CN114181319A - 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents

用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114181319A
CN114181319A CN202111425242.1A CN202111425242A CN114181319A CN 114181319 A CN114181319 A CN 114181319A CN 202111425242 A CN202111425242 A CN 202111425242A CN 114181319 A CN114181319 A CN 114181319A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
polypeptide conjugate
cells
coupling agent
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111425242.1A
Other languages
English (en)
Inventor
秦志海
陶宁
李建茹
陈波
李香群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Win Win Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Win Win Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Win Win Technology Co ltd filed Critical Beijing Win Win Technology Co ltd
Priority to CN202111425242.1A priority Critical patent/CN114181319A/zh
Publication of CN114181319A publication Critical patent/CN114181319A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001112—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用。所述多肽偶联物包括靶向肿瘤细胞的插入肽、偶联剂以及CD19多肽；其中，所述插入肽通过所述偶联剂与所述CD19多肽连接；所述插入肽选自如下(a1)或(a2)：(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的多肽；(a2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且为具有靶向肿瘤细胞功能由(a1)衍生的多肽。本发明利用了原本影响肿瘤的发展和治疗效果的肿瘤低氧和酸化特征，令其成为治疗的靶向条件，能够将目标分子特异性的插入到肿瘤微环境的细胞中，给肿瘤带有特异性的标志，为靶向杀伤和治疗提供靶点，从而吸引免疫细胞靶向攻击和杀伤。

Description

用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤微环境是由肿瘤细胞、多种基质细胞以及一系列的细胞因子和趋化因子组成。其中基质细胞包括成纤维细胞、肿瘤浸润的免疫细胞、内皮细胞、骨髓来源未成熟细胞等；细胞因子如TNF、VEGF、IL-1等；趋化因子如CXCL12、CCL27、CCL21等。细胞因子和趋化因子可以由肿瘤细胞分泌，亦可由基质细胞和上述浸润的免疫细胞产生。这些细胞和活性介质一同形成稳定的肿瘤免疫微环境，保护肿瘤组织逃脱机体的免疫监视并促进肿瘤进展。肿瘤细胞具有很强的异质性和增殖能力，而其在生长过程中的高突变率使我们在肿瘤治疗过程中，很难能够找到在多种肿瘤上或者在同一种肿瘤类型的不同病人之间稳定表达的特异性肿瘤抗原。
肿瘤微环境中具有低氧和酸化的特质，低氧和酸化是从良性肿瘤发展为转移生长的恶性肿瘤的重要原因。其中酸化对肿瘤的发展有三方面的影响：即增加对化疗的耐受性、增加突变率、增强浸润性。
低pH值插入肽(pH low insertion peptide，PHLIP)可以在肿瘤微环境的酸性环境下可以发生从无规则卷曲到α螺旋的构象转化，而这种构象转化可以使其将自己插入到肿瘤的细胞膜上，C端在细胞内，N端在细胞外。这种在低pH值下的自组装已经被证明可以在多种实体瘤上有效的发生。
骨髓(造血)微环境是指可以调控造血细胞增殖、分化和功能的网络系统，包括细胞成分和细胞产物。细胞成分有基质细胞和附属细胞，基质细胞有成纤维细胞、成骨细胞、巨噬细胞、内皮细胞等；附属细胞主要为单核细胞和淋巴细胞、骨髓基质细胞可以产生和沉淀复杂的细胞外基质。
T淋巴细胞在人体免疫系统，尤其是适应性免疫系统中发挥重要的关键性作用。其起源于骨髓的多能干细胞，在人体胚胎期和初生期，前T细胞迁移至胸腺内，在胸腺急速的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖去定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行淋巴再循环，发挥细胞免疫的功能。T细胞的激活需要两条细胞信号通路的共同作用：一条是TCR与MHC分子结合，对T奥进行激活，第二条信号通路是T细胞的CD28或者4-1BB等表面蛋白与受体相结合形成共刺激信号，从而刺激T细胞的增殖。两条信号通路同时作用才会真正的发挥作用。其主要的效应行使有两种：与靶细胞特异性结合，破坏细胞膜，直接杀伤靶细胞；释放淋巴因子，是免疫效应扩大和增强。T细胞在多种免疫作用过程中都发挥着重要作用，在抗肿瘤的过程中也作为免疫治疗的有力武器。
对于肿瘤和癌症治疗，早期会选择利用手术清除加以放疗或者化疗(紫杉醇等)的方式进行治疗；后来开始针对肿瘤特异性靶点完成靶向治疗；近期人们开始了对调节人体免疫对肿瘤的治疗过程，在2018年诺贝尔医学奖颁给了美国的詹姆斯.艾利森和日本的本庶佑，以表彰他们在癌症免疫疗法(CTLA-4、PD-1的发现)上做出的开创性工作。利用T细胞进行免疫治疗的精准靶向疗法CAR-T疗法也应运而生。由于CARs提供MH非依赖行抗原识别，可以避免肿瘤细胞用于免疫逃逸的一些机制，例如MHC分子的下调，其优点只要是高效、靶向结合肿瘤相关抗原，激活特异性杀伤。
发明内容
为此，本发明提供用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种多肽偶联物，所述多肽偶联物包括靶向肿瘤细胞的插入肽、偶联剂以及CD19多肽；其中，所述插入肽通过所述偶联剂与所述CD19多肽连接；
所述插入肽选自如下(a1)或(a2)：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的多肽；
(a2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且为具有靶向肿瘤细胞功能由(a1)衍生的多肽。
本发明的一个实施例中，所述偶联剂为磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯。
本发明的一个实施例中，所述CD19多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种多肽偶联物的制备方法，其包括以下步骤：
将CD19多肽分子与偶联剂连接，得到CD19多肽偶联物；
将所述CD19多肽偶联物与靶向肿瘤细胞的插入肽连接，得到所述多肽偶联物；
所述偶联剂为磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯。
本发明的一个实施例中，所述CD19多肽偶联物的制备方法为：
将4800nmol偶联剂溶解到300μL PBS溶液中，得到偶联剂溶液；将10nmol的CD19多肽溶解到200μL PBS中，得到CD19多肽溶液
将偶联剂溶液和CD19多肽溶液加入到1.5mL离心管中，室温摇晃1-3小时，控制混合溶液的pH为7.4，得到CD19多肽偶联物溶液，纯化得CD19多肽偶联物。
本发明的一个实施例中，所述CD19多肽偶联物与靶向肿瘤细胞的插入肽连接过程为：
向所述纯化的CD19多肽偶联物溶液中加入4800nmol的靶向肿瘤细胞的插入肽，室温摇晃4-6h反应，纯化反应产物，得到所述多肽偶联物。
本发明的一个实施例中，所述靶向肿瘤细胞的插入肽为pHLIP。
本发明还提供含上述所述的多肽偶联物的细胞。
上述所述的多肽偶联物在制备用于肿瘤细胞的识别和/或标记和/或分选和/或药物靶向的产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明的多肽偶联物利用肿瘤微环境中，pH＜7的微酸环境的特点，多肽偶联物给微环境中的肿瘤细胞以及其他基质细胞膜表面插入CD19分子，多肽偶联物中的插入肽可在微酸环境下，通过自卷曲插入到肿瘤细胞细胞膜上，起到靶向作用同时利用可以靶向杀伤含有CD19分子的CAR-T细胞，从而招募并激活CAR-T细胞，达到对肿瘤细胞的杀伤功能。
本发明中，CD19片段来自人源的B细胞表面抗体。
本发明中，偶联剂为磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)，以连接靶向肿瘤细胞的插入肽和ADCC诱导性CD19多肽片段。
本发明具有如下优点：
(1)本发明采用的多肽偶联物主要有三部分组成：靶向肿瘤细胞的插入肽低pH纳米插入肽pHLIP、偶联剂sulfo-SMCC和CD19分子，该多肽偶联物既能分别发挥功能，又能相互协调，提供有效的和安全的微环境插入分子；
(2)本发明利用了原本影响肿瘤的发展和治疗效果的肿瘤低氧和酸化特征，令其成为治疗的靶向条件，能够将目标分子特异性的插入到白血病骨髓肿瘤微环境的细胞中，给肿瘤带有特异性的标志，为靶向杀伤和治疗提供靶点，从而吸引免疫细胞(T细胞)靶向攻击和杀伤；
(3)本发明的多肽偶联物通过调动自身免疫系统，对肿瘤进行杀伤和治疗，和已有的肿瘤靶向杀伤不同，该方法可以适用于所有淋巴瘤以及所有实体瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的pHLIP-CD19多肽偶联物的连接的示意图；
图2为本发明实施例提供的pHLIP-CD19多肽偶联物发生自卷曲从而插入到肿瘤细胞膜表面的示意图；
图3为本发明实施例提供的靶向肿瘤细胞的插入肽高效液相色谱检测图谱；
图4为本发明实施例提供的靶向肿瘤细胞的插入肽合成质谱检测图谱；
图5为本发明实施例提供的pHLIP-CD19多肽偶联物对骨肉瘤肿瘤细胞进行插入效率检测结果图；
图6为本发明实施例提供的CAR T细胞中CAR表达的百分比的结果示意图；
图7为本发明实施例提供的pHLIP-CD19多肽偶联物提高CAR T细胞杀伤的效率的试验结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
本发明实施例中，靶向肿瘤细胞的插入肽，即低pH纳米插入肽pHLIP是由上海淘普生物科技有限公司合成，低pH纳米插入肽pHLIP是SEQ ID NO.1所示的肽段在N端乙酰化的产物。
人源的CD19分子购买于北京义翘神州科技有限公司，来自人源的CD19氨基酸分子序列如SEQ ID NO.2所示。
下面通过优选实施例的方式对本发明所要求保护的靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段从结构重组、细胞膜插入能力、与人源CD19蛋白结合能力、体外CAR-T细胞杀伤实验检测效果、以及动物实验方面进行详细论述。
实施例1、多肽偶联物pHLIP-CD19的构建
1、连接CD19与偶联剂sulfo-SMCC
分别配制4800nmol sulfo-SMCC(Thermo Scientific,USA)溶解到300μL PBS溶液中，以及10nmol的CD19(Sino Biological Inc,China)溶解到200μL PBS溶液中，将sulfo-SMCC溶液和CD19溶液混匀到1.5mL Eppendorf离心管中室温轻柔摇晃2小时，在整个过程中，控制混合溶液的pH＝7.4，得到CD19多肽偶联物溶液。然后，将CD19多肽偶联物溶液用PBS缓冲液预平衡的NAP-5(GE Healthcare,UK)的柱子纯化，得到纯化后的含CD19多肽偶联物的溶液，如图1所示，pHLIP-CD19多肽偶联物的连接的示意图。
2、连接CD19多肽偶联物与靶向肿瘤细胞的插入肽pHLIP
如图3所示，为合成的靶向肿瘤细胞的插入肽pHLIP高效液相色谱检测结果图。如图4所示，为合成的靶向肿瘤细胞的插入肽pHLIP的质谱检测图
将4800nmol的pHLIP溶解在PBS缓冲液中，加入到纯化后的含CD19多肽偶联物的溶液中，室温下轻柔摇晃5小时诱导连接反应。最终得到的pHLIP-CD19多肽偶联物，用PBS缓冲液预平衡过的NAP-10(GE Healthcare,UK)的柱子纯化过滤，得到pHLIP-CD19多肽偶联物。
实施例2、pHLIP-CD19多肽偶联物的细胞转化
1、将重组pHLIP-CD19多肽偶联物转化到细胞表面。
OCI-LY8为人弥漫性大B淋巴瘤细胞系，本身表达CD19分子，后续用于杀伤实验的阳性对照组，培养于RPMI-1640细胞培养基中，MG63细胞为骨肉瘤细胞，培养与DMEM培养基中，加入10％FBS(WISENT,Canada)，培养于37℃，5％CO2细胞培养箱中。
将pHLIP-CD19多肽偶联物和MG63细胞分别在pH＝6.8环境下共培养诱导2个小时，在此过程中，溶液的pH值保持。如图2所示，为本实施例的pHLIP-CD19多肽偶联物发生自卷曲从而插入到肿瘤细胞膜表面的过程示意图。
2、流式细胞术进行多肽插入检测
将pHLIP-CD19多肽偶联物按照浓度(0,1,3,5μg/mL)加入到24孔板中，每孔铺1×105个MG63细胞，培养在400μL的pH＝6.8的培养基中2小时。细胞用PBS清洗3次后进行流式细胞检测，每个样品检测3次。结果如图5所示，pHLIP-CD19多肽偶联物对骨肉瘤细胞进行不同浓度下插入效率检测结果。
实施例3、体外细胞毒性的检测
1、CAR T细胞的构建
使用磁珠法从人血中分离出T细胞，经CD3/CD28复合物激活之后，使用包装好的慢病毒根据病毒滴度进行感染，48h流式细胞术检测表达水平。
50ml离心管加入15ml淋巴细胞分离液，将30ml全血缓慢加入装有淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g离心25min(离心速度缓升缓降，升1降0)。离心结束后，小心吸取单核细胞层细胞至新的50ml离心管中，加入PBS至50ml，轻轻吹打均匀，500g离心10min。
用50ml PBS重悬细胞团，细胞计数。300g离心10min。细胞沉淀用缓冲液(x-vivo基础培养基+10％FBS)重悬，每107细胞加入70μL缓冲液。
每107细胞各加入20μL CD4和CD8磁珠，4℃孵育15min。孵育结束后，细胞悬液加入缓冲液至15ml清洗细胞，1200g离心5min。离心弃上清，加入500μL缓冲液重悬。
将分离柱放入磁场，缓冲液润洗柱子。将细胞悬液加入柱子中，让液体缓慢下滴，细胞悬液液面接近磁柱上端时加入缓冲液冲洗2次。
将柱子移出磁场，加入缓冲液，迅速用活塞将细胞推入新的离心管中，300g离心10min。离心结束后，弃上清，加入完全培养基，计数。将重组人IL-7、IL-15、IL-21按1：1000比例加入x-vivo基础培养基中并加入10％FBS。
调整细胞密度为1×106细胞/ml，加入CD3和CD28复合物，按1:100比例加入激活培养基中，混匀培养48h。
细胞离心后重悬，调整细胞密度为10M/ml。根据所制备病毒的滴度，在T细胞中加入慢病毒，封口膜密封后1800rpm，32℃离心1h，离心后的细胞转入培养箱，12h后换成正常培养基，得到CAR T细胞。48h后流式检测CAR T细胞CAR的表达(Novoprotein,China)。如图6所示，为本实施例提供的48h后流式检测CAR T细胞中CAR的表达百分比的结果示意图。
2、体外细胞毒性检测
根据CytoTox-GloTM细胞毒性测定试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)的使用说明书检测T细胞杀伤功能。
杀伤实验选用靶向人CD19分子的CAR-T细胞进行实验。
将2×104个OCI-LY8、Mg63肿瘤细胞培养在96孔板中，设置实验组和对照组，对照组不加多肽偶联物，实验组用实施例2制备的pHLIP-CD19多肽偶联物(3μg/mL)(pH＝6.8)培养2-4小时，按照效应细胞：靶细胞＝10：1的比例，将2×105个CAR-T细胞加入到培养体系中诱导培养4个小时，总培养体系为100uL。
用多模板读卡器(PerkinElmer，USA)检测荧光值。测定乳酸脱氢酶(LDH)释放，并在根据下式校正背景吸光度值后计算细胞毒性百分比：
Figure BDA0003378070970000091
如图7所示，本发明的pHLIP-CD19多肽偶联物提高CAR T细胞杀伤效率的试验结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0003378070970000101
Figure BDA0003378070970000111
Figure BDA0003378070970000121
序列表
<110> 北京双赢科创生物科技有限公司
<120> 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用
<130> GG20879544A
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 2
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu
1 5 10 15
Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp
20 25 30
Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu
35 40 45
Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile
50 55 60
Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly
65 70 75 80
Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu
85 90 95
Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu
100 105 110
Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser
115 120 125
Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro
130 135 140
Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu
165 170 175
Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu
180 185 190
Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu
195 200 205
Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala
245 250 255
Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
260 265 270

Claims (9)

1.一种多肽偶联物，其特征在于，所述多肽偶联物包括靶向肿瘤细胞的插入肽、偶联剂以及CD19多肽；其中，所述插入肽通过所述偶联剂与所述CD19多肽连接；
所述插入肽选自如下(a1)或(a2)：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的多肽；
(a2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且为具有靶向肿瘤细胞功能由(a1)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽偶联物，其特征在于，
所述偶联剂为磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯。
3.如权利要求1所述的多肽偶联物，其特征在于，
所述CD19多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种多肽偶联物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将CD19多肽分子与偶联剂连接，得到CD19多肽偶联物；
将所述CD19多肽偶联物与靶向肿瘤细胞的插入肽连接，得到所述多肽偶联物；
所述偶联剂为磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯。
5.如权利要求4所述的多肽偶联物的制备方法，其特征在于，
所述CD19多肽偶联物的制备方法为：
将4800nmol偶联剂溶解到300μL PBS溶液中，得到偶联剂溶液；将10nmol的CD19多肽溶解到200μL PBS中，得到CD19多肽溶液
将偶联剂溶液和CD19多肽溶液加入到1.5mL离心管中，室温摇晃1-3小时，控制混合溶液的pH为7.4，得到CD19多肽偶联物溶液，纯化得CD19多肽偶联物。
6.如权利要求5所述的多肽偶联物的制备方法，其特征在于，
所述CD19多肽偶联物与靶向肿瘤细胞的插入肽连接过程为：
向所述纯化的CD19多肽偶联物溶液中加入4800nmol的靶向肿瘤细胞的插入肽，室温摇晃4-6h反应，纯化反应产物，得到所述多肽偶联物。
7.如权利要求6所述的多肽偶联物的制备方法，其特征在于，
所述靶向肿瘤细胞的插入肽为pHLIP。
8.含权利要求1-3中任一项所述的多肽偶联物的细胞。
9.权利要求1-3中任一项所述的多肽偶联物在制备用于肿瘤细胞的识别和/或标记和/或分选和/或药物靶向的产品中的应用。
CN202111425242.1A 2021-11-26 2021-11-26 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用 Pending CN114181319A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111425242.1A CN114181319A (zh) 2021-11-26 2021-11-26 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111425242.1A CN114181319A (zh) 2021-11-26 2021-11-26 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114181319A true CN114181319A (zh) 2022-03-15

Family

ID=80541606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111425242.1A Pending CN114181319A (zh) 2021-11-26 2021-11-26 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114181319A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116640229A (zh) * 2023-04-10 2023-08-25 中国人民解放军总医院第五医学中心 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105770901A (zh) * 2016-03-01 2016-07-20 中国人民解放军南京军区南京总医院 交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料及其应用
CN110698565A (zh) * 2018-11-30 2020-01-17 北京泽勤生物医药有限公司 靶向肿瘤的CD38-pHLIP融合肽
CN111285936A (zh) * 2020-03-11 2020-06-16 北京双赢科创生物科技有限公司 靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用
CN111454371A (zh) * 2020-04-18 2020-07-28 北京泽勤生物医药有限公司 PDL1-pHLIP、制备方法及其在治疗自身免疫病中的应用
CN111936158A (zh) * 2017-12-15 2020-11-13 艾丽塔生物治疗剂公司 Cd19变体
CN112426438A (zh) * 2019-11-14 2021-03-02 上海鑫湾生物科技有限公司 用于调控酸性环境免疫应答的组合物、其制备方法和用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105770901A (zh) * 2016-03-01 2016-07-20 中国人民解放军南京军区南京总医院 交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料及其应用
CN111936158A (zh) * 2017-12-15 2020-11-13 艾丽塔生物治疗剂公司 Cd19变体
CN110698565A (zh) * 2018-11-30 2020-01-17 北京泽勤生物医药有限公司 靶向肿瘤的CD38-pHLIP融合肽
CN112426438A (zh) * 2019-11-14 2021-03-02 上海鑫湾生物科技有限公司 用于调控酸性环境免疫应答的组合物、其制备方法和用途
CN111285936A (zh) * 2020-03-11 2020-06-16 北京双赢科创生物科技有限公司 靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用
CN111454371A (zh) * 2020-04-18 2020-07-28 北京泽勤生物医药有限公司 PDL1-pHLIP、制备方法及其在治疗自身免疫病中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116640229A (zh) * 2023-04-10 2023-08-25 中国人民解放军总医院第五医学中心 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用
CN116640229B (zh) * 2023-04-10 2024-01-30 中国人民解放军总医院第五医学中心 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105624107B (zh) 一种多种淋巴细胞亚群的扩增方法及其应用
CN112048481B (zh) 一种靶向cd19的嵌合抗原受体nk细胞及其应用
CN111748044B (zh) Cd19和pd-l1双靶点嵌合抗原受体及其应用
CN110373415B (zh) 特异性结合pd-l1蛋白的核酸适配体及其用途
CN112029729B (zh) Cd19和cd22双靶点嵌合抗原受体nk细胞及其应用
CN112251412B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞及其应用
KR20040099352A (ko) 세포상해성 림프구의 제조방법
CN112426526B (zh) 一种nk细胞的制备方法及其在治疗癌症中的应用
CN111848820B (zh) Cd19和bcma双靶点嵌合抗原受体及其应用
WO2020248486A1 (zh) 以Tcm为主要效应成分的CAR-T制备方法及其应用
CN111411085A (zh) 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN113621077B (zh) 一种tim-3/cd28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的car-t细胞
CA2536492A1 (en) Process for producing cytotoxic lymphocytes
CN113621047A (zh) 一种t细胞抗原受体、其多聚体复合物及其制备方法和应用
CN114181319A (zh) 用于靶向肿瘤细胞的多肽偶联物及其制备方法与应用
CN113045675B (zh) 一种抗cd22蛋白分子的抗体及其应用
CN110615847A (zh) TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用
CN113735981B (zh) Cd19-car-t细胞及其制备方法
CN112626028B (zh) 一种激活nk样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用
CN113667640A (zh) CAR-γδT细胞的制备方法
CN111763264A (zh) 一种靶向psca的嵌合抗原受体及其应用
WO2008056734A1 (fr) Procédé de production de cellules dendritiques à partir de cellules souches d&#39;embryons humains
CN112538108B (zh) 高亲和pvr突变体
CN114213550B (zh) 分泌表达pd-1、gm-csf抗体的car-t细胞及其用途
CN112755051B (zh) 一种nk细胞的制备及治疗癌症中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination