BR112021003640A2

BR112021003640A2 - célula t, medicamento, vetor de expressão, e, métodos para produzir uma célula de t car e para tratar câncer

Info

Publication number: BR112021003640A2
Application number: BR112021003640-7A
Authority: BR
Inventors: Chihiro TAKE; Takayuki Tatamiya; Akiko Yamaguchi
Original assignee: Noile-Immune Biotech, Inc.; Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-05-18
Also published as: TW202016295A; EP3845654A4; US20210309712A1; MX2021002373A; JPWO2020045610A1; SG11202101930XA; EP3845654A1; CA3111170A1; WO2020045610A1; CO2021003508A2; CN112771166A; KR20210053925A; EA202190624A1; AU2019331866A1; IL281013A

Abstract

CÉLULA T, MEDICAMENTO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA CÉLULA DE T CAR E PARA TRATAR CÂNCER. São providos imunócitos (células T CAR, etc.) tendo uma atividade antitumor maior que os imunócitos (células T CAR, etc.) expressando um CAR sozinho (não expressando uma citocina e/ou uma quimiocina). As células T providas em um aspecto da presente invenção expressam: (1) um receptor de antígeno quimérico (CAR); (2) pelo menos um membro selecionado a partir do grupo que consiste em interleucina-15 (IL-15), interleucina-18 (IL-18), interleucina-21 (IL-21) e interleucina-27 (IL-27); e (3) ligante de quimiocina CC 19 (CCL19).

Description

1 / 76 CÉLULA T, MEDICAMENTO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, MÉTODOS

PARA PRODUZIR UMA CÉLULA DE T CAR E PARA TRATAR

CÂNCER Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere às células imunológicas que expressam um receptor de antígeno quimérico (em seguida indicado como “CAR”) (em seguida indicadas como “células imunológicas que expressam CAR”) que podem ser usadas para a imunoterapia do câncer, tipicamente, as células T que expressam um CAR (em seguida indicadas como células “T CAR”), e um vetor de expressão para produzir as células imunológicas que expressam CAR (tais como as células T CAR). Mais especificamente, a presente invenção se refere às células imunológicas que expressam CAR (tais como as células T CAR) que expressam as citocinas e quimiocinas predeterminadas, e um vetor de expressão para produzir as células. Fundamentos da Técnica

[002] A imunoterapia do câncer através da administração das células T CAR foi mostrada ser eficaz nas malignidades hematopoiéticas tais como leucemia e linfoma, mas existem tipos e casos de câncer para os quais nenhum efeito terapêutico foi observado devido aos problemas tais como baixa eficácia de sobrevivência das células T CAR in vivo e inibição da atividade das células T CAR no microambiente dos cânceres pelo mecanismo de evitação imunológica do tumor das células cancerosas, especialmente, em cânceres sólidos. Portanto, as células T CAR que apresentam um efeito terapêutico e tendo maior atividade antitumoral são necessárias, especialmente, nos cânceres sólidos.

[003] A Literatura Patentária 1 e Literatura Não Patentária 1 descrevem as células T CAR que expressam IL-7 e CCL19 e são mais excelentes na atividade antitumoral que as células T CAR convencionais. Contudo, a Literatura Patentária 1 e Literatura Não Patentária 1 não incluem

2 / 76 as descrições específicas das outras combinações das citocinas e quimiocinas.

[004] A Literatura Não Patentária 2 descreve as células T CAR que têm persistência melhorada independente da sinalização de CAR e expressam IL-15 quimérico ligado à membrana (mbIL-15). Contudo, a Literatura Não Patentária 2 não inclui as descrições específicas das combinações de mbIL-15 com quimiocinas tal como CCL19.

[005] A Literatura Não Patentária 3 descreve que o uso de uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligada a um domínio IL-15Rαsushi por intermédio de um conector flexível pode prover uma atividade mais potente na proliferação dos linfócitos (tais como células NK, células NK-T, e células de memória positivas para CD8), uma ativação das células dendríticas, e outros, do que aquela causada pelo uso combinado convencional dos domínios de IL-15 e IL-15Rαsushi. Contudo, a Literatura Não Patentária 3 não inclui as descrições específicas das combinações dos domínios de IL-15 e IL-15Rαsushi com quimiocinas, tais como CCL19.

[006] A Literatura Não Patentária 4 descreve que a transfecção de uma proteína de fusão secretora de camundongo IL-15 e IL-15Rα melhora a viabilidade e a capacidade proliferativa das células T positivas para CD8. Contudo, a Literatura Não Patentária 4 não inclui as descrições específicas de combinações de IL-15 com quimiocinas, tais como CCL19.

[007] A Literatura Não Patentária 5 descreve a IL-27 de cadeia única (p28 e EBI3 ligados por um conector flexível) e um efeito desta no tratamento da doença do intestino inflamatório (IBD). Contudo, a Literatura Não Patentária 5 não inclui as descrições específicas das células T CAR e combinações de IL-27 de cadeia única com quimiocinas, tais como CCL19.

[008] A Literatura Patentária 2 descreve as células T que expressam a IL-7 recombinante, IL-15 recombinante, ou combinações destas e descreve que a expressão de tais citocinas melhora a sobrevivência das células T. Contudo, a Literatura Patentária 2 não inclui as descrições específicas das

3 / 76 células T CAR e combinações das citocinas específicas com quimiocinas tais como, CCL19.

[009] A Literatura Patentária 3 descreve uma célula T exterminadora natural modificada contendo um construto de expressão que codifica IL-2, IL- 4, IL-7, IL-15 ou combinações destes, e um construto de CAR. Contudo, a Literatura Patentária 3 não inclui as descrições específicas das combinações das citocinas específicas com quimiocinas tais como CCL19.

[0010] A Literatura Patentária 4 descreve as células T CAR que expressam as citocinas ligadas à membrana tais como IL-7, IL-15 (proteína de fusão IL-15/IL-15Rα), e IL-21. Contudo, a Literatura Patentária 4 não inclui as descrições específicas das combinações das citocinas específicas com quimiocinas tais como CCL19.

[0011] A Literatura Patentária 5 descreve uma célula T CAR que expressa IL-15 e alveja CD19. Contudo, a Literatura Patentária 5 não inclui as descrições específicas das combinações de IL-15 com as quimiocinas, tal como CCL19.

[0012] A Literatura Não Patentária 6 descreve uma célula T CAR que expressa IL-15 e/ou IL-21 e alveja GPC3. Contudo, a Literatura Patentária 6 não inclui as descrições específicas das combinações das citocinas específicas com quimiocinas, tais como CCL19. Lista de Citação Literatura Patentária Literatura Patentária 1: WO 2016/056228 Literatura Patentária 2: WO 2007/037780 Literatura Patentária 3: WO 2013/040371 Literatura Patentária 4: WO 2014/186469 Literatura Patentária 5: US 2013/0071414 Literatura Não Patentária Literatura Não Patentária 1: Adachi et al., Nature

4 / 76 Biotechnology, VOL 36, No 4, 346-353 Literatura Não Patentária 2: Hurton et al., Proc Natl Acad Sci., 113 (48), E7788-97, 2016 Literatura Não Patentária 3: Mortier et al., J Biol Chem. 281 (3), 1612-9, 2006 Literatura Não Patentária 4: Rowley et al., Eur J Immunol. 39 (2), 491-506, 2009 Literatura Não Patentária 5: Sasaoka et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 300: G568-576 Literatura Não Patentária 6: Barta et al., Armored Glypican-3- Specific CAR T cells for the Immunotherapy of Hepatocellular Carcinoma, ASGCT 2018, maio de 2018, abstract Sumário da Invenção Problema Técnico

[0013] É um objeto da presente invenção prover células imunológicas (tais como as células T CAR) tendo atividade antitumoral maior que as células imunológicas (tais como as células T CAR) expressando o CAR sozinho (não expressando as citocinas e/ou quimiocinas). Solução ao Problema

[0014] Existem pelo menos várias centenas de moléculas in vivo que podem controlar as funções das células imunológicas tais como as células T. Os inventores verificaram que a atividade antitumoral é intensificada pelas células T CAR que expressam pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-15 (IL-15), interleucina-18 (IL-18), interleucina- 21 (IL-21), e interleucina-27 (IL-27), que são citocinas, em combinação com o ligante de quimiocina CC 19 (CCL19), que é uma quimiocina, junto com CAR, quando comparado com as células que expressam CAR sozinho, e a persistência e proliferação das células T CAR são especialmente melhoradas, deste modo realizando a presente invenção.

5 / 76

[0015] IL-15, IL-18, IL-27, e CCL19 são as citocinas e uma quimiocina que não são expressas pelas células T naturais (em que nenhum gene exógeno é introduzido) in vivo. IL-21 é uma citocina expressa pelas células T naturais in vivo (tais como as células T NK e células T positivas para CD4). Na presente invenção, a expressão da citocina e quimiocina predeterminadas significa a expressão da citocina e quimiocina predeterminadas em níveis maiores que as células T naturais in vivo pela introdução dos genes para expressar a citocina e quimiocina exógenas predeterminadas nas células T.

[0016] Além disso, a modalidade de transferência e expressão genética das interleucinas e quimiocinas predeterminadas acima mencionadas junto com CAR nas células T pode ser estendida para uma modalidade de transferência de genes e expressão destas nas células imunológicas outras que não as células T, tais como células NK, monócitos, macrófagos, e células dendríticas.

[0017] A presente invenção inclui pelo menos os seguintes aspectos.

[0018] [1] Uma célula T que expressa: (1) um receptor de antígeno quimérico (CAR); (2) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em interleucina-15 (IL-15), interleucina-18 (IL-18), interleucina-21 (IL-21), e interleucina-27 (IL-27); e (3) ligante de quimiocina CC 19 (CCL19).

[0019] [2] A célula T de acordo com o item 1, em que o (2) é IL-15.

[0020] [3] A célula T de acordo com o item 2, em que o IL-15 é ligado à IL-15Rα para formar uma proteína de fusão.

[0021] [4] A célula T de acordo com o item 3, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15LSP ligado à IL-15 (IL15LSP), uma proteína de fusão compreendendo o domínio extracelular IL- 15Rα ligado à IL-15 (sIL15RA), uma proteína de fusão compreendendo IL-15

6 / 76 ligada à IL-15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL-15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

[0022] [5] A célula T de acordo com o item 3, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligado à IL-15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL- 15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

[0023] [6] Um medicamento compreendendo a célula T de acordo com o item 1.

[0024] [7] O medicamento de acordo com o item 6, em que o medicamento é um agente terapêutico para o câncer.

[0025] [8] O medicamento de acordo com o item 7, em que o câncer é melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma, ou leucemia.

[0026] [9] Um vetor de expressão compreendendo: (1) um ácido nucléico que codifica um CAR; (2) um ácido nucléico que codifica pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27; e (3) um ácido nucléico que codifica CCL19.

[0027] [10] O vetor de expressão de acordo com o item 9, em que o (2) é IL-15.

[0028] [11] O vetor de expressão de acordo com o item 10, em que a

7 / 76 IL-15 é ligada à IL-15Rα para formar uma proteína de fusão.

[0029] [12] O vetor de expressão de acordo com o item 11, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15LSP ligada à IL-15 (IL15LSP), uma proteína de fusão compreendendo o domínio extracelular de IL-15Rα ligado à IL-15 (sIL15RA), uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligada à IL-15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL-15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

[0030] [13] O vetor de expressão de acordo com o item 11, em que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligada à IL- 15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL-15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

[0031] [14] Um método para produzir uma célula T CAR, compreendendo uma etapa de introduzir o vetor de expressão de acordo com o item 9 em uma célula T.

[0032] [15] Um método para tratar câncer, compreendendo uma etapa de administrar a célula T de acordo com o item 1 a um indivíduo em necessidade de um tratamento para o câncer.

[0033] [16] O método para tratar de acordo com o item 15, em que o câncer é melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar da célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma, ou leucemia.

[0034] [17] A célula T de acordo com o item 1, para o uso como um

8 / 76 componente ativo para o tratamento do câncer.

[0035] [18] A célula T de acordo com o item 17, em que o câncer é melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar da célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma, ou leucemia.

[0036] Em seguida, a célula T do [1] acima também é indicado como “célula T da presente invenção”, o medicamento de [6] acima também é indicado como “medicamento da presente invenção”, o vetor de expressão de

[9] acima também é indicado como “vetor de expressão da presente invenção”, e o método para produzir uma célula T CAR de [14] acima também é indicado como “o método para produção da presente invenção”.

[0037] Aqueles versados na técnica seriam capazes de converter apropriadamente as modalidades (categorias) da invenção em consideração dos conteúdos aqui descritos como um todo. Por exemplo, o medicamento da presente invenção de acordo com [6] acima pode ser convertido em “um método para tratar câncer, compreendendo uma etapa de administrar uma célula T expressando: (1) um CAR; (2) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27; e (3) CCL19 a um indivíduo em necessidade do tratamento do câncer”, “ uma célula T expressando: (1) um CAR; (2) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27; e (3) CCL19 para o uso como um componente ativo para o tratamento do câncer”, e “uso de uma célula T expressando: (1) um CAR; (2) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27; e (3) CCL19 para a fabricação

9 / 76 de um medicamento para tratar o câncer.

[0038] Aqueles versados na técnica seriam capazes de converter apropriadamente a modalidade da célula T da presente invenção a ser obtida permitindo-se que a célula T expresse a citocina e quimiocina predeterminadas junto com um CAR, e modalidades relevantes a esta tal como o medicamento da presente invenção, o vetor de expressão da presente invenção, e o método para produção da presente invenção em uma modalidade das células imunológicas outras que não as células T (tais como células NK, monócitos, macrófagos, e células dendríticas) a citocina e quimiocina predeterminadas, junto com um CAR e as modalidades relevantes a este, tal como um medicamento, um vetor de expressão, e um método para produção, em consideração dos conteúdos aqui descritos como um todo. Efeitos Vantajosos da Invenção

[0039] A persistência e proliferação da célula T da presente invenção são melhoradas pela célula T expressando a citocina predeterminada (tal como IL-15) e quimiocina (CCL19). Portanto, a atividade antitumoral pelo CAR pode ser intensificada (por exemplo, redução no número de células tumorais residuais, melhora da quantidade de IFNγ a ser produzida, e melhora da migração e acúmulo das células imunológicas hospedeiras (tais como células T, células dendríticas, células NK) no local do tumor). Além disso, o efeito terapêutico no câncer pode ser melhorado por um medicamento contendo a célula T da presente invenção. Em particular, a célula T da presente invenção pode estar envolvida na ativação da célula NK e, portanto, pode ser útil para o tratamento de carcinomas sensíveis às células NK (tais como melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar da célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de

10 / 76 Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma, e leucemia). Além disso, visto que a intensificação da atividade antitumoral reduz o número de células a serem administradas, os efeitos tais como redução dos efeitos colaterais tal como CRS (Síndrome da Liberação de Citocina) e redução no custo de produção são esperados.

[0040] A combinação predeterminada da citocina e quimiocina da presente invenção exerce ação e efeito que várias células imunológicas que expressam CAR com alta atividade antitumoral pode ser obtida mesmo no caso onde os genes são transferidos e expressados juntos com um gene de CAR nas células imunológicas em geral, isto é, não somente nas células T como mencionado acima, mas também nas células NK, monócitos, macrófagos, e células dendríticas. Descrição Resumida das Figuras

[0041] [Figura 1] A Figura 1 mostra os resultados da análise do nível de expressão do CAR (o eixo geométrico horizontal) e CD8 (o eixo geométrico vertical) nas seguintes células T do Exemplo (Exemplo Experimental 1) através da citometria de fluxo. O valor numérico (%) na figura representa a porcentagem da população celular em cada compartimento com relação às células totais. “Transdução (-)” é um resultado for a transdução de células T (-) do Exemplo Comparativo 1 (células T sem transdução), “T CAR conv.” é um resultado para as células T CAR conv. Do Exemplo Comparativo 2 (células T CAR CD20 anti-humano), “15LSP x 19 T CAR” é um resultado para IL15LSP × CCL19 células T CAR do Exemplo 1-1 (células T CAR CD20 de IL15LSP_CCL19_anti-humana), “s15RA x 19 T CAR” é um resultado para sIL15RA × células T CAR CCL19 do Exemplo 1-2 (células T CAR CD20 de sIL15RA_CCL19_anti-humana), “mb15RA x 19 T CAR” é um resultado para mbIL15RA × células T CAR CCL19 do Exemplo 1-

11 / 76 3 (células T CAR CD20 mbIL15RA_CCL19_anti-human), “sushi15 x 19 T CAR” é um resultado para sushiIL15 × células T CAR CCL19 do Exemplo 1-4 (células T CAR CD20 de sushiIL15_CCL19_anti-humana), “18 x 19 T CAR” é um resultado para IL-18 × células T CAR CCL19 do Exemplo 2 (células T CAR CD20IL18_CCL19_anti-humana), “21 x 19 T CAR” é um resultado para IL-21 × células T CAR CCL19 do Exemplo 3 (células T CAR de CD20IL21_CCL19_anti-humana), e “sc27 x 19 T CAR” é um resultado para scIL27 × células T CAR CCL19 do Exemplo 4 (células T CAR CD20de scIL27_CCL19_anti-humana). O mesmo também se aplica às Figuras de 2 a 6 abaixo.

[0042] [Figura 2] A Figura 2 mostra o resultado das medições das quantidades de (A) IL-15, (B) IL-18, (C) IL-21, (D) IL-27, e (E) CCL19 secretadas no sobrenadante de cultura nas células T no Exemplo (Exemplo Experimental 1) por ELISA.

[0043] [Figura 3] A Figura 3 mostra os resultados da medição do número de células vivas nas células T 3 dias, 5 dias, e 7 dias depois do estímulo de ativação pela cocultura com CD20 humana expressando mastocitoma P815 (hCD20/P815) no Exemplo (Exemplo Experimental 2).

[0044] [Figura 4] A Figura 4 mostra os resultados da análise de histograma da intensidade de tingimento com um reagente CytoTell nas células T no Exemplo (Exemplo Experimental 2). O pico do histograma mostra o número de gerações devido à divisão celular, e o valor numérico (%) no gráfico de donut mostra a porcentagem das frações ativadas na população de célula T positiva para Thy1,2 (1 representa a primeira geração não dividida, 2 representa a segunda geração depois de uma divisão, 3 representa a terceira geração depois das duas divisões, 4 representa a quarta geração depois das 3 divisões, > 5 representa a quinta e subsequente gerações depois de quatro ou mais divisões).

[0045] [Figura 5] A Figura 5 mostra o resultado da medição da

12 / 76 atividade citotóxica de tumor das células T em (A) células tumorais alvo (hCD20/P815) e (B) células de controle de tumor (P815) no Exemplo (Exemplo Experimental 3) através da citometria de fluxo.

[0046] [Figura 6] A Figura 6 mostra os resultados da medição da concentração de IFNγ no sobrenadante de cultura das células T na hora da cocultura com (A) células tumorais alvo (hCD20/P815), e (B) células tumorais de controle (P815) no Exemplo (Exemplo Experimental 3).

[0047] [Figura 7] A Figura 7 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 (fragmento de DNA de CAR CD20 anti-humano).

[0048] [Figura 8] A Figura 8 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 (fragmento de DNA de MCS).

[0049] [Figura 9] A Figura 9 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4 (fragmento de DNA IL15LSP_F2A_CCL19).

[0050] [Figura 10] A Figura 10 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6 (fragmento de DNA de sIL15RA_F2A_CCL19).

[0051] [Figura 11] A Figura 11 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 8 (fragmento de DNA de mbIL15RA_F2A_CCL19).

[0052] [Figura 12] A Figura 12 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 10 (fragmento de DNA de sushiIL15_F2A_CCL19).

[0053] [Figura 13] A Figura 13 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 12 (fragmento de DNA de IL-18_F2A_CCL19).

[0054] [Figura 14] A Figura 14 mostra o arranjo dos genes e outros

13 / 76 contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14 (fragmento de DNA de IL-21_F2A_CCL19).

[0055] [Figura 15] A Figura 15 mostra o arranjo dos genes e outros contidos na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 16 (fragmento de DNA de scIL27_F2A_CCL19).

[0056] [Figura 16] A Figura 16 mostra o resultado da medição da atividade antitumoral (mudança no volume de tumor) para um modelo de transplante de tumor de melanoma em camundongo no Exemplo (Exemplo Experimental 4).

[0057] [Figura 17] A Figura 17 mostra o resultado da medição da atividade antitumoral (mudança no volume de tumor) para um modelo de tumor colorretal em camundongo in Exemplo (Exemplo Experimental 4). Descrição das Modalidades

[0058] Como aqui usado, “transfecção” significa a introdução de qualquer substância em uma célula. Uma célula inclui pelo menos um citoplasma e um núcleo em seu interior.

[0059] “Cultura” ou “cultivar” significa manter, proliferar, e/ou diferenciar s células fora dos tecidos ou fora do corpo, por exemplo, em uma placa, uma placa de Petri, um frasco, ou um tanque de cultura.

[0060] “Pluripotência” significa a capacidade de diferenciar em tecidos e células tendo várias morfologias e funções diferentes, e a capacidade de diferenciar em células de qualquer linhagem das três camadas de germes. “Pluripotência” é distinto “totipotência” que significa a capacidade de diferenciar e, qualquer tecido no corpo, incluindo blastócitos, nos quais a pluripotência não significa a capacidade de diferenciar em blastócitos e, portanto, se a capacidade de formar indivíduos.

[0061] “Multipotência” significa a capacidade de diferenciar em células de um número limitado de linhagens. Por exemplo, células tronco mesequimatosas, células tronco hematopoiéticas, e células tronco neurais são

14 / 76 multipotentes, mas não pluripotentes.

[0062] Os exemplos de “células tronco” incluem as células tronco pluripotentes.

[0063] As “células tronco pluripotentes” que podem ser usadas na presente invenção se referem às células tronco que podem diferenciar em tecidos e células tendo várias morfologias e funções diferentes do corpo vivo e têm a capacidade de diferenciar em células de qualquer linhagem das três camadas de germes (endoderme, mesoderme, e ectoderme). Os exemplos destes incluem, mas não são especificamente limitados a células tronco embrionárias (ESCs), células tronco embrionárias derivadas de embriões clonados obtidos através do transplante nuclear, células tronco espermáticas, células germinais embrionárias, e células tronco pluripotentes induzidas (em seguida também indicadas como “iPSCs”).

[0064] Além disso, as “células tronco multipotentes” que podem ser usadas na presente invenção se referem às células tronco tendo a capacidade de diferenciar em células de um número limitado de linhagens. Os exemplos de “células tronco multipotentes” que podem ser usadas na presente invenção incluem as células tronco somáticas derivadas de células tronco de polpa dental, células tronco derivadas da mucosa oral, células tronco do folículo capilar, fibroblastos de cultura, e célula tronco da medula óssea. As células tronco pluripotentes preferidas são ESCs e iPSCs.

[0065] As “células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)” se referem às células obtidas introduzindo-se um fator específico (fator de reprogramação nuclear) nas células mamíferas somáticas ou células tronco não diferenciadas e reprogramando as células. No presente, existem vários tipos de “células tronco pluripotentes induzidas”. Outras que não as iPSCs estabelecidas introduzindo-se quatro fatores de Oct3/4, Sox2, Klf4, e c-Myc em fibroblastos de camundongo por Yamanaka, et al. (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), iPSCs derivadas de células

15 / 76 humanas estabelecidas pela introdução dos mesmos quatro fatores nos fibroblastos humanos (Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.), células Nanog-iPS estabelecidas pela introdução dos quatro fatores e depois ordenando as células usando a expressão de Nanog como um índice (Okita, K., Ichisaka, T., e Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), as células iPS produzidas através de um método que exclui c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106), e células iPS estabelecidas introduzindo-se seis fatores através de um método isento de vírus (Okita K et al. Nat. Methods, maio de 2011; 8(5): 409-12, Okita K et al. Steam Cells. 31(3): 458-66.) também podem ser usadas. Além disso, as células tronco pluripotentes induzidas, produzidas por Thomson, et al., estabelecidas introduzindo-se quatro fatores de OCT3/4, SOX2, NANOG, e LIN28 (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), células tronco pluripotentes induzidas produzidas por Daley, et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), células tronco pluripotentes induzidas produzidas por Sakurada, et al. (JP 2008-307007), e outros também podem ser usadas. Diferente do acima, qualquer uma das células tronco pluripotentes induzidas conhecida na técnica descritas em todos os papéis publicados (tais como Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol 3, Publicação 5, 568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646- 650; e Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797) ou patentes (tais como JP 2008-307007, JP 2008-283972, US 2008-2336610, US 2009-047263, WO 2007-069666, WO 2008-118220, WO 2008-124133, WO 2008-151058, WO 2009-006930, WO 2009-006997, e WO 2009-007852) também podem ser usadas.

[0066] Como “células tronco pluripotentes induzidas”, várias linhagens de iPSC estabelecidas pelo NIH, Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN), Universidade de Kyoto, etc., podem ser usadas. Os exemplos de linhagens iPSC humanas incluem a linhagem HiPS-RIKEN-1A,

16 / 76 a linhagem HiPS-RIKEN-2A, a linhagem HiPS-RIKEN-12A e a linhagem Nips-B2 pela RIKEN, e a linhagem 253G1, linhagem 201B7, linhagem 409B2, linhagem 454E2, linhagem 606A1, linhagem 610B1 e linhagem 648A1 pela Universidade de Kyoto. Alternativamente, as linhagens celulares de grau clínico providas pela Kyoto University, Cellular Dynamics International, ou outros, e as linhagens celulares para pesquisa e uso clínico produzidas usando tais linhagens celulares podem ser usadas.

[0067] Como “células tronco embrionárias (ESCs)”, as ESCs de camundongo tais como várias linhagens de ESC de camundongo estabelecidas pelo laboratório de alvejamento inGenious, RIKEN (Institute of Physical and Chemical Research), e outros podem ser usados, e as ESCs humanas tais como as várias linhagens de ESC humanas estabelecidas pelo NIH, Institute of Physical and Chemical Research, Universidade de Kyoto, e Cellartis pode, ser usadas. Por exemplo, as linhagens de ESC humanas tais como as linhagens CHB-1 a CHB-12, linhagem RUES1, linhagem RUES2 e as linhagens HUES1 a HUES28 pelo NIH, linhagem H1 e H9 pelo WisCell Research, e linhagem KhES-1, linhagem KhES-2, linhagem KhES-3, linhagem KhES-4, linhagem KhES-5, linhagem SSES1, linhagem SSES2 e linhagem SSES3 pela RIKEN podem ser usadas. Alternativamente, as linhagens celulares de grau clínico, e as linhagens celulares para a pesquisa e uso clínico produzidas usando tais linhagens celulares podem ser usadas.

[0068] Os termos “compreende(m) ou compreendendo” significam incluir os elementos após o termo, mas não estar limitados aos elementos. Portanto, a inclusão dos elementos após o termo é sugerida, mas a exclusão de qualquer outro elemento não é sugerida. Os termos “consiste(m) em ou consistindo em” significam incluir todos os elementos após o termo, e estar limitados aos elementos. Portanto, os termos “consiste(m) em ou consistindo em” indicam que os elementos listados são necessários ou indispensáveis, e outros elementos não existem substancialmente. Os termos “consiste(m)

17 / 76 essencialmente em ou consistindo essencialmente em” significam incluir qualquer elemento após o termo, e outros elementos são limitados àqueles que não afetam a atividade ou ação do elemento especificado na presente descrição. Portanto, o termo “consiste(m) essencialmente em ou consistindo essencialmente em” indica que os elementos listados são necessários ou indispensáveis, mas outros elementos são opcionalmente selecionados e podem ou pode não existir dependendo se ou não os outros elementos afetam a atividade ou ação dos elementos listados.

[0069] A combinação da citocina e quimiocina predeterminadas da presente invenção pode prover células imunológicas que expressam CAR com alta atividade antitumoral transferindo-se os genes em células imunológicas, especialmente as células T responsáveis pela imunidade mediada pela célula de imunidade adquirida, e as células NK, monócitos, macrófagos, e células dendríticas, que são responsáveis pela imunidade natural, junto com um gene de CAR e expressando os genes. Em outras palavras, a transferência e a expressão dos genes da combinação da citocina e quimiocina predeterminadas da presente invenção podem comunicar outras características técnicas para as células T (células T CAR), células NK (células CAR-NK), monócitos (CAR- monócitos), macrófagos (CAR-macrófagos), e células dendríticas (CAR- células dendríticas) em que um gene de CAR é transferido e expressado.

[0070] As “células imunológicas” não são especificamente limitadas, contanto que estas sejam as células tendo a capacidade de danificar as células alvo (células patogênicas) tais como as células cancerosas através de algum mecanismo de ação (as então chamadas células efetoras de imunidade). Os exemplos destes incluem as células T responsáveis pela imunidade mediada por célula da imunidade adquirida, e as células NK, monócitos, macrófagos, e células dendríticas, que são responsáveis pela imunidade natural. Em uma modalidade preferida, as células imunológicas podem ser as células T. Em uma outra modalidade preferida, as células imunológicas podem ser as células

18 / 76 responsáveis pela a imunidade natural tal como as células NK, macrófagos, e células dendríticas. É considerado que, enquanto as células T têm um risco considerável de causar GVHD pelo transplante alogênico (alo) mesmo no caso onde o tipo de HLA correspondem, as células NK alo não causam a GVHD. Portanto, o uso imediato é permitido preparando-se vários tipos de HLA das células alo imunológicas. As células CAR-NK são descritas, por exemplo, no documento US 2016/0096892, Mol Ther. 25(8): 1769-1781 (2017), etc., e as células CAR-dendríticas, CAR-macrófagos, etc., são descritas, por exemplo, no documento WO 2017/019848, eLIFE. 2018 e36688, etc.

[0071] Em seguida, a presente invenção será descrita com referências às modalidades adotando as células T como um exemplo representativo das células imunológicas. Contudo, a presente invenção não é limitada apenas às modalidades nas quais as células imunológicas são células T, e a presente invenção também inclui as modalidades em que as células imunológicas são células NK, monócitos, macrófagos, células dendríticas, ou outras. Na seguinte descrição, “células (CAR-) T” podem ser apropriadamente lidas como “células (CAR-) NK”, “(CAR-) monócitos”, “(CAR-) macrófagos”, “células (CAR-) dendríticas”, ou outros.

[0072] Em seguida, a célula T da presente invenção será descrita em detalhes.

[0073] A célula T da presente invenção expressa: (1) um CAR; (2) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27; e (3) CCL19.

[0074] A célula T da presente invenção pode ser qualquer célula T tal como células αβ, T células T γδ, células T CD8+, células T CD4+, tumor células T de infiltração, células T da memória, células T ingênuas, e células T NK, como as células T que expressam CARs comuns ou conhecidas.

[0075] A célula T pode ser isolada e purificada das células

19 / 76 imunológicas que infiltram nos fluidos corporais tais como sangue e fluidos da medula óssea, tecidos tais como baço, timo, linfônodos, ou tecidos cancerosos tais como tumores primários, tumores metastáticos, e ascite cancerosa. Além disso, a célula T pode ser obtida cultivando-se as células tronco pluripotentes induzidas (iPS células), células tronco embrionárias (células ES), outras células tronco, células progenitoras, ou outros, sob condições apropriadas e deste modo induzindo e diferenciando tais células em células T.

[0076] A célula T pode ser derivada de humanos ou pode ser derivada de mamíferos outros que não humanos (mamíferos não humanos). Os exemplos de mamíferos não humanos incluem camundongos, ratos, hamsters, porquinhos-da-índia, coelhos, cães, gatos, porcos, vacas, cavalos, ovelhas e macacos. (1) CAR

[0077] O CAR expressado pela célula T da presente invenção é basicamente constituído pelos peptídeos nos sítios de (i) um anticorpo de cadeia única que reconhece um antígeno de superfície celular das células cancerosas, (ii) um domínio de transmembrana, e (iii) um domínio de sinalização que induz a ativação da célula T, que são ligados por intermédio de espaçadores, como necessário, como CARs comuns ou conhecidos.

[0078] O anticorpo de cadeia única (i) que reconhece um antígeno de superfície celular das células cancerosas é tipicamente um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada derivadas de sítios de aglutinação ao antígeno de um anticorpo monoclonal que especificamente se aglutina ao antígeno e a um peptídeo conector que liga tais regiões.

[0079] O “antígeno de superfície celular das células cancerosas” alvejado pelo CAR pode ser uma biomolécula que é especificamente expressa nas células cancerosas e suas células progenitoras, uma biomolécula que foi

20 / 76 recém expressa pela cancerização das células, ou uma biomolécula com um nível de expressão aumentado nas células cancerosas se comparado com as células normais. Tal antígeno é geralmente indicado como “antígeno associado ao tumor” (TAA), e exemplos destes podem incluir BCMA, B7-H3, B7-H6, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD56, CD70, CD74, CD97, CD123, CD133, CD138, CD171, CD248, CAIX, CEA, c-Met, CS1 (CD319), CSPG4, CLDN6, CLD18A2, CYP1B1, DNAM-1, GD2, GD3, GM2, GFRα4, GPC3, GPR20, GPRC5D, globoH, Gp100, GPR20, GPRC5D, EGFR, EGFRvariante, EpCAM, EGP2, EGP40, FAP, FITC, HER2, HER3, HPV E6, HPV E7, hTERT, IgG cadeia κ, IL-11Ra, IL-13Ra2, KIT, Lewis A, Lewis Y, Legumain, LMP1, LMP2, Ly6k, LICAM, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE- A1, antígeno 1 associado ao melanoma, MUC1, MUC16, NA-17, NY-BR-1, NY-ESO-1, O-acetil-GD2, h5T4, PANX3, PDGRFb, PLAC1, ácido polisiálico, PSCA, PSMA, RAGE1, ROR1, sLe, SSEA-4, TARP, TAG-72, TEM7R, antígeno de Tn, receptor de TRAIL, TRP2, TSHR, fetoproteína α, mesotelina, receptor do ácido fólico α (FRα), receptor do ácido fólico β (FRβ), FBP, UPK2, VEGF-R2, e WT-1, mas não é limitado a estes exemplos.

[0080] O domínio de transmembrana (ii) é um polipeptídeo que serve como uma região para fixar CAR à membrana celular das células T. Os exemplos do domínio de transmembrana podem incluir BTLA, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 4-1BB (CD137), CTLA-4, GITR, ICOS, LAG3, OX40, SLAMF4 (CD244, 2B4), ou domínios de transmembrana derivados da cadeia α ou β de um receptor da célula T. Alternativamente, os domínios de transmembrana mutantes tendo uma sequência de aminoácido com uma homologia de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais, à sequência de aminoácido

21 / 76 natural do domínio de transmembrana acima mencionado também podem ser usados. Em uma modalidade da presente invenção, o domínio de transmembrana de CD8 é preferível como tal domínio de transmembrana.

[0081] Ao domínio de transmembrana, uma região de dobradiça que é um peptídeo (oligopeptídeo ou polipeptídeo), consistindo em qualquer sequência de aminoácido, tendo um comprimento de 1 a 100 aminoácidos, preferivelmente de 10 a 70 aminoácidos pode ser ligada. Os exemplos da região de dobradiça podem incluir as regiões de dobradiça derivadas de CD3, CD8, KIR2DS2, ou IgG4, IgD ou outras imunoglobinas. Alternativamente, as regiões de dobradiça mutantes tendo uma sequência de aminoácido com uma homologia de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais, à sequência de aminoácidos naturais das regiões de dobradiça acima mencionadas também podem ser usadas. Em uma modalidade da presente invenção, a região de dobradiça de CD8 é preferível como tal região de dobradiça.

[0082] O domínio de sinalização (iii) que induz a ativação da célula T é um polipeptídeo que serve como uma região para transmitir sinais dentro das células T quando o anticorpo de cadeia única reconhece o antígeno de superfície celular das células cancerosas e se aglutina a este. Os exemplos do domínio de sinalização podem incluir um ou mais domínios intracelulares selecionados a partir do grupo que consiste nas moléculas de MHC classe I, proteínas do receptor de TNF, proteínas semelhantes à imunoglobulina, receptores de citocina, integrinas, receptores da célula NK ativados, receptores semelhantes à dobre de sino, B7-H3, BAFFR, BTLA, BY55 (CD160), CD2, CD3ζ, CD4, CD7, CD8α, CD8β, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD18, CD19, CD19a, CD27, CD28, CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD84, CD96 (Tactile), CD103, 4-1BB (CD137), CDS, CEACAM1, CRTAM, CNAM1 (CD226), DAP10, cadeia γ associada

22 / 76 ao receptor de Fc, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICOS (CD278), IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIRDS2, Ly9 (CD229), LAT, LFA-1 (CD11a/CD18), LIGHT, LTBR, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PSGL1, SELPLG (CD162), SEMA4D (CD100), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), SLAMF4 (CD244, 2B4), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAMF7, SLAMF8 (BLAME), SLP-76, TNFR2, TRANCE/RANKL, VLA1, e VLA-6. Alternativamente, os domínios de sinalização mutantes (domínios intracelulares) tendo uma sequência de aminoácido com uma homologia de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais, à sequência de aminoácido natural do domínio de sinalização acima mencionado (domínio intracelular) também pode ser usado. Em uma modalidade da presente invenção, o domínio de sinalização preferivelmente contém três domínios intracelulares, CD28, 4-1BB, e CD3ζ.

[0083] No caso onde o domínio de sinalização contém uma pluralidade de domínios intracelulares, os domínios intracelulares podem ser ligados uns aos outros por intermédio dos peptídeos conectores (oligopeptídeos ou polipeptídeos) que consistem em 2 a 10 aminoácidos. Os exemplos de tais peptídeos conectores podem incluir um peptídeo que consiste em uma sequência contígua de glicina-serina.

[0084] Cada um entre o anticorpo de cadeia única e o domínio de transmembrana, e entre o domínio de transmembrana e o domínio de sinalização, uma região espaçadora que é um peptídeo (oligopeptídeo ou polipeptídeo) consistindo em qualquer sequência de aminoácido, tendo um comprimento de 1 a 100 aminoácidos, preferivelmente de 10 a 50 aminoácidos podem ser incluídas. Os exemplos da região espaçadora pode incluir um peptídeo que consiste em uma sequência contígua de glicina-

23 / 76 serina.

[0085] A sequência de aminoácido de CAR acima mencionada expressa pela célula T da presente invenção pode ser apropriadamente ajustada dependendo da aplicação da célula T, tipicamente, isto funciona como um componente ativo de um medicamento para tratar o câncer. Como a sequência de aminoácido do anticorpo de cadeia única (i) contra o antígeno de superfície celular das células cancerosas, várias sequências de aminoácidos são conhecidas, e a informação de tais sequências de aminoácidos também podem ser usadas na presente invenção. Alternativamente, um novo anticorpo contra o antígeno de superfície celular das células cancerosas desejado pode ser produzido de acordo com um método convencional, e a informação obtida determinando-se a sequência de aminoácido do novo anticorpo (preferivelmente regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, especialmente CDRs) pode ser usada na presente invenção. Além disso, várias sequências de aminoácidos derivadas de humanos e mamíferos outros que não os humanos são conhecidas como a sequência de aminoácidos do domínio de transmembrana (ii) e a domínio de sinalização da ativação da célula T (iii), e tais sequências de aminoácidos também são registradas nos bancos de dados tais como NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/), e UniProt (The Universal Protein Resource; https://www.uniprot.org). Portanto, tal informação também pode ser usada na presente invenção. (2) Citocina

[0086] A citocina expressa pela célula T da presente invenção é pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL- 21, e IL-27. A célula T da presente invenção pode expressar qualquer uma das quatro citocinas acima mencionadas ou duas ou mais destas.

[0087] A IL-15 é uma citocina tendo funções relacionadas à sobrevivência e ativação da célula T, o diferenciamento em células T da

24 / 76 memória, ativação da célula NK, e outros. O termo “IL-15” na presente invenção inclui não somente a proteína IL-15 natural de comprimento total, mas também várias modalidades contanto que as funções de IL-15 na ação e efeito da presente invenção sejam retidas. Isto é, “IL-15” na presente invenção inclui não somente a proteína inteira (polipeptídeo) que consiste na sequência de aminoácido da IL-15 natural, mas também uma parte desta (polipeptídeo parcial funcional) e variantes de toda ou uma parte da IL-15 natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da range tendo a homologia posteriormente descrita), e, além disso, o total ou uma parte da IL-15 natural ou variantes destas ligados às proteínas para formar uma proteína de fusão (por exemplo, aquela ligada à toda ou uma parte da IL-15Rα para formar uma proteína de fusão). Na presente invenção, o estado em que a célula T “expressa IL-15” inclui expressar IL-15 em várias formas como descrito acima (toda ou uma parte de uma proteína tendo a sequência de aminoácido natural ou variantes destes que pode ou não pode estar na forma de proteínas de fusão), contanto que a ação e efeito da presente invenção não sejam perdidos.

[0088] Os exemplos de IL-15 incluem as seguintes quatro modalidades. Todas estas são conhecidas (ver a Literatura Não Patentária 2, Literatura Não Patentária 3, Literatura Não Patentária 4, e Literatura Patentária 4 acima). Contudo, a IL-15 que pode ser usada na presente invenção não é limitada a estes exemplos específicos, e várias IL-15 modificadas de acordo com a presença ou ausência e tipos de peptídeos de sinal e conectores nas sequências, a ordem dos elementos, e outros pontos de vista (em seguida também indicada IL-15 “modificada”) também pode ser usada. Primeira modalidade de IL-15: IL-15LSP/IL-15 (em seguida também indicada como “IL15LSP”)

25 / 76

[0089] A “IL-15LSP” é um peptídeo de sinal de cadeia longa consistindo em 29 aminoácidos e se aglutina ao lado do N-terminal da IL-15 na primeira modalidade. A expressão da IL-15 da primeira modalidade intensifica a atividade antitumoral das células T CAR. O termo “IL-15LSP” também inclui não somente o polipeptídeo inteiro que consiste na sequência de aminoácido da IL-15LSP natural, mas também uma parte deste (polipeptídeo funcional parcial) e variantes de toda ou uma parte da IL-15LSP natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa tendo a homologia posteriormente descrita). Como um exemplo do tipo modificado da primeira modalidade, “IL-15LSP” substituído com “IL-2SP” (um peptídeo de sinal de IL-2, que pode ser toda ou uma parte da proteína natural ou variantes desta, como IL-15LSP) pode ser mencionada. Segunda modalidade de IL-15: Domínio extracelular de IL-15/IL-15Rα (em seguida também aludido como “sIL15RA”)

[0090] O “domínio extracelular de IL-15Rα“ se refere a uma parte da IL-15Rα (cadeia α do receptor de interleucina 15) excluindo o domínio de transmembrana e o domínio intracelular. O domínio extracelular de IL-15Rα inclui um domínio sushi (motivo comum às várias proteínas de aglutinação). O termo “domínio extracelular IL-15Rα“ também inclui não somente o polipeptídeo inteiro que consiste na sequência de aminoácido do domínio extracelular natural de IL-15Rα, mas também uma parte deste (polipeptídeo funcional parcial) e variantes de toda ou uma parte da IL-15Rα natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa tendo a homologia posteriormente descrita). Na segunda modalidade, o domínio extracelular de IL-15Rα normalmente se aglutina ao lado do C-terminal de IL-15 por intermédio de um conector (por

26 / 76 exemplo, um conector de glicina-serina que consiste em 26 aminoácidos). Na segunda modalidade, IL-2SP (um peptídeo de sinal de IL-2, que pode ser toda ou uma parte da proteína natural ou variantes desta) normalmente se aglutina ao lado do N-terminal de IL-15 ao invés de IL-15LSP. A segunda modalidade é de uma do tipo secretora e é um agonista que se aglutina fortemente a IL- 15Rβ (cadeia β do receptor de interleucina 15 compartilhado pelo receptor de interleucina 2) e γc (uma cadeia γ comum compartilhada como um receptor de interleucina 2, 4, 7, 9, 15, 21, ou outros). Terceira modalidade de IL-15: IL-15/IL-15Rα de comprimento total (em seguida também indicado como “mbIL15RA”)

[0091] A “IL-15Rα de comprimento total” inclui todos de domínio extracelular, domínio de transmembrana, e o domínio intracelular de IL-15Rα e normalmente se aglutina ao lado do C-terminal de IL-15 por intermédio de um conector (por exemplo, um conector de glicina-serina que consiste em 20 aminoácidos) na terceira modalidade. O termo “IL-15Rα de comprimento total “também inclui não somente a proteína inteira (polipeptídeo) consistindo na sequência de aminoácido da IL-15Rα de comprimento total natural, mas também as variantes da IL-15Rα natural de comprimento total em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácido é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa tendo a homologia posteriormente descrita). Além disso, IL-2SP (que pode ser toda ou uma parte da proteína natural ou variantes desta) normalmente se aglutina ao lado do N-terminal de IL-15 ao invés de IL- 15LSP também na terceira modalidade. A terceira modalidade é de um tipo de ligação à membrana, e a expressão desta intensifica a atividade antitumoral das células T CAR. Quarta modalidade de IL-15: IL-15Rαsushi/IL-15 (em seguida também indicado como “sushiIL15”)

[0092] Na quarta modalidade, IL-15Rα contendo um peptídeo de

27 / 76 sinal e um domínio sushi normalmente se aglutina ao lado do N-terminal de IL-15 por intermédio de um conector (por exemplo, um conector que consiste em 20 aminoácidos). O termo “IL-15Rαsushi” também inclui não somente o polipeptídeo inteiro que consiste na sequência de aminoácido da IL- 15Rαsushi natural, mas também uma parte deste (o polipeptídeo funcional parcial) e variantes de toda ou uma parte da IL-15Rαsushi natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa de homologia posteriormente descrita). A quarta modalidade é de um tipo secretor.

[0093] Na presente invenção, IL-15 é preferivelmente IL-15 (toda ou parte de uma proteína tendo a sequência de aminoácido natural ou variantes desta) na forma de uma proteína de fusão com IL-15Rα (toda ou parte de uma proteína tendo a sequência de aminoácido natural ou variantes desta) em vista de uma persistência e proliferação das células como descrito nos exemplos (Exemplos Experimentais) abaixo. Por exemplo, a segunda, terceira ou quarta modalidades acima mencionadas ou seus tipos modificados são preferíveis, e a terceira ou quarta modalidades acima mencionadas ou seus tipos modificados são mais preferíveis.

[0094] A IL-18 é uma citocina tendo funções relacionadas à ativação da célula T, ativação da célula NK, ativação da célula dendrítica, e outros. O termo “IL-18” na presente invenção inclui não somente a proteína IL-18 natural de comprimento total, mas também várias modalidades contanto que as funções de IL-18 na ação e efeito da presente invenção sejam retidas. Isto é, a “IL-18” na presente invenção inclui não somente a proteína de comprimento total (polipeptídeo) que consiste na sequência de aminoácido da IL-18 natural, mas também uma parte desta (polipeptídeo funcional parcial) e variantes de toda ou parte da IL-18 natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência

28 / 76 de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa de homologia posteriormente descrita), e além disso, toda ou parte da IL-18 natural ligada à outras proteínas para formar uma proteína de fusão. Na presente invenção, o termo “expressa IL-18” no contexto da célula T inclui expressar a IL-18 de várias formas como descrito acima (toda ou parte de uma proteína tendo a sequência de aminoácido natural ou variantes desta que pode ou pode não estar na forma das proteínas de fusão), contanto que a ação e efeito da presente invenção não sejam perdidos.

[0095] A IL-21 é uma citocina tendo funções relacionadas às funções das células T CD8+, diferenciamento de células T CD8+ em células T da memória, sobrevivência da célula NK, e outros. O termo “IL-21” na presente invenção inclui não somente a proteína IL-21 de comprimento total natural, mas também várias modalidades contanto que as funções de IL-21 na ação e efeito da presente invenção sejam perdidos. Isto é, “IL-21” na presente invenção inclui não somente a proteína de comprimento total (polipeptídeo) que consiste na sequência de aminoácido da IL-21 natural, mas também uma parte desta (polipeptídeo funcional parcial) e variantes de toda ou parte da IL- 21 natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa de homologia posteriormente descrita), e também toda ou parte da IL-21 natural ligada a outras proteínas para formar uma proteína de fusão. Na presente invenção, o termo “expressa IL-21” no contexto da célula T inclui expressar várias formas de IL-21 como descrito acima (toda ou parte de uma proteína tendo a sequência de aminoácido natural ou variantes desta que pode ou pode não estar na forma das proteínas de fusão), contanto que a ação e efeito da presente invenção não sejam perdidos.

[0096] A IL-27 é uma citocina tendo funções relacionadas à sobrevivência da célula T, ativação da célula NK, inibição da proliferação tumoral e angiogênese, e outros. O termo “IL-27” na presente invenção inclui

29 / 76 não somente a proteína IL-27 de comprimento total natural, mas também várias as modalidades contanto que as funções de IL-27 na ação e efeito da presente invenção sejam perdidas. Isto é, “IL-27” na presente invenção inclui não somente a proteína de comprimento total (polipeptídeo) que consiste na sequência de aminoácido da IL-27 natural, mas também uma parte desta (polipeptídeo funcional parcial) e variantes de toda ou parte da IL-27 natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa de homologia posteriormente descrita), e também toda ou parte da IL-27 natural ligada a outras proteínas para formar uma proteína de fusão. Na presente invenção, o termo “expressa IL-27” no contexto da célula T inclui expressar IL-27 em várias formas como descrito acima (toda ou parte de uma proteína tendo a sequência de aminoácido natural ou variantes desta que podem ou pode não estar na forma das proteínas de fusão), contanto que a ação e efeito da presente invenção não sejam perdidos.

[0097] Os exemplos de IL-27 incluem uma proteína de fusão (proteína de cadeia única) em que p28 e EBI3 (gene 3 induzido pelo vírus de Epstein-Barr), que são duas subunidades que constituem a IL-27, são ligados por um conector, por exemplo, um conector que consiste em 20 a 30 aminoácidos tal como (G4S) 3 (ver a Literatura Não Patentária 5 acima, por exemplo) ou um conector que consiste em GSTSGSGKPGSGEGSTKG (J Immunol. 183, 6217-26 (2009)). Os termos “p28” e “EBI3” também incluem, cada um, o todo ou parte de um polipeptídeo com a sequência de aminoácido natural ou variantes desta.

[0098] A sequência de aminoácidos das citocinas acima mencionadas expressas pela célula T da presente invenção pode ser apropriadamente ajustada dependendo da aplicação da célula T (célula T CAR) da presente invenção, tipicamente, suas funções como um componente ativo de um medicamento para tratar o câncer em consideração do efeito das células T

30 / 76 CAR na intensificação da atividade antitumoral incluindo a melhora na persistência e proliferação das células T CAR. As sequências de aminoácidos de IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, e IL-15Rα naturais derivadas de humanos e mamíferos outros que não os humanos (por exemplo, camundongos) são conhecidas e também registradas nos bancos de dados tais como NCBI e UniProt, e, portanto, a informação destas também pode ser usada na presente invenção. Por exemplo, a SEQ ID NO: 18 mostra a sequência de aminoácido de IL-15 natural humana (o comprimento total incluindo o peptídeo de sinal e partes de propeptídeo) registrada como UniProtKB-P40933, e a SEQ ID NO: 19 mostra a sequência de aminoácido de IL-15Rα natural humana (o comprimento total incluindo um peptídeo de sinal, o domínio sushi, o domínio extracelular, etc.) registrada como UniProtKB-Q13261. Na modalidade descrita posteriormente em que uma sequência de aminoácido natural de camundongo é substituída com uma sequência de aminoácido natural humana na sequência de aminoácido de um número de ID de sequência predeterminada, as sequências de aminoácidos das partes correspondentes incluídas nas SEQ ID NOs: 18 e 19 podem ser referentes. Além disso, muitas variantes, proteínas de fusão com outras proteínas, e seus tipos modificados de IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, e IL-15Rα são mostrados, e a informação quanto às suas sequências de aminoácidos também pode ser usada na presente invenção.

[0099] Os exemplos das variantes de IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27 incluem aqueles tendo uma sequência de aminoácido com uma homologia de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais, como uma região inteira ou parcial (domínio), às suas sequências de aminoácidos naturais derivados de humanos ou mamíferos outros que não os humanos, por exemplo, no caso onde o peptídeo de sinal é substituído como mostrado abaixo, como a homologia da região excluindo o

31 / 76 peptídeo de sinal. Como uma variante tendo uma homologia dentro de tal faixa para uma sequência de aminoácido natural derivada de uma espécie, uma sequência de aminoácido natural derivada de outra espécie pode ser aplicável (substancialmente incluída). Além disso, o peptídeo de sinal na sequência de cada uma de IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27 pode ser substituído com um peptídeo de sinal conhecido. Em um aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácido de IL-15, IL-18, IL-21, ou IL-27 naturais de camundongo pode ser substituída com a sequência de aminoácido de uma variante tendo tal um homologia, a sequência de aminoácido de IL-15, IL-18, IL-21, ou IL-27 naturais humana que é substancialmente aplicável a tal, ou uma outra variante desta na sequência de aminoácidos das proteínas (polipeptídeos) expressas pelas sequências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4: IL15LSP_F2A_CCL19 fragmento de DNA (fragmento de DNA #3), SEQ ID NO: 6: fragmento de DNA sIL15RA_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #4), SEQ ID NO: 8: fragmento de DNA mbIL15RA_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #5), SEQ ID NO: 10: fragmento de DNA sushiIL15_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #6), fragmento de DNA SEQ ID NO: 12: IL- 18_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #7), SEQ ID NO: 14: fragmento de DNA IL-21_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #8), e a SEQ ID NO: 16: fragmento de DNA scIL27_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #9), ou na sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 5: IL15LSP, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 7: sIL15RA, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 9: mbIL15RA, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 11: sushiIL15, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 13: IL-18, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 15: IL-21, e uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 17: scIL27.

[00100] Os exemplos de variantes do domínio extracelular de IL- 15Rα, a IL-15Rα de comprimento total, e a IL-15Rαsushi incluem aquelas tendo uma sequência de aminoácido com uma homologia de 80% ou mais,

32 / 76 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais, às suas sequências de aminoácido naturais derivadas humanos ou mamíferos outros que não os humanos. Em um aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácido do domínio extracelular de IL-15Rα natural de camundongo, IL-15Rα de comprimento total, ou IL-15Rαsushi pode ser substituída com a sequência de aminoácido de uma variante tendo tal homologia, a sequência de aminoácido do domínio extracelular de IL-15Rα, natural humana, a IL-15Rα de comprimento total ou a IL-15Rαsushi que é substancialmente aplicável a tal variante, ou uma outra variante destas na sequência de aminoácidos das proteínas (polipeptídeos) expressa pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4: fragmento IL15LSP_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #3), SEQ ID NO: 6: fragmento sIL15RA_F2A_CCL19de DNA (fragmento de DNA #4), SEQ ID NO: 8: fragmento mbIL15RA_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #5), SEQ ID NO: 10: fragmento sushiIL15_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #6), ou na sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 5: IL15LSP, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 7: sIL15RA, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 9: mbIL15RA, e uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 11: sushiIL15.

[00101] IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27 são preferivelmente derivados de humanos ou mamíferos outros que não os humanos (por exemplo, camundongos) do mesmo tipo que aqueles a partir dos quais a célula T (ou receptores de IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27 da célula T) usada para produzir a célula T da presente invenção é derivada. As partes outras que não IL-15, IL- 18, IL-21, e IL-27 (por exemplo, IL-15Rα) contidas nas proteínas de fusão de IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27, respectivamente, também são preferivelmente derivadas de humanos ou mamíferos outros que não os humanos do mesmo tipo que aqueles a partir dos quais a célula T usada para produzir a célula T da

33 / 76 presente invenção é derivada. Em um aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácido de IL-15, IL-18, IL-21, ou IL-27 natural de camundongo ou a sequência de aminoácido do domínio extracelular de IL- 15Rα, a IL-15Rα de comprimento total, ou a IL-15Rαsushi podem ser substituídas com a sequência de aminoácido natural humana destas na sequência de aminoácidos de proteínas (polipeptídeos) expressa pelas sequências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4: fragmento IL15LSP_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #3), SEQ ID NO: 6: fragmento sIL15RA_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #4), SEQ ID NO: 8: fragmento mbIL15RA_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #5), SEQ ID NO: 10: fragmento sushiIL15_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #6), SEQ ID NO: 12: fragmento IL-18_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #7), SEQ ID NO: 14: fragmento IL-21_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #8), SEQ ID NO: 16: fragmento scIL27_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #9), ou na sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 5: IL15LSP, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 7: sIL15RA, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 9: mbIL15RA, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 11: sushiIL15, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 13: IL-18, uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 15: IL-21, e uma proteína de fusão contendo a SEQ ID NO: 17: scIL27. (3) Quimiocina

[00102] A quimiocina expressa pela célula T da presente invenção é CCL19. A CCL19 é principalmente produzida a partir das células dendríticas e macrófagos dos linfônodos e tem a função de induzir by mail of células T, células B, e células dendríticas maduras por intermédio do seu receptor, CCR7. Isto é, a “CCL19” na presente invenção inclui não somente a proteína de comprimento total (polipeptídeo) que consiste na sequência de aminoácido ao CCL19 natural, mas também uma parte desta (polipeptídeo funcional

34 / 76 parcial) e variantes de toda ou parte da CCL19 natural em que uma ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos é excluída, substituída, ou adicionada à sequência de aminoácido natural (preferivelmente, dentro da faixa de homologia posteriormente descrita).

[00103] A sequência de aminoácido da quimiocina acima mencionada expressa pela célula T da presente invenção pode ser apropriadamente ajustada dependendo da aplicação da célula T (célula T CAR) da presente invenção, tipicamente, suas funções como um componente ativo de um medicamento para tratar o câncer em consideração do efeito da célula T CAR na intensificação da atividade antitumoral incluindo a melhora na persistência e proliferação da célula T CAR. A sequência de aminoácidos de CCL19 natural derivada de humanos e mamíferos outros que não os humanos (por exemplo, camundongos) é conhecida e também registrada nos bancos de dados tais como NCBI e UniProt, e, portanto, a esta informação também pode ser usada na presente invenção. Além disso, a informação na sequência de aminoácidos das variantes conhecidas de CCL19 também podem ser usadas na presente invenção.

[00104] Os exemplos das variantes de CCL19 incluem aquelas tendo uma sequência de aminoácido com uma homologia de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais, como toda ou uma região parcial, à sequência de aminoácidos da CCL19 natural derivada destes humanos ou mamíferos outros que não os humanos. Em um aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácido de CCL19 natural de camundongo pode ser substituída com a sequência de aminoácido de uma variante tendo tal homologia, a sequência de aminoácido de CCL19 natural humana que é substancialmente aplicável a tal variante, ou uma outra variante desta na sequência de aminoácidos das proteínas (polipeptídeos) expressa pelas sequências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4: fragmento

35 / 76 IL15LSP_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #3), SEQ ID NO: 6: fragmento sIL15RA_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #4), SEQ ID NO: 8: fragmento mbIL15RA_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #5), SEQ ID NO: 10: fragmento sushiIL15_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #6), SEQ ID NO: 12: IL-18_F2A_CCL19 fragmento de DNA (fragmento de DNA #7), SEQ ID NO: 14: fragmento de DNA IL- 21_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #8), e SEQ ID NO: 16: fragmento scIL27_F2A_CCL19 de DNA (fragmento de DNA #9).

[00105] A CCL19 é preferivelmente derivada destes humanos ou outros mamíferos que não os humanos (por exemplo, camundongos) do mesmo tipo que a célula T usada para produzir a célula T da presente invenção (receptor de CCL19 da célula T) ou variantes destas.

[00106] Em seguida, o medicamento da presente invenção será descrito em detalhes.

[00107] O medicamento da presente invenção contém a célula T da presente invenção como descrito acima e também pode conter outros componentes, como necessário. Aqueles versados na técnica seriam capazes de preparar apropriadamente o medicamento da presente invenção usando a célula T da presente invenção em consideração da aplicação (alvo do tratamento) e forma de dosagem.

[00108] O medicamento da presente invenção é principalmente um medicamento (agente anticâncer) para tratar o câncer correspondente ao antígeno de superfície celular das células cancerosas (antígeno específico do câncer) alvejado pelo CAR expressado pela célula T da presente invenção. Portanto, o tipo do câncer alvejado pelo medicamento da presente invenção não é especificamente limitado, contanto que as células cancerosas expressem o antígeno alvejado pelo CAR estejam contidas no tecido canceroso, e um certo nível do efeito terapêutico seja observado pela célula T da presente invenção. Os exemplos do câncer que podem ser alvejados pelo medicamento

36 / 76 da presente invenção podem incluir cânceres tais como adenocarcinoma, carcinoma da célula escamosa, carcinoma adenoescamoso, câncer não diferenciado, câncer da célula grande, câncer da célula pequena, câncer de pele (por exemplo, melanoma e câncer da célula de Merkel), câncer mamário, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer vaginal, câncer de pescoço, câncer de cabeça e pescoço, câncer uterino, câncer cervical, câncer hepático, câncer renal, câncer pancreático, câncer do baço, câncer pulmonar, câncer pulmonar da célula não pequena, câncer da traquéia, câncer brônquico, câncer colônico, câncer retal, câncer do intestino delgado, câncer colorretal, câncer de estômago, câncer esofágico, câncer de vesícula biliar, câncer testicular, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, e câncer nasofaríngeo; cânceres do tecido ósseo, tecido da cartilagem, tecido adiposo, tecido muscular, tecido vascular, e tecido hematopoiético; sarcomas tais como condrossarcoma, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, hemangioendotelioma maligno, tumor maligno, osteossarcoma, e sarcoma de tecido macio; blastomas tais como hepatoblastoma, meduloblastoma, nefroblastoma, neuroblastoma, pancreato- blastoma, blastoma pleuropulmonar, e retinoblastoma; tumores da célula embrionária; linfoma; leucemia, leucemia mieloide aguda, e mieloma múltiplo.

Preferivelmente, Os exemplos destes incluem carcinomas sensíveis às células NK (tais como melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar da célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma, e leucemia). Mais preferivelmente, os exemplos destes incluem melanoma, câncer colorretal, câncer renal, mieloma múltiplo, linfoma e leucemia.

37 / 76

[00109] Os exemplos de componentes que podem estar contidos no medicamento da presente invenção outros que não a célula T incluem aditivos farmaceuticamente aceitáveis, mais especificamente, solução salina, solução salina tamponada, meio de cultura celular, dextrose, água para injeção, glicerol, etanol, estabilizantes, solubilizantes, tensoativos, tampões, conservantes, agentes isotônicos, enchedores e lubrificantes.

[00110] O medicamento da presente invenção pode ser usado sendo administrado a um indivíduo em necessidade do tratamento do câncer (tais como pacientes com câncer e animais que carregam câncer) através do mesmo método como para as Células T conhecidas expressando CAR. Os exemplos do método para administração incluem injeções intratumorais, intravenosas, intra-arterial, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal.

[00111] A quantidade da célula T da presente invenção a ser contida no medicamento da presente invenção pode ser apropriadamente ajustada, por exemplo, dependendo da aplicação, forma de dosagem, efeito terapêutico intencionado, e outros, em consideração do tipo, local, e severidade do câncer, a idade, peso corporal, e condição do indivíduo a ser tratado, e outros. Por exemplo, o medicamento da presente invenção pode ser formulado de modo que a célula T da presente invenção seja administrada em uma quantidade de normalmente 1 × 104 a 1 × 1010, preferivelmente de 1 × 105 a 1 × 109, mais preferivelmente de 5 × 106 a 5 × 108, em uma dose única.

[00112] O intervalo de administração do medicamento da presente invenção não é especificamente limitado e pode ser apropriadamente ajustado em consideração da quantidade da célula T da presente invenção a ser administrada de uma vez, e outros. O medicamento da presente invenção pode ser independentemente administrado, por exemplo, 4 vezes, 3 vezes, duas vezes, ou uma vez ao dia, dia sim dia não, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, uma vez por semana, a cada 8 dias, a cada 9 dias, a cada 10 dias, duas vezes por semana, uma vez por mês, ou duas vezes em um mês.

38 / 76

[00113] O medicamento da presente invenção (agente anticâncer) pode ser usado em combinação com os agentes anticâncer conhecidos. Os exemplos dos agentes anticâncer podem incluir fármacos de alquilação tais como ciclofosfamida, bendamustina, iosfamida, e dacarbazina; antimetabólitos tais como pentostatina, fludarabina, cladribina, metotrexato, 5-fluorouracila, 6-mercaptopurina, e enocitabina; fármacos de alvejamento molecular tais como rituximab, cetuximab, e trastuzumab; inibidores de cinase tais como imatinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib, e trametinib; inibidores de proteassoma tais como bortezomib; inibidores de calcineurina tais como ciclosporina e tacrolimus; antibióticos antitumoral tal como idarrubicina e doxorrubicina mitomicina C; alcaloides vegetais tais como irinotecano e etoposídeo; preparações de platina tais como cisplatina, oxaliplatina, e carboplatina; fármacos terapêuticos de hormônio tais como tamoxifeno e bicalutamida; e fármacos imunorreguladores tais como interferon, nivolumab, e pembrolizumab.

[00114] O uso do medicamento da presente invenção em combinação com o agente anticâncer adicional pode estar em qualquer forma de (a) usar o agente anticâncer adicional e depois o medicamento da presente invenção, (b) usar o medicamento da presente invenção e o agente anticâncer adicional ao mesmo tempo, ou (c) usar o medicamento da presente invenção e depois o agente anticâncer adicional. Quando o medicamento da presente invenção é usado em combinação com o agente anticâncer adicional, é esperado que o efeito terapêutico no câncer seja mais melhorado, e os efeitos colaterais devido aos agentes anticâncer podem ser reduzidos reduzindo-se o número de administrações ou as doses do medicamento da presente invenção e/ou o outro agente anticâncer.

[00115] Em seguida, o vetor de expressão da presente invenção será descrito em detalhes.

[00116] O vetor de expressão da presente invenção contém: (1) um

39 / 76 ácido nucléico que codifica um CAR; (2) um ácido nucléico que codifica pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27; e (3) um ácido nucléico que codifica CCL19.

[00117] Na presente invenção, o termo “contém um ácido nucléico que codifica IL-15” no contexto do vetor de expressão inclui compreendendo um ácido nucléico que codifica não somente a proteína IL-15 de comprimento total natural, mas também a IL-15 em várias formas como descrito acima. O mesmo também se aplica ao termo “contém um ácido nucléico que codifica IL-18”, “contém um ácido nucléico que codifica IL-21”, “contém um ácido nucléico que codifica IL-27”, ou “contém um ácido nucléico que codifica CCL19” no contexto do vetor de expressão.

[00118] O “ácido nucléico” pode ser qualquer molécula obtida através da polimerização dos nucleotídeos e moléculas tendo funções equivalentes aos nucleotídeos. Os exemplos destes podem incluir RNA, que é um polímero de ribonucleotídeos, DNA, que é um polímero de desoxirribonucleotídeos, um ribonucleotídeo de mistura polimérica e desoxirribonucleotídeos, e um polímero de nucleotídeo contendo análogos de nucleotídeos. Além disso, o ácido nucléico pode ser um polímero de nucleotídeo contendo derivados de ácido nucléico. Além disso, o ácido nucléico pode ser um ácido nucléico de filamento único ou um ácido nucléico de filamento duplo. Além disso, o ácido nucléico de filamento duplo também inclui um ácido nucléico de filamento duplo em que um filamento é hibridizado com o outro filamento sob condições rigorosas.

[00119] Os análogos de nucleotídeos podem ser quaisquer moléculas com modificação de um ribonucleotídeo, um desoxirribonucleotídeo, RNA, ou DNA, para melhorar a resistência da nuclease, estabilizar, aumentar a afinidade com ácidos nucléicos de filamento complementar, aumentando a permeabilidade celular, ou visualizando as células, se comparado com RNA ou DNA. Os análogos de nucleotídeos podem ser moléculas de ocorrência

40 / 76 natural ou moléculas não naturais. Os exemplos destes incluem análogos de nucleotídeos modificados com açúcar e análogos de nucleotídeos modificados com ligação de fosfodiéster.

[00120] Os análogos de nucleotídeos modificados com açúcar podem ser qualquer análogo obtido adicionando-se qualquer material estrutural químico a ou substituindo com qualquer material estrutural químico parte ou toda a estrutura química do açúcar do nucleotídeo. Os exemplos específicos destes podem incluir os análogos de nucleotídeos substituídos com 2’-O-metil ribose, análogos de nucleotídeos substituídos com 2’-O-propil ribose, análogos de nucleotídeos substituídos com 2’-metoxietóxi ribose, análogos de nucleotídeos substituídos com 2’-O-metoxietil ribose, análogos de nucleotídeos substituídos com 2’-O-[2-(guanidino)etil]ribose, análogos de nucleotídeos substituídos com 2’-fluororribose, ácidos nucléicos artificiais reticulados tendo duas estruturas cíclicas introduzindo-se as estruturas reticuladas na parte de açúcar (Ácidos Nucleicos Ligados em Ponte) (BNAs), mais especificamente, ácidos nucléicos artificiais bloqueados em que o átomo de oxigênio na posição 2’ e o átomo de carbono na posição 4’ são reticulados por intermédio de metileno (Ácidos Nucléicos Bloqueados) (LNAs), e ácidos nucléicos artificiais reticulados com etileno (Ácidos nucléicos ligados em ponte com etileno) (ENAs) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)], e também incluem ácidos nucléicos de peptídeos (PNAs) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)], ácidos nucléicos de oxipeptídeos (OPNAs) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)], e ácidos ribonucléicos de peptídeos (PRNAs) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)].

[00121] Os análogos de nucleotídeos modificados com a ligação de fosfodiéster podem ser qualquer análogo obtido adicionando-se qualquer substância química a ou substituindo com qualquer substância química parte ou toda a estrutura química da ligação de fosfodiéster do nucleotídeo. Os exemplos específicos destes podem incluir os análogos de nucleotídeos

41 / 76 substituídos com ligações de fosforotioato, e análogos de nucleotídeos substituídos com ligações de N3’-P5’ fosforamidita [Cell technology, 16, 1463-1473 (1997)] [método para RNAi e método antissentido, Kodansha Ltd. (2005)].

[00122] Os derivativos de ácido nucléico podem ser quaisquer moléculas obtidas adicionando-se uma outra substância química aos ácidos nucléicos, para melhorar a resistência da nuclease, estabilizando, aumentando a afinidade com ácidos nucléicos de filamento complementar, aumentando a permeabilidade celular, ou visualizando as células, se comparado com os ácidos nucléicos. Os exemplos específicos destes podem incluir derivados com 5’-poliamina adicionada, derivados com colesterol adicionado, derivados com esteroide adicionado, derivados com ácido biliar adicionado, derivados com vitamina adicionada, derivados adicionados com Cy5, derivados com Cy3 adicionado, derivados com 6-FAM adicionado, e derivados com biotina adicionada.

[00123] O vetor de expressão da presente invenção somente precisa ser capaz de produzir a célula T da presente invenção comunicando-se uma célula T ou sua precursora, sendo introduzida na célula, e expressando uma proteína predeterminada (polipeptídeo) codificada dentro da célula T. Esta modalidade não é especificamente limitada. Aqueles versados na técnica seriam capazes de projetar e produzir um vetor de expressão capaz de expressar uma proteína desejada (polipeptídeo) na célula T.

[00124] O vetor de expressão da presente invenção pode ser linear ou cíclico e pode ser um vetor não viral tal como um plasmídeo, um vetor viral, ou um vetor de transposon.

[00125] Os exemplos do vetor viral podem incluir um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral, e um vetor viral associado a adeno. Os exemplos preferíveis do vetor retroviral podem incluir um vetor de pMSGV (Tamada k et al., ClinCancer Res 18:6436-6445 (2002)) e um vetor

42 / 76 de pMSCV (disponível da Takara Bio Inc). No caso de usar o vetor retroviral, os genes contidos no vetor são incorporados no genoma de uma célula hospedeira (a célula T na presente invenção), e, portanto, os genes podem ser estavelmente expressados por um longo período de tempo.

[00126] Em uma modalidade da presente invenção, um vetor de expressão contém todos os elementos de (1) um ácido nucléico que codifica um CAR, (2) um ácido nucléico que codifica pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27, e (3) um ácido nucléico que codifica CCL19. Em uma outra modalidade da presente invenção, um primeiro vetor de expressão contém um ou dois dos elementos acima mencionados (1) a (3), e um segundo vetor de expressão contém o elemento restante. Em uma outra modalidade da presente invenção, um primeiro vetor de expressão contém o elemento acima mencionado (1), um segundo vetor de expressão contém o elemento acima mencionado (2), e um terceiro vetor de expressão contém o elemento acima mencionado (3). Portanto, o vetor de expressão da presente invenção pode significar uma combinação (conjunto) de uma pluralidade de vetores de expressão, isto é, uma combinação do primeiro e segundo vetores de expressão acima mencionados ou uma combinação do primeiro, segundo, e terceiro vetores de expressão acima mencionados, dependendo da modalidade. No caso onde um vetor de expressão contém uma pluralidade de elementos, a ordem na qual aqueles elementos são arranjados do lado à montante para o lado à jusante não é particularmente limitada.

[00127] As sequências de nucleotídeos dos três elementos predeterminados (CAR, citocina e quimiocina) contidos no vetor de expressão da presente invenção podem ser designados de modo a codificar a sequência de aminoácidos das proteínas (polipeptídeos), respectivamente, correspondendo às proteínas (polipeptídeos) selecionadas como os elementos. Os ácidos nucléicos (oligonucleotídeos) contidos no vetor de expressão

43 / 76 podem ser produzidos sintetizando-se quimicamente o oligo DNA ou podem ser produzidos (clonados) como o cDNA.

[00128] O vetor de expressão da presente invenção pode conter (no caso das combinações acima mencionadas de uma pluralidade dos vetores de expressão, os vetores de expressão, podem conter cada um, independentemente) as sequências de promotores, terminadores, intensificadores, códons de partida, códons de parada, sinais de poliadenilação, sinais de localização nuclear (NLS), sítios de multiclonagem (MCS), e outros, que estão envolvidos na expressão de cada gene, como necessário, na adição às sequências (genes) que codificam os elementos predeterminados acima mencionados.

[00129] Em uma modalidade da presente invenção, no caso onde um vetor de expressão contém dois ou mais dos três elementos acima mencionados, um gene que codifica um peptídeo de autoclivagem (peptídeo 2A) ou IRES (Sítio Interno de Entrada do Ribossomo) pode ser inserido entre os elementos.

[00130] O peptídeo 2A é um peptídeo de autoclivagem derivado de um vírus e tem uma característica que uma posição predeterminada (posição de um resíduo do terminal C) na sequência de aminoácido é clivada no retículo endoplasmático (Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5 (5): 627-638 (2005)). Portanto, os genes integrados antes e depois do peptídeo 2A será expressado independentemente um dos outros na célula. Os exemplos do peptídeo 2A incluem aqueles derivados de picornavírus, rotavírus, vírus de inseto, aptovírus, ou vírus de tripanossoma.

[00131] O vetor de expressão da presente invenção também pode conter ácidos nucléicos (sequências de nucleotídeos) que codificam “genes funcionais” tais como um gene repórter (tipicamente, um gene que codifica uma proteína fluorescente), um gene de seleção de fármaco, e um gene suicida.

44 / 76

[00132] No caso de usar um “gene de resistência ao fármaco” como um gene funcional, as células nas quais o vetor de expressão da presente invenção contendo o gene de resistência ao fármaco é introduzido podem ser selecionadas adicionando-se um medicamente predeterminado ao meio no método para produzir uma célula de T CAR da presente invenção. Os exemplos do gene de resistência ao fármaco incluem um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à ampicilina, e um gene de resistência à puromicina. Um destes genes pode ser usado, ou dois ou mais destes podem ser usados.

[00133] No caso de usar um “gene que codifica uma proteína fluorescente” como um gene funcional, as células T com o vetor de expressão da presente invenção introduzido podem ser observadas usando um microscópio de fluorescência, ou as células com o vetor de expressão da presente invenção introduzido podem ser classificadas usando um citômetro de fluxo (classificador celular), no método para produzir uma célula T CAR da presente invenção. Um exemplo típico do gene repórter é um gene que codifica uma proteína fluorescente. Os exemplos do “gene que codifica uma proteína fluorescente” incluem proteínas azul fluorescentes tais como Sirius, BFP, e EBFP; proteínas ciano fluorescentes tais como mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, e CFP; proteínas verde fluorescentes tais como TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (por exemplo, hmAG1), ZsGreen, EmGFP, EGFP, GFP2, e HyPer; proteínas amarelo fluorescentes tais como TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, e mBanana; proteínas laranja fluorescentes tais como KusabiraOrange (por exemplo, hmKO2) e mOrange; proteínas vermelho fluorescentes tais como TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, e mStrawberry; e proteínas próximas ao infravermelho fluorescentes tais como TurboFP602, mRFP1, JRed, KillerRed, mCherry, HcRed, KeimaRed (por exemplo, hdKeimaRed), mRasberry, e

45 / 76 mPlum. Qualquer um destes genes pode ser usado, ou dois ou mais destes podem ser usados. No caso de usar dois ou mais genes que codificam as proteínas fluorescentes, as proteínas fluorescentes preferivelmente têm diferentes comprimentos de onda de emissão de modo a não interferir com a visibilidade uma das outras.

[00134] No caso de usar um “gene suicida” como um gene funcional, o número das células T da presente invenção in vivo pode ser controlado administrando um medicamento que ativa a função do gene suicida, dependendo do curso do tratamento do câncer, por exemplo, no estágio quando o tumor desapareceu. Os exemplos do gene suicida incluem um gene que codifica a toxina da difteria A, timidina cinase do herpes simples (HSV- TK), carboxipeptidase G2 (CPG2), carboxil esterase (CA), citosina desaminase (CD), citocromo P450 (cyt-450), desoxicitidina cinase (dCK), nitrorredutase (NR), purina nucleosídeo fosforilase (PNP), timidina fosforilase (TP), timidina cinase do vírus varicela-zóster (VZV-TK), xantina- guanina fosforibosil transferase (XGPRT), ou caspase 9 induzível. Qualquer um destes genes pode ser usado, ou dois ou mais destes podem ser usados. Os fármacos que ativam a função de cada gene suicida são conhecidos, e os exemplos destes incluem ganciclovir para timidina cinase do herpes simples (HSV-TK), e AP1903 que é um composto indutor de dímeros para a caspase 9 induzível.

[00135] Em seguida, o método para produzir uma célula T CAR da presente invenção será descrito em detalhes. O método para produzir uma célula T CAR da presente invenção contém uma etapa de introduzir o vetor de expressão da presente invenção em uma célula T como descrito acima (que será em seguida indicada como “etapa que introduz o vetor de expressão”).

[00136] O método para introduzir o vetor de expressão em uma célula T pode se tornar adequado para a modalidade do vetor de expressão. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser introduzido na célula T através de

46 / 76 métodos conhecidos tais como um método para infecção viral, um método para ácido fosfórico de cálcio, um método para lipofecção, um método para microinjeção, e um método para eletroporação. O vetor de expressão da presente invenção pode ser preparado em uma forma adequada para o uso em cada método através de meios conhecidos e usando-se kits comercialmente disponíveis como apropriado (de acordo com as instruções destes). Na etapa de introduzir o vetor de expressão, as células T podem ser cultivadas trazendo-se uma tal preparação em contato com as células T, geralmente, em um meio ao qual uma preparação contém o vetor de expressão.

[00137] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o vetor de expressão da presente invenção é introduzido nas células T através de um método para infecção viral. Por exemplo, um método no qual o vetor da presente invenção e o vetor de empacotamento (plasmídeo) de cada vírus são transfectados em uma célula hospedeira, usando um kit comercialmente disponível a cada vetor viral tal como um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral, e um vetor viral associado a adeno, para produzir um vírus recombinante, e em seguida, as células T são infectadas com o vírus recombinante obtidas, pode ser mencionado. Os exemplos do kit comercialmente disponível para os vetores virais incluem o Retrovirus packaging Kit Eco (disponível da Takara Bio Inc). Os exemplos da célula hospedeira incluem a célula GP2-293 (disponível da Takara Bio Inc.), célula Plat-GP (disponível da Cosmo Bio Co., Ltd.), célula PG13 (ATCC CRL- 10686), e célula PA317 (ATCC CRL-9078).

[00138] O método para produzir uma célula T CAR da presente invenção também pode conter outras etapas antes e depois da etapa de introdução do vetor de expressão. Os exemplos das outras etapas incluem uma etapa de cultivar as T células, e uma etapa incluindo um processo para fazer com que um gene funcional contido no vetor de expressão funcione.

[00139] As células T nas quais o vetor de expressão da presente

47 / 76 invenção é produzido podem ser normalmente pré-cultivadas in vitro através de um método conhecido. Por exemplo, as células T podem ser isoladas e purificadas de acordo com um método convencional dos corpos fluidos tal como fluido de sangue e medula óssea; os tecidos tais como baço, timo e linfônodos; ou tecidos cancerosos tais como tumores primários, tumores metastáticos, e ascite cancerosa, que são coletados de humanos ou animais não humanos, e depois cultivados em um meio apropriado, e (uma preparação contendo) o vetor de expressão da presente invenção pode ser adicionado ao meio. Alternativamente, as células T (ou precursores destas) podem ser preparadas antecipadamente das células iPS, células ES, e outras células tronco pluripotentes através de uma etapa de indução de diferenciamento apropriada, e (uma preparação contendo) o vetor de expressão da presente invenção pode ser adicionado ao meio.

[00140] Além disso, no caso onde o vetor de expressão da presente invenção contém um gene de resistência ao fármaco como um gene funcional, uma etapa de cultivo das células T enquanto adicionado um fármaco correspondente ao gene de resistência ao fármaco usado para o meio pode ser realizada depois da etapa de introdução do vetor de expressão, de modo a selecionar as células T com o vetor de expressão introduzido. Aqueles versados na técnica seriam capazes de ajustar apropriadamente as condições para usar o fármaco correspondente ao gene de resistência ao fármaco tal como a concentração no meio e o período de cultura.

[00141] No caso onde o vetor de expressão da presente invenção contém um gene que codifica uma proteína fluorescente (gene repórter) como um gene funcional, uma etapa de observar as células T com o vetor de expressão introduzido usando um microscópio de fluorescência, uma etapa de selecionar as células T com o vetor de expressão introduzido usando um seletor celular, e outras podem ser realizadas depois da etapa de introdução do vetor de expressão. Aqueles versados na técnica seriam capazes de ajustar

48 / 76 apropriadamente as condições para observação usando um microscópio de fluorescência e seleção usando um seletor celular, tal como irradiação com luz tendo um comprimento de onda de excitação e detecção de luz tendo um comprimento de onda de emissão correspondente à proteína fluorescente. Exemplos

[00142] O CAR nos seguintes exemplos é um CAR que alveja a CD20 humana, especificamente, um CAR de CD20 anti-humano que consiste em scFv de CD20 anti-humano, domínio de transmembrana CD8 de camundongo, e motivo de sinal intracelular CD28_4-1BB_CD3ζ de camundongo. Além disso, a citocina nos seguintes exemplos é qualquer uma de IL-15 de camundongo (“IL15LSP”, “sIL15RA”, “mbIL15RA” ou “sushiIL15”); IL-18 de camundongo; IL-21 de camundongo; ou uma proteína de cadeia única “scIL27” contendo IL-27 de camundongo (p28 e EBI3). A quimiocina nos seguintes exemplos é CCL19 de camundongo. As células T derivadas de camundongo que expressam o CAR, a citocina, e a quimiocina foram produzidas como segue e testadas. [Tabela 1] Exemplo / CAR Citocina Quimiocina Exemplo Comparativo IL15LSP CCL19 Exemplo 1-1 CD20scFv anti-humano (Camundongo) (Camundongo) sIL15RA CCL19 Exemplo 1-2 CD20scFv anti-humano (Camundongo) (Camundongo) mbIL15RA CCL19 Exemplo 1-3 CD20scFv anti-humano (Camundongo) (Camundongo) sushiIL15 CCL19 Exemplo 1-4 CD20scFv anti-humano (Camundongo) (Camundongo) IL-18 CCL19 Exemplo 2 CD20scFv anti-humano (Camundongo (Camundongo) IL-21 CCL19 Exemplo 3 CD20scFv anti-humano (Camundongo) (Camundongo) scIL27 CCL19 Exemplo 4 CD20scFv anti-humano (Camundongo) (Camundongo) Exemplo Comparativo 1 - - - Exemplo Comparativo 2 CD20scFv anti-humano - - [Exemplo 1-1] células T CAR de IL15LSP × CCL19

49 / 76

[00143] Em uma etapa que produz vetor, três tipos de fragmentos de DNA (fragmentos de DNA 1 a 3) foram primeiro artificialmente sintetizados na etapa 1, e depois um vetor de expressão contendo todos os genes que codificam o CAR, citocina, e quimiocina predeterminados foram produzidos usando os três tipos de fragmentos de DNA na etapa 2. Subsequentemente, em uma etapa que produz a célula T CAR, um vetor retroviral foi primeiro preparado usando o vetor de expressão na etapa 1, e depois os genes predeterminados foram transduzidos nas células T de camundongo usando a preparação de vetor retroviral na etapa 2. [A: Etapa de produção de vetor] Produção do vetor de expressão de CAR da CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano Etapa 1: Síntese de fragmentos de DNA Fragmento de DNA #1: Fragmento de DNA contendo CAR de CD20 anti-humano

[00144] Um fragmento de DNA (fragmento de DNA #1) contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o CAR de CD20 anti-humano que consiste em scFv de CD20 anti-humano, domínio de transmembrana CD8 de camundongo, e o motivo de sinal intracelular CD28_4-1BB_CD3ζ foi artificialmente sintetizado. A SEQ ID NO: 1 (Figura 7) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro de DNA #1. Na SEQ ID NO: 1, as bases nas posições de 3 a 785 formam uma sequência que codifica a scFv de CD20 anti-humano, as bases nas posições 795 a 1040 formam uma sequência que codifica o domínio de transmembrana de CD8 de camundongo, as bases nas posições de 1041 a 1637 formam uma sequência que codifica o motivo de sinal intracelular CD28_4-1BB_CD3ζ de camundongo (entre estes, as bases nas posições de 1041 a 1163 codificam o domínio intracelular de CD28 de camundongo, as bases nas posições 1164 a 1298 codificam o domínio intracelular 4-1BB de camundongo, e as bases nas posições 1299 a 1637 codificam o polipeptídeo no domínio intracelular de CD3ζ de camundongo).

50 / 76 A SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão expressada pela sequência de nucleotídeos nas de posições 3 a 1637 do fragmento de DNA #1. Fragmento de DNA #2: Fragmento de DNA contendo códons de parada e sítios de multiclonagem

[00145] Um fragmento de DNA (fragmento de DNA #2) contendo a sequência de nucleotídeos dos códons de parada e a sequência de nucleotídeos dos sítios de multiclonagem (MCS) foi artificialmente sintetizado. A SEQ ID NO: 3 (Figura 8) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro de DNA #2. Fragmento de DNA #3: Fragmento de DNA para IL15LSP e CCL19

[00146] Um fragmento de DNA (fragmento de DNA #3) contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo 2A (F2A) que é um peptídeo de autoclivagem, peptídeo de sinal IL-2 de camundongo (IL-2SP), construto IL-15 de camundongo “IL15LSP” (peptídeo de fusão que consiste em IL-15LSP e IL-15), F2A, e camundongo CCL19 foram artificialmente sintetizados. A SEQ ID NO: 4 (Figura 9) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro de DNA #3. Na SEQ ID NO: 4, as bases nas posições 7 a 81 formam uma sequência que codifica o primeiro F2A, as bases nas posições de 82 a 168 formam uma sequência que codifica o camundongo IL-15LSP, as bases nas posições de 169 a 567 formam uma sequência que codifica o camundongo IL-15 (excluindo os códons de parada), as bases nas posições de 568 a 642 formam uma sequência que codifica o segundo F2A, e as bases nas posições de 646 a 969 formam uma sequência que codifica o camundongo CCL19. A SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira que é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 969 do fragmento de DNA #3, autocliva em dois sítios de F2A, e contém IL15LSP.

51 / 76 Etapa 2: Produção do vetor de expressão de retrovírus

[00147] O fragmento de DNA #1 e o fragmento de DNA #2 foram ligados para produzir um construto (CAR_MCS de CD20 anti-humano). O construto obtido foi incorporado em um vetor de expressão do retrovírus pMSGV (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) através do tratamento por enzima de restrição (Nco I e Sal I), para produzir um vetor de expressão de retrovírus pMSGV contendo CAR_MCS de CD20 anti-humano.

[00148] Depois, a sequência de nucleotídeos nas posições de 1337 a 1637 do fragmento de DNA #1 e fragmento de DNA #3 foram ligadas para produzir um construto. O construto obtido foi incorporado em um vetor retroviral pMSGV contendo CAR_MCS de CD20 anti-humano através do tratamento enzimático de restrição (Sbf I e Sal I), para produzir um vetor de expressão do retrovírus pMSGV contendo CAR_F2A_IL15LSP_F2A_CCL19 de CD20 anti-humano (Vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano). [B: Etapa de produção da célula de T CAR] Produção de células T CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano Etapa 1: Preparação do retrovírus

[00149] Usando Lipofectamina 3000 (disponível da Thermo Fisher SCIENTIFIC K.K.), o vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano obtido pela etapa de produzir vetor foi transfectada na linhagem celular de empacotamento GP2-293 (Takara Bio Inc.) junto com o plasmídeo pCL-Eco (Novus Biologicals, LLC). DMEM com 10% de FBS desativado e antibióticos adicionados foi usado como uma solução de cultura para a linhagem celular de empacotamento GP2-293. 48 horas depois da transfecção, o sobrenadante da solução de cultura da linhagem celular de empacotamento GP2-293 foi coletado, para formar uma preparação do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti- humano.

52 / 76 Etapa 2: Transdução das células T de camundongo

[00150] 3 × 106 células T de camundongo derivadas do baço de camundongo e linfônodos e purificadas foram ativadas por 48 horas na presença de um anticorpo monoclonal CD3 anticamundongo imobilizado (3 µg/mL), um anticorpo monoclonal CD28 anticamundongo (1 µg/mL), e IL-2. Subsequentemente, o vetor de expressão da preparação contendo CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano (sobrenadante de cultura celular GP2- 293) obtido na etapa 1 e as células T de camundongos ativadas como descrito acima foram misturados dentro dos poços de uma placa em que 25 µg/mL de retronectina é imobilizada (marca registrada: Takara Bio Inc.), seguido pela centrifugação a 1500 rpm por 2 horas, e a mistura foi cultivada por 6 horas na presença de IL-2. De modo a remover o retrovírus da solução de cultura, as células T de camundongo foram coletadas, transferidas a um novo meio de RPMI completo contendo IL-2, e novamente cultivadas por 42 horas, para obter as células T de camundongo (células T CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, em seguida indicadas como “células T CAR IL15LSP × CCL19”) com um vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano introduzido, isto é, expressando um CAR de CD20 anti-humano, IL15LSP, e CCL19.

[00151] O “meio de RPMI completo” usado para cultivar as células T foi um meio de RPMI-1640 ao qual FBS a 10% desativado, antibióticos, 50- mM de 2-mercapto etanol, e 25-mM de tampão de HEPES foram adicionados. Um meio de RPMI completo ao qual os componentes separadamente descritos foram novamente adicionados, como necessário, foi usado abaixo como uma solução de cultura para as células T. [Exemplo 1-2] sIL15RA (proteína de fusão IL-15/IL-15RA secretora) × células T CAR de CCL19 [A: Etapa de produzir o vetor] Produção do vetor de expressão de CAR de CD20 sIL15RA_CCL19_anti-humano

53 / 76

[00152] Usar o mesmo fragmento de DNA #1 e fragmento de DNA #2 como na etapa 1 do Exemplo 1-1 e fragmento de DNA #4 como descrito abaixo, ao invés do fragmento de DNA #3, um construto foi produzido da mesma maneira como na etapa 2 do Exemplo 1-1, para obter um vetor de expressão de retrovírus pMSGV contendo CAR_F2A_sIL15RA_F2A_CCL19 de CD20 anti-humano (Vetor de expressão de CAR de CD20 sIL15RA_CCL19_anti-humano).

Fragmento de DNA #4: Fragmento de DNA para sIL15RA e CCL19

[00153] Um fragmento de DNA (fragmento de DNA #4) contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica F2A, camundongo IL-2SP, um construto de camundongo IL-15 “sIL15RA” (peptídeo de fusão que consiste em IL-15, um conector, e o domínio extracelular IL-15Rα), F2A, e CCL19 de camundongo foram sintetizados. A SEQ ID NO: 6 (Figura 10) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro de DNA #4. Na SEQ ID NO: 6, as bases nas posições de 7 a 81 formam uma sequência que codifica o primeiro F2A, as bases nas posições de 82 a 141 formam uma sequência que codifica a IL-2SP de camundongo, as bases nas posições de 142 a 1137 formam uma sequência que codifica sIL15RA (entre estas, as bases nas posições de 142 a 540 codificam a IL-15 de camundongo (excluindo as sequências de sinal e códons de parada), as bases nas posições de 541 a 618 servem como um conector, e as bases nas posições de 619 a 1137 codificam o domínio extracelular IL-15Rα de camundongo), as bases nas posições de 1138 a 1212 formam uma sequência que codifica o segundo F2A, e as bases nas posições de 1216 a 1539 formam uma sequência que codifica o CCL19 de camundongo. A SEQ ID NO: 7 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira que é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1539 do fragmento de DNA #4, autocliva nos dois sítios de F2A, e contém sIL15RA.

54 / 76 [B: Etapa de produção da célula T CAR] Produção de células T CAR de CD20 sIL15RA_CCL19_anti-humanos

[00154] Uma preparação contendo retrovírus foi obtida na etapa 1 da mesma maneira como na etapa que produz a célula T CAR do Exemplo 1-1 exceto que o vetor de expressão de CAR de CD20 sIL15RA_CCL19_anti- humano obtido através a etapa de produção de vetor acima mencionada foi usado como um vetor de expressão de retrovírus, ao invés do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, para obter as células T de camundongos expressando os genes de CAR de CD20 anti- humano, sIL15RA, e CCL19 contidos no retrovírus (células T CAR de CD20 sIL15RA_CCL19_anti-humano, em seguida indicadas como células T CAR de sIL15RA × CCL19) na etapa 2. [Exemplo 1-3] mbIL15RA (proteína de fusão IL-15/IL-15RA ligada à membrana) × células T CAR de CCL19 [A: Etapa de produção de vetor] Produção de Vetor de expressão de CAR de CD20 mbIL15RA_CCL19_anti-humano

[00155] Usando o mesmo fragmento de DNA #1 e o fragmento de DNA #2 como na etapa 1 do Exemplo 1-1 e o fragmento de DNA #5 como descrito abaixo, ao invés do fragmento de DNA #3, um construto foi produzido da mesma maneira como na etapa 2 do Exemplo 1-1, para obter um vetor de expressão de retrovírus pMSGV de CD20 contendo CAR_F2A_mbIL15RA_F2A_CCL19 anti-humano (Vetor de expressão de CAR de CD20 mbIL15RA_CCL19_anti-humano). Fragmento de DNA #5: Fragmento de DNA para mbIL15RA e CCL19

[00156] Um fragmento de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica F2A, IL-2SP de camundongo, um construto de IL- 15 de camundongo “mbIL15RA” (peptídeo de fusão que consiste em IL-15, um conector, e IL-15Rα de comprimento total), F2A, e CCL19 de camundongo

55 / 76 foram sintetizados. A SEQ ID NO: 8 (Figura 11) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro de DNA #5. Na SEQ ID NO: 8, as bases nas posições de 7 a 81 formam uma sequência que codifica a primeira F2A, as bases nas posições de 82 a 141 formam uma sequência que codifica a IL-2SP de camundongo, as bases nas posições de 142 a 1311 formam uma sequência que codifica mbIL15RA (entre estas, as bases nas posições de 142 a 540 codificam a IL-15 de camundongo (excluindo as sequências de sinal e os códons de parada), as bases nas posições de 541 a 618 servem como um conector, e as bases nas posições de 619 a 1311 codificam a IL-15Rα de camundongo (comprimento total)), as bases nas posições de 1312 a 1386 formam uma sequência que codifica a segunda F2A, e as bases nas posições de 1390 a 1713 formam uma sequência que codifica o camundongo CCL19. A SEQ ID NO: 9 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira que é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1713 de fragmento de DNA #5, autocliva nos dois sítios de F2A, e contém mbIL15RA.

[B: Etapa de produção celular de T CAR] A produção de células T CAR de CD20mbIL15RA_CCL19_anti-humano

[00157] Uma preparação contendo retrovírus foi obtida na etapa 1 da mesma maneira como na etapa de produção da célula de T CAR do Exemplo 1-1 exceto que o vetor de expressão de CAR de CD20 mbIL15RA_CCL19_anti- humano obtido através da etapa de produção do vetor acima mencionado foi usado como um vetor de expressão de retrovírus, ao invés do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, para produzir as células T de camundongo expressando os genes de CAR de CD20 anti- humano, mbIL15RA, e CCL19 contidos no retrovírus (células T CAR de CD20 mbIL15RA_CCL19_anti-humano, em seguida indicada como “células T CAR mbIL15 × CCL19”) na etapa 2. [Exemplo 1-4] sushiIL15 (proteína de fusão de IL-15RA/IL-15

56 / 76 secretória) × células T CAR de CCL19 [A: Etapa de produção de vetor] Produção de vetor de expressão de CD20 CAR sushiIL15_CCL19_anti-humano

[00158] Usando o mesmo fragmento de DNA 1 e o fragmento de DNA 2 como na etapa 1 do Exemplo 1-1 e o fragmento de DNA #6 como descrito abaixo, ao invés o fragmento de DNA #3, um construto foi produzido da mesma maneira como na etapa 2 do Exemplo 1-1, para obter um vetor de expressão do retrovírus pMSGV contendo CAR_F2A_sushiIL15_F2A_CCL19 da CD20 anti-humano (Vetor de expressão de CAR da CD20 sushiIL15_CCL19_anti-humano). Fragmento de DNA #6: Fragmento de DNA para sushiIL15 e CCL19

[00159] Um fragmento de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica F2A, um construto de IL-15 de camundongo “sushiIL15” (peptídeo de fusão que consiste no domínio sushi IL-15Rα, um conector, e IL-15), F2A, e CCL19 de camundongo foi sintetizado. A SEQ ID NO: 10 (Figura 12) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro de DNA #6. Na SEQ ID NO: 10, as bases nas posições de 7 a 81 formam uma sequência que codifica a primeira F2A, as bases nas posições de 82 a 777 formam uma sequência que codifica sushiIL15 (entre estas, as bases nas posições de 82 a 375 codificam o SP e o domínio sushi do camundongo IL- 15Rα, as bases nas posições de 376 a 435 servem como um conector, e as bases nas posições de 436 a o 777 codificam o IL-15 de camundongo (excluindo as sequências de sinal e propeptídeos)), as bases nas posições de 778 a 852 formam uma sequência que codifica o segundo F2A, e as bases nas posições de 856 a 1179 formam uma sequência que codifica o CCL19 de camundongo. A SEQ ID NO: 11 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira que é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1179 de fragmento de DNA #6, autocliva em dois sítios de

57 / 76 F2A, e contém sushiIL15. [B: Etapa de produção da célula T CAR] Produção de células T CAR de CD20 sushiIL15_CCL19_anti-humano

[00160] Uma preparação contendo retrovírus foi obtida na etapa 1 da mesma maneira como na etapa de produção de célula de T CAR do Exemplo 1-1 exceto que o vetor de expressão de CAR de CD20 sushiIL15_CCL19_anti- humano obtido através da etapa de produção de vetor acima mencionada foi usada como um vetor de expressão de retrovírus, ao invés do vetor de expressão de CAR de CD20IL15LSP_CCL19_anti-humano, para obter as células T de camundongo expressando os genes de CAR de CD20 anti- humano, sushiIL15, e CCL19 contidos nos retrovírus (células T CAR de CD20 sushiIL15_CCL19_anti-humano, em seguida indicado como “células T CAR de sushiIL15 × CCL19”) na etapa 2. [Exemplo 2] células T CAR de IL-18 × CCL19 [A: Etapa de produção do vetor] Produção do vetor de expressão de CAR de CD20 IL18_CCL19_anti-humano

[00161] Usando o mesmo fragmento de DNA 1 e fragmento de DNA 2 como na etapa 1 do Exemplo 1-1 e o fragmento de DNA #7 como descrito abaixo, ao invés do fragmento de DNA #3, um construto foi produzido da mesma maneira como na etapa 2 do Exemplo 1-1, para obter um vetor de expressão do retrovírus pMSGV contendo CAR_F2A_IL-18_F2A_CCL19 de CD20 anti-humano (Vetor de expressão de CAR de CD20 IL18_CCL19_anti- humano). Fragmento de DNA #7: Fragmento de DNA para IL-18 e CCL19

[00162] Um fragmento de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro F2A, IL-18 de camundongo, o segundo F2A, e o CCL19 camundongo foi artificialmente sintetizado. A SEQ ID NO: 12 (Figura 13) mostra a sequência de nucleotídeos inteira do fragmento de

58 / 76 DNA #7. Na SEQ ID NO: 12, as bases nas posições de 7 a 81 formam uma sequência que codifica o primeiro F2A, as bases nas posições de 82 a 657 formam uma sequência que codifica o IL-18 de camundongo, as bases nas posições de 658 a 732 formam uma sequência que codifica o segundo F2A, e as bases nas posições de 736 a 1059 formam uma sequência que codifica o CCL19 de camundongo. A SEQ ID NO: 13 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira que é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1059 do fragmento de DNA #7 e auto cliva nos dois sítios de F2A. [B: Etapa de produção da célula de T CAR] Produção das células T CAR de CD20 IL18_CCL19_anti-humano

[00163] Uma preparação contendo retrovírus foi obtida na etapa 1 da mesma maneira como na etapa de produção da célula de T CAR do Exemplo 1-1 exceto que o vetor de expressão de CAR de CD20 IL18_CCL19_anti- humano obtido pela etapa de produção de vetor acima mencionada foi usado como um vetor de expressão de retrovírus, ao invés do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, para obter as células T de camundongo que expressam os genes de CAR de CD20 anti-humano, IL-18, e CCL19 contidos no retrovírus (células T CAR de CD20 IL18_CCL19_anti- humano, em seguida indicadas como “células T CAR IL18 × CCL19”) na etapa 2. [Exemplo 3] Células T CAR de IL-21 × CCL19 [A: Etapa de produção do vetor] Produção do vetor de expressão de CAR de CD20 IL21_CCL19_anti-humano

[00164] Usando o mesmo fragmento de DNA 1 e o fragmento de DNA 2 como na etapa 1 do Exemplo 1-1 e o fragmento de DNA #8 como descrito abaixo, ao invés do fragmento de DNA #3, um construto foi produzido da mesma maneira como na etapa 2 do Exemplo 1-1, para obter um vetor de expressão do retrovírus pMSGV contendo o CAR de CD20 anti-

59 / 76 humano_F2A_IL-21_F2A_CCL19 (Vetor de expressão de CAR de CD20 IL21_CCL19_anti-humano). Fragmento de DNA #8: Fragmento de DNA para IL-21 e CCL19

[00165] Um fragmento de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro F2A, IL-21 de camundongo, o segundo F2A, e CCL19 de camundongo foi artificialmente sintetizado. A SEQ ID NO: 14 (Figura 14) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro do DNA #8. Na SEQ ID NO: 14, as bases nas posições de 7 a 81 formam uma sequência que codifica o primeiro F2A, as bases nas posições de 82 a 567 formam uma sequência que codifica o camundongo IL-21, as bases nas posições de 568 a 642 formam uma sequência que codifica o segundo F2A, e as bases nas posições de 646 a 969 formam uma sequência que codifica CCL19 de camundongo. A SEQ ID NO: 15 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 969 do fragmento de DNA #8 e autocliva nos dois sítios de F2A. [B: Etapa de produção da célula de T CAR] Produção de células T CAR de CD20 IL21_CCL19_anti-humano

[00166] Uma preparação contendo retrovírus foi obtida na etapa 1 da mesma maneira como na etapa de produção da célula de T CAR do Exemplo 1-1 exceto que o vetor de expressão de CAR de CD20 IL21_CCL19_anti- humano obtido pela etapa de produção de vetor acima mencionada foi usado como um vetor de expressão de retrovírus, ao invés do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, para obter as células T de camundongo expressando os genes de CAR de CD20 anti-humano, IL-21, e CCL19 contidos no retrovírus (células T CAR de CD20 IL21_CCL19_anti- humano, em seguida indicadas como “células T CAR IL21 × CCL19”) na etapa 2.

60 / 76 [Exemplo 4] Células T CAR scIL27 × CCL19 [A: Etapa de produção de vetor] Produção do vetor de expressão de CAR de CD20 scIL27_CCL19_anti-humano

[00167] Usando o mesmo fragmento de DNA 1 e fragmento de DNA 2 como na etapa 1 do Exemplo 1-1 e o fragmento de DNA #9 como descrito abaixo, ao invés do fragmento de DNA #3, um construto foi produzido da mesma maneira como na etapa 2 do Exemplo 1-1, para obter um CAR de vetor de expressão do retrovírus pMSGV contendo CD20 anti- humano_F2A_scIL-27_F2A_CCL19 (Vetor de expressão de CAR de CD20scIL27_CCL19_anti-humano). Fragmento de DNA #9: Fragmento de DNA para scIL27 e CCL19

[00168] Um fragmento de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro F2A, um construto de IL-27 de camundongo “scIL27” (peptídeo de fusão que consiste em p28, um conector, e EBI3), o segundo F2A, e CCL19 foram artificialmente sintetizados. A SEQ ID NO: 16 (Figura 15) mostra a sequência de nucleotídeos do fragmento inteiro de DNA #9. Na SEQ ID NO: 16, as bases nas posições de 7 a 81 formam uma sequência que codifica o primeiro F2A, as bases nas posições de 82 a 1437 formam uma sequência que codifica scIL27 (entre estas, as bases nas posições 82 a 765 codificam o camundongo EBI3, as bases nas posições de 766 a 819 servem como um conector, e as bases nas posições 820 a 1437 codificam o camundongo p28), as bases nas posições de 1438 a 1512 formam uma sequência que codifica o segundo F2A, e as bases nas posições de 1516 a 1839 formam uma sequência que codifica camundongo CCL19. A SEQ ID NO: 17 mostra a sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1839 de fragmento de DNA #9, autocliva nos dois sítios de F2A, e contém scIL27. [B: Etapa de produção da célula de T CAR] Etapa de produção

61 / 76 da célula de T CAR de CD20 scIL27_CCL19_anti-humano

[00169] Uma preparação contendo retrovírus foi obtida na etapa 1 da mesma maneira como na etapa de produção da célula de T CAR do Exemplo 1-1 exceto que o vetor de expressão de CAR de CD20 scIL27_CCL19_anti- humano obtido pela etapa de produção de vetor acima mencionada foi usado como um vetor de expressão de retrovírus, ao invés do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, para obter as células T de camundongo que expressam os genes de CAR de CD20 anti-humano, scIL27, e CCL19 contidos no retrovírus (células T CAR de CD20 scIL27_CCL19_anti-humano, em seguida indicadas como “células T CAR scIL27 × CCL19”) na etapa 2. [Exemplo Comparativo 1] Transdução das células T (-)

[00170] As células T de camundongo que foram somente ativadas (em seguida indicadas como “células T (-) de transdução”) foram produzidas pelo mesmo procedimento exceto que a produção do vetor retroviral e a transeção nas células T usando o vetor retroviral não foram realizados, e uma quantidade equivalente de um meio de DMEM usado para a cultura de célula GP2-293 foi adicionada, ao invés da preparação do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, na etapa 2 da etapa B do Exemplo 1-1. [Exemplo Comparativo 2] Células T CAR conv. [A: Etapa de produção do vetor] Produção do vetor de expressão de CAR de CD20 anti-humano

[00171] Um CAR de vetor de expressão do retrovírus pMSGV contendo CD20 anti-humano_MCS foi produzido usando o fragmento de DNA 1, fragmento de DNA 2, e o vetor retroviral de pMSGV através do mesmo procedimento como no meio da etapa 2 de A do Exemplo 1-1. Isto foi usado como um vetor de expressão do retrovírus de controle (vetor de expressão de CAR de CD20 anti-humano) que não coexpressa as citocinas e

62 / 76 quimiocinas. [B: Etapa de produção da célula de T CAR] Produção de células T CAR de CD20 anti-humano

[00172] Uma preparação contendo retrovírus foi obtida na etapa 1 da mesma maneira como na etapa de produção da célula de T CAR do Exemplo 1-1 exceto que um vetor de expressão de CAR de CD20 anti-humano foi usado como um vetor de expressão de retrovírus, ao invés do vetor de expressão de CAR de CD20 IL15LSP_CCL19_anti-humano, para obter as células T de camundongo expressando apenas o CAR de CD20 anti-humano contido no retrovírus (não expressando as citocinas e quimiocinas) (as células T CAR de CD20 anti-humano, em seguida indicado como “células T CAR conv.”) na etapa 2. [Exemplo Experimental 1] Confirmação do nível de expressão de CAR, citocina, e quimiocina introduzidos [A: Medição da expressão de CAR através da citometria de fluxo]

[00173] Usando as células T produzidas nos Exemplos e Exemplos Comparativos acima, o nível de expressão do CAR de CD20 anti-humano na superfície celular foi analisado através da citometria de fluxo, como descrito abaixo.

[00174] Um citômetro de fluxo “BD FACSCanto® II” (BD Biosciences) foi usado para a citometria de fluxo, e um software FlowJo (BD Biosciences) foi usado para a análise de dados.

[00175] As células T foram tratadas usando uma proteína L rotulada com biotina (que especificamente se aglutina à cadeia leve κ de scFv de CD20 anti-humano) e Brilliant Violet® 421 estreptavidina ligada a (BV421), para detectar a expressão de CAR. Ao mesmo tempo, a taxa de CD8 positiva em cada população da célula T foi medida usando um anticorpo monoclonal de CD8 anticamundongo ligado à aloficocianina (APC) (BioLegend). Visto

63 / 76 que as células T positivas para CD8 são geralmente consideradas ter uma atividade citotóxica direta, a presença (taxa positiva) das células T positivas para CD8 podem suportas a potência.

[00176] A Figura 1 mostra os resultados. Foi confirmado que 60% ou mais da população celular das células T CAR em todos os Exemplos (e Exemplo Comparativo 2) expressados (isto é, foram positivos para) o CAR de CD20 anti-humano. [B: Medição das quantidades de citocina e quimiocina secretadas]

[00177] Os sobrenadantes de cultura das células T foram coletados 42 horas depois da transdução, as concentrações de IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, e CCL19 foram medidas usando um kit ELISA comercialmente disponível (disponível da MBL apenas para IL-18, e R&D systems para os outros).

[00178] A Figura 2 mostra os resultados. Para IL-15 (Figura 2A), IL- 15 foi detectado em uma concentração de 250 pg/mL do sobrenadante de cultura das células T CAR do Exemplo 1-1 (15LSP x 19 T CAR). Enquanto isso, as concentrações de IL-15 nos sobrenadantes de cultura das células T CAR do Exemplo 1-2 (s15RA x 19 T CAR), Exemplo 1-3 (mb15RA x 19 T CAR), e Exemplo 1-4 (sushi15 x 19 T CAR) foram similares àquelas das células T ativadas não transduzidas (transdução (-): Exemplo Comparativo 1) e as células T de CAR expressando CD20 anti-humano (T CAR conv.: Exemplo Comparativo 2) como um controle, e nenhuma secreção de IL-15 foi observada pelo kit ELISA usado no Exemplo Experimental 1. Contudo, visto que o Exemplo 1-2, Exemplo 1-3, e Exemplo 1-4 apresentaram um efeito de proliferação celular notável no Exemplo Experimental 2, que será descrito abaixo, é entendido que a IL-15 foi expressada e secretada nestes exemplos bem como no Exemplo 1-1.

[00179] Para IL-18 (Figura 2B), IL-18 foi detectado em uma concentração de 150 pg/mL ou mais a partir do sobrenadante de cultura das

64 / 76 células T CAR do Exemplo 2 (18 x 19 T CAR). Enquanto isso, a quantidade secretada das Células T de CAR expressando CD20 anti-humano (T CAR conv.: Exemplo Comparativo 2) como um controle no sobrenadante de cultura foi tão pequena quanto a das células T não transduzidas ativadas (transdução (-): Exemplo Comparativo 1).

[00180] Para IL-21 (Figura 2C), a IL-18 foi detectada em uma concentração de 400 pg/mL ou mais a partir do sobrenadante de cultura das células T CAR do Exemplo 3 (21 x 19 T CAR). Enquanto isso, a quantidade secretada de CAR expressando as Células T de CD20 anti-humano (T CAR conv.: Exemplo Comparativo 2) como um controle estava abaixo do limite de detecção (Não detectada) bem como das células T não transduzidas ativadas (transdução (-): Exemplo Comparativo 1).

[00181] Para a IL-27 (Figura 2D), p28 que é uma subunidade da IL-27 foi detectada em uma concentração de 250 pg/mL ou mais a partir do sobrenadante de cultura das células T CAR do Exemplo 4 (sc27 x 19 T CAR). Enquanto isso, a quantidade secretada das células T CAR de CD20 anti- humano (T CAR conv.: Exemplo Comparativo 2) como um controle foi similar àquela das células T não transduzidas ativadas (transdução (-): Exemplo Comparativo 1) (em uma concentração de cerca de 50 pg/mL no sobrenadante de cultura).

[00182] Para CCL19 (Figura 2E), enquanto as concentrações no sobrenadante de culturas das células T CAR de CD20 anti-humano (T CAR conv.: Exemplo Comparativo 2) como um controle e as células T ativadas não transduzidas (transdução (-): Exemplo Comparativo 1) estavam abaixo do limite de detecção, as concentrações no sobrenadante de cultura das células T CAR dos Exemplos foram de 150 a 500 pg/mL.

[00183] [Exemplo Experimental 2] Avaliação da capacidade proliferativa in vitro das células T CAR

[00184] Usar as células T produzidas nos Exemplos e Exemplos

65 / 76 Comparativos acima, se ou não cada citocina produzida das células T (IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27) exerceram funções biológicas e apresentaram efeitos imunoindutores foi determinado medindo-se o número e a capacidade proliferativa das células T CAR, como segue.

[00185] As células T foram tingidas com CytoTell® UltraGreen (AAT Bioquest) e depois cocultivadas no mesmo poço que aquelas do mastocitoma P815 (hCD20/P815) tratado com mitomicina C e geneticamente transformado para expressar a CD20 humana, seguido pelo estímulo. Depois de cultivar por 3 dias, 5 dias, ou 7 dias a partir do início do estímulo, as células foram coletadas e analisadas através da citometria de fluxo. As células foram tingidas com um anticorpo monoclonal anti-Thy1,2 ligado à APC (eBioscience), e o número de células positivas para Thy1,2 na população de células T (linfócito) foi contado como células T sobreviventes.

[00186] A Figura 3 mostra os resultados. As células T (-) de transdução (Exemplo Comparativo 1) não foram submetidas ao estímulo de ativação mesmo quando cocultivadas com asa células hCD20/P815, e o número de células vivas foi de 1/10 ou menos no dia 3 da cultura. Enquanto isso, foi confirmado no dia 3 da cultura que a proliferação no número de células vivas equivalentes a ou maiores que as Células T CAR conv. (Exemplo Comparativo 2) como um controle foi mantido nas células T CAR de IL15LSP × CCL19 (Exemplo 1-1), as células T CAR sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo 1-4), as células T CAR de IL-18 × CCL19 (Exemplo 2), as células T CAR de IL-21 × CCL19 (Exemplo 3), e as células T CAR de scIL27 × CCL19 (Exemplo 4), que foram cocultivadas com as células hCD20/P815. Além disso, quando a cultura foi continuada até o dia 7, as células T CAR de sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), e as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo 1-4) especialmente apresentaram uma proliferação celular notável.

66 / 76 As células T CAR IL15LSP × CCL19 (Exemplo 1-1), as células T CAR de IL- 18 × CCL19 (Exemplo 2), as células T CAR de IL-21 × CCL19 (Exemplo 3), e as células T CAR de scIL27 × CCL19 (Exemplo 4) mantiveram o número das células equivalentes às células T CAR conv. (Exemplo Comparativo 2) como um controle do dia 3 ao dia 7 da cultura.

[00187] Além disso, a análise do histograma da intensidade do tingimento com um reagente CytoTell na população celular positiva para Thy1,2 foi realizada. A Figura 4 mostra os resultados para cada população celular 5 dias depois do início do estímulo. Nas células T CAR de IL15LSP × CCL19 (Exemplo 1-1), as células T CAR de sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1- 2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo 1-4), as células T CAR de IL-18 × CCL19 (Exemplo 2), e as células T CAR de IL-21 × CCL19 (Exemplo 3), a proporção da população celular da segunda geração (depois de uma divisão) especialmente diminuiu e a proporção da população celular depois da quinta geração (depois de quatro ou mais divisões) aumentou, se comparada com as células T CAR conv. (Exemplo Comparativo 2) como um controle.

[00188] A partir dos resultados mostrados na Figura 3 e Figura 4, foi verificado que as combinações da proteína de fusão IL-15/IL-15Rα e CCL-19 produzidas nas células T CAR de sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), e as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo de 1 a 4) foram especialmente preferíveis para promover a sobrevivência e a proliferação das células T CAR e exercer as funções biológicas. [Exemplo Experimental 3] Avaliação da atividade citotóxica de tumor das células T CAR

[00189] Usando as células T produzidas nos Exemplos e Exemplos Comparativos acima, a atividade citotóxica de tumor específica ao antígeno alvo foi examinada.

67 / 76 [A: Medição da atividade citotóxica de tumor através da citometria de fluxo]

[00190] Os mastocitomas P815 (hCD20/P815) geneticamente transformados para expressar a CD20 humana foram usados como células de tumor alvo, e os mastocitomas P815 (P815) que não foram geneticamente transformados como acima foram usados como células tumorais de controle.

[00191] Depois das células de tumor alvo ou células de tumor de controle serem coletadas e semeadas em uma placa de cultura, as células T CAR dos Exemplos (as células T CAR de IL15LSP × CCL19 (Exemplo 1-1), as células T CAR sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo 1-4), as células T CAR de IL-18 × CCL19 (Exemplo 2), as células T CAR de IL-21 × CCL19 (Exemplo 3), e as células T CAR de scIL27 × CCL19 (Exemplo 4)), ou as células T CAR do Exemplo Comparativo 2 (células T CAR conv.) foram adicionadas a esta como células T efetoras, e as células foram cocultivadas por 72 horas. As células T efetoras foram adicionadas de modo que o número de células positivas para CAR fosse de 1/3 das células de tumor alvo (razão de E:T = 1:3), e o número total das células T semeadas foi ajustado para ser o mesmo em cada grupo adicionando-se, de acordo com o número de células T semeadas com a taxa de expressão de CAR mais baixa, as células T não transduzidas para os outros grupos de célula T. Depois de cocultivar por 72 horas, todas as células foram coletadas, analisadas por citometria de fluxo, e medidas quanto o número de células vivas. As células foram tingidas com um anticorpo monoclonal anti- Thy1,2 ligado a APC (eBioscience) e um Zombie Green Fixable Viability Kit (BioLegend), e as proporções das células T e as células tumorais na população celular viva foram calculadas a partir da taxa positiva de Thy1.2. O número de células vivas foi medido usando NucleoCounter NC-200 (chemometec).

68 / 76

[00192] A Figura 5 mostra os resultados. Como mostrado na Figura 5A, o número de células tumorais de hCD20/P815 depois da cocultura por 72 horas foi calculado a partir da taxa negativa de Thy1.2 nas células vivas. Como um resultado, o número de células tumorais de hCD20/P815 cocultivadas com cada uma das células T CAR de IL15LSP × CCL19 (Exemplo 1-1), as células T CAR sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo 1-4), as células T CAR de IL-18 × CCL19 (Exemplo 2), as células T CAR de IL-21 × CCL19 (Exemplo 3), ou as células T CAR de scIL27 × CCL19 (Exemplo 4) diminuíram significantemente se comparado com as células T (-) de transdução (Exemplo Comparativo 1) e também diminuíram ainda mais se comparado com as células T CAR conv. (Exemplo Comparativo 2), e as células tumorais sobreviventes foram de 1% ou menos. Enquanto isso, nenhuma diminuição nas células tumorais, as células P815 que não expressando CD20 humana, foram observadas em qualquer grupo, como mostrado na Figura 5B, e nenhuma citotoxicidade não específica às células tumorais que não expressam a CD20 humana foi confirmada. [B: Medição da produção de IFNγ através do ensaio ELISA]

[00193] Como um índice de ativação da capacidade citotóxica específica ao antígeno alvo, a interferon γ (IFNγ) produzida a partir das células T CAR foi medida usando um kit de ensaio ELISA comercialmente disponível (R&D). As células T CAR dos Exemplos (as células IL15LSP × CCL19 de T CAR (Exemplo 1-1), as células T CAR de sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo 1-4), as células T CAR de IL- 18 × CCL19 (Exemplo 2), as células T CAR de IL-21 × CCL19 células T CAR (Exemplo 3), e as células T CAR scIL27 × CCL19 (Exemplo 4)), ou as células T CAR do Exemplo Comparativo 2 (células T CAR conv.) foram cocultivadas com as células P815 (células de controle tumoral) ou células

69 / 76 hCD20-P815 (células de tumor alvo) para medir a quantidade de IFNγ no sobrenadante de cultura 4 dias depois da cocultura.

[00194] A Figura 6 mostra os resultados. Como mostrado na Figura 6A, o nível de IFNγ foi maior que nas células T CAR conv. (Exemplo Comparativo 2), e cerca de 15 ng/mL ou mais de IFNγ foi detectado no sobrenadante de cultura de qualquer uma das células T CAR de IL15LSP × CCL19 (Exemplo 1-1), as células T CAR de sIL15RA × CCL19 (Exemplo 1- 2), as células T CAR de mbIL15RA × CCL19 (Exemplo 1-3), as células T CAR de sushiIL15 × CCL19 (Exemplo 1-4), as células T CAR de IL-18 × CCL19 (Exemplo 2), as células T CAR de IL-21 × CCL19 (Exemplo 3), ou as células T CAR de scIL27 × CCL19 (Exemplo 4), que foram cocultivadas com as células hCD20-P815. A quantidade de IFNγ produzida nos grupos cocultivados com as células T (-) de transdução (Exemplo Comparativo 1) estava abaixo do limite de detecção. Enquanto isso, a concentração de IFNγ no sobrenadante de cultura das células que expressam CAR células cocultivadas com as células P815 foi de 10 pg/mL ou menos, como mostrado na Figura 6B.

[00195] A partir dos resultados acima do Exemplo Experimental 3 (Figura 5 e Figura 6), foi confirmado que todas as células T dos Exemplos e Exemplo Comparativo 2 apresentaram uma célula que expressa CD20 humana, isto é, atividade citotóxica específica de antígeno alvejado.

[00196] [Exemplo Experimental 4] Efeito terapêutico nos modelos tumorais de camundongo

[00197] O efeito terapêutico das células T produzido no Exemplo de 1 a 3, Exemplo 1 a 4, e Exemplo Comparativo 2 em um modelo de transplante de tumor de melanoma em camundongo ou um modelo de tumor colorretal em camundongo foi examinado usando os seguintes camundongos que carregam câncer. (Efeito terapêutico no modelo de transplante de tumor de

70 / 76 melanoma em camundongo)

[00198] 5 × 105 de melanomas de camundongo B16F10 geneticamente transformados para expressar a CD20 humana (B16F10-hCD20) foram subcutaneamente inoculados em camundongos C57BL/6N. Um agente anticâncer, ciclofosfamida (CPA, 50 mg/kg), foi intraperitonealmente administrado no dia 7 depois da inoculação, e 1 × 106 das células T CAR do Exemplo 1-3 (T CAR de mbIL15RAxCCL19), as células T CAR do Exemplo 1- 4 (T CAR de sushiIL15xCCL19), ou as células do Exemplo Comparativo 2 (T CAR conv.) foram intravenosamente administradas no dia 10. Como grupos de controle, um grupo não tratado de T CAR com administração apenas de CPA e um grupo inoculado com melanoma de camundongo B16F10-hCD20 e em seguida os não tratados foram determinados. O volume de tumor nos camundongos foi medido duas vezes por semana.

[00199] A Figura 16 mostra os resultados do volume de tumor do modelo de transplante de tumor de melanoma em camundongo. O eixo geométrico horizontal indica o número de dias depois da inoculação com o dia no qual o B16F10-hCD20 foi subcutaneamente inoculado nos camundongos tomado como dia 0, e o eixo geométrico vertical indica o volume de tumor (diâmetro maior de tumor × (diâmetro menor de tumor)2/2 (mm3)). O desvio padrão foi calculado em cada grupo experimental. “Nenhum tratamento” significa um grupo não tratado, “CPA” significa um grupo com apenas a administração de CPA, “CPA + Conv.” significa um grupo com a administração de CPA e a subsequente administração do Exemplo Comparativo 2 (T CAR Conv.), “CPA+mbIL15RAx19” significa um grupo com a administração de CPA e a subsequente administração das células T CAR do Exemplo de 1 a 3 (mbIL15RAxCCL19 T CAR), e “CPA+sushiIL15RAx19” significa um grupo com a administração de CPA e a subsequente administração das células T CAR do Exemplo 1-4 (T CAR de sushiIL15xCCL19).

71 / 76

[00200] Como mostrado na Figura 16, o efeito de reduzir o volume do tumor foi confirmado nos grupos com a administração das células T CAR do Exemplo 1-3 (T CAR de mbIL15RAxCCL19) e as células T CAR do Exemplo 1-4 (T CAR de sushiIL15RAxCCL19), como comparado com os grupos com a administração do Exemplo Comparativo 2 (T CAR conv.), os grupos não tratados (nenhum tratamento), e os grupos apenas com a administração de CPA. Portanto, foi verificado que as células T CAR do Exemplo 1-3 (T CAR de mbIL15RAxCCL19) e as células T CAR do Exemplo 1-4 (T CAR sushiIL15xCCL19) tiveram excelentes atividades antitumor no modelo de tumor de melanoma do camundongo. (Efeito terapêutico no modelo de transplante de tumor de câncer colorretal em camundongos)

[00201] 5 × 105 de câncer colorretal MC38 em camundongos (MC38-hCD20) geneticamente transformados para expressar a CD20 humana foram subcutaneamente inoculados em camundongos C57BL/6N. Um agente anticâncer, ciclofosfamida (CPA, 50 mg/kg), foi intraperitonealmente administrado no dia 7 depois da inoculação, e 1 × 106 das células T CAR do Exemplo 1-3 (T CAR de mbIL15RAxCCL19), as células T CAR do Exemplo 1- 4 (T CAR de sushiIL15xCCL19), ou as células do Exemplo Comparativo 2 (T CAR conv.) foram intravenosamente administradas no dia 10. Como grupos de controle, um grupo não tratado com T CAR com somente a administração de CPA e um grupo inoculado com câncer colorretal de camundongo MC38- hCD20 e, em seguida, os não tratados foram determinados. O volume de tumor nos camundongos foi medido duas vezes por semana.

[00202] A Figura 17 mostra os resultados do volume de tumor do modelo de transplante de tumor colorretal de câncer em camundongos. O eixo geométrico horizontal indica o número de dias depois da inoculação com o dia em que MC38-hCD20 foi subcutaneamente inoculado nos camundongos considerados como dia 0, e o eixo geométrico vertical indica o volume de

72 / 76 tumor (diâmetro de tumor maior × (diâmetro de tumor menor)2/2 (mm3)). O desvio padrão foi calculado em cada grupo experimental. “sem tratamento” significa um grupo não tratado, “CPA” significa um grupo com apenas a administração de CPA, “CPA+Conv.” significa um grupo com a administração de CPA e a administração subsequente do Exemplo Comparativo 2 (T CAR Conv.), “CPA+mbIL15RAx19” significa um grupo com a administração de CPA e a subsequente administração das células de T CAR do Exemplo 1-3 (mbIL15RAxCCL19 T CAR), e “CPA+sushiIL15RAx19” significa um grupo com a administração de CPA e a subsequente administração das células de T CAR do Exemplo 1-4 (T CAR de sushiIL15xCCL19).

[00203] Como mostrado na Figura 17, o efeito de reduzir o volume de tumor foi confirmado nos grupos com a administração das células de T CAR do Exemplo 1-3 (mbIL15RAxCCL19 T CAR) e as células de T CAR do Exemplo 1-4 (sushiIL15RAxCCL19 T CAR), se comparado com os grupos com a administração do Exemplo Comparativo 2 (T CAR Conv.), os grupos não tratados (sem tratamento), e os grupos com apenas a administração de CPA. Portanto, foi verificado que as células de T CAR do Exemplo 1-3 (T CAR de mbIL15RAxCCL19) e as células de T CAR do Exemplo 1-4 (T CAR de sushiIL15xCCL19) tiveram excelentes atividades antitumor também no modelo de câncer colorretal camundongos.

[00204] Nos Exemplos e Exemplos Experimentais acima, as células T derivadas de camundongo, uma citocina (proteína de fusão com IL-15 ligada à IL-15Rα ou os semelhantes) e uma quimiocina (CCL19) cada contendo a sequência de aminoácidos natural de camundongo, foram usadas, e os testes in vivo nos camundongos foram conduzidos. Contudo, aqueles versados na técnica seriam capazes de entender que, também nas modalidades relacionadas aos mamíferos outros que não camundongos, preferivelmente os humanos, isto é, no caso de usar as células T derivadas de humanos, uma

73 / 76 citocina (proteína de fusão com IL-15 ligada à IL-15Rα ou os semelhantes), e uma quimiocina (CCL19) cada contendo a sequência de aminoácidos natural humana ou testes in vivo nos humanos foram conduzidos, a presente invenção pode ser realizada da mesma maneira, e a ação e efeito da presente invenção seria exercida.

[00205] Por exemplo, a proteína de fusão contendo IL15LSP que foi realizada (produzida e usada) usando a sequência de aminoácidos natural de camundongo mostrada na SEQ ID NO: 5 pode ser realizada usando a sequência de aminoácidos nas posições de 1 a 29 (porção de peptídeo de sinal) e 49 a 162 (porção de IL-15) na sequência de aminoácidos natural humana para IL-15 mostrada na SEQ ID NO: 18 ou usando ácidos nucléicos tendo a sequência de nucleotídeos que codifica tal sequência de aminoácidos.

[00206] A proteína de fusão contendo sIL15RA que foi realizada usando a sequência de aminoácidos naturais de camundongo mostrada na SEQ ID NO: 7 pode ser realizada usando a sequência de aminoácidos nas posições 49 a 162 (porção de IL-15) na sequência de aminoácidos natural humana para IL- 15 mostrada na SEQ ID NO: 18 e a sequência de aminoácidos nas posições de 31 a 205 (domínio extracelular IL-15Rα) na sequência de aminoácidos natural humana para IL-15Rα mostrada na SEQ ID NO: 19 ou usando ácidos nucléicos tendo a sequência de nucleotídeos que codifica tais sequências de aminoácidos.

[00207] A proteína de fusão contendo mbIL15RA que foi realizada usando a sequência de aminoácidos natural de camundongo mostrada na SEQ ID NO: 9 pode ser realizada usando a sequência de aminoácidos nas posições de 49 a 162 (porção IL-15) na sequência de aminoácidos natural humana para IL-15 mostrada na SEQ ID NO: 18 e a sequência de aminoácidos nas posições de 1 a 267 (comprimento total da IL-15Rα) na sequência de aminoácidos natural humana para IL-15Rα mostrada na SEQ ID NO: 19 ou usando ácidos nucléicos tendo a sequência de nucleotídeos que codifica tais

74 / 76 sequências de aminoácidos.

[00208] A proteína de fusão contendo sushiIL15 que foi realizada usando a sequência de aminoácidos natural de camundongo mostrada na SEQ ID NO: 11 pode ser realizada usando a sequência de aminoácidos nas posições 49 a 162 (porção de IL-15) na sequência de aminoácidos natural humana para IL- 15 mostrada na SEQ ID NO: 18 e a sequência de aminoácidos nas posições 31 a 95 (domínio sushi) na sequência de aminoácidos natural humana para IL- 15Rα mostrada na SEQ ID NO: 19 ou usando ácidos nucléicos tendo a sequência de nucleotídeos que codifica tal sequência de aminoácidos. Aplicabilidade Industrial

[00209] As células de T CAR de acordo com a presente invenção que são excelentes na persistência e proliferação são adequadamente usadas para produzir um medicamento para tratar o câncer ou outros. Além disso, o vetor de expressão de acordo com a presente invenção é adequadamente usado para produzir as células de T CAR. Texto livre de listagem de sequências SEQ ID NO: 1: Sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA contendo um CAR de CD20 anti-humano (fragmento de DNA #1) SEQ ID NO: 2: Sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão expressada pela a sequência de nucleotídeos nas posições de 3 a 1637 do fragmento de DNA #1 SEQ ID NO: 3: Sequência de nucleotídeos de um fragmento MCS de DNA que codifica os códons de parada e sítios de enzima de restrição (fragmento de DNA #2) SEQ ID NO: 4: Sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA IL15LSP_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #3) SEQ ID NO: 5: Sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 969 do fragmento de DNA #3, autocliva nos dois sítios de F2A, e

75 / 76 contém IL15LSP SEQ ID NO: 6: Sequência de aminoácidos do fragmento de DNA sIL15RA_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #4) SEQ ID NO: 7: Sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1539 do fragmento de DNA #4, autocliva em dois sítios F2A diferentes, e contém sIL15RA SEQ ID NO: 8: Sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA de mbIL15RA_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #5) SEQ ID NO: 9: Sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1713 do fragmento de DNA #5, autocliva em dois sítios de F2A, e contém mbIL15RA SEQ ID NO: 10: Sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA sushiIL15_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #6) SEQ ID NO: 11: Sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1179 do fragmento de DNA #6, autocliva em dois sítios de F2A, e contém sushiIL15 SEQ ID NO: 12: Sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA IL-18_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #7) SEQ ID NO: 13: Sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1059 do fragmento de DNA #7 e autocliva em dois sítios de F2A SEQ ID NO: 14: Sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA IL-21_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #8) SEQ ID NO: 15: Sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 969 do fragmento de DNA #8 e autocliva em dois sítios de F2A

76 / 76

SEQ ID NO: 16: fragmento de DNA scIL27_F2A_CCL19

(fragmento de DNA #9) SEQ ID NO: 17: Sequência de aminoácidos da proteína de fusão inteira a qual é expressada pela sequência de nucleotídeos nas posições de 7 a 1839 do fragmento de DNA #9, autocliva em dois sítios de F2A, e contém scIL27 SEQ ID NO: 18: Sequência de aminoácidos de IL-15 natural humana (comprimento total incluindo o peptídeo de sinal e as partes de propeptídeo) registrada como UniProtKB-P40933 SEQ ID NO: 19: Sequência de aminoácidos de IL-15Rα natural humana (comprimento total incluindo o peptídeo de sinal, domínio sushi, domínio extracelular, etc.) registrada como UniProtKB-Q13261

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula T, caracterizada pelo fato de que expressa: (1) um receptor de antígeno quimérico (CAR); (2) pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em interleucina-15 (IL-15), interleucina-18 (IL-18), interleucina-21 (IL-21), e interleucina-27 (IL-27); e (3) ligante de quimiocina CC 19 (CCL19).

2. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o (2) é IL-15.

3. Célula T de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a IL-15 é ligada à IL-15Rα para formar uma proteína de fusão.

4. Célula T de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15LSP ligada à IL-15 (IL15LSP), uma proteína de fusão compreendendo o domínio extracelular de IL-15Rα ligado à IL-15 (sIL15RA), uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligada à IL-15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL-15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

5. Célula T de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligada à IL-15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL-15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

6. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende a célula T como definida na reivindicação 1.

7. Medicamento de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento é um agente terapêutico para o câncer.

8. Medicamento de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma ou leucemia.

9. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) um ácido nucléico que codifica um CAR; (2) um ácido nucléico que codifica pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em IL-15, IL-18, IL-21, e IL-27; e (3) um ácido nucléico que codifica CCL19.

10. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o (2) é IL-15.

11. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a IL-15 é ligada à IL-15Rα para formar uma proteína de fusão.

12. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15LSP ligada à IL-15 (IL15LSP), uma proteína de fusão compreendendo um domínio extracelular de IL-15Rα ligado à IL-15 (sIL15RA), uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligada à IL-15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL- 15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

13. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo IL-15 ligada à IL-15Rα de comprimento total (mbIL15RA), ou uma proteína de fusão compreendendo IL-15Rα contendo um peptídeo de sinal e um domínio sushi ligado à IL-15 (sushiIL15).

14. Método para produzir uma célula de T CAR, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de introduzir o vetor de expressão como definido na reivindicação 9 em uma célula T.

15. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de administrar a célula T como definida na reivindicação 1 a um indivíduo em necessidade de tratamento para câncer.

16. Método para tratar de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar da célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma, ou leucemia.

17. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para o uso como um componente ativo para tratamento de câncer.

18. Célula T de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer da célula de Merkel, câncer colorretal, câncer renal, câncer mamário, câncer ovariano, câncer da trompa de falópio, câncer cervical, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer pulmonar da célula não pequena, câncer de cabeça e pescoço, câncer do intestino delgado, câncer prostático, câncer de bexiga, câncer retal, câncer pancreático, sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, câncer nasofaríngeo, câncer esofágico, câncer do trato biliar, neuroblastoma, osteossarcoma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma ou leucemia.

transdução T CAR conv.

Petição 870210018669, de 25/02/2021, pág. 93/110

T CAR T CAR T CAR T CAR 1/16

T CAR T CAR T CAR

Petição 870210018669, de 25/02/2021, pág. 94/110 Não detectado trans- trans- T CAR trans- T CAR

T CAR dução dução T CAR dução T CAR

T CAR T CAR T CAR T CAR 2/16 T CAR trans- T CAR trans- dução T CAR T CAR T CAR dução T CAR

T CAR T CAR T CAR T CAR transdução Petição 870210018669, de 25/02/2021, pág. 95/110

T CAR

T CAR células vivas (linfócitos Thy1.2)

T CAR

T CAR 3/16 dias

T CAR

Células de tumor hCD20/P815 depois de 72 horas cocultura com células T CAR Número de células de tumor células trans- T CAR dução T CAR T CAR T CAR

T CAR T CAR T CAR T CAR Células de tumor P815 depois de 72 horas Número de células de tumor cocultura com células T CAR células trans- T CAR dução T CAR T CAR T CAR

T CAR T CAR T CAR T CAR

Células de tumor hCD20/P815 depois de 72 horas cocultura com células T CAR trans- T CAR dução T CAR T CAR T CAR

T CAR T CAR T CAR T CAR Células de tumor P815 depois de 72 horas cocultura com células T CAR trans- T CAR dução T CAR T CAR T CAR

T CAR T CAR T CAR T CAR

Fragmento de DNA DC20 CAR anti-humano (fragmento de DNA #1)

CD20 scFv anti-humano

3º domínio TM (CD8)

domínio CP

SEQ ID NO: 3: fragmento de DNA MCS codificando códons de parada e sítios de enzima de restrição (fragmento de DNA #2)

códon de parada

SEQ ID NO: 4: fragmento de DNA de IL15LSP¬_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #3)

peptídeo de sinal longo de IL-15 de camundongo

IL-15 de camundongo

CCL19 de camundongo códon de parada

SEQ ID NO: 6: fragmento de DNA de sIL15RA¬_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #4)

peptídeo de sinal de IL-2 de camundongo

IL-15 de camundongo conector de 26aa domínio extracelular de IL-15RA de camundongo

CCL19 de camundongo códon de parada

SEQ ID NO: 8: fragmento de DNA de mbIL15RA_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #5)

peptídeo de sinal de IL-2 de camundongo

IL-15 de camundongo conector de 26aa

IL-15RA de camundongo

CCL19 de camundongo códon de parada

SEQ ID NO: 10: fragmento de DNA de sushiIL15_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #6)

IL-15RAsushi de camundongo conector 26aa

IL-15 de camundongo

CCL19 de camundongo códon de parada

SEQ ID NO: 12: fragmento de DNA de IL18_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #7)

IL-21 de camundongo

CCL19 de camundongo códon de parada

SEQ ID NO: 14: fragmento de DNA de IL21_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #8)

IL-21 de camundongo

CCL19 de camundongo códon de parada

SEQ ID NO: 16: fragmento de DNA de scIL27_F2A_CCL19 (fragmento de DNA #9)

EBI3 de camundongo conector 18aa

CCL19 de camundongo códon de parada dias após a inoculação T CAR Conv. nenhum tratamento volume do tumor dias após a inoculação T CAR Conv. nenhum tratamento volume do tumor