CN111936158A - Cd19变体 - Google Patents

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CN111936158A CN201880088889.XA CN201880088889A CN111936158A CN 111936158 A CN111936158 A CN 111936158A CN 201880088889 A CN201880088889 A CN 201880088889A CN 111936158 A CN111936158 A CN 111936158A
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R·罗布
P·伦讷特
B·哈克尔
J·克莱史密斯
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University of Minnesota
Aleta Biotherapeutics Inc
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Abstract

描述了CD19变体、鉴定CD19变体的方法、和使用此类CD19变体例如用于治疗癌症的方法。

Description

CD19变体
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月15日提交的美国临时专利申请号62/599,211的优先权，该专利申请的全部内容通过引用特此并入。
背景技术
B淋巴细胞抗原CD19，也称为CD19(分化簇19)，是由CD19基因编码的人体中的蛋白。CD19是不同免疫疗法(包括CD19 CAR T细胞)的靶。
发明内容
本披露提供了鉴定CD19变体的方法，这些CD19变体具有特定功能属性，例如结合抗CD19抗体的能力和/或改进的稳定性。因此，在一些方面，本披露提供了鉴定稳定的CD19变体的方法，所述方法包括：a)获得或提供多种CD19多肽，每种CD19多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代；b)确定所述多种CD19多肽是否结合抗CD19抗体或其片段；c)确定相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述多种CD19多肽是否对蛋白酶裂解更具有抗性；和/或d)确定相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述多种CD19多肽是否是更热稳定的；其中如果所述多肽(i)结合抗CD19抗体或其片段，(ii)相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，对蛋白酶裂解更具有抗性，和/或(iii)相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，是更热稳定的，则所述CD19多肽是稳定的CD19变体。在一些实施例中，抗CD19抗体是FMC63或4G7。
在一些实施例中，多种CD19多肽包含在SEQ ID NO:2的位置2、3、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、28、29、30、31、32、33、34、38、39、45、47、49、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、66、68、70、72、84、90、93、94、99、100、105、108、111、113、114、115、122、123、124、125、127、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、145、146、148、149、154、167、169、171、185、189、193、194、196、198、202、204、206、207、209、211、212、213、215、216、217、219、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、232、235、240、243、247、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、264、265、269、或271处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，多种CD19多肽包含在以下组的SEQ ID NO:2的氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸取代：5/7/9；14/16/18；29/31；29/31/33；35/37/39；45/47/49；52/54/56；59/61/63；62/64/66；76/78/80；86/88/90；167/169/171；175/177/179；193/195/197；206/208/210；207/209/211；219/221/223；240/243；224/226/228；247/249/251；253/255/256；255/256；或261/262/264/265。
在其他方面，本披露提供了CD19变体、包含CD19变体的融合蛋白、编码CD19变体(或融合蛋白)的核酸、和编码此类CD19变体或融合蛋白的细胞治疗剂。此类组合物可用于治疗癌症和/或可用于启动或调控免疫应答。
在一些实施例中，CD19变体具有比包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽高至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、400％、或500％的测量的稳定性水平。在一些实施例中，相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，CD19变体对蛋白酶裂解更具有抗性。在一些实施例中，相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，CD19变体是更热稳定的。
在一些实施例中，CD19变体包含表1A、表1B、表2A、表2B、表3、表6、图8B、图11、图12B、图14A、图14B、图14C、图14D、或图15B中列出的SEQ ID NO:2的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施例中，CD19变体包含在以下组的SEQ ID NO:2的氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸取代：5/7/9；14/16/18；29/31；29/31/33；35/37/39；45/47/49；52/54/56；59/61/63；62/64/66；76/78/80；86/88/90；167/169/171；175/177/179；193/195/197；206/208/210；207/209/211；219/221/223；240/243；224/226/228；247/249/251；253/255/256；255/256；或261/262/264/265。在一些实施例中，氨基酸取代包含示于表1B、表2B、表3、表6、图8B、图11、图14A、图14B、图14C、图14D、或图15B中的取代。
在一些实施例中，CD19变体结合抗CD19抗体。在一些实施例中，CD19变体结合肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原是MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、CEA、p53、Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA、人类乳头瘤病毒(HPV)抗原E6或E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、erbB、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、MUC16、IL13Rα2、FRα、VEGFR2、Lewis Y、FAP、EphA2、CEACAM5、EGFR、CA6、CA9、GPNMB、EGP1、FOLR1、内皮受体、STEAP1、SLC44A4、结合素-4、AGS-16、胍基环化酶C、MUC-1、CFC1B、整联蛋白α3链(a3b1的链，即层粘连蛋白受体链)、TPS、CD19、CD20、CD22、CD30、CD72、CD180、CD171(L1CAM)、CD123、CD133、CD138、CD37、CD70、CD79a、CD79b、CD56、CD74、CD166、CD71、CLL-1/CLEC12A、ROR1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSCA、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、BCMA、GD-2、MY-ESO-1或MAGE A3。
在一些实施例中，本披露提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，抗原是与自身免疫病症相关联的抗原。在一些实施例中，抗原是感染因子抗原。在一些实施例中，抗体或支架多肽、或其抗原结合片段包含scFv或VHH或III型纤连蛋白结构域。在一些实施例中，CD19变体融合至片段抗体的轻链的C-末端或N-末端。在一些实施例中，CD19变体融合至片段抗体的重链的C-末端或N-末端。在一些实施例中，CD19变体融合至片段抗体的轻链的C-末端。
在一些实施例中，VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列、或其片段。在一些实施例中，VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个。在一些实施例中，VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，其中所述部分缺乏在SEQID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS。在一些实施例中，VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。在一些实施例中，VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。在一些实施例中，VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个。在一些实施例中，VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS。在一些实施例中，VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。在一些实施例中，VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。
在一些实施例中，VHH包含在SEQ ID NO:203-225任一项中所示的至少一个CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)。在一些实施例中，VHH包含与SEQ ID NO:203-225任一项中所示的CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的至少一个CDR。在一些实施例中，VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1-13任一项中的CDR1、CDR2、和/或CDR3。在一些实施例中，VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1-13任一项中的(i)CDR1和CDR2；(ii)CDR2和CDR3；(iii)CDR1和CDR3；或(iv)CDR1、CDR2、和CDR3。在一些实施例中，VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1的CDR1、CDR2、和CDR3；组2的CDR1、CDR2、和CDR3；组3的CDR1、CDR2、和CDR3；组4的CDR1、CDR2、和CDR3；组5的CDR1、CDR2、和CDR3；组6的CDR1、CDR2、和CDR3；组7的CDR1、CDR2、和CDR3；组8的CDR1、CDR2、和CDR3；组9的CDR1、CDR2、和CDR3；组10的CDR1、CDR2、和CDR3；或组13的CDR1、CDR2、和CDR3。
在一些实施例中，本披露提供了编码本文所述的融合蛋白的核酸。在一些实施例中，本披露提供了编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，本披露提供了包含编码融合蛋白的核酸的细胞，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，本披露提供了腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、或嵌合AAV/噬菌体(AAVP)载体，这些载体包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，本披露提供了包含编码融合蛋白的核酸的溶瘤病毒载体，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，溶瘤病毒载体是自主性细小病毒载体、粘液瘤病毒载体、副粘病毒载体、呼肠孤病毒载体、小核糖核酸病毒载体、牛痘病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、或水疱性口炎病毒载体。
在一些实施例中，本披露提供了包含载体的细胞，所述载体包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，这一细胞是肿瘤细胞。
在一些实施例中，本披露提供了慢病毒载体或逆转录病毒载体，所述载体包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，所述慢病毒载体或逆转录病毒载体进一步包含编码CAR的核酸。
在一些实施例中，本披露提供了包含慢病毒载体或逆转录病毒载体的细胞，所述载体包含编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，所述细胞是T细胞。
在一些实施例中，本披露提供了治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体；施用包含编码融合蛋白的载体的细胞，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体；或施用包含编码融合蛋白的核酸的载体，所述融合蛋白包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)CD19变体。在一些实施例中，所述治疗方法包括向所述受试者施用抗体、抗体药物缀合物、或CAR-T细胞，其中所述抗体、抗体药物缀合物、或CAR-T细胞结合所述CD19变体。
在一些实施例中，本披露提供了鉴定稳定的CD19变体的方法，所述方法包括：a)获得多种CD19多肽，每种CD19多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代；b)确定所述多种CD19多肽是否结合抗CD19抗体或其片段；c)确定相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述多种CD19多肽是否对蛋白酶裂解更具有抗性；和/或d)确定相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述多种CD19多肽是否是更热稳定的；其中如果所述多肽(i)结合抗CD19抗体或其片段，(ii)相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，对蛋白酶裂解更具有抗性，和/或(iii)相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，是更热稳定的，则所述CD19多肽是稳定的CD19变体。在一些实施例中，抗CD19抗体是FMC63或4G7。在一些实施例中，多种CD19多肽包含在SEQ ID NO:2的位置2、3、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、28、29、30、31、32、33、34、38、39、45、47、49、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、66、68、70、72、84、90、93、94、99、100、105、108、111、113、114、115、122、123、124、125、127、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、145、146、148、149、154、167、169、171、185、189、193、194、196、198、202、204、206、207、209、211、212、213、215、216、217、219、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、232、235、240、243、247、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、264、265、269、或271处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，多种CD19多肽包含在以下组的SEQ ID NO:2的氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸取代：5/7/9；14/16/18；29/31；29/31/33；35/37/39；45/47/49；52/54/56；59/61/63；62/64/66；76/78/80；86/88/90；167/169/171；175/177/179；193/195/197；206/208/210；207/209/211；219/221/223；240/243；224/226/228；247/249/251；253/255/256；255/256；或261/262/264/265。
本发明的其他特征、目标和优点将从以下具体实施方式中变得明显。然而，应当理解，虽然指示了本发明的实施例，但是该具体实施方式仅以说明而非限制的方式给出。根据该具体实施方式，本发明范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员将变得明显。
附图说明
附图的图仅出于说明的目的，而不是限制。
图1A是CD19蛋白的示意图(复制自Tedder，Nat.Rev.Rheumatol.[风湿病学自然评论]5:572-577(2009))。图1B是由HHPred服务器预测CD19的细胞外部分的结构的带状图(Soding等人,Nucl.Acid Res.[核酸研究]33:244-248(2005))。
图2是示出三重文库设计的表。两种或三种氨基酸同时多样化为27种不同组合。基于如通过同源建模(图1)确定的潜在结构重要性和非极性选择位点。
图3描绘了通过流式细胞术对抗体结合酵母展示的野生型CD19的分析。诱导酵母以将CD19展示为与Aga2p的C-末端(上)或N-末端(下)融合物。将具有展示的CD19的酵母维持在室温下或在70℃下孵育30分钟，然后冷却并且用指示抗体和抗cMYC抗体标记，从而检测全长CD19展示。经由流式细胞术，用第二抗体检测结合。
图4描绘了通过流式细胞术对经演变以结合抗体FMC63的CD19变体的分析。将展示所示组合文库的酵母(未分类的或对于FMC63结合是富集的)与FMC63和FITC缀合的抗cMYC抗体(用来标记C-末端表位从而指示全长CD19)、随后是抗小鼠AlexaFluor647一起孵育，并且通过流式细胞术进行评估。
图5A是描绘酵母展示的野生型CD19的蛋白酶K裂解的图。将展示野生型CD19的酵母与指示量的PBSA中的蛋白酶K在37℃下一起孵育10min。洗涤酵母，并且用抗体标记N-末端HA和C-末端MYC表位，并且通过流式细胞术进行评估。0.002和0.02单位的蛋白酶K提供CD19裂解，同时维持Aga2p-HA展示。图5B是具有指示表位的酵母展示的CD19的示意图。
图6描绘了通过流式细胞术对改进的CD19变体的选择的分析。将展示CD19文库的酵母与0.002单位的PBSA中的蛋白酶K在37℃下一起孵育10min。洗涤酵母，并且用抗体标记N-末端HA和C-末端MYC表位，并且通过流式细胞术进行评估。收集具有最高MYC/HA比的变体。
图7描绘了通过使用流式细胞术的热选择对CD19变体的分析。在37℃下对在图块1中展示具有单突变的CD19变体的酵母进行诱导用于CD19展示，用FITC缀合的抗MYC进行标记用于展示，并且通过流式细胞术进行分析。收集前5％用于分析。
图8A是具有用侧链和颜色示出的多样化位置的CD19的示意图。图8B是呈现合并的文库设计中允许的序列的示例组的表。例如，允许在野生型序列中为N、V、和Q的(第一行)位点14、16、和18是T、A、和W；E、W、和P；D、W、和R；T、V、和P；或T、W、和P。
图9描绘了使用流式细胞术从多重突变体文库来选择改进的CD19变体。将展示所示CD19群体(野生型克隆、两次分类的三重文库、或两次分类的合并的文库)的酵母与FMC63和FITC缀合的抗MYC抗体(用来标记C-末端表位从而指示全长CD19)、随后是抗小鼠AlexaFluor647一起孵育，并且通过流式细胞术进行评估。
图10A和图10B描绘了通过流式细胞术来表征多重突变体。将展示野生型CD19或分类的CD19群体的酵母(i)与FMC63和FITC缀合的抗MYC抗体(用来标记C-末端表位从而指示全长CD19)、随后是抗小鼠AlexaFluor647一起孵育，并且通过流式细胞术进行评估(图10A)；或(ii)与0.002单位的PBSA中的蛋白酶K在37℃下一起孵育10min(图10B)。洗涤酵母，并且用抗体标记N-末端HA和C-末端MYC表位，并且通过流式细胞术进行评估。
图11描绘了对来自多重突变体文库的改进的CD19变体的序列分析。对从FMC63结合和蛋白酶抗性的选择中产生的CD19变体进行测序。指出了针对多个克隆的在多样化位置处的氨基酸。将从设计到分类的群体的频率的相对改变呈现在下表中。
图12A是CD19的细胞外结构域的带状图，突出了用于多样性产生结合配体的潜在区域。橙色：Ig结构域1环；蓝色：Ig结构域2环；红色：Ig结构域2片。图12B描绘了示例性多样性设计的表。同源性模型如下进行确定。使用缺省参数，将包含N-末端结构域、结构域接头、和C-末端结构域的CD19的258个残基氨基酸序列提交至HHPred(
Figure BDA0002622936260000091
等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]33:244-248(2005))。然后使用HHPpred makemodel，使用自动选择最佳模板选项为MODELLER制作模型(Eswar等人,Curr.Protoc.Bioinforma.[生物信息学实验指南]5.6.1-32(2006)doi:10.1002/0471250953.bi0506s4711)。为MODELLER选择最佳单个模板(1qz1)(注意：选择多个最佳模板的选项也输出类似于1qz1的结构)。然后通过侧链重新包装和全结构最小化在Foldit(Coope等人,Nature[自然]466:756-760(2010))独立版中完善所述输出结构。
图13描绘了使用流式细胞术来选择改进的CD19-配体变体。将展示CD19-Fn(抗EGFR)群体或CD19-scFv(抗HER2)群体的酵母(它们可以针对靶结合和FMC63结合而进行两次富集)与FMC63和生物素缀合的EGFR或HER2胞外结构域、随后是抗小鼠AlexaFluor647和链霉亲和素-AlexaFluor488一起孵育，并且通过流式细胞术进行评估。
图14A描绘了对来自多重突变体文库的CD19/EGFR结合纤连蛋白结构域变体的序列分析；对从FMC63结合和EGFR结合的选择中产生的突变体进行测序。指出了针对多个克隆的在多样化位置处的氨基酸。将从设计到分类的群体的频率的相对改变呈现在下表中。
图14B描绘了对来自多重突变体文库的CD19/抗HER2 scFv变体的序列分析；对从FMC63结合和HER2结合的选择中产生的突变体进行测序。指出了针对多个克隆的在多样化位置处的氨基酸。将从设计到分类的群体的频率的相对改变呈现在下表中。
图14C描绘了对来自多重突变体文库的CD19/抗HER2 scFv变体的另外的序列分析；对从FMC63结合和HER2结合的选择中产生的突变体进行测序。指出了针对多个克隆的在多样化位置处的氨基酸。
图14D描绘了对来自多重突变体文库的CD19/EGFR结合纤连蛋白结构域变体的序列分析；对从FMC63结合和EGFR结合的选择中产生的突变体进行测序。指出了针对多个克隆的在多样化位置处的氨基酸。图15A描绘了通过流式细胞术来选择改进的配体-CD19变体。将展示Fn(抗EGFR)-CD19群体或scFv(抗HER2)-CD19群体的酵母(它们可以针对靶结合和FMC63结合而进行富集)与FMC63和生物素缀合的EGFR或HER2胞外结构域、随后是抗小鼠AlexaFluor647和链霉亲和素-AlexaFluor488一起孵育，并且通过流式细胞术进行评估。
图15B描绘了对来自多重突变体文库的CD19/抗HER2 scFv变体的序列分析；对从FMC63结合和HER2结合的选择中产生的突变体进行测序。指出了针对多个克隆的在多样化位置处的氨基酸。
图15C描绘了通过深度测序鉴定的偶联的多点突变(上图的顶部)或单突变(上图的底部)的相对氨基酸频率改变。底部描绘了对于三种融合蛋白背景，从未分类的文库至功能上分类的突变体的相对氨基酸频率改变(“CT FnEGFR”＝CD19-Fn3/EGFR；“CT scFvHER2”＝CD19-scFv/Her2；“NT scFvHER2”＝scFv/Her2-CD19)。
图16描绘了分泌的N-末端CD19变体-Fn3/EGFR融合蛋白的检测。
图17描绘了分泌的N-末端CD19变体-scFv/Her2融合蛋白的检测。
图18描绘了分泌的C-末端scFv/Her2-CD19变体融合蛋白的检测。
图19描绘了C-末端scFv/Her2-CD19变体融合蛋白与Her2阳性细胞的结合。
图20描绘了由于通过C-末端scFv/Her2-CD19变体融合蛋白桥接，通过CAR19杀伤Her2阳性细胞。
图21描绘了分泌的C-末端scFv/CD20-CD19变体融合蛋白的检测。
图22描绘了C-末端scFv/CD20-CD19变体融合蛋白与CD20阳性细胞的结合。
图23描绘了由于通过C-末端scFv/CD20-CD19变体融合蛋白桥接，通过CAR19杀伤CD20阳性细胞。
图24描绘了分泌的掩蔽的和未掩蔽的C-末端西妥昔单抗-CD19变体融合蛋白的检测。
图25描绘了由于在uPA存在下，通过未掩蔽的C-末端西妥昔单抗-CD19变体融合蛋白和掩蔽的C-末端西妥昔单抗-CD19变体融合蛋白桥接，通过CAR19杀伤EGFR阳性细胞。
图26描绘了分泌的包含CD19变体蛋白的双特异性融合蛋白的检测。
图27描绘了C-末端曲妥珠单抗-CD19变体融合蛋白与Her2阳性细胞的结合。
图28描绘了由于通过C-末端曲妥珠单抗-CD19变体融合蛋白桥接，通过CAR19杀伤Her2阳性细胞。
图29描绘了C-末端利妥昔单抗-CD19变体融合蛋白与CD20阳性细胞的结合。
图30描绘了由于通过C-末端利妥昔单抗-CD19变体融合蛋白桥接，通过CAR19杀伤CD20阳性细胞。
图31描绘了无糖基(aglycosyl)C-末端曲妥珠单抗-CD19变体融合蛋白与Her2阳性细胞的结合。
图32描绘了无糖基C-末端利妥昔单抗-CD19变体融合蛋白与CD20阳性细胞的结合。
图33描绘了由于通过无糖基C-末端利妥昔单抗-CD19变体融合蛋白桥接，通过CAR19杀伤CD20阳性细胞。
图34描绘了由于通过N-末端截短的CD19变体-scFv/Her2融合蛋白桥接，通过CAR19杀伤Her2阳性细胞。
图35描绘了不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体与U937细胞的结合。
图36描绘了不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体与U937细胞的结合。
图37描绘了不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体的EC50的确定。
图38描绘了不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体的效价。
图39描绘了不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体的效价。
图40描绘了不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体与CLEC12a的结合。
图41描绘了不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体与CLEC12a的结合。
图42描绘了由于通过不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体的桥接，通过CAR19杀伤CLEC12a阳性细胞。
图43描绘了由于通过不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体的桥接，通过CAR19杀伤CLEC12a阳性细胞。
图44描绘了由于通过不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体的桥接，通过CAR19杀伤CLEC12a阳性细胞的剂量曲线。
图45描绘了由于通过不同CD19突变体-VHH/Clec12A和VHH/Clec12A-CD19突变体构建体的桥接，通过CAR19杀伤CLEC12a阳性细胞的EC50。
图46A和46B描绘了包含构建体#186的VH和VL结构域、抗CLEC12a VHH(克隆2H3)、和CD19突变体的双特异性构建体的结合EC50。
图47A和47B描绘了由于通过包含构建体#186的VH和VL结构域、抗CLEC12a VHH(克隆2H3)、和CD19突变体的双特异性构建体的桥接，通过CAR19杀伤CLEC12a阳性细胞。
图48描绘了融合构建体自用慢病毒载体感染的细胞的表达和分泌，所述慢病毒载体编码包含CAR19、CD19、和抗CLEC12a scFv的融合蛋白。
图49描绘了通过用慢病毒载体感染的细胞杀伤U937和NALM6细胞，所述慢病毒载体编码包含CAR19、CD19、和抗CLEC12a scFv的融合蛋白。
图50描绘了mab3B10对酵母上表达的CD19或肽的滴定。
定义
为了更易于理解本发明，下文首先定义某些术语。以下术语和其他术语的另外的定义在整个说明书中阐述。
施用：如本文使用的，术语“施用”是指将组合物向受试者或系统施用。向动物受试者(例如，向人类)的施用可以通过任何适当的途径进行。例如，在一些实施例中，施用可以是支气管内(包括通过支气管滴注)、口腔内、肠内、真皮间(interdermal)、动脉内、真皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(例如，肝内)、粘膜、鼻腔、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、经皮、阴道和玻璃体。在一些实施例中，施用可以是肿瘤内或肿瘤周围。在一些实施例中，施用可以涉及间歇给药。在一些实施例中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)持续至少选定的时间段。
过继性细胞疗法：如本文使用的，“过继性细胞疗法”或“ACT”涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到癌症患者中。在一些实施例中，ACT是一种治疗方法，该方法涉及使用具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞在体外扩增至大量并将这些细胞输注到携带癌症的宿主中。
亲和力：如本文使用的，术语“亲和力”是指抗原结合部分(例如本文所述的抗体)和抗原靶(例如CLL-1)之间的结合相互作用的特征并且指示结合相互作用的强度。在一些实施例中，亲和力的测量值表示为解离常数(KD)。在一些实施例中，抗原结合部分对抗原靶具有高亲和力(例如小于约10-7M、小于约10-8M、或小于约10-9M的KD)。
改善：如本文使用的，“改善”是指预防、减轻和/或缓解受试者的状态或者改进受试者的状态。改善包括但不要求疾病、障碍或病症的完全恢复或完全预防。
氨基酸：如本文使用的，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以并入到多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成的氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常存在于天然存在的肽中的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论它是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文使用的，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代物。可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或用可以改变肽的循环半衰期而对其活性没有不利影响的其他化学基团的取代来修饰氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可包含一种或多种翻译后修饰，例如与一种或多种化学实体(例如，甲基基团、乙酸酯基团、乙酰基基团、磷酸酯基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸酯基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文中将明显看出该术语是指游离氨基酸或者肽的残基。
抗体：如本文使用的，术语“抗体”是指包含足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的规范免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域中已知的，天然产生的完整抗体是由两个相同的重链多肽(各自约50kD)和两个相同的轻链多肽(各自约25kD)组成的大约150kD的四聚体药剂，这些多肽彼此缔合成通常被称为“Y形”的结构。每条重链由以下组成：至少四个结构域(每个长约110个氨基酸)-氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的尖端处)，接着是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3(位于Y的茎的基部处)。称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2和CH3结构域连接到抗体的其余部分。在该铰链区中的两个二硫键将两个重链多肽在完整抗体中彼此连接。每条轻链由两个结构域组成，即一个氨基末端可变(VL)结构域，接着是一个羧基末端恒定(CL)结构域，由另一个“开关”彼此分开。完整的抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成，在这些二聚体中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接，这样使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也典型地在CH2结构域上被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有特征在于“免疫球蛋白折叠”的结构，该免疫球蛋白折叠由在压缩的反平行β桶中彼此封装的两个β折叠片(例如，3股、4股或5股折叠片)形成。每个可变结构域含有称为“互补决定区”的三个高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构框架的β折叠片，并且来自重链和轻链两者的CDR环区在三维空间中聚集在一起，这样使得它们产生位于Y结构的尖端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区结合到补体系统的元件，并且还结合到效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体。如本领域中已知的，Fc区对Fc受体的亲和力和/或其他结合属性可以通过糖基化或其他修饰来调控。在一些实施例中，根据本披露产生和/或利用的抗体包含糖基化Fc结构域，包括具有修饰或工程化的这种糖基化的Fc结构域。出于本披露的目的，在某些实施例中，包含如存在于天然抗体中的足够免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以被称为和/或用作“抗体”，无论这种多肽是天然产生的(例如，由对抗原反应的生物体生成的)还是通过重组工程、化学合成或其他人工系统或方法学产生的。在一些实施例中，抗体是多克隆的；在一些实施例中，抗体是单克隆的。在一些实施例中，抗体具有是小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特征的恒定区序列。在一些实施例中，如本领域中已知的，抗体序列元件是完全人的或人源化的、灵长类化的、嵌合的等。此外，如本文使用的，术语“抗体”可以在适当的实施例中(除非另有说明或从上下文清楚看出)指本领域已知的或开发的构建体或者用于在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的形式中的任一种。例如，在一些实施例中，根据本披露利用的抗体呈选自但不限于以下的形式：完整IgG、IgE和IgM，双特异性或多特异性抗体(例如，
Figure BDA0002622936260000151
等)，单链Fv，多肽-Fc融合物，Fab，骆驼科动物抗体，掩蔽抗体(例如，
Figure BDA0002622936260000152
)，小模块免疫药物(“SMIPsTM”)，单链或串联双抗体
Figure BDA0002622936260000153
VHH，
Figure BDA0002622936260000154
Figure BDA0002622936260000161
迷你抗体，
Figure BDA0002622936260000162
锚蛋白重复序列蛋白或
Figure BDA0002622936260000163
DART，TCR样抗体，
Figure BDA0002622936260000164
微量蛋白，
Figure BDA0002622936260000165
和
Figure BDA0002622936260000166
在一些实施例中，抗体可能缺乏天然产生将会具有的共价修饰(例如，聚糖的附接)。在一些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如，聚糖、有效载荷(例如，可检测部分、治疗性部分、催化部分等)或其他侧基(例如，聚乙二醇等)的附接)。
抗体片段：如本文使用的，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如像抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段；三抗体；四抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，抗体片段包括分离的片段，“Fv”片段(由重链和轻链的可变区组成)，其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)，以及由氨基酸残基组成的模拟高变区的最小识别单元。在许多实施例中，抗体片段含有足够的其亲本抗体的序列，该序列是与亲本抗体结合相同抗原的片段；在一些实施例中，片段以与亲本抗体的相当的亲和力结合到抗原和/或与亲本抗体竞争结合到抗原。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段、以及分离的互补决定区(CDR)区。抗体的抗原结合片段可以通过任何手段产生。例如，抗体的抗原结合片段可以通过完整抗体的片段化来酶促地或化学地产生并且/或者抗体的抗原结合片段可以由编码部分抗体序列的基因重组产生。可替代地或另外，抗体的抗原结合片段可以全部或部分合成产生。抗体的抗原结合片段可以可选地包含单链抗体片段。可替代地或另外，抗体的抗原结合片段可以包含例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体的抗原结合片段可以可选地包含多分子复合物。功能性抗体片段典型地包含至少约50个氨基酸，并且更典型地包含至少约200个氨基酸。
抗原：如本文使用的，术语“抗原”是指引发免疫应答的药剂；和/或结合到T细胞受体(例如，当由MHC分子呈递时)或者抗体或抗体片段的药剂。在一些实施例中，抗原引发体液应答(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；在一些实施例中，抗原引发细胞应答(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。在一些实施例中，抗原结合到抗体并且可能或可能不在生物体中诱导特定的生理应答。一般来讲，抗原可以是或包括任何化学实体，例如像小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施例中除了生物聚合物以外(例如，除了核酸或氨基酸聚合物以外))等。在一些实施例中，抗原是或包括多肽。在一些实施例中，抗原是或包括聚糖。本领域的普通技术人员将理解，一般来讲，抗原可以呈分离的或纯的形式提供，或者可替代地可以呈粗制形式提供(例如，与其他物质一起，例如在例如细胞提取物等提取物中或其他相对较粗的含抗原来源的制品中)，或者可替代地可以存在于细胞上或细胞中。在一些实施例中，抗原是重组抗原。
大约或约：如本文使用的，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个所感兴趣的值时，是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指落在所陈述的参考值的任一方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围，除非另有说明或从上下文中另外明显看出(除这种数字超过可能值的100％的情况)。
结合：应当理解，如本文使用的，术语“结合”典型地是指两个或更多个实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及通过与一个或多个中间实体进行物理接触的物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合典型地可以在多种情况中的任一种下进行评定，这些情况包括在分离中或在更复杂的系统的情况(例如，当与载体实体共价或以其他方式缔合时和/或在生物系统或细胞中)下研究相互作用的实体或部分的情况。
癌症：术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在此可互换使用，是指表现出相对异常的、不受控制的和/或自主的生长、这样使得它们表现出异常生长表型的细胞，该异常生长表型的特征在于细胞增殖控制的显著丧失。一般来讲，本申请中用于检测或治疗的目的细胞包括癌前细胞(例如，良性细胞)、恶性细胞、转移前细胞、转移细胞和非转移细胞。本披露的传授内容可能与任何和所有癌症有关。仅举几个非限制性实例，在一些实施例中，本披露的传授内容应用于一种或多种癌症，例如像造血细胞癌包括白血病、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓性白血病、骨髓瘤和骨髓增生障碍；肉瘤，黑色素瘤，腺瘤，实体组织癌，口腔鳞状细胞癌，咽癌，喉癌，和肺癌，肝癌，生殖泌尿癌症例如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌和肾细胞癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，皮肤或眼内黑色素瘤，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，头颈癌，乳腺癌，胃肠癌和神经系统癌症，良性病变例如乳头状瘤，等等。
组合疗法：如本文使用的，术语“组合疗法”是指其中受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施例中，两种或更多种药剂可以同时施用；在一些实施例中，这类药剂可以顺序施用；在一些实施例中，这类药剂以重叠给药方案施用。
结构域：术语“结构域”在此用于指实体的一段或一部分。在一些实施例中，“结构域”与实体的特定结构和/或功能特征相关联，这样使得当结构域与其亲本实体的其余部分物理分离时，该实体基本上或完全保留该特定结构和/或功能特征。可替代地或另外，结构域可以是或包含实体的一部分，当与该(亲本)实体分离并与不同(受体)实体连接时，该部分基本上保留和/或赋予受体实体亲本实体特有的一个或多个结构和/或功能特征。在一些实施例中，结构域是分子(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸或多肽)的一段或一部分。在一些实施例中，结构域是多肽的一段；在一些这类实施例中，结构域的特征在于，特定的结构元件(例如，特定的氨基酸序列或序列基序、α-螺旋特征、β-折叠片特征、卷曲螺旋特征、无规卷曲特征等)和/或特定的功能特征(例如，结合活性、酶活性、折叠活性、信号传导活性等)。
剂型：如本文使用的，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于有待治疗患者的治疗剂的物理离散单位。每个单位含有经计算产生所希望的治疗效果的预先确定量的活性物质。然而，应当理解，组合物的总剂量将由主治医生在正确医学判断的范围内决定。
给药方案：如本文使用的，术语“给药方案”是指单独向受试者施用的一组单位剂量(典型地多于一个)，典型地按时间段分开。在一些实施例中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，该给药方案可以涉及一个或多个剂量。在一些实施例中，给药方案包括多个剂量，每个剂量按相同长度的时间段彼此分开；在一些实施例中，给药方案包括多个剂量和将单独剂量分开的至少两个不同时间段。在一些实施例中，给药方案内的所有剂量具有相同的单位剂量量。在一些实施例中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施例中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，接着是不同于第一剂量量的第二剂量量的一个或多个另外剂量。在一些实施例中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，接着是与第一剂量量相同的第二剂量量的一个或多个另外剂量。在一些实施例中，当在整个相关群体中施用时，给药方案与所希望的或有益的结果相关(即，是治疗性给药方案)。
表达：如本文使用的，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)由DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
融合蛋白：如本文使用的，术语“融合蛋白”通常是指包含至少两个区段的多肽，每个区段与(1)天然存在的和/或(2)代表多肽的功能结构域的肽部分显示出高度氨基酸同一性。典型地，如果两个区段是(1)在自然界中不包含在同一肽中，和/或(2)先前在单个多肽中未彼此连接，和/或(3)通过人工的行为已经彼此连接的部分，则认为含有至少两个这类区段的多肽是融合蛋白。
基因：如本文使用的，术语“基因”具有其在本领域中所理解的含义。本领域的普通技术人员将理解，术语“基因”可以包括基因调节序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。应当进一步理解，基因的定义包括对不编码蛋白质，而是编码例如tRNA、RNAi诱导剂等功能性RNA分子的核酸的参考。出于清楚的目的，我们注意到，如在本申请中使用的，术语“基因”通常是指编码蛋白质的核酸的一部分；该术语可以任选地涵盖调节序列，如本领域的普通技术人员从上下文将清楚的。该定义并非旨在排除术语“基因”对于非蛋白质编码的表达单元的应用，而是为了阐明在大多数情况下，本文件中使用的术语是指编码蛋白质的核酸。
基因产物或表达产物：如本文使用的，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指由基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由该基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
同一性：如本文使用的，术语“同一性”是指核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽之间的总体相关性。在一些实施例中，如果核酸或多肽的序列是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的，则认为它们是彼此“基本相同”。例如，两个核酸或多肽序列的百分比同一性的计算可以通过出于最优比较的目的比对这两个序列来进行(例如，可以在第一和第二序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较目的，不相同序列可以忽略)。在某些实施例中，出于比较的目的，进行比对的序列的长度是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或基本100％的参考序列的长度。然后比较在对应位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，则这些分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是这两个序列共有的相同位置数目的函数，考虑空位数、每个空位的长度，它们需要被引入以进行两个序列的最佳比对。序列比较和两个序列之间同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成。例如，可以使用Meyers和Miller,1989的算法(该算法已并入ALIGN程序(版本2.0)中)确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。在一些示例性实施例中，用ALIGN程序进行核酸序列比较使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。可替代地，可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵，确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。
免疫球蛋白单可变结构域：如本文使用的，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”意指能够特异性结合抗原的表位而不与另外的可变免疫球蛋白结构域配对的免疫球蛋白可变结构域。在本发明的含义内，免疫球蛋白单可变结构域的一个实例是“结构域抗体”，例如免疫球蛋白单可变结构域VH和VL(VH结构域和VL结构域)。如本文所述的，免疫球蛋白单可变结构域的另一个实例是来自骆驼科动物的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。
免疫球蛋白可变结构域：如本文使用的，术语“免疫球蛋白可变结构域”或“可变结构域”意指是或包括四个“框架区”(本领域和本文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；和“框架区4”或“FR4”)的免疫球蛋白结构域；这些框架区由三个“互补决定区”或“CDR”(本领域和本文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”)隔开。在一些实施例中，免疫球蛋白可变结构域的通用结构或序列可以如下所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
改进、增加或减轻：如本文使用的，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等同物指示相对于基线测量值的值，该基线测量值例如在开始本文所述的治疗之前同一个体中的测量值，或在不存在本文所述的治疗的情况下对照个体(或多个对照个体)中的测量值。
个体、受试者、患者：如本文使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”是指人类或非人类哺乳动物受试者。所治疗的个体(也称为“患者”或“受试者”)是患有疾病例如癌症的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人)。在一些实施例中，该受试者是人类。
Ka：如本文使用的，“Ka”是指用来形成抗原结合部分/抗原靶复合物的特定抗原结合部分和抗原靶的缔合速率。
Kd：如本文使用的，“Kd”是指特定抗原结合部分/抗原靶复合物的解离速率。
KD：如本文使用的，“KD”是指解离常数，其获得自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)，并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域很好地确立的方法，例如通过使用表面等离子共振，或使用生物传感器系统(例如
Figure BDA0002622936260000211
系统)，确定KD值。
接头：如本文使用的，术语“接头”是指例如在融合蛋白中，除了出现在天然蛋白质的特定位置处的氨基酸序列以外的具有适当长度的氨基酸序列，并且通常被设计成柔性的和/或用于在两个蛋白质部分之间插入例如a-螺旋等的结构。一般来讲，接头允许融合蛋白的两个或更多个结构域保留每个结构域的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的生物学活性。接头也可被称为间隔子。在一些实施例中，多肽接头长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸。当将多肽(例如融合多肽)工程化时，可以适当使用的多种不同接头元件是本领域已知的(参见例如Holliger,P.等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure[结构]2:1121-1123)。
核酸：如本文使用的，“核酸”在其最广泛的意义上是指作为寡核苷酸链或者可以并入到寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是作为寡核苷酸链或者经由磷酸二酯键可以并入到寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如将从上下文清楚看出的，在一些实施例中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包括RNA；在一些实施例中，“核酸”是或包括DNA。在一些实施例中，核酸是一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或者由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施例中，核酸是一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物或者由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于核酸类似物不使用磷酸二酯骨架。例如，在一些实施例中，核酸是一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”或由一个或多个“肽核酸”组成，这些肽核酸在本领域中是已知的并且在骨架中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本发明的范围内。可替代地或另外，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸是一种或多种天然核苷、包含一种或多种天然核苷或由一种或多种天然核苷组成(该一种或多种天然核苷例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)。在一些实施例中，核酸是一种或多种核苷类似物、包含一种或多种核苷类似物或由一种或多种核苷类似物组成(该一种或多种核苷类似物例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴代尿苷、C5-氟代尿苷、C5-碘代尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基及其组合)。在一些实施例中，核酸包含一种或多种与天然核酸中的糖相比修饰的糖(例如，2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码功能性基因产物例如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，核酸通过以下方法中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合进行酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中进行繁殖以及化学合成。在一些实施例中，核酸长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施例中，“核酸”是单链的；在一些实施例中，“核酸”是双链的。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，该元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施例中，核酸具有酶活性。
可操作地连接：如本文使用的，“可操作地连接”是指并置，其中所描述的部件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。“可操作地连接”到编码序列的控制序列以这样一种方式连接，该方式使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和以反式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列两者。如本文使用的，术语“表达控制序列”是指实现表达和加工与它们连接的编码序列所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，这类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，典型地，这类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工至关重要的部件，并且还可以包括其存在有利的另外部件，例如前导序列和融合配偶体序列。
肽：如本文使用的，术语“肽”是指典型地相对较短的多肽，例如长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸、或小于10个氨基酸。
药学上可接受的：如本文使用的，术语“药学上可接受的”是指在正确医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症、与合理益处/风险比相称的物质。
多肽：如本文使用的，总而言之，“多肽”是通过肽键彼此附接的至少两个氨基酸的串。在一些实施例中，多肽可以包含至少3-5个氨基酸，每个氨基酸通过至少一个肽键附接到其他氨基酸。本领域的普通技术人员将理解，多肽有时可选地包括“非天然”氨基酸或其他但能够整合到多肽链中的实体。
启动子：如本文使用的，“启动子”是启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机制或引入的合成机制所识别的DNA序列。“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。“诱导型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在启动子特异性诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
蛋白质：如本文使用的，术语“蛋白质”是指多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白质可以包括除了氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)并且/或者可以其他方式加工或修饰。本领域的普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其一部分。本领域的普通技术人员将理解，蛋白质有时可以包括例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合的多于一个的多肽链。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。可用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施例中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。
参考物：如本文使用的，“参考物”描述了相对于其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施例中，将目的药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施例中，参考物或对照的测试和/或确定基本上与目的测试或确定同时进行。在一些实施例中，参考物或对照是历史参考物或对照，任选地体现在有形介质中。典型地，如本领域的技术人员将理解的，参考物或对照在与正在评估的那些相当的条件或环境下进行确定或表征。本领域的技术人员将理解，当存在足够的相似性时才能证明能够依赖特定可能的参考物或对照和/或与其进行比较。
选择性结合：如本文使用的，“选择性结合(selective binding和selectivelybinds)”、“特异性结合(specific binding或specifically binds)”是指相对于抗原结合部分和抗原靶，抗原结合部分与抗原靶而不与非抗原靶的实体的优先缔合。在抗原结合部分和非靶之间可能发生某种程度的非特异性结合。在一些实施例中，如果抗原结合部分和抗原靶之间的结合比抗原结合部分和非靶的结合大2倍、大5倍、大10倍、或大100倍，则抗原结合部分选择性结合抗原靶。在一些实施例中，如果结合亲和力小于约10-5M、小于约10-6M、小于约10-7M、小于约10-8M、或小于约10-9M，则抗原结合部分选择性结合抗原靶。
受试者：“受试者”意指哺乳动物(例如，人类，在一些实施例中包括产前人类形式)。在一些实施例中，受试者患有相关的疾病、障碍或病症。在一些实施例中，受试者易患有疾病、障碍或病症。在一些实施例中，受试者表现疾病、障碍或病症的一种或多种症状或特征。在一些实施例中，受试者未表现疾病、障碍或病症的任何症状或特征。在一些实施例中，受试者是具有易患有疾病、障碍或病症或处于疾病、障碍或病症的风险中特有的一种或多种特征的人。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是施用和/或已经施用诊断和/或疗法的个体。
罹患：“罹患”疾病、障碍或病症(例如，癌症)的个体已被诊断患有和/或表现出疾病、障碍或病症的一种或多种症状。
症状减轻：根据本发明，当特定疾病、障碍或病症的一种或多种症状的量级(例如，强度、严重性等)或频率减小时，“症状减轻”。出于清楚的目的，特定症状发作的延迟被认为是减少该症状频率的一种形式。并不旨在将本发明仅限于症状消除的情况。本发明特别设想了使得一种或多种症状得到减轻(并且因此“改进”受试者的状况)的治疗，尽管没有完全消除。
治疗剂：如本文使用的，短语“治疗剂”一般来讲是指当向生物体施用时引发所希望的药理学效果的任何药剂。在一些实施例中，如果药剂在适当的群体中展示出统计学显著的效果，则该药剂被认为是治疗剂。在一些实施例中，适当的群体可以是模型生物体的群体。在一些实施例中，可以通过各种准则来定义适当的群体，这些准则例如某一年龄组、性别、遗传背景、预先存在的临床状况等。在一些实施例中，治疗剂是可以用于对疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征而言缓和、改善、解除、抑制、预防、延缓发作、降低严重性和/或降低发病率的物质。在一些实施例中，“治疗剂”是已经或需要由政府机构批准才可以销售以向人类施用的药剂。在一些实施例中，“治疗剂”是需要医学处方以向人类施用的药剂。在一些实施例中，治疗剂是本文所述的细胞治疗剂(例如包含以下或由以下组成的免疫细胞：由如本文所述的和一种诱导型表达构建体编码的抗原结合受体)。
治疗有效量：如本文使用的，术语“治疗有效量”意指当根据治疗性给药方案向罹患或易患有疾病、障碍和/或病症的群体施用时，足以治疗该疾病、障碍和/或病症的量。在一些实施例中，治疗有效量是对疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状而言降低发病率和/或严重性、稳定一种或多种特征和/或延迟发作的量。本领域的普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可以是在向需要这种治疗的患者施用时，在显著数量的受试者中提供特定的所希望的药理学应答的量。例如，在一些实施例中，“治疗有效量”是指当在发明性疗法的情况下向对其有需要的个体施用时，将阻断、稳定、减弱或逆转发生在所述个体中的癌症支持性过程，或者将增强或增加所述个体中的癌症抑制过程的量。在癌症治疗的情况下，“治疗有效量”是当向诊断患有癌症的个体施用时，将预防、稳定、抑制或减少个体中癌症的进一步发展的量。本文所述的组合物的特别优选的“治疗有效量”(在治疗性治疗中)逆转恶性肿瘤的发展或帮助实现或延长恶性肿瘤的缓解。向个体施用以在该个体中治疗癌症的治疗有效量可以与施用以促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。如同大多数癌症疗法一样，本文所述的治疗方法不应被解释为、限制于或以其他方式局限于癌症的“治愈”；相反，治疗方法涉及使用所述的组合物来“治疗”癌症，即实现患有癌症的个体的合乎需要的或有益的健康变化。这类益处被肿瘤学领域中技术熟练的医疗保健提供者所认可，并且包括但不限于患者状况的稳定、肿瘤大小的减小(肿瘤消退)、生命功能的改进(例如，癌性组织或器官的改进的功能)、进一步转移的降低或抑制、机会性感染的减少、增加的存活能力、疼痛的减轻、改进的运动功能、改进的认知功能、改进的能量感觉(活力、不适感减少)、改进的健康感、正常食欲的恢复、健康体重增加的恢复及其组合。另外，个体中特定肿瘤的消退(例如，作为本文所述的治疗的结果)还可以通过以下方式来评估：从肿瘤部位例如胰腺癌取癌细胞样品(例如，在整个治疗过程中)，并测试癌细胞的代谢和信号传导标志物的水平来监测癌细胞的状态，以便在分子水平下验证癌细胞消退至较小恶性的表型。例如，通过采用本发明的方法诱导的肿瘤消退将通过以下来指示：发现一种或多种促血管生成标志物的减少，抗血管生成标志物的增加，在诊断患有癌症的个体中表现出异常活性的代谢通路、细胞间信号传导通路或胞内信号传导通路的正常化(即，向不罹患癌症的正常个体中发现的状态的改变)。本领域的普通技术人员将理解，在一些实施例中，治疗有效量能以单个剂量配制和/或施用。在一些实施例中，治疗有效量能以多个剂量(例如，作为给药方案的一部分)配制和/或施用。
转导：如本文使用的，“转导”是通过病毒载体，将核酸引入细胞的过程。在一些实施例中，转导描述了病毒载体介导的将核酸序列引入淋巴细胞，以产生细胞治疗剂。
转化：如本文使用的，“转化”是指将外源DNA引入到宿主细胞中的任何过程。转化可以使用本领域中众所周知的各种方法在自然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。在一些实施例中，特定的转化方法基于所转化的宿主细胞来选择，并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、配合、脂质转染。病毒载体介导的转化可以称为“转导”。在一些实施例中，“转化的”细胞被稳定转化，因为插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。在一些实施例中，转化的细胞在有限的时间段内瞬时表达引入的核酸。
治疗：如本文使用的，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat或treating)”)是指对特定疾病、障碍和/或病症(例如，癌症)的一种或多种症状、特征和/或病因而言部分或完全缓和、改善、解除、抑制、延缓发作、降低严重性和/或降低发病率的物质的任何施用。这种治疗可以关于未表现出相关疾病、障碍和/或病症的体征的受试者，并且/或者关于仅表现出该疾病、障碍和/或病症的早期体征的受试者。可替代地或另外，这种治疗可以关于表现出相关疾病、障碍和/或病症的一个或多个确立体征的受试者。在一些实施例中，治疗可以关于已被诊断为罹患相关疾病、障碍和/或病症的受试者。在一些实施例中，治疗可以关于已知具有与相关疾病、障碍和/或病症的增加的发展风险统计相关的一个或多个易感性因素的受试者。
肿瘤浸润淋巴细胞：如本文使用的，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”是指罹患癌症(例如黑色素瘤)的受试者的白细胞，这些白细胞已经离开血流并且已经迁移到肿瘤中。在一些实施例中，肿瘤浸润淋巴细胞具有肿瘤特异性。
变体：如本文使用的，术语“变体”是指与参考实体相比，在存在或具有一定水平的一种或多种化学部分时，示出与参考实体的显著结构同一性但是结构上不同于参考实体的实体。术语“变体”和“突变体”在本文中可互换使用。在许多实施例中，变体在功能上也不同于其参考实体。一般来讲，是否将特定实体适当地视为参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将理解的，任何生物的或化学的参考实体具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共享一个或多个此类特征性结构元件的不同化学实体。多肽可以具有由多个氨基酸组成的特征性序列元件，这些氨基酸在线性或三维空间中相对于彼此具有指定位置和/或有助于特定的生物学功能。例如，由于氨基酸序列中的一个或多个差异和/或在共价附接至多肽主链的化学部分(例如碳水化合物、脂质等)中的一个或多个差异，变体多肽可以不同于参考多肽。在一些实施例中，变体多肽示出与参考多肽的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％的总体序列同一性。可替代地或另外，在一些实施例中，变体多肽与参考多肽并不共享至少一个特征性序列元件。在一些实施例中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施例中，变体多肽共享参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施例中，变体多肽缺乏参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施例中，与参考多肽相比，变体多肽示出了减少的或增加的水平的一种或多种生物活性。在许多实施例中，如果多肽具有与亲本相同的氨基酸序列但是在特定位置处有少量序列改变，则认为所述多肽是亲本或参考多肽的“变体”。典型地，与亲本相比，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基被取代。在一些实施例中，与亲本相比，变体具有10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个取代的残基。通常，变体具有非常少量(例如少于5、4、3、2、或1个)的取代的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。此外，与亲本相比，变体典型地具有不多于5、4、3、2、或1个添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失典型地少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个，并且通常少于约5、约4、约3、或约2个残基。在一些实施例中，亲本或参考多肽是天然存在的多肽。
载体：如本文使用的，“载体”是指能够转运与它缔合的另一个核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体能够在宿主细胞例如真核和/或原核细胞中进行染色体外复制和/或表达与它们连接的核酸。能够导向可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。
具体实施方式
除其他事项之外，本披露提供了鉴定CD19变体的方法，以及包括此类CD19变体的组合物。已知基于结合蛋白的支架具有结合特异性抗原靶(例如类似于抗体)的潜力。一些支架结合蛋白包括稳定的框架核心，并且推定的抗原结合区可以耐受多个取代。因此，可以合成地工程化支架框架核心，可以从其构建不同序列变体的文库。在蛋白质的外表面(例如可以充当潜在抗原结合区的环结构或其他外表面)典型地存在序列多样性。本披露涉及筛选并且鉴定表现出抗原结合和/或稳定性的CD19变体。
CD19
CD19是用作B细胞发育的生物标记物的95kDa I型跨膜糖蛋白(Wang等人,Exp.Hematol.Oncol.[实验血液学和肿瘤学]1:36(2012))。在淋巴瘤和白血病中的CD19表达已经使得它成为有效的治疗靶，尤其是对于嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法而言(Maude等人,Blood[血液]125:4017-4024(2015))。基于CD19在CAR-T细胞疗法中的独特有效性能，已经描述的治疗方法涉及使用被工程化从而直接结合肿瘤生物标记物的抗体-CD19融合物或CD19变体，将CD19-肿瘤“转化”为CD19+肿瘤(参见例如，WO 2017/075537和WO 2017/075533)。在这些上下文中，CD19胞外区的结构完整性(包括适当折叠、生物学表位的呈递、和稳定性)对于分子疗法的实施可能很重要。
假设CD19的胞外区含有两个C2样免疫球蛋白结构域(参见例如Wang等人,Exp.Hematol.Oncol.[实验血液学和肿瘤学]1:36(2012)；Tedder等人,Nat.Rev.Rheumatol.[风湿病学自然评论]5:572-577(2009))。这得到了同源性建模的支持(
Figure BDA0002622936260000291
等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]33:244-248(2005))(参见图1)。然而，最近公开的结构证明CD19并不包括C2样免疫球蛋白结构域(Teplyakov等人,Proteins[蛋白质]86:495-500(2018))。
人CD19的核苷酸序列以及CD19的特异性结构域的核苷酸序列是已知的(参见Genbank登录号M84371.1)。例如，编码CD19的细胞外结构域的核苷酸序列是：
CCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAG(SEQ ID NO:1)。
CD19的细胞外结构域的氨基酸序列是：PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK(SEQ ID NO:2)。
如本文讨论的，本披露提供了CD19变体。在一些实施例中，CD19变体是或包括全长CD19多肽、或其一部分，所述全长CD19多肽包括本文所述的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，CD19变体是或包括CD19细胞外结构域、或其一部分，所述CD19细胞外结构域包括本文所述的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，CD19变体是或包括一个或两个CD19C2样Ig结构域(或一个或两个Ig结构域的一部分)，所述结构域中的一个或两个包括本文所述的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，CD19变体是或包括CD19细胞外结构域，并且包括本文所述的一个或多个氨基酸取代，所述CD19细胞外结构域在C-末端缺乏一个或多个氨基酸并且包括两个C2样Ig结构域。在一些实施例中，CD19变体是或包括CD19细胞外结构域，并且包括本文所述的一个或多个氨基酸取代，所述CD19细胞外结构域在C-末端缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多个氨基酸并且包括两个C2样Ig结构域。
鉴定CD19变体的方法
可通过筛选具有特异性靶向性的细胞外结构域取代的变体(例如变体的文库)，鉴定CD19变体。据信使用这样一种方法，可以将总体CD19稳定性最大化，同时将非免疫原性取代最小化。另外，可以定制CD19变体的文库的大小，使得可以在一个或多个系统中筛选总体多样性。因此，在一些实施例中，将CD19的细胞外结构域(ECD)和/或由Teplyakov等人,Proteins[蛋白质]86:495-500(2018)描述的包括环或片的C2样Ig结构域中的一个或两个用作支架，以便诱变，并且可以基于表达和/或基于本文所述的一个或多个功能特征(例如结合抗CD19抗体、结合靶抗原、和/或稳定性)，筛选并且选择包括一个或多个突变的CD19变体(例如CD19或其一部分(例如ECD，一个或两个C2样Ig结构域，由Teplyakov等人,Proteins[蛋白质]86:495-500(2018)描述的一个或多个环、和/或其一部分))。
为了提供编码CD19变体的变体核酸序列，可以利用本领域已知的多种方法。在一些实施例中，使用能够鉴定和/或分离以下核酸的筛选程序，所述核酸编码结合抗CD19抗体和/或结合特定抗原的CD19变体。示例性方法包括由以下技术已知的所谓生物淘选步骤：例如噬菌体展示(Kang,A.S.等人1991.Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]88,4363-4366)，核糖体展示(Schaffitzel,C.等人1999.J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]231,119-135)，DNA展示(Cull,M.G.等人1992.Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]89,1865-1869),RNA-肽展示(Roberts,R.W.,Szostak,J.W.,1997.Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]94,12297-12302)，共价展示(WO 98/37186)，细菌表面展示(Fuchs,P.等人1991.Biotechnology[生物技术]9,1369-1372)，酵母表面展示(Boder,E.T.,Wittrup,K.D.,1997.Nat Biotechnol[自然生物技术]15,553-557)以及真核病毒展示(Grabherr,R.，Ernst,W.，2001.Comb.Chem.High Throughput.Screen.[组合化学和高通量筛选]4,185-192)。FACS和磁珠分选也适用于使用标记的抗CD19抗体或标记的抗原的富集(淘选)目的。免疫检测测定，例如ELISA(Dreher,M.L.等人1991.J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]139,197-205)和ELISPOT(Czerkinsky,C.C.等人1983.J Immunol Methods.[免疫学方法杂志]65,109-21)，也可以在生物淘选步骤之后使用或单独使用。
文库
在一些实施例中，通过合成编码CD19的限定区域(例如ECD或其一部分)并且具有预定氨基酸的不多于一个密码子的单个寡核苷酸，产生CD19变体用于筛选。例如，这可以通过在寡核苷酸内的每个密码子位置处并入合成野生型多肽所需的密码子或预定氨基酸的密码子来实现(参见例如美国公开号20050136428)。在另一个实施例中，可以使用模糊突变(walk-through mutagenesis，WTM)(参见例如美国专利号6,649,340；5,830,650；和5,798,208)。WTM允许对最少数量的寡核苷酸进行多种突变，这些突变可以使用例如掺杂技术单独分批生产，然后根据需要进行混合或合并。
可以通过已知方法合成用于产生文库的寡核苷酸的混合物。可以使用标准基因工程技术将合成的多核苷酸插入合适的载体中。借助适当载体(包括例如噬菌体载体、质粒)，可以将基因引入适合表达纤连蛋白结合结构域分子的无细胞提取物、噬菌体、原核细胞、或真核细胞中。
在一些实施例中，将CD19核酸序列引入单链质粒中。例如，可以将基因克隆到噬菌体载体或具有丝状噬菌体复制起点的载体中，所述载体在使用辅助噬菌体的情况下允许单链分子的繁殖。单链模板可以与一组代表所希望的突变的简并多核苷酸一起退火，并且延伸并连接，由此将每个模拟链并入可以引入适当宿主的分子群体中(参见例如Sayers,J.R.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:791-802(1988))。聚合酶链反应(PCR)方法还可以用于将多核苷酸掺入基因中。
文库的大小可以根据CD19的靶向性区域(例如CD19 ECD或其一部分)和所希望的序列多样性的量而变化。在一些实施例中，设计文库含有少于1015、1014、1013、1012、1011、1010、109、108、107、或106个CD19变体。在一些实施例中，使用本领域公认的技术，文库可以附接至固体支持物(例如微芯片)，并且优选地排列。
在一些实施例中，可以鉴定具有更好的抗原结合特性和/或改进的化学物理特性(例如溶解性或稳定性)的CD19变体。在一些实施例中，使鉴定的CD19变体经受亲和力成熟从而增加所述结合分子对靶抗原的亲和力/亲合力。
表达和筛选
可以表达并且筛选通过以上技术中任一项或其他合适的技术产生的多核苷酸文库，从而鉴定具有所希望的结构和/或活性的CD19变体。可以使用无细胞提取物(以及例如核糖体展示)、噬菌体展示、原核细胞、或真核细胞(例如酵母展示)，进行CD19变体的表达。在一些实施例中，将微生物表达和展示系统用来表达和筛选CD19变体文库。典型地，通过接头肽将本文所述的CD19多肽或其一部分连接至产生融合蛋白的另一个表面分子。
在一些实施例中，将多核苷酸工程化，从而用作可以在无细胞提取物中表达的模板。可以使用如例如在美国专利号5,324,637；5,492,817；5,665,563中所述的载体和提取物。可以使用核糖体展示和其他无细胞技术用于将多核苷酸(即基因型)与多肽(即表型)关联(参见例如美国专利号6,348,315；6,261,804；6,258,558)。
在一些实施例中，在大肠杆菌表达系统中表达多核苷酸(参见例如Pluckthun等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]178:476-515(1989)；Skerra等人,Biotechnology[生物技术]9:273-278(1991))，并且表达CD19变体用于在细菌的培养基和/或细胞质中分泌(参见例如Better等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]178:476(1989))。在一些实施例中，将CD19变体附接至编码信号序列(例如ompA、phoA或pelB信号序列)的序列的3’端(参见例如Lei等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:4379(1987))。
在一些实施例中，使用如例如在US 20040072740 A1；US 20030100023 A1；和US20030036092 A1中所述的分泌信号和脂化部分，在原核生物(例如大肠杆菌)的膜表面上表达CD19变体。
在另一个实施例中，例如，使用如例如在美国专利号6,423,538；6,331,391；和6,300,065中所述的酵母展示，在真核细胞(例如酵母)中表达多核苷酸。酵母展示系统利用a-凝集素酵母粘着受体来在细胞表面上展示蛋白。将CD19变体文库作为融合配偶体与Aga2蛋白A一起表达，并且可以使用标准技术，将CD19变体的文库转染到受体酵母宿主中。在一些实施例中，本文所述的接头包含在CD19多肽(或部分)和Aga2蛋白A之间。使表达的融合蛋白从细胞分泌并且其用二硫键连接至Aga1蛋白，所述Aga1蛋白附接至酵母细胞壁(参见英杰公司(Invitrogen)，pYD1酵母展示产品文献)。然后可以使用已知方法，例如流式细胞术和荧光活化细胞分选法(FACS)或磁珠，筛选并且分离酵母细胞。
还可以使用高等真核细胞用于表达CD19变体，例如哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞(例如NS/0细胞)、杂交瘤细胞、HEK-293细胞、或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。还可以将CD19变体设计为表达至培养基中，或表达在此类细胞的表面上。
可以通过任何适当手段完成表达的CD19变体的筛选。例如，可以通过标准免疫测定和/或亲和色谱法评估结合活性。还可以使用例如Biacore公司的仪器在体外测定结合活性。在一些实施例中，鉴定的CD19变体以比野生型CD19高至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、400％、500％或更多的水平结合靶标(例如本文所述的靶抗原)。
在一些实施例中，可以使用已知技术，例如在暴露于升高的温度后测量蛋白水平、和/或在酶处理和/或化学处理后测量蛋白水平，评估CD19变体的稳定性。在一些实施例中，在暴露于升高的温度、酶处理、和/或化学处理后，鉴定的CD19变体具有的测量的蛋白水平比暴露于相同条件下的野生型CD19高至少3％、5％、7％、9％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、400％、500％或更多。例如，CD19变体可以具有比暴露于相同条件下的野生型CD19的对应熔融温度高约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、或10摄氏度的熔融温度。
在本文所述的示例性方法中，鉴定的CD19变体显示出阈值水平的稳定性和/或改进水平的稳定性(例如相对于野生型CD19或另一种CD19变体)。例如，可以将编码CD19 ECD的核苷酸序列系统地诱变从而创建第一CD19突变体文库，所述突变体文库可以筛选显示出稳定性的CD19变体。在一些实施例中，可以从编码鉴定自第一CD19突变体文库的稳定CD19变体的核苷酸序列创建第二文库(“子文库”)，所述第二文库也可以筛选显示出稳定性的CD19变体。可以在本文所述的一种或多种组合物和/或方法中使用表现出稳定性的CD19变体(例如鉴定自第一和/或第二文库)。另外或可替代地，可以针对结合特定抗原(例如本文所述的抗原)的能力，进一步筛选表现出稳定性的CD19变体(例如鉴定自第一和/或第二文库)。例如，可以将编码相对于野生型CD19具有一个或多个氨基酸突变的稳定CD19变体的核苷酸序列系统地诱变(即在编码鉴定为赋予稳定性的那些以外的氨基酸的密码子处)，从而创建随后可以筛选结合特定抗原(例如本文所述的抗原)的稳定CD19变体的新文库。
抗原
在一些实施例中，CD19变体被鉴定为选择性结合任何靶抗原。示例性靶抗原包括例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、CEA、p53、Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA、人类乳头瘤病毒(HPV)抗原E6或E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、erbB、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、MUC16、IL13Rα2、FRα、VEGFR2、Lewis Y、FAP、EphA2、CEACAM5、EGFR、CA6、CA9、GPNMB、EGP1、FOLR1、内皮受体、STEAP1、SLC44A4、结合素-4、AGS-16、胍基环化酶C、MUC-1、CFC1B、整联蛋白α3链(a3b1的链，即层粘连蛋白受体链)、TPS、CD19、CD20、CD22、CD30、CD72、CD180、CD171(L1CAM)、CD123、CD133、CD138、CD37、CD70、CD79a、CD79b、CD56、CD74、CD166、CD71、CLL-1/CLEC12A、ROR1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSCA、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、BCMA、GD-2、MY-ESO-1、或MAGE A3。
示例性CD19变体
使用本文所述的方法，鉴定的CD19变体显示出相对于野生型CD19增加的稳定性水平。因此，在一些实施例中，CD19变体包括表1A、表1B、表2A、表2B、表3、表6、图8B、图11、图12B、图14A-图14D、或图15B中列出的SEQ ID NO:2的氨基酸取代中的一个或多个。
在一些实施例中，CD19变体包括在SEQ ID NO:2的以下氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸取代：2、3、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、28、29、30、31、32、33、34、38、39、45、47、49、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、66、68、70、72、84、90、93、94、99、100、105、108、111、113、114、115、122、123、124、125、127、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、145、146、148、149、154、167、169、171、185、189、193、194、196、198、202、204、206、207、209、211、212、213、215、216、217、219、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、232、235、240、243、247、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、264、265、269、或271。在这些位置处的示例性氨基酸取代示出在表1A、表2A、表3、表6、图11、图12B、图14A-图14D、或图15B中。
在一些实施例中，CD19变体包括在以下位置中的一个或多个处的以下氨基酸取代中的一个或多个，如表6所示：
表6：
Figure BDA0002622936260000361
Figure BDA0002622936260000371
Figure BDA0002622936260000381
Figure BDA0002622936260000391
在一些实施例中，CD19变体包括在以下组的SEQ ID NO:2的氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸取代：5/7/9；14/16/18；29/31；29/31/33；35/37/39；45/47/49；52/54/56；59/61/63；62/64/66；76/78/80；86/88/90；167/169/171；175/177/179；193/195/197；206/208/210；207/209/211；219/221/223；240/243；224/226/228；247/249/251；253/255/256；255/256；或261/262/264/265。在这些组的位置处的示例性氨基酸取代示于表1B、表2B、表3、表6、图8B、图11、图14A、图14B、图14C、图14D、或图15B中。
可以使用本披露的方法鉴定另外的CD19变体。
使用CD19变体的方法
融合蛋白
WO 2017/075537和WO 2017/075533部分描述了融合蛋白或编码此类融合蛋白的表达构建体，所述融合蛋白包含以下或由以下组成：抗原结合蛋白(例如抗体或片段、或支架多肽或片段)和CD19或其片段。本文所述的CD19变体、或使用本披露的方法鉴定的CD19变体可以包括在WO 2017/075537和WO 2017/075533中描述的任何基于CD19的构建体中。如WO2017/075537和WO 2017/075533中所述，此类构建体可用于治疗癌症。
因此，在一些实施例中，包括作为融合蛋白的一部分的本文所述的CD19变体，所述融合蛋白例如包括本文所述的CD19变体和抗体、抗体片段、支架多肽、或支架多肽片段的融合蛋白。在一些实施例中，融合蛋白是或包括与另一蛋白的氨基(N)末端融合的CD19变体，例如与抗原结合蛋白(例如本文所述的抗体或抗体片段、或支架多肽或片段)的氨基(N)末端融合的CD19变体。在一些实施例中，融合蛋白是或包括与抗体或其片段的轻链的氨基末端融合的CD19变体。在一些实施例中，融合蛋白是或包括与抗体或其一部分的重链的氨基末端融合的CD19变体。在一些实施例中，CD19变体融合蛋白包括本文所述的接头。
在一些实施例中，融合蛋白是或包括与另一蛋白的羧基(C)末端融合的CD19变体，例如与抗原结合蛋白(例如本文所述的抗体或抗体片段、或支架多肽或片段)的羧基(C)末端融合的CD19变体。在一些实施例中，融合蛋白是或包括与抗体或其片段的轻链的羧基末端融合的CD19变体。在一些实施例中，融合蛋白是或包括与抗体或其一部分的重链的羧基末端融合的CD19变体。
在其他实施例中，本披露包括如WO 2017/075537和WO 2017/075533中所述的组成型或诱导型表达构建体，所述表达构建体包含以下核酸序列，所述核酸序列包括至少一个可操作地连接至编码本文所述的CD19变体融合蛋白的核苷酸序列的启动子。
抗体
如本文所述，在一些实施例中，本披露提供了融合蛋白，所述融合蛋白包括CD19变体以及抗体或其片段。任何抗体可以包括在此类融合蛋白中。在一些实施例中，抗体是抗肿瘤抗体。已经发表了各种综述文章，这些文章描述了可用的抗肿瘤抗体(参见例如Adler等人,Hematol.Oncol.Clin.North Am.[北美血液肿瘤临床杂志]26:447-81(2012)；Li等人,Drug Discov.Ther.[药物发现与治疗]7:178-84(2013)；Scott等人,Cancer Immun.[癌症免疫学]12:14(2012)；以及Sliwkowski等人,Science[科学]341:1192-1198(2013))。表4呈现了由已知的可用抗体药剂靶向的某些人类多肽抗原的非综合性列表，并且说明了已提出这些抗体药剂对其有用的某些癌症适应症。
表4：
Figure BDA0002622936260000411
Figure BDA0002622936260000421
Figure BDA0002622936260000431
在一些实施例中，本文所述的融合蛋白包括CD19变体以及抗体或其片段，所述抗体或其片段包括例如完整IgG、IgE或IgM，双特异性或多特异性抗体(例如，
Figure BDA0002622936260000432
等)，单链Fv，多肽-Fc融合物，Fab，骆驼科动物抗体，掩蔽抗体(例如，
Figure BDA0002622936260000433
)，小模块免疫药物(“SMIPsTM”)，单链或串联双抗体
Figure BDA0002622936260000434
VHH，
Figure BDA0002622936260000435
迷你抗体，
Figure BDA0002622936260000436
锚蛋白重复序列蛋白或
Figure BDA0002622936260000437
DART，TCR样抗体，
Figure BDA0002622936260000438
Figure BDA0002622936260000439
微量蛋白，
Figure BDA00026229362600004310
和
Figure BDA00026229362600004311
在一些实施例中，可以将本文所述的CD19变体放置(例如融合)在本文所述的抗体(或片段)的C-末端和/或N-末端上。例如，可以将CD19变体与轻链或一部分(例如VL)的C-末端和/或N-末端融合；和/或与重链或一部分(例如VH)的C-末端和/或N-末端融合。在一些实施例中，可以将本文所述的CD19变体放置(例如融合)在本文所述的抗体(或片段)内或抗体结构域(例如scFv)之间。例如，融合蛋白可以包括处于不同构型的抗EGFR scFv、抗Her2scFv和突变体CD19。此类融合配偶体可以存在于处于不同构型的此类融合蛋白内，例如抗EGFR scFv/CD19突变体/抗Her2 scFv；抗Her2scFv/CD19突变体/抗EGFR scFv；CD19突变体/抗EGFR scFv/抗Her2 scFv；CD19突变体/抗Her2 scFv/抗EGFR scFv；抗EGFR scFv/抗Her2 scFv/CD19突变体；和/或抗Her2 scFv/抗EGFR scFv/CD19突变体。
在一些实施例中，抗体靶向本文所述的抗原。例如，在一些实施例中，抗体靶向PD-1、TIM-3、LAG-3、IDO、A2AR、TGFβ、CD47或涉及免疫抑制途径的另一种蛋白质。示例性非限制性融合蛋白可以包括抗PD1 scFv；抗PD-L1 scFv；抗CD39 scFv；或抗CD73 scFv。
在一些实施例中，抗体靶向一种或多种感染因子。例如，抗体可以靶向CD163(参见例如Svendsen等人,Mol.Ther.:Methods&Clin.Dev.[分子疗法：方法与临床开发]4:50-61(2017))。在一些实施例中，抗体靶向细菌，例如细菌O25b抗原(参见例如Guachalla等人,Antimicrob.Agents Chemother.[抗菌药物和化疗]61:e01428-17(2017))；β桶组装机(BAM)的一个或多个组分，例如BamA、BamB、BamC、BamD、或BamE(例如MAB1抗体)(参见例如Storek等人,PNAS 115:3692-3697(2018))；或金黄色葡萄球菌(例如Zhou等人,mAbs 8:1612-1619(2016)中描述的抗金黄色葡萄球菌抗体)。
可以通过本领域已知用于合成抗体的任何方法产生抗体或片段(参见例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],(Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],第2版,1988)；Brinkman等人,1995,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]182:41-50；WO 92/22324；WO 98/46645)。可以使用例如Morrison,1985,Science[科学]229:1202中描述的方法产生嵌合抗体，并且通过例如美国专利号6,180,370中描述的方法产生人源化抗体。
单结构域抗体
单结构域抗体是其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除抗体衍生的那些之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域已知的任一种，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人类、骆驼、美洲驼、山羊、兔、牛。根据本披露的一个方面，如本文使用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。此类单结构域抗体披露于例如WO 94/04678中。衍生自天然缺乏轻链的重链抗体的此类可变结构域在本文中称为“VHH”或“纳米抗体”。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼)中产生的抗体。骆驼科之外的其他物种(例如智人)也可以产生天然缺乏轻链的重链抗体；此类VHH在本披露的范围内。
根据以下文献给出的对VH结构域的通用编号，对来自骆驼科动物的VHH结构域的氨基酸残基进行编号：Kabat等人,“Sequence of proteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列]”,US Public Health Services[美国公共卫生服务],NIH(贝塞斯达，马里兰州)，公开号91-3242(1991)；还参见Riechmann等人,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]231:25-38(1999)。根据此编号，FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，FR2包含在位置36-49处的氨基酸，CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，并且FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
然而(如本领域对VH结构域和对VHH结构域熟知的)，应注意的是，每个CDR中的氨基酸残基的总数可以变化，并且可以不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可以不被实际序列占据，或实际序列可以含有比Kabat编号允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应于或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
用于对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代性方法是本领域已知的，这些方法也可以按类似方式应用于VHH结构域。然而，在本披露内容、权利要求书和附图中，将遵循根据Kabat并如以上所述应用于VHH结构域的编号，除非另外说明。
抗CLL-1单结构域抗体
人类C型凝集素样分子-1(CLL-1)，也称为MICL或CLEC12A，是II型跨膜糖蛋白，并且是免疫调节中涉及的C型凝集素样受体的大家族中的成员。先前已经从骨髓衍生细胞鉴定了CLL-1。CLL-1的细胞内结构域含有基于免疫酪氨酸的抑制基序(ITIM)和YXXM基序。在多种细胞上的含ITIM的受体的磷酸化可通过蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2和SHIP的募集而导致对激活途径的抑制。YXXM基序具有针对PI-3激酶13(参与细胞激活途径)的p85亚基的潜在SH2结构域结合位点，揭示了CLL-1作为针对骨髓细胞的抑制和活化分子的潜在双重作用。实际上，在转染的并且是骨髓衍生的细胞系中，已经通过实验证明了CLL-1与SHP-1和SHP-2的缔合。
在一些实施例中，本披露提供了包括CLL-1结合抗体或其片段(例如，其CLL-1结合片段)的融合蛋白，所述CLL-1结合抗体是或包括具有SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的VHH。如本文提供的序列表中所示，SEQ ID NO:203-225中的每一个包括在N-末端的VHH氨基酸和在C-末端的以下氨基酸：(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS)。因此，在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)的VHH，其中所述部分缺乏(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺乏(i)-(v)中的一个或多个的一部分)。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有SEQID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)的VHH，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)的VHH，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS。
在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有SEQID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)的VHH，其中所述部分缺乏(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺乏(i)-(v)中的一个或多个的一部分)，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多个)另外的氨基酸(即，(i)-(v)中包括的氨基酸以外的氨基酸)。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)的VHH，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多个)另外的氨基酸。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)的VHH，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多个)另外的氨基酸。
在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有以下氨基酸序列的VHH，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，其中所述部分缺乏(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺乏(i)-(v)中的一个或多个的一部分)。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有以下氨基酸序列的VHH，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有以下氨基酸序列的VHH，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS。
在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有以下氨基酸序列的VHH，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，其中所述部分缺乏(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺乏(i)-(v)中的一个或多个的一部分)，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多个)另外的氨基酸(即，(i)-(v)中包括的氨基酸以外的氨基酸)。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有以下氨基酸序列的VHH，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多个)另外的氨基酸。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括具有以下氨基酸序列的VHH，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，其中所述部分缺乏在SEQID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多个)另外的氨基酸。
在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括VHH，所述VHH包含在SEQ ID NO:203-225任一项中所示的至少一个CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括VHH，所述VHH包含在SEQ ID NO:203-225任一项中所示的至少一个CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)的一部分，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225中任一项所示的CDR中的1、2、3、4、5、或更多个氨基酸。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括VHH，所述VHH包含与SEQ ID NO:203-225任一项中所示的CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的至少一个CDR。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括VHH，所述VHH包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列与在SEQ ID NO:203-225任一项中所示的至少一个CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225中任一项所示的CDR中的1、2、3、4、5、或更多个氨基酸。
在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括VHH，所述VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1-13任一项中的CDR1、CDR2、和/或CDR3。在一些实施例中，本披露提供了包括抗体的融合蛋白，所述抗体是或包括VHH，所述VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1-13任一项中的(i)CDR1和CDR2；(ii)CDR2和CDR3；(iii)CDR1和CDR3；或(iv)CDR1、CDR2、和CDR3(例如，其中CDR来自一个特定的组，或其中CDR选自两个或更多个不同的组)。在一些实施例中，本披露提供了抗体，所述抗体是或包括VHH，所述VHH包含组1的CDR1、CDR2、和CDR3；组2的CDR1、CDR2、和CDR3；组3的CDR1、CDR2、和CDR3；组4的CDR1、CDR2、和CDR3；组5的CDR1、CDR2、和CDR3；组6的CDR1、CDR2、和CDR3；组7的CDR1、CDR2、和CDR3；组8的CDR1、CDR2、和CDR3；组9的CDR1、CDR2、和CDR3；组10的CDR1、CDR2、和CDR3；组11的CDR1、CDR2、和CDR3；组12的CDR1、CDR2、和CDR3；或组13的CDR1、CDR2、和CDR3，如表5A和/或表5B中所示。
表5A：
组 CDR1 CDR2 CDR3
1 CAASGSIFAINEI VAACASDGNTY DANSRGNYY
2 CVVSGDTRSI VAACASDGNTY DANSRGNYY
3 CVASGSIRSI VAACASDGNTY DANSRGNYY
4 CAASGFTFNSYA WVSDINSGGGSTN ATELRGSDYYRGPIREYAY
5 CAASGLTFSNYA AINWSGGTTD AASYRLRITVVVTPDEYHY
6 CAASGFAFDDYA WVSSISWNGGGTY VKLVDSGWYSAYDY
7 CVVSGATSNVNA LVAAISSGGSTS AAQDWATEGYEYDY
8 CVVSGTMFSGKD VATVSSDGGTD HFLWGRHY
9 CVASGNDISGSA VAVDAPRERPF GPSLRTFHGREWYRPPWFTS
10 CAASGSIFSINA VAVVSRFGETT NARIRGNYGSRIDY
11 CVVSGNMLDLNT LVAALGISTY ARDYNFES
12 GSDRSINV ITSGGTT KADTRWGGMY
13 GRTIDNGA INWSGGAT ASRRGVDLRRNSYEYDY
表5B：如基于IMGT编号和ANARCI软件鉴定的CDR(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/ANARCI.php)
组 CDR1 CDR2 CDR3
1 <u>GSIFAINEINL</u> <u>CASDGNT</u> DANSRGNYY
2 <u>GDTRSINL</u> <u>CASDGNT</u> DANSRGNYY
3 <u>GSIRSINV</u> <u>CASDGNT</u> DANSRGNYY
4 <u>GFTFNSYA</u> <u>INSGGGST</u> ATELRGSDYYRGPIREYAY
5 <u>GLTFSNYA</u> <u>INWSGGTT</u> AASYRLRITVVVTPDEYHY
6 <u>GFAFDDYA</u> <u>ISWNGGGT</u> VKLVDSGWYSAYDY
7 <u>GATSNVNA</u> <u>ISSGGST</u> AAQDWATEGYEYDY
8 <u>GTMFSGKD</u> <u>VSSDGGT</u> HFLWGRHY
9 <u>GNDISGSA</u> <u>VDAPRERP</u> GPSLRTFHGREWYRPPWFTS
10 <u>GSIFSINA</u> <u>VSRFGET</u> NARIRGNYGSRIDY
11 <u>GNMLDLNT</u> <u>LGIST</u> ARDYNFES
12 <u>GSDRSINV</u> <u>ITSGGTT</u> KADTRWGGMY
13 <u>GRTIDNGA</u> <u>INWSGGAT</u> ASRRGVDLRRNSYEYDY
如本领域的技术人员将理解的，例如使用分子生物学技术，可以容易地将任何此类CDR序列与本文提供的或本领域另外已知的任何其他抗体序列或结构域(包括如本文披露的或本领域另外已知的任何框架区、CDR、或恒定结构域、或其一部分，如可以存在于如本文披露的或本领域另外已知的任何形式的抗体或结合分子中)组合。
在一些实施例中，本披露提供了包括一种或多种抗CLEC12a抗体(或其一部分)和一种或多种本文所述的CD19突变体的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包括处于不同构型的抗Clec12a scFv、突变体CD19、和抗Clec12a VHH。在另一个实例中，可以将不同抗Clec12aVHH与处于不同构型的突变体CD19组合。在另一个实例中，不同抗Clec12a VHH可以与处于不同构型的突变体CD19一起，与靶向骨髓性白血病细胞上存在的一种或多种抗原的scFv或VHH组合。
可以通过本领域已知的方法，例如以下方法之一：BIACORE分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、X射线晶体学、序列分析和扫描诱变，测量本文所述的抗体与抗原(例如CLL-1)的结合特性。可以使用表面等离子共振(SPR)分析抗体和抗原(例如CLL-1)的结合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)实时监测生物特异性相互作用，而无需标记任何相互作用物。在BIA芯片的结合表面上的质量变化(指示结合事件)导致表面附近的光的折射率的改变。折射性的变化产生可检测信号，所述可检测信号作为生物分子之间的实时反应的指示而被测量。描述了使用SPR的方法，例如在美国专利号5,641,640；Raether(1988)Surface Plasmons[表面等离子]Springer Verlag[施普林格出版公司]；Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.[分析化学]63:2338-2345；Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.[结构生物学最新观点]5:699-705中，并且由BIAcore国际公司(BIAcore International AB，乌普萨拉，瑞典)提供了网络资源。另外，还可以使用可得自Sapidyne仪器公司(Sapidyne Instruments，博伊西，爱达荷州)的
Figure BDA0002622936260000512
测定(动力学排除测定)。
来自SPR的信息可以用于提供针对抗体与抗原(例如CLL-1)的结合的平衡解离常数(KD)、和动力学参数(包括Kon和Koff)的准确且定量的测量。此类数据可以用于比较不同的分子。来自SPR的信息还可以用于开发结构-活性关系(SAR)。可以鉴定与特定结合参数(例如高亲和力)相关的在给定位置处的变体氨基酸。
在某些实施例中，本文所述的抗体对结合抗原(例如CLL-1)表现出高亲和力。在各种实施例中，如本文所述的抗体对抗原(例如CLL-1)的KD小于约10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、或10-15M。在某些实例中，如本文所述的抗体对抗原(例如CLL-1)的KD在0.001与1nM之间，例如0.001nM、0.005nM、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、或1nM。
支架多肽
在一些实施例中，本披露提供了融合蛋白，所述融合蛋白包括本文所述的CD19变体和支架多肽(或其片段)。可以选择支架多肽(或片段)以结合到例如肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)。此类支架多肽(或片段)包括例如纤连蛋白结构域(例如III型纤连蛋白结构域)、DARPin、adhiron、脂质运载蛋白/抗运载蛋白、蛋白A、亲和体、硫氧还蛋白等。例如，融合蛋白可以是或包括III型纤连蛋白结构域-CD19变体融合蛋白。
掩蔽的构建体
在一些实施例中，本披露包括本文所述的抗原结合蛋白(例如本文所述的抗体)的掩蔽形式。在一些实施例中，本披露的融合蛋白包括本文所述的抗体或抗体片段的掩蔽形式(例如
Figure BDA0002622936260000511
如描述于例如Sandersjoo等人,Cell.Mol.Life Sci.[细胞与分子生命科学](2015)72:1405-1415；US 2015/0183875；US 8,513,390；和US 9,120,853中)。在一些实施例中，掩蔽的构建体包含抗体(或其片段)、掩蔽部分、可裂解部分、和/或接头。
在一些实施例中，掩蔽的构建体包含抗原结合蛋白(例如抗体、或其片段)和掩蔽部分。在一些实施例中，掩蔽部分是与抗原结合蛋白偶联的氨基酸序列，并且被定位使得掩蔽部分降低蛋白质特异性地结合其靶(“掩蔽”抗原结合蛋白)的能力。在一些实施例中，掩蔽部分通过接头与抗原结合蛋白偶联。在一些实施例中，与“未掩蔽的”抗原结合蛋白与靶的特异性结合相比，或与亲本抗原结合蛋白与靶的特异性结合相比，掩蔽的抗原结合蛋白与其靶的特异性结合被减少或被抑制。在一些实施例中，例如当在体内或在靶位移体外免疫吸附测定中(描述于US 8,513,390中)测量时，与未掩蔽的抗原结合蛋白与靶的特异性结合相比，或与亲本抗原结合蛋白与靶的特异性结合相比，掩蔽的抗原结合蛋白证明没有可测量的与靶的结合或基本上没有可测量的与靶的结合，并且/或者证明不多于0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的与靶的结合，例如持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96个小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长。
在一些实施例中，与未掩蔽的抗原结合蛋白与靶的特异性结合相比，或与亲本抗原结合蛋白与靶的特异性结合相比，掩蔽的抗原结合蛋白与其靶的特异性结合被减少或被抑制。掩蔽的抗原结合蛋白对靶的Kd可以是未掩蔽的抗原结合蛋白或亲本抗原结合蛋白对靶的Kd的至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍大或更大，或者5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍之间大。相反地，掩蔽的抗原结合蛋白对靶的结合亲和力可以比未掩蔽的抗原结合蛋白或亲本抗原结合蛋白对靶的结合亲和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或者低5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍之间。
掩蔽部分在本领域中是已知的并且包括例如抗体或其片段的已知结合配偶体。在一些实施例中，掩蔽部分是抗原结合蛋白的N-末端处、C-末端处和/或内部位点(例如，抗原结合环)内的氨基酸序列。在一些实施例中，掩蔽部分是或包括一对或多对半胱氨酸残基，例如从而在半胱氨酸对之间引起二硫键的形成。在一些这类实施例中，二硫键引起构象约束的结构，该结构可以通过例如还原剂裂解二硫键而“未掩蔽”。示例性掩蔽部分描述于以下中：例如Sandersjoo等人Cell.Mol.Life Sci.[细胞与分子生命科学](2015)72:1405–1415；US 2015/0183875；US 8,513,390；和US 9,120,853。
细胞治疗剂
在一些实施例中，可以将编码本文所述的CD19变体的核苷酸序列、或编码包含本文所述的CD19变体或由其组成的融合蛋白的核苷酸序列引入细胞治疗剂中。在一些实施例中，细胞治疗剂可以由免疫细胞(例如，可用于或能够用于过继性细胞疗法的细胞)产生。在一些实施例中，细胞治疗剂由选自下组的细胞类型产生，该组由以下组成：TIL、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、δ-γT-细胞、调节性T细胞或外周血单核细胞。如本文使用的，“肿瘤浸润淋巴细胞”或TIL是指已离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。淋巴细胞可以分为三个群组，包括B细胞、T细胞和自然杀伤细胞。如本文使用的，“T细胞”是指CD3+细胞，包括CD4+辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞和δ-γT细胞。
在某些实施例中，通过用编码本文所述的CD19变体或编码包含本文所述的CD19变体或由其组成的融合蛋白的核酸对细胞(例如免疫细胞)进行遗传修饰(例如转化)，产生了细胞治疗剂。在一些实施例中，此类核酸包含在重组表达载体中。重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，这些核苷酸可以是单链或双链的，合成的或部分从天然来源获得的，并且可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键联或两种类型的键联。
重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，例如质粒和病毒。例如，载体可以选自pUC系列(马里兰州格伦伯尼的富酶泰斯生命科学公司(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.))、pBluescript系列(加利福尼亚州拉霍亚的Stratagene公司(Stratagene,LaJolla,Calif.))、pET系列(威斯康星州麦迪逊的Novagen公司(Novagen,Madison,Wis.))、pGEX系列(瑞典乌普萨拉的法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden))和pEX系列(加利福尼亚州帕罗奥图的克隆科技公司(Clontech,Palo Alto,Calif.))。也可以使用噬菌体载体，例如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene公司(Stratagene))、λEMBL4和λNM1149。可用于本披露的上下文中的植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(克隆科技公司(Clontech))。可用于本披露的上下文中的动物表达载体的实例包括pcDNA、pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(克隆科技公司(Clontech))。
在一些实施例中，重组表达载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、甲病毒、牛痘、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒载体，并且优选地具有转化免疫细胞(例如，T细胞)的天然或工程化的能力。
在离体应用(例如细胞疗法)中，首先开发了衍生自鼠白血病病毒(MLV)的γ逆转录病毒载体，并且仍在使用该载体。广泛使用了基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体。在设计慢病毒载体方面的一般策略是基于天然病毒序列的缺失和改变，从而防止产生具有复制能力的病毒。因此，将慢病毒组分分离到三种或四种不同的质粒构建体中，目的是防止完全重组成完全具有复制能力的慢病毒(RCL)的可能性。病毒载体基因组至少含有转基因表达盒、长末端重复序列(LTR)、和包装信号。在大多数情况下，三种另外的质粒提供了病毒产生和包装所需的因子(例如gag、pol、env)。还缺失了来自3’LTR的启动子-增强子区，这防止了从这一区域的转录和随后的病毒复制(称为自失活载体；SIN)。离体细胞转化或转导的必要步骤涉及细胞分离和所希望的细胞类型的培养，从而允许在已经用病毒载体转导细胞之前或之后进行选择、扩增、和分化。在造血细胞的情况下，这些步骤中的大多数都是在封闭系统中使用一次性采血袋和处理袋进行的。对于CAR T细胞疗法，收获患者的血液细胞，并且选择所希望的T细胞群体，并且使其生长至所需水平。然后用携带所希望的基因盒的病毒载体转导它们，随后是CAR T细胞扩增，至百万个细胞的水平。已经示出慢病毒载体可有效转导T细胞，并且因此慢病毒载体是用于将CAR引入患者靶细胞的优选载体。然后将扩增的细胞重新引入患者体内。
在一些实施例中，通过已经转导T细胞的载体来表达识别CD19蛋白的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，通过已经转导T细胞的载体来表达识别CD19蛋白的CAR，并且表达融合蛋白。在一些实施例中，使用两种载体来转导T细胞，一种载体表达CAR，一种载体表达融合蛋白。
重组表达载体可以使用描述于以下中的标准重组DNA技术来制备：例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,ColdSpring Harbor Press[冷泉港出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约州,2001；以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学当前方案],GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons[格林出版集团和约翰威立父子出版公司],纽约州,1994。可以制备环状或线性的表达载体的构建体以含有在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可以衍生自例如ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等等。
重组表达载体可以包含一个或多个标记物基因，这些标记物基因允许选择转化或转染的宿主。标记物基因具有杀生物剂抗性(例如，对抗生素、重金属等的抗性)，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型等等。用于重组表达载体的合适的标记物基因包括例如新霉素/G418抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
可用于本披露的上下文中的载体可以是“裸”核酸载体(即，具有很少或不具有包封它们的蛋白质、糖和/或脂质的载体)或与其他分子复合的载体。可以与载体适合地组合的其他分子包括但不限于病毒外壳、阳离子脂质、脂质体、多胺、金颗粒和靶向部分例如靶向细胞分子的配体、受体或抗体。
可以经由常规转化或转染技术将载体DNA引入到细胞(例如免疫细胞(例如T细胞))中。如本文使用的，术语“转化”和“转染”以及“转导”旨在是指用于将外来核酸(例如，DNA)引入到细胞中的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂转染、基因枪或电穿孔。
在一些实施例中，用表达嵌合抗原受体(CAR)或特定T细胞受体(TCR)的整合型载体转导细胞(例如免疫细胞(例如T细胞))。在一些实施例中，整合型表达载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施例中，使用转座子技术引入表达构建体。在一些实施例中，使用例如信使RNA(mRNA)的电穿孔，引入表达构建体。在一些实施例中，整合型载体表达多个元件，例如CAR序列和一个或多个另外的元件。在一些实施例中，另外的元件包括但不限于融合蛋白、抗体或其片段、天然蛋白、细胞因子、和肽。在一些实施例中，通过可裂解元件，例如P2A或T2A序列，从另外的一个或多个元件分离CAR序列。在一些实施例中，例如，表达的产物包含CAR19序列；2A可裂解序列；CD19或其结构域、或变体；另外的元件1；另外的元件2。在一些实施例中，例如，表达的产物包含CD19或其结构域、或变体；另外的元件1；另外的元件2；2A可裂解序列；和CAR19序列。在一些实施例中，例如，表达的产物包含CAR19序列；2A可裂解序列；另外的元件1；另外的元件2；和CD19或其结构域、或变体。在一些实施例中，例如，表达的产物包含另外的元件1；CD19或其结构域、或变体；另外的元件2；2A可裂解序列；和CAR19序列。
蛋白质治疗剂
在一些方面中，本文所述的CD19变体、或包含CD19变体或由其组成的融合蛋白可以产生，并且用作代替由本文所述的细胞治疗剂产生的治疗剂的治疗剂或用作除由本文所述的细胞治疗剂产生的治疗剂之外的治疗剂。这类多肽可以包含在组合物例如药物组合物中，并用作蛋白质治疗剂。例如，包括CD19变体的蛋白质治疗剂可以与靶向CD19的细胞治疗剂(例如CAR-T细胞或ADC)组合施用。
制备多肽的多种方法在本领域中是已知的，并且可以用于制备包含在蛋白质治疗剂中的多肽。例如，多肽可以通过利用经工程化以表达编码多肽的核酸的宿主细胞系统来重组产生。基因的重组表达可以包括构建含有编码多肽的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得多核苷酸，用于产生多肽的载体可以使用本领域已知的技术通过重组DNA技术来产生。已知的方法可以用于构建含有多肽编码序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
表达载体可以通过常规技术转移到宿主细胞，并且然后转染的细胞可以通过常规技术培养以产生多肽。
可以使用多种宿主表达载体系统(参见例如，美国专利号5,807,715)。这类宿主表达系统可以用于产生多肽，并且随后在需要时进行纯化。这类宿主表达系统包括用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属和毕赤酵母属)；用含有多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0和3T3细胞)。
对于细菌系统，可以使用多种表达载体，包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,1983,EMBO[欧洲分子生物学组织杂志]12:1791)；pIN载体(Inouye和Inouye,1985,Nucleic Acids Res.[核酸研究]13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]24:5503-5509)；等等。pGEX载体也可以用于表达作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白的外来多肽。
对于哺乳动物宿主细胞中的表达，可以利用基于病毒的表达系统(参见例如Logan和Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]8 1:355-359)。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强表达的效率(参见例如，Bittner等人,1987,Methods in Enzymol.[酶学方法]153:516-544)。
另外，可以选择宿主细胞株，该宿主细胞株调控插入的序列的表达或以所希望的特定方式修饰并加工基因产物。不同宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特有的且特定的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保对所表达的多肽进行正确的修饰和加工。这类细胞包括例如，建立的哺乳动物细胞系和昆虫细胞系、动物细胞、真菌细胞和酵母细胞。哺乳动物宿主细胞包括例如，BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l，ECACC号：85110503)；人类视网膜母细胞(PER.C6，库赛尔公司(CruCell)，莱顿，荷兰)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚胎肾系(293或亚克隆用于在悬浮液培养中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen.Virol.[普通病毒学杂志],36:59,1977)；人类纤维肉瘤细胞系(例如，HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报],77:4216,1980)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学],23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1，ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人类宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报],383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人类肝癌细胞系(Hep G2)。
为了重组蛋白质的长期高产量生产，将宿主细胞工程化以稳定表达多肽。宿主细胞可以用由本领域已知的适当表达控制元件(包括启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点和可选择标记物)控制的DNA进行转化。可以使用重组DNA技术领域中常见已知的方法来选择所希望的重组克隆。
一旦本文所述的蛋白质已经通过重组表达产生，该蛋白质就可以通过本领域中已知的用于纯化的任何方法来纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱和尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。例如，抗体可以通过适当地选择和组合亲和柱(例如蛋白A柱)和色谱柱、过滤、超滤、盐析和透析程序进行分离和纯化(参见Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],1988)。此外，如本文所述的，多肽可以融合到异源多肽序列以促进纯化。可替代地或另外，多肽或融合蛋白可以部分或完全通过化学合成来制备。
病毒递送
在一些实施例中，将编码本文所述的融合蛋白(例如本文所述的CD19变体融合蛋白)的核酸引入病毒载体中。在一些实施例中，这种病毒载体可以用于将融合蛋白引入癌细胞(例如肿瘤细胞)中。这种融合蛋白的引入可以增加对受试者的免疫系统和/或一种或多种另外的治疗剂的易感性(参见例如WO 2017/075533)。
载体设计
可以将编码本文所述的CD19变体融合蛋白的核酸序列克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可以克隆到质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒中。其他载体可以包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体、以及病毒载体。在其他实例中，载体可以是泡沫病毒(FV)载体，这是由泡沫病毒(spumavirus)制成的一种类型的逆转录病毒载体。病毒载体设计和技术在本领域中是众所周知的，如在以下中所述：Sambrook等人,(MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],2001)和其他病毒学和分子生物学手册。
病毒转导
病毒在向特定细胞类型的核酸递送方面是高度有效的，同时经常避免通过感染的宿主免疫系统进行的检测。这些特征使得某些病毒成为作为将细胞疗法靶引入到癌细胞例如实体瘤细胞中的媒介物的吸引人的候选物。多种基于病毒的系统已经被开发用于将基因转移到哺乳动物细胞中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、1型单纯疱疹病毒、疱疹病毒、肿瘤病毒(例如，鼠白血病病毒)等等。一般来讲，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点、以及一个或多个选择性标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
慢病毒和逆转录病毒转导可以通过添加聚凝胺(圣克鲁斯公司(SantaCruz)的sc-134220；Millipore公司的TR-1003-G；西格玛公司(Sigma)的107689)(一种用于增加逆转录病毒转导的效率的阳离子聚合物(还称为海地美溴铵(hexamehtrine bromide)))来增强。
例如，逆转录病毒为基因递送系统提供平台。逆转录病毒是属于逆转录病毒病毒科的包膜病毒。一旦处于宿主细胞中，病毒就通过使用病毒逆转录酶进行复制以便将其RNA转录为DNA。逆转录病毒DNA复制为宿主基因组的一部分，并且称为前病毒。所选基因可以使用本领域中已知的技术插入到载体中并且封装在逆转录病毒颗粒中。重组病毒然后可以被分离并且递送到受试者的体内细胞中。多种逆转录病毒系统在本领域中是已知的(参见例如美国专利号5,994,136、6,165,782和6,428,953)。
逆转录病毒包括α逆转录病毒属(例如，禽类白血病病毒)、β逆转录病毒属；(例如，小鼠乳腺肿瘤病毒)、δ逆转录病毒属(例如，牛白血病病毒和人类T淋巴细胞病毒)、ε逆转录病毒属(例如，大眼鲈皮肤肉瘤病毒)、以及慢病毒属。在一些实施例中，逆转录病毒是慢病毒(逆转录病毒科的病毒属)，例如其特征在于长潜伏期。慢病毒在逆转录病毒中在能够感染非分裂细胞方面是独特的；慢病毒可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，所以可以用作有效基因递送载体。在一些实例中，慢病毒可以是但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(S1V)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血(EIA)、以及绵羊髓鞘脱落病毒。衍生自慢病毒的载体提供实现显著水平体内基因转移的方式。
在一些实施例中，载体是腺病毒载体。腺病毒是含有双链DNA的大家族病毒。它们复制宿主细胞的DNA，同时使用宿主的细胞机器来合成病毒RNA DNA和蛋白质。在本领域中已知腺病毒影响复制和非复制细胞两者，以便适应大转基因并且编码蛋白质而不整合到宿主细胞基因组中。
在一些实施例中，使用AAVP载体。AAVP载体是原核-真核载体的杂交物，它们是重组腺相关病毒和噬菌体的遗传顺式元件的嵌合体。AAVP组合噬菌体和AAV载体系统两者的所选元件，从而提供在细菌中简单地产生并且会表现出很小的或没有封装限制的载体，同时允许感染哺乳动物细胞，与整合到宿主染色体中组合。含有许多适当的元件的载体可商购获得，并且可以通过标准方法来进一步修饰以便包含必需序列。除其他事项之外，AAVP不需要辅助病毒或反式作用因子。另外，哺乳动物细胞的AAV的天然向性被消除，因为不存在AAV壳体形成。其他方法和细节在美国专利8,470,528和Hajitou A.等人,Cell[细胞],125:358-398中。
在一些实施例中，使用人类乳头瘤(HPV)假病毒。DNA质粒可以封装到乳头瘤病毒L1和L2衣壳蛋白中，以生成可以有效递送DNA的假病毒体。包封可以保护DNA免受核酸酶的影响，并且提供具有高水平的稳定性的靶向递送。HPV假病毒可以减轻与使用病毒载体相关的许多安全性问题。其他方法和实例见于Hung,C.等人,Plos One[公共科学图书馆期刊],7:7(e40983)；2012，美国专利8,394,411，以及Kines,R.等人Int J of Cancer[癌症国际杂志],2015中。
在一些实施例中，使用溶瘤病毒。溶瘤病毒疗法可以选择性地复制癌细胞中的病毒，并且随后可以在肿瘤内扩散，例如在不影响正常组织的情况下。可替代地，溶瘤病毒可以优先感染并杀伤细胞而不对正常组织造成损害。溶瘤病毒还可以有效地诱导对于其本身以及对于感染的肿瘤细胞的免疫应答。典型地，溶瘤病毒落入两种类别中：(I)优先在癌细胞中天然复制并且在人类中是非致病性的病毒。示例性类别(I)溶瘤病毒包括自主细小病毒、粘液瘤病毒(痘病毒)、新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus，NDV；副粘病毒)、呼肠孤病毒、以及塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus)(小核糖核酸病毒)。第二种类别(II)包括在基因上操纵以用作疫苗载体的病毒，包括麻疹病毒(副粘病毒)、脊髓灰质炎病毒(小核糖核酸病毒)、以及痘苗病毒(痘病毒)。另外，溶瘤病毒可以包括使用对于在正常细胞但是不在癌细胞中复制所需要的基因中的突变/缺失在基因上工程化的那些病毒，包括腺病毒、单纯疱疹病毒、和水疱性口炎病毒。溶瘤病毒由于其遗传抗性的低可能性而可以用作病毒转导方法，因为它们可以靶向多种途径并且在肿瘤选择性方法中进行复制。肿瘤内的病毒剂量由于原位病毒扩增而可以随时间增加(与随时间降低的小分子疗法相比较)，并且安全性特征可以在内部建立(即，药物和免疫敏感性)。
施用
本披露的某些实施例包括例如以有效治疗受试者的量向受试者(或其群体)施用本文所述的细胞治疗剂、本文所述的蛋白质治疗剂、包含细胞治疗剂的组合物和/或包含蛋白质治疗剂的组合物的方法。在一些实施例中，该方法在受试者中有效地治疗癌症。
在一些实施例中，细胞治疗剂包括施用到获得免疫细胞的相同受试者中的自体细胞。可替代地，从受试者获得免疫细胞，并且用本文所述的表达构建体对所述免疫细胞进行转化(例如转导)，以获得同种异体转移到另一名受试者中的细胞治疗剂。
在一些实施例中，细胞治疗剂对受试者是自体的，并且在从受试者中分离免疫细胞之前，受试者可以是免疫原性的、免疫的、患病的或处于另一种状况。
在一些实施例中，另外的步骤可以在向受试者施用之前进行。例如，细胞治疗剂可以在使免疫细胞与本文所述的表达构建体接触(例如，转导或转染)之后但在向受试者施用之前进行体外扩增。体外扩增可以在向受试者施用之前进行1天或更长，例如2天或更长、3天或更长、4天或更长、6天或更长或8天或更长。可替代地或除此之外，体外扩增可以在向受试者施用之前进行21天或更短，例如18天或更短、16天或更短、14天或更短、10天或更短、7天或更短或5天或更短。例如，体外扩增可以在向受试者施用之前进行1-7天、2-10天、3-5天或8-14天。
在一些实施例中，在体外扩增期间，细胞治疗剂可以用抗原(例如，TCR抗原)刺激。抗原特异性扩增可以任选地用在非特异性刺激淋巴细胞增殖(例如像抗CD3抗体、抗Tac抗体、抗CD28抗体或植物凝集素(PHA))的条件下的扩增补充。扩增的细胞治疗剂可以直接施用到受试者中或可以冷冻以供将来使用，即用于随后向受试者施用。
在一些实施例中，细胞治疗剂在输注到癌症患者中之前用白细胞介素-2(IL-2)离体处理，并且在输注之后用IL-2治疗癌症患者。此外，在一些实施例中，癌症患者可以在施用细胞治疗剂之前经历制备性淋巴细胞消耗，即临时消除免疫系统。IL-2处理和制备性淋巴细胞消耗的组合可以增强细胞治疗剂的持久性。
在一些实施例中，用编码细胞因子的核酸转导或转染细胞治疗剂，该核酸可以被工程化以提供细胞因子的组成型、可调节型或时间受控表达。合适的细胞因子包括，例如在收缩阶段起增强T淋巴细胞存活作用的细胞因子，这些细胞因子可以促进记忆T淋巴细胞的形成和存活。
在某些实施例中，细胞治疗剂在施用另一种治疗剂(例如癌症治疗剂)之前、基本上同时或之后施用。癌症治疗剂可以是例如化学治疗剂、生物药剂或放射治疗。在一些实施例中，接受细胞治疗剂的受试者不被施用足以导致免疫细胞消耗的治疗，例如淋巴细胞消耗化学疗法或放射疗法。
本文所述的细胞治疗剂可以形成为组合物，例如细胞治疗剂和药学上可接受的载体。在某些实施例中，组合物是包含本文所述的至少一种细胞治疗剂和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。本文所述的药学上可接受的载剂(例如，媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂)是本领域技术人员熟知的且易于获得的。优选地，药学上可接受的载体对一种或多种活性剂(例如，细胞治疗剂)是化学惰性的，并且在使用条件下不引发任何有害的副作用或毒性。
可以将组合物配制用于通过任何合适的途径施用，该适合途径例如像静脉内、瘤内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、硬膜外和/或皮下施用途径。优选地，将该组合物配制用于肠胃外施用途径。
适用于肠胃外施用的组合物可以是水性或非水性的等渗无菌注射溶液，该注射溶液可以含有例如使得组合物与预定接收者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质。水性或非水性无菌悬浮液可以含有一种或多种悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
向受试者(特别是人类)施用的剂量将随着特定实施例、所采用的组合物、施用方法和被治疗的特定部位和受试者而变化。然而，剂量应当足以提供治疗应答。本领域中技术熟练的临床医生可以确定有待向人类或其他受试者施用的组合物的治疗有效量，以便治疗或预防特定的医学病状。治疗有效所需的组合物的精确量取决于除在本领域技术人员范围内的许多受试者特异性的考虑之外的多种因素，例如像细胞治疗剂的比活性和施用途径，肿瘤细胞(例如，由于肿瘤块或肿瘤负荷的范围)上和/或正常细胞上的可用的一种或多种抗原的量。在一些实施例中，可以在剂量递增临床试验中定义针对特定的一种或多种癌症适应症的细胞治疗剂的适当剂量。
可以将任何适合数量的细胞治疗剂细胞向受试者施用。虽然本文所述的单一细胞治疗剂细胞能够扩增并提供治疗益处，但在一些实施例中，施用102个或更多，例如103个或更多、104个或更多、105个或更多或108个或更多的细胞治疗剂细胞。可替代地或另外，将本文所述的1012个或更少，例如1011个或更少、109个或更少、107个或更少或105个或更少的细胞治疗剂细胞向受试者施用。在一些实施例中，施用本文所述的102-105、104-107、103-109或105-1010个细胞治疗剂细胞。
本文所述的细胞治疗剂的剂量可以在合适的时间段内(例如，在每天、每半周、每周、每两周、每半月、每两月、每半年或每年基础上)一次性或以一系列亚剂量按需向哺乳动物施用。包含有效量的细胞治疗剂的剂量单位可以单一日剂量施用，或者总日剂量可以每天施用二、三、四或更多个分剂量按需施用。
本文所述的多肽可以并入到药物组合物中(例如，用作蛋白质治疗剂)。包含多肽的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法进行配制(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences[雷明顿的医药科学]第1447-1676页(Alfonso R.Gennaro,编著,第19版1995))。药物组合物可以包含无菌溶液或水悬浮液的可注射制剂或者另一种药学上可接受的液体的形式肠胃外施用。例如，药物组合物可以通过以下进行配制：将多肽与药学上可接受的媒介物或介质(例如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味赋形剂、稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂)适合地组合，然后以通常接受的药物实践所需的单位剂量形式混合。包含在药物制剂中的活性成分的量是提供在指定范围内的合适的剂量。
用于注射的无菌组合物可以根据常规药物实践使用用于注射的蒸馏水作为媒介物进行配制。例如，含有葡萄糖和其他添加剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的生理盐水或等渗溶液可以任选地与合适的增溶剂组合用作用于注射的水性溶液，该增溶剂例如醇(例如乙醇和多元醇(例如丙二醇或聚乙二醇))以及非离子型表面活性剂(例如聚山梨酯80TM、HCO-50等等)。
油状液体的非限制性实例包括芝麻油和大豆油，并且该油状液体可以与作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苄醇组合。可以包含的其他项目是缓冲液(例如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液)、安抚剂(例如普罗卡因盐酸盐)、稳定剂(例如苄醇或苯酚)和抗氧化剂。配制的注射液可以包装在合适的安瓿中。
施用途径可以是肠胃外施用，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。施用可以是全身性的或局部的，通过静脉注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射进行。
可以基于受试者的年龄和状况来选择合适的施用手段。含有多肽的药物组合物的单次剂量可以选自0.001至1000mg/kg体重的范围。另一方面，剂量可以在0.001至100000mg/体重的范围内选择，但是本披露不限于这类范围。施用的剂量和方法可以根据受试者的体重、年龄、状况等等而变化，并且可以由本领域技术人员按需适合地选择。
肿瘤
本披露提供可用于治疗任何肿瘤的技术。在一些实施例中，肿瘤是或包括血液恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、多毛细胞白血病、AIDS相关的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、多发性骨髓瘤或骨髓增生性赘生物。
在一些实施例中，肿瘤是或包括实体瘤，包括但不限于乳腺癌、鳞状细胞癌、结肠癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、间皮瘤、生殖泌尿癌、直肠癌、胃癌或食道癌。
在一些特定实施例中，肿瘤是或包括晚期肿瘤和/或难治性肿瘤。在一些实施例中，当在肿瘤中(例如，在组织样品，例如从肿瘤获得的活检样品中)观察到某些病理学时，并且/或者当患有这类肿瘤的癌症患者典型地被认为不是常规化学疗法的候选人时，这种肿瘤被表征为晚期的。在一些实施例中，将肿瘤表征为晚期的病理学可以包括肿瘤大小、遗传标记物的表达改变、肿瘤细胞对邻近器官和/或淋巴结的侵入。在一些实施例中，当患有肿瘤的患者对一种或多种已知的治疗模式(例如，一种或多种常规化学疗法方案)有抗性时，并且/或者当特定患者对一种或多种这类已知治疗模式表现出抗性(例如，缺乏应答性)时，这种肿瘤被表征为难治性的。
组合疗法
在一些实施例中，细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂与第二细胞治疗剂、抗体-药物缀合物、抗体和/或多肽组合施用。在一些实施例中，第二细胞治疗剂(例如，CAR-T细胞)的肿瘤靶向和/或杀伤程度高于(例如是相加的或协同的)在不存在与本文所述的细胞治疗剂或蛋白质治疗剂的组合疗法时观察或测量到的水平。
包含本文所述的细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂的药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的治疗剂(例如癌症治疗剂，例如化学治疗剂或生物药剂)并且/或者与一种或多种另外的治疗剂组合施用。可以与本文所述的细胞治疗剂组合使用的化学治疗剂的实例包括铂化合物(例如，顺铂、卡铂和奥沙利铂)，烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、噻替派、美法仑、白消安、甲基苄肼、链脲霉素、替莫唑胺、达卡巴嗪和苯达莫司汀)，抗肿瘤抗生素(例如，道诺霉素、阿霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、博来霉素、丝裂霉素C、普卡霉素和更生霉素)，紫杉烷(例如，紫杉醇和多西他赛)，抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、培美曲塞、硫鸟嘌呤、氟尿苷、卡培他滨和甲氨蝶呤)，核苷类似物(例如，氟达拉滨、氯法拉滨、克拉屈滨、喷司他丁和奈拉滨)，拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑替康和伊立替康)，低甲基化剂(例如阿扎胞苷和地西他滨)，蛋白体抑制剂(例如，硼替佐米)，表鬼臼毒素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)，DNA合成抑制剂(例如，羟基脲)，长春花生物碱(例如，长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和长春花碱)，酪氨酸激酶抑制剂(例如，伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼、索拉非尼和舒尼替尼)，亚硝基脲(例如，卡莫司汀、福莫司汀和洛莫司汀)，六甲蜜胺，米托坦，血管生成抑制剂(例如，沙利度胺和来那度胺)，类固醇(例如，强的松、地塞米松和泼尼松龙)，激素药剂(例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、亮丙瑞林、比卡鲁胺(bicaluatmide)、格拉司琼和氟他胺)，芳香酶抑制剂(例如，来曲唑和阿那曲唑)，三氧化二砷，维甲酸，非选择性环氧合酶抑制剂(例如，非类固醇抗炎剂、水杨酸盐、阿司匹林、吡罗昔康、布洛芬、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸、托美丁、酮洛芬、萘丁美酮和奥沙普秦)，选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂或其任何组合。
可以用于本文所述的组合物和方法中的生物药剂的实例包括单克隆抗体(例如，利妥昔单抗、西妥昔单抗、帕木单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、贝伐单抗、卡妥索单抗、地舒单抗、奥比妥珠单抗、奥法木单抗、雷莫卢单抗、帕妥珠单抗、伊匹木单抗、纳武单抗、尼妥珠单抗、兰布罗利珠单抗(lambrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、司妥昔单抗、BMS-936559、RG7446/MPDL3280A、MEDI4736、曲美木单抗或本文在表1中列出的其他抗体)，酶(例如，左旋天冬酰胺酶)，细胞因子(例如，干扰素和白细胞介素)，生长因子(例如，集落刺激因子和促红细胞生成素)，癌症疫苗，基因疗法载体或其任何组合。
在一些实施例中，本文所述的治疗方法在医学病状的其他治疗失败或通过其他手段的治疗成功较少的受试者上进行。另外，本文所述的治疗方法可以结合医学病状的一种或多种另外的治疗来进行。例如，该方法可以包括在施用本文所述的细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂或其组合物之前、基本上同时或之后施用癌症方案，例如非清髓性化学疗法、手术、激素疗法和/或放射。在某些实施例中，施用本文所述的细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂的受试者也可以用抗生素和/或一种或多种另外的药剂来治疗。
本文提到的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考文献通过引用以其整体并入。另外，材料、方法、和实例都仅是说明性的而不旨在是限制性的。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法或材料可以用于实践或测试本发明，但是本文描述了合适的方法和材料。
本披露的示例性氨基酸和核苷酸序列列于下表中：
Figure BDA0002622936260000671
Figure BDA0002622936260000681
Figure BDA0002622936260000691
Figure BDA0002622936260000701
通过以下实例进一步说明本披露。以下实例是仅出于说明性目的而提供，并且不应解释为以任何方式限制本披露的范围或内容。
实例
实例1-CD19组合文库
使用酵母表面展示(Boder等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]15:553-557(1997))和荧光活化细胞分选法(Chao等人,Nat.Protoc.[自然实验手册]1:755-768(2006))，经由选择，从组合文库鉴定出具有改进的结构完整性的CD19的细胞外结构域(下文称为CD19；SEQ ID NO:2)。产生两种组合文库。在第一文库中，每种氨基酸独立地多样化为所有二十种典型氨基酸；即包括所有单残基突变。唯一的例外是L165和S166(将它们从多样化中排除)、以及S164(使用NNC简并密码子将它多样化为15种氨基酸)，这两者均为蛋白编码基因序列内包括切口内切酶(nicking endonuclease)识别DNA序列的要求。在第二文库中，使两个或三个氨基酸的选择组合同时突变，以鉴定相加的和协同的突变(图2)。
使用在每个多样化位点处具有NNK密码子的切口诱变(Wrenbeck等人,Nat.Methods[自然方法]13:928-930(2016))来产生突变体CD19基因，将其引入pCT-Aga2p-CD19-MYC酵母展示载体中，并且转化到酵母中。基于单重和三重突变文库的多样化的位置，将它们分别分成三个和两个池，使得能够经由Illumina深度测序(所述测序不能在一次读取中有效将整个CD19基因测序)鉴定它们的突变。单重1对应于SEQ ID NO:2的位点1P至92W。单重2对应于SEQ ID NO:2的位点93T至156P。单重3对应于SEQ ID NO:2的位点157P至272K。三重1对应于结构域1中的组(图2中的前15行)，并且三重2对应于结构域2中的组(图2中的后12行)。对于每个文库，获得了105至106个独特的连接转化子，这提供了单重文库中可能的序列的29-98倍过采样，和三重文库中的1.1-2.4倍过采样。
经由以下三种选择模式，从每个文库鉴定CD19变体：(1)结合构象依赖性抗体FMC63和4G7的能力；(2)当暴露于蛋白酶K时，对裂解的抗性；和(3)如实例2-4中所述，在热应力(37℃)下进行诱导时，酵母表面展示的程度。
实例2.抗体结合
示出抗体FMC63和4G7结合在哺乳动物细胞培养中产生的野生型CD19，而不结合酵母展示的野生型CD19(图3)。相反，抗体UmAb103和3B10确实能有效地结合酵母展示的野生型CD19(图3)。值得注意的是，甚至在对CD19进行升高的热处理后，UmAb103和3B10能够结合酵母展示的野生型CD19(图3)。这些结果表明，UmAb103和3B10结合非构象性表位(所述表位容易地呈现在酵母展示的野生型CD19上)，而FMC63和4G7结合在野生型CD19的酵母展示的版本上未适当地重演的表位。
因此，将重新获得与FMC63和/或4G7的结合的CD19变体鉴定为结构上改进的CD19变体。在未分类的文库中，功能突变体是罕见的，但是存在(图4)。流式细胞仪分选分离了经由Illumina MiSeq深度测序鉴定的这些改进的变体(图4)。统计分析揭示显著富集的变体(表1A和表1B)。
表1A-具有对FMC63和4G7的改进的结合的单重突变体：
单重突变体
Figure BDA0002622936260000721
表1B：具有对FMC63和4G7的改进的结合的三重突变体：
三重突变体
Figure BDA0002622936260000731
实例3.蛋白酶抗性
用蛋白酶K处理酵母展示的野生型CD19导致蛋白部分裂解，这取决于孵育的时间、蛋白酶浓度、和CD19稳定性。这可以通过C-末端MYC表位信号的减少同时相对维持N-末端HA表位信号来容易地测量(图5)。对单重和三重突变体组合文库进行分类从而鉴定对蛋白酶K裂解具有改进的抗性的突变体(图6)。Illumina MiSeq深度测序揭示分离的改进的变体(表2A和表2B)。
表2A：对蛋白酶解具有改进的抗性的单重突变体
单重突变体
Figure BDA0002622936260000751
表2B：对蛋白酶解具有改进的抗性的三重突变体
三重突变体
Figure BDA0002622936260000761
实例4.热应力
还针对在诱导的展示期间突变体耐受热应力的能力，将组合文库分类。在37℃(已经示出导致具有减小的热稳定性的蛋白变体的降低展示的条件)下诱导酵母(Shusta等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]292:949-956(1999)；Hackel等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]401:84-96(2010))。选择具有增加展示的CD19突变体(图7)并且测序(表3)。
表3：在热应力下具有改进的表达的突变体
Figure BDA0002622936260000781
实例5.第二代CD19 ECD组合子文库
选择具有改进的抗体结合、蛋白酶抗性、和/或热抗性的CD19变体不仅鉴定了具有独特功能的分子，而且还鉴定了可以组合从而进一步推进功能的突变体。将来自初始CD19工程的13组高度有益突变(在CD19 ECD中的291个位点中的39个位点处)进行组合。初始筛选鉴定了从突变中受益最大的39个位点，这些位点约束了对序列空间的另外的大量检索。此外，在39个位点处的所有可能的氨基酸突变将推导出2039＝1050种变体。在这些位点处的功能突变的鉴定使得组合文库能够被约束至7x 107种变体(图8)。
对这一组合文库的分析表明，相对于野生型CD19或三重突变体，基本上升高的FMC63结合(图9和图15C)。
实例6.工程化的CD19突变体的选择
具有增强的蛋白酶抗性和FMC63结合的CD19多重突变体的选择产生了具有改进的FMC63结合(图10A)和升高的蛋白酶抗性(图10B)的群体。
实例7.CD19配体文库的产生
CD19 ECD由被短接头区隔开的两个Ig结构域组成(图12)。对CD19 ECD进行多样化从而产生对多种分子靶的新结合功能性。例如，为了产生CD19配体文库，要改变Ig结构域1、或Ig结构域2中的溶剂暴露的环，或Ig结构域2中的β折叠片表面(图12)。其他表面和其他特定氨基酸也有所变化。在遗传水平(>1x 108个酵母转化子)上构建文库(Woldring等人,PLoS One[公共科学图书馆期刊]10,e0138956(2015))。
在稳定性工程化的CD19结构域的背景下，实现这些突变(参见实例6)。值得注意的是，通过使在观察到改进CD19的结构完整性的特定位点处的特定氨基酸的频率增加(实例2-6)，并且通过使在阻碍结构完整性的位点处的氨基酸的频率降低，进一步指导图12中的实例文库设计。
实例8.基于CD19的配体的发现和进化
使用在磁选择和流式细胞仪选择(Hackel等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]401:84-96(2010)；Woldring等人,PLoS One[公共科学图书馆期刊]10,e0138956(2015)；Ackerman等人,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]25:774-783(2009))下的重组EGFR胞外结构域，随后是使用洗涤剂增溶的EGFR+细胞裂解物的流式细胞仪选择，将文库针对与分子靶(例如表皮生长因子受体(EGFR))的结合物进行分类。使用针对对照蛋白和EGFR-裂解物的消耗分选，使特异性进化。从酵母分离针对特异性结合而富集的群体的基因，并且进行测序从而评估CD19 Ig结构域的多样性和完整性。使用易错PCR和环改组(Wrenbeck等人,Nat.Methods[自然方法]13:928-930(2016))，随后是更严格的分选，使基因进化。
实例9.N-末端CD19—配体融合物
将提供对高度功能性序列空间的集中检索的组合突变文库(实例5)用于鉴定在CD19—配体融合物(其中CD19位于配体的N-末端)中具有模块性(即充当蛋白融合物的成员的能力)的CD19突变体。将组合的突变文库遗传地融合至EGFR结合纤连蛋白或HER2结合单链抗体片段的N-末端。使用双功能筛选(其中收集实现FMC63结合和靶(EGFR、HER2)结合这两者的突变体)对文库进行两次分类。在两次双重分类后，获得双重功能性CD19-配体融合物的不同群体(图13)。序列分析揭示了在指示位点处进化的全长CD19变体(图14)。
实例10.配体-C末端CD19融合物
将提供对高度功能性序列空间的集中检索的组合突变文库(实例5)用于鉴定在配体—CD19融合物(其中CD19位于配体的C-末端)中具有模块性(即充当蛋白融合的成员的能力)的CD19突变体。将组合的突变文库遗传地融合至EGFR结合纤连蛋白或HER2结合单链抗体片段的C-末端。使用双功能筛选(其中收集实现FMC63结合和靶(EGFR、HER2)结合这两者的突变体)对文库进行分类。在一次分类后，获得双重功能性配体-CD19融合物的不同群体(图15)。
实例11.N-末端CD19-配体融合物的功能
为了进一步证明CD19突变体充当融合蛋白(例如N-末端CD19-配体融合物)的成员的能力，进一步测试了在实例9中鉴定的四种CD19突变体。将具有对应于如图14所示的JRK2、JRK5、JRK14和JRK15的氨基酸取代的CD19突变体遗传地融合至EGFR结合纤连蛋白的N-末端(CD19-Fn3/EGFR；分别是构建体#227、228、229、和230；SEQ ID No 3、4、5、和6)。将这些构建体中的两个(#228和#230)转染到HEK293细胞中导致相对于融合至EGFR结合纤连蛋白的N-末端的野生型CD19(构建体#160，SEQ ID No.7)，分泌到上清液中的融合蛋白增加(图16)。针对所有四种构建体结合EGFR阳性细胞并且杀伤这些细胞的能力，对其进行分析。所有四种构建体都很好地结合并且也都杀伤细胞。在分泌水平、结合或杀伤能力方面，四种构建体之间未见显著差异(数据未显示)。
另外，测试其中CD19突变体JRK15遗传地融合至HER2结合单链抗体片段的N-末端的融合蛋白(CD19-scFv/Her2构建体#311；SEQ ID NO 8)。当与野生型CD19-scFv/Her2融合蛋白(#42，SEQ ID NO.9)相比时，用位于scFv/Her2的N-末端的CD19突变体JRK15也见到约8倍的分泌增加(图17)。
实例12.配体-C-末端CD19融合物的功能
为了进一步证明CD19突变体充当蛋白融合物(例如配体-C-末端CD19融合物)的成员的能力，进一步测试了三种CD19突变体。将CD19突变体遗传地融合至HER2结合单链抗体片段的C-末端(scFv/Her2-CD19)(分别是构建体#263、264、和265；SEQ ID No 10、11、和12)。将包含融合至HER2结合单链抗体片段的C-末端的野生型CD19 D1+2结构域的融合蛋白(构建体#40；SEQ ID NO:38)转染到无法分泌的HEK293细胞中。然而，具有C-末端CD19突变体的这三种构建体分泌良好(图18)。
纯化scFv/Her2-CD19融合蛋白(构建体263、264、和265)中的每一种，并且针对结合和杀伤Her2阳性SKOV3细胞进行滴定。图19示出通过FACS分析，对结合SKOV3细胞的三种scFv/Her2-CD19构建体进行检测。用抗His-PE和FMC63-PE抗体两者检测这些构建体。图20示出三种scFv/Her2-CD19构建体中的每一种桥接CAR19细胞导致杀伤Her2阳性SKOV3细胞的能力。
为了提供在C-末端处包括突变体CD19的融合蛋白的活性的另外的证据，将突变体CD19放置在来自抗CD20 mAb Leu16的scFv的C-末端(构建体#302，SEQ ID NO.13)。观察到该融合蛋白的良好分泌(图21)。还针对这一构建体结合并杀伤用CD20转染的293T细胞的能力测试了这一构建体。图22示出如通过FMC63-PE检测的，相对于包括位于Leu16抗-CD20scFv的N-末端的野生型CD19 D1+D2的融合蛋白(构建体#83，SEQ ID NO.14)，构建体#302与CD20结合。图23示出构建体#302桥接CAR19细胞导致杀伤CD20阳性293T细胞的能力。实际上，构建体#302展示出相对于野生型CD19 D1+D2融合蛋白(构建体#83)的增加的杀伤，这表明图22中示出的改进的结合可能会导致增加的杀伤。
这些数据进一步证明了在C-末端包括CD19突变体的融合蛋白的功能能力。
实例13.掩蔽的CD19-配体融合物的功能
该实例进一步通过评估遗传地融合至N-末端掩蔽的scFv的C-末端的CD19突变体的活性，证明了CD19突变体蛋白的功能能力。如所发表的(Desnoyers LR等人,ScienceTranslational Medicine[科学转化医学](2013))，将CD19突变体与含有可被多种蛋白酶(例如尿激酶型纤溶酶原激活质，uPA)裂解的蛋白酶底物的、来自西妥昔单抗的抗EGFRscFv的掩蔽形式的C-末端融合。首先，产生并且测试了掩蔽的西妥昔单抗scFv，以验证在不存在蛋白酶的情况下，它并不结合EGFR，但是在用蛋白酶(例如uPA)活化后，它就能结合EGFR，这完全验证了所发表的数据(未示出)。接下来，产生未掩蔽的(分别是构建体#307和#308，SEQ ID NO.15和16)和掩蔽的(分别是#309和310，SEQ ID NO.17和18)西妥昔单抗-CD19构建体。这些构建体都分泌良好，无论是掩蔽的还是未掩蔽的，如在ELISA中通过FMC63结合所检测的和通过HRP-抗His进行检测，并且示出在图24中。
为了证明掩蔽的构建体的功能性，针对掩蔽的(构建体#309)和未掩蔽的(构建体#307)西妥昔单抗-CD19构建体桥接杀伤EGFR阳性H292细胞的能力，对它们进行了测试。图25示出未掩蔽的scFv/西妥昔单抗-CD19构建体#307能够通过CART140(CAR19-T细胞)桥接杀伤EGFR阳性细胞。相反，掩蔽的scFv/西妥昔单抗-CD19构建体#309示出仅在uPA存在下才能显著杀伤。因此，这证明了具有掩蔽的抗原结合蛋白的CD19突变体C-末端融合物是稳定并且有功能的。
实例14.CD19-多配体融合物的功能
这一实例证明CD19突变体可以放置在两个其他结构域之间并且并不限于N-末端或C-末端融合。具体地，该实例证明了位于两个scFv中心的CD19突变体的活性。制成掩蔽的scFv/西妥昔单抗-CD19-scFv/Her2构建体(构建体#354，SEQ ID NO.19)从而测试这一概念。图26示出当转染时，很好地分泌构建体#354。
实例15抗体轻链-CD19融合物的功能
我们接下来评估在抗体轻链上包括突变体CD19的融合蛋白是否可以产生功能性mAb-CD19融合蛋白。在两种融合蛋白的背景下测试这一概念。对于第一融合蛋白，将突变体CD19以C-末端地融合至曲妥珠单抗抗体的轻链(轻链-CD19融合物：构建体#375，SEQ IDNO.20；重链：构建体#376，SEQ ID NO.21)。对于第二融合蛋白，将突变体CD19以C-末端地融合至利妥昔单抗利妥昔单抗抗体的轻链(轻链-CD19融合物：构建体#377，SEQ ID NO.22；重链：构建体#378，SEQ ID NO.23)。
曲妥珠单抗-CD19构建体(#375/376)容易地从转染细胞中分泌；如通过FMC63-PE和抗人Fc-FITC在FACS中检测的，其有效结合Her2阳性SKOV3细胞(图27)；并且通过CART254(CAR19 T细胞)，其有效桥接杀伤Her2阳性SKOV3细胞(图28)。提供野生型CD19-scFv/Her2构建体用于比较。以下在实例16中描述的在曲妥珠单抗抗体的重链中缺乏糖基化位点的构建体也包括在图28中。
利妥昔单抗-CD19构建体(#377/378)也容易地从转染细胞中分泌，有效结合CD20阳性HEK293细胞(图29)，并且有效桥接杀伤CD20阳性HEK293细胞(图30)。包括Leu16scFv-CD19构建体(构建体#302，SEQ ID NO.13)用于比较。Leu16scFv-CD19构建体具有约3nm的Kd，而基于利妥昔单抗的构建体(即完整的利妥昔单抗mAb)具有约16pM的Kd。
实例16.无糖基mAb-CD19融合物
产生曲妥珠单抗-CD19和利妥昔单抗-CD19构建体，其中CD19突变体遗传地融合至轻链的C-末端，并且在重链中造成N297A突变从而去除单糖基化位点。无糖基曲妥珠单抗-CD19构建体(轻链-CD19融合物：构建体#375，SEQ ID NO.20；无糖基重链：构建体#393，SEQID NO.24)展示细胞结合，所述细胞结合与野生型曲妥珠单抗-CD19构建体(轻链-CD19融合物：构建体#375，SEQ ID NO.20；重链：构建体#376，SEQ ID NO.21)的细胞结合等同(图31)。图28证明野生型和无糖基曲妥珠单抗-CD19构建体对于杀伤而言具有等同的EC50。无糖基利妥昔单抗-CD19构建体(轻链-CD19融合物：构建体#377，SEQ ID NO.22；无糖基重链：构建体#394，SEQ ID NO.25)示出相对于野生型利妥昔单抗-CD19构建体(轻链-CD19融合物：构建体#377，SEQ ID NO.22；重链：c构建体#378，SEQ ID NO.23)的改进的结合(约2倍)(图32)。将观察到的结合的增加转化为相对于野生型构建体的、通过无糖基利妥昔单抗-CD19构建体进行的细胞杀伤的增加(图33)。
实例17.具有不同CD19截短的融合蛋白
某些CD19构建体，例如构建体#42，包括略微截短的CD19 ECD(去除最后11个氨基酸)(本文中称为“D1+D2”或“D1+2”)。为了评估是否可以使用全长CD19 ECD，评估了另外的构建体。具体地，将野生型CD19-scFv/Her2(构建体#42，含有“D1+D2”CD19)的活性与NsCD19-scFv/Her2(即，CD19 ECD N末端突变体#2-曲妥珠单抗scFv；构建体#311；SEQ IDNO:8)和截短的NsCD19-scFv/Her2(即，CD19 D1+2N末端突变体#2-曲妥珠单抗scFv；构建体#340；SEQ ID NO:31)进行比较。与Her2阳性SKOV3细胞的结合基本上是相同的(数据未显示)，其中在分泌或效力方面无有差异，并且对Her2阳性SKOV3细胞的杀伤是相同的(图34)。这证明该截短在稳定的CD19突变体中是等效的。
实例18.VHH CD19融合物
产生了具有不同CD19突变体和识别Clec12A的llama VHH的融合蛋白。由下表中列出的以下克隆编号和序列描述VHH：
克隆 序列
1B1 SEQ ID NO:203
1G6 SEQ ID NO:205
1B12 SEQ ID NO:208
2C8 SEQ ID NO:211
2F5 SEQ ID NO:212
1A10 SEQ ID NO:214
2H3 SEQ ID NO:215
1H1 SEQ ID NO:216
2F3 SEQ ID NO:220
1B11 SEQ ID NO:224
2C2 SEQ ID NO:225
产生并且测试的融合蛋白包括构建体#186、289、290、291、292、293、320、321、323、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、和357(分别是SEQ ID NO:52、39、40、41、42、43、44、26、45、28、46、47、27、48、49、50、51、30、29、和53)。
针对结合U937细胞的能力，测试构建体#289、291、292、293、321、和330(它们包括在N-末端处的CD19突变体#2和在C-末端处的不同VHH)。如图35和36所示，构建体#289、291、292、和293能够以3nM与5nM之间的相似EC50结合U937细胞。如图37所示，CD19-VHH1B12/Clec12A(构建体#321，SEQ ID NO.26)和VHH1A10/Clec12A-CD19(构建体#330，SEQ IDNO.27)构建体两者均以1-3nM范围结合表达Clec12A的U937细胞。
针对在293T细胞中表达后结合抗CD19抗体FMC63的能力，测定包括在N-末端处的CD19突变体和在C-末端处的VHH的不同构建体，或包括在C-末端处的CD19突变体和在N-末端处的VHH序列的构建体。图38和39示出不同构建体的效价。针对这些构建体结合CLEC12a的能力，对其进行测定。结果示于图40和41中。
接下来，针对构建体介导通过CAR-T254细胞杀伤表达CLEC12a的U937细胞的能力，对其进行测定。简言之，在圆底96孔板的孔中，在RPMI培养基中孵育1X 104个U937细胞。对于总计25μL/孔，添加1μg/mL和20ng/mL构建体。按1:10的比率，将CAR-T254细胞添加至U937细胞中。在48小时后，将细胞旋转、裂解，并且测量荧光素酶水平。图42示出荧光素酶水平，并且图43示出不同构建体的杀伤％，这表明C末端融合物比N末端融合物更有效。对于四种C末端构建体(#327、337、338、和330)和一种N末端构建体(#321)，描绘剂量杀伤曲线。简言之，在圆底96孔板的孔中，在RPMI培养基中孵育1X 104个U937细胞。25μL/孔，从1μg/mL至1ng/mL滴定构建体。按1:10的比率，将CAR-T254细胞(CAR19 T细胞)添加至U937细胞中。在48小时后，将细胞旋转、裂解，并且测量荧光素酶水平。如图44所示，用所有构建体实现了最大U937细胞杀伤。产生EC50，如图45所示。
另外，产生并且测定了双特异性构建体。双特异性构建体包括Wiersma等人,MAbs7:321-30(2015)中描述的抗CLEC12a scFv。构建体#186包括CD19结构域1+2以及抗CLL1 VH和VL结构域(Wiersma等人所述)。产生的双特异性构建体(构建体#357)包括构建体#186的VH和VL结构域、抗CLEC12a VHH(克隆2H3)、和CD19突变体#2。针对与U937细胞的结合，测定这些构建体。简言之，将U937细胞(5x 104个)进行Fc阻断、旋转、沉淀，添加100μL的3X连续稀释的融合蛋白(以7.5μg/mL开始)，在4C下孵育30分钟，旋转，洗涤两次，向沉淀中添加抗FMC63-PE并在4C下孵育30分钟。然后将细胞旋转，洗涤两次，固定，并且通过FACS进行分析。如图46A和46B所示，构建体#357的结合EC50小于构建体#330(对照，其EC50小于构建体#186的EC50)。还针对这些构建体介导通过CAR-T254细胞杀伤表达CLEC12a的U937细胞的能力，对其进行测定。简言之，在圆底96孔板的孔中，在RPMI培养基中孵育1X 104个U937细胞。按1:10的比率，将1X 105个CAR-T254细胞添加至U937细胞中。使用100μL的3X连续稀释的构建体(起始浓度是1μg/mL，作为最终物)。48小时孵育后，测量荧光素酶水平。如图47A和47B所示，构建体#357的杀伤EC50远远小于构建体#186或#330。
最后，产生慢病毒载体(构建体#221)，其编码(i)CD19 CAR，和(ii)构建体#186。此类慢病毒载体用于产生表达CD19 CAR并且分泌构建体#186融合蛋白的CAR T细胞。此类T细胞称为“CAR221”细胞。还产生了构建体#142、173、和174，作为对照。如图48所示，来自活化CAR221细胞的构建体#221的表达是较低的。(请注意，“LG142”、“LG221”、“LG173”、和“LG174”分别是相同构建体#142、221、173和174，但由供应商制成)。图49展示通过构建体#221和LG221杀伤U937和NALM6。
实例19 CD19表位
将导致FMC63和3B10结合的损失的鉴定(使用以上描述的系统诱变文库)的氨基酸位置映射到CD19的结构上(Teplyakov等人,Proteins[蛋白质]86:495-500(2018))。这两个mAb的表位重叠，并且远离接近质膜的N-末端和C-末端。虽然FMC63表位不是线性的，但是3B10表位与CD19中的线形肽序列匹配，这与3B10表位具有温度抗性是一致的(实例2中所述；图3)。当经由酵母展示表达该肽时，mAb 3B10很好地结合。令人惊讶地，mAb 3B10与酵母上表达的CD19 ECD结合较差。参见图50。
等同物
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同物。本发明的范围不旨在限于以上说明书，而是如在以下权利要求书中所陈述的：
序列表
SEQ ID NO:1
CCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAG
SEQ ID NO:2
PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK
构建体氨基酸序列的列表
SEQ ID NO:3
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SEQ ID NO:4
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SEQ ID NO:5
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SEQ ID NO:6
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SEQ ID NO:7
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SEQ ID NO:8
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SEQ ID NO:9
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SEQ ID NO:10
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SEQ ID NO:11
MEFGLSWVFLVALFRGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPEEPLVVKVEEGDTAALWCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKYSFGGPGLGIHMRPDAISVVISNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSRDLTVAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPAREMWVTGTRLFLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPSRHHHHHH
SEQ ID NO:12
MEFGLSWVFLVALFRGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPEEPLVVKVEEGDTAALWCLKGTSDGPTEQVTWSRESPLKPFLKLSLGLPGGGGHVRPNAVSLVIRNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSRDLTVAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVTETGLLLPRATAQDAGKWYCHRGNLTMSFHLEITARPSRHHHHHH
SEQ ID NO:13
MMEFGLSWVFLVALFRGVQCQVKLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGQGTTVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPTILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKRAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPEEPLVVKVEEGDTAALWCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKYSLGVPGLGVHVRPDAISVVIRNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSRDLTVAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMGTSLMLPRATAQDAGKWYCHRGNLTMSFHLEITARPSRHHHHHH
SEQ ID NO:14
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SEQ ID NO:15
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SEQ ID NO:16
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SEQ ID NO:17
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SEQ ID NO:18
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SEQ ID NO:19
MDFGLIFFIVALLKGVQCQGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPEEPLVVKVEEGDTAALWCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKYSLGVPGLGVHVRPDAISVVIRNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSRDLTVAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMGTSLMLPRATAQDAGKWYCHRGNLTMSFHLEITARPSRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTHHHHHH
SEQ ID NO:20
MEFGLSWVFLVALFRGVQCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPEEPLVVKVEEGDTAALWCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKYSLGVPGLGVHVRPDAISVVIRNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSRDLTVAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMGTSLMLPRATAQDAGKWYCHRGNLTMSFHLEITARPSRHHHHHH
SEQ ID NO:21
MEFGLSWVFLVALFRGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:22
MEFGLSWVFLVALFRGVQCQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPEEPLVVKVEEGDTAALWCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKYSLGVPGLGVHVRPDAISVVIRNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSRDLTVAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMGTSLMLPRATAQDAGKWYCHRGNLTMSFHLEITARPSRHHHHHH
SEQ ID NO:23
MEFGLSWVFLVALFRGVQCQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:24
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SEQ ID NO:25
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SEQ ID NO:26
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SEQ ID NO:27
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SEQ ID NO:28
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SEQ ID NO:29
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SEQ ID NO:30
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SEQ ID NO:31
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SEQ ID NO:32
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SEQ ID NO:33
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SEQ ID NO:34
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SEQ ID NO:35
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SEQ ID NO:36
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SEQ ID NO:37
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SEQ ID NO:38
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SEQ ID NO:39
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SEQ ID NO:40
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SEQ ID NO:41
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SEQ ID NO:42
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SEQ ID NO:43
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SEQ ID NO:44
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SEQ ID NO:45
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SEQ ID NO:46
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SEQ ID NO:47
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SEQ ID NO:48
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SEQ ID NO:49
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SEQ ID NO:50
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SEQ ID NO:51
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SEQ ID NO:52
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SEQ ID NO:53
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SEQ ID NO:54
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SEQ ID NO:55
MRLLVLLWGCLLLPGYEADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDYKDDDDKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTSRHHHHHH
SEQ ID NO:56
MRLLVLLWGCLLLPGYEADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDYKDDDDKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGQVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVETKRTHHHHHH
SEQ ID NO:57
MRLLVLLWGCLLLPGYEADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDYKDDDDKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMAQVKLQESGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPTILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKRAAAHHHHHH
构建体核苷酸序列的列表
SEQ ID NO:58
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACGACGCCTGGCTGAGGTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCAGCCAGGTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGTACAGCCTGGGCGTGCCCGGCCTGGGCGTGCACATCAGGCCCCTGGCCATCGGCCTGGTGATCCCCAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACCATGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGAGATGATCGTGGACGAGACCGGCCTGCTGCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTACTACTGCCACAGGGGCAACAGGACCATCAGCTACCACCTGGAGATCACCGCCAGGCCCGTGAGCGCCCACACCCCCCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTGTGAGCGACGTGCCCAGGGACCTGGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTTCGACTACGCCGTGACCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCGGCTGGATCAGCACCGCCACCATCAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTGACCGACAACAGCCACTGGCCCTTCAGGAGCACCCCCATCAGCACCAACTACAGGACCGAGATCGACAAGCCCCCCCAGCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:59
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACACCGCCGTGCTGCCCTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCCAGCAGCTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGTACAGCCTGGGCGTGCCCGGCCTGGGCGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTGATCAGGAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACCATGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGAGATGATCGTGGACGAGACCGGCCTGCTGCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTGGTACTGCAGCAGGGGCAACGTGACCACCAGCTACCACCTGGAGATCACCGCCAGGCCCGTGAAGGCCCACAGCGACCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTGTGAGCGACGTGCCCAGGGACCTGGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTTCGACTACGCCGTGACCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCGGCTGGATCAGCACCGCCACCATCAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTGACCGACAACAGCCACTGGCCCTTCAGGAGCACCCCCATCAGCACCAACTACAGGACCGAGATCGACAAGCCCCCCCAGCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:60
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACACCGCCGCCCTGTGGTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCCAGCAGCTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGCTGAGCCTGGGCCTGCCCGGCATGGGCGTGCACATGAGGCCCGGCGCCGTGAGCGCCGTGATCAGCAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCAGGGACATGACCGTGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGACATGTGGGTGATGGGCACCAGCCTGATCCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTACTACTGCCACAGGGGCAACCTGACCATGAGCTTCCACCTGGAGGTGGTGGCCAGGCCCGTGAAGGCCCACAGCGACCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTGTGAGCGACGTGCCCAGGGACCTGGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTTCGACTACGCCGTGACCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCGGCTGGATCAGCACCGCCACCATCAGCGGCCTGAAGCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTGACCGACAACAGCCACTGGCCCTTCAGGAGCACCCCCATCAGCACCAACTACAGGACCGAGATCGACAAGCCCCCCCAGCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:61
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACACCGCCGCCCTGTGGTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCCAGCAGCTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGTACAGCCTGGGCGTGCCCGGCATGGGCGTGCACGTGAGGCCCAACGCCGTGAGCCTGGTGATCAGCAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCAGGGACATGACCGTGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGACATGTGGGTGATGGAGACCGGCCTGGTGCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTGGTACTGCCACAGGGGCAACGTGACCACCAGCTACCACCTGGAGATCACCGCCAGGCCCGTGAGCGCCCACACCCCCCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTGTGAGCGACGTGCCCAGGGACCTGGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTTCGACTACGCCGTGACCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCGGCTGGATCAGCACCGCCACCATCAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTGACCGACAACAGCCACTGGCCCTTCAGGAGCACCCCCATCAGCACCAACTACAGGACCGAGATCGACAAGCCCCCCCAGCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:62
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTGTGAGCGACGTGCCCAGGGACCTGGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTTCGACTACGCCGTGACCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCGGCTGGATCAGCACCGCCACCATCAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTGACCGACAACAGCCACTGGCCCTTCAGGAGCACCCCCATCAGCACCAACTACAGGACCGAGATCGACAAGCCCCCCCAGCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:63
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACACCGCCGTGCTGCCCTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCCAGCAGCTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGTACAGCCTGGGCGTGCCCGGCCTGGGCGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTGATCAGGAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACCATGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGAGATGATCGTGGACGAGACCGGCCTGCTGCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTGGTACTGCAGCAGGGGCAACGTGACCACCAGCTACCACCTGGAGATCACCGCCAGGCCCGTGAAGGCCCACAGCGACCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCGGGGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTGCTTCTCAAGATGTTAATACTGCTGTTGCTTGGTATCAACAAAAACCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATTCTGCTTCTTTTCTTTATTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTCGTTCTGGTACTGATTTTACTCTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATTTTGCTACTTATTATTGTCAACAACATTATACTACTCCTCCTACTTTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:64
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGGGGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGTGGAGGTGGGTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCGGGGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTGCTTCTCAAGATGTTAATACTGCTGTTGCTTGGTATCAACAAAAACCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATTCTGCTTCTTTTCTTTATTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTCGTTCTGGTACTGATTTTACTCTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATTTTGCTACTTATTATTGTCAACAACATTATACTACTCCTCCTACTTTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGTCTAGAGGGCCCCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:65
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCGGGGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTGCTTCTCAAGATGTTAATACTGCTGTTGCTTGGTATCAACAAAAACCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATTCTGCTTCTTTTCTTTATTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTCGTTCTGGTACTGATTTTACTCTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATTTTGCTACTTATTATTGTCAACAACATTATACTACTCCTCCTACTTTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAATACAGCCTGGGGGTGCCAGGCCTGGGAGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGGCACGAGCCTGATGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:66
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCGGGGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTGCTTCTCAAGATGTTAATACTGCTGTTGCTTGGTATCAACAAAAACCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATTCTGCTTCTTTTCTTTATTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTCGTTCTGGTACTGATTTTACTCTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATTTTGCTACTTATTATTGTCAACAACATTATACTACTCCTCCTACTTTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAATACAGCTTTGGGGGCCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTTATCAGCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGAGATGTGGGTAACCGGCACGCGGCTGTTTTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTACTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:67
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCGGGGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTGCTTCTCAAGATGTTAATACTGCTGTTGCTTGGTATCAACAAAAACCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATTCTGCTTCTTTTCTTTATTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTCGTTCTGGTACTGATTTTACTCTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATTTTGCTACTTATTATTGTCAACAACATTATACTACTCCTCCTACTTTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTGAGCAGGTTACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTCCCAGGCGGCGGAGGTCACGTGAGGCCCAACGCCGTGAGCCTCGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAACCGAGACGGGTCTGCTCTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:68
ATGATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTCAAACTACAGGAGTCAGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGACTATTACTGTGCAAGATCTAATTATTACGGTAGTAGCTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAACAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGGACTGGTACCAGAAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTTTTAATCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCCGCCGCTGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAATACAGCCTGGGGGTGCCAGGCCTGGGAGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGGCACGAGCCTGATGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:69
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTATGGCCCAGGTCAAACTACAGGAGTCAGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGACTATTACTGTGCAAGATCTAATTATTACGGTAGTAGCTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAACAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGGACTGGTACCAGAAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTTTTAATCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCCGCCGCTCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:70
ATGGACTTCGGCCTGATCTTCTTCATCGTGGCCCTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCCGGCGAGAGGGTGAGCTTCAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTACCAGCAGAGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGGCTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGGAGGAGGTGGGTCCGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAATACAGCCTGGGGGTGCCAGGCCTGGGAGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGGCACGAGCCTGATGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:71
ATGGACTTCGGCCTGATCTTCTTCATCGTGGCCCTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCCGGCGAGAGGGTGAGCTTCAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTACCAGCAGAGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGGCTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGGAGGAGGTGGGTCCGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTGAGCAGGTTACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTCCCAGGCGGCGGAGGTCACGTGAGGCCCAACGCCGTGAGCCTCGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAACCGAGACGGGTCTGCTCTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:72
ATGGACTTCGGCCTGATCTTCTTCATCGTGGCCCTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGGCCAGAGCGGCCAGTGCATCAGCCCCAGGGGCTGCCCCGACGGCCCCTACGTGATGTACGGCAGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCCTGAGCGGCAGGAGCGACAACCACGGCAGCAGCGGCACCCAGATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCCGGCGAGAGGGTGAGCTTCAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTACCAGCAGAGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGGCTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAATACAGCCTGGGGGTGCCAGGCCTGGGAGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGGCACGAGCCTGATGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:73
ATGGACTTCGGCCTGATCTTCTTCATCGTGGCCCTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGGCCAGAGCGGCCAGTGCATCAGCCCCAGGGGCTGCCCCGACGGCCCCTACGTGATGTACGGCAGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCCTGAGCGGCAGGAGCGACAACCACGGCAGCAGCGGCACCCAGATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCCGGCGAGAGGGTGAGCTTCAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTACCAGCAGAGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGGCTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTGAGCAGGTTACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTCCCAGGCGGCGGAGGTCACGTGAGGCCCAACGCCGTGAGCCTCGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAACCGAGACGGGTCTGCTCTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:74
ATGGACTTCGGCCTGATCTTCTTCATCGTGGCCCTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCCAGGGCCAGAGCGGCCAGTGCATCAGCCCCAGGGGCTGCCCCGACGGCCCCTACGTGATGTACGGCAGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCCTGAGCGGCAGGAGCGACAACCACGGCAGCAGCGGCACCCAGATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCCGGCGAGAGGGTGAGCTTCAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTACCAGCAGAGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCCAGCCAGAGCCTGAGCATCACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCCTTCACCAGCAGGCTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAATACAGCCTGGGGGTGCCAGGCCTGGGAGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGGCACGAGCCTGATGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGAGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCGGGGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTGCTTCTCAAGATGTTAATACTGCTGTTGCTTGGTATCAACAAAAACCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATTCTGCTTCTTTTCTTTATTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTCGTTCTGGTACTGATTTTACTCTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATTTTGCTACTTATTATTGTCAACAACATTATACTACTCCTCCTACTTTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:75
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGACGTGAACACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTCCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCAGGAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACCCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGCGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATACCGCTGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAATACAGCCTGGGGGTGCCAGGCCTGGGAGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTTATCCGGAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCGGGACCTCACCGTTGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGGCACGAGCCTGATGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTGGTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCATCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:76
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGTCCTAGCGTTTTTCCATTGGCTCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGAGACGAGTTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
SEQ ID NO:77
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SEQ ID NO:78
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SEQ ID NO:79
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SEQ ID NO:80
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SEQ ID NO:81
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SEQ ID NO:82
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SEQ ID NO:83
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SEQ ID NO:84
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SEQ ID NO:85
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SEQ ID NO:86
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SEQ ID NO:87
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACACCGCCGTGCTGCCCTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCCAGCAGCTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGTACAGCCTGGGCGTGCCCGGCCTGGGCGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTGATCAGGAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACCATGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGAGATGATCGTGGACGAGACCGGCCTGCTGCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTGGTACTGCAGCAGGGGCAACGTGACCACCAGCTACCACCTGGAGATCACCGCCAGGCCCGTGAAGGCCCACAGCGACCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTCAGGTCAAACTACAGGAGTCAGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGACTATTACTGTGCAAGATCTAATTATTACGGTAGTAGCTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAACAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGGACTGGTACCAGAAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTTTTAATCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCCGCCGCTCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:88
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SEQ ID NO:89
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SEQ ID NO:90
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SEQ ID NO:91
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SEQ ID NO:92
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SEQ ID NO:93
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SEQ ID NO:94
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SEQ ID NO:95
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SEQ ID NO:96
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SEQ ID NO:97
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SEQ ID NO:98
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SEQ ID NO:99
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACACCGCCGTGCTGCCCTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCCAGCAGCTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGTACAGCCTGGGCGTGCCCGGCCTGGGCGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTGATCAGGAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACCATGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGAGATGATCGTGGACGAGACCGGCCTGCTGCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTGGTACTGCAGCAGGGGCAACGTGACCACCAGCTACCACCTGGAGATCACCGCCAGGCCCGTGAAGGCCCACAGCGACCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCGCAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCGACCGCAGTATCAATGTCATGAACTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCGATTACTAGTGGTGGTACCACAAATTATGCACAGTCCGTGAAGGGCCGAGTCACCATCTCCAGGGACAGCGCCAAGAACACGGTGTATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTTCTGTAAAGCAGATACGCGTTGGGGTGGGATGTACTGGGGCCCGGGGACCCAGGTCACCGTTTCCTCAACTAGTGGCCCGGGAGGCCAAGGCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGGCGCACACCATCACCACCATCATGGCGCATCT
SEQ ID NO:100
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SEQ ID NO:101
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SEQ ID NO:102
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SEQ ID NO:103
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SEQ ID NO:104
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SEQ ID NO:105
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SEQ ID NO:106
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAGCCCCTGGTGGTGAAGGTGGAGGAGGGCGACACCGCCGTGCTGCCCTGCCTGAAGGGCACCAGCGACGGCCCCACCCAGCAGCTGACCTGGAGCAGGGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGTACAGCCTGGGCGTGCCCGGCCTGGGCGTGCACGTGAGGCCCGACGCCATCAGCGTGGTGATCAGGAACGTGAGCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGCCAGCCCGGCCCCCCCAGCGAGAAGGCCTGGCAGCCCGGCTGGACCGTGAACGTGGAGGGCAGCGGCGAGCTGTTCAGGTGGAACGTGAGCGACCTGGGCGGCCTGGGCTGCGGCCTGAAGAACAGGAGCAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCAAGCTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACAGGCCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCCCCCTGCCTGCCCCCCAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACCATGGCCCCCGGCAGCACCCTGTGGCTGAGCTGCGGCGTGCCCCCCGACAGCGTGAGCAGGGGCCCCCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCCAAGGGCCCCAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAGCTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGGGAGATGATCGTGGACGAGACCGGCCTGCTGCTGCCCAGGGCCACCGCCCAGGACGCCGGCAAGTGGTACTGCAGCAGGGGCAACGTGACCACCAGCTACCACCTGGAGATCACCGCCAGGCCCGTGAAGGCCCACAGCGACCTGAGGACCGGCGGCTGGAAGGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGAAGCATCTTCGCTATTAATGAAATCAATCTTATGGGGTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTTGTGCTAGTGATGGCAACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCGAGAAAACGGTGTATCTGCAGATGAACAACCTGAAACCTGACGACACAGCCGTCTATTACTGTGATGCGAATTCGAGGGGGAATTATTATTCGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAACTAGTGGCCCGGGAGGCCAAGGCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGGCGCACACCATCACCACCATCATGGCGCATCT
SEQ ID NO:107
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SEQ ID NO:108
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SEQ ID NO:109
ATGAGGCTTCTGGTGCTTCTTTGGGGTTGCTTGCTGTTGCCCGGTTACGAAGCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAAGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGAGGCGGCGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGGTCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTACAACTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTCCGCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCCCTGCCCCCTCGCCGCGCGAAACGCAGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCCGCGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCTGGCGGCGGCGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGTGGCGGGTCTGGTGGCGGCGGGTCTGACATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCGTGGTGAGCGGCGGCAGCATCAGCAGCAGCAACTGGTGGAGCTGGGTGAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCACAGCGGCAGCCCCGACTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACAAGAGCAGGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGTGAGCACCGGCGGCTTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGAGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCTACAGCACCCCCCCCACCTTCGGCCCCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGACCCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO:110
ATGAGGCTTCTGGTGCTTCTTTGGGGTTGCTTGCTGTTGCCCGGTTACGAAGCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAAGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGAGGCGGCGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGGTCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTACAACTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTCCGCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCCCTGCCCCCTCGCCGCGCGAAACGCAGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCCGCGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCTGGCGGCGGCGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGTGGCGGGTCTGGTGGCGGCGGGTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTTGTTCAACCTGGTGGTTCTCTTCGTCTTTCTTGTGCTGCTTCTGGTTTTAATATTAAAGATACTTATATTCATTGGGTTCGTCAAGCTCCTGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTATCCTACTAATGGTTATACTCGTTATGCTGATTCTGTTAAAGGTCGTTTTACTATTTCTGCTGATACTTCTAAAAATACTGCTTATCTTCAAATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTTCTCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCGGGGGCGGCGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGCGGCGGGTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTGCTTCTCAAGATGTTAATACTGCTGTTGCTTGGTATCAACAAAAACCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATTCTGCTTCTTTTCTTTATTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTCGTTCTGGTACTGATTTTACTCTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATTTTGCTACTTATTATTGTCAACAACATTATACTACTCCTCCTACTTTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGTCTAGACATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:111
ATGAGGCTTCTGGTGCTTCTTTGGGGTTGCTTGCTGTTGCCCGGTTACGAAGCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAAGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGAGGCGGCGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGGTCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTACAACTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTCCGCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCCCTGCCCCCTCGCCGCGCGAAACGCAGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCCGCGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTGAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCAGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACCCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGCCATCGGCGGCAGCGGCGGCAGCCTGCCCTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTACTGGCCCATGGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATGTACGACGCCAGCATCAGGGCCACCGGCATCCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGGCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACCAGAGCTGGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGACCAAGAGGACCCATCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:112
ATGAGGCTTCTGGTGCTTCTTTGGGGTTGCTTGCTGTTGCCCGGTTACGAAGCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAAGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGAGGCGGCGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGGTCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTACAACTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGACTACAAAGACGATGACGACAAGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTCCGCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGAGGGAAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCTATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGGAGGAGGTGGGTCTGGAGGTGGAGGATCTGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCTATGGCCCAGGTCAAACTACAGGAGTCAGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGACTATTACTGTGCAAGATCTAATTATTACGGTAGTAGCTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAACAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGGACTGGTACCAGAAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTTTTAATCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCCGCCGCTCATCATCACCATCACCAT
VHH克隆序列
SEQ ID NO:203(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))
Figure BDA0002622936260001571
SEQ ID NO:204(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))
Figure BDA0002622936260001581
SEQ ID NO:205(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))
Figure BDA0002622936260001582
SEQ ID NO:206(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001583
SEQ ID NO:207(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001584
SEQ ID NO:208(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001585
Figure BDA0002622936260001591
SEQ ID NO:209(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001592
SEQ ID NO:210(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001593
SEQ ID NO:211(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001594
SEQ ID NO:212(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001595
SEQ ID NO:213(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001601
SEQ ID NO:214(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001602
SEQ ID NO:215(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001603
SEQ ID NO:216(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001604
SEQ ID NO:217(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001605
Figure BDA0002622936260001611
SEQ ID NO:218(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001612
SEQ ID NO:219(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001613
SEQ ID NO:220(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001614
SEQ ID NO:221(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001615
SEQ ID NO:222(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001621
SEQ ID NO:223(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001622
SEQ ID NO:224(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001623
SEQ ID NO:225(下划线依次表示CDR1、CDR2、CDR3；在C-末端处的粗体斜体表示(i)9个氨基酸(TSGPGGQGA)的接头，(ii)myc-标签(EQKLISEEDL)，(iii)2个氨基酸(GA)的接头，(iv)六组氨酸标签(HHHHHH)，以及(v)另外的3个氨基酸(GAS))：
Figure BDA0002622936260001624

Claims (48)

1.一种CD19变体，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少一个氨基酸取代，其中所述CD19变体比包含SEQ ID NO:2的序列的多肽更稳定。
2.如权利要求1所述的CD19变体，其中所述CD19变体具有比包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽高至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、400％、或500％的测量的稳定性水平。
3.如权利要求1或2所述的CD19变体，其中相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述CD19变体对蛋白酶裂解更具有抗性。
4.如权利要求1或2所述的CD19变体，其中相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述CD19变体是更热稳定的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的CD19变体，其中所述CD19变体包含表1A、表1B、表2A、表2B、表3、表6、图8B、图11、图12B、图14A、图14B、图14C、图14D、或图15B中列出的SEQ IDNO:2的一个或多个氨基酸取代。
6.如权利要求1-4中任一项所述的CD19变体，其中所述CD19变体包含在以下组的SEQID NO:2的氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸取代：5/7/9；14/16/18；29/31；29/31/33；35/37/39；45/47/49；52/54/56；59/61/63；62/64/66；76/78/80；86/88/90；167/169/171；175/177/179；193/195/197；206/208/210；207/209/211；219/221/223；240/243；224/226/228；247/249/251；253/255/256；255/256；或261/262/264/265。
7.如权利要求6所述的CD19变体，其中所述氨基酸取代包含示于表1B、表2B、表3、表6、图8B、图11、图14A、图14B、图14C、图14D、或图15B中的取代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的CD19变体，其中所述CD19变体结合抗CD19抗体。
9.如权利要求1-7中任一项所述的CD19变体，其中所述CD19变体结合肿瘤抗原。
10.如权利要求9所述的CD19变体，其中所述肿瘤抗原是MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、CEA、p53、Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA、人类乳头瘤病毒(HPV)抗原E6或E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、erbB、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、MUC16、IL13Rα2、FRα、VEGFR2、Lewis Y、FAP、EphA2、CEACAM5、EGFR、CA6、CA9、GPNMB、EGP1、FOLR1、内皮受体、STEAP1、SLC44A4、结合素-4、AGS-16、胍基环化酶C、MUC-1、CFC1B、整联蛋白α3链(a3b1的链，即层粘连蛋白受体链)、TPS、CD19、CD20、CD22、CD30、CD72、CD180、CD171(L1CAM)、CD123、CD133、CD138、CD37、CD70、CD79a、CD79b、CD56、CD74、CD166、CD71、CLL-1/CLEC12A、ROR1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSCA、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、BCMA、GD-2、MY-ESO-1或MAGE A3。
11.一种融合蛋白，其包含(a)结合抗原的抗体或支架多肽、或其抗原结合片段，和(b)如权利要求2-8中任一项所述的CD19变体。
12.如权利要求11所述的融合蛋白，其中所述抗原是与自身免疫病症相关联的抗原。
13.如权利要求11所述的融合蛋白，其中所述抗原是感染因子抗原。
14.如权利要求11-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或支架多肽、或其抗原结合片段包含scFv或VHH或III型纤连蛋白结构域。
15.如权利要求11-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述CD19变体融合至片段抗体的轻链的C-末端或N-末端。
16.如权利要求11-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述CD19变体融合至片段抗体的重链的C-末端或N-末端。
17.如权利要求11-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述CD19变体融合至片段抗体的轻链的C-末端。
18.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列、或其片段。
19.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个。
20.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS。
21.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。
22.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分(例如CLL-1结合部分)，所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。
23.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个。
24.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS。
25.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS中的一个或多个，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。
26.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含与SEQ ID NO:203-225中任一项的氨基酸序列的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，其中所述部分缺乏在SEQ ID NO:203-225每一项中所示的全部C-末端氨基酸TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS，并且其中所述部分缺乏一个或多个(例如1、2、3、4、5、或更多)另外的氨基酸。
27.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含在SEQ ID NO:203-225任一项中所示的至少一个CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)。
28.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含与SEQ ID NO:203-225任一项中所示的CDR(例如CDR1、CDR2、和/或CDR3)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的至少一个CDR。
29.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1-13任一项中的CDR1、CDR2、和/或CDR3。
30.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1-13任一项中的(i)CDR1和CDR2；(ii)CDR2和CDR3；(iii)CDR1和CDR3；或(iv)CDR1、CDR2、和CDR3。
31.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述VHH包含表5A和/或表5B中所示的组1的CDR1、CDR2、和CDR3；组2的CDR1、CDR2、和CDR3；组3的CDR1、CDR2、和CDR3；组4的CDR1、CDR2、和CDR3；组5的CDR1、CDR2、和CDR3；组6的CDR1、CDR2、和CDR3；组7的CDR1、CDR2、和CDR3；组8的CDR1、CDR2、和CDR3；组9的CDR1、CDR2、和CDR3；组10的CDR1、CDR2、和CDR3；或组13的CDR1、CDR2、和CDR3。
32.一种核酸，其编码如权利要求11-31中任一项所述的融合蛋白。
33.一种细胞，其包含如权利要求32所述的核酸。
34.一种腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、或嵌合AAV/噬菌体(AAVP)载体，所述载体包含如权利要求32所述的核酸。
35.一种溶瘤病毒载体，其包含如权利要求32所述的核酸。
36.如权利要求35所述的溶瘤病毒载体，其中所述溶瘤病毒载体是自主性细小病毒载体、粘液瘤病毒载体、副粘病毒载体、呼肠孤病毒载体、小核糖核酸病毒载体、牛痘病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、或水疱性口炎病毒载体。
37.一种细胞，其包含如权利要求34-36中任一项所述的载体。
38.如权利要求37所述的细胞，其中所述细胞是肿瘤细胞。
39.一种慢病毒载体或逆转录病毒载体，其包含如权利要求32所述的核酸。
40.如权利要求39所述的慢病毒载体或逆转录病毒载体，其进一步包含编码CAR的核酸。
41.一种细胞，其包含如权利要求39或40所述的慢病毒载体或逆转录病毒载体。
42.如权利要求41所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
43.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求11-31中任一项所述的融合蛋白，或如权利要求41或42所述的细胞，或如权利要求34-36中任一项所述的载体。
44.如权利要求43所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用抗体、抗体药物缀合物、或CAR-T细胞，其中所述抗体、抗体药物缀合物、或CAR-T细胞结合所述CD19变体。
45.一种鉴定稳定的CD19变体的方法，所述方法包括：
a)获得多种CD19多肽，每种CD19多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代；
b)确定所述多种CD19多肽是否结合抗CD19抗体或其片段；
c)确定相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述多种CD19多肽是否对蛋白酶裂解更具有抗性；和/或
d)确定相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，所述多种CD19多肽是否是更热稳定的；
其中如果所述多肽(i)结合抗CD19抗体或其片段，(ii)相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，对蛋白酶裂解更具有抗性，和/或(iii)相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，是更热稳定的，则所述CD19多肽是稳定的CD19变体。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述抗CD19抗体是FMC63或4G7。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中所述多种CD19多肽包含在SEQ ID NO:2的位置2、3、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、28、29、30、31、32、33、34、38、39、45、47、49、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、66、68、70、72、84、90、93、94、99、100、105、108、111、113、114、115、122、123、124、125、127、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、145、146、148、149、154、167、169、171、185、189、193、194、196、198、202、204、206、207、209、211、212、213、215、216、217、219、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、232、235、240、243、247、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、264、265、269、或271处的一个或多个氨基酸取代。
48.如权利要求45或46所述的方法，其中所述多种CD19多肽包含在以下组的SEQ IDNO:2的氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸取代：5/7/9；14/16/18；29/31；29/31/33；35/37/39；45/47/49；52/54/56；59/61/63；62/64/66；76/78/80；86/88/90；167/169/171；175/177/179；193/195/197；206/208/210；207/209/211；219/221/223；240/243；224/226/228；247/249/251；253/255/256；255/256；或261/262/264/265。
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