CN116004547A - 一种辐照car-t细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辐照CAR‑T细胞及其制备方法与应用。具体地公开了辐照GPC3CAR‑IC细胞，其可按照包括如下步骤的方法制备：用电离射线对GPC3CAR‑IC细胞进行辐照处理得到辐照GPC3CAR‑IC细胞，其含有SEQ ID No.3所示的核酸分子。本发明的辐照GPC3CAR‑IC细胞通过在基因层面改造CAR基因实现了抑制肿瘤微环境的免疫抑制作用，提高了GPC3CAR‑IC细胞的抗肿瘤效果，并且本发明的辐照GPC3CAR‑IC细胞无需进行基因编辑即可降低GVHD风险，具有安全、通用、低成本的特点，可实现大规模工业化生产，对肿瘤的CAR‑T治疗具有广泛的临床应用价值。

Description

一种辐照CAR-T细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种辐照CAR-T细胞及其制备方法与应用。

背景技术

过继性细胞免疫治疗(Adoptive cell therapy，ACT)是指通过向机体输注在体外扩增的自体或同种异体特异性或非特异性的免疫细胞，直接或间接杀伤肿瘤细胞的疗法。过继性细胞免疫治疗包括淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activated killercell，LAK cell)免疫疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TIL)免疫疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK cell)免疫疗法、细胞毒性T细胞(Cytotoxic Tlymphocyte，CTL)免疫疗法、T细胞受体基因工程改造的T细胞(T cell receptor gene engineered T cell，TCR-T)免疫疗法和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法。研究表明，CAR-T细胞对肿瘤的攻击是特异、高效及持续的，尤其在血液肿瘤的治疗方面。近年来，CAR-T细胞治疗在B细胞等的血液系统肿瘤中取得了令人鼓舞的疗效，但该疗法的产业化难以实现仍然是阻碍其发展的瓶颈所在。

特异性识别肿瘤抗原只是CAR-T成功的第一步。肿瘤为了存活给自己创建了一个免疫抑制性的微环境，这个环境对于CAR-T是不友好的。肿瘤细胞的糖酵解使环境缺氧、呈酸性、营养耗竭。CAR-T功能的执行也需要糖酵解和氧化磷酸化，但是糖被肿瘤细胞耗尽了，CAR-T细胞的效应功能因而受损。在炎症环境中，肿瘤细胞通常会上调抑制性配体，如PD-L1和Galectin-9等。此外，肿瘤微环境还有大量抑制性免疫细胞和基质细胞，如肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)、髓性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、肿瘤相关中性粒细胞(TANs)、肥大细胞和调节性T细胞(Tregs)。这些细胞和肿瘤细胞分泌的VEGF、TGF-β等能够导致肿瘤血管畸形，促进TAMs等免疫细胞的抗炎极化，参与上皮细胞间质转化(EMT)。它们还能产生活性氧(ROS)和诸如乳酸、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、前列腺素E2(PGE2)、可溶性脂肪酸和腺苷等分子，形成抑制性的免疫微环境。近期有研究表明，CAR-T细胞治疗后肿瘤微环境的免疫抑制作用变得更强了。

目前常规自体CAR-T或异体CAR-T治疗仍面临如下问题：(1)治疗窗口和细胞制备：常规自体CAR-T的治疗窗口和细胞生产时间较长，不太适合用于进展较快的侵袭性肿瘤的治疗；自体CAR-T的细胞来源受限于患者本身免疫系统中T细胞的数量和其杀伤能力，导致治疗效果有高有低；自体CAR-T细胞每批生产的批量小，仅适合用于1个患者使用，不易于规模化生产；自体CAR-T细胞需针对每个患者的具体情况实施生产，流程复杂，不易于统一质控。(2)安全问题：常规自体CAR-T或异体CAR-T治疗过程中，患者都有可能面临细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome，CRS)和CAR-T细胞相关性脑病综合征(CAR-Tcellrelevant encephalopathy syndrome，CRES)等；异体CAR-T即便通过CRISPR基因编辑敲除相关的HLA I和TCR，也还是有可能出现移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVHD)；同时异体CAR-T是在制备过程中通过CRISPR技术对T细胞进行基因编辑，存在相关基因编辑风险。此外，并非每位适合CAR-T治疗的患者的细胞均能制备成功，对于那些经过多次化疗的患者，其自身T细胞的增殖能力大大减弱，有近1/4患者的CAR-T细胞制备不成功。因此，如何生产出高效、安全的通用型CAR-T细胞是极大的挑战。

鉴于以上几个方面，建立能克服免疫抑制的肿瘤微环境并且安全、高效、低成本的通用型CAR-T技术显得尤为紧迫，将是今后发展的一个新方向，它能够实现CAR-T细胞治疗的产业化，广泛而便捷地供给合适的患者使用，并极大地降低细胞制品的生产成本和患者的治疗成本。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于预防或治疗表达GPC3抗原的肿瘤、可抵御肿瘤微环境的免疫抑制作用、降低GVHD(Graft versus host disease，移植物抗宿主病)风险、能高效生产、安全、通用和/或低成本的辐照GPC3 CAR-IC细胞。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为实现上述目的，本发明首先提供了辐照CAR-T细胞，所述细胞可按照包括如下步骤的方法制备：用电离射线对离体的CAR-T细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线选自α射线、β射线、γ射线、X射线、电子束、质子束、重离子束、中子束中的一种或几种，所述离体的CAR-T细胞可为GPC3 CAR-IC细胞，所述GPC3 CAR-IC细胞含有核酸分子，所述核酸分子可包括嵌合抗原受体的编码基因和嵌合转换开关受体的编码基因，所述嵌合转换开关受体可包括TGFβ受体II型胞外区(转化生长因子β的II型受体胞外区)、μPD-1和CD27跨膜区和胞浆区，所述μPD-1(突变优化的PD-1的胞外区)的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第187-332位，所述嵌合抗原受体的编码基因可为靶向GPC3的嵌合抗原受体的编码基因。

进一步地，所述辐照CAR-T细胞与所述GPC3 CAR-IC细胞相比增殖活性降低的同时保持了特异性分泌T细胞效应分子IFN-γ的作用、细胞毒作用、特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞的作用、特异性分泌T细胞效应分子IFNα2的作用、诱导NK细胞分泌功能效应分子IFN-γ的作用和/或体内抑瘤作用。

所述辐照CAR-T细胞(包括辐照GPC3 CAR-IC细胞)是将CAR元件导入健康人的T细胞，然后对细胞进行一定程度的辐照处理以抑制细胞回输后在体内的过度增殖，进而降低GVHD反应，但不影响CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

所述辐照CAR-T细胞可为辐照GPC3 CAR-IC细胞。

进一步地，所述嵌合转换开关受体的编码基因可为下述任一种：

A1)编码融合蛋白的DNA分子；

A2)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

A3)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

所述融合蛋白可为下述任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

所述融合蛋白可为嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)。

所述融合蛋白及其编码基因可用于提高CAR细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力、使CAR细胞具有更强的体内持久性和/或抑制PD-1和TGFβ信号通路以增强CD27信号通路的效果。

所述融合蛋白的编码基因可用于制备本发明所述的核酸分子或含有本发明所述核酸分子的CAR细胞。

本文所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的、具有与本发明融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述融合蛋白且具有所述融合蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

进一步地，所述核酸分子还可包括IFNα基因(α干扰素基因)和/或P2A基因。

所述IFNα基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1552-2118位。

所述P2A基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1474-1551位。

进一步地，所述嵌合抗原受体的靶点可为GPC3。

进一步地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列可为SEQ ID No.4。

所述IFNα的氨基酸序列可为SEQ ID No.5。

进一步地，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体的编码基因可为下述任一种：

G1)编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质的DNA分子；

G2)编码序列是SEQ ID No.3第1-1473位的DNA分子；

G3)核苷酸序列是SEQ ID No.3第1-1473位的DNA分子。

进一步地，所述核酸分子可为下述任一种：

C1)核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA分子；

C2)SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的DNA分子具有70％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

所述70％以上的同一性可为至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文所述GPC3 CAR-IC细胞可为过继性细胞免疫治疗中的效应T细胞。

本文所述GPC3 CAR-IC细胞含有SEQ ID No.3所示的DNA分子，表达GPC3 CAR-IC基因(SEQ ID No.3)。

本文所述GPC3 CAR-IC细胞可为将SEQ ID No.3所示的DNA分子导入T细胞得到的重组细胞。具体地，在本发明的一个实施方案中，所述GPC3 CAR-IC细胞为将重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC通过包装细胞包装得到重组逆转录病毒后，将所述重组逆转录病毒导入T细胞得到的重组细胞，所述包装细胞可为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞和PG13细胞。

所述重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC是将逆转录病毒载体MP71的NotI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA片段，保持逆转录病毒载体MP71的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。

进一步地，本文所述电离射线可为X射线，所述辐照处理的时间可为20-3000秒，所述辐照处理的剂量可为1-50Gy。

本文所述20-3000秒可为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000秒。

本文所述1-50Gy可为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50Gy。

进一步地，所述辐照处理条件可为：辐照剂量为10Gy，剂量率为1.199Gy/min。

进一步地，所述辐照处理条件可为：电压为160KV，电流为25mA，0.3mm铜滤过。所述0.3mm铜滤过表示X-射线管具有附加的铜滤板以产生0.3mm Cu半值层(HVL，Half ValueLayer)的辐照质量。

本发明还提供了本文中任一所述辐照CAR-T细胞的下述任一种应用：

D1)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用；

D2)在制备用于预防或治疗表达GPC3抗原的肿瘤的药物中的应用；

D3)在制备用于预防或治疗肝癌、黑色素瘤、Wilm’s瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、直结肠癌、肝胚细胞瘤或神经胶质瘤的药物中的应用。

上述应用中，所述表达GPC3抗原的肿瘤可为肝癌、黑色素瘤、Wilm’s瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、直结肠癌、肝胚细胞瘤或神经胶质瘤但不限于此。

进一步地，所述肝癌可为肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)。

进一步地，所述鳞状细胞癌可为肺鳞癌。

进一步地，所述黑色素瘤可为恶性黑色素瘤。

进一步地，所述神经胶质瘤可为胶质母细胞瘤。

进一步地，所述表达GPC3抗原的肿瘤可为GPC3高表达的肿瘤。

进一步地，所述D1)可为在制备用于抑制和/或杀伤肿瘤的药物中的应用。

进一步地，所述D2)可为在制备用于抑制和/或杀伤表达GPC3抗原的肿瘤的药物中的应用。

所述抑制可为抑制肿瘤增殖和/或生长。

本文所述肿瘤可为实体瘤(如胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌或脑胶质瘤)。

本发明还提供了一种制备本文中任一所述辐照CAR-T细胞的方法，所述方法可包括下述任一种：

E1)用电离射线对本文中任一所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线选自α射线、β射线、γ射线、X射线、电子束、质子束、重离子束、中子束中的一种或几种；

E2)用电离射线对本文中任一所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线为X射线，所述辐照处理的时间为20-3000秒，所述辐照处理的剂量为1-50Gy；

E3)用电离射线对本文中任一所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线为X射线，所述辐照处理条件为：辐照剂量为10Gy，剂量率为1.199Gy/min。

本发明还提供了一种抑制本文中任一所述GPC3 CAR-IC细胞增殖的方法，所述方法可包括下述任一种：

F1)用电离射线对所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理，完成对所述GPC3 CAR-IC细胞增殖的抑制，所述电离射线选自α射线、β射线、γ射线、X射线、电子束、质子束、重离子束、中子束中的一种或几种；

F2)用电离射线对所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理，完成对所述GPC3 CAR-IC细胞增殖的抑制，所述电离射线为X射线，所述辐照处理的时间为20-3000秒，所述辐照处理的剂量为1-50Gy；

F3)用电离射线对所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理，完成对所述GPC3 CAR-IC细胞增殖的抑制，所述电离射线为X射线，所述辐照处理条件为：辐照剂量为10Gy，剂量率为1.199Gy/min。

进一步地，所述抑制GPC3 CAR-IC细胞增殖可为抑制GPC3 CAR-IC细胞的过度增殖。

进一步地，所述抑制GPC3 CAR-IC细胞的过度增殖可为抑制GPC3 CAR-IC细胞回输后在体内的过度增殖。

本文所述核酸分子可表达氨基酸序列为SEQ ID No.4的嵌合抗原受体、氨基酸序列为SEQ ID No.5的IFNα和氨基酸序列为SEQ ID No.1的融合蛋白(嵌合转换开关受体)。

本文所述核酸分子可为GPC3 CAR-IC基因，所述GPC3 CAR-IC基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3，所述GPC3 CAR-IC基因从N端至C端依次可为嵌合抗原受体的编码基因、P2A基因、IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因。结构示意图如图1所示(IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因三部分可总称IC基因)。其中：

所述IC基因(IFNα基因+启动子元件基因+嵌合转换开关受体的编码基因)的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1552-3882位。

所述嵌合抗原受体的编码基因从N端至C端依次可为Signal(信号肽)、GPC3 scFv(肿瘤抗原结合区，即单链抗体区)、Hinge(铰链区)、CD8(跨膜区)、4-1BB(胞内信号区)、CD3ζ(胞内信号区)的编码基因。所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1-1473位，其编码嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列可为SEQ ID No.4。

所述嵌合抗原受体的编码基因中，Signal(信号肽)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1-63位，GPC3 scFv的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第64-789位，Hinge(铰链区)+CD8(跨膜区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第790-996位，4-1BB(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第997-1137位，CD3ζ(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1138-1473位。

所述P2A基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1474-1551位。其编码的P2A肽可为来源于病毒的短肽，通常被称为“自我剪切”肽。P2A肽的“自我剪切”功能可使一条转录产物产生多种蛋白，即通过自我切割形成上游产物和下游产物两个蛋白。

所述IFNα基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1552-2118位，其编码的IFNα(α干扰素)的氨基酸序列可为SEQ ID No.5。

所述启动子元件基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第2119-2661位，其中，SEQIDNo.3的第2136-2635位为启动子。

所述嵌合转换开关受体的编码基因从N端至C端依次可为TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)、Linker(接头)、μPD-1、CD27跨膜区和胞浆区的编码基因。进一步地，所述CD27的跨膜区和胞浆区的编码基因可为密码子优化得到的oCD27，其在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。所述嵌合转换开关受体的编码基因的核苷酸序列可为SEQ IDNo.3的第2662-3882位(即SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，其编码嵌合转换开关受体(CSR)的氨基酸序列可为SEQ ID No.1。

所述嵌合转换开关受体的编码基因中，TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第2662-3159位，Linker(接头)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第3160-3219位，μPD-1的编码基因的核苷酸序列可为SEQ IDNo.3的第3220-3657位，CD27的跨膜区和胞浆区(即oCD27)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ IDNo.3的第3658-3882位。

本文所述嵌合抗原受体可特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞。GPC3全称为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，通过细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定连接于细胞表面，在大多数的肝癌组织中呈特异性高表达，能够用于靶向肝癌细胞启动杀瘤，是一种理想的肿瘤治疗靶点。

本文所述IFNα(α干扰素)可广谱抗瘤，直接调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移；抑制肿瘤血管的新生和转移；具有免疫调节功能，可通过以下方式增强抗肿瘤免疫活性：上调肿瘤细胞中MHC I、肿瘤抗原和PD-L1的表达；激活天然免疫细胞如NK、DC和γδT细胞，特别是NK细胞的扩增、迁移和功能；调控适应性免疫细胞如T细胞和B细胞，特别是T细胞的扩增、迁移、功能和存活；负性调节免疫抑制细胞如TAM、Treg和髓样抑制细胞MDSCs；上调肿瘤细胞中PD-L1的表达。

本文所述嵌合转换开关受体能够抑制PD-1和TGFβ信号通路以达到增强CD27信号通路的效果，赋予CAR-T细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力，并使其具有更强的体内持久性；由于肿瘤细胞通常在其表面表达PD-L1以激活T细胞上的抑制性PD-1来规避/抑制抗肿瘤T细胞反应，因此嵌合转换开关受体将上述抑制作用转化为CD27介导的激活信号，同时通过PD-1靶向有利于CAR-T细胞向表达PD-L1的肿瘤部位聚集。

虽然本发明构建了核苷酸序列为SEQ ID No.3的GPC3 CAR-IC基因，但本发明不限于该特定序列，本领域技术人员可对GPC3 CAR-IC基因中的P2A基因和/或启动子元件基因进行替换，例如采用与P2A基因具有相同“自我剪切”功能的F2A(VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG)、T2A(EGRGSLLTCGDVEENPG)、E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPG)等但不限于此，启动子元件基因可采用本领域已知的启动子，只要构建的核酸分子能够表达氨基酸序列为SEQ ID No.4的嵌合抗原受体、氨基酸序列为SEQ ID No.5的IFNα和氨基酸序列为SEQ ID No.1的融合蛋白(嵌合转换开关受体)，并且与本发明所述核酸分子功能相同，均视为与本发明核酸分子等同的核酸分子。

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，设计了一种含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因，并设计构建了以GPC3为靶点的GPC3 CAR-IC基因(SEQIDNo.3)，经逆转录病毒包装、感染，从而获得了GPC3 CAR-IC细胞。本发明构建的GPC3CAR-IC细胞表达两个人工受体，一个是嵌合抗原受体(CAR)，用于肿瘤相关抗原的识别，特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞，靶向肝癌细胞启动杀瘤。另一个是嵌合转换开关受体(CSR)，用于将肿瘤微环境中的免疫抑制信号转化为CAR-T细胞中的激活信号，其中的TRII胞外区可以结合HCC中大量分泌的TGFβ，阻断其抑制通路，并激活CAR-T细胞中的CD27信号通路，为CAR-T细胞提供生长刺激，增强CAR-T细胞的存活、迁移，抑制肿瘤微环境；CSR中的μPD-1也可以结合HCC中表达的PD-L1，阻断T细胞上的PD-1信号通路，抑制T细胞衰竭，同时激活CAR-T细胞中的CD27信号通路，增强杀瘤效果。此外本发明构建的GPC3 CAR-IC细胞还表达IFNα，用于广谱抗瘤、降低抗原异质性和肿瘤细胞逃逸、增强免疫细胞浸润、免疫调节、改善肿瘤微环境以及抗HBV/HCV感染。

本发明通过设计含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因来构建CAR-T细胞，将PD-L1和TGFβ激活的抑制抗肿瘤T细胞反应转化为CD27介导的激活信号，赋予CAR-T细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力，并使其具有更强的体内持久性，促进了CAR-T细胞的扩增、延长了体内存活时间以及促进细胞因子分泌，实现了通过促进细胞因子IFN-γ和IFN-α2的分泌来调节肿瘤附近的微环境，解除其免疫抑制性，通过调动机体自身免疫力参与对肿瘤细胞的杀伤作用，提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果。

本发明设计构建的GPC3 CAR-IC细胞通过在基因层面的改造可更好地用于过继性细胞免疫治疗，而过继性细胞免疫治疗的另一个重要难点就是后期的不良反应处理及质量控制，为了实现GPC3 CAR-IC细胞的产业化，开发完善的免疫治疗技术，本发明的发明人进一步开发了一种辐照GPC3 CAR-IC细胞。

本发明的辐照GPC3 CAR-IC细胞的增殖活性被一定程度地抑制(增殖活性降低)，进而可以抑制其回输后在体内的过度增殖以降低GVHD反应，但同时仍保持良好的特异性分泌T细胞效应分子IFN-γ的作用、细胞毒作用、特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞的作用、特异性分泌T细胞效应分子IFNα2的作用、诱导NK细胞分泌功能效应分子IFN-γ的作用和/或体内抑瘤作用，不影响辐照GPC3 CAR-IC细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

本发明的辐照GPC3 CAR-IC细胞在体内可存活5-10天。

综上所述，本发明的辐照GPC3 CAR-IC细胞具有如下优点：

(1)通过在基因层面改造CAR基因后，实现了降低或抑制肿瘤微环境的免疫抑制作用，促进了GPC3 CAR-IC细胞的扩增、延长了体内存活时间以及促进细胞因子分泌，提高了GPC3 CAR-IC细胞的抗肿瘤效果。

(2)现有技术是通过CRISPR基因编辑技术敲除相关的HLA I和TCR来降低GVHD风险，但还是有可能出现GVHD，并且存在相关基因编辑风险。而本发明的辐照GPC3 CAR-IC细胞经过辐照后在体内存活时间比较短，该段时间不足以产生GVHD反应，因此无需进行基因编辑，避免了基因编辑相关风险，更加安全。

(3)制备CAR-T细胞中使用的病毒载体被辐照处理后会进一步丧失扩增能力，并且病毒会被杀死，能够更好地避免CAR-T产品污染复制型逆转录病毒(Replication-competent retrovirus，RCR)的风险。

(4)可进一步通过控制辐照GPC3 CAR-IC细胞的治疗剂量，更有效地控制肿瘤患者治疗过程中可能产生的毒副反应如细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome，CRS)、CAR-T细胞相关性脑病综合征(CAR-T cell relevant encephalopathy syndrome，CRES)和移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVHD)。

(5)高效：辐照易于规模化操作，可以实现大规模工业化生产。

(6)通用、低成本：即时可用的“现货成品”，可以提前大批量生产、有合适的患者需要时即可进入治疗，可以很好地避免因常规CAR-T细胞生产制备周期长而错过癌症进展较快患者的最佳治疗时机，广泛而便捷地供给合适的患者使用，并极大地降低细胞制品的生产成本和患者的治疗成本。

本发明开发的辐照GPC3 CAR-IC细胞及其制备方法对肿瘤(如肝细胞癌)的CAR-T治疗具有重要的意义和广泛的临床应用价值。

附图说明

图1为GPC3 CAR-IC基因结构示意图。

图2为实施例2中GPC3 CAR-IC细胞的各部分表达检测结果。

图3为辐照对GPC3 CAR-IC细胞存活和增殖的影响。其中图3中A和B为辐照对GPC3CAR-IC细胞存活的影响；图3中C为辐照对GPC3 CAR-IC细胞增殖的影响。

图4为辐照对GPC3 CAR-IC细胞分泌功能效应分子IFN-γ的影响。

图5为辐照GPC3 CAR-IC细胞的细胞毒(脱颗粒CD107a的表达)功能检测结果。

图6为辐照GPC3 CAR-IC细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒作用检测结果。

图7为辐照GPC3 CAR-IC细胞分泌IFN-γ和IFN-α2的细胞功能检测结果。

图8为体外检测辐照后GPC3 CAR-IC细胞与靶细胞共培养分泌的IFN-α2对NK细胞的诱导作用。

图9为移植瘤HepG2-NSG模型评估辐照后GPC3 CAR-IC细胞的体内杀瘤作用和动物存活情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pUC57载体为北京擎科生物科技有限公司产品。

下述实施例中的逆转录病毒载体MP71记载于如下文献中：Engels B,Cam H,etal.Retroviral Vectors for High-Level Transgene Expression in T Lymphocytes[J].Human Gene Therapy,2003,14(12):1155-1168.，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)来源于健康志愿者的静脉血。

下述实施例中的HepG2细胞为中国科学院细胞库产品，目录号为SCSP-510。

下述实施例中的NSG小鼠(6～7周龄，体重18～25g)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。

下述实施例中的RPMI-1640培养基为sigma公司产品，货号为R8758。

下述实施例中含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(10％ FBS RPMI-1640培养基)是以RPMI-1640培养基(R8758)为溶剂，以胎牛血清为溶质配制而成，也称为完全培养基。

下述实施例中所涉及的序列如表1。

表1、GPC3 CAR-IC基因的相关序列

实施例1、GPC3 CAR-IC细胞构建

本实施例构建的GPC3 CAR-IC细胞以GPC3为靶点，表达两个人工受体，一个是嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)，用于肿瘤相关抗原的识别，另一个是嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)，用于将肿瘤微环境中的免疫抑制信号转化为CAR-T细胞中的激活信号，进而为CAR-T细胞提供生长刺激，增强CAR-T细胞的存活、迁移，抑制肿瘤微环境。具体构建方法如下：

1、GPC3 CAR-IC基因设计

GPC3 CAR-IC基因从N端至C端依次为嵌合抗原受体的编码基因、P2A基因、IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因。结构示意图如图1所示(IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因三部分总称IC基因)。其中：

IC基因(IFNα基因+启动子元件基因+嵌合转换开关受体的编码基因)的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1552-3882位。

嵌合抗原受体的编码基因从N端至C端依次为Signal(信号肽)、GPC3 scFv(肿瘤抗原结合区，即单链抗体区)、Hinge(铰链区)、CD8(跨膜区)、4-1BB(胞内信号区)、CD3ζ(胞内信号区)的编码基因。所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1-1473位，其编码嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

嵌合抗原受体的编码基因中，Signal(信号肽)的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.3的第1-63位，GPC3 scFv的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第64-789位，Hinge(铰链区)+CD8(跨膜区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第790-996位，4-1BB(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第997-1137位，CD3ζ(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1138-1473位。

P2A基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1474-1551位。其编码的P2A肽为来源于病毒的短肽，通常被称为“自我剪切”肽。P2A肽的“自我剪切”功能可使一条转录产物产生多种蛋白，即通过自我切割形成上游产物和下游产物两个蛋白。

IFNα基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1552-2118位，其编码的IFNα(α干扰素)的氨基酸序列为SEQ ID No.5。

启动子元件基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第2119-2661位，其中，SEQ IDNo.3的第2136-2635位为启动子。

嵌合转换开关受体的编码基因从N端至C端依次为TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)、Linker(接头)、μPD-1、CD27跨膜区和胞浆区的编码基因。进一步地，CD27跨膜区和胞浆区的编码基因为密码子优化得到的oCD27，其在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。μPD-1为突变优化的PD-1的胞外区。嵌合转换开关受体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第2662-3882位(即SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，其编码嵌合转换开关受体(CSR)的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

嵌合转换开关受体的编码基因中，TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第2662-3159位，Linker(接头)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第3160-3219位，μPD-1的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第3220-3657位，CD27跨膜区和胞浆区(即oCD27)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第3658-3882位。

嵌合抗原受体可特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞。GPC3全称为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，通过细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定连接于细胞表面，在大多数的肝癌组织中呈特异性高表达，能够用于靶向肝癌细胞启动杀瘤，是一种理想的肿瘤治疗靶点。

IFNα(α干扰素)可广谱抗瘤，直接调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移；抑制肿瘤血管的新生和转移；具有免疫调节功能，可通过以下方式增强抗肿瘤免疫活性：上调肿瘤细胞中MHC I、肿瘤抗原和PD-L1的表达；激活天然免疫细胞如NK、DC和γδT细胞，特别是NK细胞的扩增、迁移和功能；调控适应性免疫细胞如T细胞和B细胞，特别是T细胞的扩增、迁移、功能和存活；负性调节免疫抑制细胞如TAM、Treg和髓样抑制细胞MDSCs；上调肿瘤细胞中PD-L1的表达。

嵌合转换开关受体由TRII型胞外区、μPD-1和CD27跨膜区和胞浆区组成，能够抑制PD-1和TGFβ信号通路以达到增强CD27信号通路的效果，赋予CAR-T细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力，并使其具有更强的体内持久性；由于肿瘤细胞通常在其表面表达PD-L1以激活T细胞上的抑制性PD-1来规避/抑制抗肿瘤T细胞反应，因此嵌合转换开关受体将上述抑制作用转化为CD27介导的激活信号，同时通过PD-1靶向有利于CAR-T细胞向表达PD-L1的肿瘤部位聚集。

2、GPC3 CAR-IC基因合成

野生型人CD27跨膜区和胞浆区的编码基因全长序列称为nCD27，经密码子优化得到oCD27，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞的表达。oCD27的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第3658-3882位所示。

根据步骤1中的设计(参见图1)构建GPC3 CAR-IC基因，由擎科生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体上，得到重组载体pUC57-GPC3 CAR-IC，并测序确定。

GPC3 CAR-IC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其表达氨基酸序列为SEQIDNo.4的嵌合抗原受体、氨基酸序列为SEQ ID No.5的IFNα和氨基酸序列为SEQ ID No.1的融合蛋白(嵌合转换开关受体)。

3、GPC3 CAR-IC细胞构建

将步骤2中构建的GPC3 CAR-IC基因转入T细胞中稳定表达，得到表达GPC3 CAR-IC基因(SEQ ID No.3)的T细胞，命名为GPC3 CAR-IC细胞。具体步骤如下：

3-1、构建重组逆转录病毒载体

(1)用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切重组载体pUC57-GPC3 CAR-IC，切胶回收目的基因片段。

(2)用NotI和EcoRI双酶切逆转录病毒载体MP71，切胶回收载体大片段。

(3)用T4连接酶(NEB)连接上述目的基因片段和载体大片段，即得到携带GPC3CAR-IC基因的重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC。

(4)将重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC转化感受态大肠杆菌DH5α，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到MP71-GPC3 CAR-IC质粒。

重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC(即MP71-GPC3 CAR-IC质粒)是将逆转录病毒载体MP71的NotI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA片段，保持逆转录病毒载体MP71的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。

3-2、逆转录病毒包装

将步骤3-1中制备的MP71-GPC3 CAR-IC质粒导入包装细胞进行包装，完成病毒装配，得到逆转录病毒。病毒包装具体步骤如下：

a)第1天：Phoenix Ecotropic(ECO)细胞应是小于20代、不过分长满的。以0.6×10⁶/ml的细胞密度铺板，10cm皿添加10mL DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；

b)第2天：ECO细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μL，H₂O 1mL，总体积为1.25mL；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的2×HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到ECO皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基；

c)第4天：转染48h后收集上清，用0.45μm滤器过滤即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃；

d)NTC 6孔板中每孔加入1.2mL 15ug/mL的Retronectin包板溶液，4℃过夜；

e)小心吸去封闭液，加入2mL/孔PBS洗涤，每孔加入5mL上述病毒溶液，32℃、2000×g离心2h，吸弃未结合的病毒上清；

f)取对数期PG13细胞用10mL PBS润洗一次，加入1mL 0.25％的重组胰酶，室温静置2-3min；

g)加入5ml含10％ FBS的完全培养基，终止消化，1500rpm离心5min；

h)弃上清，用完全培养基调整细胞密度为0.5×10⁵cell/mL，按照3mL/孔加入上述病毒包板过的NTC 6孔板中，使最终细胞数为1.5×10⁵cell/孔；

i)1000rpm离心1min，37℃、5％ CO₂培养48h；

j)传代1～2代后转到T175培养瓶中用含12％ FBS的DEME培养基培养2d；

k)更换新的含12％ FBS的DEME培养基继续培养48h后收集上清，用0.45μm滤器过滤即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃。

3-3、逆转录病毒感染人的T细胞

a)复苏冻存的健康人外周血PBMC，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基调整细胞密度为1×10⁶-2×10⁶个细胞/mL。

b)Ficoll分离液(天津灏洋)收集PBMC，磁珠法分离获得CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞＝3:1加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。

c)T细胞活化后第二天，用PBS稀释至终浓度为15μg/mL的RetroNectin(TAKARA)包被非组织处理培养板，6孔板每孔1.2mL。避光，4℃过夜备用。

d)T细胞活化培养两天后，取出包被好的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

e)步骤3-2中制备的逆转录病毒溶液加入孔内，每孔加5-6mL，32℃、2000×g离心2h。每孔加入含hIL-2(500U/mL)的新鲜完全培养基3mL，继续培养1天。

f)细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含100U/mL IL-2的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/mL左右，便于细胞扩增。

g)由此获得感染了步骤3-2中制备的逆转录病毒的重组细胞，命名为GPC3 CAR-IC细胞(即表达核苷酸序列为SEQ ID No.3的GPC3 CAR-IC基因的T细胞)。

实施例2、GPC3 CAR-IC细胞的CAR表达检测

构建好的GPC3 CAR-IC细胞和CTR T细胞(即无病毒转染的T细胞，作为对照)采用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基于37℃培养，并记为D0天，培养至D8天进行CAR表达检测。

1、GPC3 CAR、μPD-1和TRⅡ的表达检测：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，96孔圆形底板中每孔加入200μL FACSbuffer(1×PBS含0.1％ NaN₃和2％ FBS)重悬，1500rpm离心5min；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(抗人FITC-GPC3(rp)/PE-PD-L1/APC-TRII)重悬混匀，4℃孵育30min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min；

(4)弃上清，用400μL FACS buffer重悬细胞转移至流式读数管中，流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞，分析GPC3 CAR、μPD-1和TRⅡ在T细胞中的百分比。

2、干扰素α2(IFNα2)表达检测：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，96孔圆形底板中每孔加入200μL FACSbuffer(1×PBS含0.1％ NaN₃和2％ FBS)重悬，1500rpm离心5min；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(抗人FITC-GPC3(rp))重悬混匀，4℃孵育30min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min；

(4)弃上清，每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；

(5)1500rpm离心5min后弃上清，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(6)每孔加入20μL配制好的抗人Biotin-IFNα2/SA-APC重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL的0.5％ BSA，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(8)每孔加入20μL配制好的SA-APC重悬混匀，4℃孵育10min；

(9)每孔加入200μL的0.5％ BSA，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞转移至流式读数管中，流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞，分析IFNα2在T细胞中的百分比。

检测结果如图2所示，制备的GPC3 CAR-IC细胞中同时表达CAR(即GPC3 CAR)、IFNα2、μPD-1和TRⅡ，说明GPC3 CAR-IC细胞中各部分的表达达到预期设计。

实施例3、辐照对GPC3 CAR-IC细胞存活的影响

将构建好的GPC3 CAR-IC细胞用含10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，采取不同辐照剂量处理，辐射剂量分别为0Gy、10Gy，辐照条件为：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，辐照时间＝辐照剂量/(1.199Gy/min)。

0Gy辐照的GPC3 CAR-IC按每孔1×10⁶个细胞、10Gy辐照的GPC3 CAR-IC按每孔2×10⁶个细胞分别培养在24孔TC板上，培养基为含IL-2(500U/mL)的10％ FBS RPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。

使用APC Annexin V(Biolegend，货号640920)和7-AAD Viability StainingSolution(Biolegend，货号420404)连续六天(D0天、D1天、D2天、D3天、D4天、D5天)取辐照的细胞进行计数，并计算细胞活率。

结果如图3中A和B所示，辐照后，细胞活率和活细胞数均逐渐减少，D5天的细胞活率约为原来的35％，活细胞数约为原来的38％。

实施例4、辐照对GPC3 CAR-IC细胞增殖的影响

1、CFSE染料标记GPC3 CAR-IC细胞：

(1)收集GPC3 CAR-IC细胞，离心弃培养上清，用1×PBS缓冲液离心洗涤3次，以去除FBS对CFSE标记的影响；

(2)用1×PBS缓冲液重悬细胞至1×10⁷个/mL，加入CFSE染料(Invitrogen，货号65-0850-84)至5μM迅速混匀，置于37℃培养箱孵育10min；

(3)加入至少2倍体积的冷的含10％ FBS的RPMI-1640培养基终止CFSE标记，然后离心去上清；

(4)用含10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬，离心洗涤2次；

(5)最后标记好的GPC3 CAR-IC细胞按需要的密度用含10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬。

2、将标记好的GPC3 CAR-IC细胞按实验要求的剂量进行辐照。

具体地：将标记好的GPC3 CAR-IC细胞用含10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，采取不同辐照剂量处理，辐射剂量分别为0Gy、5Gy、7.5Gy和10Gy，辐照条件为：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，辐照时间＝辐照剂量/(1.199Gy/min)。

3、不同剂量辐照的GPC3 CAR-IC细胞按每孔2×10⁶个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％ FBS RPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。

4、收集D4天的细胞，流式检测GPC3 CAR-IC细胞的增殖情况。

结果如图3中C所示，辐照抑制GPC3 CAR-IC细胞扩增，有剂量效应。D4天时，辐照剂量为10Gy的GPC3 CAR-IC细胞无扩增，辐照剂量为5Gy和7.5Gy的CAR-IC细胞有少量细胞分裂。

实施例5、辐照对GPC3 CAR-IC细胞功能的影响

GPC3 CAR-IC细胞用含10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，采取不同辐照剂量处理，辐射剂量分别为0Gy、10Gy，辐照条件为：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，辐照时间＝辐照剂量/(1.199Gy/min)。

不同剂量辐照的GPC3 CAR-IC细胞按每孔2×10⁶个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％ FBS RPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。

培养后进行下述多种功能检测。

5.1、辐照对GPC3 CAR-IC细胞分泌功能效应分子IFN-γ的影响

连续四天(D0天、D1天、D2、D3天)取上述辐照后的GPC3 CAR-IC细胞检测其分泌的IFN-γ。具体步骤如下：

1、分别取不同辐照剂量条件下的上述培养D0天、D1天、D2天和D3的GPC3 CAR-IC细胞，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取100μL加入96孔U底板中，以受试细胞:靶细胞＝1:1的比例加入HepG2细胞，之后每孔加入终浓度为5μg/mL的Brefeldin A(Med Chem Express，HY-16592)，置于37℃培养箱孵育6小时。

2、孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％ NaN₃和2％ FBS)重悬，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体和GPC3-hFc重组蛋白)重悬混匀，避光、室温孵育10min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min后弃上清；

(4)每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；

(5)1500rpm离心5min弃上清后，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(6)每孔加入20μL稀释的APC标记的抗人IFN-γ(Biolegend，货号506510)重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL Perm buffer，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞，分析功能效应分子IFN-γ在CAR-T细胞中的百分比。

结果如图4所示，D0/D1/D2/D3天的GPC3 CAR-IC细胞均能特异性分泌T细胞效应分子IFN-γ，辐照后3天的GPC3 CAR-IC细胞仍保留CAR特异性的效应功能(IFN-γ分泌)。

5.2、辐照GPC3 CAR-IC细胞的细胞毒(脱颗粒CD107a的表达)功能检测

连续四天(D0天、D1天、D2、D3天)取上述辐照后的GPC3 CAR-IC细胞检测脱颗粒能力，即CD107a的表达。

1)上述细胞培养至D15天，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取100μL加入96孔U底板中；

2)以受试细胞:靶细胞＝1:1的比例每孔加入HepG2细胞作为CAR抗原特异性刺激；

3)每孔加入1μL APC标记的抗人CD107a抗体(Biolegend公司，货号328620)，37℃孵育4h；

4)每孔加入10μL 1:50倍稀释的Monensin Solution(Invitrogen，货号00-4505-51)，继续孵育3h；

5)孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％ NaN₃和2％ FBS)重悬混匀，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8/GPC3(rp))重悬混匀，避光、室温孵育10min；

(3)1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACS buffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞并分析细胞脱颗粒分子CD107a在T细胞中的百分比。

检测结果如图5所示，D0/D1/D2/D3天辐照后GPC3 CAR-IC细胞均能特异性上调CD107a，辐照后3天的GPC3 CAR-IC细胞仍保留CAR特异性的杀伤功能。

5.3、辐照GPC3 CAR-IC细胞毒作用检测

连续四天(D0天、D1天、D2、D3天)取上述辐照后的GPC3 CAR-IC细胞检测杀伤肿瘤细胞的细胞毒作用。

1)上述受试细胞培养至D10天，调整细胞密度至2×10⁵个/mL，取100μL加入96孔U底板中；加入终浓度为100μg/mL的D-萤火虫荧光素钠盐(Yeasen Biotechnology，货号40901ES08，储存浓度为100mg/mL)，重复3孔；

2)按不同的效靶比率(1:1、1:3、1:9、1:27)分别加入靶细胞HepG2，37℃培养16h。

3)用TECAN spark酶标仪测量荧光数值，取三个重复孔的平均值计算GPC3 CAR-IC细胞的特异性杀伤活性(Cytotoxicity)：

Specific lysis％＝100-100×(Eexp-Emin)/(Tmax-Tmin)

Eexp：效应细胞和靶细胞共培养时的RLU数值；

Emin：无细胞的情况下，效应细胞的自发死亡RLU数值；

Tmax：无效应细胞的情况下，靶细胞的自发死亡RLU数值；

Tmin：最大杀伤率条件下的RLU数值。

检测结果如图6所示，无辐照和有辐照的GPC3 CAR-IC细胞均能特异性杀伤GPC3⁺靶细胞，且两者在D0天、D1天、D2、D3天的杀伤作用相似；对照CTR T对GPC3⁺靶细胞均无杀伤作用。

5.4、辐照GPC3 CAR-IC细胞分泌IFN-γ和IFN-α2的细胞功能检测

辐照后的GPC3 CAR-IC细胞培养至D15天，按每孔1mL共1×10⁶个细胞加入24孔TC板中，以受试细胞:靶细胞＝1:1的比例加入HepG2细胞，置于37℃培养箱共培养，并记为D0天。

连续五天(D1天、D2、D3、D4、D5天)取上述共培养细胞检测分泌的IFN-γ和IFN-α2。

检测分组及对照如下：

CTR 0Gy-HepG2：每孔共1×10⁶个无病毒转染、未辐照的T细胞(CTR T细胞)，无HepG2细胞共培养；

CTR 0Gy+HepG2：每孔1×10⁶个无病毒转染、未辐照的T细胞(CTR T细胞)中加入1×10⁶个HepG2细胞共培养；

GPC3 CAR-IC 0Gy-HepG2：每孔1×10⁶个未辐照的GPC3 CAR-IC细胞，无HepG2细胞共培养；

GPC3 CAR-IC 0Gy+HepG2：每孔1×10⁶个未辐照的GPC3 CAR-IC细胞中加入1×10⁶个HepG2细胞；

GPC3 CAR-IC 10Gy-HepG2：每孔1×10⁶个10Gy辐照的GPC3 CAR-IC细胞，无HepG2细胞共培养；

GPC3 CAR-IC 10Gy+HepG2：每孔1×10⁶个10Gy辐照的GPC3 CAR-IC细胞中加入1×10⁶个HepG2细胞。

具体检测步骤如下：

1、上述培养D1天、D2、D3、D4、D5天的共培养细胞，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取100μL加入96孔U底板，每孔加入终浓度为5μg/mL的Brefeldin A(Med Chem Express，HY-16592)，置于37℃培养箱孵育5～6小时。

2、孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％ NaN₃和2％ FBS)重悬，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8/GPC3(rp))重悬混匀，避光、室温孵育10min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min后弃上清；

(4)每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；

(5)1500rpm离心5min弃上清后，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(6)每孔加入20μL稀释的APC标记的抗人IFN-γ(Biolegend，货号506510)或抗人IFN-α2(Biolegend，货号537204)重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL Perm buffer，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞，分析功能效应分子IFN-γ和IFN-α2在GPC3 CAR-IC细胞和对照细胞中的百分比。

检测结果如图7所示，与靶细胞抗原共培养后，无辐照和有辐照的GPC3 CAR-IC细胞均能特异性分泌T细胞效应分子IFN-γ；无抗原刺激条件下GPC3 CAR-IC细胞可分泌低水平的IFNα2，有抗原刺激条件下GPC3 CAR-IC细胞可分泌高水平的IFNα2。

5.5、体外检测辐照后GPC3 CAR-IC细胞与靶细胞共培养分泌的IFN-α2对NK细胞的诱导作用

受试细胞为辐照后的GPC3 CAR-IC细胞和CTR T细胞(即无病毒转染的T细胞)。

检测步骤如下：

1)上述受试细胞培养至D10天，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取1mL加入96孔U底板中；

2)以受试细胞:靶细胞＝1:1的比例每孔加入1×10⁶个HepG2细胞，共培养3天；

3)离心收集上清，同PBMC细胞共孵育，其中PBMC：1×10⁶个/well，上清：0.1mL/well；

4)孵育过夜后，每孔加入Brefeldin A(Med Chem Express，HY-16592)至工作浓度5μg/mL，37℃孵育4h；

5)孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％ NaN₃和2％ FBS)重悬，1500rpm离心5min；

(2)每孔加入40μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD56)重悬混匀，避光、室温孵育10min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min后弃上清；

(4)每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；

(5)1500rpm离心5min弃上清后，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(6)每孔加入40μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人IFNγ)重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL Perm buffer，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞转移至流式读数管中，流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞，分析效应分子IFN-γ在NK细胞中的百分比。

检测结果如图8所示，辐照后的GPC3 CAR-IC细胞分泌的IFN-α2能够诱导NK细胞分泌功能效应分子IFN-γ。

5.6、移植瘤HepG2-NSG模型评估辐照后GPC3 CAR-IC细胞的体内杀瘤作用和动物存活情况

采用HepG2皮下荷瘤NSG小鼠模型(HepG2-NSG模型)评估辐照后GPC3 CAR-IC细胞的体内杀瘤作用和动物存活情况。具体步骤如下：

1)NSG小鼠(6-7周龄)右侧下肢背部皮下接种HepG2细胞，1×10⁷个细胞/只。

2)第12天，小鼠肿瘤长至80-100mm³后注射辐照后GPC3 CAR-IC细胞，记为D0天。期间随机将荷瘤小鼠分为3组，5只/组，分组如下：

对照组(CTR T)：注射CTR T细胞，3×10⁶个细胞/只；

GPC3 CAR-IC 0Gy组：注射未辐照的GPC3 CAR-IC细胞，3×10⁶个细胞/只；

GPC3 CAR-IC 10Gy组：注射10Gy辐照的GPC3 CAR-IC细胞，3×10⁶个细胞/只。

3)D5天，GPC3 CAR-IC 10Gy组第二次注射。

4)分别在给药后的D7、D14、D21、D28、D35天用游标卡尺测量肿瘤大小。

5)分别在小鼠给药后的D1、D3、D5、D6、D8、D10、D14天颌下取血，常规qPCR方法检测辐照后GPC3 CAR-IC细胞在体内的存留情况。

检测结果如图9所示，同对照组比较，D0和D5注射两次高剂量辐照后的GPC3 CAR-IC细胞具有显著的抑瘤效果，尽管同未辐照的GPC3 CAR-IC细胞相比效果稍差。细胞注射后，D1天在血液中可检测到辐照后的GPC3 CAR-IC细胞，D3天达到峰值后逐渐下降，D5天仍可检测到。证明辐照后GPC3 CAR-IC细胞在体内至少可存活5天。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.辐照CAR-T细胞，所述细胞按照包括如下步骤的方法制备：用电离射线对离体的CAR-T细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线选自α射线、β射线、γ射线、X射线、电子束、质子束、重离子束、中子束中的一种或几种，所述离体的CAR-T细胞为GPC3 CAR-IC细胞，所述GPC3 CAR-IC细胞含有核酸分子，所述核酸分子包括嵌合抗原受体的编码基因和嵌合转换开关受体的编码基因，所述嵌合转换开关受体包括TGFβ受体II型胞外区、μPD-1和CD27跨膜区和胞浆区，所述μPD-1的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第187-332位，所述嵌合抗原受体的编码基因为靶向GPC3的嵌合抗原受体的编码基因。

2.根据权利要求1所述的辐照CAR-T细胞，其特征在于，所述辐照CAR-T细胞与所述GPC3CAR-IC细胞相比增殖活性降低的同时保持了特异性分泌T细胞效应分子IFN-γ的作用、细胞毒作用、特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞的作用、特异性分泌T细胞效应分子IFNα2的作用、诱导NK细胞分泌功能效应分子IFN-γ的作用和/或体内抑瘤作用。

3.根据权利要求1或2所述的辐照CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合转换开关受体的编码基因为下述任一种：

A1)编码融合蛋白的DNA分子；

A2)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

A3)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

所述融合蛋白为下述任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

4.根据权利要求1-3中任一所述的辐照CAR-T细胞，其特征在于，所述核酸分子还包括IFNα基因和/或P2A基因。

5.根据权利要求1-4中任一所述的辐照CAR-T细胞，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：

C1)核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA分子；

C2)SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的DNA分子具有70％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

6.根据权利要求1-5中任一所述的辐照CAR-T细胞，其特征在于，所述电离射线为X射线，所述辐照处理的时间为20-3000秒，所述辐照处理的剂量为1-50Gy。

7.根据权利要求1-6中任一所述的辐照CAR-T细胞，其特征在于，所述辐照处理条件为：辐照剂量为10Gy，剂量率为1.199Gy/min。

8.权利要求1-7中任一所述辐照CAR-T细胞的下述任一种应用：

D1)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用；

D2)在制备用于预防或治疗表达GPC3抗原的肿瘤的药物中的应用；

D3)在制备用于预防或治疗肝癌、黑色素瘤、Wilm’s瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、直结肠癌、肝胚细胞瘤或神经胶质瘤的药物中的应用。

9.一种制备权利要求1-7中任一所述辐照CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：

E1)用电离射线对权利要求1-5中任一所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线选自α射线、β射线、γ射线、X射线、电子束、质子束、重离子束、中子束中的一种或几种；

E2)用电离射线对权利要求1-5中任一所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线为X射线，所述辐照处理的时间为20-3000秒，所述辐照处理的剂量为1-50Gy；

E3)用电离射线对权利要求1-5中任一所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理得到辐照CAR-T细胞，所述电离射线为X射线，所述辐照处理条件为：辐照剂量为10Gy，剂量率为1.199Gy/min。

10.一种抑制权利要求1-5中任一所述GPC3 CAR-IC细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：

F1)用电离射线对所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理，完成对所述GPC3CAR-IC细胞增殖的抑制，所述电离射线选自α射线、β射线、γ射线、X射线、电子束、质子束、重离子束、中子束中的一种或几种；

F2)用电离射线对所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理，完成对所述GPC3CAR-IC细胞增殖的抑制，所述电离射线为X射线，所述辐照处理的时间为20-3000秒，所述辐照处理的剂量为1-50Gy；

F3)用电离射线对所述GPC3 CAR-IC细胞进行辐照处理，完成对所述GPC3CAR-IC细胞增殖的抑制，所述电离射线为X射线，所述辐照处理条件为：辐照剂量为10Gy，剂量率为1.199Gy/min。

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