CN115552019A - 在髓样细胞和小胶质细胞中特异性表达治疗性蛋白的病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在人类疗法中使用，特别是用于在起源于脑或基于脑的疾病或疾患，特别是PGRN相关的神经退行性疾病或疾患中使用的新颖病毒载体，所述PGRN相关的神经退行性疾病或疾患包括额颞叶退行性疾病或疾患，例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病。本发明还提供了病毒载体，所述病毒载体用于在脑肿瘤，特别是选自由成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤或任何其他CNS肿瘤组成的组的脑肿瘤的治疗中使用，以及进一步在源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌和黑素瘤，或任何其他实体瘤，以及任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤的脑转移的治疗中使用。此外，所述病毒载体可在自体免疫性疾病、炎性疾病和/或过敏性疾病的治疗中使用。

Description

在髓样细胞和小胶质细胞中特异性表达治疗性蛋白的病毒 载体
本发明提供了用于在人类基因疗法中使用，特别是用于在起源于脑或基于脑的疾病或疾患，特别是PGRN相关的神经退行性疾病或疾患中使用的新颖病毒载体，所述PGRN相关的神经退行性疾病或疾患包括额颞叶退行性疾病或疾患，例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病。本发明还提供了病毒载体，所述病毒载体用于在脑肿瘤，特别是选自由成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤或任何其他CNS肿瘤组成的组的脑肿瘤的治疗中使用，以及进一步在源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌和黑素瘤，或任何其他实体瘤，和/或任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤的脑转移的治疗中使用。
背景技术
用于治疗人类疾病的基因疗法包括对离体分离的细胞或体内的细胞和组织进行遗传操纵的所有方法。第一种临床成功的基因疗法研究发布于2000年，提出了用于治疗患有危及生命的先天免疫系统缺陷的儿童的造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)(Cavazzana-Calvo等人，(2000)Science 288:669-72)。这些研究基于使用γ逆转录病毒基因疗法载体对CD34+髓样细胞群内的HSC进行离体操纵。
逆转录病毒基因疗法载体是其中包含病毒载体RNA序列和编码治疗性蛋白质序列的RNA序列(即患者的患病基因的健康拷贝)的单链RNA被掺入逆转录病毒粒子中并由逆转录病毒粒子转运的病毒载体。在一个基因疗法逆转录病毒粒子中，两个RNA分子以及逆转录成双链DNA所需的病毒蛋白被由病毒蛋白组成的衣壳结构包封。病毒衣壳被包封在病毒包膜中，所述病毒包膜具有在转导过程期间与靶细胞的细胞膜融合的能力。逆转录病毒蛋白使得能够将转运的治疗性RNA序列逆转录成双链DNA，然后将所述双链DNA转运到转导的细胞的细胞核中并整合到转导的靶细胞的基因组中。
神经退行性痴呆是中老年患者残疾的重要原因，导致身体和社会自立性丧失。不仅是治疗，而且家庭或护老院的日常护理，对家庭、医务人员和社会都是巨大的挑战。据估计大于60岁的人的痴呆症患病率为5-7％，2010年全球有大于3500万人受到影响。
总体而言，在所有低于65岁的痴呆症发病患者中高达20％受到额颞叶痴呆(frontotemporal dementia,FTD)的影响。一项研究估计患病率在介于15与22/100,000之间的范围中(Onyike&Diehl-Schmid(2013)Int Rev Psychiatry 25:130-137)，总发病率为每100,000个人中有2.7-4.1个新病例(Onyike&Diehl-Schmid(2013)Int Rev Psychiatry25:130-137)。在英国的两个郡这个，患病率在65岁与69岁之间显示出42.6/100,000的峰值。目前不存在用于包括FTD在内的神经退行性痴呆的治愈性治疗选项。
对于所有FTD病例，存在对编码颗粒体蛋白前体蛋白或颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)的GRN基因中的突变比例的各种估计。这些估计的范围大致为5％(Gass等人(2006)Hum Mol Genet.15:2988-3001；Le Ber等人(2007)Hum Mutat.28:846-55)至30％(Bunessi等人(2009)Neurobiology of Disease 33:379-385)，其中低于65岁的个体中的外显率为1/3，并且高于65岁的个体中的外显率为2/3。
在患者中鉴定出的所有GRN突变都已与功能丧失和单倍剂量不足相关联，结局是较低的PGRN水平。这一事实使PGRN缺陷型FTD成为旨在恢复PGRN的生理水平的治疗方法的合适目标。
PGRN主要在小胶质细胞中表达，小胶质细胞是组织驻留巨噬细胞的脑驻留对应物。在三项报道的使用基因治疗方法的动物研究中(Arrant等人(2018)JNeurosci.38:2341-58；Arrant等人(2017)Brain 140:1447-65；Amado等人(2019)Mol Ther.27:465-478)，均不可恢复小胶质细胞中的PGRN表达：在现有技术中报道的研究中，将AAV病毒基因疗法载体注射到小鼠脑中，从而导致PGRN在神经元中表达，但不在小胶质细胞中表达。此外，在最新的动物研究中，强PGRN过表达与神经元毒性的病征相关联。
因此，需要以脑小胶质细胞中的生理PGRN表达为目标的替代治疗策略。这种靶向策略不同于上述使用AAV病毒载体的早期尝试，所述早期尝试导致神经元PGRN过表达和神经元毒性。
此外，本领域需要更安全的策略来在髓样细胞中表达转基因，特别是在转导HSC后，在外周血、外周组织中和在脑/CNS中表达转基因。
发明内容
本发明提供了此类替代和改进的策略，所述策略在本文描述的各种实施方式和权利要求中书定义。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在启动子或启动子片段控制下编码治疗性多肽或治疗性多肽组合的核酸分子，其中所述启动子或启动子片段驱动所述治疗性蛋白或所述治疗性蛋白组合在髓样细胞和小胶质细胞中的表达，并且其中所述启动子或启动子片段在造血祖细胞和/或干细胞中是无活性的。
也就是说，本发明基于令人惊讶的启动子鉴定，所述启动子可以驱动转基因在髓样细胞和小胶质细胞中的表达，但在干细胞中，特别是在造血干细胞和造血干祖细胞中是沉默的。此类细胞特异性启动子在细胞和基因疗法应用中是有利的，因为它们使用伴随的转基因表达将载体活性限制到分化的靶细胞，即髓样细胞和小胶质细胞。此是特别重要的，因为未分化的干细胞中的启动子/增强子活性可能导致并发症，例如致癌基因反式激活、克隆优势化、染色体不稳定性、单体7或白血病转化，并且未分化的干细胞中的转基因表达可能导致细胞功能受损或免疫反应。因此，本发明的启动子对泛在启动子是有利的，因为它们可以显著提高细胞和基因疗法应用的精确度和安全性。
已经表明，造血干细胞中的基因疗法伴随白消安介导的骨髓调理导致通过源自经基因修饰的造血干细胞移植物的细胞至少部分重构了脑中的髓样隔室(Biffi等人(2013)Science 341:1233158)。因此，本领域中需要促进和限制转基因表达成造血吞噬细胞和脑髓样细胞即小胶质细胞的启动子。本发明人出人意料地鉴定出了驱动转基因在髓样细胞和小胶质细胞中表达的启动子。如本文所用的术语“髓样细胞”是指一系列骨髓源性细胞谱系，包括粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞、枯氏细胞和肥大细胞。此外，还包括骨髓来源的外周血树突细胞，以及在适当培养条件存在下从单核细胞体外衍生的树突细胞和巨噬细胞。
如本文所用，术语“小胶质细胞”或“小神经胶质细胞”是指通过充当巨噬细胞参与介导中枢神经系统内的免疫反应的一类神经胶质细胞。小胶质细胞能够产生外泌体、细胞因子、趋化因子和神经营养因子，并且进一步包括不同形式的小胶质细胞，包括变形性小胶质细胞、分支状小胶质细胞和反应性小胶质细胞。小胶质细胞包括反应性小胶质细胞，其被定义为休眠的分支状小胶质细胞，所述休眠的分支状小胶质细胞转化成反应性巨噬细胞样状态并在脑损伤和炎症部位积聚以帮助组织修复和神经再生。本领域中已知造血干细胞可以迁移到脑并分化成具有小胶质细胞的许多特征的巨噬细胞。由于本发明的启动子已被证明在巨噬细胞和小胶质细胞中有活性，因此至少合理的是这些启动子在造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)源性小胶质细胞样细胞中也是有活性的。
虽然外周血中的髓样细胞仅来源于HSC，但是据信在正常条件下组织驻留巨噬细胞和小胶质细胞仅来源于卵黄囊红系骨髓前体。基于外周血髓样细胞和小胶质细胞的这种不同来源，可以认为令人惊奇的是本发明的启动子可以驱动两种细胞类型中的表达。
重要的是，本发明的启动子不驱动在干细胞中或在祖细胞中的表达。特别地，本发明的启动子不驱动在造血干细胞和造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitorcell,HSPC)中的表达(参见图21)。
如本文所用，术语“造血干祖细胞”或“HSPC”是指通过存在抗原性标志物CD34(CD34+)而鉴定出并且因此被表征为CD34+细胞的细胞，以及此类细胞的群体。在特定实施方式中，术语“HSPC”是指通过存在抗原性标志物CD34(CD34+)和不存在谱系(lin)标志物而鉴定出并且因此被表征为CD34+/Lin(-)细胞的细胞，以及此类细胞的群体。认识到包括CD34+和/或Lin(-)细胞的细胞群还包括造血祖细胞，并且因此出于本申请的目的，术语“HSPC”包括造血干细胞和造血祖细胞。
技术人员知道确定启动子在特定细胞类型中是否有活性的方法。例如，为了确定启动子在特定细胞类型中是否有活性，可以用病毒载体转导相应细胞类型的细胞，所述病毒载体包含处于感兴趣的启动子控制下的荧光标志物。启动子是否驱动荧光标志物的表达可以例如通过流式细胞术检测。也就是说，如果可以在转导细胞中检测到足够量的荧光标志物，则称启动子驱动转基因在这种细胞类型中的表达。然而，如果在转导细胞中不能检测到或只能检测到极少量的荧光标志物，则称启动子不驱动在这种细胞类型中的表达。本领域技术人员进一步意识到细胞可以在转导工序期间分化成其他细胞类型。然而，技术人员知道用于确定转导工序之前和之后的细胞类型的特定细胞表面标志物组合。本领域技术人员知道，无启动子活性的陈述受到启动子驱动的转基因产物检测的灵敏度的限制，并且可以以高灵敏度检测荧光蛋白，尤其是例如作为转基因产物的具有高量子产率的EGFP。因此，在这些类型的表达实验中没有检测到荧光蛋白被认为是启动子低于检测限的指示，并且最可能没有生物学相关性。
本发明的启动子可以驱动编码治疗性蛋白或治疗性蛋白组合的转基因在髓样细胞和小胶质细胞中的表达。也就是说，本发明的启动子可操作地连接至转基因。如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。通常，它是指转录调控序列与转录的序列的功能关系。例如，如果启动子序列刺激或调节编码序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中的转录，则所述启动子序列可操作地连接至所述编码序列。通常，可操作地连接至转录序列的启动子转录调控序列与转录序列物理上邻接，即它们是顺式作用的。
转基因可以是编码蛋白质或功能性RNA的任何核酸。下文讨论转基因的优选示例。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述启动子是
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
d)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
e)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
f)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
g)融合启动子，所述融合启动子包含miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；所述启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，启动子是启动子miR223或其功能片段。术语“miR223启动子”是指SEQ ID NO:1的序列和/或至少200个核苷酸的其任何片段，和/或是指与其具有>95％的序列同一性的至少200个核苷酸的任何序列或片段。
ACTTGTACAGCTTCACAGGGCTCCATGCTTAGAAGGACCCCACACTTAGTTTAATGTTCTGCTGTCATCATCTTGATATTCTTAATTTTTAAATAAAGGGCCTATCGTTTTCATTTTTTACTGGGCCTTGCAAATTATGTAGCTGGTTCTGTATGCCAGGAGAGAAGTTGGAAGTAAAATGGTATTCCAGGACCAGGAGGCATTCTGGCAGAGTGAAAGAACATGTGATTTGGAGTCCATGGGGATGGGTTTAAATTTCAGCTTTCCACTAATTTGCTTTGTGATACTGAGTATTTCCTTTTATCCCTCAGAGGCTCTGTTTCTCAATTTTGACTACGGGTTTTTTCATTAGATAATGTCTCAGTTCTGGTATTCCAGGTTTCCCTCAATTATTCTGGGAAAACCTCCTTGACCCACAGGCAGAGCCTAGGGCAGCCAGGTGCTTTCTACTCTCTCTCTCTCTGCAGCTTGGAAAGTTAGTGTCTGTTGAAGGTCAGCTGGGAGTTGGTGGAGGCAGGGCAGTGGCCTGCTACTATTGCTGCAGTAGCAGACCCTTTCACAACAGCATTGTTTTGTCATTTTGCATCCAGATTTCCGTTGGCTAACCTCAGTCTTATCTTCCTCATTTCTGTTTCCTGTTGAAGACACCAAGGGCCCTTCAAAACACAGAAGCTTCTTGCTCACGGCAGAAAGCCCAATTCCATCTGGCCCCTGCAGGTTGGCTCAGCACTGGGGAATCAGAGTCCCCTCCATGACCAAGGCACCACTCCACTGACAG(SEQ ID NO:1)
本文已显示启动子miR223驱动在各种髓样细胞类型中的表达(图11和图18)，但根据文献不在小胶质细胞中表达。本发明人出人意料地检测到了在永生化小胶质细胞系中的miR223启动子活性(图13)。
miR223启动子可以具有SEQ ID NO:1的序列。然而，技术人员知道SEQ ID NO:1的片段和/或序列变体可以具有与miR223启动子相同的特征。
因此，术语“miR223启动子”的适用范围也扩展至miR223启动子的功能片段。miR223启动子的功能片段是包含SEQ ID NO:1的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸的核苷酸序列。miR223启动子的功能片段被定义为驱动在相同的细胞类型中以与SEQ ID NO:1所示的启动子可比的水平表达。
还应理解的是，本发明涵盖包含miR223启动子的两个或更多个功能片段的启动子。也就是说，在某些实施方式中，启动子可以包含两个不同的核苷酸序列，该两个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个或至少300个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含三个不同的核苷酸序列，该三个不同的核苷酸序列包含SEQID NO:1的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个或至少200个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含四个不同的核苷酸序列，该四个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续核苷酸。
术语“miR223启动子”的适用范围也扩展至具有miR223启动子的启动子功能性的启动子。如果启动子驱动在相同的细胞类型中以与miR223启动子可比的水平表达并且如果所述启动子包含与miR223启动子至少一定程度的序列相似性，则称所述启动子具有miR223启动子的功能性。
如果启动子包含SEQ ID NO:1的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，则称所述启动子具有与miR223启动子一定程度的相似性。
或者，如果启动子与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性，则称所述启动子具有与miR223启动子一定程度的相似性。
此外，如果启动子包含SEQ ID NO:1的至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，其中所述连续段与SEQID NO:1的对应片段具有至少95％的序列同一性，则可以确定所述启动子具有与miR223启动子一定程度的相似性。
也就是说，在某些实施方式中，miR223启动子的功能片段是与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性的至少100个、150个、200个、300个、400个、500个、600个或700个碱基对的核酸序列，其中所述核酸序列具有miR223启动子活性。
如本文所用的术语“序列同一性”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定的，其中与不包含添加或缺失的参考序列相比，比较窗口中的多核苷酸片段可以包含添加或缺失(例如，空位或突出端)，以实现这两个序列的最佳比对。序列同一性百分比是通过以下方式计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量；将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和WatermanAdd.APL.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源兴比对算法、通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现方式(Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA)、或通过检查来进行。
在某些实施方式中，启动子是启动子ITGAM或其功能片段。术语“ITGAM启动子”是指SEQ ID NO:6的序列和/或至少200个核苷酸的其任何片段，和/或是指与其具有>95％的序列同一性的至少200个核苷酸的任何序列或片段。
CGCACCCAGCCAAGTTTGTACATATATTTTTGACTACACTTCTTAACTATTCTTAGGATAAATTACTAGAAGTGAAAATTCTTGGGTGAAGAGCTTGAGGCCTTTACACACACACACACACACACACACAAAAATAGGCTGGATGCAGTGGCTCACACCTGTAATCTCAGCAGTTTGGGAGGCTGAGGAAGGAGGATCACTTGAGTCCAGGAGGTTGAGAATAGCCTGAACAACATAGCAAGATCTTGTCTCTACAAAAAATTTAAAAAAAATTAGCTGGCCATGGCAGCATGTGCCTGTAGTACCAGCTACTCGGAAGGCTGAGGTAGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAGGTTGATTGAAGCTGCAGTGAGCTGTGATTACACCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCTAGACTCTGTCTCTAAAAAAAGCACAAAATAATATTTAAAAAGCACCAGGTATGCCTGTACTTGAGTTGTCTTTGTTGATGGCTACAAATGAGGACAGCTCTGGCTGAAGGGCGCTTCCATTTCCATGGGCTGAAGGAGGGACATTTTGCAAAGTGTGTTTTCAGGAAGACACAGAGTTTTACCTCCTACACTTGTTTGATCTGTATTAATGTTTGCTTATTTATTTATTTAATTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTCACTCTGTCACCTGGGCTGGAGTGCAGTGGCATTATTGAGGCTCATTGCAGTCTCAGACTCCTGAGCTCAAACAATCCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTAGGACTACAGGCATGTGCCACCATGCCTGGCTAATTTTTTAAATGTATTTTTTTGTAGAGTCGGGGTCTCCCTATGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGTGATCCTAGCTCACTGCAGCCTGGACCTCGGGCTCAAGTAATTCTCACACCTCAGCCTGTCCAGTAGCAGGGGCTACAGGCGCGCACCACCATGCCCAGCTAATTAAAAATATTTTTTTGTAGAGACAGGGTCTCTCTATGTTGCCCAGGCTGGTTTCAAACTCCCAGGCTCAAGCAATCCTCCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGCATTACAGGCGTGAGCCACTGCGCCTGGCCCGTATTAATGTTTAGAACACGAATTCCAGGAGGCAGGCTAAGTCTGTTCAGCTTGTTCATATGCTTGGGCCAACCCAAGAAACAAGTGGGTGACAAATGGCACCTTTTGGATAGTGGTATTGACTTTGAAAGTTTGGGTCAGGAAGCTGGGGAGGAAGGGTGGGCAGGCTGTGGGCAGTCCTGGGCGGAAGACCAGGCAGGGCTATGTGCTCACTGAGCCTCCGCCCTCTTCCTTTGAATCTCTGATAGACTTCTGCCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCCCTTCTTTGCTTTGG(SEQ ID NO:6)
本文已显示，启动子ITGAM驱动在各种髓样细胞类型中(图11和图18)和小胶质细胞中(图13)的表达。
ITGAM启动子可以具有SEQ ID NO:6的序列。然而，技术人员知道SEQ ID NO:6的片段和/或序列变体可以具有与ITGAM启动子相同的特征。
因此，术语“ITGAM启动子”的适用范围也扩展至ITGAM启动子的功能片段。ITGAM启动子的功能片段是包含SEQ ID NO:6的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸的核苷酸序列。ITGAM启动子的功能片段驱动在相同的细胞类型中以与SEQ ID NO:6所示的启动子可比的水平表达。
还应理解的是，本发明涵盖包含ITGAM启动子的两个或更多个功能片段的启动子。也就是说，在某些实施方式中，启动子可以包含两个不同的核苷酸序列，该两个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个或至少300个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含三个不同的核苷酸序列，该三个不同的核苷酸序列包含SEQ IDNO:6的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个或至少200个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含四个不同的核苷酸序列，该四个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续核苷酸。
术语“ITGAM启动子”的适用范围也扩展至具有ITGAM启动子的启动子功能性的启动子。如果启动子驱动在相同的细胞类型中以与ITGAM启动子可比的水平表达并且如果所述启动子包含与ITGAM启动子至少一定程度的序列相似性，则称所述启动子具有ITGAM启动子的功能性。
如果启动子包含SEQ ID NO:6的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，则称所述启动子具有与ITGAM启动子一定程度的相似性。
或者，如果启动子与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性，则称所述启动子具有与ITGAM启动子一定程度的相似性。
此外，如果启动子包含SEQ ID NO:6的至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，其中所述连续段与SEQID NO:6的对应片段具有至少95％的序列同一性，则可以确定所述启动子具有与ITGAM启动子一定程度的相似性。
也就是说，在某些实施方式中，ITGAM启动子的功能片段是与SEQ IDNO:6具有至少95％的同一性的至少100个、150个、200个、300个、400个、500个、600个或700个碱基对的核酸序列，其中所述核酸序列具有ITGAM启动子活性。
在某些实施方式中，启动子是启动子AIF1或其功能片段。术语“AIF1启动子”是指SEQ ID NO:5的序列和/或至少200个核苷酸的其任何片段，和/或是指与其具有>95％的序列同一性的至少200个核苷酸的任何序列或片段。
CGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGTAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCAGTGGTTGCAGTGAGCCGAGATTGCACCATTGCACTCCCGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCGACTCAAAAAAAAAAAAAAAAGCAGCAGCAGCAGCCAGAGGCCACTCCAGCATCTCCCCTACCTGGCTTGGGTCAGGGAGAGGGCAGTGAGAAGTGAAAACTCCCAGCTACAGAAAAGGAAATATGTTGGGGGGAAGGGAGAAGGAAAGGTGTCTTCATCAATGCCGGGGCAGGGTAGATGGAGCCCTGGGCAGGGAGTTTGGACCAGGAAATCTCAATGAGGGAAATGTGCTGTCCTCACCTCTCCAAGAAGCGACTGGCCAAACAGAGTGACAGAGGGGATAAAGGTTATGCCTAGGGAGGCATGTGTCAGAGGCTATCATCCACTCTGTTGAACCCACAGTGACCAGCACCACCATCACACAAACATGCCTGCATGTGTGCACGCACGTGCAGTGTGCAAACCTGATGTCAGCCTCACTCCCTGGCTCTTCTGTCCACAAACGCTGTTTCTTTAAGTACCACTTTCAGTTCCTCCAAAGAATCTACTTAAACTCTTAAATTCCTGATCTCTATAGATTTTACTAAAGATTTCAAAGGAGATAAGATGAGAGGGTTACGTTGCACATTCTAAAGCAAACAAATTAAAATGTTTTGTTAGACATTTCCATATTTTTAAGGGCCTCCTTGGAGCTGCCAGGCTGGGAGTGAGGTTTCTCTCCCTTTCTAAACCCTGTGCCCATCTTGTCACCCTCCTGGAGCTGCCAGCAGACTTCAGATTCTTCTCCGATCTACAGAGCAGAAAAATTCAGCCAGCCCTTCCTTGTCTTCCTATCCACAGCTGCCTGCCCAGACTCATGAAACCTGACAAAATGCAAGGTCTTATCATTACCTGAACCTTGGACCTGTTCAAAAATACTAGTTCCTGAGAATAAATATCCCTGGTGTCTTCCTGCCCTTCCTGCACACCTCCAGTGGCTTATCAAAATATTTGTTTCATGCGCACACTGGGCTCTCATTTAAGAGGAATTTGGGAGAATGTTATTTTCTAATCTGCATTTCACACCAGGCTCCCCCTCCTTCCTGGGGTGCTAGTGTCAGCAGAACCTGATGGGGAAGTGAGGTCTGGGAGGCAGAGGAGGAAGGAATGAGGGGAAAGGGGAAGTTTGGGAGGAAGGCTTCTG(SEQ ID NO:5)
AIF1启动子可以具有SEQ ID NO:5的序列。然而，技术人员知道SEQ ID NO:5的片段和/或序列变体可以具有与AIF1启动子相同的特征。
因此，术语“AIF1启动子”的适用范围也扩展至AIF1启动子的功能片段。AIF1启动子的功能片段是包含SEQ ID NO:5的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸的核苷酸序列。AIF1启动子的功能片段驱动在相同的细胞类型中以与SEQ ID NO:5所示的启动子可比的水平表达。
还应理解的是，本发明涵盖包含AIF1启动子的两个或更多个功能片段的启动子。也就是说，在某些实施方式中，启动子可以包含两个不同的核苷酸序列，该两个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个或至少300个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含三个不同的核苷酸序列，该三个不同的核苷酸序列包含SEQ IDNO:5的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个或至少200个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含四个不同的核苷酸序列，该四个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续核苷酸。
术语“AIF1启动子”的适用范围也扩展至具有AIF1启动子的启动子功能性的启动子。如果启动子驱动在相同的细胞类型中以与AIF1启动子可比的水平表达并且如果所述启动子包含与AIF1启动子至少一定程度的序列相似性，则称所述启动子具有AIF1启动子的功能性。
如果启动子包含SEQ ID NO:5的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，则称所述启动子具有与AIF1启动子一定程度的相似性。
或者，如果启动子与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性，则称所述启动子具有与AIF1启动子一定程度的相似性。
此外，如果启动子包含SEQ ID NO:5的至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，其中所述连续段与SEQID NO:5的对应片段具有至少95％的序列同一性，则可以确定所述启动子具有与AIF1启动子一定程度的相似性。
也就是说，在某些实施方式中，AIF1启动子的功能片段是与SEQ ID NO:5具有至少95％的同一性的至少100个、150个、200个、300个、400个、500个、600个或700个碱基对的核酸序列，其中所述核酸序列具有AIF1启动子活性。
在某些实施方式中，启动子是启动子P2RY12(也称为P2Y12，参见https://www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/18124)或其功能片段。术语“P2RY12启动子”是指SEQ ID NO:2的序列和/或至少200个核苷酸的其任何片段，和/或是指与其具有>95％的序列同一性的至少200个核苷酸的任何序列或片段。
GGTGTTGGAGAGGATGTGGAGAAATAGGAACACTTTTACACTGTTGGTGGGACTATAAACTAGTTCAACCATTGTGGAAGTCAGTGTGGTGATTCCTCAGTGATCTAGAACTAGAAATACCATTTAACCCAGCCATCCCATTACTGGGTATATACCCAAAGGATTATAAGTCATGCTGCTATAAAGACACATGCACACGTATGTTTATTGCGGCACTATTCATAATAGCAAAGACTTGGAACCAACCCAAAAGTCCAACAATGATAGACTGGATTAAGAAAATGTGGCACATATACACCATGGAATACTATGCAGCCATAAAAAATGATGAGTTCATGTCCTTTGTAGGGACATGGATGAAATTAGAAATCATCATTCTCAGTAAACTATCGCAAGAACAAAAAACCAAACACCACATATTCTCACTCATAGGTGGGAACTGAACAATGAGAACACATGGACACAGGAAGGGAAACACTACACTCTGGGGACTGTTGTGGGGTGGGGGGATGGGGGAGGGATAGCTTTAGGAGATATACCTAATGCTAAATGACGAGTTAATGGGTGTAGCACACCAGCATGGCACATGTATACATATGTAACTAACCTGCACATTGTGCACATGTACCCTAAAACTTAACGTATAATAATAATAAAATTAAAAAAAAAAAGTTAAAGCAGCAAAACACTTTGCCCTTCAATCTCACCCCTAACATATTTTTTGCCCTTCTGGTTTCAAAGTTAAACAACTGTAAATAATTGTGATACAAGGATGCCTTAATTTAATGTTATATTTTCCCAAAAACTCAAAGTTAGGTAAAGAAACAAAAAAAAATTGTTTATATTTAAATTCTATTCAAGAAAAGCATGAACGACACAGTATATAATAAGCCTGGCAATGGATACAATCACTTCTCTAATGTAATTTTGGAATCTGCTAATTTATAATAGAAGGAAGCTGTTTCACCTACAAAGGAGTTAATCAAACACAGGTTTAAAATAATGACATTATTAACCAAGGGAAAAACAAAGGGCCAGAGACTTAACATCCCTAGCCAGCACGCATTTTGAGTTAACATAATTACTTGTTAGAAGAAAATACATCACCCAGTGTTGTACACAATATATTTCAGATAAATTAACCACCCAAGAAAGCAAGCTTAAAATCTTCTCCAGGAAGCAGACTTCGAAGGCTTGATCTCAACTTGGATTTATCATTTGCATAGAAAATAACCATAACTCGAAGTTATAAATCATCAACTCTATAGCAGGTTTCAGTAAAAAGCCGCAAGATTTTAAATTGCTTTTTAAAAGATGACTTCTCAGCCATCCTCATCCCACATTTCCTGGGAAATAAAAGCAGAAGTCCTAAAAGAGGACAGATAGAAATTCAGTGTCTGCATAGCTTTGAGTCCAGTGTTTGA(SEQ ID NO:2)
P2RY12启动子可以具有SEQ ID NO:2的序列。然而，技术人员知道SEQ ID NO:2的片段和/或序列变体可以具有与P2RY12启动子相同的特征。
因此，术语“P2RY12启动子”的适用范围也扩展至P2RY12启动子的功能片段。P2RY12启动子的功能片段是包含SEQ ID NO:2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸的核苷酸序列。P2RY12启动子的功能片段驱动在相同的细胞类型中以与SEQ ID NO:2所示的启动子可比的水平表达。在某些实施方式中，P2RY12启动子的功能片段具有SEQ ID NO:21的序列。在某些实施方式中，P2RY12启动子的功能片段具有SEQ ID NO:22的序列。
还应理解的是，本发明涵盖包含P2RY12启动子的两个或更多个功能片段的启动子。也就是说，在某些实施方式中，启动子可以包含两个不同的核苷酸序列，该两个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个或至少300个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含三个不同的核苷酸序列，该三个不同的核苷酸序列包含SEQID NO:2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个或至少200个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含四个不同的核苷酸序列，该四个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续核苷酸。
术语“P2RY12启动子”的适用范围也扩展至具有P2RY12启动子的启动子功能性的启动子。如果启动子驱动在相同的细胞类型中以与P2RY12启动子可比的水平表达并且如果所述启动子包含与P2RY12启动子至少一定程度的序列相似性，则称所述启动子具有P2RY12启动子的功能性。
如果启动子包含SEQ ID NO:2的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，则称所述启动子具有与P2RY12启动子一定程度的相似性。
或者，如果启动子与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性，则称所述启动子具有与P2RY12启动子一定程度的相似性。
此外，如果启动子包含SEQ ID NO:2的至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，其中所述连续段与SEQID NO:2的对应片段具有至少95％的序列同一性，则可以确定所述启动子具有与P2RY12启动子一定程度的相似性。
也就是说，在某些实施方式中，P2RY12启动子的功能片段是与SEQ IDNO:2具有至少95％的同一性的至少100个、150个、200个、300个、400个、500个、600个或700个碱基对的核酸序列，其中所述核酸序列具有P2RY12启动子活性。
在某些实施方式中，启动子是启动子TMEM119或其功能片段。术语“TMEM119启动子”是指SEQ ID NO:3的序列和/或至少200个核苷酸的其任何片段，和/或是指与其具有>95％的序列同一性的至少200个核苷酸的任何序列或片段。
GTTCCTACCCAGAGAGCACGCACTCATCCTTCATGCACTCCCCTGTTCCAAACCCTCACTGGCTCCGTACTGCCTCCGACCTTCCGAGACTTTAGCCTGGCTCCTGTCAACATCTCTGACCCTTACTACATGATCCTCTCTTTGGTCCATGCTCCAGCCTAATCTAATTGCGGTGGCTTGTGCGTGGTGGCATTCCCAGCCACCATACCTTTACCCACGCTGGTCCTTCCATGCGGAATGCCTTTCCAGGGCCTGCTTTGCCCGCTTCTGCTCATACACAGGCATGCCCTCCAGGATGGCTTCCTACCTCTTTCCCTTGGGGGATTGATCTCTCTGTCTTGGGGTTCTCGGAGCCCTTGACCTGACCCCTTTCTGTTTGGCAAAAAAGTAATTTACCTCGGTGTCCTTCTCCCTGGTAGTCTGTGAGCTCCCCAAGGCTGGGCTGTGCCTGATTCACCTCTGGAACTTGCTTAGCACAGTGCGTGGCCTGCTGCAGGTGTTCATTGAGCACTTGCCGAATGAATGCATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGCAAGGGGCTGCTAATCCACAGGACTCCTCAGGTCAGCCAGACGTCCCGGTTCCAAGGCCTGCCACTGACTCACCTCAGGACCCTGCTTGAACCATTAGAACTCACCCTGCCTCACTTTCCCCCTCTGTGAAATGGGGCTCCAACTCCTATTCAAGCTACTATCATTTGGGGGCATTGTGAGGCCACAGATCCCAGAACATCAGAGTCAGAGGTAGCCCAGAAAGCTTCCCACCCATCCCTACAAATGGGAAACTGAGGTCTGGAGAGGGAAGGGCAGAGTTGGGCTCCCTGTCTCAGGCTCGGACCCACCATCAGGCCTGTCTCTAAAACGAATCCCAGCTCCCACGCTGCACCCTGAGCCTGGAAGCCTGAGCCACACAAGGACGGGGAATTTTCCTTCCCACTTCCAGAGGCCTCTGAACCTCCCTGAGCTTGTCCCCTTTGGAGGGTATTGGGCAGCAGCGTGGGCAGAACCCCAGCTCACTGTCTGGGGGAGCGCTGCAGGACAGCCTTGTCTGTCTGTCTCAGCCTGCCCTGGGGACCCGAGGTCAGGGAGGAAGTGCCGCATCTGGTCTTCCCCAGAGCGAGAGTGTGAGCAAGGGTGGGATTGCGTGTGGCCCGAGAGTAGCCCCTCCCCTCCCCCTGTCCCCACCCCAAACCCTCTTAATGAAATCAAGCTGGCCCTGCGGCCCAGCCGGGGAGGGAGGAAGGAGGAGGGACGGGAGGAGGGACGGGAGGAGGGAGGGCGGGCAGGC(SEQ ID NO:3)
TMEM119启动子可以具有SEQ ID NO:3的序列。然而，技术人员知道SEQ ID NO:3的片段和/或序列变体可以具有与TMEM119启动子相同的特征。
因此，术语“TMEM119启动子”的适用范围也扩展至TMEM119启动子的功能片段。TMEM119启动子的功能片段是包含SEQ ID NO:3的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸的核苷酸序列。TMEM119启动子的功能片段驱动在相同的细胞类型中以与SEQ ID NO:3所示的启动子可比的水平表达。在某些实施方式中，TMEM119启动子的功能片段具有SEQ ID NO:23的序列。在某些实施方式中，TMEM119启动子的功能片段具有SEQ ID NO:24的序列。
还应理解的是，本发明涵盖包含TMEM119启动子的两个或更多个功能片段的启动子。也就是说，在某些实施方式中，启动子可以包含两个不同的核苷酸序列，该两个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个或至少300个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含三个不同的核苷酸序列，该三个不同的核苷酸序列包含SEQID NO:3的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个或至少200个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含四个不同的核苷酸序列，该四个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续核苷酸。
术语“TMEM119启动子”的适用范围也扩展至具有TMEM119启动子的启动子功能性的启动子。如果启动子驱动在相同的细胞类型中以与TMEM119启动子可比的水平表达并且如果所述启动子包含与TMEM119启动子至少一定程度的序列相似性，则称所述启动子具有TMEM119启动子的功能性。
如果启动子包含SEQ ID NO:3的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，则称所述启动子具有与TMEM119启动子一定程度的相似性。
或者，如果启动子与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性，则称所述启动子具有与TMEM119启动子一定程度的相似性。
此外，如果启动子包含SEQ ID NO:3的至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，其中所述连续段与SEQID NO:3的对应片段具有至少95％的序列同一性，则可以确定所述启动子具有与TMEM119启动子一定程度的相似性。
也就是说，在某些实施方式中，TMEM119启动子的功能片段是与SEQ IDNO:3具有至少95％的同一性的至少100个、150个、200个、300个、400个、500个、600个或700个碱基对的核酸序列，其中所述核酸序列具有TMEM119启动子活性。
在某些实施方式中，启动子是启动子OLFML3或其功能片段。术语“OLFML3启动子”是指SEQ ID NO:4的序列和/或至少200个核苷酸的其任何片段，和/或是指与其具有>95％的序列同一性的至少200个核苷酸的任何序列或片段。
GCAGTGTCCAGGGTCCTTACTTCACATCATCTGGATCTGACCCTTTGAAAGAGGTAGAAGACTTCTGAGACCGGCTAATTAAGCTTTGTTTCCTCATATGTTTTGCCAGATAGCAGTAGCAGAATGAAAAGATGAGTAACCACAGGAAGCTGCTATTTTTCCCCTCCTTTCAAACTGTACTGTTAGAGTCATGGTCCTTTTTACAGAAGGAACCTCTCATCAGATTCTGTTGATTCTAAAGTGAATAGAATTTCTCCCGATAAAGAAATAGGGGTTTGTTTCGATTAATGACTGCAGGTCTCTGAGTAAATGCTCTATTTGATTTTTTTTTTCGGCCCGTGTGTCTACCTTATGGCCCAAGTCTACCTTATGGTGGCCATTAATTCATTTTGGGCTCCTGCAGCCTTAGTTGGGATATAGAAATGAGAAACACTCAGAAATACCCTTTTGGACCACAACCAAGAGAAATAACCAATAGTCTTTTCTCCCAGTGGTAAGGAAGTCAGAATACATTGATCTAGACTGCAACAACATATATATATATATCAGATTCCGCCCCCCCGCAATACATGAATGTATAGTAAATTAGTGTGAACTCACTGAACACTCCTCAGTTTTGGTGAGAGACTATATCTGGCCTCTTTCAAGCAAAGGAAAGCCATGTAAAACAGCGCTGCTGTCAGCCTTAACTTCCAGACGATCGAGTTAATTTACTAACTTCTCAGTGACCTGTTTTTTTTTTTTTTTTAATCTCAGTTATATTTTCTTCCTTGGGCTAAATCAGATATTTGCATAGCCCCCAAAGTAGTAATTGGATAGTCTTGGGGGAAATATGCATTTCAGTGGTGAAAACCCCTGTAAATTCAATATATTTGGCTTTTGTGGAAAATTTTCCTCATGGGGTGAAGTCTAAGCCTTAGTTTCTGTATTATCATGAGAGATGACACCAGCTGCTTAGCACAAGGTGGCGCCAATGAGCTTTAGAATAAGTTGGGCTTGACCACTTGGGCCATTGTTTTCCTGCTTCCTCCCTTCAAGCCTCACCTCCCCAGCTCCCAGCTTCTACTGAACAAGGCTGAAAACCCACTCTATTGCAGGGAAAGGGAAAGATTAATGAAAAATGTCAGTTTCTTAAGTCAGCACTGGTGAAACTTTCCTAAAACAGGAATGGCGTTTGCTGAGTTTTCTCTGGGGTCTCTGCTTTCTGCAGCTAGCTTCCCTGCTTGACTGCCTAGAAGGCCTCTGCTTTCGGGTTTCCATCTCTTTCCCCTCCAGAGGACCCTACAGCCTAGGCGGGAGGTGGTTAAGGCTTCTGGCTGCTGTGCAATGGGGCCATCTGTGTTTGATCAATCCTGGCGGAAAGGAGGGGGTGGGGGTTGTAAAGAGAACTGAAAGCATTCCAGAGTAGTGAGAGAGA(SEQ ID NO:4)
OLFML3启动子可以具有SEQ ID NO:4的序列。然而，技术人员知道SEQ ID NO:4的片段和/或序列变体可以具有与OLFML3启动子相同的特征。
因此，术语“OLFML3启动子”的适用范围也扩展至OLFML3启动子的功能片段。OLFML3启动子的功能片段是包含SEQ ID NO:4的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸的核苷酸序列。OLFML3启动子的功能片段驱动在相同的细胞类型中以与SEQ ID NO:4所示的启动子可比的水平表达。在某些实施方式中，OLFML3启动子的功能片段具有SEQ ID NO:25的序列。
还应理解的是，本发明涵盖包含OLFML3启动子的两个或更多个功能片段的启动子。也就是说，在某些实施方式中，启动子可以包含两个不同的核苷酸序列，该两个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个或至少300个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含三个不同的核苷酸序列，该三个不同的核苷酸序列包含SEQID NO:4的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个或至少200个连续核苷酸。在某些实施方式中，启动子可包含四个不同的核苷酸序列，该四个不同的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续核苷酸。
术语“OLFML3启动子”的适用范围也扩展至具有OLFML3启动子的启动子功能性的启动子。如果启动子驱动在相同的细胞类型中以与OLFML3启动子可比的水平表达并且如果所述启动子包含与OLFML3启动子至少一定程度的序列相似性，则称所述启动子具有OLFML3启动子的功能性。
如果启动子包含SEQ ID NO:4的至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，则称所述启动子具有与OLFML3启动子一定程度的相似性。
或者，如果启动子与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性，则称所述启动子具有与OLFML3启动子一定程度的相似性。
此外，如果启动子包含SEQ ID NO:4的至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个核苷酸的连续段，其中所述连续段与SEQID NO:4的对应片段具有至少95％的序列同一性，则可以确定所述启动子具有与OLFML3启动子一定程度的相似性。
也就是说，在某些实施方式中，OLFML3启动子的功能片段是与SEQ IDNO:4具有至少95％的同一性的至少100个、150个、200个、300个、400个、500个、600个或700个碱基对的核酸序列，其中所述核酸序列具有OLFML3启动子活性。
在某些实施方式中，启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR223启动子、其片段或具有miR223功能性的启动子和(b)第二启动子。除了其在髓样细胞和小胶质细胞中的特定活性外，启动子miR223由于其对DNA甲基化的抗性而对于在细胞和基因疗法应用中使用具有吸引力。这是重要的，因为已知干细胞分化成髓样细胞或小胶质细胞样细胞会导致启动子序列的广泛甲基化，这通常会导致转基因在分化细胞中的沉默。因此，启动子miR223具有其使得能够在源自HSC的分化细胞中进行稳定的转基因表达的优势。
优选地，融合启动子包含miR223启动子、其片段或具有miR223功能性的启动子，以及
(a)TMEM119启动子、其功能片段或具有TMEM119功能性的启动子；(b)P2RY12启动子、其功能片段或具有P2RY12功能性的启动子；(c)OLFML3启动子、其功能片段或具有OLFML3功能性的启动子；(d)ITGAM启动子、其功能片段或具有ITGAM功能性的启动子；或(e)AIF1启动子、其功能片段或具有AIF1功能性的启动子。
术语“miR223融合构建体”或“miR223融合启动子”是指由以下物质组成的启动子构建体：miR223启动子，
(i)与P2Y12启动子或衍生自P2Y12启动子的启动子片段融合，该启动子片段由P2Y12启动子的序列的至少200个核苷酸组成；或者
(ii)与TMEM119启动子或衍生自TMEM119启动子的启动子片段融合，该启动子片段由TMEM119启动子的序列的至少200个核苷酸组成；或者
(iii)与OLFML3启动子或衍生自OLFML3启动子的启动子片段融合，该启动子片段由OLFML3启动子的序列的至少200个核苷酸组成；或者
(iv)与AIF1启动子或衍生自AIF1启动子的启动子片段融合，该启动子片段由AIF1启动子的序列的至少200个核苷酸组成；或者
(v)与ITGAM启动子或衍生自ITGAM启动子的启动子片段融合，该启动子片段由ITGAM启动子的序列的至少200个核苷酸组成。
也就是说，在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。应当理解的是，功能片段优选是具有如上定义的miR223和/或P2RY12功能性的启动子。
在某些实施方式中，包含miR223启动子和P2RY12启动子的融合启动子可以包含核苷酸序列SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。应当理解的是，功能片段优选是具有如上定义的miR223和/或TMEM119功能性的启动子。
在某些实施方式中，包含miR223启动子和TMEM119启动子的融合启动子可以包含核苷酸序列SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。应当理解的是，功能片段优选是具有如上定义的miR223和/或OLFML3功能性的启动子。
在某些实施方式中，包含miR223启动子和OLFML3启动子的融合启动子可以包含核苷酸序列SEQ ID NO:29或与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。应当理解的是，功能片段优选是具有如上定义的miR223和/或ITGAM功能性的启动子。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。应当理解的是，功能片段优选是具有如上定义的miR223和/或AIF1功能性的启动子。
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的载体，其中启动子是
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)融合启动子，所述融合启动子包含miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；所述启动子可操作地连接至TMEM119启动子或与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的载体，其中启动子是
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)融合启动子，所述融合启动子包含miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的载体，其中启动子是
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)融合启动子，所述融合启动子包含miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；所述启动子可操作地连接至TMEM119启动子或与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的载体，其中启动子是
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)融合启动子，所述融合启动子包含miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；所述启动子可操作地连接至TMEM119启动子或与SEQ IDNO:23所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的载体，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含：(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；所述启动子或其功能片段可操作地连接至(b)TMEM119启动子，或与SEQ ID NO:23所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子；或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的载体，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含：(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子；所述启动子可操作地连接至(b)TMEM119启动子，或与SEQ ID NO:23所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子。
在本发明中，如果除了上面公开的序列相似性之外，启动子还驱动在相同细胞类型中以可比水平表达，则称所述启动子具有特定启动子(参考启动子，例如根据SEQ ID NO:1的miR223)的功能性。如果来自启动子的报道基因的表达水平是来自参考启动子的相同报道基因在可比条件下的表达水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％，则称所述启动子驱动可比水平的表达。在本领域中已知有许多报道基因适用于确定两个启动子是否具有可比的活性和细胞特异性。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述病毒载体包含至少一种转录调控元件，其中所述至少一种转录调控元件被布置成使得其抑制或激活所述启动子的转录活性。
也就是说，病毒载体可以进一步包含允许更精确地控制转基因的表达的调控元件。如本文所用，术语“转录调控元件”是指能够调控一种或多种基因，优选地转基因的表达的核酸片段。转录调控元件可以激活或抑制转基因的表达。因此，转录调控元件、转基因和启动子可操作地连接至彼此。
应当理解的是，转录调控元件是与本发明的启动子紧邻的核酸序列。优选地，转录调控元件构成转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合位点。转录激活蛋白是在与转录调控元件结合时激活转基因表达的蛋白质。转录阻遏蛋白是在与转录调控元件结合时阻止转基因表达的蛋白质。
在某些实施方式中，转录激活蛋白或阻遏蛋白可以经历结构变化，所述结构变化确定了与转录调控元件的结合潜力。例如，当转录激活蛋白由诱导剂分子特异性结合时，所述激活蛋白可能仅与转录调控元件结合并由此激活转基因的表达。或者，当转录阻遏蛋白由阻遏物分子特异性结合时，所述阻遏蛋白可仅与转录调控元件结合并由此使转基因的表达失活。
技术人员知道可用于控制来自本发明的启动子的转基因的表达的各种系统。在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述至少一种转录调控元件包含用于转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合位点，特别地其中所述转录激活蛋白或阻遏蛋白包含：
i)抗生素结合结构域，特别是四环素/强力霉素结合结构域、大环内酯结合结构域或普那霉素结合结构域；
ii)激素结合结构域，特别是RU486结合结构域或脱落酸结合结构域；
iii)类固醇结合结构域，特别是蜕皮激素结合结构域；或者
iv)二聚体系统，特别是基于雷帕霉素或基于雷帕霉素类似物的二聚体系统。
也就是说，在某些实施方式中，诱导剂或阻遏物分子是抗生素或抗生素衍生物。抗生素或抗生素衍生物与转录激活蛋白或阻遏蛋白的特异性结合可分别诱导或阻遏转基因的表达。起转录激活蛋白或阻遏蛋白作用的调节蛋白的众所周知的示例是包含四环素/强力霉素结合结构域、大环内酯结合结构域或普那霉素结合结构域的蛋白质。
或者，转录激活蛋白或阻遏蛋白可以包含激素结合位点。在这种情况下，转录激活蛋白或阻遏蛋白与病毒载体中所包含的转录调控元件的结合受激素与转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合的控制。起转录激活蛋白或阻遏蛋白作用的调节蛋白的众所周知的示例是包含RU486结合结构域或脱落酸结合结构域的蛋白质。
或者，转录激活蛋白或阻遏蛋白可包含类固醇结合位点。在这种情况下，转录激活蛋白或阻遏蛋白与病毒载体中所包含的转录调控元件的结合受类固醇与转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合的控制。起转录激活蛋白或阻遏蛋白作用的调节蛋白的众所周知的示例是包含蜕皮激素结合结构域的蛋白质。
在某些实施方式中，转基因的表达可以由二聚体系统控制。二聚体系统是由两种不同的蛋白质组成的转录激活蛋白。第一蛋白质包含针对病毒载体中所包含的转录调控元件的结合位点以及另外的药物结合结构域。第二蛋白质包含另一个药物结合结构域和可分别诱导或阻遏转基因表达的激活蛋白或阻遏蛋白结构域。使用二聚体系统进行激活或阻遏仅在二聚体分子存在的情况下起作用，所述二聚体分子可以由两种蛋白质的药物结合结构域特异性结合并由此使两种蛋白质紧邻，使得它们可诱导或阻遏转基因的表达。二聚体系统的众所周知的示例是基于雷帕霉素或基于雷帕霉素类似物的二聚体系统。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述病毒载体编码核糖开关，其中所述核糖开关控制编码所述治疗性蛋白或所述治疗性蛋白组合的mRNA的翻译。
替代或作为对转录调控元件的补充，根据本发明的病毒载体可以编码核糖开关，所述核糖开关控制由转基因编码的mRNA的翻译。
如本文所用，术语“核糖开关”是指RNA多核苷酸(或编码核糖开关的DNA)的调控区段。本发明上下文中的核糖开关包含传感器区域(例如，适体)和效应物茎环，所述传感器区域和效应物茎环共同负责感测配体(例如，小分子)的存在并调节定位在效应物茎环中的多腺苷酸化序列的可及性。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述治疗性多肽是
i)在细胞或组织中恢复细胞功能和/或引发细胞反应的多肽；或者
ii)使得能够实现和/或增加细胞的靶特异性的多肽。
转基因优选编码一种或多种治疗性蛋白。在本发明中，设想了两种主要类型的治疗性蛋白。
第一类治疗性蛋白是恢复靶细胞的细胞功能或在靶细胞中引发细胞反应的蛋白质。例如，已知某些疾病是由异常低水平的特定蛋白质或由特定蛋白质的无活性突变变体引起的。通过将编码此类蛋白质的功能变体的转基因递送至这些细胞，可以恢复此类细胞中的正常蛋白质功能。或者，转基因可以编码在表达转基因的细胞中或在周围组织中引发细胞反应的蛋白质。例如，转基因可以编码在靶细胞中引发特异性反应的细胞因子。此外，细胞因子可以从靶细胞中分泌出，使得所述细胞因子不仅可以在靶细胞中引发反应，而且还可以在周围组织中引起反应。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中在细胞中恢复细胞功能和/或引发细胞反应的所述多肽包含选自由以下项组成的组的一种或多种多肽的至少一个片段：PGRN、早老素1、早老素2、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、IFN-α受体、IFN-γ、IFN-γ受体、FasL/Fas、CD11b、选择蛋白例如L-选择蛋白或P-选择蛋白、PSGL(P-选择蛋白配体)、TRAIL、TRAIL-R、淋巴毒素β(LT-β)、LT-βR、诱骗受体1至3、TNF-α、TNF-αR、MSH、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL31、IL1R、IL31R、IL-10、IL-23、CXCR3配体例如CXCL9和CXCL-10、PD-1、PD-1L、PD-2(PDC2)、PD-2L、颗粒酶B、颗粒溶解素、CD11b、TIGIT、CD 112、CD 155、一氧化氮合酶、DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)、含有Jumonji结构域的蛋白1A(JMJD1A)、生长抑素、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)例如HDAC3或HDAC 9、CSF1受体(CSF1R)、IL-34、TAM、所有趋化因子和趋化因子受体、所有细胞因子和细胞因子受体。
在某些实施方式中，在细胞中恢复细胞功能和/或引发细胞反应的多肽包含由基因MAPT、C9orf72、TDP-43、FUS、CHMP2B、VCP、SQSTM1、UBQLN2、TBK1、OPTN、SOD1、SYT11、FGF20、PM20D1、BST1、GPNMB、APP、PSEN1、和/或PSEN2编码的一种或多种多肽的至少一个片段。
或者，治疗性蛋白可以是将靶细胞引导至特定位置的蛋白质。例如，治疗性蛋白可以是抗原结合分子，所述抗原结合分子将转导细胞引导至特定细胞类型或组织。例如，表达与肿瘤抗原特异性结合的蛋白质可以将转导细胞(例如免疫细胞)引导至肿瘤。在某些实施方式中，抗原结合分子可以是抗体或可以包含抗体。在某些实施方式中，抗原结合分子可以是抗体的片段或可以包含抗体的片段。在某些实施方式中，抗原结合分子可以是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中使得能够实现和/或增加细胞的靶特异性的所述多肽使得能够实现和/或增加对肿瘤抗原的特异性，特别地其中所述肿瘤抗原是VEGF、VEGF受体、金属蛋白酶拮抗剂(例如MMP-9)、CD40/CD40L、EGFR、膜联蛋白1、FGFR-1、Her2、St6galnac5、MMP1-28、TIMPS1-4、黑素转铁蛋白、α4-β1整合素、VCAM-1、E-钙粘蛋白、α-v-β3整合素、α-v-β5整合素、α-v-β6整合素、α-v-β8整合素、CCND1、BRCA、CEA、癌症相关抗原72-4(CA 72-4)、癌症相关抗原19-9(CA 19-9)、WT1、CD11b、L-选择素、NY-ESO-1，或它们的片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)PGRN或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及一种编码颗粒蛋白前体(PGRN)的病毒载体。术语“颗粒蛋白前体”、“PGRN”、“颗粒体蛋白”、“GRN”是指包含SEQ ID NO:7的蛋白质序列和/或SEQ ID NO:8的蛋白质序列、和/或SEQ IDNO:9的蛋白质序列的蛋白质，或衍生自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的蛋白质序列的长度为至少50个氨基酸的任何蛋白质片段，或与其具有大于95％的同源性的任何蛋白质序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
颗粒蛋白前体同种型1(SEQ ID NO:7)
MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
由以下DNA序列(SEQ ID NO:30)编码：
Figure BDA0003936132980000291
Figure BDA0003936132980000301
Figure BDA0003936132980000311
颗粒蛋白前体同种型2(SEQ ID NO:8)
MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
由以下DNA序列(SEQ ID NO:31)编码：
Figure BDA0003936132980000312
Figure BDA0003936132980000321
Figure BDA0003936132980000331
颗粒蛋白前体同种型3(SEQ ID NO:9)
MAITAAHGASTAVQTGDPASKDQVTTPWVPSSALIVSSNARTSPRAVLWSMAPGGAAPCPRLPAVKTGCTAVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
由以下DNA序列(SEQ ID NO:32)编码：
Figure BDA0003936132980000332
Figure BDA0003936132980000341
颗粒蛋白前体是颗粒体蛋白的前体蛋白。颗粒蛋白前体的切割产生多种有活性的6kDa颗粒体蛋白肽。这些较小的切割产物被命名为颗粒体蛋白A、颗粒体蛋白B、颗粒体蛋白C等。上皮素1和上皮素2分别与颗粒体蛋白A和颗粒体蛋白B同义。颗粒蛋白前体切割成颗粒体蛋白发生在细胞外基质或溶酶体中。弹性蛋白酶、蛋白酶3和基质金属蛋白酶是能够将颗粒蛋白前体切割成单独的颗粒体蛋白肽的蛋白酶。颗粒蛋白前体和颗粒体蛋白可以通过它们在细胞中的假设相反作用进一步区分。虽然颗粒蛋白前体与抗炎相关联，但是经切割的颗粒体蛋白肽已经与促炎性行为有关。颗粒蛋白前体(GRN)基因的突变是家族性额颞叶痴呆的主要原因。它们导致单倍体不足并因此导致颗粒蛋白前体水平的降低以及与GRN相关的脑退行性变化，这种变化会持续数年甚至数十年。在此类情况下，可以用本发明的病毒载体恢复颗粒蛋白前体水平。
颗粒蛋白前体的功能片段是与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和/或SEQ IDNO:9具有至少95％的序列同一性的至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的片段，其中所述片段具有颗粒蛋白前体活性。如果蛋白质可以被切割成至少一种颗粒体蛋白，则称所述蛋白质具有颗粒蛋白前体活性。在某些实施方式中，如果蛋白质可以被切割成颗粒体蛋白A、颗粒体蛋白B和/或颗粒体蛋白C中的至少一者，则称所述蛋白质具有颗粒蛋白前体活性。在某些实施方式中，如果蛋白质可以被切割成颗粒体蛋白A、颗粒体蛋白B和颗粒体蛋白C，则称所述蛋白质具有颗粒蛋白前体活性。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的PGRN或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的PGRN或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的PGRN或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
如本文所用的术语“骨髓特异性启动子”是指可以驱动在髓样细胞中表达的任何启动子。技术人员知道鉴定启动子是否可以驱动在髓样细胞中的表达的方法。例如，髓样细胞，例如单核细胞系THP-1，可以用编码在所讨论的启动子控制下的荧光标志物的病毒载体转导。如果在将病毒载体整合到髓样细胞的基因组中后可以在髓样细胞中检测到荧光标志物的表达，则确定所述启动子是骨髓特异性启动子。本发明含义内的骨髓特异性启动子包括但不限于miR223启动子、AIF1启动子和ITGAM启动子。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
如本文所用的术语“小胶质细胞特异性启动子”是指可以驱动在小胶质细胞中表达的任何启动子。技术人员知道鉴定启动子是否可以驱动在小胶质细胞中的表达的方法。例如，小胶质细胞，例如永生化的小胶质细胞系，可以用编码在所讨论的启动子控制下的荧光标志物的病毒载体转导。如果在将病毒载体整合到小胶质细胞的基因组中后可以在小胶质细胞中检测到荧光标志物的表达，则确定所述启动子是小胶质细胞特异性启动子。本发明含义内的小胶质细胞特异性启动子包括但不限于P2RY12启动子、TMEM119启动子、OLFML3启动子、ITGAM启动子和AIF1启动子。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的PGRN或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的PGRN或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码PGRN或其功能片段；或与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-12或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:11所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段；和/或与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码白介素-12(IL-12)的病毒载体。术语“白介素-12”或“IL-12”是指包含SEQ ID NO:11的蛋白质序列和SEQ ID NO:12的蛋白质序列的蛋白质，或衍生自蛋白质序列SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12的长度为至少50个氨基酸的任何蛋白质片段，或与其具有大于95％的同源性的任何蛋白质序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
IL-12亚基α(SEQ ID NO:11)
MCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
IL-12亚基β(SEQ ID NO:12)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
用接头连接的IL-12β和α亚基(SEQ ID NO:33)
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
优选地，本发明的病毒载体编码根据SEQ ID NO:11的多肽和根据SEQ IDNO:12的多肽两者。在某些实施方式中，两个IL-12亚基α和β可以通过接头连接。在某些实施方式中，接头具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:34)。在某些实施方式中，根据本发明的病毒载体中编码的IL-12是单链IL-12变体。本领域中已经公开了单链IL-12变体。
白介素12(IL-12)是由树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和人类B淋巴母细胞(NC-37)响应于抗原刺激而自然产生的白介素。IL-12由一束四个α螺旋构成。它是由两个单独的基因IL-12A(p35)和IL-12B(p40)编码的异二聚体细胞因子。p40的活性异二聚体(称为‘p70’)和同源二聚体是在蛋白质合成后形成的。因此，本发明的病毒载体优选地编码IL-12的α亚基(SEQ ID NO:11)和β亚基(SEQ ID NO:12)两者。白介素12(IL-12)已成为用于抗肿瘤免疫疗法最有效药剂之一。然而，与全身施用IL-12相关联的潜在致死毒性排除了其以纯细胞因子形式的临床应用。
IL-12的功能片段是与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个、至少150个或至少200个氨基酸的片段，其中所述片段具有IL-12活性。用于确定蛋白质是否具有IL-12活性的测定已在本领域中描述，例如由Peng等人，Asingle-chain IL-12IgG3 antibody fusion protein retains antibody specificityand IL-12bioactivity and demonstrates antitumor activity；J Immunol.1999年7月1日；163(1):250-8描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12，包括其单链变体或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-12或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-12或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-12或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子，或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子，或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-12或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的IL-12或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ IDNO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQIDNO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-12或其功能片段；或与SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQIDNO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ IDNO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)干扰素-γ(IFN-γ)，或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码干扰素-γ(IFN-γ)的病毒载体。术语“干扰素-γ”或“IFN-伽马”或“IFN-γ”是指SEQ ID NO:10的蛋白质序列，和/或与其序列同一性>95％同源性的任何序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQ ID NO:10)
由以下DNA序列(SEQ ID NO:35)编码：
Figure BDA0003936132980000451
Figure BDA0003936132980000461
IFN-γ是二聚化的可溶性细胞因子，其为II型干扰素的唯一成员。在人类中，IFN-γ蛋白由IFNG基因编码。IFN-γ或II型干扰素是细胞因子，所述细胞因子对于针对病毒、一些细菌和原生动物感染的先天性和适应性免疫至关重要。IFN-γ是巨噬细胞的重要激活剂和主要组织相容性复合物II类分子表达的诱导剂。异常的IFN-γ表达与许多自身炎性和自体免疫性疾病相关联。IFN-γ在免疫系统中的重要性部分源于其直接抑制病毒复制的能力，并且最重要地源于其免疫刺激和免疫调节效应。IFN-γ主要由自然杀伤细胞(naturalkiller cell,NK)和自然杀伤T细胞(natural killer T cell,NKT)作为先天免疫反应的一部分产生，并且一旦抗原特异性免疫作为适应性免疫反应的一部分发展，就由CD4 Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)效应T细胞产生。IFN-γ也由非细胞毒性先天淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)产生，ILC是2010年代初首次发现的免疫细胞家族。
IFN-γ1b被美国食品和药物管理局批准用于治疗慢性肉芽肿病和骨硬化病。它正被研究用于治疗弗里德希共济失调。尽管未经官方批准，但IFN-γ也已被证明有效治疗患有中度至重度特应性皮炎的患者。IFN-γ尚未被批准用于任何癌症免疫疗法中的治疗。然而，当将IFN-γ施用于患有膀胱癌和黑素瘤癌的患者时，观察到了提高的存活率。在卵巢癌2期和3期患者中实现了最有希望的结果。
IFN-γ的功能片段是与SEQ ID NO:10具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个或至少150个氨基酸的片段，其中所述片段具有IFN-γ活性。用于确定蛋白质是否具有IFN-γ活性的测定已在本领域中描述，例如由Corstjens等人，A user-friendly,highlysensitive assay to detect the IFN-gamma secretion by T cells；ClinBiochem.2008年4月；41(6):440-444描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的IFN-γ或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IFN-γ或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IFN-γ或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及编码IFN-γ或其功能片段的病毒载体；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的IFN-γ或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的IFN-γ或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ IDNO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
ii)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
i)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-γ或其功能片段；或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)GM-CSF或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的病毒载体。术语“GM-CSF”是指SEQ ID NO:13的蛋白质序列，和/或与其序列同一性>95％同源性的任何序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO:13)
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的单体糖蛋白，所述单体糖蛋白用作细胞因子。天然存在的GM-CSF的药物类似物被称为沙格司亭(sargramostim)和莫拉司亭。与专门促进嗜中性粒细胞增殖和成熟的粒细胞集落刺激因子不同，GM-CSF影响更多的细胞类型，尤其是巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。GM-CSF是一种单体糖蛋白，所述单体糖蛋白用作细胞因子—其是一种白细胞生长因子。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞退出循环并迁移到组织中，然后它们成熟为巨噬细胞和树突细胞。因此，GM-CSF是免疫/炎症级联的一部分，通过所述免疫/炎症级联激活少量巨噬细胞可以迅速导致巨噬细胞数量增加，这是对抗感染的关键过程。
GM-CSF的功能片段是与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个或至少140个氨基酸的片段，其中所述片段具有GM-CSF活性。用于确定蛋白质是否具有GM-CSF活性的测定已在本领域中进行了描述，例如由Singh等人，GM-CSF Enhances Macrophage Glycolytic Activity In Vitro andImproves Detection of Inflammation In Vivo；J Nucl Med.2016年9月；57(9):1428-35.doi:10.2967/jnumed.115.167387.电子出版2016年4月14日描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的GM-CSF或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的GM-CSF或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的GM-CSF或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子，或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)AIF1启动子，或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及编码GM-CSF或其功能片段的病毒载体；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的GM-CSF或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的GM-CSF或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ IDNO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)G-CSF或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的病毒载体。术语“G-CSF”是指SEQ ID NO:14的蛋白质序列，和/或与其序列同一性>95％同源性的任何序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQ ID NO:14)
粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)，也称为集落刺激因子3(CSF3)，是一种糖蛋白，其刺激骨髓产生粒细胞和干细胞并将所述粒细胞和干细胞释放到血液中。在功能上，它是细胞因子和激素、一类集落刺激因子，并且由许多不同的组织产生。天然存在的G-CSF的药物类似物被称为非格司亭和来格司亭。G-CSF还刺激嗜中性粒细胞前体和成熟的嗜中性粒细胞的存活、增殖、分化和功能。
化疗可导致骨髓抑制和不可接受的低水平白细胞(白细胞减少症)，使患者容易感染和患败血症。G-CSF刺激粒细胞的产生，粒细胞是一种白细胞。在肿瘤学和血液学中，重组形式的G-CSF用于某些癌症患者以加速康复并降低化疗后嗜中性粒细胞减少症的死亡率，从而允许更高强度的治疗方案。在阿尔茨海默氏病小鼠模型中，G-CSF已被证明减轻炎症、减少淀粉样蛋白β负担并逆转认知障碍。由于其神经保护性质，G-CSF目前正处于临床IIb期脑缺血研究中，并发表了几项针对其他神经系统疾病(例如肌萎缩侧索硬化症)的临床初步研究。
G-CSF的功能片段是与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个、至少120个、至少140个、至少160个或至少180个氨基酸的片段，其中所述片段具有G-CSF活性。用于确定蛋白质是否具有G-CSF活性的测定已在本领域中描述，例如由Mickiene等人，Human granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF)/stem cell factor(SCF)fusion proteins:design,characterization and activity；PeerJ.2020；8:e9788描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的G-CSF或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的G-CSF或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的G-CSF或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)ITGAM启动子，或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)AIF1启动子，或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的G-CSF或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的G-CSF或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF或其功能片段；或与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)GM-CSF和IFN-γ，或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段；以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段；或者
c)与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体的病毒载体。所述共表达构建体可以编码如上定义的GM-CSF或其任何功能片段或变体。所述共表达构建体可以进一步编码如上定义的INF-γ或其任何功能片段或变体。GM-CSF和INF-γ，以及它们的功能片段或变体，可以表达为与本发明的病毒载体分离的多肽。在某些实施方式中，GM-CSF和INF-γ可以表达为融合蛋白。
用于GM-CSF-INF-γ共表达的示例性核酸序列可包含以下核酸序列：
TCCTTCCAGCCATGTTTAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCCGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAGAACTTTAAGGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCGAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAAGATATCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGATACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAATGTGGCCACTGCAAAGTCTGCTTTTGCTGGGCACCGTAGCTTGTAGCATATCAGCGCCTGCTCGGAGTCCCTCTCCATCAACGCAACCCTGGGAACACGTGAACGCAATTCAGGAGGCAAGAAGGTTGCTGAACCTGAGCCGGGACACCGCCGCTGAAATGAATGAAACCGTAGAAGTGATTTCCGAGATGTTTGACCTCCAAGAACCAACTTGTCTGCAAACAAGACTTGAGCTTTATAAACAGGGACTCCGAGGCAGCCTGACAAAACTCAAGGGGCCCCTCACAATGATGGCAAGCCATTATAAACAACACTGTCCTCCGACCCCGGAGACTTCTTGCGCCACACAGATCATCACTTTTGAGAGCTTCAAAGAGAACCTTAAAGACTTTCTGCTGGTCATTCCGTTCGATTGCTGGGAACCCGTGCAGGAGTGA(SEQ ID NO:15)
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或编码与SEQ IDNO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包括：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ IDNO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ IDNO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ IDNO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ IDNO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ IDNO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段体；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子，或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码GM-CSF-INF-γ共表达构建体；或与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或编码其功能片段，以及与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子，或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)G-CSF和IFN-γ，或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段；以及与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段；或者
c)与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码G-CSF-INF-γ共表达构建体的病毒载体。所述共表达构建体可以编码如上定义的G-CSF或其任何功能片段或变体。所述共表达构建体可以进一步编码如上定义的INF-γ或其任何功能片段或变体。G-CSF和INF-γ，以及它们的功能片段或变体，可以表达为与本发明的病毒载体分离的多肽。在某些实施方式中，G-CSF和INF-γ可以表达为融合蛋白。
本文还提供了编码所述共表达构建体的核酸序列。
示例性G-CSF-INF-γ共表达构建体可包含以下核酸序列：
TCCTTCCAGCCATGTTTAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCCGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAGAACTTTAAGGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCGAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAAGATATCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGATACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAATGGCCGGCCCCGCCACCCAGAGCCCCATGAAGCTGATGGCCCTGCAGCTGCTGCTGTGGCACAGCGCCCTGTGGACCGTGCAGGAGGCCACCCCCCTCGGCCCCGCCAGCAGCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTGAAGTGCCTCGAACAAGTGCGCAAGATACAAGGCGACGGCGCCGCCCTGCAGGAGAAGCTCGTGAGCGAGTGCGCCACCTACAAGCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTGGGCCACAGCCTCGGCATCCCCTGGGCCCCCCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAAGCCCTGCAGCTGGCCGGCTGCCTGAGCCAGCTGCACAGCGGCCTGTTCCTGTACCAAGGCTTACTACAGGCCCTCGAAGGCATCAGCCCCGAGCTGGGCCCCACCCTCGACACCCTGCAGCTGGACGTGGCCGACTTCGCCACCACCATCTGGCAGCAGATGGAGGAGCTGGGCATGGCCCCCGCCCTGCAGCCCACCCAAGGCGCCATGCCCGCCTTCGCCAGCGCCTTCCAGCGCCGCGCCGGGGGCGTGCTGGTGGCCAGCCACCTGCAGAGCTTCCTCGAAGTGAGCTACCGCGTGCTGCGCCACCTCGCCCAGCCC TGA(SEQ ID NO:16)
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码包含与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，并且编码与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包括：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ IDNO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ IDNO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ IDNO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子，或与SEQ IDNO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ IDNO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子，或与SEQ IDNO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子，或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码G-CSF-INF-γ共表达构建体或其功能片段；或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列，或其功能片段；或编码与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一多肽，或其功能片段，以及与SEQ IDNO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子，或与SEQ IDNO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子，或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-2或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码白介素-2(IL-2)的病毒载体。术语“IL-2”是指SEQ ID NO:17的蛋白质序列，和/或与其序列同一性>95％同源性的任何序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:17)
白介素2(IL-2)是一种白介素，是免疫系统中的一种类型的细胞因子信号传导分子。它是调节负责免疫的白细胞(白细胞，通常是淋巴细胞)的活动的15.5-16kDa蛋白质。IL-2是身体对微生物感染的自然反应的一部分，用于区分外来(“非自身”)和“自身”。IL-2通过结合至由淋巴细胞表达的IL-2受体来介导其效应。IL-2的主要来源是活化的CD4+T细胞和活化的CD8+T细胞。
阿地白介素是重组白介素-2的一种形式。它是使用重组DNA技术制造的，并且作为蛋白质治疗剂销售并以普留净(Proleukin)为品牌。它已被美国食品和药物管理局(FDA)和几个欧洲国家批准用于以大间歇剂量治疗癌症(恶性黑素瘤、肾细胞癌)，并已被以连续剂量广泛使用。
IL-2的功能片段是与SEQ ID NO:17具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个或至少140个氨基酸的片段，其中所述片段具有IL-2活性。用于确定蛋白质是否具有IL-2活性的测定已在本领域中描述，例如由Leivestad等人，A simple and sensitive bioassay for the detection of IL-2activity；JImmunol Methods.1988年11月10日；114(1-2):95-9.doi:10.1016/0022-1759(88)90159-7描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-2或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-2或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-2或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及编码IL-2或其功能片段的病毒载体；或与SEQID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及编码IL-2或其功能片段的病毒载体；或与SEQID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-2或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的IL-2或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-2或其功能片段；或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-15或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码白介素-15(IL-15)的病毒载体。术语“IL-15”是指SEQ ID NO:18的蛋白质序列，和/或与其序列同一性>95％同源性的任何序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:18)
白介素15(IL-15)是一种与白介素2(IL-2)结构相似的细胞因子。与IL-2一样，IL-15与由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和常见的γ链(γ-C、CD132)构成的复合物结合并经由该复合物发信号。IL-15在病毒感染后由单核吞噬细胞(和一些其他细胞)分泌。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞(即先天免疫系统的细胞)的增殖，自然杀伤细胞的主要作用是杀死被病毒感染的细胞。IL-15调节T细胞和自然杀伤(NK)细胞的活化和增殖。在没有抗原的情况下维持记忆T细胞的存活信号由IL-15提供。这种细胞因子也与NK细胞发育有关。在啮齿动物淋巴细胞中，IL-15通过诱导BCL2L1/BCL-x(L)(细胞凋亡途径的抑制剂)来防止细胞凋亡。在患有乳糜泻的人中，IL-15通过诱导Bcl-2和/或Bcl-xL类似地抑制T淋巴细胞的凋亡。
在临床前模型中，IL-15已被证明增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫力。一项评估IL-15在患有转移性黑素瘤和肾细胞癌(肾癌)的患者中的安全性、投配和抗肿瘤功效的I期临床试验已开始在国立卫生研究院(National Institutes of Health)招募患者。
IL-15的功能片段是与SEQ ID NO:18具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个或至少140个氨基酸的片段，其中所述片段具有IL-15活性。用于确定蛋白质是否具有IL-15活性的测定已在本领域中进行了描述，例如由Hu等人，Discovery of a novel IL-15based protein with improved developabilityand efficacy for cancer immunotherapy；Sci Rep.2018年5月16日；8(1):7675.doi:10.1038/s41598-018-25987-4描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-15或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-15或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-15或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-15或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的IL-15或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-15或其功能片段；或与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-21或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码白介素-21(IL-21)的病毒载体。术语“IL-21”是指SEQ ID NO:19的蛋白质序列，和/或与其序列同一性>95％同源性的任何序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO:19)
白介素-21(IL-21)是一种对免疫系统的细胞具有强大的调节效应的细胞因子，所述免疫系统的细胞包括可以破坏被病毒感染的细胞或癌细胞的自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞。这种细胞因子在其靶细胞中诱导细胞分裂/增殖。
报道了IL-21在调节人类T细胞的分化编程中的作用，其中它显示为丰富集具有独特的CD28+CD127hi CD45RO+表型和IL-2生产能力的中枢记忆型CTL群体。在IL-21存在下通过引发生成的肿瘤反应性抗原特异性CTL导致了稳定的‘辅助者非依赖性’表型。还注意到IL-21通过持续和增加的CD8+细胞反应以实现持久的肿瘤免疫力而具有抗肿瘤效应。
IL-21被批准用于转移性黑素瘤(MM)和肾细胞癌(RCC)患者中的1期临床试验。它被证明对于施用是安全的，具有作为副作用的流感样症状。剂量限制性毒性包括低淋巴细胞、嗜中性粒细胞和血小板计数以及肝毒性。根据实体瘤反应评估标准(ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumor,RECIST)反应量表，47名MM患者中的2名和19名RCC患者中的4名分别表现出完全和部分反应。此外，存在外周NK细胞和CD8+T细胞中的穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ和CXCR3 mRNA的增加。这表明IL-21增强了CD8+效应子功能，由此导致抗肿瘤反应。IL-21进入2期临床试验，在所述2期临床试验中将IL-21单独施用或与如索拉非尼和利妥昔单抗的药物联合施用。
IL-21的功能片段是与SEQ ID NO:19具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个或至少140个氨基酸的片段，其中所述片段具有IL-21活性。用于确定蛋白质是否具有IL-21活性的测定已经在本领域中进行了描述，例如由Maurer等人，Generation and characterization of human anti-human IL-21neutralizing monoclonal antibodies；MAbs.2012年1月至2月；4(1):69-83描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-21或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-21或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IL-21或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的IL-21或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的IL-21或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IL-21或其功能片段；或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IFN-α或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及编码干扰素-α(IFN-α)的病毒载体。术语“IFN-α”是指SEQ ID NO:20的蛋白质序列，和/或与其序列同一性>95％同源性的任何序列。本文还提供了编码所述蛋白质的核酸序列。
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQ ID NO:20)
人干扰素α-2(IFNα2)是属于I型IFN家族的细胞因子。IFNα2是一种由被病毒感染的细胞分泌并作用于其他细胞以抑制病毒感染的蛋白质。
如果口服给予，则IFNα2会被消化酶降解并且不再具有活性。因此，IFNα2主要通过基本上皮下或肌内注射施用。一旦进入血液，IFNα2就会被肾脏迅速消除。由于IFNα2在生物体中的短寿命，因此需要每周注射几次。聚乙二醇干扰素α-2a和聚乙二醇干扰素α-2b(与IFNα2连接的聚乙二醇)是长效IFNα2制剂，其使得能够每周注射单次。
重组IFNα2(α2a和α2b)已被证明在被诊断为患有一些病毒感染(例如慢性病毒性乙型肝炎和丙型肝炎)或一些类型的癌症(黑素瘤、肾细胞癌和各种血液恶性肿瘤)的患者的治疗中的效率。
IFN-α的功能片段是与SEQ ID NO:20具有至少95％序列同一性的至少50个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个或至少140个氨基酸的片段，其中所述片段具有IFN-α活性。用于确定蛋白质是否具有IFN-α活性的测定已在本领域中描述，例如由Moll等人The differential activity of interferon-αsubtypes is consistent amongdistinct target genes and cell types；Cytokine.2011年1月；53(1):52-59描述。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述一种或多种启动子包含：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，在某些实施方式中，如上文所公开的IFN-α或其功能片段或突变变体可以从骨髓特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IFN-α或其功能片段或突变变体可以从小胶质细胞特异性启动子或从其功能片段表达。在其他实施方式中，如上文所公开的IFN-α或其功能片段或突变变体可以从融合启动子表达，优选地其中所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
第二启动子可以是本领域中已知的任何启动子。然而，在某些实施方式中，如上文所公开的IFN-α或其功能片段或突变变体可以从包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。也就是说，上文所公开的任何骨髓特异性启动子可以以任何次序与上文所公开的任何小胶质细胞特异性启动子组合。
在某些实施方式中，如上所公开的IFN-α或其功能片段或突变变体可以从包含miR223、其功能片段或具有miR223功能性的启动子和小胶质细胞特异性启动子的融合启动子表达。
也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述第一启动子是ITGAM启动子，或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:28具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种病毒载体，所述病毒载体编码IFN-α或其功能片段；或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，或其功能片段，其中所述启动子是融合启动子，所述融合启动子包含(a)miR233启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和(b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某些实施方式中，所述融合启动子包含与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述一种或多种启动子包括：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
也就是说，上文所公开的转基因，或其功能片段或变体中的任一者，可以可操作地连接至一个或多个启动子。在某些实施方式中，上文所公开的转基因或其功能片段或变体可以可操作地连接至骨髓特异性启动子或其功能片段。在某些实施方式中，上文所公开的转基因或其功能片段或变体可以可操作地连接至小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。在某些实施方式中，上文所公开的转基因或其功能片段或变体可以可操作地连接至融合启动子，所述融合启动子包含骨髓特异性或小胶质细胞特异性启动子或其功能片段和第二启动子。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
如本文所用的术语“骨髓特异性启动子”是指可以驱动在髓样细胞中表达的任何启动子。技术人员知道鉴定启动子是否可以驱动在髓样细胞中的表达的方法。例如，髓样细胞，例如单核细胞系THP-1，可以用编码在所讨论的启动子控制下的荧光标志物的病毒载体转导。如果在将病毒载体整合到髓样细胞的基因组中后可以在髓样细胞中检测到荧光标志物的表达，则确定所述启动子是骨髓特异性启动子。本发明含义内的骨髓特异性启动子包括但不限于miR223启动子、AIF1启动子和ITGAM启动子。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
如本文所用的术语“小胶质细胞特异性启动子”是指可以驱动在小胶质细胞中表达的任何启动子。技术人员知道鉴定启动子是否可以驱动在小胶质细胞中的表达的方法。例如，小胶质细胞，例如永生化的小胶质细胞系，可以用编码在所讨论的启动子控制下的荧光标志物的病毒载体转导。如果在将病毒载体整合到小胶质细胞的基因组中后可以在小胶质细胞中检测到荧光标志物的表达，则确定所述启动子是小胶质细胞特异性启动子。本发明含义内的小胶质细胞特异性启动子包括但不限于P2RY12启动子、TMEM119启动子、OLFML3启动子、ITGAM启动子和AIF1启动子。
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
也就是说，融合启动子可优选地包含骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子。在某些实施方式中，小胶质细胞特异性启动子融合至骨髓特异性启动子的5′端。在某些实施方式中，小胶质细胞特异性启动子融合至骨髓特异性启动子的3′端。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。在某个实施方式中，根据本发明的病毒载体包含与SEQ ID NO:28所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述病毒载体包含至少一种转录调控元件，并且其中所述至少一种转录调控元件被布置成使得其抑制或激活所述启动子的转录活性。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述至少一种转录调控元件包含用于转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合位点，特别地其中所述转录激活蛋白或阻遏蛋白包含：
i)抗生素结合结构域，特别是四环素/强力霉素结合结构域、大环内酯结合结构域或普那霉素结合结构域；
ii)激素结合结构域，特别是RU486结合结构域或脱落酸结合结构域；
iii)类固醇结合结构域，特别是蜕皮激素结合结构域；
iv)二聚体系统，特别是基于雷帕霉素或基于雷帕霉素类似物的二聚体系统。
在一个具体实施方式中，根据本发明的病毒载体，其中所述病毒载体编码核糖开关，并且其中所述核糖开关控制编码所述治疗性蛋白或所述治疗性蛋白组合的mRNA的翻译。
也就是说，编码上文所公开的转基因或其功能片段或变体中的任一者的病毒载体可以包含允许控制转基因表达的调控元件。优选地，调控元件是本文别处所公开的任何调控元件。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述病毒载体是
a)逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体，更特别是慢病毒SIN载体；或者
b)泡沫病毒载体；或者
c)病毒载体，所述病毒载体选自由以下项组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、细小病毒载体、冠状病毒载体和α-逆转录病毒载体。
根据本发明的病毒载体可以是允许将转基因递送至哺乳动物细胞，或优选递送至人类细胞的任何类型的病毒载体。
在某些实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体。如本文所用，术语“逆转录病毒”是指由病毒来源的外包膜糖蛋白壳组成的病毒，所述外包膜糖蛋白壳包括但不限于水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)糖蛋白(vesicular stomatitis virusglycoprotein,VSVG)，所述VSVG具有膜融合活性、包封病毒RNA；以及将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝以及随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中所必需的病毒蛋白。
逆转录病毒是用于基因传递的常用工具(Miller,2000,Nature.357:455-460)。一旦病毒整合到宿主基因组中，它就被称为“前病毒”。前病毒作为RNA聚合酶II的模板并指导RNA分子的表达，所述RNA分子编码产生新病毒粒子所需的结构蛋白和酶。示例性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus,MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(Harvey murinesarcoma virus,HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(murine mammary tumor virus,MuMTV)、长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus,GaLV)、猫白血病病毒(feline leukemiavirus,FLV)、泡沫病毒属、弗云德鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus)、鼠干细胞病毒(Murine Stem Cell Virus,MSCV)和劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus,RSV)和慢病毒。
如本文所用，术语“慢病毒”是指一组(或属)复杂的逆转录病毒。示例性慢病毒包括但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；visna-maedi病毒(visna-maedi virus,VMV)病毒；山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)；马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)；猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,FIV)；牛免疫缺陷病毒(bovine immune deficiencyvirus,BIV)；和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)。在一个实施方式中，基于HIV的载体骨架(即，HIV顺式作用序列元件)是优选的。
术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。经转移的核酸通常连接至载体核酸分子，即插入到载体核酸分子中。载体可以包括在细胞中指导自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
在本发明中，病毒载体用于转导靶细胞。术语“转导”涉及条件的生成，所述条件的目的是并允许使病毒载体与靶细胞物理接触，之后将病毒核酸引入靶细胞，并且在逆转录病毒的情况下，将其逆转录为DNA并整合到靶细胞的基因组中。
术语“慢病毒载体”可用于指慢病毒感染性粒子，所述慢病毒感染性粒子由病毒包膜糖蛋白装饰的生物膜组成或仅由具有膜融合潜力的没有病毒包膜蛋白壳的生物膜组成，所述生物膜包裹着由慢病毒蛋白形成的慢病毒衣壳结构，其中衣壳结构包裹着逆转录和稳定整合到靶细胞基因组中所必需的慢病毒RNA和慢病毒蛋白。
慢病毒载体使得能够将编码治疗性多肽的核酸分子递送至分裂和/或非分裂的细胞中。慢病毒载体可用于体外转导以及用于体内注射，而AAV感染性粒子可用于通过体内注射将DNA递送到非分裂细胞中。
优选地，根据本发明的病毒载体是自灭活慢病毒载体。“自灭活”(SIN)载体是复制缺陷型载体，例如病毒或慢病毒载体，其中右侧(3′)LTR增强子-启动子区，称为U3区，已经被修饰(例如，通过缺失和/或取代)以防止病毒转录超出第一轮病毒复制。因此，载体只能感染并随后整合到宿主基因组中一次，而不能进一步传代。这是因为在病毒复制期间右侧(3′)LTR U3区域被用作左侧(5′)LTR U3区域的模板，并且因此在没有U3增强子-启动子的情况下，就无法制成病毒转录物。如果未制成病毒转录物，就不能加工或包装成病毒体，病毒的生命周期也就结束了。
在某些实施方式中，病毒载体可以是泡沫病毒载体。如本文所用，术语“泡沫病毒载体”是指采用泡沫病毒衍生的部分的病毒载体。用于开发病毒载体的方法是技术人员已知的(例如，Mergia,A和M Heinkelein,2003,Current topics in microbiology andimmunology vol.277:131-59)。
在某些实施方式中，病毒载体选自由以下项组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、细小病毒载体、冠状病毒载体和α-逆转录病毒载体。
如本文所用，术语“腺病毒载体”是指含有主要来源于腺病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。
如本文所用，术语“腺病毒”是指腺病毒科的成员。腺病毒科通常是中等大小(90-100nm)、无包膜(没有外部脂质双层)的病毒，其具有含有双链DNA基因组的二十面体核衣壳。用于获得腺病毒载体的方法是技术人员已知的(参见例如，Kamen,A.和Henry,O.,2004,The Journal of Gene Medicine:Across-disciplinary journal for research on thescience of gene transfer and its clinical applications,6(S1),S184-S192；Volpers,C.和Kochanek,S.,2004,The Journal of Gene Medicine:A cross-disciplinary journal for research on the science of gene transfer and itsclinical applications,6(S1),S164-S171)。
如本文所用，术语“疱疹病毒载体”是指含有主要来源于疱疹病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。如本文所用，术语“疱疹病毒”是指来自单纯病毒属的任何病毒。用于获得疱疹病毒载体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Logvinoff,Carine和Alberto L.Epstein,2001,Human gene therapy 12.2:161-167)。
如本文所用，术语“α-逆转录病毒载体”是指含有主要来源于α-逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。如本文所用，术语“α-逆转录病毒”是指来自α逆转录病毒属的任何病毒。用于获得α-逆转录病毒载体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Garoff、Henrik、和Kejun Li,1998,Gene Therapy.61-69)。
在某些实施方式中，病毒载体可以是腺相关病毒(adeno-associated viral,AAV)载体。目前有两类使用中的重组AAV(recombinant AAV,rAAV)：单链AAV(ssAAV)和自互补AAV(self-complementary AAV,scAAV)。ssAAV被包装为有义(正链)或反义(负链)基因组。
也就是说，在某些实施方式中，病毒载体是基于DNA的病毒载体。在此类实施方式中，病毒DNA可以直接整合到靶细胞的基因组中，而无需进行病毒DNA的逆转录。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种融合启动子，所述融合启动子包含
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；
其中所述miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段，其可操作地连接至小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
启动子miR223由于其对细胞分化时的甲基化的抗性而对于在靶向HSC或角质形成细胞的细胞和基因疗法应用中使用显示出巨大的潜力。在某些实施方式中，启动子miR223或其功能片段或变体可融合至第二启动子，优选小胶质细胞特异性启动子。
因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的融合启动子，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
d)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
e)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子和P2RY12启动子。也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及一种融合启动子，所述融合启动子包含
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，根据本发明的miR223-P2RY12融合启动子包含如SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，根据本发明的miR223-P2RY12融合启动子包含与如SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27所示的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子和TMEM119启动子。也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及一种融合启动子，所述融合启动子包含
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及
b)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，根据本发明的miR223-TMEM119融合启动子包含如SEQ IDNO:28所示的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，根据本发明的miR223-TMEM119融合启动子包含与如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子和OLFML3启动子。也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及一种融合启动子，所述融合启动子包含
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及
b)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，根据本发明的miR223-OLFML3融合启动子包含如SEQ IDNO:29所示的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，根据本发明的miR223-OLFML3融合启动子包含与如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子和AIF1启动子。也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及一种融合启动子，所述融合启动子包含
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及
b)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在某些实施方式中，融合启动子包含miR223启动子和ITGAM启动子。也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及一种融合启动子，所述融合启动子包含
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及
b)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的融合启动子，其中所述融合启动子包含至少一种转录调控元件，其中所述至少一种转录调控元件被布置成使得其抑制或激活所述启动子的转录活性。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的融合启动子，其中所述至少一种转录调控元件包含用于转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合位点，特别地其中所述转录激活蛋白或阻遏蛋白包含：
i)抗生素结合结构域，特别是四环素/强力霉素结合结构域、大环内酯结合结构域或普那霉素结合结构域；
ii)激素结合结构域，特别是RU486结合结构域或脱落酸结合结构域；
iii)类固醇结合结构域，特别是蜕皮激素结合结构域；
iv)二聚体系统，特别是基于雷帕霉素或基于雷帕霉素类似物的二聚体系统。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的融合启动子，其中所述病毒载体编码核糖开关，并且其中所述核糖开关控制编码所述治疗性蛋白或所述治疗性蛋白组合的mRNA的翻译。
也就是说，本发明的融合启动子可以包含允许以更精确的方式控制转基因表达的调控元件。优选地，调控元件是本文别处所公开的任何调控元件。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的融合启动子，其中所述融合启动子
a)包含SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:29所示的序列中的任何一种序列：或者
b)包含与SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:29所示的序列中的任何一种序列具有90％、91％、92％、93％、94％或95％序列同一性的序列，其中所述启动子驱动在小胶质细胞和/或髓样细胞中的表达。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的融合启动子，其中所述融合启动子
a)包含如SEQ ID NO:28所示的序列：或者
b)包含与SEQ ID NO:28所示的序列具有90％、91％、92％、93％或95％序列同一性的序列，其中所述启动子驱动在小胶质细胞和/或髓样细胞中的表达。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明的病毒载体。
也就是说，本发明还涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的病毒载体。在某些实施方式中，所述宿主细胞可以是用于产生根据本发明的病毒载体的细胞。例如，宿主细胞可以是HEK293T细胞。在某些实施方式中，宿主细胞可以是被感染性病毒粒子感染的细胞(例如HSC)或其包含与其病毒产生能力无关的病毒核酸的子代细胞(例如巨噬细胞)。
如果宿主细胞已经用编码用于产生病毒载体的遗传元件的质粒转染，并且所述质粒已经整合到宿主细胞的基因组中成为“稳定产生的细胞”，则所述宿主细胞也被认为包含根据本发明的病毒载体。因此，病毒载体不一定必须是环状形式才能被包含在宿主细胞中。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是造血干细胞，优选地CD34阳性富集细胞群的造血干细胞，或其中所述宿主细胞是髓样细胞。也就是说，在某些实施方式中，宿主细胞可以是转导的造血干细胞，优选地CD34阳性富集细胞群的造血干细胞，或转导的髓样细胞。具体地，用于治疗和/或预防本文所公开的任何疾病和/或疾患的宿主细胞优选是转导的造血干细胞，优选地CD34阳性富集细胞群的造血干细胞，或转导的髓样细胞。
在某些实施方式中，宿主细胞可以是造血干细胞。也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及已经用本文所公开的任何病毒载体转导的造血干细胞。
与术语“HSC”或“HSPC”相同的术语“造血干细胞”涉及在但不限于骨髓抽吸、干细胞动员后的单采术时获得的或从(脐)带血获得的任何细胞群，和/或涉及其中通过任何方法(为但不限于CD34阳性和/或CD133阳性细胞标记和富集，或通过以本领域已知的任何方法对谱系阳性细胞进行耗竭)富集了CD34阳性或CD133阳性细胞的任何细胞群。
如本文所用，“CD34阳性富集的”表示该群体包含比在富集步骤之前的细胞群体中发现的更高数量和/或更高百分的CD34阳性细胞。各种用于CD34阳性细胞富集的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Baldwin,K.等人，2015,Stem cells,33(5),1532-1542；Wojciechowski,Joel C等人，2008,British journal of haematology，第140卷，6 673-81；Gori,J.L.等人，2012,Blood,The Journal of the American Society ofHematology,120(13),e35-e44；Kilic,P.等人，2019,Cells Tissues Organs,207(1),15-20)。
在一个优选实施方式中，宿主细胞是富集的CD34阳性骨髓细胞群中的细胞。在一个更优选的实施方式中，宿主细胞是富集的CD34阳性骨髓细胞群中的造血干祖细胞。在最优选的实施方式中，宿主细胞是富集的CD34阳性骨髓细胞群中的造血干细胞。
在其他实施方式中，宿主细胞可以是髓样细胞。也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及已用本文所公开的任何病毒载体转导的粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞、枯氏细胞或肥大细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是巨噬细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是单核细胞。在另外的实施方式中，宿主细胞是小胶质细胞。
技术人员知道富集和/或鉴定以上所公开的细胞类型并用病毒载体转导所述细胞类型的方法。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的病毒载体和/或根据本发明的宿主细胞。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所公开的任何一种病毒载体和/或本文所公开的任何一种宿主细胞。
在某些实施方式中，所述药物组合物包含根据本发明的病毒载体。在此类实施方式中，所述药物组合物优选用于体外转导靶细胞，例如造血干细胞。或者，可将药物组合物直接施用于有需要的受试者，使得药物组合物中所包含的病毒载体在体内转导靶细胞。技术人员知道适用于在体内靶向特定靶细胞群的病毒载体。技术人员还知道在药物组合物中配制病毒载体的方法。
在其他实施方式中，所述药物组合物包含宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明的病毒载体。此类宿主细胞可以通过用根据本发明的任何一种载体转导宿主细胞来获得。可以将包含转导的宿主细胞的药物组合物施用于有需要的受试者。技术人员知道在药物组合物中配制转导的宿主细胞的方法。
如本文所用的术语“药物组合物”意指由本身药学上可接受的单独组分的组合产生的组合物。例如，在预计静脉内或鞘内施用的情况下，所述组分是对于静脉内或鞘内施用来说适合或可接受的(在质量和数量两者方面)。技术人员知晓适用于分别配制病毒载体和宿主细胞的药学上可接受的组分。
在某些实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的病毒载体和/或根据本发明的宿主细胞；以及至少一种另外的治疗剂。
如本文所用，术语“治疗剂”是指在以治疗有效量施用于受试者时向所述受试者提供治疗益处的化合物或物质组合物。治疗剂可以是用于治疗、控制或预防疾病或医学病症的任何类型的药物、药品、药剂、激素、抗生素、蛋白质、基因、生长因子和/或生物活性材料。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物(和任何另外的治疗剂)是以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用的。在本文上下文中考虑的因素包括正在治疗的特定疾患、正在治疗的特定受试者、受试者的临床状况、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
根据本发明的病毒载体和/或根据本发明的宿主细胞不需要但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的其他治疗剂一起配制在药物组合物中。
本发明的载体可以肠胃外地，优选血管内(包括静脉内)和鞘内地施用于受试者。当肠胃外地施用时，优选的是载体在适合注射的药物媒介物(例如无菌水溶液或分散体)中给予。在施用后，监测受试者以检测基因表达的变化。治疗的剂量和持续时间是取决于要治疗的病症或疾病单独确定的。可以基于通过在本发明的载体中施用感兴趣的基因而产生的基因表达来治疗多种病症或疾病。使用本发明的方法递送的载体剂量将取决于期望的所使用的宿主和载体的反应而变化。
在本发明中，设想将根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物施用到受试者的血流中或脑脊液中(或脑组织中)。如本文所用，将宿主细胞“引入受试者的血流中”应包括但不限于通过注射将此类细胞引入受试者的静脉或动脉之一。此类施用也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时段内执行。单次注射是优选的，但是在一些情况下可能需要加时(例如，每季度、每半年或每年)重复注射。此类施用也优选使用宿主细胞和药学上可接受的载剂的掺和物执行。药学上可接受的载剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于0.01-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。此外，此类药学上可接受的载剂可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液和悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，例如林格氏葡萄糖、基于林格氏葡萄糖的那些等等。常用于静脉注射(i.v.)施用的流体见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版，第808页，Lippincott Williams&Wilkins(2000)中。还可能存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
本文优选的是将根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物施用到受试者的血流中。然而，根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物也可以直接施用于靶组织。也就是说，在某些实施方式中，可以将根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物直接注射到脑中。或者，根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物可以通过直接CNS注射、注射到CSF中、鞘内注射和/或血管内施用来施用。
或者，可以将根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物直接施用到肿瘤中。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于药物中。
也就是说，根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物可以用于治疗有需要的受试者。如本文所用的术语“治疗(treatment)”包括预防性(例如，预防性的)、治愈性或姑息性治疗，并且如本文所用的“治疗(treating)”也包括预防性、治愈性和姑息性治疗。如本文所用的术语“受试者”涉及动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于治疗起源于或表现在脑中或是基于脑的疾病或疾患。
由于血脑屏障的选择性渗透性，所以靶向脑细胞以进行治疗性治疗是挑战性的。在本发明中，本发明人通过细胞和基因疗法靶向脑的疾病或疾患。为此，造血干细胞或包含造血干细胞的细胞群可以用本文所公开的任何一种病毒载体转化，并施用于患有脑疾病或疾患的受试者。造血干细胞可以在血流中循环并且能够跨越血脑屏障，尤其是在进行治疗相关的照射或通过例如白消安施用进行化疗时血脑屏障的暂时渗漏期间。一旦在脑内，造血干细胞就可以分化成显示出小胶质细胞特征的巨噬细胞并且可以替代脑中的小胶质细胞(Speicher等人，Generating microglia from human pluripotent stem cells:novelin vitro models for the study of neurodegeneration；MolecularNeurodegeneration；14，文章编号46(2016))。本发明的病毒载体特别适合于靶向脑，因为所述病毒载体已被证明在巨噬细胞和小胶质细胞中都有活性。
虽然优选将包含根据本发明的病毒载体的造血干细胞施用到有需要的受试者的血流中，但也可以将根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物直接施用到脑中(颅内地)。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于预防和/或治疗PGRN相关疾病或疾患，特别地其中所述病毒载体编码PGRN或其功能片段。
不同的疾病和疾患已被报道是由颗粒蛋白前体的异常表达引起的。特别地，PGRN基因的突变已被报道为各种神经退行性疾病或疾患的原因。因此，根据本发明的病毒载体可用于恢复患有PGRN相关疾病或疾患的受试者脑中的颗粒蛋白前体水平。为此，优选的是病毒载体中所编码的转基因是PGRN基因或编码具有PGRN功能性并且与SEQ ID NO:7、SEQID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽的多核苷酸。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述PGRN相关疾病或疾患是神经退行性疾病或疾患。
也就是说，PGRN相关疾病可能是神经退行性疾病或疾患。在本发明中，神经退行性疾病或疾患优选是与异常PGRN表达相关联的神经退行性疾病或疾患。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述神经退行性疾病或疾患是额颞叶退行性疾病或疾患。在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述退行性疾病或疾患选自由以下项组成的组：阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、神经元蜡样脂褐质沉积症和帕金森氏病。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述额颞叶退行性疾病或疾患是额颞叶痴呆。优选地，所述额颞叶退行性疾病或疾患是由PGRN基因突变引起的额颞叶痴呆。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于治疗癌症、淋巴瘤和/或肉瘤，特别地其中所述病毒载体编码IL-12、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-15、IL-21和/或IFN-α中的至少一者；或其功能片段。
也就是说，本发明的病毒载体可以用于治疗癌症。本文中已证明本发明的启动子在不同的髓样细胞以及小胶质细胞中有活性。因此，根据本发明的病毒载体或包含根据本发明的病毒载体的宿主细胞可用于治疗脑部以及身体其他部分中的癌症。
例如，可以将包含根据本发明的病毒载体的造血干细胞施用于患有癌症的受试者。所述造血干细胞可以分化成髓样细胞并迁移到肿瘤部位以引发针对肿瘤的免疫反应。所述髓样细胞可包含编码本文所公开的细胞因子中的一种细胞因子的转基因以增加针对肿瘤的免疫反应。或者或此外，转基因可编码抗原结合蛋白，该蛋白将髓样细胞引导至肿瘤以引发针对肿瘤的更显著的免疫反应。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述癌症、淋巴瘤和/或肉瘤是脑肿瘤或脑转移瘤。
也就是说，根据本发明的病毒载体或宿主细胞可用于治疗脑部的肿瘤。脑肿瘤可以是原发性或继发性脑肿瘤。如上所述，包含根据本发明的病毒载体的造血干细胞可以迁移到脑并分化成显示出小胶质细胞特征的巨噬细胞并且可以替代脑中的小胶质细胞。在脑内部，这些小胶质细胞和小胶质细胞样细胞可以分泌细胞因子，例如IL-12、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-15、IL-21、IFN-α或其组合或融合变体，以触发脑中针对肿瘤的免疫反应。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述脑肿瘤选自由以下项组成的组：成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤、脑膜瘤、成视网膜细胞瘤和神经母细胞瘤。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述脑肿瘤是源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌肿瘤或任何其他实体瘤或任何肉瘤、或任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤的转移性肿瘤。
如本文所用，术语“癌症”是指表征为细胞增殖和/或生长失调的疾病。所述术语包括良性和恶性癌性疾病，例如肿瘤，并且可以指侵袭性或非侵袭性癌症。所述术语包括所有类型的癌症，包括癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病毒载体、宿主细胞或药物组合物与减少血脑屏障完整性的疗法结合施用，特别地其中所述减少血脑屏障完整性的疗法是骨髓调理疗法、CNS调理疗法和/或血脑屏障调理疗法。
如上所公开的，本发明可用于预防和/或治疗起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患。为此，设想将包含本发明的病毒载体的造血干细胞施用于有需要的受试者。一旦施用于受试者，所述造血干细胞可以迁移到脑中并分化成小胶质细胞样巨噬细胞或分化成小胶质细胞。
或者，可以将根据本发明的基于AAV的病毒载体或包含根据本发明的基于AAV的病毒载体的药物组合物直接应用到脑区室中，以用于体内感染需要的细胞。
为了更有效地用本发明的转导细胞替代脑中的小胶质细胞，优选的是在施用转导细胞之前耗竭内源性小胶质细胞。各种降低血脑屏障完整性的治疗方案已被报道导致小胶质细胞的耗竭。例如，Capotondo等人已证明脑调理有助于在造血干细胞移植后成功的小胶质细胞重构(Proc Natl Acad Sci U S A.2012Sep11；109(37):15018–15023)。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述骨髓调理疗法包括使用细胞毒性剂、烷基化剂、白消安、曲奥舒凡、依托泊苷、洛莫司汀、放射疗法、靶向放射疗法(例如钇-90标记的抗CD45抗体、或钇-90标记的抗CD66抗体)、ACK2(抗c-kit抗体)、CD117抗体-药物-偶联物、CD45-SAP、集落刺激因子1(CSF1)特异性药剂、PLX3397、BLZ9445、PLX5622、RG7155、PLX647、Ki20227、GW2580、IL-34和/或达沙替尼。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中CNS调理疗法包括使用白消安。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述血脑屏障调理疗法包括放射疗法或靶向放射疗法。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物是在降低所述血脑屏障的完整性的疗法之后施用的，特别地其中所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物在不早于降低血脑屏障的完整性的疗法之后半天施用。
也就是说，根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物可以在降低血脑屏障的完整性的疗法之后0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用于有需要的受试者。
虽然本发明的病毒载体由于其在髓样细胞和小胶质细胞中的启动子活性而特别适合治疗基于脑的疾病或疾患，但重要的是理解病毒载体也可用于靶向CNS或身体的任何其他部分中的肿瘤。原则上，本发明的病毒载体可用于治疗髓样细胞(例如巨噬细胞或单核细胞)可接近的任何器官或组织中的癌症。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于治疗自体免疫性疾病。
也就是说，根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物也可以用于治疗自体免疫性疾病。
如本文所用的术语“自体免疫性疾病”被定义为由自身免疫反应引起的疾患。自体免疫性疾病是对自身抗原的不适当和过度反应的结果。自体免疫性疾病的示例包括但不限于爱迪生氏病、斑秃、强直性脊柱炎、除寻常型天疱疮之外的自身免疫性大疱性疾病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩氏病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、所有类型的血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。
可用于治疗自体免疫性疾病的转基因包括IL-1、IL-1R拮抗剂、IL-2、IL-4、IL-10、TGFβ、FOXP3、T-bet、GATA-3，结合CD1b、CD1c、CD1D的CD36家族(CD36-L1、CD36-L2)，以及T细胞受体识别MHC相关蛋白1号(MR1)。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于治疗自身炎性疾病。
如本文所用的术语“自身炎性疾病”应理解为包括任何自身炎性疾病。可以用本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物治疗的自身炎性疾病的非限制性示例是低补体血症和正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、白塞综合征、PAPA综合征、布劳氏综合征、痛风、成人和青少年斯蒂尔病、冷吡啉病、穆-韦二氏综合征、家族性寒冷诱发的自身炎性综合征、新生儿发病的多系统炎性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经皮肤关节综合征、全身性幼年特发性关节炎、高IgD综合征、施尼茨勒综合征和TNF受体相关周期性综合征(TNF receptor-associated periodicsyndrome,TRAPS)。
可用于治疗自身炎性疾病的转基因包括IL-1受体拮抗剂IL-1β。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于治疗过敏性疾病。
如本文所用的术语“过敏性疾病”是指由过敏引起的任何症状、组织损伤或组织功能丧失，并且包括但不限于诸如特应性皮炎、荨麻疹、接触性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏反应、食物过敏和花粉症的疾病。
可用于治疗过敏性疾病的转基因包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质包括针对任何IgE的任何部分(包括Fc、Fab，包括Fab的可变区和高变区)的抗体和其他受体结合蛋白；或暗示介导过敏反应的细胞(包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞和T细胞)的任何受体。此外，可溶性潜在中和结合蛋白和肽或抗体应由抗IL-1、IL-4、IL-33和任何其他细胞因子(包括与过敏性疾病有关的所有形式的白介素和趋化因子)的基因诱导。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物用于造血和实体器官移植。
也就是说，根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物可以在造血或实体器官移植之前施用于有需要的受试者。可用于造血和实体器官移植的转基因包括IL-1、IL-1R拮抗剂、IL-2、IL-4、IL-10、TGFβ、FOXP3、T-bet、GATA-3，结合CD1b、CD1c、CD1D的CD36家族(CD36-L1、CD36-L2)，以及T细胞受体识别MHC相关蛋白1号(MR1)。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：
a)对造血干细胞和/或富集的CD34阳性髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述造血干细胞和/或所述富集的CD34阳性髓样细胞群与根据本发明的病毒载体接触的步骤；或对髓样细胞和/或富集的髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群与根据本发明的病毒载体接触的步骤；
b)将来自步骤(a)的所述经遗传修饰的细胞静脉内施用于所述有需要的受试者；以及
c)治疗所述有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患。
也就是说，本发明还涉及用于治疗脑部疾病或疾患的方法。如上所述，包含根据本发明的病毒载体的宿主细胞可以迁移到患有基于脑的疾病或疾患的受试者的脑中并替代小胶质细胞。
为此，可以用根据本发明的病毒载体离体转导细胞，例如造血干细胞或髓样细胞。然后可以将转导细胞群施用于有需要的受试者。在某些实施方式中，将转导的造血干细胞施用于有需要的受试者。这可能是有利的，因为干细胞比其他细胞类型具有更高的跨越血脑屏障的潜力。然而，宿主细胞也可以是髓样细胞，例如单核细胞和/或巨噬细胞。然而，单核细胞和/或巨噬细胞优选在血脑屏障受损的受试者中使用。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述造血干细胞和/或富集的CD34阳性髓样细胞群、或所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群已从所述有需要的受试者或从外源供体获得。
也就是说，在某些实施方式中，本发明的方法包括使用自体细胞。技术人员知道从受试者的血液中富集某些细胞类型的方法。因此，可以从有需要的受试者的血液中富集某种类型的血细胞，用根据本发明的病毒载体进行转导，然后再施用回到所述有需要的受试者。自体细胞具有降低免疫原性反应风险的优势。
在其他实施方式中，施用于有需要的受试者的细胞可以源自外源供体。本领域技术人员知道用于鉴定相容供体或操纵有需要的细胞和/或受试者以便降低免疫原性反应风险的方法。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述有需要的受试者中动员造血干细胞；
b)在步骤(a)中的所述造血干细胞动员之后，将根据本发明的所述病毒载体静脉内施用于所述有需要的受试者；以及
c)治疗所述有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患。
也就是说，本发明的病毒载体或包含根据本发明的病毒载体的药物组合物也可以直接施用于有需要的受试者。优选地，受试者用导致所述受试者中的造血干细胞动员的药剂进行预处理，使得动员的造血干细胞可以用根据本发明的病毒载体体内感染。通常用于刺激来自骨髓的造血干细胞的动员的药剂是G-CSF和普乐沙福。然而，其他刺激来自骨髓的造血干细胞的动员的药剂是在本领域中已知的并且可以用作所要求保护的方法的一部分。
在某些实施方式中，体内转导的造血干细胞可以迁移到脑中，在所述脑中它们分化成小胶质细胞或小胶质细胞样细胞。在此类实施方式中，所述方法可以用于预防和/或治疗基于脑的疾病和疾患。小胶质细胞样细胞可以表达预防和/或治疗基于脑的疾病或疾患所需的一种或多种转基因。例如，当用于预防和/或治疗本文所公开的PGRN相关疾病或疾患之一时，小胶质细胞样细胞可以表达PGRN。或者，当用于治疗脑肿瘤时，小胶质细胞样细胞可表达本文所公开的细胞因子中的一种细胞因子。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中在所述有需要的受试者中动员造血干细胞包括施用G-CSF和/或普乐沙福。普乐沙福(INN和USAN，商品名Mozobil)是一种免疫刺激剂，其用于将癌症患者中的造血干细胞动员到血流中。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患是PGRN相关疾病或疾患，特别地其中所述PGRN相关疾病或疾患是神经退行性疾病或疾患，特别地其中所述神经退行性疾病或疾患是额颞叶退行性疾病或神经退行性疾患，特别地其中所述额颞叶退行性疾病或神经退行性疾患选自由以下项组成的组：阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、神经元蜡样脂褐质沉积症和帕金森氏病，特别地其中所述病毒载体编码PGRN或其功能片段。
也就是说，编码颗粒蛋白前体或具有PGRN功能性且与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽的病毒载体可用于治疗本文所公开的任何PGRN相关的神经退行性疾病。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患是脑肿瘤，特别地其中所述脑肿瘤选自由以下项组成的组：神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤；或者其中所述脑肿瘤是源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、或任何其他实体瘤或任何肉瘤、或任何血液肿瘤，包括所有形式白血病和淋巴瘤的转移性肿瘤，特别地其中所述病毒载体编码IL-12、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-15、IL-21和/或IFN-α或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述方法包括暂时降低血脑屏障的完整性的附加步骤，特别地其中降低血脑屏障的完整性包括骨髓调理疗法、CNS调理疗法、和/或血脑屏障调理疗法。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中降低血脑屏障的完整性的疗法是在将所述经遗传修饰的细胞施用于所述有需要的受试者之前执行的，特别地其中所述降低血脑屏障的完整性的疗法与所述经遗传修饰的细胞的施用之间的时间间隔是在所述降低血脑屏障的完整性的疗法之后进行的。
用于降低血脑屏障完整性的疗法可以是本文所公开的疗法中的任何一种疗法。在某些实施方式中，用于降低血脑屏障完整性的疗法可以在施用根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物之前0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用。
如上所述，根据本发明的病毒载体、宿主细胞或药物组合物也可用于治疗身体的其他部位中的癌症。也就是说，在一个具体实施方式中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述有需要的受试者中动员造血干细胞；
b)在步骤(a)中的所述造血干细胞动员之后，将根据本发明的所述病毒载体静脉内施用于所述有需要的受试者；以及
c)治疗所述有需要的受试者中的癌症。
对于癌症的治疗，优选的是病毒载体编码IL-12、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-15、IL-21和/或IFN-α中的至少一者，或其功能片段。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种在受试者的脑和/或CNS中表达转基因的方法，所述方法包括以下步骤：
a)对造血干细胞和/或富集的CD34阳性髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述造血干细胞和/或所述富集的CD34阳性髓样细胞群与根据本发明的病毒载体接触的步骤；或对髓样细胞和/或富集的髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群与根据本发明的病毒载体接触的步骤；
b)将来自步骤(a)的所述经遗传修饰的细胞静脉内或鞘内施用于所述有需要的受试者；以及
c)在所述受试者的所述脑和/或CNS中表达由所述病毒载体编码的所述转基因。
也就是说，所述方法可以用于在有需要的受试者的脑或中枢神经系统中表达转基因。为此，可以用根据本发明的病毒载体离体转导细胞群。在某些实施方式中，细胞群可以是造血干细胞群或富集的CD34阳性骨髓细胞群。优选地，富集的CD34阳性骨髓细胞群包含造血干细胞和/或造血祖细胞。在某些实施方式中，细胞群可以是富集的髓样细胞群。所述髓样细胞可以是本文所公开的任何髓样细胞。在某些实施方式中，髓样细胞可以是巨噬细胞。
术语“细胞群”用于表示多个细胞。例如，造血干细胞群是指多个干细胞。造血干细胞群可能仅由造血干细胞组成。然而，如本文所用，“造血干细胞群”优选地理解为包括造血干细胞的细胞群。也就是说，“造血干细胞群”可以包括其他细胞类型，特别是CD34阳性细胞类型。本领域技术人员知道用于从细胞混合物，例如从血液或骨髓中富集造血干细胞的方法。例如，造血干细胞可基于细胞表面标志物CD34的表达而富集，从而产生富集的CD-34阳性骨髓细胞群。富集的CD-34阳性骨髓细胞群可以是这样的细胞群，其中所述群体中的所有细胞的至少70％、至少80％、至少90％或至少95％表达细胞表面标志物CD34。
富集的髓样细胞群是这样的细胞群，其中所述群体中的所有细胞的至少70％、至少80％、至少90％或至少95％是髓样细胞。技术人员知道可用于通过流式细胞术富集一种或多种特定类型的髓样细胞的细胞表面标志物的组合。
可以用本文所公开的任何病毒载体转导细胞群。转导步骤可以离体进行。技术人员知道用病毒载体转导细胞的方法。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述造血干细胞和/或富集的CD34阳性髓样细胞群、或所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群已从所述受试者或从外源供体获得。
也就是说，细胞群可包含如上所述的自体同源或同种异体细胞。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种在受试者的脑和/或CNS中表达转基因的方法，所述方法包括以下步骤：
a)动员所述受试者中的造血干细胞；
b)在步骤(a)中的所述造血干细胞动员之后，将根据本发明的所述病毒载体静脉内施用于所述有需要的受试者；以及
c)在所述受试者的所述脑和/或CNS中表达在所述病毒载体中编码的所述转基因。
也就是说，在某些实施方式中，可以将转基因体内递送给有需要的受试者。也就是说，本发明的病毒载体可以直接施用于受试者，优选地在所述受试者接受干细胞动员疗法之后。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中在受试者中动员造血干细胞包括施用G-CSF或普乐沙福。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述方法包括暂时降低血脑屏障的完整性的附加步骤，特别地其中降低血脑屏障的完整性包括骨髓调理疗法、CNS调理疗法、和/或血脑屏障调理疗法。
也就是说，如果在施用病毒载体之前有需要的受试者体内的小胶质细胞已经耗竭，则转导的造血干细胞至脑的迁移可能会更有效。用于耗竭受试者体内的小胶质细胞的方法和化合物是本领域中已知的并且已在本文中公开。
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中降低血脑屏障的完整性的疗法是在将所述经遗传修饰的细胞施用于所述有需要的受试者之前执行的，特别地其中所述降低血脑屏障的完整性的疗法与所述经遗传修饰的细胞的施用之间的时间间隔是在所述降低所述血脑屏障的完整性的疗法之后进行的。
也就是说，用于降低血脑屏障的完整性的疗法可以在施用根据本发明的病毒载体或包含根据本发明的病毒载体的药物组合物之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用。
在一个具体实施方式中，本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将根据本发明的病毒载体施用于有需要的受试者的脑中或鞘内施用；以及
b)治疗所述有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患。
也就是说，根据本发明的病毒载体或包含根据本发明的病毒载体的药物组合物可以直接施用到脑或椎管中(鞘内地)。在此类实施方式中，优选的是病毒载体是基于AAV的病毒载体。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的病毒载体，其中所述病毒载体是基于AAV的病毒载体。
应当理解的是，所述方法可以用于治疗或预防本文所公开的任何基于脑的疾病或疾患，特别是神经退行性疾病和疾患以及癌症。如本文所用的术语“鞘内地”意指施用到覆盖脑和脊髓的薄组织层之间的充满流体的空间中或其内。
本发明提供了新颖逆转录病毒载体，所述新颖逆转录病毒载体用于在人类疗法中使用，特别是用于在起源于脑或基于脑的疾病或疾患，特别是PGRN相关的神经退行性疾病或疾患中使用，所述PGRN相关的神经退行性疾病或疾患包括额颞叶退行性疾病或疾患，例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病。本发明还提供了逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体用于在脑肿瘤，特别是选自由成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤或任何其他CNS肿瘤组成的组的脑肿瘤的治疗中使用，以及进一步在源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌和黑素瘤，或任何其他实体瘤，以及任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤的脑转移的治疗中使用。
具体地，本发明提供了一种逆转录病毒基因疗法载体，特别是慢病毒基因疗法载体，所述基因疗法载体包含在组织特异性启动子控制下编码治疗性转基因，特别是PGRNcDNA的核苷酸序列，所述载体可用于转导造血干细胞(HSC)。根据本发明的特定载体架构导致治疗性转基因仅在脑中的HSC源单核细胞/巨噬细胞、树突细胞以及小胶质细胞样细胞和小胶质细胞中表达，并导致中等水平的基因表达以避免海马毒性和神经变性，从而如使用替代构建体时所看到的影响神经元和神经胶质细胞。
根据本发明的载体包含用于吞噬细胞特异性表达的骨髓/小胶质细胞特异性启动子(优选但不限于miR223基因启动子、或包含miR223启动子的融合启动子构建体)的安全特征，以驱动转基因表达，特别是PGRN cDNA的表达。
因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及通过慢病毒自灭活(SIN)基因疗法载体将编码PGRN的表达盒引入HSC中，所述表达盒包含骨髓/小胶质细胞特异性启动子，优选但不限于miR223启动子。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及引入编码PGRN的表达盒，所述表达盒包含选自由以下项组成的组的骨髓/小胶质细胞特异性启动子：TMEM119启动子、P2RY12启动子、OLFML3启动子、AIF1启动子和ITGAM启动子。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及引入编码PGRN的表达盒，所述表达盒包含骨髓/小胶质细胞特异性启动子，优选但不限于miR223融合启动子，特别是这样的融合启动子，其中所述miR223启动子或其功能部分与选自由以下项组成的组的启动子的整体或功能部分融合：TMEM119启动子、P2RY12启动子、OLFML3启动子、AIF1启动子和ITGAM启动子。
在一个方面中，本发明涉及TMEM119启动子构建体、P2RY12启动子构建体、OLFML3启动子构建体，或由与TMEM119融合的miR223、与P2RY12融合的miR223、或与OLFML3启动子融合的miR223组成的融合构建体在巨噬细胞迁移到脑中后驱动HSC源单核细胞/巨噬细胞、树突细胞以及小胶质细胞样细胞或小胶质细胞中的PGRN表达的用途。
在HSC转导后之后是将经离体处理的HSC施用于患者。在一个具体实施方式中，经离体处理的HSC是静脉内施用的。
对于HSC移植，患者的骨髓将用合适的调理化合物或处理进行调理，特别是用白消安、曲奥舒凡、放射疗法或可能耗竭内源性脑小胶质细胞的生物制剂进行调理，但优选用白消安进行调理。这将允许HSC源性转基因单核细胞/巨噬细胞或树突细胞进入脑中，以达到HSC源性单核细胞/巨噬细胞、小胶质细胞样巨噬细胞、树突细胞和/或小胶质细胞在脑中相当水平的嵌合，并由此将足量的PGRN或其他转基因递送到脑中。
在本发明的一个具体实施方式中，在施用之前的介于过去5天至过去20天之间的窗口内，但特别地在引入之前的最后8天或最后15天内，用白消安、曲奥舒凡、放射疗法或生物制剂(例如集落刺激因子1(CSF1)的基于单克隆抗体或基于小分子的抑制剂和CSF1受体(CSF1R)抑制剂，例如PLX3397、BLZ9445、PLX5622、RG7155、PLX647、Ki20227、GW2580或CSF1R-配体IL-34、达沙替尼以及它们的任何组合)对患者进行预处理。
根据本发明的逆转录病毒载体还可用于靶向脑肿瘤和转移中所涉及的骨髓源性巨噬细胞和小胶质细胞。根据本发明的包含骨髓/小胶质细胞特异性启动子的特异性载体结构是在骨髓源性单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、小胶质细胞样细胞和小胶质细胞中成功表达蛋白质，以逆转或减缓肿瘤进展的基础。
具体地，本发明涉及根据本发明并且如本文所述的逆转录病毒载体构建体在用于治疗患有脑肿瘤，特别是选自由成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤或任何其他CNS肿瘤组成的组的脑肿瘤的患者中的用途。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明并且如本文所述的逆转录病毒载体构建体在用于治疗患有脑转移的患者中的用途，所述脑转移源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌和黑素瘤，或任何其他实体瘤，以及任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤。
具体地，本发明提供了以下实施方式：
1.一种逆转录病毒载体分子，所述逆转录病毒载体分子包含在骨髓/小胶质细胞特异性启动子、或骨髓特异性启动子和小胶质细胞特异性启动子的组合，特别是融合启动子的控制下编码治疗性多肽或治疗性多肽组合的核酸分子，所述启动子在巨噬细胞迁移到脑中后驱动治疗性多肽或治疗性多肽组合在HSC源性髓样细胞、HSC源性血液单核细胞/巨噬细胞、树突细胞中和在脑小胶质细胞或小胶质细胞样细胞中的表达。
2.根据实施方式1所述的逆转录病毒载体，其中所述小胶质细胞特异性启动子是启动子或启动子片段，所述启动子或启动子片段具有选自由以下项组成的组的启动子的启动子功能性：TMEM119启动子、P2RY12启动子、OLFML3启动子、AIF1启动子和ITGAM启动子。
3.根据实施方式1所述的逆转录病毒载体，其中所述骨髓/小胶质细胞特异性启动子是启动子或启动子片段，所述启动子或启动子片段具有选自以下的启动子的启动子功能性
(a)AIF1启动子或ITGAM启动子；或者
(b)融合启动子，所述融合启动子包含具有miR223启动子的启动子功能性的启动子或启动子片段和具有选自由以下项组成的组的启动子的启动子功能性的启动子或启动子片段：TMEM119启动子、P2RY12启动子、OLFML3启动子。
4.根据实施方式3所述的逆转录病毒载体，其中具有miR233启动子功能性的启动子或启动子片段与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少200个核苷酸长的其片段，所述启动子或片段仍然具有miR223启动子的启动子功能性。
5.根据实施方式1至3中任一项所述的逆转录病毒载体，其中具有P2RY12启动子功能性的启动子或启动子片段与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少200个核苷酸长的其片段，所述启动子或片段仍然具有P2RY12启动子的启动子功能性。
6.根据实施方式1至3中任一项所述的逆转录病毒载体，其中具有TMEM119启动子功能性的启动子或启动子片段与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少200个核苷酸长的其片段，所述启动子或片段仍然具有TMEM119启动子的启动子功能性。
7.根据实施方式1至3中任一项所述的逆转录病毒载体，其中具有OLFML3启动子功能性的启动子或启动子片段与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少200个核苷酸长的其片段，所述启动子或片段仍然具有OLFML3启动子的启动子功能性。
8.根据实施方式1至3中任一项所述的逆转录病毒载体，其中具有AIF1启动子功能性的启动子或启动子片段与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少200个核苷酸长的其片段，所述启动子或片段仍然具有AIF1启动子的启动子功能性。
9.根据实施方式1至3中任一项所述的逆转录病毒载体，其中具有ITGAM启动子功能性的启动子或启动子片段与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少200个核苷酸长的其片段，所述启动子或片段仍然具有ITGAM启动子的启动子功能性。
10.根据实施方式3至9中任一项所述的逆转录病毒载体，其中所述组织特异性启动子是miR223启动子融合启动子。
11.根据实施方式1至10中任一项所述的逆转录病毒载体，其中所述治疗性多肽是PGRN或其功能片段。
12.根据实施方式11所述的逆转录病毒载体，其中所述治疗性多肽与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少50个氨基酸长的其片段，所述多肽仍然提供PGRN功能性。
13.根据实施方式12所述的逆转录病毒载体，其中所述PGRN多肽的部分序列为至少40个氨基酸长。
14.根据实施方式1至10中任一项所述的逆转录病毒载体，其中所述治疗性多肽选自由以下项组成的组：FasL/Fas、Trail/TRAIL-R、淋巴毒素β、诱骗受体1-3、TNF-α、TNF-αR、IFN-γ、IFN-γ受体、IL-1-IL31、IL1R-IL31受体、IL-10、IL-12、IL-23、CXCL-10、PD-1L、PD-1、PD-2L、PD-2、颗粒酶B、颗粒溶解素、一氧化氮合酶、DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)、含有Jumonji结构域的蛋白质1A(JMJD1A)、组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)、和HDAC 9、CSF1受体(CSF1R)或CSD1R-配体IL-34、所有趋化因子、趋化因子受体、VEGF、VEGF受体、金属蛋白酶拮抗剂(例如MMP-9)、CD40/CD40L、肿瘤特异性配体和受体，例如EGFR、膜联蛋白1、FGFR-1、Her2、St6galnac5、MMP1-28及其对应物TIMPS1-4(金属蛋白酶的组织抑制剂)、黑素转铁蛋白、α4-β1整合素及其配体内皮细胞VCAM-1、E-钙粘着蛋白、α-v-β3整合素、α-v-β5整合素、α-v-β6整合素、α-v-β8整合素、单核苷酸变异新抗原、INDEL移码新抗原、剪接变异抗原、融合蛋白新抗原、内源性逆转录元件抗原、肿瘤特异性抗原，特别是癌症的肿瘤特异性抗原，特别是CCND1、BRCA、CEA、癌症相关抗原72-4(CA 72-4)、癌症相关抗原19-9(CA 19-9)、WT1和NY-ESO-1)、可溶性和膜结合。
15.根据实施方式14所述的逆转录病毒载体，其中所述治疗性多肽是干扰素γ(IFNγ)或其功能片段。
16.根据实施方式14所述的逆转录病毒载体，其中所述治疗性多肽是P-选择蛋白、MSH、GM-CSF、IL-12、TNF-α或颗粒酶B。
17.根据实施方式15所述的逆转录病毒载体，其中所述治疗性多肽与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，或者是至少50个氨基酸长的其片段，所述多肽仍然提供IFNγ功能性。
18.根据实施方式1至17中任一项所述的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体，特别是慢病毒SIN载体。
19.根据实施方式1至17中任一项所述的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体是泡沫病毒载体。
20.根据实施方式1至17中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体和疱疹病毒载体，或者其中所述病毒载体是α-逆转录病毒载体。
21.根据实施方式1至20中任一项所述的逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体用于在疗法中使用。
22.根据实施方式1至20中任一项所述的逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体用于治疗起源于脑中或基于脑或神经系统的疾病或疾患。
23.根据实施方式1至13和18至232中任一项所述的逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体用于治疗PGRN相关疾病或疾患。
24.根据实施方式23所述的逆转录病毒载体，其中所述PGRN相关疾病或疾患是神经退行性疾病或疾患。
25.根据实施方式24所述的逆转录病毒载体，其中所述神经退行性疾病或疾患是额颞叶退行性疾病或疾患。
26.根据实施方式25所述的逆转录病毒载体，其中所述额颞叶退行性疾病或疾患选自由以下项组成的组：阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病。
27.根据实施方式1至10和14至22中任一项所述的逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体用于在脑肿瘤的治疗中使用。
28.根据实施方式27所述的逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体用于在选自由成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤或任何其他CNS肿瘤组成的组的脑肿瘤的治疗中使用。
29.根据实施方式27所述的逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体用于在源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌和黑素瘤，或任何其他实体瘤，以及任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤的脑转移的治疗中使用。
30.一种用于治疗起源于脑或基于脑的疾病或疾患的方法，所述方法包括通过用根据实施方式1至22中任一项所述的逆转录病毒载体进行逆转录病毒转导来对所述患者的造血干细胞和/或富集的CD34阳性骨髓细胞群进行离体遗传修饰，并将经修饰的细胞施用于患有此类疾病或疾患的患者。
31.根据实施方式30所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是根据实施方式1至13和18至22中任一项所述的载体，并且其中所述患者患有PGRN相关疾病或疾患。
32.根据实施方式31所述的方法，其中所述PGRN相关疾病或疾患是神经退行性疾病或疾患。
33.根据实施方式32所述的方法，其中所述神经退行性疾病或疾患是额颞叶退行性疾病或疾患。
34.根据实施方式33所述的方法，其中所述额颞叶退行性疾病或疾患选自由以下项组成的组：阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病。
35.根据实施方式30所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是根据实施方式1至10和14至21中任一项所述的载体，并且其中所述患者患有脑肿瘤。
36.根据实施方式35所述的方法，其中所述脑肿瘤选自由以下项组成的组：神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤或任何其他CNS肿瘤。
37.根据实施方式35所述的方法，其中所述患者患有源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌和黑素瘤，或任何其他实体瘤，以及任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤的脑转移。
38.根据实施方式30至37中任一项所述的方法，其中在施用之前的介于过去8天至过去15天之间的窗口内，用白消安、曲奥舒凡、放射疗法、生物制剂(例如集落刺激因子1(CSF1)的基于单克隆抗体或基于小分子的抑制剂和CSF1受体(CSF1R)抑制剂，例如PLX3397、BLZ9445、PLX5622、RG7155、PLX647、Ki20227、GW2580或CSF1R-配体IL-34、达沙替尼以及它们的任何组合)对所述患者进行预处理。
附图说明
图1：SIN-慢病毒构建体vUS6，其包含处于启动子miR223(SEQ ID NO:1)控制下的转基因GRN。2A：自切割肽；GFP：绿色荧光蛋白；nls：核定位序列；PRE4：改良的土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHP)转录后调控元件。
图2：在转导后用HEK293T细胞进行FACS分析。左侧：未转导的细胞。右侧：用图1所示的慢病毒构建体(vUS6)转导的细胞(滴度：6.04×106TU/mL；MOI＝2)。
图3：转导后用THP1细胞进行FACS分析。左侧：未转导的细胞。右侧：用图1所示的慢病毒构建体(vUS6)转导的细胞(滴度：6.04×106TU/mL；MOI＝2)。
图4：转导后用人小胶质细胞进行FACS分析。左侧：未转导的细胞。右侧：用图1所示的慢病毒构建体(vUS6)转导的细胞(滴度：6.04×106TU/mL；MOI＝2)。
图5：通过用ELISA测量人小胶质细胞(GRN-/-)得到的颗粒蛋白前体释放。左条形：未转导的细胞。右条形：用图1所示的慢病毒构建体(vUS6)转导的细胞。
图6：SIN-慢病毒构建体，其包含处于启动子miR223(SEQ ID NO:1)控制下的转基因IL-12。IRES：内部核糖体进入位点；PRE4：改良的土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件。
图7：转导后用THP1细胞进行FACS分析。左侧：未转导的细胞。右侧：用图6所示的慢病毒构建体转导的细胞(滴度：3.24×106TU/mL；MOI＝2)。
图8：转导后用人小胶质细胞进行FACS分析。左侧：未转导的细胞。右侧：用图6所示的慢病毒构建体转导的细胞(滴度：3.24×106TU/mL；MOI＝2)。
图9：SIN-慢病毒构建体，其包含处于启动子(A)miR223-TMEM119(vUS7；SEQ IDNO:28)；(B)ITGAM(vUS8；SEQ ID NO:6)；(C)miR223_P2RY12(vUS11；SEQ ID NO:26)；和(D)miR223_OLFML3(vUS12；SEQ ID NO:29)控制下的转基因GRN。2A：自切割肽；GFP：绿色荧光蛋白；nls：核定位序列；PRE4：改良的土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHP)转录后调控元件。
图10：用在分化成巨噬细胞时用不同载体转导的THP-1细胞进行FACS分析。(A)非转导对照；(B)vUS6-LV_miR223_GRN(图1)；(C)vUS7-LV_miR223-TMEM119_GRN(图9A)；(D)vUS8-LV_ITGAM_GRN(图9B)；(E)vUS11-LV_miR223-P2RY12(图9C)；(F)vUS12-LV_miR223-OLFML3(图9D)。
图11：(A)分化的THP-1细胞中GFP阳性细胞的百分比(转导率)。(B)分化的THP-1细胞的平均荧光强度。
图12：对用不同载体转导的人小胶质细胞系(GRN-/-)的FACS分析。(A)非转导对照；(B)vUS6-LV_miR223_GRN(图1)；(C)vUS7-LV_miR223-TMEM119_GRN(图9A)；(D)vUS8-LV_ITGAM_GRN(图9B)；(E)vUS11-LV_miR223-P2RY12(图9C)；(F)vUS12-LV_miR223-OLFML3(图9D)。
图13：(A)人小胶质细胞系(GRN-/-)中GFP阳性细胞的百分比(转导率)。(B)人小胶质细胞系(GRN-/-)的平均荧光强度。
图14：人小胶质细胞系(GRN-/-)中的GRN分泌的恢复。(A)上清液中颗粒体蛋白的量。(B)通过载体拷贝数归一化的平均荧光强度。(C)通过(转导率×载体拷贝数)归一化的颗粒体蛋白的量。
图15：将人CD34+骨髓细胞用编码作为转基因的GRN-2A-GFP的载体进行慢病毒转导，然后分化成单核细胞并在单核细胞中进行FACS分析(第12天)。(A)非转导对照；(B)vUS6-LV_miR223_GRN(图1)；(C)vUS7-LV_miR223-TMEM119_GRN(图9A)；(D)vUS8-LV_ITGAM_GRN(图9B)；(E)vUS11-LV_miR223-P2RY12(图9C)；(F)vUS12-LV_miR223-OLFML3(图9D)。
图16：GFP阳性单核细胞的百分比。
图17：在分化成单核细胞后人CD34+细胞中的候选启动子的活性的分析(第7天)。(A)非转导的对照；(B)vUS6-LV_miR223_GRN(图1)：(左)在两性霉素B存在下的转导，(右)在Lentiboost存在下的转导；(C)vUS7-LV_miR223-TMEM119_GRN(图9A)：(左)在两性霉素B存在下的转导，(右)在Lentiboost存在下的转导；(D)vUS8-LV_ITGAM_GRN(图9B)：(左)在两性霉素B存在下的转导，(右)在Lentiboost存在下的转导。
图18：人CD34+细胞在分化成单核细胞时的载体拷贝数(第12天)。(顶部)在两性霉素B存在下的转导，(底部)在Lentiboost存在下的转导。
图19：图18的总结。
图20：从人CD34+细胞获得的髓样细胞中的转导效率(GFP阳性细胞％除以载体拷贝数(VCN))。
图21：单核细胞、巨噬细胞和iPSC源性造血干细胞同源物中的miR223启动子活性。
实施例
实施例1：适合于治疗患有由于GRN基因突变导致的额颞叶痴呆的患者的经基因修饰的造血干细胞(HSC)的生产
将在HSC动员时通过白细胞去除术获得的HSC用慢病毒自灭活(SIN)载体转导，所述载体包含在根据SEQ ID NO:1的miR223启动子的控制下编码根据SEQ ID NO:7的cDNA的人PGRN(颗粒蛋白前体)。优选地，经遗传修饰的自体同源HSC群体在遗传操纵后冷冻保存。
实施例2：适合于治疗患有由于GRN基因突变导致的额颞叶痴呆的患者的经基因修饰的CD34+细胞的生产
将在HSC动员时通过白细胞去除术获得的CD34+细胞群用慢病毒SIN载体转导，所述慢病毒SIN载体在miR223融合启动子构建体的控制下编码根据SEQ ID NO:7的PGRN，所述miR223融合启动子构建体由与根据SEQ ID NO:1的miR223启动子融合的包含在SEQ ID NO:3中的TMEM119启动子组成。
实施例3：适合于治疗患有由于GRN基因突变导致的额颞叶痴呆的患者的经基因修饰的CD34+富集骨髓细胞的生产
将CD34+富集的骨髓细胞用慢病毒载体转导，所述慢病毒载体在根据SEQ ID NO:6的ITGAM启动子的控制下编码根据SEQ ID NO:8的PGRN。
实施例4：适合于治疗患有由于GRN基因突变导致的额颞叶痴呆的患者的经基因修饰的CD34+富集骨髓细胞的生产
将CD34+骨髓细胞用泡沫病毒载体转导，所述泡沫病毒载体在根据SEQ ID NO:6的ITGAM启动子的控制下编码根据SEQ ID NO:8的PGRN。
实施例5：适合于治疗患有胶质母细胞瘤的患者的经基因修饰的血液源性单核细胞的生产
将患有胶质母细胞瘤的患者的血液源性单核细胞用慢病毒载体转导，所述慢病毒载体在根据SEQ ID NO:6的ITGAM启动子的控制下编码干扰素-γ。
实施例6：适合于治疗患有肾癌和脑转移的患者的经基因修饰的血液源性单核细胞的生产
将患有肾癌并且任选患有脑转移的患者的血液源性单核细胞用慢病毒载体转导，所述慢病毒载体在根据SEQ ID NO:1的miR223启动子的控制下编码干扰素-γ。
实施例7：使用慢病毒-SIN载体进行吞噬细胞特异性转基因表达的实验
细胞系转导测试
所开发的慢病毒SIN载体使得能够实现吞噬细胞特异性转基因表达，并且因此可用于吞噬细胞是致病细胞的人类疾病中的应用，或者吞噬细胞可以提供治疗元件来治愈或治疗这些疾病的应用。对于起源于脑的疾患，例如神经退行性疾病、或脑癌或转移，以及对于脑外疾患，例如免疫缺陷或癌症，就是这种情况。
用包含GRN转基因的载体转导：
分析了以下细胞系：
1.作为阳性对照的HEK293T细胞(人胚肾细胞)；
2.作为吞噬细胞校正模型的THP1细胞(人类吞噬细胞系)；
3.作为疾病模型的GRN基因被敲除(GRN-/-)的永生化人小胶质细胞系(Im-hMicro)。
对于细胞系的转导，使用慢病毒自灭活(SIN)载体，所述载体包含作为内部启动子的miR223启动子和作为转基因的hGRN，所述hGRN编码cDNA，以及通过2A序列与GRN连接的EGFP报告基因(图1)。在补充有10％ FBS、未添加细胞因子或转导增强剂的DMEM培养基中以MOI 2(基于6.04*TU/mL的滴度)进行转导实验。在转导后48h通过FACS测量GFP表达，并与GRN转基因的表达进行关联。
在载体构建体中，miR223启动子活性导致了一种编码颗粒体蛋白和GFP两者的mRNA物质的翻译，所述颗粒体蛋白和GFP以1:1的分子比共翻译成两种单独的蛋白质，其中GFP通过流式细胞术分析检测。在以下所有三种细胞系中，用LV-miR223-GRN载体转导导致了GFP的高表达水平：HEK293T细胞，77％ GFP阳性细胞(图2)；THP1细胞，88.6％ GFP阳性细胞(图3)；永生化人小胶质细胞GRN-/-细胞系，63.9％ GFP阳性细胞(图4)。因此，已成功证明启动子miR223驱动转基因在吞噬细胞中以及小胶质细胞中的表达。
此外，在永生化的人小胶质细胞GRN-/-细胞系中，在转导后10天执行测量颗粒蛋白前体蛋白到细胞培养上清液中的释放的ELISA测定，证实了颗粒蛋白前体蛋白生产的重构和从小胶质细胞中的释放(图5)。对于ELISA，在分析不含FBS的DMEM培养基之前，将补充有10％ FBS的含DMEM的培养基更换达24h。将未转导的细胞与转导的细胞进行比较。
用IL-12转基因载体转导：
分析了以下细胞系：
1.作为吞噬细胞校正模型的THP1细胞(人吞噬细胞系)；和
2.作为小胶质细胞校正模型的永生化人小胶质细胞系(Im-hMicro)，其中GRN基因被敲除(GRN-/-)。
对于细胞系的转导，使用慢病毒自灭活(SIN)载体，所述载体包含作为内部启动子的miR223启动子；和人IL12-β和IL12-α，所述人IL12-β和IL12-α编码通过蛋白质接头与一种具有IL-12活性的蛋白质融合的cDNA亚基；以及mCherry报告基因，所述mCherry报告基因连接至IL12亚基，所述IL12亚基前面是内部核糖体进入位点(IRES)(图6)。在补充有10％FBS、未添加细胞因子或转导增强剂的DMEM培养基中基于3.24*106TU/mL的滴度以MOI 2进行转导实验。在转导后48h通过FACS测量mCherry表达，并与IL12转基因的表达进行关联。
在以下两种细胞系中，用LV-miR223-IL12载体转导导致了mCherry的高表达水平：THP1细胞，98.7％mCherry阳性细胞(图7)；永生化人小胶质细胞GRN-/-细胞系，99.7％ GFP阳性细胞(图8)。因此，已成功证明启动子miR223驱动转基因在吞噬细胞中以及小胶质细胞中的表达。
实施例8：吞噬细胞系中附加启动子的分析
在实施例7中已经证明，启动子miR223可以驱动人吞噬细胞中以及人小胶质细胞中的表达。在本实施例中，在吞噬细胞中测试了附加启动子的活性。
测试了以下慢病毒构建体：
·LV-miR223-hGRN-2A-EGFP-NLS-WPRE(图1)
·LV-miR223-TMEM119-hGRN-2A-EGFP-NLS-WPRE(图9A)
·LV-ITGAM-hGRN-2A-EGFP-NLS-WPRE(图9B)
·LV-miR223-P2RY12-hGRN-2A-EGFP-NLS-WPRE(图9C)
·LV-miR223-OLFML3-hGRN-2A-EGFP-NLS-WPRE(图9D)
将THP-1细胞以40,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。在接种后立即通过添加适量的病毒(MOI 2)并在孔中重悬细胞进行转导。为了分化未转导或转导的THP-1细胞，将细胞在分化培养基(RPMI 10％ FBS、1X GlutaMAX、1X PenStrep、10ng/mL PMA)中培养并孵育72小时。将贴壁细胞用StemPro细胞消化液分离，并将所述细胞用PBS洗涤。为了进行分析，将Fc受体通过FcR封闭剂以1:20的稀释度封闭，将细胞用LIVE/DEAD Fixable Violet染料(1:1000)和PE-Cy7-CD11b(1:200)进行染色，然后在LSR II Fortessa流式细胞仪中进行分析。仅分析单个活细胞(对于LIVE/DEAD Fixable Violet染色呈阴性)。在分化成巨噬细胞后，量化分化成巨噬细胞时PE-Cy7-CD11b染色的增加。通过量化GFP荧光信号强度来测定GRN/GFP共表达。所有实验一式两份地执行。
所有测试的启动子变体均导致THP-1细胞中的高转基因表达。这种测定的结果总结在图10和图11中。
实施例9：小胶质细胞中附加启动子的分析
还在小胶质细胞中测试了实施例8中所描述的慢病毒构建体的活性
为此，将永生化的人小胶质细胞以40,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。在接种后立即通过添加适量的病毒(MOI 2)并在孔中重悬细胞进行转导。将贴壁细胞用TrypLEExpress分离，并将所述细胞用PBS洗涤。为了分析，将细胞用LIVE/DEAD Fixable Violet染料(1:1000)染色，之后在LSR II Fortessa流式细胞仪中进行分析。仅分析单个活细胞(对于LIVE/DEAD Fixable Violet染色呈阴性)。通过量化GFP荧光信号强度来测定GRN/GFP共表达。
为了量化颗粒体蛋白缺陷型人小胶质细胞的基因疗法治疗时的颗粒体蛋白分泌，在500μL培养基中将细胞以150,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中的。在接种后24小时，去除培养基并更换为500μL新鲜的不含抗生素的培养基。在培养24小时后收集条件培养基，通过以17,000g离心10分钟去除碎片，并将样品储存于-20℃直至处理。对于颗粒体蛋白浓度的量化，将上清液样品用Amicon Ultra-0.5 3K离心过滤装置浓缩，并按照制造商的方案用颗粒蛋白前体(人)ELISA试剂盒(Adipogen，产品目录号AG-45A-0018YEK-KI01)测定PGRN浓度。以ng为单位的结果代表150,000个细胞在24小时内释放到500μL培养基中的PGRN的总ng数。所有实验一式两份地执行。
所有测试的启动子变体均导致小胶质细胞中的高转基因表达。这种测定的结果总结在图12和图13中。GRN-/-细胞中颗粒体蛋白分泌的恢复在图14中示出。
实施例10：转导人CD34+骨髓细胞，之后分化成单核细胞
将市售的人CD34+骨髓细胞解冻并在X-VIVO 20、1％ HSA、300ng/mL的SCF、300ng/mL的Flt3-L、100ng/mL的TPO中进行培养(第0天)。在第1天和第2天，在4μg/mL的硫酸鱼精蛋白和1μg/mL的两性霉素B的存在下，用MOI3转导细胞。在第3天，将细胞重新铺板在扩增培养基(X-VIVO 20、1％HSA、PenStrep 1X、100ng/mL的SCF、100ng/mL的Flt3-L、100ng/mL的TPO)中。在第5天，将培养基更换为前髓样细胞扩增培养基(IMDM、5mM的HEPES、2mM的GlutaMax、10％的FBS、PenStrep 0.5X、100ng/mL的SCF、100ng/mL的IL-3)。并且在第8天更换成前髓样细胞分化培养基(IMDM、5mM的HEPES、2mM的GlutaMax、10％的FBS、PenStrep 0.5X、50ng/mL的SCF、20ng/mL的IL-3、20ng/mL的GM-CSF、100ng/mL的M-CSF)。在第12天通过流式细胞术分析细胞的谱系标志物和标记基因表达。
对分化细胞的CD11b和CD14表达的分析揭露了大于80％的分化的单核细胞。在单核细胞群内，分析了与颗粒体蛋白共表达的GFP标记基因表达(参见图15和图16)。
实施例11：CD34+细胞中附加启动子的分析
将人CD34+细胞解冻(第0天)并进行培养(在X-VIVO 20、1％ HSA、300ng/mL的SCF、300ng/mL的Flt3-L、100ng/mL的TPO中)。在第1天和第2天，用病毒感染粒子连续转导细胞三次(在转导增强剂(两性霉素B或Lentiboost)存在下)。从第2天结束到第5天，在前髓样细胞扩增培养基(IMDM、10％的FBS、PenStrep 0.5X、100ng/mL的SCF、100ng/mL的IL-3)中培养细胞。在第5天，将细胞重新铺板在前髓样细胞分化培养基(IMDM、20％的FBS、PenStrep 0.5X、100ng/mL的SCF、100ng/mL的IL-3、20ng/mL的G-CSF)中。在第7天通过FACS分析量化GFP标志物表达(图17)；在培养的第12天对VCN进行量化(图18)。
实施例12：转导的CD34+细胞中的载体拷贝数测定
-将分化方案第12天的细胞沉淀，并将所述细胞沉淀物储存在-20℃直至处理。
-按照制造商的方案使用
Figure BDA0003936132980001311
DNA血液微型试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从细胞沉淀物中分离出基因组DNA。
-使用FOXP2作为参考基因并使用WPRE作为整合的载体基因，通过qPCR和Δ-ΔCt方法测定VCN。
-携带2个γ整合的克隆H10被用作参考。
结果总结在图19和图20中。
实施例13：在HSPC和髓样细胞中的转基因表达
用慢病毒载体转导p47phox缺陷型iPSC，所述慢病毒载体在miR223启动子的控制下或在组成型活性SFFV启动子的控制下编码p47phox。细胞分化为拟胚体并进一步分化为单核细胞和巨噬细胞。iPSC(CD133+)。分析作为iPSC源性造血干细胞同源物的CD34阳性细胞在拟胚体、单核细胞(CD14+)和巨噬细胞(CD206)中的转基因p47phox表达。
图21示出了miR223启动子在单核细胞和巨噬细胞中是有活性的，但在iPSC源性造血干细胞同源物中是无活性的。
序列表
<110> 苏黎世大学 (Universität Zürich)
<120> 病毒载体
<130> AD2195 PCT BS
<160> 35
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 778
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> miR223启动子序列
<400> 1
acttgtacag cttcacaggg ctccatgctt agaaggaccc cacacttagt ttaatgttct 60
gctgtcatca tcttgatatt cttaattttt aaataaaggg cctatcgttt tcatttttta 120
ctgggccttg caaattatgt agctggttct gtatgccagg agagaagttg gaagtaaaat 180
ggtattccag gaccaggagg cattctggca gagtgaaaga acatgtgatt tggagtccat 240
ggggatgggt ttaaatttca gctttccact aatttgcttt gtgatactga gtatttcctt 300
ttatccctca gaggctctgt ttctcaattt tgactacggg ttttttcatt agataatgtc 360
tcagttctgg tattccaggt ttccctcaat tattctggga aaacctcctt gacccacagg 420
cagagcctag ggcagccagg tgctttctac tctctctctc tctgcagctt ggaaagttag 480
tgtctgttga aggtcagctg ggagttggtg gaggcagggc agtggcctgc tactattgct 540
gcagtagcag accctttcac aacagcattg ttttgtcatt ttgcatccag atttccgttg 600
gctaacctca gtcttatctt cctcatttct gtttcctgtt gaagacacca agggcccttc 660
aaaacacaga agcttcttgc tcacggcaga aagcccaatt ccatctggcc cctgcaggtt 720
ggctcagcac tggggaatca gagtcccctc catgaccaag gcaccactcc actgacag 778
<210> 2
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> P2Y12启动子序列
<400> 2
ggtgttggag aggatgtgga gaaataggaa cacttttaca ctgttggtgg gactataaac 60
tagttcaacc attgtggaag tcagtgtggt gattcctcag tgatctagaa ctagaaatac 120
catttaaccc agccatccca ttactgggta tatacccaaa ggattataag tcatgctgct 180
ataaagacac atgcacacgt atgtttattg cggcactatt cataatagca aagacttgga 240
accaacccaa aagtccaaca atgatagact ggattaagaa aatgtggcac atatacacca 300
tggaatacta tgcagccata aaaaatgatg agttcatgtc ctttgtaggg acatggatga 360
aattagaaat catcattctc agtaaactat cgcaagaaca aaaaaccaaa caccacatat 420
tctcactcat aggtgggaac tgaacaatga gaacacatgg acacaggaag ggaaacacta 480
cactctgggg actgttgtgg ggtgggggga tgggggaggg atagctttag gagatatacc 540
taatgctaaa tgacgagtta atgggtgtag cacaccagca tggcacatgt atacatatgt 600
aactaacctg cacattgtgc acatgtaccc taaaacttaa cgtataataa taataaaatt 660
aaaaaaaaaa agttaaagca gcaaaacact ttgcccttca atctcacccc taacatattt 720
tttgcccttc tggtttcaaa gttaaacaac tgtaaataat tgtgatacaa ggatgcctta 780
atttaatgtt atattttccc aaaaactcaa agttaggtaa agaaacaaaa aaaaattgtt 840
tatatttaaa ttctattcaa gaaaagcatg aacgacacag tatataataa gcctggcaat 900
ggatacaatc acttctctaa tgtaattttg gaatctgcta atttataata gaaggaagct 960
gtttcaccta caaaggagtt aatcaaacac aggtttaaaa taatgacatt attaaccaag 1020
ggaaaaacaa agggccagag acttaacatc cctagccagc acgcattttg agttaacata 1080
attacttgtt agaagaaaat acatcaccca gtgttgtaca caatatattt cagataaatt 1140
aaccacccaa gaaagcaagc ttaaaatctt ctccaggaag cagacttcga aggcttgatc 1200
tcaacttgga tttatcattt gcatagaaaa taaccataac tcgaagttat aaatcatcaa 1260
ctctatagca ggtttcagta aaaagccgca agattttaaa ttgcttttta aaagatgact 1320
tctcagccat cctcatccca catttcctgg gaaataaaag cagaagtcct aaaagaggac 1380
agatagaaat tcagtgtctg catagctttg agtccagtgt ttga 1424
<210> 3
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> TMEM119启动子序列
<400> 3
gttcctaccc agagagcacg cactcatcct tcatgcactc ccctgttcca aaccctcact 60
ggctccgtac tgcctccgac cttccgagac tttagcctgg ctcctgtcaa catctctgac 120
ccttactaca tgatcctctc tttggtccat gctccagcct aatctaattg cggtggcttg 180
tgcgtggtgg cattcccagc caccatacct ttacccacgc tggtccttcc atgcggaatg 240
cctttccagg gcctgctttg cccgcttctg ctcatacaca ggcatgccct ccaggatggc 300
ttcctacctc tttcccttgg gggattgatc tctctgtctt ggggttctcg gagcccttga 360
cctgacccct ttctgtttgg caaaaaagta atttacctcg gtgtccttct ccctggtagt 420
ctgtgagctc cccaaggctg ggctgtgcct gattcacctc tggaacttgc ttagcacagt 480
gcgtggcctg ctgcaggtgt tcattgagca cttgccgaat gaatgcatga atgaatgaat 540
gaatgaatga atgcaagggg ctgctaatcc acaggactcc tcaggtcagc cagacgtccc 600
ggttccaagg cctgccactg actcacctca ggaccctgct tgaaccatta gaactcaccc 660
tgcctcactt tccccctctg tgaaatgggg ctccaactcc tattcaagct actatcattt 720
gggggcattg tgaggccaca gatcccagaa catcagagtc agaggtagcc cagaaagctt 780
cccacccatc cctacaaatg ggaaactgag gtctggagag ggaagggcag agttgggctc 840
cctgtctcag gctcggaccc accatcaggc ctgtctctaa aacgaatccc agctcccacg 900
ctgcaccctg agcctggaag cctgagccac acaaggacgg ggaattttcc ttcccacttc 960
cagaggcctc tgaacctccc tgagcttgtc ccctttggag ggtattgggc agcagcgtgg 1020
gcagaacccc agctcactgt ctgggggagc gctgcaggac agccttgtct gtctgtctca 1080
gcctgccctg gggacccgag gtcagggagg aagtgccgca tctggtcttc cccagagcga 1140
gagtgtgagc aagggtggga ttgcgtgtgg cccgagagta gcccctcccc tccccctgtc 1200
cccaccccaa accctcttaa tgaaatcaag ctggccctgc ggcccagccg gggagggagg 1260
aaggaggagg gacgggagga gggacgggag gagggagggc gggcaggc 1308
<210> 4
<211> 1417
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> OLFML3启动子序列
<400> 4
gcagtgtcca gggtccttac ttcacatcat ctggatctga ccctttgaaa gaggtagaag 60
acttctgaga ccggctaatt aagctttgtt tcctcatatg ttttgccaga tagcagtagc 120
agaatgaaaa gatgagtaac cacaggaagc tgctattttt cccctccttt caaactgtac 180
tgttagagtc atggtccttt ttacagaagg aacctctcat cagattctgt tgattctaaa 240
gtgaatagaa tttctcccga taaagaaata ggggtttgtt tcgattaatg actgcaggtc 300
tctgagtaaa tgctctattt gatttttttt ttcggcccgt gtgtctacct tatggcccaa 360
gtctacctta tggtggccat taattcattt tgggctcctg cagccttagt tgggatatag 420
aaatgagaaa cactcagaaa tacccttttg gaccacaacc aagagaaata accaatagtc 480
ttttctccca gtggtaagga agtcagaata cattgatcta gactgcaaca acatatatat 540
atatatcaga ttccgccccc ccgcaataca tgaatgtata gtaaattagt gtgaactcac 600
tgaacactcc tcagttttgg tgagagacta tatctggcct ctttcaagca aaggaaagcc 660
atgtaaaaca gcgctgctgt cagccttaac ttccagacga tcgagttaat ttactaactt 720
ctcagtgacc tgtttttttt ttttttttaa tctcagttat attttcttcc ttgggctaaa 780
tcagatattt gcatagcccc caaagtagta attggatagt cttgggggaa atatgcattt 840
cagtggtgaa aacccctgta aattcaatat atttggcttt tgtggaaaat tttcctcatg 900
gggtgaagtc taagccttag tttctgtatt atcatgagag atgacaccag ctgcttagca 960
caaggtggcg ccaatgagct ttagaataag ttgggcttga ccacttgggc cattgttttc 1020
ctgcttcctc ccttcaagcc tcacctcccc agctcccagc ttctactgaa caaggctgaa 1080
aacccactct attgcaggga aagggaaaga ttaatgaaaa atgtcagttt cttaagtcag 1140
cactggtgaa actttcctaa aacaggaatg gcgtttgctg agttttctct ggggtctctg 1200
ctttctgcag ctagcttccc tgcttgactg cctagaaggc ctctgctttc gggtttccat 1260
ctctttcccc tccagaggac cctacagcct aggcgggagg tggttaaggc ttctggctgc 1320
tgtgcaatgg ggccatctgt gtttgatcaa tcctggcgga aaggaggggg tgggggttgt 1380
aaagagaact gaaagcattc cagagtagtg agagaga 1417
<210> 5
<211> 1247
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> AIF1启动子序列
<400> 5
cgcctgtagt cccagctact caggaggctg aggtaggaga attgcttgaa cccaggaggc 60
agtggttgca gtgagccgag attgcaccat tgcactcccg cctgggcgac agagcaagac 120
tccgactcaa aaaaaaaaaa aaaagcagca gcagcagcca gaggccactc cagcatctcc 180
cctacctggc ttgggtcagg gagagggcag tgagaagtga aaactcccag ctacagaaaa 240
ggaaatatgt tggggggaag ggagaaggaa aggtgtcttc atcaatgccg gggcagggta 300
gatggagccc tgggcaggga gtttggacca ggaaatctca atgagggaaa tgtgctgtcc 360
tcacctctcc aagaagcgac tggccaaaca gagtgacaga ggggataaag gttatgccta 420
gggaggcatg tgtcagaggc tatcatccac tctgttgaac ccacagtgac cagcaccacc 480
atcacacaaa catgcctgca tgtgtgcacg cacgtgcagt gtgcaaacct gatgtcagcc 540
tcactccctg gctcttctgt ccacaaacgc tgtttcttta agtaccactt tcagttcctc 600
caaagaatct acttaaactc ttaaattcct gatctctata gattttacta aagatttcaa 660
aggagataag atgagagggt tacgttgcac attctaaagc aaacaaatta aaatgttttg 720
ttagacattt ccatattttt aagggcctcc ttggagctgc caggctggga gtgaggtttc 780
tctccctttc taaaccctgt gcccatcttg tcaccctcct ggagctgcca gcagacttca 840
gattcttctc cgatctacag agcagaaaaa ttcagccagc ccttccttgt cttcctatcc 900
acagctgcct gcccagactc atgaaacctg acaaaatgca aggtcttatc attacctgaa 960
ccttggacct gttcaaaaat actagttcct gagaataaat atccctggtg tcttcctgcc 1020
cttcctgcac acctccagtg gcttatcaaa atatttgttt catgcgcaca ctgggctctc 1080
atttaagagg aatttgggag aatgttattt tctaatctgc atttcacacc aggctccccc 1140
tccttcctgg ggtgctagtg tcagcagaac ctgatgggga agtgaggtct gggaggcaga 1200
ggaggaagga atgaggggaa aggggaagtt tgggaggaag gcttctg 1247
<210> 6
<211> 1402
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGAM启动子序列
<400> 6
cgcacccagc caagtttgta catatatttt tgactacact tcttaactat tcttaggata 60
aattactaga agtgaaaatt cttgggtgaa gagcttgagg cctttacaca cacacacaca 120
cacacacaca aaaataggct ggatgcagtg gctcacacct gtaatctcag cagtttggga 180
ggctgaggaa ggaggatcac ttgagtccag gaggttgaga atagcctgaa caacatagca 240
agatcttgtc tctacaaaaa atttaaaaaa aattagctgg ccatggcagc atgtgcctgt 300
agtaccagct actcggaagg ctgaggtagg aggatcgctt gagcccagga ggttgattga 360
agctgcagtg agctgtgatt acaccactgc actccagcct gggcaacaga gctagactct 420
gtctctaaaa aaagcacaaa ataatattta aaaagcacca ggtatgcctg tacttgagtt 480
gtctttgttg atggctacaa atgaggacag ctctggctga agggcgcttc catttccatg 540
ggctgaagga gggacatttt gcaaagtgtg ttttcaggaa gacacagagt tttacctcct 600
acacttgttt gatctgtatt aatgtttgct tatttattta tttaattttt tttttgagac 660
agagtctcac tctgtcacct gggctggagt gcagtggcat tattgaggct cattgcagtc 720
tcagactcct gagctcaaac aatcctcctg cctcagcctc tggagtagct aggactacag 780
gcatgtgcca ccatgcctgg ctaatttttt aaatgtattt ttttgtagag tcggggtctc 840
cctatgttgc ccaggctgga gtgcagtggt gtgatcctag ctcactgcag cctggacctc 900
gggctcaagt aattctcaca cctcagcctg tccagtagca ggggctacag gcgcgcacca 960
ccatgcccag ctaattaaaa atattttttt gtagagacag ggtctctcta tgttgcccag 1020
gctggtttca aactcccagg ctcaagcaat cctcctgcct tggcctccca aagtgctggc 1080
attacaggcg tgagccactg cgcctggccc gtattaatgt ttagaacacg aattccagga 1140
ggcaggctaa gtctgttcag cttgttcata tgcttgggcc aacccaagaa acaagtgggt 1200
gacaaatggc accttttgga tagtggtatt gactttgaaa gtttgggtca ggaagctggg 1260
gaggaagggt gggcaggctg tgggcagtcc tgggcggaag accaggcagg gctatgtgct 1320
cactgagcct ccgccctctt cctttgaatc tctgatagac ttctgcctcc tacttctcct 1380
tttctgccct tctttgcttt gg 1402
<210> 7
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 颗粒蛋白前体同种型1
<400> 7
Met Trp Thr Leu Val Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Gly Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Pro Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu
20 25 30
Asp Pro Gly Gly Ala Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys
35 40 45
Trp Pro Thr Thr Leu Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp
50 55 60
Ala His Cys Ser Ala Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr
65 70 75 80
Ser Ser Cys Cys Pro Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His
85 90 95
His Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys
100 105 110
Phe Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys Pro Asp
115 120 125
Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met Val Asp
130 135 140
Gly Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp
145 150 155 160
Arg Val His Cys Cys Pro His Gly Ala Phe Cys Asp Leu Val His Thr
165 170 175
Arg Cys Ile Thr Pro Thr Gly Thr His Pro Leu Ala Lys Lys Leu Pro
180 185 190
Ala Gln Arg Thr Asn Arg Ala Val Ala Leu Ser Ser Ser Val Met Cys
195 200 205
Pro Asp Ala Arg Ser Arg Cys Pro Asp Gly Ser Thr Cys Cys Glu Leu
210 215 220
Pro Ser Gly Lys Tyr Gly Cys Cys Pro Met Pro Asn Ala Thr Cys Cys
225 230 235 240
Ser Asp His Leu His Cys Cys Pro Gln Asp Thr Val Cys Asp Leu Ile
245 250 255
Gln Ser Lys Cys Leu Ser Lys Glu Asn Ala Thr Thr Asp Leu Leu Thr
260 265 270
Lys Leu Pro Ala His Thr Val Gly Asp Val Lys Cys Asp Met Glu Val
275 280 285
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Ser Gly Ala Trp
290 295 300
Gly Cys Cys Pro Phe Thr Gln Ala Val Cys Cys Glu Asp His Ile His
305 310 315 320
Cys Cys Pro Ala Gly Phe Thr Cys Asp Thr Gln Lys Gly Thr Cys Glu
325 330 335
Gln Gly Pro His Gln Val Pro Trp Met Glu Lys Ala Pro Ala His Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Asp Pro Gln Ala Leu Lys Arg Asp Val Pro Cys Asp Asn
355 360 365
Val Ser Ser Cys Pro Ser Ser Asp Thr Cys Cys Gln Leu Thr Ser Gly
370 375 380
Glu Trp Gly Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val Cys Cys Ser Asp His
385 390 395 400
Gln His Cys Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Cys Val Ala Glu Gly Gln Cys
405 410 415
Gln Arg Gly Ser Glu Ile Val Ala Gly Leu Glu Lys Met Pro Ala Arg
420 425 430
Arg Ala Ser Leu Ser His Pro Arg Asp Ile Gly Cys Asp Gln His Thr
435 440 445
Ser Cys Pro Val Gly Gln Thr Cys Cys Pro Ser Leu Gly Gly Ser Trp
450 455 460
Ala Cys Cys Gln Leu Pro His Ala Val Cys Cys Glu Asp Arg Gln His
465 470 475 480
Cys Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Cys Asn Val Lys Ala Arg Ser Cys Glu
485 490 495
Lys Glu Val Val Ser Ala Gln Pro Ala Thr Phe Leu Ala Arg Ser Pro
500 505 510
His Val Gly Val Lys Asp Val Glu Cys Gly Glu Gly His Phe Cys His
515 520 525
Asp Asn Gln Thr Cys Cys Arg Asp Asn Arg Gln Gly Trp Ala Cys Cys
530 535 540
Pro Tyr Arg Gln Gly Val Cys Cys Ala Asp Arg Arg His Cys Cys Pro
545 550 555 560
Ala Gly Phe Arg Cys Ala Ala Arg Gly Thr Lys Cys Leu Arg Arg Glu
565 570 575
Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu
580 585 590
Leu
<210> 8
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 颗粒蛋白前体同种型2
<400> 8
Met Trp Thr Leu Val Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Gly Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Pro Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu
20 25 30
Asp Pro Gly Gly Ala Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys
35 40 45
Trp Pro Thr Thr Leu Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp
50 55 60
Ala His Cys Ser Ala Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr
65 70 75 80
Ser Ser Cys Cys Pro Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His
85 90 95
His Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys
100 105 110
Phe Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys Pro Asp
115 120 125
Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met Val Asp
130 135 140
Gly Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp
145 150 155 160
Arg Val His Cys Cys Pro His Gly Ala Phe Cys Asp Leu Val His Thr
165 170 175
Arg Cys Ile Thr Pro Thr Gly Thr His Pro Leu Ala Lys Lys Leu Pro
180 185 190
Ala Gln Arg Thr Asn Arg Ala Val Ala Leu Ser Ser Ser Val Met Cys
195 200 205
Pro Asp Ala Arg Ser Arg Cys Pro Asp Gly Ser Thr Cys Cys Glu Leu
210 215 220
Pro Ser Gly Lys Tyr Gly Cys Cys Pro Met Pro Asn Ala Thr Cys Cys
225 230 235 240
Ser Asp His Leu His Cys Cys Pro Gln Asp Thr Val Cys Asp Leu Ile
245 250 255
Gln Ser Lys Cys Leu Ser Lys Glu Asn Ala Thr Thr Asp Leu Leu Thr
260 265 270
Lys Leu Pro Ala His Thr Val Gly Asp Val Lys Cys Asp Met Glu Val
275 280 285
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Ser Gly Ala Trp
290 295 300
Gly Cys Cys Pro Phe Thr Gln Ala Val Cys Cys Glu Asp His Ile His
305 310 315 320
Cys Cys Pro Ala Gly Phe Thr Cys Asp Thr Gln Lys Gly Thr Cys Glu
325 330 335
Gln Gly Pro His Gln Val Pro Trp Met Glu Lys Ala Pro Ala His Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Asp Pro Gln Ala Leu Lys Arg Asp Val Pro Cys Asp Asn
355 360 365
Val Ser Ser Cys Pro Ser Ser Asp Thr Cys Cys Arg Asp Asn Arg Gln
370 375 380
Gly Trp Ala Cys Cys Pro Tyr Arg Gln Gly Val Cys Cys Ala Asp Arg
385 390 395 400
Arg His Cys Cys Pro Ala Gly Phe Arg Cys Ala Ala Arg Gly Thr Lys
405 410 415
Cys Leu Arg Arg Glu Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro
420 425 430
Ala Leu Arg Gln Leu Leu
435
<210> 9
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 颗粒蛋白前体同种型3
<400> 9
Met Ala Ile Thr Ala Ala His Gly Ala Ser Thr Ala Val Gln Thr Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Lys Asp Gln Val Thr Thr Pro Trp Val Pro Ser Ser
20 25 30
Ala Leu Ile Val Ser Ser Asn Ala Arg Thr Ser Pro Arg Ala Val Leu
35 40 45
Trp Ser Met Ala Pro Gly Gly Ala Ala Pro Cys Pro Arg Leu Pro Ala
50 55 60
Val Lys Thr Gly Cys Thr Ala Val Cys Asp Leu Ile Gln Ser Lys Cys
65 70 75 80
Leu Ser Lys Glu Asn Ala Thr Thr Asp Leu Leu Thr Lys Leu Pro Ala
85 90 95
His Thr Val Gly Asp Val Lys Cys Asp Met Glu Val Ser Cys Pro Asp
100 105 110
Gly Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Ser Gly Ala Trp Gly Cys Cys Pro
115 120 125
Phe Thr Gln Ala Val Cys Cys Glu Asp His Ile His Cys Cys Pro Ala
130 135 140
Gly Phe Thr Cys Asp Thr Gln Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro His
145 150 155 160
Gln Val Pro Trp Met Glu Lys Ala Pro Ala His Leu Ser Leu Pro Asp
165 170 175
Pro Gln Ala Leu Lys Arg Asp Val Pro Cys Asp Asn Val Ser Ser Cys
180 185 190
Pro Ser Ser Asp Thr Cys Cys Gln Leu Thr Ser Gly Glu Trp Gly Cys
195 200 205
Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val Cys Cys Ser Asp His Gln His Cys Cys
210 215 220
Pro Gln Gly Tyr Thr Cys Val Ala Glu Gly Gln Cys Gln Arg Gly Ser
225 230 235 240
Glu Ile Val Ala Gly Leu Glu Lys Met Pro Ala Arg Arg Ala Ser Leu
245 250 255
Ser His Pro Arg Asp Ile Gly Cys Asp Gln His Thr Ser Cys Pro Val
260 265 270
Gly Gln Thr Cys Cys Pro Ser Leu Gly Gly Ser Trp Ala Cys Cys Gln
275 280 285
Leu Pro His Ala Val Cys Cys Glu Asp Arg Gln His Cys Cys Pro Ala
290 295 300
Gly Tyr Thr Cys Asn Val Lys Ala Arg Ser Cys Glu Lys Glu Val Val
305 310 315 320
Ser Ala Gln Pro Ala Thr Phe Leu Ala Arg Ser Pro His Val Gly Val
325 330 335
Lys Asp Val Glu Cys Gly Glu Gly His Phe Cys His Asp Asn Gln Thr
340 345 350
Cys Cys Arg Asp Asn Arg Gln Gly Trp Ala Cys Cys Pro Tyr Arg Gln
355 360 365
Gly Val Cys Cys Ala Asp Arg Arg His Cys Cys Pro Ala Gly Phe Arg
370 375 380
Cys Ala Ala Arg Gly Thr Lys Cys Leu Arg Arg Glu Ala Pro Arg Trp
385 390 395 400
Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
405 410
<210> 10
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人干扰素-γ
<400> 10
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp
50 55 60
Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
65 70 75 80
Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
85 90 95
Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg
100 105 110
Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val
115 120 125
Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser
130 135 140
Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
145 150 155 160
Gly Arg Arg Ala Ser Gln
165
<210> 11
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-12亚基α
<400> 11
Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
20 25 30
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
35 40 45
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
50 55 60
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
65 70 75 80
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
85 90 95
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
100 105 110
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
115 120 125
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
145 150 155 160
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
165 170 175
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
195 200 205
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
210 215
<210> 12
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-12亚基β
<400> 12
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 13
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人GM-CSF
<400> 13
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
20 25 30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
130 135 140
<210> 14
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人G-CSF
<400> 14
Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
35 40 45
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
50 55 60
Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
65 70 75 80
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
85 90 95
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
100 105 110
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
115 120 125
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
130 135 140
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
145 150 155 160
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
165 170 175
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
180 185 190
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
195 200 205
<210> 15
<211> 1532
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> GM-CSF—INF-γ共表达构建体
<400> 15
tccttccagc catgtttaaa tatacaagtt atatcttggc ttttcagctc tgcatcgttt 60
tgggttctct tggctgttac tgccaggacc catatgtaaa agaagcagaa aaccttaaga 120
aatattttaa tgccggtcat tcagatgtag cggataatgg aactcttttc ttaggcattt 180
tgaagaattg gaaagaggag agtgacagaa aaataatgca gagccaaatt gtctcctttt 240
acttcaaact ttttaagaac tttaaggatg accagagcat ccaaaagagt gtggagacca 300
tcaaggaaga catgaatgtc aagtttttca atagcaacaa aaagaaacga gatgacttcg 360
aaaagctgac taattattcg gtaactgact tgaatgtcca acgcaaagca atacatgaac 420
tcatccaagt gatggctgaa ctgtcgccag cagcgaaaac agggaagcga aaaaggagtc 480
agatgctgtt tcgaggtcga agagcatccc agtaagatat cccctctccc tccccccccc 540
ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 600
tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 660
tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 720
tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 780
tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 840
tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 900
tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 960
agatacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 1020
agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa 1080
aaacacgatg ataaatgtgg ccactgcaaa gtctgctttt gctgggcacc gtagcttgta 1140
gcatatcagc gcctgctcgg agtccctctc catcaacgca accctgggaa cacgtgaacg 1200
caattcagga ggcaagaagg ttgctgaacc tgagccggga caccgccgct gaaatgaatg 1260
aaaccgtaga agtgatttcc gagatgtttg acctccaaga accaacttgt ctgcaaacaa 1320
gacttgagct ttataaacag ggactccgag gcagcctgac aaaactcaag gggcccctca 1380
caatgatggc aagccattat aaacaacact gtcctccgac cccggagact tcttgcgcca 1440
cacagatcat cacttttgag agcttcaaag agaaccttaa agactttctg ctggtcattc 1500
cgttcgattg ctgggaaccc gtgcaggagt ga 1532
<210> 16
<211> 1718
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> G-CSF—INF-γ共表达构建体
<400> 16
tccttccagc catgtttaaa tatacaagtt atatcttggc ttttcagctc tgcatcgttt 60
tgggttctct tggctgttac tgccaggacc catatgtaaa agaagcagaa aaccttaaga 120
aatattttaa tgccggtcat tcagatgtag cggataatgg aactcttttc ttaggcattt 180
tgaagaattg gaaagaggag agtgacagaa aaataatgca gagccaaatt gtctcctttt 240
acttcaaact ttttaagaac tttaaggatg accagagcat ccaaaagagt gtggagacca 300
tcaaggaaga catgaatgtc aagtttttca atagcaacaa aaagaaacga gatgacttcg 360
aaaagctgac taattattcg gtaactgact tgaatgtcca acgcaaagca atacatgaac 420
tcatccaagt gatggctgaa ctgtcgccag cagcgaaaac agggaagcga aaaaggagtc 480
agatgctgtt tcgaggtcga agagcatccc agtaagatat cccctctccc tccccccccc 540
ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 600
tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 660
tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 720
tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 780
tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 840
tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 900
tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 960
agatacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 1020
agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa 1080
aaacacgatg ataaatggcc ggccccgcca cccagagccc catgaagctg atggccctgc 1140
agctgctgct gtggcacagc gccctgtgga ccgtgcagga ggccaccccc ctcggccccg 1200
ccagcagcct gccccagagc ttcctgctga agtgcctcga acaagtgcgc aagatacaag 1260
gcgacggcgc cgccctgcag gagaagctcg tgagcgagtg cgccacctac aagctgtgcc 1320
accccgagga gctggtgctg ctgggccaca gcctcggcat cccctgggcc cccctgagca 1380
gctgccccag ccaagccctg cagctggccg gctgcctgag ccagctgcac agcggcctgt 1440
tcctgtacca aggcttacta caggccctcg aaggcatcag ccccgagctg ggccccaccc 1500
tcgacaccct gcagctggac gtggccgact tcgccaccac catctggcag cagatggagg 1560
agctgggcat ggcccccgcc ctgcagccca cccaaggcgc catgcccgcc ttcgccagcg 1620
ccttccagcg ccgcgccggg ggcgtgctgg tggccagcca cctgcagagc ttcctcgaag 1680
tgagctaccg cgtgctgcgc cacctcgccc agccctga 1718
<210> 17
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-2
<400> 17
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 18
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-15
<400> 18
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 19
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IL-21
<400> 19
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
85 90 95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
100 105 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
145 150 155 160
Asp Ser
<210> 20
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IFN-α
<400> 20
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser
35 40 45
Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His
65 70 75 80
Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
100 105 110
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
115 120 125
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys
130 135 140
Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu
165 170 175
Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
180 185
<210> 21
<211> 760
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> P2Y12启动子序列2 (760 bp)
<400> 21
ttgcccttca atctcacccc taacatattt tttgcccttc tggtttcaaa gttaaacaac 60
tgtaaataat tgtgatacaa ggatgcctta atttaatgtt atattttccc aaaaactcaa 120
agttaggtaa agaaacaaaa aaaaattgtt tatatttaaa ttctattcaa gaaaagcatg 180
aacgacacag tatataataa gcctggcaat ggatacaatc acttctctaa tgtaattttg 240
gaatctgcta atttataata gaaggaagct gtttcaccta caaaggagtt aatcaaacac 300
aggtttaaaa taatgacatt attaaccaag ggaaaaacaa agggccagag acttaacatc 360
cctagccagc acgcattttg agttaacata attacttgtt agaagaaaat acatcaccca 420
gtgttgtaca caatatattt cagataaatt aaccacccaa gaaagcaagc ttaaaatctt 480
ctccaggaag cagacttcga aggcttgatc tcaacttgga tttatcattt gcatagaaaa 540
taaccataac tcgaagttat aaatcatcaa ctctatagca ggtttcagta aaaagccgca 600
agattttaaa ttgcttttta aaagatgact tctcagccat cctcatccca catttcctgg 660
gaaataaaag cagaagtcct aaaagaggac agatagaaat tcagtgtctg catagctttg 720
agtccagtgt ttgaagacaa tctctgattg tgaagccctc 760
<210> 22
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> P2Y12启动子序列3 (438 bp)
<400> 22
taaccaaggg aaaaacaaag ggccagagac ttaacatccc tagccagcac gcattttgag 60
ttaacataat tacttgttag aagaaaatac atcacccagt gttgtacaca atatatttca 120
gataaattaa ccacccaaga aagcaagctt aaaatcttct ccaggaagca gacttcgaag 180
gcttgatctc aacttggatt tatcatttgc atagaaaata accataactc gaagttataa 240
atcatcaact ctatagcagg tttcagtaaa aagccgcaag attttaaatt gctttttaaa 300
agatgacttc tcagccatcc tcatcccaca tttcctggga aataaaagca gaagtcctaa 360
aagaggacag atagaaattc agtgtctgca tagctttgag tccagtgttt gaagacaatc 420
tctgattgtg aagccctc 438
<210> 23
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> TMEM119启动子序列2 (1005 bp)
<400> 23
cccttgacct gacccctttc tgtttggcaa aaaagtaatt tacctcggtg tccttctccc 60
tggtagtctg tgagctcccc aaggctgggc tgtgcctgat tcacctctgg aacttgctta 120
gcacagtgcg tggcctgctg caggtgttca ttgagcactt gccgaatgaa tgcatgaatg 180
aatgaatgaa tgaatgaatg caaggggctg ctaatccaca ggactcctca ggtcagccag 240
acgtcccggt tccaaggcct gccactgact cacctcagga ccctgcttga accattagaa 300
ctcaccctgc ctcactttcc ccctctgtga aatggggctc caactcctat tcaagctact 360
atcatttggg ggcattgtga ggccacagat cccagaacat cagagtcaga ggtagcccag 420
aaagcttccc acccatccct acaaatggga aactgaggtc tggagaggga agggcagagt 480
tgggctccct gtctcaggct cggacccacc atcaggcctg tctctaaaac gaatcccagc 540
tcccacgctg caccctgagc ctggaagcct gagccacaca aggacgggga attttccttc 600
ccacttccag aggcctctga acctccctga gcttgtcccc tttggagggt attgggcagc 660
agcgtgggca gaaccccagc tcactgtctg ggggagcgct gcaggacagc cttgtctgtc 720
tgtctcagcc tgccctgggg acccgaggtc agggaggaag tgccgcatct ggtcttcccc 780
agagcgagag tgtgagcaag ggtgggattg cgtgtggccc gagagtagcc cctcccctcc 840
ccctgtcccc accccaaacc ctcttaatga aatcaagctg gccctgcggc ccagccgggg 900
agggaggaag gaggagggac gggaggaggg acgggaggag ggagggcggg caggcgccag 960
cccagagcag ccccgggcac cagcacggac tctctcttcc atcta 1005
<210> 24
<211> 590
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> TMEM119启动子序列3 (590 bp)
<400> 24
cccagaaagc ttcccaccca tccctacaaa tgggaaactg aggtctggag agggaagggc 60
agagttgggc tccctgtctc aggctcggac ccaccatcag gcctgtctct aaaacgaatc 120
ccagctccca cgctgcaccc tgagcctgga agcctgagcc acacaaggac ggggaatttt 180
ccttcccact tccagaggcc tctgaacctc cctgagcttg tcccctttgg agggtattgg 240
gcagcagcgt gggcagaacc ccagctcact gtctggggga gcgctgcagg acagccttgt 300
ctgtctgtct cagcctgccc tggggacccg aggtcaggga ggaagtgccg catctggtct 360
tccccagagc gagagtgtga gcaagggtgg gattgcgtgt ggcccgagag tagcccctcc 420
cctccccctg tccccacccc aaaccctctt aatgaaatca agctggccct gcggcccagc 480
cggggaggga ggaaggagga gggacgggag gagggacggg aggagggagg gcgggcaggc 540
gccagcccag agcagccccg ggcaccagca cggactctct cttccatcta 590
<210> 25
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> OLFML3启动子序列2 (990 bp)
<400> 25
tacccttttg gaccacaacc aagagaaata accaatagtc ttttctccca gtggtaagga 60
agtcagaata cattgatcta gactgcaaca acatatatat atatatcaga ttccgccccc 120
ccgcaataca tgaatgtata gtaaattagt gtgaactcac tgaacactcc tcagttttgg 180
tgagagacta tatctggcct ctttcaagca aaggaaagcc atgtaaaaca gcgctgctgt 240
cagccttaac ttccagacga tcgagttaat ttactaactt ctcagtgacc tgtttttttt 300
ttttttttaa tctcagttat attttcttcc ttgggctaaa tcagatattt gcatagcccc 360
caaagtagta attggatagt cttgggggaa atatgcattt cagtggtgaa aacccctgta 420
aattcaatat atttggcttt tgtggaaaat tttcctcatg gggtgaagtc taagccttag 480
tttctgtatt atcatgagag atgacaccag ctgcttagca caaggtggcg ccaatgagct 540
ttagaataag ttgggcttga ccacttgggc cattgttttc ctgcttcctc ccttcaagcc 600
tcacctcccc agctcccagc ttctactgaa caaggctgaa aacccactct attgcaggga 660
aagggaaaga ttaatgaaaa atgtcagttt cttaagtcag cactggtgaa actttcctaa 720
aacaggaatg gcgtttgctg agttttctct ggggtctctg ctttctgcag ctagcttccc 780
tgcttgactg cctagaaggc ctctgctttc gggtttccat ctctttcccc tccagaggac 840
cctacagcct aggcgggagg tggttaaggc ttctggctgc tgtgcaatgg ggccatctgt 900
gtttgatcaa tcctggcgga aaggaggggg tgggggttgt aaagagaact gaaagcattc 960
cagagtagtg agagagaccc agagatcagg 990
<210> 26
<211> 1544
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> miR223_P2RY12 (760 bp)融合启动子
<400> 26
acttgtacag cttcacaggg ctccatgctt agaaggaccc cacacttagt ttaatgttct 60
gctgtcatca tcttgatatt cttaattttt aaataaaggg cctatcgttt tcatttttta 120
ctgggccttg caaattatgt agctggttct gtatgccagg agagaagttg gaagtaaaat 180
ggtattccag gaccaggagg cattctggca gagtgaaaga acatgtgatt tggagtccat 240
ggggatgggt ttaaatttca gctttccact aatttgcttt gtgatactga gtatttcctt 300
ttatccctca gaggctctgt ttctcaattt tgactacggg ttttttcatt agataatgtc 360
tcagttctgg tattccaggt ttccctcaat tattctggga aaacctcctt gacccacagg 420
cagagcctag ggcagccagg tgctttctac tctctctctc tctgcagctt ggaaagttag 480
tgtctgttga aggtcagctg ggagttggtg gaggcagggc agtggcctgc tactattgct 540
gcagtagcag accctttcac aacagcattg ttttgtcatt ttgcatccag atttccgttg 600
gctaacctca gtcttatctt cctcatttct gtttcctgtt gaagacacca agggcccttc 660
aaaacacaga agcttcttgc tcacggcaga aagcccaatt ccatctggcc cctgcaggtt 720
ggctcagcac tggggaatca gagtcccctc catgaccaag gcaccactcc actgacaggg 780
atccttgccc ttcaatctca cccctaacat attttttgcc cttctggttt caaagttaaa 840
caactgtaaa taattgtgat acaaggatgc cttaatttaa tgttatattt tcccaaaaac 900
tcaaagttag gtaaagaaac aaaaaaaaat tgtttatatt taaattctat tcaagaaaag 960
catgaacgac acagtatata ataagcctgg caatggatac aatcacttct ctaatgtaat 1020
tttggaatct gctaatttat aatagaagga agctgtttca cctacaaagg agttaatcaa 1080
acacaggttt aaaataatga cattattaac caagggaaaa acaaagggcc agagacttaa 1140
catccctagc cagcacgcat tttgagttaa cataattact tgttagaaga aaatacatca 1200
cccagtgttg tacacaatat atttcagata aattaaccac ccaagaaagc aagcttaaaa 1260
tcttctccag gaagcagact tcgaaggctt gatctcaact tggatttatc atttgcatag 1320
aaaataacca taactcgaag ttataaatca tcaactctat agcaggtttc agtaaaaagc 1380
cgcaagattt taaattgctt tttaaaagat gacttctcag ccatcctcat cccacatttc 1440
ctgggaaata aaagcagaag tcctaaaaga ggacagatag aaattcagtg tctgcatagc 1500
tttgagtcca gtgtttgaag acaatctctg attgtgaagc cctc 1544
<210> 27
<211> 1222
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> miR223_P2RY12 (438 bp)融合启动子
<400> 27
acttgtacag cttcacaggg ctccatgctt agaaggaccc cacacttagt ttaatgttct 60
gctgtcatca tcttgatatt cttaattttt aaataaaggg cctatcgttt tcatttttta 120
ctgggccttg caaattatgt agctggttct gtatgccagg agagaagttg gaagtaaaat 180
ggtattccag gaccaggagg cattctggca gagtgaaaga acatgtgatt tggagtccat 240
ggggatgggt ttaaatttca gctttccact aatttgcttt gtgatactga gtatttcctt 300
ttatccctca gaggctctgt ttctcaattt tgactacggg ttttttcatt agataatgtc 360
tcagttctgg tattccaggt ttccctcaat tattctggga aaacctcctt gacccacagg 420
cagagcctag ggcagccagg tgctttctac tctctctctc tctgcagctt ggaaagttag 480
tgtctgttga aggtcagctg ggagttggtg gaggcagggc agtggcctgc tactattgct 540
gcagtagcag accctttcac aacagcattg ttttgtcatt ttgcatccag atttccgttg 600
gctaacctca gtcttatctt cctcatttct gtttcctgtt gaagacacca agggcccttc 660
aaaacacaga agcttcttgc tcacggcaga aagcccaatt ccatctggcc cctgcaggtt 720
ggctcagcac tggggaatca gagtcccctc catgaccaag gcaccactcc actgacaggg 780
atcctaacca agggaaaaac aaagggccag agacttaaca tccctagcca gcacgcattt 840
tgagttaaca taattacttg ttagaagaaa atacatcacc cagtgttgta cacaatatat 900
ttcagataaa ttaaccaccc aagaaagcaa gcttaaaatc ttctccagga agcagacttc 960
gaaggcttga tctcaacttg gatttatcat ttgcatagaa aataaccata actcgaagtt 1020
ataaatcatc aactctatag caggtttcag taaaaagccg caagatttta aattgctttt 1080
taaaagatga cttctcagcc atcctcatcc cacatttcct gggaaataaa agcagaagtc 1140
ctaaaagagg acagatagaa attcagtgtc tgcatagctt tgagtccagt gtttgaagac 1200
aatctctgat tgtgaagccc tc 1222
<210> 28
<211> 1789
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> miR223_TMEM119融合启动子
<400> 28
acttgtacag cttcacaggg ctccatgctt agaaggaccc cacacttagt ttaatgttct 60
gctgtcatca tcttgatatt cttaattttt aaataaaggg cctatcgttt tcatttttta 120
ctgggccttg caaattatgt agctggttct gtatgccagg agagaagttg gaagtaaaat 180
ggtattccag gaccaggagg cattctggca gagtgaaaga acatgtgatt tggagtccat 240
ggggatgggt ttaaatttca gctttccact aatttgcttt gtgatactga gtatttcctt 300
ttatccctca gaggctctgt ttctcaattt tgactacggg ttttttcatt agataatgtc 360
tcagttctgg tattccaggt ttccctcaat tattctggga aaacctcctt gacccacagg 420
cagagcctag ggcagccagg tgctttctac tctctctctc tctgcagctt ggaaagttag 480
tgtctgttga aggtcagctg ggagttggtg gaggcagggc agtggcctgc tactattgct 540
gcagtagcag accctttcac aacagcattg ttttgtcatt ttgcatccag atttccgttg 600
gctaacctca gtcttatctt cctcatttct gtttcctgtt gaagacacca agggcccttc 660
aaaacacaga agcttcttgc tcacggcaga aagcccaatt ccatctggcc cctgcaggtt 720
ggctcagcac tggggaatca gagtcccctc catgaccaag gcaccactcc actgacaggg 780
atcccccttg acctgacccc tttctgtttg gcaaaaaagt aatttacctc ggtgtccttc 840
tccctggtag tctgtgagct ccccaaggct gggctgtgcc tgattcacct ctggaacttg 900
cttagcacag tgcgtggcct gctgcaggtg ttcattgagc acttgccgaa tgaatgcatg 960
aatgaatgaa tgaatgaatg aatgcaaggg gctgctaatc cacaggactc ctcaggtcag 1020
ccagacgtcc cggttccaag gcctgccact gactcacctc aggaccctgc ttgaaccatt 1080
agaactcacc ctgcctcact ttccccctct gtgaaatggg gctccaactc ctattcaagc 1140
tactatcatt tgggggcatt gtgaggccac agatcccaga acatcagagt cagaggtagc 1200
ccagaaagct tcccacccat ccctacaaat gggaaactga ggtctggaga gggaagggca 1260
gagttgggct ccctgtctca ggctcggacc caccatcagg cctgtctcta aaacgaatcc 1320
cagctcccac gctgcaccct gagcctggaa gcctgagcca cacaaggacg gggaattttc 1380
cttcccactt ccagaggcct ctgaacctcc ctgagcttgt cccctttgga gggtattggg 1440
cagcagcgtg ggcagaaccc cagctcactg tctgggggag cgctgcagga cagccttgtc 1500
tgtctgtctc agcctgccct ggggacccga ggtcagggag gaagtgccgc atctggtctt 1560
ccccagagcg agagtgtgag caagggtggg attgcgtgtg gcccgagagt agcccctccc 1620
ctccccctgt ccccacccca aaccctctta atgaaatcaa gctggccctg cggcccagcc 1680
ggggagggag gaaggaggag ggacgggagg agggacggga ggagggaggg cgggcaggcg 1740
ccagcccaga gcagccccgg gcaccagcac ggactctctc ttccatcta 1789
<210> 29
<211> 1774
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> miR223_OLFML3融合启动子
<400> 29
acttgtacag cttcacaggg ctccatgctt agaaggaccc cacacttagt ttaatgttct 60
gctgtcatca tcttgatatt cttaattttt aaataaaggg cctatcgttt tcatttttta 120
ctgggccttg caaattatgt agctggttct gtatgccagg agagaagttg gaagtaaaat 180
ggtattccag gaccaggagg cattctggca gagtgaaaga acatgtgatt tggagtccat 240
ggggatgggt ttaaatttca gctttccact aatttgcttt gtgatactga gtatttcctt 300
ttatccctca gaggctctgt ttctcaattt tgactacggg ttttttcatt agataatgtc 360
tcagttctgg tattccaggt ttccctcaat tattctggga aaacctcctt gacccacagg 420
cagagcctag ggcagccagg tgctttctac tctctctctc tctgcagctt ggaaagttag 480
tgtctgttga aggtcagctg ggagttggtg gaggcagggc agtggcctgc tactattgct 540
gcagtagcag accctttcac aacagcattg ttttgtcatt ttgcatccag atttccgttg 600
gctaacctca gtcttatctt cctcatttct gtttcctgtt gaagacacca agggcccttc 660
aaaacacaga agcttcttgc tcacggcaga aagcccaatt ccatctggcc cctgcaggtt 720
ggctcagcac tggggaatca gagtcccctc catgaccaag gcaccactcc actgacaggg 780
atcctaccct tttggaccac aaccaagaga aataaccaat agtcttttct cccagtggta 840
aggaagtcag aatacattga tctagactgc aacaacatat atatatatat cagattccgc 900
ccccccgcaa tacatgaatg tatagtaaat tagtgtgaac tcactgaaca ctcctcagtt 960
ttggtgagag actatatctg gcctctttca agcaaaggaa agccatgtaa aacagcgctg 1020
ctgtcagcct taacttccag acgatcgagt taatttacta acttctcagt gacctgtttt 1080
tttttttttt ttaatctcag ttatattttc ttccttgggc taaatcagat atttgcatag 1140
cccccaaagt agtaattgga tagtcttggg ggaaatatgc atttcagtgg tgaaaacccc 1200
tgtaaattca atatatttgg cttttgtgga aaattttcct catggggtga agtctaagcc 1260
ttagtttctg tattatcatg agagatgaca ccagctgctt agcacaaggt ggcgccaatg 1320
agctttagaa taagttgggc ttgaccactt gggccattgt tttcctgctt cctcccttca 1380
agcctcacct ccccagctcc cagcttctac tgaacaaggc tgaaaaccca ctctattgca 1440
gggaaaggga aagattaatg aaaaatgtca gtttcttaag tcagcactgg tgaaactttc 1500
ctaaaacagg aatggcgttt gctgagtttt ctctggggtc tctgctttct gcagctagct 1560
tccctgcttg actgcctaga aggcctctgc tttcgggttt ccatctcttt cccctccaga 1620
ggaccctaca gcctaggcgg gaggtggtta aggcttctgg ctgctgtgca atggggccat 1680
ctgtgtttga tcaatcctgg cggaaaggag ggggtggggg ttgtaaagag aactgaaagc 1740
attccagagt agtgagagag acccagagat cagg 1774
<210> 30
<211> 1779
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 颗粒蛋白前体同种型1
<400> 30
atgtggacac tggtgagttg ggtggcattg acagcaggtc tggtagcagg cacaagatgt 60
ccagatggtc agttttgtcc agtggcttgt tgtcttgacc ctgggggtgc ctcatatagt 120
tgctgccgcc cactgctcga taagtggcct accacactga gtcgccactt gggtggtcct 180
tgtcaagttg atgcccattg ttcagcagga cattcatgca tctttaccgt aagcggaacc 240
agttcctgtt gcccatttcc agaggcagta gcgtgtgggg acggtcacca ctgttgccca 300
aggggattcc actgctcagc cgacggcagg agttgtttcc agaggagcgg caataactct 360
gtcggggcaa tccagtgtcc agacagccag tttgagtgcc ctgacttttc tacttgctgc 420
gtgatggttg acggctcctg gggttgctgt ccaatgcccc aggcaagttg ctgtgaggat 480
agagtgcact gctgccccca cggcgcattt tgcgacctgg ttcatactag gtgtatcacc 540
cccactggta cacaccccct cgctaaaaag ctcccagctc agagaactaa cagagccgtt 600
gcgttgtcat cctccgtcat gtgtcctgat gcacggagca gatgtccaga tggaagcaca 660
tgctgtgagc tgccaagcgg caagtacggc tgttgtccga tgcccaacgc cacctgttgt 720
tcagaccacc ttcattgttg tccacaggac accgtgtgtg acctcattca gagcaaatgc 780
ctgagtaaag aaaacgcgac tacagacctc ctcacaaagt tgcccgcgca cacagtgggg 840
gatgtgaaat gtgacatgga agtgtcctgt cctgacgggt acacttgctg tagacttcag 900
tctggcgcgt gggggtgctg tccttttacc caggcagtgt gctgtgaaga ccacattcat 960
tgttgccccg cagggttcac atgtgacaca caaaagggaa cctgcgaaca gggtcctcac 1020
caggtgcctt ggatggagaa agccccagca catctgtcac tgcctgaccc tcaagctttg 1080
aaacgggacg tgccttgcga caatgtgtct tcctgtcctt catctgacac gtgctgccaa 1140
ttgacaagtg gagagtgggg atgctgcccc attccagagg ccgtctgttg cagcgaccat 1200
cagcactgtt gtccccaggg atacacgtgt gtggccgagg gacagtgtca gcgagggagt 1260
gagattgtgg ctggtctgga aaagatgcca gcaagaagag cgtccctttc tcatcccagg 1320
gatattggct gtgaccaaca cactagctgt cctgtgggtc agacatgttg ccccagtctg 1380
ggtggttcat gggcctgctg ccagctccct catgccgttt gttgcgaaga ccgccagcat 1440
tgctgtccag cgggatacac atgcaacgtg aaggcacgga gctgtgaaaa ggaagtcgta 1500
tcagcacagc ccgcaacttt tctcgctcgc tccccccatg tgggggtaaa ggacgtggag 1560
tgtggtgagg gccatttctg ccacgataac cagacatgtt gccgcgataa tcgccagggt 1620
tgggcctgct gtccctacag acagggagtc tgctgtgctg ataggcgaca ttgttgtcca 1680
gcaggattta ggtgtgctgc gagaggcacg aaatgcctga ggcgggaggc tccaagatgg 1740
gatgcacctc ttcgggaccc agctctcagg caactgctg 1779
<210> 31
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 颗粒蛋白前体同种型2
<400> 31
atgtggaccc tcgtatcttg ggttgctctt acagcaggtc tcgttgcagg gactagatgt 60
cctgacggac agttttgccc tgtggcatgt tgtctggacc caggcggagc atcctactca 120
tgttgtcgcc ccctcctgga caagtggcct actactctgt caagacattt gggaggaccc 180
tgtcaagttg acgcccattg ttccgcagga cactcttgca tctttactgt ctctgggaca 240
agctcctgtt gcccatttcc tgaagccgtg gcttgcggcg acggacatca ctgttgtcca 300
cgagggttcc attgctcagc agatggcaga agctgttttc aaaggagtgg gaacaattcc 360
gtaggcgcaa ttcagtgccc agattcacag ttcgagtgcc ctgatttcag cacctgctgt 420
gtgatggtcg atgggtcatg gggatgctgc cctatgccac aagcctcttg ttgtgaggac 480
cgagtccact gttgccctca tggcgcattt tgtgacctgg tgcatacaag gtgcatcacg 540
cccacaggaa cccaccccct tgctaaaaaa cttccagcac aaaggacaaa cagagccgtt 600
gctctctctt cttccgtgat gtgccccgac gccagaagca gatgcccaga tggctcaact 660
tgttgcgagc tgcctagtgg gaagtacggg tgctgcccaa tgccaaatgc cacgtgttgc 720
tctgaccacc ttcactgctg cccgcaagat actgtgtgcg acctgattca gtccaaatgt 780
ttgtctaagg aaaatgccac caccgacctg ctgacaaaac ttcccgctca cacagtgggg 840
gacgtgaaat gtgatatgga ggtttcatgc cccgacgggt atacatgttg tagattgcag 900
agcggcgcat ggggatgttg tccattcacc caggctgttt gttgcgagga ccacatccac 960
tgttgtcctg ctgggttcac atgcgacaca caaaaaggca cttgcgagca aggaccacac 1020
caggttcctt ggatggagaa agccccagcc cacctgtctt tgcctgaccc tcaggctttg 1080
aagcgcgatg taccctgcga caacgtttct tcctgtccct cctccgatac atgttgcaga 1140
gacaatagac agggatgggc ttgttgtcct tatcgacagg gcgtttgctg cgctgatagg 1200
aggcattgtt gtcccgcagg ttttcggtgc gctgctaggg gaacaaaatg tctgagacgg 1260
gaggctccaa gatgggatgc tcctttgcgc gaccccgctc tgcgacaact gctc 1314
<210> 32
<211> 1239
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 颗粒蛋白前体同种型3
<400> 32
atggcaataa ctgctgcaca tggggcctct acagccgtgc aaactggaga cccagcaagt 60
aaggaccaag ttacaacccc ctgggtgccc agctctgctc ttatcgtatc cagtaatgct 120
cgaaccagtc cccgagctgt attgtggtct atggccccag gaggggcagc tccatgtcct 180
agattgcctg ccgtaaagac aggatgcacc gctgtatgcg acctcatcca atctaagtgt 240
ctgtctaaag aaaacgcaac tacagacctg cttacgaagc tgcccgctca taccgtaggg 300
gacgtcaaat gtgatatgga ggtatcctgt cctgacggct atacatgttg tcgcttgcag 360
agtggtgctt ggggatgttg tcccttcaca caggccgtgt gttgtgagga ccacatacac 420
tgctgccctg ctgggttcac atgtgacacg cagaagggga catgtgagca gggaccccat 480
caagtacctt ggatggagaa ggccccagct catctgagtc tgcctgaccc ccaggcactg 540
aagagagatg tgccctgtga caacgtgtcc tcctgcccct catctgacac ttgctgccag 600
ttgacatctg gcgaatgggg ctgctgccct atacccgaag ctgtgtgttg tagtgaccac 660
caacactgct gcccccaggg atacacctgt gtggctgagg gacagtgcca gaggggttcc 720
gaaattgttg ctggcttgga gaagatgcct gctcggagag cctcacttag ccatccacgc 780
gatattgggt gtgaccagca cacctcctgt cctgtcggac agacatgttg cccgtccctt 840
ggtggaagtt gggcttgttg tcagctcccc catgccgttt gttgcgagga ccgacagcac 900
tgttgtccag caggctatac ctgcaatgtg aaagctagga gctgcgagaa ggaggttgtt 960
agcgctcaac cagcaacatt tctggcccgc tccccccatg tcggtgtgaa agatgttgaa 1020
tgtggcgagg gacacttctg ccacgacaac cagacttgct gtagggacaa ccgccagggt 1080
tgggcttgct gtccatatag acagggggtg tgctgtgctg ataggagaca ttgttgtcct 1140
gctggattta gatgtgcggc tagaggcact aaatgtttgc gaagggaagc tcctagatgg 1200
gatgctccac ttagagaccc agccctgcgg caattgctc 1239
<210> 33
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 用接头连接的IL-12 β和α亚基
<400> 33
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp
340 345 350
Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala
355 360 365
Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro
370 375 380
Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr
385 390 395 400
Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser
405 410 415
Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu
420 425 430
Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile
435 440 445
Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala
450 455 460
Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met
465 470 475 480
Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu
485 490 495
Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr
500 505 510
Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val
515 520 525
Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
530 535 540
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> IFN-γ
<400> 35
atgaagtaca cctcctacat cctcgctttt caactgtgca ttgtccttgg gtctcttgga 60
tgttactgtc aagacccata cgtgaaagag gcagagaacc tcaaaaagta tttcaatgct 120
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gctgaactga gccccgccgc taaaactggt aaaaggaagc gcagccaaat gctgtttcga 480
gggaggcgcg ccagtcag 498

Claims (73)

1.一种病毒载体，所述病毒载体包含在启动子或启动子片段控制下编码治疗性多肽或治疗性多肽组合的核酸分子，其中所述启动子或启动子片段驱动所述治疗性蛋白或所述治疗性蛋白组合在髓样细胞和小胶质细胞中的表达，并且其中所述启动子或启动子片段在祖细胞和/或干细胞中是无活性的。
2.根据权利要求1所述的病毒载体，其中所述启动子是
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
d)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
e)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
f)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
g)融合启动子，所述融合启动子包含miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；所述启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
3.根据权利要求1或2所述的病毒载体，其中所述病毒载体包含至少一种转录调控元件，其中所述至少一种转录调控元件被布置成使得其抑制或激活所述启动子的转录活性。
4.根据权利要求3所述的病毒载体，其中所述至少一种转录调控元件包含对于转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合位点，特别地其中所述转录激活蛋白或阻遏蛋白包含：
i)抗生素结合结构域，特别是四环素/强力霉素结合结构域、大环内酯结合结构域或普那霉素结合结构域；
ii)激素结合结构域，特别是RU486结合结构域或脱落酸结合结构域；
iii)类固醇结合结构域，特别是蜕皮激素结合结构域；或者
iv)二聚体系统，特别是基于雷帕霉素或基于雷帕霉素类似物的二聚体系统。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体编码核糖开关，其中所述核糖开关控制编码所述治疗性蛋白或所述治疗性蛋白组合的mRNA的翻译。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的病毒载体，其中所述治疗性多肽是
i)在细胞中恢复细胞功能和/或引发细胞反应的多肽；或者
ii)使得能够实现和/或增加细胞的靶特异性的多肽。
7.根据权利要求6所述的病毒载体，其中所述在细胞中恢复细胞功能和/或引发细胞反应的多肽包含选自由以下项组成的组的一种或多种多肽的至少一个片段：PGRN、早老素1、早老素2、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、IFN-α受体、IFN-γ、IFN-γ受体、FasL/Fas、CD11b、选择蛋白例如L-选择蛋白或P-选择蛋白、PSGL(P-选择蛋白配体)、TRAIL、TRAIL-R、淋巴毒素β(LT-β)、LT-βR、诱骗受体1至3、TNF-α、TNF-αR、MSH、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL31、IL1R、IL31R、IL-10、IL-23、CXCR3配体例如CXCL9和CXCL-10、PD-1、PD-1L、PD-2(PDC2)、PD-2L、颗粒酶B、颗粒溶解素、CD11b、TIGIT、CD 112、CD 155、一氧化氮合酶、DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)、含有Jumonji结构域的蛋白1A(JMJD1A)、生长抑素、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)例如HDAC3或HDAC 9、CSF1受体(CSF1R)、IL-34、TAM、所有趋化因子和趋化因子受体、所有细胞因子和细胞因子受体。
8.根据权利要求6所述的病毒载体，其中所述使得能够实现和/或增加细胞的靶特异性的多肽使得能够实现和/或增加对肿瘤抗原的特异性，特别地其中所述肿瘤抗原是VEGF、VEGF受体，金属蛋白酶拮抗剂(例如MMP-9)、CD40/CD40L、EGFR、膜联蛋白1、FGFR-1、Her2、St6galnac5、MMP1-28、TIMPS1-4、黑素转铁蛋白、α4-β1整合素、VCAM-1、E-钙粘蛋白、α-v-β3整合素、α-v-β5整合素、α-v-β6整合素、α-v-β8整合素、CCND1、BRCA、CEA、癌症相关抗原72-4(CA 72-4)、癌症相关抗原19-9(CA 19-9)、WT1、CD11b、L-选择素、NY-ESO-1，或它们的片段。
9.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)PGRN或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
10.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-12或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:11所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段；和/或与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
11.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IFN-γ或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
12.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)GM-CSF或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
13.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)G-CSF或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
14.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)GM-CSF和IFN-γ，或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
15.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)G-CSF和IFN-γ，或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
16.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-2或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
17.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-15或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
18.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IL-21或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
19.一种病毒载体，所述病毒载体包含在一个或多个启动子控制下的转基因，其中所述转基因编码
a)IFN-α或其功能片段；或者
b)与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段。
20.根据权利要求9至19中任一项所述的病毒载体，其中所述一种或多种启动子包括：
a)骨髓特异性启动子，或其功能片段；和/或
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；和/或
c)融合启动子，所述融合启动子包含以下或由以下组成
i)第一启动子，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子或小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；以及
ii)第二启动子。
21.根据权利要求20所述的病毒载体，其中所述骨髓特异性启动子是
a)miR233启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)AIF1启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
c)ITGAM启动子或其功能片段；或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
22.根据权利要求20或21所述的病毒载体，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的病毒载体，其中所述第一启动子是骨髓特异性启动子并且其中所述第二启动子是小胶质细胞特异性启动子，或反之亦然。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的病毒载体，其中所述第一启动子是miR233启动子，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子或其功能片段；并且其中所述第一启动子可操作地连接至
i)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
ii)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或其功能片段；
iii)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
iv)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:11所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；和/或
v)AIF1启动子或与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
25.根据权利要求9至24中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体包含至少一种转录调控元件，并且其中所述至少一种转录调控元件被布置成使得其抑制或激活所述启动子的转录活性。
26.根据权利要求25所述的病毒载体，其中所述至少一种转录调控元件包含对于转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合位点，特别地其中所述转录激活蛋白或阻遏蛋白包含：
i)抗生素结合结构域，特别是四环素/强力霉素结合结构域、大环内酯结合结构域或普那霉素结合结构域；
ii)激素结合结构域，特别是RU486结合结构域或脱落酸结合结构域；
iii)类固醇结合结构域，特别是蜕皮激素结合结构域；
iv)二聚体系统，特别是基于雷帕霉素或基于雷帕霉素类似物的二聚体系统。
27.根据权利要求9至26中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体编码核糖开关，并且其中所述核糖开关控制编码所述治疗性蛋白或治疗性蛋白组合的mRNA的翻译。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的病毒载体，其中所述病毒载体是
a)逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体，更特别是慢病毒SIN载体；或者
b)泡沫病毒载体；或者
c)病毒载体，所述病毒载体选自由以下项组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、细小病毒载体、冠状病毒载体和α-逆转录病毒载体。
29.一种融合启动子，所述融合启动子包含
a)miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；以及
b)小胶质细胞特异性启动子，或其功能片段；
其中所述miR223启动子或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段，可操作地连接至所述小胶质细胞特异性启动子或其功能片段。
30.根据权利要求29所述的融合启动子，其中所述小胶质细胞特异性启动子是
a)TMEM119启动子或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
b)P2RY12启动子或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
c)OLFML3启动子或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；
d)AIF1启动子或与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段；或者
e)ITGAM启动子或与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的启动子，或其功能片段。
31.根据权利要求29或30所述的融合启动子，其中所述融合启动子包含至少一种转录调控元件，其中所述至少一种转录调控元件被布置成使得其抑制或激活所述启动子的转录活性。
32.根据权利要求31所述的融合启动子，其中所述至少一种转录调控元件包含对于转录激活蛋白或阻遏蛋白的结合位点，特别地其中所述转录激活蛋白或阻遏蛋白包含：
i)抗生素结合结构域，特别是四环素/强力霉素结合结构域、大环内酯结合结构域或普那霉素结合结构域；
ii)激素结合结构域，特别是RU486结合结构域或脱落酸结合结构域；
iii)类固醇结合结构域，特别是蜕皮激素结合结构域；
iv)二聚体系统，特别是基于雷帕霉素或基于雷帕霉素类似物的二聚体系统。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的融合启动子，其中所述融合启动子
a)包含SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:29所示的序列中的任何一种序列：或者
b)包含与SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:29所示的序列中的任何一种序列具有90％、91％、92％、93％、94％或95％序列同一性的序列，其中所述启动子驱动在小胶质细胞和/或髓样细胞中的表达。
34.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体。
35.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是造血干细胞，优选地CD34阳性富集细胞群的造血干细胞，或者其中所述宿主细胞是髓样细胞。
36.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体和/或根据权利要求34或35所述的宿主细胞。
37.根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求32或33所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在医药中使用。
38.根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求34或35所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患的治疗中使用。
39.根据权利要求9或20至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求34或35所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在PGRN相关疾病或疾患的预防和/或治疗中使用，特别地其中所述病毒载体编码PGRN或其功能片段。
40.根据权利要求39所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述PGRN相关疾病或疾患是神经退行性疾病或疾患。
41.根据权利要求40所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述神经退行性疾病或疾患是退行性疾病或疾患。
42.根据权利要求41所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述退行性疾病或疾患选自由以下项组成的组：阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、神经元蜡样脂褐质沉积症和帕金森氏病。
43.根据权利要求10至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求34或35所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在癌症、淋巴瘤和/或肉瘤的治疗中使用，特别地其中所述病毒载体编码IL-12、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-15、IL-21和/或IFN-α中的至少一者；或其功能片段。
44.根据权利要求43所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述癌症、淋巴瘤和/或肉瘤是脑肿瘤或脑转移瘤。
45.根据权利要求44所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述脑肿瘤选自由以下项组成的组：成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤、脑膜瘤、成视网膜细胞瘤和神经母细胞瘤。
46.根据权利要求44所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述脑肿瘤是源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌肿瘤或任何其他实体瘤或任何肉瘤、或任何血液肿瘤，包括所有形式的白血病和淋巴瘤的转移性肿瘤。
47.根据权利要求37至46中任一项所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病毒载体、宿主细胞或药物组合物与减少血脑屏障完整性的疗法结合施用，特别地其中所述减少血脑屏障完整性的疗法是骨髓调理疗法、CNS调理疗法和/或血脑屏障调理疗法。
48.根据权利要求47所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述骨髓调理疗法包括使用细胞毒性剂、烷基化剂、白消安、曲奥舒凡、依托泊苷、洛莫司汀、放射疗法、靶向放射疗法(例如钇-90标记的抗CD45抗体或钇-90标记的抗CD66抗体)、ACK2(抗c-kit抗体)、CD117抗体-药物-偶联物、CD45-SAP、集落刺激因子1(CSF1)特异性药剂、PLX3397、BLZ9445、PLX5622、RG7155、PLX647、Ki20227、GW2580、IL-34和/或达沙替尼。
49.根据权利要求47或48所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述CNS调理疗法包括使用白消安。
50.根据权利要求47至49中任一项所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述血脑屏障调理疗法包括放射疗法或靶向放射疗法。
51.根据权利要求47至50中任一项所述用途的病毒载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物是在降低所述血脑屏障的完整性的疗法之后施用的，特别地其中所述病毒载体、所述宿主细胞或所述药物组合物在不早于降低血脑屏障的完整性的疗法之后半天施用。
52.根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求34或35所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在自体免疫性疾病的治疗中使用。
53.根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求34或35所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在自身炎性疾病的治疗中使用。
54.根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求34或35所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在过敏性疾病的治疗中使用。
55.根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体、根据权利要求34或35所述的宿主细胞或根据权利要求36所述的药物组合物，用于在造血和实体器官移植中使用。
56.一种用于在有需要的受试者中治疗起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：
a)对造血干细胞和/或富集的CD34阳性髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述造血干细胞和/或所述富集的CD34阳性髓样细胞群与根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体接触的步骤；或对髓样细胞和/或富集的髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群与根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体接触的步骤；
b)将来自步骤(a)的所述经遗传修饰的细胞静脉内施用于所述有需要的受试者；以及
c)治疗所述有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述造血干细胞和/或富集的CD34阳性髓样细胞群、或所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群已从所述有需要的受试者或从外源供体获得。
58.一种用于治疗有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述有需要的受试者中动员造血干细胞；
b)在步骤(a)中的所述造血干细胞动员之后，将根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体静脉内施用于有需要的受试者；以及
c)治疗所述有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述在所述有需要的受试者中动员造血干细胞包括施用G-CSF和/或普乐沙福。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中所述起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患是PGRN相关疾病或疾患，特别地其中所述PGRN相关疾病或疾患是神经退行性疾病或疾患，特别地其中所述神经退行性疾病或疾患是退行性疾病或神经退行性疾患，特别地其中所述退行性疾病或神经退行性疾患选自由以下项组成的组：阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、神经元蜡样脂褐质沉积症和帕金森氏病，特别地其中所述病毒载体编码PGRN或其功能片段。
61.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中所述起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患是脑肿瘤，特别地其中所述脑肿瘤选自由以下项组成的组：神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、PNET(原始神经外胚层肿瘤)、成神经管细胞瘤、CNS淋巴瘤和神经母细胞瘤；或者
其中所述脑肿瘤是源自任何形式的乳腺癌、肺癌、结肠癌、睾丸癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、或任何其他实体瘤或任何肉瘤、或任何血液肿瘤，包括所有形式白血病和淋巴瘤的转移性肿瘤，特别地其中所述病毒载体编码IL-12、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-15、IL-21和/或IFN-α或其功能片段。
62.根据权利要求56至61中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低血脑屏障的完整性的附加步骤，特别地其中降低血脑屏障的完整性包括骨髓调理疗法、CNS调理疗法、和/或血脑屏障调理疗法。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述降低血脑屏障的完整性的疗法是在将所述经遗传修饰的细胞施用于所述有需要的受试者之前执行的，特别地其中所述降低血脑屏障的完整性的疗法与所述经遗传修饰的细胞的施用之间的时间间隔是在所述降低血脑屏障的完整性的疗法之后进行的。
64.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述有需要的受试者中动员造血干细胞；
b)在步骤(a)中的所述造血干细胞动员之后，将根据本发明的所述病毒载体静脉内施用于所述有需要的受试者；以及
c)治疗所述有需要的受试者中的癌症。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述在所述有需要的受试者中动员造血干细胞包括施用G-CSF和/或普乐沙福。
66.一种在受试者的脑和/或CNS中表达转基因的方法，所述方法包括以下步骤：
a)对造血干细胞和/或富集的CD34阳性髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述造血干细胞和/或所述富集的CD34阳性髓样细胞群与根据权利要求1至26中任一项所述的病毒载体接触的步骤；或对髓样细胞和/或富集的髓样细胞群进行遗传修饰，所述修饰步骤包括使所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群与根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体接触的步骤；
b)将来自步骤(a)的所述经遗传修饰的细胞静脉内施用于所述有需要的受试者；以及
c)在所述受试者的所述脑和/或CNS中表达由所述病毒载体编码的所述转基因。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述造血干细胞和/或所述富集的CD34阳性髓样细胞群；或其中所述髓样细胞和/或所述富集的髓样细胞群已经从受所述试者或从外源供体获得。
68.一种在受试者的脑和/或CNS中表达转基因的方法，所述方法包括以下步骤：
a)动员所述受试者中的造血干细胞；
b)在步骤(a)中的所述造血干细胞动员之后，将根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体静脉内施用于有需要的受试者；以及
c)在所述受试者的所述脑和/或CNS中表达在所述病毒载体中编码的所述转基因。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述受试者中的所述造血干细胞动员包括施用G-CSF或普乐沙福。
70.根据权利要求66至69中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低血脑屏障的完整性的附加步骤，特别地其中降低血脑屏障的完整性包括骨髓调理疗法、CNS调理疗法、和/或血脑屏障调理疗法。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述降低血脑屏障的完整性的疗法是在将所述经遗传修饰的细胞施用于所述有需要的受试者之前执行的，特别地其中所述降低血脑屏障的完整性的疗法与所述经遗传修饰的细胞的施用之间的时间间隔是在所述降低血脑屏障的完整性的疗法之后进行的。
72.一种用于在有需要的受试者中治疗起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将根据权利要求1至28中任一项所述的病毒载体施用于所述有需要的受试者的脑中或鞘内施用；以及
b)治疗所述有需要的受试者中起源于或表现在脑中或基于脑的疾病或疾患。
73.根据权利要求72所述的病毒载体，其中所述病毒载体是基于AAV的病毒载体。
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