可為CD4+或CD8+。記憶T細胞通常表現細胞表面蛋白CD45RO。調節T細胞(Treg細胞)先前稱為抑制T細胞，其對於維持免疫耐受性而言為關鍵的。其主要作用為關閉T細胞介導免疫性至免疫反應結束且抑制逃避胸腺中之陰性選擇過程之主動反應T細胞。

已描述兩種主要類別之CD4+ Treg細胞 - 天然產生之Treg細胞及適應性Treg細胞。天然產生之Treg細胞(亦稱為CD4+CD25+FoxP3+ Treg細胞)在胸腺中產生且與在產生T細胞與已用TSLP活化之骨髓(CD11c ⁺)及漿細胞樣(CD123 ⁺)樹突狀細胞之間的相互作用有關。天然產生之Treg細胞與其他T細胞之區別可在於存在細胞內分子(稱為FoxP3)。適應性Treg細胞(亦稱為Tr1細胞或Th3細胞)可在正常免疫反應期間產生。

自然殺手細胞(或NK細胞)為形成先天免疫系統之一部分的一種細胞溶解細胞。NK細胞以MHC非依賴性方式提供對來自病毒感染細胞之先天性信號的快速反應。NK細胞(屬於先天性淋巴樣細胞之群)定義為大型顆粒狀淋巴球(LGL)且構成區別於產生B及T淋巴球之常見淋巴樣前驅細胞之第三種類細胞。

在某些實施例中，本發明之治療性細胞包含經工程改造以表現CoStAR之自體細胞。在某些實施例中，本發明之治療性細胞包含經工程改造以表現CoStAR之同種異體細胞。歸因於接受體同種異體抗原之TCR介導之識別，表現CoStAR之自體細胞可有利地避免避開移植物抗宿主病(GVHD)。此外，CoStAR接受體之免疫系統可攻擊輸注之CoStAR細胞，引起排斥反應。在某些實施例中，為預防GVHD及減少排斥反應，藉由基因組編輯自同種異體CoStAR細胞移除內源性TcR。 核酸

本發明之一態樣提供本發明之核酸序列，其編碼本文中所描述之CoStAR、多肽或蛋白質中之任一者(包括其功能部分及功能變異體)。如本文所用，術語「聚核苷酸」、「核苷酸」及「核酸」既定為彼此同義。技術人員應理解，由於遺傳密碼之簡併，大量不同聚核苷酸及核酸可編碼相同的多肽。另外，應理解，技術人員可使用常規技術進行不影響由本文所描述之聚核苷酸編碼之多肽序列的核苷酸取代，以反映多肽將在其中表現之任何特定宿主生物體之密碼子用途(例如密碼子最佳化)。根據本發明之核酸可包含DNA或RNA。其可為單股或雙股的。其亦可為在其內包括合成或經修飾之核苷酸之聚核苷酸。對寡核苷酸之多種不同類型之修飾為此項技術中已知的。此等修飾包括甲基膦酸酯及硫代磷酸酯主鏈，在分子之3'端及/或5'端處添加吖啶或聚離胺酸鏈。出於本發明之目的，應瞭解，聚核苷酸可藉由此項技術中可獲得之任何方法修飾。可進行此類修飾以便增強所關注聚核苷酸之活體內活性或壽命。

關於核苷酸序列之術語「變異體」、「同系物」或「衍生物」包括來自或關於序列之一個(或多個)核酸之任何取代、變化、修飾、置換、缺失或添加。

核酸序列可以編碼展示為SEQ ID NO:2之蛋白質序列或其變異體。核苷酸序列可包含經密碼子最佳化之核酸序列，其顯示為經工程改造以表現於人類細胞中。

本發明亦提供核酸序列，其包含編碼CoStAR之核酸序列及編碼T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)之另一核酸序列。

核酸序列可藉由允許兩個或更多個核酸序列之共同表現的序列接合。舉例而言，構築體可包含內部啟動子、內部核糖體進入序列(IRES)或編碼裂解位點之序列。裂解位點可自我裂解，使得當產生多肽時，不需要任何外部裂解活性即裂解為離散蛋白質。已知各種自我裂解位點，包括口蹄疫病毒(FMDV)及2A自我裂解肽。共同表現序列可為內部核糖體進入序列(IRES)。共同表現序列可為內部啟動子。 載體

在一態樣中，本發明提供一種載體，其包含本發明之核酸序列或核酸構築體。

此類載體可用於將核酸序列或核酸構築體引入宿主細胞中，使得其表現一或多種根據本發明之第一態樣之CoStAR及視情況選用之一或多種其他所關注蛋白質(POI)，例如TCR或CAR。載體可例如為質體或病毒載體，諸如反轉錄病毒載體或慢病毒載體，或基於轉座子之載體或合成mRNA。

本發明之核酸亦可用於使用標準基因遞送方案的核酸免疫接種及基因療法。基因遞送方法為此項技術中已知的。參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，該等專利以全文引用之方式併入本文中。

源自反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為達成長期基因轉移之適合工具，因為其允許一或多種轉殖基因之長期穩定整合及其在子細胞中之傳播。載體可能夠轉染或轉導包括T細胞或NK細胞之淋巴球。本發明亦提供其中插入有本發明之核酸的載體。編碼CoStAR及視情況選用之TCR或CAR之天然或合成核酸之表現通常藉由將編碼CoStAR及TCR/CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至一或多種啟動子且將構築體併入表現載體中來達成。

其他啟動子元件(例如強化子)調控轉錄起始頻率。通常，此等元件位於起始位點上游30-110 bp區中，但多個啟動子最近已展示含有亦位於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間的間距通常為靈活的，使得當元件相對於彼此倒置或移動時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始下降之前可增加至相隔50 bp。

適合啟動子之一個實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅使任何與其可操作地連接之聚核苷酸序列之高表現量的強組成性啟動子序列。適合啟動子之另一實例為延伸生長因子-1α (EF-1α)。然而，亦可使用其他組成性啟動子序列，包括(但不限於)猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、MSCV啟動子、MND啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。

載體可適合於真核宿主細胞中之複製及整合。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調節所需核酸序列表現之啟動子。病毒載體技術為此項技術中所熟知且描述於例如Sambrook等人(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)及其他病毒學及分子生物學手冊中，亦參見WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號。在一些實施例中，所表現之構築體如SEQ ID NO:32-65及67-79中所示。在一些實施例中，核酸為多順反子構築體，其允許在單一啟動子控制下表現多個轉殖基因(例如CoStAR及TCR及/或CAR等)。在一些實施例中，轉殖基因(例如CoStAR及TCR及/或CAR等)由自我裂解2A肽分隔。適用於本發明之核酸構築體中之2A肽之實例包括F2A、P2A、T2A及E2A。在本發明之其他實施例中，本發明之核酸構築體為多順反子構築體，其包含兩個啟動子；一個啟動子驅動CoStAR表現且另一啟動子驅動TCR或CAR表現。在一些實施例中，本發明之雙啟動子構築體為單向的。在其他實施例中，本發明之雙啟動子構築體為雙向的。為評定CoStAR多肽或其部分之表現，待引入細胞中之表現載體亦可含有可選標記基因或報導基因或兩者以促進自設法經病毒載體轉染或經轉導之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。 細胞來源

在擴增及基因修飾之前，自受試者獲得細胞源，例如免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)。術語「受試者」欲包括可引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物)。受試者之實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。T細胞可獲自許多來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、肋膜積液、脾組織及腫瘤。

在一個態樣中，藉由溶解紅血球及例如藉由經由PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核球，自周邊血液淋巴球分離T細胞。T細胞可在血球分離中心及細胞儲存設施處收集，其中T細胞可經採集、維護且容易轉移。T細胞可低溫保存且儲存以供稍後使用。可判定及驗證儲存的可接受持續時間，且可為至多6個月、至多一年或更長。

在另一態樣中，腫瘤浸潤性細胞(TIL)例如藉由經碎斷、分割或酶消化之腫瘤活檢體或團塊自腫瘤分離及/或擴增。TIL可使用腫瘤活檢體作為起始物質在兩階段過程中產生：階段1 (通常在2至3小時內進行)：首先收集腫瘤物質且使用分割、酶消化及均質化進行處理以產生單細胞懸浮液，該懸浮液可直接冷凍保存以使起始物質穩定以用於後續製造，及階段2，其可發生數天或數年之後。階段2可經4週進行，其可為以階段1之產物解凍開始，及自腫瘤起始物質生長TIL (約2週)，隨後TIL細胞快速擴增過程(約2週)以增加細胞量且因此增加劑量的連續過程。可將TIL濃縮且在調配為細胞之液體懸浮液之前洗滌。

TIL群體可在收集後之任何時間點轉導。在某些實施例中，在解凍後，將低溫保存之TIL群體轉導以表現CoStAR。在某些實施例中，在自腫瘤起始物質過度生長或初始擴增期間，TIL群體經轉導以表現CoStAR。在某些實施例中，在REP期間(例如但不限於REP之約第8天至約第10天)，TIL群體經轉導以表現CoStAR。例示性TIL製備描述於申請人於2019年12月20日申請之美國專利申請案第62/951,559號中。

T細胞之特異性亞群，諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+T細胞可藉由正選擇或負選擇技術進一步分離。舉例而言，在一個態樣中，T細胞係藉由與抗CD3/抗CD28結合之珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以正向選擇所需T細胞的時間段來分離。在一個態樣中，該時間段為約30分鐘。在另一態樣中，該時間段在30分鐘至36小時或更長及其間所有整數值範圍內。在另一態樣中，該時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在又一較佳態樣中，該時間段為10至24小時。在一個態樣中，培育時間段為24小時。在相比於其他細胞類型存在極少T細胞之任何情況下可使用較長培育時間分離T細胞，諸如自腫瘤組織或免疫功能不全個體分離腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。另外，使用較長培育時間可提高捕捉CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單縮短或延長時間使T細胞結合於CD3/CD28珠粒及/或藉由增加或降低珠粒與T細胞之比率(如本文進一步描述)，對於或針對在培養起始時或在該方法期間之其他時間點可優先選擇T細胞之亞群。另外，藉由增加或降低珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，對於或針對在培養起始時或在其他所要時間點可優先選擇T細胞之亞群。熟習此項技術者將認識到在本發明之背景下亦可使用多輪選擇。在某些態樣中，可能需要進行選擇程序且在活化及擴展過程中使用「未經選擇之」細胞。「未經選擇之」細胞亦可經受其他多輪選擇。

藉由負選擇使T細胞群體富集可使用針對負選擇之細胞所獨特之表面標記的抗體之組合來實現。一種方法為經由負磁性免疫黏附或流動式細胞測量術分選及/或選擇細胞，該負磁性免疫黏附或流動式細胞測量術使用針對負選擇細胞上存在之細胞表面標記之單株抗體混合物。舉例而言，為了藉由負選擇使CD4+細胞富集，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中，可能需要富集或正選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、CD137、PD1、TIM3、LAG-3、CD150及FoxP3+之調節T細胞。或者，在某些態樣中，藉由抗C25結合之珠粒或其他類似選擇方法耗盡T調節細胞。

本文所描述之方法可包括例如使用例如本文所描述之負選擇技術選擇免疫效應細胞(例如，作為T調節細胞耗盡群體之T細胞、CD25+耗盡細胞)之特定亞群。較佳地，T調節耗盡細胞群體含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%之CD25+細胞。

可藉由正選擇技術富集特異性結合至目標抗原之CoStAR效應細胞的特定亞群。舉例而言，在一些實施例中，效應細胞係藉由與目標抗原結合之珠粒一起培育足以正選擇所需abTCR效應細胞之時間段來進行富集。在一些實施例中，該時間段為約30分鐘。在一些實施例中，時間段在30分鐘至36小時或更長(包括此等值之間的所有範圍)的範圍內。在一些實施例中，該時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在一些實施例中，該時間段為10至24小時。在一些實施例中，培育時間段為24小時。關於異質性細胞群體中以低含量存在之效應細胞之分離，使用較長培育時間(諸如24小時)可提高細胞產量。在任何相較於其他細胞類型存在較少效應細胞的情形中可使用較長培育時間分離效應細胞。熟習此項技術者將認識到在本發明之背景下亦可使用多輪選擇。

用於刺激的T細胞亦可在洗滌步驟後加以冷凍。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，細胞可懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為此項技術中已知且將適用於此情形，但一種方法涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO，或31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基或含有例如Hespan及PlasmaLyte A之其他適合細胞冷凍培養基，細胞接著在每分鐘1°之速率下冷凍至-80℃且以氣相儲存於液氮儲存槽中。可使用受控冷凍以及在-20℃下或在液氮中不受控冷凍之其他方法。 同種異體CoStAR

在本文所描述之實施例中，免疫效應細胞可為同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。舉例而言，細胞可為同種異體T細胞，例如缺乏內源性T細胞受體(TCR)及/或人類白血球抗原(HLA)(例如HLA I類及/或HLA II類)表現之同種異體T細胞。

缺乏功能性內源性TCR之T細胞可例如經工程改造使得其不在其表面上表現任何功能性TCR，經工程改造使得其不表現包含功能性TCR的一或多個次單元(例如，經工程改造使得其不表現TCR α、TCR β、TCR γ、TCR δ、TCR ε及/或TCR ξ (或展現其降低之表現))，或經工程改造使得其在其表面上產生極少功能性TCR。或者，T細胞可表現實質上受損TCR，例如藉由表現TCR之一或多個次單元之突變或截短形式。術語「實質上受損TCR」意謂此TCR將不會在宿主中引起不良免疫反應。

本文所描述之T細胞可例如經工程改造以使其不在其表面上表現功能性HLA。舉例而言，本文所描述之T細胞可經工程改造以使得HLA (例如HLA 1類及/或HLA II類)之細胞表面表現下調。在一些態樣中，HLA下調可藉由減少或消除β-2微球蛋白(B2M)之表現來實現。

在一些實施例中，T細胞可缺乏功能性TCR及功能性HLA，例如HLA I類及/或HLA II類。缺乏功能性TCR及/或HLA表現之經修飾T細胞可藉由任何適合方式獲得，包括一或多個TCR或HLA次單元之基因剔除或阻斷基因表現。舉例而言，T細胞可包括使用siRNA、shRNA、簇集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)阻斷TCR及/或HLA之基因表現。

在一些實施例中，同種異體細胞可為不表現抑制性分子或以低含量表現抑制性分子之細胞，例如藉由本文所描述之任何方法工程改造之細胞。舉例而言，細胞可為不表現抑制性分子或以低含量表現抑制性分子之細胞，該抑制性分子例如可降低CoStAR表現細胞建立免疫效應反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、Gal9、腺苷及TGFR β。抑制性分子之抑制，例如在DNA、RNA或蛋白質含量上之抑制，可使CAR表現細胞效能最佳。在實施例中，可使用例如如本文所描述之抑制性核酸(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、簇集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)。

使用siRNA及shRNA抑制內源性TCR或HLA

在一些實施例中，T細胞中之TCR表現及/或HLA表現可使用靶向編碼TCR及/或HLA之核酸的siRNA或shRNA及/或本文所描述之抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、Gal9、腺苷及TGFR β)抑制。

可使用任何習知表現系統(例如，慢病毒表現系統)實現T細胞中siRNA及shRNA之表現。下調TCR之組分之表現的例示性shRNA描述於例如US公開案第2012/0321667號中。下調HLA I類及/或HLA II類基因表現之例示性siRNA及shRNA描述於例如美國公開案第US 2007/0036773號中。

抑制TCR或HLA之CRISPR

如本文所用之「CRISPR」或「抑制TCR及/或HLA之CRISPR」係指一組叢集規律性間隔之短回文重複序列或包含此類一組重複之系統。如本文所用，「Cas」係指CRISPR相關蛋白質。「CRISPR/Cas」系統係指來源於可用於使TCR及/或HLA基因靜默或突變之CRISPR及Cas及/或本文所描述之抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)的系統。

天然產生之CRISPR/Cas系統發現於約40%定序真細菌基因組及90%定序古菌中。Grissa等人(2007) BMC Bioinformatics 8: 172。此系統為原核免疫系統類型，其賦予外來遺傳元件(諸如質體及噬菌體)以抗性且提供後天性免疫性形式。Barrangou等人(2007) Science 315: 1709-1712; Marragini等人( 2008) Science 322: 1843-1845。

T細胞之活化及擴增

T細胞通常可以如以下中所描述之方法活化及擴增：例如美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號。

一般而言，本發明之T細胞可以藉由與表面接觸來擴增，該表面連接有刺激CD3/TCR複合體相關信號的藥劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子的配位體。詳言之，T細胞群體可如本文所描述刺激，諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定於表面上之抗CD2抗體，或藉由與蛋白激酶C活化因子(例如苔蘚抑素)以及鈣離子載體接觸。為了共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配位體。舉例而言，可以使T細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，可使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)，可按此項技術中通常已知之其他方法使用(Berg等人, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen等人, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland等人, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。

在一些實施例中，擴增可使用燒瓶或容器或熟習此項技術者已知之透氣容器進行且可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天、約7天至約14天、約8天至約14天、約9天至約14天、約10天至約14天、約11天至約14天、約12天至約14天、或13天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約14天。

在某些實施例中，擴增可在介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激進行。非特異性T細胞受體刺激物可包括例如抗CD3抗體，諸如約30 ng/ml OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, N.J.或Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.)或UHCT-1 (可購自BioLegend, San Diego, Calif., USA)。CoStAR細胞可藉由視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)之存在下包括癌症之一或多種抗原(包括其抗原部分，諸如抗原決定基)而活體外擴增，該一或多種抗原可視情況自載體表現，該載體諸如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3. mu.MMART-1:26-35(27L)或gp100:209-217 (210M)。其他適合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。CoStAR細胞亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈現細胞上之癌症的相同一或多種抗原再刺激而快速擴增。或者，CoStAR細胞可進一步用例如實例經輻射之自體淋巴球或用經輻射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2刺激。在一些實施例中，刺激作為擴增之部分發生。在一些實施例中，擴增在經輻射之自體淋巴球或經輻射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下發生。

在某些實施例中，細胞培養基包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL、或約8000 IU/mL、或介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或8000 IU/mL與9000 IU/mL之間的IL-2。

在某些實施例中，細胞培養基包含OKT3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL、約1 μg/mL、或介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間、或介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT3抗體。

在某些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，在擴增期間可包括IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為擴增期間之組合。在一些實施例中，可包括IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合。

在某些實施例中，擴增可在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞之補充細胞培養基中進行。

在某些實施例中，擴增培養基包含約500 IU/mL之IL-15、約400 IU/mL之IL-15、約300 IU/mL之IL-15、約200 IU/mL之IL-15、約180 IU/mL之IL-15、約160 IU/mL之IL-15、約140 IU/mL之IL-15、約120 IU/mL之IL-15、或約100 IU/mL之IL-15、或約500 IU/mL之IL-15至約100 IU/mL之IL-15、或約400 IU/mL之IL-15至約100 IU/mL之IL-15、或約300 IU/mL之IL-15至約100 IU/mL之IL-15或約200 IU/mL之IL-15、或約180 IU/mL之IL-15。

在一些實施例中，擴增培養基包含約20 IU/mL之IL-21、約15 IU/mL之IL-21、約12 IU/mL之IL-21、約10 IU/mL之IL-21、約5 IU/mL之IL-21、約4 IU/mL之IL-21、約3 IU/mL之IL-21、約2 IU/mL之IL-21、約1 IU/mL之IL-21、或約0.5 IU/mL之IL-21、或約20 IU/mL之IL-21至約0.5 IU/mL之IL-21、或約15 IU/mL之IL-21至約0.5 IU/mL之IL-21、或約12 IU/mL之IL-21至約0.5 IU/mL之IL-21、或約10 IU/mL之IL-21至約0.5 IU/mL之IL-21、或約5 IU/mL之IL-21至約1 IU/mL之IL-21、或約2 IU/mL之IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL之IL-21或約0.5 IU/mL之IL-21。

在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞(APC)為PBMC。在實施例中，在擴增中CoStAR細胞與PBMC及/或抗原呈現細胞之比率為約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400或約1:500、或介於1:50至1:300之間、或介於1:100與1:200之間。

在某些態樣中，T細胞之主要刺激信號及共刺激信號可藉由不同方案提供。舉例而言，提供各信號之試劑可在溶液中或偶合至表面。當偶合至表面時，試劑可偶合至同一表面(亦即，以「順式」形式)或偶合至獨立表面(亦即，以「反式」形式)。或者，一種試劑可偶合至表面且另一試劑在溶液中。在一個態樣中，提供協同刺激信號之試劑結合至細胞表面且提供初級活化信號之試劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種試劑可在溶液中。在一個態樣中，該等試劑可呈可溶形式，且隨後交聯至表面(諸如表現Fc受體之細胞，或抗體，或將結合於該等試劑之其他結合劑)。就此而言，人工抗原呈現細胞(aAPC)參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號，其預期在本發明中用於活化及擴增T細胞。

在一個態樣中，兩種試劑固定於珠粒上，在同一珠粒上，亦即「順」；或在獨立珠粒上，亦即「反」。舉例而言，提供初級活化信號之試劑為抗CD3抗體或其抗原結合片段且提供共刺激信號之試劑為抗CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種試劑以等效分子量共同固定於同一珠粒。在一個態樣中，使用結合於用於CD4+ T細胞擴增及T細胞生長之珠粒的1:1比率之各抗體。在本發明之某些態樣中，使用一定比率之結合於珠粒之抗CD3:CD28抗體，使得觀測到T細胞擴增相較於使用1:1比率所觀測到的擴增增加。在一個特定態樣中，相較於使用1:1比率觀測到之擴增而言觀測到約1倍至約3倍之增加。在一個態樣中，結合至珠粒之CD3:CD28抗體的比率在100:1到1:100及其間的所有整數值範圍內。在本發明之一個態樣中，結合至粒子的抗CD28抗體比抗CD3抗體多，亦即，CD3:CD28比率小於一。在本發明之某些態樣中，結合於珠粒之抗CD28抗體與抗CD3抗體之比率大於2:1。在一個特定態樣中，使用1:100之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用1:75之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在另一態樣中，使用1:50之結合於珠粒的CD3:CD28抗體比率。在一個態樣中，使用1:30之結合至珠粒的CD3:CD28抗體比率。在一個較佳態樣中，使用1:10之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用1:3之結合於珠粒的CD3:CD28抗體比率。在又一個態樣中，使用3:1之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。

可使用1:500至500:1及其間之任何整數值的粒子與細胞之比率刺激T細胞或其他目標細胞。如一般技術者可容易瞭解，粒子與細胞之比率可視相對於目標細胞之粒徑而定。舉例而言，小型珠粒可僅結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞與粒子之比率在1:100至100:1及其間之任何整數值範圍內，且在其他態樣中，包含1:9至9:1及其間之任何整數值的比率亦可用於刺激T細胞。導致T細胞刺激的抗CD3及抗CD28偶合粒子比T細胞之比率可如上所指變化，然而，某些較佳值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1及15:1，一個較佳比率為至少1:1粒子/T細胞。在一個態樣中，使用1:1或更小的粒子與細胞之比率。在一個特定態樣中，較佳粒子:細胞比率為1:5。在其他態樣中，粒子與細胞之比率可視刺激天數而變化。舉例而言，在一個態樣中，粒子與細胞之比率在第一天為1:1至10:1，且其後每天或每隔一天向細胞添加額外粒子長達10天，最終比率為1:1至1:10 (以添加當天之細胞計數計)。在一個特定態樣中，刺激第一天粒子與細胞之比率為1:1且在刺激第三天及第五天調整至1:5。在一個態樣中，在每天或每隔一天基礎上添加粒子直至第一天的最終比率為1:1，且刺激第三天及第五天為1:5。在一個態樣中，粒子與細胞之比率在刺激第一天為2:1且在刺激第三天及第五天調整至1:10。在一個態樣中，在每天或每隔一天基礎上添加粒子直至第一天的最終比率為1:1，且刺激第三天及第五天為1:10。熟習此項技術者將瞭解多種其他比率可適於本發明。詳言之，比率將視粒徑及細胞尺寸及類型而變化。在一態樣中，第一天使用之最典型比率為約1:1、2:1及3:1。

在本發明之其他態樣中，細胞(諸如T細胞)與經試劑塗佈之珠粒組合，隨後分離珠粒與細胞，且隨後培養細胞。在替代態樣中，在培養之前，經試劑塗佈之珠粒及細胞不分離，而是一起培養。在另一態樣中，珠粒及細胞首先藉由施加力(諸如磁力)集中，導致細胞表面標記之接合增加，進而誘導細胞刺激。 CoStAR細胞之製備

基於病毒及非病毒之基因工程改造工具可用於產生CoStAR細胞，包括(但不限於) T細胞、導致治療性基因之永久或短暫表現的NK細胞。基於反轉錄病毒之基因遞送為成熟的充分表徵之技術，其已用於將CAR永久地整合至宿主細胞基因組中(Scholler J., 例如Decade-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T cells. Sci. Transl. Med. 2012;4:132ra53; Rosenberg S.A.等人，Gene transfer into humans - immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. N. Engl. J. Med. 1990;323:570-578)

亦可使用非病毒DNA轉染方法。舉例而言，Singh等人描述使用經開發用於對CAR T細胞進行工程改造之睡美人(SB)轉座子系統(Singh H.等人，Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 2008;68:2961-2971)且用於臨床試驗中(參見例如ClinicalTrials.gov: NCT00968760及NCT01653717)。相同技術適用於對CoStAR細胞進行工程改造。

已使用多種SB酶遞送轉基因。Mátés描述在與第一代轉座酶相比時效率提高約100倍之高度活性轉座酶(SB100X)。SB100X支援富集於造血幹細胞或前驅細胞中之人類CD34(+)細胞的35至50%穩定基因轉移(Mátés L.等人，Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat. Genet. 2009;41:753-761)且多個轉基因可自多順反子單質體(例如Thokala R.等人，Redirecting specificity of T cells using the Sleeping Beauty system to express chimeric antigen receptors by mix-and-matching of VL and VH domains targeting CD123+ tumors. PLoS ONE. 2016;11:e0159477)或多個質體(例如，Hurton L.V.等人，Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016;113:E7788-E7797)遞送。此類系統與本發明之CoStAR一起使用。

Morita等人描述用以整合較大轉基因之piggyBac轉座子系統(Morita D.等人，Enhanced expression of anti-CD19 chimeric antigen receptor in piggyBac transposon-engineered T cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2017;8:131-140)。Nakazawa等人描述使用該系統產生表現HER2特異性嵌合抗原受體之EBV特異性細胞毒性T細胞(Nakazawa Y等人，PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 2011;19:2133-2143)。Manuri等人使用該系統產生CD-19特異性T細胞(Manuri P.V.R.等人，piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 2010;21:427-437)。

轉座子技術為容易且經濟的。一個潛在缺點為當前採用之較長擴增方案可能導致T細胞分化、減弱之活性及輸注細胞之不良留存性。Monjezi等人描述開發微型環載體，其經由較高效率整合使此等困難降至最低(Monjezi R.等人，Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 2017;31:186-194)。此等轉座子技術可用於本發明之CoStAR。 醫藥組合物

本發明亦關於一種醫藥組合物，其含有本發明之載體或CoStAR表現細胞以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及視情況選用之一或多種其他醫藥活性多肽及/或化合物。

在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含上文所描述之CoStAR及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含編碼根據上文所述實施例中之任一者之CoStAR的核酸及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含表現上述CoStAR之效應細胞及醫藥學上可接受之載劑。此類調配物可例如呈適合於靜脈內輸注之形式。

如本文所用，「醫藥學上可接受」或「藥理學相容性」意謂在生物學上或在其他方面無不良影響之材料，例如，該材料可併入投與患者之醫藥組合物中而不會引起任何顯著不良生物學效應或以有害方式與含有其之組合物中的任何其他組分相互作用。醫藥學上可接受之載劑或賦形劑較佳滿足毒理學及製造測試之必需標準及/或包括於美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug administration)制定之非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。

本發明之一態樣提供表現重組CoStAR之經修飾T細胞群體。適合群體可藉由上文所描述之方法產生。

經修飾T細胞之群體可用作藥劑。舉例而言，如本文中所描述之經修飾T細胞的群體可用於癌症免疫療法療法，例如過繼T細胞療法中。

本發明之其他態樣提供如本文所描述之經修飾T細胞群體用於製造供治療癌症用之藥劑的用途、用於治療癌症之如本文所描述之經修飾T細胞群體，且治療癌症之方法可包含向有需要之個體投與如本文所描述之經修飾T細胞群體。

經修飾T細胞群體可為自體的，亦即，經修飾T細胞最初自其隨後投與其之同一個體獲得(亦即供體及接受者個體相同)。適用於向個體投與之經修飾T細胞群體可藉由包含以下之方法產生：提供自個體獲得之初始T細胞群體；修飾T細胞以表現cAMP PDE或其片段及特異性結合於受試者中之癌細胞之抗原受體；及培養經修飾T細胞。

經修飾T細胞群體可為同種異體的，亦即經修飾T細胞最初自不同個體獲得至其隨後投與之受試者(亦即供體及受體受試者不同)。供體及接受者個體可為HLA匹配的，以避免GVHD及其他不合需要之免疫效應。適用於向接受者個體投與之經修飾T細胞群體可藉由包含以下之方法產生：提供自供體受試者獲得之初始T細胞群體；修飾T細胞以表現特異性結合於受體受試者中之癌細胞的CoStAR；及培養經修飾T細胞。

在投與經修飾之T細胞之後，接受者個體可展現針對接受者個體中之癌細胞的T細胞介導之免疫反應。此可對個體中之癌症病狀具有有益作用。

癌症病狀的特徵可在於惡性癌細胞之異常增殖且可包括白血病，諸如AML、CML、ALL及CLL；淋巴瘤，諸如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤及多發性骨髓瘤；及實體癌，諸如肉瘤、皮膚癌、黑色素瘤、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸癌、食道癌、胰臟癌、腎癌、腎上腺癌、胃癌、睪丸癌、膽囊及膽道癌、甲狀腺癌、胸腺癌、骨癌、腦癌以及未知原發性癌症(CUP)。

個體內之癌細胞可與受試者中之正常體細胞免疫不同(亦即癌性腫瘤可為免疫原性的)。舉例而言，癌細胞可能能夠在個體中誘發針對癌細胞所表現之一或多種抗原的全身性免疫反應。引發免疫反應之腫瘤抗原可對癌細胞具有特異性或可由個體中之一或多個正常細胞共有。

適合於如上文所描述治療之個體可為哺乳動物，諸如嚙齒動物(例如天竺鼠、倉鼠、大鼠、小鼠)、鼠類(例如小鼠)、犬類(例如犬)、貓類(例如貓)、馬類(例如馬)、靈長類動物、猿猴(例如猴或類人猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、類人猿(例如大猩猩、黑猩猩、紅毛猩猩、長臂猿)或人類。

在較佳實施例中，個體為人類。在其他較佳實施例中，可採用非人類哺乳動物，尤其習知地用作在人類(例如鼠類、靈長類動物、豬、犬或兔動物)中展現治療功效之模型的哺乳動物。 治療方法

術語「治療有效量」係指如本文所揭示之CoStAR或包含CoStAR之組合物在個體中有效「治療」疾病或病症的量。在癌症的情況下，如本文所揭示之CoStAR或包含CoStAR之組合物的治療有效量可以減少癌細胞數目；減小腫瘤尺寸或重量；抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳為終止)癌細胞浸潤至周邊器官；抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳為終止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕一或多種與癌症有關的症狀。在如本文所揭示之CoStAR或包含CoStAR之組合物可阻止生長及/或殺死現有癌細胞之程度上，其可為細胞生長抑制及/或細胞毒性的。在一些實施例中，治療有效量為生長抑制量。在一些實施例中，治療有效量為改良患者之無進展存活期的量。在諸如病毒感染之傳染性疾病之情況下，如本文所揭示之CoStAR或包含CoStAR之組合物的治療有效量可減少受到病原體感染之細胞的數目；減少源自病原體之抗原的產生或釋放；抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳終止)病原體擴散至未感染細胞中；及/或在一定程度上減輕一或多種與感染相關之症狀。在一些實施例中，治療有效量為延長患者存活期之量。

用於本發明之方法中的表現CoStAR之細胞，包括T及NK細胞，可自患者自身周邊血液(自體)離體產生，或在來自供體周邊血液(同種異體)或未連接供體(同種異體)之周邊血液的造血幹細胞移植環境中產生。或者，T細胞或NK細胞可衍生自誘導性前驅細胞或胚胎前驅細胞向T細胞或NK細胞之活體內分化。在此等情況下，藉由引入編碼CoStAR及視情況選用之CAR及/或TCR之DNA或RNA，藉由包括用病毒載體轉導、用DNA或RNA轉染之許多方式中之一者產生表現CoStAR及視情況選用之CAR及/或TCR之T細胞。

表現本發明之CoStAR且視情況表現TCR及/或CAR之T或NK細胞可用於治療血液癌或實體腫瘤。

用於治療疾病之方法係關於本發明之載體或細胞(包括T或NK細胞)之治療用途。就此而言，載體或T或NK細胞可投與患有現有疾病或病狀之受試者以便減輕、減少或改良至少一種與疾病相關之症狀及/或減緩、減少或阻斷疾病進展。本發明之方法可引起或促進T細胞介導之癌細胞殺滅。根據本發明之載體或T或NK細胞可與一或多種另外的治療劑一起投與患者。一或多種另外的治療劑可共投與患者。「共投與」意謂在時間上足夠接近地投與一或多種另外治療劑及本發明之載體或T或NK細胞以使得載體或T或NK細胞可增強一或多種另外治療劑之作用，或反之亦然。就此而言，首先可投與載體或細胞，且其次可投與一或多種另外治療劑，或反之亦然。或者，載體或細胞及一或多種另外治療劑可同時投與。可能適用的一種共投與治療劑為IL-2，因為其當前用於現有細胞療法中以加強所投與細胞之活性。然而，IL-2治療與毒性及耐受性問題相關。

如所提及，為了向患者投與，CoStAR效應細胞對於患者可為同種異體或自體的。在某些實施例中，同種異體細胞進一步例如藉由基因編輯經基因修飾，以便使針對CoStAR細胞之GVHD及/或患者免疫反應降至最低或對其進行預防。

CoStAR效應細胞用於治療與目標抗原相關之癌症及贅生性疾病。可使用本文所描述之方法中的任一者治療之癌症及贅生性疾病包括未血管化或尚未實質上血管化之腫瘤，以及血管化腫瘤。癌症可包含非實體腫瘤(諸如血液腫瘤，例如白血病及淋巴瘤)或可包含實體腫瘤。待用本發明之CoStAR效應細胞治療之癌症的類型包括(但不限於)癌瘤、母細胞瘤及肉瘤，以及某些白血病或淋巴惡性病、良性及惡性腫瘤，以及例如肉瘤、癌瘤與黑色素瘤等惡性病。成人腫瘤/癌症及小兒腫瘤/癌症亦包括在內。

血液癌為血液或骨髓之癌症。血液(或血性)癌之實例包括白血病，包括急性白血病(諸如急性淋巴球性白血病、急性骨髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病及骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅白血病)、慢性白血病(諸如慢性骨髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴球性白血病)、真性紅血球增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(頑固性及高級形式)、多發性骨髓瘤、漿細胞瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈病、骨髓發育不良症候群、毛細胞白血病及骨髓發育不良。

實體腫瘤為通常不含有囊腫或液體區域之異常組織塊體。實體腫瘤可為良性或惡性的。不同類型的實體腫瘤關於形成其之細胞類型命名(諸如肉瘤、癌瘤及淋巴瘤)。諸如肉瘤及癌瘤之實體腫瘤之實例包括腎上腺皮質癌、膽管癌、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胃癌、淋巴惡性病、胰臟癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺癌(例如，甲狀腺髓質癌及乳頭狀甲狀腺癌)、嗜鉻細胞瘤、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨膜癌、威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌(例如，子宮頸癌瘤及侵襲前子宮頸發育不良)、結腸直腸癌、肛門癌、肛管癌或肛腸癌、陰道癌、外陰癌(例如，鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌及纖維肉瘤)、陰莖癌、口咽癌、食道癌、頭癌(例如，鱗狀細胞癌)、頸癌(例如，鱗狀細胞癌)、睪丸癌(例如，精細胞癌、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、絨毛膜癌、肉瘤、萊迪希氏細胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤及脂肪瘤)、膀胱癌、腎癌、黑色素瘤、子宮癌(例如，子宮內膜癌)、尿道上皮癌(例如，鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌、輸尿管癌及膀胱癌)、以及CNS腫瘤(諸如神經膠質瘤(諸如腦幹神經膠質瘤及混合神經膠質瘤)、神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤)、星形細胞瘤、CNS淋巴瘤、胚細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤及腦轉移瘤)。

當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，待投與之本發明組合物之精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及患者(受試者)病狀的差異來決定。一般可規定包含本文所描述之T細胞之醫藥組合物可以10 ⁴至10 ⁹個細胞/公斤體重，在一些情況下10 ⁵至10 ⁶個細胞/公斤體重(包括彼等範圍內之全部整數值)之劑量投與。T細胞組合物亦可以此等劑量多次投與。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如，Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。 組合療法

本文所描述之CoStAR表現細胞可與其他已知藥劑及療法組合使用。如本文中所使用，「組合」投與意謂在受試者受病症折磨之病程期間向受試者遞送兩種(或更多種)不同治療，例如，在受試者已被確診患有病症之後及在病症治癒或消除或出於其他原因治療停止之前，遞送兩種或更多種治療。在一些實施例中，當開始遞送第二治療時，第一治療之遞送仍存在以使得在投與方面存在重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「並行遞送」。在其他實施例中，一種治療之遞送在另一種治療遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，療法由於組合投與而更有效。舉例而言，相較於在第一治療不存在下投與第二治療將可見，第二治療更有效，例如使用較少第二治療即可見同等效果，或第二治療減輕症狀達更大程度，或對於第一治療可見類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀減輕，或與病症相關之其他參數大於在無另一治療存在下遞送一種治療所將觀測到的參數。兩種治療之效果可部分加合，完全加合或大於加合。遞送可使得所遞送之第一治療之效果在遞送第二治療時仍可偵測。

本文所描述之CoStAR表現細胞及至少一種另外治療劑可在相同或獨立組合物中同時投與或依序投與。對於依序投與，本文所描述之CAR表現細胞可首先投與，且其次可投與另外藥劑，或投與順序可顛倒。

CoStAR療法及/或其他治療劑、程序或模態在病症活躍期期間或在疾病緩解或不太活躍期期間投與。CoStAR療法可在其他治療之前、與治療並行、治療後或在病症緩解期間投與。

當組合投與時，療法及另外藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部可以與各藥劑例如以單一療法形式獨立使用之量或劑量相比更高、更低或相同的量或劑量投與。在某些實施例中，CoStAR療法、另外藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部之投與量或劑量與各藥劑例如以單一療法形式獨立使用之量或劑量相比更低(例如至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。在其他實施例中，引起所需作用(例如癌症治療)的CoStAR療法、另外藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部之量或劑量與各藥劑例如以單一療法形式獨立使用為達成相同治療作用所需之量或劑量相比更低(例如低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。

在其他態樣中，本文所描述之CoStAR表現細胞可用於治療方案與手術、化學療法、輻射、免疫抑制劑(諸如環孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲胺喋呤(methotrexate)、黴酚酸酯(mycophenolate)及FK506)、抗體或其他免疫消融劑，諸如CAMPATH、抗CD3抗體或其他抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、類固醇、FR901228、細胞介素、及放療、肽疫苗(諸如Izumoto等人 2008 J Neurosurg 108:963-971中所描述者)的組合。

在某些情況下，本發明之化合物與其他治療劑組合，諸如其他抗癌劑、抗過敏劑、抗噁心劑(或抗嘔吐劑)、疼痛舒解劑、細胞保護劑及其組合。

在一個實施例中，本文所描述之CoStAR表現細胞可與化學治療劑組合使用。例示性化學治療劑包括蒽環黴素(anthracycline)(例如，多柔比星(doxorubicin) (例如，脂質體多柔比星))、長春花生物鹼(vinca alkaloid) (例如，長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))、烷基化劑(例如，環磷醯胺、達卡巴嗪(decarbazine)、美法侖(melphalan)、異環磷醯胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide))、免疫細胞抗體(例如，阿侖單抗(alemtuzamab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、奧法木單抗(ofatumumab)、托西莫單抗(tositumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab))、抗代謝物(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑(例如，氟達拉濱))、mTOR抑制劑、TNFR糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白質(GITR)促效劑、蛋白酶體抑制劑(例如，阿克拉黴素A (aclacinomycin A)、膠毒素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))、免疫調節劑(諸如沙立度胺(thalidomide)或沙立度胺衍生物(例如，來那度胺(lenalidomide)))。

考慮用於組合療法中之一般化學治療劑包括白消安(busulfan) (Myleran®)、白消安注射液(Busulfex®)、克拉屈濱(cladribine) (Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射液(DepoCyt®)、鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride) (Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射液(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride) (Adriamycin®，Rubex®)、依託泊苷(etoposide) (Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)(Fludara®)、羥基脲(hydroxyurea) (Hydrea®)、艾達黴素(Idarubicin) (Idamycin®)、米托蒽醌(mitoxantrone) (Novantrone®)、津妥珠單抗奧吉妥珠單抗(Gemtuzumab Ozogamicin) (mylotarg®)。

在實施例中，考慮用於組合療法中之一般化學治療劑包括阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide) (Casodex®)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate) (Blenoxane®)、白消安(Myleran®)、白消安注射液(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine)(Xeloda®)、 N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin) (Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine) (BiCNU®)、氯丁酸氮芥(chlorambucil) (Leukeran®)、順鉑(cisplatin) (Platinol®)、克拉屈濱(cladribine) (Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射特(DepoCyt®)、達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC-Dome®)、放線菌素(放線菌素D，Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride)(Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射液(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、多烯紫杉醇(docetaxel) (Taxotere®)、鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)(Adriamycin®, Rubex®)、依託泊苷(etoposide) (Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate) (Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®, Efudex®)、氟他胺(flutamide) (Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(Gemcitabine) (二氟去氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羥基脲(Hydrea®)、艾達黴素(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(irinotecan) (Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲醯四氫葉酸鈣(leucovorin calcium)、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺喋呤(methotrexate) (Folex®)、米托蒽醌(Novantrone®)、麥羅塔(mylotarg)、紫杉醇(paclitaxel)(Taxol®)、菲尼克斯(phoenix)(釔90/MX-DTPA)、噴司他丁(pentostatin)、具有卡莫司汀植入之聚苯丙生20 (Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen)(Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide)(Vumon®)、6-硫代鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine) (Tirazone®)、注射用鹽酸拓朴替康(topotecan hydrochloride)(Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞賓(vinorelbine) (Navelbine®)。

治療可例如藉由腫瘤消退、腫瘤重量或尺寸收縮、進展時間、存活持續時間、無進展存活期、總反應率、反應持續時間、生活品質、蛋白質表現及/或活性來評估。可以採用測定療法功效之方法，包括例如經由放射學成像量測反應。 序列

以下序列包括完整CoStAR及CoStAR組分且為非限制性的。組分包括信號肽(SP)、結合域(BD)、連接子、間隔子及跨膜域(STM)、無細胞外或細胞內序列之CD28跨膜片段(STM-CD28TM)、細胞內信號域(SD)及CD40域及基序。SEQ ID NO: 33-108包含具有N端信號肽之CoStAR。整個蛋白質內之組分位置可自GenBank及其他來源確認。構築體及組分就精確尺寸及程度而言為說明性的且組件可來自多於一個來源。當存在超過一個細胞內傳訊域或傳訊片段時，多個域可為任何次序。應理解，儘管某些蛋白質在表現時可包含N端信號肽，但彼等信號肽在表現蛋白質時裂解且可能不完全裂解，且自其中移除信號肽之所得蛋白質包含在N端胺基酸之位置具有至多約五個胺基酸之變化的結合域。

序列表
ID NO:	組分	序列
1	SP-OSM	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASM
2	SP-PD1	MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGW
3	SP-TGIT	MRWCLLLIWA QGLRQAPLAS G
4	BD1-MOV19	QVQLQQSGAE LVKPGASVKI SCKASGYSFT GYFMNWVKQS HGKSLEWIGR IHPYDGDTFY NQNFKDKATL TVDKSSNTAH MELLSLTSED FAVYYCTRYD GSRAMDYWGQ GTTVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIELTQS PASLAVSLGQ RAIISCKASQ SVSFAGTSLM HWYHQKPGQQ PKLLIYRASN LEAGVPTRFS GSGSKTDFTL NIHPVEEEDA ATYYCQQSRE YPYTFGGGTK LEIK
5	BD1-MFE23	QVQLQQSGAE LVRSGTSVKL SCTASGFNIK DSYMHWLRQG PEQGLEWIGW IDPENGDTEY APKFQGKATF TTDTSSNTAY LQLSSLTSED TAVYYCNEGT PTGPYYFDYW GQGTTVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSENVLT QSPAIMSASP GEKVTITCSA SSSVSYMHWF QQKPGTSPKL WIYSTSNLAS GVPARFSGSG SGTSYSLTIS RMEAEDAATY YCQQRSSYPL TFGAGTKLEL KR
6	BD1-PD1	RPGWFLDSPD RPWNPPTFSP ALLVVTEGDN ATFTCSFSNT SESFVLNWYR MSPSNQTDKL AAFPEDRSQP GQDCRFRVTQ LPNGRDFHMS VVRARRNDSG TYLCGAISLA PKAQIKESLR AELRVTERRA EVPTAH
7	BD1-TIGIT	MMTGTIETTG NISAEKGGSI ILQCHLSSTT AQVTQVNWEQ QDQLLAICNA DLGWHISPSF KDRVAPGPGL GLTLQSLTVN DTGEYFCIYH TYPDGTYTGR IFLEVLESSV AEHGARFQIP
8	3xA3xGS	AAAGSGGSG
9	BD2-PD1	RPGWFLDSPD RPWNPPTFSP ALLVVTEGDN ATFTCSFSNT SESFVLNWYR MSPSNQTDKL AAFPEDRSQP GQDCRFRVTQ LPNGRDFHMS VVRARRNDSG TYLCGAISLA PKAQIKESLR AELRVTERRA EVPTAH
10	BD2-TGIT	MMTGTIETTG NISAEKGGSI ILQCHLSSTT AQVTQVNWEQ QDQLLAICNA DLGWHISPSF KDRVAPGPGL GLTLQSLTVN DTGEYFCIYH TYPDGTYTGR IFLEVLESSV AEHGARFQIP
11	STM-spCD28	ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWV
12	STM-spCD8	FVPVFLPAKP TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACDIYIWA PLAGTCGVLL LSLVITLYCN HRN
13	STM-spIG4	ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGKM FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV
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20	Sig GITR	QLGLHIWQLR SQCMWPRETQ LLLEVPPSTE DARSCQFPEE ERGERSAEEK GRLGDLWV
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24	CD40_tandem	KKVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTQED GKESRISVQE RQKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQ
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36	OSM_MFE23_spCD28 _CD134_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRRDQR LPPDAHKPPG GGSFRTPIQE EQADAHSTLA KIKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQ
37	OSM_MFE23 _spCD28_CD2_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVKRKKQ RSRRNDEELE TRAHRVATEE RGRKPHQIPA STPQNPATSQ HPPPPPGHRS QAPSHRPPPP GHRVQHQPQK RPPAPSGTQV HQQKGPPLPR PRVQPKPPHG AAENSLSPSS NKKVAKKPTN KAPHPKQEPQ EINFPDDLPG SNTAAPVQET LHGCQPVTQE DGKESRISVQ ERQ
38	OSM_MFE23 _spCD28 _GITR_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVQLGLH IWQLRSQCMW PRETQLLLEV PPSTEDARSC QFPEEERGER SAEEKGRLGD LWVKKVAKKP TNKAPHPKQE PQEINFPDDL PGSNTAAPVQ ETLHGCQPVT QEDGKESRIS VQERQ
39	OSM_MFE23 _spCD28 _CD29_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVKLLMI IHDRREFAKF EKEKMNAKWD TGENPIYKSA VTTVVNPKYE GKKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQ
40	OSM_MFE23 _spCD28 _CD150_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRRRGK TNHYQTTVEK KSLTIYAQVQ KPGPLQKKLD SFPAQDPCTT IYVAATEPVP ESVQETNSIT VYASVTLPES KKVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTQED GKESRISVQE RQ
41	CTP190 OSM_MFE23 _spCD8_CD28_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS KKVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTQED GKESRISVQE RQ
42	CTP193 OSM_MFE23 _spCD8_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNK KVAKKPTNKA PHPKQEPQEI NFPDDLPGSN TAAPVQETLH GCQPVTQEDG KESRISVQER Q
43	CTP192 OSM_MFE23 _spCD8_CD137_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNR FSVVKRGRKK LLYIFKQPFM RPVQTTQEED GCSCRFPEEE EGGCEKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
44	OSM_MFE23 _spCD8_CD134_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNR RDQRLPPDAH KPPGGGSFRT PIQEEQADAH STLAKIKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKSR ISVQERQ
45	CTP191 OSM_MFE23 _spCD8_CD2_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNK RKKQRSRRND EELETRAHRV ATEERGRKPH QIPASTPQNP ATSQHPPPPP GHRSQAPSHR PPPPGHRVQH QPQKRPPAPS GTQVHQQKGP PLPRPRVQPK PPHGAAENSL SPSSNKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
46	OSM_MFE23 _spCD8_GITR_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNQ LGLHIWQLRS QCMWPRETQL LLEVPPSTED ARSCQFPEEE RGERSAEEKG RLGDLWVKKV AKKPTNKAPH PKQEPQEINF PDDLPGSNTA APVQETLHGC QPVTQEDGKE SRISVQERQ
47	OSM_MFE23_spCD8 _CD29_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNK LLMIIHDRRE FAKFEKEKMN AKWDTGENPI YKSAVTTVVN PKYEGKKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQ
48	OSM_MFE23_spCD8 _CD150_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPT IASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLV ITLYCNHRNR RRGKTNHYQT TVEKKSLTIY AQVQKPGPLQ KKLDSFPAQD PCTTIYVAAT EPVPESVQET NSITVYASVT LPESKKVAKK PTNKAPHPKQ EPQEINFPDD LPGSNTAAPV QETLHGCQPV TQEDGKESRI SVQERQ
49	CTP203 OSM_MFE23_spIG4 _CD28_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVRSKRSRL LHSDYMNMTP RRPGPTRKHY QPYAPPRDFA AYRSKKVAKK PTNKAPHPKQ EPQEINFPDD LPGSNTAAPV QETLHGCQPV TQEDGKESRI SVQERQ
50	OSM_MFE23 _spIG4_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVKKVAKKP TNKAPHPKQE PQEINFPDDL PGSNTAAPVQ ETLHGCQPVT QEDGKESRIS VQERQ
51	OSM_MFE23_spIG4 _CD137_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVKKVAKKP TNKAPHPKQE PQEINFPDDL PGSNTAAPVQ ETLHGCQPVT QEDGKESRIS VQERQ
52	OSM_MFE23_spIG4 _CD134_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVRRDQRLP PDAHKPPGGG SFRTPIQEEQ ADAHSTLAKI KKVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTQED GKESRISVQE RQ
53	OSM_MFE23_spIG4 _CD2_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVKRKKQRS RRNDEELETR AHRVATEERG RKPHQIPAST PQNPATSQHP PPPPGHRSQA PSHRPPPPGH RVQHQPQKRP PAPSGTQVHQ QKGPPLPRPR VQPKPPHGAA ENSLSPSSNK KVAKKPTNKA PHPKQEPQEI NFPDDLPGSN TAAPVQETLH GCQPVTQEDG KESRISVQER Q
54	OSM_MFE23_spIG4 _GITR_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVQLGLHIW QLRSQCMWPR ETQLLLEVPP STEDARSCQF PEEERGERSA EEKGRLGDLW VKKVAKKPTN KAPHPKQEPQ EINFPDDLPG SNTAAPVQET LHGCQPVTQE DGKESRISVQ ERQ
55	OSM_MFE23_spIG4 _CD29_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVKLLMIIH DRREFAKFEK EKMNAKWDTG ENPIYKSAVT TVVNPKYEGK KKVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTQED GKESRISVQE RQ
56	OSM_MFE23_spIG4 _CD150_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVRRRGKTN HYQTTVEKKS LTIYAQVQKP GPLQKKLDSF PAQDPCTTIY VAATEPVPES VQETNSITVY ASVTLPESKK VAKKPTNKAP HPKQEPQEIN FPDDLPGSNT AAPVQETLHG CQPVTQEDGK ESRISVQERQ
57	OSM_MFE23_spIG4 _CD40_tandem	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGKMFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTQED GKESRISVQE RQKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQKKVA
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59	CTP204 OSM_MFE23_PD1 _sCD28TM_CD28 _CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGRPGW FLDSPDRPWN PPTFSPALLV VTEGDNATFT CSFSNTSESF VLNWYRMSPS NQTDKLAAFP EDRSQPGQDC RFRVTQLPNG RDFHMSVVRA RRNDSGTYLC GAISLAPKAQ IKESLRAELR VTERRAEVPT AHCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQ
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82	OSM_MOV19_spIG4 _CD134_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGKMFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRRDQR LPPDAHKPPG GGSFRTPIQE EQADAHSTLA KIKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQ
83	OSM_MOV19_spIG4 _CD2_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGKMFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVKRKKQ RSRRNDEELE TRAHRVATEE RGRKPHQIPA STPQNPATSQ HPPPPPGHRS QAPSHRPPPP GHRVQHQPQK RPPAPSGTQV HQQKGPPLPR PRVQPKPPHG AAENSLSPSS NKKVAKKPTN KAPHPKQEPQ EINFPDDLPG SNTAAPVQET LHGCQPVTQE DGKESRISVQ ERQ
84	OSM_MOV19_spIG4 _GITR_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGKMFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVQLGLH IWQLRSQCMW PRETQLLLEV PPSTEDARSC QFPEEERGER SAEEKGRLGD LWVKKVAKKP TNKAPHPKQE PQEINFPDDL PGSNTAAPVQ ETLHGCQPVT QEDGKESRIS VQERQ
85	OSM_MOV19_spIG4 _CD29_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGKMFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVKLLMI IHDRREFAKF EKEKMNAKWD TGENPIYKSA VTTVVNPKYE GKKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQ
86	OSM_MOV19_spIG4 _CD150_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGKMFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRRRGK TNHYQTTVEK KSLTIYAQVQ KPGPLQKKLD SFPAQDPCTT IYVAATEPVP ESVQETNSIT VYASVTLPES KKVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTQED GKESRISVQE RQ
87	OSM_MOV19_spIG4 _CD40_tandem	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGKMFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQKKVAKK PTNKAPHPKQ EPQEINFPDD LPGSNTAAPV QETLHGCQPV TQEDGKESRI SVQERQKKVA
88	OSM_MOV19_spIG4 _CD40_P227A	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGKMFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVKKVAK KPTNKAAHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
89	CTP188 PD1_PD1_sCD28TM _CD28_CD40 (二聚)	MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHCPSPL FPGPSKPFWV LVVVGGVLAC YSLLVTVAFI IFWVRSKRSR LLHSDYMNMT PRRPGPTRKH YQPYAPPRDF AAYRSKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
90	PD1_PD1_sCD28TM _CD40	MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHCPSPL FPGPSKPFWV LVVVGGVLAC YSLLVTVAFI IFWVKKVAKK PTNKAPHPKQ EPQEINFPDD LPGSNTAAPV QETLHGCQPV TQEDGKESRI SVQERQ
91	TIGIT_TIGIT _CD28TM _CD28_CD40	MRWCLLLIWA QGLRQAPLAS GMMTGTIETT GNISAEKGGS IILQCHLSST TAQVTQVNWE QQDQLLAICN ADLGWHISPS FKDRVAPGPG LGLTLQSLTV NDTGEYFCIY HTYPDGTYTG RIFLEVLESS VAEHGARFQI PFWVLVVVGG VLACYSLLVT VAFIIFWVRS KRSRLLHSDY MNMTPRRPGP TRKHYQPYAP PRDFAAYRSK KVAKKPTNKA PHPKQEPQEI NFPDDLPGSN TAAPVQETLH GCQPVTQEDG KESRISVQER Q
92	TIGIT_TIGIT _CD28TM_CD40	MRWCLLLIWA QGLRQAPLAS GMMTGTIETT GNISAEKGGS IILQCHLSST TAQVTQVNWE QQDQLLAICN ADLGWHISPS FKDRVAPGPG LGLTLQSLTV NDTGEYFCIY HTYPDGTYTG RIFLEVLESS VAEHGARFQI PFWVLVVVGG VLACYSLLVT VAFIIFWVKK VAKKPTNKAP HPKQEPQEIN FPDDLPGSNT AAPVQETLHG CQPVTQEDGK ESRISVQERQ
93	OSM_MOV19_PD1 _sCD28TM_CD28 _CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGRP GWFLDSPDRP WNPPTFSPAL LVVTEGDNAT FTCSFSNTSE SFVLNWYRMS PSNQTDKLAA FPEDRSQPGQ DCRFRVTQLP NGRDFHMSVV RARRNDSGTY LCGAISLAPK AQIKESLRAE LRVTERRAEV PTAHCPSPLF PGPSKPFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVRSKRSRL LHSDYMNMTP RRPGPTRKHY QPYAPPRDFA AYRSKKVAKK PTNKAPHPKQ EPQEINFPDD LPGSNTAAPV QETLHGCQPV TQEDGKESRI SVQERQ
94	OSM_MOV19_PD1 _sCD28TM_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGRP GWFLDSPDRP WNPPTFSPAL LVVTEGDNAT FTCSFSNTSE SFVLNWYRMS PSNQTDKLAA FPEDRSQPGQ DCRFRVTQLP NGRDFHMSVV RARRNDSGTY LCGAISLAPK AQIKESLRAE LRVTERRAEV PTAHCPSPLF PGPSKPFWVL VVVGGVLACY SLLVTVAFII FWVKKVAKKP TNKAPHPKQE PQEINFPDDL PGSNTAAPVQ ETLHGCQPVT QEDGKESRIS VQERQ
95	OSM_MOV19_TIGIT _sCD28TM_CD28 _CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGMM TGTIETTGNI SAEKGGSIIL QCHLSSTTAQ VTQVNWEQQD QLLAICNADL GWHISPSFKD RVAPGPGLGL TLQSLTVNDT GEYFCIYHTY PDGTYTGRIF LEVLESSVAE HGARFQIPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQ
96	OSM_MOV19_TIGIT _sCD28TM_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVKPG ASVKISCKAS GYSFTGYFMN WVKQSHGKSL EWIGRIHPYD GDTFYNQNFK DKATLTVDKS SNTAHMELLS LTSEDFAVYY CTRYDGSRAM DYWGQGTTVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI ELTQSPASLA VSLGQRAIIS CKASQSVSFA GTSLMHWYHQ KPGQQPKLLI YRASNLEAGV PTRFSGSGSK TDFTLNIHPV EEEDAATYYC QQSREYPYTF GGGTKLEIKA AAGSGGSGMM TGTIETTGNI SAEKGGSIIL QCHLSSTTAQ VTQVNWEQQD QLLAICNADL GWHISPSFKD RVAPGPGLGL TLQSLTVNDT GEYFCIYHTY PDGTYTGRIF LEVLESSVAE HGARFQIPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ
97	連接子	GGGGSGGGGS GGGGS
98	經截短細胞質域CD28變異體	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKR
99	CD28.CD137融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSRFSVVKRG RKKLLYIFKQ PFMRPVQTTQ EEDGCSCRFP EEEEGGCE
100	CD28.CD134融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSRRDQRLPP DAHKPPGGGS FRTPIQEEQA DAHSTLAKI
101	CD28.CD2融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSKRKKQRSR RNDEELETRA HRVATEERGR KPHQIPASTP QNPATSQHPP PPPGHRSQAP SHRPPPPGHR VQHQPQKRPP APSGTQVHQQ KGPPLPRPRV QPKPPHGAAE NSLSPSSN
102	CD28.CD29融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSKLLMIIHD RREFAKFEKE KMNAKWDTGE NPIYKSAVTT VVNPKYEGK
103	CD28.GITR融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSQLGLHIWQ LRSQCMWPRE TQLLLEVPPS TEDARSCQFP EEERGERSAE EKGRLGDLWV
104	CD28.IL2Rγ融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSERTMPRIP TLKNLEDLVT EYHGNFSAWS GVSKGLAESL QPDYSERLCL VSEIPPKGGA LGEGPGASPC NQHSPYWAPP CYTLKPET
105	CD28.CD40融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSKKVAKKPT NKAPHPKQEP QEINFPDDLP GSNTAAPVQE TLHGCQPVTQ EDGKESRISV QERQ
106	CD28.CD150融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSRRRGKTNH YQTTVEKKSL TIYAQVQKPG PLQKKLDSFP AQDPCTTIYV AATEPVPESV QETNSITVYA SVTLPES
107	CD28.CD2.CD40融合物	NKILVKQSPM LVAYDNAVNL SCKYSYNLFS REFRASLHKG LDSAVEVCVV YGNYSQQLQV YSKTGFNCDG KLGNESVTFY LQNLYVNQTD IYFCKIEVMY PPPYLDNEKS NGTIIHVKGK HLCPSPLFPG PSKPFWVLVV VGGVLACYSL LVTVAFIIFW VRSKRSRLLH SDYMNMTPRR PGPTRKHYQP YAPPRDFAAY RSKRKKQRSR RNDEELETRA HRVATEERGR KPHQIPASTP QNPATSQHPP PPPGHRSQAP SHRPPPPGHR VQHQPQKRPP APSGTQVHQQKGPPLPRPRV QPKPPHGAAENSLSPSSNKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNT AAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
108	CD28(IEV)變異體	IEVMYPPPYL DNEKSNGTII HVKGKHLCPS PLFPGPSKPF WVLVVVGGVL ACYSLLVTVA FIIFWVRSKR SRLLHSDYMN MTPRRPGPTR KHYQPYAPPR DFAAYRS
109	CTP189 PD1_PD1_sCD28TM _CD28_CD40 (單體)	MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFWVLV VVGGVLACYS LLVTVAFIIF WVRSKRSRLL HSDYMNMTPR RPGPTRKHYQ PYAPPRDFAA YRSKKVAKKP TNKAPHPKQE PQEINFPDDL PGSNTAAPVQ ETLHGCQPVT QEDGKESRIS VQERQ
110	CTP195 OSM_MFE23_ spCD28 _CD28_CD40 (SVQE-AVQA)	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RIAVQARQ
111	CTP196 OSM_MFE23_ spCD28 _CD28_CD40 (PVQET-AVAEA)	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA AVAEALHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQ
112	CTP197 OSM_MFE23_ spCD28 _CD28_CD40 (PQEINF-AQAINF)	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAPHP KQEAQAINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQ
113	CTP198 OSM_MFE23_ spCD28_ _CD28_CD40 (P227A)	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAAHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQ
114	CTP199 OSM_MFE23 _spCD28_CD28 _CD40 (Q263A)	KKVAKKPTNK APHPKQEPQE INFPDDLPGS NTAAPVQETL HGCQPVTAED GKESRISVQE RQ
115	CTP200 OSM_MFE23 _spCD28 _CD28 _CD40_CD40_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTAEDGKES RISVQERQKK VAKKPTNKAP HPKQEPQEIN FPDDLPGSNT AAPVQETLHG CQPVTAEDGK ESRISVQERQ
116	CTP201 OSM_MFE23 _spCD28_CD28 (PYAPP-AYAA)_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQAYAAPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQ
117	CTP202 OSM_MFE23 _spCD28_CD28 (YMNM-FMNM)_CD40	MGVLLTQRTL LSLVLALLFP SMASMQVQLQ QSGAELVRSG TSVKLSCTAS GFNIKDSYMH WLRQGPEQGL EWIGWIDPEN GDTEYAPKFQ GKATFTTDTS SNTAYLQLSS LTSEDTAVYY CNEGTPTGPY YFDYWGQGTT VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS ENVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG TKLELKRAAA GSGGSGILVK QSPMLVAYDN AVNLSCKYSY NLFSREFRAS LHKGLDSAVE VCVVYGNYSQ QLQVYSKTGF NCDGKLGNES VTFYLQNLYV NQTDIYFCKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDFMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKKVA KKPTNKAPHP KQEPQEINFP DDLPGSNTAA PVQETLHGCQ PVTQEDGKES RISVQERQ
118	SH3 motif2	PTNKAPHP
119	SH3 motif3	PTNKAPH
120	TRAF2_motif4	PKQET
121	TRAF2_motif5	PVQET
122	TRAF2_motif6	SVQET
123	TRAF6-Motif2	QEPQEINFP

儘管已詳細描述本發明及其優點，但應理解，在不背離由所附申請專利範圍所限定之本發明之精神及範疇之情況下，本文可進行各種改變、取代及更改。

本發明將進一步說明於以下實例中，該等實例僅出於說明之目的而給出且不意欲以任何方式限制本發明。 實例 實例1 - 產生表現CoStAR之T細胞

材料及方法

構築體設計 -  MFE23 CoStAR由MFE23衍生之單鏈抗體片段核苷酸序列組成，其中抑瘤素M1前導序列融合至整個人類CD28核酸序列。CoStAR核苷酸序列經密碼子最佳化且由Genewiz Inc.基因合成。經由XbaI及NheI位點將構築體選殖至pSF.Lenti (Oxford Genetics)中。

慢病毒產生 - 使用三質體包裝系統(Cell Biolabs, San Diego, USA)，藉由將10 μg各質體加10 μg含有轉殖基因之pSF.Lenti慢病毒質體一起在含有50 mM CaCl ₂之無血清RPMI中混合來進行慢病毒產生。在75 cm ²燒瓶中將混合物逐滴添加至293T細胞之50%彙集單層中。在轉染後48及72 h收集病毒上清液，合併且根據製造商說明書使用LentiPac慢病毒上清液濃縮(GeneCopoeia, Rockville, Maryland, USA)溶液濃縮。慢病毒上清液經10倍濃縮且用於在4 μg/ml凝聚胺(Sigma-Aldrich, Dorset, UK)存在下直接感染初級人類T細胞。在根據製造商說明書用T細胞活化及擴增珠粒(Invitrogen)活化24小時之前，自正常健康供體分離周邊血液單核細胞，隨後添加慢病毒上清液。

使用CEA.hFc蛋白及抗hFc-PE次級抗體加上抗CD34-APC抗體或藉由單獨的抗CD34-PE抗體，在感染後96小時評定細胞轉導。隨後，藉由添加1 μg/ml PHA及200 IU/ml IL-2，在RPMI + 10% FCS中以1:20至1:200比率使用×10供體錯配輻射PBMC飼養細胞進一步擴增細胞。14天後，細胞係如先前染色且儲存起來以準備用於分析。

藉由混合CoStAR陽性或陰性細胞與野生型或經OKT3工程改造之CEA陽性LoVo或LS174T細胞進行功能性分析。簡言之，將T細胞與LoVo細胞以不同比率在96孔盤中混合且藉由ELISA量測IFNγ或IL-2。將剩餘細胞與1:10稀釋度之WST-1試劑(Sigma，UK)一起培育30分鐘，隨後在450 nm處讀取吸光度。細胞毒性%係使用以下等式=100- ((實驗讀數-單獨的T細胞)/(單獨的腫瘤))×100測定。

藉由首先在37℃下以1×10 ⁷個細胞/毫升之濃度用10 μM eFluor450增殖染料(eBioscience, UK)負載T細胞10 min，隨後在冰上在5體積的低溫T細胞培養基中培育細胞5 min來進行增殖分析。接著，過度洗滌細胞以移除未結合染料且添加至含有腫瘤細胞之共培養物。在2、6及10天移除細胞，添加1:200稀釋度之DRAQ7且使用MAC細胞儀及MACSQuantify軟體分析細胞。

藉由自孔採集細胞且用抗CD2 PerCP eFluor710抗體(eBioscience, UK)在暗處染色20 min，接著進行DRAQ7染色來進行細胞計數以用於增殖分析，且使用MACSQuant分析儀進行計數。

結果

初級人類T細胞係自獲自商業供應商(Lonza或NHSBT)之白血球層中分離。T細胞係藉由Ficoll介導之分離及T細胞陰性分離套組(StemCell)分離。將經分離之T細胞用人類T細胞活化及擴增珠粒(Invitrogen, UK)活化。將細胞與集中的慢病毒粒子一起培育且經數天擴增。慢病毒含有MFE.CoStAR.2A.tCD34構築體之DNA序列(MFE23.scFv經由2A裂解序列融合至與經截短人類CD34共同表現之全長人類CD28)。使用如材料及方法中所概述之經輻射飼養細胞進一步擴增成功轉導之細胞。供體1轉導率經量測為22.69% (17.15 CD34+/CoStAR+ 5.53% CD34-/CoStAR+)量測，供體2轉導率經量測為20.73%，且供體3轉導率經量測為13.34%。使用抗CD34抗體使表現CoStAR之細胞富集，以獲得大於90% CoStAR陽性之T細胞群體。

為了產生生理學相關活體外模型以測試CoStAR對T細胞活性之影響，針對CEA+腫瘤細胞株LoVo及LS174T測試未經轉導及經轉導之細胞。為了能夠回應於不匹配腫瘤株來活化T細胞，對腫瘤細胞進行工程改造以表現藉助於合成跨膜域錨定至細胞膜之抗CD3單鏈抗體片段，且使用IRES元件自GFP標記基因分裂以使用流動式細胞測量術來使經轉導之細胞可視。

自塊體轉染物產生LoVo及LS174T之單細胞純系。將未經轉導及經CoStAR轉導之T細胞以不同效靶比與野生型未經轉導或經OKT3工程改造之LS174T或LoVo細胞混合。在24小時之後，獲取共培養基用於IL-2 ELISA量測。回應於經OKT3工程改造之LS174T細胞，自來自三個供體之CoStAR+及CoStAR-T細胞群體觀測到活化依賴性IL-2分泌，其中自經轉導及未經轉導之T細胞中發現背景回應於未工程改造之腫瘤細胞的IL-2分泌(圖3 A-C)。在所有三個測試供體中發現針對經OKT3工程改造之腫瘤細胞之CoStAR增強型IL-2分泌。在8:1及16:1之E:T比率下的效應最明顯，且在較高E:T比率下，IL-2分泌過低而不能精確量測。在較低效靶比下，似乎非轉導細胞的IL-2分泌飽和。在LoVo細胞中重複此等觀測結果，其中測試針對LS174T之三個供體中之兩個，結果類似(圖3D及圖3E)。

為了測定CoStAR對T細胞擴增之影響，將經轉導或未經轉導之T細胞與野生型或OKT3-GFP工程改造之LoVo細胞混合，在3天之後對總細胞之數目進行計數。CoStAR增強在IL-2存在(圖4A)及IL-2不存在(圖4B)下經工程改造之T細胞回應於LoVo-OKT3而非野生型LoVo細胞的存活率及/或增殖。為進一步研究此現象，在來自兩個供體之T細胞中使用增殖染料進行細胞增殖分析以對各群體經6天所經歷之細胞週期的數目進行計數(圖4C及圖4D)。相比於未經工程改造之細胞，較大比例之經CoStAR工程改造之細胞在6天內回應於LoVo-OKT3經歷5、6或7個增殖週期，而經CoStAR轉導之細胞及未經轉導之細胞在相同持續時間內回應於野生型LoVo經歷平均約2個週期。

產生多種融合受體，其由CD28融合至另一N端共刺激域組成。選擇獲自以下之共刺激域：CD137、CD2、CD29、CD134、CD150、CD40、GITR，及來自IL-2受體γ-鏈(IL-2Rγ)之傳訊域。包括接近於用於誘導性共刺激之先前研究中的受體。經指定為CD28(IEV)之此受體經截短，使得CD28之C端基序為胺基酸三合物『IEV』。藉由Genewiz重新產生序列且在EF1α啟動子連同藉由2A自我裂解肽與融合CoStAR分離之CD34標記基因下選殖至慢病毒載體中。初級CD8+ T細胞係使用EasySep珠粒(StemCell Technologies)分離且在添加慢病毒粒子之前將其用抗CD3/抗CD28活化/擴增Dynabeads活化。在短擴增期之後，在包括抗CD107a抗體及佈雷菲爾德菌素及莫能菌素(monensin)的情況下，將細胞與LoVo或LoVo-OKT3細胞混合，且在16小時培育之後，固定該等細胞且用針對標記基因(CD34)的抗體以及針對IL-2、IFNγ及Bcl-xL的抗體將該等細胞染色。使用MACSQuant分析儀及MACSQuantify軟體進行分析。圖5展示來自CD34- (未經CoStAR轉導)及CD34+ (經CoStAR轉導)之IL-2反應。統計分析證明，當含有變異CoStAR受體時，所有所測試受體均誘導產生IL-2之細胞比例的顯著增加。同時量測三個其他讀數：IFNγ，一種在正常信號1條件下釋放但藉由共刺激增強之細胞介素；CD107a，一種脫粒標記；及Bcl-xL，一種藉由共刺激上調之抗凋亡蛋白質。CoStAR之接合按不同程度增強所有分析之效應功能。CD28.CD2及CD28.CD40融合受體似乎會引發所有所測試受體之最穩固反應(參見圖6)。 實例2

比較基於CD28及基於CD28.CD40之CoStAR對基於細胞介素分泌之群體的作用。來自三個供體之初級T細胞係經CD28(IEV)截短之CoStAR、全長CD28 CoStAR或CD28.CD40 CoStAR (具有全長CD28，如SEQ ID NO. 10中所示，但缺乏N端N及K殘基)轉導，或保持未經轉導。使用CD34標記基因針對CoStAR表現富集T細胞，且擴增後，將細胞與LoVo-OKT3細胞混合且藉由ELISA分析IL-2分泌(參見圖7)。未經轉導之細胞平均產生0.80 ng/ml IL-2，其中CD28 (IEV)及全長CD28 CoStAR分別產生4.6及5.0 ng/ml IL-2。然而，CD28.CD40平均跨越三個供體誘導29.0 ng/ml IL-2，因此證明將CD40併入至基礎基於CD28之CoStAR中有明顯益處。

接下來，分析CoStAR對T細胞擴增之作用。來自七個供體之T細胞係經具有抗CA125 (196-14)或抗葉酸受體(MOV19) scFv或抗葉酸受體肽(C7)抗原結合域之CD28或CD28.CD40 CoStAR轉導。另外的細胞係經含有抗CEA scFv之CD28 CoStAR轉導作為錯配對照。接著將細胞與CA125+/葉酸受體+/經工程改造以表現膜結合OKT3 (OvCAR-OKT3)之CEA-細胞株OvCAR3混合。7、14及21天後進行T細胞計數，且在第7及14天添加新鮮OvCAR-OKT3。觀測到含有抗CA125 scFv之有限細胞擴增(平均擴增倍數：CD28: 15.1；CD28.CD40: 69.1)，然而靶向具有scFv之葉酸受體之細胞會在CD28及CD28.CD40群組中進行擴增(平均擴增倍數：CD28: 186.7；CD28.CD40: 1295.0)。當C7肽用於靶向葉酸受體時可見更有限擴增(平均擴增倍數：CD28: 71.5；CD28. CD40：28.0)。對照CEA靶向受體表明有限擴增(平均擴增倍數：28.0)。

為較佳理解信號1 T細胞與信號2 T細胞之協同作用經鼠類恆定域修飾之TCR工程改造，該TCR在HLA-A*02以及靶向細胞表面CEA蛋白質之CD28或CD28.CD40 CoStAR的上下文中識別CEA肽(691至699)。作為對照，細胞亦用CA125特異性CD28 CoStAR轉導。將T細胞與HLA-A*02/CEA H508細胞混合且藉由細胞內流動式細胞測量術染色分析細胞介素產生。使用針對鼠類TCRβ恆定域(標記經TCR工程改造之細胞)以及DYKDDDDK (SEQ ID NO: 14)抗原決定基標籤(標記經CoStAR工程改造之細胞)的抗體進行流動式細胞測量術圈選。因此，有可能分析各共培養孔中之TCR-/CoStAR-、TCR+/CoStAR-、TCR-/CoStAR+及TCR+/CoStAR+細胞。隨後將細胞介素產生標繪於CD4+或CD8+ T細胞中之各亞群中(圖9)。在CD4+細胞中，CD28.CD40 CoStAR增強單獨TCR刺激以上之CD137及TNFα產生，然而，CD4+細胞中之TCR反應由於TCR對CD8之依賴性而不佳。在CD8+細胞中，IL-2及CD107a之效應子活性更穩固，尤其顯示CD28.CD40 CoStAR群組中之更強誘導。為更好地比較受體，在CD4+及CD8+細胞中標繪僅TCR+/CoStAR+群組中之效應子活性(圖10)。在CD4+細胞中，相較於CEA或錯配靶向CD28 CoStAR，藉由CD28.CD40顯著增強CD137之誘導。在CD8+細胞中，CD137誘導相較於CEA或錯配靶向CD28 CoStAR顯著增加，而CD107a誘導相較於對照CoStAR增加。因此，CD28.CD40在大範圍模型及效應子活性中顯示增強的效應子活性。 實例3

為了評估藉由承載CD40之CoStAR進行的共刺激，初級人類T細胞經模擬轉導或經MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR轉導，其各自含有由2A裂解肽分離之CD34標記基因。MFE23為對於癌胚抗原(CEA)具有高親和力的單鏈Fv抗體。在活體外培養之後，使用MACS™順磁選擇試劑(Miltenyi Biotech)使CD34細胞富集且接著使用輻射飼養細胞於數目上擴增細胞。MFE23.CD28 CoStAR強介導CD34 ⁺T細胞之擴增，且MFE23.CD28.CD40 CoStAR進一步增強擴增(圖11)。

為評估共刺激活性及存留性，在存在(200 IU/ml)或不存在外源性IL-2的情況下以8:1效靶比將經模擬轉導或經MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40轉導之T細胞與LoVo-OKT3細胞共培養。在第1天、第4天、第7天、第11天及第18天，採集細胞且在MACSQuant流式細胞儀上藉由使用抗CD2試劑來計算活的T細胞數目。在無腫瘤及IL-2刺激的情況下，細胞數目減少，如所預計(圖12A)。在不存在刺激但存在IL-2的情況下，細胞存活較明顯，但無特異性生長(圖12B)。在存在腫瘤但不存在IL-2的情況下，模擬細胞未顯示出特異性存活。MFE23.CD28 CoStAR介導在前四天內的擴增明顯倍增，隨後衰減。MFE23.CD28.CD40介導較大擴增，直至第7天，隨後穩定衰減(圖12C)。在相同條件但存在IL-2的情況下，經模擬轉導及經MFE23.CD28轉導之細胞在18天內展現出20倍擴增，而MFE23.CD28.CD40細胞擴增超過60倍(圖12D)。因此，基於CD28.CD40之受體在外源性IL-2存在及不存在的兩種情況下展現出在刺激條件下優良的擴增及存活。

隨後測試經模擬轉導及經MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR轉導之T細胞的細胞介素產生。對獲自T細胞/腫瘤共培養物之上清液進行珠粒陣列分析。將經工程改造之T細胞與LoVo-OKT3細胞以1:1效靶比培育24小時且收集上清液。亦自等量單獨的T細胞或單獨的LoVo-OKT3細胞收集經調節之上清液。使用Legendplex™人類TH1/TH2細胞介素套件(Biolegend)分析IL-2、IFN-γ、TNFα、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9及IL-21之產生(圖13A至圖13M)。細胞介素在來自T細胞或單獨腫瘤的培養基中為極低或不可偵測的。然而，當與腫瘤細胞介素產生共同培養時增強。與模擬物相比，MFE23.CD28促進IL-2、IL-5、IL-17A/17F、IL-10、IL-9及IL-21之產生。然而，MFE23.CD28.CD40亦促進TNFα、IL-13及IL-22產生。MFE23.CD28.CD40亦促進產生多個細胞介素，其數目大於MFE23.CD28所產生之細胞介素(IL-2、IL-9及IL-17F)，以及將一些細胞介素產量降低至對於MFE23.CD28 (IL-5及IL-10)觀察到之水準以下。總之，此資料表明，添加CD40至基於CD28之共刺激受體增強及/或調節其在細胞介素產生方面的比活性。

進一步測試經模擬轉導及經MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR轉導之T細胞的趨化介素產生。使用Legendplex™人類促炎趨化介素套件分析IL-8 (CXCL8)、IP-10 (CSCL10)、伊紅趨素(CCL11)、TARC (CCL17)、MCP-1 (CCL2)、RANTES (CCL5)、MIP-1a (CCL3)、MIG (CXCL9)、ENA-78 (CXCL5)、MIP-3α (CCL20)、GROα (CXCL1)、I-TAC (CXCL11)及MEP-1β (CCL4)。(圖14A至圖14M)。趨化介素在來自單獨T細胞之培養基中為極低或不可偵測的。當與腫瘤共培養時，促進趨化介素產生。與模擬物相比，MFE23.CD28促進CXCL5、CXCL10、CXCL11、CCL17及CCL20之產生。然而，MFE23.CD28.CD40促進CCL2、CXCL1及CXCL9之產生。MFE23.CD28.CD40亦進一步促進產生某些細胞介素，其量大於MFE23.CD28所產生之細胞介素(CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL17、CCL2、CXCL9、CCL5及CCL20)，同時將一些細胞介素產量降低至對於MFE23.CD28 (CCL4)觀察到之水準以下。總之，此資料表明，添加CD40至基於CD28之共刺激受體增強及/或調節其在趨化介素產生方面的比活性。

測試CoStAR針對癌症標靶之功能活性。將細胞用對FolR或CA125具有特異性之scFv結合域(分別為scFv MOV19及scFv 196-14)工程改造的CD28或CD28.CD40 CoStER轉導。人類葉酸受體α (FolR)表示多種腫瘤(包括卵巢癌、頭頸癌、腎癌及肺癌)之適合標靶，且CA125表示卵巢癌之替代標靶。來自六個健康供體之初級人類T細胞係用196-14.CD28、196-14.CD28.CD40、MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40受體進行工程改造，其全部具有DYKDDDDK抗原決定基標籤以供偵測。將經轉導細胞與FolR+/CA125+ OvCAR-OKT3細胞混合，隨後使用抗原決定基標籤陽性及陰性群體中之細胞內染色分析效應子活性。與模擬轉導之細胞相比，在經CD28及CD28.CD40工程改造之細胞中觀測到回應於CA125及FolR兩者之效應子活性之特異性增強，其藉由IL-2 (圖15A及15B)、TNFα (圖15C及15D)、CD137 (圖15E及15F)及Bcl-xL (圖15G及15H)之產生測定，但與MOV19.CD28.CD40相比，MOV19.CD28進行之特異性Bcl-xL誘導並不顯著。

評估經模擬轉導之TIL或經TILMOV19.CD28.CD40 CoStAR工程改造之TIL的擴增及患者匹配之腫瘤消解物刺激之CD137產生(圖16)。測試三個供體腫瘤，其在消解時顯示不同水準之FolR，其範圍為陰性(6A)、低表現(6B)至高表現(6C)。對於FolR陰性消解物匹配之經CoStAR工程改造之TIL群體中的模擬物及CoStAR陰性TIL證實在腫瘤共培養之後類似的CD137上調量，其不因CoStAR (D)之存在而增強(圖16D)。在暴露於FolR低表現消解物的TIL中，與CoStARa-相比，CoStAR+細胞的活性增強，其中CD137表現自＜10%增加至＞20% (圖16E)。在暴露於FolR高表現腫瘤消解物之TIL中，CoStAg-群體中活性自約20%增加，CoStAR+群體中活性增加至大約50% (圖16F)。

檢驗FolR靶向CoStAR以增強效應功能。回應於FolR+腫瘤消解物，MOV19.CD28.CD40將CD137表現自約20%增強至約50% (圖17A)，將TNFα產生自10%增強至15% (圖17B)且將IL-2產生自2%增強至5% (圖17C)。

亦檢查藉由可溶性配位體進行之CoStAR介導之刺激。將來自三個健康供體之T細胞用MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40 CoStAR進行工程改造且用固定OKT3活化，從而在不存在FolR的情況下提供刺激或提供OvCAR-OKT3刺激，以提供TCR及CoStAR活性。在OKT3刺激之後，在三個供體中，Bcl-XL活性增加10至20% (圖18A)，而IL-2增加0%至12% (圖18B)且TNFα增加0至20% (圖18C)。外源性可溶性FolR之存在並不增強此等特定效應功能中之任一者。在OvCAR-OKT3存在下，Bcl-xL誘導在CD28 CoStAR中增強約20%且在CD28.CD40 CoStAR中增強約35% (圖18D)，IL-2誘導在CD28 CoStAR中增強約20%且在CD28.CD40 CoStAR中增強30%至50% (圖18E)，且TNFα產生在CD28 CoStAR中增強20%至30%並在CD28.CD40 CoStAR中增強25%至50% (圖18F)。外源性可溶性FolR不具有對此等效應功能中之任一者的抑制作用。 實例4

材料及方法

構築體設計 - MFE23、MOV19及196-14 CoStAR構築體包括MFE23 (CEA特異性)、MOV19 (葉酸受體α特異性)或196-14 (CA125特異性)衍生之單鏈抗體片段核苷酸序列，其中抑瘤素M1前導序列融合至共刺激域。共刺激域含有來源於人類CD8或CD28之細胞外間隔區及跨膜域及CD28、CD2或CD137及/或野生型或突變型CD40變異體之傳訊域。本文中詳述之一些CoStAR包含融合至CD28及CD40之人類PD1細胞外域。用P2A裂解序列及人類CD34之截短形式選殖受體以允許偵測經轉導細胞。CoStAR核苷酸序列經密碼子最佳化且由Genewiz Inc.基因合成。將構築體選殖至第三代慢病毒載體中。

在根據製造商說明書用T細胞活化及擴增珠粒(Invitrogen)活化24小時之前，自正常健康供體分離周邊血液單核細胞，隨後添加慢病毒上清液。

使用CEA.hFc蛋白(R&D Systems)及抗hFc-PE次級抗體加上抗CD34-APC抗體或藉由單獨的抗CD34-PE抗體，在感染後96小時評定細胞轉導。隨後，藉由添加30 ng/ml OKT3及200 IU/ml IL-2，在RPMI + 10% FCS中以1:20至1:200比率使用×10供體錯配輻射PBMC飼養細胞進一步擴增細胞。14天後，細胞係如先前染色且儲存起來以準備用於分析。

藉由混合CoStAR陽性或陰性細胞與野生型或經OKT3工程改造之CEA陽性LoVo細胞進行功能性分析。簡言之，將T細胞與LoVo細胞以不同比率在96孔盤中混合。為進行流動分析，將共培養物與佈雷非德菌素及莫能菌素以及抗CD107a抗體一起培育16小時，隨後用固定活力染料ef450 (eBiosciences)染色細胞，用4%多聚甲醛固定且接著使Fix/Perm洗滌緩衝液(BD Biosciences)滲透。細胞接著用抗CD34抗體或抗DYKDDDDK抗體染色以區分CoStAR+與CoStAR-群體、抗IL-2抗體、抗TNFα抗體及抗IFNγ抗體(Biolegend)。對於可溶性分析物分析，收集上清液以便藉由ELISA、細胞介素珠粒陣列(LEGENDPLEX™人類Th細胞介素套件(12-plex))或趨化介素珠粒陣列(LEGENDPLEX™人類促炎趨化介素套件(13-plex)分析。

藉由在存在或不存在IL-2之情況下在完整T細胞培養基(補充有10% FCS、0.01 M HEPES及1%青黴素/鏈黴素、50 mM β-巰基乙醇之TCM:RPMI)中以8:1效靶比混合T細胞與腫瘤細胞來進行增殖分析。在指定時間點進行細胞計數且在再刺激分析中以8:1之最終E:T添加新鮮腫瘤細胞。藉由自孔採集細胞且用抗CD2 PerCP eFluor710抗體(eBioscience, UK)在暗處染色20 min，接著進行DRAQ7染色來進行細胞計數以用於增殖分析，且使用MACSQuant分析儀進行計數。 實例5

為評估經承載CD40之CoStAR轉導的T細胞之活體內抗腫瘤活性，初級人類T細胞經模擬轉導或經MOV19.CD28.CD40 CoStAR構築體轉導，隨後進行活體外擴增及低溫保存。MOV19為對於葉酸受體α (FOLR1)具有高親和力之單鏈Fv抗體。向免疫功能不全小鼠植入已建立之卵巢癌細胞株(A2870、OVCAR-5、OVCAR-8或SK-OV-3)，使其在動物中生長幾天。小鼠隨後根據其腫瘤負荷分級，且最後注射經模擬轉導之T細胞或經MOV19.CD28.CD40轉導之T細胞。在T細胞給藥後不久，向一些小鼠注射靜脈內IL-2 (5 μg IL2-，Q2Dx7)以支援T細胞之移植及初始擴增。最終研究設計含有5組(每組含有5隻小鼠)：PBS (未給藥細胞)、經模擬轉導之T細胞、補充有IL-2之經模擬轉導之T細胞、經MOV19.CD28.CD40轉導之T細胞及補充有IL-2之經MOV19.CD28.CD40轉導之T細胞。每週一次監測腫瘤生長及小鼠存活，持續總共40天。

與經模擬轉導之組相比，投與MOV19.CD28.CD40轉導細胞之小鼠展示更好腫瘤控制及延長之存活率，無論是否補充有IL-2。此資料表明CoStAR平台在活體內提高T細胞抗腫瘤反應之能力且亦說明此經改良反應如何不依賴於外源性IL-2之存在。 實例6

實例係關於鑑別CoStAR之關鍵組分，諸如(但不限於) PD-1、MFE23、CD40與另一組分、間隔子、CD40突變體及/或CD28突變體之組合。

藉由HEK293T細胞之CaCl ₂轉染進行病毒產生。CD34 (標記基因)表現藉由用JRT3細胞滴定來測定。

健康供體中過度生長之實驗設計如下：第0天為自冷凍PBMC之T細胞分離。第0天亦為用Dynabeads活化。第2天為藉由離心接種轉導。第5天為珠粒移除。第8天量測成活力及轉導速率。第8天亦為活化後(REP前)，第13天至15天為冷凍。

在分類之前及在分類之後的陽性及陰性級分中量測在磁富集之後且在REP之前的CD34表現。將健康供體用Dynabeads活化且用CD40 CoStAR構築體或模擬轉導(離心接種，MOI 5)。接著使表現CD34之細胞經磁性富集且在分選前後藉由流動式細胞測量術(Novocyte)分析。

健康供體之實驗設計包括如上文所描述之過度生長以及REP：第2天為經轉導之T細胞解凍，第1天為磁性CD34富集，第0天為使用G-Rex之REP，第5天至第6天為改變培養基，第11天至第12天量測成活力及轉導速率且冷凍。

CD34富集及REP之後，CD4中富集大部分經CD40 CoStAR修飾之T細胞(圖20)。在REP之後10至11天，使用抗人類CD4-PerCP-eF710、抗人類CD8-PE-Cy7及抗人類CD3-FITC評定CD4及CD8 T細胞表型。藉由流動式細胞測量術(Novocyte)進行分析且使用NovoExpress 1.5.0軟體用以下圈選策略分析資料：活/死排除、單細胞、CD3+細胞、CD4+細胞或CD8+細胞。

經CoStAR修飾之CD4 T細胞相比於CD8群體經高度轉導。將健康供體用Dynabeads活化且用CD40 CoStAR構築體或模擬轉導(離心接種，MOI 5)。接著，使表現CD34之細胞經磁性富集且遵循快速擴增方案(REP)擴增。在REP之後10至11天，使用與抗人類CD4-PerCP-eF710相關之抗人類CD34-PE、抗人類CD8-PE-Cy7及抗人類CD3-FITC評定標記基因CD34在CD4及CD8 T細胞上之表面表現。藉由流動式細胞測量術(Novocyte)進行分析且使用NovoExpress 1.5.0軟體用以下圈選策略分析資料：CD4+細胞或CD8+細胞當中的活/死排除、單細胞、CD3+細胞、CD34+細胞。 實例7

由融合至CD40共刺激結構域之細胞外檢查點結合域構成的CoStAR可在CoStAR接合後將抑制信號轉化為活化信號。為了測試此等受體之適用性，吾人基於Ankri等人J Immunol 2013; 191:4121-4129及Prosser等人Molecular Immunology 51 (2012) 263-272中所概述之說明產生PD1-融合CoStAR，但不同之處係添加CD40至傳訊域(圖21A)。自健康供體分離之初級人類T細胞用CD3/CD28 Dynabeads活化，且用MOI=5之指定PD1融合CoStAR受體或MFE23.CD28.CD40 CoStAR (陽性對照)轉導或經模擬轉導(陰性對照)。轉導之T細胞使用CD34微珠富集且在儲備之前經由快速擴增方案使用輻射飼養細胞擴增。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo (CCL-229TM)或LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養。24小時後，收集上清液且冷凍。LoVo及LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予貫穿單獨的CoStAR (LoVo)或與信號1 (LoVo.OKT3.GFP)相關的信號2。一式三份地進行共培養，且實驗中包括相對應的陰性(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)及陽性(PMA+離子黴素)對照。藉由ELISA偵測分泌的IL-2及IFN-γ並使用FLUOstar Omega微定盤式讀取器來量測吸光度，且隨後用Omega MARS 3.42 R5軟體進行分析。各符號為各供體之平均一式三份值(圖21C)。在LoVo-OKT3細胞存在下產生平均約4000 pg/ml IL-2之MFE23.CD28.CD40 (CTP194)表現細胞，而由PD1融合產生＜1000 pg/ml。IFNγ分泌之分析亦證實與模擬物相比，此細胞介素自MFE23.CD28.CD40工程改造之細胞之產生增強，然而未觀測到自含有PD1融合物之細胞之產生增強。接著，吾人評定在重複腫瘤攻擊存在下PD1-融合CoStAR介導T細胞存活之能力(圖22)。為此目的，將經CoStAR或模擬轉導之T細胞與LoVo-OKT3細胞在第0天及第7天以8:1 E:T比混合且在第6至8天及第14至15天進行計數及檢查點表現表型(圖23)。圖22展示細胞在實驗持續時間內之擴增倍數，其中模擬轉導之細胞在整個實驗中數目下降；相反地，經MFE23.CD28.CD40 (CTP194)工程改造之細胞在第14天用腫瘤連續刺激時擴增直至12倍。儘管PD1融合CoStAR未展現與CTP194工程改造之細胞類似的擴增程度，但T細胞死亡程度不如經模擬物工程改造之細胞，表明PD1域可介導一定程度之T細胞存活。亦在CD34-及CD34+群體中評定CD4+及CD8+細胞中之檢查點表現(LAG3、PD1及TIM3)且在第6至8天及第14至15天展示於圖23上。發現LAG3在第6至8天在CD4+及CD8+細胞中相對較低(通常＜20%) (即使在CD8+細胞中更加可變)，含有不同受體之細胞或經模擬轉導之細胞之間無明顯差異。然而，在第14至15天，吾人觀測到相比於經模擬物工程改造之細胞，含有基於PD1或MFE23之CoStAR的細胞中之LAG3表現較低。PD1表現更難以評定，因為作為CoStAR之組分之PD1可不與內源性表現分開。在CD4+細胞中，吾人觀測到與模擬轉導之細胞相比，經MFE23.CD28.CD40工程改造之細胞中之PD1表現較低，一種在第14至15天更明顯之效應。在第6至8天，TIM3之表現反映在CD4+及CD8+細胞中之LAG3表現，而在第14至15天，TIM3表現一般較低，但吾人觀測到在第14至15天經模擬轉導細胞中TIM3之高表現(約80%細胞)，其在PD1-融合CoStAR細胞中較低，但在含有MFE23.CD28.CD40之細胞中＜20%。總之，由諸如PD1之反轉信號之抗原識別域組成的CoStAR為功能性的，但在細胞介素釋放或擴增分析中的表現與具有基於scFv之抗原識別域之含有CoStAR之細胞不同。與經模擬物工程改造之細胞相比，PD1-融合受體亦可調節檢查點表現。

接下來，吾人設法瞭解CD40可如何作為CoStAR之單一組分或與除CD28以外之共刺激域組合操作。為了控制受體寡聚及化學計量之作用，吾人使用針對各融合物之基礎CD8跨膜域且與對照MFE23.CD28.CD40受體進行比較(圖24A)。第一受體由具有CD8細胞外域及跨膜域之CD28.CD40傳訊域(CTP190)、具有CD8細胞外域及跨膜域之CD2.CD40傳訊域(CTP191)或具有CD8細胞外域及跨膜域之CD137.CD40傳訊域(CTP192)組成。另外，亦產生由單獨CD40 (CTP193)組成之受體。經轉導細胞之流動式細胞測量術分析顯示此等受體之表現與CD34標記基因表現不充分相關，表明結構形式不准許有效表面表現(圖24A，左下圖)。然而，吾人進行功能性分析且顯示CD28.CD40、CD137.CD40及CD40受體可相較於LoVo-OKT3共培養物中之經模擬轉導細胞介導增強之IL-2分泌增強，而IFNγ分泌低於經模擬轉導細胞及經MFE23.CD28.CD40工程改造之細胞(圖24B)。在LoVo-OKT3細胞存在下之擴增分析(圖25)顯示，基於MFE23.CD28.CD40之受體在含有天然CD28細胞外域及跨膜域(CTP194)之彼等受體勝過具有CD8衍生之跨膜域(CTP190)之彼等受體的情況下介導最佳擴增。CD137與CD40之融合在整個實驗中維持T細胞數目而無相關擴增，然而僅由CD2.CD40或單獨的CD40組成之受體不支援長期存活。類似於關於經模擬轉導之細胞所發現之作用，亦在第6至8天及第14至15天進行細胞之表型分析(圖26)。LAG3在第6至8天在CD4細胞上非常低，且在CD8+細胞上＜20%。在第14至15天，LAG3存在於約50%之CD4+模擬細胞上，但存在於＜20%之經工程改造之細胞上(資料對於一些受體不可用，因為待分析之細胞數目不足)。在所分析之兩個時間點，CD4+及CD8+細胞上的PD1表現再次＜20%，除了在第6至8天經CD2.CD40 CTP191工程改造之細胞及在較晚時間點經模擬轉導之細胞以外。在所分析之兩個分析時間點，CD4+細胞中之TIM3表現一般較低，但在CD8+細胞中，尤其在CD137.CD40 (CTP192)及CD40 (CTP193)工程改造之細胞中較高。最後，經模擬轉導之細胞在第14至15天顯示出TIM3之＞70%表現，而含有CD28.CD40 CoStAR之細胞具有約20%表現。總而言之，含有用CD40測試之共刺激域之任何組合的CoStAR可調節檢查點表現，但此作用與CD28之組合最明顯，且比在CD40用作唯一傳訊組分時要好。

隨後，吾人設法研究MFE23.CD28.CD40構築體內特異性突變之效應，致力於理解不同傳訊組分如何負責CTP194 MFE23.CD28.CD40受體之最佳活性。為此目的，吾人將突變引入已知TRAF2結合基序(SVQE-AVQA) (CTP195)、TRAF2/3結合域PVQET-AVAEA) (CTP196)及TRAF6結合域(PQEINF-AQAINF) (CTP197)中。吾人亦引入點突變以引入CD40之多晶型變異體，已顯示其在B細胞(P227A) (CTP198)及Q263A突變中具有增強的活性，已顯示其影響TRAF3結合(Leo等人J Biol Chem1999)(CTP199)。最後，藉由用一式三份的CD40細胞內域(CTP200)選殖CoStAR完成受體群組(圖27)。如先前，初級人類T細胞經編碼此等受體之慢病毒載體轉導，使用CD34微珠富集且冷凍，隨後實驗。CD34之表現量平均在60%與70%之間(圖27A)。將經轉導或模擬轉導之細胞與LoVo-OKT3細胞及IL-2混合，且24h後藉由ELISA量測IFNγ (圖29B)。來自模擬轉導之細胞之IL-2產量低於偵測水準。由對照CTP194受體產生之IL-2為大致4000 pg/ml，如由含有SVQE-AQA突變之CTP195及含有具有P227A多形性之CTP198受體之細胞產生。表現TRAF6結合突變PQEINF-AQAINF或TRAF3結合突變Q263A之細胞以及表現一式三份之CD40基序之細胞均顯示出IL-2產量之適度降低。然而，表現含有TRAF2/3結合基序突變PVQET-AVAEA之CTP196的細胞顯示IL-2產量大量降低。當量測IFNγ時，亦觀測到此細胞介素降低，其中所有受體均產生＞30 ng/ml IFNγ，除了類似於經模擬轉導細胞產生大約10 ng/ml之CTP196以外。

接下來，吾人評定此等不同CD40傳訊域突變對支援重複刺激之能力的影響(圖28)。為此目的，將模擬或經轉導之T細胞與LoVo-OKT3細胞以8:1之E:T比率混合且在三個不同供體中在第6至8天及第14至15天進行計數。表現CTP194之細胞在第一時間點擴增約四倍，且在再刺激時擴增至＞10倍。表現TRAF2結合突變CTP195、TRAF6結合突變CTP197或P227A多形性(CTP198)之細胞在支援再刺激之能力方面具有中等降低，而表現C263A TRAF3結合突變之細胞或一式三份之CD40結合域在其擴增細胞之能力方面進一步被禁用。驚人地，表現TRAF2/3結合突變體CTP196之細胞在其支援重複刺激之能力方面受到深刻影響。亦進行表現此等不同突變之細胞之表型分析(圖29)。第6至8天，在經轉導與未經轉導之細胞之間的LAG3在CD4+或CD8+細胞中之相對表現方面未看到明顯差異，然而，相比於表現CD4+細胞之任一CoStAR，模擬轉導之細胞在第14至15天具有較高LAG3表現。在第14至15天，在CD8+細胞中未觀測到關於LAG3表現之差異。對於所有受體工程改造之CD4+細胞，發現PD1表現第6天至第8天平均＜20%，其中在模擬工程改造之細胞中表現較高。有趣地，吾人亦觀測到在第6至8天表現TRAF2/3基序突變體CTP196之CD4+及CD8+細胞中升高，且在第14至15天在CD4+細胞中之PD1表現升高。在所分析之兩個時間點發現TIM3表現在所有CD4+細胞群組中平均小於20%。表現在第一時間點在CD8+細胞中一般更可變，平均約為30%，但在表現CTP196之細胞中略微較高。在第14天及第15天，經模擬轉導之細胞具有顯著高於經轉導之細胞的TIM3表現，且表現CTP196之細胞具有比來自其他群組之細胞大約多達兩倍的TIM3表現。

最後一組所測試受體為含有CD28之受體，CD28具有YMNM及PYAP細胞質基序之突變，其對於尤其涉及PKCθ、PI3k及Lck之活化信號級聯而言為關鍵的(Esensten等人，2016)。CTP201含有PYAP-AYAA突變，而CTP202含有YMNM-FMNM突變。吾人亦將具有經擴增之IgG4鉸鏈之受體包括至此群組中以確定含有較長連接域之CoStAR是否維持功能性(CTP203) (圖30A)。如先前，細胞經轉導且富集CD34微珠。對於表現野生型對照及CTP201及CTP202受體之細胞，發現分選及擴增後之表現為大致60%，但對於表現CTP203 IgG4鉸鏈域受體之細胞，表現低至30% (圖30A，下圖)。在與LoVo-OKT3細胞共培養後評定來自模擬或經轉導T細胞之IL-2產生(圖30B)。來自CTP194表現細胞之IL-2為大致4000 pg/ml且對於CD28突變受體更低，兩者均為大致2500 pg/ml。然而，來自表現IgG4鉸鏈受體之細胞之IL-2低至約1000 pg/ml。由於來自模擬轉導細胞之對照IL-2低於較低偵測水準。吾人亦自相同細胞量測IFNγ (圖30B)。來自CTP194之IFNγ為大致1000 pg/ml，如同來自含有PYAP-AYAA CD28突變之CTP201細胞之IFNγ。吾人觀測到IFNγ自表現YMNM-FMNM突變之細胞分泌增強。在此受體群組內，自表現CTP203 IgG4鉸鏈受體之細胞中IFNγ之產量最高。

接下來，吾人分析支援使用此受體群組再刺激腫瘤之後擴增的能力(圖31)。表現MFE23.CD28.CD40之細胞在兩輪使用LoVo-OKT3細胞刺激之後擴增約10倍。吾人觀測到，CD28傳訊域之突變對細胞經兩輪刺激擴增之能力具有深遠作用，含有IgG4鉸鏈/間隔域之受體的用途一樣。模擬細胞在經兩輪刺激後數目下降。在第一次刺激(6至8天)之後細胞之表型分析揭露CD4+或CD8+胞內之LAG3表現無明顯差異，其中前者表現平均約10%表現，且後者表現20% (圖32)。然而，在第14天至第15天，相比於經轉導細胞中平均10%或更低，LAG3在CD4+模擬細胞中之表現較高，大致50%+，且相比於經轉導細胞，在CD8模擬細胞中亦較高。PD1表現分析揭露在第一時間點MFE23.CD28.CD40或CD28突變CD4+細胞中之大約10%表現，而表現IgG4受體之細胞具有＞20% PD1表現，與模擬轉導細胞一樣。在第14天至第15天，其中100%模擬CD4+細胞為PD1之差異更大。CD8+細胞在兩個時間點展現低PD1陽性。最後，在第6至8天，未發現CD4或CD8+ TIM3表現之明顯差異，然而，在第14至15天，表現IgG4間隔域受體之CD4+細胞相比於表現對照或CD28突變受體之細胞顯示較高PD1陽性，且在CD8+細胞中觀測到類似效應。 實例8

共培養分析設定。將效應(亦即，非Td及Td) T細胞在共培養前一天解凍，以1×10 ⁶個細胞/毫升再懸浮於無IL-2之TCM中，且在37℃下用5% CO ₂培育隔夜。在共培養當天，收集T細胞及BA/F3標靶(亦即WT、OKT3、FOLR1及OKT3-FOLR1)且使用ViCELL BLU根據製造商說明書對其進行計數。非Td及Td T細胞兩者均在室溫下利用表示卵巢癌患者血清中報導之濃度以及超生理水準之solFOLR1 (亦即0、20、60及200 ng/mL)濃度範圍預培育30分鐘。在培育之後，將細胞與BA/F3 WT、OKT3、FOLR1或OKT3-FOLR1標靶以如下E:T比(3:1、1:1、1:3)共培養隔夜。各條件一式兩份地進行。根據製造商說明書用PMA/離子黴素刺激之T細胞及未刺激之T細胞分別充當陽性及陰性對照。隔夜後，收集培養盤且以500×g離心3分鐘。自各孔收集100 μL上清液且儲存在-80℃下，隨後分析細胞介素含量。接著如下文所描述將盤中之剩餘細胞染色。

對於增殖共培養分析，T細胞首先根據製造商說明書在共培養設定當天用CellTrace™紫色染料標記。接著將經標記之細胞與BA/F3目標細胞(BA/F3、BA/F3-FOLR1、BA/F3-OKT3-FOLR1)以10:1之E:T一起培養5天。

共培養物分析之流動染色及分析。在收集上清液之後，洗滌顆粒化細胞且在室溫下用100 μL活/死可固定近IR染料(藉由添加1 μL復原染料至1 mL PBS中製備)標記30分鐘。藉由添加100 μL染色緩衝液至各孔中進行所有洗滌步驟，以500×g離心3分鐘且傾析上清液。與活/死染料一起培育之後，洗滌細胞且在室溫下用Fc阻斷無(1:50稀釋度)阻斷15分鐘，隨後將50 μL抗體混合液添加至各孔中且在4℃下培育30分鐘。接著洗滌細胞且添加100 μL體積之BD Cytofix緩衝液並在4℃下培育細胞20分鐘。固定後，洗滌細胞，在150 μL染色緩衝液中復原，且儲存在4℃直至使用BD LSR Fortessa X-20分析。

在細胞學分析之前，培養盤以500×g離心3分鐘，且將25 μL具有125 μL FAC染色緩衝液之計數珠粒(亦即26000個珠粒)添加至各孔中。自各孔採集總共100 μL樣本。圈選策略如下：

淋巴球(正向散射[FSC]-A對比側散射[SSC]-A)

單細胞圈選1 (FSC-H對比FSC-A)

單細胞圈選2 (SSC-H對比SSC-A)

活細胞(FSC-H對比近遠IR APC-Cy7染料)

腫瘤對比T細胞(抗小鼠CD45 BV785對比抗人類CD45 BV650)

活化標記4-1BB (FSCH對比抗人類4-1BB BV421)及CD69 (FSC-H對比抗人類CD69 BV711)，其由T細胞特異性圈選

使用以下圈選策略記錄來自各孔之珠粒計數：

FSC-A對比SSC-A

SSC-H對比FITC

使用FlowJo (BD，第10版)進行分析。使用GraphPad Prism9標繪曲線圖。

細胞介素分析。藉由來自MSD V-Plex之稀釋劑2加來自Meso scale discovery (MSD)之促炎套件1套組進行純或1:200稀釋，評估自如上所述之共培養物分析收集的上清液。根據製造商說明書進行分析且使用MSD發現工作台軟體進行分析。

分別由來自3個健康供體的用Ba/F3標靶共同培養隔夜之未經轉導(NTD)及抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞(CoStAR) 表現活化標記(4-1BB及CD69)及細胞介素生產(IL-2及IFNγ)。抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞中之4-1BB表現高於NTD細胞，而兩種細胞中之CD69表現類似(圖34A)。抗FOLR1 coSTAR修飾之T細胞中之IL-2及IFNγ表現高於NTD細胞(圖34B)。

在與NTD及CoStAR T細胞共培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評定之Ba/F3標靶之腫瘤計數在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞及NTD細胞中相當(圖34C)。

在與Ba/F3標靶共培養隔夜或5天之後藉由流動式細胞測量術評定之NTD及CoStAR T細胞計數以及增殖指示，CD4及CD8 T細胞之總細胞計數及增殖在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞中高於NTD細胞(圖34D)。

與濃度遞增之可溶性葉酸受體(sFOLR)一起預培育且與Ba/F3標靶共同培養隔夜的來自3個健康供體之未經轉導(NTD)及抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞(CoStAR)之活化標記(4-BB及CD69)之表現在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞及NTD細胞中係相當的，除了抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞之表現相較於NTD細胞增加以外(圖25A、B)。

在與濃度遞增之sFOLR一起預培育之NTD及CoStAR T細胞共培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評定之Ba/F3標靶之腫瘤計數在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞及NTD細胞係相當的(圖35C)。

在與Ba/F3標靶共培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評定的與濃度遞增之sFOLR一起預培育之NTD及CoStAR T細胞之細胞介素產生(IL-2)的表現在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞及NTD細胞中係相當的。

自3個健康供體的與Ba/F3標靶共培養隔夜之未經轉導(NTD)及抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞(CoStAR)之活化標記(4-BB及CD69)的表現在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞及NTD細胞中係相當的(圖36A)。

與NTD細胞相比，在經抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞中，來自3個健康供體的與Ba/F3標靶共培養隔夜之未經轉導之(NTD)及抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞(CoStAR)的細胞介素產生(IL-2)之表現增加(圖36B)。

在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞及NTD細胞中，在與NTD及CoStAR T細胞共培養隔夜之後藉由流動式細胞測量術評定之Ba/F3標靶之腫瘤計數係相當的(圖36C)。

與NTD細胞相比，在抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞中，在與Ba/F3標靶共培養隔夜或5天之後藉由流動式細胞測量術評定之NTD及CoStAR T細胞計數增加(圖36D)。 實例：9

CoStAR TIL之產生

藉由消解釋放來自6種卵巢腫瘤之TIL且將其在3000U IL-2中進行培養。在腫瘤消解後48h及72h，在為5之MOI下進行用編碼CoStAR分子及靶向人類FOLR1之scFv的第3代慢病毒載體、連接子、融合至經截短CD40細胞質域之全長CD28的轉導。

使用流動式細胞測量術分析以使用抗受試者基因型抗體進行表面偵測來測定表現CoStAR分子之CD4及CD8 T細胞的頻率。約20%至70%之CD4及CD8 T細胞表現CoStAR分子(圖37A)。

使用流動式細胞測量術表面染色分析來測定細胞表現TCRαβ及TCRγδ的頻率。約100%之CD3+細胞表現TCRαβ且極大減少之CD3+細胞(接近零)表現TCRγδ (圖37C)。

將來自6種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與自體消解物一起在佈雷菲爾德菌素A存在下共培養隔夜。次日藉由流動式細胞測量術評定細胞表現IL-2或TNFα的頻率。藉由CoStAR分子增強使TIL與自體消解物反應的頻率(圖38A)。

將來自6種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與自體消解物共培養且評定上清液之細胞介素釋放。經CoStAR修飾之細胞的效應功能提高，如由增加之IFNγ、TNFα及IL-13釋放證明。此等分子之最大含量回應於用PMA (佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯)及離子黴素(ionomycin)刺激而為類似的(圖38B)。

將來自5種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與BA/F3細胞或經工程改造以表現OKT3、FOLR或兩者之BA/F3細胞共培養。當與未經修飾之BA/F3或僅表現OKT3或僅表現FOLR1之BA/F3共培養時，未經修飾之TIL及經CoStAR修飾之TIL的細胞介素分泌相等。當與經修飾以表現FOLR1及OKT3兩者之BA/F3共培養時，經CoStAR修飾之TIL所分泌之細胞介素IL-2及IFNγ的含量增加(圖39A)。

將來自5種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與BA/F3細胞或經工程改造以表現OKT3、FOLR或兩者之BA/F3細胞共培養。經由細胞計數評定針對BA/F3目標細胞之細胞毒性，細胞計數係藉由對小鼠CD45之流動式細胞測量術分析測定。未經修飾之細胞及經CoStAR修飾之細胞等效地殺滅表現OKT3之目標細胞。經CoStAR修飾之TIL不會殺滅僅表現FOLR1之BA/F3細胞(圖39B)。

在不存在阻斷、MHCI、MHC II或MHC I+MHC II阻斷或抗體或同型對照的情況下，將來自3種卵巢癌患者之模擬TIL或經CoStAR修飾之TIL與自體腫瘤共培養。評定上清液之IFNγ釋放量。在按無抗體之釋放量標準化的情況下，模擬TIL及經CoStAR修飾之TIL中之IFNγ水準類似地減少，表示活性藉由內源性TCR-MHC肽相互作用產生(圖39C)。 * * *

在由此詳細描述本發明之較佳實施例的情況下，應理解，由上文段落定義之本發明不限於上文描述中所闡述之特定細節，因為其許多明顯變化可在不偏離本發明之精神或範疇的情況下進行。

以舉例方式給出，但並不意欲將本發明僅限制於所述特定實施例之以下實施方式可與隨附圖式結合而最佳地理解。

圖1 - 單一共刺激及融合共刺激域受體之結構組織化。示出申請專利範圍中所闡明之CoStAR受體之示意性表示。首先係基於單一共刺激受體之CoStAR，且其次係由融合至第二共刺激域之全長共刺激受體傳訊域組成之融合CoStAR。

圖2 - 潛在CoStAR組態之基因體組織化 -  CoStAR由抗原結合域、視情況選用之間隔域及共刺激域組成，如圖中所示及申請專利範圍中所描述。CoStAR可經表現如下：A)僅自具有由單一(Ai)或融合(Aii)共刺激受體組成之CoStAR之啟動子表現；B)可在N端或C端處與抗原決定基標誌(例如His標誌、DYKDDDDK (SEQ ID NO: 14)等)一起表現以實現對CoStAR之直接染色；C)與使用2A裂解序列或內部核糖體進入位點(IRES)分離之標記基因一起表現；D)與由第二啟動子表現之標記基因一起表現；E)與所關注蛋白質(諸如使用2A裂解序列或內部核糖體進入位點(IRES)分離之嵌合抗原受體或T細胞受體)一起表現； F)與所關注蛋白質(諸如自第二啟動子表現之嵌合抗原受體或T細胞受體)一起表現。具有充足知識之個體將清楚，CoStAR及標記基因/嵌合抗原受體/T細胞受體/其他相關蛋白質相對於彼此可在取向或3' (3-上撇號)或5'(5-上撇號)中表現。

圖3A-3E - T細胞中對LS174T及LoVo腫瘤呈現抗原有反應的CoStAR的功能活性。來自供體1 (A及D)、供體2 (B)及供體3 (C及E)之正常供體T細胞群體係經慢病毒工程改造以表現靶向癌胚抗原之CoStAR且使用CD34磁性選擇經磁性分選以富集轉基因。將T細胞與經工程改造以表現細胞表面錨定之抗CD3單鏈抗體片段(活化腫瘤)之野生型未經工程改造之CEA+腫瘤細胞(非活化腫瘤)或CEA+腫瘤細胞以指定效靶比混合，且藉由ELISA量測上清液中之IL-2。獲得使用LS174T細胞(A、B及C)及LoVo (D及E)之資料。

圖4 -  CoStAR對T細胞增殖之作用。將5×10 ⁵個經轉導及未經轉導之T細胞與6.25×10 ³個野生型LoVo或LoVo-OKT3細胞在IL-2存在(A)或不存在(B)的情況下混合，且三天之後進行細胞計數。在另一分析中，在相同細胞比率下，來自兩個供體之T細胞裝載有增殖染料，且在六天之後使用流動式細胞測量術藉由染料稀釋測定細胞所經歷之增殖循環次數。

圖5 - 初級人類T細胞中CoStAR融合受體之IL-2活性。來自七個供體之正常供體CD8+ T細胞(除了對照CoStAR為三個供體以外)係用指定的CEA靶向CoStAR經慢病毒轉導，且在LoVo-OKT3細胞存在下隔夜刺激之後評定IL-2生成。使用細胞內流動式染色測定CD34陰性(未經CoStAR轉導)群體及CD34+ (經CoStAR轉導)群體中之IL-2陽性細胞之比例。星號顯示使用配對威爾科克森(Wilcoxon)符號秩檢驗的經轉導群體與未經轉導之群體之間的顯著差異，其中*p＜0.05。

圖6A-6D - 初級人類T細胞中CoStAR活性之多參數分析。正常供體CD8+ T細胞係用所指定的CEA靶向CoStAR經慢病毒轉導，且在LoVo-OKT3細胞存在下隔夜刺激之後評定IL-2生成。使用細胞內流動式染色測定ICD34陰性(未經CoStAR轉導)群體及CD34+ (經CoStAR轉導)群體中之IL-2 (七個供體)(圖6A)、IFNγ (七個供體) (圖6B)、Bcl-xL (五個供體) (圖6C)及CD107a (六個供體) (圖6D)陽性細胞的比例。對照為無關CA125靶向CoStAR且在所有情況下來自三個供體。熱圖為其中色彩強度與在所定義條件下針對特定讀數呈陽性之細胞之百分比有關的所有抗體之平均值。

圖7 - CD40促進IL-2自基於CD28之CoStAR產生。來自三個健康供體之初級人類T細胞保持未經轉導或經細胞外域截短CD28 (Tr CD28)、全長CD28 (FL CD28)或具有CEA特異性scFv (MFE23)的基於CD28.CD40之CoStAR轉導。使用CD34標記基因選擇經轉導細胞且在分析之前將其擴增。在藉由ELISA分析IL-2生成之前，將T細胞與表現OKT3之CEA+ LoVo細胞以8:1效靶比混合20小時。

圖8 - 傳訊域及目標抗原對CoStAR介導之T細胞擴增之作用。T細胞係經DYKDDDDK (SEQ ID NO:14)抗原決定基標記之CD28或含有CA125、FOLR1或CEA特異性scFv的基於CD28.CD40之CoStAR或FOLR1特異性結合肽(C7)轉導。將T細胞與表現OKT3之CA125+/FOLR1+/CEA-細胞株OVCAR3之混合。每7天計算經轉導細胞之數目一次，最多21天，且在每一次計數之後添加新鮮的OVCAR3細胞。

圖9 -  (A及B)基於CD40之CoStAR在TCR轉移模型中增強對T細胞之共刺激。來自三個健康供體之初級人類T細胞係經CEA特異性TCR加上DYKDDDK標記之CD28或具有MFE23 (空心或實心圓)或CA125 (空心方塊)特異性scFv之基於CD28.CD40之CoStAR轉導。將T細胞與CEA+/CA125- H508細胞以1:1效靶比混合且進行細胞內細胞介素染色以測定TCR+/CoStAR+、TCR+/CoStAR-、TCR-/CoStAR+及TCR-/CoStAR-群體中有反應的CD4+或CD8+ T細胞之數目。進行2向ANOVA (圖基檢驗(Tukeys test))以測定活性之顯著差異：*p＞0.05，** p＞0.01，*** p＞0.001，**** p＞0.0001。

圖10 TCR轉移模型中活性之CoStAR依賴性增強來自三個健康供體之初級人類T細胞係經CEA特異性TCR加上DYKDDDK標記之CD28或具有MFE23 (空心或實心圓)或CA125 (空心方塊)特異性scFv之基於CD28.CD40之CoStAR轉導。將T細胞與CEA+/CA125- H508細胞以1:1效靶比混合且進行細胞內細胞介素染色以測定TCR+/CoStAR+群體中有反應的CD4+或CD8+ T細胞之數目。進行2向ANOVA (圖基檢驗)以測定活性之顯著差異：** p＞0.01，**** p＞0.0001。

圖11描繪經轉導以表現本發明之共刺激分子之初級人類T細胞的富集及擴增。MFE23為對於癌胚抗原(CEA)具有高親和力的單鏈Fv抗體。初級人類T細胞經模擬轉導或經MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR轉導，各具有由2A裂解肽分離之CD34標記基因。在活體外培養之後，使用MACS™順磁選擇試劑(Miltenyi Biotech)使CD34細胞富集且接著使用輻射飼養細胞於數目上擴增細胞。示出來自三個供體中之一者的例示性圖表。

圖12A至12D描繪回應於刺激及外源性IL-2擴增經本發明之共刺激分子轉導之T細胞。細胞經模擬轉導或經MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR轉導，並且在外源性IL-2存在(200 IU/ml)或不存在的情況下以8:1效靶比與LoVo-OKT3細胞共培養。在第1天、第4天、第7天、第11天及第18天，採集細胞且在MACSQuant流式細胞儀上藉由使用抗CD2試劑來計算活的T細胞數目。(A)在無腫瘤及IL-2刺激的情況下，細胞數目減少，如所預計。(B)在不存在刺激但存在IL-2的情況下，細胞存活較明顯，但無特異性生長。(C)在存在腫瘤但不存在IL-2的情況下，模擬物細胞未顯示出特異性存活。MFE23.CD28 CoStAR介導在前四天內的擴增明顯倍增，隨後衰減。MFE23.CD28.CD40介導較大擴增，直至第7天，隨後穩定衰減。(D)在相同條件但存在IL-2的情況下，經模擬轉導及經MFE23.CD28轉導之細胞兩者在18天內展現出20倍擴增，而MFE23.CD28.CD40細胞擴增超過60倍。因此，基於CD28.CD40之受體在外源性IL-2存在及不存在的兩種情況下展現出在刺激條件下優良的擴增及存活。

圖13A至13M描繪藉由模擬物、MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40工程改造之T細胞產生細胞介素。對獲自T細胞/腫瘤共培養物之上清液進行珠粒陣列分析。將經工程改造之T細胞與LoVo-OKT3細胞以1:1效靶比培育24小時且收集上清液。亦自等量單獨的T細胞或單獨的LoVo-OKT3細胞收集經調節之上清液。使用Legendplex™人類TH1/TH2細胞介素套件(Biolegend)分析細胞介素產生。(A) IL-2；(B) IFN-γ；(C) TNFα；(D) IL-4；(E) IL-5；(F) IL-13；(G) IL-17A；(H) IL-17F；(I) IL-22；(J) IL-6；(K) IL-10；(L) IL-9；(M) IL-21。細胞介素在來自T細胞或單獨腫瘤的培養基中為極低或不可偵測的。當與腫瘤共培養時，促進細胞介素產生。與模擬物相比，MFE23.CD28促進IL-2、IL-5、IL-17A/17F、IL-10、IL-9及IL-21產生。MFE23.CD28.CD40亦促進TNFα、IL13及IL-22產生。MFE23.CD28.CD40進一步促進產生多個細胞介素，其數目大於MFE23.CD28所提供之細胞介素(IL-2、IL-9及IL-17F)，以及將一些細胞介素產量降低至對於MFE23.CD28 (IL-5及IL-10)觀察到之水準以下。總之，此資料表明，添加CD40至基於CD28之共刺激受體增強及/或調節其在細胞介素產生方面之比活性。

圖14A至14M描繪使用Legendplex™人類促發炎套件分析趨化介素。(A)IL-8 (CXCL8)；(B) IP-10 (CSCL10)；(C) Eotaxin (CCL11)；(D)TARC (CCL17)；(E) MCP-1 (CCL2)；(F) RANTES (CCL5)；(G) MIP-1a (CCL3) (H)MIG (CXCL9) (I) ENA-78 (CXCL5) (J) MIP-3α (CCL20) (K)GROα (CXCL1) (L) I-TAC (CXCL11) (M) MEP-1β (CCL4)。趨化介素在來自單獨T細胞之培養基中為極低或不可偵測的。當與腫瘤共培養時，促進趨化介素產生。與模擬物相比，MFE23.CD28促進CXCL5、CXCL10、CXCL11、CCL17及CCL20產生。MFE23.CD28.CD40亦促進CCL2、CXCL1及CXCL9產生。MFE23.CD28.CD40進一步促進產生多個細胞介素，其數目大於MFE23.CD28 (CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL17、CCL2、CXCL9、CCL5及CCL20)所提供之細胞介素，以及將一些細胞介素產量降低至對於MFE23.CD28 (CCL4)觀察到之水準以下。總之，此資料表明，添加CD40至基於CD28之共刺激受體增強及/或調節其在趨化介素產生方面的比活性。

圖15A至15H描繪使用具有FolR或CA125反應性scFv (分別為MOV19及196-14)之CoStARo的經CoStAR工程改造之卵巢細胞的功能活性。人類葉酸受體α (FolR)表示多種腫瘤(包括卵巢癌、頭頸癌、腎癌及肺癌)之適合標靶，且CA125表示卵巢癌之替代標靶。來自六個健康供體之初級人類T細胞係用196-14.CD28、196-14.CD28.CD40、MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40受體進行工程改造，其全部具有DYKDDDDK抗原決定基標籤以供偵測。將經轉導細胞與FolR+/CA125+OvCAR-OKT3細胞混合，隨後使用抗原決定基標籤陽性及陰性群體中之細胞內染色分析效應子活性。在CD28及CD28.CD40工程改造細胞中觀測到回應於CA125及FolR兩者的效應子活性之特異性增強，其藉由IL-2 (15A及15B)、TNFα (15C及15D)、CD137 (15E及15F)及BCL-xL (15G及15H)之產生測定，只是相較於MOV19.CD28.CD40，未觀測到MOV19.CD28進行之特異性BCL-xL誘導。

圖16A至16F描繪經模擬轉導或用MOV19.CD28.CD40 CoStAR工程改造且隨後與患者匹配之腫瘤消解物混合的三種TIL群體。供體腫瘤顯示在消解物上各種含量之FolR，其範圍自陰性(A)、低表現(B)至高表現(C)。對於FolR陰性消解物匹配之經CoStAR工程改造之TIL群體中的模擬物及CoStAR陰性TIL證實在腫瘤共培養之後類似的CD137上調量，其不因CoStAR之存在而增強(D)。在暴露於FolR低表現消解物的TIL中，與CoStARa-相比，CoStAR+細胞的活性增強，其中CD137表現自＜10%增加至＞20% (E)。在暴露於FolR高腫瘤消解物之TIL中，CoStAg-群體中活性自約20%增加，CoStAR+群體中活性增加至多大約50% (F)。

圖17A至17C描繪效應功能之增強。回應於FolR+腫瘤消解物，FolR靶向CoStAR將CD137表現自約20%增強至約50% (A)，將TNFα產生自10%增強至15% (B)且將IL-2產生自2%增強至5% (C)。

圖18描繪可溶性配位體不抑制效應功能。將來自三個健康供體之T細胞用MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40 CoStAR進行工程改造且用固定OKT3活化，從而在不存在FolR的情況下提供刺激或提供OvCAR-OKT3刺激，以提供TCR及CoStAR活性。在OKT3刺激之後，在三個供體中，Bcl-XL活性增加10至20% (A)，而IL-2增加0%至12% (B)且TNFα增加0至20%。外源性可溶性FolR之存在並不增強此等特定效應功能中之任一者。在OvCAR-OKT3存在下，Bcl-xL誘導在CD28 CoStAR中增強約20%，但在CD28.CD40 CoStAR中增強約35% (D)，IL-2誘導在CD28 CoStAR中增強約20%，但在CD28.CD40 CoStAR中增強30%至50% (E)，且TNFα產生在CD28 CoStAR中增強20%至30%並在CD28.CD40 CoStAR中增強25%至50% (F)。外源性可溶性FolR不具有對此等效應功能中之任一者的抑制作用。

圖19描繪例示性CoStAR構築體。MFE23：對癌胚抗原(CEA)具有特異性之scFv。鑑別共刺激域。CTP188：SEQ ID NO:89；CTP189：SEQ ID NO:109；CTP190：SEQ ID NO: 41；CTP191：SEQ ID NO: 45；CTP192：SEQ ID NO: 43；CTP193：SEQ ID NO: 42；CTP194：SEQ ID NO: 33；CTP195：SEQ ID NO: 110；CTP196：SEQ ID NO: 111；CTP197 SEQ ID NO: 112；CTP198：SEQ ID NO: 113；CTP199：SEQ ID NO: 114；CTP200：SEQ ID NO: 115；CTP201：SEQ ID NO: 116；CTP202：SEQ ID NO: 117；CTP203：SEQ ID NO: 49；CTP204：SEQ ID NO: 59。

圖20描繪經CD40 CoStAR修飾之T細胞之CD4+及CD8+亞群。四個健康供體之T細胞經活化且經各種CD40 CoStAR轉導，並且經CD34標記或模擬轉導。使表現CD34之細胞富集且遵循快速擴增方案(REP)擴增。在REP之後10至11天，使用抗人類CD4-PerCP-eF710、抗人類CD8-PE-Cy7及抗人類CD3-FITC評定CD4 (淺灰色)及CD8 (灰色) T細胞表型。資料展示為平均值+/-SD，n=4個健康供體

圖21描繪與經模擬轉導之T細胞相比，PD-1融合CD40 CoStAR中IL-2之量增加。用Dynabeads活化且用CTP188、CTP189、CTP194轉導(A)或經模擬轉導之供體細胞係針對CD34 (轉導標記)表現富集(B)，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo (來自ATCC之CCL-229 ^TM)或LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養。24小時後，收集上清液且冷凍。LoVo及LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予貫穿單獨的CoStAR (LoVo)或與信號1 (LoVo.OKT3.GFP)相關的信號2。一式三份地進行共培養，且實驗中包括相對應的陰性(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)及陽性(PMA+離子黴素)對照。解凍後，藉由ELISA偵測分泌的IL-2及IFN-γ並使用FLUOstar Omega微定盤式讀取器來量測吸光度，且隨後用Omega MARS 3.42 R5軟體進行分析。各點表示一個供體之一式三份之平均值。應注意，陰性對照(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)全部低於偵測範圍(#)(C)。

圖22描繪在與LoVo.OKT3共培養時賦予經CD40 CoStAR轉導之T細胞之輕微增殖優勢的PD-1細胞外域。用Dynabeads活化且用CTP188、CTP189、CTP194轉導或經模擬轉導之健康供體T細胞係針對CD34表現而經富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天，且藉由觀察CD34標記基因表現測定其轉導速率(右圖)。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。在長期共培養結束時，量測成活力及絕對計數，且計算倍數擴增。資料展示為一式三份地分析之n≤3個供體之平均值+/-SEM。

圖23描繪經PD-1融合CD40 CoStAR轉導之T細胞在腫瘤攻擊之後的耗竭概況。健康供體T細胞係用Dynabeads活化且用CTP188、CTP189、CTP194轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。經轉導(CD34+ (灰色))或未經轉導(CD34- (白色)) CD4 (上分圖)及CD8 (下分圖)之耗竭概況(LAG-3 (A)、PD-1 (B)、TIM-3(C))係藉由流動式細胞測量術評定且展示為n≤3個供體之平均值+/-SD。

圖24A至24B描繪相較於經模擬轉導之T細胞，經CD28、CD137及單獨的CD40 CoStAR轉導之T細胞在活化後分泌較高量之IL-2。(A)健康供體T細胞係用Dynabeads活化且用CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194轉導或經模擬轉導。在轉導之後8天，藉由流動式細胞測量術評定來自一個受試者之經轉導T細胞之表面上的CD34標記基因及MFE23 scFv之表現之間的相關性(左下圖)。接著，使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天，且藉由觀察CD34標記基因表現測定其轉導速率(右下圖)。(B)在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo (來自ATCC之CCL-229 ^TM)或LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養。24小時後，收集上清液且冷凍。LoVo及LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予貫穿單獨的CoStAR (LoVo)或與信號1 (LoVo.OKT3.GFP)相關的信號2。一式三份地進行共培養，且實驗中包括相對應的陰性(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)及陽性(PMA+離子黴素)對照。解凍後，藉由ELISA偵測分泌的IL-2及IFN-γ並使用FLUOstar Omega微定盤式讀取器來量測吸光度，且隨後用Omega MARS 3.42 R5軟體進行分析。各點表示一個供體之一式三份之平均值。應注意，陰性對照(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)全部低於偵測範圍(#) (B)。

圖25描繪在與LoVo.OKT3共培養時賦予經CD40 CoStAR轉導之T細胞之增殖優勢的CD28及CD137胞內域。健康供體T細胞係用Dynabeads活化且用CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。在長期共培養結束時，量測成活力及絕對計數，且計算倍數擴增。資料展示為一式三份地分析之n≤3個供體之平均值+/-SEM。

圖26A至26C描繪經CD28、CD2、CD137及單獨的CD40 CoStAR轉導之T細胞在腫瘤攻擊之後的耗竭概況。健康供體T細胞係用Dynabeads活化且用CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。經轉導(CD34+ (灰色))或未經轉導(CD34- (白色)) CD4 (上分圖)及CD8 (下分圖)之耗竭概況(LAG-3 (A)、PD-1 (B)、TIM-3(C))係藉由流動式細胞測量術評定且展示為n≤3個供體之平均值+/-SD。

圖27描繪在活化後CD40 CoStAR TRAF結合位點突變對IL-2及IFN-γ分泌具有直接影響。(A)三個供體之細胞係用Dynabeads活化且用CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天，且藉由觀察CD34標記基因表現測定其轉導速率(A，下圖)。(B)在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo (來自ATCC之CCL-229 ^TM)或LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養。24小時後，收集上清液且冷凍。LoVo及LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予貫穿單獨的CoStAR (LoVo)或與信號1 (LoVo.OKT3.GFP)相關的信號2。一式三份地進行共培養，且實驗中包括相對應的陰性(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)及陽性(PMA+離子黴素)對照。解凍後，藉由ELISA偵測分泌的IL-2及IFN-γ並使用FLUOstar Omega微定盤式讀取器來量測吸光度，且隨後用Omega MARS 3.42 R5軟體進行分析。各點表示一個供體之一式三份之平均值。應注意，陰性對照(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)全部低於偵測範圍(#)。

圖28描繪在與LoVo.OKT3共培養時PVQET TRAF結合基序在經CD28.CD40 CoStAR轉導之T細胞之長期存活及增殖中的重要作用。三個供體之細胞係用Dynabeads活化且用CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。在長期共培養結束時，量測成活力及絕對計數，且計算倍數擴增。資料展示為一式三份地分析之n≤3個供體之平均值+/-SEM。

圖29描繪經CD28.CD40突變體CoStAR構築體轉導之T細胞在腫瘤攻擊之後的耗竭概況。三個供體之細胞係用Dynabeads活化且用CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。經轉導(CD34+ (灰色))或未經轉導(CD34- (白色)) CD4 (上分圖)及CD8 (下分圖)之耗竭概況(LAG-3 (A)、PD-1 (B)、TIM-3(C))係藉由流動式細胞測量術評定且展示為n≤3個供體之平均值+/-SD。

圖30描繪CD28突變體及經IgG4 CD40 CoStAR轉導之T細胞相較於經模擬轉導之T細胞在活化後分泌較高量之IL-2及IFN-γ。(A)三個供體之細胞係用Dynabeads活化且用CTP194、CTP201、CTP202、CTP203轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天，且藉由觀察CD34標記基因表現測定其轉導速率(A，下圖)。(B)在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo (來自ATCC之CCL-229 ^TM)或LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養。24小時後，收集上清液且冷凍。LoVo及LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予貫穿單獨的CoStAR (LoVo)或與信號1 (LoVo.OKT3.GFP)相關的信號2。一式三份地進行共培養，且實驗中包括相對應的陰性(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)及陽性(PMA+離子黴素)對照。解凍後，藉由ELISA偵測分泌的IL-2及IFN-γ並使用FLUOstar Omega微定盤式讀取器來量測吸光度，且隨後用Omega MARS 3.42 R5軟體進行分析。各點表示一個供體之一式三份之平均值。應注意，陰性對照(單獨的T細胞、單獨的腫瘤細胞)全部低於偵測範圍(#)。

圖31描繪在與LoVo.OKT3共培養時CD28 PYAP及YMNM基序在經CD40 CoStAR轉導之T細胞之長期存活及增殖中的重要作用。三個供體之細胞係用Dynabeads活化且用CTP194、CTP201、CTP202、CTP203轉導或經模擬轉導。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。在長期共培養結束時，量測成活力及絕對計數，且計算倍數擴增。資料展示為一式三份地分析之n≤3個供體之平均值+/-SEM。

圖32描繪經CD28突變體CD40 CoStAR構築體轉導之T細胞在腫瘤攻擊之後的耗竭概況。將三個供體之細胞用Dynabeads活化且用CTP194、CTP201、CTP202、CTP203轉導或經模擬轉導(離心接種(spinoculation)，MOI 5)。使表現CD34標記之細胞富集，遵循快速擴增方案(REP)擴增且經冷凍以用於後續實驗。解凍後，將細胞在補充有IL-2之完全RPMI中靜置3至4天。在IL-2饑餓隔夜之後，使用DRAQ-7 (1:200)藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定成活力及絕對計數，且使用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。在IL-2不存在的情況下將經轉導T細胞與LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞以8:1效靶比共培養6至8天，從而每3至4天更換一半培養基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表現CEA及PD-L1，從而向經轉導T細胞賦予信號2及信號1 (OKT3)兩者。在6至8天之後，評定成活力及絕對計數，且再用如上文所描述之新鮮LoVo.OKT3.GFP腫瘤細胞再攻擊活T細胞一週。經轉導(CD34+ (灰色))或未經轉導(CD34- (白色)) CD4 (上分圖)及CD8 (下分圖)之耗竭概況(LAG-3 (A)、PD-1 (B)、TIM-3(C))係藉由流動式細胞測量術評定且展示為n≤3個供體之平均值+/-SD。

圖33描繪在CD34富集及擴增之後自四個健康供體產生經轉導T細胞。4個健康供體(NBC360、NBC362、NBC358、NBC361)之T細胞係用Dynabeads活化且用CTP188、CTP189、CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200、CTP201、CTP202、CTP203、CTP204轉導或經模擬轉導。接著，使表現CD34之細胞經磁性富集且遵循快速擴增方案(REP)擴增。藉由流動式細胞測量術(Novocyte)評定REP之後10至11天各樣本之成活力。用NovoExpress 1.5.0軟體分析資料。同一供體內之各點表示不同構築體。

圖34描繪來自與Ba/F3標靶共培養隔夜之3個健康供體的未經轉導(NTD)或抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞(CoStAR)的活化標記之表現及細胞介素產生。測定活化標記4-1BB及CD69(A)之表現及IL-2及IFNγ(B)之產生。CoStAR接合增強細胞介素分泌。(C)未經轉導且CoStAR細胞毒性係相當的。在與未經轉導(NTD)及CoStAR T細胞共培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評定Ba/F3標靶之腫瘤計數。(D) CoStAR接合增強CD4及CD8 T細胞增殖。在與Ba/F3標靶共培養隔夜或5天之後，藉由流動式細胞測量術評定NTD及CoStAR T細胞計數以及增殖。

圖35描繪來自3個健康供體之抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞(CoStAR)的活化標記之表現，該等T細胞係用可溶性葉酸受體(sFOLR1)預培育，接著與Ba/F3標靶共培養隔夜。X軸以ng/mL為單位展示sFOLR1。在各組中，條1至4為未經轉導的，條5至8經CoStAR轉導。可溶性FOLR1不影響CoStAR T細胞上活化標記之上調。測定活化標記4-1BB (A)及CD69(B)之表現。(C) sFOLR1不影響CoStAR T細胞之細胞毒性。在與用遞增濃度之sFOLR預培育的未經轉導(NTD)之T細胞或CoStAR轉導之T細胞共培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評定Ba/F3標靶之腫瘤計數。(D) sFOLR1不影響細胞介素分泌。IL-2產生展示於抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞中，該等T細胞係用可溶性葉酸受體(sFOLR)預培育，接著與Ba/F3標靶共培養隔夜。

圖36描繪FOLR1 CoStAR需要信號1發揮作用。(A、B)分別為來自3個健康供體的與Ba/F3標靶共培養隔夜之未經轉導之(NTD)及抗FOLR1 CoStAR修飾之T細胞(CoStAR)的活化標記之表現(A)及細胞介素產生(B)。(A)在僅有信號2的情況下對活化標記的上調最小。(B)在僅有信號2的情況下未觀測到細胞介素分泌。(C)在與NTD及CoStAR T細胞共培養隔夜之後，藉由流動式細胞測量術評定Ba/F3標靶之腫瘤計數。在僅有信號2的情況下未觀測到細胞毒性。(D)在與Ba/F3標靶共培養隔夜或5天之後藉由流動式細胞測量術評定NTD及CoStAR T細胞計數。在僅有信號2的情況下未觀測到增殖。

圖37描繪TIL在卵巢癌中利用CoStAR發揮功能。(A)藉由消解釋放來自6種卵巢腫瘤之TIL且將其在3000U IL-2中進行培養。在腫瘤消解後48h及72h，在為5之MOI下進行用編碼CoStAR分子及靶向人類FOLR1之scFv的第3代慢病毒載體、連接子、融合至經截短CD40細胞質域之全長CD28的轉導。在第12至23天進行快速擴增方案。(B)流動式細胞測量術分析係用以使用抗受試者基因型抗體進行表面偵測來測定表現CoStAR分子之CD4及CD8 T細胞之頻率。(C)流動式細胞測量術分析係用以藉由流動式細胞測量術表面染色測定表現TCRαβ及TCRγδ之細胞的頻率。模擬物- 未經轉導之細胞。CoStAR ^-/+：如藉由流動式細胞測量術圈選所測定的對經處理之細胞群體中CoStAR分子呈陰性或陽性的細胞。

圖38描繪TIL在卵巢癌中利用CoStAR發揮功能。(A)將來自5種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與自體消解物一起在佈雷菲爾德菌素A (brefeldin A)存在下共培養隔夜。次日藉由流動式細胞測量術評定細胞表現IL-2或TNFα之頻率。藉由CoStAR分子提高TIL與自體消解物反應的頻率。NTD：未轉導細胞。CoStAR ^-/+：如藉由流動式細胞測量術圈選所測定的對經處理之細胞群體中CoStAR分子呈陰性或陽性的細胞。(B)將來自5種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與自體消解物共培養且評定上清液之細胞介素釋放。經CoStAR修飾之細胞的效應功能提高，如由增加之IFNγ、TNFα及IL-13釋放證明。此等分子之最大含量回應於用PMA (佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯)及離子黴素(ionomycin)刺激而為類似的。

圖39描繪CoStAR TIL保留穩固效應功能並保留對於信號1及2的要求。(A)將來自5種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與BA/F3細胞或經工程改造以表現OKT3、FOLR1或兩者之BA/F3細胞共培養。當與未經修飾之BA/F3或僅表現OKT3或僅表現FOLR1之BA/F3共培養時，未經修飾之TIL及經CoStAR修飾之TIL的細胞介素分泌相等。當與經修飾以表現FOLR1及OKT3兩者之BA/F3共培養時，經CoStAR修飾之TIL所分泌之細胞介素含量增加。(B)將來自5種卵巢腫瘤之經CoStAR修飾之TIL與BA/F3細胞或經工程改造以表現OKT3、FOLR1或兩者之BA/F3細胞共培養。經由細胞計數評定針對BA/F3目標細胞之細胞毒性，細胞計數係藉由對小鼠CD45之流動式細胞測量術分析測定。未經修飾之細胞及經CoStAR修飾之細胞等效地殺滅表現OKT3之細胞。經CoStAR修飾之TIL不會殺滅僅表現FOLR1之BA/F3細胞。(C)在不存在阻斷、MHCI、MHC II或MHC I+MHC II阻斷或抗體或同型對照的情況下，將來自3名卵巢癌患者之模擬物或經CoStAR修飾之TIL與自體腫瘤共培養。評定上清液之IFNγ釋放量。在按無抗體時的釋放量標準化的情況下，相對於不存在抗體或同型對照的條件，模擬物及經CoStAR修飾之TIL的IFNγ含量類似地降低，表明活性係藉由內源性TCR-MHC肽相互作用產生。

Claims (52)

1. 一種嵌合共刺激抗原受體(CoStAR)，其包含： 對腫瘤相關抗原(TAA)具有特異性之細胞外結合域，其可操作地連接至跨膜域、CD28傳訊域及CD40傳訊域或其傳訊片段。
2. 如請求項1之CoStAR，其中該CoStAR對FOLR1具有特異性。
3. 如請求項2之CoStAR，其中該細胞外結合域包含MOV19 scFv。
4. 一種靶向表現FOLR1之受試者之癌症的方法，其包含投與表現如請求項1至3之CoStAR的經工程改造之免疫細胞。
5. 如請求項4之方法，其中該癌症包含腎癌、肺癌或卵巢癌。
6. 如請求項4或5之方法，其中該工程改造之免疫細胞包含腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、αβ T細胞、γδ T細胞或NK T細胞。
7. 一種嵌合共刺激抗原受體(CoStAR)，其包含： 細胞外結合域，其可操作地連接至跨膜域、第一傳訊域及CD40傳訊域或其傳訊片段。
8. 如請求項7之CoStAR，其中該CoStAR不包含信號1傳訊域。
9. 如請求項7之CoStAR，其中該第一傳訊域包含CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137 (41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6之傳訊域或傳訊片段。
10. 如請求項7之CoStAR，其中該CD40傳訊片段由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SH3基序(KPTNKAPH，SEQ ID NO:26)、TRAF2基序(PKQE，SEQ ID NO:27、PVQE，SEQ ID NO:28、SVQE，SEQ ID NO:29)、TRAF6基序(QEPQEINFP，SEQ ID NO:30)、PKA基序(KKPTNKA，SEQ ID NO:31、SRISVQE，SEQ ID NO:32)或其組合，或為全長CD40細胞內域。
11. 如請求項7之CoStAR，其中該CD40傳訊片段由PVQET組成、基本上由PVQET組成或包含PVQET。
12. 如請求項7之CoStAR，其中該CoStAR包含第一傳訊域、第二傳訊域及CD40傳訊域或其傳訊片段。
13. 如請求項12之CoStAR，其中該第二傳訊域包含CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134 (OX40)、CD137 (41BB)、CD150 (SLAM)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)或EphB6之傳訊域或傳訊片段。
14. 如請求項9之CoStAR，其中該第一傳訊域包含全長共刺激域。
15. 如請求項7之CoStAR，其中該第一傳訊域包含CD28傳訊域。
16. 如請求項7之CoStAR，其中該CD40傳訊域包含SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25。
17. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合域藉由連接子及/或間隔子可操作地連接至該跨膜域。
18. 如請求項16之CoStAR，其中該連接子包含約5至約20個胺基酸。
19. 如請求項16之CoStAR，其中該連接子包含AAAGSGGSG (SEQ ID NO:8)。
20. 如請求項16之CoStAR，其中該間隔子包含約10至約250個胺基酸。
21. 如請求項7之CoStAR，其中該CoStAR包含第二細胞外結合域。
22. 如請求項21之CoStAR，其中該第二細胞外結合域包含來自CD8或CD28之配位體結合域。
23. 如請求項16之CoStAR，其中該間隔子包含一或多個免疫球蛋白域或免疫球蛋白恆定區。
24. 如請求項16之CoStAR，其中該間隔子包含SEQ ID NO: 13之一或多個免疫球蛋白域或免疫球蛋白恆定區。
25. 如請求項7之CoStAR，其中該跨膜域包含CD28或CD8之跨膜域。
26. 如請求項7之CoStAR，其中該跨膜域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之跨膜域序列。
27. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合域結合至腫瘤相關抗原。
28. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合域結合至腫瘤微環境相關抗原。
29. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合域對以下具有特異性：CD70、CD146、FOLR1、癌胚抗原(CEA)、5T4、黑素轉鐵蛋白(mellanotransferrin) (CD228)、Her2、EGFR、GPC3、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP/CSPG4)、CD71、EPCAM、SM5-1、葉酸受體或CA125、PDL-1、PD-1、CD155 PD-1、間皮素、或腫瘤特異性肽(p)-主要組織相容(MHC)複合體，或腫瘤特異性pMHC複合體抗原特異性單鏈T細胞受體(scTCR)、或運鐵蛋白，或抗體或抗原結合蛋白。
30. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合域對PDL1具有特異性。
31. 如請求項30之CoStAR，其中該細胞外結合域包含SEQ ID NO: 6。
32. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合域對CEA具有特異性。
33. 如請求項32之CoStAR，其中該細胞外結合域包含SEQ ID NO: 5。
34. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合結構域對FOLR1具有特異性。
35. 如請求項32之CoStAR，其中該細胞外結合域包含SEQ ID NO: 4。
36. 如請求項7之CoStAR，其中該細胞外結合域對CD155、CD112或CD113具有特異性。
37. 如請求項36之CoStAR，其中該細胞外結合域包含SEQ ID NO: 7。
38. 如請求項1至37中任一項之CoStAR，其包含兩個或更多個細胞外結合域。
39. 如請求項1之CoStAR，其中該細胞外結合域包含scFv、肽、抗體重鏈、天然配位體或受體。
40. 如請求項1至37中任一項之CoStAR，其進一步包含在C端處之CD3ζ傳訊域。
41. 如請求項1至37中任一項之CoStAR，其進一步包含N端信號肽。
42. 一種核酸，其編碼如請求項1至41中任一項之CoStAR。
43. 一種載體，其包含如請求項42之核酸。
44. 一種細胞，其表現如請求項1至41中任一項之CoStAR。
45. 一種細胞，其表現如請求項1至41中任一項之CoStAR中之兩者或更多者。
46. 如請求項45之細胞，其表現抗FOLR1.CD28.CD40及抗CA125.41BB.CD40或表現抗FOLR1.CD28.CD40及PD1.CD28.CD40。
47. 如請求項44之細胞，其中該細胞包含α-β T細胞、γ-δ T細胞、T調節細胞、TIL、NKT細胞或NK細胞。
48. 如請求項44之細胞，其中該細胞共同表現CAR或TCR。
49. 一種製造如請求項44之細胞之方法，其包含用如請求項43之載體轉導或轉染細胞之步驟。
50. 一種製備表現如請求項1至41中任一項之CoStAR之細胞群體的方法，其包含 i)偵測該CoStAR在經如請求項43之載體轉染或轉導之細胞之表面上的表現；及 ii)選擇經鑑別為表現該CoStAR之細胞。
51. 一種細胞群體，其富集細胞以表現如請求項1至41中任一項之CoStAR。
52. 一種治療受試者之疾病的方法，其包含向該受試者投與如請求項44至48中任一項之細胞或如請求項51之細胞群體的步驟。

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