KR20230147619A - 외인적으로 도입된 사이토카인을 발현하는 조작된 면역이펙터 세포 - Google Patents

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KR20230147619A
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polypeptide
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샤오후 판
지에 마오
퀴우추안 주앙
창지앙 장
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난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디.
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Abstract

본 출원은 면역 이펙터 세포를 제공하며, 상기 면역 이펙터 세포는 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛; 외인적으로 도입된 CCR7의 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21); 및 기능적 외인성 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체)를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.

Description

외인적으로 도입된 사이토카인을 발현하는 조작된 면역 이펙터 세포
1. 관련 출원의 상호참조
본 출원은 2021년 2월 26일에 제출된 국제 특허 출원번호 PCT/CN2021/078227의 우선권을 주장하는 바, 그 모든 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
2. 서열목록
본 출원은 본 출원과 함께 제출된 서열목록을 참조로 포함하며, 상기 서열목록은 텍스트 형식이고, 제목은 “14651-039-228_SEQ_LISTING.txt”이며, 2022년 2월 18일에 생성되었고, 크기는 145,395 바이트이다.
3. 기술분야
본 출원은 기능적 외인성 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체)를 포함하는 폴리펩티드, 조작된 면역 이펙터 세포, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 본 출원은 또한 치료 용도를 위한 세포의 활성화 및 증폭에 관한 것으로, 특히 키메라 항원 수용체를 기반으로 한 T 세포 면역 요법에 관한 것이다.
4. 배경기술
조작된 면역 이펙터 세포의 입양 전이는 새로운 혁신적인 치료 전략을 나타낸다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작된 T 세포는 혈액암 환자에서 효과적인 임상 반응을 유도하여 통상적인 치료법에 비해 양호한 예후를 보였다. 그러나, 저효율적인 생체 내 생존, 내인성 면역 세포의 불충분한 활성화, 면역 억제 미세 환경, T 세포 고갈 및 질환 조직 침윤의 어려움은 CAR-T 세포가 특정 질환에 도전적인 일반적인 이유이다. 따라서, 당업계에는 질환 또는 병증을 치료하기 위해 개선된 구축물 또는 CAR-T 세포와 같은 조작된 면역 이펙터 세포가 여전히 필요하다.
5. 발명의 내용
일 양태에서, 본원은 면역 이펙터 세포를 제공하며, 상기 면역 이펙터 세포는, 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛; 외인적으로 도입된 CCR7의 리간드(예를 들어CCL-19 및 CCL-21); 및 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원은 면역 이펙터 세포를 제공하며, 상기 면역 이펙터 세포는, 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛; 외인적으로 도입된 CCL-19; 및 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원은 면역 이펙터 세포를 제공하며, 상기 면역 이펙터 세포는, 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛; 외인적으로 도입된 CCL-21; 및 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, p40은 인간 p40 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시예에서, p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 막 결합된 폴리펩티드(예를 들어, MB12)이다.
일부 실시예에서, CCL-19는 인간 CCL-19 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시예에서, CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, CCL-21은 인간 CCL-21 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시예에서, CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 TCR(cTCR), 또는 T 세포 항원 접합체(TAC) 유사 키메라 수용체이다. 일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 CAR이다.
일부 실시예에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 막관통 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 면역 이펙터 세포의 1차 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 1차 세포내 신호 전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 상기 세포내 신호 전달 도메인은 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 공동자극 신호 전달 도메인은 공동자극 분자로부터 유래되고, 상기 공동자극 분자는 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 공동자극 신호 전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 및/또는 CD137의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포이다.
다른 실시예에서, 본원은 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는, 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛; 외인적으로 도입된 CCR7의 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21); 및 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원은 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는, 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛; 외인적으로 도입된 CCL-19; 및 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
다른 실시예에서, 본원은 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는, 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛; 외인적으로 도입된 CCL-21; 및 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, p40은 인간 p40 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시예에서, p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 막 결합된 폴리펩티드(예를 들어, MB12)이다.
일부 실시예에서, CCL-19는 인간 CCL-19 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시예에서, CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, CCL-21은 인간 CCL-21 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시예에서, CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 TCR(cTCR), 또는 T 세포 항원 접합체(TAC) 유사 키메라 수용체이다. 일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 CAR이다.
일부 실시예에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 막관통 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 면역 이펙터 세포의 1차 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 1차 세포내 신호 전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 상기 세포내 신호 전달 도메인은 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 공동자극 신호 전달 도메인은 공동자극 분자로부터 유래되고, 상기 공동자극 분자는 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 공동자극 신호 전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 및/또는 CD137의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체폴리펩티드의 N-말단에 위치한 신호 펩티드를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시예에서, p40, CCL-19 및 기능적 외인성 수용체는 펩티드 링커를 통해 서로 연결된다. 일부 실시예에서, p40, CCL-21 및 기능적 외인성 수용체는 펩티드 링커를 통해 서로 연결된다. 일부 실시예에서, 상기 펩티드 링커는 2A 자가 절단 펩티드이고, 상기 2A 자가 절단 펩티드는 F2A, E2A, P2A, T2A 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택된다. 일부 특정 실시예에서, 상기 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 P2A 단편이다. 일부 특정 실시예에서, 상기 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 T2A 단편이다.
일부 실시예에서, p40 및 CCL-19는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 존재한다. 다른 실시예에서, p40 및 CCL-19는 도메인에 존재하고, 상기 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, p40 및 CCL-21은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 존재한다. 다른 실시예에서, p40 및 CCL-21은 도메인에 존재하고, 상기 도메인은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 단리된 핵산을 제공하며, 상기 단리된 핵산은 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 단리된 핵산을 제공하며, 상기 단리된 핵산은, 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛을 코딩하는 제1 영역; 외인적으로 도입된 CCR7의 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21)를 코딩하는 제2 영역; 및기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제3 영역을 포함하고, 상기 기능적 외인성 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, CCR7의 리간드는 CCL-19이다. 다른 실시예에서, CCR7의 리간드는 CCL-21이다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 의해 제공되는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 면역 이펙터 세포의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은, (i) 본원에 의해 제공되는 핵산 또는 벡터; 또는 (ii) 각각 IL-12의 p40 서브유닛, CCL-19 중 하나 또는 둘을 코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하는 조성물; 및 기능적 외인성 수용체, 또는 각각 IL-12의 p40 서브유닛, CCL-21 중 하나 또는 둘을 코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하는 조성물; 및 기능적 외인성 수용체 를 면역 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본원은 본원에 의해 제공되는 방법에 따라 생성된 면역 이펙터 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 본원에 의해 제공되는 면역 이펙터 세포, 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 피험자의 질환 또는 병증에 대한 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 피험자에게 유효량의 본원에 의해 제공되는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
6. 도면의 간단한 설명
도 1은 H93 CAR, H93M CAR, 및 H93P CAR의 구조를 나타낸다. SP는 신호 펩티드를 의미한다. TM은 막관통 도메인을 의미한다. TAA 결합 단백질은 종양 관련 항원의 항원 결합 도메인 또는 결합 단백질(즉, 항-GPC3 scFv)을 의미한다.
도 2는 인간화 항-GPC3 scFv CAR을 발현하는 H93 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포의 양성률을 나타낸다. UnT는 CAR로 형질도입되지 않은 T 세포를 의미한다.
도 3a-3b는 정상 조건(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)에서 배양된 CAR-T 세포의 IL-23(도 3a) 및 CCL-19(도 3b) 단백질의 생성을 나타낸다.
도 4a-4b는 재유발(rechallengey) 측정에서 CAR-T 세포의 증폭을 나타낸다. 세포를 2일마다 1:1 E/T 비율로 PLC/PRF/5 세포로 밤새 자극하였다. 각 라운드가 끝날 때 T 세포의 증폭 배수(도 4a) 및 생존력(도 4b)를 기록하였다.
도 5a-5c는 재유발 측정에서 상이한 자극 라운드로 처리한 후 1:1 E/T 비율에서 GPC3 양성 세포주에 대한 CAR-T 세포의 시험관 내 세포 독성(도 5a), TNF-α 방출 수준(도 5b) 및 IFN-γ 방출 수준(도 5c)을 나타낸다.
도 6은 재유발 측정에서 상이한 자극 라운드로 처리한 후 CAR-T 세포의 양성률을 나타낸다.
도 7a-7d는 재유발 측정에서 각각의 자극 라운드 24시간 후 CAR-T 세포에서 PD-1(도 7a 및 도 7b) 및 LAG3(도 7c 및 도 7d)의 발현을 나타낸다.
도 8a-8b는 96-웰 트랜스웰 챔버를 통해 수행된 CAR-T 세포의 세포 이동 측정을 나타낸다. 상이한 CAR-T 세포와 PLC/PRF/5 세포를 1:1 E/F 비율로 30시간 동안 공동 배양하고, 세포 배양 상등액을 수집하여 하부 챔버에 첨가하였다. 4, 6, 8시간 후 상부 챔버로부터 이동한 하부 챔버의 T 세포의 수(도 8a), 및 공동 배양 상등액에서의 CCL-19의 농도(도 8b)를 정량화하였다.
도 9a-9d는 NCG 마우스 이종 이식 모델에서 CAR-T 세포의 항종양 작용을 나타낸다. NCG 마우스에 Huh7 세포를 피하 접종하고, 0.2 M 용량 및 0.6 M 용량의 CAR-T 세포로 처리(i.v.)(군당 n = 4 마리 마우스)하였다. 종양 부피(도 9a 및 도 9b) 및 NCG 마우스 말초 혈액의 게놈 DNA에서 CAR 복제 수(도 9c 및 도 9d)를 평가하였다.
도 10a-10b는 NCG 마우스 이종 이식 모델에서 0.2 M(도 10a) 및 0.6 M(도 10b) 용량의 CAR-T 세포로 처리된 마우스(군당 n = 4 마리 마우스)의 체중 변화를 나타낸다.
도 11a-11d는 0.2 M 또는 0.6 M 용량의 CAR-T 세포로 처리된 NCG 마우스 말초 혈액에서 IL-23 단백질(도 11a 및 도 11b) 및 IFN-γ 단백질(도 11c 및 도 11d)의 수준(군당 n = 3 마리 마우스)을 나타낸다.
도 12는 NCG 마우스 이종 이식 모델에서 동물 실험 종점(n = 3)에서 0.2 M UnT, H93 CAR-T 세포 또는 H93M CAR-T 세포로 처리된 마우스의 종양 조직 내 T 세포의 침윤 상황을 나타낸다. 종양 조직을 포르말린으로 고정하고, 파라핀에 포매하여 면역 조직 화학(IHC)에 사용하여 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)으로 염색된 T 세포의 침윤 상황을 검출하였다. 3D HISTECH(DRNJIER)를 통해 이미지를 획득하였다. 오른쪽 열은 검은색 직사각형의 확대 영역을 나타낸다.
도 13은 NCG 마우스 이종 이식 모델에서 0.2 M UnT, H93 CAR-T 세포 또는 H93M CAR-T 세포로 처리한 후 종양 조직에서 마우스 대식세포 및 마우스 수지상 세포의 모집 상황을 나타낸다. 동물 실험의 종점에서, 종양 조직을 포르말린으로 고정하고,파라핀에 포매하여 면역 조직 화학(IHC)에 사용하였다. CD68을 갖는 대식세포(왼쪽 열) 및 CD11c를 갖는 수지상 세포(오른쪽 열)를 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)으로 염색하였다. 3D HISTECH(DRNJIER)를 통해 이미지를 획득하였다.
도 14는 인간화 항-GPC3 scFv CAR을 발현하는 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포 및 H93P CAR-T 세포의 양성률을 나타낸다.
도 15a-15b는 재유발 측정 결과를 나타낸다. 각 라운드가 끝날 때 CAR-T 세포의 증폭 배수(도 15a)를 기록하였다. 도 15b는 재유발 측정에서 상이한 자극 라운드로 처리한 후 총 T 세포와 표적 세포의 비율이 1:2일 때 GPC3 양성 세포주에 대한 CAR-T 세포의 시험관 내 세포 독성을 나타낸다.
도 16은 96-웰 트랜스웰 챔버를 통해 수행된 CAR-T 세포의 세포 이동 측정을 나타낸다. 상이한 CAR-T 세포와 PLC/PRF/5 세포를 1:1 E/T 비율로 30시간 동안 공동 배양하고, 세포 배양 상등액을 수집하여 하부 챔버에 첨가하였다. 2, 4 및 6시간 후 상부 챔버로부터 이동한 하부 챔버의 T 세포의 수를 정량화하였다.
도 17a-17b는 NCG 마우스 이종 이식 모델에서 CAR-T 세포의 항종양 작용을 나타낸다. NCG 마우스에 GPC3+ Hep3B 세포를 피하 접종하고, 두 가지 용량의 CAR-T 세포 : 0.3 M CAR+ T 세포/마우스 및 0.8M CAR+ T 세포/마우스를 주입(i.v.)(군당 n = 4 마리 마우스)하였다.
도 18a-18c는 NCG 마우스 이종 이식 모델에서 CAR-T 세포의 항종양 작용을 나타낸다. NCG 마우스에 Hep3B 세포를 피하 접종하고, 0.3 M 용량의 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포, H93IL12p40 CAR-T 세포 또는 H93CCL19 CAR-T 세포로 처리(i.v.)(군당 n = 4 마리 마우스)하였다. 종양 부피(도 18a), NCG 마우스 말초 혈액에서 CD3 양성 세포율(도 18b) 및 체중(도 18c)을 평가하였다.
도 19a-19d는 C57BL/6 마우스 이종 이식 모델에서 CAR-T 세포의 항종양 작용을 나타낸다. C57BL/6 마우스에 LL/2-hGPC3 세포를 피하 접종하고, 각각 10 M, 6 M, 6 M 및 6 M 용량의 musH93 CAR-T 세포, musH93M CAR-T 세포, musH93IL12p40 CAR-T 세포 및 musH93CCL19 CAR-T 세포로 처리(i.v.)(군당 n = 5 마리 마우스)하였다. 종양 부피(도 19a), C57BL/6 마우스 말초 혈액에서 CAR+CD3+의 비율(도 19b) 및 체중(도 19c)을 평가하고, 생존율(%)(도 19d)을 계산하였다.
도 20a-20b는 261 CAR-T 세포 및 261M CAR-T 세포가 CLDN18.2+NUGC4 세포와 밤새 공동 배양된 후 IL-23(도 20a) 및 CCL-19(도 20b) 단백질의 생성을 나타낸다.
도 21a-21c는 261 CAR-T 세포 및 261M CAR-T 세포의 재유발 측정 결과를 나타낸다. 기존의 조건(10%1640 + 300 IU IL-2)(도 21a) 및 재유발 측정에서(도 21b)의 CAR-T 세포의 증폭 배수의 비교는 261M CAR-T 세포가 NUGC4 세포에 의해 여러 번 유발된 후 항원 의존적 증폭을 나타냄을 보여준다. 도 21c는 재유발 측정에서 여러 자극 라운드로 처리한 후 CAR-T 세포의 세포 생존력을 나타낸다.
도 22a-22d는 NCG 마우스 이종 이식 모델에서 261 CAR-T 세포 및 261M CAR-T 세포의 항종양 작용을 나타낸다. NCG 마우스에 NUGC4 세포를 피하 접종하고, 0.5 M 용량의 CAR-T 세포로 처리(i.v.)(군당 n = 4 마리 마우스)하였다. 종양 부피(도 22a 및 B), NCG 마우스 말초 혈액에서 CD3 양성 세포의 비율(도 22c) 및 체중(도 22d)을 평가하였다.
도 23a-23b는 C57BL/6 마우스 이종 이식 모델에서 mus261M CAR-T 세포 및 mus261-719 CAR-T 세포의 항종양 작용을 나타낸다. C57BL/6 마우스에 LL/2-hCLDN18.2 세포를 피하 접종하고, 10 M 용량의 마우스 CAR-T 세포로 처리(i.v.)(군당 n = 4 마리 마우스)하였다. 종양 부피(도 23a) 및 체중(도 23b)을 평가하였다.
도 24a-24b는 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포의 CAR 양성률(도 24a) 및 IL12p40 양성률(도 24b)을 나타낸다.
도 25a-25b는 항-CD3/CD28 비드로 밤새 자극한 후 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포의 IL12p40(도 25a), IL-23(도 25b), CCL-19(도 25c), IL-12(도 25d) 단백질의 생성을 나타낸다.
도 26a-26b는 96-웰 트랜스웰 챔버를 통해 수행된 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포의 세포 이동 측정을 나타낸다. 상이한 CAR-T 세포와 PLC/PRF/5 세포를 1:1 E/F 비율로 24시간 동안 공동 배양하고, 세포 배양 상등액을 수집하여 하부 챔버에 첨가하였다. 2, 4, 6시간 후 상부 챔버로부터 이동한 하부 챔버의 T 세포의 수(도 26a), 및 공동 배양 상등액에서 CCL-19의 농도(도 26b)를 정량화하였다.
도 27a-27c는 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포의 재유발 측정 결과를 나타낸다. 도 27a 및 도 27b는 기존의 조건(10% 1640 + 300 IU IL-2) 및 재유발 측정에서 CAR-T 세포의 증폭 배수를 나타낸다. 도 27c는 재유발 측정에서 여러 자극 라운드로 처리한 후 CAR-T 세포의 CAR 양성 변화를 나타낸다.
도 28a-28b는 재유발 측정에서 상이한 자극 라운드로 처리한 후 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포의 시험관 내 사이토카인 분비, TNF-α 방출 수준(도 28a) 및 IFN-γ 방출 수준(도 28b)을 나타낸다.
7. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 출원은 하나 이상의 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR) 및 외인적으로 도입된 p40 및 CCR7 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21)를 발현하는 조작된 면역 세포의 기능 및 성질이 개선된다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다.
7.1. 정의
본원에서 설명되거나 참조된 기술 및 절차는 통상적인 방법을 사용하여 당업자에 의해 전체적으로 잘 이해되거나 및/또는 일반적으로 사용되는 것을 포함하며, 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (제3판 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등 편집, 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An 편집 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar 편집 2010); 및 Antibody Engineering 제1권 및 제2권 (Kontermann 및 D
Figure pct00001
bel 편집, 제2판 2010)에 설명된 널리 사용되는 방법을 포함한다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 본 발명을 해석하기 위해 다음과 같은 용어 설명이 적용되며, 임의의 적절한 경우 단수 형태로 사용되는 용어는 복수 형태로도 포함하며 그 역도 마찬가지이다. 명시된 용어에 대한 임의의 설명이 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 모순되는 경우 아래에 명시된 용어에 대한 설명을 기준으로 한다.
용어 “항체”, “면역글로불린” 또는 “Ig”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 예를 들어 단클론 항체(작동제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 완전 단클론 항체 포함), 다중 에피토프 또는 단일 에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다클론 또는 1가 항체, 다가 항체,적어도 2개의 완전 항체로 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 이중특이성 항체), 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH) 및 이의 단편(예를 들어, 도메인 항체)을 포함한다. 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및/또는 친화성 성숙 항체, 및 다른 종(예를 들어, 마우스, 토끼, 라마 등)으로부터 유래된 항체일 수 있다. 용어 “항체”는 면역글로불린계 폴리펩티드 중의 B 세포의 폴리펩티드 생성물을 포함하는 것으로 의도되며, 이는 특정 분자 항원에 결합할 수 있고 두 쌍의 동일한 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 쌍의 폴리펩티드 사슬은 하나의 중쇄(약 50-70 kDa) 및 하나의 경쇄(약 25 kDa)를 갖고, 각 사슬의 각 아미노 말단 부분은 약 100 내지 약 130 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하며, 각 사슬의 각 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, Antibody Engineering (Borrebaeck 편집, 제2판 1995); 및 Kuby, Immunology (제3판 1997)를 참조할 수 있다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 낙타과 종(예를 들어, 라마 또는 알파카)으로부터 유래된 단일 도메인 항체 또는 이들의 인간화 변이체, 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 어느 하나의 기능성 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이러한 기능성 단편은 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 일부분을 의미하며, 이는 상기 단편이 유래된 항체의 일부 또는 전부 결합 활성을 유지한다. 기능성 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)의 비제한적 구현예는 단일 사슬 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이성, 이중특이성 등 포함), Fab 단편, F(ab’) 단편, F(ab)2단편, F(ab')2단편, 이황화 결합 Fv(dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디를 포함한다. 특히, 본원에 의해 제공되는 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예를 들어, 항원 결합 도메인, 또는 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자(예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR)를 포함한다. 이러한 항체 단편은 예를 들어 Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers 편집, 1995); Huston 등, 1993, Cell Biophysics 22:189-224; Pl
Figure pct00002
ckthun 및 Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515; 및 Day, Advanced Immunochemistry (제2판, 1990)를 참조할 수 있다. 본원에 의해 제공되는 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 항체는 작용성 항체 또는 길항성 항체일 수 있다. 항체는 작용성 항체도 길항성 항체도 아닐 수 있다.
“항원”은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 구조일 수 있다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 자연 발생 또는 합성된 화합물일 수 있다. 일부 실시예에서, 표적 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 항원은 세포와 연관되어 있으며, 예를 들어, 세포 상에 또는 세포 내에 존재한다.
“완전” 항체는 항원 결합 부위뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 영역은 인간 불변 영역 또는 이의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 완전 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
“단일 사슬 Fv”(“sFv” 또는 “scFv”로 약칭됨)는 단일 폴리펩티드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 상기 폴리펩티드 링커는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 한다. sFv에 대한 종합적인 서술은 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 제113권, Rosenburg 및 Moore 편집, Springer-Verlag, New York, 제269-315페이지(1994)를 참조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, “단일 도메인 항체” 또는 “sdAb”는 단일 단량체 가변 항체 도메인을 의미하며 항원에 결합할 수 있다. 단일 도메인 항체는 본 원에 따른VHH 도메인을 포함한다. 단일 도메인 항체의 구현예는 경쇄가 자연적으로 결여된 항체, 예를 들어 낙타과 종(예를 들어, 라마)으로부터 유래된 항체, 통상적인 4쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체, 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의이 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 단일 도메인 항체는 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 과나코와 같은 낙타과 종에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성할 수 있으며; 이러한 다른 종으로부터 유래된 VHH는 본 출원의 범위 내에 있다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 구조를 갖는다. 단일 도메인 항체는 본원에 따른 다른 분자(예를 들어, 제(agent))에 유전적으로 융합되거나 화학적으로 접합될 수 있다. 단일 도메인 항체는 큰 결합 분자(예를 들어, 다중특이성 항체 또는 키메라 항원 수용체)의 일부분일 수 있다.
용어 “결합(binds 또는 binding)”은 예를 들어 복합체 형성을 포함하는 분자 사이의 상호 작용을 의미한다. 상호 작용은 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호 작용 및/또는 반 데르 발스 상호 작용(van der Waals interactions)을 포함하는 비공유 상호 작용일 수 있다. 복합체는 공유 또는 비공유 결합, 상호 작용 또는 힘에 의해 함께 결합되는 2개 이상의 분자의 결합을 포함할 수 있다. 항체 상의 단일 항원 결합 부위와 표적 분자(예를 들어, 항원)의 단일 에피토프 사이의 전체 비공유 상호 작용의 강도는 상기 에피토프에 대한 항체 또는 기능성 단편의 친화력이다. 1가 항원에 대한 결합 분자(예를 들어, 항체)의 해리 속도(koff)와 회합 속도(kon)의 비율(koff/kon)은 해리 상수(KD)이며, 이는 친화력과 반비례한다. KD값이 낮을수록, 항체의 친화력이 높다. KD값은 항체 및 항원의 상이한 복합체에 따라 다르며, kon 및 koff에 의해 결정된다. 본원에 의해 제공되는 항체의 해리 상수(KD)는 본원에 의해 제공되는 임의의 방법 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 결합 부위의 친화력이 항상 항체와 항원 사이의 상호 작용의 실제 강도를 반영하는 것은 아니다. 다수의 반복 항원 결정기를 함유하는 복합 항원(예를 들어, 다가 항원)이 다수의 결합 부위를 함유하는 항체와 접촉할 경우, 하나의 부위에서의 항체와 항원의 상호 작용은 두 번째 부위에서 반응이 일어날 확률을 증가시킨다. 다가 항체와 항원 사이의 이러한 다중 상호 작용의 강도를 친화력이라고 한다.
본원에 따른 결합 분자와 관련하여, “결합”, “ 특이적 결합”과 같은 용어 및 유사한 용어는 또한 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 항원(예를 들어, 폴리펩티드)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 결합 분자를 의미한다. 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 예를 들어 면역 측정, Octet®, Biacore® 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의해 동정될 수 있다. 일부 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인이 임의의 교차 반응성 항원보다 더 높은 치화력으로 항원에 결합할 경우, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 예를 들어 면역 측정법(RIA) 및 효소 결합 면역 흡착 측정법(ELISA)에 의한 측정과 같은 실험 기술에 의해 항원에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 잡음의 적어도 2배이며 배경의 10배 이상일 수 있다. 예를 들어, Fundamental Immunology 332-36 (Paul 편집, 제2판 1989)의 결합 특이성에 관한 논의를 참조할 수 있다. 일부 실시예에서, FACS 분석 또는 RIA에 의해 측정된 바와 같이, “비-표적” 단백질에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합 정도는 특정 표적 항원에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합의 약 10% 미만이다. 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 결합 분자가 예를 들어 항원을 표적으로 하는 치료제 및/또는 진단제로 사용될 수 있도록 충분한 친화력으로 항원에 결합할 수 있는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 1 μM, 800 nM, 600 nM, 550 nM, 500 nM, 300 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM 또는 0.1 nM보다 작거나 같은 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 상이한 종으로부터 유래된 항원에 보존되는 항원 에피토프에 결합한다.
일부 실시예에서, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 “키메라” 서열을 포함할 수 있고, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 가지며, 사슬의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 및 이러한 항체의 단편 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 갖는다(미국 특허 번호 4,816,567 및 Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55 참조). 키메라 서열은 인간화 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 비-인간(예를 들어, 낙타과 동물, 뮤린, 비-인간 영장류 동물) 항체의 “인간화 ” 형태의 부분을 포함할 수 있고, 이러한 비-인간 항체는 인간 면역글로불린(예를 들어, 수용자 항체)으로부터 유래된 서열을 포함하며, 여기서 천연 CDR 잔기는 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 낙타과 동물, 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 동물과 같은 비-인간 종(예를 들어, 공여자 항체)으로부터 유래된 상응하는 CDR의 잔기에 의해 치환된다. 일부 경우, 인간 면역글로불린 서열의 하나 이상의 FR 영역 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 인간화 항체 중쇄 또는 경쇄는 거의 모든 적어도 하나 이상의 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서 모든 또는 거의 모든 CDR은 비-인간면역글로불린의 CDR에 대응되며, 모든 또는 거의 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 일부 실시예에서, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함한다. 자세한 내용은 Jones 등, Nature 321:522-25 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-29 (1988); Presta, Curr.Op.Struct.Biol. 2:593-96 (1992); Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-89 (1992); 미국 특허 번호: 6,800,738, 6,719,971, 6,639,055, 6,407,213, 및 6,054,297을 참조할 수 있다.
일부 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 “완전 인간 항체” 또는 “인간 항체”의 부분을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 인간 가변 영역 및 예를 들어 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 결합 분자는 단일 도메인 항체 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 용어는 인간 유래 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 일부 실시예에서, “완전 인간” 항체는 또한 폴리펩티드에 결합하고 핵산 서열에 의해 코딩되는 항체를 포함할 수 있고, 이러한 핵산 서열은 인간 생식계열 면역글로불린 핵산 서열의 자연 발생 체세포 변이체이다. 용어 “완전 인간 항체”는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 대응되는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하며, 예를 들어 Kabat 등(Kabat 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242 참조)에 의해 설명되어 있다. “인간 항체”는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 대응되는 아미노산 서열을 갖는 항체 및/또는 인간 항체를 제조하는데 사용되는 임의의 기술을 사용하여 생성된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특별히 배제하였다. 파지 디스플레이 라이브러리(Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581 (1991)) 및 효모 디스플레이 라이브러리(Chao 등, Nature Protocols 1:755-68(2006))를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간 항체를 생성할 수 있다. 또한, Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985); Boerner 등, J. Immunol. 147(1):86-95(1991); 및 van Dijk 및 van de Winkel, Curr.Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)에 설명된 방법도 인간 단클론 항체의 제조에 사용될 수 있다. 인간 항체는 항원 유발에 대한 반응으로 그러한 항체를 생성하도록 변형되었지만 그의 내인성 유전자좌가 비활성화된 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있으며(예를 들어, Jakobovits, Curr.Opin. Biotechnol. 6(5):561-66 (1995); Br
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ggemann 및 Taussing, Curr.Opin. Biotechnol. 8(4):455-58 (1997); 및 XENOMOUSETM 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 인간 B 세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체에 관해서는 예를 들어 Li 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62 (2006)를 더 참조할 수 있다.
일부 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 “재조합 인간 항체”의 부분을 포함할 수 있고, 여기서 상기 어구는 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합된 조합 인간 항체 라이브러리에서 단리된 항체,인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 및/또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)에서 단리된 항체(예를 들어, Taylor, L. D. 등, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 (1992) 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것과 관련된 임의의 다른 방식으로 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같은 재조합 방식으로 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 가질 수 있다(Kabat, E. A. 등(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242 참조). 그러나, 일부 실시예에서, 이러한 재조합 인간 항체에 대해 시험관 내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열의 형질전환 동물을 사용하는 경우, 생체내 체세포 돌연변이 유발을 수행)을 수행하므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되어 있지만 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리에 자연적으로 발생하지 않을 수 있는 서열이다.
일부 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 “단클론 항체”의 일부분을 포함할 수 있고, 여기서 본원에 사용된 용어는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 예를 들어, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 또는 잘 알려진 번역 후 변형(예를 들어, 아미노산 이성체화 또는 탈아미드화, 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아미드화)을 제외하고는 상기 집단을 구성하는 각 항체는 동일하고, 각 단클론 항체는 일반적으로 항원의 단일 에피토프를 인식한다. 특정 실시예에서, 본원에 사용된 “단클론 항체”는 단일 하이브리도마 또는 다른 세포에 의해 생성된 항체이다. 용어 “단클론”은 항체를 제조하는 임의의 특정 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 출원에 사용될 수 있는 단클론 항체는 Kohler 등, Nature 256:495 (1975)에 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 사용하여 박테리아 또는 진핵 동물 또는 식물 세포에서 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). “단클론 항체”는 예를 들어 Clackson 등, Nature 352:624-28 (1991) 및 Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991) 에 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리에서 분리할 수도 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현된 단클론 항체를 제조하는 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등 편집, 제5판, 2002)를 참조할 수 있다.
전형적인 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경(L) 사슬 및 2개의 동일한 중(H) 사슬로 구성된 이종사량체 당단백질이다. IgG의 경우, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소타입에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 사슬 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬 내 이황화 가교를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 하나의 가변 도메인(VH)을 가지며, α 사슬 및 γ 사슬 중 각각의 경우, 그 뒤는 3개의 불변 도메인(CH)이고, μ 이소타입 및 ε 이소타입의 경우, 그 뒤는 4개의 CH 도메인이다. 각각의 L 사슬은 N-말단에서 하나의 가변 도메인(VL)을 가지며 다른 쪽 끝에 하나의 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL과 VH는 정렬되고, CL과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)은 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL은 쌍을 이루어 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스 항체의 구조 및 성질은 예를 들어 Basic and Clinical Immunology 71 (Stites 등 편집, 제8판, 1994) 및 Immunobiology (Janeway 등 편집, 제5판, 2001)를 참조할 수 있다.
용어 “Fab” 또는 “Fab 영역”은 항원에 결합하는 항체 영역을 의미한다. 통상적인 IgG는 일반적으로 2개의 Fab 영역을 포함하며, 각각의 Fab 영역은 Y자형 IgG 구조의 2개의 팔 중 하나에 위치한다. 각각의 Fab 영역은 일반적으로 중쇄 및 경쇄 각자의 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 구성된다. 특히, Fab 영역 중 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VH 영역 및 CH1 영역이고, Fab 영역 중 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VL 영역 및 CL 영역이다. Fab 영역 중의 VH, CH1, VL 및 CL은 본 출원에 따른 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, VH 영역 및 CH1 영역은 하나의 폴리펩티드에 있을 수 있고, VL 영역 및 CL 영역은 별도의 폴리펩티드에 있을 수 있으며, 통상적인 IgG의 Fab 영역과 유사하다. 대안적으로, VH 영역, CH1 영역, VL 영역 및 CL 영역은 모두 동일한 폴리펩티드에 있을 수 있고, 아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 상이한 순서로 배향될 수 있다.
용어 “가변 영역”, “가변 도메인”, “V 영역” 또는 “V 도메인”은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부분을 의미하며, 이는 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 위치하고, 중쇄에는 약 120 내지 130개의 아미노산 및 경쇄에는 약 100 내지 110개의 아미노산의 길이를 가지며, 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 중쇄의 가변 영역은 “VH”로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 영역은 “VL”로 지칭될 수 있다. 용어 “가변”은 가변 영역의 일부 세그먼트가 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 의미한다. V 영역은 항원 결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110개의 아미노산 범위 내에 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 약 15-30개의 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 변화가 적은(예를 들어, 상대적으로 변하지 않음) 세그먼트로 구성되고, 이러한 세그먼트는 각각이 약 9-12개의 아미노산 길이인 “초가변 영역”이라고 하는 변화가 큰(예를 들어, 극단적 변화) 짧은 영역에 의해 분리된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각자는 주로 β 시트 구조를 채택한 4개의 FR을 포함하고, 이들은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되며, 이 3개의 초가변 영역은 루프 연결을 형성하고, 일부 경우 β 시트 구조의 일부분을 형성한다. 각 사슬 중의 초가변 영역은 FR에 의해 긴밀하고 근접하게 함께 결합되고, 다른 사슬로부터 유래된 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 도움이 된다(예를 들어, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest (제5판, 1991) 참조). 불변 영역은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체가 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포 독성(CDC)에 관여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 가변 영역은 상이한 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다. 특정 실시예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
용어 “Kabat에 따른 가변 영역 잔기 넘버링” 또는 “Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링” 및 이의 변형은 상기 Kabat 등에서 항체 편집에 사용된 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 넘버링 시스템을 의미한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 삽입에 대응되는 더 적거나 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 잔기 82 이후에 3개의 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. . 항체 서열과“표준” Kabat 넘버링 서열의 상동성 영역에서의 정렬을 통해 주어진 항체의 잔기의 Kabat 넘버링을 결정할 수 있다. 가변 도메인 중의 잔기(약 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급할 경우, 일반적으로 kabat넘버링 시스템(예를 들어, 상기 Kabat 등)을 사용한다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 중의 잔기를 언급할 경우,일반적으로 “EU 넘버링 시스템” 또는 “EU 인덱스”(예를 들어, 상기 Kabat 등에 보고된 EU 인덱스)를 사용한다. “Kabat 중의 EU 인덱스”는 인간 IgG 1 EU 항체의 잔기 넘버링을 의미한다. 다른 넘버링 시스템은 예를 들어 AbM, Chothia, Contact, IMGT 및 AHon에 의해 설명되었다.
항체를 언급할 경우, 용어 “중쇄”는 약 50-70 kDa의 폴리펩티드 사슬을 의미하며, 여기서 아미노 말단 부분은 약 120 내지 130 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여, 불변 영역은 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 지칭되는 5가지 상이한 유형 (예를 들어, 이소타입) 중 하나일 수 있다. 상이한 중쇄는 크기가 다른데, α, δ 및 γ는 약 450개의 아미노산을 함유하고, μ 및 ε은 약 550개의 아미노산을 함유한다. 경쇄와 조합할 경우, 이러한 상이한 유형의 중쇄는 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM인 5개의 잘 알려진 클래스(예를 들어, 이소타입)의 항체를 생성하고, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4인 IgG의 4개의 서브클래스를 포함한다.
항체를 언급할 경우, 용어 “경쇄”는 약 25 kDa의 폴리펩티드 사슬을 의미하며, 여기서 아미노 말단 부분은 약 100 내지 약 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217개의 아미노산이다. 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 또는 람다(λ)로 지칭되는 2가지 상이한 유형이 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “초가변 영역”, “HVR”, “상보성 결정 영역” 및 “CDR”은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. “CDR”은 면역글로불린(Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 하나, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 하나를 의미한다. VH 도메인 중의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이라고도 한다. VL 도메인 중의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이라고도 한다. 따라서, CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 산재된 가변 영역 서열이다.
CDR 영역은 당업자에게 잘 알려져 있고, 잘 알려진 넘버링 시스템에 의해 정의되었다. 예를 들어, Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며 가장 일반적으로 사용된다 (예를 들어 상기 Kabat 등; Nick Deschacht 등, J Immunol 2010; 184:5696-5704 참조). 대신 Chothia는 구조 루프의 위치를 의미한다 (예를 들어 Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987) 참조). Kabat 넘버링 규칙을 사용하여 넘버링할 경우, Chothia CDR-H1 루프의 말단은 H32와 H34 사이에서 변하는데, 이는 루프의 길이에 의해 결정된다(이는 Kabat 넘버링 방안이 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이며; 35A 및 35B가 모두 존재하지 않으면, 루프는 32에서 종료되고; 35A만 존재하면, 루프는33에서 종료되며; 35A 및 35B가 모두 존재하면, 루프는 34에서 종료됨). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 타협을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다(예를 들어 Antibody Engineering 제2권 (Kontermann 및 D
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bel 편집, 제2판, 2010) 참조). “접촉” 초가변 영역은 사용 가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 개발되어 널리 채택된 또 다른 일반 넘버링 시스템은 ImMunoGeneTics (IMGT) Information System®(Lafranc 등, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))이다. IMGT는 인간 및 다른 척추 동물의 면역글로불린(IG), T 세포 수용체(TCR) 및 주요 조직 적합성 복합체(MHC)를 전문으로 연구하는 종합 정보 시스템이다. 본원에서, CDR은 경쇄 또는 중쇄 내의 아미노산 서열 및 위치를 의미한다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 내에서 CDR의 “위치”는 종 간에 보존되고 루프라는 구조에서 발생하기 때문에, 구조적 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용하여 CDR 및 프레임워크 잔기를 매우 쉽게 인식한다. 상기 정보는 한 종으로부터 유래된 면역글로불린의 CDR 잔기를 일반적으로 인간 항체로부터 유래된 수용자 프레임워크로 이식하고 교체하는데 사용될 수 있다. Honegger 및 Pl
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ckthun, J. Mol. Biol. 309:657-70 (2001)는 다른 넘버링 시스템(AHon)을 개발하였다. 예를 들어 Kabat 넘버링 및 IMGT 고유 넘버링 시스템을 포함한 넘버링 시스템 간의 대응 관계는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어 상기 Kabat; 상기 Chothia 및 Lesk; 상기 Martin; 상기 Lefranc 등 참조). 이러한 초가변 영역 또는 CDR 중 각각으로부터 유래된 잔기는 하기 표 1에 예를 들어 설명되어 있다.
표 1. 다양한 넘버링 시스템에 따른 예시적인 CDR
주어진 CDR의 경계는 인식에 사용되는 방안에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 용어 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 가변 영역)의 “CDR” 및 “상보성 결정 영역” 및 항체 또는 이의 영역의 각 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2)은 상기 기재된 임의의 공지된 방안에 의해 정의된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 일부 경우, IMGT, Kabat, Chothia 또는 Contact 방법으로 정의된 CDR과 같은 하나 이상의 특정 CDR을 인식하기 위한 방안을 지정한다. 다른 경우, CDR의 특정 아미노산 서열이 주어진다. CDR 영역은 Kabat와 Chothia 넘버링 시스템의 조합, 또는 Kabat와 IMGT 넘버링 시스템의 조합과 같은 다양한 넘버링 시스템의 조합에 의해 정의될 수도 있음에 유의해야 한다. 따라서, “특정 VH 또는 VHH에 제시된 바와 같은 CDR”과 같은 용어는 상기 예시적인 CDR 넘버링 시스템에 의해 정의된 임의의 CDR1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일단 가변 영역(예를 들어, VHH, VH 또는 VL)이 주어지면, 당업자는 상기 영역 내의 CDR이 상이한 넘버링 시스템 또는 이들의 조합에 의해 정의될 수 있음을 이해할 것이다.초가변 영역은 VL 중의 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2) 및 89-97 또는 89-96(L3), 및 VH 중의 26-35 또는 26-35A(H1), 50-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102(H3)와 같은 “확장된 초가변 영역”을 포함할 수 있다.
용어 “불변 영역 ” 또는 “불변 도메인”은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체의 상호 작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카르복시 말단 부분을 의미한다. 상기 용어는 면역글로불린 분자의 일부분을 의미하며, 상기 면역글로불린 분자의 일부분은 면역글로불린의 다른 부분인 가변 영역에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 가지며, 상기 아미노산 서열은 항원 결합 부위를 함유한다. 불변 영역은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 영역 및 경쇄의 CL 영역을 함유할 수 있다.
용어 “프레임워크” 또는 “FR”은 CDR의 양측에 위치한 가변 영역 잔기를 의미한다. FR 잔기는 예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 도메인 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체), 디아바디, 선형 항체 및 이중특이성 항체에 존재한다. FR 잔기는 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 용어 “Fc 영역”은 예를 들어천연 서열 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위한 것이다. 면역글로불린 중쇄 Fc 영역의 경계는 상이할 수 있지만, 인간 IgG중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226 또는 Pro230 위치의 아미노산 잔기로부터 그 카르복시 말단까지 연장되는 것으로 정의된다. 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 공학을 통해 Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)을 제거할 수 있다. 따라서, 완전 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단 및 K447잔기가 있거나 없는 항체 혼합물이 있는 항체 집단을 포함할 수 있다. “기능성 Fc 영역”은 천연 서열 Fc 영역의 “이펙터 기능”을 갖는다. 예시적인 “이펙터 기능”은 C1q 결합, CDC, Fc 수용체 결합, ADCC, 식세포작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역을 결합 영역 또는 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 영역 또는 도메인)과 조합하는 것을 필요로 하고, 당업자에게 공지된 다양한 측정법을 사용하여 평가될 수 있다. “변이체 Fc 영역”은 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 추가 또는 결실)으로 인해 천연 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성을 가질 수 있거나, 또는 이와 적어도 약 90%의 상동성을 가질 수 있으며, 예를 들어 이와 적어도 약 95%의 상동성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, “에피토프”는 당업계의 용어이며, 결합 분자(예를 들어, 단일 사슬 항체 서열을 포함하는 항체)가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소 영역을 의미한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 구조적, 비선형 또는 불연속 에피토프일 수 있다. 폴리펩티드 항원의 경우, 예를 들어, 에피토프는 폴리펩티드의 연속 아미노산(“선형” 에피토프)일 수 있거나, 또는 에피토프는 폴리펩티드의 2개 이상의 불연속 영역으로부터 유래된 아미노산(“구조적”, “비선형” 또는 “불연속” 에피토프)을 포함할 수 있다. 당업자는 일반적으로 선형 에피토프가 2차, 3차 또는 4차 구조에 의존하거나 의존하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 결합 분자는 아미노산이 천연 3차원 단백질 구조로 접혀 있는지 여부에 관계없이 한 그룹의 아미노산에 결합한다. 다른 실시예에서, 결합 분자는 에피토프를 인식하고 결합하기 위해, 특정 형태(예를 들어, 구부림, 뒤틀림, 회전 또는 접힘)를 나타내기 위해 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기를 필요로 한다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대한 “아미노산 서열의 동일성 백분율(%)” 및 “상동성”은 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열의 동일성 백분율을 달성한 후 서열의 동일성의 일부분으로서 어떠한 보존적 치환을 고려하지 않을 때 후보 서열에서 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식에 따라, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 얻을 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정렬하여 아미노산 서열의 동일성 백분율을 결정할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열에서의 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “기능적 외인성 수용체”는 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)에 도입된 후에도 그의 생물학적 활성을 유지하는 외인성 수용체(예를 들어, 재조합 또는 조작된 TCR, cTCR, TAC 유사 키메라 수용체 또는 CAR과 같은 TCR)를 의미한다. 생물학적 활성은 분자에 특이적으로 결합하는 외인성 수용체의 능력, 및 세포 증식 유도, 사이토카인 생성 및/또는 조절 또는 세포용해 이펙터 기능의 실행과 같은 다운스트림 신호를 적절하게 전달하는 능력을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, “키메라 항원 수용체” 또는 “CAR”은 하나 이상의 항원을 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포에 특이적으로 이식하는데 사용될 수 있는 유전적으로 조작된 수용체를 의미한다. 일부 CAR은 “인공 T 세포 수용체”, “키메라 T 세포 수용체” 또는 “키메라 면역 수용체”로도 지칭된다. 일부 실시예에서, CAR은 하나 이상의 항원(예를 들어, 종양 항원)에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 T 세포 및/또는 다른 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. “CAR-T 세포” 또는 “CAR-T”는 CAR을 발현하는 T 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 “재조합 또는 조작된 TCR”은 본원에 의해 제공되는 기능적 외인성 수용체로서 포함되며, 면역 세포에서 발현되는 펩티드를 의미한다. 재조합 또는 조작된 TCR의 기능은 예를 들어 표면에 특정 마커가 있는 암세포 및 감염된 세포와 같은 원하는 유형의 세포에 대한 면역 세포의 면역 활동을 재지정하는 것을 포함할 수 있다. 이는 내인성 TCR로 대체되거나 내인성 TCR과 공동 발현될 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 재조합 TCR은 오픈 리딩 프레임을 포함하는 단일 사슬 TCR이며, 여기서 가변 Vα 및 Vβ 도메인은 단백질 링커와 쌍을 이룬다. 여기에는 선택한 항원에 특이적인 것으로 알려진 TCR 유전자의 분자 클로닝이 포함된다. 그런 다음 이러한 사슬은 일반적으로 레트로바이러스 벡터를 통해 T 세포에 도입된다. 따라서, 클로닝된 TCRα 및 TCRβ 유전자의 발현은 형질도입된 T 세포에 이들 신규 유전자의 쌍에 의해 결정되는 기능적 특이성을 부여한다. 재조합 또는 조작된 TCR의 구성요소는 세포에 도입된 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 재조합 TCRα 및 TCRβ와 같은 TCR의 임의의 기능적 서브유닛이다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 기능적 외인성 수용체는 항원 결합 기능 및 T 세포 활성화 기능을 모두 갖는 키메라 TCR(cTCR)이다. 예를 들어, cTCR은 (a) 종양 항원(예를 들어, GPC3, 클라우딘 18.2)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원 결합 단편(예를 들어, sdAb, scFv)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인; (b) 선택적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛(예를 들어, CD3ε)의 선택적인 세포외 도메인 또는 이의 일부분; (d) 제2 TCR 서브유닛(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛(예를 들어, CD3ε)의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있고; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다(예를 들어, 모두 CD3ε임). 일부 실시예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시예에서, cTCR은 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시예에서, cTCR은 cTCR의 N-말단에 위차한 신호 펩티드, 예를 들어 CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 T 세포 항원 접합체(TAC)이며, 예를 들어, (a) 종양 항원(예를 들어, GPC3, 클라우딘 18.2)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원 결합 단편(예를 들어, sdAb, scFv)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인; (b) 선택적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛(예를 들어, CD3ε)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인; (d) 선택적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공수용체(예를 들어, CD4)의 선택적인 세포외 도메인 또는 이의 일부분; (f) 제2 TCR 공수용체(예를 들어, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공수용체(예를 들어, CD4)의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 선택적인 세포내 신호 전달 도메인을 포함하고; 여기서 상기 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되며; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 공수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공수용체는 동일하다. 일부 실시예에서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공수용체는 상이하다. 일부 실시예에서, TAC는 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시예에서, TAC는 TAC의 N-말단에 위치한 신호 펩티드, 예를 들어 CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 TCR 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 실시예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 TCR 결합 도메인의 C-말단에 있다.
일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 TAC 유사 키메라 수용체이며, 예를 들어, (a) 종양 항원(예를 들어, GPC3, 클라우딘 18.2)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원 결합 단편(예를 들어, sdAb, scFv)을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인; (b) 선택적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛(예를 들어, TCRα)의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포외 TCR 결합 도메인; (d) 선택적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛(예를 들어, CD3ε)의 선택적인 세포외 도메인 또는 이의 일부분; (f) 제3 TCR 서브유닛(예를 들어, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛(예를 들어, CD3ε)의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 선택적인 세포내 신호 전달 도메인을 포함하고; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시예에서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 TCR 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 실시예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 세포외 TCR 결합 도메인의 C-말단에 있다. 일부 실시예에서, TAC 유사 키메라 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시예에서, TAC 유사 키메라 수용체는 TAC 유사 키메라 수용체의 N-말단에 위치한 신호 펩티드, 예를 들어 CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 더 포함한다.
용어 “폴리펩티드” 및 “펩티드” 및 “단백질”은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이러한 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하며; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 상기 정의는 또한 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체(비천연 아미노산 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음) 및 당업계에 공지된 다른 변형을 함유한 폴리펩티드를 포함한다. 본 출원의 폴리펩티드는 항체 또는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 기초할 수 있기 때문에, 일부 실시예에서, “폴리펩티드”는 단일 사슬 또는 2개 이상의 관련 사슬로서 존재할 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있는 “폴리뉴클레오티드” 또는 “핵산”은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 이의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, “올리고뉴클레오티드”는 길이가 일반적으로(반드시 그런 것은 아닌) 약 200개 미만의 뉴클레오티드인 짧은 보통 단일 가닥 합성 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 “올리고뉴클레오티드” 및 “폴리뉴클레오티드”는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여 위에서 설명한 것은 올리고뉴클레오티드에도 동등하고 완전하게 적용된다. 본 출원의 결합 분자를 생성하는 세포는 모 하이브리도마 세포, 및 항체를 코딩하는 핵산이 도입된 박테리아 및 진핵 숙주 세포를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 임의의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3'으로의 추가 방향을 전사 방향이라고 하며; DNA 가닥 상에 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5'에서 5' 말단에 있는 서열 영역을 “업스트림 서열”이라고 하고; DNA 가닥 상에 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 3'에서 3' 말단에 있는 서열 영역을 “다운스트림 서열”이라고 한다.
“단리된 핵산”은 천연 서열이 자연적으로 동반하는 다른 게놈 DNA 서열 및 단백질 또는 복합체, 예를 들어 리보솜 및 중합효소로부터 실질적으로 단리된 핵산(예를 들어, RNA, DNA 또는 혼합 핵산)이다. “단리된” 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 단리된 핵산 분자이다. 또한, cDNA 분자와 같은 “단리된” 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배지가 실질적으로 함유되지 않을 수 있거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 함유되지 않을 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 기재된 바와 같이단일 사슬 항체 또는 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 분리되거나 정제된다. 상기 용어는 자연 발생 환경에서 제거된 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 상기 분자의 단리된 형태를 포함할 수 있습니다. 특히, 본원에 따른 CAR을 코딩하는 “단리된” 핵산 분자는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 단리된 핵산 분자이며, 상기 핵산 분자는 일반적으로 그것이 생성되는 환경에서 적어도 하나의 오염 핵산 분자와 회합된다.
용어 “제어 서열”은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 사용하기에 적합한 제어 서열은 예를 들어 프로모터, 선택적인 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “작동 가능하게 연결된” 및 유사한 문구(예를 들어, 유전적으로 융합된)는 핵산 또는 아미노산과 관련하여 사용될 때 각각 서로 기능적 관계에 있는 작동 가능하게 연결된 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 프로모터, 인핸서 요소, 오픈 리딩 프레임, 5' 및 3' UTR 및 터미네이터 서열은 핵산 분자(예를 들어, RNA)의 정확한 생성을 유발한다. 일부 실시예에서, 작동 가능하게 연결된 핵산 요소는 오픈 리딩 프레임의 전사를 유발하고 궁극적으로 폴리펩티드의 생성(즉, 오픈 리딩 프레임의 발현)을 유발한다. 다른 구현예로서, 작동 가능하게 연결된 펩티드는 기능적 도메인이 서로로부터 적절한 거리에 배치되어 각 도메인에 의도된 기능을 부여하는 펩티드이다.
용어 “벡터”는 핵산 서열을 운반하거나 포함하기 위한 물질을 의미하며, 상기 핵산 서열은 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위해 예를 들어 본원에 따른 결합 분자(예를 들어 항체)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 사용에 적합한 벡터는 예를 들어 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함하며, 여기에는 숙주 세포 염색체로의 안정적인 통합을 위한 선택 서열 또는 마커가 포함될 수 있다. 또한, 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선택 가능한 마커 유전자는 예를 들어 항생제 또는 독소에 대한 저항성을 제공하거나, 영양결핍을 보완하거나, 배지에 존재하지 않는 중요한 영양소를 공급한다. 발현 제어 서열은 당업계에 잘 알려진 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 터미네이터 등을 포함할 수 있다. 2개 이상의 핵산 분자가 동시 발현될 때(예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄 또는 항체 VH 및 VL), 2개의 핵산 분자는 예를 들어 단일 발현 벡터 또는 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현을 위해, 코딩 핵산은 공통 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되거나, 유도성 프로모터 및 구성적 프로모터와 같은 상이한 발현 제어 서열에 연결될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 숙주 세포로의 핵산 분자의 도입을 확인할 수 있다. 이러한 방법은 mRNA의 노던 블롯 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭과 같은 핵산 분석, 유전자 생성물 발현을 위한 면역블롯팅 또는 도입된 핵산 서열 또는 그에 상응하는 유전사 생성물의 발현을 테스트하는 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당업자는 핵산 분자가 원하는 생성물을 생성하기에 충분한 양으로 발현된다는 것을 이해해야 하며, 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 충분한 발현을 얻기 위해 발현 수준을 최적화할 수 있음을 추가로 이해해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “숙주”는 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 동물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “숙주 세포”는 핵산 분자로 형질감염될 수 있는 특정 대상 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미한다. 이러한 세포의 자손은 다음 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈으로의 핵산 분자의 통합으로 인해 핵산 분자로 형질감염된 모 세포와 동일하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “자가”는 나중에 개인에게 재도입될 동일한 개인으로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
“동종이계”는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “형질감염” 또는 “형질전환” 또는 “형질도입”은 외인성 핵산을 숙주 세포로 전달 또는 도입하는 과정을 의미한다. “형질감염된” 또는 “형질전환된” 또는 “형질도입된” 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 상기 세포는 1차 대상 세포 및 그 자손을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “약학적으로 허용 가능한”은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 동물, 보다 특히 인간에 사용하기 위해 미국 약전, 유럽 약전 또는 기타 인정된 약전에 등재된 것을 의미한다.
“부형제”는 약학적으로 허용 가능한 재료, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 용매 또는 캡슐화 재료를 의미한다. 부형제는 예를 들어 캡슐화 재료 또는 첨가제, 예를 들어 흡수 촉진제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 습윤제, 윤활제, 향료, 방부제, 추진제, 이형제, 멸균제, 감미제, 가용화제, 습윤제 및 이들의 혼합물을 포함한다. 용어 “부형제”는 또한 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 보조제(완전 또는 불완전)) 또는 비히클을 의미할 수 있다.
일부 실시예에서, 부형제는 약학적으로 허용 가능한 부형제이다. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 구현예는 인산염, 구연산염 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS™와 같은 비이온성 계면활성제. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 다른 구현예는 Remington 및 Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (제18판, 1990)에 설명되어 있다.
일 실시예에서, 각각의 성분은 약제학적 제형의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 “약학적으로 허용 가능한” 것이며, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 다른 문제나 합병증 없이 사람과 동물의 조직 또는 기관과의 접촉에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하다. 예를 들어, Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 제6판; Rowe 등 편집; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association:2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 제3판; Ash 및 Ash 편집; Gower Publishing Company:2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 제2판; Gibson 편집; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009를 참조할 수 있다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 사용되는 용량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 수성 pH 완충 용액이다.
일부 실시예에서, 부형제는 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함한 물 및 오일과 같은 멸균 액체이다. 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)이 정맥내로 투여될 때, 물은 예시적인 부형제이다. 염수 용액 및 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 부형제로 사용될 수 있다. 부형제는 또한 전분, 포도당, 유당, 자당, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말제, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 포함하는 경구 조성물은 제약 등급의 만니톨, 유당, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 부형제를 포함할 수 있다.
약제학적 화합물을 포함하는 조성물은 예를 들어 분리 또는 정제된 형태의 결합 분자(예를 들어, 항체) 및 적합한 양의 부형제를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “유효량” 또는 “치료적 유효량”은 원하는 결과를 생성하기에 충분한 조작된 면역 이펙터 세포, 또는 약제 및 본원에 의해 제공되는 조작된 면역 이펙터 세포 또는 약학적 조성물을 포함하는 치료 분자의 양을 의미한다.
용어 “피험자” 및 “환자”는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시예에서, 피험자는 비-영장류 동물 또는 영장류 동물(예를 들어, 인간)과 같은 포유동물이다. 특정 실시예에서, 피험자는 인간이다. 일 실시예에서, 피험자는 질환 또는 병증으로 진단된 인간과 같은 포유동물이다. 다른 실시예에서, 피험자는 인간과 같은 질환 또는 병증이 발생할 위험이 있는 포유동물이다.
“투여(Administer 또는 administration)”는 신체 외부에 존재하는 물질을 예를 들어 점막, 피내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 물리적 전달 방법과 같이 환자에게 주사하거나 달리 물리적으로 전달하는 행위를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “치료(treat, treatment 및 treating)”는 하나 이상의 요법의 투여로 인한 질환 또는 병태의 진행, 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시키거나 개선하는 것을 의미한다. 치료는 기저 질환과 관련된 하나 이상의 증상이 감소, 완화 및/또는 경감되어 환자가 여전히 기저 질환을 앓고 있을 수 있지만 환자의 개선이 관찰되는지 여부를 평가하여 결정할 수 있다. 용어 “치료”는 질환의 관리 및 개선을 포함한다. 용어 “관리(manage, managing, 및 management)”는 반드시 질환의 치유를 유발하지 않는 요법으로부터 피험자가 얻는 유익한 효과를 의미한다.
용어 “예방(prevent, preventing, 및 prevention)”은 질환, 병증, 병태 또는 관련 증상(예를 들어, 암)의 발병(또는 재발) 가능성을 줄이는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 암의 발달을 “지연”시킨다는 것은 질환의 발달을 연기, 방해, 완화, 지체, 안정화 및/또는 늦추는 것을 의미한다. 상기 지연은 질환의 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 상이한 시간이 될 수 있다. 상기 개체가 상기 질환을 앓지 않기 때문에 충분하거나 현저한 지연이 실제로 예방을 포함할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 상기 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여, 암의 발달을 “지연”시키는 방법은 주어진 시간 범위 내에서 질환 발달의 가능성을 감소시키거나 및/또는 주어진 시간 범위 내에서 질환의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의미한 수의 개체를 사용한 임상 연구를 기반으로 한다. 표준 방법을 사용하여 암의 발달을 검출할 수 있으며, 이러한 표준 방법은 컴퓨터 축 단층 촬영(CAT 스캔), 자기 공명 영상(MRI), 복부 초음파, 응고 검사, 동맥 조영술 또는 생검을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 발달은 또한 초기에 검출할 수 없을 수 있는 암의 진행을 의미할 수 있으며, 발생, 재발 및 발병을 포함한다.
용어 “약” 및 “대략”은 주어진 값 또는 범위에서 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내 또는 그 이하를 의미한다.
본 출원 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 “하나/일(a/an)”, 및 “해당/상기”는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
본원에서 임의의 곳에서 용어 “포함”으로 실시예를 설명할 경우, “...로 구성” 및/또는 “기본적으로 ...로 구성”으로 설명된 유사한 실시예도 제공함을 이해해야 한다. 또한,본원에서 임의의 곳에서 문구 “기본적으로 ...로 구성”으로 실시예를 설명할 경우, “...로 구성”으로 설명된 유사한 실시예도 제공함을 이해해야 한다.
문구 “A와 B 사이” 또는 “A-B 사이”에서 사용된 용어 “... 사이”는 A와 B를 포함하는 범위를 의미한다.
본원에서 “A 및/또는 B”와 같은 문구에서 사용된 용어 “및/또는”은 A 및 B; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, “A, B 및/또는 C”와 같은 문구에서 사용된 용어 “및/또는”은 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독) 중 각 실시예를 포함하도록 의도된다.
7.2. 조작된 면역 이펙터 세포
아래 제8 부분에 나타낸 바와 같이, IL-12의 p40 서브유닛과 CCR7의 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21)의 특정 조합을 하나 이상의 기능적 외인성 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포에 도입하면, 면역 이펙터 세포의 성질/기능을 현저하게 개선할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본원은 숙주 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 제공하며, 상기 숙주 세포는 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCR7의 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21)를 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 하나 이상의 기능적 외인성 수용체를 발현한다.
CCR7(C-C 케모카인 수용체 타입 7)은 인체에서 CCR7 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. CCR7은 BLR2, CC-CKR-7, CCR-7, CD197, CDw197, CMKBR7, EBI1 및 C-C 모티프 케모카인 수용체 7이라고도 한다 . 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCR7은 OMIM: 600242; MGI: 103011; HomoloGene: 1387; 및/또는 GeneCards: CCR7로 확인되었다. 상기 수용체에 대해 2가지 천연 리간드: CCL-19 및 CCL-21이 확인되었다. 본원에 의해 제공되는 CCR7의 리간드는 임의의 종의 CCR7의 천연 리간드일 수 있다. 다른 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCR7의 리간드는 임의의 종의 CCR7의 인공 또는 합성 리간드일 수 있다.
기능적 외인성 수용체는 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 키메라 TCR(cTCR), 및 T 세포 항원 접합체(TAC) 유사 키메라 수용체일 수 있다. 일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 CAR이다. 일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 TCR이다. 일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 cTCR이다. 다른 실시예에서, 기능적 외인성 수용체는 TAC이다. 본 발명에서 면역 이펙터 기능을 수행할 수 있는 임의의 면역 이펙터 세포를 사용할 수 있으며, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포 독성 T 세포, 호중구 및 호산구를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 본원은 본원에 따른(예를 들어, 아래 부분에서 제공된) 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 제공한다.
일부 특정 실시예에서, 본원은 CAR-T 세포를 제공하며, 상기 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현한다. 일부 특정 실시예에서, 본원은 TCR-T 세포를 제공하며, 상기 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현한다. 일부 특정 실시예에서, 본원은 TAC-T 세포를 제공하며, 상기 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현한다.
일부 특정 실시예에서, 본원은 CAR-T 세포를 제공하며, 상기 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현한다. 일부 특정 실시예에서, 본원은 TCR-T 세포를 제공하며, 상기 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현한다. 일부 특정 실시예에서, 본원은 TAC-T 세포를 제공하며, 상기 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현한다.
7.2.1. P40, CCL-19 및 CCL-21
일부 실시예에서, 본 발명의 조작된 면역 이펙터 세포는 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛 또는 이의 변이체 및 CCL-19 또는 이의 변이체의 특정 조합을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조작된 면역 이펙터 세포는 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛 또는 이의 변이체 및 CCL-21 또는 이의 변이체의 특정 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, p40은 IL-12B라고도 하는 인터루킨 12의 서브유닛β, 자연 살해 세포 자극 인자 2, 세포 독성 림프구 성숙 인자 p40 또는 인터루킨-12 서브유닛 p40이며, 인체에서 IL12B 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. P40은 인터루킨 12 및 인터루킨 23의 일반적인 서브유닛이다. 일부 실시예에서, p40은 OMIM: 161561, MGI: 96540, HomoloGene: 1648, 및/또는 GeneCards: IL12B로 확인되었다. 본원에 사용된 p40은 임의의 종으로부터 유래된 p40을 포함한다. 본원에 사용된 p40은 또한 그의 적어도 한 가지 생물학적 활성을 실질적으로 유지(예를 들어, 그의 생물학적 활성 중 하나의 적어도 80%를 유지)하는 임의의 p40 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 인간 p40 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5와 약 80% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 p40의 생물학적 활성의 적어도 80%를 유지한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 막 결합된 폴리펩티드(예를 들어, MB12)이다.
본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 형성된 막 결합된 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, p40 폴리펩티드는 막 앵커링 도메인을 통해 막에 결합된다. 일부 실시예에서, p40 폴리펩티드는 막관통 도메인을 통해 막에 결합된다. 예시적인 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 α, β 또는 ζ 사슬, CD28, CD3 ε, CD45, CD4, CD5, CD8, B7, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDl la, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CD19, IL-2R β, IL-2R γ, CD8α, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDIOO(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C 등 막관통 도메인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, p40 폴리펩티드는 막 결합된 것이고, 제2 폴리펩티드 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 폴리펩티드 단편은 CD28, CD8α, OX40 및 B7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, p40 단편과 제2 폴리펩티드 단편은 펩티드 링커를 통해 서로 연결된다. 일부 실시예에서, 상기 링커펩티드는 유연한 링커이다. 예시적인 유연한 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어 (GSGGS)n(SEQ ID NO: 46), (GGGS)n(SEQ ID NO: 47) 및 (GGGGS)n(SEQ ID NO: 48)를 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 공지된 다른 유연한 링커를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 막 결합된 p40 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 신호 펩티드, p40, CD8α로부터 유래된 힌지 및 막관통 도메인, 및 선택적으로 CD8α로부터 유래된 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 막 결합된 p40 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 막 결합된 p40 폴리펩티드는 제3 폴리펩티드 단편을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제3 폴리펩티드 단편은 우성 음성 수용체(DNR)이다. 일부 실시예에서, 상기 제3 폴리펩티드 단편은 TGFβRⅡ DNR이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 막 결합된 p40 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 신호 펩티드, p40, TGFβRⅡ DNR, CD8α로부터 유래된 힌지 및 막관통 도메인, 및 선택적으로 CD8α로부터 유래된 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
케모카인(C-C 모티프) 리간드19(CCL-19)는 인체에서 CCL19 유전자에 의해 코딩되는 단백질이며, CKb11, ELC, MIP-3b, MIP3B, SCYA19 및 C-C 모티프 케모카인 리간드 19라고도 한다. 일부 실시예에서, CCL-19는 OMIM: 602227; MGI: 5434459; HomoloGene: 4569; 및/또는 GeneCards: CCL19로 확인되었다. 본원에 사용된 CCL-19는 임의의 종으로부터 유래된 CCL-19를 포함한다. 본원에 사용된 CCL-19는 또한 적어도 한 가지 생물학적 활성을 실질적으로 유지(예를 들어, 그의 생물학적 활성 중 하나의 적어도 80%를 유지)하는 임의의 CCL-19 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 인간 CCL-19 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 SEQ ID NO: 6과 약 80% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CCL-19의 생물학적 활성의 적어도 80%를 유지한다.
케모카인(C-C 모티프) 리간드 21(CCL-21)은 CC 케모카인 계열에 속하는 사이토카인이다. CCL-21은 6Ckine, CKb9, ECL, SCYA21, SLC, TCA4 및 C-C 모티프 케모카인 리간드21이라고도 한다. 일부 실시예에서, CCL-21은 OMIM: 602737; MGI: 1349183; HomoloGene: 2247; 및/또는 GeneCards: CCL21로 확인되었다. 본원에 사용된 CCL-21은 임의의 종으로부터 유래된 CCL-21을 포함한다. 본원에 사용된 CCL-21은 또한 그의 적어도 한 가지 생물학적 활성을 실질적으로 유지(예를 들어, 그의 생물학적 활성 중 하나의 적어도 80%를 유지)하는 임의의 CCL-21 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 인간 CCL-21 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 SEQ ID NO: 22와 약 80% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CCL-21의 생물학적 활성의 적어도 80%를 유지한다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 또한 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하고; 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열은 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하고; 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
수학적 알고리즘을 사용하여 2개의 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 사이의 동일성 백분율을 결정할 수 있다. 2개의 서열을 비교하기 위한 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적 구현예는 Karlin 및 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268 (1990)의 알고리즘이며, Karlin 및 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877 (1993)로 수정되었다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403 (1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되었다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 스코어 = 100, 단어 길이 = 12와 같은 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터 세트로 수행되어 본원에 따른 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 스코어 = 50, 단어 길이 = 3과 같은 XBLAST 프로그램 파라미터 세트로 수행되어 본원에 따른 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402 (1997)에 기재된 바와 같은 Gapped BLAST를 사용할 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST는 분자 간 거리 관계를 검출하는 반복 검색(Id.)에 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI Blast 프로그램을 사용할 경우, (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 상응하는 프로그램의 기본 파라미터(예를 들어,월드와이드 웹의 NCBI(National Center for Biotechnology Information), ncbi.nlm.nih.gov 참조)를 사용할 수 있다. 서열 비교를 위한 수학적 알고리즘의 다른 비제한적 구현예는 Myers 및 Miller, CABIOS 4:11-17 (1998)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 ALIGN 프로그램(2.0 버전)에 통합되었고, 상기 프로그램은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부분이다. ALIGN 프로그램을 사용하여 아미노산 서열을 정렬할 경우, 갭 길이 패널티가 12이고 갭 패널티가 4인 PAM120 중량 잔기 표를 사용할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 따른 p40, CCL-19 및 CCL-21의 하나 이상의 아미노산 서열 변형 또는 변이를 고려하였다. 변이는 원래 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다.
아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환한 결과일 수 있으며, 예를 들어 세린으로 류신을 치환한 것, 예를 들어 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 기술은 본원에 의해 제공되는 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 아미노산 치환을 초래하는 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발을 포함한다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1개 내지 5개의 아미노산의 범위 내에 있다. 일부 실시예에서, 치환, 결실 또는 삽입은 원래 분자에 비해 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시예에서, 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서의 보존적 아미노산 치환이다. 허용되는 변화는 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 수행하고 얻은 변이체의 모 폴리펩티드에 의해 나타나는 활성을 테스트함으로써 결정될 수 있다.
본 출원은 보존적 아미노산 치환에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 보존적 아미노산 치환에서, 아미노산 잔기는 유사하게 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 치환된다. 상술한 바와 같이, 유사하게 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 대안적으로, 예를 들어 포화 돌연변이 유발을 통해 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 돌연변이를 도입할 수 있고, 얻은 돌연변이체의 생물학적 활성을 스크리닝하여 활성이 유지된 돌연변이체를 동정할 수 있다. 돌연변이 유발 후, 코딩된 단백질을 발현할 수 있고 단백질의 활성을 결정할 수 있다. 보존적(예를 들어, 유사한 성질 및/또는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹 내에서) 치환을 수행하여 성질을 유지하거나 크게 변경하지 않는다.
아미노산은 이들의 측쇄 성질의 유사성에 따라 분류될 수 있다(예를 들어 Lehninger, Biochemistry 73-75(제2판, 1975) 참조): (1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 하전되지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); 및 (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H). 대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 예를 들어, 펩티드의 정확한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 예를 들어 알라닌 또는 세린과 같은 또 다른 아미노산으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 향상시키고 비정상적인 가교결합을 방지할 수 있다. 비보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 구성원으로 교환해야 한다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 매개(부위 지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 변화를 이룰 수 있다. 클로닝된 DNA에 대해 부위 지정 돌연변이 유발(예를 들어, Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); 및 Zoller 등, Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982) 참조), 카세트 돌연변이 유발(예를 들어, Wells 등, Gene 34:315-23 (1985) 참조) 또는 다른 알려진 기술을 수행하여 폴리펩티드 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
7.2.2. 키메라 항원 수용체
본 발명의 조작된 면역 이펙터 세포는 하나 이상의 기능적 외인성 수용체를 발현한다. 임의의 기능적 외인성 수용체는 모두 본 출원에 포함된다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 본원에 의해 제공되는 예시적인 기능적 외인성 수용체로서만 하기에 보다 상세하게 설명되지만, 본 출원의 범위를 제한하지 않는다.
일부 실시예에서, 본 발명의 면역 이펙터 세포 내의 CAR은 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는, (a) 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함하며, 이들 각각 및 추가 영역은 하기에 보다 상세하게 설명된다.
세포외 항원 결합 도메인
본원에 따른 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 단일특이다. 다른 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 다중특이적이다. 다른 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 1가이다. 다른 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 다가이다. 일부 실시예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하고, 이러한 항원 결합 도메인은 펩티드 결합 또는 펩티드 링커를 통해 서로 직접 융합된다.
일부 실시예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들어, 상기 결합 도메인은 단클론 항체(작동제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 완전 단클론 항체 포함), 다중 에피토프 또는 단일 에피토프 특이성을 갖는 항체, 다클론 또는 1가 항체, 다가 항체, 적어도 2개의 완전 항체로 형성된 다중특이성 항체(예를 들어,원하는 생물학적 활성을 나타내는 이중특이성 항체), 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체 및 이의 단편(예를 들어, 도메인 항체)로부터 유래될 수 있다. 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및/또는 친화성 성숙 항체, 및 다른 종(예를 들어, 마우스, 토끼, 라마 등)으로부터 유래된 항체일 수 있다. 일부 실시예에서, 항체는 면역글로불린계 폴리펩티드 중의 B 세포의 폴리펩티드 생성물을 포함하며, 이는 특정 분자 항원에 결합할 수 있고 두 쌍의 동일한 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 여기서 각 쌍의 폴리펩티드 사슬은 하나의 중쇄(약 50-70 kDa) 및 하나의 경쇄(약 25 kDa)를 갖고, 각 사슬의 각 아미노 말단 부분은 약 100 내지 약 130 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하며, 각 사슬의 각 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, Antibody Engineering (Borrebaeck 편집, 제2판 1995); 및 Kuby, Immunology (제3판 1997)를 참조한다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 낙타과 종(예를 들어, 라마 또는 알파카)으로부터 유래된 단일 도메인 항체 또는 이들의 인간화 변이체, 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 어느 하나의 기능성 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이러한 기능성 단편은 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 일부분을 의미하며, 이는 상기 단편이 유래된 항체의 일부 또는 전부 결합 활성을 유지한다. 기능성 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)의 비제한적 구현예는 단일 사슬 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이성, 이중특이성 등 포함), Fab 단편, F(ab’) 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합 Fv(dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디를 포함한다. 특히, 본원에 의해 제공되는 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예를 들어, 항원 결합 도메인, 또는 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자(예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR)를 포함한다. 이러한 항체 단편은 예를 들어 Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers 편집, 1995); Huston 등, 1993, Cell Biophysics 22:189-224; Pl
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ckthun 및 Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515; 및 Day, Advanced Immunochemistry (제2판, 1990)를 참조할 수 있다. 본원에 의해 제공되는 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 항체는 작용성 항체 또는 길항성 항체일 수 있다. 항체는 작용성 항체도 길항성 항체도 아닐 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 단일 사슬 Fv(sFv 또는 scFv)를 포함한다. scFv는 단일 폴리펩티드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 상기 폴리펩티드 링커는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 한다. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 제113권, Rosenburg 및 Moore 편집, Springer-Verlag, New York, 제269-315페이지 (1994)를 참조할 수 있다.
다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. sdAb는 동일하거나 상이한 유래일 수 있으며 동일하거나 상이한 크기를 가질 수 있다. 예시적인 sdAb는 중쇄만 갖는 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(예를 들어, VHH 또는 VNAR), 경쇄가 자연적으로 결여된 결합 분자, 통상적인 4쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인(예를 들어, VH 또는 VL), 중쇄만 갖는 인간화 항체, 인간 중쇄 세그먼트를 발현하는 형질전환 마우스 또는 래트에 의해 생성된 인간 단일 도메인 항체, 및 조작된 도메인 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 출원에서 위에 기재된 단일 도메인 항체를 포함한 당업계에 공지되거나 본 출원에 의해 개발된 임의의 sdAb는 본원에 따른 CAR의 구축에 사용될 수 있다. sdAb는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 이러한 종은 마우스, 래트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 물고기, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에서 고려되는 단일 도메인 항체는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터 유래된 자연 발생 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
일부 실시예에서, sdAb는 경쇄가 결여된 중쇄 항체(본원에서는 “중쇄만 갖는 항체”라고도 함)로 알려진 자연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 예를 들어, 이러한 단일 도메인 분자는 WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, C. 등Nature 363:446-448(1993)에 개시되어 있다. 명확히 하기 위해, 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 4쇄 면역글로불린의 통상적인 VH 영역과 구별하기 위해 본원에서는 VHH로 지칭된다. 이러한 VHH 분자는 낙타, 라마, 비쿠나, 단봉낙타, 알파카 및 과나코와 같은 낙타과 종에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자를 생성할 수 있으며, 이러한 VHH는 본 출원의 범위 내에 있다. 또한, VHH의 인간화 버전뿐만 아니라 다른 변형 및 변이체도 고려되며 본 출원의 범위 내에 있다. 일부 실시예에서, sdAb는 연골 어류에서 발견된 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래된다. 예를 들어, sdAb는 상어 혈청에서 발견된 신규 항원 수용체(NAR)라고 하는 면역글로불린 이소타입으로부터 유래될 수 있다. NAR(“IgNAR”)의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자를 생성하는 방법은 WO 03/014161 및 Streltsov, Protein Sci.14:2901-2909(2005)에 설명되어 있다.
일부 실시예에서, 특정 항원 또는 표적에 대한 자연 발생 VHH 도메인은 낙타과 동물 VHH 서열의(나이브 또는 면역) 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 방법은 상기 항원 또는 표적, 또는 이의 적어도 일부, 단편, 항원 결정기 또는 에피토프를 사용하고 당업계에 공지된 하나 이상의 스크리닝 기술을 사용하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이러한 라이브러리 및 기술은 예를 들어 WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에 설명되어 있다. 대안적으로, (나이브 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반합성 라이브러리, 예를 들어, 무작위 돌연변이 유발 및/또는 CDR 셔플링과 같은 WO 00/43507에 설명된 기술을 사용하여 (나이브 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 VHH 라이브러리를 얻을 수 있다.
일부 실시예에서, sdAb는 재조합, CDR 이식, 인간화, 낙타화, 탈면역화 및/또는 시험관 내 생성된(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선택됨) 것이다. 일부 실시예에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역 중 특정아미노산 잔기의 “낙타화”에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 통상적인 4쇄 항체로부터 유래된(자연 발생) VH 도메인의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 중쇄 항체의 VHH 도메인 중 하나 이상의 상응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 대체 또는 치환되는 것을 의미한다. 이는 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있으며, 상기 방식은 당업자에게 있어서 명백한 것이다. 이러한 “낙타화” 치환은 바람직하게는 VH-VL 계면을 형성하거나 및/또는 상기 VH-VL 계면에 존재하는 아미노산 위치, 및/또는 소위 낙타과 특징 잔기에 삽입되며, 이는 본원에 정의된 바와 같다(예를 들어, WO 94/04678; Davies 및 Riechmann FEBS Letters 339:285-290(1994); Davies 및 Riechmann, Protein Engineering 9(6):531-537(1996); Riechmann, J. Mol. Biol. 259:957-969(1996); 및 Riechmann 및 Muyldermans, J. Immunol. Meth. 231:25-38(1999) 참조).
일부 실시예에서, sdAb는 인간 중쇄 세그먼트를 발현하는 형질전환 마우스 또는 래트에 의해 생성된 인간 단일 도메인 항체이다. 예를 들어, US 20090307787, 미국 특허 번호 8,754,287, US 20150289489, US 20100122358, 및 WO 2004049794를 참조할 수 있다.
일부 실시예에서, 단일 도메인 항체는 통상적인 4쇄 항체에 의해 생성된다. 예를 들어, EP 0 368 684; Ward 등, Nature, 341(6242):544-6(1989); Holt 등, Trends Biotechnol., 21(11):484-490(2003); WO 06/030220; 및 WO 06/003388을 참조할 수 있다.
일부 실시예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 인간화 항체는 인간 프레임워크 영역 및 인간 불변 영역 서열을 포함할 수 있다.
인간화 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있으며, CDR 이식(유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka 등, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska 등, 1994, PNAS 91:969-973), 사슬 셔플링(미국 특허 번호 5,565,332) 및 예를 들어 다음에 개시된 기술: 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, WO 93/17105, Tan 등, J.Immunol.169:1119 25(2002), Caldas 등, Protein Eng.13(5):353-60(2000), Morea 등, Methods 20(3):267 79(2000), Baca 등, J. Biol. Chem.272(16):10678-84 (1997), Roguska 등, Protein Eng.9(10):895 904(1996), Couto 등, Cancer Res.55(23 Supp):5973s-5977s(1995), Couto 등, Cancer Res.55(8):1717-22(1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10(1994), 및 Pedersen 등, J. Mol. Biol.235(3):959-73(1994)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한 미국 특허 공개 번호 US 2005/0042664 A1(2005년 2월 24일)을 참조할 수 있으며, 여기서 각각은 참조로서 본원에 인용된다.
비-인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다 . 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간에서 유래되어 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 일반적으로 “수입”잔기로 지칭되며, 이러한 잔기는 전형적으로 “수입” 가변 도메인으로부터 취해진다. 예를 들어, Jones 등, 1986, Nature 321:522-25; Riechmann 등, 1988, Nature 332:323-27; 및 Verhoeyen 등, 1988, Science 239:1534-36 등 방법에 따라, 초가변 영역 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환하여 인간화를 수행할 수 있다.
일부 경우, 인간화 항체는 CDR 이식에 의해 구축되며, 여기서 모 비-인간 항체(예를 들어, 설치류 동물)의 6개의 CDR의 아미노산 서열이 인간 항체 프레임워크에 이식된다. 예를 들어, Padlan 등은 CDR에 있는 잔기의 약 1/3만이 실제로 항원과 접촉한다고 결정하고, 이들을 “특이성 결정 잔기” 또는 SDR(Padlan 등, 1995, FASEB J. 9:133-39)이라고 하였다. SDR 이식 기술에서, SDR 잔기만 인간 항체 프레임워크에 이식된다(예를 들어, Kashmiri 등, 2005, Methods 36:25-34 참조).
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간(경쇄 및 중쇄) 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 소위 “베스트-핏(best-fit)” 방법에 따라, 비-인간(예를 들어, 설치류 동물) 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류 동물에 가장 가까운 인간 서열을 인간화 항체의 인간 프레임워크로 선택할 수 있다(Sims 등, 1993, J. Immunol. 151:2296-308; 및 Chothia 등, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용하는 것이다. 동일한 프레임워크는 여러 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다(Carter 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89; 및 Presta 등, 1993, J. Immunol. 151:2623-32). 일부 경우, 프레임워크는 가장 풍부한 인간 서브클래스 VL6 하위 그룹 I(VL6I) 및 VH 하위 그룹 III(VHIII)의 공통 서열로부터 유래된다. 또 다른 방법에서, 인간 생식계열 유전자는 프레임워크 영역의 공급원으로 사용된다.
초인간화라고 불리는 CDR의 비교에 기초한 대안적 패러다임에서, FR 상동성은 부적절하다. 상기 방법은 비-인간 서열과 기능적 인간 생식계열 유전자 레퍼토리의 비교로 구성된다. 그런 다음 뮤린 서열과 동일하거나 밀접하게 관련된 표준 구조를 코딩하는 유전자를 선택한다. 다음으로, 비-인간 항체와 표준 구조를 공유하는 유전자 중에서 CDR 내에서 가장 높은 상동성을 갖는 유전자를 FR 공여자로 선택한다. 마지막으로, 비-인간 CDR을 이러한 FR에 이식한다(예를 들어, Tan 등, 2002, J. Immunol. 169:1119-25 참조).
또한 항원에 대한 친화력 및 다른 유리한 생물학적 성질을 유지하기 위해 항체를 인간화하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 한 방법에 따르면, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 방법을 통해 인간화 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 획득 가능하며 당업자에게 친숙한 것이다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램을 획득할 수 있다. 이들은 예를 들어 WAM(Whitelegg 및 Rees, 2000, Protein Eng. 13:819-24), Modeller(Sali 및 Blundell, 1993, J. Mol. Biol. 234:779-815) 및 Swiss PDB Viewer(Guex 및 Peitsch, 1997,Electrophoresis 18:2714-23)을 포함한다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능성 있는 역할의 분석, 예를 들어 후보 면역글로불린의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이로써, 하나 이상의 표적 항원에 대한 증가된 친화력과 같은 원하는 항체 특징이 얻어지도록 FR 잔기가 수용체 및 수입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 가장 크게 관여한다.
항체 인간화에 대한 또 다른 방법은 HSC(Human String Content)라는 항체 인간성 메트릭을 기반으로 한다. 상기 방법은 마우스 서열을 인간 생식계열 유전자 레퍼토리와 비교하고 그 차이를 HSC로 채점하는 것이다. 그런 다음 표적 서열은 다양한 상이한 인간화 변이체를 생성하기 위해 전역 동일성 척도를 사용하는 대신 HSC를 최대화하여 인간화된다(Lazar 등, 2007, Mol. Immunol. 44:1986-98).
상기 방법 외에도 경험적 방법을 사용하여 인간화 항체를 생성하고 선택할 수 있다. 이러한 방법에는 인간화 변이체의 대규모 라이브러리 생성 및 농축 기술 또는 고처리량 스크리닝 기술을 사용하여 최적의 클론을 선택을 기반으로 하는 방법이 포함된다. 항체 변이체는 파지, 리보솜 및 효모 디스플레이 라이브러리에서 분리되거나 박테리아 콜로니 스크리닝에 의해 분리될 수 있다(예를 들어, Hoogenboom, 2005, Nat. Biotechnol. 23:1105-16; Dufner 등, 2006, Trends Biotechnol. 24:523-29; Feldhaus 등, 2003, Nat. Biotechnol. 21:163-70; 및 Schlapschy 등, 2004, Protein Eng. Des. Sel. 17:847-60 참조).
FR 라이브러리 방법에서, FR 중의 특정 위치에 잔기 변이체 모음을 도입한 다음 라이브러리를 스크리닝하여 이식된 CDR을 가장 잘 지원하는 FR을 선택한다. 치환될 잔기는 CDR 구조에 도움될 수 있는 것으로 동정된 “버니어(Vernier)” 잔기의 일부 또는 전부를 포함하거나(예를 들어, Foote 및 Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224:487-99 참조), Baca 등(1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84)에 의해 동정된 보다 제한된 표적 잔기 세트로부터 유래될 수 있다.
FR 셔플링에서, 선택된 잔기 변이체의 조합 라이브러리를 구축하기보다는 전체 FR이 비-인간 CDR과 조합된다(예를 들어, Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60 참조). 2단계 프로세스(먼저 VL 인간화, 다음 VH)에서 결합을 위해 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 대안적으로, 1단계 FR 셔플링 프로세스를 사용할 수 있다. 이러한 방법은 얻은 항체가 향상된 발현, 증가된 친화력 및 열안정성을 포함하여 개선된 생화학적 및 물리화학적 성질을 나타내기 때문에 2단계 스크리닝보다 더 효율적인 것으로 입증되었다(예를 들어, Damschroder 등, 2007, Mol. Immunol. 44:3049-60 참조).
“인간화(humaneering)” 방법은 필수 최소 특이성 결정기(minimum specificity determinant, MSD)의 실험적 동정과 비-인간 단편을 인간 FR 라이브러리로 순차적으로 대체하고 결합 평가를 기반으로 한다. 이는 비-인간 VH 및 VL 사슬의 CDR3 영역에서 시작하여 VH 및 VL의 CDR1 및 CDR2를 포함하여 인간 FR로 비-인간 항체의 다른 영역을 점진적으로 대체한다. 이러한 방법은 일반적으로 에피토프를 유지하고 상이한 인간 V-세그먼트 CDR을 갖는 다수의 서브클래스로부터 유래된 항체를 동정한다. 인간화는 인간 생식계열 유전자 항체와 91%-96%의 상동성을 갖는 항체의 분리를 허용한다(예를 들어, Alfreito, Cambridge Healthtech Institute의 제3회 연례 PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007 참조).
“인간공학(human engineering)” 방법은 항체의 아미노산 서열을 특이적으로 변경하여 비-인간 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 마우스 또는 키메라 항체 또는 항체 단편)을 변경함으로써 인간에서 면역원성이 감소된 변형된 항체를 생산하는 것에 관한 것이며, 상기 변형된 항체는 여전히 원래 비-인간 항체의 원하는 결합 성질을 유지한다. 일반적으로, 상기 기술은 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 아미노산 잔기를 “저위험”, “중간 위험” 또는 “고위험” 잔기로 분류하는 것에 관한 것이다. 전반적인 위험/보상 계산을 사용하여 분류하며, 상기 계산은 특정 치환(예를 들어, 인간의 면역원성에 대해)을 수행하는 예측 이점과 치환이 얻은 항체의 접힘에 영향을 미칠 위험을 평가한다. 비-인간 항체 가변 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 특정 또는 공통 인간 항체 서열의 상응하는 영역을 정렬하여 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체 서열의 주어진 위치(예를 들어, 저위험 또는 중간 위험)에서 치환될 특정 인간 아미노산 잔기를 선택할 수 있다. 비-인간 서열에서 저위험 또는 중간 위험 위치에 있는 아미노산 잔기는 정렬에 따라 인간 항체 서열에서 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 인간공학 단백질을 제조하기 위한 기술은 Studnicka 등, 1994, Protein Engineering 7:805-14; 미국 특허 번호 5,766,886, 5,770,196, 5,821,123 및 5,869,619; 및 PCT 공개 WO 93/11794에 상세하게 설명되어 있다.
예를 들어 Composite Human Antibody™ 기술(Antitope Ltd., Cambridge, United Kingdom)을 사용하여 복합 인간 항체를 생성할 수 있다. 복합 인간 항체를 생성하기 위해, T 세포 에피토프를 피하는 방식으로 다수의 인간 항체 가변 영역 서열의 단편으로부터 가변 영역 서열을 설계함으로써, 얻은 항체의 면역원성을 최소화한다. 이러한 항체는 인간 경쇄 및/또는 중쇄 불변 영역과 같은 인간 불변 영역 서열을 포함할 수 있다.
탈면역화된 항체는 T 세포 에피토프가 제거된 항체이다. 탈면역화된 항체를 제조하기 위한 방법이 이미 설명되었다. 예를 들어, Jones 등, Methods Mol Biol. 2009; 525: 405-23, xiv 및 De Groot 등, Cell. Immunol. 244:148-153(2006)를 참조할 수 있다. 탈면역화된 항체는 T 세포 에피토프가 결실된 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함한다. 간략하게는, 항체의 VH 및 VL을 클로닝하고 T 세포 증식 측정에서 항체 VH 및 VL로부터 유도된 중첩 펩티드를 테스트함으로써 T 세포 에피토프를 후속적으로 동정하였다. 인실리코 방법을 통해 T 세포 에피토프를 동정하여 인간 MHC 클래스 II에 결합하는 펩티드를 동정한다. VH 및 VL에 돌연변이를 도입하여 인간 MHC 클래스 II에 대한 결합을 제거한다. 그런 다음 돌연변이된 VH 및 VL을 사용하여 탈면역화된 항체를 생성한다.
일부 실시예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 다수의 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 다중특이성 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 예를 들어, 세포외 항원 결합 도메인은 직렬된 다수의 결합 도메인(예를 들어, 다수의 scFv)을 포함한다. 다른 실시예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 다가 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 용어 “특이성”은 항원 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질의 선택적 인식을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “다중특이성”은 항원 결합 단백질이 2개 이상의 항원 결합 부위를 가짐을 나타내며, 그 중 적어도 2개는 상이한 항원에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “가(valent)”는 항원 결합 단백질에 지정된 수의 결합 부위가 존재함을 나타낸다. 전장 항체는 2개의 결합 부위를 가지며 2가이다. 이와 같이, 용어 “3가”, “4가”, “5가” 및 “6가”는 각각 항원 결합 단백질에 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위가 존재함을 나타낸다.
이중특이성 항체와 같은 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 다중특이성 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지된 것이며, 예를 들어, 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 공동 발현하는 것이고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(예를 들어, Milstein 및 Cuello, 1983, Nature 305:537-40 참조). 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)의 생성에 대한 추가적인 상세 내용은 예를 들어 이중특이성 항체(Kontermann 편집, 2011)를 참조할 수 있다.
항체는 2개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체(예를 들어, 4가 항체)일 수 있으며, 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현을 통해 상기 항체를 쉽게 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, 다가 항체는 3개 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다(또는 3개 내지 약 8개의 항원 결합 부위로 구성됨). 이러한 실시예에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다(또는 4개의 항원 결합 부위로 구성됨). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하며, 여기서 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있으며, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 VH-CH1-유연한 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있따. 본원의 다가 항체는 적어도 2개(예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원의 다가 항체는 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 선택적으로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명의 CAR의 세포외 항원 결합 도메인에 다수의 결합 도메인이 존재하는 경우, 다양한 도메인은 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다. 일부 실시예에서, 도메인은 어떠한 펩티드 링커도 없이 서로 직접 융합된다. 펩티드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 다양한 도메인의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라, 각각의 펩티드 링커는 동일하거나 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. 각각의 펩티드 링커를 독립적으로 선택 및 최적화할 수 있다. CAR에 사용되는 하나 이상의 펩티드 링커의 길이, 유연성 정도 및/또는 다른 성질은 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화력, 특이성 또는 결합력을 포함하지만 이에 한정되지 않는 성질에 일부 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시예에서, 펩티드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 하는 유연한 잔기(예를 들어, 글리신 및 세린)를 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 이중체는 적합한 펩티드 링커일 수 있다.
펩티드 링커는 자연 발생 서열 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄만 갖는 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열은 링커로 사용될 수 있다. 예를 들어 WO 1996/34103을 참조할 수 있다. 일부 실시예에서, 펩티드 링커는 유연한 링커이다. 예시적인 유연한 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(SEQ ID NO: 46), (GGGS)n(SEQ ID NO: 47) 및 (GGGGS)n(SEQ ID NO: 48), 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 공지된 다른 유연한 링커를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, WO 2016014789, WO 2015158671, WO 2016102965, US 20150299317, WO 2018067992, US 7741465, Colcher 등, J.Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197(1990), 및 Bird 등, Science 242:423-426(1988)에 기재된 당업계에 공지된 다른 링커도 본원에 의해 제공되는 CAR에 포함될 수 있으며, 여기서 각 개시 내용은 참조로서 본원에 인용된다.
일부 실시예에서, 본 발명의 CAR에서 제공되는 세포외 항원 결합 도메인은 특수 질환 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 항원을 인식한다. 일부 실시예에서, 항원은 종양 항원이다. 종양은 면역 반응(특히 T 세포 매개 면역 반응)에 대한 표적 항원으로 작용할 수 있는 다양한 단백질을 발현한다. CAR이 표적으로 하는 항원은 단일 병변 세포 상의 항원이거나, 각각 질환에 영향을 미치는 상이한 세포에서 발현되는 항원일 수 있다. CAR이 표적으로 하는 항원은 질환에 직간접적으로 관여할 수 있다.
일부 실시예에서, 표적 세포의 항원은 암세포 표면의 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 종양 특이적 항원, 종양 관련 항원 또는 신생 항원이다.
일부 실시예에서, 표적 세포는 부신암, 항문암, 충수돌기암, 담관암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 담낭암, 임신성 영양모세포암, 두경부암, 호지킨 림프종, 장암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종(MM), 신경내분비 종양, 비호지킨 림프종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 부비동암, 피부암, 연조직 육종, 척추암, 위암, 고환암, 인후암, 갑상선암, 자궁암, 자궁내막암, 질암 또는 외음부암의 세포와 같은 암세포이다. 일부 실시예에서, 암은 부신암, 항문암, 충수돌기암, 담관암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 담낭암, 임신성 영양모세포암, 두경부암, 호지킨 림프종, 장암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종(MM), 신경내분비 종양, 비호지킨 림프종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 부비동암, 피부암, 연조직 육종, 척추암, 위암, 고환암, 인후암, 갑상선암, 자궁암, 자궁내막암, 질암 또는 외음부암이다. 일부 실시예에서, 암은 부신암이다. 일부 실시예에서, 암은 항문암이다. 일부 실시예에서, 암은 충수돌기암이다. 일부 실시예에서, 암은 담관암이다. 일부 실시예에서, 암은 방광암이다. 일부 실시예에서, 암은 골암이다. 일부 실시예에서, 암은 뇌암이다. 일부 실시예에서, 암은 유방암이다. 일부 실시예에서, 암은 자궁경부암이다. 일부 실시예에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시예에서, 암은 식도암이다. 일부 실시예에서, 암은 담낭암이다. 일부 실시예에서, 암은 임신성 영양모세포암이다. 일부 실시예에서, 암은 두경부암이다. 일부 실시예에서, 암은 호지킨 림프종이다. 일부 실시예에서, 암은 장암이다. 일부 실시예에서, 암은 신장암이다. 일부 실시예에서, 암은 백혈병이다. 일부 실시예에서, 암은 간암이다. 일부 실시예에서, 암은 폐암이다. 일부 실시예에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시예에서, 암은 중피종이다. 일부 실시예에서, 암은 다발성 골수종(MM)이다. 일부 실시예에서, 암은 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 암은 비호지킨 림프종이다. 일부 실시예에서, 암은 구강암이다. 일부 실시예에서, 암은 난소암이다. 일부 실시예에서, 암은 췌장암이다. 일부 실시예에서, 암은 전립선암이다. 일부 실시예에서, 암은 부비동암이다. 일부 실시예에서, 암은 피부암이다. 일부 실시예에서, 암은 연조직 육종, 척추암이다. 일부 실시예에서, 암은 위암이다. 일부 실시예에서, 암은 고환암이다. 일부 실시예에서, 암은 인후암이다. 일부 실시예에서, 암은 갑상선암이다. 일부 실시예에서, 암은 자궁암, 자궁내막암이다. 일부 실시예에서, 암은 질암이다. 일부 실시예에서, 암은 외음부암이다.
일부 실시예에서, 부신암은 부신겉질샘암종(ACC), 부신피질암종, 갈색세포종 또는 신경모세포종이다. 일부 실시예에서, 항문암은 편평세포 암종, 배설강 암종, 선암종, 기저세포 암종 또는 흑색종이다. 일부 실시예에서, 충수돌기암은 신경내분비 종양(NET), 점액성 선암종, 술잔세포 유암종, 장형 선암종 또는 반지세포 선암종이다. 일부 실시예에서, 담관암은 간외 담관암, 선암종, 간문부 담관암, 문주위 담관암, 원위 담관암 또는 간내 담관암이다. 일부 실시예에서, 방광암은 이행세포 암종(TCC), 유두상 암종, 편평 암종, 편평세포 암종, 선암종, 소세포 암종 또는 육종이다. 일부 실시예에서, 골암은 원발성 골암, 육종, 골육종, 연골육종, 육종, 섬유 육종, 악성 섬유성 조직구종, 골거대세포종양, 척색종 또는 전이성 골암이다. 일부 실시예에서, 뇌암은 성상세포종, 뇌줄기신경아교종, 교모세포종, 수막종, 상의세포종, 핍지교종, 혼합신경아교종, 뇌하수체 선암종, 뇌하수체 선종, 두개인두종, 생식 세포 종양, 송과체 부위 종양, 수모세포종 또는 원발성 CNS 림프종이다. 일부 실시예에서, 유방암은 유방 선암종, 침윤성 유방암, 비침윤성 유방암, 유방 육종, 화생암종, 샘낭암종, 엽상종양, 혈관 육종, HER2 양성 유방암, 삼중음성 유방암 또는 염증성 유방암이다. 일부 실시예에서, 자궁경부암은 편평세포 암종 또는 선암종이다. 일부 실시예에서, 결장직장암은 결장직장 선암종, 원발성 결장직장 림프종, 위장관 기질 종양, 평활근 육종, 카르시노이드 종양, 점액성 선암종, 반지세포 선암종, 위장관 카르시노이드 종양 또는 흑색종이다. 일부 실시예에서, 식도암은 선암종 또는 편평세포 암종이다. 일부 실시예에서, 담낭암은 선암종, 유두상 선암종, 선편평세포 암종, 편평세포 암종, 소세포 암종 또는 육종이다. 일부 실시예에서, 임신성 융모성 질환(GTD)은 포상기태, 임신성 융모성 종양(GTN), 융모막 암종, 태반 부착부 융모성 종양(PSTT) 또는 상피 융모성 종양(ETT)이다. 일부 실시예에서, 두경부암은 후두암, 비인두암, 하인두암, 비강암, 부비동암, 침샘암, 구강암, 구인두암 또는 편도암이다. 일부 실시예에서, 호지킨 림프종은 전형적 호지킨 림프종, 결절성 경화증, 혼합세포형, 림프구 풍부형, 림프구 고갈형 또는 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종(NLPHL)이다. 일부 실시예에서, 장암은 소장암(small intestine cancer), 소장암(small bowel cancer), 선암종, 육종, 위장관 기질 종양, 카르시노이드 종양 또는 림프종이다. 일부 실시예에서, 신장암은 신세포암종(RCC), 투명세포 RCC, 유두상 RCC, 발색단 RCC, 집합관 RCC, 분류되지 않은 RCC, 이행세포 암종, 요로 상피암종, 신장 골반 암종 또는 신장 육종이다. 일부 실시예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 털세포 백혈병(HCL) 또는 골수 이형성 증후군(MDS)이다. 특정 실시예에서, 백혈병은 AML이다. 일부 실시예에서, 간암은 간세포 암종(HCC), 섬유층판형 HCC, 담관암, 혈관 육종 또는 간 전이이다. 일부 실시예에서, 폐암은 소세포 폐암, 소세포 암종, 복합 소세포 암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 편평세포 폐암, 대세포 미분화 암종, 폐결절, 전이성 폐암, 선편평세포 암종, 대세포 신경내분비 암종, 타액선형 폐암종, 폐 유암종, 중피종, 폐 육종양 암종 또는 악성 과립세포 폐 종양이다. 일부 실시예에서, 흑색종은 표재 확산성 흑색종, 결절성 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 무색소성 흑색종, 섬유조직형성 흑색종, 안구 흑색종 또는 전이성 흑색종이다. 일부 실시예에서, 중피종은 흉막 중피종, 복막 중피종, 심낭 중피종 또는 고환 중피종이다. 일부 실시예에서, 다발성 골수종은 활동성 골수종 또는 아급성 골수종이다. 일부 실시예에서, 신경내분비 종양은 위장관 신경내분비 종양, 췌장 신경내분비 종양 또는 폐 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 비호지킨 림프종은 역형성 대세포 림프종, 림프모구 림프종, 말초 T 세포 림프종, 여포성 림프종, 피부 T 세포 림프종, 림프형질세포 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 전구체 T-림프모구 백혈병/림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 성인 T 세포 림프종/백혈병(ATLL), 털세포 백혈병, B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 원발성 종격동 B 세포 림프종, 원발성 중추신경계(CNS) 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종, 림프절내 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 B 세포 림프종, 림프형질세포 림프종, B 세포 비호지킨 림프종, T 세포 비호지킨 림프종, 자연 살해 세포림프종, 피부 T 세포 림프종, Alibert-Bazin 증후군, 세자리 증후군(Sezary syndrome), 원발성 피부 역형성 대세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 혈관 면역모세포성 T 세포 림프종(AITL), 역형성 대세포 림프종(ALCL), 전신성 ALCL, 장병성 T 세포 림프종(EATL) 또는 간비장 γ/δ T 세포 림프종이다. 일부 실시예에서, 구강암은 편평세포 암종, 사마귀모양 암종, 소타액선 암종, 림프종, 양성 구강 종양, 호산구성 육아종, 섬유종, 과립세포 종양, 각질가시세포종, 평활근종, 골연골종, 지방종, 신경초종, 신경섬유종, 유두종, 뾰족콘딜로마, 사마귀상 황색종, 화농성 육아종, 횡문근종, 치성 종양, 백반증, 홍반증, 편평세포 입술 암종, 기저세포 입술 암종, 입술암, 잇몸암 또는 설암이다. 일부 실시예에서, 난소암은 난소 상피암, 점액성 상피 난소암, 자궁내막양 상피 난소암, 투명세포 상피 난소암, 미분화 상피 난소암, 난소 경계악성종양, 원발성 복막 암종, 나팔관암, 생식세포 종양, 기형종, 난소고환종, 난소 생식세포 암종, 내배엽동 종양, 성삭-간질 종양, 성삭-생식선 간질 종양, 난소 간질 종양, 과립막 세포 종양, 과립막-테카 세포 종양, 세르톨리-라이디히 종양(Sertoli-Leydig tumor), 난소 육종, 난소암육종, 난소선육종, 난소 평활근 육종, 난소 섬유 육종, 크루켄버그 종양(Krukenberg tumor) 또는 난소 낭종이다. 일부 실시예에서, 췌장암은 췌장 외분비 선암종, 췌장 내분비 선암종 또는 췌장 선암종, 도세포 종양 또는 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 전립선암은 전립선 선암종, 전립선 육종, 이행세포 암종, 소세포 암종 또는 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 부비동암은 편평세포 암종, 점막세포 암종, 선양 낭성 세포 암종, 세엽세포 암종, 비동 미분화 암종, 비강암, 부비동암, 상악동암, 사골동암 또는 비인두암이다. 일부 실시예에서, 피부암은 기저세포 암종, 편평세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 카포시 육종(KS), 광선 각화증, 피부 림프종 또는 각질가시세포종이다. 일부 실시예에서, 연조직 암은 혈관 육종, 피부 섬유 육종, 상피양 육종, 유잉 육종(Ewing’s sarcoma), 섬유 육종, 위장관 기질 종양(GIST), 카포시 육종, 평활근 육종, 지방 육종, 탈분화 지방 육종(DL), 점액양/원형 세포 지방 육종(MRCL), 고분화 지방 육종(WDL), 악성 섬유성 조직구종, 신경 섬유 육종, 횡문근 육종(RMS) 또는 윤활막 육종이다. 일부 실시예에서, 척추암은 척추 전이암이다. 일부 실시예에서, 위암은 위 선암종, 위 림프종, 위장관 기질 종양, 카르시노이드 종양, 위 카르시노이드 종양, 유형 I ECL 세포 카르시노이드, 유형 II ECL 세포 카르시노이드 또는 유형 III ECL 세포 카르시노이드이다. 일부 실시예에서, 고환암은 정상피종, 비정상피종, 배아 암종, 난황낭 암종, 융모막 암종, 기형종, 생식선 간질 종양, 라이디히 세포 종양 또는 세르톨리 세포 종양이다. 일부 실시예에서, 인후암은 편평세포 암종, 선암종, 육종, 후두암, 인두암, 비인두암, 구인두암, 하인두암, 후두암, 후두 편평세포 암종, 후두 선암종, 림프상피종, 방추세포 암종, 사마귀모양 암종, 미분화 암종 또는 림프절 암종이다. 일부 실시예에서, 갑상선암은 유두상 암종, 여포상 암종, H
Figure pct00008
rthle 세포 암종, 갑상선 수질 암종 또는 역형성 암종이다. 일부 실시예에서, 자궁암은 자궁내막암, 자궁내막 선암종, 자궁내막양 암종, 장액성 선암종, 선편평세포 암종, 자궁암육종, 자궁 육종, 자궁 평활근 육종, 자궁내막 간질 육종 또는 미분화 육종이다. 일부 실시예에서, 질암은 편평세포 암종, 선암종, 흑색종 또는 육종이다. 일부 실시예에서, 외음부암은 편평세포 암종 또는 선암종이다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 예시적인 종양 항원은 신경아교종 관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파태아단백(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라아제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제, 전립선 특이 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스타글란딘, PSMA, HER2/neu, 서바이빈 및 텔로머라아제, 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 암 항원은 CEA, 미성숙 라미닌 수용체, TAG-72, HPV E6, HPV E7, BING-4, 칼슘 활성화 클로라이드 채널 2, 사이클린-B1, 9D7, EpCAM, EphA3, Her2/neu, 텔로머라아제, 메소텔린, SAP-1, 서바이빈, BAGE 계열 항원, CAGE 계열 항원, GAGE 계열 항원, MAGE 계열 항원, SAGE 계열 항원, XAGE 계열 항원, NY-ESO-1/LAGE-1, PRAME, SSX-2, Melan-A, MART-1, Gp100, pmel17, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, P.폴리펩티드, MC1R, 전립선 특이 항원, β-카테닌, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, 피브로넥틴, MART-2, p53, Ras, TGF-βRII 또는 MUC1이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 CEA이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 미성숙 라미닌 수용체이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 TAG-72이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 HPV E6이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 HPV E7이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 BING-4이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 칼슘 활성화 클로라이드 채널 2이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 사이클린-B1이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 9D7이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 EpCAM이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 EphA3이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 Her2/neu이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 텔로머라아제이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 메소텔린이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 SAP-1이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 서바이빈이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 BAGE 계열 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 CAGE 계열 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 GAGE 계열 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 MAGE 계열 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 SAGE 계열 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 XAGE 계열 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 NY-ESO-1/LAGE-1이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 PRAME이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 SSX-2이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 Melan-A이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 MART-1이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 Gp100이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 pmel17이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 티로시나제이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 TRP-1이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 TRP-2이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 P.폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 MC1R이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 전립선 특이 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 β-카테닌이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 BRCA1이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 BRCA2이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 CDK4이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 CML66이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 피브로넥틴이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 MART-2이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 p53이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 Ras이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 TGF-βRII이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 MUC1이다.
일부 실시예에서, 상기 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격의 표적 항원으로 사용될 수 있는 많은 단백질을 발현한다. 이러한 분자는 조직 특이 항원, 예를 들어 흑색종에서의 MART-1, 티로시나제 및 gp100, 및 전립선암에서의 전립선 산 포스파타제(PAP) 및 전립선 특이 항원(PSA)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다른 표적 분자는 암 유전자 HER2/Neu/ErbB-2와 같은 변형 관련 분자 그룹에 속한다. 또 다른 표적 항원 그룹은 암배아 항원(CEA)과 같은 종양-태아 항원이다.
일부 실시예에서, 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)이다. TSA는 종양 세포에 고유하며 생체내의 다른 세포에 존재하지 않는다. TAA 관련 항원은 종양 세포에만 고유한 것이 아니라 항원에 대한 면역 관용 상태를 유도하지 않는 조건에서 정상 세포에서도 발현될 수 있다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건 하에서 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙하여 반응할 수 없는 배아 발달 동안 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있거나, 정상적으로는 정상 세포에서는 일반적으로 매우 낮은 수준으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적 구현예는 MART-1/MelanA(MART-I), gp 100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 분화 항원, 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5와 같은 종양 특이적 다계통 항원; CEA와 같은 과발현된 배아 항원; p53, Ras, HER2/neu와 같은 과발현된 암 유전자 및 돌연변이된 종양 억제 유전자; BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR와 같은 염색체 전좌로 인한 독특한 종양 항원; 및 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 항원 EBVA 및 인유두종 바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7과 같은 이러스 항원을 포함한다.
다른 대형 단백질 기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파태아단백, β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼시클로필린 C 관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 포함한다.
본원에 의해 제공되는 CAR의 다른 비제한적 예시적인 표적은 GPC2, CD276, δ-유사 단백질 리간드 3(DLL3), NY-ESO-1, 흑색종 관련 항원 4; 서바이빈, 윤활막 육종 X 중단점 단백질 2, CD3, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), erbb2 티로신 키나아제 수용체, HER2, CEA, CD66, CD66e, ROR1, ntrkr1 티로신 키나아제 수용체, GPC3, 클라우딘 18.2, 메소텔린, 글루타메이트 카르복시펩티다제 II, PMSA, PD-L1, 엽산 수용체α, PSCA, 뮤신 1, HLA 항원(예를 들어, HLA 클래스 I 항원 A-2 α, HLA 클래스 I 항체 A-11α 및 HLA 클래스 II 항원), c-Met, 간세포 성장 인자 수용체, K-Ras GTPase(KRAS), IL-15 수용체, Kit 티로신 키나아제, PDGF 수용체 β, RET 티로신 키나아제 수용체; Raf 1 단백질 키나아제, Raf B 단백질 키나아제, 티미딜레이트 신타아제, 토포이소머라아제 II, Brachyury 단백질, Flt3 티로신 키나아제, VEGF, VEGF 수용체(VEGF-1 수용체, VEGF-2 수용체 및 VEGF-3 수용체), 에스트로겐 수용체, 신생 항원, 인유두종 바이러스E6 및 열충격 단백질을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD19이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD20이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD22이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 BCMA이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 VEGFR2이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 FAP이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 EpCam이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 GPC3이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 클라우딘 18.2이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD133이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 IL13Ra이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 EGFRIII이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 EphA2이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 Muc1이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD70이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD123이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 ROR1이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 PSMA이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD5이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 GD2이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 GAP이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CD33이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 CEA이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 PSCA이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 Her2이다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 CAR의 적어도 하나의 표적 항원은 메소텔린이다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR은 B 세포 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD2, CD5, CD6, CD9, CD11a, CD11b, CD11c, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD29, CD30, CD31, CD32a, CD32b, CD35, CD37, CD38, CD39, CD40, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO, CD46, CD47, CD48, CD49b, CD49c, CD49d, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD60a, CD62L, CD63, CD68, CD69, CD70, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75S, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85E, CD85I, CD85J, CD86, CD92, CD95, CD97, CD98, CD99, CD100, CD102, CD108, CD119, CD120a, CD120b, CD121b, CD122, CD124, CD125, CD126, CD130, CD132, CD137, CD138, CD139, CD147, CD148, CD150, CD152, CD162, CD164, CD166, CD167a, CD170, CD171, CD175, CD175s, CD180, CD184, CD185, CD192, CD196, CD197, CD200, CD205, CD201a, CDw210b, CD212, CD213a1, CD213a2, CD 215, CD217, CD218a, CD218b, CD220, CD221, CD222, CD224, CD225, CD226, CD227, CD229, CD230, CD232, CD252, CD252, CD254, CD255, CD256, CD257, CD258, CD259, CD260, CD261, CD262, CD263, CD264, CD267, CD268, CD269, CD270, CD272, CD274, CD275, CD277, CD279, CD283, CD289, CD290, CD295, CD298, CD300, CD300c, CD305, CD306, CD307a, CD307b, CD307c, CD307d, CD307e, CD314, CD215, CD316, CD317, CD319, CD321, CD327, CD328, CD329, CD338, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD356, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362 또는 CD363 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD1a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD1b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD1c 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD1d 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD2 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD5 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD6 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD9 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD11a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD11b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD11c 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD17 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD18 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD19 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD20 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD21 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD22 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD23 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD24 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD25 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD26 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD27 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD29 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD30 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD31 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD32a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD32b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD35 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD37 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD38 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD39 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD40 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD45 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD45RA 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD45RB 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD45RC 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD45RO 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD46 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD47 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD48 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD49b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD49c 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD49d 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD50 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD52 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD53 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD54 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD55 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD58 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD60a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD62L 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD63 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD68 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD69 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD70 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD72 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD73 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD74 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD75 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD75S 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD77 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD79a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD79b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD80 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD81 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD82 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD83 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD84 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD85E 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD85I 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD85J 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD86 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD92 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD95 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD97 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD98 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD99 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD100 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD102 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD108 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD119 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD120a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD120b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD121b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD122 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD124 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD125 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD126 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD130 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD132 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD137 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD138 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD139 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD147 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD148 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD150 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD152 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD162 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD164 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD166 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD167a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD170 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD171 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD175 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD175s 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD180 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD184 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD185 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD192 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD196 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD197 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD200 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD205 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD201a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CDw210b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD212 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD213a1 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD213a2 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD 215 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD217 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD218a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD218b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD220 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD221 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD222 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD224 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD225 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD226 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD227 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD229 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD230 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD232 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD252 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD252 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD254 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD255 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD256 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD257, CD258 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD259 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD260 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD261 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD262 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD263 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD264 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD267 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD268 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD269 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD270 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD272 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD274 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD275 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD277 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD279 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD283 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD289 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD290 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD295 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD298 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD300 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD300c 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD305 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD306 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD307a 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD307b 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD307c 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD307d 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD307e 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD314 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD215 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD316 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD317 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD319 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD321 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD327 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD328 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD329 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD338 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD351 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD352 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD353 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD354 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD355 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD356 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD357 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD358 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD360 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD361 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD362 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 CD363 항원이다.
일 실시예에서, 본 발명의 CAR의 표적은 병원체이다. 일부 실시예에서, 표적 세포는 병원체를 포함하는 세포이다.
일부 실시예에서, 병원체는 급성 이완성 척수염(AFM), 아나플라즈마증, 탄저병, 바베시아증(Babesiosis), 보툴리누스 중독(Botulism), 브루셀라증(Brucellosis), 캄필로박테리아증(Campylobacteriosis), 카바페넴 내성 감염, 연성하감, 치쿤구니아 바이러스 감염(Chikungunya Virus Infection), 클라미디아, 시구아테라, 디피실 감염(Difficile Infection), 퍼프린젠스, 콕시디오이데스진균증, 코로나바이러스 감염, Covid-19(SARS-CoV-2), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob Disease)/전염성 해면상뇌증, 크립토스포리디움증(Crypto), 원포자충증, 뎅기열 1,2,3 또는 4형, 디프테리아, 대장균 감염/시가 독소 생성(STEC), 동부 말 뇌염, 출혈열(에볼라), 에를리키아증, 뇌염, 아르보바이러스 또는 파라감염성 질환, 비소아마비 엔테로바이러스 질환, D68 엔테로바이러스 질환(EV-D68), 지아르디아증, 글랜더, 임균 감염, 서혜부 육아종, B형 헤모필루스 인플루엔자(Hib 또는 H-플루), 한타바이러스 폐 증후군(HPS), 용혈성 요독 증후군(HUS), A형 간염(Hep A), B형 간염(Hep B), C형 간염(Hep C), D형 간염(Hep D), E형 간염(Hep E), 포진, 대상포진(Herpes Zoster/Shingles), 히스토플라스마증 감염, 인간 면역결핍 바이러스/에이즈(HIV/AIDS), 인유두종 바이러스(HPV), 인플루엔자(Flu), 레지오넬라증(재향군인병), 나병(한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증(리스테리아), 라임병, 성병성 림프육아종 감염(LGV), 말라리아, 홍역, 멜리오이드증, 수막염(바이러스성), 수막구균성 질환(수막염(박테리아성)), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 질환(MERS-CoV), 유행성 이하선염, 노로바이러스 질환, 소아마비, 골반 염증성 질환(PID), 페르투시스(백일해), 흑사병(가래톳 흑사병, 패혈증성 흑사병, 폐렴성 흑사병), 폐렴구균성 질환(폐렴), 급성 회백수염(회색질척수염(Polio)), 포와산, 프시타코증, 음모슬증(Pthiriasis), 농포성 발진 질환(두창, 원숭이두창, 우두), 큐열, 광견병, 리케차증(록키산 홍반열), 풍진(Rubella/German Measles), 살모넬라 위장염(살모넬라), 옴, 스콤브로이드(Scombroid), 농독증, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 이질 위장염(시겔라), 두창, 메티실린 내성 포도상구균 감염(MRSA), 포도상구균 식중독 장독소 B 중독(포도상구균 식중독), 반코마이신 중간 내성 포도상구균 감염(VISA), 반코마이신 내성 포도상구균 감염(VRSA), A군 연쇄상구균 질환(침습성)(Strep A(침습성)), B군 연쇄상구균성 질환(Strep-B), 연쇄상구균 독성 쇼크 증후군 STSS 독성 쇼크, 매독(원발성, 이차성, 초기 잠복성, 후기 잠복성, 선천성), 파상풍 감염, 트리코모나스증, 트리코모나스(Trichonosis) 감염, 결핵(TB), 잠복결핵(LTBI), 야토병, D군 장티푸스, 질증, 수두(Varicella/Chickenpox), 비브리오 콜레라병(콜레라), 비브리오증(비브리오), 에볼라 바이러스 출혈열, 라사 바이러스(Lasa Virus) 출혈열, 마버그 바이러스 출혈열, 웨스트 나일 바이러스 질환, 황열병, 예르시니아(Yersenia) 질환 및 지카 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 감염성 질환을 유발한다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 급성 이완성 척수염(AFM)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 아나플라즈마증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 탄저병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 바베시아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 보툴리누스 중독이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 브루셀라증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 캄필로박테리아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 카바페넴 내성 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 연성하감이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 치쿤구니아 바이러스 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 클라미디아이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 시구아테라이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 디피실 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 퍼프린젠스이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 콕시디오이데스진균증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 코로나바이러스 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 Covid-19(SARS-CoV-2)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 크로이츠펠트-야콥병/전염성 해면상뇌증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 크립토스포리디움증(Crypto)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 원포자충증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 뎅기열 1,2,3 또는 4형이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 디프테리아이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 대장균 감염/시가 독소 생성(STEC)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 동부 말 뇌염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 출혈열(에볼라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 에를리키아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 뇌염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 아르보바이러스 또는 파라감염성 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 비소아마비 엔테로바이러스이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 D68 엔테로바이러스 질환(EV-D68)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 지아르디아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 글랜더이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 임균 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 서혜부 육아종이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 B형 헤모필루스 인플루엔자(Hib 또는 H-플루)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 한타바이러스 폐 증후군(HPS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 용혈성 요독 증후군(HUS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 A형 간염(Hep A)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 B형 간염(Hep B)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 C형 간염(Hep C)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 D형 간염(Hep D)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 E형 간염(Hep E)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 포진이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 대상포진(Herpes Zoster/Shingles)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 히스토플라스마증 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스/에이즈(HIV/AIDS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 인유두종 바이러스(HPV)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 인플루엔자(Flu)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 레지오넬라증(재향군인병)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 나병(한센병)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 렙토스피라증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 리스테리아증(리스테리아)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 라임병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 성병성 림프육아종 감염(LGV)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 말라리아이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 홍역이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 멜리오이드증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 수막염(바이러스성)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 수막구균성 질환(수막염(박테리아성))이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 질환(MERS-CoV)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 유행성 이하선염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 노로바이러스 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 소아마비이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 골반 염증성 질환(PID)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 페르투시스(백일해)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 흑사병(가래톳 흑사병; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 패혈증성 흑사병; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 폐렴성 흑사병)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 폐렴구균성 질환(폐렴)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 급성 회백수염(회색질척수염)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 포와산이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 프시타코증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 음모슬증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 농포성 발진 질환(두창; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 원숭이두창; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 우두)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 큐열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 광견병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 리케차증(록키산 홍반열)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 풍진(Rubella/German Measles)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 살모넬라 위장염(살모넬라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 옴이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 스콤브로이드이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 농독증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 이질 위장염(시겔라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 두창이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 메티실린 내성 포도상구균 감염(MRSA)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 포도상구균 식중독 장독소 B 중독(포도상구균 식중독)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 반코마이신 중간 내성 포도상구균 감염(VISA)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 반코마이신 내성 포도상구균 감염(VRSA)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 A군 연쇄상구균 질환(침습성)(Strep A(침습성))이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 연쇄상구균성 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 B군 질환(Strep-B)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 연쇄상구균 독성 쇼크 증후군 STSS 독성 쇼크이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 매독(원발성; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 이차성이고; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 초기 잠복성이며; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 후기 잠복성이고; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 선천성임)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 파상풍 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 트리코모나스증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 트리코모나스 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 결핵(TB)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 잠복결핵(LTBI)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 야토병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 D군 장티푸스이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 질증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 수두(Varicella/Chickenpox), 비브리오 콜레라병(콜레라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 비브리오증(비브리오)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 에볼라 바이러스 출혈열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 라사 바이러스 출혈열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 마버그 바이러스 출혈열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 웨스트 나일 바이러스 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 황열병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 예르시니아질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 지카 바이러스 감염이다.
일부 실시예에서, 병원체는 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 바실러스 속, 바르토넬라(bartonella) 속, 보르데텔라(bordetella) 속, 보렐리아(borrelia) 속, 브루셀라(brucella) 속, 캄필로박터 속, 클라미디아 속, 클라미도필라 속, 클로스트리디움 속, 코리네박테리움 속, 엔테로코쿠스 속, 에스체리치아 속, 프란시셀라 속, 해모필러스 속, 헬리코박터 속, 레지오넬라 속, 렙토스피라 속, 리스테리아 속, 마이코박테리움 속, 마이코플라스마 속, 나이세리아 속, 슈도모나스 속, 리케차 속, 살모넬라 속, 시겔라 속, 포도상구균 속, 연쇄상구균 속, 트레포네마 속, 우레아플라즈마 속, 비브리오 속 또는 예르시니아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 바실러스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 바르토넬라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 보르데텔라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 보렐리아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 브루셀라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 캄필로박터 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 클라미디아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 클라미도필라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 클로스트리디움 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 코리네박테리움 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 엔테로코쿠스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 에스체리치아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 프란시셀라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 해모필러스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 헬리코박터 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 레지오넬라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 렙토스피라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 리스테리아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 마이코박테리움 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 마이코플라스마 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 나이세리아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 슈도모나스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 리케차 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 살모넬라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 시겔라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 포도상구균 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 연쇄상구균 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 트레포네마 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 우레아플라즈마 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 비브리오 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 예르시니아 속의 박테리아이다.
일부 실시예에서, 병원체는 기생충이다. 일부 실시예에서, 기생충은 원생동물, 연충 또는 외부기생충이다. 일부 실시예에서, 원생동물은 엔타메바, 지아르디아, 리슈마니아, 바란티디움, 플라스모디움 또는 크립토스포리디움이다. 일부 실시예에서, 연충은 흡충, 조충, 구두충 또는 회충이다. 일부 실시예에서, 외부기생충은 절지동물이다.
일부 실시예에서, 병원체는 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스과, 아레나바이러스과, 아스트로바이러스과, 부냐바이러스과(bunyaviridae), 칼리시바이러스과, 코로나바이러스과, 필로바이러스과, 플라비바이러스과, 헤파드나바이러스과, 헤페바이러스과, 오르소믹소바이러스과, 파필로마바이러스과, 파라믹소바이러스과, 파르보바이러스과, 피코르나바이러스과, 폴리오마바이러스과, 폭스바이러스과, 레오바이러스과, 레트로바이러스과, 랍도바이러스과 또는 토가바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 과(family)이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아레나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아스트로바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 부냐바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 칼리시바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 코로나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 필로바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 플라비바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 헤파드나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 헤페바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 오르소믹소바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파필로마바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파라믹소바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파르보바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피코르나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 폴리오마바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 폭스바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 레오바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 레트로바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 랍도바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 토가바이러스과의 바이러스이다.
일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 단순포진 바이러스 2형, 사이토메갈로바이러스, 인간 포진 바이러스 8형, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 인유두종 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 급성 회백수염 바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 풍진 바이러스 또는 수두-대상포진 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 코로나바이러스이다. 일부 실시예에서, 코로나바이러스는 Covid-19(SARS-CoV-2)이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 콕사키바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 A형 간염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 C형 간염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 단순포진 바이러스 2형이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 사이토메갈로바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인간 포진 바이러스 8형이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 홍역 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 유행성 이하선염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인유두종 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파라인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 급성 회백수염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 광견병 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 호흡기 세포융합 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 풍진 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 수두-대상포진 바이러스이다.
막관통 도메인
본 출원의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, “막관통 도메인”은 세포막(바람직하게는 진핵 세포막)에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 의미한다. 본원에 따른 CAR에 사용하기에 적합한 막관통 도메인은 자연 발생 단백질로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 이는 합성된 비-자연 발생 단백질 세그먼트, 예를 들어 세포막에서 열역학적으로 안정한 소수성 단백질 세그먼트일 수 있다.
막관통 도메인의 3차원 구조에 따라 막관통 도메인을 분류한다. 예를 들어, 막관통 도메인은 α 나선, 하나 이상의α 나선의 복합체, β-배럴 구조 또는 세포 인지질 이중층에 걸쳐 있을 수 있는 임의의 다른 안정한 구조를 형성할 수 있다. 또한, 막관통 도메인은 막관통 도메인이 막을 통과하는 횟수 및 단백질의 배향을 포함하는 막관통 도메인 토폴로지 구조에 따라 분류될 수 있거나 대안적으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 단일 통과 막 단백질은 세포막을 한 번 통과하고 다중 통과 막 단백질은 세포막을 적어도 두 번(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 이상) 통과한다. 막 단백질은 세포의 내부 및 외부에 상대적인 말단 및 하나 이상의 막관통 세그먼트의 토폴로지 구조에 따라 유형 I, 유형 II 또는 유형 III으로 정의될 수 있다. 유형 I 막 단백질은 단일 막관통 영역을 가지며 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하는 반면 상기 단백질의 C-말단이 세포내 측에 존재하도록 배향된다. 유형 II 막 단백질도 단일 막관통 영역을 갖지만 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고 상기 단백질의 N-말단이 세포내 측에 존재하도록 배향된다. 유형 III 막 단백질은 다수의 막관통 세그먼트를 가지며 막관통 세그먼트의 수와 N-말단 및 C-말단의 위치에 따라 추가로 분류될 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 따른 CAR의 막관통 도메인은 유형 I 단일 통과 막 단백질로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 단중 통과 막 단백질로부터 유래된 막관통 도메인은 또한 본원에 따른 CAR에서 사용하기에 적합할 수 있다. 단중 통과 막 단백질은 복합체(적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상) α 나선 또는 β 시트 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 단중 통과 막 단백질의 N-말단과 C-말단은 지질 이중층의 반대편에 존재하며, 예를 들어, 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포내 측에 존재하고 상기 단백질의 C-말단은 세포외 측에 존재한다.
본원에 따른 CAR에 사용되는 막관통 도메인은 합성된 비-자연 발생 단백질 세그먼트의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 막관통 도메인은 합성된 비-자연 발생 α 나선 또는 β 시트이다. 일부 실시예에서, 단백질 세그먼트는 적어도 약 20개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 아미노산이다. 합성된 막관통 도메인의 구현예는 미국 특허 번호 7,052,906 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776과 같이 당업계에 공지되어 있으며, 이의 관련 개시 내용은 참조로서 본원에 인용된다.
본원에 의해 제공되는 막관통 도메인은 막관통 영역 및 막관통 도메인의 C-말단 측에 위치한 세포내 영역을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 세포내 영역은 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 일부 실시예에서, 지질 이중층에서 막관통 도메인의 배향에 도움이 된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 막관통 영역에 존재한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 세포내 영역에 존재한다. 일부 실시예에서, 막관통 도메인의 세포내 영역은 양전하를 띤 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 막관통 도메인의 세포내 영역은 아르기닌, 세린 및 라이신과 같은 아미노산을 포함한다.
일부 실시예에서, 막관통 도메인의 막관통 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR의 막관통 도메인은 인공 소수성 서열을 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항은 막관통 도메인의 C-말단에 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 막관통 영역은 주로 소수성 아미노산 잔기, 예를 들어 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 발린을 포함한다. 일부 실시예에서, 막관통 영역은 소수성이다. 일부 실시예에서, 막관통 영역은 폴리류신-알라닌 서열을 포함한다. 단백질 또는 단백질 세그먼트의 친수성 또는 소수성 또는 친수성 특징은 Kyte 및 Doolittle 친수성 분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 평가될 수 있다.
일부 실시예에서, CAR의 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 α, β 또는 ζ 사슬, CD28, CD3 ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDl la, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CD19, IL-2R β, IL-2R γ, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDIOO(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 다른 특정 실시예에서, 막관통 도메인은 CD28α로부터 유래된다.
세포내 신호 전달 도메인
본원에 의해 제공되는 CAR 내의 세포내 신호 전달 도메인은 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포의 적어도 하나의 정상적인 이펙터 기능의 활성화를 담당한다. 용어 “이펙터 기능”은 세포의 특수 기능을 의미한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성(사이토카인 분비 포함)일 수 있다. 따라서, 용어 “세포내 신호 전달 도메인”은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특정 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 의미한다. 일반적으로 전체 세포내 신호 전달 도메인을 사용할 수 있지만, 많은 경우에 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호 전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 한, 이러한 절단된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달한다면 완전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호 전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호 전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 면역 이펙터 세포의 1차 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, CAR은 기본적으로 면역 이펙터 세포의 1차 세포내 신호 전달 도메인으로 구성된 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. “1차 세포내 신호 전달 도메인”은 자극적 방식으로 작용하여 면역 이펙터 기능을 유도하는 세포내 신호 전달 서열을 의미한다. 일부 실시예에서, 1차 세포내 신호 전달 도메인은 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM이라는 신호 전달 모티프를 함유한다. 본원에 사용된 바와 같이, “ITAM”은 많은 면역 세포에서 발현되는 신호 전달 분자의 꼬리에서 일반적으로 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 모티프는 6-8개의 아미노산에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개의 반복을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 x는 독립적으로 임의의 아미노산이고, 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생성한다. 신호 전달 분자 내의 ITAM은 세포내 신호 전달에 중요하며, 상기 신호 전달은 신호 전달 분자의 활성화 후 ITAM에서 티로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. ITAM은 또한 신호 전달 경로에 관여하는 다른 단백질의 도킹 부위 역할을 할 수 있다. 예시적인 ITAM 함유 1차 세포내 신호 전달 서열은 CD3z, FcR γ(FCER1G), FcR β(Fc ε Rib), CD3 γ, CD3 δ, CD3 ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래되는 것들을 포함한다.
공동자극 신호 전달 도메인
일부 실시예에서, CAR은 적어도 하나의 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “공동자극 신호 전달 도메인”은 세포내 신호 전달을 매개하여 면역 반응(예를 들어, 이펙터 기능)을 유도하는 단백질의 적어도 일부분을 의미한다. 항원 특이적 신호를 자극하는 것 외에도 많은 면역 이펙터 세포는 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진하고 세포의 이펙터 기능을 활성화하기 위해 공동자극을 필요로 한다.
본원에 따른 키메라 수용체의 공동자극 신호 전달 도메인은 신호를 전달하고 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구와 같은 면역 세포에 의해 매개되는 반응을 조절하는 공동자극 단백질로부터 유래된 세포내 신호 전달 도메인일 수 있다. “공동자극 신호 전달 도메인”은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 용어 “공동자극 분자”는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합함으로써 예를 들어 증식 및 생존을 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역 세포의 공동자극 반응을 매개하는 면역 세포(예를 들어, T 세포) 상의 동족 결합 파트너를 의미한다.
일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 단일 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 2개 이상(예를 들어, 약 2, 3, 4개 또는 그 이상 중 임의의 하나)의 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 2개 이상의 동일한 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 상이한 공동자극 단백질(예를 들어, 본원에 따른 임의의 2개 이상의 공동자극 단백질)로부터 유래된 2개 이상의 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 1차 세포내 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3z의 세포내 신호 전달 도메인) 및 하나 이상의 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 공동자극 신호 전달 도메인과 1차 세포내 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3z의 세포내 신호 전달 도메인)은 선택적인 펩티드 링커에 의해 서로 융합된다. 1차 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 신호 전달 도메인은 임의의 적합한 순서에 따라 배열될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 공동자극 신호 전달 도메인은 막관통 도메인과 1차 세포내 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3z의 세포내 신호 전달 도메인) 사이에 위치한다. 다수의 공동자극 신호 전달 도메인은 부가적 또는 상승적 자극 효과를 제공할 수 있다.
숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 공동자극 신호 전달 도메인의 활성화는 세포가 사이토카인 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포 독성을 증가시키거나 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 공동자극 분자의 공동자극 신호 전달 도메인은 본원에 따른 CAR에 사용하기에 적합할 수 있다. 공동자극 신호 전달 도메인의 하나 이상의 유형은 예를 들어 이펙터 분자가 발현될 면역 이펙터 세포의 유형(예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구) 및 원하는 면역 이펙터 기능(예를 들어, ADCC 효과) 등 요인에 기초하여 선택된다. CAR에 사용되는 공동자극 신호 전달 도메인의 구현예는 B7/CD28 패밀리의 구성원(예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC 및 PDCD6); TNF 슈퍼 패밀리의 구성원(예를 들어, 4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림프독소-α/TNF-β, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-α 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원(예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 및 SLAM/CD150); 및 CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 클래스 I , HLA-DR, Ikaros, 인테그린 α4/CD49d, 인테그린 α4β1, 인테그린 α4β7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1) 및 NKG2C와 같은 임의의 다른 공동자극 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 공동자극 단백질의 세포내 신호 전달 도메인일 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 공동자극 신호 전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 공동자극 신호 전달 도메인은 공동자극 신호 전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조절할 수 있도록 하는 본원에 따른 임의의 공동자극 신호 전달 도메인의 변이체이다. 일부 실시예에서, 공동자극 신호 전달 도메인은 야생형 대조물과 비교하여 최대 10개의 아미노산 잔기 변이(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 8개)를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 변화를 포함하는 이러한 공동자극 신호 전달 도메인은 변이체로 지칭될 수 있다. 공동자극 신호 전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동자극 신호 전달 도메인에 비해 증가된 신호 전달 및 면역 반응의 강화된 자극을 유발할 수 있다. 공동자극 신호 전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동자극 신호 전달 도메인에 비해 감소된 신호 전달 및 면역 반응의 감소된 자극을 유발할 수 있다.
신호 펩티드
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR은 폴리펩티드의 N-말단에 신호 펩티드(신호 서열이라고도 함)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩티드는 폴리펩티드가 세포의 원하는 부위로 표적화하도록 하는 펩티드 서열이다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 이펙터 분자를 세포의 분비 경로로 표적화하고 지질 이중층으로의 이펙터 분자의 통합 및 고정을 허용한다. 본원에 따른 CAR에서 사용하기에 적합하고 자연 발생 단백질의 신호 서열 또는 합성된 비-자연 발생 신호 서열을 포함하는 신호 펩티드는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 CD8α, GM-CSF 수용체α 및 IgG1 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
힌지 영역
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR은 세포외 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 일반적으로 단백질의 2개의 도메인 사이에서 발견되는 아미노산 세그먼트이며, 단백질의 유연성 및 서로에 대한 하나 또는 두 도메인의 이동을 허용할 수 있다. 이펙터 분자의 막관통 도메인에 비해 세포외 항원 결합 도메인의 이러한 유연성 및 이동을 제공하는 임의의 아미노산 서열을 사용할 수 있다.
항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체)의 힌지 도메인은 또한 본원에 따른 pH 의존성 키메라 수용체 시스템에 사용하기에 적합하다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인이며, 항체 및 상기 항체의 하나 이상의 불변 영역의 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인은 항체 및 상기 항체의 CH3 불변 영역의 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인은 항체 및 상기 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역의 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체이다. 일부 실시예에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시예에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비-자연 발생 펩티드는 또한 본원에 따른 키메라 수용체의 힌지 도메인으로 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, Fc 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이의 힌지 도메인은 (GxS)n 링커와 같은 펩티드 링커이며, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상을 포함하는 3 내지 12의 정수일 수 있다.
힌지 도메인은 약 10-100개의 아미노산, 예를 들어, 약 15-75개의 아미노산, 20-50개의 아미노산 또는 30-60개의 아미노산 중 임의의 하나를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인의 길이는 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75개의 아미노산 중 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 모두 본원에 따른 키메라 수용체에 사용하기에 적합하다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이며, 키메라 수용체에 유연성을 부여한다.
일부 특정 실시예에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 일부분, 예를 들어 CD8α의 힌지 도메인의 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30, 35 또는 40개)의 연속 아미노산을 함유하는 단편이다. 다른 실시예에서, 힌지 도메인은 CD28α로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 힌지 도메인은 CD28α의 힌지 도메인의 일부분, 예를 들어 CD28α의 힌지 도메인의 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30, 35 또는 40개)의 연속 아미노산을 함유하는 단편이다.
예시적인 CAR
본 출원에서 Kymria™(tisagenlecel), Yescart™(axicabtagene ciloleucel), ALEXIS AIDT-2 EOC(Kiromic Biopharma Inc), CIK-CAR.PSMA(Formula Pharmaceuticals Inc), ADI-002(Adicet Bio Inc), TSC-200(TScan Therapeutics Inc), TSC-100(TScan Therapeutics Inc), RB-H21(Refuge Biotechnologies Inc), ADP-A2AFP(Adapimmune Therapeunics plc), CT-0729(Carisma Therapeustics), CT-1119(Carisma Therapeutics), CCT-301-59(EXUMA Biotech Corp), BOXR-889(Unum Therapeutics Inc), meso-CAR-T+PD-78(MirImmune LLC), MAGE-A10C796T(Adaptimune Therapeunics plc), NKG2D-DARIC T 세포(Bluebird Bio Inc), AGENt-NY-ESO-1 X(AgenTus Therapeutics Inc), MB-105(City of Hope Medical Center), P-MUC1C-101(Poseida Therapeustics Inc), TT-16(Baylor College of Medicine), ACTR-087(Unum Therapeutics Inc), EGFR-806(Seattle Children's Hospital), TAC01-ROR1(Triumvira Immunologics Inc), CCT-301-38(EXUMA Biotech Corp), MB-103(Mustang Bio Inc), TAB-28z(OncoTab Inc), ET-1402(Eureka Therapeutics Inc), ITI-1000(Duke University), CIDeCAR(Bellicum Pharmaceuticals Inc), MT-201(Myeloid Therapeunics Inc), CT-0508(Carisma Therapeustics), ADP-A2M4(Adapeimune Therapeutics plc), AMG-119(Amgen Inc), iCasp9M28z T 세포(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center), P-PSMA-101(Poseida Therapeutics Inc), ACE-1702(Acepodia Inc), AIC-100(Cornell University), PRGN-3005(Precigen Inc), UniCAR-T-PSMA(GEMoaB Monoclonals GmbH), IMA-204(MD Anderson Cancer Center), DSG3-CAART(University of Pennsylvania), LXF-821(University of Pennsylvania), MOv19-BBz CAR T 세포(University of Pennsylvania), Tn MUC-1 CAR-T(University of Pennsylvania), huMesoCART(University of Pennsylvania), IMA-203(Immatics NV), IMA-202(Immatics NV), XYP-317(Xyphos Inc), CYAD-101(Celyad Oncology), huMNC2-CAR44 T 세포(Minerva Biotechnologies Corp), HER2Bi-armed ATC(Roger Williams Medical Center) 및 CYAD-200 계열(Celdara Medical LLC), Lisocabtagene Maralequel(liso-cel), FT596(Fate Therapeutics), KTE-C19(Kite Pharma Inc), KTE-X19(Kite Pharma Inc), KITE-718(Kite Pharma Inc), KITE-439(Kite Pharma Inc), JCAR-024(Fred Hutchinson Cancer Research Center), JCAR-023(Juno Therapeutics Inc), BPX-201(Bellicum Pharmaceuticals Inc), BPX-601(Bellicus Pharmacueticals Inc), BPX-603(Bellicom Pharmaceeticals Inc), MCY-M11(MaxCyte Inc), KUR-503(Baylor College of Medicine), ICS-200(University of Alabama at Birmingham), ADP-A2M4CD8(Adapeimune Therapeutics plc), GLYCAR(Baylor College of Medicine)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 CAR을 사용할 수 있따.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CAR은 상기 및 하기 제8 부분에 기재된 예시적인 CAR 중 임의의 하나에 대해 일정한 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 CAR을 제공하며, 상기 CAR은 세포외 도메인을 포함하거나 상기 세포외 도메인으로 구성되며, 상기 세포외 도메인은 상기 및 하기 제8 부분에 기재된 CAR의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는다.
일부 실시예에서, 본원에 따른 CAR의 하나 이상의 아미노산 서열 변형을 고려하였다. 예를 들어, 세포외 도메인의 친화력, 및/또는 특이성, 열안정성, 발현 수준, 이펙터 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성 또는 용해성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 생물학적 성질의 최적화가 필요할 수 있다. 따라서, 본원에 따른 세포외 도메인 이외에, 본원에 따른 도메인의 변이체가 제조될 수도 있음이 고려된다. 예를 들어, 코딩 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 및/또는 원하는 항체 또는 폴리펩티드를 합성하여 scFv변이체를 제조할 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 항체의 번역 후 과정을 변경할 수 있음을 이해한다.
변이는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있으며, 그 결과 원래의 항체 또는 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열이 변경될 수 있다. 치환 돌연변이 유발에 대한 목적 부위는 CDR 및 FR을 포함한다.
아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환한 결과일 수 있으며, 예를 들어 세린으로 류신을 치환한 것, 예를 들어 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 기술은 본원에 의해 제공되는 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 아미노산 치환을 초래하는 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발을 포함한다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1개 내지 5개의 아미노산의 범위 내에 있다. 일부 실시예에서, 치환, 결실 또는 삽입은 원래 분자에 비해 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시예에서, 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서의 보존적 아미노산 치환이다. 허용되는 변화는 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 수행하고 얻은 변이체의 모 폴리펩티드에 의해 나타나는 활성을 테스트함으로써 결정될 수 있다.
본 출원은 보존적 아미노산 치환에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 보존적(예를 들어, 유사한 성질 및/또는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹 내에서) 치환을 수행하여 성질을 유지하거나 크게 변경하지 않는다.
한 유형의 치환변이체는 본 발명의 CAR의 세포외 항원 결합 도메인에서 모 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기 또는 이의 단편을 치환하는 것에 관한 것이다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 얻은 변이체는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들어, 증가된 친화력, 감소된 면역원성)에서 변형(예를 들어, 개선)을 가질 것이고 및/또는 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 파지 디스플레이 기반 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에 기재된 것을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화성 성숙 항체이다. 간단히 말해서, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지에 표시되며 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다.
예를 들어 항체 친화력을 향상시키기 위해 CDR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. CDR “핫스팟”, 즉 체세포 성숙 동안 빈번한 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기기(예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) 참조) 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이러한 변경이 이루어질 수 있으며, 여기서 얻은 변이체 항체 또는 이의 단편에 대한 결합 친화력이 테스트된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화성 성숙은 예를 들어, Hoogenboom 등Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 등 편집, Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 설명되어 있다. 친화성 성숙의 일부 실시예에서, 다양한 방법(예를 들어, 오류-유발 PCR, 사슬 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발) 중 어느 하나에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 다양성이 도입된다. 그런 다음 2차 라이브러리를 구축한다. 그런 다음 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화력을 갖는 임의의 항체 변이체를 동정한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 여러 CDR 잔기(예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)를 무작위로 지정하는 CDR 지정 방법에 관한 것이다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 동정할 수 있다.
일부 실시예에서, 그러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화력을 유의하게 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 의해 제공되는 보존적 치환)은 CDR에서 이루어질 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
Cunningham 및 Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)에 기재된 바와 같이, 돌연변이 유발의 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 동정하는 유용한 방법은 “알라닌 스캐닝 돌연변이 유발”로 불린다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 결정하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 동정할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환 후보물로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를 선별하여 원하는 성질을 포함하는지 여부를 결정할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 구현예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N-말단 또는 C-말단을 항원 결합 도메인 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예를 들어, ADEPT용) 또는 폴리펩티드와 융합한 것을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 매개(부위 지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 변화를 이룰 수 있다. 클로닝된 DNA에 대해 부위 지정 돌연변이 유발(예를 들어, Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); 및 Zoller 등, Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982)),카세트 돌연변이 유발(예를 들어, Wells 등, Gene 34:315-23 (1985) 참조) 또는 다른 알려진 기술을 수행하여 항체 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
본 출원은 면역 이펙터 세포를 더 포함하며, 상기 면역 이펙터 세포는 2개의 상이한 표적에 결합하는 이중 CAR과 같은 2개 이상의 기능적 외인성 수용체를 포함한다.
7.2.3. 면역 이펙터 세포
“면역 이펙터 세포”는 면역 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 면역 세포를 의미한다. 일부 실시예에서, 상기 면역 이펙터 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 발휘한다. ADCC를 매개하는 면역 이펙터 세포의 구현예는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포 독성 T 세포, 호중구, 및 호산구를 포함한다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포이다. 일부 실시예에서, 이러한 T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시예에서, T 세포는 CAR을 발현하고 표적 세포에 결합한 후 IL-2, TFN 및/또는 TNF를 생성한다. 일부 실시예에서, CD8+ T 세포는 CAR을 발현하고 표적 세포와 결합한 후 항원 특이성 표적 세포를 용해한다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 NK 세포이다. 다른 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 NK-92 세포와 같은 확립된 세포주이다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 줄기 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS, 또는 배아 줄기 세포)로부터 분화된다.
조작된 면역 이펙터 세포는 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드를 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포에 도입하여 제조된다. 일부 실시예에서, 임의의 단리된 핵산 또는 임의의 상기 벡터의 형질감염을 통해 폴리펩티드를 면역 이펙터 세포에 도입한다.
벡터 또는 단리된 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 것이다. 설명된 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법을 통해 면역 이펙터 세포로 전달될 수 있다.
벡터를 면역 이펙터 세포에 도입하는 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 함유하는 세포의 생성 방법은 당업계에 잘 알려진 것이다. 예를 들어, Sambrook 등 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York를 참조할 수 있다. 일부 실시예에서, 전기천공에 의해 벡터를 세포에 도입한다.
벡터를 면역 이펙터 세포에 도입하는 생물학적 방법에는 DNA 및 RNA 벡터의 사용이 포함된다. 바이러스 벡터는 유전자를 인간 세포와 같은 포유동물에 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다.
벡터를 면역 이펙터 세포에 도입하는 화학적 방법은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템과 같은 콜로이드 분산 시스템을 포함한다. 시험관내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
일부 실시예에서, 본원에 따른 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 분자는 통상적인 방법(예를 들어, 시험관 내 전사)을 통해 제조된 다음, mRNA 전기천공과 같은 공지된 방법을 통해 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, Rabinovich 등, Human Gene Therapy 17:1027-1035 (2006)를 참조할 수 있다.
일부 실시예에서, 형질도입되거나 형질감염된 면역 이펙터 세포는 벡터 또는 단리된 핵산이 도입된 후 생체외에서 증식된다. 일부 실시예에서, 형질도입되거나 형질감염된 면역 이펙터 세포는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일 또는 14일 중 임의의 일간 증식되도록 배양된다. 일부 실시예에서, 형질도입되거나 형질감염된 면역 이펙터 세포를 추가로 평가 또는 스크리닝하여 조작된 포유동물 세포를 선택한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 동정하고 조절 서열의 기능을 평가하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 발현되지 않는 유전자이며, 상기 리포터 유전자는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드의 발현은 검출이 용이한 일부 특성(예를 들어, 효소 활성)에 의해 나타난다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포에 도입된 후 적합한 시간에 검출된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, Ui-Tei 등 FEBS Letters 479: 79-82 (2000)). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다.
조작된 면역 이펙터 세포에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재를 확인하는 다른 방법은 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 분자 생물학적 측정법; 면역학적 방법(예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯)을 통해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 생화학적 측정법을 포함한다.
7.2.4. T 세포 유래
일부 실시예에서, T 세포의 증폭 및 유전적 변형 전에, 피험자로부터 T 세포를 얻는다. T 세포는 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양으로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시예에서, 당업계에서 사용 가능한 다양한 T 세포주를 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 당업자에게 공지된 다양한 기술(예를 들어, Ficoll™ 분리)을 사용하여, 피험자로부터 수집된 혈액으로부터 T 세포를 얻을 수 있다. 일부 실시예에서, 개체의 순환 혈액으로부터 유래된 세포는 성분채집술(apheresis)에 의해 얻어진다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일부 실시예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 부분을 제거할 수 있고, 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣는다. 일부 실시예에서, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척한다. 일부 실시예에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고, 마그네슘이 부족할 수 있거나, (전부는 아니지만) 많은 2가 양이온이 부족할 수 있다. 칼슘이 존재하지 않는 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 당업자는 제조자의 지시에 따라 반자동 “유동식” 원심분리기를 사용하는 것과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 세척 단계를 수행할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5). 세척 후, 세포는 Ca2+ 무함유, Mg2+ 무함유 PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액을 함유하거나 함유하지 않는 다른 염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플에서 바람직하지 않은 성분을 제거하고 배지에 직접 세포를 재현탁할 수 있다.
일부 실시예에서, 예를 들어 PERCOLL™ 구배 원심분리 또는 역류 원심분리에 의한 용출에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈하여 말초 혈액 림프구에서 T 세포를 분리한다. 양성 또는 음성 선택 기술을 통해 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위 집단을 추가로 분리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 동안 항-CD3/항-CD28(즉, 3 × 28) 접합 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)와 함께 배양하여 T 세포를 분리한다. 일부 실시예에서, 상기 시간은 약 30분이다. 다른 실시예에서, 상기 시간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 다른 실시예에서, 상기 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 일부 실시예에서, 상기 시간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시예에서, 상기 배양 시간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 분리하기 위해 더 긴 배양 시간(예를 들어, 24시간)을 사용하면 세포 수율을 높일 수 있다. 종양 조직 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 경우와 같이 다른 세포 유형보다 T 세포가 적은 임의의 경우 T 세포를 분리하기 위해 더 긴 배양 시간을 사용할 수 있다. 또한, 더 긴 배양 시간을 사용하면 CD8+ T 세포의 포획 효율을 높일 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단순히 단축 또는 연장하고 및/또는 T 세포에 대한 비드의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써 배양 시작 시 또는 배양 과정에서의 다른 시점에서 T 세포의 하위 집단을 우선적으로 선택하거나 선택하지 않을 수 있다. 또한, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, 배양 시작 시 또는 다른 원하는 시점에서 T 세포의 하위 집단을 우선적으로 선택하거나 선택하지 않을 수 있다. 당업자는 다수의 선택 라운드가 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 일부 실시예에서, 선택 절차를 수행하고 활성화 및 증폭 과정에서 “선택되지 않은” 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있습니다. “선택되지 않은” 세포도 추가 선택 라운드를 거칠 수 있습니다.
음성 선택에 의해 T 세포 집단을 풍부하게 하는 것은 음성 선택 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체를 결합함으로써 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성 자기 면역 부착 또는 유세포 분석에 의한 세포 분류 및/또는 선택이며,상기 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체 칵테일을 사용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단일 클론 항체 칵테일에는 일반적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체가 포함된다. 일부 실시예에서, CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+을 일반적으로 발현하는 조절 T 세포를 풍부하게 하거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다다. 대안적으로, 일부 실시예에서, 항-C25 접합 비드 또는 다른 유사한 선택 방법을 통해 T 조절 세포를 고갈시킨다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 분리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 입자(예를 들어 비드))의 농도를 변경할 수 있다. 일부 실시예에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 20억 세포/mL의 농도를 사용한다. 일 실시예에서, 10억 세포/mL의 농도를 사용한다. 다른 실시예에서, 1억 이상 세포/mL를 사용한다. 다른 실시예에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만 세포/mL의 세포 농도를 사용한다. 또 다른 실시예에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억 세포/mL의 세포 농도를 사용한다. 다른 실시예에서, 1.25 또는 1.50억 세포/mL의 농도를 사용할 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증폭을 증가시킨다. 또한, 고농도의 세포를 사용하면 목적 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포(예를 들어, CD28 음성 T 세포), 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)을 보다 효율적으로 포획하도록 허용할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치가 있을 수 있으며 얻을 수 있을 것으로 예상된다. 일부 실시예에서, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 CD28 발현이 약한 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택하도록 허용한다.
일부 실시예에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석하여 입자와 세포 사이의 상호 작용을 최소화시킨다. 이로써 입자에 결합된 많은 양의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선택하였다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현하고 희석 농도의 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일부 실시예에서, 사용된 세포의 농도는 5 × 106개/mL이다. 일부 실시예에서, 사용된 농도는 약 1 × 105개/mL 내지 1 × 106개/mL, 및 양자 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
일부 실시예에서, 세포는 2℃ 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 시간 동안 상이한 속도로 회전기에서 배양될 수 있다.
자극에 사용되는 T 세포는 세척 단계 후에 냉동될 수도 있다. 이론에 얽매이지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단으로부터 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공할 수 있다. 혈장과 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 세포를 냉동 용액에 현탁시킬 수 있다. 많은 냉동 용액 및 매개변수가 당업계에 알려져 있고 이러한 상황에서 유용하지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 함유하는 배지, 또는 예를 들어 Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 사용한 다음, 세포를 1℃/분의 속도로 -80℃로 냉동하고 액체 질소 저장 탱크의 기상에 저장하는 것에 관한 것이다. -20℃ 또는 액체 질소에서 제어되지 않은 즉각적인 냉동뿐만 아니라 다른 제어된 냉동 방법을 사용할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 바와 같이, 동결 보존된 세포를 해동하고 세척하며, 활성화 전에 실온에서 1시간 동안 방치한다.
본 출원에서는 또한 본원에 따른 증폭된 세포가 필요할 가능성이 있기 이전의 기간에 피험자로부터 혈액 샘플 또는 성분채집술 생성물의 수집이 고려된다. 따라서, 증폭될 세포의 공급원은 임의의 필요한 시점에 수집될 수 있고, T 세포와 같은 원하는 세포를 분리 및 냉동하여 T 세포 요법에서 T 세포 요법으로 이익을 얻을 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 다양한 질환 또는 병태에 후속적으로 사용한다. 일 실시예에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술 혈액 성분은 일반적으로 건강한 피험자로부터 채취된다. 일부 실시예에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술 혈액 성분은 질환에 걸릴 위험이 있지만 아직 질병에 걸리지 않은 일반적으로 건강한 피험자로부터 채취되고 목적 세포를 분리하여 나중에 사용하기 위해 냉동한다. 일부 실시예에서, T 세포는 증폭되고 나중에 사용하기 위해 냉동될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 따른 특정 질환의 진단 직후 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 샘플을 수집한다. 다른 실시예에서,다양한 관련 치료 방식에 앞서 피험자의 혈액 샘플 또는 성분채집술 혈액 성분에서 세포를 분리하며, 이러한 관련 치료 방식은 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab)과 같은 약제, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역 억제제(예를 들어, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506), 항체 또는 다른 면역 제거제(immunoablative agent)(예를 들어, CAMPATH, 항-CD3 항체, 시토크산(cytoxan), 플루다라빈(fludarabine), 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228) 및 방사선을 사용한 치료를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 성장 인자 유도 신호 전달에 중요한 p70S6 키나아제(라파마이신)를 억제한다(Liu 등, Cell 66:807-815 (1991); Henderson 등, Immun 73:316-321 (1991); Bierer 등, Curr. Opin. Immun. 5:763-773 (1993)). 다른 실시예에서, 환자의 세포를 분리하고 냉동하여, 골수 또는 줄기 세포로의 이식, 화학요법제(예를 들어, 플루다라빈)를 사용한 T 세포 고갈 요법, 외부 빔 방사선 요법(XRT), 시토크산 또는 항체(예를 들어, OKT3 또는 CAMPATH)와 결합(예를 들어, 이전, 동시 또는 이후)하여 사용한다. 다른 실시예에서, B 세포 고갈 요법(예를 들어, 리툭산(Rituxan)과 같은 CD20과 반응하는 약제) 전에 세포를 분리하고, 나중에 사용하기 위해 냉동할 수 있다.
일부 실시예에서,치료 동안 또는 직접 환자로부터 T 세포를 얻는다. 이와 관련하여 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용하여 치료한 후, 얻은 T 세포의 품질은 환자가 일반적으로 치료에서 회복하는 기간, 치료 직후에 최적의 상태가 될 수 있음이 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 따른 방법을 사용한 생체 외 조작 후, 이러한 세포는 향상된 생착 및 생체내 증폭을 위해 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, T 세포, 수지상 세포, 또는 다른 조혈 계통의 세포를 포함하는 혈액 세포가 해당 회복 단계 동안 수집되는 것이 본 출원의 맥락에서 고려된다. 또한, 부 실시예에서, 동원(예를 들어, GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 방안은 피험자에서 조건을 생성하는데 사용될 수 있으며, 여기서 특히 치료 후 정의된 기간 동안 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 증폭에 유리하다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
7.2.5. T 세포의 활성화 및 증폭
일부 실시예에서, 본원에 따른 CAR을 갖는 T 세포의 유전적 변형 이전 또는 이후에, T 세포는 모두 일반적으로 예를 들어 미국 특허 번호 6,352,694, 6,534,055, 6,905,680, 6,692,964, 5,858,358, 6,887,466, 6,905,681, 7,144,575, 7,067,318, 7,172,869, 7,232,566, 7,175,843, 5,883,223, 6,905,874, 6,797,514, 6,867,041, 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 방법을 사용하여 활성화 및 증폭될 수 있다.
일반적으로, CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 약제 및 T 세포 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 T 세포를 증폭할 수 있다. 특히, 본원에 기재된 바와 같이 예를 들어 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온 백터에 결합된 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)에 의해 T 세포 집단을 자극할 수 있다. T 세포 표면의 보조 분자를 공동 자극하기 위해 보조 분자에 결합하는 리간드를 사용할 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식을 자극하기에 적합한 조건에서, T 세포 집단을 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 사용할 수 있다. 항-CD3 항체의 구현예는 UCHT1, OKT3, HIT3a(BioLegend, San Diego, US)를 포함하며, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용할 수 있다(Graves J 등, J.Immunol. 146:2102 (1991); Li B 등, Immunology 116:487 (2005); Rivollier A 등, Blood 104:4029 (2004)). 항-CD28 항체의 구현예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)을 포함하며, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용할 수 있다(Berg 등, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998); Haanen 등, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland 등, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63 (1999)).
일부 실시예에서, T 세포의 1차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 방안에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어,각 신호를 제공하는 약제는 용액에 있거나 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합할 경우, 약제는 동일한 표면에 결합될 수 있거나(즉, “시스” 형태) 또는 별도의 표면에 결합될 수 있다(즉, “트랜스” 형태). 대안적으로, 한 가지 약제는 용액에서 표면 및 다른 한 가지 약제에 결합될 수 있다. 일 실시예에서, 공동자극 신호를 제공하는 약제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 약제는 용액 중에 있거나 표면에 결합된다. 일부 실시예에서, 두 가지 약제는 모두 용액에 있을 수 있다. 다른 실시예에서, 약제는 가용성 형태일 수 있고, Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 약제에 결합할 다른 결합제와 같은 표면에 가교결합될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810의 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 참조할 수 있으며, 이들은 본 출원의 일부 실시예에서 T 세포의 활성화 및 증폭에 사용하기 위해 고려된다.
일부 실시예에서, T 세포를 약제가 코팅된 비드와 조합하고, 후속적으로 비드와 세포를 분리한 다음, 세포를 배양한다. 다른 실시예에서, 배양 전에 약제가 코팅된 비드와 세포를 분리하지 않고 함께 배양한다. 다른 실시예에서, 먼저 자기력과 같은 힘을 가하여 비드와 세포를 농축시켜 세포 표면 마커의 연결을 증가시킴으로써 세포 자극을 유도한다.
예를 들어, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드(3 × 28 비드)가 T 세포와 접촉하도록 함으로써 연결될 수 있다. 일 실시예에서, 세포(예를 들어, 104 내지 4 × 108 T 세포)와 비드(예를 들어, 권장 역가가 1:100인 항-CD3/CD28 MACSiBead 입자)를 완충액, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 없음)에 조합한다. 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에서 매우 적고 샘플의 0.01%만 차지하거나 전체 샘플(즉, 100%)이 목적 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포의 수는 모두 본 출원의 범위 내에 있다. 일부 실시예에서, 세포와 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 약 20억개 세포/mL의 농도를 사용한다. 다른 실시예에서, 1억 이상 세포/mL를 사용한다. 다른 실시예에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만 세포/mL의 세포 농도를 사용한다. 또 다른 실시예에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억 세포/mL의 세포 농도를 사용한다. 다른 실시예에서, 1.25 또는 1.50억 세포/mL의 농도를 사용할 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증폭을 증가시킨다. 또한, 고농도의 세포를 사용하면 목적 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 CD28 음성 T 세포와 같은 세포를 보다 효율적으로 포획하도록 허용할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치가 있을 수 있으며 일부 실시예에서 얻을 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 CD28 발현이 약한 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택하도록 허용한다.
일부 실시예에서, 혼합물은 몇 시간(약 3시간) 내지 약 14일 또는 양자 사이의 임의의 시간 정수 값 동안 배양될 수 있다. 다른 실시예에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 일 실시예에서, 비드 및 T 세포는 함께 약 8일 동안 배양된다. 다른 실시예에서, 비드 및 T 세포는 함께 2-3일 동안 배양된다. T 세포 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 주기의 자극이 필요할 수도 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 적합한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지1640 또는 X-vivo 15(Lonza))를 포함하며, 이는 혈청(예를 들어, 소태아혈청 또는 인간 혈청), 인터루킨 -2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포 성장에 사용되는 임의의 다른 첨가제를 포함한 증식 및 생존력에 필요한 인자를 함유할 수 있다. 세포 성장에 사용되는 다른 첨가제는 계면활성제, 인간 혈장 단백질 분말, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, 옵티마이저이 포함될 수있고, 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 첨가되거나, 무혈청 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 결정된 호르몬 세트, 및/또는 성장 및 증폭T 세포의 성장 및 증폭에 충분한 양의 사이토카인이 보충될 수 있다. 항생제(예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신)는 피험자 체내에 주입할 세포 배양물이 아닌 실험 배양물에만 포함된다. 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기+5% CO2)와 같은 성장을 지원하는데 필요한 조건에서 표적 세포를 유지한다. 상이한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집술 혈핵 성분의 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포 독성 또는 억제 T 세포 집단(TC, CD8)보다 보조 T 세포 집단(TH, CD4+)이 더 많다. CD3 및 CD28 수용체의 자극에 의한 T 세포의 생체외 증폭을 통해 T 세포 집단을 생성하며, 상기 T 세포 집단은 약 8-9일 전에 주로 TH 세포로 구성되고, 약 8-9일 후, T 세포 집단은 더 많은 TC 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 피험자에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원 특이적 하위 집합이 분리되면, 상기 하위 집합을 더 크게 증폭하는 것이 유익할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 외에도 다른 표현형 마커도 상당히 다르지만 세포 증폭 과정에서 대부분 재현 가능하다. 따라서, 이러한 재현성은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 제품의 맞춤화를 가능하게 한다.
7.3. 기능적 외인성 수용체 및 하나 이상의 추가 도메인을 포함하는 폴리펩티드
다른 양태에서, 본원은 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR, TCR 및 TAC) 및 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCR7의 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21) 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예에서, 본원은 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR, TCR 및 TAC) 및 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCL-19 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예에서, 본원은 CAR 및 p40을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시예에서, 본원은 CAR 및 CCL-19를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본원은 CAR 및 p40 및 CCL-19를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 CAR은 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 p40 및 CCL-19는 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 본원은 TCR 및 p40을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시예에서, 본원은 TCR 및 CCL-19를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본원은 TCR 및 p40 및 CCL-19를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 p40 및 CCL-19는 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 본원은 TAC 및 p40을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시예에서, 본원은 TAC 및 CCL-19를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본원은 TAC 및 p40 및 CCL-19를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 p40 및 CCL-19는 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 인간 p40 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 막 결합된 폴리펩티드(예를 들어, MB12)이다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 인간 CCL-19 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드에서, CAR, p40 및/또는 CCL-19는 임의의 순서에 따라 배열될 수 있다. 예를 들어, 여기서 CAR, p40 및 CCL-19가 모두 폴리펩티드에 존재하는 경우, 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CAR, p40 및 CCL-19를 포함하고; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CAR, CCL-19 및 p40을 포함하며; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CCL-19, p40 및 CAR을 포함하고; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 p40, CCL-19 및 CAR을 포함하며; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 p40, CAR 및 CCL-19를 포함하고; 또한 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CCL-19, CAR 및 p40을 포함한다.
본원에 의해 제공되는 다양한 폴리펩티드의 일부 실시예에서, CAR, p40 및/또는 CCL-19는 펩티드 링커를 통해 서로 연결된다. 일부 실시예에서, 펩티드 링커는 CAR, p40 및/또는 CCL-19가 세포에서 절단된 후 별도의 폴리펩티드가 되도록 하는 2A 자가 절단 펩티드와 같은 자가 절단 펩티드이다.
다른 실시예에서, 본원은 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR, TCR 및 TAC) 및 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCL-21 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예에서, 본원은 CAR 및 p40을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시예에서, 본원은 CAR 및 CCL-21을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본원은 CAR 및 p40 및 CCL-21을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 CAR은 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 p40 및 CCL-21은 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 본원은 TCR 및 p40을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시예에서, 본원은 TCR 및 CCL-21을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본원은 TCR 및 p40 및 CCL-21을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 p40 및 CCL-21은 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 본원은 TAC 및 p40을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시예에서, 본원은 TAC 및 CCL-21을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본원은 TAC 및 p40 및 CCL-21을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 p40 및 CCL-21은 상기 제7.2 부분에 설명된 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 인간 p40 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 p40 폴리펩티드는 막 결합된 폴리펩티드(예를 들어, MB12)이다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 인간 CCL-21 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드에서, CAR, p40 및/또는 CCL-21은 임의의 순서에 따라 배열될 수 있다. 예를 들어, 여기서 CAR, p40 및 CCL-21이 모두 폴리펩티드에 존재하는 경우, 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CAR, p40 및 CCL-21을 포함하고; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CAR, CCL-21 및 p40을 포함하며; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CCL-21, p40 및 CAR을 포함하고; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 p40, CCL-21 및 CAR을 포함하며; 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 p40, CAR 및 CCL-21을 포함고; 또한 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CCL-21, CAR 및 p40을 포함한다.
본원에 의해 제공되는 다양한 폴리펩티드의 일부 실시예에서, CAR, p40 및/또는 CCL-21은 펩티드 링커를 통해 서로 연결된다. 일부 실시예에서, 펩티드 링커는 CAR, p40 및/또는 CCL-21이 세포에서 절단된 후 별도의 폴리펩티드가 되도록 하는 2A 자가 절단 펩티드와 같은 자가 절단 펩티드이다.
2A 펩티드의 구성원은 처음 설명된 이들의 바이러스의 이름을 따서 명명되었다. 예를 들어, 처음 설명된 2A 펩티드 F2A는 구제역 바이러스로부터 유래된다. 자가 절단하는 18-22개의 아미노산 길이의 2A 펩티드는 프롤린과 글리신 잔기 사이의 “리보솜 스키핑”을 매개하고 다운스트림 번역에 영향을 미치지 않고 펩티드 결합 형성을 억제한다. 이러한 펩티드는 여러 단백질이 번역 시 구성 단백질로 분리되는 다단백질로 코딩되도록 한다. 자가 절단 펩티드는 피코르나바이러스과 바이러스 계열의 구성원에 존재하며, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV), 말 비염 A 바이러스(ERAV), 테세아 아시그나 바이러스(TaV) 및 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1)과 같은 구제역 바이러스(aphthovirus)(Donnelly 등, J. Gen. Virol., 82: 1027-101 (2001); Ryan 등, J. Gen. Virol., 72: 2727-2732 (2001) 참조), 및 틸로바이러스(예를 들어, 타일러 뮤린 뇌척수염) 및 뇌심근염 바이러스와 같은 심장 바이러스를 포함한다. FMDV, ERAV, PTV-1 및 TaV로부터 유래된 2A 펩티드는 때로 각각 “F2A”, “E2A”, “P2A” 및 “T2A”로 지칭되고, 본 출원의 내용에 포함되며, 예를 들어, Donnelly 등, J. Gen. Virol., 78: 13-21 (1997); Ryan 및 Drew, EMBO J., 13: 928-933 (1994); Szymczak 등, Nature Biotech., 5: 589-594 (2004); Hasegawa 등, Stem Cells, 25(7): 1707-12 (2007) 등 문헌에 기재되어 있다. 다른 실시예에서, 본원은 Shah 및 Muir, Chem Sci., 5(1): 446-461 (2014) 및 Topilina 및 Mills, Mobile DNA, 5 (5) (2014)에 기재된 바와 같은 인테인 매개 단백질 스플라이싱 시스템을 사용한다. 당업계에 공지된 다른 방법은 또한 본 발명의 구축물에 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 2A 자가 절단 펩티드는 F2A, E2A, P2A, T2A 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 2A 자가 절단 펩티드 P2A 단편이다. 특정 실시예에서, 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 T2A 단편이다.
일부 특정 실시예에서, p40 및 CCL-19는 제1 자가 절단 펩티드를 통해 연결된다. 일부 실시예에서, 제1 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 2A 자가 절단 펩티드 T2A 단편이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCL-19를 포함하는 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCL-19를 포함하는 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR)는 제2 자가 절단 펩티드를 통해 도메인에 연결된다. 일부 실시예에서, 제2 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 2A 자가 절단 펩티드 P2A 단편이다.
다른 특정 실시예에서, p40 및 CCL-21은 제1 자가 절단 펩티드를 통해 연결된다. 일부 실시예에서, 제1 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 2A 자가 절단 펩티드 T2A 단편이다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCL-21을 포함하는 도메인은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 IL-12의 p40 서브유닛 및 CCL-21을 포함하는 도메인은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열의 동일성을 가는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR)는 제2 자가 절단 펩티드를 통해 도메인에 연결된다. 일부 실시예에서, 제2 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 2A 자가 절단 펩티드 P2A 단편이다.
다른 양태에서, 본원은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하며, 상기 폴리펩티드는 본원에 의해 제공되는 기능적 외인성 수용체(예를 들어, CAR), IL-12의 p40 서브유닛, 및/또는 CCR7의 리간드(예를 들어, CCL-19 및 CCL-21)를 포함하고, 이는 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
7.4. 폴리뉴클레오티드
다른 양태에서, 본 출원은 상기 제7.2 부분 및 제7.3 부분에 설명된 것을 포함하는, 본원에 의해 제공되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
보다 특히, 일부 실시예에서, 본원은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체(CAR), p40 및 CCL-19를 포함하고, 여기서 상기 CAR, p40 및 CCL-19는 펩티드 링커(예를 들어, 2A 자가 절단 펩티드 링커)를 통해 서로 융합된다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 CAR을 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역 및/또는 CCL-19를 코딩하는 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 이러한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CAR을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 CCL-19를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CAR을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 영역 및 CCL-19를 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 p40을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, CAR을 코딩하는 영역 및 CCL-19를 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CCL-19를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, CAR을 코딩하는 영역 및 p40을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 TCR(또는 이의 서브유닛), p40 및 CCL-19를 포함하고, 여기서 상기 TCR(또는 이의 서브유닛), p40 및 CCL-19는 펩티드 링커(예를 들어, 2A 자가 절단 펩티드 링커)를 통해 서로 융합된다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역, 및/또는 CCL-19를 코딩하는 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 이러한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 CCL-19를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 영역 및 CCL-19를 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 p40을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 영역 및 CCL-19를 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CCL-19를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 영역 및 p40을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 TAC(또는 이의 도메인), p40 및 CCL-19를 포함하고, 여기서 상기 TAC(또는 이의 도메인), p40 및 CCL-19는 펩티드 링커(예를 들어, 2A 자가 절단 펩티드 링커)를 통해 서로 융합된다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역, 및/또는 CCL-19를 코딩하는 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 이러한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 CCL-19를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 영역 및 CCL-19를 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 p40을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 영역 및 CCL-19를 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CCL-19를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 영역 및 p40을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시예에서, 본원은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체(CAR), p40 및 CCL-21을 포함하고, 여기서 상기 CAR, p40 및 CCL-21은 펩티드 링커(예를 들어, 2A 자가 절단 펩티드 링커)를 통해 서로 융합된다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 CAR을 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역 및/또는 CCL-21을 코딩하는 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 이러한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CAR을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 CCL-21을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CAR을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 영역 및 CCL-21을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 p40을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, CAR을 코딩하는 영역 및 CCL-21을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CCL-21을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, CAR을 코딩하는 영역 및 p40을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 TCR(또는 이의 서브유닛), p40 및 CCL-21을 포함하고, 여기서 상기 TCR(또는 이의 서브유닛), p40 및 CCL-21은 펩티드 링커(예를 들어, 2A 자가 절단 펩티드 링커)를 통해 서로 융합된다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역, 및/또는 CCL-21을 코딩하는 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 이러한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 CCL-21을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 영역 및 CCL-21을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 p40을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 영역 및 CCL-21을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CCL-21을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TCR(또는 이의 서브유닛)을 코딩하는 영역 및 p40을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 TAC(또는 이의 도메인), p40 및 CCL-21을 포함하고, 여기서 상기 TAC(또는 이의 도메인), p40 및 CCL-21은 펩티드 링커(예를 들어, 2A 자가 절단 펩티드 링커)를 통해 서로 융합된다.
또 다른 양태에서, 본원은 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역, 및/또는 CCL-21을 코딩하는 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 이러한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 CCL-21을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, p40을 코딩하는 영역 및 CCL-21을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 p40을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 영역 및 CCL-21을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 CCL-21을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, TAC(또는 이의 도메인)를 코딩하는 영역 및 p40을 코딩하는 영역을 함유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하고; 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 단일 가닥이면, 코딩 가닥 또는 비코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 cDNA 형태이다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 합성 폴리뉴클레오티드이다.
본 출원은 또한 본원에 따른 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이며, 여기서 상기 변이체는 예를 들어 본 출원의 폴리펩티드의 단편, 유사체 및/또는 유도체를 코딩한다. 일부 실시예에서, 본 출원은 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 75%의 동일성, 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 약 85%의 동일성, 적어도 약 90%의 동일성, 적어도 약 95%의 동일성을 갖고 또한 일부 실시예에서 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구“참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 예를 들어 95%의 “동일성”을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드”는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 100개 뉴클레오티드당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일성을 가짐을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해, 참조 서열 내 뉴클레오티드의 최대 5%를 삭제되거나 다른 뉴클레오티드로 치환할 수 있거나, 참조 서열 내 전체 뉴클레오티드의 최대 5%에 해당하는 다수의 뉴클레오티드를 참조 서열에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이러한 돌연변이는 참조 서열의 단일 뉴클레오티드 사이에 산재된 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이러한 말단 사이에서 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속 그룹 중의 임의의 위치에서 발생할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비코딩 영역 또는 둘 다에 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 성질 또는 활성을 변경하지 않는 침묵 치환, 추가 또는 결실을 유발하는 변경을 함유한다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 (유전자 코드의 축퇴로 인해) 폴리펩티드의 아미노산 서열에 변화를 일으키지 않는 침묵 치환을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 예를 들어 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해(즉, 인간 mRNA의 코돈을 대장균과 같은 박테리아 숙주가 선호하는 코돈으로 변경하기 위해) 다양한 이유로 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체 서열의 비코딩 또는 코딩 영역에서 적어도 하나의 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체를 생성하여 코딩된 폴리펩티드의 발현(또는 발현 수준)을 조절하거나 변경한다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체를 생성하여 코딩된 폴리펩티드의 발현을 증가시킨다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체를 생성하여 코딩된 폴리펩티드의 발현을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 모 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시예에서, 모 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여, 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 감소된 발현을 갖는다.
7.5. 벡터
본원에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다. 일 실시예에서, 핵산 분자를 재조합 발현 벡터에 혼입할 수 있다.
본 출원은 본원에 따른 폴리펩티드 중 어느 하나를 클로닝 및 발현하기 위한 벡터를 제공한다. 일부 실시예에서, 벡터는 진핵 세포예를 들어 포유동물 세포에서의 복제 및 통합에 적합하다. 일부 실시예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 구현예는 아데노바이러스벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스벡터, 우두 벡터, 단순포진 바이러스 벡터 및 이의 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Sambrook 등(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 다른 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 설명되어 있다.
포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 이종 핵산을 벡터에 삽입하고 레트로바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 그런 다음 재조합 바이러스를 분리하여 시험관 내 또는 생체외에서 조작된 포유동물 세포로 전달할 수 있다. 많은 레트로바이러스 시스템은 당업계에 공지된 것이다. 일부 실시예에서, 아데노바이러스벡터를 사용한다. 많은 아데노바이러스벡터는 당업계에 공지된 것이다. 일부 실시예에서, 렌티바이러스 벡터를 사용한다. 일부 실시예에서, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들어, 면역 조절제(예를 들어, 면역관문 억제제) 코딩 서열을 갖는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 및/또는 키메라 항원 수용체를 갖는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 방안으로 패키징될 수 있다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 얻은 렌티바이러스 벡터를 포유동물 세포(예를 들어, 1차 인간 T 세포)의 형질도입에 사용할 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 전이유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 자손 세포에서의 증식을 허용하기 때문에 장기 유전자 전달에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 면역원성이 낮고 증식하지 않는 세포를 형질도입할 수 있다.
일부 실시예에서, 벡터는 본원에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 어느 하나를 포함한다. 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커의 사용을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 분자 클로닝 방법을 사용하여 핵산을 벡터로 클로닝할 수 있다. 일부 실시예에서, 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 위해 다양한 프로모터가 연구되었고, 당업계에 공지된 임의의 프로모터가 본 출원에서 사용될 수 있다. 프로모터는 대략 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터와 같은 조절성 프로모터로 분류될 수 있다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 이종 유전자(전이유전자라고도 함)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 허용한다. 본원에서 고려되는 예시적인 구성적 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 인간 신장 인자-1α(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나아제 프로모터(PGK), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터(CAGG)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전이유전자 발현의 유도에 대한 이러한 구성적 프로모터의 효율성은 많은 연구에서 광범위하게 비교되었다. 예를 들어, Michael C. Milone 등은 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK가 1차 인간 T 세포에서 키메라 항원 수용체 발현을 유도하는 효율을 비교하여, hEF1α 프로모터가 최고 수준의 전이유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라 CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지된다는 결론을 얻었다(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). 일부 실시예에서, CAR을 코딩하는 핵산은 hEF1α 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, CAR을 코딩하는 핵산은 MSCV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시예에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절성 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 물리적 조건, 조작된 면역 이펙터 세포의 미세환경 또는 조작된 면역 이펙터 세포의 생리학적 상태, 유도물질(즉, 유도제) 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 조건에 의해 유도될 수 있다.
일부 실시예에서, 유도 조건은 조작된 포유동물 세포 및/또는 약학적 조성물을 받는 피험자에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 유도 조건은 유도물질, 방사선(예를 들어, 전리 방사선, 광), 온도(예를 들어, 열), 산화환원 상태, 종양 환경 및 조작된 포유동물 세포의 활성화 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 벡터는 또한 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하기 위한 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 함유한다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자는 모두 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열 옆에 위치할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 전사 및 번역 터미네이터, 개시 서열 및 핵산 서열의 발현 조절에 사용할 수 있는 프로모터를 함유할 수 있다.
일부 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 벡터는 MND 프로모터(골수 증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, dl587rev 프라이머 결합 부위 치환된(MND) 프로모터)를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 벡터는 MSCV 프로모터를 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 벡터는 EF1α를 포함한다.
7.6. 제조 방법
또 다른 양태에서, 본원은 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포 또는 TAC-T 세포)의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 의해 제공되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 상기 제7.4 부분 및 제7.5 부분에 기재된 바와 같음)를 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)에 도입하는 단계를 포함한다.
보다 특히, 일부 실시예에서, 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포는 제 7.3 부분에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 제7.4 부분에 기재된 하나 이상의 핵산을 세포에 도입하여 생성할 수 있다.
CAR, p40 및 CCL-19는 각각 별도의 폴리펩티드로서 별도로 T 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 의해 제공되는 CAR을 코딩하는 핵산, p40을 코딩하는 핵산 및 CCL-19를 코딩하는 핵산을 각각 T 세포에 도입한다. 대안적으로, 3개 중 임의의 2개 또는 3개 모두가 하나의 핵산에 의해 T 세포에 단일 폴리펩티드로서 함께 도입될 수 있으며, 상기 핵산은 세포에서 번역 시 분해된다. 예를 들어, 본원에 의해 제공되는 CAR 및 자가 절단 펩티드 링커를 통해 연결된 p40을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 T 세포에 도입하고, CCL-19를 코딩하는 핵산을 T 세포에 별도로 도입한다. 유사하게, 본원에 의해 제공되는 CAR 및 자가 절단 펩티드 링커를 통해 연결된 CCL-19를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 T 세포에 도입하고, p40을 코딩하는 핵산을 T 세포에 별도로 도입한다. 일부 실시예에서, 자가 절단 펩티드 링커를 통해 서로 연결된 CAR, p40 및 CCL-19 세 가지 모두를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 T 세포에 도입할 수 있다. 위에서 자가 절단 펩티드 링커를 더 상세히 설명하였다. 일부 실시예에서, 2A 자가 절단 펩티드는 F2A, E2A, P2A, T2A 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 2A 자가 절단 펩티드 P2A 단편이다. 특정 실시예에서, 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 T2A 단편이다.
대안적으로, 본원에 의해 제공되는 CAR-T 세포는 CAR을 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역 및/또는 CCL-19를 코딩하는 영역과 같은 다수의 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 성성될 수 있다. 상이한 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 상이한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 의해 제공되는 방법에 따라 생성된 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 제공한다. 다른 특성 이외에, 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19가 없는 CAR-T 세포와 비교하여 더 높은 수준의 IL-23을 갖는다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 20% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 30% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 40% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 50% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 60% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 70% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 80% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 90% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상이다.
다른 실시예에서, 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현하는 CAR-T 세포는 제7.3 부분에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 제7.4 부분에 기재된 하나 이상의 핵산을 세포에 도입하여 생성할 수 있다.
CAR, p40 및 CCL-21은 각각 별도의 폴리펩티드로서 별도로 T 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 의해 제공되는 CAR을 코딩하는 핵산, p40을 코딩하는 핵산 및 CCL-21을 코딩하는 핵산을 각각 T 세포에 도입한다. 대안적으로, 3개 중 임의의 2개 또는 3개 모두가 하나의 핵산에 의해 T 세포에 단일 폴리펩티드로서 함께 도입될 수 있으며, 상기 핵산은 세포에서 번역 시 분해된다. 예를 들어, 본원에 의해 제공되는 CAR 및 자가 절단 펩티드 링커를 통해 연결된 p40을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 T 세포에 도입하고, CCL-21을 코딩하는 핵산을 T 세포에 별도로 도입한다. 유사하게, 본원에 의해 제공되는 CAR 및 자가 절단 펩티드 링커를 통해 연결된 CCL-21을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 T 세포에 도입하고, p40을 코딩하는 핵산을 T 세포에 별도로 도입한다. 일부 실시예에서, 자가 절단 펩티드 링커를 통해 서로 연결된 CAR, p40 및 CCL-21 세 가지 모두를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 T 세포에 도입할 수 있다. 위에서 자가 절단 펩티드 링커를 더 상세히 설명하였다. 일부 실시예에서, 2A 자가 절단 펩티드는 F2A, E2A, P2A, T2A 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 2A 자가 절단 펩티드 P2A 단편이다. 특정 실시예에서, 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 T2A 단편이다.
대안적으로, 본원에 의해 제공되는 CAR-T 세포는 CAR을 코딩하는 영역, p40을 코딩하는 영역 및/또는 CCL-21을 코딩하는 영역과 같은 다수의 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 생성될 수 있다. 상이한 영역은 동일한 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 하나의 프로모터로부터 유래된 다수의 유전자를 발현한다. 다른 실시예에서, 상이한 영역은 별도의 프로모터에 의해 제어된다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 의해 제공되는 방법에 따라 생성된 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 제공한다. 다른 특성 이외에, 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현하는 CAR-T 세포는 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21이 없는 CAR-T 세포와 비교하여 더 높은 수준의 IL-23을 갖는다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 20% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 30% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 40% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 50% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 60% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 70% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 80% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 90% 더 높다. 일부 실시예에서, IL-23의 수준은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상이다.
상기 CAR-T 세포와 관련하여 기재된 방법은 또한 다른 면역 이펙터 세포(예를 들어, TCR-T 세포 및 TAC-T 세포)의 생성에 사용하기에 적합하다.
7.7. 약학적 조성물
일 양태에서, 본 출원은 또한 본 출원의 조작된 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 실시예에서, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 본 출원의 조작된 T 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
특정 실시예에서, 용어 “부형제”는 또한 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 보조제(완전 또는 불완전)), 담체 또는 비히클을 의미할 수 있다. 약제학적 부형제는 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함한 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 염수 용액, 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 용액은 또한 액체 부형제로 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 포도당, 유당, 자당, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말제, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 구현예는 Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA에 설명되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 투여하기에 적합한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 부형제와 함께 정제된 형태와 같은 본원에 의해 제공되는 활성 성분을 예방적 또는 치료적 유효량으로 함유할 것이다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
일부 실시예에서, 부형제의 선택은 부분적으로 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다.
일반적으로, 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제응 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨을 포함하는 항산화제; 방부제, 등장화제, 안정화제, 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); EDTA 및/또는 비이온성 계면활성제와 같은 킬레이트제를 포함한다.
완충제는 특히 안정성이 pH 의존적인 경우 치료 효과를 최적화하는 범위 내에서 pH를 제어하는데 사용할 수 있다. 본 출원에 사용하기에 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 및 이의 염을 포함한다. 예를 들어, 구연산염, 인산염, 숙신산염, 주석산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 옥살산염, 젖산염, 아세트산염이다. 또한, 완충액은 Tris와 같은 히스티딘 및 트리메틸아민 염을 포함할 수 있다.
방부제를 첨가하여 미생물 성장을 지연시킬 수 있다. 본 출원에 사용하기에 적합한 방부제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 할라이드(예를 들어, 염소, 브롬, 요오드), 벤제토늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸파라벤 또는 프로필파라벤과 같은 알킬파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
등장화제(때로 “안정화제”라고 함)는 조성물에서 액체의 등장성을 조절하거나 유지하기 위해 존재할 수 있다. 단백질 및 항체와 같은 크고 하전된 생체 분자와 함께 사용하면 아미노산 측쇄의 하전된 그룹과 상호 작용할 수 있으므로 분자 간 및 분자 내 상호 작용의 가능성을 줄일 수 있기 때문에 일반적으로 “안정화제”라고 한다. 예시적인 등장화제는 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 다가 당 알코올, 3가 이상의 당 알코올을 포함한다.
또한 예시적인 부형제는 (1) 충전제, (2) 가용화제, (3) 안정화제 및 (4) 용기 벽에 대한 변성 또는 부착을 방지하는 약제를 포함한다. 이러한 부형제는 다가 당 알코올(위에서 열거됨); 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등과 같은 아미노산; 자당, 유당, 락티톨, 트레할로즈, 트레할로즈, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스(myoinisitose), 미오이니시톨(myoinisitol), 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 당 또는 당 알코올; 요소, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨과 같은 황 함유 환원제; 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린과 같은 저분자량 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 단당류(예를 들어, 자일로스, 만노스, 과당, 포도당); 이당류(예를 들어, 유당, 맥아당, 자당); 라피노스와 같은 담당류; 및 덱스트린 또는 덱스트란과 같은 다당류를 포함한다.
비이온성 계면활성제 또는 세제(“습윤제”라고도 알려짐)는 치료제의 가용화를 돕고 교반 유도 응집으로부터 치료 단백질을 보호하기 위해 존재할 수 있으며, 이는 또한 제형이 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성 없이 전단 표면 응력에 노출되도록 한다. 적합한 비이온성 계면활성제는 예를 들어 폴리소르베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴록사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 자당 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포석시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함한다.
투여 경로는 단일 또는 다중 볼루스 또는 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 관절내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입, 또는 지속 방출 또는 지연 방출과 같은 적합한 방식으로 장기간 주입되는 공지되고 허용된 방법에 따른다.
다른 실시예에서, 약학적 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로서 제공될 수 있다. 일 실시예에서, 펌프를 사용하여 제어 방출 또는 지속 방출을 구현할 수 있다(예를 들어, Sefton, Crit. Ref. Biomed.Eng. 14:201-40 (1987); Buchwald 등, Surgery 88:507-16 (1980); 및 Saudek 등, N. Engl. J. Med. 321:569-74 (1989) 참조). 다른 실시예에서, 중합 재료는 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에 따른 융합 단백질) 또는 본원에 의해 제공되는 조성물의 제어 방출 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Medical Applications of Controlled Release(Langer 및 Wise 편집, 1974 참조); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance(Smolen 및 Ball 편집, 1984); Ranger 및 Peppas, J. Macromol.Sci. Rev. Macromol.Chem. 23:61-126 (1983); Levy 등, Science 228:190-92 (1985); During 등, Ann.Neurol.25:351-56 (1989); Howard 등, J. Neurosurg.71:105-12 (1989); 미국 특허 번호 5,679,377, 5,916,597, 5,912,015, 5,989,463, 및 5,128,326; PCT 공개 번호 WO 99/15154 및 WO 99/20253). 지속 방출 제형에 사용되는 중합체의 구현예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈) ), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜리드)(PLGA) 및 폴리오르소에스테르를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일 실시예에서, 지속 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이며 침출성 불순물이 없고 저장 안정성, 멸균 및 생분해성입니다. 또 다른 실시예에서, 제어 방출 또는 지속 방출 시스템은 비강이나 폐와 같은 특정 표적 조직 근처에 배치할 수 있으므로 전신 용량의 일부만 필요하다(예를 들어, Goodson, Medical Applications of Controlled Release 제2권, 115-38 (1984) 참조). 제어 방출 시스템은 예를 들어 Langer, Science 249:1527-33 (1990)에 의해 토론되었다. 당업자에게 공지된 임의의 기술은 하나 이상의 본원에 따른 약제를 포함하는 지속 방출 제형의 생산에 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938, PCT 공개 번호 WO 91/05548 및 WO 96/20698, Ning 등, Radiotherapy & Oncology 39:179-89 (1996); Song 등, PDA J. of Pharma.Sci. & Tech.50:372-97 (1995); Cleek 등, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54 (1997); 및 Lam 등, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60 (1997) 참조).
본원에 따른 약학적 조성물은 또한 치료되는 특정 징후에 대해 요구되는 바와 같이 하나 이상의 활성 화합물 또는 활성화제를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 세포 독성제, 화학요법제, 사이토카인, 면역 억제제 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합되어 존재한다.
활성 성분은 또한 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐과 같은 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐에 캡슐화될 수 있고, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 캡슐화되거나 매크로에멀젼에 캡슐화된다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 제18판에 개시되어 있다.
다양한 조성물 및 전달 시스템이 알려져 있고 본원에 의해 제공되는 치료제와 함께 사용될 수 있으며, 상기 조성물 및 전달 시스템은 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐에 캡슐화되고 본원에 의해 제공되는 단일 도메인 항체 또는 치료 분자를 발현할 수 있는 재조합 세포, 레트로바이러스벡터 또는 다른 벡터의 일부분으로서 구축된 핵산 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 약학적 조성물은 질환 또는 병증의 치료 또는 예방에 대한 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같은 유효량의 결합 분자 및/또는 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 치료 또는 예방 효능은 치료받는 피험자를 주기적으로 평가함으로써 모니터링된다. 며칠 이상 반복 투여하는 경우 병태에 따라 원하는 질환 증상 억제가 발생할 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 용량 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다.
7.8. 방법 및 용도
다른 양태에서, 본원은 본원에 의해 제공되는 조작된 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 사용 방법 및 용도를 제공한다. 이러한 방법 및 용도는 세포 또는 세포 함유 조성물을 질환 또는 병증이 있는 피험자에게 투여하는 것과 같은 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 질환 또는 병증의 치료를 달성하기 위한 유효량으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료에서 세포의 용도, 및 이러한 치료 방법을 위한 약물 제조의 용도를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 질환 또는 병태를 갖거나 가질 것으로 의심되는 피험자에게 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행된다. 일부 실시예에서, 이러한 방법에 의해 피험자의 질환 또는 병증을 치료한다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 치료는 질환 또는 병증 또는 이들과 과련된 증상, 부작용 또는 결과 또는 표현형의 완전하거나 부분적인 개선 또는 감소를 유발한다. 치료의 이상적인 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행률의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 예후의 개선을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 용어에는 질환의 완전한 치유 또는 임의의 증상의 완전한 제거 또는 모든 증상 또는 결과에 대한 하나 이상의 영향이 포함되지만 암시하지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 치료는 질환 또는 병증의 발달을 지연시키고, 예를 들어 질환(예를 들어, 암)의 발달을 지연, 방해, 완화, 지체, 안정화, 억제 및/또는 연기시킨다. 상기 지연은 질환의 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 상이한 시간이 될 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 상당한 지연은 실제로 예방을 포함할 수 있는데, 그 이유는 개체가 질환 또는 병증이 없기 때문이다. 예를 들어, 말기 암(예를 들어, 전이의 발달)을 지연시킬 수 있다. 다른 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 방법 또는 용도는 질환 또는 병증을 예방한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 CAR-T 세포 요법은 고형 종양 암의 치료에 사용된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 CAR-T 세포 요법은 혈액암의 치료에 사용된다. 다른 실시예에서, 질환 또는 병증은 자가면역 및 염증성 질환이다. 다른 실시예에서, 질환 또는 병증은 감염성 질환이다.
일부 실시예에서, 질환 또는 병증은 비정상적인 세포 성장 및/또는 세포사멸이 조절되지 않는 질환이다. 이러한 질환의 구현예는 암, 중피종, 방광암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 골암, 결장암, 직장암, 항문암, 위암, 위장관(위, 결장직장 및/또는 십이지장)암, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 고환암, 간세포(간 및/또는 담관)암, 원발성 또는 속발성 중추신경계 종양, 원발성 또는 속발성 뇌종양, 호지킨병(Hodgkin's disease), 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 림프종, 림프모구 백혈병, 여포성 림프종, T 세포 또는 B 세포 기원의 림프구성 악성 종양, 흑색종, 다발성 골수종, 구강암, 비소세포 폐암, 전립선암, 소세포 폐암, 신장 및/또는 요관암, 신세포암종, 신장 골반 암종, 중추신경계 종양, 원발성 중추신경계 림프종, 비호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체 선종, 부신피질암종, 담낭암, 비장암, 담관암, 섬유 육종, 신경모세포종, 망막모세포종 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 질환 또는 병증은 방광암, 뇌암, 유방암, 골수암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 식도암, 간세포 암종, 림프모구 백혈병, 여포성 림프종, T 세포 또는 B 세포 기원의 림프구성 악성 종양, 흑색종, 골수성 백혈병, 골수종, 구강암, 난소암, 비소세포 폐암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 질환 또는 병증은 백혈병, 림프종 또는 골수종과 같은 혈액암이다. 일부 실시예에서, 암은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 피부 B 세포 림프종, 활성화 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 중심 림프종, 변형 림프종, 중간 분화 림프구성 림프종, 중간 림프구성 림프종(ILL), 미만성 저분화 림프구성 림프종(PDL), 중심세포 림프종, 미만성 소절단 세포 림프종(DSCCL), 말초 T 세포 림프종(PTCL), 피부 T 세포 림프종, 외투막 림프종, 저등급 여포성 림프종, 다발성 골수종(MM), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 골수 이형성 증후군(MDS), 급성 T 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 전구체 B 급성 림프모구 백혈병, 전구체 T 급성 림프모구 백혈병, 버킷 백혈병(Burkitt’s leukemia)(버킷 림프종), 급성 양성 표현형 백혈병, 만성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML) 및 만성 단구성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 질환 또는 병증은 골수 이형성 증후군(MDS)이다. 다른 특정 실시예에서, 상기 질환 또는 병증은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 다른 특정 실시예에서, 상기 질환 또는 병증은 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 또 다른 특정 실시예에서, 상기 질환 또는 병증은 다발성 골수종(MM)이다.
다른 실시예에서, 상기 질환 또는 병증은 고형 종양 암이다. 일부 실시예에서, 고형 종양 암은 암, 선암종, 부신피질암종, 결장 선암종, 결장직장 선암종, 결장직장암, 관 세포 암종, 폐암, 갑상선암, 비인두암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 간암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 암은 부신암이다. 일부 실시예에서, 암은 항문암이다. 일부 실시예에서, 암은 충수돌기암이다. 일부 실시예에서, 암은 담관암이다. 일부 실시예에서, 암은 방광암이다. 일부 실시예에서, 암은 골암이다. 일부 실시예에서, 암은 뇌암이다. 일부 실시예에서, 암은 유방암이다. 일부 실시예에서, 암은 자궁경부암이다. 일부 실시예에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시예에서, 암은 식도암이다. 일부 실시예에서, 암은 담낭암이다. 일부 실시예에서, 암은 임신성 영양모세포암이다. 일부 실시예에서, 암은 두경부암이다. 일부 실시예에서, 암은 호지킨 림프종이다. 일부 실시예에서, 암은 장암이다. 일부 실시예에서, 암은 신장암이다. 일부 실시예에서, 암은 백혈병이다. 일부 실시예에서, 암은 간암이다. 일부 실시예에서, 암은 폐암이다. 일부 실시예에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시예에서, 암은 중피종이다. 일부 실시예에서, 암은 다발성 골수종(MM)이다. 일부 실시예에서, 암은 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 암은 비호지킨 림프종이다. 일부 실시예에서, 암은 구강암이다. 일부 실시예에서, 암은 난소암이다. 일부 실시예에서, 암은 췌장암이다. 일부 실시예에서, 암은 전립선암이다. 일부 실시예에서, 암은 부비동암이다. 일부 실시예에서, 암은 피부암이다. 일부 실시예에서, 암은 연조직 육종, 척추암이다. 일부 실시예에서, 암은 위암이다. 일부 실시예에서, 암은 고환암이다. 일부 실시예에서, 암은 인후암이다. 일부 실시예에서, 암은 갑상선암이다. 일부 실시예에서, 암은 자궁암, 자궁내막암이다. 일부 실시예에서, 암은 질암이다. 일부 실시예에서, 암은 외음부암이다.
일부 실시예에서, 부신암은 부신겉질샘암종(ACC), 부신피질암종, 갈색세포종 또는 신경모세포종이다. 일부 실시예에서, 항문암은 편평세포 암종, 배설강 암종, 선암종, 기저세포 암종 또는 흑색종이다. 일부 실시예에서, 충수돌기암은 신경내분비 종양(NET), 점액성 선암종, 술잔세포 유암종, 장형 선암종 또는 반지세포 선암종이다. 일부 실시예에서, 담관암은 간외 담관암, 선암종, 간문부 담관암, 문주위 담관암, 원위 담관암 또는 간내 담관암이다. 일부 실시예에서, 방광암은 이행세포 암종(TCC), 유두상 암종, 편평 암종, 편평세포 암종, 선암종, 소세포 암종 또는 육종이다. 일부 실시예에서, 골암은 원발성 골암, 육종, 골육종, 연골육종, 육종, 섬유 육종, 악성 섬유성 조직구종, 골거대세포종양, 척색종 또는 전이성 골암이다. 일부 실시예에서, 뇌암은 성상세포종, 뇌줄기신경아교종, 교모세포종, 수막종, 상의세포종, 핍지교종, 혼합신경아교종, 뇌하수체 선암종, 뇌하수체 선종, 두개인두종, 생식 세포 종양, 송과체 부위 종양, 수모세포종 또는 원발성 CNS 림프종이다. 일부 실시예에서, 유방암은 유방 선암종, 침윤성 유방암, 비침윤성 유방암, 유방 육종, 화생암종, 샘낭암종, 엽상종양, 혈관 육종, HER2 양성 유방암, 삼중음성 유방암 또는 염증성 유방암이다. 일부 실시예에서, 자궁경부암은 편평세포 암종 또는 선암종이다. 일부 실시예에서, 결장직장암은 결장직장 선암종, 원발성 결장직장 림프종, 위장관 기질 종양, 평활근 육종, 카르시노이드 종양, 점액성 선암종, 반지세포 선암종, 위장관 카르시노이드 종양 또는 흑색종이다. 일부 실시예에서, 식도암은 선암종 또는 편평세포 암종이다. 일부 실시예에서, 담낭암은 선암종, 유두상 선암종, 선편평세포 암종, 편평세포 암종, 소세포 암종 또는 육종이다. 일부 실시예에서, 임신성 융모성 질환(GTD)은 포상기태, 임신성 융모성 종양(GTN), 융모막 암종, 태반 부착부 융모성 종양(PSTT) 또는 상피 융모성 종양(ETT)이다. 일부 실시예에서, 두경부암은 후두암, 비인두암, 하인두암, 비강암, 부비동암, 침샘암, 구강암, 구인두암 또는 편도암이다. 일부 실시예에서, 호지킨 림프종은 전형적 호지킨 림프종, 결절성 경화증, 혼합세포형, 림프구 풍부형, 림프구 고갈형 또는 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종(NLPHL)이다. 일부 실시예에서, 장암은 소장암(small intestine cancer), 소장암(small bowel cancer), 선암종, 육종, 위장관 기질 종양, 카르시노이드 종양 또는 림프종이다. 일부 실시예에서, 신장암은 신세포암종(RCC), 투명세포 RCC, 유두상 RCC, 발색단 RCC, 집합관 RCC, 분류되지 않은 RCC, 이행세포 암종, 요로 상피암종, 신장 골반 암종 또는 신장 육종이다. 일부 실시예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 털세포 백혈병(HCL) 또는 골수 이형성 증후군(MDS)이다. 특정 실시예에서, 백혈병은 AML이다. 일부 실시예에서, 간암은 간세포 암종(HCC), 섬유층판형 HCC, 담관암, 혈관 육종 또는 간 전이이다. 일부 실시예에서, 폐암은 소세포 폐암, 소세포 암종, 복합 소세포 암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 편평세포 폐암, 대세포 미분화 암종, 폐결절, 전이성 폐암, 선편평세포 암종, 대세포 신경내분비 암종, 타액선형 폐암종, 폐 유암종, 중피종, 폐 육종양 암종 또는 악성 과립세포 폐 종양이다. 일부 실시예에서, 흑색종은 표재 확산성 흑색종, 결절성 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 무색소성 흑색종, 섬유조직형성 흑색종, 안구 흑색종 또는 전이성 흑색종이다. 일부 실시예에서, 중피종은 흉막 중피종, 복막 중피종, 심낭 중피종 또는 고환 중피종이다. 일부 실시예에서, 다발성 골수종은 활동성 골수종 또는 아급성 골수종이다. 일부 실시예에서, 신경내분비 종양은 위장관 신경내분비 종양, 췌장 신경내분비 종양 또는 폐 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 비호지킨 림프종은 역형성 대세포 림프종, 림프모구 림프종, 말초 T 세포 림프종, 여포성 림프종, 피부 T 세포 림프종, 림프형질세포 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 전구체 T-림프모구 백혈병/림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 성인 T 세포 림프종/백혈병(ATLL), 털세포 백혈병, B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 원발성 종격동 B 세포 림프종, 원발성 중추신경계(CNS) 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종, 림프절내 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 B 세포 림프종, 림프형질세포 림프종, B 세포 비호지킨 림프종, T 세포 비호지킨 림프종, 자연 살해 세포림프종, 피부 T 세포 림프종, Alibert-Bazin 증후군, 세자리 증후군, 원발성 피부 역형성 대세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 혈관 면역모세포성 T 세포 림프종(AITL), 역형성 대세포 림프종(ALCL), 전신성 ALCL, 장병성 T 세포 림프종(EATL) 또는 간비장 γ/δ T 세포 림프종이다. 일부 실시예에서, 구강암은 편평세포 암종, 사마귀모양 암종, 소타액선 암종, 림프종, 양성 구강 종양, 호산구성 육아종, 섬유종, 과립세포 종양, 각질가시세포종, 평활근종, 골연골종, 지방종, 신경초종, 신경섬유종, 유두종, 뾰족콘딜로마, 사마귀상 황색종, 화농성 육아종, 횡문근종, 치성 종양, 백반증, 홍반증, 편평세포 입술 암종, 기저세포 입술 암종, 입술암, 잇몸암 또는 설암이다. 일부 실시예에서, 난소암은 난소 상피암, 점액성 상피 난소암, 자궁내막양 상피 난소암, 투명세포 상피 난소암, 미분화 상피 난소암, 난소 경계악성종양, 원발성 복막 암종, 나팔관암, 생식세포 종양, 기형종, 난소고환종, 난소 생식세포 암종, 내배엽동 종양, 성삭-간질 종양, 성삭-생식선 간질 종양, 난소 간질 종양, 과립막 세포 종양, 과립막-테카 세포 종양, 세르톨리-라이디히 종양(Sertoli-Leydig tumor), 난소 육종, 난소암육종, 난소선육종, 난소 평활근 육종, 난소 섬유 육종, 크루켄버그 종양(Krukenberg tumor) 또는 난소 낭종이다. 일부 실시예에서, 췌장암은 췌장 외분비 선암종, 췌장 내분비 선암종 또는 췌장 선암종, 도세포 종양 또는 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 전립선암은 전립선 선암종, 전립선 육종, 이행세포 암종, 소세포 암종 또는 신경내분비 종양이다. 일부 실시예에서, 부비동암은 편평세포 암종, 점막세포 암종, 선양 낭성 세포 암종, 세엽세포 암종, 비동 미분화 암종, 비강암, 부비동암, 상악동암, 사골동암 또는 비인두암이다. 일부 실시예에서, 피부암은 기저세포 암종, 편평세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 카포시 육종(KS), 광선 각화증, 피부 림프종 또는 각질가시세포종이다. 일부 실시예에서, 연조직 암은 혈관 육종, 피부 섬유 육종, 상피양 육종, 유잉 육종, 섬유 육종, 위장관 기질 종양(GIST), 카포시 육종, 평활근 육종, 지방 육종, 탈분화 지방 육종(DL), 점액양/원형 세포 지방 육종(MRCL), 고분화 지방 육종(WDL), 악성 섬유성 조직구종, 신경 섬유 육종, 횡문근 육종(RMS) 또는 윤활막 육종이다. 일부 실시예에서, 척추암은 척추 전이암이다. 일부 실시예에서, 위암은 위 선암종, 위 림프종, 위장관 기질 종양, 카르시노이드 종양, 위 카르시노이드 종양, 유형 I ECL 세포 카르시노이드, 유형 II ECL 세포 카르시노이드 또는 유형 III ECL 세포 카르시노이드이다. 일부 실시예에서, 고환암은 정상피종, 비정상피종, 배아 암종, 난황낭 암종, 융모막 암종, 기형종, 생식선 간질 종양, 라이디히 세포 종양 또는 세르톨리 세포 종양이다. 일부 실시예에서, 인후암은 편평세포 암종, 선암종, 육종, 후두암, 인두암, 비인두암, 구인두암, 하인두암, 후두암, 후두 편평세포 암종, 후두 선암종, 림프상피종, 방추세포 암종, 사마귀모양 암종, 미분화 암종 또는 림프절 암종이다. 일부 실시예에서, 갑상선암은 유두상 암종, 여포상 암종, H
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rthle 세포 암종, 갑상선 수질 암종 또는 역형성 암종이다. 일부 실시예에서, 자궁암은 자궁내막암, 자궁내막 선암종, 자궁내막양 암종, 장액성 선암종, 선편평세포 암종, 자궁암육종, 자궁 육종, 자궁 평활근 육종, 자궁내막 간질 육종 또는 미분화 육종이다. 일부 실시예에서, 질암은 편평세포 암종, 선암종, 흑색종 또는 육종이다. 일부 실시예에서, 외음부암은 편평세포 암종 또는 선암종이다.
일부 실시예에서, 질환 또는 병증은 병원체에 의해 유발된 것이다. 일부 실시예에서, 병원체는 급성 이완성 척수염(AFM), 아나플라즈마증, 탄저병, 바베시아증, 보툴리누스 중독, 브루셀라증, 캄필로박테리아증, 카바페넴 내성 감염, 연성하감, 치쿤구니아 바이러스 감염, 클라미디아, 시구아테라, 디피실 감염, 퍼프린젠스, 콕시디오이데스진균증, 코로나바이러스 감염, Covid-19(SARS-CoV-2), 크로이츠펠트-야콥병/전염성 해면상뇌증, 크립토스포리디움증(Crypto), 원포자충증, 뎅기열 1,2,3 또는 4형, 디프테리아, 대장균 감염/시가 독소 생성(STEC), 동부 말 뇌염, 출혈열(에볼라), 에를리키아증, 뇌염, 아르보바이러스 또는 파라감염성 질환, 비소아마비 엔테로바이러스, D68 엔테로바이러스 질환(EV-D68), 지아르디아증, 글랜더, 임균 감염, 서혜부 육아종, B형 헤모필루스 인플루엔자(Hib 또는 H-플루), 한타바이러스 폐 증후군(HPS), 용혈성 요독 증후군(HUS), A형 간염(Hep A), B형 간염(Hep B), C형 간염(Hep C), D형 간염(Hep D), E형 간염(Hep E), 포진, 대상포진(Herpes Zoster/Shingles), 히스토플라스마증 감염, 인간 면역결핍 바이러스/에이즈(HIV/AIDS), 인유두종 바이러스(HPV), 인플루엔자(Flu), 레지오넬라증(재향군인병), 나병(한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증(리스테리아), 라임병, 성병성 림프육아종 감염(LGV), 말라리아, 홍역, 멜리오이드증, 수막염(바이러스성), 수막구균성 질환(수막염(박테리아성)), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 질환(MERS-CoV), 유행성 이하선염, 노로바이러스 질환, 소아마비, 골반 염증성 질환(PID), 페르투시스(백일해), 흑사병(가래톳 흑사병, 패혈증성 흑사병, 폐렴성 흑사병), 폐렴구균성 질환(폐렴), 급성 회백수염(회색질척수염(Polio)), 포와산, 프시타코증, 음모슬증, 농포성 발진 질환(두창, 원숭이두창, 우두), 큐열, 광견병, 리케차증(록키산 홍반열), 풍진(Rubella/German Measles), 살모넬라 위장염(살모넬라), 옴, 스콤브로이드, 농독증, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 이질 위장염(시겔라), 두창, 메티실린 내성 포도상구균 감염(MRSA), 포도상구균 식중독 장독소 B 중독(포도상구균 식중독), 반코마이신 중간 내성 포도상구균 감염(VISA), 반코마이신 내성 포도상구균 감염(VRSA), A군 연쇄상구균 질환(침습성)(Strep A(침습성)), B군 연쇄상구균성 질환(Strep-B), 연쇄상구균 독성 쇼크 증후군 STSS 독성 쇼크, 매독(원발성, 이차성, 초기 잠복성, 후기 잠복성, 선천성), 파상풍 감염, 트리코모나스증, 트리코모나스 감염, 결핵(TB), 잠복결핵(LTBI), 야토병, D군 장티푸스, 질증, 수두(Varicella/Chickenpox), 비브리오 콜레라병(콜레라), 비브리오증(비브리오), 에볼라 바이러스 출혈열, 라사 바이러스(Lasa Virus) 출혈열, 마버그 바이러스 출혈열, 웨스트 나일 바이러스 질환, 황열병, 예르시니아질환 및 지카 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 감염성 질환을 유발한다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 급성 이완성 척수염(AFM)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 아나플라즈마증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 탄저병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 바베시아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 보툴리누스 중독이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 브루셀라증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 캄필로박테리아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 카바페넴 내성 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 연성하감이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 치쿤구니아 바이러스 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 클라미디아이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 시구아테라이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 디피실 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 퍼프린젠스이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 콕시디오이데스진균증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 코로나바이러스 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 Covid-19(SARS-CoV-2)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 크로이츠펠트-야콥병/전염성 해면상뇌증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 크립토스포리디움증(Crypto)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 원포자충증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 뎅기열 1,2,3 또는 4형이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 디프테리아이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 대장균 감염/시가 독소 생성(STEC)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 동부 말 뇌염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 출혈열(에볼라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 에를리키아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 뇌염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 아르보바이러스 또는 파라감염성 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 비소아마비 엔테로바이러스이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 D68 엔테로바이러스 질환(EV-D68)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 지아르디아증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 글랜더이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 임균 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 서혜부 육아종이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 B형 헤모필루스 인플루엔자(Hib 또는 H-플루)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 한타바이러스 폐 증후군(HPS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 용혈성 요독 증후군(HUS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 A형 간염(Hep A)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 B형 간염(Hep B)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 C형 간염(Hep C)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 D형 간염(Hep D)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 E형 간염(Hep E)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 포진이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 대상포진(Herpes Zoster/Shingles)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 히스토플라스마증 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 인간 면역결핍 바이러스/에이즈(HIV/AIDS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 인유두종 바이러스(HPV)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 인플루엔자(Flu)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 레지오넬라증(재향군인병)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 나병(한센병)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 렙토스피라증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 리스테리아증(리스테리아)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 라임병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 성병성 림프육아종 감염(LGV)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 말라리아이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 홍역이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 멜리오이드증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 수막염(바이러스성)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 수막구균성 질환(수막염(박테리아성))이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 질환(MERS-CoV)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 유행성 이하선염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 노로바이러스 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 소아마비이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 골반 염증성 질환(PID)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 페르투시스(백일해)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 흑사병(가래톳 흑사병; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 패혈증성 흑사병; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 폐렴성 흑사병)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 폐렴구균성 질환(폐렴)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 급성 회백수염(회색질척수염)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 포와산이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 프시타코증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 음모슬증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 농포성 발진 질환(두창; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 원숭이두창; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 우두)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 큐열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 광견병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 리케차증(록키산 홍반열)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 풍진(Rubella/German Measles)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 살모넬라 위장염(살모넬라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 옴이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 스콤브로이드이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 농독증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 이질 위장염(시겔라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 두창이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 메티실린 내성 포도상구균 감염(MRSA)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 포도상구균 식중독 장독소 B 중독(포도상구균 식중독)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 반코마이신 중간 내성 포도상구균 감염(VISA)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 반코마이신 내성 포도상구균 감염(VRSA)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 A군 연쇄상구균 질환(침습성)(Strep A(침습성))이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 연쇄상구균성 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 B군 질환(Strep-B)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 연쇄상구균 독성 쇼크 증후군 STSS 독성 쇼크이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 매독(원발성; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 이차성이고; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 초기 잠복성이며; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 후기 잠복성이고; 일부 실시예에서, 감염성 질환은 선천성임)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 파상풍 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 트리코모나스증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 트리코모나스 감염이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 결핵(TB)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 잠복결핵(LTBI)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 야토병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 D군 장티푸스이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 질증이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 수두(Varicella/Chickenpox), 비브리오 콜레라병(콜레라)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 비브리오증(비브리오)이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 에볼라 바이러스 출혈열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 라사 바이러스 출혈열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 마버그 바이러스 출혈열이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 웨스트 나일 바이러스 질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 황열병이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 예르시니아질환이다. 일부 실시예에서, 감염성 질환은 지카 바이러스 감염이다.
일부 실시예에서, 병원체는 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 바실러스 속, 바르토넬라 속, 보르데텔라 속, 보렐리아 속, 브루셀라 속, 캄필로박터 속, 클라미디아 속, 클라미도필라 속, 클로스트리디움 속, 코리네박테리움 속, 엔테로코쿠스 속, 에스체리치아 속, 프란시셀라 속, 해모필러스 속, 헬리코박터 속, 레지오넬라 속, 렙토스피라 속, 리스테리아 속, 마이코박테리움 속, 마이코플라스마 속, 나이세리아 속, 슈도모나스 속, 리케차 속, 살모넬라 속, 시겔라 속, 포도상구균 속, 연쇄상구균 속, 트레포네마 속, 우레아플라즈마 속, 비브리오 속 또는 예르시니아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 바실러스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 바르토넬라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 보르데텔라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 보렐리아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 브루셀라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 캄필로박터 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 클라미디아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 클라미도필라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 클로스트리디움 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 코리네박테리움 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 엔테로코쿠스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 에스체리치아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 프란시셀라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 해모필러스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 헬리코박터 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 레지오넬라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 렙토스피라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 리스테리아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 마이코박테리움 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 마이코플라스마 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 나이세리아 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 슈도모나스 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 리케차 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 살모넬라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 시겔라 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 포도상구균 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 연쇄상구균 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 트레포네마 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 우레아플라즈마 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 비브리오 속의 박테리아이다. 일부 실시예에서, 박테리아는 예르시니아 속의 박테리아이다.
일부 실시예에서, 병원체는 기생충이다. 일부 실시예에서, 기생충은 원생동물, 연충 또는 외부기생충이다. 일부 실시예에서, 원생동물은 엔타메바, 지아르디아, 리슈마니아, 바란티디움, 플라스모디움 또는 크립토스포리디움이다. 일부 실시예에서, 연충은 흡충, 조충, 구두충 또는 회충이다. 일부 실시예에서, 외부기생충은 절지동물이다.
일부 실시예에서, 병원체는 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스과, 아레나바이러스과, 아스트로바이러스과, 부냐바이러스과, 칼리시바이러스과, 코로나바이러스과, 필로바이러스과, 플라비바이러스과, 헤파드나바이러스과, 헤페바이러스과, 오르소믹소바이러스과, 파필로마바이러스과, 파라믹소바이러스과, 파르보바이러스과, 피코르나바이러스과, 폴리오마바이러스과, 폭스바이러스과, 레오바이러스과, 레트로바이러스과, 랍도바이러스과 또는 토가바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 과(family)이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아레나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아스트로바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 부냐바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 칼리시바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 코로나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 필로바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 플라비바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 헤파드나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 헤페바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 오르소믹소바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파필로마바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파라믹소바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파르보바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피코르나바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 폴리오마바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 폭스바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 레오바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 레트로바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 랍도바이러스과의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 토가바이러스과의 바이러스이다.
일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스, 코로나바이러스, 콕사키바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 단순포진 바이러스 2형, 사이토메갈로바이러스, 인간 포진 바이러스 8형, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 인유두종 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 급성 회백수염 바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 풍진 바이러스 또는 수두-대상포진 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 코로나바이러스이다. 일부 실시예에서, 코로나바이러스는 Covid-19(SARS-CoV-2)이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 콕사키바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 A형 간염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 C형 간염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 단순포진 바이러스 2형이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 사이토메갈로바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인간 포진 바이러스 8형이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 홍역 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 유행성 이하선염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인유두종 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 파라인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 급성 회백수염 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 광견병 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 호흡기 세포융합 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 풍진 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 수두-대상포진 바이러스이다.
다른 실시예에서, 상기 질환 또는 병증은 면역 또는 자가면역 병증이다. 이러한 병증은 자가면역 수포성 질환, 무베타리포단백혈증, 후천성 면역결핍 관련 질환, 장기 이식과 관련된 급성 면역 질환, 후천성 말단청색증, 급성 및 만성 기생충 또는 감염 과정, 급성 췌장염, 급성 신부전, 급성 류마티스열, 급성 횡단 척수염, 선암종, 심방 이소성 박동(aerial ectopic beat), 성인(급성) 호흡곤란 증후군, AIDS 치매 증후군, 알코올성 간경변증, 알코올성 간손상, 알코올성 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기 및 천식, 동종이식 거부반응, 알파-l-항트립신 결핍증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 강직성 척추염 관련 폐질환, 전각 세포 변성, 항체 매개 세포 독성, 항인지질 증후군, 항수용체 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥성 고혈압, 동맥 경화증, 동정맥루, 관절병증, 무력증, 천식, 운동실조, 아토피성 알레르기, 심방 세동(지속성 또는 발작성), 심방 조동, 방실 차단, 위축성 자가면역 갑상선기능저하증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 1형 자가면역성 간염(고전적 자가면역 또는 루포이드 간염), 자가면역 매개 저혈당, 자가면역성 호중구감소증, 자가면역성 혈소판감소증, 자가면역성 갑상선 질환, B세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 폐쇄세기관지염, 다발분지차단, 화상, 악액질, 심장 부정맥, 심장 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심폐 바이패스 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼돈 또는 다발성 심방 빈맥, 화학요법 관련 장애, 클라미디아, 담즙울혈(choleosatatis), 만성 알코올 중독, 만성 활동성 간염, 만성 피로 증후군, 장기 이식 관련 만성 면역 질환, 만성 호산구성 폐렴, 만성 염증 질환, 만성 피부 점막 칸디다증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 만성 살리실산 중독, 결장직장 공통 각종 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 결막염, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐질환, 접촉성 피부염, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 폐심장병, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 잠재성 자가면역 간염, 잠재성 섬유화 폐포염, 배양 음성 패혈증, 낭포성 섬유증, 사이토카인 요법 관련 장애, 크론병(Crohn's disease), 권투 선수 치매, 탈수초성 질환, 뎅기출혈열, 피부염, 피부경화증 피부염, 피부 질환, 피부근염/다발성근염 관련 폐질환, 당뇨병(diabetes), 당뇨병성 동맥경화증, 당뇨병(diabetes mellitus), 미만성 루이소체병, 확장성 심근병증, 확장성 울혈성 심근병증, 원판상 홍반성 루푸스, 기저핵 질환, 파종성 혈관내 응고, 중년 다운 증후군, 약물 유발성 간질성 폐질환, 약물 유발성 간염, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의한 약물유발 이상운동증, 약물 감수성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병증, 장병성 활막염, 후두덮개염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 홍반통, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 혈구탐식 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드라이히 운동실조(Friedreich's ataxia), 기능성 말초 동맥 장애, 여성 불임, 섬유증, 섬유성 폐질환, 진균성 패혈증, 가스 괴저, 위궤양, 거대 세포 동맥염, 토리콩팥염, 사구체신염(glomerulonephritides), 굿파스쳐 증후군, 갑상선종 자가면역 갑상선기능저하증(하시모토병), 통풍성 관절염, 모든 장기 또는 조직의 이식 거부, 이식편대숙주병, 그람 음성 농독증, 그람 양성 농독증, 세포내 유기체로 인한 육아종, B군 연쇄상구균(GBS) 감염, 그레이브스병, 혈철증 관련 폐질환, 모상세포 백혈병, 할러로덴-스파츠병, 하시모토 갑상선염, 꽃가루 알레르기, 심장 이식 거부, 혈색소 침착증, 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 용혈성 빈혈, 용혈성 요독 증후군/혈전성 혈소판 감소성 자반병, 출혈, 헤노호-쉔라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpura), A형 간염, B형 간염, C형 간염, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨병, 부갑상선기능저하증, 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea), 운동과다운동장애, 과민반응, 과민성 폐렴, 갑상선기능항진증, 운동저하장애, 시상하부-뇌하수체-부신 축 평가, 특발성 에디슨병(idiopathic Addison's disease), 특발성 백혈구감소증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판감소증, 특발성 간질환, 영아 척수성 근위축증, 감염성 질환, 대동맥 염증, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 당뇨병, 간질성 폐렴, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 악성 빈혈, 소아 류마티스 관절염, 소아 척수성 근위축증, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 가와사키병, 신장 이식 거부, 레지오넬라균 질환, 레슈만편모충증, 나병, 피질 척수계 병변, 선형 IgA 질환, 지질종(lipidema), 간 이식 거부, 라임병(Lyme disease), 림프부종(lymphederma), 림프구성 침윤성 폐질환, 말라리아, 남성 불임 특발성 또는 NOS, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 수막염, 수막구균성 패혈증, 신장 현미경적 혈관염, 편두통, 미토콘드리아 다기관 장애, 혼합 결합 조직 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐질환, 단클론성 감마병증, 다발성 골수종, 다계통 변성(Mencel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager 및 Machado-Joseph), 근육통성 뇌염/만성 피로 증후군(Royal Free Disease), 중증 근무력증, 신장 현미경적 혈관염, 마이코박테리움 아비움 인트라셀룰라레 질환, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 질환, 골수이형성 증후군, 심근 경색증, 심근 허혈성 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐질환, 신장염, 신장 질환, 신증후군, 신경퇴행성 질환, 신경성 제1형 근위축증, 호중구감소증 저체온증, 비알코올성 지방간염, 복부 대동맥 및 그 분지 폐색, 폐색성 동맥 장애, 장기 이식 거부, 고환염/부고환염(epidydimitis), 고환염/정관 절제술 역전술, 기관비대, 골관절증, 골다공증, 난소부전, 췌장 이식 거부, 기생충 질환, 부갑상선 이식 거부, 파킨슨병, 골반 염증성 질환, 심상성 천포창, 잎사귀 천포창, 유천포창, 통년성 비염, 심낭 질환, 말초 죽상동맥경화성 질환, 말초혈관 질환, 복막염, 악성 빈혈, 수태성 포도막염, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발신경병증, 기관비대, 내분비병증, 단클론성 감마병증, 피부 변화 증후군), 관류 후 증후군, 펌프 후 증후군(post-pump syndrome), 심근경색 후 증후군, 감염 후 간질성 폐질환, 조기 난소 부전, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 간염, 원발성 점액수종, 원발성 폐고혈압, 원발성 경화성 담관염, 원발성 혈관염, 진행성 핵상 마비, 건선, 건선 1형, 건선 2형, 건선성 관절병증, 결합 조직 질환에 속발성 폐고혈압, 결절성 다발동맥염의 폐 징후, 염증 후 간질성 폐질환, 방사선 섬유증, 방사선 요법으로 인한 질환, 레이노 현상 및 질환(Raynaud's phenomenon and disease), 레이노병, 레프섬병(Refsum's disease), 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 라이터병(Reiter's disease), 신장 질환 NOS, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐질환, 류마티스성 척추염, 유육종증, 슈미트 증후군(Schmidt's syndrome), 경피증, 노인성 무도증, 루이소체형 노인성 치매, 패혈증 증후군, 패혈성 쇼크, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 낫적혈구빈혈, T세포 또는 FAB ALL, 타카야수병(Takayasu's disease)/동맥염, 모세혈관확장증, Th2형 및 Th1형 매개 질환, 폐쇄성 혈소판혈관염, 혈소판감소증, 갑상선염, 독성, 독성 쇼크 증후군, 이식, 외상/출혈, 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 세포증을 동반한 B형 인슐린 저항성 흑색종, III형 과민반응, IV형 과민증, 궤양성 대장염 관절병증, 궤양성 대장염, 불안정 협심증, 요독증, 요로 패혈증, 두드러기, 포도막염, 심장 판막 질환, 정맥류, 맥관염, 혈관염 미만성 폐질환, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 백반증 급성 간 질환, 바이러스 및 진균 감염, 바이러스성 뇌염/무균 수막염, 바이러스 관련 혈구탐식 증후군, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff syndrome), 윌슨병(Wilson's disease), 장기 또는 조직의 이종이식 거부, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절병증, 후천성 면역결핍 질환 증후군(AIDS), 자가면역림프증식증후군, 용혈성 빈혈, 염증성 질환, 혈소판감소증, 장기이식관련 급성 및 만성 면역질환, 에디슨병, 알레르기 질환, 탈모증, 원형탈모증, 죽상경화성질환/동맥경화증, 죽상동맥경화증, 관절염(골관절염, 소아 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염 및 반응성 관절염을 포함), 쇼그렌병 관련 폐질환(Sjogren's disease-associated lung disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 피부 동종이식 거부반응, 피부 변화 증후군(skin changes syndrome), 소장 이식 거부, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 하위 유형), 척추 운동 실조증, 척수소뇌 변성, 척추관절병증, 산발성 다분비선 결핍 유형 I, 산발적 다분비선 결핍 유형 II, 스틸병(Still's disease), 연쇄구균성 근육염, 뇌졸중, 구조적 소뇌병변, 아급성 경화성 범뇌염, 교감신경성 안염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 아나필락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신 발병 소아 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스 관련 폐질환, 루푸스 신염, 전신 경화증 및 전신 경화증 관련 간질성 폐질환을 포함한다.
일부 실시예에서, 질환 또는 병증은 염증성 질환이다. 염증은 숙주 방어와 면역 매개 질환의 진행에 중요한 역할을 한다. 염증 반응은 화학 매개체(예를 들어, 사이토카인 및 프로스타글란딘) 및 염증 세포(예를 들어, 백혈구)를 포함한 일련의 복잡한 캐스케이드 사건에 의해 손상(예를 들어, 외상, 허혈 및 이물질) 및 감염(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 감염)에 대한 반응으로 시작된다. 염증 반응은 혈류 증가, 모세관 투과성 증가 및 식세포 유입을 특징으로 한다. 이러한 사건은 부상 또는 감염 부위의 부기, 발적, 발열(변화된 열 패턴) 및 고름 형성을 초래한다.
사이토카인 및 프로스타글란딘은 염증 반응을 조절하고 규칙적이고 자기 제한적인 캐스케이드 방식으로 혈액이나 영향을 받은 조직으로 방출된다. 이러한 사이토카인 및 프로스타글란딘의 방출은 부상이나 감염 부위로의 혈류를 증가시켜 발적과 발열을 유발할 수 있다. 이러한 화학 물질 중 일부는 체액이 조직으로 누출되어 부종을 일으킨다. 이 보호 과정은 신경을 자극하고 통증을 유발할 수 있다. 이러한 변화는 해당 부위에서 제한된 기간 동안 발생하면 신체에 유익하게 작용한다.
염증 반응의 체액성 면역 요소와 세포성 면역 요소 사이의 섬세하고 균형 잡힌 상호 작용은 유해한 약제를 제거하고 손상된 조직의 복구를 시작할 수 있다. 이러한 섬세하고 균형 잡힌 상호 작용이 중단되면 염증 반응은 정상 조직에 상당한 손상을 일으킬 수 있으며 초기 반응을 유발한 손상보다 더 해로울 수 있다. 이러한 염증 반응이 통제 불능인 경우 조직 손상 및 장기 기능 장애를 예방하기 위해 임상 개입이 필요하다. 예를 들어 건선, 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 크론병, 천식, 알레르기 또는 염증성 장 질환과 같은 질환은 만성 염증을 특징으로 한다. 관절염, 관련 관절염 병태(예를 들어, 골관절염, 류마티스성 관절염 및 건선성 관절염), 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염), 농독증, 건선, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 및 만성 폐쇄성 폐질환과 같은 염증성 질환, 만성 염증성 폐질환도 만연하고 문제가 되는 질환이다.
일부 실시예에서, 이러한 방법은 유전자 조작된 세포를 피험자에게 투여하는 입양 세포 요법을 포함한다. 이러한 투여는 질환 또는 장애의 세포가 파괴의 표적이 되도록 세포의 활성화(예를 들어, T 세포 활성화)를 촉진할 수 있다.
일부 실시예에서, 이러한 방법은 질환 또는 병증을 갖거나, 질환 또는 병증을 가질 위험이 있거나, 질환 또는 병증을 가질 것으로 의심되는 피험자, 조직 또는 세포와 같은 피험자, 조직 또는 세포에 이러한 세포 또는 이러한 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법에 의해 세포, 집단 및 조성물을 치료될 특정 질환 또는 병증을 갖는 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서, 질환 또는 병증을 갖거나 질환 또는 병증을 가질 위험이 있는 피험자와 같은 피험자에게 세포 또는 조성물을 투여한다. 일부 실시예에서, 상기 방법에 의해 예를 들어 질환 또는 병증의 하나 이상의 증상을 개선한다.
입양 세포 요법에 사용되는 세포의 투여 방법은 공지된 것이며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238; 미국 특허 번호 4,690,915; Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol.8 (10):577-85 (2011); Themeli 등, Nat Biotechnol. 31(10):928-933 (2013); Tsukahara 등, Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9 (2013); 및 Davila 등, PLoS ONE 8(4): e61338 (2013)에 기재되어 있다. 이러한 방법은 본원에 의해 제공되는 방법 및 조성물과 결합하여 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법 또는 그러한 피험자로부터 유래된 샘플을 받기 위해 피험자로부터 분리 및/또는 다른 방식으로 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 피험자로부터 유래되고, 분리 및 처리 후에 세포는 동일한 피험자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받거나 궁극적으로 받을 피험자 이외의 피험자(예를 들어, 제1 피험자)로부터 분리 다른 방식으로 제조된다. 이러한 실시예에서, 동일한 종의 상이한 피험자, 예를 들어 제2 피험자에게 세포를 투여한다. 일부 실시예에서, 제1 피험자와 제2 피험자는 유전적으로 동일하다. 일부 실시예에서, 제1 피험자와 제2 피험자는 유전적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제2 피험자는 제1 피험자와 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼타입을 발현한다.
일부 실시예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 피험자는 인간과 같은 영장류 동물이다. 피험자는 남성 또는 여성일 수 있고 영유아, 유아, 청소년, 성인 및 노인 피험자를 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 피험자는 질환, 입양 세포 요법 및/또는 독성 결과 평가를 위한 검증된 동물 모델이다.
본원에 의해 제공되는 조성물은 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 안구주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전안방내 주사, 결막하 주사, 안내 경막하 주사, 안구뒤 주사, 안구주위 주사와 같은 주사, 또는 후방 공막옆 전달과 같은 임의의 적합한 방식에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 이들은 비경구적으로, 폐내로, 비강내로, 국소 치료를 위해 필요한 경우 병변내로 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
질환 또는 병태를 예방 및/또는 치료하는데 효과적인 본원에 의해 제공되는 예방제 또는 치료제의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템에서 얻은 용량-반응 곡선에서 외삽할 수 있다. 질환의 예방 또는 치료를 위해 결합 분자 또는 세포의 적절한 용량은 치료할 질환 또는 병증의 유형, 결합 분자의 유형, 질환 또는 병증의 중증도 및 경과, 치료제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응, 및 주치의 판단에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시예에서, 조성물, 분자 및 세포는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 여러 용량을 간헐적으로 투여할 수 있다. 초기에 더 높은 부하 용량을 투여한 후 하나 이상의 더 낮은 용량을 투여할 수 있다.
유전적으로 조작된 세포의 경우, 일부 실시예에서, 약 100만 내지 약 1000억 개의 세포 및/또는 체중 킬로그램당 이러한 양의 세포가 피험자에게 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 여기서 상기 약학적 조성물은 본원에 따른 조작된 면역 세포 중 어느 하나를 포함하며, 상기 약학적 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 세포/kg개체 체중 중 어느 하나의 용량으로 투여된다. 용량은 질환 또는 병증 및/또는 환자 및/또는 다른 치료의 특정 속성에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시예에서, 약학적 조성물은 1회 투여된다. 일부 실시예에서, 약학적 조성물은 여러 회(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상 중 어느 하나) 투여된다. 일부 실시예에서, 약학적 조성물은 투여 주기에서 1회 이상 투여된다. 투여 주기는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5주 또는 그 이상, 또는 1, 2, 3, 4, 5개월 또는 그 이상일 수 있다. 특정 환자에 대한 최적의 용량 및 치료 방안은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 조성물은 조합 치료의 일부분으로서, 예를 들어 다른 치료적 개입(예를 들어, 다른 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 약제, 예를 들어 세포 독성제 또는 치료제)과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다.
일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 조성물은 하나 이상의 추가 치료제와 공동 투여되거나 다른 치료적 개입과 병용 투여되거나 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 일부 실시예에서, 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대의 경우도 가능하도록 충분한 시간 내에 다른 요법과 함께 세포를 병용 투여한다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 조성물은 하나 이상의 추가 치료제 이전에 투여된다. 일부 실시예에서, 본원에 의해 제공되는 조성물은 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다.
일부 실시예에서, 세포를 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여한 후, 다양한 공지된 방법 중 어느 하나를 통해 조작된 세포 집단의 생물학적 활성을 측정한다. 평가된 파라미터는 생체내(예를 들어, 이미징에 의해) 또는 생체외(예를 들어, ELISA 또는 유세포 분석에 의해) 조작된 또는 천연 T 세포 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다른 면역 세포를 포함한다. 일부 실시예에서,표적 세포를 파괴하는 조작된 세포의 능력은 예를 들어 Kochenderfer 등, J. Immunotherapy, 32(7):689-702 (2009) 및 Herman 등J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004)에 기재된 세포 독성 측정법과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시예에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부담 감소와 같은 임상 결과를 평가하여 측정된다.
7.9. 카세트(키트) 및 제품
본원에 따른 조작된 면역 이펙터 세포 중 어느 하나를 포함하는 카세트, 단위 용량 및 제품을 더 제공한다. 일부 실시예에서, 본원에 따른 약학적 조성물 중 어느 하나를 포함하는 카세트를 제공하며, 바람직하게는 그의 사용 지침을 제공한다.
본 발명의 카세트는 적합한 포장에 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 항아리, 가요성 포장(예를 들어, 밀봉된 마일러 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 카세트는 선택적으로 완충액 및 해석 정보와 같은 다른 구성 요소를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 바이알(예를 들어, 밀봉된 바이알), 병, 항아리, 가요성 포장 등을 포함하는 제품을 더 제공한다.
제품은 용기 및 상기 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료(예를 들어, 유리 또는 플라스틱)로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 따른 질환 또는 병증(예를 들어, 암)을 치료하는데 효과적인 조성물을 수용하고 멸균 접근 포트(예를 들어, 용기는 정맥 용액 백 또는 피하 주사바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음)를 가질 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 개체의 특정 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 개체에게 조성물을 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 라벨에는 재구성 및/또는 사용 지침이 표시되어 있을 수 있다. 약학적 조성물을 수용하는 용기는 재구성된 제형의 반복 투여(예를 들어, 2-6회 투여)를 허용하는 여러 회 사용되는 바이알일 수 있다. 패키지 삽입물은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업용 패키지에 일반적으로 포함되는 지침을 의미한다. 추가로, 제품은 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 원하는 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
카세트 또는 제품은 약국(예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국)에서 보관 및 사용하기에 충분한 양으로 포장된 복수의 단위 용량의 약학적 조성물 및 사용 설명서를 포함할 수 있다.
간결함을 위해 본원에서는 특정 약어를 사용한다. 일 구현예는 아미노산 잔기를 나타내는 단일 문자 약어이다. 아미노산 및 이에 해당하는 세 문자 및 단일 문자 약어는 다음과 같다.
본 출원은 본원에서 일반적으로 다양한 실시예를 설명하기 위해 긍정 언어를 사용하여 본 명세서에 개시된다. 본 출원은 또한 특별히 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 방안, 절차, 측정 또는 분석과 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 실시예를 포함한다. 따라서, 비록 본 출원에 포함되지 않는 내용에 따라 본 출원이 일반적으로 표현되지 않더라도, 본 출원에 명시적으로 포함되지 않는 양태들은 여전히 본원에 개시된다.본 출원의 다수의 실시예가 설명되었다. 그러나, 본 출원의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 하기 구현예는 특허청구범위에 기재된 개시 내용의 범위를 제한하는 것이 아니라 설명하기 위한 것이다.
8. 구현예
본원의 구현예는 아래의 실험이 모두 수행되었거나 이러한 실험만 수행되었음을 의미하는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)의 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다.
8.1. 구현예 1: 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 제조
외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 예시적인 CAR-T 세포를 구축하고 테스트하였다. 예를 들어, 본 구현예 및 아래 구현예에서, 본 발명을 예시하기 위해 항-GPC3 CAR-T 세포를 구축하였다.
8.1.1. 키메라 항원 수용체의 구축
인간화 항-GPC3 scFv CAR(즉, H93 CAR)을 구축하기 위해, N-말단에서 C-말단까지 CD8α 힌지 도메인(SEQ ID NO: 8), CD8α 막관통 도메인(SEQ ID NO: 9), CD137 공동자극 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 10) 및 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 11)을 포함하는 CAR 백본 폴리펩티드를 코딩하는 CAR 백본 서열을 화학적으로 합성하여 다운스트림 사전 변형된 렌티바이러스 벡터(pLSINK-BBzBB)에 클로닝하고, 구성적 hEF1α 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 시험관 내 전사에 사용하였다. 벡터 중의 다클론부위(MCS)는 항-GPC3인간화 scFv 단편(즉, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 scFv)의 N-말단에 융합된 CD8α신호 펩티드(SEQ ID NO: 7)를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열이 CAR 백본 벡터에 삽입되도록 허용하며, CAR 백본 서열 업스트림에 있고 CAR 백본 서열에 작동 가능하게 연결된다. CD8α신호 펩티드 및 항-GPC3 인간화 scFv 단편을 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, 당업계에 공지된 분자 클로닝 기술에 의해 EcoRI(5'-GAATTC-3')(SEQ ID NO: 15) 및 SpeI(5'-ACTAGT-3')(SEQ ID NO: 16) 제한 부위를 통해 pLSINK-BBzBB CAR 백본에 클로닝하였다. 얻은 H93 CAR은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다. CAR 코딩 영역은 도 1의 상단에 표시되었다.
H93 CAR 백본에 기초하여, H93M CAR벡터 중의 MCS는 인간 IL12p40(SEQ ID NO: 5) 및 인간 CCL-19(SEQ ID NO: 6)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 삽입을 허용하고, 상기 핵산 서열은 다른 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 P2A 단편)의 C-말단에 융합된 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 14로 표시되는 T2A 펩티드)를 통해 연결되며, CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단 업스트림에 있고 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단에 작동 가능하게 연결된다. P2A 펩티드 및 IL12p40-T2A-CCL-19 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, HpaI(5'-GTTAAC-3')(SEQ ID NO: 17) 및 MluI(5'-ACGCGT-3')(SEQ ID NO: 23) 제한 부위를 통해 pLSINK-BBzBB CAR 백본에 클로닝하였다. 얻은 H93M CAR은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 12의 핵산 서열을 포함한다. H93M의 CAR 코딩 영역은 도 1의 중간에 표시되었다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, H93M CAR-T 세포에서 과발현된 IL12p40은 내인성 IL-23α p19 서브유닛과 함께 IL-23을 형성할 수 있으며, 상기 내인성 IL-23α p19 서브유닛은 TCR 자극 후 T 세포에 의해 상향 조절되는 것으로 보고되었다. 예를 들어 Ma 등, Interleukin-23 engineering improves CAR T cell function in solid tumors. Nat Biotechnol. 2020 Apr; 38(4):448-459를 참조할 수 있다.
pMDLg.pRRE(Addgene#12251), pRSV-REV(Addgene#12253) 및 pMD2.G(Addgene#12259)를 함유하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 혼합물과 CAR 구축물을 발현하는 벡터를 미리 최적화된 비율로 폴리에테르이미드(PEI)와 미리 혼합한 다음, 25℃에서 5분 동안 배양하였다. 그런 다음 HEK293 세포른 형질감염 혼합물에 첨가하였다. 그런 다음, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 세포 배양기에서 밤새 배양하였다. 4℃ 및 3000 g에서 15분 동안 원심분리한 후 상등액을 수집하고, 0.45 μm PES 필터를 통해 여과한 다음, 초원심분리하여 렌티바이러스를 농축하였다. 상등액을 조심스럽게 버리고, 미리 냉각된 DPBS로 바이러스 입자를 조심스럽게 헹구었다. 바이러스를 적절하게 액화하고, -80℃에서 보관하였다. CHO(중국 햄스터 난소) 세포주의 형질도입에 의한 적정법으로 바이러스 역가를 측정하였다.
8.1.2. CAR-T 세포의 제조
PBMC는 TPCS(#A19Z284097)에서 구입하였다. Pan T 세포 분리 키트(Miltenyi #130-096-535)를 사용하여 아래에 설명된 제조업체의 방안에 따라 PBMC로부터 인간 T 세포를 정제하였다. 세포의 수를 측정하고, 세포 현탁액을 300 g으로 10분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 상등액을 완전히 흡인하고, 세포 입자를 10개 총 세포당 40 μL의 완충액에 재현탁하였다. 10개 총 세포당 10 μL의 Pan T 세포 비오틴-항체 혼합물을 첨가하고, 충분히 혼합하여 냉장고(2℃-8℃)에서 약 5분 동안 배양하였다. 그런 다음 10개 세포당 30 μL의 완충액을 첨가하였다. 10개 세포당 20 μL의 Pan T 세포 비드 혼합물을 첨가하였다. 세포 현탁액 혼합물을 충분히 혼합하여 냉장고(2℃-8℃)에서 10분 동안 더 배양하였다. 자기 분리에는 적어도 500 μL가 수요된다. 자기 분리를 위해, LS 칼럼을 적합한 MACS 분리기의 자기장에 배치하였다. 3 mL 완충액으로 헹구어 칼럼을 제조하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 칼럼에 적용하고, 풍부한 T 세포 분획을 나타내는 표지되지 않은 세포를 함유하는 유출물을 수집하였다. 3 mL 완충액으로 칼럼을 세척하고 통과된 표지되지 않은 세포를 수집하여 추가 T 세포를 수집하였다. 이러한 표지되지 않은 세포는 풍부한 T 세포를 재차 나타내며, 이전 단계의 유출물과 조합된다. 그런 다음 수집된 풍부한 T 세포를 원심분리하고 RPMI-1640+300IU/mL IL-2에 재현탁하였다.
제조된 T 세포는 이후에 인간 T 세포 TransAct 키트(Miltenyi#170-076-156)를 사용하여 제조업체의 방안에 따라 48시간 동안 미리 활성화하였으며, 여기서 항-CD3/CD28 MACSiBead 입자는 40 μL/백만의 비드와 세포의 비율로 첨가되었다.
CAR-T 세포 제조를 위해, 미리 활성화된 T 세포를 0.5 × 106개 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 그런 다음, 정제된 바이러스를 웰에 첨가하였다. 하룻밤 지난 후 수집하여 원심분리하고, 신선한 RPMI-1640+300IU/mL IL-2로 재현탁한 후, 형질도입된 세포를 24-웰 G-Rex(Wilson Wolf #80192M)에 넣었다. 형질도입되지 않은 T 세포(UnT)를 음성 대조군으로 사용하였다. 7일째에, 네이키드 H93 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포의 CAR 양성률은 각각 39.3% 및 32.5%였다(도 2).
8.1.3. IL-23 및 CCL-19의 발현
H93M CAR의 구조를 검증하기 위해, 정상 조건(RPMI-1640+300IU/mL IL-2)에서 CAR-T 세포를 배양하고, IL-23 및 CCL-19의 분비 상황을 분석하였다. 간략하게는, 6-웰 플레이트에서 1×106개 세포/mL로 세포를 배양하고, 각각 12일째, 14일째 및 17일째에 상등액을 얻었다. 제조업체의 방안에 따라, 인간 IL-23 키트(CISBIO#62HIL23PEG) 및 CCL-19 ELISA 키트(Abcam#ab100601)를 사용하여 IL-23 및 CCL-19의 양을 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T 세포 및 UnT와 비교하여, H93M CAR-T 세포만이 IL-23(286.9 pg/106개의 세포-570.3 pg/106개의 세포) 및 CCL-19(65.4 pg/106개의 세포-237.2 pg/106개의 세포)을 분비하였다(IL-23 발현도 CCL-19 발현도 검출되지 않음).
8.2. 구현예 2: 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 시험관 내 반복 유발 측정
시험관 내에서 CAR-T 세포의 지속성 및 고갈성을 평가하기 위해, CAR-T 세포 반복 유발 모델을 구축하였다. GPC3 양성 종양 세포로 CAR-T 세포를 여러 라운드 동안 자극하여 CAR-T 세포의 고갈 표현형을 얻었다. 재유발 측정에는 3개의 처리 군이 있는데 각각 H93 CAR-T군(초기 CAR-T 세포는 H93 CAR-T 세포임), H93M CAR-T군(초기 CAR-T 세포는 H93M CAR-T 세포임) 및 UnT(초기 T 세포는 CAR로 형질도입되지 않음)이다. 첫 번째 라운드(라운드 1) 재유발에서, CAR-T 세포와 종양 세포는 1:1 E/T 비율로 6-웰 플레이트에서 공동 배양되었다. 하룻밤 지난 후, 웰 내 CAR-T 세포를 부드럽게 수집하고, 원심분리하며, 신선한 CAR-T 배지(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)에 재현탁하였다. 그런 다음 CAR-T 세포를 새로운 플레이트에 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다. 그런 다음, 웰 내 CAR-T 세포를 수집하고, 신선한 배지에 재차 재현탁하여 신선한 종양 세포가 접종된 새로운 플레이트에 첨가하였다(라운드 2). 이전 라운드가 끝날 때 CAR-T 세포의 양성률에 의해 첨가된 신선한 종양 세포의 수를 계산하였다. 나머지 CAR-T 세포의 세포의 수 및 생존력에 따라, 상기 과정을 여러 라운드 동안 반복할 수 있다. 각 라운드의 종양 세포 재유발 24시간 후에 CAR+ T 세포에서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 고갈 마커 PD-1 및 LAG3을 분석하였다. 각 라운드가 끝날 때 T 세포를 계수하고, 자극 72시간 후에 GPC3 양성 HCC 세포주 PLC/PRF/5에 대해 세포 독성 측정을 수행하였다.
8.2.1. T 세포의 증폭
H93M CAR-T 세포의 증폭 기능의 이점을 확인하기 위해, 각 라운드의 재유발이 끝날 때 총 T 세포의 세포의 수 및 생존력을 기록하였다.
4a에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T군(라운드 6에서 10.5배) 및 UnT군(라운드 6에서 0.2배)과 비교하여, PLC/PRF/5 세포를 사용한 반복 자극은 H93M CAR-T군 세포의 유의한 증폭(라운드 6에서 138.4배)을 유발하였다. 동시에, H93M CAR-T군의 세포 생존력은 여전히 높았으며, 비교로서 H93 CAR-T군 및 UnT군은 각각의 자극 후에 점차 감소하였다(도 4b).
8.2.2. 세포 독성 측정 및 사이토카인 방출
또한 CAR-T 재유발 측정에서 매 두 라운드가 끝날때 마다 CAR-T 세포의 세포 독성을 평가하였으며, 총 T 세포:표적 세포 비율은 1:1이다. 표적 세포는 당업계에 공지된 기술에 의해 반딧불 루시퍼라제를 발현하도록 조작된 GPC3 양성 PLC/PRF/5 세포이다. 매 두 라운드가 끝날때마다 세포를 수집하고, 표적 세포(2 × 103 세포/웰)를 혼합하며, 384-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 종양 세포에 대한 CAR-T 세포의 세포 독성을 측정하기 위해, 제조업체의 방안에 따라 One-glo 발광 루시페라제 측정 시약(Promega #E6110)을 제조하고 공동 배양 세포에 첨가하여 웰에 남아 있는 루시퍼라제 활성을 검출하였다. 루시페라아제는 종양 세포에서만 발현되기 때문에 웰에 남아 있는 루시퍼라제 활성은 웰에서 생존 가능한 표적 세포의 수와 직접적으로 관련된다. 이펙터 세포가 없는 표적 세포에 배지를 첨가하여 최대 루시퍼라제 활성을 얻었다. 세포 독성 측정 시작 시 최종 농도 1%의 Triton X-100을 첨가하여 최소 루시페라제 활성을 측정하였다. 공식: 특이성 세포 독성% = 100% × (1-(RLU 샘플 - RLUmin)/(RLUmax - RLUmin))에 의해 특이적 세포 독성을 계산하였다.
도 5a에 도시된 바와 같이, 라운드 1 이후 동일한 세포 독성(21.1% 대 22.4%)을 나타낸 것을 제외하고, 라운드 3 이후 H93M CAR-T군은 H93 CAR-T군보다 더 높은 세포 독성을 보였다. 구체적으로, H93M CAR-T군은 라운드 3 이후 74.4%의 평균 세포 독성을 나타내고, 라운드 5(80.7%) 및 라운드 7(83.4%) 이후 소폭 증가하였다. H93 CAR-T군에서 상대적으로 낮은 세포 독성이 관찰되었으며, 평균 세포 독성은 각각 52.7%(라운드 3), 57.9%(라운드 5) 및 47.0%(라운드 7)이다. 이는 H93M CAR-T군이 GPC3 양성 HCC 세포주 PLC/PRF/5.Luc 세포에 대해 지속적으로 높은 수준의 세포 독성을 가짐을 보여준다.
H93 CAR-T 세포와 비교하여 재유발 측정에서 GPC3 양성 종양 세포에 대한 H93M CAR-T 세포의 지속적인 세포 독성 활성을 추가로 검증하기 위해, CAR-T 세포와 PLC/PRF/5.Luc 세포를 1:1 E/T 비율(총 T 세포:표적 세포)로 24시간 동안 공동 배양한 후, ELISA를 통해 TNF-α 및 IFN-γ의 생성을 분석하였다. 결과는 H93 CAR-T군에 비해 H93M CAR-T군이 TNF-α 및 IFN-γ를 생산하는 능력이 유의하게 높았고 모든 라운드에서 세포 독성 효능과 유의한 상관관계를 나타냄을 보여준다. 도 5b 및 5c에 도시된 바와 같이, H93M CAR-T군 세포에 의해 분비된 TNF-α 및 IFN-γ 농도는 라운드 3 내지 라운드 5 이후 각각 451.2-1151.1 pg/mL(TNF-α) 및 18353.7-37072.7 pg/mL(IFN-γ)의 범위 내로 유의하게 증가하였고, H93 CAR-T군 세포에 의해 분비된 TNF-α 및 IFN-γ농도는 라운드 3 내지 라운드 7 이후 각각 197.1-129.2 pg/mL(TNF-α) 및 4993.1-1672.1 pg/mL(IFN-γ)의 범위 내로 점차 감소하였다.
8.2.3. 양성 CAR-T 세포의 비율 변화
H93 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포의 양성률은 매 두 라운드 후 계산되었으며,이는 자극 라운드 수가 증가함에 따라 30%-86% 범위 내로 거의 동일하였다. 마지막으로, 라운드 5 이후 H93 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포의 양성률은 증가하지 않았다(도 6). 라운드 5 재유발 후, H93M CAR-T 세포는 높은 세포 독성을 나타냈고, 평평한 CAR+%(도 6)와 비교하여 세포 독성이 증가하였다(도 5a).
8.2.4. T 세포의 고갈
재유발 측정에서, 각 라운드 24시간 후 T 세포 고갈을 평가하였다. 각각 항-인간 PD-1 항체(Biolegend#329908) 및 항-LAG-3 항체(Invitrogen#17-2239-42)를 사용하여 2가지 고갈 마커 PD-1 및 LAG-3을 표지하고, CD4+CAR+ T 세포 및 CD8+CAR+ T 세포 이중 양성 하위 집단의 발현 수준을 분석하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T군과 비교하여, H93M CAR-T군은 모든 라운드에서 고갈 마커 PD-1 및 LAG3의 발현이 감소된 것으로 나타났다. 특히 라운드 3 내지 라운드 5에서, H93M CAR-T군에서 CD4+CAR+ 이중 양성 하위 집단의 PD-1 발현은 13%-18% 사이이고, H93 CAR-T군은 30%(도 7a)보다 높았다. 모든 라운드(R2-R7)에서, CD4+CAR+ 이중 양성 하위 집단에서 H93M CAR-T군은 H93 CAR-T군(30%-49%)보다 유의하게 낮은 LAG-3 발현(12%-25%)을 갖는다(도 7c). CD8+CAR+ 이중 양성 하위 집단에서, H93M CAR-T군에서 PD-1의 발현 수준은 여전히 H93 CAR-T군(라운드 3 내지 라운드 7에서 1.3%-4.1% 대 5.6%-9.4%)보다 낮으며(도 7b), 라운드 3 내지 라운드 5에서, H93M CAR-T군의 LAG3 발현 수준은 56.6%-82.9% 사이로 H93 CAR-T군(82.7%-88.1%)보다 낮은데(도 7d), 이는 H93M CAR-T 세포가 고갈에 저항하는 능력을 가짐을 보여준다.
8.3. 구현예3: 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 세포 이동 측정
CCL-19의 화학주성 기능을 평가하기 위해, 세포 이동 측정을 수행하였다. 96-웰 트랜스웰 챔버(Corning)에서 5-μm 기공 크기의 폴리카보네이트 필터에 의한 이동을 통해 반응하는 T 세포의 화학주성을 측정하였다. GPC3 양성 인간 HCC 세포주 PLC/PRF/5 세포로 CAR-T 세포 및 UnT 세포를 자극하고, 30시간 후 공동 배양 상등액을 수집하였다. 그런 다음 125 μL 상등액을 하부 챔버에 넣고, 75 μL처리되지 않은 T 세포(0.075 M)를 상부 챔버에서 배양하였다. 4, 6 및 8시간 후, 혈액 계수 챔버를 통해 상부 챔버로부터 하부 챔버로 이동한 T 세포를 계수하였다. 세포 이동 측정에는 3개의 처리 군이 있는데 각각 H93 CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93 CAR-T 세포로부터 얻음), H93M CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M CAR-T 세포로부터 얻음) 및 UnT군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 UnT 세포로부터 얻음)이다.
도 8a에 도시된 바와 같이, 상이한 시점에서, PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M CAR-T 세포(CCL-19의 분비 포함)의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93 CAR-T 세포 및 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 UnT 세포의 상등액보다 더 많은 T 세포를 흡인하였다(H93M CAR-T군과 H93 CAR-T군: P < 0.0001). 구체적으로, H93M CAR-T군은 6시간(0.104 M)에 상부 챔버의 모든 T 세포를 완전히 흡인할 수 있고, CCL-19가 생성되지 않은 H93 CAR-T군 및 UnT군은 8시간에도 각각 0.032 M 및 0.026 M으로 더 적은 T 세포만 이동하였다. 또한, CCL-19 ELISA(Abcam#ab100601)를 통해 공동 배양 상등액에서 CCL-19의 농도를 측정하였다. 상기 결과는 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M CAR-T 세포로부터 얻은 상등액이 CCL-19(4590.15±380.85 pg/mL)를 분비함을 보여주며, 이는 H93M CAR-T 세포의 화학주성 기능을 추가로 검증하였다(도 8b).
8.4. 구현예 4: 생체내 입양 전이 후 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 항종양 작용
구현예1에 개시된 방법에 따라, 인간 IL12p40 및 인간 IL-7을 발현하는 H93C CAR-T 세포도 제조하였다. H93 CAR 백본에 기초하여, H93C CAR벡터 중의 MCS는 인간 IL12p40(SEQ ID NO: 5) 및 인간 IL-7(SEQ ID NO: 24)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 삽입을 허용하고, 상기 핵산 서열은 다른 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 P2A 단편)의 C-말단에 융합된 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 P2A 펩티드)를 통해 연결되며, CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단 업스트림에 있고 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단에 작동 가능하게 연결된다. P2A 펩티드 및 IL12p40-P2A-IL-7 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, HpaI(5'-GTTAAC-3')(SEQ ID NO: 17) 및 MluI(5'-ACGCGT-3')(SEQ ID NO: 23) 제한 부위를 통해 pLSINK-BBzBB CAR 백본에 클로닝하였다. IL12p40-P2A-IL-7 펩티드의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 표시된다.
NCG 마우스 이종 이식 모델에서 CAR-T 세포의 생체내 항종양 효능을 평가하였다. 피하 이종이식 모델의 경우, 6-7 주령의 NCG 마우스의 오른쪽 앞다리에 Huh7 세포(1.5 × 106 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 100 mm3에 가까워졌을 때(이종이식 접종 후 11일째), 마우스를 무작위로 여러 군으로 나누고, 꼬리 정맥 주사를 통해 각각 H93 CAR-T 세포(0.2 M 또는 0.6 M 용량), H93M CAR-T 세포(0.2 M 또는 0.6 M 용량), H93C CAR-T 세포(0.2 M 용량), UnT(2.3 M 용량, CAR-T군과 동일한 총 T 세포의 세포의 수) 및 용매만(비히클)으로 처리하였다. 주당 2회 디지털 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피: 종양 부피 = ((길이) × (너비)2)/2에 따라 종양 부피를 계산하였다. 또한 각각 입양 전이 후 0, 7, 14, 21 및 28일째에 디지털 PCR을 통해 마우스 혈액에서 CAR-T 세포의 복제 수를 검출하였다.
동물 윤리로 인해, 20일째에 비히클, UnT 및 H93 CAR-T 세포로 처리된 마우스를 희생시켰으며, 이 세 군의 종양 부피는 2000 mm3 이상에 도달했다. H93M CAR-T 세포로 처리된 마우스를 27일째(용량: 0.2 M) 및 49일째(용량: 0.6 M)까지 계속 기록하였다. 도 9a에 도시된 바와 같이, UnT 및 H93 CAR-T 세포군과 비교하여, 20일째에 입양 전이된 H93M CAR-T 세포가 투여된 마우스의 종양 크기가 각각 76.8% 및 74.6%(584.3 mm3 대 2514.7 mm3, 2297.3 mm3)로 감소되고, 20일째 이후, 종양 크기가 여전히 점차 감소된 것으로 관찰되었는데, 이는 H93M CAR-T 세포가 낮은 용량(0.2 M/마우스)에서 H93 CAR-T 세포보다 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여준다. 동시에, H93C CAR-T 세포군은 약간의 항종양 작용만 보였고, 20일째에 32.7%의 성장 억제율(1546.8 mm3 대 2297.3 mm3)을 갖는데, 이는 외인적으로 도입된 IL12p40 및 IL-7을 발현하는 H93C CAR-T 세포와 비교하여, 외인적으로 도입된 IL12p40 및 CCL-19를 발현하는 H93M CAR-T 세포가 생체내 입양 전이 후 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여준다. 용량을 0.6 M/마우스로 증가시켰을 때, 도 9b에 도시된 바와 같이, H93M CAR-T 세포의 투여는 종양 성장에 상당한 억제 작용이 있으며, 20일째에 UnT와 비교하여 성장 억제율은 96.0%(101.6 mm3 대 2514.7 mm3)이지만, H93M CAR-T 세포 처리군 및 H93 CAR-T 세포 처리군에서 유사한 종양 퇴행(101.6 mm3137.3 mm3)이 과찰되었다. 34일째에, H93M CAR-T 세포로 처리된 마우스는 거의 종양이 없었다.
디지털 PCR을 통해 마우스 말초 혈액 세포에서 CAR 유전자 복제 수를 검출하고, H93M CAR-T 세포는 0.2 M 용량에서 21일째에 유의한 증폭을 보인 후 감소하였으며, 전체 처리 과정에서, H93 CAR-T 세포 및 UnT로 처리된 마우스에서는 유의한 증폭이 없었다(도 9c). 0.2 M 용량에서, 21일째에 H93M CAR-T 세포의 복제 수는 0일째의 335.6배(133.4175개 복제 대 0.3975개 복제)이고, 28일째에 184.7배(73.4250개 복제 대 0.3975개 복제)로 감소하였다. H93C CAR-T 세포는 14일째 이후 제어 불가능한 증폭을 보였고, 28일째에 4873.7배(231.5350개 복제 대 0.0475개 복제)(도 9c)에 도달하였다. 0.6 M 용량에서, H93M CAR-T 세포 및 H93 CAR-T 세포는 7일째 이후 모두 유의한 증폭을 보였고, H93M CAR-T 세포는 H93 CAR-T 세포보다 더 우수한 증폭 능력(21일째에 272.2850개 복제 대 83.6275개 복제)을 갖는다(도 9d).
이 실험 동안, 0.2 M 용량 또는 0.6 M 용량에 관계없이, 세 군 모두에서 마우스 체중 감소가 관찰되지 않았다(도 10a 및 도 10b). 그러나 H93 CAR-T 세포로 처리된 마우스는 0.2 M 용량에서 20일째에 털이 곤두서며, 등이 굽고, 쇠약해진 등 증상을 보였고, H93M CAR-T 세포로 처리된 마우스는 정상이었다. 0.6 M 용량에서, 두 군의 마우스는 외모가 모두 정상이었다. H93C CAR-T 세포(0.2 M 용량)가 입양 전이된 4마리의 마우스에서, 2마리는 24일째에 희생시켰고, 털이 곤두서며, 등이 굽고, 쇠약해지며, 호흡곤란 등 증상을 보였다. H93M CAR-T 세포 및 H93C CAR-T 세포로 처리한 마우스의 데이터를 비교한 결과, H93M CAR-T 세포가 H93C CAR-T 세포보다 더 우수한 항종양 잠재력, 제어 가능한 증폭 및 생체내 안전성을 가짐을 보여준다.
H93M CAR-T 세포에서 IL-23의 활성화 의존적 생성을 검증하기 위해, 인간 IL-23 키트(CISBIO#62HIL23PEG) 및 인간 IFN-γ 키트(CISBIO#62HIFNGPEG)를 사용하여 CAR-T 세포로 처리된 NCG 마우스 말초 혈액에서 IL-23 및 IFN-γ의 분비 수준을 분석하였다. 도 11a에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T 세포 처리군과 비교하여, H93M CAR-T 세포 처리군은 낮은 용량(0.2 M, 21일째)에서 3배에 달하는 더 높은 IL-23 분비 수준을 나타냈다. 높은 용량(0.6 M)의 H93M CAR-T 세포로 처리된 마우스 및 H93 CAR-T 세포로 처리된 마우스에서 유사하게 낮은 수준의 IL-23이 관찰되었다(도 11b). 동시에, 마우스 말초 혈액에서 활성화 의존적으로 생성된 IFN-γ의 분비 거동은 IL-23과 유사한데(도 11c 및 11d), 이는 H93M CAR-T 세포에서 IL-23의 활성화 의존적 생산을 나타낸다.
생체내에서 H93M CAR-T 세포의 항종양 작용을 연구하기 위해, 면역 조직 화학(IHC)을 사용하여 T 세포의 침윤 상황 및 종양 부위 대식세포 및 수지상 세포(DC)의 모집 상황을 연구하였다. 간략하게는, 조직 파라핀 절편 슬라이드를 60℃에서 60분 동안 가열한 다음, 자일렌에서 3회 탈랍하되, 매회 10분 동안 수행하고, 100%, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 알콜올 및 물에서 재수화하되, 매회 5분 동안 수행한다. 슬라이드를 항원 회수 완충액에 20분 동안 끓여 항원을 회수한 다음, 슬라이드를 항원 회수 완충액에 담그고 실온(RT)으로 냉각시킨 후 메탄올에 녹인 3% 과산화수소로 슬라이드를 10분 동안 처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 파괴하였다. 비특이적 배경 염색을 줄이기 위해, 슬라이드를 차단 완충액(DPBS에 희석된 5% 염소 혈청)과 함께 2℃-8℃에서 밤새 배양하였다.
하룻밤 지난 후, 슬라이드를 실온에서 30분 동안 배양한 다음, 희석된 1차 항체와 함께 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 2차 항체 HRP-접합 항-마우스 IgG 항체(Fuzhou Maixin Biotech. Co., Ltd. # KIT-5002)와 함께 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양하였다. 제조업체의 지침에 따라 DAB 기질을 제조하고, 200-500 μL DAB 기질을 슬라이드에 첨가하여 어두운 곳에서 2분 동안 배양하였다. 증류수로 5분 동안 세척하여 염색을 중지하였다. 마지막으로 슬라이드에 중성 발삼을 첨가하고, 헤마톡실린으로 대조염색하며, 1% 염산 알코올로 분화시키고, 알코올로 탈수시킨 후 슬라이드를 밀봉하였다.
H93M CAR-T 세포가 낮은 용량(0.2M)에서 항종양 능력을 향상시키는 메커니즘을 밝히기 위해, TCRα(H-1)(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY#sc-515719)를 사용하여 IHC를 통해 처리된 마우스의 종양 조직에서 T 세포 침윤을 연구하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T 세포 및 UnT 처리군과 비교하여, H93M CAR-T 세포 처리군의 3마리 마우스 모두에서 종양 부위의 T 세포 침윤이 모두 개선되었다. H93M CAR-T 세포 처리군에서, 더 많은 T 세포가 중앙 종양 네스트로 침윤한 반면, H93 CAR-T 세포로 처리된 3마리의 마우스 중 한 마리의 마우스만 종양 가장자리 부위에 T 세포 침윤이 적었고, 다른 마우스는 종양 부위의 T 세포가 매우 적었다. UnT 처리군에서, 3마리의 마우스의 종양 부위에서 T 세포 침윤이 관찰되지 않았다.
또한, 종양 조직에서의 대식세포 및 DC 모집도 연구하였다. 항-CD68 항체(Abcam#ab125212) 및 항-CD11c 항체(Cell signaling technology#97585S)를 사용하여 종양 조직에서 마우스 대식세포 및 DC를 검출하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, CD68+ 대식세포(왼쪽 열) 및 CD11c+ DC(오른쪽 열)는 DAB로 염색되었다. 대식세포 및 DC의 종양 부위로의 모집은 H93M CAR-T 세포 처리군에서 유의하게 더 높았고, UnT 및 H93 CAR-T 세포 처리군은 종양 조직 가장자리에서만 대식세포 모집을 보였다. 이러한 데이터는, H93 CAR-T 세포 및 UnT와 비교하여, H93M CAR-T 세포가 종양 조직에서 더 많은 대식세포 및 DC 모집을 유도할 수 있고, 종양 조직에서 보다 효과적으로 천선척 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.
8.5. 구현예 5: 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현하는 CAR-T 세포의 제조
PBMC는 TPCS(#A19K268037)에서 구입하였다. Pan T 세포 분리 키트(Miltenyi #130-096-535)를 사용하여 상기 제8.1.2 부분에 기재된 제조업체의 방안에 따라 PBMC로부터 인간 T 세포를 정제하였다.
제조된 T 세포는 이후에 인간 T 세포 TransAct 키트(Miltenyi#170-076-156)를 사용하여 제조업체의 방안에 따라 48시간 동안 미리 활성화하였으며, 여기서 항-CD3/CD28 MACSiBead 입자는 40 μL/백만의 비드와 세포의 비율로 첨가되었다. CAR-T 세포 제조를 위해, 미리 활성화된 T 세포를 0.5 × 106 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트(BD)에 플레이팅하였다. 그런 다음, 정제된 바이러스를 웰에 첨가하였다. 하룻밤 지난 후 수집하여 원심분리하고, 신선한 RPMI-1640 + 300IU/mL IL-2로 재현탁한 후, 형질도입된 세포를 24-웰 G-Rex(Wilson Wolf #80192M)에 넣었다. 형질도입되지 않은 T 세포(UnT)를 음성 대조군으로 사용하였다. 상술한 바와 같이 H93 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포, 및 H93P CAR을 갖는 H93P CAR-T 세포(이의 코딩 영역은 도 1의 하단에 표시됨)를 제조하였다. H93P CAR은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 19의 핵산 서열을 포함한다. 6일째에, 네이키드 H93 CAR-T 세포, 장갑된(armored) H93M CAR-T 세포(IL-23 및 CCL-19 분비) 및 장갑된 H93P CAR-T 세포(IL-23 및 CCL-21 분비)의 CAR 양성률은 각각 63.52%, 48.59% 및 25.24%였다(도 14).
8.6. 구현예 6: 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현하는 CAR-T 세포 및 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 재유발 측정
상기 구현예 2에 기재된 바와 같이 CAR-T 세포 반복 유발 모델을 구축하였다. GPC3 양성 세포주 PLC/PRF/5 세포를 표적 세포로 사용하였다. 첫 번째 라운드(라운드 1) 재유발에서, CAR-T 세포와 종양 세포는 1:1 E/T 비율로 6-웰 플레이트에서 공동 배양되었다. 하룻밤 지난 후, 웰 내 CAR-T 세포를 부드럽게 수집하고, 원심분리하며, 신선한 CAR-T 배지(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)에 재현탁하였다. 그런 다음 CAR-T 세포를 새로운 플레이트에 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다. 그런 다음, 웰 내 CAR-T 세포를 수집하고, 신선한 배지에 재차 재현탁하여 신선한 종양 세포가 접종된 새로운 플레이트에 첨가하였다(라운드 2). CAR-T 세포를 총 8 라운드 자극하였다. 각 라운드에서 T 세포를 계수하고, 각각의 자극 72시간 후, GPC3 양성 인간 간세포 암종(HCC) 세포주 PLC/PRF/5.Luc를 사용하여 세포 독성 측정을 수행하였다. 총 T 세포와 표적 세포의 비율을 사용하여 세포 독성 측정을 수행하였다. 재유발 측정에는 4개의 처리 군이 있는데 각각 H93군(초기 CAR-T 세포는 H93 CAR-T 세포임), H93M군(초기 CAR-T 세포는 H93M CAR-T 세포)임, H93P군(초기 CAR-T 세포는 H93P CAR-T 세포임) 및 UnT(초기 T 세포는 CAR로 형질도입되지 않은 T 세포임)이다.
8.6.1. T 세포의 증폭
재유발 측정에서 IL12p40 발현을 갖는 CAR-T 세포의 증폭 기능의 이점을 확인하기 위해, 각 라운드가 끝날 때 T 세포의 수를 기록하고, 증폭 배수를 계산하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T군(라운드 8에서 109배) 및 UnT군(라운드 8에서 7배)과 비교하여, PLC/PRF/5 세포를 사용한 반복 자극은 H93M CAR-T군의 유의한 증폭(라운드 8에서 2759배)을 유발하고, H93P CAR-T군은 H93M군과 유사한 강력한 증폭 능력을 가지고 있다.
8.6.2. 세포 독성 측정
또한 재유발 측정에서 CAR-T 세포의 세포 독성을 평가하였으며, 총 T 세포:표적 세포 비율은 1:2이다. 표적 세포는 당업계에 공지된 기술에 의해 반딧불이 루시퍼라제를 발현하도록 조작된 GPC3 양성 인간 간세포 암종(HCC) 세포주 PLC/PRF/5.Luc이다. 매 두 라운드가 끝날때마다 세포를 수집하고, 표적 세포(2 × 103 세포/웰)를 혼합하며, 384-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 종양 세포에 대한 CAR-T의 세포 독성을 측정하기 위해, 제조업체의 방안에 따라 One-glo 발광 루시페라제 측정 시약(Promega#E6110)을 제조하고 공동 배양 세포에 첨가하여 웰에 남아 있는 루시퍼라제 활성을 검출하였다. 공식: 특이성 세포 독성% = 100% × (1-(RLU 샘플 - RLUmin)/(RLUmax - RLUmin))에 의해 특이적 세포 독성을 계산하였다. 도 15b에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T군, H93M CAR-T군 및 H93P CAR-T군은 R0에서(PLC/PRF/5 자극 전) 유사한 세포 독성을 갖는다. PLC/PEF/5 반복 자극 후, H93M CAR-T군 및 H93P CAR-T군은 유사한 세포 독성(모든 라운드에서 47%-68%)을 가지며, H93 CAR-T군(모든 라운드에서 24%-39%)보다 유의하게 높은데, 이는 H93M CAR-T군 및 H93P CAR-T군이 GPC3 양성 HCC 세포주 PLC/PRF/5.Luc 세포에 대해 모두 지속적으로 높은 수준의 세포 독성을 가짐을 보여준다.
8.7. 구현예 7: 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현하는 CAR-T 세포 및 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 세포 이동 측정
CCL-19 및 CCL-21의 화학주성 기능을 평가하기 위해, 세포 이동 측정을 수행하였다. 96-웰 트랜스웰 챔버(Corning)에서 5-μm 기공 크기의 폴리카보네이트 필터에 의한 이동을 통해 반응하는 T 세포의 화학주성을 측정하였다. GPC3 양성 인간 HCC 세포주 PLC/PRF/5 세포로 CAR-T 세포 및 UnT 세포를 자극하고, 30시간 후 공동 배양 상등액을 수집하였다. 그런 다음 125 μL 상등액을 하부 챔버에 넣고, 75 μL처리되지 않은 T 세포(0.075 M)를 상부 챔버에서 배양하였다. 2, 4 및 6시간 후, 혈액 계수 챔버를 통해 상부 챔버로부터 하부 챔버로 이동한 T 세포를 계수하였다. 4개의 처리군이 있는데 각각 H93 CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93 CAR-T 세포로부터 얻음), H93M CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M CAR-T 세포로부터 얻음), H93P CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93P CAR-T 세포로부터 얻음) 및 UnT군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 UnT 세포로부터 얻음)이다.
도 16에 도시된 바와 같이, 상이한 시점에서, PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93 CAR-T 세포 및 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 UnT 세포의 상등액와 비교하여, PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M CAR-T 세포(CCL-19 분비) 및 H93P(CCL-21 분비) CAR-T 세포의 상등액은 더 많은 T 세포를 흡인하였다. 그러나, 시험관 내에서 이동을 유도하는 H93M CAR-T군의 능력은 H93P CAR-T군보다 유의하게 강했다(H93M CAR-T군과 H93P CAR-T군, 6시간에서 P < 0.0001). 구체적으로, H93M CAR-T군은 6시간(0.095 M)에 상부 챔버의 모든 T 세포를 완전히 흡인할 수 있고, H93P CAR-T군은 대부분의 T 세포(0.065 M)를 흡인하였다. CCL-19 또는 CCL-21이 생성되지 않은 H93 CAR-T군 및 UnT군은 6시간에도 각각 0.028 M 및 0.025 M으로 더 적은 T 세포만 이동하였다. 또한, 각각 CCL-19 ELISA(Abcam#ab100601) 및 CCL-21 ELISA(Thermo#EHCCL21)를 통해 상등액에서 CCL-19 및 CCL-21의 농도를 측정하였다. 상기 결과는 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M 및 H93P CAR-T 세포로부터 얻은 상등액이 각각 CCL-19(2292.10 ± 85.48 pg/mL) 및 CCL-21(3481.08 ± 193.11 pg/mL)을 분비함을 보여주며, 이는 H93M 및 H93P CAR-T 세포의 화학주성 기능을 추가로 검증하였다.
8.8. 구현예8: 생체내 입양 전이 후, 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-21을 발현하는 CAR-T 세포 및 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 항종양 작용
NCG 마우스 이종 이식 모델에서 CAR-T 세포의 생체내 항종양 효능을 평가하였다. 피하 이종이식 모델의 경우, 6-7 주령의 NCG 마우스의 오른쪽 앞다리에 Hep3B 세포(4.0 × 106 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 150 mm3에 가까워졌을 때(이종이식 접종 후 5일째), 마우스를 무작위로 8군으로 나누고, 꼬리 정맥 주사를 통해 각각 H93 CAR-T 세포(0.3 M 및 0.8 M 용량), H93M CAR-T 세포(0.3 M 및 0.8 M 용량), H93P CAR-T 세포(0.3 M 및 0.8 M 용량), UnT(0.2 M 용량) 및 용매만(비히클)으로 처리하였다. 주당 2회 디지털 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피 = 에 따라 종양 부피를 계산하였다. 입양 전이 후 7, 14, 21 및 28일째에, 또한 FACS 염색 항-인간 CD3(Biolegend#300316)을 통해 마우스 혈액에서 T 세포의 수를 검출하였다.
도 17a에 도시된 바와 같이, UnT 및 H93 CAR-T 세포군과 비교하여, H93M CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스의 종양 크기가 32일째에 각각 98.2% 및 97.1%(52.0 mm3 대 2942.0 mm3, 1766.5 mm3)로 감소된 것으로 관찰되었다. 이 결과는 낮은 용량(0.3 M/마우스)에서 H93M CAR-T 세포가 H93 CAR-T 세포보다 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여준다. 22일째 전에, H93P CAR-T 세포 처리군과 H93M CAR-T 세포 처리군이 유사한 항종양 치료 효과를 가지며, 22일 째에 종양 크기가 각각 77.3% 및 65.7%(368.3 mm3대1620.8 mm3, 1072.7 mm3)로 감소하였지만 그 후 종양 크기가 증가된 것으로 관찰되었다. 용량을 0.8 M/마우스로 증가시켰을 때, 도 17b에 도시된 바와 같이, H93 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포는 모두 종양 성장에 대해 유의한 억제 작용을 갖고, 32일째에 성장 억제율은 100%였지만, H93P CAR-T 세포의 투여는 유의한 종양 부피 억제 작용이 없는 것으로 보였다. 그러나, H93P CAR-T군의 이종이식 조직이 다른 군과 달리 해면질로 관찰되었고, 종양 크기가 2000 mm3를 초과했기 때문에 26일째에 마우스를 안락사시켰다.
8.9. 구현예 9: p40 및 CCL-19로 장갑된 CAR과 둘 중 하나로 장갑된 CAR의 비교
8.9.1. NCG 마우스 이종 이식 모델에서, p40 및 CCL-19로 장갑된 CAR과 둘 중 하나로 장갑된 CAR의 비교
H93 CAR 백본에 기초하여, H93IL12p40 CAR벡터 또는 H93CCL19 CAR벡터 중의 MCS는 인간 IL12p40(SEQ ID NO: 5) 또는 인간 CCL-19(SEQ ID NO: 6)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 삽입을 허용하고, 상기 핵산 서열은 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 P2A 단편)의 C-말단에 융합되며, CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단 업스트림에 있고 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단에 작동 가능하게 연결된다.
H93M CAR-T 세포에서의 시너지 효과를 밝히기 위해, H93M CAR-T 세포, H93IL12p40 CAR-T 세포(IL12p40 분비), H93CCL19 CAR-T 세포(CCL-19 분비)를 제조하고, NCG 마우스 이종 이식 모델에서 평가하였다. 구현예 8에서 개시된 바와 같이, 6-7 주령의 NCG 마우스의 오른쪽 앞다리에 Hep3B 세포(4.0 × 106개 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 150 mm3에 가까워졌을 때(이종이식 접종 후 5일째), 마우스를 무작위로 6군으로 나누고, 꼬리 정맥 주사를 통해 각각 H93 CAR-T 세포(0.3 M 용량), H93M CAR-T 세포(0.3 M 용량), H93IL12p40 CAR-T 세포(0.3 M 용량), H93CCL19 CAR-T 세포(0.3 M 용량), UnT(3.5 M 용량, CAR-T군과 동일한 총 T 세포의 세포의 수) 및 용매만(비히클)으로 처리하였다. 주당 2회 디지털 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피: 종양 부피 = ((길이) × (너비)2)/2에 따라 종양 부피를 계산하였다. 입양 전이 후 제7, 14, 21 및 28일째에, FACS 염색 항-인간 CD3(Biolegend#300316)을 통해 마우스 혈액에서 T 세포의 수를 검출하였다.
도 18a에 도시된 바와 같이, UnT군과 비교하여, 26일째에 H93M CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스의 종양 크기가 92.0%(150.3 mm3 대 1878.2 mm3)로 감소된 것으로 관찰되었고, 26일째에 H93IL12p40 CAR-T 세포 및 H93CCL19 CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스의 종양 크기가 각각 72.9% 및 11.7%(508.7 mm3 대 1878.2 mm3 및 1658.7 mm3 대 1878.2 mm3)로 감소된 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 H93M CAR-T 세포가 H93IL12p40 CAR-T 세포 및 H93CCL19 CAR-T 세포보다 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여준다.
CD3+%의 FACS로 마우스 말초 혈액 세포에서 CAR-T 세포의 증폭을 검출하였다. H93M CAR-T 세포는 21일째 이전에 유의한 증폭을 보였고, 이후 감소하였다. H93IL12p40 CAR-T 세포는 차선의 증식 능력을 가지며, H93CCL19 CAR-T 세포는 H93 CAR-T 세포와 유사하게 유의한 증폭이 없었다(도 18b). 구체적으로, 21일째에 H93M군의 CD3 비율은 40.2%이고, 이후 28일째에 종양 부피가 감소되었으므로, CD3 비율은 29.8%로 감소하였다. H93IL12p40 CAR-T 세포군에서 CD3의 비율은 21일째에 26.1%이고, 28일째에 38.5%로 증가하였다. H93CCL19 CAR-T 세포군은 H93 CAR-T 세포 및 UnT군과 유사하게 유의한 증폭이 없었다.
이 실험 동안, CAR-T군에서 마우스 체중 감소가 관찰되지 않았으며, UnT군의 마우스 체중이 20% 이상 감소된 것을 제외하고(도 18c), CAR-T 세포 처리군의 모든 마우스는 외모가 모두 정상이었다.
8.9.2. C57BL/6 동계 모델에서, p40 및 CCL-19가 장갑된 CAR과 둘 중 하나로 장갑된 CAR의 비교
구현예 1에 개시된 방법에 따라, 항-GPC3 scFv(SEQ ID NO:1) 및 마우스 CAR 백본 폴리펩티드(SEQ ID NO: 28)를 사용하여 마우스 항-GPC3 scFv CAR(즉, musH93 CAR, SEQ ID NO: 27)을 발현하는 벡터를 구축하였으며, 상기 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 마우스 CD8α 힌지 도메인, 마우스 CD8α 막관통 도메인, 마우스 CD137 공동자극 신호 전달 도메인, 및 마우스 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
musH93 CAR 백본에 기초하여, musH93M CAR벡터 중의 MCS는 마우스 IL12p40(SEQ ID NO: 29) 및 마우스 CCL-19(SEQ ID NO: 30)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 삽입을 허용하고, 상기 핵산 서열은 다른 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 P2A 단편)의 C-말단에 융합된 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 14로 표시되는 T2A 펩티드)를 통해 연결되며, CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단 업스트림에 있고 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단에 작동 가능하게 연결된다. P2A 펩티드 및 마우스 IL12p40-T2A-CCL-19 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, CloneEZ 방법을 통해 pMSCV BBzBB CAR 백본에 클로닝하였다. 얻은 musH93M CAR은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 32의 핵산 서열을 포함한다. 유사하게, 또한 각각 마우스 IL12p40 및 마우스 CCL-19를 포함하는 musH93IL12p40 CAR(SEQ ID NO: 33) 및 musH93CCL19 CAR(SEQ ID NO: 34)을 구축하였다.
musH93M CAR-T 세포에서의 시너지 효과를 더 잘 밝히기 위해, musH93M CAR-T 세포, musH93IL12p40 CAR-T 세포, musH93CCL19 CAR-T 세포 및 musH93 CAR-T 세포를 제조하고, C57BL/6 동계 모델에서 평가하였다. 피하 이종이식 모델의 경우, 6-7 주령의 C57BL/6 마우스의 오른쪽 앞다리에 LL/2-hGPC3 세포(hGPC3을 과발현하는 LL/2 세포)(1.0 × 106개 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 100 mm3에 가까워졌을 때(이종이식 접종 후 9일째), 마우스를 무작위로 5군으로 나누고, 꼬리 정맥 주사를 통해 각각 musH93 CAR-T 세포(10 M 용량), musH93M CAR-T 세포(6 M 용량), musH93IL12p40 CAR-T 세포(6 M 용량), musH93CCL19 CAR-T 세포(6 M 용량), UnT(24.1 M 용량, CAR-T군과 동일한 총 T 세포의 세포의 수)로 처리하였다. 주당 2회 디지털 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피 = ((길이) × (너비)2)/2에 따라 종양 부피를 계산하였다. 입양 전이 후 각각 1, 7, 14, 21 및 28일째에, FACS 염색 항-마우스 CD3(Biolegend#100236) 및 CAR 양성률(Genscript#CP0001)을 통해 말초 혈액에서 CAR-T 세포의 증폭을 검출하였다.
도 19a 및 19d에 도시된 바와 같이, 종양 부피가 크기 때문에(> 3000 mm3), 네이키드 musH93 CAR-T군 및 UnT군의 모든 마우스를 19일째 전에 희생시켰다. 29일째에, musH93M CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스는 종양이 거의 없었다(91.5 mm3). 15일째에, musH93CCL19 CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스의 종양 크기가 유의하게 감소되었지만(437.2 mm3), 이후 종양 재발이 발생한 것으로 관찰되었다. musH93IL12p40 CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스가 전체 실험에서 유의한 치료 효과가 없음에 유의해야 한다. 이러한 결과는 musH93M CAR-T 세포가 musH93IL12p40 CAR-T 세포 및 musH93CCL19 CAR-T 세포보다 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여주며, 이는 상기 NCG 마우스 이종 이식 모델에서의 결과와 일치하다.
FACS로 마우스 말초 혈액 세포에서 CAR-T 세포의 증폭을 검출하였다. MusH93M CAR-T 세포는 28일째 전에 유의한 증폭을 보였고, musH93CCL19 CAR-T 세포는 유의한 증식 능력이 없으며, musH93IL12p40 CAR-T 세포는 증폭이 무시될 수 있는 musH93 CAR-T 세포와 유사하다(도 19b). 구체적으로, musH93M CAR-T 세포군에서 CD3 및 CAR 양성 비율은 21일째에 17.0%이고, 28일째에 21.9%로 증가하였다. MusH93CCL19 CAR-T 세포군은 21일째에 6.9%이고, 28일째에 8.7%로 증가하였다.
이 실험 동안, CAR-T군에서 마우스 체중 감소가 관찰되지 않았으며(도 19c), CAR-T 세포 처리군의 모든 마우스는 외모가 모두 정상이었다.
8.10. 구현예 10: 위암 모델에서 p40 및 CCL-19로 장갑된 CAR의 검증.
8.10.1. 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 261M CAR-T 세포의 제조
구현예 1에 개시된 방법에 따라, PCT 특허 출원 번호 PCT/CN2020/139143에 개시된 항-클라우딘 18.2 VHH CAR(즉, 261 CAR, SEQ ID NO: 41)을 구축하였으며, 이는 항-클라우딘 18.2 VHH 도메인(SEQ ID NO: 40) 및 CAR 백본 폴리펩티드를 포함하고, 상기 백본 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 CD8α 힌지 도메인(SEQ ID NO: 8), CD8α 막관통 도메인(SEQ ID NO: 9), CD137 공동자극 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 10) 및 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 11)을 포함한다. 또한 H93M CAR과 동일하고 IL12p40-T2A-CCL-19를 포함하는 261M CAR(SEQ ID NO: 42)의 구조를 구축하였다.
구현예 1에 설명된 방법을 사용하여 261 CAR-T 세포 및 261M CAR-T 세포(IL12p40 및 CCL-19 분비)를 제조하였다. 5일째에, 형질도입 후, 네이키드 261 CAR-T 세포 및 장갑된 261M CAR-T 세포의 CAR 양성률은 각각 50.7% 및 23.0%이다.
8.10.2. IL-23 및 CCL-19 발현
261M CAR의 구조를 검증하기 위해, CAR-T 세포와 클라우딘 18.2 양성 세포주-NUGC4를 밤새 공동 배양하고, IL-23 및 CCL-19의 분비 상황을 분석하였다. 간략하게는, CAR-T 세포 및 NUGC4 세포를 6-웰 플레이트에서 E/T = 1:1로 공동 배양하고, 하룻밤 지난 후 상등액을 얻었다. 제조업체의 방안에 따라, 인간 IL-23 키트(CISBIO#62HIL23PEG) 및 CCL-19 ELISA 키트(Abcam#ab100601)를 사용하여 IL-23 및 CCL-19의 양을 측정하였다. 도 20a 및 20b에 도시된 바와 같이, 261M CAR-T 세포만이 높은 수준의 IL-23(3703.3 pg/mL) 및 CCL-19(265.1 pg/mL)를 동시에 분비하였다.
8.10.3. 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 261M CAR-T 세포의 시험관 내 반복 유발 테스트
상기 구현예 2에 기재된 바와 같이 CAR-T 세포 반복 유발 모델을 구축하였다. CLDN18.2 양성 세포주NUGC4 세포를 표적 세포로 사용하였다. 첫 번째 라운드(라운드 1) 재유발에서, CAR-T 세포와 종양 세포는 1:1 E/T 비율로 6-웰 플레이트에서 공동 배양되었다. 하룻밤 지난 후, 웰 내 CAR-T 세포를 부드럽게 수집하고, 원심분리하며, 신선한 CAR-T 배지(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)에 재현탁하였다. 그런 다음 CAR-T 세포를 새로운 플레이트에 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다. 그런 다음, 웰 내 CAR-T 세포를 수집하고, 신선한 배지에 재차 재현탁하여 신선한 종양 세포가 접종된 새로운 플레이트에 첨가하였다(라운드 2). CAR-T 세포를 총 5 라운드 자극하였다. 각 라운드에서 T 세포의 수 및 생존력을 계수하였다. 재유발 측정에는 3개의 처리 군이 있는데 각각 261 CAR-T군(초기 CAR-T 세포는 262 CAR-T 세포임), 261M CAR-T군(초기 CAR-T 세포는 261M CAR-T 세포임) 및 UnT(초기 T 세포는 CAR로 형질도입되지 않은 T 세포임). 재유발 측정에서 IL12p40 발현을 갖는 CAR-T 세포의 증폭 기능의 이점을 확인하기 위해, 각 라운드가 끝날 때 T 세포의 수를 기록하고, 증폭 배수를 계산하였다. 도 21b에 도시된 바와 같이, 261 CAR-T군(라운드 5에서 6.7배) 및 UnT군(라운드 5에서 5.1배)와 비교하여, NUGC4 세포를 사용한 반복 자극은 261M CAR-T군 세포의 유의한 증폭(라운드 5에서 46.6배)을 유발하였다. 261M CAR-T 세포의 세포 생존력(라운드 5에서 68.7%)은 네이키드 261 CAR-T 세포(라운드 5에서 41.7%) 및 UnT 세포(라운드 5에서 38.8%)보다 높았다(도 21c). 기존의 배양 조건(10% 1640 + 300 IU IL-2)에서 세 군의 유사한 T 세포 증폭 및 생존력와 비교하여, 261M CAR-T 세포(라운드 5에서 46.6배)는 NUGC4 세포에 의해 여러 번 유발된 후 항원 의존적 증폭을 나타낸다(도 21a 및 21b).
8.10.4. 위암 모델에서, 입양 전이된 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 항종양 작용
위암 모델에서, 입양 전이된 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 261M CAR-T 세포의 치료 효능을 평가하였다. 261M CAR-T 세포 및 네이키드 261 CAR-T 세포를 제조하고, NUGC4이종이식 모델에서 평가하였다. 피하 이종이식 모델의 경우, 6-7 주령의 NCG 마우스의 오른쪽 앞다리에 NUGC4 세포(3.0 × 106개 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 100 mm3에 가까워졌을 때(이종이식 접종 후 14일째), 마우스를 무작위로 3군으로 나누고, 꼬리 정맥 주사를 통해 각각 261 CAR-T 세포(0.5 M 용량), 261M CAR-T 세포(0.5 M 용량) 및 UnT 세포(1.9 M 용량) 로 처리하였다. 주당 2회 디지털 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피 = 에 따라 종양 부피를 계산하였다.
도 22a 및 22b에 도시된 바와 같이, UnT 및 261 CAR-T 세포군과 비교하여, 29일째에 261M CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스의 종양 크기가 각각 59.0% 및 52.9%(609.0 mm3 대 1484.8 mm3, 1291.8 mm3)로 감소된 것으로 관찰되었는데, 이는 261M CAR-T 세포가 낮은 용량(0.5 M/마우스)에서 네이키드 261CAR-T 세포보다 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여준다.
FACS로 마우스 말초 혈액 세포에서 CAR-T 세포의 증폭을 검출하였다. 0.5 M 용량에서, 261M CAR-T 세포는 5일째 이후 유의한 증폭을 보였고, CD3 양성T 세포의 비율은 21일째에 최고(7.1%)에 도달하였으며, 이후 28일째에 감소하였고(5.3%), 전체 처리 과정에서 네이키드 mus261 CAR-T 세포 및 UnT로 처리된 마우스에서는 유의한 증폭이 없었다(도 22c). 이러한 데이터는, 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 261M CAR-T 세포가 생체내에서 우수한 증폭 능력 및 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여주며(도 22a 및 22c), 이는 GPC3 마우스 모델에서의 결과와 일치하다.
이 실험 동안, 세 군에서 모두 마우스 체중 감소가 관찰되지 않았으며(도 22d), 각 처리군의 마우스는 외모가 모두 정상이었다.
8.11. 구현예 11: 생체내 입양 전이 후, 외인적으로 도입된 p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포 및 외인적으로 도입된 IL-7 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 항종양 작용
구현예 1에 개시된 방법에 따라, 항-클라우딘 18.2 VHH 도메인(SEQ ID NO: 40) 및 마우스 CAR 백본 폴리펩티드(SEQ ID NO: 31)로 마우스항-클라우딘 18.2 VHH CAR(즉, mus261 CAR, SEQ ID NO: 35)을 구축하였으며, 상기 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 마우스 CD8α 힌지 도메인, 마우스 CD8α 막관통 도메인, 마우스 CD137 공동자극 신호 전달 도메인, 및 마우스 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
mus261 CAR 백본에 기초하여, mus261M CAR벡터 중의 MCS는 마우스 IL12p40(SEQ ID NO: 29) 및 마우스 CCL-19(SEQ ID NO: 30)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 삽입을 허용하고, 상기 핵산 서열은 다른 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 P2A 단편)의 C-말단에 융합된 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 14로 표시되는 T2A 펩티드)를 통해 연결되며, CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단 업스트림에 있고 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인의 C-말단에 작동 가능하게 연결된다. P2A 펩티드 및 마우스 IL12p40-T2A- 마우스 CCL-19 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, 클론 EZ 방법을 통해 pMSCV-BBzBB CAR 백본에 클로닝하였다. 얻은 mus261M CAR은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 45의 핵산 서열을 포함한다. 유사하게, F2A 펩티드 및 마우스 IL7-F2A- 마우스 CCL19 펩티드(SEQ ID NO: 36)를 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, 클론 EZ 방법을 통해 pMSCV-BBzBB CAR 백본에 클로닝하여 mus261-719 CAR을 형성하였다.
동계 위암 모델에서, 외인적으로 도입된 IL12p40 및 CCL-19를 발현하는mus261M CAR-T 세포 및 외인적으로 도입된 IL-7 및 CCL-19를 발현하는 mus261-719 CAR-T 세포의 입양 전이 후 치료 효능을 평가하였다. Mus261M CAR-T 세포 및 mus261-719 CAR-T 세포를 제조하고, C57BL/6 동계 이종이식 모델에서 평가하였다. 피하 이종이식 모델의 경우, 6-7 주령의 C57BL/6 마우스의 오른쪽 앞다리에 LL/2-hCLDN18.2 세포(인간 클라우딘 18.2를 과발현하는 LL/2 세포)(1.0 × 106개 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 100 mm3에 가까워졌을 때(이종이식 접종 후 9일째), 마우스를 무작위로 4군으로 나누고, 꼬리 정맥 주사를 통해 각각 mus261 CAR-T 세포(10 M 용량), mus261M CAR-T 세포(10 M 용량), mus261-719 CAR-T 세포(10 M 용량) 및 용매만(비히클)으로 처리하였다. 마우스가 치료를 받기 전날부터 주당 2회 디지털 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피: 종양 부피 = ((길이) × (너비)2)/2에 따라 종양 부피를 계산하였다.
도 23a에 도시된 바와 같이, 비히클 및 mus261 CAR-T 세포군과 비교하여, mus261M CAR-T 세포가 입양 전이된 마우스는 종양이 없었고, 42일째까지 지속적인 효능을 가졌다. 14일째, 비히클군과 비교하여 Mus261-719 CAR-T 세포 처리군이 종양 성장에 대해 유의한 억제 작용이 있고(191.9 mm3 대 914.8 mm3), 성장 억제율이 79.0%였지만, 그 후 종양 크기가 증가된 것으로 관찰되었고, 21일째에 종양 파열 및 까지 형성으로 인해 모든 마우스를 희생시켰다. 이 결과는 mus261M CAR-T 세포(musIL12p40 및 musCCL-19 분비)가 mus261-719 CAR-T 세포(musIL7 및 musCCL-19 분비)보다 더 우수한 치료 잠재력을 가짐을 보여준다.
이 실험 동안, CAR-T군에서 마우스 체중 감소가 관찰되지 않았다(도 23b).
8.12. 구현예 12: 막 결합된 IL12p40 및 CCL-19를 발현하는 CAR-T 세포의 제조 및 특성화
IL12p40 및 CCL-19장갑된 CAR-T 세포의 기능을 더 개선하기 위해, 예시적인 막 결합된 형태의 IL12p40(MB12)을 구축하였다. H93 CAR 백본에 기초하여, H93M-MB12 CAR벡터 중의 MCS는 핵산 서열의 삽입을 허용하고, 상기 핵산 서열은 막 결합된 IL12p40(즉, MB12, SEQ ID NO: 37) 및 인간 CCL19(SEQ ID NO: 6)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구체적으로, 인간 IL12p40은 CD8α 힌지, CD8α 막관통 도메인 및 세포내CD8α세포내 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 통해 연결됨으로써, IL12p40이 세포막에 고정될 수 있도록 한다. MB12는 2A 자가 절단 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 14로 표시되는 T2A 단편)의 N-말단에 융합되고, 인간 CCL-19다운스트림에 있으며 인간 CCL-19에 조작 가능하게 연결된다. MB12 및 CCL19를 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, HpaI(5'-GTTAAC-3')(SEQ ID NO: 17) 및 MluI(5'-ACGCGT-3')(SEQ ID NO: 23) 제한 부위를 통해 pLSINK-BBzBB CAR 백본에 클로닝하였다. 얻은 H93M-MB12 CAR은 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 39의 핵산 서열을 포함한다. 구현예 1에 개시된 절차에 따라 H93M-MB12 CAR-T 세포를 제조하였다.
8.12.1. CAR-T 세포막에서 IL12p40 단백질의 발현
막 결합 전략을 검증하기 위해, FACS 염색 항-인간 IL12p40(Biolegend#501809) 및 CAR 양성률(Genscript#CP0001)을 통해 막에서 IL12p40 단백질의 발현을 검출하였다. 도 24a에 도시된 바와 같이, 네이키드 H93 CAR-T 세포, H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포의 CAR 양성률은 각각 61.58%, 50.74% 및 33.97%이다. 도 24b에 도시된 바와 같이, 막에서 H93M-MB12 CAR-T 세포의 IL12p40 단백질의 발현은 100%에 가까운데, 이는 초기 막 결합 전략의 가능성을 보여준다.
8.12.2. IL12p40, IL-23, CCL-19 및 IL-12 단백질의 분비
막 결합 전략의 가능성을 더 검증하기 위해, IL12p40 및 IL-23의 분비를 분석하였다. 간략하게는, 6-웰 플레이트에서 1 × 106 세포/mL로 항-CD3/CD28과 공동 배양된 세포(RPMI-1640 + 300 IU/mL IL-2+항-CD3/CD28)를 배양하였다, 하룻밤 지난 후 상등액을 얻었다. 제조업체의 방안에 따라, 인간 IL12p40 키트(Invitrogen#4215608), IL-23 키트(Cisbio#62HIL23PEG) 및 CCL-19 키트(Abcam#ab100601)를 사용하여 IL12p40, IL-23 및 CCL-19의 양을 측정하였다. 도 25a 및 도 25b에 도시된 바와 같이, 항-CD3/CD28과 공동 배양한 후, H93 CAR-T 세포와 비교하여, IL12p40을 분비하는 H93M CAR-T 세포는 더 높은 IL12p40(17288.6 pg/mL 대 41.1 pg/mL) 및 IL23(1775.1 pg/mL대 0 pg/mL) 분비를 가지며, H93M-MB12 CAR-T 세포에서 IL12p40 분비(267.7 pg/mL)는 유의하게 감소하였고, 항-CD3/CD28과 공동 배양된 후 유의한 IL23 분비가 없었다. 또한, H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포는 동일한 수준의 CCL-19를 갖는다(도 25c). 데이터는 MB12의 막 결합된 IL12p40 구조가 가능함을 보여준다. 도 25d에 도시된 바와 같이, 항-CD3/CD28과 공동 배양한 후, 모든 테스트 세포에서 유의한 IL-12 분비가가 없었는데, 이는 H93M CAR-T 세포가 IL12p40을 분비하지만 이들은 IL-12가 아닌 IL-23만 생성하는 것을 보여준다.
8.12.3 IL12p40 막 결합된 CAR-T 세포의 세포 이동 측정
H93M-MB12 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포에서 CCL-19의 화학주성 기능을 평가하기 위해, 세포 이동 측정을 수행하였다. 96-웰 트랜스웰 챔버(Corning)에서 5-μm 기공 크기의 폴리카보네이트 필터에 의한 이동을 통해 반응하는 T 세포의 화학주성을 측정하였다. GPC3 양성 인간 HCC 세포주 PLC/PRF/5 세포로 CAR-T 세포 및 UnT 세포를 자극하고, 24시간 후 공동 배양 상등액을 수집하였다. 그런 다음 125 μL 상등액을 하부 챔버에 넣고, 75 μL처리되지 않은 T 세포(0.075 M)를 상부 챔버에서 배양하였다. 2, 4 및 6시간 후, 혈액 계수 챔버를 통해 상부 챔버로부터 하부 챔버로 이동한 T 세포를 계수하였다. 세포 이동 측정에는 4개의 처리 군이 있는데 각각 H93 CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93 CAR-T 세포로부터 얻음), H93M CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M CAR-T 세포로부터 얻음), H93M-MB12 CAR-T군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M-MB12 CAR-T 세포로부터 얻음) 및 UnT군(하부 챔버의 상등액은 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 UnT 세포로부터 얻음)이다.
도 26a에 도시된 바와 같이, 4 h 및 6 h에서, PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93 CAR-T 세포 및 PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 UnT 세포의 상등액와 비교하여, PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M CAR-T 세포 및 H93M-MB12 CAR-T 세포의 상등액은 더 많은 T 세포를 흡인하였다. 구체적으로, H93M CAR-T 및 H93M-MB12 CAR-T군은 6시간(0.077 M 및 0.075 M)에 상부 챔버의 모든 T 세포를 완전히 흡인할 수 있고, CCL-19가 생성되지 않은 H93 CAR-T군 및 UnT군은 6시간에도 각각 0.051 M 및 0.048 M으로 더 적은 T 세포만 이동하였다. 또한, CCL-19 ELISA(Abcam#ab100601)를 통해 공동 배양 상등액에서 CCL-19의 농도를 측정하였다. PLC/PRF/5 세포와 공동 배양된 H93M-MB12 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포로부터 얻은 상등액에서 CCL-19의 농도는 각각 1389.1 pg/mL 및 1804.7 pg/mL(p < 0.005)이다(도 26b). 이 결과는 H93M-MB12 CAR-T 세포가 시험관 내에서 H93M CAR-T 세포와 동일한 화학주성 기능을 가짐을 보여준다.
8.12.4. IL12p40 막 결합된 CAR-T 세포의 재유발 측정
상기 구현예 2에 기재된 바와 같이 반복 유발 모델을 구축하였다. GPC3 양성 세포주-Hep3B 세포를 표적 세포로 사용하였다. 첫 번째 라운드(라운드 1) 재유발에서, CAR-T 세포와 종양 세포는 2:1 E/T 비율로 6-웰 플레이트에서 공동 배양되었다. 하룻밤 지난 후, 웰 내 CAR-T 세포를 부드럽게 수집하고, 원심분리하며, 신선한 CAR-T 배지(RPMI-1640+300 IU/mL IL-2)에 재현탁하였다. 그런 다음 CAR-T 세포를 새로운 플레이트에 첨가하여 2일 동안 더 배양하였다. 그런 다음, 웰 내 CAR-T 세포를 수집하고, 신선한 배지에 재차 재현탁하여 신선한 종양 세포가 접종된 새로운 플레이트에 첨가하였다(라운드 2). CAR-T 세포를 총 5 라운드 자극하였다. 각 라운드에서 T 세포를 계수하고, 각각의 자극 후 밤새 사이토카인을 검출하였다. 재유발 측정에서 4개의 처리 군이 있는데 각각 H93 CAR-T군(초기 CAR-T 세포는 H93 CAR-T 세포임), H93M CAR-T군(초기 CAR-T 세포는 H93M CAR-T 세포임), H93M-MB12 CAR-T군(초기 CAR-T 세포는 H93M-MB12 CAR-T 세포임) 및 UnT군(초기 T 세포는 CAR로 형질도입되지 않은 T 세포임)이다.
8.12.4.1. T 세포의 증폭
재유발 측정에서 막 결합된 IL12p40 발현을 갖는 CAR-T 세포의 증폭 기능의 이점을 확인하기 위해, 각 라운드가 끝날 때 T 세포의 수를 기록하고, 증폭 배수를 계산하였다. 도 27b에 도시된 바와 같이, H93M CAR-T군(라운드 5에서 708.1배) 및 H93 CAR-T군(라운드 5에서 115.1배)와 비교하여, Hep3B 세포를 사용한 반복 자극은 H93M-MB12 CAR-T군의 유의한 증폭(라운드 5에서 1155.7배)을 유발하는데, 이는 IL12p40 막 결합된 CAR-T 세포가 여전히 CAR-T 세포의 증폭 기능의 이점을 가짐을 보여준다. 그러나, 항원 자극이 없는 기존의 배양 조건에서, IL12p40 막 결합된 CAR-T 세포는 더 우수한 증폭 이점을 나타내지 않았는데, IL23의 항원 의존적 발현에 기인한 것이다(도 27a).
각 라운드 후 H93M-MB12 CAR-T 세포 및 H93M CAR-T 세포의 CAR 양성률을 계산하였다. 도 27c에 도시된 바와 같이, H93M-MB12 CAR-T 세포의 CAR 양성률은 자극 라운드 수가 증가함에 따라 H93M CAR-T 세포보다 빠르게 증가하였으며(라운드 4 후 89.0% 대 81.0%), 네이키드 H93 CAR-T 세포의 CAR 양성률은 느리게 증가하였다(라운드 4 후 48.5%).
8.12.4.2. 사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ의 분비
H93 CAR-T 세포와 비교하여 재유발 측정에서 GPC3 양성 종양 세포에 대한 H93M-M12 CAR-T의 지속적인 세포 독성 활성을 추가로 검증하기 위해, CAR-T 세포와 Hep3B 세포를 2:1 E/T 비율로 밤새 공동 배양한 후, ELISA를 통해 TNF-α 및 IFN-γ의 생성을 분석하였다. 결과는 H93 CAR-T군 또는 심지어 H93M CAR-T군과 비교하여, H93M-M12 CAR-T군이 모든 라운드에서 TNF-α 및 IFN-γ를 생성하는 능력이 유의하게 더 높음을 보여준다. 도 28a 및 28b에 도시된 바와 같이, 라운드 3 내지 라운드 5 후, H93M-MB12 CAR-T군의 세포에 의해 분비된 TNF-α 및 IFN-γ의 농도는 5939.4-13287.2 pg/mL(TNF-α) 및 52842.5-56072.5 pg/mL(IFN-γ) 범위 내로 다른 군보다 높았다. H93M CAR-T 세포도 3134.2-7343.9 pg/mL(TNF-α) 및 46799.6-53462.7 pg/mL(IFN-γ) 범위 내로 높은 생산 수준을 가지며, H93 CAR-T군 세포에 의해 분비된 TNF-α 및 IFN-γ농도는 5823.0-2065.3 pg/mL(TNF-α) 및 51265.5-21996.2 pg/mL(IFN-γ) 범위 내로 라운드 1 내지 라운드 5 후 점차 감소하였다.
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고 문헌의 교시 내용은 모두 전체적으로 참조로서 본원에 인용된다. 예시적인 실시예를 특별히 나타내고 설명하였지만, 첨부된 특허청구범위에 포함된 실시예의 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부 사항에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해해야 한다.
위의 내용으로부터, 본원에서는 특정 실시예를 설명의 목적으로 기술하였지만, 본원에 의해 제공된 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 수 있다. 위에서 언급한 모든 참고 문헌은 전체적으로 참조로서 본원에 포함된다.
서열목록
SEQ ID NO: 1. 인간화 항-GPC3 scFv 아미노산
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSG SGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 2. H93 CAR 아미노산
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 3. H93M CAR 아미노산
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEED GITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWS TDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKK DRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKD GCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO: 4. IL12p40-T2A-CCL-19
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEED GITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWS TDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKK DRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKD GCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO: 5. 인간 IL12p40
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
SEQ ID NO: 6. 인간 CCL19
MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO: 7. CD8α 신호 펩티드
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO: 8. CD8α 힌지
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO: 9. CD8α 막관통 도메인
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO: 10. 4-1BB(CD137) 세포내 도메인
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO: 11. CD3ζ(CD3z) 세포내 도메인
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 12. H93M CAR 핵산
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGCAATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGCCTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCA CCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGG CAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAA TCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAG CTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAA GCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACA CATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGA AGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGA ACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTG GTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGC TCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGG GTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCC GCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTG TGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGA CATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAG CGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTG ATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO: 13. P2A
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO: 14. T2A
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO: 15. EcoRI 제한 부위
GAATTC
SEQ ID NO: 16. SpeI 제한 부위
ACTAGT
SEQ ID NO: 17. HpaI 제한 부위
GTTAAC
SEQ ID NO: 18. H93P CAR아미노산
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ VSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSIS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVE ENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCD TPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKE DGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYEN YTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGK SKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSL LTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVV RSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG CRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO: 19. H93P CAR 핵산
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGA GAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGC AATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGA TCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCG GATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCAC AAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGA GGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGA AGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAG ACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGG GAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCC GGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTA GCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGC CTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCC AGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCT GCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGC TGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGT CCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTC CTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAA GATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTG AGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAC CAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC CTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGG TGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTT CAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGACAACAAGGAGTACGAGTATA GCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTA TCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCT CCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTG ATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGTGCGGGCTCAGGACCGATATTACTCAT CATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCTTGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGCTGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTTGCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO: 20. IL12p40-T2A-CCL21 아미노산
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO: 21. IL12p40-T2A-CCL21 핵산
ATGTGCCATCAGCAGCTGGTCATTTCTTGGTTCTCTCTGGTGTTTCTGGCTAGTCCTCTGGTCGCTATTTGGGAACTGAAAAAAGATGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTG GTATCCAGATGCACCAGGAGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCCGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGAAGCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGATGCCGGCCAGTACACATGTCA CAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCCACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGATCCACAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGAGCGCCGAGCGGGTGAGA GGCGACAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGATTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGTCCCTGCCTATCGAAGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCAG ATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAATTCCCGCCAGGTGGAGG TGTCTTGGGAGTACCCTGATACCTGGTCCACACCACACAGCTATTTCTCCCTGAC CTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCTAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACAAGCGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCTCTGT GCGGGCTCAGGACCGATATTACTCATCATCATGGAGTGAATGGGCCTCAGTGCCT TGCTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCCCAGAGCCTTGCTCTCTCTCTGCTCATTCTGGTGC TGGCATTCGGCATCCCACGTACCCAGGGCTCCGACGGCGGCGCGCAGGACTGTT GCCTGAAGTACTCCCAGCGCAAGATCCCCGCCAAGGTGGTCCGCAGCTACAGGAAGCAGGAGCCAAGTCTAGGGTGCTCTATCCCTGCCATCCTGTTTCTGCCCCGCAAGCGCAGCCAGGCCGAGCTGTGCGCCGACCCGAAGGAGCTTTGGGTGCAGCAGCTGATGCAACACTTGGATAAAACTCCGAGCCCTCAGAAGCCTGCTCAGGGGTGCCGAAAGGACCGCGGAGCTTCCAAGACCGGCAAAAAGGGTAAGGGCTCCAAAGGTTGTAAACGTACCGAACGGTCACAGACGCCCAAGGGACCC
SEQ ID NO: 22. 인간 CCL21
MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP
SEQ ID NO: 23. MluI 제한 부위
ACGCGT
SEQ ID NO: 24. 인간 IL-7
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO: 25. IL12p40-P2A-IL-7 아미노산
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO: 26. IL12p40-P2A-IL7 핵산
ATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGC CACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACT GGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGG AAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGGCA AAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTGCC ATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAG ACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCCG ACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGAC CTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTTTCATGTCTCCTTCCGCTACATCTTCGGGCTCCCTCCCCTGATCCTCGTTCTGCTGCCAGTGGCATCTAGCGATTGTGACATTGAGGGCA AAGACGGCAAGCAATACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCGATTGACCAGCTGTTGG ATTCTATGAAAGAGATCGGCTCCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGCCACATCTGTGACGCCAACAAGGAAGGTATGTTTCTGTTCCGGGCCGCGCGCAAGCTGAGGCAGTTCCTGAAAATGAATTCCACCGGTGATTTCGACTTGCACCTGCTTAAGGTGTCCGAGGGCACGACCATCCTTCTTAACTGCACTGGACAGGTCAAGG GCCGTAAGCCCGCCGCTCTAGGGGAGGCTCAGCCGACAAAGTCGCTGGAGGAGAACAAGTCACTCAAAGAACAGAAGAAGCTCAACGACCTGTGCTTTTTGAAGCGCCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGTTGGAATAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGC AC
SEQ ID NO: 27. MusH93 CAR 아미노산
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTTTKPVLRT PSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO: 28. 마우스 CAR 백본 (마우스 CD8α 힌지-마우스 CD8α 막관통 도메인-마우스 4-1BB(CD137) 세포내 도메인-마우스 CD3ζ 세포내)
TTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO: 29. 마우스 IL12p40
MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO: 30. 마우스 CCL-19
MAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO: 31. 마우스 H93M CAR 아미노산
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDW TPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO: 32. 마우스 H93M CAR 핵산
ATGGCAAGTCCTCTGACTCGGTTTCTGTCTCTGAATCTGCTCCTCCTCGGTGAATCCATTATCCTCGGTTCCGGTGAAGCTAAGCCTCAGGCCGACATCGTGATGACACAGAGCCCACTGTCCCTGCCAGTGACCCCAGGAGAGCCTGCTAGCATCTCCTGTAGGAGCTCCCAGACAATCGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCTGGACAGTCCCCACAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTTA GCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCAGCGGATCCGGCACAGACTTCACCCTGA AGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGGAGTGTACTACTGTTTTCAGGTGAGCCACGTGCCATACACATTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCTCTA CAAGCGGATCCGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACCAAGGGACAGGTG CAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCTACAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGGCATCGATCCTGAGACAGGC AACACCGCCTACAGCCAGAAGTTCAAGGGAAGGGTGACAATGACCAGAAACAC ATCTATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGCCTGCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGCTACTACTCTTTTGCCTACTGGGGCCAGGGAACACTGG TGACCGTGTCCTCTACATCCACCACAACCAAGCCAGTGCTGAGGACCCCAAGCCCTGTGCACCCAACAGGCACCTCCCAGCCACAGAGGCCCGAGGATTGTAGGCCCAGAGGATCTGTGAAGGGCACAGGACTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCTCCTCTGGCTGGAATCTGCGTGGCTCTGCTGCTGTCTCTGATCATCACCCTGATCTGCAGCGTGCTGAAGTGGATCCGGAAGAAGTTCCCCCACATCTTTAAGCAGCCTTTCAAGAAGACAACCGGAGCTGCTCAGGAGGAGGACGCCTGCTCCTGTAGGTGCCCTCAGGAAGAAGAGGGAGGAGGAGGAGGATACGAGCTGAGGGCTAAGTTCTCCCGCTCTGCTGAGACAGCCGCTAACCTGCAGGATCCAAACCAGCTGTACAACGAGCT GAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGAGAAGAAGCGGGCTCGCGATCCTGAGATGGGAGGAAAGCAGCAGCGGCGCAGGAACCCACAGGAGGGCGTG TACAACGCTCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACAGCGAGATCGGCACCAAGGGAGAGAGACGGCGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTACCAGGGACTCTC AACCGCTACTAAGGACACCTACGATGCTCTCCATATGCAGACCCTCGCACCCCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTG GAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCCTCAGAAACTGACTATATCATGGTTTGCCA TTGTGCTGCTGGTAAGTCCTCTCATGGCCATGTGGGAATTGGAGAAAGATGTGTA CGTGGTGGAGGTGGACTGGACCCCTGACGCACCAGGAGAAACAGTGAACCTGACGTGTGATACGCCAGAAGAGGATGACATTACTTGGACATCAGATCAAAGACACGG TGTCATAGGGTCAGGCAAAACTCTTACCATCACAGTCAAGGAGTTCCTAGATGCTGGCCAGTATACCTGCCATAAAGGAGGGGAAACCCTGTCCCACTCGCATCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAAACGGCATCTGGAGCACAGAGATCCTGAAGAATTTTAAGAATAAGACCTTCTTGAAATGTGAGGCCCCCAACTACAGCGGGAGGTTCACCTGTTCCTGGCTGGTGCAACGGAACATGGACCTGAAGTTCAATATTAAATCTTCATCTTCC TCCCCGGACAGTCGCGCAGTTACTTGTGGCATGGCTTCTTTATCGGCAGAGAAAGTCACCCTTGACCAGCGCGACTATGAGAAGTATTCTGTTTCCTGCCAGGAGGACGTGACGTGCCCCACAGCTGAAGAGACTTTGCCTATTGAGTTAGCCCTGGAGGCCAG ACAACAGAACAAATATGAAAATTATTCCACTTCATTCTTCATCCGTGATATCATC AAGCCCGATCCACCCAAGAATCTTCAGATGAAGCCTCTAAAGAACAGCCAGGTGGAGGTTAGCTGGGAGTACCCAGATAGCTGGTCTACCCCACATTCCTACTTTAGTT TAAAGTTTTTTGTAAGAATCCAGAGGAAAAAAGAAAAGATGAAAGAGACTGAAGAAGGTTGCAACCAGAAGGGAGCGTTTCTCGTTGAGAAGACAAGCACAGAAGTCCAGTGCAAAGGTGGAAATGTATGTGTGCAAGCTCAGGACAGGTACTACAACAGTAGCTGTTCTAAGTGGGCATGTGTCCCCTGCCGAGTGCGGAGTGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCCTAGAGTGACACCTTTGCTGGCCTTTTCTCTTCTAGTGTTGTGGACGTTTCCTGCACCCACCCTGGGTGGAGCGAATGATGCAGAGGACTGCTGCCTCAGTGTCACCCAAAGGCCCATACCAGGGAACATTGTGAAGGCCTTCCGCTATCTTCTCAATGAAGATGGATGTCGGGTTCCTGCTGTGGTCTTCACTACTTTACGCGGCTACCAGCTGTGTGCTCCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGACCGTATCATCCGAAGGCTGAAGAAAAGCAGCGCCAAGAACAAAGGCAACTCAACAAGAAGATCCCCAGTTTCC
SEQ ID NO: 33. 마우스 H93IL12p40 CAR 아미노산
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDW TPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
SEQ ID NO: 34. 마우스 H93CCL19 CAR 아미노산
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQADIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGR VTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTKPVL RTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO: 35. mus261 CAR 아미노산
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR
SEQ ID NO: 36. 마우스 IL7-F2A-마우스 CCL19 아미노산
MFHVSFRYIFGIPPLILVLLPVTSSECHIKDKEGKAYESVLMISIDELDKMTGTDSNCPNNEPNFFRKHVCDDTKEAAFLNRAARKLKQFLKMNISEEFNVHLLTVSQGTQTLVNCTSKEEKNVKEQKKNDACFLKRLLREIKTCWNKILKGSIGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO: 37. MB12 아미노산(IL12p40-CD8α 힌지-CD8α 막관통 도메인-세포내 CD8α세포내 도메인)
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCNHRNRRR
SEQ ID NO: 38. H93M-MB12 CAR 아미노산
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQATGQGLEWMGGIDPETGNTAYSQKFKGRVTMTRNTSIS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYSFAYWGQGTLVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPE EDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCL YCNHRNRRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDA EDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO: 39. H93M-MB12 CAR 핵산
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCCCGCCCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCCCCTGTCCCTGCCAGTGACCCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGGAGCTCCCAGACCATCGTGCACAGCAACGGC AATACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACAGGTTCAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTAGCGGATCCG GATCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCTAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGG GCGTGTACTATTGCTTCCAGGTGAGCCACGTGCCATATACCTTTGGCGGCGGCAC AAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCTCCGGATCTGGCAAGCCAGGATCCGGAGAGGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAG ACTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCAACCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGACCCAGAGACAGGCAACACAGCCTACTCCCAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCATGACAAGAAATACCAGCATCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTA GCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTCGCTACTATTCCTTTGC CTACTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCAACTAGTACCACGACGCC AGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGT CCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAA GATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTG AGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAC CAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC CTGCCCCCTCGCGTTAACGGTTCCGGCGCCACCAACTTTTCACTGTTAAAGCAGGCCGGTGATGTGGAGGAGAATCCAGGCCCTATGGATTGGACCTGGATCCTCTTCCTGGTGGCTGCAGCCACCCGTGTCCACTCCATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTCGACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTTCTGAC CTGTGACACCCCAGAGGAAGACGGCATCACCTGGACCCTGGACCAGAGCTCCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAAACTTTGACTATCCAGGTCAAGGAGTTCGGTGATGC AGGCCAATACACATGCCATAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCATTCTCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAAGATGGCATTTGGTCGACTGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTAAGGTGTGAGGCCAAGAACTATTCCGGTCGCTTCACATGTTGGTGGCTAACCACAATTTCGACCGACCTGACCTTTAGCGTAAAAT CCTCTCGTGGCTCGAGCGATCCTCAGGGAGTCACCTGCGGGGCCGCCACTCTGTCCGCCGAGCGCGTGCGCGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCCGTGGAGTGTCAGGAGGACAGCGCCTGCCCAGCAGCCGAGGAGAGCCTCCCCATCGAAGTGATGGTGGACGCGGTACACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCAGCTCCTTCTTCATCCG CGACATCATCAAGCCGGACCCGCCCAAAAACCTGCAGCTGAAACCTTTGAAAAACTCCCGCCAGGTCGAAGTCAGTTGGGAGTACCCGGACACCTGGTCGACTCCCCACAGCTATTTCAGTCTTACGTTCTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAACGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACGGACAAGACTTCCGCTACCGTCATCTGCCGCAAGAACGCGAGCATCTCTGTCAGAGCTCAGGACCGCTACTACTCTTCCAGTTGGTCTGAGTGGGCGTCCGTCCCCTGTTCTACCACGACCCCGGCGCCGCGCCCCCCAACCCCTGCCCCTACCATTGCCTCACAGCCGTTGTCTCTGCGGCCCGAGGCGTGCCGACCTGCCGCGGGAGGCGCGGTGCACACGCGGGGTCTCGACTTTGCTTGTGATATTTACAT ATGGGCTCCCCTGGCCGGCACCTGCGGGGTTTTGCTCCTTTCCTTGGTGATCACTCTTTACTGCCTGTACTGCAATCACCGGAACCGCCGCCGTGGCAGTGGAGAGGGCA GAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTC TGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCC CGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGT GCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTGCAGCGCACCTCAGCTAAGATG AAACGCCGCTCAAGT
SEQ ID NO: 40. 항-클라우딘 18.2 VHH 도메인
QVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 41. 261 CAR 아미노산
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SEQ ID NO: 42. 261M CAR 아미노산
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRVNGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO: 43. 261M CAR 핵산
ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTGTCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTGAGTCGATTATCCTGGGGAGTGGAGAAGCTAAGCCACAGGCACAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGAGGAGGAAGCGTGCAAGTGGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACAGATCCAGCGTGTGCATGGGATGGTTTAGACAGGCACCAGGAAAGGAGAGGGAGAGAGTGGCAGTGATCGGAAGGGACGGATCCACCACATATATC GATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACACTGTCTCTGCAGATGGACAATCTGAAGCCTGAAGACACAGCCATGTACAGCTGCGCCG CCGGCCTGGGATACTGGGCTTGCGAATACAACTACTGGGGGCAGGGCACTCAGG TGACCGTCTCTTCTACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACAT CTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACC CTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTA TGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAG AAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGA CGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCC GGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGTTAACGGCAGCGGAGCTACAAACTTCAGTCTTCTAAAACAGGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTGCCACCAGCAGCTGGTGATCAGTTGGTTCTCTCTGGTGTTCCTGGCCTCGCCACTTGTTGCCATATGGGAACTCAAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGG ACTGGTACCCCGACGCTCCCGGGGAGATGGTGGTCCTGACCTGTGATACTCCGGAGGAAGATGGCATCACCTGGACATTGGATCAGAGCTCCGAGGTACTGGGCTCCGG CAAAACTCTGACCATCCAGGTGAAGGAGTTCGGTGATGCTGGACAATACACCTG CCATAAGGGCGGCGAGGTTCTTAGCCATTCTCTGCTGCTCCTCCACAAGAAGGAAGACGGTATTTGGTCGACCGACATCCTGAAGGACCAGAAGGAGCCCAAAAACAAGACTTTTTTGCGCTGCGAGGCCAAAAACTACTCCGGTCGCTTCACATGCTGGTGGCTAACGACCATCTCAACCGACCTGACCTTCTCTGTCAAGAGCTCTCGTGGCTCCAGCGATCCTCAGGGCGTCACCTGCGGGGCAGCCACCCTGAGCGCAGAGCGCGTGAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCGGTGGAGTGTCAGGAGGACTCGGCCTGCCCAGCGGCCGAGGAGAGCCTGCCCATTGAGGTGATGGTAGACGCCGTCCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATCAAGCCC GACCCGCCCAAGAACCTGCAGCTCAAGCCTTTGAAGAATTCCCGCCAGGTTGAAGTCAGTTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCTACTCCGCACAGCTATTTCTCGCTGA CCTTCTGCGTGCAGGTCCAGGGAAAGTCCAAGCGCGAGAAGAAAGACAGGGTGTTCACCGACAAGACCTCCGCCACCGTGATTTGCCGAAAAAACGCCTCCATCTCCGTGCGTGCGCAGGACCGCTACTACAGTTCCTCTTGGTCCGAGTGGGCTTCCGTGCCTTGTTCAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGCTCTGCTGCTGGCACTGAGTCTGCTGGTCCTGTGGACATCACCTGCACCTACCCTGAGTGGAACTAATGACGCTGAAGATTGTTGCCTGAGCGTGACCCAGAAGCCAATCCCCGGCTACATCGTGAGGAACTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCTGCAGTGGTGTTTACCACACTGCGGGGCAGACAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCCTGGGTCGAGAGAATTATTCAGAGACTG CAGCGCACCTCAGCTAAGATGAAACGCCGCTCAAGTTAA
SEQ ID NO: 44. mus261M CAR 아미노산
MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAKPQAQVQLEESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYRSSVCMGWFRQAPGKERERVAVIGRDGSTTYIDSVKGRFTISRDSAKNTLSLQMDNLKPEDTAMYSCAAGLGYWACEYNYWGQGTQVTVSSTSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYELRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
SEQ ID NO: 45. mus261M CAR 핵산
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SEQ ID NO: 46. 글리신-세린 중합체 링커
(GSGGS)n [n은 적어도 1인 정수임]
SEQ ID NO: 47. 글리신-세린 중합체 링커
(GGGS)n [n은 적어도 1인 정수임]
SEQ ID NO: 48. 글리신-세린 중합체 링커
(GGGGS)n [n은 적어도 1인 정수임]
SEQUENCE LISTING <110> NANJING LEGEND BIOTECH CO., LTD. <120> ENGINEERED IMMUNE EFFECTOR CELLS EXPRESSING EXOGENOUSLY INTRODUCED CYTOKINES <130> 14651-039-228 <140> <141> <150> PCT/CN2021/078227 <151> 2021-02-26 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized anti-GPC3 scFv amino acid <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Val 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Ser Gln 180 185 190 Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr 195 200 205 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 2 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H93 CAR amino acid <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 35 40 45 Thr Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Phe Gln Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 130 135 140 Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 145 150 155 160 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 165 170 175 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr 180 185 190 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn 195 200 205 Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn 210 215 220 Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp 245 250 255 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro 260 265 270 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 275 280 285 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 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Val Cys Met 50 55 60 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala Val 65 70 75 80 Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 90 95 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met 100 105 110 Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala Gly 115 120 125 Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 130 135 140 Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 145 150 155 160 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 165 170 175 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 195 200 205 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 210 215 220 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 225 230 235 240 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 245 250 255 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 260 265 270 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 275 280 285 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 290 295 300 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 305 310 315 320 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 325 330 335 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 340 345 350 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 355 360 365 Gln Ala Leu Pro Pro Arg Val Asn Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser 370 375 380 Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Cys 385 390 395 400 His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Ser 405 410 415 Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu 420 425 430 Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys 435 440 445 Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser 450 455 460 Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe 465 470 475 480 Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser 485 490 495 His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr 500 505 510 Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg 515 520 525 Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr 530 535 540 Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser 545 550 555 560 Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu 565 570 575 Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln 580 585 590 Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val 595 600 605 Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser 610 615 620 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 625 630 635 640 Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr 645 650 655 Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys 660 665 670 Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe 675 680 685 Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile 690 695 700 Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp 705 710 715 720 Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu 725 730 735 Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu 740 745 750 Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser 755 760 765 Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro 770 775 780 Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp 785 790 795 800 Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln 805 810 815 Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg 820 825 830 Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser 835 840 845 <210> 43 <211> 2538 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 261M CAR nucleic acid <400> 43 atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60 atcctgggga gtggagaagc taagccacag gcacaggtgc agctggagga gtctggagga 120 ggaagcgtgc aagtgggagg ctccctgagg ctgtcttgcg cagcaagcgg atacagatcc 180 agcgtgtgca tgggatggtt tagacaggca ccaggaaagg agagggagag agtggcagtg 240 atcggaaggg acggatccac cacatatatc gattctgtga agggccggtt taccatctcc 300 agagactctg ccaagaacac actgtctctg cagatggaca atctgaagcc tgaagacaca 360 gccatgtaca gctgcgccgc cggcctggga tactgggctt gcgaatacaa ctactggggg 420 cagggcactc aggtgaccgt ctcttctact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 480 acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 540 gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 600 gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 660 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 720 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 780 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080 gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gcgttaacgg cagcggagct 1140 acaaacttca gtcttctaaa acaggctggt gacgtggagg agaatcccgg ccctatgtgc 1200 caccagcagc tggtgatcag ttggttctct ctggtgttcc tggcctcgcc acttgttgcc 1260 atatgggaac tcaaaaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtaccc cgacgctccc 1320 ggggagatgg tggtcctgac ctgtgatact ccggaggaag atggcatcac ctggacattg 1380 gatcagagct ccgaggtact gggctccggc aaaactctga ccatccaggt gaaggagttc 1440 ggtgatgctg gacaatacac ctgccataag ggcggcgagg ttcttagcca ttctctgctg 1500 ctcctccaca agaaggaaga cggtatttgg tcgaccgaca tcctgaagga ccagaaggag 1560 cccaaaaaca agactttttt gcgctgcgag gccaaaaact actccggtcg cttcacatgc 1620 tggtggctaa cgaccatctc aaccgacctg accttctctg tcaagagctc tcgtggctcc 1680 agcgatcctc agggcgtcac ctgcggggca gccaccctga gcgcagagcg cgtgagaggg 1740 gacaacaagg agtatgagta ctcggtggag tgtcaggagg actcggcctg cccagcggcc 1800 gaggagagcc tgcccattga ggtgatggta gacgccgtcc acaagctgaa gtacgagaac 1860 tacacctcct ccttctttat ccgggacatc atcaagcccg acccgcccaa gaacctgcag 1920 ctcaagcctt tgaagaattc ccgccaggtt gaagtcagtt gggagtaccc tgacacctgg 1980 tctactccgc acagctattt ctcgctgacc ttctgcgtgc aggtccaggg aaagtccaag 2040 cgcgagaaga aagacagggt gttcaccgac aagacctccg ccaccgtgat ttgccgaaaa 2100 aacgcctcca tctccgtgcg tgcgcaggac cgctactaca gttcctcttg gtccgagtgg 2160 gcttccgtgc cttgttcagg cagtggagag ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac 2220 gtcgaggaga atcctggccc aatggctctg ctgctggcac tgagtctgct ggtcctgtgg 2280 acatcacctg cacctaccct gagtggaact aatgacgctg aagattgttg cctgagcgtg 2340 acccagaagc caatccccgg ctacatcgtg aggaacttcc actatctgct gatcaaggac 2400 ggatgcaggg tgcctgcagt ggtgtttacc acactgcggg gcagacagct gtgcgcacca 2460 cctgatcagc cctgggtcga gagaattatt cagagactgc agcgcacctc agctaagatg 2520 aaacgccgct caagttaa 2538 <210> 44 <211> 865 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mus261M CAR amino acid <400> 44 Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Gln 20 25 30 Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser 35 40 45 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys Met 50 55 60 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala Val 65 70 75 80 Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 90 95 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln Met 100 105 110 Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala Gly 115 120 125 Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 130 135 140 Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu 165 170 175 Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala 180 185 190 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu 195 200 205 Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Ser Val Leu Lys Trp Ile 210 215 220 Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr 225 230 235 240 Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu 245 250 255 Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg 260 265 270 Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn 275 280 285 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys 290 295 300 Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn 305 310 315 320 Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 325 330 335 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 340 345 350 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 355 360 365 Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr 370 375 380 Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 385 390 395 400 Pro Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu 405 410 415 Leu Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr 420 425 430 Val Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn 435 440 445 Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp 450 455 460 Gln Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val 465 470 475 480 Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu 485 490 495 Thr Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile 500 505 510 Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys 515 520 525 Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val 530 535 540 Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser 545 550 555 560 Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu 565 570 575 Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys 580 585 590 Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu 595 600 605 Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr 610 615 620 Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu 625 630 635 640 Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr 645 650 655 Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe 660 665 670 Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly 675 680 685 Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val 690 695 700 Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr 705 710 715 720 Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 725 730 735 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 740 745 750 Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Pro Arg Val Thr Pro Leu Leu Ala Phe 755 760 765 Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Phe Pro Ala Pro Thr Leu Gly Gly Ala 770 775 780 Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Arg Pro Ile Pro 785 790 795 800 Gly Asn Ile Val Lys Ala Phe Arg Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Gly Cys 805 810 815 Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Tyr Gln Leu Cys 820 825 830 Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Asp Arg Ile Ile Arg Arg Leu Lys 835 840 845 Lys Ser Ser Ala Lys Asn Lys Gly Asn Ser Thr Arg Arg Ser Pro Val 850 855 860 Ser 865 <210> 45 <211> 2598 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mus261M CAR nucleic acid <400> 45 atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60 atcctgggga gtggagaagc taagccacag gcacaggtgc agctggagga gtctggagga 120 ggaagcgtgc aagtgggagg ctccctgagg ctgtcttgcg cagcaagcgg atacagatcc 180 agcgtgtgca tgggatggtt tagacaggca ccaggaaagg agagggagag agtggcagtg 240 atcggaaggg acggatccac cacatatatc gattctgtga agggccggtt taccatctcc 300 agagactctg ccaagaacac actgtctctg cagatggaca atctgaagcc tgaagacaca 360 gccatgtaca gctgcgccgc cggcctggga tactgggctt gcgaatacaa ctactggggg 420 cagggcactc aggtgaccgt ctcttctact agtactacta ccaagccagt gctgcgaact 480 ccctcacctg tgcaccctac cgggacatct cagccccaga gaccagaaga ttgtcggccc 540 cgtggctcag tgaaggggac cggattggac ttcgcctgtg atatttacat ctgggcaccc 600 ttggccggaa tctgcgtggc ccttctgctg tccttgatca tcactctcat ctgctctgtg 660 ctcaaatgga tcaggaaaaa attcccccac atattcaagc aaccatttaa gaagaccact 720 ggagcagctc aagaggaaga tgcttgtagc tgccgatgtc cacaggaaga agaaggagga 780 ggaggaggct atgagctgag agcaaaattc agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg 840 caggacccca accagctcta caatgagctc aatctagggc gaagagagga atatgacgtc 900 ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag atgggaggca aacagcagag gaggaggaac 960 ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag 1020 atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1080 agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc ctgcatatgc agaccctggc ccctcgcggc 1140 agcggagcta caaacttcag tcttctaaaa caggctggtg acgtggagga gaatcccggc 1200 cctatgtgtc ctcagaagct aaccatctcc tggtttgcca tcgttttgct ggtgtctcca 1260 ctcatggcca tgtgggagct ggagaaagac gtttatgttg tagaggtgga ctggactccc 1320 gatgcccctg gagaaacagt gaacctcacc tgtgacacgc ctgaagaaga tgacatcacc 1380 tggacctcag accagagaca tggagtcata ggctctggaa agaccctgac catcactgtc 1440 aaagagtttc tagatgctgg ccagtacacc tgccacaaag gaggcgagac tctgagccac 1500 tcacatctgc tgctccacaa gaaggaaaat ggaatttggt ccactgaaat tttaaaaaat 1560 ttcaaaaaca agactttcct gaagtgtgaa gcaccaaatt actccggacg gttcacgtgc 1620 tcatggctgg tgcaaagaaa catggacttg aagttcaaca tcaagagcag tagcagttcc 1680 cctgactctc gggcagtgac atgtggaatg gcgtctctgt ctgcagagaa ggtcacactg 1740 gaccaaaggg actatgagaa gtattcagtg tcctgccagg aggatgtcac ctgcccaact 1800 gccgaggaga ccctgcccat tgaactggcg ttggaagcac ggcagcagaa taaatatgag 1860 aactacagca ccagcttctt catcagggac atcatcaaac cagacccgcc caagaacttg 1920 cagatgaagc ctttgaagaa ctcacaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgactcctgg 1980 agcactcccc attcctactt ctccctcaag ttctttgttc gaatccagcg caagaaagaa 2040 aagatgaagg agacagagga ggggtgtaac cagaaaggtg cgttcctcgt agagaagaca 2100 tctaccgaag tccaatgcaa aggcgggaat gtctgcgtgc aagctcagga tcgctattac 2160 aattcctcat gcagcaagtg ggcatgtgtt ccctgcaggg tccgatccgg cagtggagag 2220 ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc aatggctcct 2280 agagtgacac ctttgctggc cttttctctt ctagtgttgt ggacgtttcc tgcacccacc 2340 ctgggtggag cgaatgatgc agaggactgc tgcctcagtg tcacccaaag gcccatacca 2400 gggaacattg tgaaggcctt ccgctatctt ctcaatgaag atggatgtcg ggttcctgct 2460 gtggtcttca ctactttacg cggctaccag ctgtgtgctc ctccagacca gccctgggtg 2520 gaccgtatca tccgaaggct gaagaaaagc agcgccaaga acaaaggcaa ctcaacaaga 2580 agatccccag tttcctaa 2598 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine-serine polymer linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> GSGGS can be repeated n times, where n is an integer of at least one <400> 46 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine-serine polymer linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> GGGS can be repeated n times, where n is an integer of at least one <400> 47 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine-serine polymer linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> GGGGS can be repeated n times, where n is an integer of at least one <400> 48 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (54)

  1. 면역 이펙터 세포로서,
    (i) 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛;
    (ii) 외인적으로 도입된 CCR7의 리간드; 및
    (iii) 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는,
    (a) 세포외 항원 결합 도메인,
    (b) 막관통 도메인, 및
    (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함하며,
    상기 CCR7의 리간드는 CCL-19이거나, 또는 상기 CCR7의 리간드는 CCL-21인 면역 이펙터 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 p40은 인간 p40 또는 이의 단편 또는 변이체인 면역 이펙터 세포.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CCL-19는 인간 CCL-19 또는 이의 단편 또는 변이체이고; 및/또는 CCL-21은 인간 CCL-21 또는 이의 단편 또는 변이체인 면역 이펙터 세포.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기능적 외인성 수용체는 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 TCR(cTCR), 또는 T 세포 항원 접합체(TAC) 유사 키메라 수용체인 면역 이펙터 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 기능적 외인성 수용체는 CAR인 면역 이펙터 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래되는 면역 이펙터 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래되는 면역 이펙터 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 도메인은 면역 이펙터 세포의 1차 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 1차 세포내 신호 전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는 면역 이펙터 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 도메인은 공동자극 신호 전달 도메인을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 공동자극 신호 전달 도메인은 공동자극 분자로부터 유래되고, 상기 공동자극 분자는 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 이펙터 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 공동자극 신호 전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 및/또는 CD137의 세포내 도메인을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 상기 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 더 포함하는 면역 이펙터 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래되는 면역 이펙터 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드의 N-말단에 위치한 신호 펩티드를 더 포함하는 면역 이펙터 세포.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래되는 면역 이펙터 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 이펙터 세포는 T 세포인 면역 이펙터 세포.
  22. 폴리펩티드로서,
    (i) 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛;
    (ii) 외인적으로 도입된 CCR7의 리간드; 및
    (iii) 기능적 외인성 수용체를 발현하고, 상기 기능적 외인성 수용체는,
    (a) 세포외 항원 결합 도메인,
    (b) 막관통 도메인, 및
    (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함하며,
    상기 CCR7의 리간드는 CCL-19이거나, 또는 상기 CCR7의 리간드는 CCL-21인 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 p40은 인간 p40 또는 이의 단편 또는 변이체인 폴리펩티드.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 p40은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CCL-19는 인간 CCL-19 또는 이의 단편 또는 변이체이고; 및/또는 상기 CCL-21은 인간 CCL-21 또는 이의 단편 또는 변이체인 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 CCL-19는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 CCL-21은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기능적 외인성 수용체는 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 TCR(cTCR), 또는 T 세포 항원 접합체(TAC) 유사 키메라 수용체인 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 기능적 외인성 수용체는 CAR인 폴리펩티드.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래되는 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래되는 폴리펩티드.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 도메인은 면역 이펙터 세포의 1차 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 1차 세포내 신호 전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는 폴리펩티드.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 도메인은 공동자극 신호 전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 공동자극 신호 전달 도메인은 공동자극 분자로부터 유래되고, 상기 공동자극 분자는 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 공동자극 신호 전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 및/또는 CD137의 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 상기 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 더 포함하는 폴리펩티드.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래되는 폴리펩티드.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 신호 펩티드를 더 포함하는 폴리펩티드.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래되는 폴리펩티드.
  42. 제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 p40, 상기 CCL-19 및 상기 기능적 외인성 수용체는 펩티드 링커를 통해 서로 연결되거나; 또는 상기 p40, 상기 CCL-21 및 상기 기능적 외인성 수용체는 펩티드 링커를 통해 서로 연결되는 폴리펩티드.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 펩티드 링커는 2A 자가 절단 펩티드이고, 상기 2A 자가 절단 펩티드는 F2A, E2A, P2A, T2A 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택되는 폴리펩티드.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 P2A 단편인 폴리펩티드.
  45. 제43항에 있어서,
    상기 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 T2A 단편인 폴리펩티드.
  46. 제22항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 p40 및 상기 CCL-19는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 존재하거나, 또는 상기 p40 및 상기 CCL-19는 도메인에 존재하고, 상기 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  47. 제22항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 p40 및 상기 CCL-21은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 존재하거나, 또는 상기 p40 및 상기 CCL-21은 도메인에 존재하고, 상기 도메인은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  48. 제22항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  49. 단리된 핵산으로서,
    (i) 외인적으로 도입된 IL-12의 p40 서브유닛을 코딩하는 제1 영역;
    (ii) 외인적으로 도입된 CCR7의 리간드를 코딩하는 제2 영역; 및
    (iii) 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제3 영역을 포함하고, 상기 기능적 외인성 수용체는,
    (a) 세포외 항원 결합 도메인,
    (b) 막관통 도메인, 및
    (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함하며,
    상기 CCR7의 리간드는 CCL-19이거나, 또는 상기 CCR7의 리간드는 CCL-21인 핵산.
  50. 제49항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  51. 면역 이펙터 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은,
    (i) 제48항 또는 제49항에 따른 핵산 또는 제50항에 따른 벡터; 또는
    (ii) 각각 IL-12의 p40 서브유닛, CCL-19 중 하나 또는 둘을 코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하는 조성물; 및 기능적 외인성 수용체, 또는 각각 IL-12의 p40 서브유닛, CCL-21 중 하나 또는 둘을 코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하는 조성물; 및 기능적 외인성 수용체 를 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  52. 제51항에 따른 방법에 따라 생성된 면역 이펙터 세포.
  53. 제1항 내지 제21항 및 제52항 중 어느 한 항에 따른 면역 이펙터 세포, 제22항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제48항 및 제49항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 또는 제50항에 따른 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  54. 피험자의 질환 또는 병증에 대한 치료 방법으로서, 상기 방법은 상기 피험자에게 유효량의 제53항에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111093689A (zh) * 2017-07-03 2020-05-01 转矩医疗股份有限公司 免疫刺激融合分子及其用途
US20210032661A1 (en) * 2018-04-09 2021-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods And Compositions Comprising A Viral Vector For Expression Of A Transgene And An Effector
CN110818803B (zh) * 2019-07-24 2023-01-03 浙江启新生物技术有限公司 分泌表达il15ra-il15融合蛋白、ccl21趋化因子的嵌合抗原受体-t细胞及应用
CN110590960B (zh) * 2019-09-26 2020-08-28 武汉波睿达生物科技有限公司 以cd99为靶点的嵌合抗原受体及其应用
CN110684739B (zh) * 2019-11-11 2022-05-27 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN112175998A (zh) * 2020-10-12 2021-01-05 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用

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