CN115109774B

CN115109774B - 一种新型同种异体car-t细胞的制备及应用

Info

Publication number: CN115109774B
Application number: CN202210723088.4A
Authority: CN
Inventors: 朱建高; 杨文君
Original assignee: Carbiogene Therapeutics Co ltd
Current assignee: Carbiogene Therapeutics Co ltd
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2042-06-24
Also published as: CN115109774A

Abstract

本发明公开了一种新型同种异体CAR‑T细胞的制备及应用。所要解决的技术问题是如何在过继性细胞免疫治疗中抑制T细胞增殖以降低GVHD反应并保持T细胞活性的方法。本发明首先提供了一种抑制T细胞增殖的方法，包括用电离射线对离体的T细胞进行辐照处理，所述电离射线可为X射线，所述辐照处理条件包括10Gy照射500s或30Gy照射1500s。本发明制备的辐照CAR‑T细胞增殖活性被抑制，但仍保持良好的T细胞活性、分泌功能效应分子IFN‑γ功能、脱颗粒能力和体内和体外特异性杀伤靶细胞的能力。可提前大批量生产，有效地控制毒副反应CRS、CRES、GVHD，无基因编辑相关风险，避免污染RCR的风险。

Description

一种新型同种异体CAR-T细胞的制备及应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗领域中的一种新型同种异体CAR-T细胞的制备及应用。

背景技术

过继性细胞免疫治疗(Adoptive cell therapy，ACT)是指通过向机体输注在体外扩增的自体或同种异体特异性或非特异性的免疫细胞，直接或间接杀伤肿瘤细胞的疗法。过继性细胞免疫治疗包括淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activated killercell，LAK cell)免疫疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TIL)免疫疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK cell)免疫疗法、细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫疗法、T细胞受体基因工程改造的T细胞(T cell receptor gene engineered T cell，TCR-T)免疫疗法和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法。LAK细胞疗法因高剂量IL-2的应用而产生严重的不良反应，另外LAK细胞自身在体外较低的扩增能力和体内有限的杀瘤活性，导致其慢慢地退出临床治疗的舞台。TIL细胞是指从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，是过继性细胞免疫治疗中继LAK细胞后又一代高效的抗肿瘤效应T细胞，1986年Rosenberg等首先报道了TIL用于治疗转移性黑色素瘤，得到较好的临床疗效。作为肿瘤微环境中的一类免疫细胞，TIL在宿主抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。CIK细胞又称为自然杀伤细胞样T细胞，是继LAK细胞、TIL之后的新一代抗肿瘤过继性免疫细胞。CIK细胞的杀伤毒性较LAK细胞强，也不像TIL增殖时需与肿瘤细胞直接接触，并且具有广谱的杀瘤活性，在免疫治疗过程中产生的不良反应较小，是一种安全、有效的治疗方法。CTL的功能特点是可以在MHC限制的条件下，直接、连续、特异性地杀伤靶细胞，具有高效性。TCR-T和CAR-T是目前临床研究中过继性细胞免疫治疗的两大最新技术。TCR-T细胞和CAR-T细胞均通过基因改造手段提高T细胞受体(TCR)对特异性肿瘤抗原的识别、攻击和杀伤能力，但是两者在受体结构和抗原识别方面有很大区别。TCR-T细胞免疫技术作为传统过继性细胞免疫疗法的延伸，其识别肿瘤抗原的能力依赖于表达于抗原提呈细胞表面的MHC分子，其优势在于不仅能够识别肿瘤细胞表面抗原，还能够识别肿瘤细胞内的抗原。CAR-T是将外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)在体外经过基因修饰、细胞因子刺激和诱导生成的一种具有非MHC限制性的携带特异性抗原受体且可在体内扩增的CTL。研究表明，CAR-T细胞对肿瘤的攻击是特异、高效及持续的，尤其在血液肿瘤的治疗方面。近年来，CAR-T细胞治疗在B细胞等的血液系统肿瘤中取得了令人鼓舞的疗效，但该疗法的产业化难以实现仍然是阻碍其发展的瓶颈所在。

目前常规自体CAR-T或异体CAR-T治疗面临如下问题：(1)治疗窗口和细胞制备：常规自体CAR-T的治疗窗口和细胞生产时间较长，不太适合用于进展较快的侵袭性肿瘤的治疗；自体CAR-T的细胞来源受限于患者本身免疫系统中T细胞的数量和其杀伤能力，导致治疗效果有高有低；自体CAR-T细胞每批生产的批量小，仅适合用于1个患者使用，不易于规模化生产；自体CAR-T细胞需针对每个患者的具体情况实施生产，流程复杂，不易于统一质控。(2)安全问题：常规自体CAR-T或异体CAR-T治疗过程中，患者都有可能面临细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome，CRS)和CAR-T细胞相关性脑病综合征(CAR-T cellrelevant encephalopathy syndrome，CRES)等；异体CAR-T即便通过CRISPR基因编辑敲除相关的HLA I和TCR，也还是有可能出现移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVHD)；同时异体CAR-T是在制备过程中通过CRISPR技术对T细胞进行基因编辑，存在相关基因编辑风险。此外，并非每位适合CAR-T治疗的患者的细胞均能制备成功，对于那些经过多次化疗的患者，其自身T细胞的增殖能力大大减弱，有近1/4的患者CAR-T细胞制备不成功。因此，如何生产出高效、安全的通用型CAR-T细胞以减少生产成本是极大的挑战。

鉴于以上几个方面，通用型CAR-T技术的建立显得尤为紧迫，将是今后发展的一个新方向，它能够实现CAR-T细胞治疗的产业化，广泛而便捷地供给合适的患者使用，并极大地降低细胞制品的生产成本和患者的治疗成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何在过继性细胞免疫治疗中抑制T细胞增殖以降低GVHD反应并保持T细胞活性的方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种抑制T细胞增殖的方法，所述方法包括用电离射线对离体的T细胞进行辐照处理，所述电离射线可选自α射线、β射线、γ射线、X射线、电子束、质子束、重离子束、中子束中的一种或几种。

上述方法中，所述电离射线可为X射线，所述辐照处理的时间可为200-2000秒。

进一步地，上述方法中，所述电离射线可为X射线，所述辐照处理的时间可为200-1500、300-1500、400-1500、500-1500、500-1600、500-1700、500-1800、500-1900或500-2000秒。

进一步地，所述辐照处理时间可为600-1500、700-1500、800-1500、900-1500、1000-1500、1100-1500、1200-1500、1300-1500、1400-1500、500-1400、500-1300、500-1200、500-1100、500-1000、500-900、500-800、500-700或500-600秒。

进一步地，所述辐照处理时间可为200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000秒。

上述方法中，所述辐照处理的剂量可为1-50Gy。

进一步地，上述方法中，所述辐照处理的剂量可为10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、1-30、5-30、10-30、15-30、20-30Gy。

进一步地，所述辐照处理的剂量可为11-30、12-30、13-30、14-30、15-30、16-30、17-30、18-30、19-30、20-30、21-30、22-30、23-30、24-30、25-30、26-30、27-30、28-30、29-30、10-29、10-28、10-27、10-26、10-25、10-24、10-23、10-22、10-21、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12或10-11Gy。

进一步地，所述辐照处理的剂量可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50Gy。

上述方法中，所述辐照处理可为下述任一种：

A1)辐照剂量为10Gy，辐照时间为500秒；

A2)辐照剂量为30Gy，辐照时间为1500秒；

上述方法中，所述辐照处理条件可为：剂量率为1.199Gy/min。

进一步地，所述辐照处理条件可为：电压为160KV，电流为25mA，0.3mm铜滤过。

所述0.3mm铜滤过表示X-射线管具有附加的铜滤板以产生0.3mm Cu半值层(HVL，Half Value Layer)的辐照质量。

上述方法中，所述T细胞可为过继性细胞免疫治疗中的效应T细胞。

上述方法中，所述效应T细胞可为下述任一种：

B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；

B2)表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞。

本发明还提供了一种制备增殖活性降低的T细胞的方法，所述方法包括利用本文中任一所述方法对T细胞进行辐照处理，得到辐照T细胞，所述辐照T细胞的增殖活性低于所述T细胞，所述辐照T细胞为增殖活性降低的T细胞。

由上述方法制备的增殖活性降低的T细胞也在本发明的保护范围内。

进一步地，上述增殖活性降低的T细胞中，所述T细胞可为下述任一种：

B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；

B2)表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞(命名为B&CD27 T细胞)。

进一步地，所述辐照T细胞可为辐照CAR-T细胞。

进一步地，所述辐照CAR-T细胞可为辐照B&CD27 T细胞。

进一步地，本发明还提供了一种制备增殖活性降低的辐照CAR-T细胞的方法，所述方法包括利用本文中任一所述方法对所述CAR-T细胞进行辐照处理，得到所述增殖活性降低的辐照CAR-T细胞。

进一步地，上述制备增殖活性降低的辐照CAR-T细胞的方法中，所述CAR-T细胞可为表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞(B&CD27 T细胞)。

本发明还提供了一种过继性细胞免疫治疗的方法，所述方法包括向受试者施用上述增殖活性降低的T细胞，以进行过继性细胞免疫治疗。

进一步地，所述增殖活性降低的T细胞中，所述T细胞可为下述任一种：

B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；

B2)表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞(B&CD27 T细胞)。

本发明还提供了一种用于治疗BCMA介导的多发性骨髓瘤的CAR-T细胞免疫疗法，所述方法包括向受试者施用所述增殖活性降低的辐照CAR-T细胞，所述CAR-T细胞可为表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞。

所述受试者是指任何动物，包括人和非人动物，其中，非人动物包括所有的脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物。

进一步地，本文所述BCMA-CAR-CD27基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一个实施方案中，采用公告号为CN111850013B的发明专利《一种共刺激受体增效的嵌合抗原受体及其应用》中所述的方法构建所述表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞，包括如下步骤：

(1)将BCMA-CAR-CD27基因克隆到逆转录病毒载体MP71中，得到携带BCMA-CAR-CD27基因的重组逆转录病毒载体MP71-BCMA-CAR-CD27；

(2)将所述重组逆转录病毒载体MP71-BCMA-CAR-CD27转染逆转录病毒包装细胞(ECO细胞)进行包装，然后进行细胞培养后得到逆转录病毒；

(3)逆转录病毒感染人的T细胞，得到所述表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞(B&CD27 T细胞)。

在本发明的一个实施方案中，所述抑制T细胞增殖的方法包括用电离射线对所述T细胞(即B&CD27 T细胞)进行辐照处理，具体包括如下步骤：

使用X-射线辐照仪(Radsource，RS2000)进行辐照处理。

辐照条件：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，10Gy照射500s或30Gy照射1500s。

其中0.3mm铜滤过表示X-射线管具有附加的铜滤板以产生0.3mm Cu半值层(HVL，Half Value Layer)的辐照质量。

上述方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

虽然，本发明提供的实施例利用BCMA-CAR-CD27基因构建CAR-T细胞，但本发明不限于该特定基因和/或该特定细胞。本领域技术人员可采用其它任何合适的方法构建其他的过继性同种异体T细胞(如TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞)，并按照本发明所述的方法对构建的T细胞进行辐照处理，进一步用于过继性细胞免疫治疗。这些替代方法未脱离本发明的范围，本发明应包括这些替代方法。

本发明所述辐照CAR-T细胞(AI CAR-T)是将CAR元件导入健康人的T细胞，然后对细胞进行一定程度的辐照处理以抑制细胞回输后在体内的过度增殖，进而降低GVHD反应，但不影响CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

本发明制备的辐照CAR-T细胞(即辐照B&CD27 T细胞)增殖活性被抑制，但仍保持良好的T细胞活性、分泌功能效应分子IFN-γ的功能、脱颗粒能力、体内和体外特异性杀伤靶细胞的能力。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、即时可用的“现货成品”：可以提前大批量生产AI CAR-T，有合适的患者需要时即可进入治疗，可以很好地避免因常规CAR-T细胞生产制备周期长而错过癌症进展较快患者的最佳治疗时机。

2、安全性高：通过控制AI CAR-T的治疗剂量，可以有效地控制肿瘤患者治疗过程中可能产生的毒副反应如细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome，C RS)、CAR-T细胞相关性脑病综合征(CAR-T cell relevant encephalopathy syndrom e，CRES)和移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVHD)；不需要通过CR ISPR技术对T细胞进行基因编辑，避免了基因编辑相关风险；病毒载体被辐照处理后会进一步丧失扩增能力，并且病毒会被杀死，能够更好地避免CAR-T产品污染复制型逆转录病毒(replication-competent retrovirus，RCR)的风险。

3、同常规通用型CAR-T(Universal CART，UCAR-T)细胞和CAR-NK细胞产品一样，可以实现大规模工业化生产；同CAR-NK细胞相比，更易生产。

4、AI CAR-T细胞在体内不能进行扩增，其存活时间同可体内扩增的常规UCAR-T细胞相比较短，该段时间不足以产生GVHD反应，无需进行基因编辑，更加安全。

附图说明

图1为BCMA-CAR-CD27基因结构图。

图2为辐照对CAR-T细胞增殖的影响。

图3为辐照对CAR-T细胞存活的影响。

图4为CAR-T细胞亚群对辐照的敏感性。

图5为辐照对CAR-T细胞分泌功能效应分子IFN-γ的影响。

图6为辐照对CAR-T细胞脱颗粒能力的影响(CD107a的表达)。

图7为辐照CAR-T细胞特异性杀伤靶细胞的能力。

图8为辐照CAR-T细胞的体内杀瘤活性和动物存活情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pUC57载体为北京擎科生物科技有限公司产品。

下述实施例中的逆转录病毒载体MP71记载于如下文献中：Engels B,Cam H,etal.Retroviral Vectors for High-Level Transgene Expression in T Lymphocytes[J].Human Gene Therapy,2003,14(12):1155-1168.，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)来源于健康志愿者的静脉血。

下述实施例中的RPMI-1640培养基为sigma公司产品，货号为R8758。

下述实施例中的MM1.S细胞为上海吉凯基因医学科技股份有限公司产品。

下述实施例中的NSG小鼠(6～7周龄，体重20～22g)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。

下述实施例中的胎牛血清(FBS)为Thermo公司产品，货号：10091148；1×PBS为苏州美伦生物科技有限公司产品，货号：PWL050；青链霉素双抗(Pen Strep)为Gibco公司产品，产品编号：15140-122。

实施例1、辐照CAR-T细胞的制备

1、CAR-T细胞的制备

采用公告号为CN111850013B的发明专利《一种共刺激受体增效的嵌合抗原受体及其应用》中所述的方法构建CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达BCMA-CAR-CD27基因，其中BCMA-CAR-CD27基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。BCMA-CAR-CD27基因结构如图1所示。具体步骤如下：

(1)将BCMA-CAR-CD27基因克隆到pUC57载体上，得到重组载体pUC57-BCMA-CAR-CD27。

(2)用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切重组载体pUC57-BCMA-CAR-CD27，切胶回收目的基因片段。

(3)用NotI和EcoRI双酶切逆转录病毒载体MP71，切胶回收载体大片段。

(4)用T₄连接酶(NEB)连接上述目的基因片段和载体大片段，即得到携带BCMA-CAR-CD27基因的重组逆转录病毒载体MP71-BCMA-CAR-CD27。

(5)将重组逆转录病毒载体MP71-BCMA-CAR-CD27转化感受态大肠杆菌DH5α，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到的MP71-BCMA-CAR-CD27质粒进行逆转录病毒包装。

(6)逆转录病毒包装：a)第1天：Phoenix Ecotropic(ECO)细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6×10⁶个细胞/mL的密度铺板，10cm皿添加10mL的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；b)第2天：ECO细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备MP71-BCMA-CAR-CD27质粒12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μL，H₂O 1ml，总体积为1.25mL；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的2×HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到ECO皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基；c)第4天：转染48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤后，即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃。

(7)逆转录病毒感染人的T细胞：

a)复苏冻存的健康人外周血PBMC，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基调整细胞密度为1×10⁶-2×10⁶个细胞/mL。

b)Ficoll分离液(天津灏洋)收集PBMC，磁珠法分离获得CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞比为3:1加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。

c)T细胞活化后第二天，用PBS稀释至终浓度为15μg/mL的RetroNectin(TAKARA)包被非组织处理培养板，6孔板每孔1.2mL。避光，4℃过夜备用。

d)T细胞活化培养两天后，取出包被好的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

e)步骤(6)制备的逆转录病毒溶液加入孔内，每孔加5-6mL，32℃，2000×g，离心2h。每孔加入含hIL-2(500U/mL)的新鲜完全培养基3mL，继续培养1天。

f)细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100U/mL的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/mL左右，便于细胞扩增。

g)由此获得感染了步骤(6)制备的逆转录病毒的CAR-T细胞，命名为B&CD27T细胞(即表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞)。

2、CAR-T细胞的辐照处理

辐照处理的CAR-T细胞为步骤1制备的B&CD27 T细胞。

使用X-射线辐照仪(Radsource，RS2000)进行辐照处理。

实施例2、辐照对CAR-T细胞增殖的影响

1、CFSE染料标记CAR-T细胞：

(1)收集实施例1的CAR-T细胞(B&CD27 T细胞)，离心弃培养上清，用1×PBS缓冲液离心洗涤3次，以去除FBS对CFSE标记的影响；

(2)用1×PBS缓冲液重悬细胞至1×10⁷个/mL，加入CFSE染料(Invitrogen，货号65-0850-84)至5μM迅速混匀，置于37℃培养箱孵育10min；

(3)加入至少2倍体积的冷的含10％FBS的RPMI-1640培养基终止CFSE标记，然后离心去上清；

(4)用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，离心洗涤2次；

(5)最后标记好的CAR-T细胞按需要的密度用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬。

2、将标记好的CAR-T细胞按实验要求的剂量进行辐照。

具体地：将标记好的CAR-T细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，采取5种不同辐照剂量处理，辐射剂量分别为0Gy、1Gy、3Gy、10Gy、30Gy，辐照条件为：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，辐照时间＝辐照剂量/(1.199Gy/min)。

3、不同剂量辐照和未辐照的CAR-T细胞按每孔2mL共2×10⁶个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBS RPMI-1640培养基(+Medium)，置于37℃培养箱培养，实验设置两组，第一组培养至D3(第3)天，第二组培养至D4(第4)天。

4、收集细胞，流式检测和分析CAR-T细胞的增殖情况(CD4/CD8/CAR)，如图2所示。其中流式检测中所用的抗体为CD3-APC(APC anti-human CD3 Antibody，Biolegend公司产品，货号：317318)、CD4-APC/Cy7(APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody，Biolegend公司产品，货号：317450)、CD8-PerCP/Cy5.5(PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD8 Antibody，Biolegend公司产品，货号：344710)、Human BCMA/TNFRSF17 Protein,Fc Tag(ACROBiosystems公司产品，货号：BC7-H5254)和Human IgG FC-PE(PE anti-human IgG FcAntibody，Biolegend公司产品，货号：410708)。

结果如图2所示，X-射线辐照能够抑制CAR-T细胞的增殖，并产生剂量效应，随着辐照剂量的增加，CAR-T细胞增殖被抑制的程度加强；辐照剂量为30Gy时，D3和D4天的CAR-T细胞无增殖；辐照剂量为10Gy时，D3天有少量的CD8⁺T细胞分裂，但在D4天时未见到分裂的细胞。

实施例3、辐照对CAR-T细胞存活的影响

将实施例1中步骤1制备的CAR-T细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，采取3种不同辐照剂量处理，辐射剂量分别为0Gy、10Gy、30Gy，辐照条件为：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，辐照时间＝辐照剂量/(1.199Gy/min)。

不同剂量辐照和未辐照的CAR-T细胞按每孔2mL共2×10⁶个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBS RPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。

使用APC Annexin V(Biolegend，货号640920)和7-AAD Viability StainingSolution(Biolegend，货号420404)连续四天(D0天、D1天、D2天、D3天)取辐照后的CAR-T细胞检测细胞的凋亡情况。具体检测步骤如下：

1、分别取不同辐照剂量条件下的上述培养D0天、D1天、D2天和D3天的细胞悬液200μL至96孔的圆形底板中，1500rpm离心5min，弃上清后每孔加入200μL MACS buffer(含2％FBS和1％青链霉素双抗(pen strep)的PBS)洗涤1遍，再使用冰的PBS洗涤两遍，每次1500rpm离心5min；

2、每孔分别加入100μL Binding buffer(1:10稀释的10×Annexin V bindingbuffer(Biolegend，货号422201))、5μL的APC Annexin V和5μL的7-AAD ViabilityStaining，避光、室温孵育15min。

3、每孔加入400μL Binding buffer后转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞后分析Annexin V和7-AAD的百分比。

结果如图3所示，X-射线辐照导致CAR-T细胞的活率逐渐减少，CAR-T细胞的凋亡同辐照时间和辐照剂量呈现正相关。

实施例4、CAR-T细胞亚群对辐照的敏感性

将实施例1中步骤1制备的CAR-T细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，采取3种不同辐照剂量处理，辐射剂量分别为0Gy(图中记为“+0Gy”或“0Gy”)、10Gy(图中记为“+10Gy”或“10Gy”)、30Gy(图中记为“+30Gy”或“30Gy”)，辐照条件为：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，辐照时间＝辐照剂量/(1.199Gy/min)。

连续四天(D0天、D1天、D2天、D3天)取辐照后的CAR-T细胞检测细胞亚型。

具体步骤如下：

1、分别取不同辐照剂量条件下的上述培养D0天、D1天、D2天和D3天的细胞悬液200μL至96孔的圆形底板中，1500rpm离心5min；

2、每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体和BCMA-hFc重组蛋白)重悬混匀，避光、室温孵育10min；

3、每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min；

4、弃上清，用400μL FACS buffer重悬细胞，并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞并分析CD4/CD8和CAR^+/-的百分比。

结果如图4所示：

1、同CD4⁺T细胞相比，辐照处理使得CD8⁺T细胞的凋亡更快，说明CD8⁺T细胞比CD4⁺T细胞对辐照更敏感；

2、同CAR^-T细胞相比，辐照使得CAR⁺T细胞的凋亡更快，说明CAR⁺T细胞比CAR^-T细胞对辐照更敏感；

3、同CD4⁺CAR⁺T细胞相比，辐照致使CD8⁺CAR⁺T细胞的凋亡更快，说明CD8⁺CAR⁺T细胞比CD4⁺CAR⁺T细胞对辐照更敏感。

实施例5、辐照对CAR-T细胞分泌功能效应分子IFN-γ的影响

连续三天(D0天、D1天、D2天)取上述辐照后的CAR-T细胞检测其分泌的IFN-γ。具体步骤如下：

1、分别取不同辐照剂量条件下的上述培养D0天、D1天、和D2天的CAR-T细胞，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取100μL加入96孔U底板中，分为四组，分别用不同的T细胞刺激剂检测T细胞的效应功能：

(1)阴性对照(+Medium)：每孔加入100μL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)作为阴性对照；

(2)TCR特异性刺激组(+OKT3)：每孔加入100μL Medium(含终浓度为5μg/mL抗人CD3抗体OKT3的10％FBS RPMI-1640培养基)；

(3)TCR非依赖性刺激组(+PMA)：每孔加入100μL Medium(含终浓度为100ng/mLPMA的10％FBS RPMI-1640培养基)；

(4)CAR抗原特异性刺激组(+MM1.S)：每孔加入100μL共2×10⁵个MM1.S细胞；

上述各实验组铺板完成后每孔加入终浓度为5μg/mL的Brefeldin A(Med ChemExpress，HY-16592)，置于37℃培养箱孵育5～6小时。

2、孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％NaN₃和2％FBS)重悬，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体和BCMA-hFc重组蛋白)重悬混匀，避光、室温孵育10min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min后弃上清；

(4)每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；

(5)1500rpm离心5min弃上清后，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(6)每孔加入20μL稀释的APC标记的抗人IFN-γ(Biolegend，货号506510)重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL Perm buffer，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞，分析功能效应分子IFN-γ在CAR-T细胞中的百分比。

结果如图5所示：

1、TCR特异性刺激组：辐照处理的CAR-T细胞可以分泌功能效应分子IFN-γ，随着时间的增加，其分泌功能效应分子IFN-γ的能力逐渐降低；

2、TCR非依赖性刺激组：辐照处理的CAR-T细胞可以分泌功能效应分子IFN-γ，随着时间的增加，其分泌功能效应分子IFN-γ的能力逐渐降低；

3、CAR抗原特异性刺激组：辐照处理的CAR-T细胞可以分泌功能效应分子IFN-γ，随着时间的增加，其分泌功能效应分子IFN-γ的能力逐渐降低。

实施例6、辐照对CAR-T细胞脱颗粒能力的影响(CD107a的表达)

连续四天(D0天、D1天、D2天、D3天)取上述辐照后的CAR-T细胞检测脱颗粒能力，即CD107a的表达。具体步骤如下：

1、分别取不同辐照剂量条件下的上述培养D0天、D1天、D2和D3天的CAR-T细胞，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取100μL CAR-T细胞加入96孔U底板中；

2、每孔加入100μL共2×10⁵个MM1.S细胞(作为CAR抗原特异性刺激(+MM1.S)，同时每孔加入100μL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)为阴性对照(-MM1.S)；

3、每孔加入1μL APC标记的抗人CD107a抗体(Biolegend公司，货号328620)，37℃孵育1h；

4、每孔加入10μL 1:50倍稀释的Monensin Solution(Invitrogen^TM，货号00-4505-51)，继续孵育3h；

5、孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％NaN₃和2％FBS)重悬混匀，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；

(3)1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACS buffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞并分析细胞脱颗粒分子CD107a在CAR-T细胞中的百分比。

结果如图6所示，辐照处理后CAR-T细胞的脱颗粒能力略有下降，且其下降趋势同辐照强度和时间正相关。

实施例7、辐照CAR-T细胞特异性杀伤靶细胞的能力

将实施例1中步骤1制备的CAR-T细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，采取2种不同辐照剂量处理，辐射剂量分别为0Gy、30Gy，辐照条件为：160KV、25mA、0.3mm铜滤过，默认剂量率为1.199Gy/min，辐照时间＝辐照剂量/(1.199Gy/min)。

不同剂量辐照和未辐照的CAR-T细胞对照按每孔2mL共2×10⁶个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBS RPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。

连续三天(D0天、D1天、D2天)取上述辐照后的CAR-T细胞作为效应细胞检测其特异性杀伤靶细胞MM1.S细胞的能力。具体步骤如下：

1、将表达荧光素酶的MM1.S细胞以5×10⁵个细胞/mL的浓度放置在96孔圆形底板中，加入终浓度为100μg/mL的D-萤火虫荧光素钠盐(Yeasen Biotechnology，货号40901ES08，储存浓度为100mg/mL)，重复3孔；

2、按不同的效靶比率(1:1、1:3、1:9、1:27)分别加入效应细胞CAR-T(1:1条件下效应细胞的细胞密度为5×10⁵个细胞/mL)，37℃培养过夜。无效应细胞的情况下，靶细胞用10％SDS(Beyotime，货号ST626)处理；

CTR T-0Gy对照：无病毒转染的T细胞,且不进行辐照处理；

CAR T-0Gy：未经辐照处理的CAR-T细胞；

CAR T-30Gy：经辐照(30Gy)处理后的CAR-T细胞；

3、用TECAN spark酶标仪测量荧光数值，取三个重复孔的平均值计算CAR-T细胞的特异性杀伤活性(Cytotoxicity)：

Specific lysis％＝100-100×(Eexp-Emin)/(Tmax-Tmin)

Tmin：最大杀伤率条件下的RLU数值；

Eexp：效应细胞和靶细胞共培养时的RLU数值；

Tmax：无效应细胞的情况下，靶细胞的自发死亡RLU数值；

Emin：无细胞的情况下，效应细胞的自发死亡RLU数值。

结果如图7所示，CAR-T细胞无论是否经过辐照处理，均具有特异性杀伤靶细胞的能力；辐照处理的CAR-T细胞的特异性杀伤靶细胞能力略有降低，且跟辐照时间相关，依然保持了较好的特异性杀伤靶细胞的能力。

实施例8、辐照CAR-T细胞的体内杀瘤活性和动物存活情况

采用MM1.S(人IgA-骨髓瘤细胞)的NSG小鼠模型检测上述辐照后CAR-T细胞的体内杀瘤活性。具体步骤如下：

1、NSG小鼠(6～7周龄)右侧下肢背部皮下接种MM1.S肿瘤细胞株2×10⁶个细胞/只。

2、接种12天后，将荷瘤小鼠随机分为3组(每组各4只)，注射不同剂量辐照和未辐照的CAR-T细胞：

对照组(CTR T-0Gy)：每只注射1×10⁶个未经辐照处理的无病毒转染T细胞；

CAR T-0Gy治疗组：每只注射1×10⁶个未经辐照处理的CAR-T细胞；

CAR T-30Gy治疗组：每只注射10×10⁶个经辐照(30Gy)处理的CAR-T细胞；

3、分别在接种细胞后的D0、D7、D14和D21天检测荷瘤小鼠体内的荧光强度。

结果如图8所示：

1、对照组注射常规T细胞，随着时间的延长，小鼠体内肿瘤细胞逐渐增多，荧光强度相应逐渐增强，最后导致小鼠死亡；

2、注射了CAR-T细胞的荷瘤小鼠体内的荧光在D7天基本消失，并能够维持无瘤或基本无瘤状态直到D21天，说明无论是否经过辐照处理，CAR-T细胞均具有良好的体内杀瘤活性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江康佰裕生物科技有限公司

<120> 一种新型同种异体CAR-T细胞的制备及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2337

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacatcg ttttgacaca atctcctgcg tcattggcca tgagtctcgg gaagcgcgca 120

acaatatcct gtcgcgccag tgaatctgtg tctgtgatag gagcgcactt gatccattgg 180

tatcagcaga aacctggaca acctcccaag ctgctcatct acctcgccag taaccttgaa 240

acaggagtac ctgctcggtt ttcaggttcc gggtcaggga cggatttcac tttgactatc 300

gacccagttg aggaagacga cgtagccata tatagctgcc tgcagtctcg gatcttcccg 360

cgcacgttcg ggggaggaac taagctggag attaagggcg gcgggggttc tggtggcggc 420

ggcagcggcg gtggaggatc acaaatccaa ctggttcagt ccggtccaga actgaaaaag 480

ccgggggaga cggtgaaaat ctcctgtaag gcctcaggtt ataccttcac cgattacagc 540

atcaattggg taaagcgggc tccagggaaa ggtctgaaat ggatgggttg gatcaacaca 600

gaaacccgag aaccagccta tgcttacgac tttcgaggtc gattcgcttt ttccttggaa 660

acttccgcaa gcacagccta tctgcaaatc aacaatctca agtacgaaga tacggccacg 720

tatttttgtg ccctggatta cagctatgca atggattact ggggtcaggg gacgtctgtt 780

acagtttcta gtactacaac tccagcaccc agacccccta cacctgctcc aactatcgca 840

agtcagcccc tgtcactgcg ccctgaagcc tgtcgccctg ctgccggggg agctgtgcat 900

actcggggac tggactttgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca ggttcagtgt cgtgaagaga 1020

ggccggaaga agctgctgta catcttcaag cagcctttca tgaggcccgt gcagactacc 1080

caggaggaag atggatgcag ctgtagattc cctgaagagg aggaaggagg ctgtgagctg 1140

agagtgaagt tctcccgaag cgcagatgcc ccagcctatc agcagggaca gaatcagctg 1200

tacaacgagc tgaacctggg aagacgggag gaatacgatg tgctggacaa aaggcggggc 1260

agagatcctg agatgggcgg caaaccaaga cggaagaacc cccaggaagg tctgtataat 1320

gagctgcaga aagacaagat ggctgaggcc tactcagaaa tcgggatgaa gggcgaaaga 1380

aggagaggaa aaggccacga cggactgtac caggggctga gtacagcaac aaaagacacc 1440

tatgacgctc tgcacatgca ggctctgcca ccaagacgag ctaaacgagg ctcaggcgcg 1500

acgaacttta gtttgctgaa gcaagctggg gatgtagagg aaaatccggg tcccatggcc 1560

agaccccacc cctggtggct gtgcgtgctg ggaaccctgg tgggcctgtc tgccaccccc 1620

gctcctaaga gctgccccga gagacactac tgggcccagg gcaagctgtg ctgccagatg 1680

tgcgaacccg gcacctttct ggtgaaagat tgcgatcagc atagaaaggc cgcccagtgt 1740

gacccctgca tccccggagt gagcttcagc ccagaccatc acaccaggcc ccactgcgag 1800

agctgcagac actgcaacag tggcctgctg gtgagaaact gcacaattac agccaacgct 1860

gagtgcgcct gcagaaatgg atggcagtgc agagacaagg agtgcaccga atgcgacccc 1920

ctgcccaacc ccagcctgac agcccgaagc agccaggccc tgagccccca tccccagcct 1980

acccacctgc cctacgtgag tgagatgctg gaagccagaa ccgccggcca catgcagacc 2040

ctggccgact tcagacagct gcccgccaga accctgagca cccactggcc cccccagaga 2100

agcctgtgca gcagcgactt tatcagaatc ctggtgatct tctctggcat gttcctggtg 2160

tttacactgg ccggcgccct gtttctgcac cagagacgca agtaccgcag caacaaggga 2220

gaaagccccg tggagcccgc tgagccctgc agatactcct gccccagaga ggaggagggc 2280

agcaccattc ccatccagga ggactacaga aaacccgagc ccgcctgcag cccatga 2337

<210> 2

<211> 778

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu

20 25 30

Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu

35 40 45

Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser

100 105 110

Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

145 150 155 160

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

165 170 175

Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala

195 200 205

Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser

325 330 335

Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

340 345 350

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

355 360 365

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg

485 490 495

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

500 505 510

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys

515 520 525

Val Leu Gly Thr Leu Val Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser

530 535 540

Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met

545 550 555 560

Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys

565 570 575

Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp

580 585 590

His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly

595 600 605

Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys

610 615 620

Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro

625 630 635 640

Leu Pro Asn Pro Ser Leu Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro

645 650 655

His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala

660 665 670

Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro

675 680 685

Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser

690 695 700

Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val

705 710 715 720

Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg

725 730 735

Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr

740 745 750

Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp

755 760 765

Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

770 775

Claims

1.一种抑制CAR-T细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括用X射线对离体的CAR-T细胞进行辐照处理，得到辐照CAR-T细胞，所述辐照处理的时间为500-1500秒，所述辐照处理的剂量为10-30 Gy，所述CAR-T细胞为表达BCMA-CAR-CD27基因的T细胞，所述BCMA-CAR-CD27基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述方法为非疾病诊断治疗目的，所述辐照处理条件为：剂量率为1.199 Gy/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辐照处理为下述任一种：

A1）辐照剂量为10 Gy，辐照时间为500秒；

A2）辐照剂量为30 Gy，辐照时间为1500秒。

3.一种制备增殖活性降低的CAR-T细胞的方法，所述方法包括利用权利要求1-2中任一所述方法对权利要求1中所述的CAR-T细胞进行辐照处理，得到辐照CAR-T细胞，所述辐照CAR-T细胞的增殖活性低于所述CAR-T细胞，所述辐照CAR-T细胞为增殖活性降低的CAR-T细胞，所述方法为非疾病诊断治疗目的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述辐照CAR-T细胞可以降低GVHD反应同时具有良好的分泌功能效应分子IFN-γ的功能、脱颗粒能力、体外特异性杀伤靶细胞的能力和/或体内杀瘤活性。

5.由权利要求3或4所述的方法制备的所述增殖活性降低的CAR-T细胞。