CN115927192A - 一种新型通用car-t细胞的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型通用CAR‑T细胞的制备及应用。所要解决的技术问题是如何在过继性细胞免疫治疗中抑制T细胞增殖以降低GVHD反应并保持T细胞活性的方法。本发明首先提供了一种抑制T细胞增殖的方法，包括用DNA合成抑制剂对离体的T细胞进行处理，所述DNA合成抑制剂可为丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)。本发明制备的CAR‑T细胞(33&CD27T细胞)增殖活性被抑制，但仍保持良好的T细胞活性、分泌功能效应分子IFN‑γ功能、脱颗粒能力和体内和体外特异性杀伤靶细胞的能力。可大批量生产，有效地控制毒副反应CRS、CRES、GVHD，无基因编辑相关风险，有利于降低细胞制品的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域中的一种新型通用CAR-T细胞的制备及应用。
背景技术
过继性细胞免疫治疗(Adoptive cell therapy，ACT)是指通过向机体输注在体外扩增的自体或同种异体特异性或非特异性的免疫细胞，直接或间接杀伤肿瘤细胞的疗法。过继性细胞免疫治疗包括淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activated killercell，LAK cell)免疫疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TIL)免疫疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK cell)免疫疗法、细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫疗法、T细胞受体基因工程改造的T细胞(T cell receptor gene engineered T cell，TCR-T)免疫疗法和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法。LAK细胞疗法因高剂量IL-2的应用而产生严重的不良反应，另外LAK细胞自身在体外较低的扩增能力和体内有限的杀瘤活性，导致其慢慢地退出临床治疗的舞台。TIL细胞是指从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，是过继性细胞免疫治疗中继LAK细胞后又一代高效的抗肿瘤效应T细胞，1986年Rosenberg等首先报道了TIL用于治疗转移性黑色素瘤，得到较好的临床疗效。作为肿瘤微环境中的一类免疫细胞，TIL在宿主抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。CIK细胞又称为自然杀伤细胞样T细胞，是继LAK细胞、TIL之后的新一代抗肿瘤过继性免疫细胞。CIK细胞的杀伤毒性较LAK细胞强，也不像TIL增殖时需与肿瘤细胞直接接触，并且具有广谱的杀瘤活性，在免疫治疗过程中产生的不良反应较小，是一种安全、有效的治疗方法。CTL的功能特点是可以在MHC限制的条件下，直接、连续、特异性地杀伤靶细胞，具有高效性。TCR-T和CAR-T是目前临床研究中过继性细胞免疫治疗的两大最新技术。TCR-T细胞和CAR-T细胞均通过基因改造手段提高T细胞受体(TCR)对特异性肿瘤抗原的识别、攻击和杀伤能力，但是两者在受体结构和抗原识别方面有很大区别。TCR-T细胞免疫技术作为传统过继性细胞免疫疗法的延伸，其识别肿瘤抗原的能力依赖于表达于抗原提呈细胞表面的MHC分子，其优势在于不仅能够识别肿瘤细胞表面抗原，还能够识别肿瘤细胞内的抗原。CAR-T是将外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)在体外经过基因修饰、细胞因子刺激和诱导生成的一种具有非MHC限制性的携带特异性抗原受体且可在体内扩增的CTL。研究表明，CAR-T细胞对肿瘤的攻击是特异、高效及持续的，尤其在血液肿瘤的治疗方面。近年来，CAR-T细胞治疗在B细胞等的血液系统肿瘤中取得了令人鼓舞的疗效，但该疗法的产业化难以实现仍然是阻碍其发展的瓶颈所在。
目前常规自体CAR-T或异体CAR-T治疗面临如下问题：(1)治疗窗口和细胞制备：常规自体CAR-T的治疗窗口和细胞生产时间较长，不太适合用于进展较快的侵袭性肿瘤的治疗；自体CAR-T的细胞来源受限于患者本身免疫系统中T细胞的数量和其杀伤能力，导致治疗效果有高有低；自体CAR-T细胞每批生产的批量小，仅适合用于1个患者使用，不易于规模化生产；自体CAR-T细胞需针对每个患者的具体情况实施生产，流程复杂，不易于统一质控。(2)安全问题：常规自体CAR-T或异体CAR-T治疗过程中，患者都有可能面临细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome，CRS)和CAR-T细胞相关性脑病综合征(CAR-T cellrelevant encephalopathy syndrome，CRES)等；异体CAR-T即便通过CRISPR基因编辑敲除相关的HLA I和TCR，也还是有可能出现移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVHD)；同时异体CAR-T是在制备过程中通过CRISPR技术对T细胞进行基因编辑，存在相关基因编辑风险。此外，并非每位适合CAR-T治疗的患者的细胞均能制备成功，对于那些经过多次化疗的患者，其自身T细胞的增殖能力大大减弱，有近1/4的患者CAR-T细胞制备不成功。因此，如何生产出高效、安全的通用型CAR-T细胞以减少生产成本是极大的挑战。
鉴于以上几个方面，通用型CAR-T技术的建立显得尤为紧迫，将是今后发展的一个新方向，它能够实现CAR-T细胞治疗的产业化，广泛而便捷地供给合适的患者使用，并极大地降低细胞制品的生产成本和患者的治疗成本，真正将CAR-T细胞转变为药品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是何在过继性细胞免疫治疗中抑制T细胞增殖以降低GVHD反应并保持T细胞活性的方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种抑制T细胞增殖的方法，所述方法可包括用DNA合成抑制剂对离体的T细胞进行处理。
上述方法中，所述DNA合成抑制剂可为丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)。
上述方法中，所述处理可为用浓度为0.2-100μg/mL的丝裂霉素C溶液进行处理。
进一步地，所述0.2-100μg/mL可为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μg/mL。
上述方法中，所述处理可为用浓度为2-20μg/mL、2-50μg/mL、2-100μg/mL或5-15μg/mL的丝裂霉素C溶液进行处理。
上述方法中，所述处理可为用浓度为2μg/mL、10μg/mL或50μg/mL的丝裂霉素C溶液进行处理。
进一步地，所述处理的条件可为37℃孵育1h。
上述方法中，所述T细胞可为过继性细胞免疫治疗中的效应T细胞。
上述方法中，所述效应T细胞可为下述任一种：
B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；
B2)33&CD27 T细胞；
所述33&CD27 T细胞为表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞，所述CD33-CAR-CD27基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
本发明还提供了一种制备增殖活性降低的T细胞的方法，所述方法可包括利用本文任一所述抑制T细胞增殖的方法对T细胞进行处理，得到所述增殖活性降低的T细胞，所述增殖活性降低的T细胞的增殖活性低于所述T细胞。
由上述方法制备的增殖活性降低的T细胞也在本发明的保护范围内。
进一步地，上述增殖活性降低的T细胞中，所述T细胞可为下述任一种：
B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；
B2)33&CD27 T细胞；
所述33&CD27 T细胞为表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞，所述CD33-CAR-CD27基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
本发明还提供了含有所述增殖活性降低的T细胞的药物。
本文所述增殖活性降低的T细胞可为增殖活性降低的CAR-T细胞或增殖活性降低的33&CD27 T细胞。
进一步地，本发明还提供了一种制备增殖活性降低的CAR-T细胞的方法，所述方法可包括利用本文中任一所述抑制T细胞增殖的方法对CAR-T细胞进行处理，得到所述增殖活性降低的CAR-T细胞，所述增殖活性降低的CAR-T细胞的增殖活性低于所述CAR-T细胞。
进一步地，上述制备增殖活性降低的CAR-T细胞的方法中，所述CAR-T细胞可为表达CD33-CAR-CD27基因的CAR-T细胞(33&CD27 T细胞)。
本发明还提供了一种过继性细胞免疫治疗的方法，所述方法包括向受试者施用上述增殖活性降低的T细胞，以进行过继性细胞免疫治疗。
进一步地，所述增殖活性降低的T细胞中，所述T细胞可为下述任一种：
B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；
B2)表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞(33&CD27 T细胞)。
本发明还提供了一种用于治疗急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)的CAR-T细胞免疫疗法，所述方法包括向受试者施用所述增殖活性降低的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞可为表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞。
所述表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞名称为33&CD27 T细胞，所述CD33-CAR-CD27基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
所述受试者是指任何动物，包括人和非人动物，其中，非人动物包括所有的脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物。
本文所述CD33-CAR-CD27基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明的一个实施方案中，表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞(33&CD27 T细胞)的制备方法如下：
(1)将CD33-CAR-CD27基因克隆到逆转录病毒载体MP71中，得到携带CD33-CAR-CD27基因的重组逆转录病毒载体MP71-CD33-CAR-CD27；
(2)将所述重组逆转录病毒载体MP71-CD33-CAR-CD27转染逆转录病毒包装细胞(ECO细胞)进行包装，然后进行细胞培养后得到逆转录病毒；
(3)逆转录病毒感染人的T细胞，得到所述表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞(33&CD27 T细胞)。
在本发明的一个实施方案中，所述抑制T细胞增殖的方法包括如下步骤：
取培养的33&CD27 T细胞，离心弃培养上清，PBS清洗两遍，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基按照1×107个细胞/mL的密度进行重悬，重悬后的细胞添加丝裂霉素C溶液(溶剂为水，溶质为丝裂霉素C(sigma-alorich，M0503))处理，每孔中丝裂霉素C的含量分别为0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL和50μg/mL，37℃孵育1h。
上述方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
虽然，本发明提供的实施例利用CD33-CAR-CD27基因构建CAR-T细胞，但本发明不限于该特定基因和/或该特定细胞。本领域技术人员可采用其它任何合适的方法构建其他的过继性同种异体T细胞(如TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞)，并按照本发明所述的方法对构建的T细胞进行处理，进一步用于过继性细胞免疫治疗。这些替代方法未脱离本发明的范围，本发明应包括这些替代方法。
本发明所述CAR-T细胞是将CAR元件导入健康人的T细胞，然后采用DNA合成抑制剂(如丝裂霉素C)进行处理以抑制细胞回输后在体内的过度增殖，进而降低GVHD反应，但不影响CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
本发明制备的增殖活性降低的33&CD27 T细胞增殖活性被抑制，但仍保持良好的T细胞活性、分泌功能效应分子IFN-γ的功能、脱颗粒能力、体内和体外特异性杀伤靶细胞的能力，是一种可大规模生产的通用CAR-T细胞。
实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、即时可用的“现货成品”：可以提前大批量生产，有合适的患者需要时即可进入治疗，可以很好地避免因常规CAR-T细胞生产制备周期长而错过癌症进展较快患者的最佳治疗时机。
2、安全性高：通过控制本发明增殖活性降低的CAR-T的治疗剂量，可以有效地控制肿瘤患者治疗过程中可能产生的毒副反应如细胞因子释放综合症(Cytokine re leasesyndrome，CRS)、CAR-T细胞相关性脑病综合征(CAR-T cell relevant encep halopathysyndrome，CRES)和移植物抗宿主病(Graft versus host disease，GVH D)；不需要通过CRISPR技术对T细胞进行基因编辑，避免了基因编辑相关风险。
3、同常规通用型CAR-T(Universal CART，UCAR-T)细胞和CAR-NK细胞产品一样，可以实现大规模工业化生产；同CAR-NK细胞相比，更易生产。
4、本发明的增殖活性降低的CAR-T细胞在体内不能进行扩增，其存活时间同可体内扩增的常规UCAR-T细胞相比较短，该段时间不足以产生GVHD反应，无需进行基因编辑，更加安全。
附图说明
图1为丝裂霉素C处理对CAR-T细胞增殖的影响。
图2为丝裂霉素C处理对CAR-T细胞存活的影响。
图3为CAR-T细胞亚群对丝裂霉素C处理的敏感性。
图4为丝裂霉素C处理对CAR-T细胞分泌功能效应分子IFN-γ的影响。
图5为丝裂霉素C处理对CAR-T细胞的细胞毒(脱颗粒)作用的影响。
图6为丝裂霉素C处理的CAR-T细胞的体外杀瘤活性。
图7为丝裂霉素C处理的CAR-T细胞的体内杀瘤活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pUC57载体为北京擎科生物科技有限公司产品。
下述实施例中的逆转录病毒载体MP71记载于如下文献中：Engels B,Cam H,etal.Retroviral Vectors for High-Level Transgene Expression in T Lymphocytes[J].Human Gene Therapy,2003,14(12):1155-1168.，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)来源于健康志愿者的静脉血。
下述实施例中的丝裂霉素C(Mitomycin C)为sigma-alorich公司产品，货号：M0503。
下述实施例中的U937细胞为中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心产品，资源编号：1101HUM-PUMC000059。
下述实施例中的RPMI-1640培养基为sigma公司产品，货号为R8758。
下述实施例中含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(10％FBS RPMI-1640培养基)是以RPMI-1640培养基(R8758)为溶剂，以胎牛血清为溶质配制而成。
下述实施例中的NSG小鼠(6～7周龄，体重20～22g)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。
实施例1、CAR-T细胞的制备
本实施例所述CAR-T细胞表达CD33-CAR-CD27基因，其中CD33-CAR-CD27基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。CAR-T细胞制备的具体步骤如下：
(1)将CD33-CAR-CD27基因克隆到pUC57载体上，得到重组载体pUC57-CD33-CAR-CD27。
(2)用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切重组载体pUC57-CD33-CAR-CD27，切胶回收目的基因片段。
(3)用NotI和EcoRI双酶切逆转录病毒载体MP71，切胶回收载体大片段。
(4)用T4连接酶(NEB)连接上述目的基因片段和载体大片段，即得到携带CD33-CAR-CD27基因的重组逆转录病毒载体MP71-CD33-CAR-CD27。
(5)将重组逆转录病毒载体MP71-CD33-CAR-CD27转化感受态大肠杆菌DH5α，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到的MP71-CD33-CAR-CD27质粒进行逆转录病毒包装。
(6)逆转录病毒包装：a)第1天：Phoenix Ecotropic(ECO)细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6×106个细胞/mL的密度铺板，10cm皿添加10mL的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；b)第2天：ECO细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备MP71-CD33-CAR-CD27质粒12.5μg，1.25M CaCl2 250μL，H2O 1ml，总体积为1.25mL；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的2×HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到ECO皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基；c)第4天：转染48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤后，即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃。
(7)逆转录病毒感染人的T细胞：
a)复苏冻存的健康人外周血PBMC，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基调整细胞密度为1×106-2×106个细胞/mL。
b)Ficoll分离液(天津灏洋)收集PBMC，磁珠法分离获得CD3+T细胞，按磁珠:CD3+细胞比为3:1加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。
c)T细胞活化后第二天，用PBS稀释至终浓度为15μg/mL的RetroNectin(TAKARA)包被非组织处理培养板，6孔板每孔1.2mL。避光，4℃过夜备用。
d)T细胞活化培养两天后，取出包被好的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。
e)步骤(6)制备的逆转录病毒溶液加入孔内，每孔加5-6mL，32℃，2000×g，离心2h。每孔加入含hIL-2(500U/mL)的新鲜完全培养基3mL，继续培养1天。
f)细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100U/mL的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×105/mL左右，便于细胞扩增。
g)由此获得感染了步骤(6)制备的逆转录病毒的CAR-T细胞，命名为33&CD27T细胞(即表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞)。
实施例2、丝裂霉素C对CAR-T细胞的处理
发明人经过广泛而深入的研究，选取丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)对CAR-T细胞进行处理研究。丝裂霉素C是从头状链霉菌培养液中分离提取的一种广谱抗生素，可使细胞的DNA解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制细胞分裂。
丝裂霉素C处理的CAR-T细胞为实施例1中制备的33&CD27 T细胞，处理步骤如下所示：
1、33&CD27 T细胞的培养
33&CD27 T细胞采用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基于37℃培养。
2、丝裂霉素C对33&CD27 T细胞的处理
取培养至D13天的33&CD27 T细胞，离心弃培养上清，PBS清洗两遍，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基按照1×107个细胞/mL的密度进行重悬，重悬后的细胞置于24孔板中，添加丝裂霉素C溶液(溶剂为水，溶质为丝裂霉素C(sigma-alorich，M0503))，每孔中丝裂霉素C的含量分别为0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL和50μg/mL，同时设只加溶剂的对照孔，对照孔中丝裂霉素C的含量为0μg/mL。37℃孵育1h，得到不同丝裂霉素C剂量(0μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL和50μg/mL)处理的33&CD27 T细胞。
实施例3、丝裂霉素C处理对CAR-T细胞增殖的影响
1、CFSE染料标记CAR-T细胞：
(1)收集实施例2中不同丝裂霉素C剂量(0μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL和50μg/mL)处理的33&CD27 T细胞，离心弃培养上清，用1×PBS缓冲液离心洗涤2次，以去除FBS对CFSE标记的影响；
(2)用1×PBS缓冲液重悬细胞至1×107个/mL，分别加入CFSE染料(Invitrogen，货号65-0850-84)至5μM迅速混匀，置于37℃培养箱孵育10min；
(3)加入至少2倍体积的冷的含10％FBS的RPMI-1640培养基终止CFSE标记，然后离心去上清；
(4)用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，离心洗涤2次，得到标记好的CAR-T细胞；
(5)最后标记好的CAR-T细胞按需要的密度用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬。
2、将步骤1得到的不同丝裂霉素C剂量处理的CAR-T标记细胞按每孔2mL共2×106个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBS RPMI-1640培养基(+Medium)，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。
+Medium是以含10％FBS的RPMI-1640培养基为溶剂，以IL-2为溶质配制而成。
3、D3(第3)天收集细胞，流式检测和分析CAR-T细胞的增殖情况(CD4/CD8/CAR)，如图1所示。其中流式检测中所用的抗体为CD3-APC(APC anti-human CD3 Antibody，Biolegend公司产品，货号：317318)、CD4-APC/Cy7(APC/Cyanine7 anti-humanCD4Antibody，Biolegend公司产品，货号：317450)、CD8-PerCP/Cy5.5(PerCP/Cyanine5.5anti-human CD8 Antibody，Biolegend公司产品，货号：344710)、Human BCMA/TNFRSF17Protein,Fc Tag(ACROBiosystems公司产品，货号：BC7-H5254)和Human IgG FC-PE(PEanti-human IgG Fc Antibody，Biolegend公司产品，货号：410708)。
结果如图1所示，MMC处理能够抑制CAR-T细胞的增殖，并产生剂量效应；2μg/mlMMC浓度条件下，仅有少量的CAR-T细胞分裂。
实施例4、丝裂霉素C处理对CAR-T细胞存活的影响
将实施例2中不同丝裂霉素C剂量(10μg/mL和50μg/mL)处理的33&CD27 T细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBS RPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。其中，
不同丝裂霉素C剂量(10μg/mL和50μg/mL)处理的CAR-T细胞每孔铺板2×106个细胞/2mL；
无丝裂霉素C处理的CAR-T细胞每孔铺板1×106个细胞/2mL。
连续六天(D0天、D1天、D2天、D3天、D4天、D5天)取上述培养的CAR-T细胞进行细胞计数。
结果如图2所示，MMC处理导致CAR-T细胞的增殖受到抑制，随着时间的延长活细胞的数量逐渐减少；10μg/ml MMC浓度条件下，3天后活细胞的数量减少至约50％。
实施例5、CAR-T细胞亚群对丝裂霉素C处理的敏感性
将实施例2中不同丝裂霉素C剂量(10μg/mL和50μg/mL)处理的33&CD27 T细胞按每孔2mL共2×106个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBSRPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。
连续四天(D0天、D1天、D2天、D3天)取上述培养的CAR-T细胞检测细胞亚型。
具体步骤如下：
1、分别取不同丝裂霉素C剂量处理的上述培养D0天、D1天、D2天和D3天的细胞悬液200μL至96孔的圆形底板中，1500rpm离心5min；
2、每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体和BCMA-hFc重组蛋白)重悬混匀，避光、室温孵育10min；
3、每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min；
4、弃上清，用400μL FACS buffer重悬细胞，并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞并分析CD4/CD8和CAR+/-的百分比。
结果如图3所示：
与CD4+T细胞相比，MMC处理使CD8+T细胞减少地更快，说明CD8+T细胞比CD4+T细胞对MMC的处理更加敏感。
实施例6、丝裂霉素C处理对CAR-T细胞分泌功能效应分子IFN-γ的影响
将实施例2中不同丝裂霉素C剂量(10μg/mL和50μg/mL)处理的33&CD27 T细胞按每孔2mL共2×106个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBSRPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。
连续四天(D0天、D1天、D2天、D3天)取上述培养CAR-T细胞检测其分泌的IFN-γ。具体步骤如下：
1、分别取不同丝裂霉素C剂量处理的上述培养D0天、D1天、D2天、D3天的CAR-T细胞，调整细胞密度至2×106个/mL，取100μL加入96孔U底板中，分为四组，分别用不同的T细胞刺激剂检测T细胞的效应功能：
(1)阴性对照(+Medium)：每孔加入100μL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)作为阴性对照；
(2)CAR抗原特异性刺激组(+U937)：每孔加入100μL共2×105个U937肿瘤细胞(U937细胞)；
(3)TCR特异性刺激组(+OKT3)：每孔加入100μL Medium(含终浓度为5μg/mL抗人CD3抗体OKT3的10％FBS RPMI-1640培养基)；
(4)TCR非依赖性刺激组(+PMA/Ion)：每孔加入100μL Medium(含终浓度为100ng/mL PMA和250ng/mL Ionomycin(Sigma，货号I9657)的10％FBS RPMI-1640培养基)；
上述各实验组铺板完成后每孔加入终浓度为5μg/mL的Brefeldin A(Med ChemExpress，HY-16592)，置于37℃培养箱孵育5～6小时。
2、孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：
(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％NaN3和2％FBS)重悬，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；
(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体和BCMA-hFc重组蛋白)重悬混匀，避光、室温孵育10min；
(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min后弃上清；
(4)每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；
(5)1500rpm离心5min弃上清后，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；
(6)每孔加入20μL稀释的APC标记的抗人IFN-γ(Biolegend，货号506510)重悬混匀，避光、室温孵育20min；
(7)每孔加入200μL Perm buffer，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μLFACSbuffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞，分析功能效应分子IFN-γ在CAR-T细胞中的百分比。
结果如图4所示：
10μg/ml MMC处理CAR-T细胞的条件下，CAR-T细胞的功能几乎不受影响；但在50μg/ml MMC处理条件下，CAR-T细胞的功能随时间的延长部分受损。
实施例7、丝裂霉素C处理对CAR-T细胞的细胞毒(脱颗粒)作用的影响
将实施例2中不同丝裂霉素C剂量(10μg/mL和50μg/mL)处理的33&CD27 T细胞按每孔2mL共2×106个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBSRPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。
连续四天(D0天、D1天、D2天、D3天)取上述培养的CAR-T细胞检测脱颗粒能力，即CD107a的表达。具体步骤如下：
1、分别取不同丝裂霉素C剂量处理的上述培养D0天、D1天、D2和D3天的CAR-T细胞，调整细胞密度至2×106个/mL，取100μL CAR-T细胞加入96孔U底板中；
2、每孔加入100μL共2×105个U937肿瘤细胞(作为CAR抗原特异性刺激(+U937)，同时每孔加入100μL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)为阴性对照(+Medium)；
3、每孔加入1μL APC标记的抗人CD107a抗体(Biolegend公司，货号328620)，37℃孵育1h；
4、每孔加入10μL 1:50倍稀释的Monensin Solution(InvitrogenTM，货号00-4505-51)，继续孵育3h；
5、孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：
(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％NaN3和2％FBS)重悬混匀，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；
(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体和BCMA-hFc重组蛋白)重悬混匀，避光、室温孵育10min；
(3)1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACS buffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞并分析细胞脱颗粒分子CD107a在CAR-T细胞中的百分比。
结果如图5所示，MMC处理并不影响CAR-T细胞的细胞毒作用。
实施例8、丝裂霉素C处理的CAR-T细胞的体外杀瘤活性
将实施例2中不同丝裂霉素C剂量(10μg/mL和50μg/mL)处理的33&CD27 T细胞按每孔2mL共2×106个细胞培养在24孔TC板上，细胞培养基为含IL-2(500U/mL)的10％FBSRPMI-1640培养基，置于37℃培养箱培养，并记为D0天。
连续四天(D0天、D1天、D2天、D3天)取上述培养的CAR-T细胞作为效应细胞检测其特异性杀伤靶细胞U937肿瘤细胞的能力。具体步骤如下：
1、将表达荧光素酶的U937细胞以5×105个细胞/mL的浓度放置在96孔圆形底板中，加入终浓度为100μg/mL的D-萤火虫荧光素钠盐(Yeasen Biotechnology，货号40901ES08，储存浓度为100mg/mL)，重复3孔；
2、按不同的效靶比率(1:1、1:3、1:9、1:27)分别加入效应细胞CAR-T(1:1条件下效应细胞的细胞密度为5×105个细胞/mL)，37℃培养过夜。无效应细胞的情况下，靶细胞用10％SDS(Beyotime，货号ST626)处理；
CTR T对照：无病毒转染的T细胞,且不进行丝裂霉素C处理；
Mito-C(0)：未经丝裂霉素C处理的CAR-T细胞；
Mito-C(10)：10μg/mL丝裂霉素C处理的CAR-T细胞；
Mito-C(50)：50μg/mL丝裂霉素C处理的CAR-T细胞；
3、用TECAN spark酶标仪测量荧光数值，取三个重复孔的平均值计算CAR-T细胞的特异性杀伤活性(Cytotoxicity)：
Specific lysis％＝100-100×(Eexp-Emin)/(Tmax-Tmin)
Tmin：最大杀伤率条件下的RLU数值；
Eexp：效应细胞和靶细胞共培养时的RLU数值；
Tmax：无效应细胞的情况下，靶细胞的自发死亡RLU数值；
Emin：无细胞的情况下，效应细胞的自发死亡RLU数值。
结果如图6所示，MMC处理后，CAR-T细胞仍有杀瘤作用；10μg/ml MMC处理条件下，CAR-T细胞的特异性杀瘤作用略微下降；50μg/ml MMC处理条件下，其杀瘤作用下降明显。
实施例9、丝裂霉素C处理的CAR-T细胞的体内杀瘤活性
采用U937-Luc荷瘤NSG小鼠模型检测实施例2中10μg/ml MMC处理的33&CD27T细胞的体内杀瘤活性。具体步骤如下：
1、D-7天(注射前7天)时，NSG小鼠(6～7周龄)静脉注射U937肿瘤细胞5×106个细胞/只。
2、D0天时，将荷瘤小鼠随机分为3组(每组各5只)，静脉注射实施例2中10μg/mlMMC处理的CAR-T细胞(33&CD27 T细胞)：
对照组(CTR)：每只注射1×106个无病毒转染且未进行丝裂霉素C处理的T细胞；
CAR-T治疗组：每只注射2×106个未经丝裂霉素C处理的CAR-T细胞；
CAR-T+MMC(10)治疗组：每只注射50×106个经10μg/ml丝裂霉素C处理的CAR-T细胞；
3、分别在D-1(注射前1天)、D7、D14天检测荷瘤小鼠体内的荧光强度。
结果如图7所示，经10μg/ml MMC处理后，CAR-T细胞仍有杀瘤作用；10μg/ml MMC条件下，CAR-T细胞的特异性杀瘤作用略微下降。
综上，本发明制备的经丝裂霉素C处理的CAR-T细胞为增殖活性降低的CAR-T细胞，以33&CD27 T细胞为例的一个或多个实施例结果表明，该细胞增殖活性被抑制进而降低GVHD反应，但仍保持良好的T细胞活性、分泌功能效应分子IFN-γ的功能、脱颗粒能力、体内和体外特异性杀伤靶细胞的能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种抑制T细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括用DNA合成抑制剂对离体的T细胞进行处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA合成抑制剂为丝裂霉素C。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述处理为用浓度为0.2-100μg/mL的丝裂霉素C溶液进行处理。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述处理为用浓度为2μg/mL、10μg/mL或50μg/mL的丝裂霉素C溶液进行处理。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述T细胞为过继性细胞免疫治疗中的效应T细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述效应T细胞为下述任一种：
B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；
B2)33&CD27 T细胞；
所述33&CD27 T细胞为表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞，所述CD33-CAR-CD27基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
7.一种制备增殖活性降低的T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-6中任一所述方法对T细胞进行处理，得到所述增殖活性降低的T细胞，所述增殖活性降低的T细胞的增殖活性低于所述T细胞。
8.由权利要求7所述的方法制备的增殖活性降低的T细胞。
9.根据权利要求8所述的增殖活性降低的T细胞，其特征在于，所述T细胞为下述任一种：
B1)CAR-T细胞、TCR-T细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞或CTL细胞；
B2)33&CD27 T细胞；
所述33&CD27 T细胞为表达CD33-CAR-CD27基因的T细胞，所述CD33-CAR-CD27基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
10.含有权利要求8或9所述增殖活性降低的T细胞的药物。
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