CN117535324A - 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117535324A
CN117535324A CN202311588502.6A CN202311588502A CN117535324A CN 117535324 A CN117535324 A CN 117535324A CN 202311588502 A CN202311588502 A CN 202311588502A CN 117535324 A CN117535324 A CN 117535324A
Authority
CN
China
Prior art keywords
optionally
nucleic acid
cells
terminus
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311588502.6A
Other languages
English (en)
Inventor
胡渊
王烃
周英利
张彩
陈敏华
谢思奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Enkai Cell Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Enkai Cell Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Enkai Cell Technology Co ltd filed Critical Shanghai Enkai Cell Technology Co ltd
Priority to CN202311588502.6A priority Critical patent/CN117535324A/zh
Publication of CN117535324A publication Critical patent/CN117535324A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

本发明公开了多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用。所述多功能基因修饰载体携带分离的核酸，分离的核酸包括：第一核酸片段，第二核酸片段和第三核酸片段，所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段相连；其中，所述第一核酸片段用于编码靶向NKp30配体的抗原嵌合受体；所述第二核酸片段用于编码融合蛋白，所述融合蛋白包括IL‑15和IL‑15Rα，所述IL‑15和IL‑15Rα相连；所述第三核酸片段用于编码CXCR2受体。由此，采用该多功能基因修饰载体制备的多功能基因修饰免疫细胞可提高其特异性杀伤能力、存活能力、增殖能力和肿瘤内浸润能力，从而进一步提高免疫细胞的临床疗效。

Description

多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，具体地，本发明涉及一种分离的核酸、表达载体、转基因免疫细胞、试剂盒、药物组合物及其用途。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是天然免疫的主要成员之一，其可通过多种途径发挥免疫监视与免疫调节作用。在临床实践应用中，NK细胞来源丰富、可异体回输，且副作用小、安全性高，因此NK细胞疗法具有巨大的应用与开发潜力。但是，NK细胞疗法仍面临很多技术难点需克服或突破，例如NK细胞冻存复苏后细胞活性低、在体内增殖与持久性弱、在肿瘤内浸润差与易被免疫抑制等问题，严重限制了NK细胞疗法的有效性与市场价值。
肿瘤大多具备纤维组织的物理屏障，屏障内存在低氧、低pH、营养缺陷、高渗透压等肿瘤微环境，且缺少成熟的血管，因此肿瘤内微环境十分不利于免疫细胞在瘤内定位与浸润、存活与增殖，还易发生免疫抑制与耗竭。如何增强免疫细胞对肿瘤的杀伤活性与特异性，加强其在肿瘤内的浸润能力、存活与增殖的能力，增强其抵抗免疫抑制与耗竭的能力等，这些方面核心关键技术的研究与开发有望突破免疫细胞疗法对肿瘤治疗的瓶颈。
基因修饰细胞疗法是一种通过修改患者体内的细胞基因组来治疗疾病的新型疗法。其原理是利用基因工程技术将外源基因或调控因子导入细胞中，使得这些细胞获得新的功能或具备更强的治疗潜力。基因修饰细胞技术不仅应用于T细胞，在NK细胞、巨噬细胞、造血干细胞和非造血干细胞等中都有广泛的研究。
因此，亟需开发一种新的基因修饰免疫细胞，使其能够在肿瘤中长时间的存活，具有较好的特异性杀伤活性、细胞增殖、抵抗免疫耗竭和提高肿瘤内浸润的能力。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人意外发现NK细胞具有在肿瘤内易发生免疫耗竭或免疫抑制，在体内扩增与持久性弱，以及肿瘤内浸润能力差等问题，为了解决此类问题以及进一步提高NK细胞的杀伤活性与特异性，基于此，发明人构建了一种表达以NKp30为胞外识别器的嵌合抗原受体(NKp30-NKR)、细胞膜表达的IL15/IL15Rα融合蛋白与趋化因子受体CXCR2的多功能载体，该载体可用于基因修饰NK细胞、T细胞、巨噬细胞等免疫细胞，从而增强免疫细胞的识别与杀伤活性、提高体内存活周期与细胞增殖及提高免疫细胞浸润到肿瘤内部的能力，这些能力可协同提高免疫细胞的抗肿瘤活性。
因此，在本发明的第一个方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述分离的核酸包括：第一核酸片段，第二核酸片段和第三核酸片段，所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段相连；其中，所述第一核酸片段用于编码靶向NKp30配体的抗原嵌合受体；所述第二核酸片段用于编码融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15和IL-15Rα，所述IL-15和IL-15Rα相连；所述第三核酸片段用于编码CXCR2受体。发明人经过大量创造性实验发现，当携带所述分离的核酸的免疫细胞表达抗原嵌合受体(第一核酸片段)时，能够使免疫细胞与NKp30配体进行结合，从而有效靶向识别并杀伤多种表达NKp30配体的血液瘤和实体瘤细胞；此外，携带上述分离的核酸的免疫细胞还能够表达IL15/IL15Rα融合蛋白和CXCR2受体，大大提高其在体内存活和扩增的能力，并增强其在肿瘤组织内部的浸润，从而更好地发挥抗肿瘤作用。
在本发明的第二个方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述的表达载体携带第一方面所述的分离的核酸。由此，采用本发明所述的表达载体制备转基因免疫细胞，能使制备得到的转基因免疫细胞具有较高的肿瘤识别、杀伤能力，并且能够提高其在体内外的存活时间、扩增能力和肿瘤内的浸润能力。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种转基因免疫细胞。根据本发明的实施例，所述转基因免疫细胞表达靶向NKp30配体的抗原嵌合受体、融合蛋白和CXCR2受体；其中，所述融合蛋白包括IL-15Rα和IL-15，所述IL-15和IL-15Rα相连。本发明所述的转基因免疫细胞具有较高的肿瘤识别、杀伤能力以及肿瘤内浸润能力，能够在体内长期存活，并且其扩增能力以及增殖与趋化能力强。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：第一方面所述的分离的核酸、第二方面所述的表达载体或第三方面所述的转基因免疫细胞。本发明所述的药物组合物对肿瘤的杀伤效率高、抗肿瘤活性强，可用于多种肿瘤疾病的预防或治疗。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：第一方面所述的分离的核酸或第二方面所述的表达载体。采用本发明所述的试剂盒能够制备转基因免疫细胞，使制备得到的转基因免疫细胞具有较高的肿瘤识别、杀伤能力以及肿瘤内浸润能力，能够在体内长期存活，并且其扩增能力以及增殖与趋化能力强。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第二方面所述的表达载体导入免疫细胞；将所述导入表达载体的免疫细胞的进行培养处理。采用本发明所述的方法，可增强免疫细胞的杀伤效率、增强免疫细胞的抗肿瘤活性、提高免疫细胞在体内外长期存活和扩增能力以及增殖与趋化能力，尤其是可在体外制备得到杀伤、活化、增殖与趋化强的免疫细胞，用于构建所需的免疫细胞模型。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的分离的核酸、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的转基因免疫细胞或第四方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1的多功能载体的基因元件结构示意图；
图2为本发明实施例2的多功能载体各元件表达的流式检测图；其中：
A为未感染组NK细胞上mbIL15RF与CXCR2元件表达的流式检测图；
B为多功能载体慢病毒感染组NK细胞上mbIL15RF与CXCR2元件表达的流式检测图；
C为检测未感染组与感染组NK细胞上表达NKp30的MFI结果图；
图3为本发明实施例3的多功能NK-92细胞对肿瘤细胞杀伤活性的考察图；
图4为本发明实施例3的NK-92细胞与多功能NK-92细胞在不同IL-2培养浓度下的存活率变化曲线图；
图5为本发明实施例3的在不同CXCL8浓度下检测NK-92细胞与多功能NK-92细胞趋化能力的结果图；
图6为本发明实施例4的外周血来源多功能原代NK细胞对人结直肠癌NCI-H716细胞荷瘤小鼠模型的抑瘤效果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，也没有先后顺序之分。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本发明中的它处另有明确定义，否则本发明中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本发明中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本发明中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“载体”或“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或转基因免疫细胞给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药。
术语“免疫细胞”通常是指能够产生免疫应答(例如，抗原特异性免疫应答)的细胞。例如，所述免疫细胞可以或已经含有包括本申请所述的分离的核酸、和/或载体，或者能够表达本申请所述的抗原嵌合受体、融合蛋白和CXCR2受体的个体细胞，细胞系或细胞培养物。在本申请中，所述的免疫细胞可以包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在本文中，“碳端”和“C端”同义；“氮端”和“N端”同义。
发明人提出了一种表达靶向NKp30配体的嵌合抗原识别受体、细胞膜表达的增强型细胞因子与趋化因子受体的多功能载体，可用于多功能基因修饰NK细胞，增强NK细胞抗肿瘤活性。发明人在实验中发现，本发明所提出的载体基因转导NK细胞后，具有以下有益效果：1)表达的NKp30-NKR可增强NK细胞对NKp30配体高表达肿瘤的杀伤效率，增强NK细胞的抗肿瘤活性；2)细胞膜表达IL15/IL15Rα融合蛋白，可进一步提高NK细胞在体内外长期存活和扩增能力；3)表达CXCR2受体，可进一步提高NK细胞的肿瘤内浸润能力。
具体地，本发明提出了一种分离的核酸、表达载体、转基因免疫细胞、药物组合物、试剂盒、一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法及其用途，下面将分别对其进行详细描述。
分离的核酸
本发明提出了一种分离的核酸，所述核酸包括：第一核酸片段，第二核酸片段和第三核酸片段，所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段相连；其中，所述第一核酸片段用于编码靶向NKp30配体的抗原嵌合受体；所述第二核酸片段用于编码融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15和IL-15Rα，所述IL-15和IL-15Rα相连；所述第三核酸片段用于编码CXCR2受体。
发明人经过大量创造性实验发现，当携带所述分离的核酸的免疫细胞表达抗原嵌合受体时，能够使免疫细胞与NKp30配体进行结合，从而有效靶向识别并杀伤多种表达NKp30配体的血液瘤和实体瘤细胞；此外，携带上述分离的核酸的免疫细胞还能够表达IL15/IL15Rα融合蛋白和CXCR2受体，大大提高其在体内存活和扩增的能力，并增强其在肿瘤组织内部的浸润，从而更好地发挥抗肿瘤作用。
需要说明的是本发明上述三个核酸片段以独立表达为目的，因此，本发明上述基因中三个核酸片段的连接顺序可以根据实际需求进行选择，无需特殊限定。
在一些实施例中，所述上述分离的核酸还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
在一些实施例中，所述抗原嵌合受体包括：NKp30受体的胞外区和跨膜区，以及胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。
在一些实施例中，所述胞外区和跨膜区具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，所述共刺激结构域选自CD28分子胞内段。
在一些实施例中，所述CD28分子胞内段具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述胞内信号传导结构域选自CD3ζ分子胞内段。
在一些实施例中，所述CD3ζ分子胞内段具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述CD28分子的C端和所述CD3ζ分子的N端相连。
在一些实施例中，所述抗原嵌合受体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述第一核酸片段具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述IL-15的C端和IL-15Rα的N端相连，或者所述IL-15的N端和IL-15Rα的C端相连。
在一些实施例中，所述IL-15具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述IL-15Rα具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述IL-15的C端和连接肽的N端相连，所连接肽的C端和IL-15Rα的N端相连，或者所述IL-15的N端和连接肽的C端相连，所述连接肽的N端和IL-15Rα的C端相连。
在一些实施例中，所述连接肽选自柔性Linker、刚性Linker中的任意一种。
在一些实施例中，所述连接肽具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述第二核酸片段具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述CXCR2受体具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述第三核酸片段具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述分离的核酸进一步包括两个第四核酸片段，所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段中的每两个核酸片段分别通过一个所述第四核酸片段连接，其中，每个所述第四核酸片段各自独立地编码P2A或其片段。
在一些实施例中，所述P2A或其片段包括P2A、T2A、E2A和F2A中的至少之一或其片段。
在一些实施例中，所述第四核酸片段编码P2A或其片段。
在一些实施例中，所述P2A或其片段具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述第四核酸片段具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述分离的核酸进一步包括启动子，所述启动子与由所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段组成的核酸片段的5’端相连。
在一些实施例中，所述启动子选自EF1α、SFFV、CAG或CMV。
在一些实施例中，所述启动子选自EF1α。
在一些实施例中，所述EF1α具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述分离的核酸进一步包括第五核酸片段，所述第五核酸片段编码信号肽，所述信号肽的C端与所述IL-15的N端相连，所述IL-15的C端和连接肽的N端相连，所述连接肽的C端和IL-15Rα的N端相连，或者所述IL-15的N端和连接肽的C端相连，所述连接肽的N端和IL-15Rα的C端相连，所述IL-15Rα的N端和信号肽的C端相连。
在一些实施例中，所述信号肽具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列
在一些实施例中，所述第五核酸片段具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
需要说明的是，本文中所述“融合蛋白”可以包含或不包含所述“信号肽”，当构建图1所示的多功能载体时，所述“融合蛋白”包含所述“信号肽”，而当所述多功能载体导入免疫细胞后获得的转基因免疫细胞时，所述“信号肽”会被剪切掉，此时所述的“融合蛋白”不包含所述“信号肽”，因此，所述“融合蛋白”是否包含所述“信号肽”，应当视具体情况考虑，而包含或不包含所述“信号肽”的“融合蛋白”都在本发明的保护范围内。
在一些实施例中，所述分离的核酸从5’端到3’端依次为所述启动子、所述第一核酸片段、其中一个所述第四核酸片段、第五核酸片段、所述第二核酸片段、另一个所述第四核酸片段和所述第三核酸片段。
表达载体
本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带上述的分离的核酸。由此，采用本发明所述的表达载体制备转基因免疫细胞，能使制备得到的转基因免疫细胞具有较高的肿瘤识别、杀伤能力，并且能够提高其在体内外的存活时间、扩增能力和肿瘤内的浸润能力。
将上述核酸分子连接到表达载体上时，可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于表达载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到表达载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。
在一些实施例中，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
在一些实施例中，所述表达载体选自病毒、原核表达载体或真核表达载体。
在一些实施例中，所述表达载体选自病毒。
转基因免疫细胞
本发明提出了一种转基因免疫细胞，所述转基因免疫细胞表达靶向NKp30配体的抗原嵌合受体、融合蛋白和CXCR2受体；其中，所述融合蛋白包括IL-15Rα和IL-15，所述IL-15和IL-15Rα相连。本发明所述的转基因免疫细胞具有较高的肿瘤识别、杀伤能力，并且能够提高其在体内外的存活时间、扩增能力和肿瘤内的浸润能力。
在一些实施例中，上述的转基因免疫细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
在一些实施例中，所述抗原嵌合受体包括：NKp30受体的胞外区和跨膜区，以及胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连。
在一些实施例中，所述胞外区和跨膜区具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，所述共刺激结构域选自CD28分子胞内段。
在一些实施例中，所述胞内信号传导结构域选自CD3ζ分子胞内段。
在一些实施例中，所述CD28分子的C端和所述CD3ζ分子的N端相连。
在一些实施例中，所述CD28分子胞内段具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述CD3ζ分子胞内段具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗原嵌合受体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述IL-15的C端和IL-15Rα的N端相连，或者所述IL-15的N端和IL-15Rα的C端相连。
在一些实施例中，所述IL-15具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述IL-15Rα具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述IL-15的C端和连接肽的N端相连，所述连接肽的C端和IL-15Rα的N端相连，或者所述IL-15的N端和连接肽的C端相连，所述连接肽的N端和IL-15Rα的C端相连。
在一些实施例中，所述连接肽选自柔性Linker、刚性Linker中的任意一种。
在一些实施例中，所述连接肽具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述CXCR2受体具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述转基因免疫细胞是通过将上述的表达载体导入至免疫细胞获得的。
在一些实施例中，所述转基因免疫细胞来源于T细胞、NKT细胞、NK细胞和巨噬细胞中的至少之一。
在一些具体实施例中，所述转基因免疫细胞来源于NK细胞。
在一些实施例中，所述NK细胞包括选自外周血NK细胞、脐带血NK细胞、诱导多能细胞(iPSC)衍生的NK细胞和NK-92细胞中的至少之一。
在一些实施例中，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδT细胞。
药物组合物
本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物包括：上述的分离的核酸、上述的表达载体或上述的转基因免疫细胞。本发明所述的药物组合物对肿瘤的杀伤效率高、抗肿瘤活性强，可用于多种肿瘤疾病的预防或治疗。
试剂盒
本发明提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括：上述的分离的核酸或上述的表达载体。采用本发明所述的试剂盒能够制备转基因免疫细胞，使制备得到的转基因免疫细胞具有较高的肿瘤识别、杀伤能力以及肿瘤内浸润能力，能够在体内长期存活，并且其扩增能力以及增殖与趋化能力强。
一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法
本发明提出了一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法，所述方法包括：将上述的表达载体导入免疫细胞；将所述导入表达载体的免疫细胞的进行培养处理。采用本发明所述的方法，可增强免疫细胞的杀伤效率、增强免疫细胞的抗肿瘤活性、提高免疫细胞在体内外长期存活和扩增能力以及增殖与趋化能力，尤其是可在体外制备得到杀伤、活化、增殖与趋化强的免疫细胞，用于构建所需的免疫细胞模型。
在一些实施例中，上述增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
在一些实施例中，所述将表达载体导入免疫细胞是通过电转、转染或感染的方式进行的。
在一些实施例中，所述免疫细胞为T细胞、NKT细胞、NK细胞和巨噬细胞中的至少之一。
在一些具体实施例中，所述免疫细胞为NK细胞。
在一些实施例中，所述NK细胞包括选自外周血NK细胞、脐带血NK细胞、诱导多能细胞(iPSC)衍生NK细胞和NK-92细胞中的至少之一。
在一些实施例中，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδT细胞。
用途
上述的分离的核酸、上述的表达载体、上述的转基因免疫细胞或上述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。
在一些实施例中，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
在一些实施例中，所述肿瘤包括实体瘤和血液瘤。
在一些实施例中，所述实体瘤包括选自胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、前列腺癌和黑色素瘤中的至少之一。
在一些实施例中，所述血液瘤包括选自急性髓系白血病、急性淋巴细胞系白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤的至少之一。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明所涉及的序列说明详见表1。
表1：氨基酸/核苷酸序列说明表
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实施例1：多功能载体基因修饰NK-92细胞的制备
1、多功能载体的构建
将SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列通过全基因合成进行合成，合成后并将其通过酶切位点EcoRI与MluI克隆至慢病毒载体pLVX-EF1-IRES-Puro中，经测序验证正确后得到pLVX-EF1-multi-functional-vector质粒，即本发明中涉及的多功能载体质粒。本实施例的多功能载体的基因元件结构的示意图见图1。
2、慢病毒的包装
取处于对数生长期的293T细胞5×106接种于10cm的细胞培养皿中，加入10mLDMEM培养基，37℃、5％ CO2培养箱中培养过夜。待细胞培养皿中细胞密度达到80-90％时，更换10mL新鲜的DMEM培养基，并将细胞培养皿继续置于培养箱中备用。配制慢病毒包装体系，分别将慢病毒包装辅助质粒6μg psPAX2与3μg pMD2.G，6μg慢病毒载体质粒加入至体积为250μL无血清DMEM培养基中配制质粒混合液，混合均匀。将15μL加到体积为235μL无血清DMEM培养基中，混合均匀。将/>混合液一次性加入到上述质粒混合液中，混匀，室温孵育15min。将混合液加入293T细胞培养皿中。24h后进行换液，将培养皿放回37℃、5％CO2培养箱中，48h后收取细胞上清，400×g离心5min，去除细胞碎片，将上清用0.45μm的滤头过滤至50mL离心管中。加入5×PEG8000溶液进行病毒液浓缩，上下颠倒离心管混合均匀，放于4℃冰箱中过夜。4℃，4000×g离心20min，弃上清，加适量无血清DMEM重悬病毒沉淀，转移入EP管中，放于-80℃冰箱中保存。
3、慢病毒感染人NK-92细胞
吸取处于生长对数期的NK-92细胞，100×g离心5min收获细胞，加入适量α-MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×105个/mL。在24孔板中分别接入5×105个NK-92细胞、0.2mL病毒浓缩液、0.8mLα-MEM培养基与鱼精蛋白(终浓度8μg/mL)，混合均匀。置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。24h后，观察细胞状态，换液，将感染的细胞转移入EP管中，100×g离心5min，加入少量新鲜α-MEM培养基重悬细胞，将细胞转入细胞培养瓶中，加入10mL新鲜α-MEM培养基和IL-2(终浓度为200IU/mL)继续培养48h。将细胞转移入新的α-MEM培养基中并完全撤去IL-2进行加压筛选2周，即可得到多功能载体基因修饰NK-92细胞(多功能NK-92细胞)，用于后续功能实验。
实施例2：多功能载体各元件表达验证
分离外周血单个核细胞(PBMC)接种在预包被的培养瓶中进行培养，参考CN202310035787.4，采用IL-2等细胞因子进行诱导培养。在培养的第7天进行慢病毒感染。第9天换液后继续培养，在第11天时进行流式细胞术检测NK细胞上各元件的表达情况。流式检测的方法如下：将1×106个细胞加入流式管中进行染色处理，根据不同的染色方案分别进入抗体进行染色，室温孵育30min。再加入1×PBS溶液洗涤2次后，重悬细胞沉淀后上机进行流式检测。方案1加入PerCP/Cyanine5.5标记抗人CD3抗体(购自于Biolegend)、BrilliantViolet 785TM标记抗人CD56抗体(购自于Biolegend)、APC标记抗人NKp30抗体(购自于Biolegend)与PE标记抗人CXCR2抗体(购自于Biolegend)。方案2加入PerCP/Cyanine5.5标记抗人CD3抗体(购自于Biolegend)、Brilliant Violet 785TM标记抗人CD56抗体(购自于Biolegend)、APC标记抗人IL-15Rα抗体(购自于Biolegend)与PE标记抗人IL-15抗体(购自于Invitrogen)。
通过CD3与CD56的圈门分析CD3-CD56+表型的细胞，即NK细胞。接着，再分析NK细胞上mbIL15RF(IL-15与IL-15Rα双阳性)或CXCR2表达的阳性率，NKp30表达的平均荧光强度(MFI)。试验结果如图2中A与B所示，未感染组的NK细胞上不表达CXCR2与mbIL15RF分子。经多功能载体慢病毒感染后，NK细胞上CXCR2与mbIL15RF分子表达显著升高。如图2中C所示，感染组NK细胞上NKp30表达的平均荧光强度也明显高于未感染组NK细胞。这些结果表明，多功能载体中设计的三个功能元件均可高效表达。
实施例3：多功能载体基因修饰NK细胞体外功能检测
在该实施例中，发明人通过实施例1得到本发明多功能载体基因修饰NK-92细胞(多功能NK-92细胞)后，考察了该多功能NK-92细胞细胞在体外的杀伤活性、存活与趋化能力。
1、多功能载体基因修饰促进NK细胞的杀伤活性
发明人对多功能载体基因修饰NK-92细胞的杀伤活性进行检测。具体方法如下：使用CFSE对结直肠癌NCI-H716细胞进行荧光标记，按照2×104个细胞/孔接入96孔板中，再将NK-92或多功能NK-92细胞分别接入板中共孵育4h。收集细胞于流式管内，再加入PI染色区分死活细胞，通过流式细胞仪进行检测杀伤效率。考察效应细胞与靶细胞之比为2∶1。
试验结果如图3所示，经本发明多功能载体基因修饰的多功能NK-92细胞对结直肠癌NCI-H716细胞的杀伤效率显著高于NK-92细胞。
2、多功能载体基因修饰促进NK细胞的存活
发明人进一步验证了多功能载体基因修饰对NK-92细胞促存活的作用。具体方法如下：分别将相同细胞数量的NK-92细胞和多功能NK-92细胞接板于24孔板中，并设置不同的IL-2浓度(0、20和200IU/mL)，每24h进行一次流式细胞术检测凋亡率。流式细胞术检测凋亡率根据试剂盒说明书(联科生物，货号AP101)的步骤进行操作，简要为：收集细胞于EP管中，加入1×PBS溶液离心洗涤一次，重悬细胞。每管加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI。轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5min，重悬细胞进行流式检测。细胞活率为Annexin V-FITC和PI染色双阴性的比例。
培养至96h的NK细胞存活率考察结果如图4所示：NK-92细胞组在无IL-2存在时(IL-2 0IU/mL)，细胞存活率从24h开始明显降低，至72h时大部分细胞已发生凋亡；而多功能NK-92细胞组即使在完全撤除IL-2的条件下仍能保持较高的细胞活率，很少有细胞发生凋亡。这些结果提示，多功能载体基因修饰可对NK细胞的存活发挥重要的促进作用。
3、多功能载体基因促进NK细胞的趋化能力
发明人进一步通过transwell实验考察多功能NK-92细胞的趋化能力。在transwell小室上室接入1×106个NK-92细胞或多功能NK-92细胞，下室加入600μL无血清α-MEM培养基，并分别加入1、10与100ng/mL浓度趋化因子CXCL8进行趋化。将细胞放回细胞培养箱，48h后收集下室中的细胞进行细胞计数。试验结果如图5所示，与NK-92细胞相比，多功能NK-92细胞迁移至下室的细胞数量明显更多。上述试验结果显示，多功能载体基因修饰可明显促进NK细胞的趋化能力。
实施例4：多功能载体基因修饰NK细胞具有强大的体内抑瘤活性
发明人以人结直肠癌细胞系NCI-H716细胞建立人结直肠癌小鼠异位移植瘤模型，以多功能载体慢病毒感染人外周血原代NK细胞制备外周血来源多功能原代NK细胞，观察多功能原代NK细胞对结直肠癌模型的治疗作用。
具体方法如下：选择6周龄NCG小鼠进行腋下皮下荷瘤，荷瘤剂量为1×107个NCI-H716细胞/只。在荷瘤后第9天，筛选肿瘤体积为50mm3左右的小鼠用于实验，根据肿瘤体积大小随机分为未治疗组、未基因修饰的NK细胞治疗组和多功能原代NK细胞治疗组。未基因修饰的NK细胞治疗组小鼠每2天治疗1次，共治疗3次，每次尾静脉回输剂量为8×106CD56+NK细胞，共回输2.4×107CD56+NK细胞，并每2天腹腔注射5×104IU的IL-2维持NK细胞体内活性；多功能原代NK细胞治疗组小鼠尾静脉回输治疗1次，剂量分别为2×106多功能原代NK细胞/只，不进行IL-2注射辅助治疗。每周观测1-2次肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。试验结果如图6所示，与未基因修饰的NK细胞治疗组相比，在更低的细胞治疗剂量下，多功能原代NK细胞治疗组仍显示出更强的抑瘤效果。
上述试验结果说明，基于本发明的多功能载体基因修饰NK细胞对结直肠癌等实体肿瘤具有显著增强的抗肿瘤活性，且应用时剂量更低，有望突破免疫细胞疗法对肿瘤治疗效果差的瓶颈。
实施例5
在该实施例中，发明人通过实施例1得到本发明多功能载体基因修饰NK-92细胞(多功能NK-92细胞)后，考察了该多功能NK-92细胞细胞对人慢性髓系白血病K562细胞的杀伤活性。
具体方法如下：使用CFSE对K562细胞进行荧光标记，按照2×104个细胞/孔接入96孔板中，再将NK-92或多功能NK-92细胞分别接入板中共孵育4h。收集细胞于流式管内，再加入PI染色区分死活细胞，通过流式细胞仪进行检测杀伤效率。
试验结果显示，经本发明多功能载体基因修饰的多功能NK-92细胞对人慢性髓系白血病K562细胞的杀伤效率显著高于NK-92细胞。
实施例6
在该实施例中，通过实施例1步骤1中的方法将表达NKp30-NKR与上述融合蛋白和不同趋化因子受体进行组合，得到表达不同趋化因子受体的多种转基因免疫细胞。运用实施例3中的方法检测表达不同趋化因子受体的多种转基因免疫细胞的趋化能力。
试验结果显示，虽然其他趋化因子受体与CXCR2具有类似的作用，但与其它趋化因子受体相比，表达NKp30-NKR与上述表达融合蛋白和CXCR2进行组合得到的转基因免疫细胞向肿瘤部位的趋化能力最强；而改变趋化因子受体所制备的转基因免疫细胞则对肿瘤的趋化能力较弱。而且，表达NKp30-NKR与上述表达融合蛋白和CXCR2进行组合得到的转基因免疫细胞具有较其他趋化因子受体组合更强的抗肿瘤活性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (14)

1.一种分离的核酸，其特征在于，包括：第一核酸片段，第二核酸片段和第三核酸片段，所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段相连；其中，
所述第一核酸片段用于编码靶向NKp30配体的抗原嵌合受体；
所述第二核酸片段用于编码融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15和IL-15Rα，所述IL-15和IL-15Rα相连；
所述第三核酸片段用于编码CXCR2受体。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述抗原嵌合受体包括：
NKp30受体的胞外区和跨膜区，以及
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连；
任选地，所述胞外区和跨膜区具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
任选地，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域；
任选地，所述共刺激结构域选自CD28分子胞内段；
任选地，所述胞内信号传导结构域选自CD3ζ分子胞内段；
任选地，所述CD28分子的C端和所述CD3ζ分子的N端相连；
任选地，所述CD28分子胞内段具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
任选地，所述CD3ζ分子胞内段具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗原嵌合受体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
任选地，所述第一核酸片段具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述IL-15的C端和IL-15Rα的N端相连，或者所述IL-15的N端和IL-15Rα的C端相连；
任选地，所述IL-15具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
任选地，所述IL-15Rα具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述IL-15的C端和连接肽的N端相连，所述连接肽的C端和IL-15Rα的N端相连，或者
所述IL-15的N端和连接肽的C端相连，所述连接肽的N端和IL-15Rα的C端相连；
任选地，所述连接肽选自柔性Linker、刚性Linker中的任意一种；
任选地，所述连接肽具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二核酸片段具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
任选地，所述CXCR2受体具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
任选地，所述第三核酸片段具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，进一步包括两个第四核酸片段，所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段中的每两个核酸片段分别通过一个所述第四核酸片段连接，其中，每个所述第四核酸片段各自独立地编码P2A或其片段；
任选地，所述P2A或其片段包括P2A、T2A、E2A和F2A中的至少之一或其片段；
任选地，所述第四核酸片段编码P2A或其片段；
任选地，所述P2A或其片段具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
任选地，所述第四核酸片段具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，进一步包括启动子，所述启动子与由所述第一核酸片段、第二核酸片段和第三核酸片段组成的核酸片段的5’端相连；
任选地，所述启动子选自EF1α、SFFV、CAG或CMV；
任选地，所述启动子选自EF1α；
任选地，所述EF1α具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
任选地，进一步包括第五核酸片段，所述第五核酸片段编码信号肽，所述信号肽的C端与所述IL-15的N端相连，所述IL-15的C端和连接肽的N端相连，所述连接肽的C端和IL-15Rα的N端相连，或者
所述IL-15的N端和连接肽的C端相连，所述连接肽的N端和IL-15Rα的C端相连，所述IL-15Rα的N端和信号肽的C端相连；
任选地，所述信号肽具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
任选地，所述第五核酸片段具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1～5任一项所述的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸从5’端到3’端依次为所述启动子、所述第一核酸片段、其中一个所述第四核酸片段、第五核酸片段、所述第二核酸片段、另一个所述第四核酸片段和所述第三核酸片段。
7.一种表达载体，所述表达载体携带权利要求1～6任一项所述的分离的核酸；
任选地，所述表达载体选自病毒、原核表达载体或真核表达载体；
任选地，所述表达载体选自病毒。
8.一种转基因免疫细胞，其特征在于，所述转基因免疫细胞表达靶向NKp30配体的抗原嵌合受体、融合蛋白和CXCR2受体；
其中，所述融合蛋白包括IL-15Rα和IL-15，所述IL-15和IL-15Rα相连。
9.根据权利要求8所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述抗原嵌合受体包括：
NKp30受体的胞外区和跨膜区，以及
胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连；
任选地，所述胞外区和跨膜区具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
任选地，所述胞内区包括共刺激结构域和胞内信号传导结构域；
任选地，所述共刺激结构域选自CD28分子胞内段；
任选地，所述胞内信号传导结构域选自CD3ζ分子胞内段；
任选地，所述CD28分子的C端和所述CD3ζ分子的N端相连；
任选地，所述CD28分子胞内段具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
任选地，所述CD3ζ分子胞内段具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗原嵌合受体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
任选地，所述IL-15的C端和IL-15Rα的N端相连，或者所述IL-15的N端和IL-15Rα的C端相连；
任选地，所述IL-15具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
任选地，所述IL-15Rα具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述IL-15的C端和连接肽的N端相连，所连接肽的C端和IL-15Rα的N端相连，或者
所述IL-15的N端和连接肽的C端相连，所述连接肽的N端和IL-15Rα的C端相连；
任选地，所述连接肽选自柔性Linker、刚性Linker中的任意一种；
任选地，所述连接肽具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
任选地，所述CXCR2受体具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
任选地，所述转基因免疫细胞是通过将权利要求7所述的表达载体导入至免疫细胞获得的；
任选地，所述转基因免疫细胞来源于T细胞、NKT细胞、NK细胞和巨噬细胞中的至少之一，优选为NK细胞；
任选地，所述NK细胞包括选自外周血NK细胞、脐带血NK细胞、诱导多能细胞衍生的NK细胞和NK-92细胞中的至少之一；
任选地，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδT细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～6任一项所述的分离的核酸、权利要求7所述的表达载体或权利要求8～9任一项所述的转基因免疫细胞。
11.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～6任一项所述的分离的核酸或权利要求7所述的表达载体。
12.一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法，其特征在于，包括：
将权利要求7所述的表达载体导入免疫细胞；
将所述导入表达载体的免疫细胞的进行培养处理。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述将表达载体导入免疫细胞是通过电转、转染或感染的方式进行的；
任选地，所述免疫细胞为T细胞、NKT细胞、NK细胞和巨噬细胞中的至少之一；
任选地，所述免疫细胞为NK细胞；
任选地，所述NK细胞包括选自外周血NK细胞、脐带血NK细胞、诱导多能细胞衍生NK细胞和NK-92细胞中的至少之一；
任选地，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδT细胞。
14.权利要求1～6任一项所述的分离的核酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求8～9任一项所述的转基因免疫细胞或权利要求10所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤；
任选地，所述肿瘤包括实体瘤和血液瘤；
任选地，所述实体瘤包括选自胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肾癌、乳腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、前列腺癌和黑色素瘤中的至少之一；
任选地，所述血液瘤包括选自急性髓系白血病、急性淋巴细胞系白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤的至少之一。
CN202311588502.6A 2023-11-24 2023-11-24 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 Pending CN117535324A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311588502.6A CN117535324A (zh) 2023-11-24 2023-11-24 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311588502.6A CN117535324A (zh) 2023-11-24 2023-11-24 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117535324A true CN117535324A (zh) 2024-02-09

Family

ID=89785834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311588502.6A Pending CN117535324A (zh) 2023-11-24 2023-11-24 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117535324A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2390558C2 (ru) Гемопоэтическая клетка cd34+ и ее применение
CN108384760A (zh) 携带cd20/cd19双特异性嵌合抗原受体的人t淋巴细胞及制备方法和应用
CN109468283A (zh) 一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
CA3001507C (en) Cxcr6-transduced t cells for targeted tumor therapy
CN113416260B (zh) 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
EP3411473A1 (en) Mesenchymal stem cells to enhance anti-tumor activity of immunotherapy
WO2009139413A1 (ja) サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法
CN109055430A (zh) 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法
CN114592010A (zh) NK-CAR-MbIL-15细胞及其制备方法和应用
EA012520B1 (ru) Способ получения цитотоксических лимфоцитов
CN115212299A (zh) Car-t和car-m联用在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111139222B (zh) 一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途
CN109666074B (zh) 一种趋化因子受体cxcr5的用途
CN112226463B (zh) 一种质粒组合及其在制备经修饰的免疫细胞中的应用
CN115552019A (zh) 在髓样细胞和小胶质细胞中特异性表达治疗性蛋白的病毒载体
WO2024055339A1 (zh) 用于制备和扩增通用型人源化抗cd19 car-nk细胞的方法及其用途
CN107502596A (zh) 表达ny‑eso‑1特异性tcr的t细胞及其应用
CN108949759A (zh) 敲减人IL-15的siRNA、CD19 CAR表达载体、CAR-T细胞及构建方法和应用
CN117535324A (zh) 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
CN117511977A (zh) 用于治疗肿瘤的新型免疫细胞及其制备方法
CN117587014A (zh) 多功能基因修饰载体及其制备的多功能基因修饰免疫细胞和它们的应用
CN107557338A (zh) 特异性识别ny‑eso‑1的t细胞及其与细胞因子的联合的应用
CN116925236B (zh) 嵌合转换受体及其应用
CN115838439B (zh) 嵌合转换受体基因修饰的nk细胞制备方法及应用
WO2017117890A1 (zh) Il-12/cd107a融合蛋白及其制法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination