CN115927182B

CN115927182B - 一种抗肿瘤功能增强型car-t细胞的制备方法

Info

Publication number: CN115927182B
Application number: CN202310051620.7A
Authority: CN
Inventors: 崔久嵬; 牛超; 李敏; 陈永冲
Original assignee: First Hospital Jinlin University
Current assignee: First Hospital Jinlin University
Priority date: 2023-02-02
Filing date: 2023-02-02
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2043-02-02
Also published as: CN115927182A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤功能增强型CAR‑T细胞的制备方法。本发明先使用双膦酸盐和包被液共同刺激PBMCs以激活T细胞，再转染含有CAR的载体，获得的CAR‑T细胞不仅对高表达靶抗原的肿瘤细胞表现出较强的杀伤作用，而且对靶抗原表达明显降低的肿瘤细胞也表现出非常强的杀伤作用，能够提高CAR‑T细胞治疗的疗效、降低CAR‑T细胞治疗的耐药和复发。本发明同时简化了CAR‑T细胞的制备工艺，并且安全有效，可用于血液肿瘤和实体肿瘤的免疫细胞治疗。

Description

一种抗肿瘤功能增强型CAR-T细胞的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗肿瘤功能增强型CAR-T细胞的制备方法。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)T细胞是利用基因工程技术在T细胞上安装了能够识别肿瘤细胞抗原，同时能够激活T细胞的嵌合抗体，从而使T细胞能够识别并杀死肿瘤细胞。CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤中取得了巨大突破，这为开发其他癌症的治疗策略奠定了基础，但是耐药和复发是CAR-T细胞治疗面临的巨大挑战。

肿瘤患者发生CAR-T细胞耐药的部分原因是CAR-T细胞抗肿瘤效应性降低、持久性减弱。CAR-T细胞效应性和持久性差是因为CAR-T细胞发生耗竭，耗竭的CAR-T细胞再次遇到肿瘤细胞的杀伤能力明显降低。CAR-T细胞治疗的复发包括抗原阴性复发和抗原阳性复发两类。抗原阴性复发的主要机制是抗原丢失；抗原阳性复发是指抗原未完全丢失，而是表达减少或密度降低造成肿瘤细胞逃逸。因此，开发具有更强抗肿瘤效应性和持久性、可以识别低密度肿瘤抗原的CAR-T细胞有利于降低CAR-T细胞治疗的耐药和复发，提高CAR-T细胞治疗的疗效。此外，CAR-T细胞制备需要先采用分选试剂盒或分选仪分离T细胞，再经过CD3和/或CD28抗体或磁珠激活，然后才能进行转染。这些操作不仅费时，而且明显增加了CAR-T细胞的制备成本。

怎样才能改善CAR-T细胞治疗的耐药和复发，提高肿瘤患者生存率？怎样才能简化CAR-T细胞制备工艺、降低制备成本？这些都是CAR-T细胞治疗需要解决的问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗肿瘤功能增强型的CAR-T细胞，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，降低CAR-T细胞治疗的耐药和复发，并且简化CAR-T细胞的制备工艺、降低制备成本。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种抗肿瘤功能增强型CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括激活PBMCs中的T细胞、转染表达CAR的载体获得CAR-T细胞。

进一步，激活PBMCs中T细胞的方法包括向培养器材中加入含双膦酸盐的培养基进行PBMCs中T细胞的激活。

进一步，所述双膦酸盐包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸或米罗膦酸。

进一步，所述双膦酸盐为唑来膦酸。

进一步，所述唑来膦酸的浓度为1-10μM。

进一步，所述唑来膦酸的浓度为3-8μM。

进一步，所述唑来膦酸的浓度为5μM。

进一步，所述双膦酸盐的加入时间为第0天。

进一步，所述PBMCs从样本中分离获得。

进一步，所述样本来源于骨髓、脐带血和胎盘血或外周血。

进一步，所述样本来源于外周血。

进一步，采集样本的方法包括采用血细胞分离机采集、肝素抗凝采集。

进一步，所述采集样本的方法为肝素抗凝采集。

进一步，分离PBMCs的试剂包括淋巴细胞分离液、单核细胞分离液。

进一步，所述分离PBMCs的试剂为淋巴细胞分离液。

进一步，所述分离PBMCs的时间为第0天。

进一步，所述激活PBMCs中的T细胞的条件为37℃、5％CO₂。

进一步，使用包被液处理细胞培养器材。

进一步，所述包被液包括RetroNectin、Novonectin、CD137单克隆抗体、CD28单克隆抗体和/或CD3单克隆抗体。

进一步，所述包被液为RetroNectin。

进一步，所述RetroNectin的浓度为10-200μg/mL。

进一步，所述RetroNectin的浓度为50-150μg/mL。

进一步，所述RetroNectin的浓度为100μg/mL。

进一步，所述培养器材包括6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、T25细胞培养瓶、T75细胞培养瓶或T175细胞培养瓶。

进一步，所述培养器材为6孔板。

进一步，包被液处理细胞培养器材的方法包括将培养器材置于37℃培养箱中静置4h以上或将培养器材在4℃条件下静置过夜。

进一步，所述包被液处理培养器材的开始使用时间为第0天。

进一步，所述包被培养器材的使用时间为第0-4天。

进一步，所述培养基选自完全培养基。

进一步，所述完全培养基包括无血清基础培养基和附加组分。

进一步，所述无血清基础培养基选自AlyS505N-0无血清细胞培养基、BYN-PD701无血清培养基、GT551无血清培养基、X-VIVO15无血清培养基、TexMACS无血清培养基、IMSF100无血清培养基。

进一步，所述无血清基础培养基为AlyS505N-0无血清细胞培养基。

进一步，所述附加组分包括促进细胞生长的组分。

进一步，所述附加组分包括自体血浆、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21。

进一步，所述附加组分为自体血浆、IL-2。

进一步，所述自体血浆的体积占比为0-20％。

进一步，所述自体血浆的体积占比为5-15％。

进一步，所述自体血浆的体积占比为10％。

进一步，所述IL-2的浓度为100-2000U/mL。

进一步，所述IL-2的浓度为500-1500U/mL。

进一步，所述IL-2的浓度为600U/mL。

进一步，转染表达CAR的载体时加入转染增强剂。

进一步，所述转染增强剂包括polybrene、HiTransG、envirus、VirusBoost和/或Vectofusin-1。

进一步，所述转染增强剂为polybrene。

进一步，所述polybrene的终浓度为8μg/mL。

进一步，加入polybrene和表达CAR的载体进行转染的时间包括第1-5天。

进一步，所述加入polybrene和表达CAR的载体进行转染的时间包括第1天、第3天或第5天。

进一步，所述加入polybrene和表达CAR的载体进行转染的时间为第1天。

进一步，所述加入polybrene和表达CAR的载体进行转染的时间包括12-24h。

进一步，所述加入polybrene和表达CAR的载体进行转染的时间为16h。

进一步，所述表达CAR的载体包括病毒、质粒、噬菌体、粘粒、BAC或YAC。

进一步，所述病毒包括慢病毒、腺病毒、逆转录病毒。

进一步，所述病毒为慢病毒。

进一步，慢病毒的MOI＝5-20。

进一步，所述MOI＝7-15。

进一步，所述MOI＝10。

进一步，所述方法进一步包括对CAR-T细胞进行扩增。

进一步，扩增CAR-T细胞的方法包括：采用半量换液或补液的方式调整细胞密度进行培养。

进一步，细胞密度选自1-3×10⁶个细胞/mL培养基。

进一步，细胞密度为2×10⁶个细胞/mL培养基。

进一步，扩增CAR-T细胞的方法进一步包括在转染病毒之后加入完全培养基进行培养。

进一步，培养的时间为24h。

进一步，扩增CAR-T细胞的方法包括将转染培养之后的细胞转移到新的培养器材中进行培养。

进一步，扩增CAR-T细胞的方法具体包括：

1)在转染病毒后的第3天，补充加完全培养基后，继续进行培养；

2)第4天，完全去除原培养基，更换新的完全培养基，并将CAR-T细胞接种到新的培养器材中培养；

3)第11-14天收获CAR-T细胞。

进一步，3)中第11天收获CAR-T细胞。

进一步，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体肿瘤。

进一步，所述血液肿瘤包括急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病、脊髓发育不良。

进一步，所述实体肿瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肝癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、口腔癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、鼻咽癌、胸腺癌、淋巴恶性肿瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、黑色素瘤。

本发明的第二方面提供了一种抗肿瘤功能增强型CAR-T细胞，所述CAR-T细胞是由本发明的第一方面所述的方法制备得到的。

进一步，所述CAR-T细胞的CAR包含抗肿瘤抗原CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D ligands、瘤胎抗原、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF-R2、GPC3或Mesothelin的特异性抗体。

进一步，所述CAR-T细胞的CAR包含抗Mesothelin的特异性抗体。

进一步，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体肿瘤。

本发明的第三方面提供了一种CAR-T细胞免疫治疗的药物组合物，所述药物组合物包括本发明的第二方面所述的CAR-T细胞。

进一步，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。

本发明的第四方面提供了本发明的第二方面所述的CAR-T细胞或本发明的第三方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体肿瘤。

本发明的优点和有益效果：

本发明获得的CAR-T细胞与传统方法制备的CAR-T细胞相比，抗肿瘤作用明显增强；尤为重要的是，本发明获得的CAR-T细胞大大提高了CAR-T细胞的杀伤效率，降低了CAR-T细胞治疗的耐药和复发，简化了CAR-T细胞的制备工艺，节约了CAR-T细胞的制作成本，并且安全有效，可用于血液肿瘤、实体肿瘤的免疫细胞治疗。

附图说明

图1为流式细胞术检测MSLN CAR-T细胞阳性比例结果图。

图2为Calcein-AM释放法检测CAR-T细胞的靶向杀伤效率图。

图3为不同时间转染病毒获得的CAR-T细胞的比例图。

图4为不同时间转染病毒获得的CAR-T细胞数量统计图。

图5为CAR-T细胞对Mesothelin高表达(MSLN^high)肿瘤细胞的杀伤作用效果图，其中5A是流式细胞术检测MSLN^high SKOV3细胞表面MSLN的表达结果图；5B是Calcein-AM释放法检测CAR-T细胞对MSLN^high SKOV3细胞的杀伤效率图。

图6为CAR-T细胞对Mesothelin低表达(MSLN^low)肿瘤细胞的杀伤作用效果图，其中6A是流式细胞术检测MSLN^low SKOV3细胞表面MSLN的表达；6B是Calcein-AM释放法检测CAR-T细胞对MSLN^low SKOV3细胞的杀伤效率图。

图7为Calcein-AM释放法检测CAR-T细胞对靶细胞的二次杀伤效率图。

图8为胞内染色方法检测CAR-T细胞的颗粒酶B和穿孔素的表达效果图，其中8A是直方图分析颗粒酶B的表达情况图；8B是直方图分析穿孔素的表达情况图；8C是颗粒酶B的平均荧光强度统计图；8D是穿孔素的平均荧光强度统计图。

具体实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，研发了一种扩增CAR-T细胞的方法，使用该方法制备的CAR-T细胞，大大提高了CAR-T细胞的杀伤效率，尤其提高了CAR-T细胞对肿瘤抗原低表达肿瘤细胞的杀伤效率；同时，省略了传统制备CAR-T细胞方法中的T细胞分离、纯化步骤，明显简化了CAR-T细胞的制备工艺，节约了CAR-T细胞的制作成本。

肿瘤

在本发明中，术语“癌症”和“肿瘤”是可互换的术语，是指动物中任何异常细胞或组织的生长或增殖。如本发明所用，术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体肿瘤和血液肿瘤，并且还涵盖恶性、恶性前和良性生长，诸如发育异常。

实体肿瘤非限制性实例包括肺癌(小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC))、尿道癌、鳞状细胞癌、垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌(包括子宫体子宫内膜癌)、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、脑癌、睾丸癌、胆囊癌、胆管癌、胃癌、口腔癌、成神经管细胞瘤、多发性鳞状细胞瘤、软骨肉瘤、黑素瘤、鼻咽癌、胸腺癌、粘液肉瘤、黑色素瘤、淋巴恶性肿瘤、纤维肉瘤、间皮瘤和各种类型的头颈癌。

血液肿瘤非限制性实例包括急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病、脊髓发育不良。

CAR、CAR-T

在本发明中，术语“CAR-T细胞”通常是指已被重组修饰能够表达CAR(又称“嵌合抗原受体”)的T细胞。

本发明中使用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用。本发明所述CAR(嵌合抗原受体)是一种融合蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，一方面可以靶向特定的抗原蛋白，另一方面能够向细胞内传递活化信号。CAR通常包括三个主要部分：胞外域、跨膜结构域和胞内域。胞外域能够识别抗原，从根本上决定了CAR-T细胞的靶细胞。跨膜结构域的主要功能一方面是将CAR分子锚定在细胞膜上，另一方面是将CAR分子的细胞外结构域与细胞内结构域连接起来，并将胞外识别信号转导至胞内，其对CAR分子的稳定表达具有重要作用。胞内域可以包括信号转导结构域(CSD)和共刺激结构域。用于实施本发明的CAR根据本领域公知的原理制备。

在本发明中，“CAR”包括但不限于第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。术语“第一代CAR”是指CAR的胞内域仅包含单个传导信号，例如CAR的胞内域中只包含CD3ζ单一信号。第二代CAR胞内域除单一信号传导结构域如CD3ζ信号外，还包括一个共刺激分子，例如CD28，4-1BB(CD137)，这些信号增强了CAR-T的持久性、细胞因子分泌和抗肿瘤活性。第三代CAR包括二个共刺激分子。第四代CAR也被称作“装甲车”，是在第三代CAR的基础上，进一步增加可以改善CAR-T细胞功能的结构，例如细胞因子或者趋化因子的受体结构。

可以掺入本发明的CAR中的示例性细胞内信号传导结构域包含(氨基到羧基)：CD3ζ；CD28-CD3ζ；CD28-OX40-CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；41BB-CD28-CD3ζ和41BB–CD3ζ。

本发明中使用的术语“肿瘤抗原”泛指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质。可被CAR靶向的肿瘤抗原的非限制性示例包括选自所述群组的一种或多种抗原，包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B 2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D ligands、瘤胎抗原、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGEA3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、Mesothelin抗原。本发明具体实施例以靶向Mesothelin的CAR为例进行了实验验证。

载体

在本发明中，术语“载体”或“表达CAR的载体”可在本发明中互换使用，“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体、病毒、粘粒、BAC或YAC等，从而复制和/或表达细胞内的附着核酸分子。“载体”包括游离型(例如，质粒)或非游离型载体。术语“载体”包括在体外、体内或离体将核酸分子引入细胞的病毒和非病毒手段。术语“载体”可包括合成载体。可通过众所周知的方法将载体引入所需宿主细胞中，包括但不限于转染、细胞融合和脂质转染。

在一些实施方案中，载体来源于或包含非病毒载体。非病毒载体的优点包括生产满足整个患者群体所需的足够量的容易性和相对的低成本、在储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。适合用于本技术载体中的转座子系统的非限制性示例是Mariner型转座子如睡美人转座子、piggyBac样转座子或hAT家族转座子如TcBuster转座子。

在本发明中，“病毒”包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。将显而易见的是，根据本公开的病毒载体不必局限于特定病毒的组分。病毒载体可包含来源于两种或更多种不同病毒的组分，并且还可包含合成组分。

术语“逆转录病毒(retrovirus或retroviral)”是指RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。一旦病毒整合到宿主基因组中，其就被成为“前病毒”。前病毒用作RNA聚合酶II的模板，并且指导由病毒编码的RNA分子的表达。逆转录病毒(逆转录病毒科属)包含但不限于：(1)γ逆转录病毒属，如莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)和猫白血病病毒(FLV)，(2)泡沫病毒属，如猿猴泡沫病毒，(3)慢病毒属，如人类免疫缺陷病毒-1和猿猴免疫缺陷病毒。

如本发明所用，术语“慢病毒(lentiviral或lentivirus)”是指代复杂逆转录病毒的组(或属)。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。慢病毒包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV)，包含HIV类型和2型HIV；维斯纳—梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎—脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。衍生自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。

在一些实施方案中，可适用于本发明中的病毒可为腺病毒。术语“腺病毒”是具有小型(约20nm)蛋白质包壳的单链DNA病毒，属于细小病毒科，并且特指腺病毒科属的病毒。术语腺病毒科总体指代哺乳动物腺病毒属的动物腺病毒，包括但不限于人、牛、羊、马、犬、猪、鼠和猿猴腺病毒亚属。具体地说，人腺病毒包括A-F亚属以及它们的单种血清型，单种血清型和A-F亚属包括但不限于人腺病毒类型1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(AdllA和AdIIP)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91。

在本发明中，术语“转染”泛指将一核酸分子引入一选定的宿主细胞内的方式。依据本领域中已知的技术，一核酸分子(例如，一重组DNA构建体或一重组载体)可通过多种技术而被引入至一选定的宿主细胞内，例如磷酸钙或氯化钙介导的转染作用(transfection)、电穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞击法(particle bombardment)、脂质体介导的转染作用(liposome-mediated transfection)、利用细菌噬菌体的转染作用、利用逆转录病毒(retrovirus)或其他病毒(例如，痘苗病毒(vaccinia virus)或昆虫细胞的杆状病毒(baculovirus))的转导作用(transduction)、原生质融合(protoplast fusion)、农杆菌介导的转化法(Agrobacterium-mediatedtransformation)或其他方法。

术语“转染增强剂”能够提高载体对细胞的转染效率。在本发明中，“转染增强剂”用于提高含CAR的载体对PBMCs的转染效率。转染增强剂包括但不限于polybrene、HiTransG、envirus、VirusBoost和/或Vectofusin-1；优选地，所述转染增强剂为polybrene；优选地，所述polybrene的终浓度为8μg/mL。

术语“MOI”是指感染复数，也就是剂(例如病毒颗粒)与感染靶标(例如细胞)的比率。例如，当涉及一群接种了感染性病毒颗粒的细胞时，感染复数或MOI是由一个孔中沉淀的感染性病毒颗粒数量除以该孔中存在的靶细胞数量而确定的比例。在本发明中，MOI以5-20或7-15提供。在一些实施方式中，MOI＝5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；优选地，MOI＝10。

样本

在本发明中，术语“样本”意指从受试者或个体的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样本的来源可以是实体组织如来自新鲜，冷冻和/或保存的器官，组织样本，活组织检查和/或抽吸物；血液或任何血液成分如血浆；来自受试者的妊娠或发育中任意时间的细胞。样本包括但不限于：外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、血浆，血液，血液衍生的细胞，细胞提取物，胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤和组织培养液(tissue culture medium)，组织提取物如匀浆化的组织，及其组合组织样本还可以是原代或培养的细胞或细胞系。优选地，所述血液包括但不限于脐带血和胎盘血、外周血、静脉血；优选地，所述样本来源于外周血。术语“外周血”指全身的血液，也即在哺乳动物全身性循环或已经循环的血液。所述哺乳动物不是胎儿。对于本发明的目的，没有理由区分位于相同循环回路中不同部分处的血液。

在本发明中，术语“PBMCs”通常是指外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclear cells，PBMCs)，是指任何拥有圆形或近圆形细胞核的外周血细胞。这些细胞可以包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞，而红血球和血小板由于没有细胞核不属于此类；而粒细胞(包括中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)拥有多叶的核，也不属于此类。

培养

在本发明中，术语“培养器材”被定义为专门设计用于支持培养中的细胞生长和繁殖的容器。容器在大小、形状、涂层和有无盖子方面可以不同。细胞培养器材的非限制性实例包括细胞培养皿、管、板、孔和烧瓶。优选地，所述细胞培养器材包括6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、T25、T75或T175；优选地，所述细胞培养器材为6孔板。在一些实施方式中，培养器材包被液包括但不限于：重组人DL1-Fc蛋白、重组人DL4-Fc蛋白、Notch配体、RetroNectin、Novonectin、CD137单克隆抗体、CD28单克隆抗体和/或CD3单克隆抗体；在本发明的具体实施例中，所述培养器材的包被液为RetroNectin。在一些实施方式中，培养器材用包被液包被时间至少0.5h、至少1.0h、至少1.5h、至少2.0h、至少2.5h、至少3.0h、至少3.5h、至少4.0h、至少4.5h、至少5.0h、至少5.5h、至少6.0h、至少6.5h、至少7.0h、至少7.5h、至少8.0h、至少8.5h、至少9.0h、至少9.5h、至少10.0h、至少10.5h、至少11.0h、至少11.5h、至少12h；优选地，所述包被时间至少4.0h。

在一些实施方式中，RetroNectin以10μg/mL-200μg/mL的浓度或50μg/mL-150μg/mL的浓度提供。在一些实施方式中，RetroNectin以至少10μg/mL、至少20μg/mL、至少30μg/mL、至少40μg/mL、至少50μg/mL、至少60μg/mL、至少70μg/mL、至少80μg/mL、至少90μg/mL、至少100μg/mL、至少110μg/mL、至少120μg/mL、至少130μg/mL、至少140μg/mL、至少150μg/mL、至少160μg/mL、至少170μg/mL、至少180μg/mL、至少190μg/mL或至少200μg/mL的浓度提供。优选地，RetroNectin以100μg/mL的浓度提供。

在本发明中，术语“培养”是指在有利于细胞扩增和增殖的条件下在培养基中使细胞生长。术语“培养基”在本领域中是公认的，并且通常是指用于培养活细胞的任何物质或制剂。当用于细胞培养时，术语“培养基”包括细胞周围环境的组份。培养基可以是固体、液体、气体或各种相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。术语“基础培养基”是指促进许多类型的微生物生长的培养基，不需要任何特殊的营养补充剂。大多数基础培养基通常包含四个基本化学基团：氨基酸、碳水化合物、无机盐和维生素。基础培养基通常用作更复杂培养基的基础，向其中添加了补充剂，例如血清、缓冲液、生长因子、脂质等。在一方面，生长培养基可以是具有必需生长因子的复杂培养基，以支持本发明细胞的生长和扩增，同时保持其自我更新能力。术语“无血清基础培养基”是不含来自任何生物的血清(例如胎牛血清(FBS)、牛血清、马血清、山羊血清、人血清等)的培养基。无血清基础培养基的实施例包括但不限于AlyS505N-0无血清细胞培养基、BYN-PD701无血清培养基、GT551无血清培养基、X-VIVO15无血清培养基、TexMACS无血清培养基、IMSF100无血清培养基；在本发明的具体实施例中，所述无血清基础培养基为AlyS505N-0无血清细胞培养基。

在本发明中，“附加组分”包括但不限于自体血浆、IL-2、IL-6、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21、低密度脂蛋白(LDL)、干细胞因子(SCF)和/或TPO。术语“自体血浆”是指与待诱导的PBMCs具有同一来源的血浆。换言之，即该血浆与要诱导培养的单个核细胞取自同一个体。在本发明的具体实施例中，所述的附加组分包括自体血浆、IL-2。血浆中含有血清及多种营养成分，对细胞有良好的保护作用，当自体血浆的体积占比为0-20％时，例如，自体血浆的体积占比为5％、10％、15％或20％，对细胞的保护作用好。在本发明的具体实施例中，自体血浆的体积占比为10％。

在一些实施方式中，IL-2以100-2000U/mL的浓度或500-1500U/mL的浓度提供。在一些实施方式中，IL-2以至少100U/mL、至少200U/mL、至少300U/mL、至少400U/mL、至少500U/mL、至少600U/mL、至少700U/mL、至少800U/mL、至少900U/mL、至少1000U/mL、至少1100U/mL、至少1200U/mL、至少1300U/mL、至少1400U/mL、至少1500U/mL、至少1600U/mL、至少1700U/mL、至少1800U/mL、至少1900U/mL或至少2000U/mL的浓度提供。优选地，IL-2以600U/mL的浓度提供。

术语“双膦酸盐”表示以两个C-PO32-键为特征的化合物。如果这两个键位于同一碳原子上，那么该化合物被称为双膦酸盐类。应当注意，本文所用的术语“双膦酸盐”也涵盖二膦酸盐类、双膦酸类和二膦酸类以及这些物质的盐和衍生物。在涉及双膦酸盐或双膦酸盐类时使用特定命名不表示限制本发明的范围，特殊指示除外。双膦酸盐包括但不限于唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸或米罗膦酸；优选地，所述双膦酸盐为唑来膦酸。

在一些实施方式中，唑来膦酸以1-10μg/mL的浓度或3-8μg/mL的浓度提供。在一些实施方式中，唑来膦酸以至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少3μg/mL、至少4μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少7μg/mL、至少8μg/mL、至少9μg/mL或至少10μg/mL的浓度提供。优选地，唑来膦酸以5μg/mL的浓度提供。

在本发明中，术语“扩增”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本发明设想的组合物产生、引发或引起更大生理应答(即，下游效应)的能力。可测量的生理应答可包括CAR-T细胞扩增、活化、效应功能、持久性的增加，和/或癌细胞杀伤能力的增加，以及从本领域的理解和本发明的描述中显而易见的应答等。

术语“细胞密度”是指存在于指定体积的培养基中的细胞数目。在本发明的具体实施例中，CAR-T细胞密度以1-5×10⁶个细胞/mL培养基或1-3×10⁶个细胞/mL培养基提供。在一些实施方式中，CAR-T细胞密度以至少1×10⁶个细胞/mL培养基、至少2×10⁶个细胞/mL培养基、至少3×10⁶个细胞/mL培养基、至少4×10⁶个细胞/mL培养基或至少5×10⁶个细胞/mL培养基提供。优选地，所述CAR-T细胞密度为2×10⁶个细胞/mL培养基。

抗体

抗体是具有复杂内部结构的大而复杂的分子(分子量为～150,000或约1320个氨基酸)。天然抗体分子包括两对相同的多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。

在本发明中，术语“抗体”包含抗体样抗原结合结构域的各种多肽，包括但不限于常规抗体(通常包含至少一条重链和至少一条轻链)、单结构域抗体(sdAb，仅包含一条链，通常与重链相似)、含有VHH的多肽(包含至少一个仅重链抗体可变结构域或VHH的多肽)、以及前述任一者的片段，只要它们展现出所需的抗原结合活性即可。在一些实施方案中，抗体包含二聚化结构域。此类二聚化结构域包括但不限于重链恒定结构域(包含CH1、铰链、CH2和CH3，其中CH1通常与轻链恒定结构域CL配对，而铰链介导二聚化)。抗体的非限制性实例包括单结构域抗体或纳米抗体、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab3、单价IgG、scFv、双特异性抗体、双特异性双抗体、三特异性三抗体、scFv-Fc、小抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VHH或肽体。

术语“抗体”还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(如骆驼科(包括美洲驼)、鲨鱼、小鼠、人、食蟹猴等)的抗体。

术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体群体中的一种抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成所述群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，单克隆抗体样本可以与抗原上的相同表位结合。修饰语“单克隆的”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

药物组合物

如本发明所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。

术语“药物组合物”是指呈使得一种或多种活性成分的生物活性有效的形式、并且不含对所述配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。因此，它是适合于哺乳动物受试者(通常是人类)的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。此类配制品可以是无菌的。

“药学上可接受的载体”是指用于与治疗剂一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料、配制助剂或本领域常规的载体，它们共同构成用于向受试者施用的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与所述配制品的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所采用的配制品。

在本发明中，术语“治疗”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1CAR-T细胞的制备

1、实验材料

表1实验材料

2、实验方法

1)RetroNectin包被6孔板

1.1)使用PBS缓冲液将分装后的RetroNectin稀释至100μg/mL，加入6孔板中(non-tissue culture treated)，每孔加入1.5mL RetroNectin稀释液。

1.2)将孵有RetroNectin的6孔板置于37℃培养箱中静置4h以上(或4℃静置过夜)，使用前移走6孔板中RetroNectin稀释液，并使用1mL的PBS轻轻洗涤一次。

2)PBMCs的分离

2.1)采用肝素抗凝管静脉采集20mL的外周血，在生物安全柜中抽取0.5mL血液用于流式细胞术检测，其余血液平均分配至两个50mL无菌离心管中，以800g、室温、离心10min。

2.2)采用一次性无菌移液管将血浆移至新的50mL无菌离心管中，置于56℃恒温培养箱中30min，灭活补体。

2.3)向离心后的血细胞中加入生理盐水使其终体积为15mL，并混合均匀，采用一次性无菌移液管将稀释好的血细胞按照1:1(体积比)的比例缓慢移至盛有15mL淋巴细胞分离液的50mL离心管中，轻轻地将离心管移至离心机中，以400g、室温离心30min。

2.4)慢慢取出离心管，并将其轻轻放置生物安全柜中，采用10mL一次性无菌移液管吸出中间的PBMCs层，并将其放到新的50mL离心管中。

2.5)再加入生理盐水至45mL，混合均匀后，以450g、室温离心8min。重复洗涤一次。

3)转染和扩增CAR-T细胞

3.1)配置完全培养基：含有10％自体血浆和600U/mL IL-2的AlyS505N-0无血清细胞培养液。

3.2)激活PBMCs中的T细胞：第0天，用含有5μM唑来膦酸的完全培养基将PBMCs密度调整至2×10⁶个细胞/mL培养基，然后加入RetroNectin包被的6孔板中，共计2孔，每孔2mL。放置37℃，5％CO₂培养箱中培养16h。

3.3)第1天，每孔加入8μg/mL的Polybrene，并按照MOI＝10的比例在一个孔中加入Mesothelin CAR的慢病毒(CAR-T细胞组)，另一个孔加入同等计量的PBS(T细胞组)，1000g、25℃离心30min。取出6孔板，放置37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。

3.4)第3天，每孔加入2mL完全培养基，继续放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

3.5)第4天，采用一次性移液管悬起细胞，收集细胞悬液至15mL离心管中，400g、室温离心5min，弃掉上清，使用3mL培养基悬起细胞沉淀，并将细胞放置于新的6孔板中，继续放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3.6)以后每2天进行细胞计数，采用半量换液或补液的方式将细胞密度调整至2×10⁶个细胞/mL培养基，并放置37℃，5％CO₂培养箱中培养。

3.7)第11天收获细胞。

4)CAR-T细胞阳性比例和靶向杀伤功能检测

4.1)采用荧光标记的鼠抗人CD3抗体和荧光标记的人Mesothelin(MSLN)蛋白与本发明获得的CAR-T细胞共孵育，采用流式细胞术检测MSLN CAR-T细胞阳性比例。

4.2)采用Calcein-AM标记表达Mesothelin的SKOV3细胞，然后将实施例1获得的CAR-T细胞和T细胞与Calcein-AM标记的SKOV3细胞按照10:1的比例共孵育4h，通过检测靶细胞被杀伤后Calcein的释放，计算CAR-T细胞对靶细胞的体外杀伤。

3、实验结果

结果如图1、图2所示，结果表明，流式细胞术检测MSLN CAR-T细胞阳性比例的结果为38.0％；CAR-T细胞对靶细胞SKOV3的杀伤作用明显高于对照组T细胞(68.15％vs8.38％)。

实施例2不同转染时间获得的CAR-T细胞对比

1、本实施例针对实验材料，与实施例1一致。

2、实验方法

1)本实施例针对RetroNectin包被6孔板，与实施例1一致。

2)本实施例针对PBMCs的分离，与实施例1一致。

3)转染和CAR-T细胞扩增

3.1)本实施例针对配置完全培养基，与实施例1一致。

3.2)激活PBMCs中的T细胞：第0天，用含有5μM唑来膦酸的完全培养基将PBMCs密度调整至2×10⁶个细胞/mL培养基。①取2mL细胞悬液加入RetroNectin包被的6孔板的1个孔中，按照实施例1中的方法继续培养至第11天。②另取4mL细胞悬液，其中2mL加入RetroNectin包被的6孔板的1个孔中，另外2mL加入未经RetroNectin包被的6孔板的1个孔中。将两块培养板放置在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3.3)第3天，取出②中RetroNectin包被的6孔板，在含有细胞的孔中加入8μg/mL的Polybrene，并按照MOI＝10的比例在孔中加入Mesothelin CAR的慢病毒，1000g、25℃离心30min。放置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。其余操作与实施例1一致，第11天收集细胞。

3.4)第4天，取出②中另一个未经RetroNectin包被的6孔板，将细胞调整至2×10⁶个细胞/mL培养基，取2mL细胞悬液加入到RetroNectin包被的6孔板中，其余操作与实施例1一致，第11天收集细胞。

4)CAR-T细胞阳性比例、细胞数的比较

4.1)采用荧光标记的鼠抗人CD3抗体和荧光标记的人Mesothelin(MSLN)蛋白与不同方法获得的CAR-T细胞共孵育，采用流式细胞术检测MSLN CAR-T细胞阳性比例。

4.2)采用台盼蓝染色计算最终获得的活细胞数，将细胞总数乘以MSLN CAR-T细胞阳性比例即可以获得CAR-T细胞数。

3、实验结果

流式细胞术检测MSLN CAR-T细胞阳性比例，结果如图3所示，第1天病毒转染获得的阳性CAR-T细胞比例与第3天病毒转染获得的CAR-T细胞数量一致，但是明显高于第5天病毒转染获得的CAR-T细胞数量；台盼蓝染色计算CAR-T细胞的活细胞数，结果如图4所示，第1天病毒转染获得的CAR-T细胞数明显高于第3天和第5天转染获得的CAR-T细胞数。

实施例3比较不同制备工艺的CAR-T细胞的抗肿瘤效果

1、CAR-T细胞的制备

1)本实施例针对RetroNectin包被6孔板，与本实施例1一致。

2)本实施例针对PBMCs的分离，与实施例1一致。

3)按照实施例1制备CAR-T细胞。

4)对照方法制备CAR-T细胞

在第0天，取10×10⁶个PBMCs细胞，利用CD3磁珠分选试剂盒获取CD3阳性T细胞，将T细胞密度调整至2×10⁶个/mL培养基，取2mL加入RetroNectin包被的6孔板的1个孔中，加入CD3(100ng/mL)和CD28(50ng/mL)使T细胞活化，将T细胞放置在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。其余操作与实施例1一致，培养至第11天获得CAR-T细胞。

2、CAR-T细胞的抗肿瘤功能检测

1)流式细胞术分别检测SKOV3细胞表面Mesothelin(MSLN)的表达；采用Calcein-AM标记Mesothein(MSLN)高表达(MSLN^high)和低表达(MSLN^low)的SKOV3细胞，然后将CAR-T细胞与Calcein-AM标记的SKOV3细胞按照10:1的比例共孵育4h，通过Calcein-AM释放法检测靶细胞被杀伤后Calcein的释放，计算CAR-T细胞对靶细胞的体外杀伤。

2)将CAR-T细胞与SKOV3细胞按照10:1的比例共孵育24h，通过流式分选获得CAR-T细胞。将获得的CAR-T细胞与Calcein-AM标记的SKOV3细胞按照10:1的比例共孵育4h，通过检测靶细胞被杀伤后Calcein的释放，计算CAR-T细胞对靶细胞的二次杀伤作用。

3)将CAR-T细胞与SKOV3细胞共孵育4h，采用胞内染色方法检测实施例1制备的CAR-T细胞的穿孔素和颗粒酶B的分泌情况。直方图分析穿孔素和颗粒酶B的表达情况，黑色的峰是实施例1获得的CAR-T细胞，灰色的峰是对照方法获得的CAR-T细胞。

3、实验结果

CAR-T细胞对靶细胞的体外杀伤实验的结果如图5、图6所示，使用实施例1制备的CAR-T细胞对MSLN^high(高表达)或MSLN^low(低表达)的SKOV3细胞的靶向杀伤作用明显强于使用对照方法获得的CAR-T细胞，表明实施例1获得的CAR-T细胞能够有效降低CAR-T细胞治疗过程中靶抗原阳性复发发生率。

CAR-T细胞对靶细胞的二次杀伤实验的结果如图7所示，实施例1制备的CAR-T细胞对肿瘤细胞的二次杀伤作用明显强于采用对照方法获得的CAR-T细胞，表明，实施例1获得的CAR-T细胞对肿瘤细胞具有更持久的杀伤作用。

胞内染色方法检测结果如图8所示，实施例1获得的CAR-T细胞的穿孔素和颗粒酶B的分泌能力明显强于对照方法获得的CAR-T细胞，结果表明实施例1获得的CAR-T细胞的抗肿瘤功能更强。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种抗肿瘤功能增强型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括在第0天向包被液处理的培养器材中加入含唑来膦酸的培养基激活PBMCs中的T细胞、第1天转染表达CAR的慢病毒载体、第11天收获CAR-T细胞；所述包被液包含RetroNectin，所述RetroNectin的浓度为100 μg/mL，所述包被液处理的培养器材的使用时间为第0天到第4天；所述唑来膦酸的浓度为5 μM；所述培养基包含IL-2和自体血浆，所述IL-2的浓度为600U/mL，所述自体血浆的体积占比为10%，所述自体血浆和PBMCs来自同一志愿者；转染表达CAR的慢病毒载体时加入转染增强剂，所述转染增强剂为polybrene，所述polybrene的终浓度为8 μg/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PBMCs从样本中采集分离获得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述样本来源于骨髓、脐带血、胎盘血或外周血。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述样本来源于外周血。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述样本的采集方法为采用血细胞分离机采集、肝素抗凝采集。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述样本的采集方法为肝素抗凝采集。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述PBMCs的分离试剂为淋巴细胞分离液。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述PBMCs分离时间为第0天。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述激活PBMCs中的T细胞时的培养条件为37℃、5% CO₂。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养器材为6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、T25、T75或T175。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述培养器材为6孔板。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述包被液处理培养器材的方法包括将培养器材置于37℃培养箱中静置4 h以上或将培养器材在4℃条件下静置过夜。

13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒载体的MOI=10。

14.根据权利要求1-13所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法进一步包括：

1）在转染病毒后的第3天，补充加入完全培养基后，继续进行培养；

2）第4天，完全去除原培养基，更换新的完全培养基，并将CAR-T细胞接种到新的培养器材中培养；

3）第11天收获CAR-T细胞；

所述完全培养基为含有10%自体血浆和600 U/mL IL-2的AlyS505N-0无血清细胞培养液。

15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体肿瘤。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述实体肿瘤为前列腺癌、膀胱癌、肝癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、口腔癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、鼻咽癌、胸腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、或黑色素瘤。

17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CAR-T细胞的CAR为CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D 配体、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF-R2、GPC3或Mesothelin的特异性受体。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述CAR-T细胞的CAR为Mesothelin的特异性受体。