JP2023537526A - 生物工学によって作製されたウイルス特異的リンパ球を産生するための材料及び方法 - Google Patents

生物工学によって作製されたウイルス特異的リンパ球を産生するための材料及び方法 Download PDF

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シン，サンジャヤ
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Abstract

ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１ ５８－６６）を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含む、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、又は濃縮するための方法。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年８月１０日に出願された米国特許仮出願第６３／０６３，７４９号、２０２０年８月１０日に出願された同第６３／０６３，７７１号、２０２０年８月１０日に出願された同第６３／０６３，７８４号、２０２０年８月１０日に出願された同第６３／０６３，７９３号、２０２０年８月１０日に出願された同第６３／０６３，８０１号、２０２０年８月１０日に出願された同第６３／０６３，８０６号、２０２０年８月１０日に出願された同第６３／０６３，８１１号の利益を主張し、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、ファイル名「１４６２０－５４４－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ」で２０２１年７月２６日に作成され、８，０４８バイトのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
いくつかの実施形態では、生物工学によって作製されたリンパ球、例えば生物工学によって作製されたＴ細胞、及び改善されたＴ細胞を使用するためのプロセスが本明細書において提供される。インフルエンザ特異的Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞など、かかるＴ細胞を生成するための方法、及び例えば、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を産生するためのその使用が開示される。また、ある特定の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む組成物及び疾患又は障害を治療するためのその使用が本明細書において提供される。
悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子改変された免疫細胞の養子移入は、癌を治療するための新しいアプローチとして有望である（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２（２）：２５１－２５７（２０１０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，８（４）：２９９－３０８（２００８）を参照）。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞は、最も強力な癌治療の１つとして浮上している。
従来、臨床グレードのＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するためには、Ｔ細胞が、白血球除去血輸血によって患者（又は抹消血）から収集され、活性化され、ウイルスベクターを使用してＣＡＲ構造体で形質導入され、増殖され、次いで、リンパ球除去化学療法後に単回治療として同じ患者に再注入される（Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，３１（６）：４７３－４８１（２０１７）を参照）。ＣＡＲ－Ｔ療法の治療結果には前例はないが、この療法は、その自己由来の特徴によって著しく限定的である。例えば、全ての患者からＴ細胞を採取できるわけではなく、また、Ｔ細胞の品質が製造基準を満たさないことがある。加えて、従来のＣＡＲ－Ｔ療法は、製造の失敗、時間遅延、不十分な細胞増殖、又は不均一な産生物など固有の製造上の問題を有し、これらはレシピエント患者にとって有害であり得る。かかる高度に個人化された治療はまた、高額であることを避けられない。
したがって、改善されたＴ細胞療法が必要とされている。
一態様では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、又は濃縮するための方法が本明細書において提供され、この方法は、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本方法は、ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボ（生体外）で培養される。
いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ） Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、（ｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、又は（ｉｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、エクスビボで１～２０日間、２～１８日間、３～１６日間、４～１４日間、５～１４日間、６～１４日間、７～１４日間、８～１４日間、９～１４日間、１０～１４日間、１１～１４日間、又は１２～１４日間培養される。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団である。いくつかの実施形態では、全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する。
いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の２～１０％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の３～８％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の４～６％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の４～５％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の５～６％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の５．５％である。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又は本方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍、２０％～２０倍、３０％～２０倍、４０％～２０倍、５０％～２０倍、６０％～２０倍、７０％～２０倍、８０％～２０倍、９０％～２０倍、２～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍、１１～２０倍、１２～２０倍、１３～２０倍、１４～２０倍、若しくは１５～２０倍増加させる、又は本方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、又は９０％～９９％に増加させる。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞集団のＭ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む。
別の態様では、本明細書において提供される方法に従って産生されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団が本明細書において提供される。
別の態様では、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、単離された細胞集団の６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、単離された細胞集団の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、又は９０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも一部は、Ｍ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体を発現する。
別の態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法が本明細書において提供され、本方法は、（ｉ）本明細書において提供されるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、単離された細胞集団を得ることと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する。いくつかの実施形態では、癌細胞は、血液癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、固形腫瘍癌細胞である。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ１２３である。いくつかの実施形態では、抗原は、ＰＳＭＡである。
別の態様では、本明細書において提供される方法に従って産生されたＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書において提供される。
別の態様では、本明細書において提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞の治療有効量を対象に投与することを含む、対象において疾患又は障害を治療する方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は血液癌である。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。いくつかの実施形態では、対象は、それを必要とするヒト対象である。
更に別の態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するためのプロセスが本明細書において提供され、本プロセスは、（ｉ）本明細書において提供されるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、単離された細胞集団を得る機能を実行するステップ、及び（ｉｉ）Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＡＲを発現する機能を実行するステップを含む。
更に別の態様では、癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段と、ドナーＴ細胞に対するアロ反応性を低減することができる第２の手段とを含む、システムが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段は、本明細書において提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現したＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ドナーＴ細胞に対するアロ反応性を低減することができる第２の手段は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
更に別の態様では、癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段と、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドを結合することができる第２の手段とを含む、Ｔ細胞が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段は、本明細書において提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現したＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドを結合することができる第２の手段は、Ｍ１ペプチドを結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。
健康な個体の全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の有病率を示す。示した蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）プロット内の数は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋細胞の頻度を指す。ドットプロットグラフは、ＨＬＡ－Ａ２＋及びＨＬＡ－Ａ２－の健康な個体の両方の全ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋細胞の平均（±ＳＥＭ）頻度を示す。各ドットは、健康なドナーからのデータを表す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がインフルエンザＡ特異的であり、エクスビボで活性化され、増殖され得ることを示す。Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２で刺激した全ＰＢＭＣからのＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的濃縮を示す。Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２で１２日間刺激した全ＰＢＭＣ由来の陰性濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞からＶβ１７＋Ｔ細胞を陽性単離した。代表的なドットプロットにおけるゲートの上の値は、Ｖβ１７＋細胞単離プロトコルの未接触画分（左）、陽性画分（中央）、及び陰性画分（右）中のＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を指す。下列の数字は、Ｖβ１７＋細胞単離プロトコルの未接触画分（左）、陽性画分（中央）、及び陰性画分（右）における濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７－ＣＤ８＋細胞及びＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を指す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がインフルエンザＡ特異的であり、エクスビボで活性化され、増殖され得ることを示す。ヒストグラムオーバーレイを示し、数字は、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２、又はＩＬ－２のみの存在下で培養された、活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ６９）及び細胞内エフェクター分子（グランザイムＢ、パーフォリン、及びＣＤ１０７ａ）に対して陽性のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を指す。太線及び点線の白色ヒストグラムは、それぞれ、Ｍ１ペプチド＋ＩＬ－２対ＩＬ－２のみの培養条件からのＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を指す。図２Ｂには、２回の独立した実験からの代表的なデータを示す。黒灰色のヒストグラムは、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照を反映する。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がインフルエンザＡ特異的であり、エクスビボで活性化され、増殖され得ることを示す。刺激の０日目（左）及び１４日目（中央）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋細胞の頻度を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。ゲートの下の数字は、全ＣＤ８＋Ｔ細胞中のゲーティングされた集団の頻度を表す。グラフ（右）は、Ｍ１ペプチド刺激の０日目及び１４日目における健康な個体由来の全ＰＢＭＣのＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋細胞の頻度を要約する。各ドットは、健康なドナーからのデータを表す。図２Ｃには、８回の独立した実験からの９人のドナーの代表的なデータを示す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がインフルエンザＡ特異的であり、エクスビボで活性化され、増殖され得ることを示す。左は、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２で刺激されたＰＢＭＣ培養の１２日目からの濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在量を示す。右は、濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＭ１ペプチド負荷テトラマー－Ｖβ１７＋細胞及びＭ１ペプチド負荷テトラマー＋Ｖβ１７＋細胞の頻度を示す。Ｔｅｔはテトラマーを表す。２回の独立した実験からの代表的なデータを示す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）構造体で効率的にトランスフェクトされ得ることを示す。濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の実施例の節に詳述するように、抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲ構造体をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。代表的なＦＡＣＳプロット内のゲートの上の数字は、ＧＦＰ（上）及びＣＡＲ表面発現（下）について陰性又は陽性である細胞の頻度を指す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介リダイレクションが、液性腫瘍及び固形腫瘍を効果的に排除することを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２で１２日間刺激された全ＰＢＭＣ（ＨＬＡ＊０２０１ドナー由来）から濃縮されたことを示す。濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｖβ１７＋細胞について更に濃縮し、次いで、ＧＦＰ、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ ｍＲＮＡ構造体、又は抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡ構造体のいずれかでトランスフェクトした。ＣＡＲトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）を、それぞれのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識標的細胞と、示したエフェクター対標的比（ＥＴ比）で、加湿Ｃｏ２インキュベーター中３７℃で２４時間（Ｋａｓｕｍｉ－３）及び７２時間（２２Ｒｖ１細胞）共培養した。標的細胞溶解を、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）染色及びフローサイトメトリーによって判定した。代表的なグラフ内の丸及び四角は、示したＥＴ比でのそれぞれ抗ＣＤ １２３ ＣＡＲ（左）又は抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ（右）及びＧＦＰトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞によって媒介された標的細胞溶解の頻度を示す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介リダイレクションが、液性腫瘍及び固形腫瘍を効果的に排除することを示す。代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。ゲートは、共培養の５日目における、それぞれの標的細胞との共培養時（ＥＴ比１：１で）のＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）希釈（増殖）に対して陽性のエフェクター細胞の頻度を指す。点線の白色ヒストグラム及び黒色ヒストグラムは、それぞれの標的細胞と共培養されたＧＦＰトランスフェクトエフェクター細胞及び非トランスフェクトエフェクター細胞をそれぞれ指す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介リダイレクションが、液性腫瘍及び固形腫瘍を効果的に排除することを示す。図４Ａの細胞培養上清からのサイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。黒色及び灰色のバーは、標的細胞との共培養時に抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲトランスフェクトエフェクター細胞及びＧＦＰトランスフェクトエフェクター細胞によってそれぞれ産生されたサイトカイン／エフェクター分子の濃度を指す。ここでは、それぞれ１回及び２回の独立した実験による１人のドナー（図４Ａ及び図４Ｃ）並びに２人のドナー（図４Ｂ）からの代表的な実験を示す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介リダイレクションが、液性腫瘍及び固形腫瘍を効果的に排除することを示す。左は、Ｍ１ペプチド負荷ＭＨＣクラスＩ四量体及び抗ヒトＶβ１７ ｍＡｂで染色されている、１２日目の濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。右は、濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＭ１ Ｔｅｔ－Ｖβ１７＋細胞及びＭ１ Ｔｅｔ＋Ｖβ１７＋細胞の存在量を示す代表的なドットプロットを示す。象限内の数字は、Ｍ１ Ｔｅｔ＋Ｖβ１７＋細胞の分化のそれぞれのマーカーに対して陽性の細胞のパーセンテージを指す（ナイーブ：ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋；セントラルメモリー（ＴＣＭ）：ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－；エフェクターメモリー（ＴＥＭ）：ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－；ＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ）を再発現するエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７－）。図４Ｄについては、２回の独立した実験からの２人の独立したドナーのデータの代表的なデータを示す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介エフェクタープロファイルを示す。Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を健康な個体（インド系）の全ＰＢＭＣから濃縮し、抗ＣＤ１２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。抗ＣＤ １２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）を、示したＥＴ比で、加湿Ｃｏ２インキュベーター中３７℃で２４時間（Ｋａｓｕｍｉ－３）及び７２時間（２２Ｒｖ１細胞）ＣＦＳＥ標識標的細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。細胞溶解の測定値を示す。代表的なグラフ内の丸及び四角は、示したＥＴ比で、それぞれ抗ＣＤ １２３（左）又は抗ＰＳＭＡ（右）ＣＡＲ及びＧＦＰトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞によって媒介される標的細胞溶解の平均（±ＳＥＭ）頻度を示す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介エフェクタープロファイルを示す。Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を健康な個体（インド系）の全ＰＢＭＣから濃縮し、抗ＣＤ１２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。抗ＣＤ １２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）を、示したＥＴ比で、加湿Ｃｏ２インキュベーター中３７℃で２４時間（Ｋａｓｕｍｉ－３）及び７２時間（２２Ｒｖ１細胞）ＣＦＳＥ標識標的細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。ゲートの上の数字は、共培養の５日目におけるそれぞれの標的細胞との共培養時のＣＴＶ希釈（増殖）に対して陽性のエフェクター細胞の平均（±ＳＥＭ）頻度を指す。点線の白色ヒストグラム及び黒色ヒストグラムは、それぞれの標的細胞と共培養されたＧＦＰトランスフェクトエフェクター細胞及び非トランスフェクトエフェクター細胞をそれぞれ指す。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介エフェクタープロファイルを示す。Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を健康な個体（インド系）の全ＰＢＭＣから濃縮し、抗ＣＤ１２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。抗ＣＤ １２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）を、示したＥＴ比で、加湿Ｃｏ２インキュベーター中３７℃で２４時間（Ｋａｓｕｍｉ－３）及び７２時間（２２Ｒｖ１細胞）ＣＦＳＥ標識標的細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。図５Ａの細胞培養上清からのサイトカイン／エフェクター分子の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。黒色及び灰色のバーは、標的細胞との共培養時にそれぞれ抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ、抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ、又はＧＦＰによってトランスフェクトされたエフェクター細胞によって産生されたサイトカイン／エフェクター分子の濃度を指す。ここに示す値は、２回の独立した実験からの２人の独立したドナーからの累積値であった。 Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ媒介エフェクタープロファイルを示す。Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を健康な個体（インド系）の全ＰＢＭＣから濃縮し、抗ＣＤ１２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。抗ＣＤ １２３又はＰＳＭＡ ＣＡＲトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）を、示したＥＴ比で、加湿Ｃｏ２インキュベーター中３７℃で２４時間（Ｋａｓｕｍｉ－３）及び７２時間（２２Ｒｖ１細胞）ＣＦＳＥ標識標的細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。左は、新鮮なＰＢＭＣから濃縮されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。右は、標的細胞との共培養時のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化状態を示す。象限内の数字は、ＣＡＲでトランスフェクトされ、１：１のＥＴ比で標的細胞と共培養されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化のそれぞれのマーカーについて陽性の細胞を指す（ナイーブ：ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋；セントラルメモリー（ＴＣＭ）：ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－；エフェクターメモリー（ＴＥＭ）：ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ－；ＥＭＲＡ（ＴＥＭＲＡ）：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－）。図５Ｄについては、１回の独立した実験からの２人の独立したドナーのデータの代表的なデータを示す。
本開示は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びそれらの有利な特性を産生するための新規の方法又はプロセス、並びに疾患又は障害を治療するための細胞療法を行うためのそれらの使用にある程度基づいている。
５．１．定義
本明細書に記載又は参照されている技術及び手順には、当業者が概ねよく理解しているもの、及び／又は当業者が従来の手法を用いて通常採用しているもの、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら ｅｄｓ．，２００３）；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．２００９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒ ｅｄ．２０１０）；及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｓ １ ａｎｄ ２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）に記載されている広く利用されている手法などが含まれる。本明細書中で特に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。この明細書を解釈するために、以下の用語の説明が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含まれ、その逆もまた同様である。記載された用語の任意の説明が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する場合、以下に記載された用語の説明が優先するものとする。
「抗体」、「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、以下に記載するように、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長又はインタクトモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ又はモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、及びそのフラグメントを包含する。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、及び／又は親和性成熟されたものであり、並びに他の種、例えば、マウス、ウサギ、ラマなどからの抗体であり得る。「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することができ、２つの同一の対のポリペプチド鎖で構成される、ポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むことを意図しており、各対は、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）及び１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約１００～約１３０以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）；、及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９７）を参照されたい。また、抗体としては、合成抗体、組み換え産生抗体、ラクダ科種（例えば、ラマやアルパカ）由来などの単一ドメイン抗体又はそれらのヒト化変異体、体内抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかの機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、フラグメントの由来となった抗体の結合活性の一部又は全部を保持する抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの部分を指す。機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）の非限定的な例としては、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原に結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ又は２つ以上のＣＤＲ）を含む抗原結合ドメイン又は分子を含む。そのような抗体フラグメントは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５；ａｎｄ Ｄａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ ｅｄ．１９９０）に見出すことができる。本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもなくアンタゴニストでもなくてもよい。
「抗原」とは、抗体が選択的に結合することができる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在する化合物若しくは合成化合物であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。特定の実施形態では、抗原は、細胞と関連し、例えば、細胞上又は細胞内に存在する。
「インタクト」抗体とは、抗原結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含むものである。定常領域には、ヒト定常領域又はそのアミノ酸配列の変異体が含まれ得る。特定の実施形態では、インタクト抗体は、１つ又は２つ以上のエフェクター機能を有する。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖについては、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
「結合（binds）」又は「結合すること（binding）」という用語は、例えば、複合体を形成することを含む分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体には、共有結合若しくは非共有結合、相互作用、又は力によって一緒に保持された２つ以上の分子の結合も含まれる。抗体の単一の抗原結合部位と、抗原などの標的分子の単一のエピトープとの間の非共有相互作用全体の強さが、そのエピトープに対する抗体又は機能的フラグメントの親和性である。一価の抗原に対する結合分子（例えば、抗体）の解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、解離定数ＫＤであり、親和性とは逆の関係にある。ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性は高くなる。ＫＤの値は、抗体及び抗原の異なる複合体によって様々であり、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの両方に依存する。本明細書において提供される抗体の解離定数ＫＤは、本明細書において提供される任意の方法、又は当業者に周知である任意の他の方法を使用して決定することができる。１つの結合部位での親和性は、必ずしも抗体と抗原との間の相互作用の真の強さを反映するものではない。多価抗原などの複数の繰り返し抗原決定基を含む複雑な抗原が、複数の結合部位を含む抗体と接触した場合、ある部位での抗体の抗原との相互作用は、第２部位での反応の確率を増加させるであろう。そのような多価抗体と抗原との間の複数の相互作用の強さは、親和力と呼ばれる。
本明細書に記載されている結合分子に関連して、「に結合する」、「に特異的に結合する」などの用語、及び類似の用語も本明細書では互換的に使用され、ポリペプチドなどの抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原に結合するか、又は抗原に特異的に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、又は当業者に公知の他の技術によって同定することができる。いくつかの実施形態では、結合分子又は抗原結合ドメインは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など実験技術を用いて決定された任意の交差反応性抗原よりも高い親和性で抗原に結合する場合、抗原に結合するか、又は抗原に特異的に結合する。典型的には、特異的又は選択的な反応は、バックグラウンドの信号又はノイズの少なくとも２倍であり、バックグラウンドの１０倍を超える場合がある。結合特異性に関する考察については、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３２－３６（Ｐａｕｌ，ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい。特定の実施形態では、「非標的」タンパク質に対する結合分子又は抗原結合ドメインの結合の程度は、例えば、ＦＡＣＳ分析又はＲＩＡによって決定されたとき、その特定の標的抗原に対する結合分子又は抗原結合ドメインの結合の約１０％未満である。抗原に結合する結合分子又は抗原結合ドメインには、その結合分子が、例えば、抗原を標的とした治療薬及び／又は診断薬として有用であるように、十分な親和性で抗原を結合可能なものが含まれる。特定の実施形態では、抗原に結合する結合分子又は抗原結合ドメインは、１μＭ、８００ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、又は０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態では、結合分子又は抗原結合ドメインは、異なる種の抗原間で保存されている抗原のエピトープに結合する。
特定の実施形態では、結合分子又は抗原結合ドメインは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分が、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」配列、並びに所望の生物活性を示す限り、かかる抗体のフラグメントを含み得る（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－５５を参照）。キメラ配列は、ヒト化配列を含み得る。
特定の実施形態では、結合分子又は抗原結合ドメインは、ネイティブＣＤＲ残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するラクダ、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類など非ヒト種（例えば、ドナー抗体）の対応するＣＤＲからの残基に置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（例えば、レシピエント抗体）からの配列を含む非ヒト（例えば、ラクダ科、ネズミ科、非人霊長類）抗体の「ヒト化」形態の部分を含み得る。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリン配列の１つ以上のＦＲ領域残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体で見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良するために行われる。ヒト化抗体の重鎖又は軽鎖は、少なくとも１つ以上の可変領域の実質的に全てを含むことができ、その場合、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－９６（１９９２）；Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５－８９（１９９２）；米国特許第６，８００，７３８号、同第６，７１９，９７１号；同第６，６３９，０５５号；同第６，４０７，２１３号；及び同第６，０５４，２９７号を参照されたい。
特定の実施形態では、結合分子又は抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」又は「ヒト抗体」の一部を含むことができ、これらの用語は、本明細書で互換的に使用され、ヒト可変領域、及び例えばヒト定常領域を含む抗体を指す。結合分子は、単一ドメイン抗体配列を含み得る。具体的な実施形態では、これらの用語は、ヒト起源の可変領域及び定常領域を含む抗体を指す。「完全ヒト」抗体は、特定の実施形態では、ポリペプチドに結合し、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変異体である核酸配列によってコードされる、抗体も包含することができる。「完全ヒト抗体」という用語には、Ｋａｂａｔらにより記載されたようにヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれる（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照）。「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はヒト抗体を作製するための技術のうちのいずれかを使用して作製されたものである。このヒト抗体の定義では、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外している。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて産生することができ、その中には、ファージディスプレイライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））及び酵母ディスプレイライブラリ（Ｃｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１：７５５－６８（２００６））が含まれる。また、ヒトモノクローナル抗体の調製には、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６－９５（１９９１）；及びｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）に記載の方法を使用可能である。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してかかる抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスに抗原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（５）：５６１－６６（１９９５）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（４）：４５５－５８（１９９７）；並びに、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照）。また、例えば、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：３５５７－６２（２００６）（ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術で作製されたヒト抗体に関する）を参照されたい。
特定の実施形態では、結合分子又は抗原結合ドメインは、「組み換えヒト抗体」の部分を含むことができ、この語句には、組み換え手段によって調製、発現、作成、若しくは単離されたヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック及び／若しくはトランス染色体である動物（例えば、マウス又はウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５（１９９２）を参照）、又は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う任意のその他の手段によって調製、発現、作製、若しくは単離された抗体が含まれる。かかる組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有することができる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照）。しかしながら、特定の実施形態では、かかる組み換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列のトランスジェニックである動物を使用する場合は、インビボ（生体内）体細胞変異誘発）を受けており、したがって、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列及ＶＬ配列に由来し、関連しているが、インビボでのヒト抗体生殖細胞系列レパートリ内に天然には存在しない場合がある配列である。
特定の実施形態では、結合分子又は抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の一部を含むことができ、本明細書で使用されるこの用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、例えば、集団を含む個々の抗体は、微量に存在し得る天然に存在する変異や、アミノ酸の異性化や脱アミド化、メチオニンの酸化、アスパラギンやグルタミンの脱アミド化などのよく知られた翻訳後修飾を除いて同一であり、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識する。具体的な実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」とは、単一のハイブリドーマ又は他の細胞によって産生される抗体である。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製するための特定の方法に限定されるものではない。例えば、本開示で有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製され得るか、又は細菌若しくは真核動物若しくは植物細胞で組み換えＤＮＡ法を使用して作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－９７（１９９１）に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。クローン細胞株及びそれによって発現するモノクローナル抗体を調製するための他の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００２）を参照されたい。
典型的な４鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽鎖（Ｌ）及び２本の同一の重鎖（Ｈ）で構成されるヘテロ４量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、概ね約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合でＨ鎖によって連結され、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ又は２つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。また、各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（variable domain、ＶＨ）に続いて、α鎖及びγ鎖の各々に３つの定常ドメイン（constant domain、ＣＨ）並びに、μ及びεのアイソタイプには４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（variable domain、ＶＬ）に続いて、もう一方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨとアラインメントし、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインメントしている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの対合は、単一の抗原結合部位を共に形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７１（Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，８ｔｈ ｅｄ．１９９４）；及びＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００１）を参照されたい。
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」という用語は、抗原に結合する抗体領域を指す。従来のＩｇＧは通常、２つのＦａｂ領域を含み、各々がＹ字型ＩｇＧ構造の２つのアームのうちの１つに存在する。各Ｆａｂ領域は、典型的には、重鎖及び軽鎖の各々の１つの可変領域及び１つの定常領域で構成されている。より具体的には、Ｆａｂ領域における重鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＨ及びＣＨ１領域であり、Ｆａｂ領域における軽鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＬ及びＣＬ領域である。Ｆａｂ領域におけるＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬは、本開示に従って抗原結合能力を付与するために様々な方式で配置することができる。例えば、ＶＨ領域及びＣＨ１領域は、１つのポリペプチド上にあり、ＶＬ領域及びＣＬ領域は、従来のＩｇＧのＦａｂ領域と同様に、別個のポリペプチド上にあり得る。あるいは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ＶＬ領域、ＣＬ領域の全てが同じポリペプチド上に存在し、以下の節でより詳細に説明するように、異なる順序で配向することも可能である。
「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」、又は「Ｖドメイン」という用語は、軽鎖又は重鎖のアミノ末端に概ね位置し、重鎖では約１２０～１３０アミノ酸、軽鎖では約１００～１１０アミノ酸の長さを有する抗体の軽鎖又は重鎖の一部を指し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に使用される。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と称され得る。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と称され得る。「可変」という用語は、可変領域の特定のセグメントが、抗体間で配列が大きく異なることを指す。Ｖ領域は、抗原の結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を決定する。しかしながら、可変領域の１１０アミノ酸のスパン全体では、その可変性は均一ではない。代わりに、Ｖ領域は、各々が約９～１２アミノ酸の長さである「超可変領域」と呼ばれるより大きな可変性（例えば、極端な可変性）のより短い領域によって分離された、約１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と呼ばれるより可変性の低い（例えば、比較的不変の）ストレッチからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々４つのＦＲを含み、大部分はβシート構造をとり、３つの超可変領域によって接続され、βシート構造を接続するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって共に近接して保持され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ ｅｄ．１９９１）を参照）。定常領域は、抗体を抗原に結合することには直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。可変領域は、異なる抗体間で配列が大きく異なる。具体的な実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。
「Ｋａｂａｔによる可変領域残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びその変形は、Ｋａｂａｔら（上記）の抗体の編集物の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲの短縮又はこれらへの挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）と、残基８２の後に３つの挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）と、を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、その抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とを相同領域でアライメントすることにより、決定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、可変ドメインの残基（軽鎖の約１～１０７残基、重鎖の約１～１１３残基）に言及する際に概ね使用される（例えば、上記のＫａｂａｔら）。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は、免疫グロブリンの重鎖定常領域内の残基に言及する際に概ね使用される（例えば、上記のＫａｂａｔらで報告されているＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ １ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。他の番号付けシステムは、例えば、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ、及びＡＨｏｎによって記載されている。
抗体に関して使用される場合の「重鎖」という用語は、約５０～７０ｋＤａのポリペプチド鎖であって、アミノ末端部分が約１２０～１３０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含むものを指す。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）と称される５つの明確に異なるタイプ（例えば、アイソタイプ）のうちの１つであり得る。明確に異なる重鎖の大きさは異なり、α、δ、及びγは約４５０個のアミノ酸を含み、μ及びεは約５５０個のアミノ酸を含む。軽鎖と組み合わせられると、これらの明確に異なるタイプの重鎖は、それぞれ５つの周知のクラス（アイソタイプなど）の抗体、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ（ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４も含まれる）を生じさせる。
抗体に関して使用される場合の「軽鎖」という用語は、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖であって、アミノ末端部分が約１００～約１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含むものを指す。軽鎖のおおよその長さは、２１１～２１７アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）又はラムダ（λ）と称される２つの異なるタイプがある。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＶＲ」、「相補性決定領域」、及び「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ」という用語は、互換的に使用される。「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（Ｉｇ又は抗体）ＶＨ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域のうちの１つ（Ｈ１、Ｈ２、若しくはＨ３）、又は抗体ＶＬ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域のうちの１つ（Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３）を指す。したがって、ＣＤＲは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。
ＣＤＲ領域は、当業者に周知であり、周知の番号付けシステムによって定義されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（例えば、上記のＫａｂａｔらを参照）。「Ｃｈｏｔｈｉａ」は、それに代えて、構造ループの位置を指す（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７（１９８７）を参照）。Ｋａｂａｔ番号付け規則を使用して番号付けされたときのＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２からＨ３４まで変化する（これは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが、Ｈ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を配置するためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わり、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている（例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）を参照）。「ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、利用可能な複合結晶構造の分析に基づく。開発され、広く採用されている別の世界共通の番号付けシステムは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）である（Ｌａｆｒａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３））。ＩＭＧＴは、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）、並びにヒト及び他の脊椎動物の主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex、ＭＨＣ）専門の統合情報システムである。本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と、軽鎖又は重鎖内の位置との両方の観点において言及される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」は、種の間で保存され、ループと称される構造に存在するため、可変ドメイン配列を構造的特徴に従ってアラインメントする番号付けシステムを使用することにより、ＣＤＲ及びフレームワーク残基は容易に同定される。この情報は、１つの種の免疫グロブリンからのＣＤＲ残基を、典型的にはヒト抗体からのアクセプターフレームワーク内に移植及び置き換えることに使用され得る。Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－７０（２００１）によって、更なる番号付けシステム（ＡＨｏｎ）が開発されている。例えば、Ｋａｂａｔ番号付け及びＩＭＧＴ固有の番号付けシステムを含む番号付けシステム間の対応関係は、当業者に周知である（例えば、上記のＫａｂａｔ；上記のＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ；上記のＭａｒｔｉｎ；上記Ｌｅｆｒａｎｃらを参照）。これらの超可変領域又はＣＤＲのそれぞれの残基を、以下の表１に例示する。
Figure 2023537526000002
所与のＣＤＲの境界は、同定に使用されるスキームに応じて異なり得る。したがって、特に明記しない限り、可変領域などの所与の抗体又はその領域の「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」という用語、並びに抗体又はその領域の個々のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２）は、本明細書で上述した公知のスキームのうちのいずれかによって定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。場合によっては、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＣｏｎｔａｃｔ法で定義されたＣＤＲなど、特定のＣＤＲ又は複数のＣＤＲの同定のためのスキームが指定されている。他の場合には、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列が挙げられる。ＣＤＲ領域はまた、様々な番号付けシステムの組み合わせ、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムの組み合わせ、又はＫａｂａｔ番号付けシステム及びＩＭＧＴ番号付けシステムの組み合わせによって定義され得ることに留意されたい。したがって、「特定のＶＨに示されるＣＤＲ」などの用語は、上記の例示的なＣＤＲ番号付けシステムを含むが、それに限定されないシステムによって定義される任意のＣＤＲ１を含む。可変領域（例えば、ＶＨ又はＶＬ）が与えられると、当業者は、領域内のＣＤＲが、異なる番号付けシステム又はその組み合わせによって定義され得ることを理解するであろう。
超可変領域は、次のような「拡張超可変領域」を含み得る：ＶＬ内の２４～３６又は２４～３４（Ｌ１）、４６～５６又は５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７又は８９～９６（Ｌ３）、並びにＶＨ内の２６～３５又は２６～３５Ａ（Ｈ１）、５０～６５又は４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、又は９５～１０２（Ｈ３）。
「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示す軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、抗原結合部位を含む可変領域である免疫グロブリンの他の部分と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、並びに軽鎖のＣＬ領域を含み得る。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、ＣＤＲに隣接する可変領域の残基を指す。ＦＲ残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体（例えば、単一ドメイン抗体）、ダイアボディ、線状抗体、及び二重特異性抗体に存在する。ＦＲ残基は、超可変領域残基又はＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、天然配列Ｆｃ領域、組み換えＦｃ領域、及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基、又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸びると定義されることが多い。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵの番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって除去され得る。したがって、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基のある抗体とない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、貪食作用、細胞表面の受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーションなどが含まれる。かかるエフェクター機能は、概ね、Ｆｃ領域が結合領域又は結合ドメイン（例えば、抗体可変領域又はドメイン）と組み合わせられることを必要とし、当業者に公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、又は欠失）により、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有しており、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１～約１０個のアミノ酸置換、又は約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、又はそれと少なくとも約９０％の相同性、例えば、それと少なくとも約９５％の相同性を有し得る。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、当該技術分野の用語であり、結合分子（例えば、単一ドメイン抗体配列を含む抗体）が特異的に結合できる抗原の局在領域を指す。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープ、非線状エピトープ、又は不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸（「線状」エピトープ）であり得るか、又はエピトープは、ポリペプチドの２つ以上の非連続領域からのアミノ酸（「立体構造」、「非線状」、又は「不連続」エピトープ）を含み得る。概ね、線状エピトープは、二次、三次、又は四次構造に依存する場合もあれば、依存しない場合もあることが当業者によって理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、アミノ酸が天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているかどうかにかかわらず、アミノ酸の群に結合する。他の実施形態では、結合分子は、エピトープを認識して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体構造（例えば、屈曲、ねじれ、回転、又はフォールディング）を示すことを必要とする。
ペプチド、ポリペプチド、又は抗体配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、最大配列同一性パーセントを達成するように、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮することなく、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを求める目的のためのアライメントは、当該技術分野における技能の範囲内で様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、１つ以上の抗原特異性を、Ｔ細胞など免疫エフェクター細胞へとグラフトするために使用することができる遺伝子操作された受容体を指す。一部のＣＡＲはまた、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、又は「キメラ免疫受容体」としても知られている。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原（腫瘍抗原など）、膜貫通ドメイン、並びにＴ細胞及び／又は他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに特異的な細胞外抗原結合ドメインを含む。「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。介入の例としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾がある。また、定義には、例えば、非天然アミノ酸を含むがこれらに限定されない、アミノ酸の１つ又は２つ以上の類似体を含むポリペプチド、並びに当該技術分野で知られている他の修飾も含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体又は免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づき得るため、特定の実施形態では、「ポリペプチド」は、一本鎖として、又は２つ以上の関連鎖として生じ得ることが理解される。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書で互換的に使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによって、又は合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、長さが約２００ヌクレオチド未満であるが、概して必ずしも必須ではなく、短く、概ね一本鎖の合成ポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも同様に完全に適用できる。本開示の結合分子を産生する細胞には、親ハイブリドーマ細胞のほか、抗体をコードする核酸が導入された細菌及び真核生物の宿主細胞を挙げることができる。特に指定のない限り、本明細書で開示されている任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端である。二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と称される。ＲＮＡ転写物の５’から５’末端にあるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物の３’から３’末端にあるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
「単離核酸」とは、核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合核酸であり、他のゲノムＤＮＡ配列、並びに天然配列に天然に会合するリボソーム及びポリメラーゼなどのタンパク質又は複合体から実質的に分離されたものである。「単離」核酸分子とは、核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。更に、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組み換え技術によって製造された場合には、他の細胞材料又は培養液を実質的に含まなくてもよく、化学合成された場合には、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。具体的な実施形態では、単一ドメイン抗体又は本明細書に記載の抗体をコードする１つ以上の核酸分子が単離又は精製される。この用語は、天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、組み換え又はクローン化されたＤＮＡ単離物、及び化学的に合成された類似体、又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子には、その分子の単離形態が含まれることがある。具体的には、本明細書に記載のＣＡＲをコードする「単離」核酸分子は、同定され、産生環境において通常付随している少なくとも１つの混入核酸分子から単離された核酸分子である。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において操作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」という用語、及び類似の語句（例えば、遺伝的に融合された）は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、核酸配列又はアミノ酸配列が互いに機能的な関係に置かれた操作可能な連結を指す。例えば、操作可能に連結されたプロモーター、エンハンサーエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、並びにターミネーター配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらす。いくつかの実施形態では、操作可能であるように連結された核酸エレメントは、オープンリーディングフレームの転写及び最終的にはポリペプチドの生成（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。別の例として、操作可能であるように連結されたペプチドは、機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するものを指す。
「ベクター」という用語は、核酸配列を宿主細胞に導入するために、例えば、本明細書に記載の結合分子（例えば、抗体）をコードする核酸配列を含む、核酸配列を運ぶ又は含むために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターには、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工染色体が含まれ、これらは、宿主細胞の染色体に安定的に組み込むことができる選択配列又はマーカーを含み得る。加えて、ベクターは、１つ又は２つ以上の選択可能マーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含み得る。含めることができる選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質又は毒素への耐性を提供し、補助栄養要求性の欠乏を補完し、又は培養液にない重要な栄養素を供給するものである。発現制御配列は、当該技術分野で周知である構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得る。２つ以上の核酸分子を共発現させる場合（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の両方、又は抗体ＶＨ及びＶＬ）、両方の核酸分子は、例えば、単一の発現ベクター又は別個の発現ベクターに挿入され得る。単一ベクターでの発現の場合、コード核酸は、１つの共通の発現制御配列に動作可能に連結されるか、又は１つの誘導性プロモーター及び１つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結され得る。宿主細胞への核酸分子の導入は、当該技術分野で周知である方法を使用して確認することができる。そのような方法としては、例えば、ノーザンブロット又はポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によるｍＲＮＡの増幅などの核酸分析、遺伝子産物の発現のための免疫ブロッティング、又は導入した核酸配列若しくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための好適な分析方法が挙げられる。当業者は、核酸分子が所望の産物を産生するのに十分な量で発現されることを理解しており、更に、当業者に周知である方法を使用して十分な発現を得るために発現レベルを最適化することができることを理解している。
本明細書で使用される「宿主」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）など動物を指す。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子をトランスフェクションされ得る特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的な子孫を指す。そのような細胞の子孫は、核酸分子で遺伝子導入された親細胞とは、宿主細胞ゲノムへの核酸分子の後続の生成又は集積において生じ得る、変異又は環境からの影響により、同一ではないことがある。
本明細書で使用される場合、「自己」という用語は、後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
「同種」は、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。
「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、外因性の核酸が宿主細胞に移送又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性の核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、又は形質導入された細胞である。その細胞は、対象の一次細胞及びその子孫を含む。
本明細書で使用される場合、「単離」又は「単離する」という用語は、組成物中の特定の物質のパーセンテージを増加させるプロセスを指す。例えば、あるタイプの細胞を細胞集団から単離することは、このタイプの細胞のパーセンテージが、元の細胞集団におけるこのタイプの細胞のパーセンテージと比較して増加する細胞集団を作製するプロセスを指す。したがって、「単離された」という用語は、あるタイプの細胞の文脈で使用される場合、単離された細胞集団がこのタイプの細胞を１００％含むことを意味するのではなく、単離プロセス後の細胞集団におけるこのタイプの細胞のパーセンテージが増加することを意味する。
本明細書で使用される「医薬的に許容される」という用語は、動物における使用について、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方、若しくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
「賦形剤」とは、液体又は固体の充填剤、希釈剤、溶媒、カプセル化材料などの、医薬的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを指す。賦形剤としては、例えば、吸収促進剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、拡張剤、充填剤、香味剤、湿潤剤、潤滑剤、香料、防腐剤、推進剤、放出剤、殺菌剤、甘味料、可溶化剤、湿潤剤及びこれらの混合物などのカプセル化材料又は添加剤が挙げられる。また、「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全又は不完全）又はビヒクルを指すことができる。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬的に許容される賦形剤である。医薬的に許容される賦形剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（例えば、約１０アミノ酸残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。医薬的に許容される賦形剤の他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．１９９０）に記載されている。
一実施形態では、各成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があるという意味で「医薬的に許容される」ものであり、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、免疫原性、又はその他の問題又は合併症がなく、妥当な利点／リスク比に見合って、ヒト及び動物の組織又は器官と接触して使用するために好適である。例えば、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．；Ｒｏｗｅら，Ｅｄｓ．；Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００９；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ ｅｄ．；Ａｓｈ ａｎｄ Ａｓｈ Ｅｄｓ．；Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｇｉｂｓｏｎ Ｅｄ．；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００９を参照されたい。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される賦形剤は、採用される用量及び濃度で、それにさらされる細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される賦形剤は、ｐＨ緩衝水溶液である。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの無菌液体であってもよい。水は、組成物（例えば、医薬組成物）が静脈内投与される場合の例示的な賦形剤である。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液用の液体賦形剤として採用され得る。賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども挙げることができる。必要に応じて、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を更に含み得る。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態を取り得る。製剤を含む経口組成物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な賦形剤を含み得る。
医薬化合物を含む組成物は、例えば、単離又は精製された形の結合分子（例えば、抗体）を、適切な量の賦形剤と共に含み得る。
本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分である、薬剤及び本明細書で提供される単一ドメイン抗体又は医薬組成物を含む、単一ドメイン抗体又は治療用分子の量を指す。
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、特定の実施形態では、対象は、非霊長類又は霊長類（例えば、ヒトなど）の哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、疾患又は障害と診断された哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患又は障害を発症するリスクのある哺乳動物、例えば、ヒトである。
「投与する」又は「投与」とは、本明細書に記載されているか、又は当該技術分野で知られている、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、及び／又は他の任意の物理的送達方法などによって、体外に存在する物質を患者に注射又は他の方法で物理的に送達する行為を指す。
本明細書で使用される場合、「治療／処置する」、「治療／処置」、及び「治療／処置すること」という用語は、１つ又は２つ以上の治療法を投与することによって生じる、疾患又は病態の進行、重症度、及び／又は持続期間の減少又は寛解を指す。治療は、患者がまだ基礎疾患に罹患している場合があるにもかかわらず、患者に改善が観察されるように、基礎疾患と関連する１つ又は２つ以上の症状の減少、軽減及び／又は緩和があったかどうかを評価することによって決定され得る。「治療／処置すること」という用語は、疾患の管理及び寛解の両方を含む。「管理する」、「管理すること」、及び「管理」という用語は、対象が治療から得られる有益な効果を指し、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない。
「予防する」、「予防している」、及び「予防」という用語は、疾患、障害、病態、又は関連する症状（例えば、糖尿病又は癌）の発症（又は再発）の可能性を低減することを指す。
「約」及び「おおよそ」という用語は、所与の値又は範囲の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、又はそれ未満を指す。
本開示及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形を含む。
実施形態が「含む」という用語で本明細書に記載される場合は常に、そうでなければ「からなる」及び／又は「から本質的になる」に関して記載される他の類似の実施形態もまた提供されることが理解される。実施形態が「から本質的になる」という語句で本明細書に記載される場合は常に、そうでなければ「からなる」に関して記載される類似の実施形態もまた提供されることも理解される。
「ＡとＢの間」又は「Ａ～Ｂの間」などの語句で使用される「間」という用語は、Ａ及びＢの両方を含む範囲を指す。
本明細書の「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢの両方、Ａ又はＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の各実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）を包含することを意図している。
５．２．インフルエンザＡウイルス特異的Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を産生するための方法
一態様では、インフルエンザＡウイルスに特異的なＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するか、又は濃縮するための方法が本明細書において提供される。いくつかの実施態様では、本明細書において提供される方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ヒトインフルエンザＡウイルスに由来するペプチドと接触させることを含む。
５．２．１．Ｔ細胞を含む細胞集団の取得
例示的なＴ細胞としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球が挙げられる。Ｔ細胞は、多数の供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓、又は哺乳動物の他の組織若しくは体液を含むがこれらに限定されない体液、組織又は臓器から収集、単離、精製、又は誘導される。他の態様では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、培養されたＴ細胞株から得られる。具体的な実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、末梢血リンパ球、Ｔ細胞の前駆細胞（例えば、造血幹細胞、リンパ球前駆細胞など）、又はそれらを含有する細胞集団である。具体的な実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは健康なドナーに由来する。ＰＢＭＣを収集及び調製する様々な方法が当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために適切な緩衝液又は培地中に細胞を配置し得る。いくつかの実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液では、カルシウムが欠如しており、マグネシウムが欠如し得るか、又は全てではないとしても多くの二価カチオンが欠如し得る。当業者が容易に理解するように、洗浄ステップは、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を製造業者の指示に従って使用することによってなど、当業者に公知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、Ｃａ２＋を含まず、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、又は緩衝液を含む若しくは含まない他の生理食塩水など様々な生体適合性緩衝液に再懸濁させ得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁させ得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって、又は向流遠心分離水簸によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団（ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など）は、陽性選択技術又は陰性選択技術によって更に単離され得る。
例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択のために十分な期間にわたって抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）共役ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなど）でインキュベートすることによって単離される。いくつかの実施形態では、この期間は、少なくとも０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、又は６時間である。いくつかの実施形態では、この期間は０．５～３６時間以上及びその間の全ての整数値の範囲である。いくつかの実施形態では、この時間は１～３６時間である。いくつかの実施形態では、この期間は２～３６時間である。いくつかの実施形態では、この期間は３～３６時間である。いくつかの実施形態では、この期間は４～３６時間である。いくつかの実施形態では、この期間は５～３６時間である。いくつかの実施形態では、この期間は６～２４時間である。いくつかの実施形態では、この期間は７～２４時間である。いくつかの実施形態では、この期間は８～２４時間である。いくつかの実施形態では、この期間は９～２４時間である。いくつかの実施形態では、この期間は１０～２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は０．５時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は２時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は３時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は５時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は６時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は７時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は８時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は９時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１０時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１１時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１２時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１３時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１５時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１６時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１７時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１８時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は１９時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は２０時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は２１時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は２２時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は２３時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は２４時間である。
他の細胞タイプと比較してＴ細胞が少ない任意の状況でＴ細胞を単離するためには、より長いインキュベーション時間が使用され得る。更に、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を増加させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、単純にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を短縮するか延長することによって、及び／又はＴ細胞に対するビーズの比を増減させることによって、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時又はプロセス中の他の時点で優先的に選択するか、又は選択しないことができる。更に、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比を増減させることによって、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時又は他の所望の時点で優先的に選択するか、又は選択しないことができる。当業者であれば、複数回の選択も使用可能であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、選択手順を実行し、本方法又はプロセスにおいて「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞はまた、更なる回数の選択を受ける。
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーを対象とする抗体の組み合わせを用いて達成することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。陽性選択又は陰性選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞の濃度及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）は様々であり得る。特定の実施形態では、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、１０００万細胞／ｍＬ～５０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、１５００万細胞／ｍＬ～４０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、２０００万細胞／ｍＬ～３０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、２５００万細胞／ｍＬ～２０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、３０００万細胞／ｍＬ～２０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、３５００万細胞／ｍＬ～２０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、４０００万細胞／ｍＬ～２０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、４５００万細胞／ｍＬ～２０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、細胞の濃度は、５０００万細胞／ｍＬ～２０億細胞／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、又は５０００万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。いくつかの実施形態では、５５００万、６０００万、６５００万、７０００万、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、又は１億細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。いくつかの実施形態では、１億細胞／ｍＬ超が使用される。いくつかの実施形態では、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。いくつかの実施形態では、１０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。いくつかの実施形態では、２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。高濃度を使用することは、増加した細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖をもたらし得る。更に、高細胞濃度の使用は、目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕捉を可能にし得る。いくつかの実施形態では、高濃度の細胞を使用することにより、通常はより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
いくつかの実施形態では、細胞は、様々な期間にわたって様々な速度、２～１０℃又は室温のいずれかにおいて回転装置上でインキュベートされ得る。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液に懸濁させ得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で公知であり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、又は１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン及び７．５％のＤＭＳＯ、若しくは３１．２５％のｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、及び７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、又は、例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することを含む。次いで、１°／分の速度で細胞を－８０℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相に貯蔵した。他の制御された凍結方法、並びに－２０℃で直ちに、又は液体窒素中での制御されない凍結を使用することができる。
いくつかの実施形態では、凍結保存細胞は、本明細書に記載のように解凍され、洗浄され、活性化の前に室温で１時間静置される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の増殖細胞が必要とされ得る前の期間における、対象からの血液試料又はアフェレーシス産物の収集が本開示において提供される。したがって、増殖される細胞の供給源は、必要となった任意の時点で収集され得、所望の細胞（Ｔ細胞など）は、Ｔ細胞療法から利益を得る任意の数の疾患又は病気（例えば、本明細書に記載の疾患又は病気）のためのＴ細胞療法で後に使用するために単離され、凍結され得る。一実施形態では、血液試料又はアフェレーシスは、概して健康な対象から採取される。特定の実施形態では、Ｔ細胞を増殖させ、凍結させ、後に使用することができる。
５．２．２．Ｍ１ペプチド刺激
一態様では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドを、本明細書で提供されるＴ細胞を含む細胞集団と接触させることによって、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するか、又は濃縮することを含む方法が本明細書において提供される。
いくつかの実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）である。
他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５７－６８（ＫＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴＶ（配列番号９））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５７－６７（ＫＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴ（配列番号１０））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５７－６６（ＫＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１１））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５８－６８（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴＶ（配列番号１２））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５８－６７（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴ（配列番号１３））である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、ある特定のＭ１ペプチド対細胞比で（例えば、１０３～１０１１個の細胞で１～１０μｇ／ｍＬのＭ１ペプチド）Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含む。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、約２．５×１０３個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、２．５×１０４個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、２．５×１０５個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、約２．５×１０６個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、２．５×１０７個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、２．５×１０８個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、約２．５×１０９個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。一実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、約２．５×１０１０個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、Ｔ細胞を含む細胞集団と特定の期間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１～２０日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と２～１８日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と３～１６日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と４～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と５～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と６～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と７～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と８～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と９～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１０～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１１～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１２～１４日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と２日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と３日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と４日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と５日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と６日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と７日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と８日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と９日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１０日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１１日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１２日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１３日間接触する。一実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１４日間接触する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、免疫刺激剤又は免疫調節剤を、Ｍ１ペプチドと接触させたＴ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む。いくつかの特定の実施形態では、免疫刺激剤又は免疫調節剤は、Ｔ細胞を刺激することができる。好ましい実施形態では、免疫刺激剤又は免疫調節剤はＩＬ－２である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＩＬ－２を、ある特定のＩＬ－２対細胞比、例えば、１０３～１０１１個の細胞で１００～２５０ ＩＵのＩＬ－２でＴ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０３個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０４個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０５個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０６個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０７個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０８個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０９個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、２．５×１０１０個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。
いくつかの態様では、本明細書において提供される方法は、ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と特定の期間接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１～２０日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と２～１８日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と３～１６日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と４～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と５～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と６～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と７～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と８～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と９～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１０～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１１～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１２～１４日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と２日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と３日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と４日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と５日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と６日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と７日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と８日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と９日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１０日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１１日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１２日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１３日間接触する。一実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１４日間接触する。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＴ細胞を含む細胞集団は、例えば、培養培地において、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２とエクスビボで接触する。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団を、エクスビボで、ある期間、例えば、５～２０日間培養することを含む。
他の実施形態では、本方法は、Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団を、エクスビボで、ある期間（例えば、５～１０日間）培養し、次いで、ＩＬ－２を含む培地において細胞集団を、エクスビボで、ある期間（例えば、更に５～１０日間）培養することを含む。
更に他の実施形態では、本方法は、Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団を、エクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む。例えば、細胞集団は、最初にＭ１ペプチドを含む培地においてエクスビボで、ある期間培養され、次いで、ＩＬ－２が培地にある期間添加される。次いで、細胞は洗浄され、ＩＬ－２を含む培地において再び培養される。特定の実施形態では、細胞集団は、最初に、ＩＬ－２が培地に添加される前に、Ｍ１ペプチドを含む培地においてエクスビボで１～３日間培養され、次いで、細胞集団は、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２の両方を含む培地においてエクスビボで１～７日間培養され、次いで、細胞が洗浄され、ＩＬ－２を含む培地において１～１０日間培養される。別の具体的な実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、以下の第７節に例示する方法を用いて培養される。
いくつかの実施形態では、特定のタイプの細胞の量は、当業者に公知の方法によって測定される。いくつかの実施形態では、特定のタイプの細胞の量は、フローサイトメトリー分析によって測定される。
いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の２～１０％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の３～８％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の４～６％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の４～５％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の５～６％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の５．５％である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも２０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも３０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも４０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも５０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも６０％増加させる他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも７０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも８０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも９０％増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも２倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも３倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも４倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも５倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも６倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも７倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも８倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも９倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１１倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１２倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１３倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１４倍増加させる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１５倍増加させる。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの２０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの３０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの４０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの５０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの６０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの７０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの８０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの９０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの２倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの３倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの４倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの５倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの６倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの７倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの８倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの９倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１１倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１２倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団由来のＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１３倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１４倍～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１５倍～２０倍増加させる。
図１に示すように、健康な個体の全ＰＢＭＣ中のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の約５．５％である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団の、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）及び／又はＩＬ－２との接触後、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージが増加する。
いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも１０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも１５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも２０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも２５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも３５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも４０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも５０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも５５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも７０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも７５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、Ｍ１ペプチドとの接触後のものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＩＬ－２との接触後のものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２との接触後のものである。
いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の１０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の１５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の２０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の２５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の３０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の３５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の４０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の４５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の５０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の５５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の６０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の６５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の７０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の７５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の８０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の８５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の９０％～９９％である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、Ｍ１ペプチドとの接触後のものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＩＬ－２との接触後のものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２との接触後のものである。
５．２．３．ＣＤ８陽性細胞の濃縮
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又はプロセスは、Ｍ１ペプチド刺激後にＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離すること又は濃縮することを含む。
特定の実施形態では、本方法は、最初にＣＤ８＋細胞を単離し、次いでＶβ１７陽性細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、本方法は、最初にＶβ１７陽性細胞を単離し、次いでＣＤ８＋細胞を単離することを含む。別の特定の実施形態では、本方法は、ＣＤ８＋細胞及びＶβ１７陽性細胞を同時に単離することを含む。
ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔ細胞の表面に発現する膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ８は、ＣＤ８α鎖及び／又はＣＤ８β鎖のいずれかで構成されるホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する。ＣＤ８は、抗原特異的活性化中にクラスＩ ＭＨＣ受容体と相互作用し、Ｔ細胞受容体媒介活性化に関与する。
ＣＤ８＋細胞を単離及び濃縮する方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、陽性選択又は陰性選択を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、抗ＣＤ８抗体で直接コーティングされた磁気ビーズを使用すること、又は抗ＣＤ８抗体を使用して細胞をコーティングし、次いでビーズを二次試薬でコーティングして抗体を結合することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、抗ＣＤ８抗体で直接コーティングされた磁性微粒子を使用すること、又は抗ＣＤ８抗体を使用して細胞をコーティングし、次いで磁性微粒子を二次試薬でコーティングして抗体を結合することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、抗ＣＤ８抗体で直接コーティングされた磁性ナノ粒子を使用すること、又は抗ＣＤ８抗体を使用して細胞をコーティングし、次いで磁性ナノ粒子を二次試薬でコーティングして抗体を結合することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、例えば、限定されないが、アルブミン、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ、メトリザミド、Ｐｅｒｃｏｌｌを使用して望ましくない細胞を除去する密度勾配遠心分離を含む。
他の実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、望ましくない細胞に結合する試薬を用いて細胞混合物をインキュベートすることによる陰性選択を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、ＣＤ８が表面発現する細胞を選択することによる陽性選択を含む。いくつかの具体的な実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、ＣＤ８＋細胞のＦＡＣＳ選別を含む。いくつかの他の具体的な実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、ＣＤ８鎖のいずれかを標的とする抗ＣＤ８抗体を使用することを含む。いくつかの具体的な実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、ＣＤ８に対する結合剤で固定化されたアフィニティーカラムを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する方法は、上記の方法のうちの２つ以上の組み合わせを含む。
いくつかのより具体的な実施態様では、ＣＤ８＋細胞を濃縮する、又は単離するための方法は、以下の第７節に記載のとおりである。
５．２．４．Ｖβ１７陽性細胞の濃縮
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＶβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、Ｖβ１７が表面発現する細胞を選択することを含む。いくつかの他の具体的な実施形態では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、抗Ｖβ１７抗体を使用することを含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、抗Ｖβ１７抗体で直接コーティングされた磁気ビーズを使用すること、又は抗Ｖβ１７抗体を使用して細胞をコーティングし、次いでビーズを二次試薬でコーティングして抗体を結合することを含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、抗Ｖβ１７抗体で直接コーティングされた磁性微粒子を使用すること、又は抗Ｖβ１７抗体を使用して細胞をコーティングし、次いで磁性微粒子を二次試薬でコーティングして抗体を結合することを含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、抗Ｖβ１７抗体で直接コーティングされた磁性ナノ粒子を使用すること、又は抗Ｖβ１７抗体を使用して細胞をコーティングし、次いで磁性ナノ粒子を二次試薬でコーティングして抗体を結合することを含む。いくつかの具体的な実施形態では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、Ｖβ１７陽性細胞のＦＡＣＳ選別を含む。いくつかの具体的な実施形態では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、Ｖβ１７に対して結合剤で固定化されたアフィニティーカラムを含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する方法は、上記の方法のうちの２つ以上の組み合わせを含む。
いくつかのより具体的な実施態様では、Ｖβ１７陽性細胞を濃縮する、又は単離するための方法は、以下の第７節に記載のとおりである。
５．２．５．濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
本明細書において提供される方法は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップを更に含む。
いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、サイトカインを細胞に添加するステップを含み、サイトカインとしては、レクチン、肝臓増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板増殖因子、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、インスリン様増殖因子－Ｉ、インスリン様増殖因子－ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－λ、マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＬＩＦ、ｋｉｔ－リガンド、ＦＬＴ－３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びＬＴ（リンホトキシン）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、細胞をフィーダー細胞と共培養するステップを含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、免疫抑制シグナルを阻害する薬剤を添加することを含む。具体的な実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、免疫チェックポイント阻害剤を含む。具体的な実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。具体的な実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含む。
５．３．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞
別の態様では、Ｔ細胞が本明細書において提供され、このＴ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、このＴ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドを結合することができる細胞表面受容体を発現する。
別の態様では、本明細書において提供される方法によって産生される、単離されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドを結合することができる細胞表面受容体（例えば、ＴＣＲ）を含む。
更に別の態様では、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の１０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の１５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の２０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の２５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の３０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の３５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の４０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の４５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の５０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の５５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の６０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の６５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の７０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の７５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の８０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の８５％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の９０％を超える。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の９５％を超える。
いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の６％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の１０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の１５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の２０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の２５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の３０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の３５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の４０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の４５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の５０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の５５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の６０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の６５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の７０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の７５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の８０％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の８５％～９９％である。いくつかの実施形態では、単離された細胞集団が本明細書において提供され、単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、単離された細胞集団の９０％～９９％である。
いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも一部は、Ｍ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体（例えば、ＴＣＲ）を発現する。
更に別の態様では、例えば、以下の第５．４節～第５．８節により詳細に記載するように同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のために本明細書において提供されるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用するための方法が本明細書において提供される。
５．４．キメラ抗原受容体を発現するインフルエンザＡウイルス特異的Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を産生するための方法
別の態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法が本明細書において提供され、本方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、上記の第５．２節及び第５．３節に記載の方法又はプロセスに従って産生される。
より具体的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための本方法のいくつかの実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドを、本明細書において提供されるＴ細胞を含む細胞集団と接触させることによって、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するか、又は濃縮することを含む。
Ｔ細胞集団は、多数の供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓、又は哺乳動物の他の組織若しくは体液を含むがこれらに限定されない体液、組織又は臓器から収集、単離、精製、又は誘導される。他の態様では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、培養されたＴ細胞株から得られる。具体的な実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、末梢血リンパ球、Ｔ細胞の前駆細胞（例えば、造血幹細胞、リンパ球前駆細胞など）、又はそれらを含有する細胞集団である。具体的な実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは健康なドナーに由来する。
いくつかの実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５７－６８（ＫＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴＶ（配列番号９））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５７－６７（ＫＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴ（配列番号１０））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５７－６６（ＫＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１１））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５８－６８（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴＶ（配列番号１２））である。他の実施形態では、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のマトリックスタンパク質からのペプチドは、ペプチド５８－６７（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴ（配列番号１３））である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、ある特定のＭ１ペプチド対細胞比で（例えば、１０３～１０１１個の細胞で１～１０μｇ／ｍＬのＭ１ペプチド）Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド対細胞比は、約２．５×１０３個の細胞、約２．５×１０４個の細胞、約２．５×１０５個の細胞、約２．５×１０６個の細胞、約２．５×１０７個の細胞、約２．５×１０８個の細胞、約２．５×１０９個の細胞、又は約２．５×１０１０個の細胞で１μｇ／ｍＬのＭ１ペプチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、Ｔ細胞を含む細胞集団と特定の期間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、又はそれ以上接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と２日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と２日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と３日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と５日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と６日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と７日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と８日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と９日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１０日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１１日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１２日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１３日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１～２０日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と２～１８日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と３～１６日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と４～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と５～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と６～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と７～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と８～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と９～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１０～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１１～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチドは、細胞と１２～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｍ１ペプチドと連続的にある期間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｍ１ペプチドとある期間接触し、次いで、細胞は、Ｍ１ペプチドなしで別の期間培養された後、細胞は、再びＭ１ペプチドと接触する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、免疫刺激剤又は免疫調節剤を、Ｍ１ペプチドと接触させたＴ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む。いくつかの特定の実施形態では、免疫刺激剤又は免疫調節剤は、Ｔ細胞を刺激することができる。好ましい実施形態では、免疫刺激剤又は免疫調節剤はＩＬ－２である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＩＬ－２を、ある特定のＩＬ－２対細胞比、例えば、１０３～１０１１個の細胞で１００～２５０ ＩＵのＩＬ－２でＴ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２対細胞比は、約２．５×１０３個の細胞、約２．５×１０４個の細胞、約２．５×１０５個の細胞、約２．５×１０６個の細胞、約２．５×１０７個の細胞、約２．５×１０８個の細胞、約２．５×１０９個の細胞、又は約２．５×１０１０個の細胞で２１０ ＩＵのＩＬ－２である。
いくつかの態様では、本明細書において提供される方法は、ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と特定の期間接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、又はそれ以上接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と１日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と２日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と２日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と３日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と４日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と５日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と６日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と７日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と８日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と９日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と１０日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と１１日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と１２日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と１３日間接触する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、細胞と１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１～２０日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と２～１８日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と３～１６日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と４～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と５～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と６～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と７～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と８～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と９～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１０～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１１～１４日間接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２と１２～１４日間接触する。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＴ細胞を含む細胞集団は、例えば、培養培地において、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２とエクスビボで接触する。いくつかの実施形態では、本方法は、 Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団を、エクスビボで、ある期間、例えば、５～２０日間培養することを含む。
他の実施形態では、本方法は、Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団を、エクスビボで、ある期間（例えば、５～１０日間）培養し、次いで、ＩＬ－２を含む培地において細胞集団を、エクスビボで、ある期間（例えば、更に５～１０日間）培養することを含む。
更に他の実施形態では、本方法は、Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団を、エクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む。例えば、細胞集団は、最初にＭ１ペプチドを含む培地においてエクスビボで、ある期間培養され、次いで、ＩＬ－２が培地にある期間添加される。次いで、細胞は洗浄され、ＩＬ－２を含む培地において再び培養される。特定の実施形態では、細胞集団は、最初に、ＩＬ－２が培地に添加される前に、Ｍ１ペプチドを含む培地においてエクスビボで１～３日間培養され、次いで、細胞集団は、Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２の両方を含む培地においてエクスビボで１～７日間培養され、次いで、細胞が洗浄され、ＩＬ－２を含む培地において１～１０日間培養される。別の具体的な実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団は、以下の第７節に例示する方法を用いて培養される。
いくつかの実施形態では、特定のタイプの細胞の量は、当業者に公知の方法によって測定される。いくつかの実施形態では、特定のタイプの細胞の量は、フローサイトメトリー分析によって測定される。
いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の２～１０％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の３～８％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の４～６％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の４～５％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の５～６％である。いくつかの実施形態では、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントは、ＣＤ８＋細胞の５．５％である。
いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、又はそれ以上増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも２０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも３０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも４０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも５０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも６０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも７０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも８０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも９０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも２倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも３倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも４倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも５倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも６倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも７倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも８倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも９倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１１倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１２倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１３倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１４倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１５倍増加させる。
いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの２０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの３０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの４０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの５０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの６０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの７０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの８０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの９０％～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの２～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの３～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの４～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの５～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの６～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの７～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの８～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの９～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１１～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１２～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１３～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１４～２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、Ｍ１刺激は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１５～２０倍増加させる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞集団の、ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）及び／又はＩＬ－２との接触後、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージが増加する。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又はそれ以上である。
いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の１０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の１５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の２０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の２５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の３０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の３５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の４０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の４５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の５０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の５５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の６０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の６５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の７０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の７５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の８０％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の８５％～９９％である。いくつかの実施形態では、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後のＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ８＋細胞の９０％～９９％である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又はプロセスは、Ｍ１ペプチド刺激後にＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離すること又は濃縮することを含む。特定の実施形態では、本方法は、最初にＣＤ８＋細胞を単離し、次いでＶβ１７陽性細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、本方法は、最初にＶβ１７陽性細胞を単離し、次いでＣＤ８＋細胞を単離することを含む。別の特定の実施形態では、本方法は、ＣＤ８＋細胞及びＶβ１７陽性細胞を同時に単離することを含む。
本明細書において提供される方法は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップを更に含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、サイトカインを細胞に添加するステップを含み、サイトカインとしては、レクチン、肝臓増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板増殖因子、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、インスリン様増殖因子－Ｉ、インスリン様増殖因子－ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－λ、マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＬＩＦ、ｋｉｔ－リガンド、ＦＬＴ－３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びＬＴ（リンホトキシン）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、細胞をフィーダー細胞と共培養するステップを含む。いくつかの実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、免疫抑制シグナルを阻害する薬剤を添加することを含む。具体的な実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、免疫チェックポイント阻害剤を含む。具体的な実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。具体的な実施形態では、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のステップは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含む。
５．４．１．キメラ抗原受容体
本明細書において提供される、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するための方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、（ａ）細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む。
シグナルペプチド
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（シグナル配列としても知られる）を含み得る。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に標的化するペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路に標的化し、エフェクター分子の脂質二重層への組み込み及び固定を可能にする。本明細書に記載のＣＡＲにおける使用に適合する、天然に存在するタンパク質のシグナル配列又は合成の、天然に存在しないシグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選択される分子に由来する。具体的な実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、単一特異性である。他の実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、多重特異性である。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインはペプチド結合を介して、又はペプチドリンカーを介して互いに直接融合される、２つ以上の光源結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗体又はそのフラグメントを含む。例えば、結合ドメインは、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長又はインタクトなモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ特異性又はモノエピトープ特異性を有する抗体、ポリクローナル抗体又は一価抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、及びそれらのフラグメント（例えば、ドメイン抗体）に由来し得る。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、及び／又は親和性成熟されたものであり、並びに他の種、例えば、マウス、ウサギ、ラマなどからの抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、特定の分子抗原に結合することができ、２つの同一の対のポリペプチド鎖で構成される、ポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含み、各対は、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）及び１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約１００～約１３０以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）、及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９７）を参照されたい。また、抗体としては、合成抗体、組み換え産生抗体、ラクダ科種（例えば、ラマやアルパカ）由来などの単一ドメイン抗体又はそれらのヒト化変異体、体内抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかの機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、フラグメントの由来となった抗体の結合活性の一部又は全部を保持する抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの部分を指す。機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）の非限定的な例としては、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原に結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ又は２つ以上のＣＤＲ）を含む抗原結合ドメイン又は分子を含む。そのような抗体フラグメントは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５；ａｎｄ Ｄａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ ｅｄ．１９９０）に見出すことができる。本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもなくアンタゴニストでもなくてもよい。
具体的な実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）を含む。ＳｃＦｖは、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
別の具体的な実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。ｓｄＡｂは、同じ又は異なる起源のものであり得、同じ又は異なるサイズのものであり得る。例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみ抗体（例えば、ＶＨＨ又はＶＮＡＲ）由来の重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（ＶＨ又はＶＬなど）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウス又はラットによって産生されるヒト単一ドメイン抗体、並びに抗体に由来するもの以外の遺伝子操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野において公知の、又は本開示において上述した単一ドメイン抗体など本開示によって開発される任意のｓｄＡｂを使用して、本明細書に記載のＣＡＲを構築することができる。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシなどが挙げられるが、これらに限定されない任意の種に由来し得る。本明細書において企図される単一ドメイン抗体はまた、ラクダ科及びサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖抗体（本明細書では「重鎖のみ抗体」とも呼ばれる）として公知の、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。かかる単一ドメイン分子は、例えば、国際公開第９４／０４６７８号及びＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）に開示されている。明確にするために、軽鎖を天然に欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、本明細書ではＶＨＨとして知られている。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで育った抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖分子を産生することができ、かかるＶＨＨは本開示の範囲内である。加えて、ＶＨＨのヒト化バージョン並びに他の修飾及び変異体も企図され、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚類に見出される免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清中に見出される新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を産生する方法は、国際公開第０３／０１４１６１号及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２９０１－２９０９（２００５）に記載されている。
いくつかの実施形態では、特定の抗原又は標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科ＶＨＨ配列の（ナイーブ又は免疫）ライブラリから得ることができる。かかる方法は、当該分野で公知の１つ以上のスクリーニング技術を使用して、当該抗原若しくは標的、又はその少なくとも１つの部分、フラグメント、抗原決定基若しくはそのエピトープを使用して、かかるライブラリをスクリーニングすることを含んでも含まなくてもよい。かかるライブラリ及び技術は、例えば、国際公開第９９／３７６８１号、同第０１／９０１９０号、同第０３／０２５０２０号、及び同第０３／０３５６９４号に記載されている。あるいは、例えば、国際公開第００／４３５０７号に記載されているように、ランダム変異誘発及び／又はＣＤＲシャッフリングなどの技術によって（ナイーブ又は免疫）ＶＨＨライブラリから得られたＶＨＨライブラリなど（ナイーブ又は免疫）ＶＨＨライブラリに由来する改善された合成又は半合成ライブラリが使用され得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組み換え、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／又はインビトロ生成される（例えば、ファージディスプレイによって選択される）。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」によって変更され得る。ラクダ化は、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置において生ずる、アミノ酸残基の１つ以上による、従来の４本鎖抗体由来の（天然に存在する）ＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基の置き換え又は置換を指す。これは、当該分野で公知の方法で行われ得、このことは、当業者に明らかであろう。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、本明細書で定義するように、ＶＨ－ＶＬ界面、及び／又はいわゆるラクダ科のホールマーク残基を形成する、及び／又はそこに存在するアミノ酸位置において挿入される（例えば、国際公開第９４／０４６７８号、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３９：２８５－２９０（１９９４）；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（６）：５３１－５３７（１９９６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７－９６９（１９９６）；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５－３８（１９９９）を参照）。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウス又はラットによって産生されるヒト単一ドメイン抗体である。例えば、米国特許出願公開第２００９０３０７７８７号、米国特許第８，７５４，２８７号、米国特許出願公開第２０１５０２８９４８９号、同第２０１００１２２３５８号、及び国際公開第２００４０４９７９４号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、従来の４本鎖抗体から生成される。例えば、欧州特許第０ ３６８ ６８４号；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１（６２４２）：５４４－６（１９８９）；Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（１１）：４８４－４９０（２００３）；国際公開第０６／０３０２２０号、及び同第０６／００３３８８号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインはヒト化抗体又はそのフラグメントを含む。ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域及びヒト定常領域の配列を含み得る。
ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング又はリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号、同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４；及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３）、チェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、及び例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、同第５，７６６，８８６号、国際公開第９３／１７１０５号、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９ ２５（２００２），Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０（２０００），Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７ ７９（２０００），Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８－８４ （１９９７），Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５ ９０４（１９９６），Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ（１９９５），Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（８）：１７１７－２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ，Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０（１９９４），ａｎｄ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９－７３（１９９４）を含むが、これらに限定されない、当該分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。米国特許出願公開第２００５／００４２６６４（Ａ１）号（２００５年２月２４日）も参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、当該技術分野では知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「インポート」残基と称され、典型的には、「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３－２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９：１５３４－３６）の方法に従い、超可変領域の配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施することができる。
場合によっては、ヒト化抗体は、親非ヒト抗体（例えば、齧歯動物）の６つのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体フレームワークへとグラフトする、ＣＤＲグラフティングにより構築される。例えば、Ｐａｄｌａｎらは、ＣＤＲの残基の約３分の１だけが実際に抗原と接触することを決定し、これらを「特異性決定残基」又はＳＤＲと呼んだ（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３３９）。ＳＤＲグラフト化の技術では、ＳＤＲ残基のみが、ヒト抗体フレームワークにグラフト化される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５３４を参照）。
ヒト化抗体を作るのに使用される、ヒト可変ドメインの、軽鎖及び重鎖の両方の選択は、抗原性を低減するのに重要であり得る。例えば、いわゆる「ベストフィット」方法に従い、非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリの全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のヒト配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒト骨格として選択され得る（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６３０８、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１１７）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５８９、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３－３２）。場合によっては、フレームワークは、最も存在量が多いヒトサブクラスであるＶＬ６亜群Ｉ（ＶＬ６Ｉ）及びＶＨ亜群ＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖細胞系列遺伝子をフレームワーク領域の供給源として使用する。
スーパーヒト化と呼ばれるＣＤＲの比較に基づいた代替パラダイムでは、ＦＲの相同性は関係ない。この方法は、非ヒト配列及び機能的ヒト生殖細胞系列遺伝子レパートリを比較することからなる。次いで、マウス配列と同じ又は密接に関連した標準構造をコードする遺伝子が選択される。次に、非ヒト抗体と標準構造を共有する遺伝子のうち、ＣＤＲ内の相同性が最も高い遺伝子をＦＲドナーとして選択する。最後に、非ヒトＣＤＲをこれらのフレームワークにグラフト化する（例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９－２５を参照）。
更に、抗体は、抗原に対する親和性及びその他の好ましい生物学的特性を保持したままヒト化されることが概ね望ましい。この目標を達成するために、ある方法によれば、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念のヒト化産物を分析するプロセスによって、ヒト化抗体を調製する。三次元の免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された免疫グロブリン配列候補について確率の高い三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらには、例えば、ＷＡＭ（Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ ａｎｄ Ｒｅｅｓ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：８１９－２４）、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９－８１５）、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，１９９７，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４－２３）が挙げられる。これらの表示について精査することにより、免疫グロブリン配列候補の機能において残基が示す可能性の高い働きの分析、例えば、免疫グロブリン候補が、その抗原結合能に影響を及ぼす残基についての分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、所望の抗体特性が達成されるように、レシピエント配列及びインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組み合わせることができる。概して、超可変領域残基は、抗原結合に直接的に、ほとんど実質的に関与する。
抗体のヒト化の別の方法は、Ｈｕｍａｎ Ｓｔｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｅｎｔ（ＨＳＣ）と呼ばれる抗体のヒト性の測定基準に基づいている。この方法では、マウスの配列とヒト生殖細胞系列遺伝子のレパートリを比較し、その違いをＨＳＣとしてスコアリングする。次いで、標的配列は、全体的な同一性測定を使用して多様なヒト化変異体を生成するのではなく、そのＨＳＣを最大化することによってヒト化される（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１９８６－９８）。
上記の方法に加えて、経験的な方法を用いてヒト化抗体を生成及び選択することができる。これらの方法には、ヒト化変異体の大規模なライブラリを生成し、濃縮技術又はハイスループットスクリーニング技術を使用する最適なクローンの選択に基づく方法がある。抗体変異体は、ファージ、リボソーム、及び酵母ディスプレイライブラリから、並びに細菌コロニースクリーニングによって、単離することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５－１６；Ｄｕｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：５２３－２９；Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３－７０；及びＳｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：８４７－６０を参照）。
ＦＲライブラリアプローチでは、ＦＲの特定の位置に複数の残基変異体を導入した後、ライブラリをスクリーニングして、グラフトされたＣＤＲを最もよくサポートするＦＲを選択する。置換される残基は、ＣＤＲ構造に潜在的に寄与すると同定された「バーニア」残基の一部又は全て（例えば、Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７９９を参照）、又はＢａｃａ ｅｔ ａｌ（１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ。２７２：１０６７８－８４）によって同定された、より限定された標的残基のセットからのものを含み得る。
ＦＲシャフリングでは、全ＦＲを、選択された残基変異体のコンビナトリアルライブラリを創出するのではなく、非ヒトＣＤＲと組み合わせる（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，３６：４３－６０を参照）。ライブラリは、結合について、まず、ＶＬをヒト化するのに続き、ＶＨをヒト化する、２ステッププロセスでスクリーニングすることができる。代替的に、１ステップのＦＲシャフリングプロセスを使用することができる。かかるプロセスは、得られた抗体が、発現の増強、親和性の増大、及び熱的安定性を含む、生化学的特性及び物理化学的特性の改善を呈したので、２ステップスクリーニングより効率的であることが示されている（例えば、Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：３０４９－６０を参照）。
「ヒューマニアリング」方法は、必須の最小特異性決定基（minimum specificity determinant、ＭＳＤ）の実験的同定に基づくものであり、非ヒトフラグメントをヒトＦＲライブラリに順次置き換えし、結合を評価することに基づいている。ヒューマニアリング方法は、非ヒトＶＨ鎖及び非ヒトＶＬ鎖のＣＤＲ３の領域で始まり、ＶＨ及びＶＬの両方の、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む、非ヒト抗体の他の領域を、ヒトＦＲへと徐々に置き換える。この手法により、典型的には、エピトープを保持し、ヒトＶセグメントのＣＤＲが明確に異なる複数のサブクラスの抗体を同定する。ヒューマニアリングは、ヒト生殖細胞系列遺伝子抗体に９１～９６％相同な抗体の単離を可能とする（例えば、Ａｌｆｅｎｉｔｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｔｈｉｒｄ Ａｎｎｕａｌ ＰＥＧＳ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｕｍｍｉｔ，２００７を参照）。
「ヒト操作」方法は、ヒトにおける免疫原性を低減する一方で、元の非ヒト抗体の所望の結合特性を保持する修飾抗体を産生するように、抗体のアミノ酸配列へと特異的変化を施すことにより、マウス抗体又はキメラ抗体若しくは抗体フラグメントなどの非ヒト抗体又は抗体フラグメントを変更することを伴う。一般に、技法は、非ヒト（例えば、マウス）抗体のアミノ酸残基を、「低リスク」残基、「中程度のリスク」残基、又は「高リスク」残基として分類することを伴う。分類は、特定の置換を施すことの予測される利益（例えば、ヒトにおける免疫原性のための）を、結果として得られる抗体のフォールディングに置換が影響を及ぼすリスクに対して査定する、グローバルなリスク／有益性の計算を使用して実施する。非ヒト（例えば、マウス）抗体配列の、所与の位置（例えば、低リスク又は中程度のリスク）において置換される、特定のヒトアミノ酸残基は、非ヒト抗体の可変領域に由来するアミノ酸配列を、特異的又はコンセンサスヒト抗体配列の対応する領域とアライメントすることにより選択することができる。非ヒト配列の低リスク又は中リスクの位置にあるアミノ酸残基は、アライメントに応じてヒト抗体配列の対応する残基に置き換えることができる。ヒト操作タンパク質を作製するための技術は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５１４；米国特許第５，７６６，８８６号；同第５，７７０，１９６号；同第５，８２１，１２３号；及び同第５，８６９，６１９号；並びに国際公開第９３／１１７９４号に詳しく記載されている。
複合ヒト抗体は、例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）テクノロジ（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して生成することができる。複合ヒト抗体を生成するためには、複数のヒト抗体可変領域配列のフラグメントから、Ｔ細胞エピトープを回避する方法で可変領域配列を設計することで、得られる抗体の免疫原性を最小限に抑える。そのような抗体は、ヒト定常領域配列、例えば、ヒト軽鎖定常領域及び／又はヒト重鎖定常領域を含み得る。
脱免疫抗体は、Ｔ細胞エピトープが除去された抗体である。脱免疫抗体を作製する方法が記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５２５：４０５２３、ｘｉｖ，ａｎｄ Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４４：１４８－１５３（２００６））を参照されたい。脱免疫抗体は、Ｔ細胞エピトープ枯渇可変領域及びヒト定常領域を含む。略述すると、抗体のＶＨ及びＶＬをクローニングし、その後、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、抗体のＶＨ及びＶＬに由来する重複ペプチドを調べることにより、Ｔ細胞エピトープを同定する。Ｔ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを同定するためのインシリコの方法によって同定される。変異は、ヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を無効にするためにＶＨ及びＶＬに導入される。次いで、ＶＨ及びＶＬを利用して、脱免疫化抗体を生成する。
特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、複数の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは多重特異性抗体又はそのフラグメントを含む。他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは多価抗体又はそのフラグメントを含む。「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープの抗原結合タンパク質の選択的認識を指す。本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質が、２つ以上の抗原結合部位を有し、それらの少なくとも２つが異なる抗原を結合することを表す。本明細書で使用される「価」という用語は、抗原結合タンパク質中の特定の数の結合部位の存在を示す。完全長抗体は２つの結合部位を有し、二価である。したがって、「三価」、「四価」、「五価」及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質中にそれぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを示す。
二重特異性抗体など多重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体である。多重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの共発現による（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－４０を参照）。多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の生成の更なる詳細については、例えば、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｄ．，２０１１）を参照されたい。
本開示の抗体は、２つ以上の抗原結合部位を伴う多価抗体（例えば、四価抗体）の場合があり、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現により容易に産生することができる。特定の実施形態では、多価抗体は、例えば、３つ～約８つの抗原結合部位を含む（又はこれらからなる）。そのような一実施形態では、多価抗体は、４つの抗原結合部位を含む（又はこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃを含み得、配列中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは、０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ－ＣＨ１－可撓性リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含み得る。本明細書の多価抗体は、例えば、約２つ～約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書で企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、ＣＬドメインを更に含む。
本発明のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに複数の結合ドメインが存在する場合。種々のドメインは、ペプチドリンカーを介して互いに融合し得る。いくつかの実施形態では、ドメインは、いかなるペプチドリンカーもなく互いに直接融合している。ペプチドリンカーは、同じであっても異なってもよい。各ペプチドリンカーは、様々なドメインの構造的特徴及び／又は機能的特徴に応じて、同じ又は異なる長さ及び／又は配列を有し得る。各ペプチドリンカーは、独立して選択され、最適化され得る。ＣＡＲにおいて使用されるペプチドリンカーの長さ、柔軟性、及び／又は他の特性は、１つ以上の特定の抗原又はエピトープに対する親和性、特異性、又は親和力を含むがこれらに限定されない特性にいくらかの影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動するように、柔軟性残基（グリシン及びセリンなど）を含む。例えば、グリシン－セリンダブレットは、適切なペプチドリンカーであり得る。
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列を有し得る。例えば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域からの配列をリンカーとして使用することができる。例えば、国際公開第１９９６／３４１０３号を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、柔軟性リンカーである。例示的な柔軟性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎなどであり、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野で公知の他の柔軟性リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、国際公開第２０１６０１４７８９号、同第２０１５１５８６７１号、同第２０１６１０２９６５号、米国特許出願公開第２０１５０２９９３１７号、国際公開第２０１８０６７９９２号、米国特許７７４１４６５号、Ｃｏｌｃｈｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１９１－１１９７（１９９０）、及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）に記載されている当技術分野で公知の他のリンカーはまた、本明細書において提供されるＣＡＲに含まれ得、これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲにおいて提供される細胞外抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識する。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。腫瘍は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答の標的抗原として機能し得る、多数のタンパク質を発現する。ＣＡＲによって標的化される抗原は、単一の罹患細胞上の抗原であり得るか、又はそれぞれが疾患に寄与する、異なる細胞上で発現する抗原であり得る。ＣＡＲによって標的化される抗原は、疾患に直接的又は間接的に関与し得る。
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発することができる腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。例示的な腫瘍抗原としては、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、並びにメソテリンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能し得る、多数のタンパク質を発現する。これらの分子としては、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ及びｇｐ１００など組織特異的抗原、並びに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２など形質転換関連分子の群に属する。標的抗原の更に別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）など腫瘍胎児抗原である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞には存在しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下で正常細胞上でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟であり、応答することができない胎児発生期間に正常細胞上に発現する抗原であり得るか、又はそれらは、正常細胞上に非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上にはるかに高いレベルで発現する抗原であり得る。
ＴＳＡ又はＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２など分化抗原、及びＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５など腫瘍特異的多系統抗原；ＣＥＡなど過剰発現した胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕなど過剰発現した癌遺伝子及び変異した腫瘍抑制遺伝子；染色体転座から生じた固有の腫瘍抗原；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなど；並びにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。
他の大きなタンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭＡ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ１、ＲＣＡＳ １、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
いくつかのより具体的な実施形態では、抗原は、ＣＤ１２３である。具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、ＣＤ１２３を結合し、配列番号３のアミノ酸配列を含むことができるｓｃＦｖを含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。
他のより具体的な実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、ＰＳＭＡを結合し、配列番号４のアミノ酸配列を含むことができるｓｃＦｖを含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。
ヒンジ領域
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、概してタンパク質の２つのドメインの間に見出されるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の柔軟性及びドメインの一方又は両方の互いに対する移動を可能にし得る。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する細胞外抗原結合ドメインのかかる柔軟性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体）のヒンジドメインはまた、本明細書に記載のｐＨ依存性キメラ受容体系における使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を連結するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは抗体のヒンジドメインであり、抗体のヒンジドメインと、抗体の１つ以上の定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体のＣＨ３定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域と、ＣＨ２及びＣＨ３定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域と、ＣＨ３定常領域と、を含む。
天然に存在しないペプチドはまた、本明細書に記載のキメラ受容体のヒンジドメインとして使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、（ＧｘＳ）ｎリンカーなどペプチドリンカーであり、ｘ及びｎは独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上など３～１２の整数であり得る。
ヒンジドメインは、約１０～１００個のアミノ酸、例えば約１５～７５個のアミノ酸、２０～５０個のアミノ酸、又は３０～６０個のアミノ酸のうちのいずれか１つを含有し得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、又は７５のアミノ酸の長さのうちのいずれか１つである。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当該分野で公知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体での使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に柔軟性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの約１５～１００個（例えば、２０、２５、３０、３５、又は４０個）の連続するアミノ酸を含有するフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのヒンジドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインに直接的又は間接的に融合し得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然又は合成の供給源のいずれか一方に由来し得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜において熱力学的に安定である任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の、天然には存在しないタンパク質セグメント（例えば、細胞膜において熱力学的に安定である疎水性タンパク質セグメント）であり得る。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、αヘリックス、２つ以上のαヘリックスの複合体、βバレル、又は細胞のリン脂質二重層にまたがることができる任意の他の安定な構造を形成し得る。更に、膜貫通ドメインはまた、又は代替的に、膜貫通ドメイントポロジー（膜貫通ドメインが膜を通過する回数及びタンパク質の向きなど）に基づいて分類され得る。例えば、シングルパス膜タンパク質は細胞膜を１回横断し、マルチパス膜タンパク質は細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７回又はそれ以上）横断する。膜タンパク質は、細胞の内側及び外側に対するそれらの末端及び膜貫通セグメントのトポロジーに依存して、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型として定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在する向きである。ＩＩ膜タンパク質はまた、単一の膜貫通領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在する向きである。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数並びにＮ末端及びＣ末端の位置に基づいて更に下位分類され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型シングルパス膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、マルチパス膜タンパク質由来の膜貫通ドメインはまた、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合し得る。マルチパス膜タンパク質は、複合（少なくとも２、３、４、５、６、７又はそれ以上）αヘリックス又はβシート構造を含み得る。いくつかの実施形態では、マルチパス膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在する（例えば、タンパク質のＮ末端は脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は細胞外側に存在する）。
本明細書に記載のＣＡＲで使用する膜貫通ドメインはまた、合成の、天然に存在しないタンパク質セグメントの少なくとも一部を含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の、天然に存在しないαヘリックス又はβシートである。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、約１５～１００個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０個のアミノ酸、例えば、少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、又はそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第７，０５２，９０６号及び国際公開第２０００／０３２７７６号に記載されており、これらの関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において提供される膜貫通ドメインは、膜貫通領域と、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する細胞質領域と、を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３個以上のアミノ酸を含み得、いくつかの実施形態では、脂質二重層内の膜貫通ドメインの方向付けを助ける。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正電荷を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニン、セリン、及びリジンを含む。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、膜貫通ドメインのＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ほぼ疎水性のアミノ酸残基、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はバリンを含む。いくつかの実施形態では、組織領域は、疎水性である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ポリ－ロイシン－アラニン配列を含む。タンパク質又はタンパク質セグメントのハイドロパシー、すなわち、疎水性又は親水性の特徴は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー分析）によって評価され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤＩ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦＩ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤＩ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤＩ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃから選択される膜貫通ドメインを含む。
いくつかの具体的な実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤ８αの膜貫通ドメインである。
細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書において提供されるＣＡＲ内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であってもよい。したがって、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に対して特殊機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞質シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインが使用され得る範囲内で、かかる切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷鎖の代わりに使用され得る。このように、細胞質シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の主要な細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の主要な細胞内シグナル伝達ドメインから本質的になる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「主要な細胞内シグナル伝達ドメイン」は、免疫エフェクター機能を誘導するように刺激的に作用する細胞質シグナル伝達配列を指す。いくつかの実施形態では、主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわちＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有する。本明細書で使用される「ＩＴＡＭ」は、多くの免疫細胞内で発現するシグナル伝達分子のテール部分に概して存在する、保存タンパク質モチーフである。このモチーフは、保存モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉを産生する、６～８個のアミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの反復を含み得る（各ｘは独立して任意のアミノ酸である）。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、シグナル伝達分子の活性化に続くＩＴＡＭ内のチロシン残基のリン酸化によって少なくともある程度媒介される、細胞内でのシグナル伝達にとって重要である。ＩＴＡＭはまた、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位として機能し得る。例示的なＩＴＡＭを含有する主要な細胞質シグナル伝達配列としては、ＣＤ３ｚ、ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲｉｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３Δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインからなる。いくつかの実施形態では、主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ｚの主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
共刺激シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内のシグナル伝達を媒介してエフェクター機能など免疫応答を誘導するタンパク質の少なくとも一部分を指す。多くの免疫エフェクター細胞は、細胞の増殖、分化、及び生存を促進するため、並びに細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺激を必要とする。
本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを伝達し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球など免疫細胞によって媒介される応答を調節する共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、免疫細胞による共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖及び生存を媒介する免疫細胞（Ｔ細胞など）上での同族結合パートナーを指す。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上（約２、３、４、又はそれ以上のいずれかなど）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上の同一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の任意の２つ以上の共刺激タンパク質など、異なる共刺激タンパク質に由来する２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、主要な細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメイン）及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び主要な細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインなど）は、任意のペプチドリンカーを介して互いに融合する。主要な細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の適切な順序で配置され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと主要な細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインなど）との間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、相加的又は相乗的刺激効果を提供し得る。
宿主細胞（例えば、免疫細胞）での共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生及び分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、並びに／又は細胞傷害性を増減させるように細胞を誘導し得る。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプは、エフェクター分子が発現するであろう免疫エフェクター細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球））及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ効果）などの因子に基づいて選択される。ＣＡＲで使用する共刺激シグナル伝達ドメインの例は、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；並びに任意の他の共刺激分子（ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、Ｄｅｃｔｉｎ－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、及びＮＫＧ２Ｃ）を含むがこれらに限定されない共刺激タンパク質の細胞質信号伝達ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（すなわち、４－１ＢＢ）に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤｚの細胞質シグナル伝達ドメイン及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができるように、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかの変異体である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して、最大１０個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は８個）のアミノ酸残基変異体を含む。１個以上のアミノ酸変異体を含む、かかる共刺激シグナル伝達ドメインは、変異体と称され得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の増加及び免疫応答の刺激の増強をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。
例示的なＣＡＲ
例示的な多重特異性ＣＡＲは、以下の第７節に示すように生成される。
具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、配列番号２のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド、ＣＤ１２３を結合し、配列番号３のアミノ酸配列を含む、ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ｚに由来する主要な細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、配列番号２のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド、ＰＳＭＡを結合し、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ｚに由来する主要な細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、以下の第７節に例示するＣＡＲのいずれか１つに対して特定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する細胞外ドメインを含むか、又はそれからなるＣＡＲが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する細胞外ドメインを含むか、又はそれからなるＣＡＲが本明細書において提供される。
２つの配列（例えば、アミノ酸配列又は核酸配列）間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４ ２２６８（１９９０），ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３ ５８７７（１９９３）である。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムのパラメータを、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定して実行し、本明細書に記載された核酸分子に相同なヌクレオチド配列を取得することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムのパラメータを、例えば、スコア５０、ワード長＝３に設定して実行し、本明細書に記載されたタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を取得することができる。比較目的でギャップありアラインメントを取得するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ３４０２（１９９７）に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。代替的に、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを使って、分子間の離れた関係を検出する反復検索を行うこともできる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる（例えば、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を参照）。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７（１９９８）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのアミノ酸配列の修飾が企図される。例えば、細胞外ドメインの結合親和性及び／又は他の生物学的特性（特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低下、又は溶解性を含むがこれらに限定されない）を最適化することが望ましい場合がある。したがって、本明細書に記載の細胞外ドメインに加えて、本明細書に記載のドメインの変異体が調製され得ることが企図される。例えば、ｓｃＦｖ変異体は、適切なヌクレオチド変化を、コードするＤＮＡに導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製することができる。アミノ酸が変化することを理解している当業者であれば、抗体の翻訳後のプロセスを変更することができる。
変形は、ポリペプチドをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失、又は挿入であって、天然配列の抗体又はポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を結果としてもたらす、置換、欠失、又は挿入であり得る。置換変異誘発の対象部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。
アミノ酸置換は、ロイシンのセリンによる置き換え、例えば、保存的アミノ酸の置き換えなど、あるアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えた結果であり得る。当業者に知られている標準的な技術を使用して、例えば、部位特異的変異誘発及びアミノ酸置換をもたらすＰＣＲ媒介変異誘発を含む、本明細書において提供される分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。挿入又は欠失は、任意選択的に、約１～５のアミノ酸の範囲であり得る。特定の実施形態では、置換、欠失、又は挿入は、元の分子と比較して、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、又は２未満のアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態では、置換は、１つ又は２つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換である。許容される変形は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を体系的に行い、得られた変異体を親抗体によって示される活性について試験することによって決定され得る。
保存的アミノ酸置換によって生成された抗体は、本開示に含まれる。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる。上述したように、当該技術分野では、類似した電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。代替的に、飽和変異誘発などにより、コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに変異を導入することができ、得られた突然変異体の生物活性をスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することもできる。変異誘発の後、コードされたタンパク質を発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。保存的（例えば、同様な特性及び／又は側鎖による、アミノ酸群内の）置換は、特性を維持するか、又は特性を著明に変化させないように施すことができる。
アミノ酸は、以下に挙げるその側鎖の特性の類似性に応じてグループ化することができる（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３－７５（２ｄ ｅｄ．１９７５）参照）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；及び（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。代替的に、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられることもある：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。例えば、抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、例えば、アラニンやセリンなど別のアミノ酸で置換することもできる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴うことになる。
置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。概して、更なる研究のために選択された、得られた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）における修飾（例えば、改善）を有し、及び／又は親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有することになる。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、（例えば、本明細書に記載される技術などファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して）好都合に生成され得る。簡潔には、１つ以上のＣＤＲ残基が変異し、変異体抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変化（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するためにＣＤＲで行われ得る。かかる変化は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を起こすコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）で行われ得、得られた変異抗体又はそのフラグメントは、結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定変異誘発）のいずれかによって、成熟用に選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、ライブラリがスクリーニングされて、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６の残基）がランダム化される、ＣＤＲ指向アプローチを伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定され得る。
いくつかの実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、かかる変化が抗原を結合する抗体の能力を著しく低減しない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を著しく低下させない保存的変化（例えば、本明細書において提供される保存的置換）は、ＣＤＲで行われ得る。いくつかの実施形態では、各ＣＤＲは、不変であるか、又は１つ、２つ、若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
変異誘発のために標的化され得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）に記載されるように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなど荷電残基）を同定し、中性又は負荷電アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に更なる置換を導入し得る。
代替的に、又は追加的に、抗体と抗原との接触点を同定するための抗原抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的化又は排除され得る。変異体は、それらが所望の特性を含むか否かを判定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列の挿入には、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端の、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）又は抗体の血清半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。
変形は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発など、当該技術分野で知られている方法を用いて行うことができる。部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２３７：１－７（１９８６）；及びＺｏｌｌｅｒｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７－５００（１９８２）を参照）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４：３１５－２３（１９８５）を参照）、又は他の公知の技術を、クローニングされたＤＮＡに実施して、抗体変異体ＤＮＡを産生することができる。
５．４．２．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが挙げられ、これは、二本鎖又は一本鎖であり得、一本鎖の場合は、コード鎖又非コード（アンチセンス）鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの形態である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは合成ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、本明細書において提供されるＣＤ１２３結合ＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、本明細書において提供されるＰＳＭＡ結合ＣＡＲをコードする。
本開示は更に、本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体に関し、変異体は、例えば、本開示の抗体又はＣＡＲのフラグメント、類似体、及び／又は誘導体をコードする。特定の実施形態では、本開示は、本明細書のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、及びいくつかの実施形態では、少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用するとき、「参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という語句は、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに最大５個の点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味することを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列のヌクレオチドのうち最大５％が、欠失若しくは別のヌクレオチドで置換され得るか、又は参照配列の全ヌクレオチドのうち最大５％の数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’の末端位置、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で起こり得、参照配列のヌクレオチド間で個別に、又は参照配列内の１つ以上の隣接グループに散在する。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又はその両方に変化を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失をもたらす変化を含むが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を変化させない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、（遺伝子コードの縮重により）ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないサイレント置換を含む。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由のため、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するため（すなわち、ヒトのｍＲＮＡのコドンを大腸菌などの細菌宿主が好むものに変更する）、産生することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、配列の非コード領域又はコード領域における少なくとも１つのサイレント変異を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされたポリペプチドの発現（又は発現レベル）を調節又は変更するために産生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされたポリペプチドの発現を増加させるために産生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされたポリペプチドの発現を減少させるために産生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が増加している。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が減少している。
５．４．３．ベクター
また、本明細書に記載されている核酸分子を含むベクターも提供される。一実施形態では、核酸分子を組み換え発現ベクターに組み込むことができる。
本開示は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つをクローニング及び発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞などの真核細胞における複製及び組み込みに適している。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。
多くのウイルスベースのシステムが、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利なプラットフォームを提供する。異種核酸は、当該分野で公知の技術を使用して、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組み換えウイルスが単離され、インビトロ又はエクスビボで遺伝子操作された哺乳動物細胞に送達され得る。多数の異なるレトロウイルス系が、当該技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが、当該技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤など）コード配列を担持する自己不活性化レンチウイルスベクター及び／又はキメラ抗原受容体を担持する自己不活性化レンチウイルスベクターは、当技術分野で公知のプロトコルを用いてパッケージングされ得る。得られたレンチウイルスベクターは、当該分野で公知の方法を使用して、哺乳動物細胞（初代ヒトＴ細胞など）を形質導入するために使用され得る。レンチウイルスなどレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期の安定な組み込み及び子孫細胞におけるその増殖を可能にするので、長期遺伝子導入を達成するために好適なツールである。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性を有し、非増殖細胞を形質導入することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸のいずれか１つを含む。核酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択マーカーを使用することなど、当該分野で公知の任意の分子クローニング方法を使用して、ベクターにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。哺乳動物細胞における遺伝子発現を求めて様々なプロモーターが調査されており、当技術分野で公知のプロモーターのいずれかが、本開示で使用され得る。プロモーターは、大まかに構成的プロモーター又は調節性プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）として分類され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、構成的プロモーターに操作可能に連結される。構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子とも呼ばれる）が宿主細胞において構成的に発現することを可能にする。本明細書において企図される例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＭＶ初期エンハンサーと結合したニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。導入遺伝子の発現を促進する、かかる構成的プロモーターの効率は、膨大な数の研究で広く比較されてきた。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅｅｔ ａｌは、ＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、及びＰＧＫの、初代ヒトＴ細胞におけるキメラ抗原受容体発現を促進する効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターが、最高レベルの導入遺伝子の発現を誘導するだけでなく、ＣＤ４及びＣＤ８ヒトＴ細胞において最適に維持されると結論付けた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９））。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、ｈＥＦ１αプロモーターに操作可能に連結される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。誘導性プロモーターは、調節性プロモーターのカテゴリに属する。誘導性プロモーターは、１つ以上の条件（物理的条件など）、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞の微環境、若しくは遺伝子操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導物質（すなわち、誘導剤）、又はそれらの組み合わせによって誘導され得る。
いくつかの実施形態では、誘導条件は、遺伝子操作された哺乳動物細胞において、及び／又は医薬組成物を受ける対象において、内在性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、誘導条件は、誘導物質、照射（電離放射線、光など）、温度（熱など）、酸化還元状態、腫瘍環境、及び遺伝子操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を含有して、レンチウイルスベクターを介してトランスフェクトされた宿主細胞集団からＣＡＲを発現する細胞を選択する。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方には、宿主細胞における発現を可能にするために適切な制御配列が隣接し得る。例えば、ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びに核酸配列の発現の制御に有用なプロモーターを含有し得る。
５．５．ＣＡＲを発現するインフルエンザＡウイルス特異的Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞
更に別の態様では、本明細書において提供される（例えば、上記の第５．４節に記載の）方法に従って産生されたＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書において提供される。
更に別の態様では、ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書において提供され、このＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。特定の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書において提供され、このＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、このＣＡＲ－Ｔ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体を発現する。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞内のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチド、ヒンジ領域、共刺激シグナル伝達ドメイン、リンカーなど１つ以上の追加の領域／ドメインを更に含み、これらのそれぞれは、上記の第５．４．１節に記載のとおりであり得る。
具体的には、いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを更に含み得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路に標的化し、エフェクター分子の脂質二重層への組み込み及び固定を可能にする。本明細書に記載のＣＡＲにおける使用に適合する、天然に存在するタンパク質のシグナル配列又は合成の、天然に存在しないシグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選択される分子に由来する。具体的な実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗体又はそのフラグメントを含む。具体的な実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインはヒト化抗体又はそのフラグメントを含む。
特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、複数の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは多重特異性抗体又はそのフラグメントを含む。他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは多価抗体又はそのフラグメントを含む。本発明のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに複数の結合ドメインが存在する場合。種々のドメインは、ペプチドリンカーを介して互いに融合し得る。いくつかの実施形態では、ドメインは、いかなるペプチドリンカーもなく互いに直接融合している。ペプチドリンカーは、同じであっても異なってもよい。各ペプチドリンカーは、様々なドメインの構造的特徴及び／又は機能的特徴に応じて、同じ又は異なる長さ及び／又は配列を有し得る。各ペプチドリンカーは、独立して選択され、最適化され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲにおいて提供される細胞外抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識する。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。腫瘍は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答の標的抗原として機能し得る、多数のタンパク質を発現する。ＣＡＲによって標的化される抗原は、単一の罹患細胞上の抗原であり得るか、又はそれぞれが疾患に寄与する、異なる細胞上で発現する抗原であり得る。ＣＡＲによって標的化される抗原は、疾患に直接的又は間接的に関与し得る。
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発することができる腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。例示的な腫瘍抗原としては、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、並びにメソテリンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能し得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子としては、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ及びｇｐ１００など組織特異的抗原、並びに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２など形質転換関連分子の群に属する。標的抗原の更に別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）など腫瘍胎児抗原である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞には存在しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下で正常細胞上でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟であり、応答することができない胎児発生期間に正常細胞上に発現する抗原であり得るか、又はそれらは、正常細胞上に非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上にはるかに高いレベルで発現する抗原であり得る。
ＴＳＡ又はＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２など分化抗原、及びＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５など腫瘍特異的多系統抗原；ＣＥＡなど過剰発現した胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕなど過剰発現した癌遺伝子及び変異した腫瘍抑制遺伝子；染色体転座から生じた固有の腫瘍抗原；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなど；及びウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。
他の大きなタンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭＡ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ１、ＲＣＡＳ １、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
いくつかのより具体的な実施形態では、抗原は、ＣＤ１２３である。具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、ＣＤ１２３を結合し、配列番号３のアミノ酸配列を含むことができるｓｃＦｖを含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。
他のより具体的な実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、ＰＳＭＡを結合し、配列番号４のアミノ酸配列を含むことができるｓｃＦｖを含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当該分野で公知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体での使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に柔軟性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの約１５～１００個（例えば、２０、２５、３０、３５、又は４０個）の連続するアミノ酸を含有するフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのヒンジドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
本開示のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインに直接的又は間接的に融合し得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然又は合成の供給源のいずれか一方に由来し得る。本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の、天然には存在しないタンパク質セグメント（例えば、細胞膜において熱力学的に安定である疎水性タンパク質セグメント）であり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型の膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型シングルパス膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、マルチパス膜タンパク質由来の膜貫通ドメインはまた、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合し得る。本明細書に記載のＣＡＲで使用する膜貫通ドメインはまた、合成の、天然に存在しないタンパク質セグメントの少なくとも一部を含み得る。．いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、約１５～１００個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の、天然に存在しないαヘリックス又はβシートである。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０個のアミノ酸、例えば、少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、又はそれ以上のアミノ酸である。
本明細書において提供される膜貫通ドメインは、膜貫通領域と、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する細胞質領域と、を含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤＩ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦＩ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤＩ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤＩ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃから選択される膜貫通ドメインを含む。
いくつかの具体的な実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤ８αの膜貫通ドメインである。
本明細書において提供されるＣＡＲ内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の主要な細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の主要な細胞内シグナル伝達ドメインから本質的になる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわちＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有する。例示的なＩＴＡＭを含有する主要な細胞質シグナル伝達配列としては、ＣＤ３ｚ、ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲｉｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３Δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインからなる。いくつかの実施形態では、主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ｚの主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを伝達し、免疫細胞によって媒介される応答を調節する共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上（約２、３、４、又はそれ以上のいずれかなど）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上の同一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の任意の２つ以上の共刺激タンパク質など、異なる共刺激タンパク質に由来する２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、主要な細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメイン）及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び主要な細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインなど）は、任意のペプチドリンカーを介して互いに融合する。主要な細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の適切な順序で配置され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと主要な細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚの細胞質シグナル伝達ドメインなど）との間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、相加的又は相乗的刺激効果を提供し得る。
任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合し得る。ＣＡＲで使用する共刺激シグナル伝達ドメインの例は、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；並びに任意の他の共刺激分子（ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、Ｄｅｃｔｉｎ－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、及びＮＫＧ２Ｃ）を含むがこれらに限定されない共刺激タンパク質の細胞質信号伝達ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（すなわち、４－１ＢＢ）に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤｚの細胞質シグナル伝達ドメイン及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、配列番号２のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド、ＣＤ１２３を結合し、配列番号３のアミノ酸配列を含む、ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ｚに由来する主要な細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
具体的な実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、配列番号２のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド、ＰＳＭＡを結合し、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含む、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ｚに由来する主要な細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、以下の第７節に例示するＣＡＲのいずれか１つに対してある特定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する細胞外ドメインを含むか、又はそれからなるＣＡＲが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する細胞外ドメインを含むか、又はそれからなるＣＡＲが本明細書において提供される。
５．６．医薬組成物
一態様では、本開示は、本開示の遺伝子操作されたＴ細胞を含む医薬組成物を更に提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の本開示の遺伝子操作されたＴ細胞と、医薬的に許容される賦形剤と、を含む。
具体的な実施形態では、「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全又は不完全））、担体、又はビヒクルを指すこともある。医薬用賦形剤は、無菌液体、例えば水、及び落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む油であり得る。生理食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液も、液体賦形剤として採用され得る。好適な医薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じて、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を更に含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態を取り得る。好適な医薬品賦形剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。かかる組成物は、患者に適切に投与するための形態をもたらすように、精製形態など予防有効量又は治療有効量の本明細書において提供される活性成分を、好適な量の賦形剤と併せて含有する。その製剤は、投与様式に適するべきである。
いくつかの実施形態では、賦形剤の選択は、特定の細胞によって、及び／又は投与方法によってある程度決定される。したがって、種々の適切な処方が存在する。
典型的には、許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムなど）；防腐剤、等張化剤、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体；キレート剤（ＥＤＴＡ及び／又は非イオン性界面活性剤など）を含む。
緩衝剤は、特に安定性がｐＨ依存性である場合、治療有効性を最適化する範囲にｐＨを制御するために使用され得る。本開示で使用するのに好適な緩衝剤としては、有機酸及び無機酸の両方並びにそれらの塩が挙げられる。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。更に、緩衝剤は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩（Ｔｒｉｓなど）を含み得る。
防腐剤は、微生物の増殖を遅らせるために添加され得る。本開示で使用するのに好適な防腐剤としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム：塩化ヘキサメソニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチル又はプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールが挙げられる。
「安定剤」として知られることもある等張化剤は、組成物中の液体の張度を調整又は維持するために存在し得る。等張化剤は、大きな荷電生体分子（タンパク質及び抗体など）と共に使用される場合、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し得、それによって分子間及び分子内相互作用の可能性を低減するため、「安定剤」と呼ばれることが多い。例示的な等張化剤としては、多価糖アルコール、三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
更なる例示的な賦形剤としては、（１）増量剤、（２）溶解促進剤、（３）安定剤、及び（４）変性又は容器壁への付着を防止する薬剤が挙げられる。かかる賦形剤としては、多価糖アルコール（上に列挙）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどアミノ酸；有機糖又は糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ｍｙｏ－イニシトース（myoinisitose）、ｍｙｏ－イノシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖類（ラフィノースなど）；並びに多糖類、例えば、デキストリン又はデキストランが挙げられる。
非イオン性界面活性剤又は洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬の可溶化を支援するため、並びに治療用タンパク質を撹拌誘導性凝集から保護するために存在し得、これはまた、活性治療用タンパク質又は抗体の変性を引き起こすことなく、製剤が剪断表面応力に曝露されることを可能にする。好適な非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート類（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー類（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール類、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ひまし油１０、５０及び６０、グリセロールモノステアレート、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシルメチルセルロースが挙げられる。使用され得るアニオン性洗浄剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン性洗浄剤としては、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
医薬組成物がインビボ投与に使用されるためには、医薬組成物は好ましくは無菌である。医薬組成物は、滅菌濾過膜を通して濾過することによって滅菌され得る。本明細書における医薬組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器に、例えば、皮下注射針によって突き刺し可能なストッパーを有する静注用溶液バッグ又はバイアルに入れることができる。
投与経路は、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内若しくは関節内経路による注射若しくは注入、局所投与、吸入、又は持続放出若しくは延長放出手段による、適切な様式での単回若しくは複数回のボーラス、又は長期間にわたる注入などの公知かつ許容されている方法に従う。
別の実施形態では、医薬組成物は、制御放出系又は持続放出系として提供され得る。一実施形態では、制御放出又は徐放を達成するために、ポンプが使用され得る（例えば、Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１－４０（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７－１６（１９８０）；及びＳａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５６９－７４（１９８９）を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、予防薬若しくは治療薬（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質）、又は本明細書において提供される組成物の制御放出又は徐放を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ，ｅｄｓ．，１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１－１２６（１９８３）；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０－９２（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１－５６（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５－１２（１９８９）；米国特許第５，６７９，３７７号；同第５，９１６，５９７号；同第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；及び米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号及び同第９９／２０２５３号を参照されたい）。徐放性製剤に用いられるポリマーの例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、徐放性製剤中で使用されるポリマーは、不活性で、浸出性不純物を含まず、保存時に安定で、無菌で、生分解性である。更に別の実施形態では、制御放出系又は徐放系を特定の標的組織、例えば、鼻腔又は肺に近接して配置することができ、その結果、全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｖｏｌ．２，１１５－３８（１９８４）を参照）。制御放出系については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３（１９９０）により議論されている。当業者に公知の任意の技術を使用して、本明細書に記載の１つ以上の薬剤を含む徐放製剤を製造することができる（例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、国際公開第９１／０５５４８号及び同第９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９：１７９－８９（１９９６）；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＤＡ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．＆ Ｔｅｃｈ．５０：３７２－９７（１９９５）；Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３－５４（１９９７）；並びにＬａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９－６０（１９９７）を参照）。
本明細書に記載の医薬組成物はまた、治療されている特定の症状での必要性に応じて、２つ以上の活性化合物又は薬剤を含有し得る。代替的に、又は追加的に、組成物は、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、又は増殖阻害剤を含み得る。かかる分子は、組み合わせで、意図される目的において有効な量で適当に存在する。
活性成分はまた、それぞれ、例えばコアセルベーション法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセルなど）中、又はマクロエマルジョン中に封入することができる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
様々な組成物及び送達系が公知であり、本明細書において提供される治療薬で使用することができる。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、本明細書において提供される単一ドメイン抗体又は治療用分子を発現可能な組み換え細胞、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、結合分子及び／又は細胞を、疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量、例えば治療有効量又は予防有効量で含有する。いくつかの実施形態における治療効果又は予防効果は、治療対象の定期的な評価によってモニタリングされる。数日以上にわたる反復投与の場合、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療を繰り返す。しかしながら、他の薬物投与法が有用な場合があり、決定され得る。
５．７．方法及び使用
別の態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞など上記の第５．５節に記載のものなど、組み換え受容体を発現する、遺伝子操作されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用するための方法及びその使用が本明細書において提供され、このＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、このＣＡＲ－Ｔ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体を発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される遺伝子操作されたＴ細胞は、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法として有用である。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、従来の自己ＣＡＲ－Ｔ療法には存在しないより安全な特徴、例えば、サイトカインストームがないか又は低いこと、制御性Ｔ細胞の刺激がないこと、自己組織損傷の低減、自己免疫誘導の低減、移植片対宿主病の低減などを有する。
かかる方法及び使用は、例えば、疾患又は障害を有する対象への細胞又は細胞を含有する組成物の投与を含む、治療方法及び使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、疾患又は障害の治療をもたらすのに有効な量で投与される。使用には、かかる方法及び治療における、並びにかかる治療法を実施するための薬剤の調製における細胞の使用が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞又は細胞を含む組成物を、疾患又は病態を有するか又は有することが疑われる対象に投与することによって行われる。いくつかの実施形態では、本方法は、それによって、対象における疾患又は障害を治療する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される治療は、疾患若しくは障害、又はそれに関連する症状、有害作用若しくは転帰、又は表現型の完全な又は部分的な改善又は低減を引き起こす。治療の望ましい効果としては、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。これらの用語は、疾患の完全な治癒又は任意の症状若しくは全ての症状若しくは転帰に対する影響の完全な排除を含むが、これらを意味するものではない。
本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、本明細書において提供される治療は、疾患又は障害の発症を遅延させる、例えば、疾患（癌など）の発症を先送りする、妨げる、遅らせる（slow）、遅らせる（retard）、安定化させる、抑制する、及び／又は延期する。この遅延は、疾患歴及び／又は治療を受ける個体に応じて、様々な期間であり得る。当業者に明らかであるように、十分な又は著しい遅延は、事実上、個体が疾患又は障害を発症しないという点で、予防を包含し得る。例えば、転移の発生など後期癌を遅延させることができる。他の実施形態では、本明細書において提供される方法又は使用は、疾患又は障害を予防する。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、固形腫瘍癌の治療に使用される。他の実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、血液癌の治療に使用される。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、自己免疫疾患又は炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ＣＤ１２３関連疾患又は障害である。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ＰＳＭＡ関連疾患又は障害である。
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子操作された細胞が対象に投与される、養子細胞療法を含む。かかる投与は、疾患又は障害の細胞が破壊の標的となるように、細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞活性化）を促進することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞又は細胞を含有する組成物を、疾患若しくは障害を有する、そのリスクがある、又はそれを有すると疑われる対象、組織、又は細胞に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞、集団、及び組成物は、例えば、養子Ｔ細胞療法など養子細胞療法を介して、治療される特定の疾患又は障害を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、細胞又は組成物は、疾患若しくは障害を有するか、又はそのリスクがある対象など対象に投与される。いくつかの実施形態では、本方法は、それによって、疾患又は障害の１つ以上の症状を治療する、例えば、改善する。
養子細胞療法のために細胞を投与する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；米国特許第４，６９０，９１５号；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７－８５（２０１１）；Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８－９３３（２０１３）；Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）：８４－９（２０１３）；及びＤａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ８（４）：ｅ６１３３８（２０１３）に記載されているように公知である。これらの方法は、本明細書において提供される方法及び組成物に関連して使用され得る。
いくつかの実施形態では、細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、細胞療法を受ける対象から、又はかかる対象に由来する試料から細胞が単離される、及び／又は別様に調製される自家移植によって行われる。したがって、いくつかの態様では、細胞は、治療を必要とする対象に由来し、細胞は、単離及び処理後に、同じ対象に投与される。他の実施形態では、細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、細胞療法を受けるか又は最終的に受ける対象以外の対象（例えば、第１の対象）から細胞が単離される、及び／又は別様に調製される同種異系移植によって行われる。かかる実施形態では、次いで、細胞は、同種の異なる対象、例えば、第２の対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１の対象及び第２の対象は、遺伝学的に同一である。いくつかの実施形態では、第１の対象及び第２の対象は、遺伝学的に類似している。いくつかの実施形態では、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラス又はスーパータイプを発現する。
いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又は組成物が投与される対象は、ヒトなど霊長類である。対象は、男性又は女性であってよく、乳児、若年、青年、成人、及び老齢の対象を含む、任意の好適な年齢であってよい。いくつかの実施例では、対象は、疾患、養子細胞療法のための、及び／又は毒性転帰を評価するための検証された動物モデルである。
本明細書において提供される組成物は、任意の適切な手段によって、例えば、注射、例えば、静脈内若しくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、亜球下注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、又は後強膜近傍送達によって投与することができる。いくつかの実施形態では、それらは、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与によって投与され、局所療法に所望される場合、病巣内投与によって投与される。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。
疾患又は病態の予防及び／又は治療に有効である、本明細書において提供される予防薬又は治療薬の量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿され得る。疾患の予防又は治療のために、結合分子又は細胞の適切な用量は、治療される疾患又は障害のタイプ、結合分子のタイプ、疾患又は障害の重症度及び経過、治療薬が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴及び薬剤に対する反応、並びに主治医の裁量に依存し得る。組成物、分子及び細胞は、いくつかの実施形態では、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。複数回用量を断続的に投与してもよい。初回のより高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量が投与され得る。
遺伝子操作された細胞の文脈において、いくつかの実施形態では、対象は、約百万～約１，０００億個の範囲の細胞及び／又は体重１キログラム当たりその量の細胞を投与され得る。医薬組成物が本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞のいずれか１つを含むいくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、又は１０９個の細胞のいずれかの用量で投与される。用量は、疾患若しくは障害、及び／又は患者、及び／又は他の治療に特有の属性に応じて様々であり得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回（２回、３回、４回、５回、６回、又はそれ以上の回数などのいずれか）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投薬サイクル中に１回又は複数回投与される。投与サイクルは、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、若しくはそれ以上、又は１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、若しくはそれ以上であり得る。特定の患者の最適な用量及び治療計画は、医学分野の当業者によって、疾患の徴候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成物は、併用治療の一部として、例えば、別の抗体又は遺伝子操作された細胞若しくは受容体又は薬剤（細胞障害性薬剤又は治療薬など）など別の治療的介入と同時に、又は任意の順序で連続して投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成物は、１つ以上の追加の治療薬と共に、又は別の治療的介入に関連して、同時に又は任意の順序で連続してのいずれかで同時投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞集団が１つ以上の追加の治療薬の効果を増強するように、又はその逆になるように、十分に近い時間で別の療法と同時投与される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成物は、１つ以上の追加の治療薬の前に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成物は、１つ以上の追加の治療薬の後に投与される。
特定の実施形態では、細胞が哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されると、遺伝子操作された細胞集団の生物学的活性が、多数の公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメータとしては、遺伝子操作された、若しくは天然のＴ細胞又は他の免疫細胞の抗原へのインビボでの特異的結合（例えば、イメージングによる）、又はエクスビボでの特異的結合（例えば、ＥＬＩＳＡ若しくはフローサイトメトリーによる）が挙げられる。特定の実施形態では、標的細胞を破壊する、遺伝子修飾された細胞の能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９－７０２（２００９）、及びＨｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５－４０（２００４）に記載されている細胞傷害アッセイなど当該技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して測定され得る。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性はまた、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦなど特定のサイトカインの発現及び／又は分泌をアッセイすることによって測定され得る。いくつかの態様では、生物学的活性は、腫瘍量又は腫瘍負荷の低減などの臨床転帰を評価することによって測定される。
５．８．キット及び製品
本明細書に記載の遺伝子操作された免疫エフェクター細胞のいずれかを含むキット、単位用量、及び製品が更に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか１つを含み、好ましくはそれを使用するための説明書を提供するキットが提供される。
本願のキットは、好適なパッケージ内にある。好適なパッケージとしては、バイアル、瓶、ジャー、可撓性パッケージ（例えば、密封マイラー又はプラスチックバッグ）が挙げられるが、これらに限定されない。キットは、任意選択的に追加成分（緩衝液など）及び説明情報を提供し得る。したがって、本願はまた、バイアル（密封バイアルなど）、瓶、ジャー、可撓性パッケージなどを含む製品を提供する。
製品は、容器と、この容器に付着する、又は関連するラベル又はパッケージ添付文書と、を含み得る。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなど様々な材料から形成され得る。概して、容器は、疾患又は障害（癌など）を治療するために有効である、本明細書に記載の組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下用注射針で突き刺し可能な栓を有する静注用溶液バッグ又はバイアルであり得る）。ラベル又は添付文書は、組成物が、個体において特定の病態を治療するために用いられることを示す。ラベル又は添付文書は、組成物を個体に投与するための説明書を更に含む。ラベルは、再構成及び／又は使用のための指示を示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする、複数回用バイアルであり得る。「添付文書」とは、かかる治療用製品の適応症、用法、用量、投与、禁忌、及び／又は使用に関する警告に関する情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに通常的に含まれている指示書を指す。追加的に、この製品は、医薬的に許容される緩衝剤、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液を含む第２の容器を更に含み得る。この製造物品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含むことができる。
キット又は製品は、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局での保管及び使用に十分な量でパッケージングされた、複数単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含み得る。
簡潔にするために、特定の略語が本明細書で使用される。一例として、アミノ酸残基を表す単一文字の略語がある。アミノ酸及びそれらに対応する３文字及び１文字の略語は以下のとおりである：
Figure 2023537526000003
本開示は概ね、多数の実施形態を説明するために肯定的な言葉を用いて本明細書に開示される。また、本開示には、物質又は材料、方法のステップ及び条件、プロトコル、手順、アッセイ又は分析など、特定の主題が完全に又は部分的に除外されている実施形態も具体的に含まれる。したがって、本明細書では概ね、本開示が含まないものに関して本明細書で表現されていない場合であってもそれにかかわらず、本開示に明示的に含まれない態様が本明細書で開示される。
本開示の多数の実施形態が説明されてきた。しかしながら、様々な修正が、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく実行され得ることが、理解されるであろう。したがって、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された開示の範囲を説明することを意図しているが、限定するものではない。
６．実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１つのセットの実施形態（実施形態セットＡ）では、以下が提供される。
Ａ１．ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含む、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、又は濃縮するための方法。
Ａ２．Ｍ１ペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ３．ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む、実施形態Ａ１又はＡ２に記載の方法。
Ａ４．細胞集団は、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボで培養される、実施形態Ａ１～Ａ３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５．方法は、
（ｉ）Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、
（ｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、又は
（ｉｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む、実施形態Ａ３に記載の方法。
Ａ６．細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される、実施形態Ａ４又はＡ５に記載の方法。
Ａ７．細胞集団は、エクスビボで１～２０日間、２～１８日間、３～１６日間、４～１４日間、５～１４日間、６～１４日間、７～１４日間、８～１４日間、９～１４日間、１０～１４日間、１１～１４日間、又は１２～１４日間培養される、実施形態Ａ４又はＡ５に記載の方法。
Ａ８．細胞集団は、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団である、実施形態Ａ１～Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ９．全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する、実施形態Ａ８に記載の方法。
Ａ１０．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又は方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる、実施形態Ａ１～Ａ９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１１．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋の初期パーセントの１０％～２０倍、２０％～２０倍、３０％～２０倍、４０％～２０倍、５０％～２０倍、６０％～２０倍、７０％～２０倍、８０％～２０倍、９０％～２０倍、２～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍、１１～２０倍、１２～２０倍、１３～２０倍、１４～２０倍、若しくは１５～２０倍増加させる、又は方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、若しくは９０％～９９％に増加させる、実施形態Ａ１～Ａ９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１２．方法は、細胞集団のＭ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む、実施形態Ａ１～Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。
別のセットの実施形態（実施形態セットＢ）では、以下が提供される。
Ｂ１．ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含む方法によって産生されるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ２．Ｍ１ペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ１に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ３．ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ４．細胞集団は、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボで培養される、実施形態Ｂ１～Ｂ３のいずれか１つに記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ５．方法は、
（ｉ）Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、
（ｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、又は
（ｉｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む、実施形態Ｂ３に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ６．細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される、実施形態Ｂ４又はＢ５に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ７．細胞集団は、エクスビボで１～２０日間、２～１８日間、３～１６日間、４～１４日間、５～１４日間、６～１４日間、７～１４日間、８～１４日間、９～１４日間、１０～１４日間、１１～１４日間、又は１２～１４日間培養される、実施形態Ｂ４又はＢ５に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ８．細胞集団は、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団である、実施形態Ｂ１～Ｂ７のいずれか１つに記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ９．全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する、実施形態Ｂ８に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ１０．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる、実施形態Ｂ１～Ｂ９のいずれか１つに記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ１１．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍、２０％～２０倍、３０％～２０倍、４０％～２０倍、５０％～２０倍、６０％～２０倍、７０％～２０倍、８０％～２０倍、９０％～２０倍、２～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍、１１～２０倍、１２～２０倍、１３～２０倍、１４～２０倍、若しくは１５～２０倍増加させる、又は方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、若しくは９０％～９９％に増加させる、実施形態Ｂ１～Ｂ９のいずれか１つに記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ１２．方法は、細胞集団のＭ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
Ｂ１３．単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、単離された細胞集団の６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を超える、単離された細胞集団。
Ｂ１４．単離された細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、単離された細胞集団の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、又は９０％～９９％である、単離された細胞集団。
Ｂ１５．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも一部は、Ｍ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体を発現する、実施形態Ｂ１３又はＢ１４に記載の単離された細胞集団。
別のセットの実施形態（実施形態セットＣ）では、以下が提供される。
Ｃ１．ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ｉ）Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団を得ることと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することとを含む、方法。
Ｃ２．方法のステップ（ｉ）は、Ｍ１ペプチドを、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることによって、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化すること、又は濃縮することを含む、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３．Ｍ１ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｃ２に記載の方法。
Ｃ４．ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む、実施形態Ｃ２又はＣ３に記載の方法。
Ｃ５．細胞集団は、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボで培養される、実施形態Ｃ２～Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６．方法は、
（ｉ）Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、
（ｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、又は
（ｉｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む、実施形態Ｃ４に記載の方法。
Ｃ７．細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される、実施形態Ｃ５又はＣ６に記載の方法。
Ｃ８．細胞集団は、エクスビボで１～２０日間、２～１８日間、３～１６日間、４～１４日間、５～１４日間、６～１４日間、７～１４日間、８～１４日間、９～１４日間、１０～１４日間、１１～１４日間、又は１２～１４日間培養される、実施形態Ｃ５又はＣ６に記載の方法。
Ｃ９．細胞集団は、全ＰＢＭＣの集団である、実施形態Ｃ２～Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１０．全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する、実施形態Ｃ９に記載の方法。
Ｃ１１．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又は方法は細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる、実施形態Ｃ２～Ｃ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１２．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍、２０％～２０倍、３０％～２０倍、４０％～２０倍、５０％～２０倍、６０％～２０倍、７０％～２０倍、８０％～２０倍、９０％～２０倍、２～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍、１１～２０倍、１２～２０倍、１３～２０倍、１４～２０倍、若しくは１５～２０倍増加させる、又は方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、若しくは９０％～９９％に増加させる、実施形態Ｃ２～Ｃ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１３．方法は、細胞集団のＭ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む、実施形態Ｃ２～Ｃ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１４．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を超える、単離された細胞集団のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１５．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、又は９０％～９９％の、単離された細胞集団のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１６．ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１７．細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、実施形態Ｃ１６に記載の方法。
Ｃ１８．癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、実施形態Ｃ１７に記載の方法。
Ｃ１９．抗原が、ＣＤ１２３である、実施形態Ｃ１７に記載の方法。
Ｃ２０．抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｃ１７に記載の方法。
別のセットの実施形態（実施形態セットＤ）では、以下が提供される。
Ｄ１．（ｉ）Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団を得ることと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することとを含む、方法によって産生されたＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ２．方法のステップ（ｉ）は、Ｍ１ペプチドを、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることによって、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化すること、又は濃縮することを含む、実施形態Ｄ１に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ３．Ｍ１ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｄ２に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ４．ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む、実施形態Ｄ２又はＤ３に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ５．細胞集団は、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボで培養される、実施形態Ｄ２～Ｄ４のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ６．方法は、
（ｉ）Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、
（ｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、又は
（ｉｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む、実施形態Ｄ４に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ７．細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される、実施形態Ｄ５又はＤ６に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ８．細胞集団は、エクスビボで１～２０日間、２～１８日間、３～１６日間、４～１４日間、５～１４日間、６～１４日間、７～１４日間、８～１４日間、９～１４日間、１０～１４日間、１１～１４日間、又は１２～１４日間培養される、実施形態Ｄ５又はＤ６に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ９．細胞集団は、全ＰＢＭＣの集団である、実施形態Ｄ２～Ｄ８のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１０．全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する、実施形態Ｄ９に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１１．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又は方法は細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる、実施形態Ｄ２～Ｄ１０のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１２．方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍、２０％～２０倍、３０％～２０倍、４０％～２０倍、５０％～２０倍、６０％～２０倍、７０％～２０倍、８０％～２０倍、９０％～２０倍、２～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍、１１～２０倍、１２～２０倍、１３～２０倍、１４～２０倍、若しくは１５～２０倍増加させる、又は方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、若しくは９０％～９９％に増加させる、実施形態Ｄ２～Ｄ１０のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１３．方法は、細胞集団のＭ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む、実施形態Ｄ２～Ｄ１２のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１４．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を超えるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１３のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１５．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、又は９０％～９９％のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１３のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１６．ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１５のいずれか１つに記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１７．細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、実施形態Ｄ１６に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１８．癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、実施形態Ｄ１７に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ１９．抗原はＣＤ１２３である、実施形態Ｄ１７に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ２０．抗原はＰＳＭＡである、実施形態Ｄ１７に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ２１．ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを含み、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
Ｄ２２．ＣＡＲ－Ｔ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体を発現する、実施形態Ｄ２１に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ２３．細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、実施形態Ｄ２１又はＤ２２に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ２４．癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、実施形態Ｄ２３に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
Ｄ２５．抗原はＣＤ１２３又はＰＳＭＡである、実施形態Ｄ２３に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
更に別のセットの実施形態（実施形態セットＥ）では、以下が提供される。
Ｅ１．対象に治療有効量のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することを含む、対象において疾患又は障害を治療するための方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、（ｉ）Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団を得ることと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸をＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することと、を含む方法によって産生される、方法。
Ｅ２．ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法のステップ（ｉ）は、Ｍ１ペプチドを、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることによって、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化すること、又は濃縮することを含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．Ｍ１ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ２に記載の方法。
Ｅ４．ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む、実施形態Ｅ２又はＥ３に記載の方法。
Ｅ５．細胞集団は、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボで培養される、実施形態Ｅ２～Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６．ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、
（ｉ）Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、
（ｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、又は
（ｉｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む、実施形態Ｅ４に記載の方法。
Ｅ７．細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される、実施形態Ｅ５又はＥ６に記載の方法。
Ｅ８．細胞集団は、エクスビボで１～２０日間、２～１８日間、３～１６日間、４～１４日間、５～１４日間、６～１４日間、７～１４日間、８～１４日間、９～１４日間、１０～１４日間、１１～１４日間、又は１２～１４日間培養される、実施形態Ｅ５又はＥ６に記載の方法。
Ｅ９．細胞集団は、全ＰＢＭＣの集団である、実施形態Ｅ２～Ｅ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１０．全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する、実施形態Ｅ９に記載の方法。
Ｅ１１．ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又はＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる、実施形態Ｅ２～Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１２．ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍、２０％～２０倍、３０％～２０倍、４０％～２０倍、５０％～２０倍、６０％～２０倍、７０％～２０倍、８０％～２０倍、９０％～２０倍、２～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍、１１～２０倍、１２～２０倍、１３～２０倍、１４～２０倍、若しくは１５～２０倍増加させる、又はＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、若しくは９０％～９９％に増加させる、実施形態Ｅ２～Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１３．ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、細胞集団のＭ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む、実施形態Ｅ２～Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を超えるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、又は９０％～９９％のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１６．ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７．細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、実施形態Ｅ１６に記載の方法。
Ｅ１８．癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、実施形態Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．抗原が、ＣＤ１２３である、実施形態Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ２０．抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ２１．治療有効量のＣＡＲ－Ｔ細胞を対象に投与することを含む、対象において疾患又は障害を治療するための方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを含み、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である、方法。
Ｅ２２．ＣＡＲ－Ｔ細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体を発現する、実施形態Ｅ２１に記載の方法。
Ｅ２３．細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、実施形態Ｅ２１又はＥ２２に記載の方法。
Ｅ２４．癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、実施形態Ｅ２３に記載の方法。
Ｅ２５．抗原は、ＣＤ１２３又はＰＳＭＡである、実施形態Ｅ２３に記載の方法。
Ｅ２６．疾患又は障害は癌である、実施形態Ｅ１～Ｅ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２７．癌は血液癌である、実施形態Ｅ２６に記載の方法。
Ｅ２８．癌は固形腫瘍癌である、実施形態Ｅ２６に記載の方法。
Ｅ２９．対象は、方法を必要としているヒト対象である、実施形態Ｅ１～Ｅ２８のいずれか１つに記載の方法。
更に別のセットの実施形態（実施形態セットＦ）では、以下が提供される。
Ｆ１．ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するためのプロセスであって、（ｉ）Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を得る機能を実行するステップと、（ｉｉ）Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＡＲを発現する機能を実行するステップとを含む、プロセス。
Ｆ２．方法のステップ（ｉ）は、Ｔ細胞を含む細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、又は濃縮する機能を実行するステップを含む、実施形態Ｆ１に記載のプロセス。
Ｆ３．Ｔ細胞を含む細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、又は濃縮する機能を実行するステップは、Ｍ１ペプチドを、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含み、Ｍ１ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｆ２のプロセス。
Ｆ４．ＩＬ－２を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを更に含む、実施形態Ｆ３に記載のプロセス。
Ｆ５．細胞集団は、Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボで培養される、実施形態Ｆ３又はＦ４に記載のプロセス。
Ｆ６．プロセスは、
（ｉ）Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、
（ｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養すること、又は
（ｉｉｉ）Ｍ１ペプチドを含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＭ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において細胞集団をエクスビボで培養することを含む、実施形態Ｆ４に記載のプロセス。
Ｆ７．細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される、実施形態Ｆ５又はＦ６に記載のプロセス。
Ｆ８．細胞集団は、エクスビボで１～２０日間、２～１８日間、３～１６日間、４～１４日間、５～１４日間、６～１４日間、７～１４日間、８～１４日間、９～１４日間、１０～１４日間、１１～１４日間、又は１２～１４日間培養される、実施形態Ｆ５又はＦ６に記載のプロセス。
Ｆ９．細胞集団は、全ＰＢＭＣの集団である、実施形態Ｆ２～Ｆ８のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｆ１０．全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する、実施形態Ｆ９に記載のプロセス。
Ｆ１１．プロセスは、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの少なくとも１０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又はプロセスは、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる、実施形態Ｆ２～Ｆ１０のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｆ１２．プロセスは、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期パーセントの１０％～２０倍、２０％～２０倍、３０％～２０倍、４０％～２０倍、５０％～２０倍、６０％～２０倍、７０％～２０倍、８０％～２０倍、９０％～２０倍、２～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍、１１～２０倍、１２～２０倍、１３～２０倍、１４～２０倍、若しくは１５～２０倍増加させる、又はプロセスは、細胞集団からのＣＤ８＋細胞中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、ＣＤ８＋細胞の６％～９９％、１０％～９９％、１５％～９９％、２０％～９９％、２５％～９９％、３０％～９９％、３５％～９９％、４０％～９９％、４５％～９９％、５０％～９９％、５５％～９９％、６０％～９９％、６５％～９９％、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、若しくは９０％～９９％に増加させる、実施形態Ｆ２～Ｆ１０のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｆ１３．プロセスは、細胞集団のＭ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む、実施形態Ｆ２～Ｆ１２のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｆ１４．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＡＲを発現する機能を実行するステップは、ＣＡＲをコードする核酸をＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ１３のいずれか１つに記載のプロセス。
更に別のセットの実施形態（実施形態セットＧ）では、以下が提供される。
Ｇ１．癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段と、ドナーＴ細胞に対するアロ反応性を低減することができる第２の手段とを含む、システム。
Ｇ２．癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを含む、実施形態Ｇ１に記載のシステム。
Ｇ３．細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、実施形態Ｇ２に記載のシステム。
Ｇ４．癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、実施形態Ｇ３に記載のシステム。
Ｇ５．抗原はＣＤ１２３である、実施形態Ｇ３に記載のシステム。
Ｇ６．抗原はＰＳＭＡである、実施形態Ｇ３に記載のシステム。
Ｇ７．ドナーＴ細胞に対するアロ反応性を低減することができる第２の手段は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態Ｇ１～Ｇ６のいずれか１つに記載のシステム。
Ｇ８．癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段と、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドを結合することができる第２の手段とを含む、Ｔ細胞。
Ｇ９．Ｔ細胞は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態Ｇ８に記載のＴ細胞。
Ｇ１０．癌細胞の表面上の抗体を結合することができる第１の手段は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを含む、実施形態Ｇ８又はＧ９に記載のＴ細胞。
Ｇ１１．細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、実施形態Ｇ１０に記載のＴ細胞。
Ｇ１２．癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、実施形態Ｇ１１に記載のＴ細胞。
Ｇ１３．抗原はＣＤ１２３である、実施形態Ｇ１２に記載のＴ細胞。
Ｇ１４．抗原はＰＳＭＡである、実施形態Ｇ１２に記載のＴ細胞。
Ｇ１５．Ｍ１ペプチドを結合することができる第２の手段は、Ｍ１ペプチドを結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、実施形態Ｇ８～Ｇ１４のいずれか１つに記載のＴ細胞。
以下は、試験に使用された様々な方法及び材料の説明であり、当業者に本開示の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するように記載されており、本発明者らがその開示とみなす範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が実施され、実施可能な実験の全てであることを表すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記述は、必ずしも実行されたものではなく、むしろ記述は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実行できるものであることを理解されたい。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）についての正確度を保証するための努力はなされているが、多少の実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。
７．１．実施例１－インフルエンザＡウイルス特異的Ｖβ１７＋ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
７．１．１．全血からのＰＢＭＣの単離
ＰＢＭＣは、ＨｅｍａＣａｒｅ（ＨＬＡ＊０２０１ドナー）又は社内供給源（Ｃｌｉｎｉｇｅｎ／ＮＨ）のいずれかから入手した。社内ドナーについては、健康なボランティアからヘパリン添加血を入手し、等量の室温（ＲＴ）で平衡化した単純ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ培地）（ＲＰＭＩ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０－０６３、ロット番号２１０８９６５））を添加することによって希釈した。ストリペット（steripette）を使用して、５０ｍＬのファルコンチューブ内で、３０ｍＬの希釈した血液を１５ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）上に注意深く重ねた。血液をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）上に重ねながら、勾配障害を防止するように注意した。５０ｍＬのファルコンチューブを、４５０倍のｇ、室温で、中断することなく（遠心分離機の加速及び減速を０に維持して）３０分間遠心分離した。遠心分離後、ファルコンチューブを遠心分離機から注意深く取り出し、血漿－バフィーコート－ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）の境界面を乱さずに、上部血漿層を廃棄した。血漿－バフィーコート－Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）の境界面からのバフィーコートを、室温で平衡化した３０ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１、ロット番号２０９２５７５Ｐ）、及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を含有する新しい５０ｍＬのファルコンチューブに、赤血球／顆粒球ペレットを乱さずに、注意深く移した。５０ｍＬのファルコンチューブを、３５０倍のｇ、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。赤血球（ＲＢＣ）溶解は、細胞ペレットを１ｍＬのＡＣＫ溶解溶液中に室温で５～８分間再懸濁させることによって行った。インキュベーション期間後、２０ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地を添加することによってＲＢＣ溶解を停止させた。ファルコンチューブを、再び３５０倍のｇ、室温で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを３５ｍＬの１倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。チューブを、３５０倍のｇ、室温で１０分間遠心分離した。完全ＲＰＭＩ培地中に細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を血球計数器で計数した。ＰＢＭＣを、下流適用のために直接使用するか、又は２５×１０６／ｍＬの細胞濃度で凍結培地（１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０、ロット番号ＲＮＢＧ１８０８）及び９０％のＦＢＳ）中で凍結させた。
健康な個体における全ＰＢＭＣ中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の有病率を測定した。健康な個体におけるＴＣＲ Ｖβ１７＋ＣＤ８＋細胞の頻度を同定するために、全ＰＢＭＣを抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１７、ＣＤ３、及びＣＤ８ ｍＡｂで染色した。フローサイトメトリー分析は、健康な個体において、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の４～５％の平均（±ＳＥＭ）頻度でそれらの表面上にＴＣＲ Ｖβ１７を発現することを示した（図１）。
７．１．２．全ＰＢＭＣからのＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＭ１ペプチド媒介活性化及び増殖
０日目に、凍結ＰＢＭＣのバイアルを迅速に解凍し、５０ｍＬのファルコン中の４９ｍＬの温かい完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に添加して、凍結培地を希釈した。ＰＢＭＣを１５００回転／分（ＲＰＭ）で５分間遠心分離し、完全ＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。細胞ペレットを完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。細胞を計数し、完全ＲＰＭＩ培地中で２．５×１０６細胞／１．２５ｍＬに調整した。
それと同時に、ＦＬＵ ＭＰ５８ペプチドを調製した。ＦＬＵ ＭＰ ５８ペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）を、＞９５％の純度でＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ（カタログ番号ＢＰ１０－４０５、及びロット番号３６７７－３３／４２－２）にて購入した。最初にＦＬＵ ＭＰ５８ペプチドを１００％のＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍＬ（１００μＬ中１ｍｇ）の濃度に溶解し、アリコートに分け、－２０℃で凍結した。実験日に、ＦＬＵ ＭＰ ５８ペプチドを－２０℃の冷凍庫から解凍し、ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬに希釈した。最初に、２倍の濃度（２μｇ／ｍＬ）の完全ＲＰＭＩ培地中でＦＬＵ ＭＰ５８ペプチドを作製した。次いで、１．２５ｍＬのＰＢＭＣ（２．５×１０６細胞）及び１．２５ｍＬの希釈ペプチド（２倍の濃度）を、６ウェルマイクロプレート内のウェルに添加した。ウェル当たりの最終体積は２．５ｍＬであり、最終ペプチド濃度は１μｇ／ｍＬであり、細胞濃度は２．５×１０６細胞／ウェルであった。非刺激対照のために、１．２５ｍＬのＰＢＭＣ（２．５×１０６細胞）及び１．２５ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地を６ウェルマイクロプレート内のウェルに添加した。１ウェル当たりの最終体積は２．５ｍＬであり、最終細胞数は２．５×１０６細胞／ウェルであった。
２日目に、組み換えヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＥ－６０１７０３１、ロット番号ＡＥ－６０１７０３１）を添加した。ＩＬ－２の比活性度は、約２．１×１０４ＩＵ／μｇであった。ＩＬ－２を、０．１％のウシ血清アルブミンを含有する滅菌１００ｍＭ酢酸中１００μｇ／ｍＬで再構成した。作業濃度のために、５μＬのＩＬ－２ストック（１００μｇ／ｍＬ）を２５ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（２０ｎｇ／ｍＬ）で希釈した。２．５ｍＬの希釈ＩＬ－２を細胞に添加した。したがって、ウェルの最終体積は、１０ｎｇ／ｍＬ（２１０ＩＵ）のＩＬ－２を含有する５ｍＬであった。
５日目に、ＰＢＭＣを５０ｍＬのファルコンチューブに回収し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。使用済みの培地をデカントし、刺激細胞及び非刺激細胞を、完全ＲＰＭＩ培地を含有するＩＬ－２（最終濃度２１０ ＩＵ）に再懸濁させた。細胞懸濁液を、５ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに添加した。
８日目及び１０日目に、５日目に行ったようにＩＬ－２の補充を繰り返した。１２日目又は１４日目に、抗ヒトＣＤ８、ＣＤ３、及びＴＣＲＶβ１７抗体で細胞を染色することによって、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を計数し、フローサイトメーター（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）上で取得した。
７．１．３．ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮
ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（陰性選択）を製造業者の指示に従って使用して、Ｍ１ペプチドで刺激された、又は刺激されなかった全ＰＢＭＣから実行した。簡潔には、培養の１２日目又は１４日目からのＦＬＵ ＭＰ５８ペプチド刺激ＰＢＭＣを収集した。非刺激ＰＢＭＣでは、５０ｍＬのファルコンチューブ内で、凍結させたＰＢＭＣを迅速に解凍し、温かい４９ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）培地に添加して、凍結培地を希釈することによって、新鮮なＰＢＭＣを収集した。
上記の細胞を１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１倍のＰＢＳ及び２％のＰＢＳ）で１回洗浄した。細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２０１４４、及びロット番号１８Ｄ８９４４４）に５×１０７細胞／ｍＬで（０．２５～２ｍＬの体積で）再懸濁させた。細胞を５ｍＬのポリスチレン丸底チューブに移した。５０マイクロリットルの濃縮カクテルを、再懸濁した細胞の１ｍＬごとに（５Ｘ１０７個の細胞）添加した。カクテルを混合し、細胞と共に室温で１０分間インキュベートした。それと同時に、磁性粒子を３０秒間ボルテックスした。ボルテックスした１５０μＬの磁性粒子を、上記のステップからの１ｍＬの再懸濁した細胞に添加した。室温で混合した後、インキュベーションを５分間続けた。インキュベーション期間の終わりに、２．５ｍＬのＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液でチューブを満たした。チューブを、静止磁石上に室温で５分間置いた。インキュベーション期間の終わりに、磁石を用いてチューブを１回の連続運動で戻して、濃縮細胞懸濁液を収集した。収集した細胞懸濁液を、１５００ｒｐｍ、室温で５分間スピンダウンした。細胞ペレットを細胞培養培地に再懸濁させ、血球計数器（haemocytometer）で細胞数を計数した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を評価するために、濃縮細胞懸濁液を抗ヒトＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７２４、及びロット番号Ｂ２４２２３３）及びＣＤ３ ｍＡｂで染色した。
７．１．４．Ｖβ１７＋細胞の濃縮
ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７６５３Ａ、及びロット番号１００００１４８６２）を製造業者の説明書に従って（わずかな修正を加えて）使用して、Ｍ１ペプチド活性化及び増殖ＰＢＭＣ、又は非刺激ＰＭＢＣのいずれかに由来する陰性濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞（第７．１．３節に記載）からＶβ１７＋細胞を陽性選択した。
簡潔には、濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集し、１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。細胞濃度を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液（０．２５～２ｍＬ）中１×１０８細胞／ｍＬに調整した。Ｆｃ受容体ブロッカー（１００μＬ／ｍＬ）を添加して、Ｆｃ受容体を介した抗体の非特異的結合をブロックした。Ｆｃ受容体でブロックした細胞を、抗ヒトＶβ１７ビオチンｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１５－２４６、及びロット番号５１８０８０６６４６）と共に、室温、暗所で１５分間更にインキュベートした。３０００万のＣＤ８＋Ｔ細胞では、３０μＬのＦｃブロック及び３０μＬの抗ヒトＶβ１７を使用した。５ｍＬのポリプロピレンチューブを使用した。
インキュベーション期間の終わりに、２ｍＬのＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液でチューブを満たした。細胞を１５００ｒｐｍ、室温で５分間スピンダウンした。細胞ペレットをＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液に再懸濁させ、細胞懸濁液を新しい５ｍＬのポリプロピレンチューブに移した。再懸濁した細胞に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ陽性選択カクテル（１００μＬ／ｍＬ）を添加した。具体的には、ピペットを用いて細胞を穏やかに再懸濁させることによって、陽性選択カクテルを細胞と混合した。細胞懸濁液を室温で３分間インキュベートした。それと同時に、３０秒間ボルテックスすることによって放出可能なＲａｐｉＳｐｈｅａｒｅｓ（商標）を調製した。放出可能なＲａｐｉｄＳｐｈｅａｒｅｓ（商標）（１００μｌ／ｍＬ）を再懸濁細胞に添加した。試料を混合し、室温で３分間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、チューブを２．５ｍＬのＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液で満たし、室温で１０分間インキュベーションするために静止磁石に入れた。ピペットを使用して上清全体を慎重に、こぼすことなく１回で収集した。ピペットを使用して細胞を穏やかに上下にピペッティングすることによって、２．５ｍＬのＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液での洗浄を更に２回繰り返した。細胞を、０．２５～２ｍＬのＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液に再懸濁させた。再懸濁の間、細胞をチューブの側面から回収し、穏やかに上下に２～３回ピペッティングすることによって混合した。再懸濁した細胞に１倍の放出緩衝液（１００μＬ／ｍＬ）を添加し、続いて混合し、室温で３分間インキュベートした。チューブを２．５ｍＬのＥａｓｙＳｅｐ（商標）緩衝液で満たし、穏やかに上下に２～３回ピペッティングすることによって細胞を混合した。チューブを静止磁石に入れ、室温で５分間インキュベートした。壁に付着したＲａｐｉｄＳｐｈｅａｒｅｓ（商標）を乱さないように、濃縮細胞集団を新しいチューブにピペットで注意深く移した。細胞を１５００ｒｐｍ、室温で、５分間スピンダウンした。細胞懸濁液を細胞培養培地に再懸濁させ、血球計数器で計数した。Ｖβ１７＋Ｔ細胞の純度を評価するために、濃縮細胞懸濁液を抗ヒトＣＤ８及びＶβ１７ ｍＡｂで染色した。ビオチン化Ｖβ１７ｍＡｂの標識効率の対照として、Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅａｒｅｓ（商標）のインキュベーション後であるが、放出緩衝液のインキュベーション前の陰性画分を収集し、Ｖβ１７＋の存在量を評価した。
濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞において、Ｖβ１７＋細胞は、約３０～５０％を占めた（図２Ａ、左）。陽性画分中の濃縮Ｖβ１７＋細胞（図２Ａ、中央）及び陰性画分中の残りのＶβ１７＋細胞（図２Ａ、右）によって明らかなように、Ｖβ１７＋細胞は、濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞から陽性選択され、濃縮された。したがって、Ｖβ１７＋細胞は、陰性画分と比較して陽性画分において首尾よく濃縮された。
７．１．５．濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
製造業者の説明書に従ってＨｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を使用して、上記の節からの単離したＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、活性化した。５ｍＬのポリスチレンチューブ中で、所望のビーズ体積を過剰体積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０－１３６、ロット番号１９２９９７３）、好ましくは１ｍＬに再懸濁させることによってＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を洗浄した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を５秒間ボルテックスし、磁気スタンドに１～２分間ドッキングした。チューブが磁気スタンド上にある間に上清を廃棄した。５ｍＬのポリスチレンチューブ中で、所望のビーズ体積を過剰体積の完全培養培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（好ましくは１ｍＬ）に再懸濁させることによってＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を洗浄した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を５秒間ボルテックスし、磁気スタンドに１～２分間ドッキングした。チューブが磁気スタンド上にある間に上清を廃棄した。ビーズを培養培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に再懸濁させた。
１×１０６の濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞では、洗浄した２５μのＨｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を添加して、１：１の細胞対ビーズ比を得た。３０ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を培養物に添加した。上記の溶液を、加湿ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を２４ウェルプレートから回収し、ＤＰＢＳで１回洗浄した。
ＤＰＢＳ中の細胞懸濁液を５ｍＬの丸底ポリスチレンチューブに移した。チューブを静止磁石上において室温で５分間インキュベートすることによって、細胞懸濁液からビーズを除去した。チューブが磁石上にある間に、上清をピペットで注意深く収集した。上清をスピンダウンした。細胞ペレットを完全培養培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で１回洗浄した。細胞を血球計数器で計数した。Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態を、ＣＤ６９（Ａｌｅｘａ ６４７ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１０９１８、及びロット番号Ｂ２４６３１３）、ＣＤ２５、及びＣＤ６２Ｌのそれらの表面発現を測定することによって評価した。
７．１．６．Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インフルエンザＡウイルス特異的であり、エクスビボで活性化され、増殖され得る
表面表現型プロファイリングを以下のように行った。新鮮な、又は培養したＰＢＭＣを採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ及び２％のＦＢＳ）で１回洗浄した。細胞は、血球計数器を使って計数した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ及び２％のＦＢＳ）で細胞ペレットを１回洗浄した。細胞（１～２×１０６細胞／ｍＬ）を、９６ウェルＶ底プレート内のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉｏｌｅｔ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ（０．１μＬ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３４９５５、及びロット番号１９１０６８６）及びＨｕｍａｎ Ｔｒｕｓｔａｉｎ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（５μＬ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２、及びロット番号Ｂ２４７１８２）の両方を含有する１００μＬのＰＢＳ中、４℃、暗所にて３０分間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ及び２％のＦＢＳ）で１回洗浄した。抗体マスターミックスを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中４℃で３０分間インキュベートすることによって、細胞を染色した。インキュベーション期間後、細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。細胞は、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターで取得した。
細胞内エフェクター分子プロファイリングを、表面表現型プロファイリングの後に行った。表面染色細胞は、１００μＬのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４７２２、及びロット番号７１５６８８５）に細胞ペレットを再懸濁させることによって固定した。細胞懸濁液を４℃で１５分間、暗所にてインキュベートした。インキュベーション後、細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。上清を廃棄し、細胞ペレットを２００μＬの１倍のＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４７２３、及びロット番号７１８０８８８）に再懸濁させることによって細胞を洗浄した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。上清を廃棄し、細胞ペレットを、グランザイムＢ（ＡＰＣ抗ヒトグランザイムＢ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３７２２０４、及びロット番号Ｂ２４８６５１）及びパーフォリン（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１抗ヒトパーフォリン、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０８１３０、及びロット番号Ｂ２４２４６５）など細胞内抗原に対する抗体を含有する、１００μＬの１倍のＰｅｒｍ／Ｗａｓｈに再懸濁させた。細胞懸濁液を４℃で３０分間、暗所にてインキュベートした。
インキュベーション期間後、細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。１５０μＬの１倍のＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈを添加することによって細胞を洗浄し、次いで、２００μＬの１倍のＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈに細胞ペレットを再懸濁させることによってもう１回再洗浄した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。上清を廃棄し、細胞ペレットを１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ及び２％のＦＢＳ）に再懸濁させた。細胞は、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターで取得した。
Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がインフルエンザＡウイルス特異的であるか否かを同定するために、ＨＬＡ＊０２０１の健康な個体由来の全ＰＢＭＣをインフルエンザＡ由来のＭ１（５８－６６）ペプチドで刺激し、Ｖβ１７＋細胞の活性化及び存在量を評価した。Ｍ１ペプチドベースの刺激は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化した。これは、培養８日目のそれらの活性化状態（ＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ７１の表面発現）及びエフェクタープロファイル（細胞内グランザイムＢ、パーフォリン、及びＣＤ１０７ａ）によって明らかである（図２Ｂ）。同様に、全ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＶβ１７＋細胞の存在量は、培養期間の０日目と比較して、１４日目に著しく増加した（図２Ｃ）。一方、ＩＬ－２刺激のみでは、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化も増殖も生じなかった（図２Ｂ及び図２Ｃ）。更に、インフルエンザＡ由来のマトリックスタンパク質（Ｍ１）ペプチド負荷ＭＨＣクラスＩ四量体（ＭＢＬ、カタログ番号ＴＳ－００１２－２Ｃ、及びロット番号００４）は、増殖したＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の実質的に全て（約８６％）で検出され、これらの細胞が実際にインフルエンザＡ特異的であり、Ｍ１ペプチドの細胞表面受容体を発現することが再確認された（図２Ｄ）。
７．１．７．活性化Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗ＴＡＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡの電気穿孔
Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記のように、Ｍ１ペプチド刺激ＰＢＭＣ又は非刺激ＰＢＭＣのいずれかから単離した。非刺激ＰＢＭＣの場合、濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、第７．１．５節に記載のように活性化した。
細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。細胞ペレットを、Ｎｅｏｎトランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＰＫ１０９６、及びロット番号２Ｋ１１３１１）からの緩衝液Ｔ（１×１０６細胞／９０μＬの緩衝液Ｔ）で非常に穏やかに再懸濁させた。１０マイクロリットル（１０μｇ）のＧＦＰ／抗腫瘍関連抗原ＣＡＲ ｍＲＮＡ（約１μｇ／μＬのｍＲＮＡ濃度）を細胞懸濁液に添加した。細胞懸濁液を上下に２回ピペッティングすることによって、細胞懸濁液を穏やかに混合した。Ｎｅｏｎチップ（１００μＬチップ）を、Ｎｅｏｎピペットを用いてＮｅｏｎチップボックスから取り出すことによって調製し、穏やかに上下に押して、閉じ込められた空気を除去した。１００μＬの細胞懸濁液（１０μＬのｍＲＮＡを含む９０μＬの細胞懸濁液）を、Ｎｅｏｎチップにゆっくりと入れた。気泡が先端に入らないように注意した。それと同時に、３．５ｍＬの電解質緩衝液（緩衝液Ｅ）をＮｅｏｎチューブに添加した。細胞懸濁液を含有するＮｅｏｎチップを、電解質緩衝液を含有するＮｅｏｎチューブにゆっくりと入れた。Ｎｅｏｎチューブ（Ｎｅｏｎチップを含む）をＮｅｏｎドッキングステーションに入れた。
電気穿孔を、１４００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、及び１パルスで行った。電気穿孔の直後に、Ｎｅｏｎチップ（細胞懸濁液及びｍＲＮＡを含む）をＮｅｏｎチューブから取り出した。１０％のＦＢＳを含み、抗生物質を含まない、予め温めた２．５ｍＬのＲＰＭＩ培地を含有する６ウェルプレートに細胞を添加した。プレートを穏やかに揺り動かして、ウェル内の細胞の均一な分布を確実にし、加湿ＣＯ２インキュベーター中の３７℃でインキュベートした。非電気穿孔対照として、１０μＬのｍＲＮＡ ＧＦＰ又は空のＣＡＲを、１×１０６濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する９０μＬの緩衝液Ｔに添加した。代替対照として、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をｍＲＮＡなしで電気穿孔した。１０％のＦＢＳを含み抗生物質を含まない、予め温めた２．５ｍＬのＲＰＭＩ培地を含有する６ウェルプレートに細胞を添加した。プレートを穏やかに揺り動かして、ウェル内の細胞の均一な分布を確実にし、加湿ＣＯ２インキュベーター中の３７℃でインキュベートした。
細胞生存率（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色について陰性の細胞を測定することによる）及びトランスフェクション効率（ＧＦＰ＋細胞の頻度を測定することによる）を、一晩の休止期間後に細胞を含有する１００～２００μＬの培養培地を採取することによって決定した。α－ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ１２３抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０６０１４、ロット番号Ｂ２０１９４４）を評価する際に、ＧＦＰ発現をＣＡＲ発現の間接的な読み出しとした。α－ＰＳＭＡ ＣＡＲ表面発現を評価するために、ウサギ抗ラクダ科動物抗体を使用した（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４２５０６、及びロット番号Ｂ２２４６２２）。生存率及びＣＡＲ表面発現を評価したら、細胞を６ウェルプレートから回収し、血球計数器で計数した。
具体的には、２つのＣＡＲ構造体、抗ＣＤ１２３又は抗ＰＳＭＡを試験し（以下の表２を参照）、ＣＡＲ構造体によるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のトランスフェクション率を測定した。α－ＣＤ１２３ ＣＡＲ表面発現を検出するために利用可能な試薬がなかったため、ＧＦＰ発現を、α－ＣＤ１２３ ＣＡＲ表面発現について陽性又は陰性の細胞の存在量を推定するための代用マーカーとみなした。したがって、細胞の約７８％が陽性ＣＡＲ表面発現とみなされた（図３の上列）。Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのα－ＰＳＭＡ ＣＡＲ表面発現を検出するために、ウサギ抗ラクダ科動物抗体ｍＡｂを使用した。したがって、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の約６８％が、それらの表面上のα－ＰＳＭＡ ＣＡＲに対して陽性であった（図３の下列）。
Figure 2023537526000004
７．２．実施例２－Ｖβ１７＋ ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔの細胞障害性の評価
７．２．１．標的細胞、エフェクター細胞、及び共培養の調製
Ｋａｓｕｍｉ－３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－２７２５、ロット番号６３９９０１３３）を、ＲＰＭＩ、２０％のＦＢＳ、及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐの溶液中で培養した。細胞を３日ごとに継代した。簡潔には、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞をフラスコから収集し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を０．３～０．５×１０６で播種し戻した。新鮮な培地中で、１．０～２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を維持した。
２２Ｒｖ１細胞を、１０％のＦＢＳ及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞を３日ごとに継代した。簡潔には、７５～８０％のコンフルエントな２２Ｒｖ１単層細胞をＤＰＢＳですすぎ、血清のあらゆる痕跡を除去した。３～５ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｔ－７５フラスコの場合）を添加することによって細胞をフラスコから分離し、加湿インキュベーター中、３７℃で５～１０分間インキュベートした。インキュベーション期間後、過剰な培養培地（Ｔ－７５フラスコの場合は、２０ｍＬの完全培地）を添加することによってトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を中和した。細胞を収集し、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。上清を廃棄し、細胞を新鮮な完全ＲＰＭＩ培地に合計１５ｍＬの培養培地中０．１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し戻した。
ＣＤ１２３及びＰＳＭＡ発現を標的細胞で検出した。５万個のＫａｓｕｍｉ－３又は２２Ｒｖ１細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ及び２％のＦＢＳ）中で染色した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。抗ヒトＣＤ１２３又はＰＳＭＡ抗体を、それぞれのアイソタイプと共に、ＦＡＣＳ緩衝液（１倍のＰＢＳ及び２％のＦＢＳ）中２μｇ／ｍＬの濃度で細胞に添加した。試料のアリコートは、未染色のままにした。細胞を４℃で３０分間、暗所にてインキュベートした。インキュベーション後、細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ及び２％のＦＢＳ）で洗浄して、未結合抗体を除去した。洗浄をもう１回繰り返したので、２回の洗浄を行った。
染色細胞を１００μＬのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ、カタログ番号５５４６５５、ロット番号７２７１５９８）に氷上で１５分間再懸濁させることによって、染色試料を固定した。インキュベーション期間後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。染色細胞をフローサイトメーター（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）で取得し、続いてＦｌｏｗ Ｊｏ（バージョン１０．３）によって分析した。ゲーティングは、アイソタイプ及び／又はＦＭＯ対照を使用して確立した。
標的細胞（Ｋａｓｕｍｉ－３／２２Ｒｖ１）をＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５４、ロット番号１８７８３４２）で標識した。Ｋａｓｕｍｉ－３／２２Ｒｖ１細胞を採取し、単純ＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。細胞を計数し、密度を８×１０６細胞／ｍＬに調整した。細胞を１倍のＰＢＳ中１ｍＬの０．５μＭ ＣＦＳＥに再懸濁させ、時々混合しながら室温で８分間インキュベートした。１ｍＬのＦＢＳを添加して標識反応を停止させ、その後、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、及び１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で２回洗浄した。血球計算器を使用して細胞を計数し、ＥＴ比に従って１００μＬ体積中の細胞密度を調整した。ＣＦＳＥ標識標的細胞を、それぞれ２２Ｒｖ１細胞及びｋａｓｕｍｉ－３細胞の共培養の前日又は同日に播種した。共培養設定に対して１の標的比を得るために、９６ウェルプレートの１ウェル当たり３５，０００個及び１０，０００個の２２Ｒｖ１細胞及びＫａｓｕｍｉ－３細胞をそれぞれ播種した。
エフェクター細胞（Ｖβ１７＋ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞）の調製を以下のように実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、第７．１．３節に記載のように、新鮮なＰＢＭＣ又はＭ１ペプチドで１２日間刺激したＰＢＭＣのいずれかから陰性濃縮した。単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞中のＶβ１７＋細胞を、第７．１．４節に記載のように陽性濃縮した。Ｖβ１７＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の純度を、フローサイトメトリーによって、抗ヒトＣＤ８及び抗ヒトＶβ１７モノクローナル抗体で染色することによって濃縮後に評価した。第７．１．７節に詳述したようにＮｅｏｎ電気穿孔システムを用いて、濃縮Ｖβ１７＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ｍＲＮＡ電気穿孔を行った。電気穿孔後、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を一晩休ませた。休止期間後、トランスフェクトされたＶβ１７＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞（エフェクター）のＣＡＲ発現及び生存率を評価し、細胞を適切に希釈して、細胞傷害性実験における様々なエフェクター対標的（ＥＴ）比に適応させた。増殖実験のために、ＣＡＲトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１μＭのＣＴＶを含有する１ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁させることによって、ＣＴＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５７、及びロット番号１９４２２６０）で標識し、時々混合しながら、３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、１ｍＬのＦＢＳ、続いて８ｍＬの完全培養培地を添加することによって標識を停止したため、総体積は１０ｍＬである。細胞を１５００ｒｐｍ、室温で５分間スピンダウンし、血球計数器で計数した。
標的及びエフェクターの調製後に共培養を行った。ＣＦＳＥ標識標的細胞を上記のように播種した。共培養の日に、培養培地を標的細胞（２２Ｒｖ１の場合）の播種ウェルから除去し、新鮮な培地（１００μＬ）を補充した。標的細胞に、ＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を１００μＬの体積の完全ＲＰＭＩ培地に添加して、所望のＥＴ比を得た。ＣＡＲトランスフェクション効率の差を正規化するために、ＥＴ比をＣＡＲ＋細胞に対して正規化した。この目的のために、ＧＦＰ発現をα－ＣＤ１２３ ＣＡＲの代用読み出しとみなし、α－ＰＳＭＡ ＣＡＲ発現エフェクター細胞についてウサギ抗ラクダ科動物ｍＡｂによって媒介される表面染色を測定した。細胞傷害性及びサイトカインを評価するために、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間（Ｋａｓｕｍｉ－３標的細胞）及び７２時間（２２Ｒｖ１標的細胞）の期間にわたって、様々なＥＴ比（ＣＡＲ＋細胞に対する正規化後）でエフェクター細胞及び標的細胞を共培養した。増殖を評価するために、エフェクター細胞及び標的細胞を１：１のＥＴ比（ＣＡＲ＋細胞に対する正規化後）で５日間共培養した。標的細胞（２２Ｒｖ１／Ｋａｓｕｍｉ－３）を単独で培養して、自発的細胞死を定めた。共培養期間の終わりに、細胞を１５００ｒｐｍ、室温で５分間スピンダウンし、サイトカイン分析のために１００μＬの上清を収集した。接着性標的細胞の共培養の場合、標的細胞（２２Ｒｖ１）は、細胞を５０μＬのトリプシン－ＥＤＴＡと共に加湿インキュベーター中、３７℃で２～３分間インキュベートすることによって分離した。インキュベーションの終わりに、５０μＬのそれぞれの完全培養培地を添加することによってトリプシンを中和した。懸濁標的細胞（ｋａｓｕｍｉ－３）の共培養の場合、エフェクター及び標的の両方を口蓋から回収した。Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターで細胞を取得する直前に、７－ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０４０４、ロット番号Ｂ２３５８７５）を添加した（１μＬ／ウェル）。
フローサイトメトリーに基づいた取得及び分析を以下のように行った。表面表現型プロファイリング実験のために、細胞を最初に、全細胞についてＦＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ｈでゲーティングした。全細胞から生細胞をゲートインした。ＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈパラメータでゲーティングすることによって、生細胞からダブレットを排除した。ここから、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋細胞をゲーティングすることによって表面プロファイリングを行った。細胞障害性及び表増殖アッセイについては、ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いてＮｏｖｏｃｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで、染色細胞を取得した。一般的なフォルダを介して、Ｆｌｏｗ Ｊｏ（バージョン１０．３）を含むデスクトップにデータを転送した。細胞障害性実験については、ＣＦＳＥ陽性細胞を最初にゲーティングして標的細胞を同定した。ＣＦＳＥ陽性細胞内では、死細胞を、７－ＡＡＤ＋ ＦＳＣｌｏｗ細胞として同定した。ゲートは、ＣＦＳＥ未染色及び７－ＡＡＤ未染色細胞に基づいて設定した。ＣＡＲトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞から特異的に生じる細胞溶解を計算するために、自発的標的細胞溶解値を、ＧＦＰ、α－ＣＤ１２３ ＣＡＲ、又はα－ＰＳＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡで電気穿孔されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するウェルから得た細胞溶解値から減算した。増殖アッセイについては、ダブレットの除外後、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ生細胞をゲートオンし、ＣＴＶをプロットすることによって（ヒストグラムモードで）それらの増殖を評価した。エフェクター細胞の抗原増殖を同定するために、エフェクター単独又は標的細胞と共培養したエフェクターからのヒストグラムを重ね合わせた。
７．２．２．共培養中のＶβ１７＋ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞からの細胞傷害性及びサイトカイン分泌の測定
Ｈｕｍａｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ａｓｓａｙ ＬＸＳＡＨＭ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＬＸＳＡＨＭ－１５、及びロット番号Ｌ１３２２６８）を製造業者の指示に従って使用して、細胞培養上清中のサイトカイン分析を行った。簡潔には、細胞培養上清を、共培養期間の終わりに収集した（Ｋａｓｕｍｉ－３は２４時間後、２２Ｒｖ１標的細胞は３日後）。２００μＬの細胞培養上清を共培養ウェルから採取し、１５００ｒｐｍ、室温で４分間スピンダウンした。スピンダウンした試料から１００μＬの上清を収集した（上清中の細胞源を最小限にするため）。回収した上清を、分析まで－２０℃で保存した。分析の日に、サンプルを氷上でゆっくりと解凍し、５０マイクロリットルの細胞培養上清又はそれぞれの標準をマイクロプレートに添加した。分析対象の濃度が高い場合は、上清を１：１又は１：２に希釈する必要があった。その後、５０マイクロリットルの希釈微粒子カクテルをマイクロプレートの各ウェルに添加した。５０マイクロリットルの標準及び試験試料の両方をそれぞれのウェルに添加した。プレートをホイルシーラーでしっかりと覆い、ＭｉｘＭａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）振盪機（３００ｇ）上で、室温にて２時間インキュベートした。
インキュベーション期間後、プレートを磁気スタンドにドッキングし、２分間静置した。プレート内の微粒子を失うことなく、ウェルの内容物を一度に廃棄した。その後、磁気スタンドを装着したプレートをペーパータオルに押し付けて、過剰な滲出液を除去した。磁気スタンド上にプレートをしっかり載せたことを確認した。
１００μＬの洗浄緩衝液を添加することによって、マイクロプレートを３回洗浄し、上記の廃棄ステップを行った。５０マイクロリットルの希釈ビオチン抗体カクテルを各ウェルに添加した。プレートをホイルシーラーで覆い、ＭｉｘＭａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）振盪機（３００ｇ）上で、室温にて１時間インキュベートした。マイクロプレートのウェルの内容物を、上記の廃棄ステップで廃棄した。１００μＬの洗浄用緩衝液でプレートを３回洗浄した。
５０マイクロリットルの希釈ストレプトアビジン－ＰＥをマイクロプレートの各ウェルに添加した。ＭｉｘＭａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）振盪機（３００ｇ）上で、プレートを室温にて３０分間インキュベートした。１００μＬの洗浄緩衝液を添加することによって、マイクロプレートを３回洗浄し、上記の廃棄ステップを行った。１００μＬの洗浄緩衝液をマイクロプレートの各ウェルに添加することによって、マイクロ粒子を再懸濁させた。ＭｉｘＭａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）振盪機（３００ｇ）上で、プレートを室温で２分間インキュベートした。
プロトコルの最終ステップの９０分以内にＭＡＧＰＩＸ（登録商標）アナライザーでプレートを読み取った。試験試料中の分析対象の濃度をプロットしながら、ブランク（単純細胞培養培地）値を試験値から減算した。
ＣＡＲ媒介Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を測定した。ＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３／２２Ｒｖ１）細胞を、ＣＡＲ（抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ）トランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）と、様々なエフェクター対標的（ＥＴ）比で２４時間及び７２時間共培養した。対照として、ＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３／２２Ｒｖ１）細胞も、ＧＦＰトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に様々なＥＴ比で培養した。トランスフェクション効率の差のため、ＥＴ比をＣＡＲ＋エフェクター細胞に対して正規化した。驚くべきことに、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、様々なＥＴ比において、ＣＤ１２３及びＰＳＭＡ発現Ｋａｓｕｍｉ－３細胞及び２２Ｒｖ１細胞に対する顕著なＣＡＲ依存性細胞傷害性をそれぞれ示した（図４Ａ）。注目すべきことに、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、約０．３：１の低ＥＴ比で、シリアルキラーＴ細胞の特徴的なホールマーク特徴である、著しい細胞傷害性を示した（図４Ａ）。一方、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＥＧＦＰ ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴｒｉＬｉｎｋ、カタログ番号Ｌ－７２０１－１００、及びロット番号ＷＯＴＬ２９２０６）は、Ｋａｓｕｍｉ－３又は２２Ｒｖ１標的細胞に対する細胞傷害性を媒介しなかった（図４Ａ）。
抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲ媒介Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞増殖を分析するために、ＣＴＶ標識ＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を非標識標的細胞（Ｋａｓｕｍｉ－３／２２Ｒｖ１細胞）と５日間共培養した。ＣＴＶ希釈を、ＣＡＲ発現Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の尺度とみなした。興味深いことに、ＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＴＶ希釈は、抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲ発現Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がいかなる増殖も受けていないことを暗示した（図４Ｂ）。これは、これらの細胞で観察された細胞傷害性とは全く対照的である（図４Ａ）。
ＣＡＲ発現Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞から産生されるサイトカイン／エフェクター分子の大きさ及びタイプを評価するために、共培養実験から培養上清を収集し、様々な炎症誘発性サイトカイン及びエフェクター分子並びに抗炎症性サイトカイン及びエフェクター分子についてプロファイリングした。興味深いことに、抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲ発現Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、相当量のエフェクターシグネチャーサイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）及びエフェクター分子（グランザイムＡ及びＢ）を産生した（図４Ｃ）。注目すべきことに、ＩＬ－６及びＩＬ－１０のようなサイトカインは、標的細胞との共培養中にはＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生されなかった。これは、あらゆるＣＡＲ発現Ｔ細胞に対して最も求められている特徴である（図４Ｃ）。しかしながら、ＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、多量のエフェクターシグネチャーサイトカイン及びエフェクター分子を産生した（図４Ｃ）。Ｍ１ペプチド媒介活性化細胞及び増殖細胞が高度に分化した細胞を反映するかどうかを試験するために、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＡ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４１４８、及びロット番号Ｂ２２８６６９）で染色し、それらの大部分（約８０％）が、それらの培養１２日目にエフェクターメモリー表現型（ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）を示すことを見出した（図４Ｄ）。この観察は、共培養設定におけるＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の欠如を部分的に説明する。更に、ＧＦＰ発現Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞による、観察されたＣＡＲ非依存性エフェクターサイトカイン又はエフェクター分子の分泌はまた、これらの細胞の分化状態に起因し得る。
抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、液性腫瘍（ｋａｓｕｍｉ－３）及び固形腫瘍（２２Ｒｖ１）に対する細胞傷害性を組み込むのに有効であったが、標的細胞との共培養中にこれらの細胞の明確な増殖は観察されなかった。この観察された特徴は、高度に分化したＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクターメモリー／ＥＭＲＡ細胞）を連想させるものであり、これらは、残留増殖能又は自己複製能を備えた強力な細胞傷害性の可能性を示す。活性化誘導性末端分化を回避し、ＣＡＲ媒介増殖を促進するために、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を新鮮な全ＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで一時的に活性化した後、抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。エフェクター細胞（ＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）を、標的細胞（Ｋａｓｕｍｉ－３／２２Ｒｖ１細胞）と、細胞傷害性を評価するために様々なＥＴ比で（図５Ａ）、増殖のために１：１で（図５Ｂ）共培養した。Ｍ１ペプチド活性化細胞と同様に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞及び２２Ｒｖ１細胞に対して顕著な、同等の、かつＣＡＲ媒介性の細胞傷害性を示した（図５Ａ）。興味深いことに、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（エフェクター）によって一時的に活性化されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、標的細胞株との共培養時に顕著なＣＡＲ依存性増殖を示した（図５Ｂ）。この観察は、共培養期間の終わりにエフェクター細胞の中にかなりの量のあまり分化していない細胞（セントラルメモリー表現型：ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）が存在することによって更に裏付けられた（図５Ｄ）。Ｍ１ペプチド媒介活性化対抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ媒介活性化によって誘導されるＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化において観察された差は、ａ）活性化のモード（ＴＣＲ対ＣＤ３／ＣＤ２８）；ｂ）活性化の期間；ｃ）ＴＣＲシグナル伝達の強度、又はａ）、ｂ）及びｃ）の累積効果に起因し得る。更に、ＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）単独、又は標的細胞と共培養されたＧＦＰトランスフェクト又は非トランスフェクトＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれも、これらの細胞の増殖をもたらさなかった（図５Ｂ）。これは、観察されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が、ＣＡＲ依存性及び標的細胞依存性であったことを示す。加えて、抗ＣＤ１２３／ＰＳＭＡ ＣＡＲ陽性Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター）のサイトカインプロファイルは、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２２及びＩＬ－４サイトカインの残留量と共に、エフェクターサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα）及びエフェクター分子（グランザイムＡ及びＢ）のシグネチャーを示した（図５Ｃ）。
上記から、例示の目的で具体的な実施形態が本明細書に記載されているが、本明細書で提供されるものの趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることが理解されよう。上記で言及された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献のそれぞれはその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

Claims (32)

  1. ヒトインフルエンザＡウイルス由来のＭ１ペプチド（Ｍ１５８－６６）を、Ｔ細胞を含む細胞集団と接触させることを含む、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、又は濃縮するための方法。
  2. 前記Ｍ１ペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. ＩＬ－２を、前記Ｔ細胞を含む前記細胞集団と接触させることを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記細胞集団は、前記Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２を含む培地においてエクスビボで培養される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記方法は、
    （ｉ）前記Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において前記細胞集団をエクスビボで培養すること、
    （ｉｉ）前記Ｍ１ペプチドを含む培地において前記細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において前記細胞集団をエクスビボで培養すること、又は
    （ｉｉｉ）前記Ｍ１ペプチドを含む培地において前記細胞集団をエクスビボで培養し、次いで前記Ｍ１ペプチド及びＩＬ－２を含む培地において前記細胞集団をエクスビボで培養し、次いでＩＬ－２を含む培地において前記細胞集団をエクスビボで培養することを含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記細胞集団は、エクスビボで少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間培養される、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 前記細胞集団は、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記全ＰＢＭＣの集団は、健康なドナーに由来する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記方法は、前記細胞集団からの前記ＣＤ８＋細胞中の前記Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、若しくは１５倍増加させる、又は前記方法は、前記細胞集団からの前記ＣＤ８＋細胞中の前記Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、少なくとも６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％に増加させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記方法は、前記細胞集団の前記Ｍ１ペプチド及び／又はＩＬ－２との接触後に、前記細胞集団からＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離された集団。
  12. 単離された細胞集団であって、単離された前記細胞集団中のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％を超える、単離された細胞集団。
  13. 前記Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも一部は、前記Ｍ１ペプチドに結合することができる細胞表面受容体を発現する、請求項１２に記載の単離された細胞集団。
  14. ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ｉ）請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、単離された前記細胞集団を得ることと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を前記Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することとを含む、前記方法。
  15. 前記ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記細胞外ドメインは、癌細胞上で発現した抗原に結合する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記癌細胞は、血液癌細胞又は固形腫瘍癌細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記抗原はＣＤ１２３又はＰＳＭＡである、請求項１６に記載の方法。
  19. 請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、ＣＡＲ－Ｔ細胞。
  20. 請求項１９に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞の治療有効量を対象に投与することを含む、前記対象において疾患又は障害を治療する方法。
  21. 前記疾患又は前記障害は癌である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記癌は、血液癌又は固形腫瘍癌である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記対象は、前記方法を必要としているヒト対象である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するためのプロセスであって、（ｉ）請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、単離された細胞集団を得る機能を実行するステップと、（ｉｉ）前記Ｖβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＡＲを発現させる機能を実行するステップとを含む、前記プロセス。
  25. 癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段と、ドナーＴ細胞に対するアロ反応性を低減することができる第２の手段とを含む、システム。
  26. 癌細胞の表面上の抗原を結合することができる前記第１の手段は、請求項１９に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現したＣＡＲを含む、請求項２５に記載のシステム。
  27. 前記ドナーＴ細胞に対するアロ反応性を低減することができる前記第２の手段は、Ｖβ１７＋ＣＤ８＋細胞を含む、請求項２５又は２６に記載のシステム。
  28. 癌細胞の表面上の抗原を結合することができる第１の手段と、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭ１ペプチドを結合することができる第２の手段とを含む、Ｔ細胞。
  29. 前記Ｔ細胞はＶβ１７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２８に記載のＴ細胞。
  30. 癌細胞の表面上の抗原を結合することができる前記第１の手段は、請求項１９に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現したＣＡＲを含む、請求項２８又は２９に記載のＴ細胞。
  31. 前記Ｍ１ペプチドを結合することができる前記第２の手段は、前記Ｍ１ペプチドを結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  32. 実質的に本明細書、配列表、又は図面に記載されるとおりの分子、ペプチド、組成物、調製物、方法、使用、プロセス、又はシステム。
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