CN115838439A - 嵌合转换受体基因修饰的nk细胞制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种能够逆转肿瘤微环境免疫抑制信号的免疫细胞制备方法及其应用。其中，所述逆转抑制性信号的方法是将TIGIT受体的胞内段替换为4‑1BB共刺激结构域与CD3胞内段，表达该嵌合受体的免疫细胞通过TIGIT识别肿瘤微环境中的CD155，避免诱导免疫细胞丧失功能或发生耗竭，并激发免疫细胞发挥更强大的杀伤肿瘤活性。

Description

嵌合转换受体基因修饰的NK细胞制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种CAR-免疫细胞的制备及其在肿瘤治疗中的用途，更具体地，本发明涉及一种逆转肿瘤微环境抑制性信号的嵌合抗原受体、表达载体、转基因免疫细胞、药物组合物的制备方法及其用途。

背景技术

近年来，免疫疗法在肿瘤治疗领域取得了令人瞩目的进展，尤其是以抗CTLA-4和抗PD-1或PD-L1抗体为代表的免疫卡控点阻断疗法。通过阻断T细胞表面抑制性受体与其配体的结合，阻断抑制性信号的传递，纠正免疫抑制性微环境所介导的免疫抑制，恢复肿瘤微环境T细胞的抗肿瘤能力，在多种转移性晚期癌症(包括转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等)治疗方面取得了较高的应答率，使众多原本已经失去治疗机会的对放化疗无效的晚期癌症患者有了重新治疗的希望。

然而，并非所有的恶性肿瘤患者对PD-1、PD-L1或CTLA-4阻断治疗有效，对PD-1或PD-L1抗体的治疗只有10％-30％的患者表现出长期持久的反应，大多数人群缺乏响应，改善临床响应及克服耐药是该领域面临的最大挑战。探究肿瘤对免疫卡控阻断治疗不应答的机制，寻找其他影响免疫细胞功能的免疫调控卡点，成为肿瘤免疫治疗领域亟待解决的问题。目前，越来越多的免疫卡控点分子被发现并开发应用。

T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)作为一个重要的免疫卡控点，主要表达在自然杀伤(NK)细胞、活化的CD8⁺T和CD4⁺T细胞、调节性T细胞(Tregs)和滤泡辅助性T细胞(Tfh)表面。TIGIT识别的配体CD155和CD112主要在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、T细胞、B细胞和许多非造血细胞(包括不同组织学类型的肿瘤细胞)上表达。TIGIT结合CD155的亲和力显著高于其竞争受体CD226和CD96。TIGIT与其配体结合后向T细胞或NK细胞传递抑制性信号。研究发现TIGIT在多种恶性肿瘤(如非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝癌、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和滤泡性淋巴瘤)的T细胞或NK细胞高表达。TIGIT的配体CD155高表达于多种实体瘤和血液肿瘤，包括肝癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病等。TIGIT与CD155的表达丰度与患者预后密切相关。目前的的治疗方法是通过开发靶向TIGIT单抗有效地恢复T细胞或NK细胞功能，进而发挥杀伤肿瘤作用。其中，一些生物技术/制药公司(如罗氏、百济神州、复宏汉霖等)正在致力于开发抗TIGIT的抗体，相关产品处于不同的临床开发阶段。但是，临床试验结果表明，单独使用TIGIT抗体治疗效果并不理想，需与PD-1或PD-L1抗体等联合应用才可改善其效果，罗氏和百济神州开发的抗TIGIT单抗与PD-L1抗体联合用于非小细胞肺癌的治疗已经进入III期临床试验。

因此，TIGIT及其配体CD155有望成为肿瘤免疫治疗的新靶点，阻断免疫细胞表面TIGIT抑制性信号的传递，在肿瘤免疫治疗中具有巨大的应用前景。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为了能够提高肿瘤的杀伤效果以及减少外用药物所带来的副作用，本发明提供了一种能够选择性逆转免疫卡控点TIGIT抑制性信号的免疫细胞制备方法及其在恶性肿瘤治疗中的应用。

本发明所提供的逆转免疫卡控点TIGIT抑制性信号的免疫细胞制备方法为，构建靶向TIGIT配体的嵌合抗原受体，其胞外段为TIGIT胞外段、TIGIT跨膜区、胞内段为4-1BB共刺激信号域与CD3ζ胞内区。该结构能够将TIGIT识别其配体CD155的抑制性信号转化为4-1BB和CD3介导的共刺激活化信号，从而将NK细胞接收到的来自肿瘤微环境的抑制性信号转换为激活信号，有效增强免疫细胞的杀伤肿瘤活性，可应用于TIGIT配体高表达的多种恶性肿瘤的治疗。

发明人发现，TIGIT在多种恶性肿瘤的T细胞或NK细胞高表达，肿瘤微环境高表达的配体CD155通过结合TIGIT以抑制T细胞或NK细胞的杀伤作用，导致免疫耗竭的发生。且发明人发现，当胞内段为4-1BB共刺激信号域与CD3ζ胞内区时，较其他的胞内段设计，如胞内段为4-1BB共刺激信号域、IL21R胞内段与CD3ζ胞内区时，其激活的共刺激信号更强，能够激发NK细胞更强的对TIGIT配体阳性细胞更高的杀伤活性。

为此，本发明提出了一种CAR-免疫细胞，通过将抑制性受体的信号转导基因片段替换为激活信号基因片段逆转肿瘤微环境失调激活抗肿瘤免疫效应细胞功能。

因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种嵌合抗原受体。根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体包括：

胞外区，所述胞外区包括TIGIT胞外段。

跨膜区，所述跨膜区包括TIGIT跨膜区，并且嵌入到所述细胞细胞膜中。

胞内区，所述胞内区包括4-1BB共刺激因子结构域与CD3ζ胞内信号段。

根据本发明实施例，所述胞外区的C端与所述跨膜区的N端相连，所述跨膜区的C端与所述胞内区的N端相连。将本发明实施例中所述的嵌合抗原受体导入免疫细胞中表达。其中，所述原本T细胞或NK细胞收到的免疫抑制信号转换为激活信号，有效提高免疫细胞的杀伤肿瘤效果。

根据本发明的实施例，上述嵌合抗原受体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

根据本发明实施例，所述嵌合抗原受体中4-1BB共刺激因子结构域的C端与所述CD3ζ胞内信号段的N端相连。进而表达该嵌合抗原受体的免疫细胞的免疫激活效应更强。

根据本发明的实施例，所述胞外区能够结合配体，所述配体包括PVR家族成员中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述PVR家族成员包括CD155和CD112；优选地，所述PVR家族成员为CD155。

根据本发明的实施例，所述TIGIT胞外段具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述TIGIT跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述4-1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述CD3ζ胞内信号段具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQV NWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGT YTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPL(SEQ ID NO.1)

LGAMAATLVVICTAVIVVVALTR(SEQ ID NO.2)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.3)

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.4)

MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.5)

在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。根据本发明实施例的上述核酸分子在免疫细胞中表达，可将肿瘤细胞介导的抑制信号转换为激活信号。

根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

根据本发明的实施例，所述核酸分子具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

ATGCGCTGGTGTCTCCTCCTGATCTGGGCCCAGGGGCTGAGGCAGGCTCCCCTCGCCTCAGGAATGATGACAGGCACAATAGAAACAACGGGGAACATTTCTGCAGAGAAAGGTGGCTCTATCATCTTACAATGTCACCTCTCCTCCACCACGGCACAAGTGACCCAGGTCAACTGGGAGCAGCAGGACCAGCTTCTGGCCATTTGTAATGCTGACTTGGGGTGGCACATCTCCCCATCCTTCAAGGATCGAGTGGCCCCAGGTCCCGGCCTGGGCCTCACCCTCCAGTCGCTGACCGTGAACGATACAGGGGAGTACTTCTGCATCTATCACACCTACCCTGATGGGACGTACACTGGGAGAATCTTCCTGGAGGTCCTAGAAAGCTCAGTGGCTGAGCACGGTGCCAGGTTCCAGATTCCATTGCTTGGAGCCATGGCCGCGACGCTGGTGGTCATCTGCACAGCAGTCATCGTGGTGGTCGCGTTGACTAGAAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:6)在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带本发明第二方面所述的核酸分子。其中，构建表达载体的目的是为了表达目的基因序列。

根据本发明的实施例，上述表达载体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包括启动子。

根据本发明的实施例，所述启动子与本发明第二方面所述的核酸分子可操作地连接。

根据本发明的实施例，所述启动子选自CMV,EF-1,RSV的至少之一。

根据本发明的实施例，所述表达载体是非致病性病毒载体。

根据本发明的实施例，所述非致病性病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒，优选地，所述非致病性病毒为慢病毒。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒载体。根据本发明的实施例，所述慢病毒载体具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。其中，在将慢病毒载体导入受体细胞后，可在辅助激活信号在免疫细胞中的表达。

GGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACTCTAGAATGCGCTGGTGTCTCCTCCTGATCTGGGCCCAGGGGCTGAGGCAGGCTCCCCTCGCCTCAGGAATGATGACAGGCACAATAGAAACAACGGGGAACATTTCTGCAGAGAAAGGTGGCTCTATCATCTTACAATGTCACCTCTCCTCCACCACGGCACAAGTGACCCAGGTCAACTGGGAGCAGCAGGACCAGCTTCTGGCCATTTGTAATGCTGACTTGGGGTGGCACATCTCCCCATCCTTCAAGGATCGAGTGGCCCCAGGTCCCGGCCTGGGCCTCACCCTCCAGTCGCTGACCGTGAACGATACAGGGGAGTACTTCTGCATCTATCACACCTACCCTGATGGGACGTACACTGGGAGAATCTTCCTGGAGGTCCTAGAAAGCTCAGTGGCTGAGCACGGTGCCAGGTTCCAGATTCCATTGCTTGGAGCCATGGCCGCGACGCTGGTGGTCATCTGCACAGCAGTCATCGTGGTGGTCGCGTTGACTAGAAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO：7)

在本发明的第五方面，本发明提出了一种转基因免疫细胞。根据本发明的实施例，所述转基因免疫细胞携带本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体以及本发明第四方面所述的慢病毒载体。其中，所获得的转基因免疫细胞的表达可以有效增强对恶性肿瘤的杀伤能力。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种CAR-免疫细胞。根据本发明的实施例，所述CAR-免疫细胞携带本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体以及本发明第四方面所述的慢病毒载体。

根据本发明的实施例，所述CAR-免疫细胞包括选自NK-92细胞，外周血NK细胞、脐带血NK细胞、iPSC、CAR-NK细胞、CAR-T细胞、CAR-NKT细胞、CAR-γδT细胞中的至少之一。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的慢病毒载体、本发明第五方面所述的转基因免疫细胞以及本发明第六方面所述的CAR-免疫细胞。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的辅料。

在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体、核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞、CAR-免疫细胞以及药物组合物用于治疗或预防实体瘤或血液瘤。

根据本发明的实施例，所述实体瘤包括选自发生在脏器中的有形瘤，包括胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等的至少之一。

根据本发明的实施例，所述血液瘤包括选自血细胞和造血系统内的急性髓系白血病、急性淋巴细胞系白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤等的至少之一。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的靶向CD155的CAR激活信号结构模式图，其中，TIGIT胞外段表示编码与CD155结合的受体核苷酸序列，TIGIT跨膜段表示编码TIGIT跨膜段结构域的核苷酸序列，4-1BB胞内段表示编码4-1BB共刺激因子结构域的核苷酸序列，CD3ζ胞内段表示编码CD3ζ胞内段的核苷酸序列；其中TIGIT-CAR-2为作为对照的靶向CD155的CAR激活信号结构模式图，其与本发明实施例TIGIT-CAR结构不同之处在于，胞内段为4-1BB胞内段、IL-21受体(IL-21R)胞内段和CD3ζ胞内段；

图2是根据本发明实施例2的TIGIT配体CD155在肿瘤细胞中的表达水平检测结果图，其中阴影峰为同型抗体染色对照组，黑色实线为CD155抗体染色组；

图3是根据本发明实施例2的TIGIT-CAR-NK细胞的体外杀伤能力检测结果图；

图4是根据本发明实施例2的NK细胞体外杀伤相关脱颗粒检测结果图；

图5是根据本发明实施例2的TIGIT-CAR-NK细胞的IFN-γ与TNF-α的分泌水平检测结果图；

图6是根据本发明实施例3的差异治疗组抑制肿瘤生长荧光实验检测结果图；

图7是根据本发明实施例3的差异治疗组荧光强度统计结果图；

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的核酸分子的表达，进而实现所述核酸分子编码的蛋白质的体外大量获得。

本申请所述的“嵌合抗原受体”是指表达在细胞膜表面的人工受体片段，其包括胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞外区能够特异性结合相应的配体或抗原，引起胞内区所包含的免疫刺激因子的激活。

本申请构建了一种表达嵌合抗原受体的转基因免疫细胞，其中，所述嵌合抗原受体靶向的配体PVR家族成员中的至少之一。所述嵌合抗原受体能够表达激活信号，增强CAR免疫细胞的杀伤肿瘤活性，并应用于实体瘤和血液瘤的治疗。

下面将更详细地描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，以下实施中所述的“质粒”与“载体”具有相同的意义，可互换使用。

实施例1：TIGIT-CAR-NK细胞的制备

1.1pCDH-EF1-TIGIT-CAR-T2A-copGFP慢病毒质粒的构建

本发明设计的TIGIT-CAR载体序列，包含TIGIT受体的胞外段与跨膜段、4-1BB共刺激信号结构域与CD3ζ胞内区。基因元件结构示意图见图1。

将全基因合成的TIGIT-CAR片段通过酶切位点XbaI与BamHI插入到慢病毒载体pCDH-EF1-MSC-T2A-copGFP载体中。经菌落PCR鉴定以及测序验证序列正确后，表示pCDH-EF1-TIGIT-CAR-T2A-copGFP质粒构建成功。

1.2慢病毒的包装及病毒液浓缩

取处于对数生长期的293T细胞5×10⁶接种于10cm的培养皿中，加入10mL DMEM培养基，37℃、5％ CO₂培养箱中培养过夜。待细胞密度达到80％时，更换10mL新鲜的DMEM培养基，继续置于培养箱中培养。

配制慢病毒包装体系：将6μg psPAX2质粒，3μg pMD2.G质粒与6μgpCDH-EF1-TIGIT-CAR-T2A-copGFP质粒加入至体积为250μL无血清DMEM培养基中，混合均匀，配制DNA混合液；将15μL PEIpro加到体积为235μL的无血清DMEM培养基中，混合均匀配制PEIpro混合液。将PEIpro混合液一次性加入到DNA混合液中，静置混匀，室温孵育15min。将混合液加入293T细胞培养皿中。培养24h后进行换液，将培养皿放回37℃，5％ CO₂培养箱中。在48h后收取细胞上清，400×g离心5min，去除细胞碎片，将上清用0.45μm的滤头过滤至新的50ml离心管中。加入5×PEG8000溶液，上下颠倒离心管混合均匀，放于4℃冰箱中过夜。4℃，4000×g离心20min，弃上清，加适量无血清DMEM培养基重悬病毒沉淀，分装至EP管中，放于-80℃冰箱中保存。

1.3慢病毒感染人NK细胞

取处于生长对数期的NK-92细胞(购自ATCC)，加入2mLα-MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×10⁵个/mL。在24孔板中接入5×10⁵个NK-92细胞，1mL病毒浓缩液，1μL鱼精蛋白(购自索莱宝，终浓度8μg/mL)。置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养。24h后，观察细胞状态，换液，将感染细胞转移入EP管中，100×g离心5min，加入少量新鲜α-MEM培养基重悬细胞，将细胞转入细胞培养瓶中，加入10mL新鲜α-MEM培养基和IL-2(终浓度为200IU/mL)继续培养。待细胞扩增后，将细胞转移入流式管中，加入3mL1×PBS溶液重悬细胞，100×g离心5min，弃上清，涡旋起细胞沉淀，重复一次。将感染后的NK-92细胞通过流式仪分选GFP阳性的经流式分选GFP阳性的TIGIT-CAR-NK细胞用于后续实验。

实施例2：：TIGIT-CAR-NK细胞的生物学功能鉴定

2.1TIGIT配体CD155在肿瘤细胞的表达

已有研究表明卵巢癌组织以及多种卵巢癌细胞表面高表达TIGIT配体CD155。我们通过流式细胞术检测了人卵巢癌细胞系HO8910与SKOV-3细胞表面CD155的表达情况。结果显示，HO8910与SKOV-3细胞均高表达CD155分子(图2)。

2.2TIGIT-CAR-NK细胞的体外杀伤

以NK-92、TIGIT-CAR-NK-92和TIGIT-CAR2-NK-92为效应细胞，以卵巢癌细胞系HO8910作为靶细胞，设置效靶比为5:1、2.5:1与1.25:1。将效应细胞与靶细胞共孵育4h，LDH(乳酸脱氢酶)释放法检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。结果表明，TIGIT-CAR细胞对H08910细胞的杀伤效率均明显高于NK-92与TIGIT-CAR2(氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示)细胞组(图3)。以上结果说明经TIGIT-CAR基因修饰可明显提高NK细胞对CD155阳性肿瘤细胞的杀伤能力，且胞内段为4-1BB胞内段和CD3ζ胞内段的TIGIT-CAR结构优于胞内段为4-1BB胞内段、IL-21受体(IL-21R)胞内段(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)和CD3ζ胞内段的CAR结构，能够激发NK细胞更强的对CD155阳性肿瘤细胞的杀伤能力。

SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS(SEQ ID NO:8)

MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGADFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELSLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQASRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:9)

另外，检测了NK细胞杀伤相关脱颗粒的情况，将不同效应细胞分别与HO8910细胞共孵育4h后，收集NK细胞于流式管中，分别通过流式细胞术检测NK细胞上CD107a、颗粒酶(Granzyme B)和穿孔素(Perforin)的表达情况。结果可见，与HO8910细胞共孵育后，TIGIT-CAR-NK-92细胞上CD107a与分泌Granzyme B的表达水平明显高于NK-92组(图4)，Perforin的表达水平无统计学差异(图4)。进一步验证了经TIGIT-CAR基因修饰可明显提高NK细胞对CD155阳性肿瘤细胞的脱颗粒水平(CD107a、颗粒酶和穿孔素的表达水平)和杀伤功能。

2.3TIGIT-CAR-NK细胞的IFN-γ与TNF-α的分泌水平

通过流式细胞术检测TIGIT-CAR-NK-92细胞的IFN-γ与TNF-α的分泌能力变化。将NK细胞与卵巢癌HO8910细胞共孵育4h后，收集NK细胞于流式管中，通过固定破膜处理，流式细胞术检测NK细胞IFN-γ与TNF-α的分泌水平。结果可见，TIGIT-CAR-NK-92细胞分泌IFN-γ与TNF-α的水平均显著高于NK-92组(图5)。说明TIGIT-CAR可明显提高NK细胞与CD155阳性肿瘤细胞接触时IFN-γ与TNF-α的分泌能力。

实施例3：TIGIT-CAR-NK细胞体内抗肿瘤能力

以荧光素酶标记的卵巢癌HO8910细胞进行腹腔荷瘤，建立卵巢癌腹腔转移模型。选择5周龄雌性高度免疫缺陷NCG鼠进行腹腔荷瘤，每只小鼠腹腔注射2×10⁵个荧光素酶标记的HO8910细胞。荷瘤后第2天，进行NK细胞回输治疗。将小鼠随机分为对照组、NK-92治疗组和TIGIT-CAR-NK-92治疗组。治疗组小鼠采用腹腔注射NK细胞5×10⁶个/只，对照组注射等体积的1×PBS溶液，每隔一周注射一次，共治疗3次。每隔3天腹腔注射IL-2(50000IU/只)。通过小动物活体成像技术观察肿瘤大小，进而绘制肿瘤生长曲线。

结果显示，与荷瘤对照组相比，NK-92和TIGIT-CAR-NK-92治疗组均能明显抑制肿瘤的生长，而以TIGIT-CAR-NK-92为治疗组效果最佳，活体成像技术观测的肿瘤荧光信号强度明显小于NK-92治疗组(图6与图7)。说明TIGIT-CAR基因修饰后表达激活信号，激活NK细胞的杀伤肿瘤作用。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (17)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括：

胞外区，所述胞外区包括TIGIT胞外段；

跨膜区，所述跨膜区包括TIGIT跨膜区，并且嵌入到所述细胞细胞膜中；以及

胞内区，所述胞内区包括4-1BB共刺激因子结构域与CD3ζ胞内信号段；

其中，所述胞外区的C端与所述跨膜区的N端相连，所述跨膜区的C端与所述胞内区的N端相连。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4-1BB共刺激因子结构域的C端与所述CD3ζ胞内信号段的N端相连。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外区能够结合配体，所述配体包括PVR家族成员中的至少之一；

任选地，所述PVR家族成员包括CD155和CD112；

优选地，所述PVR家族成员为CD155。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述TIGIT胞外段具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列；

所述TIGIT跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

所述4-1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述CD3ζ胞内信号段具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

5.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

7.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求5或6所述的核酸分子。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，进一步包括：启动子，所述启动子与权利要求5或6所述的核酸分子可操作地连接。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述启动子选自CMV,EF-1,RSV的至少之一。

10.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是非致病性病毒载体。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述非致病性病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒，优选地，所述非致病性病毒为慢病毒。

12.一种慢病毒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

13.一种转基因免疫细胞，其特征在于，所述转基因免疫细胞表达权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体、携带权利要求5～6任一项所述的核酸分子、权利要求7～11任一项所述的表达载体或权利要求12所述的慢病毒载体。

14.一种CAR-免疫细胞，其特征在于，所述CAR-免疫细胞表达权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体、携带权利要求5～6任一项所述的核酸分子、权利要求7～11任一项所述的表达载体或权利要求12所述的慢病毒载体；

任选地，所述CAR-免疫细胞包括选自NK-92细胞，外周血NK细胞、脐带血NK细胞、iPSC、CAR-NK细胞、CAR-T细胞、CAR-NKT细胞、CAR-γδT细胞中的至少之一。

15.一种药物组合物，其特征在于，包括：

表达权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体、携带权利要求5～6任一项所述的核酸分子、权利要求7～11任一项所述的表达载体或权利要求12所述的慢病毒载体、权利要求13所述的转基因免疫细胞或权利要求14所述的CAR-免疫细胞；

任选地，进一步包括：药学上可接受的辅料。

16.表达权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体、携带权利要求5～6任一项所述的核酸分子、权利要求7～11任一项所述的表达载体或权利要求12所述的慢病毒载体、权利要求13所述的转基因免疫细胞或权利要求14所述的CAR-免疫细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防实体瘤或血液瘤。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述实体瘤包括选自发生在脏器中的有形瘤，包括胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、肺癌、头颈癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤中的至少之一；

任选地，所述血液瘤包括选自血细胞和造血系统内的急性髓系白血病、急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤中的至少之一。

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