KR20220003045A - 암 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

암 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220003045A
KR20220003045A KR1020217038771A KR20217038771A KR20220003045A KR 20220003045 A KR20220003045 A KR 20220003045A KR 1020217038771 A KR1020217038771 A KR 1020217038771A KR 20217038771 A KR20217038771 A KR 20217038771A KR 20220003045 A KR20220003045 A KR 20220003045A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
cell
fusion protein
cdr1
cdr2
Prior art date
Application number
KR1020217038771A
Other languages
English (en)
Inventor
로이 롭
폴 레너트
Original Assignee
알레타 바이오쎄라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알레타 바이오쎄라퓨틱스, 인크. filed Critical 알레타 바이오쎄라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20220003045A publication Critical patent/KR20220003045A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001112—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/29—Multispecific CARs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

조성물, 예를 들어, 세포성 치료제 및/또는 단백질 치료제를 포함하는 조성물과, 암의 치료를 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법이 기재된다.

Description

암 치료를 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 임시출원 제62/839,376호에 대해 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 내용은 본원에서 전문이 참조로서 포함된다.
적응 세포 치료(ACT)는 세포를 공여자로부터 채취하고, 이를 시험관 내에서배양하고/거나 조작한 후, 질병의 치료를 위해 환자에게 투여하는 치료 방법이다. 몇몇 부류의 장애를 치료하려는 시도에서, 다양한 세포 유형들이 ACT에 사용되어 왔다. 암의 치료를 위해, ACT는 일반적으로 림프구, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 전달에 관여한다. 이러한 CAR T 세포의 사용은 CAR T 세포가 결합할 수 있는 종양 세포 상의 항원을 식별하는 것에 관여하나, 종양의 이질성(heterogeneity)으로 인해 항원의 식별이 어려워질 수 있다. 따라서, 적응 세포 치료를 사용하는 개선된 암 치료 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 암 치료 및/또는 면역 반응의 개시 또는 조작에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 관심 대상 유전자에 작용가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 항시성 발현 제작물을 포함하는 세포성 치료제(예를 들어, 면역 세포)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 (i) 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체, 및 (ii) 관심 대상 유전자에 작용가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유도성 발현 제작물을 포함하는 세포성 치료제(예를 들어, 면역 세포)를 제공한다. 다른 것들 중에서도, 본 발명은 본원에 기재된 세포성 치료제와 하나 이상의 추가적인 치료제(예를 들어, 하나 이상의 추가적인 세포성 치료제(예를 들어, 자가 유래 CAR-T 세포, 동종이계 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 자가 유래 NK 세포, 감마 델타 T 세포, IPSC-유래 세포, 골수 세포 또는 다른 적합한 세포성 치료 세포 유형), 항체-약물 접합물, 항체, 및/또는 본원에 기재된 폴리펩티드)의 조합이, 유익한 면역 반응, 예를 들어 세포성 반응(예를 들어, T-세포 활성화)의 유도를 개선시킬 수 있다는 인식을 포괄한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로써, 대상체에게 본원에 기재된 세포성 치료제 및/또는 본원에 기재된 단백질 치료제을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 하나 이상의 추가적인 치료제(예를 들어, 제2 세포성 치료제(예를 들어, 자가 유래 CAR-T 세포, 동종이계 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 자가 유래 NK 세포, 감마 델타 T 세포, IPSC-유래 세포, 골수 세포 또는 다른 적합한 세포성 치료 세포 유형), 항체-약물 접합물, 항체, 및/또는 본원에 기재된 폴리펩티드)의 투여를 포함한다.
본 발명의 다른 특징, 목적, 및 장점들은 이하의 상세한 설명에 명백히 나타나 있다. 그러나, 본 발명의 구현예를 나타낼 때, 상세한 설명은 예시의 방식으로 제한없이 제공되어 있다고 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 볼 때 당업계의 숙련자들에게 자명할 것이다.
도면의 그림은 단지 예시만을 목적으로 하며, 제한되지 않는다.
도 1은 예시적인 세포성 치료제를 나타내는 개략도이다.
도 2는 사멸을 유도하는 신호전달 도메인을 포함하지 않고, 유전자 전사를 유도하는데 충분한 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 발현하며, 또한 CD19에 결합하는 유도성 scFv-CD19 융합 단백질 및 유도성 CAR(좌측) 또는 항시적으로 발현되는 CAR(우측)을 암호화하기도 하는 예시적인 "자체 증폭" 세포성 치료제를 나타내는 개략도이다.
도 3은 다중-돌연변이체 라이브러리로부터의 CD19 변이체의 서열을 나타낸다. 다수의 변이체들에 대해, 다양한 위치에서의 아미노산이 나타나 있다. 디자인된 집단으로부터 분류된 집단까지 빈도의 상대적 변화는 아래의 표에 나타나 있다.
도 4a는 결합 리간드를 생성하기 위한 다양성을 가질 잠재적 부위를 강조한 CD19의 세포외 도메인의 리본 다이어그램이다. 오렌지색: Ig 도메인 1의 루프; 청색: Ig 도메인 2의 루프; 적색: Ig 도메인 2의 시트. 도 4b는 예시적인 변이체 디자인의 표를 나타낸다.
도 5a는 예시적인 CD19 변이체를 나타낸다. 다수의 클론들에서, 다양한 위치에서의 아미노산이 나타나 있다. 디자인된 집단으로부터 분류된 집단까지 빈도의 상대적 변화는 아래의 표에 나타나 있다.
도 5b는 예시적인 CD19 변이체를 나타낸다. 다수의 클론들에서, 다양한 위치에서의 아미노산이 나타나 있다. 디자인된 집단으로부터 분류된 집단까지 빈도의 상대적 변화는 아래의 표에 나타나 있다.
도 5c는 예시적인 CD19 변이체를 추가로 나타낸다. 다수의 클론들에서, 다양한 위치에서의 아미노산이 나타나 있다.
도 5d는 예시적인 CD19 변이체를 나타낸다. 다수의 클론들에서, 다양한 위치에서의 아미노산이 나타나 있다.
도 6은 예시적인 CD19 변이체를 나타낸다. 다수의 클론들에서, 다양한 위치에서의 아미노산이 나타나 있다.
도 7은 이중파라토프 융합 단백질의 결합을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 CD19-scFv 단백질의 세포독성을 나타낸다. 도 9는 정제된 이중파라토프 융합 단백질의 세포독성을 나타낸다.
도 10은 정제된 이중파라토프 융합 단백질의 세포독성을 나타낸다.
도 11은 정제된 이중파라토프 융합 단백질의 세포독성을 나타낸다.
도 12는 항시적으로 발현되는 이중파라토프 융합 단백질의 세포독성을 나타낸다.
도 13은 항시적으로 발현되는 이중파라토프 융합 단백질의 세포독성을 나타낸다.
도 14는 정제된 이중파라토프 융합 단백질의 결합을 나타낸다.
도 15는 정제된 이중파라토프 융합 단백질의 세포독성을 나타낸다.
도 16a-16c는 HIS 태그가 있는 이중파라토프 융합 단백질과 HIS 태그가 없는 이중파라토프 융합 단백질에서의 동등함(equivalence)을 나타낸다.
도 17은 HIS 태그가 있는 항시적으로 발현되는 이중파라토프 융합 단백질과 HIS 태그가 없는 항시적으로 발현되는 이중파라토프 융합 단백질에서의 세포독성의 동등함을 나타낸다.
도 18은 생체내에서, HIS 태그가 있는 항시적으로 발현되는 이중파라토프 융합 단백질과 HIS 태그가 없는 항시적으로 발현되는 이중파라토프 융합 단백질에서의 세포독성의 동등함을 나타낸다.
도 19는 CLEC12A의 다수의 상이한 대립형질들에 결합하는 이중파라토프 융합 단백질의 능력을 나타낸다.
도20은 이중 항원 융합 단백질의 결합을 나타낸다.
도 21a 및 21b는 이중 항원 융합 단백질의 세포독성을 나타낸다.
정의
본 발명을 더욱 용이하게 이해하기 위하여, 특정 용어들을 이하에서 먼저 정의한다. 이하의 용어 및 다른 용어들에 대한 추가적인 정의는 명세서 전체에 제시되어 있다.
투여: 본원에서 사용된 "투여(administration)"라는 용어는, 대상체 또는 시스템에 대한 조성물의 투여를 말한다. 동물 대상체(예를 들어, 인간)에 대한 투여는 임의의 적절한 경로에 의할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여는 기관지(기관지 점적 주입(instillation) 포함), 볼 안쪽 점막(buccal), 장, 피내(interdermal), 동맥-내, 진피내((intradermal), 위내, 수내, 근육내, 비강내, 복강내, 경막내, 정맥내, 심실내, 특이적인 장기 내(예를 들어, 간내), 점막, 비강, 구강, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(기관내 점적 주입 포함), 경피, 질 및 초자체에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 종양내 또는 종양 주위에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 간헐적 투여와 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 적어도 선택된 시간 동안의 연속 투여(예를 들어, 관류)와 관련될 수 있다.
적응 세포 치료: 본원에서 사용된 "적응 세포 치료(adoptive cell therapy)" 또는 "ACT"는, 항종양 활성을 갖는 면역 세포를 암 환자에게 전달하는 것과 관련된다. 일부 구현예에서, ACT는 항종양 활성을 갖는 림프구의 사용, 시험관내에서 이 세포들의 다수로의 확장, 및 암-보유 숙주로의 이들의 주입과 관계되는 치료 접근법이다.
제제: 본원에서 사용된 "제제(agent)"라는 용어는, 예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 다당류, 지질, 소 분자, 금속, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 화학적 부류의 화합물 또는 엔티티를 말할 수 있다. 문맥상 명확하듯이, 일부 구현예에서, 제제는 세포 또는 유기체, 또는 이의 분획, 추출물, 또는 성분일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 자연에서 발견되고/거나, 자연으로부터 얻은 천연 산물이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 사람의 손으로 디자인되고, 조작되고/거나, 생산되고/거나, 자연에서는 발견되지 않은 하나 이상의 엔티티이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 분리된 형태 또는 순수한 형태로 이용될 수 있고; 일부 구현예에서, 제제는 미정제 형태로 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 잠재적 제제는 집합체(collection) 또는 라이브러리로서 제공되는데, 예를 들어 이들을 스크리닝하여 그 내부에 활성 제제가 있는지 확인하거나 특성화할 수 있다. 본 발명에 의해 이용할 수 있는 제제의 일부 특정 구현예는, 소 분자, 항체, 항체 절편, 압타머, 핵산(예를 들어, siRNA, shRNA, DNA/RNA 혼성체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임), 펩티드, 펩티드 모사체 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 중합체이거나, 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 중합체가 아니고/거나, 어떠한 중합체도 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제는 적어도 하나의 중합성 모이어티를 함유한다. 일부 구현예에서, 제제는 어떠한 중합성 모이어티도 없거나, 이를 실질적으로 포함하지 않는다.
개선: 본원에서 사용된 "개선(amelioration)"은, 예방, 감소 및/또는 상태의 완화, 또는 대상체 상태의 개선을 말한다. 개선은 질병, 장애 또는 질환의 완전한 회복 또는 완전한 예방을 포함하나, 이를 요구하지는 않는다.
아미노산: 본원에서 사용된 "아미노산(amino acid)"이라는 용어는, 가장 넓은 의미로 폴리펩티드 사슬에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연 발생적인 아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산은 합성 아미노산이다; 일부 구현예에서, 아미노산은 d-아미노산이고; 일부 구현예에서, 아미노산은 l-아미노산이다. "표준 아미노산"은 자연 발생적인 펩티드에서 흔히 발견되는 20개의 표준 l-아미노산 중 어느 것을 말한다. "비표준 아미노산"은 표준 아미노산이 아닌 임의의 아미노산을 말하며, 이들이 합성에 의해 제조되었는지, 천연 공급원에서 얻었는지와는 무관하다. 본원에서 사용된 "합성 아미노산"은, 염을 포함하나 이에 제한되지 않는 화학적으로 변형된 아미노산, 아미노산 유도체(예컨대 아미드), 및/또는 치환체를 포괄한다. 펩티드 내의 카르복시- 말단 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은, 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기, 및/또는 이들의 활성에 유해한 영향 없이 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학 기에 의한 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 디설파이드 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 예컨대 하나 이상의 화학적 엔티티(예를 들어, 메틸 기, 아세테이트 기, 아세틸 기, 포스페이트 기, 포르밀 모이어티, 이소프레노이드기, 설페이트 기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 비오틴 모이어티 등)과 관련된 하나 또는 번역후 변형을 포함할 수 있다. "아미노산"이라는 용어는 "아미노산 잔기"와 상호 교환적으로 사용되며, 자유 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수도 있다. 상기 용어가 사용되는 맥락에서, 이것이 자유 아미노산라고 지칭되는지 펩티드의 잔기라고 지칭되는지와 무관하다는 사실은 자명할 것이다.
항체: 본원에서 사용된 "항체(antibody)"라는 용어는, 특정 표적 항원에 특이적인 결합을 부여하기에 충분한 정규 이뮤노글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 천연에서 생성될 때 무손상 항체는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50 kD)와 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25 kD)로 구성된 대략 150 kD 사량체 제제이며, 이들은 서로 연결되어 통상 "Y-형" 구조라고도 불린다. 각각의 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개의 아미노산 길이)-(Y 구조의 끝에 위치한) 아미노-말단 가변(VH) 도메인, 및 그 뒤의 3개의 불변 도메인: CH1, CH2, 그리고 (Y의 스템의 기부에 위치한) 카르복시-말단 CH3로 구성된다. "스위치(switch)"라고 알려진 짧은 부위는, 중쇄의 가변 부위와 불변 부위를 연결한다. "힌지(hinge)"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지와 연결시킨다. 이러한 힌지 부위 내의 2개의 디설파이드 결합은 무손상 항체에서 2개의 중쇄 폴리펩티드를 서로 연결시킨다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인-아미노-말단 가변(VL) 도메인, 및 이후 카르복시-말단 불변(CL) 도메인으로 구성되며, 이들은 다른 "스위치"에 의해 분리된다. 무손상 항체 4량체는 2개의 중쇄-경쇄 이중체로 구성되는데, 여기에서 중쇄와 경쇄는 단일 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되고; 2개의 다른 디설파이드 결합이 중쇄 힌지 부위들을 서로 연결하여, 이중체가 서로 연결되며, 사량체가 형성된다. 자연적으로-생산된 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인 상에 당화된다. 천연 항체 내의 각 도메인은 압축된 역평형 베타 배럴(barrel)로 서로에 대해 포개어진 2개의 베타 시트(예를 들어, 3-가닥, 4-가닥, 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 "이뮤노글로불린 폴딩(immunoglobulin fold)"을 특징으로 하는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "상보성 결정 부위(complement determining region)"라고 알려진 3개의 과다 가변 루프(CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 4개의 다소 변함없는 "프레임워크" 부위(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)를 함유한다. 천연 항체가 폴딩할 때, FR 부위는 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 CDR 루프 부위는 3-차원 공간에서 함께 합쳐져서, 이들은 Y 구조의 끝에 위치한 단일 과다 가변 항원 결합 부위를 생성한다. 자연-발생적 항원의 Fc 부위는 보체 시스템의 요소에 결합하고, 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 효과기 세포를 포함하는 효과기 세포의 수용체에 결합한다. 당업계에 알려진 바와 같이, Fc 수용체를 위한 Fc 부위의 친화도 및/또는 다른 결합 속성은, 당화 또는 다른 변형을 통해 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따라 생산되고/거나 이용된 항체는 당화된 Fc 도메인을 포함하는데, 당화되도록 변형 또는 조작된 이러한 Fc 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정 구현예에서, 천연 항체에서 발견된 충분한 이뮤노글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 복합체는, 이러한 폴리펩티드가 자연적으로 생산되는지(예를 들어, 항원과 반응하는 유기체에 의해 생성되는지), 또는 재조합 조작, 화학적 합성, 또는 다른 인공 시스템 또는 방법에 의해 생산되는지와 무관하게, "항체"라고 지칭되고/거나, "항체"로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다중클론이고; 일부 구현예에서, 항체는 단일클론이다. 일부 구현예에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징인 불변 부위 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 서열 요소는 전체 인간의 것이거나, 또는 당업계에 알려진 바와 같이 인간화, 유인원화되고, 키메라 등이 된다. 게다가, 본원에서 사용된 "항체"라는 용어는, 적절한 구현예에서 (달리 기술되거나 문맥상 명확한 것이 아니라면) 대안적인 제시에서 항체 구조 및 기능성 특징을 이용하기 위해 임의의 당업계에-알려지거나 또는 개발된 제작물 또는 형식을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따라 이용된 항체는 무손상 IgG, IgE 및 IgM, 이중-또는 다중-특이적인 항체(예를 들어, Zybodies® 등), 이중-또는 다중-파라토프 항체, 단쇄 Fvs, 폴리펩티드-Fc 융합, Fab, 카멜로이드(cameloid) 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®), Small Modular ImmunoPharmaceuticals("SMIPsTM"), 단쇄 또는 연쇄반복 디아바디(TandAb®), VHH, Anticalins®, Nanobodies®, 미니바디, BiTE®, 안키린(ankyrin) 반복 단백질 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR-유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, MicroProteins, Fynomers®, Centyrins® 및 KALBITOR®로부터 선택된 형식이다. 일부 구현예에서, 항체는 자연적으로 생성되었다면 갖고 있을 공유적 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결핍될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 공유적 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드(payload)(예를 들어, 탐지가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등), 또는 다른 펜던트 기(예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등))를 함유할 수 있다.
항체-의존성 세포내 세포독성: 본원에서 사용된 "항체-의존성 세포내 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity)" 또는 "ADCC"라는 용어는, 항체가 결합한 표적 세포가 면역 효과기 세포에 의해 사멸되는 현상을 말한다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않기를 바라며, ADCC는 전형적으로 Fc 수용체 (FcR)-보유 효과기 세포가 항체-코팅된 표적 세포(예를 들어, 이들의 표면 상에 항체가 결합된 특이적인 항원을 발현하는 세포)를 인식한 후, 이를 사멸시킬 수 있다는 사실과 관계된다고 이해된다. ADCC를 매개하는 효과기 세포는 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호중구, 호산구 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 세포를 포함할 수 있다.
항체 절편: 본원에서 사용된 "항체 절편(antibody fragment)"은, 예를 들어, 항체의 항원-결합 부위 또는 가변 부위와 같은 무손상 항체의 일부분을 포함한다. 항체 절편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편; 트리아바디; 테트라바디; 선형 항체; 단-쇄 항체 분자; 및 항체 절편들로부터 형성된 다중-특이적인 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 절편은 분리된 절편, (중쇄 및 경쇄의 가변 부위로 이루어지는) "Fv" 절편, 경쇄 및 중쇄의 가변 부위가 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 항체 중쇄의 가변 부위로 이루어진 재조합 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH), 및 과다 가변 부위(예를 들어, 중쇄 가변 부위(VH)의 과다 가변 부위, 경쇄 가변 부위(VL)의 과다 가변 부위, VH 내의 하나 이상의 CDR 도메인, 및/또는 VL 내의 하나 이상의 CDR 도메인)를 모방한 아미노산 잔기들로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다. 많은 구현예에서, 항체 절편은 항체의 충분한 서열을 포함하는데, 이는 이것이 모 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 결합하는 절편이고; 일부 구현예에서, 절편은 모 항체에 필적할만한 친화도로 항원에 결합하고/거나, 항원에 대한 결합에 대해 모 항체와 경쟁한다. 항체의 항원 결합 절편의 예는 Fab 절편, Fab' 절편, F(ab')2 절편, scFv 절편, Fv 절편, dsFv 디아바디, dAb 절편, Fd' 절편, Fd 절편, 중쇄 가변 부위, 및 분리된 상보성 결정 부위(CDR) 부위를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체의 항원 결합 절편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 절편은 무손상 항체의 절편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/거나, 이는 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합에 의해 생산될 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체의 항원 결합 절편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 항원 결합 절편은 선택적으로 단쇄 항체 절편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체의 항원 결합 절편은 예를 들어, 디설파이드 연결에 의해 함께 연결된 다수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체의 항원 결합 절편은 선택적으로 다분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능성 항체 절편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고, 더욱 전형적으로는 적어도 약 200개의 아미노산을 포함한다.
항원: 본원에서 사용된 "항원(antigen)"이라는 용어는, 면역 반응을 유도하는 제제; 및/또는 (예를 들어, MHC 분자에 의해 제시될 때) T 세포 수용체에 결합하거나, 또는 항체 또는 항체 절편에 결합하는 제제를 말한다. 일부 구현예에서, 항원은 (예를 들어, 항원-특이적인 항체의 생산을 포함하는) 체액성 반응을 유도하고; 일부 구현예에서, 항원은 (예를 들어, 이의 수용체가 항원과 특이적으로 상호작용하는 T-세포와 관련된) 세포성 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원은 항체에 결합하고, 유기체 내에서 특정 생리학적 반응을 유도하거나, 유도하지 않을 수 있다. 일반적으로, 항원은 예를 들어, 소 분자, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, (일부 구현예에서 생물학적 중합체가 아닌(예를 들어, 핵산 또는 아미노산 중합체가 아닌) 중합체 등과 같은 임의의 화학적 엔티티이거나, 이들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩티드이거나, 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 글리칸이거나, 글리칸을 포함한다. 당업계의 통상의 숙련자들은 일반적으로, 항원이 분리된 형태 또는 순수 형태로 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로 미정제 형태로 (예를 들어, 추출물, 예컨대 세포 추출물 또는 항원-함유 공급원의 다른 비교적 미정제 제제 중 다른 물질과 함께) 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로 세포 상에 또는 세포 내에 존재할 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 항원은 재조합 항원이다.
항원 제시 세포: 본원에서 사용된 "항원 제시 세포(antigen presenting cell)" 또는 "APC"라는 어구는, 항원을 가공하여 T-세포에 제시하는 세포를 지칭하는 의미로 당업계에서 이해된다. 예시적인 APC는 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 특정 활성화 상피 세포, 및 TCR 자극 및 적절한 T 세포 공동자극을 일으킬 수 있는 다른 세포 유형을 포함한다.
대략 또는 약: 본원에서 사용된 "대략(approximately)" 또는 "약(about)"이라는 용어는, 하나 이상의 관심 값들에 적용될 때, 기술된 참고값과 유사한 값을 말한다. 특정 구현예에서, "대략" 또는 "약"이라는 용어는, 달리 기술되거나 문백상 명백한 경우를 제외하고는(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외), (더 크거나 더 낮은) 어느 한 방향으로 기술된 참고 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 속하는 값의 범위를 말한다.
결합: 본원에서 사용된 "결합(binding)"이라는 용어는, 전형적으로 둘 이상의 엔티티 사이의 비-공유적 연결을 말하는 것으로 이해될 것이다. "직접(Direct)" 결합은 엔티티 또는 모이어티 사이의 물리적 접촉과 관계되고; 간접 결합은 하나 이상의 중간 엔티티와의 물리적 접촉에 의한 물리적 상호작용과 관계된다. 둘 이상의 엔티티 사이의 결합은 전형적으로 임의의 다양한 맥락에서 평가될 수 있는데-엔티티 또는 모이어티와의 상호작용이 별도로 연구되거나, 또는 더욱 복합한 시스템의 맥락에서(예를 들어, 담체 엔티티와 그리고/또는 생물계 또는 세포에서 공유 결합되거나, 회합된) 연구되는 경우를 포함한다.
암: "암(cancer)", 악성 종양(malignancy)", "신생물(neoplasm)", "종양(tumor)" 및 "암종(carcinoma)"은, 본원에서 상호 교환적으로 사용되어, 비교적 비정상적인, 비조절된, 및/또는 자율적인 성장을 나타내는 세포를 말하며, 따라서 이들은 세포 증식 조절의 유의한 손실을 특징으로 하는 비정상적 성장 표현형을 나타낸다. 일반적으로, 본 출원에서 탐지 또는 치료를 위한 관심 대상 세포는 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성, 및 비-전이성 세포를 포함한다. 본 개시내용의 교시는 임의의 모든 암에 관련될 수 있다. 몇몇을 제외한 비-제한적인 예를 제시하기 위해, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 교시는 하나 이상의 암, 예를 들어, (T 세포, B 세포 및 골수) 백혈병, (호지킨 및 비-호지킨) 림프종, 골수종, 골수증식성 장애를 포함하는 조혈 암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 구강, 인후, 후두의 편평 세포 암종, 및 폐암, 간암, 비뇨생식기암, 예컨대 전립선, 자궁경부, 방광, 자궁 및 자궁내막의 암, 및 신장 세포 암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 내분비계 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 두경부암, 유방암, 위-장관 암 및 신경계 암, 양성 병변, 예컨대 유두종 등과 같은 하나 이상의 암에 적용된다.
키메라 항원 수용체: 본원에서 사용된 "키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)" 또는 "CAR" 또는 "CARs"은, 세포(예를 들어 T 세포, 예컨대 자연적 T 세포, 중심 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포 또는 이들의 조합)에 항원 특이성을 더해주는 조작된 수용체를 말한다. CAR은 또한 인공 T-세포 수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 키메라 면역수용체라고도 알려져 있다. 일부 구현예에서, CAR은 항원-특이적인 표적 부위, 세포외 도메인, 막통과 도메인, 하나 이상의 공동-자극 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 1개 초과의 항원-특이적인 표적 부위, 세포외 도메인, 막통과 도메인, 하나 이상의 공동-자극 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR은 이중특이적인 항원 표적 부위를 가질 수 있으며, 이로 인해 2개의 별개의 항원을 인식한다.
병용 요법: 본원에서 사용된 "병용 요법(combination therapy)"라는 용어는, 대상체가 둘 이상의 치료 요법(예를 들어, 둘 이상의 치료제)에 동시에 노출된 그러한 상황들을 말한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 제제는 동시에 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 이러한 제제는 순차적으로 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 이러한 제제는 중복되는 투여 요법으로 투여된다.
도메인: 본원에 사용된 "도메인(domain)"이라는 용어는, 엔티티의 단편(section) 또는 일부를 말한다. 일부 구현예에서, "도메인"은 엔티티의 특정 구조적 및/또는 기능성 특징과 관련되어, 도메인이 이의 모 엔티티의 나머지로부터 물리적으로 분리될 때, 이는 특정 구조적 및/또는 기능성 특징을 실질적으로 또는 전체적으로 보유한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 도메인은 엔티티의 일부이거나, 이를 포함할 수 있어서, 그 (모) 엔티티로부터 분리되어, 상이한 (수여체) 엔티티와 연결될 때, 모 엔티티에서 특징을 이루었던 하나 이상의 구조적 및/또는 기능성 특징을 실질적으로 보유하고/거나, 이를 수여체 엔티티에 부여한다. 일부 구현예에서, 도메인은 한 분자(예를 들어, 소 분자, 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 폴리펩티드)의 단편 또는 일부이다. 일부 구현예에서, 도메인은 폴리펩티드의 단편이며; 일부 이러한 구현예에서, 도메인은 특정 구조적 요소(예를 들어, 특정 아미노산 서열 또는 서열 모티프, α-나선 특징, β-시트 특징, 코일-코일 특징, 무작위 코일 특징 등), 및/또는 특정 기능성 특징(예를 들어, 결합 활성, 효소 활성, 폴딩 활성, 신호전달 활성 등)을 갖는 것을 특징으로 한다.
제형: 본원에서 사용된 "제형(dosage form)" 및 단위 제형(unit dosage form)"이라는 용어는, 치료될 환자를 위한 치료제의 물리적으로 개별적인 단위를 말한다. 각 단위는 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 사전 결정된 양의 활성 물질을 함유한다. 그러나, 조성물의 총 투여량은 주치의가 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 결정한다고 이해될 것이다.
투여 요법: 본원에서 사용된 "투여 요법(dosing regimen)"이라는 용어는, 개별적으로 대상체에 투여되며, 전형적으로 소정의 시간에 의해 구분된 단위 용량의 세트(전형적으로, 하나 초과)를 말한다. 일부 구현예에서, 소정의 치료제는 하나 이상의 용량과 관련될 수 있는 권고된 투여 요법을 갖는다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 다수의 용량들을 포함하는데, 이들 각각은 동일한 길이의 기간에 의해 서로 분리되며; 일부 구현예에서, 투여 요법은 다수의 용량들을 포함하고, 개별 용량은 적어도 2개의 상이한 시기들로 구분된다. 일부 구현예에서, 투여 요법 내의 모든 용량들은 동일한 단위 투여량이다. 일부 구현예에서, 투여 요법 내의 상이한 용량들은 상이한 양이다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 제1 투여량의 제1 용량, 및 이후 제1 투여량과 상이한 제2 투여량의 하나 이상의 추가적인 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 제1 투여량의 제1 용량, 및 이후 제1 투여량과 동일한 제2 투여량의 하나 이상의 추가적인 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 관련 집단에 대해 투여될 때의 원하는 또는 유익한 결과와 관련된다(즉, 치료적 투여 요법이다).
효과기 기능: 본원에서 사용된 "효과기 기능(effector function)"은, 항체 Fc 부위와 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 발생한 생화학적 사건을 말한다. 효과기 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포-매개 대식 작용(ADCP), 및 보체-매개 세포독성(CMC)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 효과기 기능은 항원의 결합 이후 작용하는 것, 항원 결합과 무관하게 작용하는 것, 또는 상기 둘 다이다.
효과기 세포: 본원에서 사용된 "효과기 세포(effector cell)"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고, 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 면역계의 세포를 말한다. 일부 구현예에서, 효과기 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포, T-림프구, B-림프구 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있으며, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.
발현: 본원에서 사용된 핵산 서열의 "발현(expression)"은, 이하의 사건들 중 하나 이상을 말한다: (1)(예를 들어, 전사에 의한) DNA 서열로부터의 RNA 주형의 생산; (2)(예를 들어, 스플라이싱, 에디팅, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 형성에 의한) RNA 전사체의 가공; (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형.
세포외 도메인: 본원에서 사용된 "세포외 도메인(extracellular domain)" (또는 "ECD")는, 막통과 도메인 이상으로 세포외 공간으로 신장된 폴리펩티드의 일부를 말한다.
융합 단백질: 본원에서 사용된 "융합 단백질(fusion protein)"이라는 용어는, 일반적으로 적어도 2개의 세그먼트를 포함하는 폴리펩티드를 말하는데, 이들 각각은 (1) 자연 발생하고/하거나, (2) 폴리펩티드의 기능성 도메인을 나타내는 펩티드 모이어티에 대해 고도의 아미노산 동일성을 나타낸다. 전형적으로, 적어도 2개의 이러한 세그먼트를 함유하는 폴리펩티드는, 2개의 세그먼트가 (1) 자연에서는 동일한 펩티드에 포함되지 않고/않거나, (2) 이전에 단일 폴리펩티드로 서로 연결되지 않았고/않거나, (3) 사람의 손을 통해 서로 연결되었던 모이어티인 경우, 융합 단백질인 것으로 간주될 것이다.
유전자: 본원에서 사용된 "유전자(gene)"라는 용어는, 당업계에서 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 당업계의 통상의 숙련자들은 "유전자"라는 용어가 유전자 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등) 및/또는 인트론 서열을 포함할 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 추가로, 유전자의 정의는 단백질을 암호화하지 않으며, 오히려 기능성 RNA 분자, 예컨대 tRNA, RNAi-유도제 등을 암호화하는 핵산을 포함한다고 인식될 것이다. 명확성을 위해, 본 출원에 사용된 "유전자"라는 용어가 일반적으로 단백질을 암호화하는 핵산의 일부를 말한다는 사실을 주목하며; 상기 용어는 본 발명자들은 문맥상 당업계의 통상의 숙련자들에게 명백한 바와 같이, 선택적으로 조절 서열을 포함할 수 있다. 이 정의는 "유전자"라는 용어를 비-단백질-암호화 발현 단위에 적용하는 것을 배제하지 않으며, 오히려 대부분의 경우, 본 문헌에 사용된 용어는 단백질-암호화 핵산을 말하는 것으로 명확히 의도된다.
유전자 산물 또는 발현 산물: 본원에서 사용된 "유전자 산물(gene product)" 또는 "발현 산물(expression product)"이라는 용어는, 일반적으로 유전자로부터 전사된 (전-가공 및/또는 후-가공) RNA, 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 암호화된 (전-변형 및/또는 후-변형) 폴리펩티드를 말한다.
면역 반응: 본원에서 사용된 "면역 반응(immune response)"이라는 용어는, 동물에서 유도되는 반응을 말한다. 면역 반응은 세포성 면역, 체액성 면역을 말하거나, 또는 상기 둘 다에 관여할 수 있다. 면역 반응은 또한 면역계의 일부에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 증가된 IFNγ반응을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 (예를 들어, 비강 및/또는 직장 세척물에서 측정할 때) 점막성 IgA 반응을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 (예를 들어, 혈청에서 측정할 때) 전신 IgG 반응을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 바이러스-중화 항체 또는 중화 항체 반응을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 T 세포에 의한 세포용해성(CTL) 반응을 유도할 수 있다.
개선하다, 증가하다, 또는 감소하다: 본원에서 사용된 "개선하다(improve)", "증가하다(increase)", "감소하다(reduce)"라는 용어 또는 문법적 균등물은, 기준 측정치, 예컨대 본원에 기재된 치료가 개시되기 전에 동일한 개체에서 측정한 값, 또는 본원에 기재된 치료 없이 대조군 개체 (또는 다수의 대조군 개체들)에서의 측정한 값을 가리킨다.
개체, 대상체, 환자: 본원에서 사용된 "대상체(subject)", "개인(individual)" 또는 "환자(patient)"라는 용어는, 인간 또는 비-인간 포유류의 대상체를 말한다. 치료되는 ("환자" 또는 "대상체"라고도 또한 불리는) 개체는, 질병, 예를 들어, 암을 앓고 있는 개체(태아, 유아, 소아, 청소년, 또는 성인)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
링커: 본원에서 사용된 "링커(linker)"라는 용어는, 예를 들어, 융합 단백질에서, 천연 단백질의 특정 위치에 나타나는 것이 아닌 적절한 길이의 아미노산 서열을 말하는데, 일반적으로 유연성이 있고/거나, 2개의 단백질 모이어티 사이에 a-나선과 같은 구조를 두도록 디자인된다. 일반적으로, 링커로 인해 융합 단백질의 둘 이상의 도메인은 각 도메인의 생물학적 활성의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상을 보유하게 된다. 링커는 스페이서라고도 불릴 수 있다.
마스킹 모이어티: 본원에서 사용된 "마스킹 모이어티(masking moiety)"는, 본원에 기재된 항원-결합 단백질에 연결될 때, 이러한 항원-결합 모이어티가 이의 표적 항원에 결합하는 것을 마스킹할 수 있는 분자 모이어티를 말한다. 이러한 마스킹 모이어티를 포함하는 항원-결합 단백질은, 본원에서 "마스킹된 항원-결합 단백질"로 지칭된다.
핵산: 본원에서 사용된 "핵산(nucleic acid)"은 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오티드 사슬이거나, 올리고뉴클레오티드 사슬에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 핵산은 올리고뉴클레오티드 사슬이거나, 포스포디에스테르 연결을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬에 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥상 명백한 바와 같이, 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 말하며; 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 말한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA이거나, RNA를 포함하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 DNA이거나, DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로서 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로서 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 골격을 이용하지 않는 점에서 핵산과 다르다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 당업계에 알려지고, 골격 내에 포스포디에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 갖고, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이로서 이루어진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합보다는 오히려 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포라미다이트 연결을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이들을 포함하거나, 이들로서 이루어진다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3 -메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 개재 염기(intercalated base) 및 이들의 조합)이거나, 이들을 포함하거나, 이들로서 이루어진다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 천연 핵산과 비교할 때, 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 기능성 유전자 산물, 예컨대 RNA 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 분리, 상보성 주형에 기초한 중합에 의한 (생체내 또는 시험관내) 효소 합성, 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 20개, 225개, 250개, 275개, 300, 325, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475, 500개, 600개, 700개, 800개, 900, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개 또는 그 이상의 잔기의 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산은 단일 가닥이고; 일부 구현예에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 보체이다. 일부 구현예에서, 핵산은 효소 활성을 갖는다.
작용가능하게 연결된: 본원에서 사용된 "작용가능하게 연결된(operably linked)"은, 기재된 요소들이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병렬을 말한다. 하나 이상의 암호화 서열(들)에 "작용가능하게 연결된" 조절 서열은, 하나 이상의 암호화 서열(들)의 발현이 조절 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 그러한 방식으로 연결된다. "작용가능하게 연결된" 서열은, 관심 대상 유전자(들)과 인접한 발현 조절 서열과 관심 대상 유전자(들)을 조절하기 위해 트랜스 작용으로 또는 원거리에서 작용하는 발현 조절 서열을 둘 다 포함한다. 본원에서 사용된 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 용어는, 이들이 라이게이션된 암호화 서열의 발현 및 가공에 영향을 미치는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효과적인 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA을 안정화하는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작 공통(Kozak consensus) 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하나, 진핵 생물에서는, 전형적으로, 이러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "조절 서열(control sequence)"이라는 용어는 이의 존재가 발현과 가공에 필수적인 요소를 포함하는 것으로 의도되며, 또한 이의 존재가 장점을 갖는 추가적인 요소, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수도 있다.
파라토프: 본원에서 사용된 "파라토프(paratope)"라는 용어는, 항원의 에피토프에 결합하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 일부를 말한다. 본원에서 사용된 "이중파라토프(biparatopic)"라는 용어는, (본원에 기재된 항체, 제작물 또는 융합 단백질의 맥락에서) 각각 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 파라토프를 포함하는 항체 또는 제작물을 말한다. 본원에서 사용된 "다중파라토프(multiparatopic)"라는 용어는, (본원에 기재된 항체 또는 제작물의 맥락에서) 각각 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 둘 이상의 파라토프를 포함하는 항체 또는 제작물을 말한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중파라토프 항체 또는 융합 단백질의 둘 이상의 파라토프는, 단일 항원 상의 비-중복 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다중파라토프 항체 또는 융합 단백질의 둘 이상의 파라토프는, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산을 공유할 수 있는, 단일 항원 상의 2개의 에피토프에 결합한다.
환자: 본원에서 사용된 "환자(patient)"라는 용어는, 제공된 조성물이 예를 들어, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적으로 투여되거나, 투여될 수 있는 임의의 유기체를 말한다. 전형적인 환자는 동물(예를 들어, 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류, 및/또는 인간)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 질환을 앓고 있거나, 이에 취약하다. 일부 구현예에서, 환자는 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 질환으로 진단받았다. 일부 구현예에서, 장애 또는 질환은 암, 또는 하나 이상의 종양의 존재이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 질병, 장애, 또는 질환을 진단받고/거나 치료하기 위해, 특정 치료를 받는 중이거나, 받았다.
펩티드: 본원에서 사용된 "펩티드(peptide)"라는 용어는, 전형적으로 예를 들어 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 10개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 비교적 짧은 폴리펩티드를 말한다.
약학적으로 허용가능한: 본원에서 사용된 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"이라는 용어는, 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 과다한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 합리적인 잇점/위험의 비에 맞게 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 물질을 말한다.
폴리펩티드: 본원에서 사용된 "폴리펩티드(polypeptide)"는, 일반적으로 말하면, 펩티드 결합에 의해 서로 부착된 적어도 2개의 아미노산의 대열이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 3-5개의 아미노산을 포함할 수 있는데, 이들 각각은 적어도 하나의 펩티드 결합에 의해 서로 부착된다. 당업계의 통상의 숙련자들은 폴리펩티드가 때때로 "비-자연적인(non-natural)" 아미노산 또는 다른 엔티티를 포함하며. 그렇다 하더라도 폴리펩티드 사슬에 선택적으로 통합될 수 있는 있다는 사실을 인식할 것이다.
프로모터: 본원에서 사용된 "프로모터(promoter)"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적인 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열이다. "항시적(constitutive)" 프로모터는, 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드에 작용가능하게 연결될 때, 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에서 유전자 산물이 세포에서 생산될 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열이다. "유도성(inducible)" 프로모터는, 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드에 작용가능하게 연결될 때, 세포에서 단지 프로모터-특이적인 유도자가 세포 내에 존재할 경우에만 유전자 산물을 실질적으로 생산될 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열이다.
단백질: 본원에서 사용된 "단백질(protein)"이라는 용어는, 폴리펩티드(즉, 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 대열)을 말한다. 단백질은 아미노산이 아닌 모이어티(예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸 등일 수 있음)를 포함할 수 있고/거나, 그렇지 않다면 가공되거나 변형될 수 있다. 당업계의 통상의 숙련자들은 "단백질"이 세포에서 생산된 (신호 서열이 있거나, 없는) 완전한 폴리펩티드 사슬일 수 있거나, 또는 이의 일부일 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 통상의 숙련자들은 단백질이 때때로 예를 들어 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결되거나, 또는 다른 수단에 의해 회합된 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 상기 둘 다를 함유할 수 있고, 당업계에 알려진 다양한 아미노산 변형 또는 유사체 중 어느 것을 함유할 수 있다. 유용한 변형은 예를 들어, 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
참조: 본원에서 사용된 "참조(reference)"는 비교 대상인 표준 또는 대조군을 설명한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 관심 대상인 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 참조 또는 대조군의 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 관심 대상인 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험되고/거나 결정된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 선택적으로 유형 매체(tangible medium)로 구현된 과거의(historical) 참조 또는 대조군이다. 전형적으로, 당업계의 숙련자들이 이해할 바와 같이, 참조 또는 대조군은 비교가능한 조건 또는 평가 하에 있는 상황에서 결정되거나, 특징화된다. 당업계의 숙련자들은 충분한 유사성이 존재하여, 특정한 가능한 참조 또는 대조군에 대한 의존 및/또는 비교를 정당화하는 경우를 인식할 것이다.
고형 종양: 본원에서 사용된 "고형 종양(solid tumor)"이라는 용어는, 통상 낭포 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적 덩어리를 말한다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형들은 이들을 형성하는 세포의 유형을 따라 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 암종, 림프종, 중피종, 신경아세포종, 망막아종 등이다.
암의 병기: 본원에서 사용된 "암의 병기(stage of cancer)"라는 용어는, 암의 진행 수준을 정성적 또는 정량적으로 평가한 것을 말한다. 암의 병기를 결정하는데 사용된 기준은, 종양의 크기 및 전이의 정도(예를 들어, 국소성 또는 원격성)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
대상체: "대상체(subject)"는 포유류(예를 들어, 인간, 일부 구현예에서는 배아기의 인간 형태 포함)를 의미한다. 일부 구현예에서, 대상체는 관련된 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 장애, 또는 질환에 취약하다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 장애, 또는 질환의 어떠한 증상 또는 특징도 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 장애, 또는 질환에 대한 취약성 또는 이에 대한 위험성의 하나 이상의 특징을 갖는 이들이다. 일부 구현예에서, 대상체는 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 진단 및/또는 치료가 실시되고/거나, 실시되었던 개체이다.
앓고 있는: 질병, 장애, 또는 질환(예를 들어, 암)을 "앓고 있는(suffering from)" 개체는, 질병, 장애, 또는 질환으로 진단받았고/거나, 이의 하나 이상의 증상을 나타내었다.
증상이 감소됨: 본 발명에 의하면, 특정 질병, 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상이 규모(예를 들어, 강도, 심각성 등) 또는 빈도에서 감소될 때, "증상이 감소된(symptoms are reduced)" 것이다. 명확성을 위해, 특정 증상의 발병 지연은 그 증상의 빈도 감소의 한 형태로 간주된다. 본 발명은 증상이 없어지는 경우에만 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 특히 비록 완전히 없어지지는 않지만, 하나 이상의 증상이 감소되고, (이로 인해 대상체의 상태가 "개선되는(improved)") 치료를 고려한다.
T 세포 수용체: 본원에서 사용된 "T 세포 수용체(T cell receptor)" 또는 "TCR"은, T-세포의 표면 상에 존재하는 항원-인식 분자를 말한다. 정상적인 T-세포 발달 동안, 4개의 TCR 유전자인 α, β, γ 및 δ는 각각 재배열하여, 매우 다양한 TCR 단백질을 만들 수 있다.
치료제: 본원에서 사용된 "치료제(therapeutic agent)"라는 어구는, 일반적으로 유기체에 투여될 때, 원하는 약학적 효과를 유발하는 임의의 제제를 말한다. 일부 구현예에서, 제제는 적절한 집단에 대한 통계적으로 유의한 효과가 입증되는 경우, 치료제인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 적절한 집단은 모델 유기체의 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 집단은 다양한 기준, 예컨대 특정 연령 그룹, 성별, 유전적 배경, 기존의 임상적 질환 등에 의해 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 질병, 장애, 및/또는 질환을 개선, 완화, 경감, 저해, 예방하고, 질병, 장애 및/또는 질환의 발병을 지연시키고, 질병, 장애, 및/또는 질환의 심각성을 감소시키고/거나, 질병, 장애, 및/또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생을 감소시키는데 사용될 수 있는 물질이다. 일부 구현예에서, "치료제"는 이것이 인간에 대한 투여용으로 시판될 수 있기 전에, 정부 기관에서 승인을 받았거나, 승인받을 필요가 있는 제제이다. 일부 구현예에서, "치료제"는 인간에 대한 투여를 위해 의학적 처방전이 필요한 제제이다.
치료 유효량: 본원에서 사용된 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"이라는 용어는, 치료 투여 요법에 따라 질병, 장애, 및/또는 질환을 앓고 있거나, 이에 취약한 집단에 투여될 때, 질병, 장애, 및/또는 질환을 치료하는데 충분한 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 치료 유효량은 질병, 장애, 및/또는 질환의 하나 이상의 증상의 발생 및/또는 심각성을 감소시키고, 질병, 장애, 및/또는 질환의 하나 이상의 특징을 안정화시키고/거나, 질병, 장애, 및/또는 질환의 발병을 지연시키는 것이다. 당업계의 통상의 숙련자들은 "치료 유효량"이라는 용어가 사실상 특정 개체에서 성공적인 치료를 달성할 것을 요구하지 않는다는 사실을 인식할 것이다. 오히려, 치료 유효량은 이러한 치료가 필요한 환자에 투여될 때, 유의한 수의 대상체에서 원하는 특정 약학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "치료 유효량"은 본 발명의 치료의 맥락에서 이것이 필요한 개체에 투여될 때, 상기 개체에서 일어나는 암-보조 과정을 차단, 안정화, 약화 또는 반전시키거나, 상기 개체에서 암-억제 과정을 향상시키거나 증가시킬 양을 말한다. 암 치료의 맥락에서, "치료 유효량"은 암으로 진단받은 개체에 투여될 때, 개체에서 암의 추가 발달을 예방, 안정화, 저해 또는 감소시킬 양이다. 본원에 기재된 조성물의 특히 바람직한 "치료 유효량"은, (치료성 치료에서) 악성 종양, 예컨대 췌장 암종의 발달을 반전시키거나, 또는 악성 종양의 퇴행을 달성하거나 연장시키는데 도움을 준다. 개체에서 암을 치료하기 위해 그 개체에 투여되는 치료 유효량은, 퇴행을 촉진시키거나 전이를 저해하기 위해 투여되는 치료 유효량과 동일한 또는 상이할 수 있다. 대부분의 암 치료와 마찬가지로, 본원에 기재된 치료 방법은 암에 대한 "치유(cure)"로 해석되거나, 이에 구속되거나, 그렇지 않다면 이에 제한되지 않을 것이고; 오히려 상기 치료의 방법은 암을 "치료"하기 위한 기재된 조성물의 사용에 관한 것으로, 즉, 암을 갖는 개체의 건강 상 바람직한 또는 유익한 변화에 영향을 준다. 이러한 잇점은 종양학 분야의 숙련된 의료인(healthcare provider)에 의해 인식되는데, 환자 상태의 안정화, 종양 크기의 감소(종양 퇴행), 생체 기능의 개선(예를 들어, 암 조직 또는 장기의 기능 개선), 추가 전이의 감소 또는 저해, 기회 감염의 감소, 생존 가능성 증가, 통증 감소, 운동 기능 개선, 인지 기능 개선, 기력의 개선(활력감, 불안감 감소), 잘 살고 있다는 느김의 개선, 정상 식욕의 회복, 건강한 체중 증가의 회복, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 개체에서 (예를 들어, 본원에 기재된 치료의 결과로써의) 특정 종양의 퇴행은 또한 (예를 들어, 치료 과정 동안) 종양, 예컨대 췌장 선암종 부위로부터 암 세포의 샘플을 채취하고, 상기 암 세포를 대사 및 신호전달 마커의 수준에 대해 시험함으로써 평가되어, 암 세포의 상태를 모니터링하고, 악성이 덜한 표현형으로의 암 세포의 퇴행을 분자 수준에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 이용함으로써 유도된 종양 퇴행은 하나 이상의 전-혈관생성 마커의 감소, 항-혈관생성 마커의 증가, 암으로 진단받은 개체에서 비정상적 활성을 나타내는 대사 경로, 세포간 신호전달 경로, 또는 세포내 신호전달 경로의 정상화(즉, 암을 앓지 않는 정상 개체에서 발견되는 상태로의 변경)을 발견함으로써 나타날 것이다. 당업계의 통상의 숙련자들은 일부 구현예에서, 치료 유효량이 단일 용량으로 제제화되고/거나 투여될 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 치료 유효량은 예를 들어, 투여 요법의 일부로서 다수의 용량으로 제제화되고/거나 투여될 수 있다. 세포성 치료제의 맥락에서, 치료 유효 용량은 세포성 치료제를 생성하는데 사용된 환자 세포의 상태, 이후 환자에 투여될 세포의 용량, 주사 이후 그리고 시간의 경과에 따라 환자에서 주사된 이 세포들의 확장 및 지속성, 종양 항원 부담, 전치료 림프구 제거의 정도, 및 알려지거나 알려지지 않은 다른 인자들을 포함하는 다양한 변수에 따라 달라질 수 있다.
형질전환: 본원에서 사용된 "형질전환(transformation)"은, 외인성 DNA 또는 RNA가 숙주 세포에 도입되는 임의의 과정을 말한다. 형질전환은 천연 또는 인공 조건 하에서, 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여 일어날 수 있다. 형질전환은 외부 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 형질전환 방법은 형질전환되는 숙주 세포에 기초하여 선택되며, 바이러스 감염 "형질도입(transduction)", 및 형질감염 기술, 예를 들어, 전기천공, 리포펙션을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, "형질전환된(transformed)" 세포는 삽입된 DNA가 자율 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 중 하나에 의해 복제할 수 있다는 점에서 안정하게 형질전환된다. 일부 구현예에서, 형질전환된 세포는 제한된 시기 동안 도입된 핵산을 일시적으로 발현한다. 일부 구현예에서, "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA 또는 RNA가 전이인자(transposon) 또는 전이성 요소(transposable element)라는 점에서 형질전환된다.
치료: 본원에서 사용된 "치료(treatment)" (또는 "치료하다(treat)" 또는 "치료하는(treating)")라는 용어는, 특정 질병, 장애, 및/또는 질환(예를 들어, 암)을 부분적으로 또는 완전히 완화, 개선, 경감, 저해하거나, 특정 질병, 장애, 및/또는 질환의 발병을 지연시키거나, 특정 질병, 장애, 및/또는 질환의 심각성을 감소시키고/거나, 특정 질병, 장애, 및/또는 질환의 하나 이상의 증상, 특징, 및/또는 원인의 발생을 감소시키는 물질의 임의의 투여를 말한다. 이러한 치료는 관련 질병, 장애 및/또는 질환의 징후를 나타내지 않는 대상체, 및/또는 단지 질병, 장애, 및/또는 질환의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 관한 것일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에 관한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질병, 장애, 및/또는 질환을 앓고 있는 것으로 진단받았던 대상체에 관한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 통계적으로 관련 질병, 장애, 및/또는 질환의 발달의 위험성 증가와 관련된 하나 이상의 취약성 인자를 갖는다고 알려진 대상체에 관한 것일 수 있다.
종양 침윤 림프구: 본원에서 사용된"종양-침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte)"(TIL 또는 TILs)라는 용어는, 혈류를 떠나서 종양으로 이동한, 암(예컨대 흑색종)으로 고통받는 대상체의 백혈구를 말한다. 일부 구현예에서, 종양-침윤 림프구는 종양 특이성을 갖는다.
벡터: 본원에서 사용된 "벡터(vector)"는, 이들이 연결된 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 일부 구현예에서, 벡터는 염색체-외 복제 및/또는 이들이 숙주 세포, 예컨대 진핵 및/또는 원핵 세포에서 연결된 핵산의 발현을 할 수 있다. 작용가능하게 연결된 유전자의 발현을 유발할 수 있는 벡터는, 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
상세한 설명
본 개시 내용은 적어도 부분적으로는, 이중파라토프 융합 단백질(예를 들어, 항-CLL-1 scFv, 항-CLL-1 VHH, 및 CD19 변이체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질)이 CLL-1에 결합할 뿐만 아니라, 항-CLL-1 scFv/CD19 변이체에 포함된 상응하는 융합 단백질, 또는 항-CLL-1 VHH/CD19 변이체에 포함된 상응하는 융합 단백질을 사용하여 생성된 것들보다 놀랍도록 더 높은 수준으로, CAR-CD19 매개 세포독성을 발생시킨다는 발견에 기초한다. 다른 것들 중에서도, 본 개시내용은 암의 치료에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 세포성 치료제, 예를 들어, 통합된 유전자, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항시성 발현 제작물 및/또는 유도성 발현 제작물)에 의해 유전적으로 변형된 면역 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현은, 본원에 기재된 이러한 뉴클레오티드 서열에 작용가능하게 연결된 발현된 프로모터 서열의 적절한 선택, 제작 및/또는 디자인에 의해 항시성 또는 유도성으로 디자인될 수 있다. 항시적 발현 제작물의 경우, 제작물 내의 유전자는 항시적으로 발현된다. 유도성 발현 제작물의 경우, 세포성 치료제는 항원 결합 수용체를 암호화하는 핵산과 유도성 발현 제작물에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 표적 항원의 결합 시, 세포성 치료제의 항원 결합 수용체는 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같은 유도성 발현 제작물에 포함된 유전자의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 이러한 유전자의 발현은 예를 들어, 하나 이상의 세포성 치료제에 의해 암의 치료를 용이하게 하고/거나 개선시킨다. 본 개시 내용은 또한 특히 이러한 유전자에 의해 암호화된 이중파라토프 융합 단백질(예를 들어, 이러한 유전자 산물의 용해성 형태, 예를 들어, 이러한 단백질을 포함하는 투여용 약학적 조성물), 및 이러한 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 유전자 치료를 위한 핵산을 포함하는 단백질 치료제를 개시한다.
항시적 발현 제작물
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 항시적 발현 제작물을 포함한다. 일부 구현예에서, 항시성 발현 제작물은 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 항시성 발현 제작물은 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조절 서열은 적절한 경우 비-유도성 발현 제작물이 도입될 세포의 유형에 특이적이다. 항시성 발현 제작물은 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작용가능하게 연결된 자연적 또는 비-자연적 프로모터를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 면역 세포에서 기능성이다. 예시적인 프로모터는 예를 들어, CMV, E1F, VAV, TCRv베타, MCSV, 및 PGK 프로모터를 포함한다. 프로모터에 뉴클레오티드 서열을 작용가능하게 연결하는 것은, 숙련 기술자의 상식 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, 항시성 발현 제작물은 본원에 기재된 재조합 발현 벡터이거나, 이를 포함한다.
유도성 발현 제작물 및 유도성 발현
유도성 발현을 위해, 본 개시내용의 세포성 치료제는 (i) 세포외 도메인, 막통과 도메인,및 세포내 (또는 세포질) 도메인을 포함하는 하나 이상의 유형의 항원 결합 수용체, 및 (ii) 유도성 발현 제작물을 포함할 수 있다.
항원 결합 수용체
항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 표적-특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 수용체의 세포내 도메인 (또는 세포질 도메인)은 신호전달 도메인을 포함한다. 신호전달 도메인은 항원 결합 도메인에 표적 항원이 결합할 때, 다른 것들 중에서도, 본원에 기재된 유도성 발현 제작물을 활성화할 수 있는 세포내 신호전달 경로를 개시하고/거나 매개하는 아미노산 서열을 포함하여, 유도성 유전자가 발현된다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 하나 이상의 면역 세포 효과기 기능(예를 들어, 자연적 면역 세포 효과기 기능)을 활성화하는 하나 이상의 추가적인 신호전달 부위(예를 들어, 공동자극성 신호전달 부위)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 T 세포 활성화, 증식, 생존, 또는 다른 T 세포 기능을 활성화하나, 세포독성 활성은 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)의 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 CAR은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Gill 외, Immunol. Rev. 263:68-89 (2015)]; 문헌[Stauss 외, Curr. Opin. Pharmacol. 24:113-118 (2015)] 참고).
항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 표적 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 종양 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 절편(예를 들어, Fab 절편, Fab' 절편, F(ab')2 절편, scFv 절편, Fv 절편, dsFv 디아바디, dAb 절편, Fd' 절편, Fd 절편, 분리된 상보성 결정 부위(CDR), 카멜로이드 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, Probody®), 단쇄 또는 연쇄반복 디아바디(TandAb®), VHH, Anticalin® 단일-도메인 항체(예를 들어, Nanobody®), 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®, Avimer®, Adnectin®, Affilin®, Affibody®, Fynomer® 또는 Centyrin®)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 부분이거나, 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 pH 민감성 도메인이다(예를 들어, 문헌[Schroter 외, MAbs 7:138-51 (2015)] 참고). 일부 구현예에서, 폴리펩티드 (예를 들어, CD19 또는 본원에 기재된 CD19 변이체)는 항원 결합 도메인으로 기능하도록 조작될 수 있다.
항원 결합 도메인은 예를 들어, 표적 세포의 표면 상에 또는 표면 근처에 존재하는 표적 항원의 유형과 수에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로 작용하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하도록 선택될 수 있다. 종양 항원은 종양 세포가 생성하며, 일부 구현예에서는, 면역 반응, 예를 들어 T-세포 매개 항-종양 면역 반응을 유도하는 단백질이다. 항원 결합 도메인의 선별은 예를 들어, 치료될 암의 특정 유형에 따라 달라질 수 있다.
막통과 도메인
일반적으로, 본원에서 사용된 "막통과 도메인"은, 막에 존재하는 (예를 들어, 세포막의 일부 또는 전부를 통과하는) 속성을 갖는 도메인을 말한다. 인식된 바와 같이, 막통과 도메인에서 모든 아미노산은 막 내에 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 막통과 도메인은 지정된 단백질의 뻗은 구간(stretch) 또는 일부가 실질적으로 막 내에 존재하는 것을 특징으로 한다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 세포 단위 이하의(subcellular) 단백질 국재화(예를 들어, 막통과 국재화)를 예측하기 위한 다양한 알고리즘을 사용하여 분석될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 다른 것들 중에서 psort(PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org)를 포함한다.
본원에 기재된 항원 결합 수용체에 포함된 막통과 도메인의 유형은, 임의의 특정 유형에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 자연적으로 항원 결합 도메인 및/또는 세포내 도메인에 관련된 막통과 도메인이 선택된다. 일부 경우, 막통과 도메인은 하나 이상의 아미노산의 변형(예를 들어, 결실, 삽입, 및/또는 치환)을 포함하여, 예를 들어, 이러한 도메인이 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막통과 도메인에 결합하는 것을 피하고, 수용체 복합체의 다른 일원들과의 상호작용을 최소화한다.
막통과 도메인은 천연 또는 합성 공급원 중 하나로부터 유래할 수 있다. 천연 공급원인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막통과 단백질로부터 유래할 수 있다. 예시적인 막통과 부위는 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD27, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, TNFSFR25, 또는 CD154로부터 유래할 수 있다(예를 들어, 이들의 적어도 막통과 부위(들)을 포함할 수 있다). 대안적으로, 막통과 도메인은 합성될 수 있고, (예를 들어, 대부분 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 수 있다). 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막통과 도메인의 각 말단에 포함된다. 일부 구현예에서, 막통과 도메인은 세포질 도메인에 직접 연결된다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고-또는 폴리펩티드 링커(예를 들어, 2개 내지 10개의 아미노산 길이)는 막통과 도메인과 세포내 도메인 사이에 연결부를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신-세린 이중체이다.
세포질 도메인
세포내 도메인 (또는 세포질 도메인)은 표적 항원이 항원 결합 도메인에 결합할 때, 본원에 기재된 유도성 발현 제작물의 발현을 유도하는 세포내 신호전달 경로를 개시하고/거나 매개하는 신호전달 도메인을 포함한다.
항원이 면역 세포에 결합할 때 신호를 전달할 수 있는 세포내 신호전달 도메인은 알려져 있는데, 이들 중 어느 것도 본원에 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열은 항원에 대한 TCR의 결합 이후 신호 전달을 개시하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Brownlie 외, Nature Rev. Immunol. 13:257-269 (2013)] 참고). 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래한 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌[Love 외, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a002485 (2010)]; 문헌[Smith-Garvin 외, Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009)] 참고).
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포(예를 들어, CD8+ T 세포)에 의한 사멸 유도 신호를 전달하는 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, TCR 세포질 서열은 다수의 신호전달 경로들을 활성화시키는 것으로 열려져 있는데, 이들 중 일부는 사멸을 유도한다(예를 들어, 문헌[Smith-Garvin 외, Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009)] 참고). 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 (예를 들어, 도 2에 예시된 바와 같이) 유도성 발현 제작물의 발현을 매개하는 신호 전달을 유도하나, 사멸은 유도하지 않는 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포질 도메인은 항원 결합 도메인이 항원 결합을 할 때, 유도성 발현 제작물의 프로모터를 유도하는 세포내 신호를 유도하는 PDGF 수용체의 세포질 부분을 포함한다. 당업계의 숙련자는 당업계의 상식을 기초로 세포내 도메인 및 유도성 발현 제작물 내에 포함될 관련 프로모터를 선택할 수 있다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전 활성화에는 불충분하여, 제2 신호 또는 공동-자극성 신호도 또한 요구된다고 알려져 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 하나 이상의 면역 세포 효과기 기능(예를 들어, 본원에 기재된 자연적 면역 세포 효과기 기능)를 활성화하는 하나 이상의 추가적인 신호전달 부위(예를 들어, 공동자극성 신호전달 부위)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 공동자극성 신호전달 부위의 일부가 효과기 기능 신호를 전달하는 이상, 상기 일부가 사용될 수도 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포질 도메인은 T 세포 공동-수용체 (또는 이들의 절편)의 하나 이상의 세포질 서열을 포함한다. 이러한 T 세포 공동-수용체의 비-제한적인 예는, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), MYD88, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 특히 CD83에 결합하는 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 둘 이상의 신호전달 도메인은 서로 무작위 또는 특정 순서로 연결된다. 선택적으로, 짧은 올리고-또는 폴리펩티드 링커(예를 들어, 2개 내지 10개의 아미노산 길이)는 연결부를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 링커는 글리신-세린 이중체이다.
유도성 발현 제작물
일부 구현예에서, 본원에서 사용된 "유도성 발현 제작물(inducible expression construct)"은, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작용가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 핵산 서열이거나, 이를 포함할 수 있다. 유도성 발현 제작물은 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역의 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조절 서열은 적절한 경우 유도성 발현 제작물이 도입될 세포의 유형에 특이적이다. 일부 구현예에서, 이러한 조절 서열은 본원에 기재된 신호전달 도메인에 의해 유도된 신호전달 경로에 특이적이다.
유도성 발현 제작물은 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 핵산에 작용가능하게 연결된 자연적 또는 비-자연적 프로모터를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 면역 세포에서 기능성이다. 프로모터와 뉴클레오티드 서열 간의 작용가능한 연결은 숙련기술자의 상식 내에 있다. 프로모터는 비-바이러스성 프로모터 또는 바이러스성 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 또는 쥣과 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복부에서 발견된 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 예로서 NFAT, NF-κB, AP-1 또는 다른 인식 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 유도성 발현 제작물에 포함된 프로모터는, IL-2 프로모터, 세포 표면 단백질 프로모터(예를 들어, CD69 프로모터), 사이토카인 프로모터(예를 들어, TNF 프로모터), 세포 활성화 프로모터(예를 들어, CTLA4, OX40, CD40L), 또는 세포 표면 접착 단백질 프로모터(예를 들어, VLA-1 프로모터)이다. 특이적인 동역학의 활성화(예를 들어, 초기 및/또는 후기 활성화)를 갖고/거나, 특이적인 동역학의 유도된 유전자의 발현(예를 들어, 단기 또는 장기 발현)을 갖는, 프로모터, 예를 들어, 강한, 약한, 유도성, 조직-특이적인, 발생-특이적인 프로모터의 선별은, 통상의 숙련 기술자의 상식 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 수일동안 측정된 신속하고 지속된 발현을 매개한다(예를 들어, CD69). 일부 구현예에서, 프로모터는 후기-유도성(예를 들어, VLA1)이라고 명명된 지연된 발현을 매개한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 신속하고 일시적인 발현을 매개한다(예를 들어, TNF, 극 초기 반응 유전자 및 많은 다른 경우).
항원 결합 수용체에 항원이 결합할 때, 신호는 예를 들어, 알려진 경로를 사용하여, 본원에 기재된 항원 결합 수용체의 신호전달 도메인으로부터 유도성 발현 제작물로 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chow 외, Mol. 세포. Biol. 19:2300-2307 (1999)]; 문헌[Castellanos 외, J. Immunol. 159:5463-73 (1997); Kramer 외, JBC 270:6577-6583 (1995)]; 문헌[Gibson 외, J. Immunol. 179:3831-40 (2007)); Tsytsykova 외, J. Biol. Chem. 271:3763-70 (1996)]; 문헌[Goldstein 외, J. Immunol. 178:201-10 (2007)] 참고). 따라서, 항원이 결합할 때, 항원 결합 수용체는 (예를 들어, 본원에 기재된 프로모터에 대한 전사 인자가 결합함으로써) 이중파라토프 융합 단백질의 발현을 유도하는 신호 형질도입 경로를 활성화한다.
이중파라토프 융합 단백질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포성 치료제는 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 발현 제작물(예를 들어, 항시성 발현 제작물 또는 유도성 발현 제작물)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중파라토프 융합 단백질은 둘 이상의 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항체 절편, 예를 들어, Fab 절편, Fab' 절편, F(ab')2 절편, scFv 절편, Fv 절편, dsFv 디아바디, dAb 절편, Fd' 절편, Fd 절편, CDR 부위, 카멜로이드 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, Probody®), 단쇄 또는 연쇄반복 디아바디(TandAb®), VHH, Anticalin®, 단일-도메인 항체(예를 들어, Nanobody®), 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®, Avimer®, Adnectin®, Affilin®, Affibody®, Fynomer®, 또는 Centyrin®)), 및 적어도 하나의 폴리펩티드 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 항원 결합 단백질은 동일한 항원의 상이한 에피토프들에 결합한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 종양 항원(예를 들어, TAA 또는 TSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 이중파라토프 융합 단백질은 2개의 항체 절편과 적어도 하나의 추가적인 비-항체 폴리펩티드이거나, 또는 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 항원 결합 단백질은 제1 종양 항원에 결합하는 둘 이상의 항원 결합 단백질과, 제2 종양 항원에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중파라토프 융합 단백질은 scFv, VHH, 및 적어도 하나의 폴리펩티드 항원(예를 들어, CD19 또는 본원에 기재된 CD19 변이체)이거나, 이들을 포함한다.
둘 이상의 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 폴리펩티드 항원은, 이중파라토프 융합 단백질 내에서 임의의 순서로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 둘 이상의 항원 결합 단백질들 중 하나의 아미노 말단에 연결(예를 들어, 융합)된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 둘 이상의 항원 결합 단백질들 중 하나의 카르복실 말단에 연결(예를 들어, 융합)된다. 예를 들어, 항원 결합 단백질 A; 항원 결합 단백질 B; 및 폴리펩티드 항원을 포함하는 이중파라토프 융합 단백질은, 이하의 배치들 중 어느 것으로 배치될 수 있다: (i) 항원 결합 단백질 A-항원 결합 단백질 B-폴리펩티드 항원; (ii) 항원 결합 단백질 B-항원 결합 단백질 A-폴리펩티드 항원; (iii) 폴리펩티드 항원-항원 결합 단백질 A-항원 결합 단백질 B; (iv) 폴리펩티드 항원-항원 결합 단백질 B-항원 결합 단백질 A; (v) 항원 결합 단백질 B-폴리펩티드 항원-항원 결합 단백질 A; (vi) 항원 결합 단백질 A-폴리펩티드 항원-항원 결합 단백질 B. 예를 들어, scFv (예를 들어, 본원에 기재된 scFv), VHH (예를 들어, 본원에 기재된 VHH), 및 폴리펩티드 항원(예를 들어, 본원에 기재된 CD19 변이체)을 포함하는 이중파라토프 융합 단백질에서, 이중파라토프 융합 단백질은 이하의 배치들 중 어느 것으로 배치될 수 있었다: (i) scFv-VHH-폴리펩티드 항원; (ii) scFv-폴리펩티드 항원-VHH; (iii) VHH-scFv-폴리펩티드 항원; (iv) VHH-폴리펩티드 항원-scFv; (v) 폴리펩티드 항원-scFv-VHH; (vi) 폴리펩티드 항원-VHH-scFv.
폴리펩티드 항원
일부 구현예에서, 이중파라토프 융합 단백질 (또는 이들의 절편)은 세포성 치료제의 표면에 발현되고/거나, 세포성 치료제에 의해 분비되고/거나, 종양 세포의 표면에 결합한다. 어떠한 폴리펩티드 항원도 본원에 기재된 발현 제작물로부터 발현될 수 있지만, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이들의 절편), 항체 융합 단백질 또는 항체-약물 접합물)의 표적인(예를 들어, 이들에 결합하는) 이중파라토프 융합 단백질에 포함된 폴리펩티드 항원이 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 융합 단백질은 예를 들어, 공지된 치료 항체(예를 들어, ADCC 또는 CDC를 나타내는 것), 치료 융합 단백질, 또는 치료 항체-약물 접합물일 수 있다. 일부 구현예에서, CAR-보유 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 표적인(예를 들어, 이에 결합하는) 이중파라토프 융합 단백질에 포함된 폴리펩티드 항원이 선택된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 하나 이상의 공지의 항-종양 항체에 결합한다. 유용한 항-종양 항체에 대해 기재하는 다양한 검토 논문들이 공개되었다(예를 들어, 문헌[Adler 외, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26:447-81 (2012)]; 문헌[Li 외, Drug Discov. Ther. 7:178-84 (2013)]; 문헌[Scott 외, 암 Immun. 12:14 (2012)]; 및 문헌[Sliwkowski 외, Science 341:1192-1198 (2013)] 참고). 표 1은 공지된 이용가능한 항체 제제가 표적화하는 특정 인간 폴리펩티드 항원의 비-완전한 목록을 제시하며, 이에 대해 항체 제제가 유용할 것으로 제안되었던 특정 암의 지표에 대해 나타낸다:
표 1
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질 (또는 하나 이상의 이러한 폴리펩티드 항원을 암호화하는 발현 제작물(예를 들어, 항시성 발현 제작물 또는 유도성 발현 제작물)), 또는 이러한 발현 구조체를 포함하는 세포성 치료제는, 하나 이상의 이러한 (또는 다른) 공지의 항체, 또는 이들의 절편과 함께 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질 (또는 하나 이상의 이러한 폴리펩티드 항원을 암호화하는 발현 제작물(예를 들어, 항시성 발현 제작물 또는 유도성 발현 제작물)), 또는 이러한 발현 구조체를 포함하는 세포성 치료제는, 하나 이상의 이들 (또는 다른) 공지된 항체, 또는 이들의 절편을 발현하는 세포성 치료제(예를 들어, CAR-T 세포)와 함께 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 공지된 항체-약물 접합물에 결합하는 폴리펩티드 항원이, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질에 포함될 수도 있다. 항체-약물 접합물은 알려져 있는데, 예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)(ADCETRIS® Seattle Genetics); 아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab)(KADCYLA® Roche); 겜투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin)(Wyeth); CMC-544; SAR3419; CDX-011; PSMA-ADC; BT-062; 및 IMGN901 (예를 들어, 문헌[Sassoon 외, Methods Mol. Biol. 1045:1-27 (2013)]; 문헌[Bouchard 외, Bioorganic Med. Chem. Lett. 24: 5357-5363 (2014)] 참고)을 포함한다. 이러한 일부 경우, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질 (또는 하나 이상의 이러한 폴리펩티드 항원을 암호화하는 발현 구조체(예를 들어, 항시성 발현 제작물 또는 유도성 발현 제작물), 또는 이러한 발현 제작물을 포함하는 세포성 치료제는, 하나 이상의 이들 (또는 다른) 공지된 항원-약물 접합물과 함께 대상체에 투여된다.
CD19
일부 구현예에서, 이중파라토프 융합 단백질에 포함된 폴리펩티드 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19 또는 이들의 절편을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19 변이체 또는 이들의 절편을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 세포외 도메인 (ECD) 또는(of) 이의 절편, CD19 또는 CD19 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 FMC63에 의해 인식된 에피토프를 포함한다(문헌[Nadler, Lee M "B Cell/Leukemia Panel Workshop: Summary and Comments" Leukocyte Typing II Ed. E. L. Reinherz 외, New York, 1986]; 문헌[Zola 외, Immunol Cell Biol. 69: 411-422]; 문헌[Nicholson 외, Mol Immunol. 34: 1157-1165]).
CD19는 B 세포 발달의 생체마커로서 사용된 95 kDa의 유형 I 막통과 당단백질이다(Wang 외, Exp. Hematol. Oncol. 1:36 (2012)). 림프종 및 백혈병에서의 CD19 발현은, 이들이 특히 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 치료에 대한 효과적인 치료 표적이 되게 한다(Maude 외, Blood 125:4017-4024 (2015)). CAR-T 세포 치료에서의 CD19의 독특하게 효과적인 성과에 기초하여, 종양 생체마커에 직접 결합하도록 조작된 항체-CD19 융합체 또는 CD19 변이체를 사용하여, CD19-종양을 CD19+ 종양으로 "전환시키는" 것에 관여하는 치료적 접근법이 설명되었다(예를 들어, WO2017/075537 및 WO2017/075533 참고). 이러한 맥락에서, CD19 세포외 부위의 적절한 폴딩, 생물학적 에피토프의 제시 및 안정성을 포함하는 구조적 무결성이 분자 치료의 성과에 중요할 수 있다.
CD19의 세포외 부위가 2개의 C2-유사 이뮤노글로불린 도메인을 함유한다는 가설을 세웠다(예를 들어, 문헌[Wang 외, Exp. Hematol. Oncol. 1:36 (2012)]; 문헌[Tedder 외, Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577 (2009)] 참고). 이것은 상동성 모델링에 의해 뒷받침된다(Soding 외, Nucleic Acids Res. 33:244-248 (2005))(도 3 참고). 그러나, 최근 공개된 구조는 CD19가 C2-유사 이뮤노글로빈 도메인을 포함하지 않는다는 사실을 입증한다(Teplyakov 외, Proteins 86:495-500 (2018)).
인간 CD19의 뉴클레오티드 서열, 뿐만 아니라 CD19의 특이적인 도메인의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다(Genbank Accession No. M84371.1 참고). 예를 들어, CD19의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 이하와 같다:
Figure pct00003
Figure pct00004
CD19의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 이하와 같다:
Figure pct00005
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질은 하나 이상의 CD19 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 전체 길이의 CD19 폴리펩티드 또는 이의 일부이거나, 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 세포외 도메인 또는 이의 일부이거나, 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 C-말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 그 이상의 아미노산이 결핍된 CD19 세포외 도메인이거나, 이를 포함하고, 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a-도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 서열 번호: 2의 이하의 아미노산 위치들 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 39, 45, 47, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 68, 70, 72, 84, 90, 93, 94, 99, 100, 105, 108, 111, 113, 114, 115, 122, 123, 124, 125, 127, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 154, 167, 169, 171, 185, 189, 193, 194, 196, 198, 202, 204, 206, 207, 209, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 232, 235, 240, 243, 247, 249, 250, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 264, 265, 269, 또는 271. 이들 위치에서의 예시적인 아미노산 치환은, 표 1A, 표 2A, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a-도 5d, 또는 도 6에 나타나 있다. 일부 구현예에서, CD19 변이체는 (WT CD19에 비해) 항-CD19 항체(예를 들어, FMC63 또는 4G7)에 대한 결합이 증가하였고; (WT CD19에 비해)(예를 들어, 표준 검정을 사용할 때) 단백질 용해에 대한 내성이 증가하였고/거나; (예를 들어, 표준 검정을 사용할 때) 열 스트레스 하에서 (WT CD19에 비해) 발현이 개선되었다.
일부 구현예에서, CD19 변이체는 표 6에 나타난 바와 같이, 이하의 위치들 중 하나 이상에서 이하의 아미노산 치환들 중 하나 이상을 포함한다:
표 6
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
일부 구현예에서, CD19 변이체는 서열 번호: 2의 이하의 아미노산 위치들의 세트 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 5/7/9; 14/16/18; 29/31; 29/31/33; 35/37/39; 45/47/49; 52/54/56; 59/61/63; 62/64/66; 76/78/80; 86/88/90; 167/169/171; 175/177/179; 193/195/197; 206/208/210; 207/209/211; 219/221/223; 240/243; 224/226/228; 247/249/251; 253/255/256; 255/256; 또는 261/262/264/265. 이 위치들의 세트에서 예시적인 아미노산 치환은, 표 1B, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 4b, 도 3, 도 5a 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나타나 있다.
표 1A -FMC63 및 4G7에 대한 결합이 향상된 단일 돌연변이체:
Figure pct00011
표 1B: FMC63 및 4G7에 대한 결합이 향상된 삼중 돌연변이체:
Figure pct00012
표 2A: 단백질 분해에 대한 내성이 개선된 단일 돌연변이체.
Figure pct00013
표 2B: 단백질 분해에 대한 내성이 개선된 삼중 돌연변이체.
Figure pct00014
TABLE 3: 열 스트레스 하에서 발현이 개선된 돌연변이체.
Figure pct00015
항-CLL-1 항체
일부 구현예에서, 발현된 이중파라토프 융합 단백질은 CLL-1에 결합하는 둘 이상의 항체, 또는 이의 절편을 포함할 수 있다. MICL 또는 CLEC12A라고도 또한 알려진 인간 C-형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1)은, II형 막통과 당단백질이고, 면역 조절에 관여하는 C-유형 렉틴-유사 수용체의 큰 패밀리의 일원이다. CLL-1은 이전에 골수-유래 세포로부터 확인되었었다. CLL-1의 세포내 도메인은 이뮤노티로신-계 저해 모티프(ITIM) 및 YXXM 모티프를 함유한다. 다양한 세포 상의 ITIM-함유 수용체의 인산화는, 단백질 티로신 포스포타제(phosphatase) SHP-1, SHP-2 및 SHIP의 소집을 통해 활성화 경로를 저해한다. YXXM 모티프는 세포 활성화 경로에 관여되었던 PI-3 키나제,13의 p85 하위 단위에 대한 잠재적인 SH2 도메인-결합 부위를 갖는데, 이는 골수 세포에서 저해 및 활성화 분자로서의 CLL-1의 잠재적인 이중 역할을 나타낸다. 확실히, CLL-1과 SHP-1 및 SHP-2와의 연결은 형질감염된 세포주 및 골수-유래 세포주에서 실험적으로 입증되었다.
항체는 예를 들어, 무손상 IgG, IgE 및 IgM, 이중-또는 다중-특이적인 항체(예를 들어, 이중파라토프, Zybodies® 등), 단쇄 Fv, 폴리펩티드-Fc 융합체, Fab, 카멜로이드 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®), Small Modular ImmunoPharmaceuticals("SMIPsTM"), 단쇄 또는 연쇄반복 디아바디(TandAb®), VHH, Anticalins®, Nanobodies®, 미니바디, BiTE®, 안키린 반복 단백질, 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR-유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, MicroProtein, Fynomers®, Centyrins® 및 KALBITOR®를 포함한다.
일부 구현예에서, 이중파라토프 융합 단백질은 적어도 2개의 항체(또는 항체 절편)을 포함하고, 이들 각각은 CLL-1/CLEC12A에 결합한다. 항-CLL-1 항체(및 절편, 예를 들어, scFv)이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 이중파라토프 융합 단백질은 CLL-1/CLEC12A, 예를 들어, 미국 특허 제7,741,443호; 문헌[Kenderian 외, Blood 2016 128:766]; 문헌[Laborda 외, Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2259]; 문헌[Tashiro 외, Mol. Ther. Vol. 25 No 9, 2202-2213, 2017]; 문헌[Wang 외, J Hematol Oncol. 2018 Jan 10;11(1):7]; 문헌[Lu 외, Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Sep 8;53(37):9841-5]; 국제 특허 출원 WO2016120219; 국제 특허 출원 WO2013169625에 개시된 서열 및 항체 또는 이들의 절편에 결합하는 하나 이상의 scFv를 포함한다.
항-CLL-1 단일 도메인 항체
일부 구현예에서, 항체는 단일 도메인 항체이다. 단일 도메인 항체는 이의 상보성 결정 부위가 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이다. 예는 중쇄 항체, 자연적으로 경쇄가 없는 항체, 종래의 4-사슬 항체로부터 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래한 것이 아닌 단일 도메인 스캐폴드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단일 도메인 항체는 당업계에 알려진 임의의 것, 또는 임의의 장래의 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 카멜, 라마, 염소, 토끼, 소를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다. 본 개시 내용의 일 양태에 의하면, 본원에서 사용된 단일 도메인 항체는 경쇄가 없는 중쇄 항체라고도 알려진 자연 발생적인 단일 도메인 항체이다. 이러한 단일 도메인 항체는 예를 들어, WO 94/04678에 개시되어 있다. 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체로부터 유래한 이러한 가변 도메인은, 본원에서 "VHH" 또는 "나노바디(nanobody)"로도 지칭된다. 이러한 VHH 분자는 낙타과(Camelidae)의 종, 예를 들어 낙타, 단봉 낙타(dromedary), 라마, 비쿠냐(vicuna), 알파카 및 과나코(guanaco)에서 발생한 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종(예를 들어, 인간)은 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산할 수 있고; 이러한 VHH는 본 개시 내용의 범주 내에 있다.
낙타과로부터의 VHH 도메인의 아미노산 잔기는, 문헌[Kabat 외, "Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH(메릴랜드주 베세즈다 소재), Publication No 91-3242 (1991)]에 제공된 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링(numbering)에 따라 넘버링되며; 또한 문헌[Riechmann 외, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999)]을 참고한다. 이러한 넘버링에 의하면, FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, FR3는 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR3는 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다.
그러나, (VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이), 각각의 CDR에서의 아미노산 잔기의 총 수는 달라질 수 있으며, Kabat 넘버링에 의해 나타난 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에 매치되지(occupied) 않을 수 있거나, 또는 실제 서열은 Kabat 넘버링에 의해 허용된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수도 있다)는 사실을 주목해야 한다. 이것은 일반적으로, Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서의 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응하거나, 또는 상응하지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 대안적인 방법이 당업계에 알려져 있는데, 상기 방법은 또한 VHH 도메인에 대해서도 유사한 방식으로 적용될 수 있다. 그러나, 달리 지시된 바 없는 경우, 본 개시내용, 청구항 및 도에서는 Kabat에 의하며, 상기 기재된 VHH 도메인에 적용된 넘버링을 따를 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질은 하나 이상의 항-CLL-1 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CLL-1 단일 도메인 항체는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이들의 절편(예를 들어, 이들의 CLL-1 결합 절편)을 갖는 VHH이거나, 이를 포함한다. 본원에 제공된 서열 목록에 나타난 바와 같이, 서열 번호: 203-225 각각은 N-말단에 VHH 아미노산을 포함하고, C-말단에 이하의 아미노산을 포함한다: (i) 9개 아미노산의 링커(TSGPGGQGA), (ii) myc-태그(EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커(GA), (iv) 6개-히스티딘 태그(HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산(GAS). 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 상기 일부에는 (i)-(v) 중 하나 이상이 없고/거나, ((i)-(v) 중 하나 이상의 일부가 없다). 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 갖는 VHH를 포함하는 항체이거나, 이를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 없다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 상기 일부에는 (i)-(v) 중 하나 이상이 없고/거나 ((i)-(v) 중 하나 이상의 일부가 없고), 상기 일부에는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)의 추가적인 아미노산(즉, (i)-(v)에 포함된 아미노산이 아닌 아미노산)이 없다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 없고, 상기 일부에는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)의 추가적인 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없고, 상기 일부에는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)의 추가적인 아미노산이 없다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 일부에는 (i)-(v) 중 하나 이상이 없고/거나, ((i)-(v) 중 하나 이상의 일부가 없다). 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 없다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 일부는 (i)-(v) 중 하나 이상이 없고/거나 ((i)-(v) 중 하나 이상의 일부가 없고), 상기 일부에는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)의 추가적인 아미노산(즉, (i)-(v)에 포함된 아미노산이 아닌 아미노산)이 없다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하되, 여기에서 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 중 하나 이상이 없고, 상기 일부에는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또 그 이상)의 추가적인 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 여기에서 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없고, 상기 일부에는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)의 추가적인 아미노산이 없다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나에 나타난 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)을 포함하는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나에 나타난 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 일부를 포함하는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공하는데, 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나에 나타난 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나에 나타난 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 적어도 하나의 CDR을 포함하는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 서열 번호: 203-225 중 어느 하나에 나타난 적어도 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 일부와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 포함하는데, 상기 일부에는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나에 나타난 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산이 없다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 그룹 1-13 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 나타내는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 (i) CDR1 및 CDR2; (ii) CDR2 및 CDR3; (iii) CDR1 및 CDR3; 또는 (iv) 그룹 1-13 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 (예를 들어, 여기에서 CDR은 특정 그룹으로부터 유래하거나, 또는 상기 CDR은 둘 이상의 상이한 그룹들로부터 선택됨)을 포함하는 VHH이거나, 이를 포함하는 항체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 제공한다. 표 5A:
Figure pct00016
표 5B: IMGT 넘버링 및 ANARCI 소프트웨어 (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/ANARCI.php)에 기초하여 확인된 CDR.
Figure pct00017
당업계의 숙련자가 이해하는 바와 같이, 임의의 이러한 CDR 서열은 본원에 개시되거나 그렇지 않다면 당업계에 알려진 임의의 형식의 항체 또는 결합 분자에 존재할 수 있으므로, 예를 들어, 분자 생물학 기술을 사용하여, 본원에 개시되거나 그렇지 않다면 당업계에 알려진 임의의 프레임워크 부위, CDR, 또는 불변 도메인, 또는 이들의 일부를 포함하는 본원에 제공되거나 그렇지 않다면 당업계에 알려진 임의의 다른 항체 서열 또는 도메인과 용이하게 조합될 수 있다.
항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 본원에 기재된 항체의 결합 특성들은, 당업계에 알려진 방법, 예를 들어, 이하의 방법들 중 하나에 의해 측정될 수 있다: BIACORE 분석, 효소 연결 면역흡착 검정법(ELISA), x-선 크로마토그래피, 서열 분석 및 주사 돌연변이 유발(scanning mutagenesis). 항체와 항원(예를 들어, CLL-1)의 결합 상호작용은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 분석될 수 있다. SPR 또는 생체분자 상호작용 분석(BIA)은 어떠한 반응물(interactant)도 표지하지 않고, 생체-특이적인 상호작용을 실시간으로 탐지한다. BIA 칩의 결합 표면에서의 질량 변화(결합 사건의 지표)는, 표면 근처의 빛의 굴절 지수를 변화시킨다. 굴절성의 변화는 탐지가능한 신호를 생성하며, 이는 생물학적 분자들 사이의 실-시간 반응의 지표로서 측정된다. SPR를 사용하기 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,641,640호; 문헌[Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag]; 문헌[Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345]; 문헌[Szabo 외 (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705] 및 BIAcore International AB (스웨덴 웁살라 소재)에 의해 제공된 온-라인 자원에 기재된다. 추가적으로, Sapidyne Instruments (Boise, Id.)로부터 이용가능한 KinExA® 검정(역학적 배제 검정법(Kinetic Exclusion Assay))도 또한 사용될 수 있다.
SPR로부터 얻은 정보를 사용하여, 항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 항체의 결합에 대한 평형 해리 상수 (KD), 및 Kon 및 Koff를 포함하는 동역학적 변수들의 정확하고 정량적인 측정치를 제공할 수 있다. 이러한 데이터는 상이한 분자들을 비교하는데 사용될 수 있다. SPR로부터 얻은 정보는 또한 구조-활성 관계 (SAR)를 개발하는데 사용될 수도 있다. 특정 결합 변수들, 예를 들어, 높은 친화도와 관련된 소정의 위치의 변이체 아미노산을 식별할 수도 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 결합 시 높은 친화성을 나타낸다. 다양한 구현예에서, 항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 본원에 기재된 항체의 KD는, 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10, 10-11, 10-12 M, 10-13 M, 10-14 M, 또는 10-15 M 미만이다. 특정 경우에, 항원(예를 들어, CLL-1)에 대한 본원에 기재된 항체의 KD는, 0.001 내지 1 nM, 예를 들어, 0.001 nM, 0.005 nM, 0.01 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 또는 1 nM이다.
다른 항체
예로 든 이중파라토프 융합 단백질이 CLL-1에 결합하는 항체를 포함하기는 하지만, 이중파라토프 융합 단백질은 표 1에 나열된 예시적인 항체를 포함하는 하나 이상의 종양 항원에 결합할 수 있는 어떠한 항체도 포함할 수 있다. 종양 항원들이 당업계에 알려져 있는데, 예를 들어, 신경교종-관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 생식샘 자극 호르몬(chorionic gonadotropin), 알파 태아단백질 (AFP), 렉틴(lectin)-반응성 AFP, 티로글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제(telomerase) 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장의 카르복실 에스터라제(carboxyl esterase), mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 전립선-특이적인 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1α p53, 프로스테인(prostein), PSMA, Her2/neu, 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제(elastase), ephrinB2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체, 및 메소텔린(mesothelin)을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프이거나, 이를 포함한다. 이러한 에피토프를 포함하는 악성 종양 항원은, 예를 들어, 조직-특이적인 항원, 예컨대 흑색종에서의 MART-1, 티로시나제 및 GP 100, 및 전립선 암에서의 전립선산 포스포타제(prostatic acid phosphatase, PAP) 및 전립선-특이적인 항원(PSA)을 포함한다. 다른 종양 항원은 형질전환-관련 분자의 그룹, 예컨대 종양 유전자 HER-2/Neu/ErbB-2에 속한다. 종양 항원의 또 다른 그룹은 종양-태아 항원, 예컨대 암배아 항원(CEA)이다. B-세포 림프종에서, 종양-특이적인 이디오타입의 이뮤노글로불린은 개별적 종양 고유의 종양-특이적인 이뮤노글로불린 항원을 구성한다. B-세포 차등 항원, 예컨대 CD19, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종의 다른 종양 항원이다. 이 항원들(예를 들어, CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입) 중 일부는, 단일클론 항체에 의한 수동적 면역치료에 대한 표적으로 사용되었으나, 성공은 제한적이었다.
본원에 기재된 종양 항원은 종양-특이적인 항원(TSA) 또는 종양-관련 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포 고유의 것이거나 (또는 고유의 것으로 생각되며), 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는다(예를 들어, 다른 세포에서는 유의한 수준으로 발생하지 않는다). TAA는 종양 세포 고유의 것이 아니고, 그 대신 정상 세포에서도 또한 발현된다(예를 들어, 항원에 대해 면역 관용의 상태를 유도하는데 실패한 조건 하에서 발현된다). 예를 들어, TAA는 면역계가 미성숙되어, 반응할 수 없을 때 배아의 발생 동안 정상 세포에서 발현된 항원일 수 있거나,또는 이들은 정상 세포에서는 통상 극히 낮은 수준으로 존재하나, 종양 세포에서는 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적인 예는, 차등 항원, 예컨대 MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적인 다계통 항원, 예컨대 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; 과다발현된 배아 항원, 예컨대 CEA; 과다발현된 종양 유전자 및 돌연변이된 종양-억제자 유전자, 예컨대 p53, Ras, HER-2/neu; 염색체 전좌로부터 발생한 고유의 종양 항원, 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7을 포함한다. 다른 종양 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, erbB, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아 단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, 공동-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린(cyclophilin) C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, MUC16, IL13Rα, FRα VEGFR2, Lewis Y, FAP, EphA2, CEACAM5, EGFR, CA6, CA9, GPNMB, EGP1, FOLR1, 내피 수용체, STEAP1, SLC44A4, 넥틴(Nectin)-4, AGS-16, 구아날릴 사이클라제(guanalyl cyclase) C, MUC-1, CFC1B, (a3b1, 라미닌 수용체 사슬의) 인테그린 알파 3 사슬, 및 TPS을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD72, CD180, CD171(L1CAM), CD123, CD133, CD138, CD37, CD70, CD79a, CD79b, CD56, CD74, CD166, CD71, CLL-1/CLECK12A, ROR1, 글리피칸(Glypican) 3(GPC3), 메소텔린, CD33/IL3Ra, IL1RAP, c-Met, PSCA, PSMA, 글리코리피드 F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1, 또는 MAGE A3이다. 추가적인 종양 항원은 예를 들어, 종양 게놈 및 엑솜을 시퀀싱함으로써, 그리고/또는 종양 프로테옴의 고-민감성 질량 분광측정 분석에 의해 식별될 수 있으며, 이들 중 어느 것도 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 다른 종양 항원은 예를 들어, WO2017/075537에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 예를 들어, 모든 세포에서 발견된 일반적인 또는 "하우스키핑(housekeeping)" 막 단백질이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 종양 줄기 세포 마커이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 신생항원(즉, 예를 들어, 비정상적 증식 때문에 종양 자체에서 발생하는 항원)이다.
절단성 링커를 갖는 이중파라토프 융합 단백질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 이중파라토프 융합 단백질은 융합 단백질의 임의의 요소들(예를 들어, scFv, VHH, CD19 변이체) 사이에 링커를 포함할 수 있다. 링커를 포함하는 융합 단백질을 제조하기 위한 다양한 적합한 링커 및 방법은 당업계에 알려져 있다. 링커는 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 예를 들어, 세포내 조건 하에서 절단될 수 있어서, 이러한 링커의 절단은 융합 파트너를 방출시킨다. 링커는 예를 들어, 아미노펩티다제, 플라스민, 및 키닌-칼리크레인(kinin-kallikrein)을 포함하나 이에 제한되지 않는 혈장 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 종양 관련 프로테아제, 예를 들어, 마트립타제(matriptase), 카텝신 B에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양-관련 프로테아제에 의한 절단은 CD19에서 배열 변화를 유도하여, CAR 에피토프를 결합시키고/거나, CAR 에피토프를 발현시켜 사멸이 되도록 한다. 일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 P2A이다.
마스킹된 이중파라토프 융합 단백질
일부 구현예에서, 발현된 이중파라토프 융합 단백질은 본원에 기재된 하나 이상의 항원-결합 단백질(들)(예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 항체 절편)의 마스킹된 버전이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현된 이중파라토프 융합 단백질은 본원에 기재된 항체 또는 항체 절편의 마스킹된 버전을 포함하다(예를 들어, 예를 들어, 문헌[Sandersjoo 외 Cell. Mol. Life Sci. (2015) 72:1405-1415]; US 2015/0183875; US 8,513,390; 및 US 9,120,853에 기재된 Probody®). 일부 구현예에서, 마스킹된 융합 단백질은 항체 또는 이들의 절편, 마스킹 모이어티, 절단성 모이어티 및/또는 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 마스킹된 융합 단백질은 둘 이상의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 또는 이들의 절편), 및 하나의 마스킹 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 절편)에 커플링된 아미노산 서열이며, 이것이 표적에 대하여 특이적으로 결합하는 단백질의 능력을 감소시키도록(항원-결합 단백질을 "마스킹하도록") 위치한다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 링커에 의해 항원-결합 단백질에 커플링된다. 일부 구현예에서, 마스킹된 항원-결합 단백질의 이의 표적에 대한 특이적인 결합은, "마스킹되지 않은" 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적인 결합에 비해, 또는 모 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적인 결합에 비해 감소되거나, 저해된다. 일부 구현예에서, 마스킹된 항원-결합 단백질은 예를 들어, 생체내에서 또는 (US 8,513,390에 기재된) 표적 이동(Target Displacement) 시험관내 면역흡착성 검정에서 측정할 때, 표적에 대한 측정가능한 결합이 없거나, 실질적으로 측정가능한 결합이 없음을 나타내고/거나, 예를 들어, 적어도 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 28 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 48 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간 동안, 또는 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 60일, 90일, 120일, 150일, 180일 동안, 또는 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월 또는 그 이상 동안 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질의 표적에 대한 결합, 또는 모 항원-결합 단백질의 표적에 대한 결합에 비해, 표적에 대해 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 이하의 결합을 나타낸다.
일부 구현예에서, 마스킹된 항원-결합 단백질의 이의 표적에 대한 특이적인 결합은, 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적인 결합에 비해, 또는 모 항원-결합 단백질의 표적에 대한 특이적인 결합에 비해 감소되거나, 저해된다. 표적에 대한 마스킹된 항원-결합 단백질의 Kd는, 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질, 또는 모 항원-결합 단백질보다 적어도 5 배, 10 배, 25 배, 50 배, 100배, 250 배, 500 배, 1,000 배, 2,500 배, 5,000 배, 10,000 배, 50,000 배, 100,000배, 500,000 배, 1,000,000 배, 5,000,000 배, 10,000,000 배, 50,000,000 배 또는 그 이상, 또는 5-10배, 10-100 배, 10-1,000 배, 10-10,000 배, 10-100,000 배, 10-1,000,000 배, 10-10,000,000 배, 100-1,000 배, 100-10,000 배, 100-100,000 배, 100-1,000,000 배, 100-10,000,000 배, 1,000-10,000 배, 1,000-100,000 배, 1,000-1,000,000 배, 1000-10,000,000 배, 10,000-100,000 배, 10,000-1,000,000 배, 10,000-10,000,000 배, 100,000-1,000,000 배, 또는 100,000-10,000,000 배 더 클 수 있다. 역으로, 마스킹된 항원-결합 단백질의 표적에 대한 결합 친화도는, 마스킹되지 않은 항원-결합 단백질, 또는 모 항원-결합 단백질보다 적어도 5 배, 10 배, 25 배, 50 배, 100 배, 250 배, 500 배, 1,000 배, 2,500 배, 5,000 배, 10,000 배, 50,000 배, 100,000 배, 500,000 배, 1,000,000 배, 5,000,000 배, 10,000,000 배, 50,000,000 배 또는 그 이상, 또는 5-10 배, 10-100 배, 10-1,000 배, 10-10,000 배, 10-100,000 배, 10-1,000,000 배, 10-10,000,000 배, 100-1,000 배, 100-10,000 배, 100-100,000 배, 100-1,000,000 배, 100-10,000,000 배, 1,000-10,000 배, 1,000-100,000 배, 1,000-1,000,000 배, 1000-10,000,000 배, 10,000-100,000 배, 10,000-1,000,000 배, 10,000-10,000,000 배, 100,000-1,000,000 배, 또는 100,000-10,000,000 배 더 작을 수 있다.
마스킹 모이어티는 당업계에 알려져 있는데, 예를 들어, 항체 또는 이의 절편의 공지된 결합 파트너를 포함한다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 항원-결합 단백질의 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 부분(예를 들어, 항원 결합 루프)에 있는 아미노산 서열이다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 한 쌍 이상의 시스테인 잔기이거나, 이를 포함하여, 예를 들어, 한 쌍의 시스테인들 사이에 디설파이드 결합을 형성한다. 이러한 일부 구현예에서, 디설파이드 결합은 형태적으로 구속되는 구조를 생성할 수 있는데, 예를 들어, 환원제에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 "마스킹되지 않을" 수 있다. 예시적인 마스킹 모이어티는, 예를 들어, 문헌[Sandersjoo 외 Cell. Mol. Life Sci. (2015) 72:1405-1415]; US 2015/0183875; US 8,513,390; 및 US 9,120,853에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 마스킹된 이중파라토프 융합 단백질은 하나 이상의 항원 결합 단백질 상의 마스킹 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 발현된 이중파라토프 융합 단백질에 포함된 하나 이상의 항원 결합 단백질의 N-말단에 있다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 발현된 이중파라토프 융합 단백질에 포함된 하나 이상의 항원 결합 단백질의 C-말단에 있다. 일부 구현예에서, 마스킹된 항체는 하나 이상의 절단성 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 절단성 모이어티는 예를 들어, 하나 이상의 프로테아제(protease), 예컨대 하나 이상의 세포외 프로테아제에 대한 기질로서 작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 서열이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단성 모이어티는 환원제의 작용에 의해 절단될 수 있는, 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 한 쌍의 시스테인-시스테인이거나, 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 절단성 모이어티는 광분해(photolysis) 시 절단될 수 있는 기질이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 절단성 모이어티는 항체, 또는 이들의 절편의 원하는 표적을 갖는 조직 내 또는 이에 인접한 프로테아제의 존재에 기초하여 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 조직은 암 조직이다. 다수의 암, 예를 들어, 고형 종양 내의 기질을 갖는 프로테아제가 당업계에 알려져 있다, (예를 들어, 문헌[La Rocca et al, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421] 참고). 일부 구현예에서, 절단성 모이어티는 예를 들어, 레구마인(legumain), 플라스민(plasmin), TMPRSS-3/4, MMP-9, MT1-MMP, ADAM(디스인테그린(disintegrin) 및 및 메탈로프로테이나제(metalloproteinase), 예를 들어, ADAMs1-20, 예를 들어, ADAM8, ADAM10, ADAM17), 카텝신(cathepsin)(예를 들어, 카텝신 A, B, C, D, E, F, G, H, L, K, O, S, V, 또는 W(Tan 외, World J. Biol. Chem. 4:91-101 (2013)), 카스파제, 인간 호중구 엘라스타제, 베타-세크레타제(secrease), 마트립타제(matriptase), uPA, 또는 PSA에 대한 표적이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 마스킹된 융합 단백질은 링커, 예를 들어, 마스킹 모이어티 및/또는 절단 모이어티에 대한 C-말단 및/또는 N-말단을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 마스킹 모이어티에 대한 유용성을 제공하여, 항원-결합 단백질의 이의 표적에 대한 결합을 반대로 저해할 수 있다. 적합한 링커는 용이하게 선택될 수 있고, 임의의 적합한 상이한 길이, 예컨대 1개 아미노산(예를 들어, Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개의 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산일 수 있는데, 4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산, 또는 7개 아미노산 내지 8개 아미노산을 포함하며, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 아미노산일 수도 있다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 폴리펩티드 링커를 통해 항원-결합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단백질에 마스킹 모이어티를 융합시키는데 사용된 링커는, 본원에 기재된 절단성 모이어티이다. 일부 구현예에서 마스킹 모이어티는 직접 또는 링커에 의해, 항원-결합 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 마스킹 모이어티는 직접 또는 링커에 의해, 항원-결합 단백질의 C-말단에 융합된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 마스킹된 융합 단백질은 추가적으로 또는 대안적으로 공지된 방법을 사용하여 생산되고/거나, 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 생산되고/거나 정제된 마스킹된 융합 단백질은, 본원에 기재된 바와 같이, 단백질 치료제로서 사용될 수 있다.
세포성 치료제의 생산 방법
일반적으로, 본원에 기재된 세포성 치료제는 면역 세포, 예를 들어, 적응 세포 치료에서 유용하거나 적응 세포 치료에 사용할 수 있는 면역 세포로부터 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포성 치료제는 TIL, T-세포, 바이러스 특이적인 T 세포(VST), CD8+ 세포, CD4+ 세포, NK-세포, 델타-감마 T-세포, 조절 T-세포, 말초혈 단핵 세포 또는 IPSC 유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 유형으로부터 생산된다. 본원에서 사용된 "종양-침윤 림프구" 또는 TIL은, 혈류를 떠나서, 종양으로 이동하는 백혈구를 말한다. 림프구는 B 세포, T 세포 및 자연 살해 세포를 포함하는 3개의 그룹으로 나눌 수 있다. 본원에서 사용된 "T-세포"는, CD4+ 도움 세포, CD8+ 세포독성 T-세포 및 델타-감마 T 세포를 포함하는 CD3+ 세포를 말한다.
특정 구현예에서, 세포성 치료제는 세포, 예를 들어, 면역 세포를, 항원 결합 수용체를 암호화하는 핵산 및/또는 본원에 기재된 발현 제작물에 의해 유전적으로 변형시킴으로써(예를 들어, 형질전환시킴으로써) 생산된다(예를 들어, (i) 항원 결합 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 유도성 발현 제작물을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터, (ii) 항원 결합 수용체를 암호화하는 핵산과 유도성 발현 제작물을 둘 다 포함하는 단일 재조합 발현 벡터; 또는 (iii) 항시적 발현 제작물을 포함하는 재조합 발현 벡터). 재조합 발현 벡터는 DNA 및 RNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이들은 단일-가닥 또는 이중-가닥이거나, 합성되거나, 또는 부분적으로 천연 공급원으로부터 얻을 수 있으며, 자연적인, 비-자연적인 또는 변형된 뉴클레오티드을 함유할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 자연-발생적인 뉴클레오티드 또는 비-자연-발생적인 뉴클레오티드 간의 연결, 또는 상기 두 유형의 연결을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 전이 인자이거나, 이를 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 전파 및 확장, 또는 발현, 또는 둘 다를 위해 디자인된 것들, 예컨대 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences, 메릴랜드주 글렌 버니 소재), pBluescript 시리즈(Stratagene, 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈(Novagen, 위스콘신주 메디슨 소재), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 및 pEX 시리즈(Clontech, 캘리포니아주 팰로앨토 소재)로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149도 또한 사용될 수 있다. 본 개시 내용의 맥락에서 유용한 식물 발현 벡터의 예는, pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 본 개시 내용의 맥락에서 유용한 동물 발현 벡터의 예는, pcDNA, pEUK-Cl, pMAM, 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중시스트론(bicistronic) IRES 벡터(예를 들어, Clontech)는 항원 결합 수용체를 암호화하는 핵산 및 본원에 기재된 유도성 발현 제작물을 둘 다 포함하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 알파바이러스, 백시니아, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 계두 바이러스 벡터를 제한 없이 포함하고, 바람직하게는 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 형질전환시키는 자연적 또는 조작된 능력을 갖는다
재조합 발현 벡터는 예를 들어, 문헌[Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001]; 및 문헌[Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994]에 기재된 표준 재조합 DNA 또는 RNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 제작물은, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능성을 갖는 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은 예를 들어, ColEl, 2μ, 플라스키드, λ, SV40, 소의 파필로마 바이러스 등으로부터 유래할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 형질전환 또는 형질감염된 숙주의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생물제 내성, 예를 들어, 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 영양요구성 숙주에서 자가영양성(prototrophy)을 제공하는 보완성 등을 포함한다. 재조합 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는, 예를 들어, 네오마이신/G418 내성 유전자, 푸로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 히스티디놀(histidinol) 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
본 개시 내용의 맥락에서 유용한 벡터는, "네이키드(naked)" 핵산 벡터(즉, 단백질, 당, 및/또는 지질로 거의 캡슐화되지 않거나, 전혀 캡슐화되지 않은 벡터), 또는 다른 분자와 복합체를 이룬 벡터일 수 있다. 벡터와 적합하게 조합될 수 있는 다른 분자는, 제한없이 바이러스 코트, 양이온성 지질, 리포좀, 폴리아민, 금 입자, 및 표적화 모이어티, 예컨대 리간드, 수용체, 또는 세포성 분자를 표적화하는 항체를 포함한다.
벡터 DNA 또는 RNA는 종래의 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 세포, 예를 들어, 면역 세포에 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 "형질전환" 및 "형질감염"이라는 용어는, 외부 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 세포에 도입하기 위한 다양한 당업계에-인식된 기술을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기에는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션, 유전자 총, 또는 전기천공을 포함한다.
단백질 치료제
일부 양태에서, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질을 생산하여, 본원에 기재된 세포 대신에, 또는 이에 더하여, 이에 의해 생산된 단백질 치료제(예를 들어, 세포성 치료제)로서 사용할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물에 포함될 수 있고, 단백질 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포성 치료제, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 ADC를 위한 표적이거나, 이를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 치료제는, 이러한 세포성 치료제, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 ADC와 함께 투여될 수 있다.
일 예에서, 단백질 치료제는 제1 항체(예를 들어, 항-CLL-1 항체, 예를 들어, 항-CLL-1 scFv, 예를 들어, 본원에 기재된 항-CLL-1 scFv), 제2 항체(예를 들어, 항-CLL-1 항체, 예를 들어, 항-CLL-1 VHH, 예를 들어, 본원에 기재된 항-CLL-1 VHH), 및 본원에 기재된 CD19 변이체를 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 포함한다.
폴리펩티드의 제조를 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있는데, 이는 단백질 치료제에 포함될 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포 시스템을 이용함으로써 재조합에 의해 제조될 수 있다. 유전자의 재조합 발현은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 제작을 포함할 수 있다. 일단 폴리뉴클레오티드를 얻으면, 폴리펩티드의 생산을 위한 벡터는 당업계에 알려진 기술을 사용하는 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 공지의 방법을 사용하여, 폴리펩티드 암호화 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 또는 RNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다.
발현 벡터는 종래의 기술에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있고, 형질감염된 세포는 그 후 종래의 기술에 의해 배양되어 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,807,715호 참고). 이러한 숙주-발현 시스템을 사용하여 폴리펩티드를 생산할 수 있고, 원하는 경우 이후 정제한다. 이러한 숙주 발현 시스템은 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아(예를 들어, 대장균(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)); 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 피키아(Pichia)); 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 의해 감염되거나, 또는 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)에 의해 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 제작물을 포함하는 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NS0, 및 3T3 세포)을 포함한다.
박테리아 시스템을 위해서는, E. coli 발현 벡터 pUR278(문헌[Ruther 외, 1983, EMBO 12:1791]); pIN 벡터(문헌[Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109]; 문헌[Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)]; 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 발현 벡터들을 사용할 수 있다. 또한, pGEX 벡터를 사용하여, 글루타티온 5-트래스퍼라제(GST)를 갖는 융합 단백질로서 외부 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
포유류 숙주 세포에서 발현시키기 위해, 바이러스-기반 발현 시스템을 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359] 참고). 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함시킴으로써 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bittner 외, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544] 참고).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 경향으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 상이한 숙주 세포들은 단백질 및 유전자 산물의 번역-후 가공 및 변형을 위한 특징 및 특이적인 메커니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 폴리펩티드의 정확한 변형 및 가공을 보장하도록 선택될 수 있다. 이러한 세포는 예를 들어, 확립된 포유류 세포주 및 곤충 세포주, 동물 세포, 진균 세포, 및 효모 세포를 포함한다. 포유류 숙주 세포는 예를 들어, BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/l, ECACC No: 85110503); 인간의 망막모세포(PER.C6, CruCell, 네덜란드 레이던 소재); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장의 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아의 신장 세포주(성장을 위해 현탁 배양액 내에서 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌[Graham 외, J. Gen Virol., 36:59,1977)]; 인간의 섬유육종 세포주(예를 들어, HT1080); 새끼 햄스터의 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터의 난소 세포 +/-DHFR (CHO, 문헌[Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980]); 마우스의 세르톨리 세포(TM4, 문헌[Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980]); 원숭이의 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이의 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트의 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간의 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간의 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(문헌[Mather 외, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간의 간암 세포주 (Hep G2)를 포함한다.
장기간의 재조합 단백질의 고-수율 생산을 위해, 숙주 세포는 폴리펩티드를 안정하게 발현하도록 조작된다. 숙주 세포는 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 및 선별 마커를 포함하는 당업계에 알려진 적절한 발현 조절 요소에 의해 조절된 DNA에 의해 형질전환될 수 있다. 재조합 DNA 기술의 업계에서 통상 알려진 방법을 사용하여, 원하는 재조합 클론을 선택할 수 있다.
일단 본원에 기재된 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질이 재조합 발현에 의해 생산되면, 이는 정제를 위해 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 크기 분류(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적인 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체를 분리하여, 적절히 선별하고, 친화도 컬럼, 예컨대 단백질 A 컬럼과 크로마토그래피 컬럼, 여과, 한외 여과, 염석(salting-out) 및 투석 과정을 조합함으로써 이를 정제할 수 있다[문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참고). 추가로, 본원에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질은 이질적인 폴리펩티드 서열들에 융합되어, 정제를 용이하게 할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질은 부분적으로 또는 완전히 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질에 포함된 폴리펩티드를 생산하고 (예를 들어, 재조합에 의해 및/또는 화학적으로 합성하고) 접합시켜(예를 들어, 화학적으로 접합시켜), 융합 단백질을 생산할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리펩티드는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다.
바이러스 전달
일부 구현예에서, 기재된 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터 내에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 벡터는 이중파라토프 융합 단백질을 암 세포(예를 들어, 종양 세포)에 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 이중파라토프 융합 단백질의 도입은 대상체의 면역계 및/또는 하나 이상의 추가적인 치료제에 대한 취약성을 증가시킬 수 있다(예를 들어, WO2017/075533 참고).
벡터 디자인
본원에 기재된 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은, 다수의 유형의 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드에 클로닝될 수 있다. 다른 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 탐침 생성 벡터, 시퀀싱 벡터, 및 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 벡터는 포미 바이러스(FV, foamy virus) 벡터, 스푸마바이러스로부터 제작된 레트로바이러스 벡터의 유형일 수 있다. 바이러스 벡터 디자인 및 기술은 문헌[Sambrook 외, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001)], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학의 매뉴얼에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
바이러스 형질도입
바이러스는 특이적인 세포 유형에 대한 핵산 전달에 매우 효과적인 반면, 종종 감염된 숙주 면역계에 의한 탐지는 피한다. 이러한 특징들로 인해 특정 바이러스가 세포성 치료 표적의 암 세포, 예를 들어, 고형 종양 세포로의 도입을 위한 비히클로서의 매력적인 후보가 된다. 다수의 바이러스 기반 시스템은 포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되어왔다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 1 바이러스, 헤르페스 바이러스, 온코바이러스(예를 들어, 쥣과 백혈병 바이러스) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체 내에서 가동하는 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 부위 및 하나 이상의 선별 마커, (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 제6,326,193호)를 함유한다.
렌티바이러스 및 레트로바이러스 형질도입은 폴리브렌(polybrene)(SantaCruz sc-134220; Millipore TR-1003-G; Sigma 107689), 레트로바이러스 형질도입의 효율을 증가시키는데 사용된 양이온성 중합체 (또한, 헥사메트린 브로마이드로도 알려짐)의 첨가에 의해 향상될 수 있다.
예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 플랫폼을 제공한다. 레트로바이러스는 레트로바이러스 과에 속하는 외피 바이러스이다. 일단 숙주의 세포 내에 있으면, 바이러스는 바이러스 역전사 효소를 사용하여, 이의 RNA를 DNA로 전사함으로써 복제한다. 레트로바이러스 DNA는 숙주 게놈의 일부를 복제하여, 프로바이러스(provirus)로도 지칭된다. 선택된 유전자는 벡터에 삽입되고, 당업계에 알려진 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자로 패키징될 수 있다. 이후, 재조합 바이러스를 분리하고, 이를 대상체의 세포로 생체내 전달할 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,994,136호, 제6,165, 782호, 및 제6,428,953호 참고).
레트로바이러스는 알파레트로바이러스의 속 (예를 들어, 조류의 백혈증(leukosis) 바이러스), 베타레트로바이러스의 속; (예를 들어, 마우스의 유선 종양 바이러스) 델타레트로바이러스의 속 (예를 들어, 소의 백혈병 바이러스 및 인간의 T-침프친화성 바이러스), 엡실론레트로바이러스의 속(예를 들어, 월아이 진피 육종 바이러스(Walleye dermal sarcoma virus)), 및 렌티바이러스의 속을 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 예를 들어, 긴 배양 기간 동안 특징화된, 레트로바이러스 과의 바이러스인 렌티바이러스 속이다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있어서 레트로바이러스 중에서도 독특하며; 이들은 유의한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으므로, 효율적인 유전자 전달 벡터로서 사용될 수 있다. 일부 예에서, 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스(S1V), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 감염 빈혈(EIA), 및 비스나 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는, 생체 내에서 유의한 수준의 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
일부 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 이중 가닥 DNA를 함유하는 바이러스의 큰 패밀리이다. 이들은 숙주 세포의 DNA를 복제하나, 그 동안 바이러스 RNA DNA 및 단백질를 합성하기 위해 숙주의 세포 기구를 사용한다. 아데노바이러스는 복제 및 비-복제 세포 모두에 감염되고, 큰 전이유전자를 수용하고, 숙주 세포 게놈으로 통합되지 않고 단백질을 암호화하는 것으로 당업게에 알려져 있다.
일부 구현예에서, AAVP 벡터가 사용된다. AAVP 벡터는 원핵-진핵 벡터의 혼성체인데, 이를 재조합 아데노-관련 바이러스와 파지의 유전적 시스-요소들의 키메라이다. AAVP는 파지 및 AAV 벡터 시스템 둘 다의 선택된 요소들을 조합하여, 박테리아에서 생산하기 간단하고, 패키징 제한이 거의 없거나 전혀 없을 수 있으나, 포유류 세포의 감염을 숙주 염색체로의 통합과 조합시키는 벡터를 제공한다. 많은 적절한 요소들을 함유하는 벡터는 상업적으로 이용가능하며, 표준 방법에 의해 추가로 변형되어, 필요한 서열을 포함할 수 있다. 다른 것들 중에서도, AAVP는 헬퍼 바이러스 또는 트랜스-작용 인자가 필요없다. 또한, AAV 캡시드 형성이 없으므로, 포유류 세포에 대한 AAV의 자연적 친화성(tropism)이 없어진다. 다른 방법 및 상세는 미국 특허 제8,470,528호 및 문헌[Hajitou A. 외, Cell, 125: 358-398]에 나와 있다.
일부 구현예에서, 인간 파필로마 (HPV) 슈도바이러스가 사용된다. DNA 플라스미드는 파필로마바이러스 L1 및 L2 캡시드 단백질로 패키징되어, DNA를 표율적으로 전달할 수 있는 슈도비리온(pseudovirion)을 생성할 수 있다. 캠슐화는 DNA를 뉴클레아제(nuclease)로부터 보호하고, 높은 수준의 안정성을 갖는 표적화된 전달을 제공할 수 있다. 바이러스 벡터의 사용과 관련된 많은 안전상의 염려는, HPV 슈도바이러스에 의해 경감될 수 있다. 다른 방법 및 예는 문헌[Hung, C., 외, Plos One, 7:7(e40983); 2012], 미국 특허 제8,394,411호, 및 문헌[Kines, R., et al Int J of Cancer, 2015]에 있다.
일부 구현예에서, 암 살상 바이러스가 사용된다. 암 살상 바이러스 치료는 암 세포에서 바이러스를 선택적으로 복제할 수 있고, 이후 예를 들어, 정상 조직에 영향을 주지 않고 종양 내에서 전파될 수 있다. 대안적으로, 암 살상 바이러스는 정상적인 조직에 손상을 유발하지 않고 세포에 우선적으로 감염되어, 세포를 사멸할 수 있다. 암 살상 바이러스는 또한 스스로 뿐만 아니라 감염된 종양 세포에 대해서도 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있다. 전형적으로, 암 살상 바이러스는 2개의 부류에 속한다: (I) 자연에서는 암 세포에서 우선적으로 복제되고, 인간에서 비병원성인 바이러스. 예시적인 부류(I)의 암 살상 바이러스는, 자율적인 파르보바이러스, 믹소마 바이러스(폭스바이러스), 뉴캐슬병 바이러스(NDV; 파라믹소바이러스), 레오바이러스, 및 세네카 밸리(Seneca valley) 바이러스(피코나바이러스)를 포함한다. 제2 부류 (II)는, 백신 벡터로서 사용하기 위해 유전적으로 조작된, 홍역 바이러스(파라믹소바이러스), 폴리오바이러스(피코나바이러스), 및 백시니아 바이러스(폭스바이러스)를 포함하는 바이러스를 포함한다. 추가적으로, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 및 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스를 포함하는 암 살상 바이러스는, 정상 세포에서는 복제에 필요하나, 암 세포에서는 그렇지 않은 유전자에 돌연변이/결실을 갖도록 유전자 조작된 것들을 포함할 수 있다. 암 살상 바이러스는 이들이 다수의 경로들을 표적화하고, 종양-선택 방법에서 복제할 수 있으므로, 이들의 낮은 유전적 내성의 확률 때문에 바이러스 형질도입 방법으로 사용될 수 있다. 종양 내의 바이러스 용량은 제자리 바이러스 증폭 때문에 (시간이 지남에 따라 감소하는 소 분자 치료제에 비해) 시간의 경과에 따라 증가할 수 있으며, 안전성 특징(즉, 약물 및 면역 민감성)이 구축될 수 있다.
투여
본 개시 내용의 특정 구현예는 본원에 기재된 세포성 치료제(또는 이들의 집단), 본원에 기재된 단백질 치료제, 세포성 치료제를 포함하는 조성물, 및/또는 단백질 치료제를 포함하는 조성물을, 예를 들어, 대상체를 치료하는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 암을 효과적으로 치료한다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 대상체로부터 얻어서, 이를 본원에 기재된 유도성 발현 제작물 또는 항시성 발현 제작물, 예를 들어, 본원에 기재된 유도성 발현 제작물 또는 항시성 발현 제작물을 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환, 예를 들어, 형질도입하여, 세포성 치료제를 얻는다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포성 치료제는 면역 세포를 얻었던 동일한 대상체에 투여된 자가 유래 세포를 포함한다. 대안적으로, 면역 세포를 대상체로부터 얻어서, 이를 본원에 기재된 유도성 발현 제작물 또는 항시성 발현 제작물, 예를 들어, 본원에 기재된 유도성 발현 제작물 또는 항시성 발현 제작물을 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환, 예를 들어 형질도입하여, 다른 대상체에 동종이계로 전달되는 세포성 치료제를 얻는다.
일부 구현예에서, 세포성 치료제는 대상체에 대해 자가 유래이고, 대상체는 대상체로부터 면역 세포를 분리하기 전에 면역학적으로 미경험 상태이거나, 면역화되었거나, 질병에 걸리거나, 또는 다른 상태에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에 투여되기 전에 추가적인 단계들이 실시될 수 있다. 예를 들어, 세포성 치료제는 면역 세포를 본원에 기재된 유도성 발현 제작물 또는 항시성 발현 제작물(예를 들어, 유도성 발현 제작물 또는 항시적 발현 제작물을 포함하는 발현 벡터)와 접촉시킨(예를 들어, 이에 의해 형질도입 또는 형질감염시킨) 후에, 그러나 대상체에 투여되기 전에 시험관 내에서 확장될 수 있다. 시험관내 확장은 대상체에 투여되기 전에 1일 이상, 예를 들어, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 6일 이상, 또는 8일 이상 진행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시험관내 확장은 대상체에 투여되기 전에 21일 이하, 예를 들어, 18일 이하, 16일 이하, 14일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 또는 5일 이하로 진행될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 확장은 대상체에 투여되기 전에 1-7 일, 2-10 일, 3-5 일, 또는 8-14 일 동안 진행될 수 있다.
일부 구현예에서, 시험관내 확장 동안, 세포성 치료제는 항원(예를 들어, TCR 항원)에 의해 자극될 수 있다. 항원 특이적인 확장은 선택적으로 예를 들어, 항-CD3 항체, 항-Tac 항체, 항-CD28 항체, 또는 피토헤마글루티닌(PHA, phytohemagglutinin)과 같은 림프구 증식을 비특이적으로 자극하는 조건 하에서의 확장에 의해 보충될 수 있다. 확장된 세포성 치료제는 대상체에 직접 투여될 수 있거나, 또는 장래의 사용을 위해, 즉 대상체에 순차적으로 투여하기 위해 동결될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포성 치료제는 암 환자에게 주입하기 전에 인터류킨-2 (IL-2)과 함께 생체 외 처리되고, 암 환자는 주입 이후 IL-2에 의해 치료된다. 일부 구현예에서, 세포성 치료제는 IL-2 및/또는 다른 사이토카인, 예를 들어, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21과 함께 생체 외 처리된다. 게다가, 일부 구현예에서, 암 환자는 세포성 치료제의 투여 이전에, 예비적 림프구 제거(preparative lymphodepletion)--면역계의 일시적인 절제를 했을 수 있다. 사이토카인 치료와 예비적 림프구 제거술의 조합은 세포성 치료제의 지속성을 향성시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 세포성 치료제는 사이토카인을 암호화하는 핵산에 의해 형질도입 또는 형질감염되는데, 여기에서 핵산은 사이토카인의 항시성, 조절가능한, 또는 일시적으로-조절된 발현을 제공하도록 조작될 수 있다. 적합한 사이토카인은 예를 들어, 수축기 동안 T 림프구의 생존을 향상시키는 역할을 하는 사이토카인을 포함하며, 이는 기억 T 림프구의 형성 및 생존을 용이하게 할 수 있다.
특정 구현예에서, 세포성 치료제는 다른 치료제, 예컨대 암 치료제의 투여 이전에, 이와 실질적으로 동시에, 또는 그 이후에 투여된다. 암 치료는 예를 들어, 화학치료제, 생물학적 제제, 또는 방사선 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포성 치료제를 받은 대상체는 면역 세포의 결핍을 유발하는데 충분한 치료, 예컨대 림프구를 제거하는 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않는다.
본원에 기재된 세포성 치료제는 조성물, 예를 들어, 세포성 치료제 및 약학적으로 허용가능한 담체로서 형성될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 본원에 기재된 세포성 치료제 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다. 본원에 기재된 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 비히클, 어쥬번트, 부형제 및 희석제는, 잘 알려져 있고, 당업계의 숙련자들에게 용이하게 이용될 수 있다. 바람직하게는, 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 제제(들), 예를 들어, 세포성 치료제에 대해 화학적으로 불활성이며, 사용 조건 하에서 임의의 해로운 부작용 또는 독성을 유발하지 않는다.
조성물은 예를 들어, 정맥내, 종양내, 동맥내, 근육내, 복강내, 경막내, 경막외, 및/또는 피하 투여 경로와 같은 임의의 적합한 경로에 의한 투여용으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 비경구 경로의 투여용으로 제제화될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 수성 또는 비수성, 등장성 멸균 주사 용액일 수 있는데, 이는 항-산화제, 완충제, 정균제, 및 예를 들어, 조성물이 의도된 수여체의 혈액과 등장성을 갖도록 하는 용질을 함유할 수 있다. 수성 또는 비수성 멸균 현탁액은 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제, 및 방부제 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
대상체, 특히 인간에 투여될 투여량은, 특정 구현예, 이용된 조성물, 투여 방법, 및 치료 중인 특정 부위 및 대상체에 따라 달라질 것이다. 그러나, 용량은 치료 반응을 제공하기에 충분해야 한다. 당업계의 숙련된 임상의는 특정 의학적 상태를 치료 또는 예방하기 위해 인간 또는 다른 대상체에 투여될 조성물의 치료 유효량을 결정할 수 있다. 치료 유효하기 위해 필요한 조성물의 정확한 양은, 예를 들어, 당업계의 숙련자의 상식 내에 있는 많은 대상체-특이적인 고려 사항 외에, 예컨대 세포성 치료제의 특이적인 활성, 및 투여의 경로와 같은 다수의 요인들에 따라 달라질 것이다.
임의의 적합한 수의 세포성 치료 세포가 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 기재된 단일 세포성 치료 세포는 치료적 이점을 확장하여 제공할 수 있으며, 일부 구현예에서, 102 개 이상, 예를 들어, 103 개 이상, 104 개 이상, 105 개 이상, 또는 108 개 이상의 세포성 치료 세포가 투여된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 1012 개 이하, 예를 들어, 1011 개 이하, 109 개 이하, 107 개 이하, 또는 105 개 이하의 본원에 기재된 세포성 치료 세포가 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이, 102-105 개, 104-107 개, 103-109 개, 또는 105-1010 개의 세포성 치료 세포가 투여된다.
본원에 기재된 세포성 치료제의 용량은 포유류에 한번에 투여되거나, 또는 필요하다면 적합한 시기 동안, 예를 들어, 매일, 반 주마다, 매 주마다, 2 주마다, 보름마다, 2-개월마다, 반년 또는 매년 기준으로 하위 용량의 시리즈로 투여될 수 있다. 유효량의 세포성 치료제를 포함하는 투여 단위는 단일 1일 투여량으로 투여될 수 있거나, 또는 필요하다면 전체 1일 투여량이 2회, 3회, 4회, 또는 그 이상의 분할된 용량으로 하루에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 (예를 들어, 단백질 치료제로서 사용하기 위해) 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 당업계의 숙련자들에게 알려진 방법에 의해 제제화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences pp. 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro, ed., 19판. 1995)] 참고). 약학적 조성물은 물 또는 다른 약학적으로 허용가능한 액체 중 멸균 용액 또는 현탁액을 포함하는 주사용 제제의 형태로 비경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 매질, 예컨대 멸균수 및 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁액 제제, 계면활성제, 안정화제, 착향 부형제, 희석제, 비히클, 방부제, 결합제와 적절히 조합한 후, 일반적으로 허용된 약학적 관행에서 요구되는 단위 투여 형태로 혼합함으로써 제제화될 수 있다. 약학적 제제에 포함된 활성 성분의 양은, 지정된 범위 내의 적합한 용량이 제공되는 양이다.
주사용 멸균 조성물은 비히클로서 주사용 증류수를 사용하는 종래의 약학적 관행에 따라 제제화될 수 있다. 예를 들어, 포도당 및 다른 보충제, 예컨대 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 염화나트륨을 함유하는 생리 식염수 또는 등장성 용액이, 주사용 수성 용액으로 사용될 수 있다.
포함될 수 있는 다른 항목은 완충제, 예컨대 포스페이트 완충제, 또는 소듐 아세테이트 완충제, 진정제, 예컨대 프로카인 하이드로클로라이드, 안정화제, 예컨대 벤질 알콜 또는 페놀, 및 항산화제이다. 제제화된 주사는 적합한 앰플 내에 포장될 수 있다.
투여 경로는 비경구, 예를 들어, 주사에 의한 투여, 비강 경유 투여, 폐경유 투여, 또는 경피 투여일 수 있다. 투여는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사에 의해 전신 또는 국소로 실시될 수 있다.
투여의 적합한 수단은 대상체의 연령 및 상태에 기초하여 선택될 수 있다. 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물의 단일 용량은 0.001 내지 1000 mg/체중 kg의 범위에서 선택될 수 있다. 다른 한편으로, 용량은 0.001 내지 100000 mg/체중의 범위 내에서 선택될 수 있으나, 본 개시내용은 이러한 범위에 제한되지 않는다. 투여의 용량 및 방법은 대상체의 체중, 연령, 상태 등에 따라 달라질 수 있으며, 필요하다면 당업계의 숙련자들이 용이하게 선택할 수 있다.
종양
본 개시내용은 어떠한 종양의 치료에도 유용한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 종양은 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발 세포 백혈병, AIDS-관련 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 랑게르한스 세포 조직구성, 다발성 골수종, 또는 골수증식성 신생물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 혈액 악성 종양이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양은 흑색종이다. 일부 구현예에서, 종양은 B 세포 종양이다.
일부 구현예에서, 종양은 유방 암종, 편평 세포 암종, 결장암(예를 들어, 결장직장), 두경부암, 난소암, 폐암, 중피종, 비뇨생식기암, 직장암, 위암, 또는 식도암을 포함하나, 이에 제한되지 않는 고형 종양이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 특정 구현예에서, 종양은 진행된 종양, 및/또는 난치성 종양이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양은 (예를 들어, 종양으로부터 얻은 조직 샘플, 예컨대 생검 샘플에서) 특정 병리 상태가 종양에서 관찰될 때, 그리고/또는 이러한 종양을 갖는 암 환자가 전형적으로 종래의 화학치료에 대한 후보가 되지 않는 것으로 간주될 때, 진행된 것으로 특징화된다. 일부 구현예에서, 종양이 진행된 것으로 특징화될 수 있는 병리 상태는 종양 크기, 유전자 마커의 변화된 발현, 종양 세포에 의한 인접 장기 및/또는 림프절의 침입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양은 환자가 하나 이상의 공지된 치료 양상(예를 들어, 하나 이상의 종래의 화학치료 요법)에 대해 내성을 갖고/거나, 특정 환자가 하나 이상의 이러한 공지된 치료 양상에 대해 내성(예를 들어, 반응성 결핍)을 나타낼 때, 난치성인 것으로 특징지어질 수 있다.
병용 요법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포성 치료제 및/또는 단백질 치료제는, 제2 세포성 치료제, 항체-약물 접합물, 항체 및/또는 폴리펩티드와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 세포성 치료제(예를 들어, CAR-T 세포)에 의한 종양 표적화 및/또는 사멸의 정도는, 본원에 기재된 세포성 치료제 또는 단백질 치료제와 조합된 치료가 없을 때 관찰되거나 측정된 수준보다 더 높다.
본원에 기재된 세포성 치료제 및/또는 단백질 치료제를 포함하는 약학적 조성물은, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대 암 치료제, 예를 들어, 화학치료제 또는 생물학적 제제를 함유하고/거나, 이와 조합하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 세포성 치료제와 조합하여 사용할 수 있는 화학치료제의 예는, 백금 화합물(예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)), 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 클로람부실(chlorambucil), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 티오테파(thiotepa), 멜팔란(melphalan), 부술판(busulfan), 프로카바진(procarbazine), 스트렙토조신(streptozocin), 테모졸로미드(temozolomide), 다카르바진(dacarbazine), 및 벤다무스틴(bendamustine)), 항종양 항생제 (예를 들어, 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 이다루비신(idarubicin), 에피루비신(epirubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 블레오마이신(bleomycin), 마이토마이신(mytomycin) C, 플리카마이신(plicamycin), 및 닥티노마이신(dactinomycin)), 탁산(taxane)(예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)), 항대사물질(예를 들어, 5-플루오로우라실, 사이타라빈(cytarabine), 프레메트렉세드(premetrexed), 티오구아닌(thioguanine), 플록수리딘(floxuridine), 카페시타빈(capecitabine), 및 메토트렉세이트(methotrexate)), 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 플루다라빈(fludarabine), 클로파라빈(clofarabine), 클라드리빈(cladribine), 텐토스타틴(pentostatin), 및 넬라라빈(nelarabine)), 토포이소머라제(topoisomerase) 저해제(예를 들어, 토포테칸(topotecan) 및 이리노테칸(irinotecan)), 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘(azacitidine) 및 데시타빈(decitabine)), 프로테오좀 저해제(예를 들어, 보테조닙(bortezomib)), 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin)(예를 들어, 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide)), DNA 합성 저해제(예를 들어, 하이드로우레아(hydroxyurea)), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(예를 들어, 빈크리스틴(vicristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 및 빈블라스틴(vinblastine)), 티로신 키나제 저해제(예를 들어, 이마티닙(imatinib), 다사티닙(dasatinib), 닐로티닙(nilotinib), 소라페닙(sorafenib), 및 수니티닙(sunitinib)), 니트로우레아(nitrosourea)(예를 들어, 카르무스틴(carmustine), 포테무스틴(fotemustine), 및 로무스틴(lomustine)), 헥사메틸멜라민, 미토탄(mitotane), 혈관생성 저해제(예를 들어, 탈리도미드(thalidomide) 및 레날리도미드(lenalidomide)), 스테로이드(예를 들어, 프레드니손(prednisone), 덱사메타손(dexamethasone), 및 프레드니솔론(prednisolone)), 호르몬 제제(예를 들어, 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 류프롤리드(leuprolide), 비칼루타미드(bicaluatmide), 그라니세트론(granisetron), 및 플루타미드(flutamide)), 아로마타제(aromatase) 저해제(예를 들어, 레트로졸(letrozole) 및 아나스트로졸(anastrozole)), 삼산화비소, 트레티노인(tretinoin), 비선택적인 사이클로옥시게나제 저해제(예를 들어, 비스테로이드성 항-염증제, 살리사일레이트(salicylate), 아스피린(aspirin), 피록시캄(piroxicam), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 나프로신(naprosyn), 디클로페낙(diclofenac), 톨메틴(tolmetin), 케토프로펜(ketoprofen), 나부메톤(nabumetone), 및 옥사프로진(oxaprozin)), 선택적인 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 저해제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용할 수 있는 생물학적 제제의 예는, 단일클론 항체(예를 들어, 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 파네투무맙(panetumumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙, 알렘투주맙(alemtuzumab), 겜투주맙 오조가마이신, 베바시주맙(bevacizumab), 카투막소맙(catumaxomab), 데노수맙(denosumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 라무시루맙(ramucirumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 이필리무맙(ipilimumab), 니볼루맙(nivolumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 람브롤리주맙(lambrolizumab), 피딜리주맙(pidilizumab), 실툭시맙(siltuximab), BMS-936559, RG7446/MPDL3280A, MEDI4736, 트레멜리무맙(tremelimumab), 또는 본원에서 표 1에 나열된 다른 것들), 효소(예를 들어, L-아스파라기나제(asparaginase)), 사이토카인(예를 들어, 인터페론 및 인터류킨), 성장 인자(예를 들어, 콜로니 자극 인자 및 에리트로포이에틴), 암 백신, 유전자 치료 벡터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법은 의학적 상태에 대한 다른 치료가 실패했거나, 또는 다른 수단을 통한 치료에서 덜 성공했던 대상체에 대해 수행된다. 추가적으로, 본원에 기재된 치료 방법은 의학적 상태의 하나 이상의 추가적인 치료와 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 방법은 본원에 기재된 세포성 치료제 및/또는 단백질 치료제, 또는 이의 조성물의 투여 이전에, 이와 실질적으로 동시에, 또는 그 이후에 암 요법, 예를 들어, 비골수제거성 화학치료, 수술, 호르몬 치료, 및/또는 방사선을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 세포성 치료제 및/또는 단백질 치료제가 투여된 대상체는, 또한 항생제 및/또는 하나 이상의 추가적인 약학적 제제에 의해서도 치료될 수 있다.
본 개시 내용의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은, 이하의 표에 나열되어 있다:
표 7
Figure pct00018
본원에 기재된 임의의 구현예에서, 본원에 기재된 단백질 및/또는 융합 단백질은 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나, 또는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
본원에 인용된 GenBank 서열을 포함하는 모든 간행물은 참조로서 본원에 명확히 포함된다.
실시예
실시예 1: 이중파라토프 융합 단백질의 결합
CLL-1 양성 U937 세포에 결합하는, CD19 변이체, 항-CLL-1 scFv 및 항-CLL-1 VHH(#357)를 함유하는 융합 단백질을 포함하는 발현된 이중파라토프 제작물의 능력을, CD19 변이체와 항-CLL-1 VHH(#330)로 구성된 융합 단백질을 함유하는 발현된 제작물과, 야생형 CD19와 항-CLL-1 scFv(#186)로 구성된 융합 단백질을 함유하는 발현된 제작물의 결합에 대해 평가하였다. 간략히 말해, 결합 친화도는 이하의 방법으로 결정하였는데: U937 세포를 FB(FACS 완충제 PBS ＋ 1% BSA ＋ 0.1% 소듐 아자이드)로 씻어낸 후, FB에 희석하고, 실온(RT)에서 10분 동안 인간 Fc 블록(Becton Dickinson)으로 차단시켰다. 샘플당 대략 5×105 개의 세포를 분배하였다(aliquoted). 세포를 회전시키고, FB로 씻어낸 후, 100㎕의 FB 중 이중파라토프 또는 단일 특이적인 융합 단백질 희석액(10㎍/㎖에서 시작한 상청액 또는 정제액)에 현탁하였다. 세포/융합 단백질 혼합물을 30분 동안 4℃에서 배양한 후, FB로 2회 씻어내었다. 세포를 100 ㎕의 FB으로 씻어내고, FMC63-PE(Millipore 5 ㎕/시험)로 염색하고, 4℃에서 30 분간 배양하였다. FB로 2회 씻어낸 후, 세포를 PBS 중 1% PFA(Thermo Scientific)의 최종 농도로 고정시키고, 그 후 유세포 분석(Accuri C6, Becton-Dickinson)에 의해 분석하였다.
도 7에서 보이는 바와 같이, 발현된 이중파라토프 융합 단백질과 항-CLL-1 VHH를 포함하는 융합 단백질은 유사한 친화도(각각, 0.7nM 및 1.0nM)로써 결합하는 것으로 보인다. 융합 단백질 #330과 #357에 대한 EC50 값의 차이는, 통계적으로 유의하게 보이지 않는다. 확실히, 발현된 이중파라토프 및 융합 단백질을 함유하는 VHH는 둘 다, 약 10nM의 친화도를 갖고 야생형 CD19와 항-CLL-1 scFv를 함유하는 융합 단백질보다 더 큰 친화도로써 결합하였다. 확실히, 일단 융합 단백질을 정제하고, 단백질 농도를 결정하여 상청액보다 더욱 정확히 희석하면, 이중파라토프 융합 단백질은 항-CLL-1 VHH를 포함하는 융합 단백질보다 더 잘 결합하고, 야생형 CD19와 항-CLL-1 scFv를 둘 다 함유하는 융합 단백질보다 더 잘 결합한다(도 14).
CLEC12A에 대한 이중파라토프 융합 단백질의 결합은, 또한 ELISA에 의해 평가될 수도 있다. 96-웰 ELISA 플레이트를 0.1 M 카보네이트 중 1 ㎍/㎖의 항-CD19 단일클론 항체 FMC63, pH 9.5으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 배양되도록 두었다. 코팅된 플레이트를 60분 동안 RT에서 TBS/0.3% 건조 탈지유 (NFD)로 차단시켰다. 플레이트를 TBST(0.1 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween 20로 씻어내었다. 정제된 이중파라토프 융합 단백질을 TBS/BSA에 희석하여, 0.005 ㎍/㎖ 내지 1 ㎍/㎖의 다양한 양으로 첨가하는데, 이는 3개 초과의 최종 농도의 log를 커버한다. 이중파라토프 융합 단백질을 1 시간 동안 RT에서 배양시킨 후, 플레이트를 씻어내고, RT에서 HRP-커플링된 항-His 항체를 60분 동안 첨가한 후, 이를 효소 탐지를 위해 제조사의 지시를 따라 사용하였다. 겉보기 EC50은 Softmax 소프트웨어의 4-변수 곡선 보정 기능을 사용하여 계산하였다.
이 결합 실험의 결과는 표 8에 나타나 있다. 이중파라토프 융합 단백질 #357은 단일 VHH #330 융합 단백질에서와 같이, 0.01nM의 EC50로 결합한다. scFv 융합 단백질은 약 2.5nM의 훨씬 약한 결합 친화도를 갖는다.
표 8:
Figure pct00019
실시예 2: 발현된 이중파라토프 융합 단백질에 의해 매개된 세포독성
몇몇 융합 단백질을 정제하여, CD19를 표적화하는 CAR-T 세포에 의한 CLL-1 발현 세포의 사멸로 연결시키는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 렌티바이러스 형질도입에 의해 루시퍼라제를 U937 세포 및 29T-CLL 세포에 도입하였다. 1일 차에, U937 세포를 둥근-바닥 96 웰 플레이트(Thermo Fisher)에 웰당 1×104 개의 세포로 분주하거나, 또는 세포 배양 배지(RPMI 1640, 10% FBS) 중의 293T-CLL-1 세포를 편평 바닥 플레이트에 분주하였다. 2일 차에, 명시된 융합 단백질 #357, #330 및 #321을 연속 3배 희석하여 0.2 ㎍/㎖(20 ng/웰)로 첨가한 후, 세포 배양기를 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 배양시켰다.
액체 질소에 보관된 사전-분취된 바이알로부터 CAR-CD19-지향-T 세포 또는 형질도입되지 않은 세포(UTD)를 새로 해동하고, 배지로 1회 씻어내어, DMSO를 제거하였다. 이후, 표적 세포가 U937 세포인 경우, 10:1 또는 1:1의 T 세포:표적 세포(효과기:표적이라고도 알려짐) 세포 비를 사용하여, CAR19 T 세포를 지정된 96 웰 플레이트에 첨가하였다.
3일 차에, 플레이트를 550 RCF에서 5분 동안 회전시키고, PBS로 헹궈낸 후, 다시 회전시켜 PBS를 제거하였다. 20 ㎕의 1×용해 완충제(루시퍼라제 검정 시스템 Promega)를 첨가하고, 용해물을 96 웰의 불투명한 조직 배양 플레이트에 옮겼다. 웰당 20 ㎕의 세포 용해물이 담긴 96 웰의 불투명한 조직 배양 플레이트를, 주사기가 달린 발광계(Promega 사의 Glomax Multi Detection System) 내에 두었다. 주사기로 웰당 100 ㎕의 루시퍼라제 검정 시약을 첨가한 후, 즉시 웰을 판독하였다. 이후, 주사-후-판독 과정을 반복하며 플레이트를 다음 웰로 전진시켰다. 293T-CLL-1 세포주의 세포독성 검정은, 세포를 편평 바닥 플레이트에 분주하고, 용해 전에 세포를 회전시키지 않는다는 점을 제외하고는 유사하였다.
세포 사멸 %(세포독성으로도 알려짐)는 이하와 같이 계산하였다:
사멸 % = [1-luc 판독치 (실험 웰)/luc 판독치 (CAR T 세포가 없는 종양 세포)]×100.
정제된 융합 단백질 #186은, 도 8에서 나타난 바와 같이, U937와 CLL-1을 발현하는 293T 세포에서 대략 100 pM의 IC50 값을 일관되게 생성하였다. 도 8a에서, 음성 대조군은 단백질 #28(CD19 단백질)이다. 도 8b에서, 형질도입되지 않은 T 세포(UTD)는 음성 대조군의 역할을 한다. 도 9에 나타난 바와 같이, 이중파라토프 제작물 #357로부터 생성된 정제된 융합 단백질은, 융합 단백질 #330(약 8-배) 및 융합 단백질 #321(약 25-배)보다 더욱 강한 사멸을 매개하였다. 유사하나 5:1의 더 낮은 E:T 비를 사용하는 실험에서, 이중파라토프 융합 단백질의 효능의 증가는 훨씬 더 현저하였다. 결과(도 10)는 이중파라토프 융합 단백질 #357이 융합 단백질 #330보다 약 15-배 보다 더 큰 CAR-CD19 세포독성을 매개한다는 사실을 나타내었다. 이러한 특정 실험에서, 융합 단백질 #186의 효능은 1 nM에서는 낮았다. 이 결과들은 도 15에 나타난 실험 결과에 의해 추가로 확인하였다.
5:1의 E:T 비를 사용하여 실시한 제3 세포독성 검정에서, 이중파라토프 융합 단백질 #357은 효능에서 유사한 효능의 경향이 나타내었는데, 융합 단백질 #330보다 약 15-배 보다 더 큰 CAR-CD19 세포독성을 매개하였다(도 11).
실시예 3: 항시적으로 발현되는 이중파라토프 제작물의 세포독성.
이중파라토프 융합 단백질 상류의 CD19 결합 CAR을 암호화하는 항시적으로 발현되는 이중파라토프 제작물 서열의 세포독성을 시험하기 위해, 이를 렌티바이러스 형질도입에 의해 T 세포에 도입하였다. 간략히, FLAG-태그, CD28 링커 및 막통과 도메인 플러스 CD28, 4-1BB 및 CD3 제타 세포내 도메인, 그 이후 P2A 부위, 그리고 그 뒤에 항-CLL-1 VHH 2H3-변이체 CD19 융합 단백질 서열을 갖는, FMC63 항체(VL-VH)로부터 유래한 항-CD19 CAR 서열(CAR-CD19)을 화학적으로 합성하고, Lentigen Technologies 벡터에 의해 렌티바이러스 벡터에 클로닝시켰다. 추가 연구를 위해, 바이러스 입자를 Lentigen에서 제조하였다. 항-CLL-1 CAR 대조군(A260)을 위해, 서열을 합성하고, Systems Biosciences 사의 변형된 벡터에 클로닝하였다. CAR 단독 렌티바이러스 입자를 제조하기 위해, SBI 프로토콜에 기재된 바와 같이, HEK 293 FT 세포의 일시적인 형질감염에 의해 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 생성하였다. 펠렛화 렌티바이러스 입자를 PBS에 현탁시켜서, 1차 T 세포 형질도입을 위해 이용하였다. 선택된 CD3+ 인간 1차 T 세포를 3×105 개 세포/㎖의 밀도로 20 IU/ml의 IL-2가 보강된 ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지(무-혈청/이종 세포)에 배양하고, CD3/CD28 T 세포 활성자 시약(STEMCELL Technologies)으로 활성화시키고, 1일 차에 1×Transdux(SBI)의 존재 하에서 CAR-CD19 플러스 융합 단백질 또는 항-CLL-1 CAR 렌티바이러스 입자에 의해 형질도입시켰다. 세포를 10일 차까지 번식시키고, 그 시점에서 항-FLAG 항체(Invitrogen)에 의한 유세포 분석에 의해 CAR-CD19의 표면 발현을 평가하였다. 발현 제작물은 “P2A” 절단 부위를 포함하여, 이중파라토프 융합 단백질로부터 CD19 CAR을 구분하고, 생성된 전사/번역은 T 세포 표면 상에 발현된 CAR-CD19, 및 이중파라토프 융합 단백질을 분비시킬 것이다. 3개의 제작물을 시험했는데: LG405는 CAR-CD19를 발현시키고, 변이체 CD19-이중-파라토프 항-CLEC12A 융합 단백질인 LG142를 분비하나, 대조군 제작물은 CAR-CD19을 발현시키고, 야생형 CD19-항-Her2 scFv 융합 단백질을 분비하며; A260은 CLL-1 (CLEC12A)를 직접 인식하는 대조군 CAR (CAR-CLEC12A)이다. LG405 제작물을 발현하는 세포를, CD19 양성 NALM6 세포 및 CLL-1 양성 U937 세포와 함께, 다양한 효과기 대 표적의 비로 공동-배양하였다. Nalm6 세포독성에 대한 양성 대조군은, 또한 CAR-CD19도 발현하는 LG142이다. U937 세포독성에 대한 양성 대조군은, A260, CAR-CLEC12A이다. 도 12는 CAR-CD19를 발현하고 =이중파라토프 융합 단백질을 분비하는 LG405-형질감염된 T 세포가, CD19 양성 NALM6 세포와 CLL-1 양성 U937 세포 둘 다의 사멸을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 확실히, U937 세포에 대해 달성한 세포독성 활성은 심지어 3:1의 E:T 비에서도 100%였다.
단일 scFv-계 또는 단일 VHH-계 융합 단백질을 분비하는 CAR T 세포는, U937 세포에 대해 효능이 덜하다. 3개의 제작물을 시험했는데: LG221-형질도입된 T 세포는 CAR-CD19를 발현하고, CD19-항-CLL-1 scFv 융합 단백질을 분비하나, LG355-형질도입된 T 세포는 CAR-CD19를 발현하고, CD19-항-CLL-1 VHH (1B12) 융합 단백질을 분비하며; LG356-형질도입된 T 세포는 CAR-CD19를 발현시키고, 항-CLL-1 VHH (2H3)-CD19 융합 단백질을 분비한다. 2개의 검정에서, LG221, LG355 및 LG356로부터 제조된 CAR T 세포는 30:1 미만의 E:T 비에서 U937 세포에 대한 활성을 잃었고, 따라서 변이체 CD19-이중-파라토프 항-CLEC12A 융합 단백질을 분비하는 LG405로부터 제조된 CAR T 세포보다 효능이 훨씬 낮다 (도 13).
실시예 4: 추가적인 이중파라토프 제작물의 결합
CD19 변이체, 항-CLL-1 scFv, 및 항-CLL-1 VHH를 포함하는 발현된 이중파라토프 융합 단백질의 결합과 세포독성 역량을 추가로 확인하기 위해, 제작물 #357과 동일한 특징을 갖지만, HIS 태그가 없는 제작물을 생성하였다. U937(ATCC) 및 OCI-AML-5(DSMZ) 세포를 제조사가 상세히 설명한 바와 같이 배양하였다. 세포를 PBS로 씻어내고, 50 ㎕의 FACS 완충제(PBS＋1% BSA, 및 0.1% 소듐 아자이드)에 현탁시키고, 인간 Fc 블록(Becton Dickinson)에 의해 실온에서 10분 동안 차단하였다. 이후, 50 ㎕의 융합 단백질, #357 또는 #518은, 1 ㎍/㎖에서 시작하여 3배 희석하여 FACS 완충제에 첨가하였다. 세포/융합 단백질 혼합물을 30분 동안 4℃에서 배양한 후, FACS 완충제로 2회 씻어내었다. 세포를 100 ㎕의 FACS 완충제에 현탁하고, FMC63-PE(Millipore 5 ㎕/시험)로 염색하고, 30분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 FACS 완충제로 2회 씻어내고, PBS(Thermo Scientific) 중 1% PFA의 최종 농도로 고정시킨 후, 유세포 분석에 의해 분석하였다.
세포독성을 시험하기 위해, 96 웰의 둥근 바닥 플레이트에 루시퍼라제 유전자(U937-luc)를 보유하는 50㎕의 U937 세포를, 항생제가 없는 RPMI 1640 배지/10% FBS(RPMI/FBS)에 1×104 세포/웰로써 분주하였다. 이중파라토프 융합 단백질 #357 또는 #518의 희석은 25㎕의 RPMI/FBS에서 실시하였고, 60 ng/ml에서 시작하여 3배 희석하여, 세포에 첨가하였다. CAR-CD19 T 세포(CAR254)를 해동하고, RPMI/FBS과 함께 550 RCF에서 10분 동안 원심분리함으로써 1회 씻어내었다. CAR T 세포를 웰에 첨가하여, 10:1의 CAR:표적 세포 비(E:T)를 제공하였다. 플레이트를 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 550 RCF에서 5분 동안 원심분리하고, 펠렛을 PBS로 헹궈내고, 다시 회전시켰다. 이후, 20㎕의 1×용해 완충제(Promega Cat. #E1500)를 펠렛에 첨가하고, 용해물을 96 웰의 불투명한 조직 배양 플레이트(Fisher Scientific Cat. #353296)에 옮겼다. 플레이트를 기질 분배용 주사기가 달린 발광계(Promega Cat. #E1500)에서 판독하였다. 사멸 퍼센트는 실험군 대 대조군(비처리) 세포의 평균 발광 손실에 기초하여 계산하였다.
도 16a는 FACS에 의할 때 HIS-태그 이중파라토프 제작물(#357)과 HIS-태그가 없는 제작물 (#518)이 CLEC12A-양성 세포주 AML5에 대해 동등한 결합을 나타내었다는 것을 보여준다. 유사한 동등함은 CLEC12A-양성 세포주 U937(도 16b)을 사용하는 경우에도 관찰되었다. CAR-CD19 T 세포를 U937 표적 세포로 이끌고, 강력한 세포독성을 매개하는 융합 단백질 둘 다의 동등한 능력이, 도 16c에 나타나 있다.
실시예 5: His-태그가 없는, 항시적으로 발현되는 이중파라토프 제작물의 세포독성
항시적으로 발현되는 이중파라토프 제작물의 세포독성을 추가로 확인하기 위해, HIS 태그가 없는 이중파라토프 융합 단백질 상류의 CD19 결합 CAR를 암호화하는 서열을 렌티바이러스 형질도입에 의해 T 세포에 도입시켰다. 또한, FLAG-태그를 CAR-CD19 서열로부터 제거하였다. 생성되는 제작물을 #468로 명명하였다.
CD19-항-CLL 융합 단백질을 발현하는 CAR-CD19 T 세포를 생산하기 위해, 2명의 공여자로부터 얻은 CD3-양성 인간 1차 T 세포를 20 IU/ml의 IL-2가 보충된 ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지(무-혈청/이종 세포)에서 3×105 개 세포/ml의 밀도로 배양하였고, 항-CD3/항-CD28 T 세포 활성자 시약(STEMCELL Technologies)으로 활성화시키고, 1일차에 1×Transdux(SBI)의 존재 하에서 CAR-405 렌티바이러스 입자(Lentigen, 1.6-3.3×106 TU/ml) 또는 CAR-468 렌티바이러스 입자(Flash, qPCR은 4.3×109 TU/ml임)에 의해 형질도입시켰다. 세포를 10일 차에 수확할 때까지 번식시켰다. 대조군 CAR, CAR-254, CAR-260 및 CAR408에 대해서는, SupT1 역가에 기초하여 입자를 첨가하였다. CAR-CD19 발현의 퍼센트는 CAR T 세포를 항-FLAG 항체에 의해, 또는 CD19-Fc(CAR-468)에 의해 염색함으로써 측정하였다. 간략히, 500,000개의 세포를 1:100로 희석된 항-FLAG 항체(Thermo Fisher) 및 이후 항-토끼 APC(1:100 희석액, Thermo Fisher), 또는 0.25 μg/ml의 CD19-Fc(R&D Systems) 및 이후 항-Fc 감마의 1:200 희석액(Jackson ImmunoResearch)과 함께 배양하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드로 고정시키고, FLAG-양성 세포 집단의 퍼센트는 BD Accuri C6 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다. 이 비교에서, 모든 CAR-T 제제들 중 최저 %는 48%였다. 표 9에 나타난 바와 같이, 다른 CAR-T는 CAR T 세포를 검정에 첨가하기 전에, UTD 세포에 의해 희석함으로써 48% 양성 CAR 발현으로 정상화하였다.
세포독성을 평가하기 위해, U937(ATCC), PL-21 및 OCI-AML-5(DSMZ) 세포를 제조사가 상술한 바와 같이 배양하였다. 렌티바이러스(GeneCopoeia) 및 푸로마이신 선별을 사용하여, 루시퍼라제 발현 세포주를 생성하였다. 항생제가 없는 RPMI 1640 ＋ 10% FBS 중의 루시퍼라제 유전자 보유 세포를, 1×104 개 세포로 96 웰의 둥근 바닥 플레이트에 웰당 50㎕로 분주하였다. CAR T 세포를 해동하고, 450 RCF에서 10분 동안의 원심분리함으로써 RPMI/FBS로 1회 씻어내었다. CAR T 세포를 각각 30:1, 10:1, 3:1, 또는 1:1의 E:T 세포 비가 되도록 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 450 RCF에서 5분 동안 원심분리하고, 펠렛을 PBS로 행궈내고, 다시 회전시켰다. 이후, 20㎕의 1×용해 완충제(Promega)를 펠렛에 첨가하고, 용해물을 96 웰의 불투명한 조직 배양 플레이트(Fisher)로 옮겼다. 플레이트를 주사기가 달린 발광계(Glomax Multi Detection System, Promega)에서 판독하였다. 사멸 퍼센트는 실험군 대 대조군(표적 세포 단독)의 평균 발광 손실을 기준으로 계산하였다.
이중파라토프 융합 단백질 농도는 CAR-405 확장 배양 배지(배치 융합 단백질)에서, 뿐만 아니라 동결-후 자극(융합 단백질 분비)을 통해 결정하였다. 수확시(10일 차) 확장 동안의 이중파라토프 융합 단백질을 측정하기 위해, 0.5ml의 무-세포 배양 배지를 모아서, -20℃로 동결하였다. 활성화 이후의 이중파라토프 융합 단백질 분비에 대해서는, CAR-405 T 세포를 해동하고, RPMI-1640/10% FBS에 3×106 개 세포/ml로 재현탁하였다. 약 6×105 개의 세포(200 ㎕의 재현탁액)를 96 웰의 u-바닥 플레이트에 분주하고, CD3/CD28 T 세포 활성자 시약(STEMCELL Technologies)에 의해 자극하였다. 4일 후, 상청액을 모아서, 이중파라토프 단백질의 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 96 웰 플레이트를 4℃에서 0.1 M의 카보네이트, pH 9.5 중 1.0 ㎍/ml의 항-CD19 FMC63(Novus)로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 1 시간 동안 RT에서 TBS 중 0.3% 탈지유로 차단시켰다. TBST(0.1 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween20)에서 3회 씻어낸 후, 100 ㎕의 세포 배양 상청액을 플레이트에 추가하고, 1 시간 동안 RT에서 배양하였다. 정제된 CD19-항-Her2 scFv 단백질을 사용하여, 표준 곡선을 생성하였다. 플레이트를 TBST에서 3회 씻어낸 후, HRP-항-His (BioLegend)을 RT의 어두운 장소에서 1 시간 동안 1:2000로 첨가하였다. 결합된 퍼록시다제를 효소적으로 정량화하기 위해, 1-단계 Ultra TMB-ELISA(Thermo Fisher) 용액을 첨가하고, 플레이트를 405 nm에서 판독하였다. 곡선을 4-변수 로지스틱(4PL) 회귀법을 사용하여 보정하여, EC50을 계산하였다.
CAR-468 T 세포가 분비하는 이중파라토프 융합 단백질은 C-말단에 His-태그가 없으므로, 추가적인 ELISA 검정을 전개하였다. CAR-405 T 세포에 대해 상기 기재된 바와 같이, 샘플을 모았다. 96 웰 플레이트를 4℃에서 0.1 M 카보네이트 중 1.0 ㎍/ml의 정제된 CLEC12A(Sino Biological), pH 9.5로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 1 시간 동안 RT에서 TBS 중 0.3% 탈지유로 차단시켰다. TBST(0.1 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween20)에서 3회 씻어낸 후, 100 ㎕의 세포 배양 상청액을 플레이트에 첨가하고, 1 시간 동안 RT에서 배양하였다. 정제된 융합 단백질 #357을 사용하여, 표준 곡선을 생성하였다. 플레이트를 TBST에서 3회 씻어낸 후, 1 ㎍/ml의 항-CD19 항체 FMC63(Novus)을 1 시간 동안 RT의 어두운 장소에서 첨가하였다. 플레이트를 다시 씻어내고, HRP-항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch)를 30분 동안 RT에서 첨가하였다. 웰에 결합된 퍼록시다제(peroxidase)를 효소적으로 정량화하기 위해, 1-단계 Ultra TMB-ELISA (Thermo Fisher) 용액을 첨가하고, 405 nm에서 플레이트를 판독하였다. 곡선을 4-변수 로지스틱(4PL) 회귀법을 사용하여 보정하여, EC50을 계산하였다.
IFNγ 생산을 결정하기 위해, CAR T 세포를 각각 3:1의 E:T 세포 비로 U937 세포에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 450 RCF에서 5 분 동안 원심분리하여, 상청액을 모았다. 이후, 혈구 계산 비드 검정(CBA, cytometric bead assay)(Becton Dickinson, 카탈로그 번호 551809)을 BD Accuri C6 장비에서 수행하여, 공동-배양 상청액에 존재하는 사이토카인을 측정하였다. 이후, FCAP 어레이 소프트웨어(Soft Flow Hungary Ltd, 카탈로그 번호 641488)를 사용하여 표준 곡선을 작성하고, 미공지된 샘플의 농도를 결정하였다.
CAR-CD19를 발현하고, HIS-태그 없는 이중파라토프 제작물(#518)을 분비하는 렌티바이러스 입자에 의해, T 세포를 형질도입시켰다. 상이한 공여자들로부터의 1차 T 세포를 사용하여 CAR T 세포(CAR468)를 제조하고, 발현 및 활성을 평가하여, 동일한 공여자로부터의 CAR405 T 세포와 비교하였다. CAR T 세포(CAR468 및 CAR405)는 표 9에 요약된 바와 같이, 다양한 변수들에 대해 동등하였다.
표 9
Figure pct00020
추가적으로, 도 17에 나타난 바와 같이, HIS 태그가 없는 이중파라토프 융합 단백질을 발현하는 CAR468 T 세포는, 다수의 CLEC12A-발현 AML 세포주들(U937; PL21; AML5)을 사멸시킬 뿐만 아니라, HIS 태그가 있는 동일한 이중파라토프 융합 단백질을 발현하는 CAR405보다 더욱 잘 사멸시킨다.
실시예 6: 이중파라토프 제작물의 생체내 세포독성
이중파라토프 융합 단백질을 분비하는 CAR-CD19 T 세포의 생체내 효능을 확인하기 위해, 이를 NSG™ 마우스에 도입시켰다. 모든 동물 연구는 Tufts University IACUC 승인된 지침을 따라 수행하였다. 6-8 주령의 NSG™ 마우스(Jackson Laboratories, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ)를 사용하였다. 마우스에게 25,000개의 U937-루시퍼라제 세포 IV를 접종하였다. 3일 차에, 공여자 38 또는 45부터의 107 개의 CAR-405, CAR-468 또는 형질도입되지 않은 T 세포(UTD)를 마우스에 IV 주사하고; 마우스의 코호트에는 T 세포를 주사하지 않았다(NA). 이미지화를 위해, 동물에 루시페린(luciferin)(150 mg/kg IP)을 주고, 이소플루란(isoflourane)으로 마취하였다. Perkin Elmer IVIS 200을 발광 수준 결정에 사용하였다. 마우스는 aset 루시퍼라제 제한치에 이르렀을 때 희생시켰다. U937 세포에 대해서는, 이 제한은 1×109 루시퍼라제 단위 또는 선속(total flux)이었다. 28일 이후 연구를 종료하였다.
HIS-태그가 있는 이중파라토프 제작물과 HIS-태그가 없는 이중파라토프 제작물을 발현하는, 2명의 상이한 공여자로부터의 CAR-T 세포들은, U937 이종이식체를 효율적으로 사멸시키지 않았다. (도 18).
실시예 7: 이중파라토프 제작물은 다수의 CLEC12A 대립형질에 결합한다.
본 발명자들은 단일 아미노산 차이를 갖는 2개의 형태의 CLEC12A이 있음을 관찰하였다(PCT/US2019/063691 참고). 정규 서열(UniProt; Q5QGZ9-1)은 리신을 함유한다(굵은 글씨체의 밑줄친 K; 서열 번호: 328).
Figure pct00021
그러나, Sino Biological(GenBank: EAW96132.1)로부터 입수한 시판용 재조합 CLEC12A 단백질의 서열은, 그 대신 글루타민을 함유한다(굵은 글씨체의 밑줄친 Q; 서열 번호: 329).
Figure pct00022
이전 연구에서, 본 발명자들은 VHH 클론 2H3이 AbClonal로부터의 CLEC12A (NCBI 참고 서열: NP_001193939.1, isoform3) 또는 Genscript로부터의 cDNA에는 결합하지 않는다는 사실을 발견하였는데, 상기 서열들은 둘 다 아미노산 254에 리신 잔기를 함유한다. 이것은 K/Q 아미노-산이 2H3 에피토프 내에 있거나, 2H3 에피토프와 가까우며, C-말단에 가까운 2H3 에피토프와 일치한다는 것을 암시한다. 반대로, 본 발명자들은 CLEC12A를 인식하는 scFv가 양쪽 단백질 변이체들에 결합한다는 사실을 발견하였다.
항-CLEC12A scFv에 대한 VHH 클론 2H3의 고융한 결합 특성들을 고려하여, 본 발명자들은 VHH 클론 2H3과 항-CLEC12A scFv를 둘 다 함유하는 이중파라토프 융합 단백질의 결합 특성을 시험하였다. HEK-293T 세포를, CLEC12A(GenScript)의 아미노산 254 “K” 버전, 또는 돌연변이 유발에 의해 생성된 이 위치에 “Q”를 갖는 버전을 발현하는 전체-길이의 CLEC12A(UniProt Q5QGZ9-1) cDNA에 의해 형질감염시켰다. 세포를 아큐타제(Accutase)에 의해 떼어내고, PBS로 씻어내고, 50 ㎕의 FACS 완충제(FB, PBS＋1% BSA, 및 0.1% 소듐 아자이드)에 현탁하고, 실온에서 10분 동안 인간 Fc 블록(Becton Dickinson)으로 차단시켰다. 이후, FACS 완충제(3 ㎍/㎖에서 시작하여 3배 희석됨)에 희석된 50 ㎕의 정제된 융합 단백질 #186, #330 또는 #357를 첨가하였다. 세포/융합 단백질의 혼합물을 30 분 동안 4℃에서 배양한 후, FACS 완충제로 2회 씻어내었다. 세포를 100 ㎕의 FACS 완충제에 현탁시키고, HIB19-PE(BioLegend 5 ㎕/시험)에 의해 염색하고, 30분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 FACS 완충제로 2회 씻어내고, PBS 중 1% PFA(Thermo Scientific)의 최종 농도로 고정시킨 후, 유세포 분석에 의해 분석하였다.
도 19는 (융합 단백질 #330에서) 항-CLEC12A VHH가 Q 형태에는 매우 잘 결합하나, K 형태에는 매우 약하게(10,000-배 더 약하게) 결합한다는 것을 나타낸다. 반대로, (융합 단백질 #186에서) 항-CLEC12A scFv는 두 형태 모두에 약하게, 그러나 유사한 강도로 결합한다. 확실히, 이중파라토프 융합 단백질(#357)은 양쪽 형태 모두에 매우 잘 결합한다(적색 및 황색 선). 이중파라토프 제작물은 Q 형태에 더 양호하게 결합하나(11.8 pM), K 형태에도 여전히 매우 잘 결합한다(43.1 pM). 이 데이터는 이중파라토프 융합 단백질이 표적 단백질(CLEC12A)에 대한 결합을 향상시킬 수 있다는 사실을 확고히 한다.
실시예 8: 이중 항원 결합 제작물의 추가적인 예
하나 초과의 항원에 결합하는 제작물의 유용성과 효과를 추가로 입증하기 위해, 항-CLEC12A VHH; 항-CD33 scFv; 및 CD19 ECD 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 생성하였다. CD19 ECD와 항-CD33 scFv를 함유하는 융합 단백질을 #410이라고 명명하였다. 항-CLEC12A VHH, 항-CD33 scFv 및 CD19 ECD를 함유하는 융합 단백질을 #440이라고 명명하였다.
CD19, CLEC12A 및 CD33에 대한 결합을 시험하기 위해, 정제된 융합 단백질 #330, #410 및 #440을 사용하여 ELISA를 전개하였다. 96 웰 플레이트를 0.1 M 카보네이트 중 1.0 μg/ml의 FMC63(Novus), pH 9.5로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 TBS 중 0.3% 탈지유로 차단하였다. TBST(0.1 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween20)에서 3회 씻어낸 후, 융합 단백질 상청액을 TBS 중 1% BSA에서 3-배 희석액을 사용하여 적정하고, 1 시간 실온에서 배양하였다. 항-His에 의한 탐지를 위해, TBST에서 3회 씻어낸 후, HRP-항-His(BioLegend)를 1:2000로 첨가하였다. 플레이트를 실온의 어두운 장소에서 1 시간 동안 배양하였다. CLEC12A에 대한 결합을 탐지하기 위해, 비오틴화 CLEC12A를 0.5 ㎍/㎖로 첨가하고, 1 시간 동안 배양하였다. 이후, 여기에 HRP-SA(Pierce)를 1:2000로 첨가하고, 실온의 어두운 장소에서 1 시간 동안 배양하였다. CD33에 대한 결합을 시험하기 위해, 비오틴화 CD33를 0.5 ㎍/㎖로 첨가하고, 1 시간 동안 배양하였다. 이후, 여기에 HRP-SA(Pierce)를 1:2000로 첨가하고, 실온의 어두운 장소에서 1 시간 동안 배양하였다. 이후, 1-단계 Ultra TMB-ELISA(Thermo Fisher) 용액을 첨가하고, 플레이트를 405 nm에서 판독하였다. 곡선을 4-변수 로지스틱(4PL) 회귀법을 사용하여 보정하여, EC50을 계산하였다.
세포에 대한 융합 단백질의 결합을 시험하기 위해, U937 또는 Molm14 세포를 PBS로 씻어내고, 50 ㎕의 FACS 완충제 (FB, PBS＋1% BSA, 및 0.1% 소듐 아자이드)에 현탁시키고, 인간 Fc 블록(Becton Dickinson)으로 실온에서 10분 동안 차단시켰다. 이후, FB 중 50 ㎕의 정제된 융합 단백질 #330, #410 또는 #440 희석액(3 ㎍/㎖에서 시작하여 3-배 희석됨)을 첨가하였다. 세포/융합 단백질의 혼합물을 30분 동안 4℃에서 배양한 후, FB로 2회 씻어내었다. 세포를 100 ㎕의 FB에 현탁하고, 항-CD19 항체 FMC63-PE(Millipore 5 ㎕/시험)로 염색하고, 30분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 FB로 2회 씻어내고, PBS(Thermo Scientific) 중 1% PFA의 최종 농도로 고정시킨 후, 유세포 분석에 의해 분석하였다.
세포독성을 시험하기 위해, 루시퍼라제 표지된 Molm14 또는 U937 세포를 CAR19 T 세포 제제를 사용하여 세포독성 사멸에 대한 표적으로 삼고, 정제된 단백질 #330, #410 및 #440을 용량 적정하여 첨가하였다. RPMI 배지 중의 1×104 개의 표적 세포를 각 웰(96 투명한 둥근 바닥 플레이트)에 첨가하였다. 단백질 적정은 180 ng/ml에서 시작하여, 상응하는 웰(웰당 25 ㎕)에 3-배 연속 적정하였다. CAR-CD19 T 세포를 다양한 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 48 시간 후, 플레이트를 (450 RCF에서 5분 동안) 원심 분리하고, 세포를 PBS로 1회 씻어낸 후, 2번째로 원심분리하였다. 20 ㎕의 용해 완충제를 각 웰에 첨가하였다. 세포 용해물을 96 불투명 백색 플레이트에 옮겼다. 플레이트를 주사기가 달린 발광계(Glomax Multi Detection System, Promega)에서 판독하였다. 사멸 퍼센트는 실험군 대 대조군(표적 세포 단독 또는 표적 세포 플러스 융합 단백질 단독)의 평균 발광 손실에 기초하여 계산하였다.
표 10은 CLEC12A 및 CD33에 대한 이중 항원 결합 융합 단백질(#440); 항-CLEC12A VHH 2H3 융합 단백질(#330); 및 항-CD33 scFv 융합 단백질(#410)의 결합 역량을 나타내는 ELISA 결과를 제공한다. 이중 항원 결합 융합 단백질은 양쪽 요소(CLEC12A 및 CD33)에 유사한 EC50 값으로 동등하게 잘 결합하였고, 이는 이중 항원 제작물 내의 각 개별 요소가 독립적으로 작용하고 있다는 사실을 나타낸다. 도 20은 이중 항원 결합 융합 단백질이 각각 개별 항원을 발현하는 U937 세포에 결합할 수 있다는 사실을 입증한다. 도 21은 U937(도 21b) 및 Molm14(도 21a) 세포주에 대한 3개의 융합 단백질의 세포독성을 보여준다. U937 세포에 대한 융합 단백질의 세포독성은, 결합 데이터와 매치되는데, 즉 비록 이중 항원 단백질은 본질적으로 동일한 활성을 갖기는 하지만, 최고의 세포독성은 가장 강력한 결합자인 VHH의 결합과 매치된다. 흥미롭게도, Molm14 세포주에서 CD33에 대한 scFv와 이중 항원 결합자는 대략 동등한 효능을 갖는 반면, CLEC12A에 대한 VHH는 덜 강력하다(VHH 2H3 단독). 이것은 Molm14 세포에서 양쪽 대립형질에 의한 CLEC12A의 K 변이체의 발현으로부터 발생할 수 있다.
Figure pct00023
서열 목록
서열 번호: 1
Figure pct00024
Figure pct00025
서열 번호: 2
Figure pct00026
VHH 클론 서열
서열 번호: 203 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00027
서열 번호: 204 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00028
서열 번호: 205 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00029
서열 번호: 206 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00030
서열 번호: 207 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00031
서열 번호: 208 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00032
서열 번호: 209 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00033
서열 번호: 210 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00034
서열 번호: 211 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00035
서열 번호: 212 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00036
서열 번호: 213 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00037
서열 번호: 214 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00038
서열 번호: 215 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00039
서열 번호: 216 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00040
서열 번호: 217 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00041
서열 번호: 218 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00042
서열 번호: 219 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00043
서열 번호: 220 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00044
서열 번호: 221 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS) ):
Figure pct00045
서열 번호: 222 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00046
서열 번호: 223 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00047
서열 번호: 224 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00048
서열 번호: 225 (밑줄친 부분은 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내고; C-말단 쪽의 굵은 이탤릭체는 (i) 9개 아미노산의 링커 (TSGPGGQGA), (ii) myc-태그 (EQKLISEEDL), (iii) 2개 아미노산의 링커 (GA), (iv) 6개-히스티딘 태그 (HHHHHH), 및 (v) 추가적인 3개의 아미노산 (GAS)을 나타낸다)
Figure pct00049
이중파라토프 제작물 서열
서열 특징에 대한 핵심 사항: 신호 서열에는 밑줄이 그어져 있고; CD19 서열은 이탤릭체로 나타나 있고; 항체 또는 이들의 절편 (예를 들어, scFv 또는 VHH)은 굵게 나타나 있되, CDR은 굵은 글씨체로 밑줄이 그어져 있으며; 스페이서/태그 서열 (myc-His 또는 His)은 굵은 이탤릭체로 나타나 있고 ; CAR 서열은 회색 음영 처리가 되어 있고, 굵은 글씨체로 나타난 CAR 내에 플래그(flag) 태그가 있고; 퓨린(Furin) 절단부와 P2A 부위는 밑줄친 굵은 이탤릭체 로 되어 있다.
제작물 #186
뉴클레오티드: 서열 번호: 300
Figure pct00050
Figure pct00051
아미노산: 서열 번호: 301
Figure pct00052
제작물 #321
뉴클레오티드: 서열 번호: 302
Figure pct00053
Figure pct00054
아미노산: 서열 번호: 303
Figure pct00055
제작물 #330
뉴클레오티드: 서열 번호: 304
Figure pct00056
Figure pct00057
아미노산: 서열 번호: 305
Figure pct00058
제작물 #357
뉴클레오티드: 서열 번호: 306
Figure pct00059
Figure pct00060
아미노산: 서열 번호: 307
Figure pct00061
제작물 #221
뉴클레오티드: 서열 번호: 308
Figure pct00062
Figure pct00063
아미노산: 서열 번호: 309
Figure pct00064
Figure pct00065
제작물 #405
뉴클레오티드: 서열 번호: 310
Figure pct00066
Figure pct00067
아미노산: 서열 번호: 311
Figure pct00068
Figure pct00069
제작물 #355
뉴클레오티드: 서열 번호: 312
Figure pct00070
Figure pct00071
아미노산: 서열 번호: 313
Figure pct00072
제작물 #356
뉴클레오티드: 서열 번호: 314
Figure pct00073
Figure pct00074
아미노산: 서열 번호: 315
Figure pct00075
Figure pct00076
제작물 #142
뉴클레오티드: 서열 번호: 316
Figure pct00077
Figure pct00078
아미노산: 서열 번호: 317
Figure pct00079
문헌[Akbarzadeh-Sharbaf 외 2012 Adv Biomed Res. 1:21]에 나온 트라스투주맙에 대한 CDR
제작물 #260 (항-CLEC12a CAR)
뉴클레오티드: 서열 번호: 318
Figure pct00080
Figure pct00081
아미노산: 서열 번호: 319
Figure pct00082
제작물 #440
뉴클레오티드 서열 번호: 320
Figure pct00083
Figure pct00084
아미노산 서열 번호: 321
Figure pct00085
Figure pct00086
제작물 #518
뉴클레오티드 서열 번호: 322
Figure pct00087
Figure pct00088
아미노산 서열 번호: 323
Figure pct00089
제작물 #410
뉴클레오티드 서열 번호: 324
Figure pct00090
Figure pct00091
아미노산 서열 번호: 325
Figure pct00092
제작물 # 468
뉴클레오티드 서열 번호: 326
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
아미노산 서열 번호: 327
Figure pct00096
Figure pct00097
서열 번호: 328
Figure pct00098
서열 번호: 329
Figure pct00099
제작물 # 408
뉴클레오티드 서열 번호: 330
Figure pct00100
Figure pct00101
아미노산 서열 번호: 331
Figure pct00102
SEQUENCE LISTING <110> ALETA BIOTHERAPEUTICS INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER <130> 2012106-0090 <140> PCT/US2020/029967 <141> 2020-04-24 <150> 62/839,376 <151> 2019-04-26 <160> 390 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cccgaggaac ctctagtggt gaaggtggaa gagggagata acgctgtgct gcagtgcctc 60 aaggggacct cagatggccc cactcagcag ctgacctggt ctcgggagtc cccgcttaaa 120 cccttcttaa aactcagcct ggggctgcca ggcctgggaa tccacatgag gcccctggcc 180 atctggcttt tcatcttcaa cgtctctcaa cagatggggg gcttctacct gtgccagccg 240 gggcccccct ctgagaaggc ctggcagcct ggctggacag tcaatgtgga gggcagcggg 300 gagctgttcc ggtggaatgt ttcggaccta ggtggcctgg gctgtggcct gaagaacagg 360 tcctcagagg gccccagctc cccttccggg aagctcatga gccccaagct gtatgtgtgg 420 gccaaagacc gccctgagat ctgggaggga gagcctccgt gtctcccacc gagggacagc 480 ctgaaccaga gcctcagcca ggacctcacc atggcccctg gctccacact ctggctgtcc 540 tgtggggtac cccctgactc tgtgtccagg ggccccctct cctggaccca tgtgcacccc 600 aaggggccta agtcattgct gagcctagag ctgaaggacg atcgcccggc cagagatatg 660 tgggtaatgg agacgggtct gttgttgccc cgggccacag ctcaagacgc tggaaagtat 720 tattgtcacc gtggcaacct gaccatgtca ttccacctgg agatcactgc tcggccagta 780 ctatggcact ggctgctgag gactggtggc tggaag 816 <210> 2 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val 1 5 10 15 Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr 20 25 30 Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly 35 40 45 Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe 50 55 60 Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro 65 70 75 80 Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val 85 90 95 Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly 100 105 110 Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro 115 120 125 Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg 130 135 140 Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser 145 150 155 160 Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr 165 170 175 Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro 180 185 190 Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser 195 200 205 Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu 210 215 220 Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr 245 250 255 Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys 260 265 270 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <400> 23 000 <210> 24 <400> 24 000 <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <400> 40 000 <210> 41 <400> 41 000 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <400> 43 000 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <400> 45 000 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <400> 47 000 <210> 48 <400> 48 000 <210> 49 <400> 49 000 <210> 50 <400> 50 000 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <400> 52 000 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <400> 54 000 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <400> 59 000 <210> 60 <400> 60 000 <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <400> 62 000 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 <400> 64 000 <210> 65 <400> 65 000 <210> 66 <400> 66 000 <210> 67 <400> 67 000 <210> 68 <400> 68 000 <210> 69 <400> 69 000 <210> 70 <400> 70 000 <210> 71 <400> 71 000 <210> 72 <400> 72 000 <210> 73 <400> 73 000 <210> 74 <400> 74 000 <210> 75 <400> 75 000 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <400> 77 000 <210> 78 <400> 78 000 <210> 79 <400> 79 000 <210> 80 <400> 80 000 <210> 81 <400> 81 000 <210> 82 <400> 82 000 <210> 83 <400> 83 000 <210> 84 <400> 84 000 <210> 85 <400> 85 000 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <400> 88 000 <210> 89 <400> 89 000 <210> 90 <400> 90 000 <210> 91 <400> 91 000 <210> 92 <400> 92 000 <210> 93 <400> 93 000 <210> 94 <400> 94 000 <210> 95 <400> 95 000 <210> 96 <400> 96 000 <210> 97 <400> 97 000 <210> 98 <400> 98 000 <210> 99 <400> 99 000 <210> 100 <400> 100 000 <210> 101 <400> 101 000 <210> 102 <400> 102 000 <210> 103 <400> 103 000 <210> 104 <400> 104 000 <210> 105 <400> 105 000 <210> 106 <400> 106 000 <210> 107 <400> 107 000 <210> 108 <400> 108 000 <210> 109 <400> 109 000 <210> 110 <400> 110 000 <210> 111 <400> 111 000 <210> 112 <400> 112 000 <210> 113 <400> 113 000 <210> 114 <400> 114 000 <210> 115 <400> 115 000 <210> 116 <400> 116 000 <210> 117 <400> 117 000 <210> 118 <400> 118 000 <210> 119 <400> 119 000 <210> 120 <400> 120 000 <210> 121 <400> 121 000 <210> 122 <400> 122 000 <210> 123 <400> 123 000 <210> 124 <400> 124 000 <210> 125 <400> 125 000 <210> 126 <400> 126 000 <210> 127 <400> 127 000 <210> 128 <400> 128 000 <210> 129 <400> 129 000 <210> 130 <400> 130 000 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 000 <210> 133 <400> 133 000 <210> 134 <400> 134 000 <210> 135 <400> 135 000 <210> 136 <400> 136 000 <210> 137 <400> 137 000 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <400> 139 000 <210> 140 <400> 140 000 <210> 141 <400> 141 000 <210> 142 <400> 142 000 <210> 143 <400> 143 000 <210> 144 <400> 144 000 <210> 145 <400> 145 000 <210> 146 <400> 146 000 <210> 147 <400> 147 000 <210> 148 <400> 148 000 <210> 149 <400> 149 000 <210> 150 <400> 150 000 <210> 151 <400> 151 000 <210> 152 <400> 152 000 <210> 153 <400> 153 000 <210> 154 <400> 154 000 <210> 155 <400> 155 000 <210> 156 <400> 156 000 <210> 157 <400> 157 000 <210> 158 <400> 158 000 <210> 159 <400> 159 000 <210> 160 <400> 160 000 <210> 161 <400> 161 000 <210> 162 <400> 162 000 <210> 163 <400> 163 000 <210> 164 <400> 164 000 <210> 165 <400> 165 000 <210> 166 <400> 166 000 <210> 167 <400> 167 000 <210> 168 <400> 168 000 <210> 169 <400> 169 000 <210> 170 <400> 170 000 <210> 171 <400> 171 000 <210> 172 <400> 172 000 <210> 173 <400> 173 000 <210> 174 <400> 174 000 <210> 175 <400> 175 000 <210> 176 <400> 176 000 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <400> 178 000 <210> 179 <400> 179 000 <210> 180 <400> 180 000 <210> 181 <400> 181 000 <210> 182 <400> 182 000 <210> 183 <400> 183 000 <210> 184 <400> 184 000 <210> 185 <400> 185 000 <210> 186 <400> 186 000 <210> 187 <400> 187 000 <210> 188 <400> 188 000 <210> 189 <400> 189 000 <210> 190 <400> 190 000 <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <400> 200 000 <210> 201 <400> 201 000 <210> 202 <400> 202 000 <210> 203 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 203 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 204 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 204 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 205 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 205 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 206 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 206 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 207 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 207 Gln Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 208 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 208 Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 209 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 209 Gln Val Gln Leu Gln Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 210 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 210 Gln Val Gln Leu Gln Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 211 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 211 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 212 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 212 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 213 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn 20 25 30 Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 35 40 45 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu 115 120 125 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His 130 135 140 His Gly Ala Ser 145 <210> 214 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Asp Thr Arg Ser Ile Asn 20 25 30 Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp 85 90 95 Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu 115 120 125 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala 130 135 140 Ser 145 <210> 215 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 215 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile Asn 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp 85 90 95 Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu 115 120 125 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala 130 135 140 Ser 145 <210> 216 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 216 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Glu Leu Arg Gly Ser Asp Tyr Tyr Arg Gly Pro Ile Arg Glu 100 105 110 Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 130 135 140 Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 145 150 155 <210> 217 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 217 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Thr Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Ile Thr Val Val Val Thr Pro Asp Glu 100 105 110 Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 130 135 140 Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 145 150 155 <210> 218 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 218 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Ile 50 55 60 Val Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Lys Leu Val Asp Ser Gly Trp Tyr Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln 115 120 125 Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His 130 135 140 His His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 219 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 219 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Ala Thr Ser Asn Val Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Gln Asp Trp Ala Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly 115 120 125 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His 130 135 140 His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 220 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 220 Gln Val Gln Leu Gln Ala Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Thr Met Phe Ser Gly Lys 20 25 30 Asp Val Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Val Glu Val Val 35 40 45 Ala Thr Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Phe Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Asn Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Met Cys His 85 90 95 Phe Leu Trp Gly Arg His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 130 135 140 <210> 221 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Gln Val Gln Leu Gln Ala Phe Gly Gly Gly Met Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Asn Asp Ile Ser Gly Ser 20 25 30 Ala Met Ala Trp Tyr Arg Ala His Leu Gly Ala Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Val Asp Ala Pro Arg Glu Arg Pro Phe Tyr Ile Asp Pro Val Ile 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Arg Asn Lys Met Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asp Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Trp Cys Gly 85 90 95 Pro Ser Leu Arg Thr Phe His Gly Arg Glu Trp Tyr Arg Pro Pro Trp 100 105 110 Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 130 135 140 Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 145 150 155 <210> 222 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 222 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Met Val 35 40 45 Ala Val Val Ser Arg Phe Gly Glu Thr Thr Tyr Thr Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ile Asn Arg Asn Asn Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Arg Ile Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Arg Ile Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly 115 120 125 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His 130 135 140 His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 223 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Gln Val Gln Leu Gln Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Asn Met Leu Asp Leu Asn 20 25 30 Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Gly Glu Leu Val Ala Ala Leu Gly Ile 35 40 45 Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Asn Phe Glu Ser 85 90 95 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala 115 120 125 His His His His His His Gly Ala Ser 130 135 <210> 224 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 224 Ala Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asp Arg Ser Ile Asn 20 25 30 Val Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Lys 85 90 95 Ala Asp Thr Arg Trp Gly Gly Met Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys 115 120 125 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly 130 135 140 Ala Ser 145 <210> 225 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 225 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Arg Thr Ile Asp Asn Gly 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Tyr Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg His Thr Leu Asp 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Thr Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Arg Arg Gly Val Asp Leu Arg Arg Asn Ser Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro 115 120 125 Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly 130 135 140 Ala His His His His His His Gly Ala Ser 145 150 <210> 226 <400> 226 000 <210> 227 <400> 227 000 <210> 228 <400> 228 000 <210> 229 <400> 229 000 <210> 230 <400> 230 000 <210> 231 <400> 231 000 <210> 232 <400> 232 000 <210> 233 <400> 233 000 <210> 234 <400> 234 000 <210> 235 <400> 235 000 <210> 236 <400> 236 000 <210> 237 <400> 237 000 <210> 238 <400> 238 000 <210> 239 <400> 239 000 <210> 240 <400> 240 000 <210> 241 <400> 241 000 <210> 242 <400> 242 000 <210> 243 <400> 243 000 <210> 244 <400> 244 000 <210> 245 <400> 245 000 <210> 246 <400> 246 000 <210> 247 <400> 247 000 <210> 248 <400> 248 000 <210> 249 <400> 249 000 <210> 250 <400> 250 000 <210> 251 <400> 251 000 <210> 252 <400> 252 000 <210> 253 <400> 253 000 <210> 254 <400> 254 000 <210> 255 <400> 255 000 <210> 256 <400> 256 000 <210> 257 <400> 257 000 <210> 258 <400> 258 000 <210> 259 <400> 259 000 <210> 260 <400> 260 000 <210> 261 <400> 261 000 <210> 262 <400> 262 000 <210> 263 <400> 263 000 <210> 264 <400> 264 000 <210> 265 <400> 265 000 <210> 266 <400> 266 000 <210> 267 <400> 267 000 <210> 268 <400> 268 000 <210> 269 <400> 269 000 <210> 270 <400> 270 000 <210> 271 <400> 271 000 <210> 272 <400> 272 000 <210> 273 <400> 273 000 <210> 274 <400> 274 000 <210> 275 <400> 275 000 <210> 276 <400> 276 000 <210> 277 <400> 277 000 <210> 278 <400> 278 000 <210> 279 <400> 279 000 <210> 280 <400> 280 000 <210> 281 <400> 281 000 <210> 282 <400> 282 000 <210> 283 <400> 283 000 <210> 284 <400> 284 000 <210> 285 <400> 285 000 <210> 286 <400> 286 000 <210> 287 <400> 287 000 <210> 288 <400> 288 000 <210> 289 <400> 289 000 <210> 290 <400> 290 000 <210> 291 <400> 291 000 <210> 292 <400> 292 000 <210> 293 <400> 293 000 <210> 294 <400> 294 000 <210> 295 <400> 295 000 <210> 296 <400> 296 000 <210> 297 <400> 297 000 <210> 298 <400> 298 000 <210> 299 <400> 299 000 <210> 300 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 300 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540 aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720 gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccaggagga 840 ggtgggtctg gaggtggagg atctggtgga ggtgggtctg gaggaggtgg gtctgacatg 900 gcccaggtgc agctgcagga gagcggcccc ggcctggtga agcccagcga gaccctgagc 960 ctgacctgcg tggtgagcgg cggcagcatc agcagcagca actggtggag ctgggtgagg 1020 cagccccccg gcaagggcct ggagtggatc ggcgagatct accacagcgg cagccccgac 1080 tacaacccca gcctgaagag cagggtgacc atcagcgtgg acaagagcag gaaccagttc 1140 agcctgaagc tgagcagcgt gaccgccgcc gacaccgccg tgtactactg cgccaaggtg 1200 agcaccggcg gcttcttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcggc 1260 ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcgagatcga gctgacccag 1320 agccccagca gcctgagcgc cagcgtgggc gacagggtga ccatcacctg cagggccagc 1380 cagagcatca gcagctacct gaactggtac cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg 1440 ctgatctacg ccgccagcag cctgcagagc ggcgtgccca gcaggttcag cggcagcggc 1500 agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc agcctgcagc ccgaggactt cgccacctac 1560 tactgccagc agagctacag cacccccccc accttcggcc ccggcaccaa ggtggagatc 1620 aagaggaccc accaccacca ccaccac 1647 <210> 301 <211> 549 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 301 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Met Ala Gln Val Gln 290 295 300 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp 325 330 335 Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu 340 345 350 Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg 355 360 365 Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu 370 375 380 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val 385 390 395 400 Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 405 410 415 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 420 425 430 Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 435 440 445 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 450 455 460 Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 465 470 475 480 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 485 490 495 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 500 505 510 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr 515 520 525 Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr His 530 535 540 His His His His His 545 <210> 302 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 302 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggagcccc tggtggtgaa ggtggaggag ggcgacaccg ccgtgctgcc ctgcctgaag 120 ggcaccagcg acggccccac ccagcagctg acctggagca gggagagccc cctgaagccc 180 ttcctgaagt acagcctggg cgtgcccggc ctgggcgtgc acgtgaggcc cgacgccatc 240 agcgtggtga tcaggaacgt gagccagcag atgggcggct tctacctgtg ccagcccggc 300 ccccccagcg agaaggcctg gcagcccggc tggaccgtga acgtggaggg cagcggcgag 360 ctgttcaggt ggaacgtgag cgacctgggc ggcctgggct gcggcctgaa gaacaggagc 420 agcgagggcc ccagcagccc cagcggcaag ctgatgagcc ccaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggacaggc ccgagatctg ggagggcgag cccccctgcc tgccccccag ggacagcctg 540 aaccagagcc tgagccagga cctgaccatg gcccccggca gcaccctgtg gctgagctgc 600 ggcgtgcccc ccgacagcgt gagcaggggc cccctgagct ggacccacgt gcaccccaag 660 ggccccaaga gcctgctgag cctggagctg aaggacgaca ggcccgccag ggagatgatc 720 gtggacgaga ccggcctgct gctgcccagg gccaccgccc aggacgccgg caagtggtac 780 tgcagcaggg gcaacgtgac caccagctac cacctggaga tcaccgccag gcccgtgaag 840 gcccacagcg acctgaggac cggcggctgg aagggaggag gtgggtctgg aggtggagga 900 tctggtggag gtgggtctgg aggaggtgga tcccaggtgc agctgcaagc gtctggggga 960 ggcttggtgc aggctggggg gtctctgaga ctctcctgtg cagcctcagg aagcatcttc 1020 gctattaatg aaatcaatct tatggggtgg taccgccagg ctccagggaa gcagcgcgag 1080 ttggtcgcag cttgtgctag tgatggcaac acatactatg cggactccgt gaagggccga 1140 ttcaccatct ccagagacaa cgccgagaaa acggtgtatc tgcagatgaa caacctgaaa 1200 cctgacgaca cagccgtcta ttactgtgat gcgaattcga gggggaatta ttattcgggc 1260 caggggaccc aggtcaccgt ttcctcaact agtggcccgg gaggccaagg cgcagaacaa 1320 aaactcatct cagaagagga tctgggcgca caccatcacc accatcatgg cgcatct 1377 <210> 303 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 303 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Thr Ala Val Leu Pro Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr 50 55 60 Ser Leu Gly Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile 65 70 75 80 Ser Val Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Glu Met Ile 225 230 235 240 Val Asp Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Trp Tyr Cys Ser Arg Gly Asn Val Thr Thr Ser Tyr His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Lys Ala His Ser Asp Leu Arg Thr Gly 275 280 285 Gly Trp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly 305 310 315 320 Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 325 330 335 Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp Tyr Arg 340 345 350 Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp 355 360 365 Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 370 375 380 Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys 385 390 395 400 Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn 405 410 415 Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly 420 425 430 Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 435 440 445 Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 450 455 <210> 304 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 304 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgc aggagtctgg gggaggcttg gtgcaggctg gggggtccct tagactctcc 120 tgtgtagcct ctggaagcat cagaagtatc aatgtcatgg gctggtaccg ccaggctcca 180 gggaagcagc gcgagttggt cgcagcttgt gctagtgatg gcaacacata ctatgcggac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgccg agaaaacggt gtatctgcag 300 atgaacaacc tgaaacctga cgacacagcc gtctattact gtgatgcgaa ttcgaggggg 360 aattattatt cgggccaggg gacccaggtc accgtttcct caactagtgg cccgggaggc 420 caaggcgcag gaggaggtgg gtctggaggt ggaggatctg gtggaggtgg gtctggagga 480 ggtggatccc ccgaggaacc tctagtggtg aaggtggaag agggagatac cgctgccctg 540 tggtgcctca aggggacctc agatggcccc actcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc 600 ccgcttaaac ccttcttaaa atacagcctg ggggtgccag gcctgggagt gcacgtgagg 660 cccgacgcca tcagcgtggt tatccggaac gtctctcaac agatgggggg cttctacctg 720 tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc tggcagcctg gctggacagt caatgtggag 780 ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg 840 aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc ccttccggga agctcatgag ccccaagctg 900 tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc tgggagggag agcctccgtg tctcccaccg 960 agggacagcc tgaaccagag cctcagccgg gacctcaccg ttgcccctgg ctccacactc 1020 tggctgtcct gtggggtacc ccctgactct gtgtccaggg gccccctctc ctggacccat 1080 gtgcacccca aggggcctaa gtcattgctg agcctagagc tgaaggacga tcgcccggcc 1140 agagatatgt gggtaatggg cacgagcctg atgttgcccc gggccacagc tcaagacgct 1200 ggaaagtggt attgtcaccg tggcaacctg accatgtcat tccacctgga gatcactgct 1260 cggccatcta gacatcatca ccatcaccat 1290 <210> 305 <211> 430 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 305 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg 35 40 45 Ser Ile Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 50 55 60 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 85 90 95 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 165 170 175 Thr Ala Ala Leu Trp Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 180 185 190 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr 195 200 205 Ser Leu Gly Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile 210 215 220 Ser Val Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 225 230 235 240 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 245 250 255 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 260 265 270 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 275 280 285 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 290 295 300 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 305 310 315 320 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Arg Asp Leu Thr Val Ala Pro 325 330 335 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 340 345 350 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 355 360 365 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 370 375 380 Val Met Gly Thr Ser Leu Met Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 385 390 395 400 Gly Lys Trp Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 405 410 415 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Ser Arg His His His His His His 420 425 430 <210> 306 <211> 2085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 306 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgac 60 atggcccagg tgcagctgca ggagagcggc cccggcctgg tgaagcccag cgagaccctg 120 agcctgacct gcgtggtgag cggcggcagc atcagcagca gcaactggtg gagctgggtg 180 aggcagcccc ccggcaaggg cctggagtgg atcggcgaga tctaccacag cggcagcccc 240 gactacaacc ccagcctgaa gagcagggtg accatcagcg tggacaagag caggaaccag 300 ttcagcctga agctgagcag cgtgaccgcc gccgacaccg ccgtgtacta ctgcgccaag 360 gtgagcaccg gcggcttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 420 ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgagat cgagctgacc 480 cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg ggcgacaggg tgaccatcac ctgcagggcc 540 agccagagca tcagcagcta cctgaactgg taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag 600 ctgctgatct acgccgccag cagcctgcag agcggcgtgc ccagcaggtt cagcggcagc 660 ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc agcagcctgc agcccgagga cttcgccacc 720 tactactgcc agcagagcta cagcaccccc cccaccttcg gccccggcac caaggtggag 780 atcaagagga ccggcggcgg aggatctggc ggaggtggaa gcggaggcgg aggaagcggt 840 ggcggcggat ctcaggtgca gctgcaggag tctgggggag gcttggtgca ggctgggggg 900 tcccttagac tctcctgtgt agcctctgga agcatcagaa gtatcaatgt catgggctgg 960 taccgccagg ctccagggaa gcagcgcgag ttggtcgcag cttgtgctag tgatggcaac 1020 acatactatg cggactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccgagaaa 1080 acggtgtatc tgcagatgaa caacctgaaa cctgacgaca cagccgtcta ttactgtgat 1140 gcgaattcga gggggaatta ttattcgggc caggggaccc aggtcaccgt ttcctcaact 1200 agtggcccgg gaggccaagg tgcaggagga ggggggtctg ggggtggagg atctggtgga 1260 ggtgggtctg gaggaggtgg atcccccgag gaacctctag tggtgaaggt ggaagaggga 1320 gataccgctg ccctgtggtg cctcaagggg acctcagatg gccccactca gcagctgacc 1380 tggtctcggg agtccccgct taaacccttc ttaaaataca gcctgggggt gccaggcctg 1440 ggagtgcacg tgaggcccga cgccatcagc gtggttatcc ggaacgtctc tcaacagatg 1500 gggggcttct acctgtgcca gccggggccc ccctctgaga aggcctggca gcctggctgg 1560 acagtcaatg tggagggcag cggggagctg ttccggtgga atgtttcgga cctaggtggc 1620 ctgggctgtg gcctgaagaa caggtcctca gagggcccca gctccccttc cgggaagctc 1680 atgagcccca agctgtatgt gtgggccaaa gaccgccctg agatctggga gggagagcct 1740 ccgtgtctcc caccgaggga cagcctgaac cagagcctca gccgggacct caccgttgcc 1800 cctggctcca cactctggct gtcctgtggg gtaccccctg actctgtgtc caggggcccc 1860 ctctcctgga cccatgtgca ccccaagggg cctaagtcat tgctgagcct agagctgaag 1920 gacgatcgcc cggccagaga tatgtgggta atgggcacga gcctgatgtt gccccgggcc 1980 acagctcaag acgctggaaa gtggtattgt caccgtggca acctgaccat gtcattccac 2040 ctggagatca ctgctcggcc atctagacat catcaccatc accat 2085 <210> 307 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 307 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 20 25 30 Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly 35 40 45 Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys 85 90 95 Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 165 170 175 Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 180 185 190 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser 195 200 205 Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly 245 250 255 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu 275 280 285 Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile Asn Val Met Gly Trp 305 310 315 320 Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala 325 330 335 Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 340 345 350 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn 355 360 365 Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg 370 375 380 Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr 385 390 395 400 Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 405 410 415 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Glu Glu Pro 420 425 430 Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Thr Ala Ala Leu Trp Cys Leu 435 440 445 Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu 450 455 460 Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr Ser Leu Gly Val Pro Gly Leu 465 470 475 480 Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile Ser Val Val Ile Arg Asn Val 485 490 495 Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser 500 505 510 Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly 515 520 525 Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly 530 535 540 Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu 545 550 555 560 Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp 565 570 575 Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser 580 585 590 Leu Ser Arg Asp Leu Thr Val Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser 595 600 605 Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr 610 615 620 His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys 625 630 635 640 Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Gly Thr Ser Leu Met 645 650 655 Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Trp Tyr Cys His Arg 660 665 670 Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Ser 675 680 685 Arg His His His His His His 690 695 <210> 308 <211> 3333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 308 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg aggggggact 360 aagttggaaa taacaggagg cggcgggtct ggaggtggag gatctggtgg tggcgggtct 420 ggaggcggcg ggtctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 480 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 1740 aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 1800 ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 1860 aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 1920 gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 1980 ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 2040 ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 2100 aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 2160 tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 2220 agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 2280 tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc cgcggccccc tctcctggac ccatgtgcac 2340 cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 2400 atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 2460 tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcct 2520 ggcggcggcg ggtctggagg tggaggatct ggtggtggcg ggtctggtgg cggcgggtct 2580 gacatggccc aggtgcagct gcaggagagc ggccccggcc tggtgaagcc cagcgagacc 2640 ctgagcctga cctgcgtggt gagcggcggc agcatcagca gcagcaactg gtggagctgg 2700 gtgaggcagc cccccggcaa gggcctggag tggatcggcg agatctacca cagcggcagc 2760 cccgactaca accccagcct gaagagcagg gtgaccatca gcgtggacaa gagcaggaac 2820 cagttcagcc tgaagctgag cagcgtgacc gccgccgaca ccgccgtgta ctactgcgcc 2880 aaggtgagca ccggcggctt cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 2940 agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga gatcgagctg 3000 acccagagcc ccagcagcct gagcgccagc gtgggcgaca gggtgaccat cacctgcagg 3060 gccagccaga gcatcagcag ctacctgaac tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc 3120 aagctgctga tctacgccgc cagcagcctg cagagcggcg tgcccagcag gttcagcggc 3180 agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc 3240 acctactact gccagcagag ctacagcacc ccccccacct tcggccccgg caccaaggtg 3300 gagatcaaga ggacccacca ccaccaccac cac 3333 <210> 309 <211> 1111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 309 Met Arg Leu Leu Val Leu Leu Trp Gly Cys Leu Leu Leu Pro Gly Tyr 1 5 10 15 Glu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser 35 40 45 Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu 100 105 110 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 145 150 155 160 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp 165 170 175 Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 195 200 205 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 210 215 220 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 260 265 270 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 275 280 285 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 290 295 300 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 305 310 315 320 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 325 330 335 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 340 345 350 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 355 360 365 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg 370 375 380 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 385 390 395 400 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 405 410 415 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 420 425 430 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 435 440 445 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 450 455 460 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 465 470 475 480 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 485 490 495 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 500 505 510 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 515 520 525 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala 530 535 540 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 545 550 555 560 Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr 565 570 575 Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu 580 585 590 Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro 595 600 605 Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu 610 615 620 Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu 625 630 635 640 Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe 645 650 655 Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly 660 665 670 Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val 675 680 685 Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu 690 695 700 Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val 705 710 715 720 Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu 725 730 735 Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met 740 745 750 Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser 755 760 765 Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro 770 775 780 Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp 785 790 795 800 Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln 805 810 815 Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe 820 825 830 His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 835 840 845 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Met Ala Gln 850 855 860 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr 865 870 875 880 Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn 885 890 895 Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 900 905 910 Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 915 920 925 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu 930 935 940 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 945 950 955 960 Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 965 970 975 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 980 985 990 Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 995 1000 1005 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 1010 1015 1020 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 1025 1030 1035 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly 1040 1045 1050 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1055 1060 1065 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 1070 1075 1080 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr 1085 1090 1095 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr His His His His His His 1100 1105 1110 <210> 310 <211> 3771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 310 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg aggggggact 360 aagttggaaa taacaggagg cggcgggtct ggaggtggag gatctggtgg tggcgggtct 420 ggaggcggcg ggtctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 480 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgg agtttgggct gagctgggtt ttcctcgttg ctctttttag aggtgtccag 1740 tgtgacatgg cccaggtgca gctgcaggag agcggccccg gcctggtgaa gcccagcgag 1800 accctgagcc tgacctgcgt ggtgagcggc ggcagcatca gcagcagcaa ctggtggagc 1860 tgggtgaggc agccccccgg caagggcctg gagtggatcg gcgagatcta ccacagcggc 1920 agccccgact acaaccccag cctgaagagc agggtgacca tcagcgtgga caagagcagg 1980 aaccagttca gcctgaagct gagcagcgtg accgccgccg acaccgccgt gtactactgc 2040 gccaaggtga gcaccggcgg cttcttcgac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 2100 agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cgagatcgag 2160 ctgacccaga gccccagcag cctgagcgcc agcgtgggcg acagggtgac catcacctgc 2220 agggccagcc agagcatcag cagctacctg aactggtacc agcagaagcc cggcaaggcc 2280 cccaagctgc tgatctacgc cgccagcagc ctgcagagcg gcgtgcccag caggttcagc 2340 ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcctgcagcc cgaggacttc 2400 gccacctact actgccagca gagctacagc acccccccca ccttcggccc cggcaccaag 2460 gtggagatca agaggaccgg cggcggagga tctggcggag gtggaagcgg aggcggagga 2520 agcggtggcg gcggatctca ggtgcagctg caggagtctg ggggaggctt ggtgcaggct 2580 ggggggtccc ttagactctc ctgtgtagcc tctggaagca tcagaagtat caatgtcatg 2640 ggctggtacc gccaggctcc agggaagcag cgcgagttgg tcgcagcttg tgctagtgat 2700 ggcaacacat actatgcgga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaacgcc 2760 gagaaaacgg tgtatctgca gatgaacaac ctgaaacctg acgacacagc cgtctattac 2820 tgtgatgcga attcgagggg gaattattat tcgggccagg ggacccaggt caccgtttcc 2880 tcaactagtg gcccgggagg ccaaggtgca ggaggagggg ggtctggggg tggaggatct 2940 ggtggaggtg ggtctggagg aggtggatcc cccgaggaac ctctagtggt gaaggtggaa 3000 gagggagata ccgctgccct gtggtgcctc aaggggacct cagatggccc cactcagcag 3060 ctgacctggt ctcgggagtc cccgcttaaa cccttcttaa aatacagcct gggggtgcca 3120 ggcctgggag tgcacgtgag gcccgacgcc atcagcgtgg ttatccggaa cgtctctcaa 3180 cagatggggg gcttctacct gtgccagccg gggcccccct ctgagaaggc ctggcagcct 3240 ggctggacag tcaatgtgga gggcagcggg gagctgttcc ggtggaatgt ttcggaccta 3300 ggtggcctgg gctgtggcct gaagaacagg tcctcagagg gccccagctc cccttccggg 3360 aagctcatga gccccaagct gtatgtgtgg gccaaagacc gccctgagat ctgggaggga 3420 gagcctccgt gtctcccacc gagggacagc ctgaaccaga gcctcagccg ggacctcacc 3480 gttgcccctg gctccacact ctggctgtcc tgtggggtac cccctgactc tgtgtccagg 3540 ggccccctct cctggaccca tgtgcacccc aaggggccta agtcattgct gagcctagag 3600 ctgaaggacg atcgcccggc cagagatatg tgggtaatgg gcacgagcct gatgttgccc 3660 cgggccacag ctcaagacgc tggaaagtgg tattgtcacc gtggcaacct gaccatgtca 3720 ttccacctgg agatcactgc tcggccatct agacatcatc accatcacca t 3771 <210> 311 <211> 1257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 311 Met Arg Leu Leu Val Leu Leu Trp Gly Cys Leu Leu Leu Pro Gly Tyr 1 5 10 15 Glu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser 35 40 45 Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu 100 105 110 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 145 150 155 160 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp 165 170 175 Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 195 200 205 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 210 215 220 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 260 265 270 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 275 280 285 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 290 295 300 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 305 310 315 320 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 325 330 335 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 340 345 350 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 355 360 365 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg 370 375 380 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 385 390 395 400 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 405 410 415 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 420 425 430 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 435 440 445 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 450 455 460 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 465 470 475 480 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 485 490 495 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 500 505 510 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 515 520 525 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala 530 535 540 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 545 550 555 560 Gly Pro Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe 565 570 575 Arg Gly Val Gln Cys Asp Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 580 585 590 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val 595 600 605 Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln 610 615 620 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly 625 630 635 640 Ser Pro Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val 645 650 655 Asp Lys Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 660 665 670 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe 675 680 685 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 690 695 700 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu 705 710 715 720 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 725 730 735 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 740 745 750 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 755 760 765 Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 770 775 780 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 785 790 795 800 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly 805 810 815 Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 820 825 830 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 835 840 845 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu 850 855 860 Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile Asn Val Met 865 870 875 880 Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala 885 890 895 Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 900 905 910 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met 915 920 925 Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Ala Asn 930 935 940 Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 945 950 955 960 Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly 965 970 975 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Glu 980 985 990 Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Thr Ala Ala Leu Trp 995 1000 1005 Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp 1010 1015 1020 Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr Ser Leu Gly 1025 1030 1035 Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile Ser Val 1040 1045 1050 Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys 1055 1060 1065 Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 1070 1075 1080 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser 1085 1090 1095 Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu 1100 1105 1110 Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr 1115 1120 1125 Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro 1130 1135 1140 Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Arg Asp 1145 1150 1155 Leu Thr Val Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val 1160 1165 1170 Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val 1175 1180 1185 His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp 1190 1195 1200 Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Gly Thr Ser Leu Met 1205 1210 1215 Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Trp Tyr Cys His 1220 1225 1230 Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg 1235 1240 1245 Pro Ser Arg His His His His His His 1250 1255 <210> 312 <211> 3054 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 312 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg aggggggact 360 aagttggaaa taacaggagg cggcgggtct ggaggtggag gatctggtgg tggcgggtct 420 ggaggcggcg ggtctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 480 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 1740 aggcccgagg agcccctggt ggtgaaggtg gaggagggcg acaccgccgt gctgccctgc 1800 ctgaagggca ccagcgacgg ccccacccag cagctgacct ggagcaggga gagccccctg 1860 aagcccttcc tgaagtacag cctgggcgtg cccggcctgg gcgtgcacgt gaggcccgac 1920 gccatcagcg tggtgatcag gaacgtgagc cagcagatgg gcggcttcta cctgtgccag 1980 cccggccccc ccagcgagaa ggcctggcag cccggctgga ccgtgaacgt ggagggcagc 2040 ggcgagctgt tcaggtggaa cgtgagcgac ctgggcggcc tgggctgcgg cctgaagaac 2100 aggagcagcg agggccccag cagccccagc ggcaagctga tgagccccaa gctgtacgtg 2160 tgggccaagg acaggcccga gatctgggag ggcgagcccc cctgcctgcc ccccagggac 2220 agcctgaacc agagcctgag ccaggacctg accatggccc ccggcagcac cctgtggctg 2280 agctgcggcg tgccccccga cagcgtgagc aggggccccc tgagctggac ccacgtgcac 2340 cccaagggcc ccaagagcct gctgagcctg gagctgaagg acgacaggcc cgccagggag 2400 atgatcgtgg acgagaccgg cctgctgctg cccagggcca ccgcccagga cgccggcaag 2460 tggtactgca gcaggggcaa cgtgaccacc agctaccacc tggagatcac cgccaggccc 2520 gtgaaggccc acagcgacct gaggaccggc ggctggaagg gaggaggtgg gtctggaggt 2580 ggaggatctg gtggaggtgg gtctggagga ggtggatccc aggtgcagct gcaagcgtct 2640 gggggaggct tggtgcaggc tggggggtct ctgagactct cctgtgcagc ctcaggaagc 2700 atcttcgcta ttaatgaaat caatcttatg gggtggtacc gccaggctcc agggaagcag 2760 cgcgagttgg tcgcagcttg tgctagtgat ggcaacacat actatgcgga ctccgtgaag 2820 ggccgattca ccatctccag agacaacgcc gagaaaacgg tgtatctgca gatgaacaac 2880 ctgaaacctg acgacacagc cgtctattac tgtgatgcga attcgagggg gaattattat 2940 tcgggccagg ggacccaggt caccgtttcc tcaactagtg gcccgggagg ccaaggcgca 3000 gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg ggcgcacacc atcaccacca tcat 3054 <210> 313 <211> 1018 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 313 Met Arg Leu Leu Val Leu Leu Trp Gly Cys Leu Leu Leu Pro Gly Tyr 1 5 10 15 Glu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser 35 40 45 Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu 100 105 110 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 145 150 155 160 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp 165 170 175 Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 195 200 205 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 210 215 220 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 260 265 270 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 275 280 285 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 290 295 300 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 305 310 315 320 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 325 330 335 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 340 345 350 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 355 360 365 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg 370 375 380 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 385 390 395 400 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 405 410 415 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 420 425 430 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 435 440 445 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 450 455 460 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 465 470 475 480 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 485 490 495 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 500 505 510 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 515 520 525 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala 530 535 540 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 545 550 555 560 Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr 565 570 575 Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu 580 585 590 Gly Asp Thr Ala Val Leu Pro Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro 595 600 605 Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu 610 615 620 Lys Tyr Ser Leu Gly Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp 625 630 635 640 Ala Ile Ser Val Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe 645 650 655 Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly 660 665 670 Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val 675 680 685 Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu 690 695 700 Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val 705 710 715 720 Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu 725 730 735 Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met 740 745 750 Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser 755 760 765 Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro 770 775 780 Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Glu 785 790 795 800 Met Ile Val Asp Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln 805 810 815 Asp Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Ser Arg Gly Asn Val Thr Thr Ser Tyr 820 825 830 His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Lys Ala His Ser Asp Leu Arg 835 840 845 Thr Gly Gly Trp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 850 855 860 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser 865 870 875 880 Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 885 890 895 Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn Glu Ile Asn Leu Met Gly Trp 900 905 910 Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala 915 920 925 Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 930 935 940 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn 945 950 955 960 Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg 965 970 975 Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr 980 985 990 Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 995 1000 1005 Asp Leu Gly Ala His His His His His His 1010 1015 <210> 314 <211> 2976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 314 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg aggggggact 360 aagttggaaa taacaggagg cggcgggtct ggaggtggag gatctggtgg tggcgggtct 420 ggaggcggcg ggtctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 480 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgg agtttgggct gagctgggtt ttcctcgttg ctctttttag aggtgtccag 1740 tgtcaggtgc agctgcagga gtctggggga ggcttggtgc aggctggggg gtcccttaga 1800 ctctcctgtg tagcctctgg aagcatcaga agtatcaatg tcatgggctg gtaccgccag 1860 gctccaggga agcagcgcga gttggtcgca gcttgtgcta gtgatggcaa cacatactat 1920 gcggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagaa aacggtgtat 1980 ctgcagatga acaacctgaa acctgacgac acagccgtct attactgtga tgcgaattcg 2040 agggggaatt attattcggg ccaggggacc caggtcaccg tttcctcaac tagtggcccg 2100 ggaggccaag gcgcaggagg aggtgggtct ggaggtggag gatctggtgg aggtgggtct 2160 ggaggaggtg gatcccccga ggaacctcta gtggtgaagg tggaagaggg agataccgct 2220 gccctgtggt gcctcaaggg gacctcagat ggccccactc agcagctgac ctggtctcgg 2280 gagtccccgc ttaaaccctt cttaaaatac agcctggggg tgccaggcct gggagtgcac 2340 gtgaggcccg acgccatcag cgtggttatc cggaacgtct ctcaacagat ggggggcttc 2400 tacctgtgcc agccggggcc cccctctgag aaggcctggc agcctggctg gacagtcaat 2460 gtggagggca gcggggagct gttccggtgg aatgtttcgg acctaggtgg cctgggctgt 2520 ggcctgaaga acaggtcctc agagggcccc agctcccctt ccgggaagct catgagcccc 2580 aagctgtatg tgtgggccaa agaccgccct gagatctggg agggagagcc tccgtgtctc 2640 ccaccgaggg acagcctgaa ccagagcctc agccgggacc tcaccgttgc ccctggctcc 2700 acactctggc tgtcctgtgg ggtaccccct gactctgtgt ccaggggccc cctctcctgg 2760 acccatgtgc accccaaggg gcctaagtca ttgctgagcc tagagctgaa ggacgatcgc 2820 ccggccagag atatgtgggt aatgggcacg agcctgatgt tgccccgggc cacagctcaa 2880 gacgctggaa agtggtattg tcaccgtggc aacctgacca tgtcattcca cctggagatc 2940 actgctcggc catctagaca tcatcaccat caccat 2976 <210> 315 <211> 992 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 315 Met Arg Leu Leu Val Leu Leu Trp Gly Cys Leu Leu Leu Pro Gly Tyr 1 5 10 15 Glu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser 35 40 45 Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu 100 105 110 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 145 150 155 160 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp 165 170 175 Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 195 200 205 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 210 215 220 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 260 265 270 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 275 280 285 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 290 295 300 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 305 310 315 320 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 325 330 335 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 340 345 350 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 355 360 365 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg 370 375 380 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 385 390 395 400 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 405 410 415 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 420 425 430 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 435 440 445 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 450 455 460 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 465 470 475 480 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 485 490 495 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 500 505 510 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 515 520 525 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala 530 535 540 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 545 550 555 560 Gly Pro Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe 565 570 575 Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu 580 585 590 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser 595 600 605 Ile Arg Ser Ile Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys 610 615 620 Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr 625 630 635 640 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu 645 650 655 Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala 660 665 670 Val Tyr Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln 675 680 685 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly 690 695 700 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 705 710 715 720 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu 725 730 735 Gly Asp Thr Ala Ala Leu Trp Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro 740 745 750 Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu 755 760 765 Lys Tyr Ser Leu Gly Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp 770 775 780 Ala Ile Ser Val Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe 785 790 795 800 Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly 805 810 815 Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val 820 825 830 Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu 835 840 845 Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val 850 855 860 Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu 865 870 875 880 Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Arg Asp Leu Thr Val 885 890 895 Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser 900 905 910 Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro 915 920 925 Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp 930 935 940 Met Trp Val Met Gly Thr Ser Leu Met Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln 945 950 955 960 Asp Ala Gly Lys Trp Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe 965 970 975 His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Ser Arg His His His His His His 980 985 990 <210> 316 <211> 3345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 316 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg aggggggact 360 aagttggaaa taacaggagg cggcgggtct ggaggtggag gatctggtgg tggcgggtct 420 ggaggcggcg ggtctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 480 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcagacta caaagacgat gacgacaaga ttgaagttat gtatcctcct 840 ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt 900 tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 960 ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtccgc 1020 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gccctgcccc ctcgccgcgc gaaacgcagc 1620 ggcagcggcg cgaccaactt tagcctgctg aaacaggcgg gcgatgtgga agaaaacccg 1680 ggcccgatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 1740 aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 1800 ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 1860 aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 1920 gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 1980 ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 2040 ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 2100 aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 2160 tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 2220 agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 2280 tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc cgcggccccc tctcctggac ccatgtgcac 2340 cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 2400 atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 2460 tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcct 2520 ggcggcggcg ggtctggagg tggaggatct ggtggtggcg ggtctggtgg cggcgggtct 2580 gaggtgcagc tggtggagtc tggtggtggt cttgttcaac ctggtggttc tcttcgtctt 2640 tcttgtgctg cttctggttt taatattaaa gatacttata ttcattgggt tcgtcaagct 2700 cctggtaaag gtcttgaatg ggttgctcgt atttatccta ctaatggtta tactcgttat 2760 gctgattctg ttaaaggtcg ttttactatt tctgctgata cttctaaaaa tactgcttat 2820 cttcaaatga actctcttcg tgctgaagat actgctgttt attattgttc tcgttggggt 2880 ggtgatggtt tttatgctat ggattattgg ggtcaaggta ctcttgtcac cgtctcctca 2940 gctagcaccg ggggcggcgg gtctggaggt ggaggatctg gtggcggcgg gtctgacatc 3000 cagatgaccc agtctccttc ttctctttct gcttctgttg gtgatcgtgt tactattact 3060 tgtcgtgctt ctcaagatgt taatactgct gttgcttggt atcaacaaaa acctggtaaa 3120 gctcctaaac ttcttattta ttctgcttct tttctttatt ctggtgttcc ttctcgtttt 3180 tctggttctc gttctggtac tgattttact cttactattt cttctcttca acctgaagat 3240 tttgctactt attattgtca acaacattat actactcctc ctacttttgg tcaaggtacc 3300 aaggtggaga tcaaacgtac gtctagacat catcaccatc accat 3345 <210> 317 <211> 1115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 317 Met Arg Leu Leu Val Leu Leu Trp Gly Cys Leu Leu Leu Pro Gly Tyr 1 5 10 15 Glu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser 35 40 45 Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu 100 105 110 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 145 150 155 160 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp 165 170 175 Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 195 200 205 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 210 215 220 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 260 265 270 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 275 280 285 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 290 295 300 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 305 310 315 320 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 325 330 335 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 340 345 350 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 355 360 365 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg 370 375 380 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 385 390 395 400 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 405 410 415 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 420 425 430 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 435 440 445 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 450 455 460 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 465 470 475 480 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 485 490 495 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 500 505 510 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 515 520 525 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala 530 535 540 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 545 550 555 560 Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr 565 570 575 Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu 580 585 590 Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro 595 600 605 Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu 610 615 620 Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu 625 630 635 640 Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe 645 650 655 Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly 660 665 670 Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val 675 680 685 Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu 690 695 700 Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val 705 710 715 720 Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu 725 730 735 Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met 740 745 750 Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser 755 760 765 Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro 770 775 780 Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp 785 790 795 800 Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln 805 810 815 Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe 820 825 830 His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 835 840 845 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 850 855 860 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 865 870 875 880 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp 885 890 895 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr 900 905 910 Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 915 920 925 Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 930 935 940 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly 945 950 955 960 Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 965 970 975 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 980 985 990 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 995 1000 1005 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 1010 1015 1020 Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 1025 1030 1035 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr 1040 1045 1050 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp 1055 1060 1065 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr 1070 1075 1080 Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 1085 1090 1095 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ser Arg His His His His 1100 1105 1110 His His 1115 <210> 318 <211> 1614 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 318 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60 gacatggccc aggtgcagct gcaggagagc ggccccggcc tggtgaagcc cagcgagacc 120 ctgagcctga cctgcgtggt gagcggcggc agcatcagca gcagcaactg gtggagctgg 180 gtgaggcagc cccccggcaa gggcctggag tggatcggcg agatctacca cagcggcagc 240 cccgactaca accccagcct gaagagcagg gtgaccatca gcgtggacaa gagcaggaac 300 cagttcagcc tgaagctgag cagcgtgacc gccgccgaca ccgccgtgta ctactgcgcc 360 aaggtgagca ccggcggctt cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420 agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga gatcgagctg 480 acccagagcc ccagcagcct gagcgccagc gtgggcgaca gggtgaccat cacctgcagg 540 gccagccaga gcatcagcag ctacctgaac tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc 600 aagctgctga tctacgccgc cagcagcctg cagagcggcg tgcccagcag gttcagcggc 660 agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc 720 acctactact gccagcagag ctacagcacc ccccccacct tcggccccgg caccaaggtg 780 gagatcaaga ggacctcttc tgactacaaa gacgatgacg acaagattga agttatgtat 840 cctcctcctt acctagacaa tgagaagagc aatggaacca ttatccatgt gaaagggaaa 900 cacctttgtc caagtcccct atttcccgga ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg 960 gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1020 gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1080 cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1140 cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1200 gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1260 ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1320 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1380 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag 1440 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1500 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1560 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1614 <210> 319 <211> 537 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 319 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro 20 25 30 Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser 35 40 45 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser 65 70 75 80 Pro Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 85 90 95 Lys Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 195 200 205 Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp 260 265 270 Asp Asp Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu 275 280 285 Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro 290 295 300 Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val 305 310 315 320 Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe 325 330 335 Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp 340 345 350 Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr 355 360 365 Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg 370 375 380 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 385 390 395 400 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 405 410 415 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 420 425 430 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 435 440 445 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 450 455 460 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln 465 470 475 480 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 485 490 495 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 500 505 510 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 515 520 525 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 530 535 <210> 320 <211> 2100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 320 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtg aagaagcccg gcgagagcgt gaaggtgagc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccaac tacggcatga actgggtgaa gcaggccccc 180 ggccagggcc tggagtggat gggctggatc aacacctaca ccggcgagcc cacctacgcc 240 gacaagttcc agggcagggt gaccatgacc accgacacca gcaccagcac cgcctacatg 300 gagatcagga acctgggcgg cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gtggagctgg 360 agcgacggct actacgtgta cttcgactac tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgagc 420 agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga catcgtgatg 480 acccagagcc ccgacagcct gaccgtgagc ctgggcgaga ggaccaccat caactgcaag 540 agcagccaga gcgtgctgga cagcagcacc aacaagaaca gcctggcctg gtaccagcag 600 aagcccggcc agccccccaa gctgctgctg agctgggcca gcaccaggga gagcggcatc 660 cccgacaggt tcagcggcag cggcagcggc accgacttca ccctgaccat cgacagcccc 720 cagcccgagg acagcgccac ctactactgc cagcagagcg cccacttccc catcaccttc 780 ggccagggca ccaggctgga gatcaaggga ggaggtgggt ctggaggtgg aggatctggt 840 ggaggtgggt ctggaggagg tggatcccag gtgcagctgc aggagtctgg gggaggcttg 900 gtgcaggctg gggggtccct tagactctcc tgtgtagcct ctggaagcat cagaagtatc 960 aatgtcatgg gctggtaccg ccaggctcca gggaagcagc gcgagttggt cgcagcttgt 1020 gctagtgatg gcaacacata ctatgcggac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga 1080 gacaacgccg agaaaacggt gtatctgcag atgaacaacc tgaaacctga cgacacagcc 1140 gtctattact gtgatgcgaa ttcgaggggg aattattatt cgggccaggg gacccaggtc 1200 accgtttcct caactagtgg cccgggaggc caaggtgcag gaggaggggg gtctgggggt 1260 ggaggatctg gtggaggtgg gtctggagga ggtggatccc ccgaggaacc tctagtggtg 1320 aaggtggaag agggagatac cgctgccctg tggtgcctca aggggacctc agatggcccc 1380 actcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc ccgcttaaac ccttcttaaa atacagcctg 1440 ggggtgccag gcctgggagt gcacgtgagg cccgacgcca tcagcgtggt tatccggaac 1500 gtctctcaac agatgggggg cttctacctg tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc 1560 tggcagcctg gctggacagt caatgtggag ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt 1620 tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc 1680 ccttccggga agctcatgag ccccaagctg tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc 1740 tgggagggag agcctccgtg tctcccaccg agggacagcc tgaaccagag cctcagccgg 1800 gacctcaccg ttgcccctgg ctccacactc tggctgtcct gtggggtacc ccctgactct 1860 gtgtccaggg gccccctctc ctggacccat gtgcacccca aggggcctaa gtcattgctg 1920 agcctagagc tgaaggacga tcgcccggcc agagatatgt gggtaatggg cacgagcctg 1980 atgttgcccc gggccacagc tcaagacgct ggaaagtggt attgtcaccg tggcaacctg 2040 accatgtcat tccacctgga gatcactgct cggccatcta gacatcatca ccatcaccat 2100 <210> 321 <211> 700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 321 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 195 200 205 Leu Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro 225 230 235 240 Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe 245 250 255 Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 290 295 300 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile 305 310 315 320 Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 325 330 335 Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 340 345 350 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr 355 360 365 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 370 375 380 Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val 385 390 395 400 Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gly Gly 405 410 415 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 420 425 430 Ser Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Thr Ala 435 440 445 Ala Leu Trp Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu 450 455 460 Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr Ser Leu 465 470 475 480 Gly Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile Ser Val 485 490 495 Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln 500 505 510 Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn 515 520 525 Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly 530 535 540 Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser 545 550 555 560 Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp 565 570 575 Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp 580 585 590 Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Arg Asp Leu Thr Val Ala Pro Gly Ser 595 600 605 Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly 610 615 620 Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu 625 630 635 640 Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met 645 650 655 Gly Thr Ser Leu Met Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys 660 665 670 Trp Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile 675 680 685 Thr Ala Arg Pro Ser Arg His His His His His His 690 695 700 <210> 322 <211> 2035 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 322 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtgac 60 atggcccagg tgcagctgca ggagagcggc cccggcctgg tgaagcccag cgagaccctg 120 agcctgacct gcgtggtgag cggcggcagc atcagcagca gcaactggtg gagctgggtg 180 aggcagcccc ccggcaaggg cctggagtgg atcggcgaga tctaccacag cggcagcccc 240 gactacaacc ccagcctgaa gagcagggtg accatcagcg tggacaagag caggaaccag 300 ttcagcctga agctgagcag cgtgaccgcc gccgacaccg ccgtgtacta ctgcgccaag 360 gtgagcaccg gcggcttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 420 ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgagat cgagctgacc 480 cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg ggcgacaggg tgaccatcac ctgcagggcc 540 agccagagca tcagcagcta cctgaactgg taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag 600 ctgctgatct acgccgccag cagcctgcag agcggcgtgc ccagcaggtt cagcggcagc 660 ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc agcagcctgc agcccgagga cttcgccacc 720 tactactgcc agcagagcta cagcaccccc cccaccttcg gccccggcac caaggtggag 780 atcaagagga ccggcggcgg aggatctggc ggaggtggaa gcggaggcgg aggaagcggt 840 ggcggcggat ctcaggtgca gctgcaggag tctgggggag gcttggtgca ggctgggggg 900 tcccttagac tctcctgtgt agcctctgga agcatcagaa gtatcaatgt catgggctgg 960 taccgccagg ctccagggaa gcagcgcgag ttggtcgcag cttgtgctag tgatggcaac 1020 acatactatg cggactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccgagaaa 1080 acggtgtatc tgcagatgaa caacctgaaa cctgacgaca cagccgtcta ttactgtgat 1140 gcgaattcga gggggaatta ttattcgggc caggggaccc aggtcaccgt ttcctcagga 1200 ggaggggggt ctgggggtgg aggatctggt ggaggtgggt ctggaggagg tggatccccc 1260 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataccg ctgccctgtg gtgcctcaag 1320 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 1380 ttcttaaaat acagcctggg ggtgccaggc ctgggagtgc acgtgaggcc cgacgccatc 1440 agcgtggtta tccggaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 1500 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 1560 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 1620 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 1680 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 1740 aaccagagcc tcagccggga cctcaccgtt gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 1800 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 1860 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 1920 gtaatgggca cgagcctgat gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtggtat 1980 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccat 2035 <210> 323 <211> 678 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 323 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 20 25 30 Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly 35 40 45 Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys 85 90 95 Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 165 170 175 Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 180 185 190 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser 195 200 205 Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 210 215 220 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly 245 250 255 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu 275 280 285 Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile Asn Val Met Gly Trp 305 310 315 320 Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala 325 330 335 Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 340 345 350 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn 355 360 365 Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg 370 375 380 Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 405 410 415 Gly Gly Ser Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 420 425 430 Thr Ala Ala Leu Trp Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 435 440 445 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr 450 455 460 Ser Leu Gly Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile 465 470 475 480 Ser Val Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 485 490 495 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 500 505 510 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 515 520 525 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 530 535 540 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 545 550 555 560 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 565 570 575 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Arg Asp Leu Thr Val Ala Pro 580 585 590 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 595 600 605 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 610 615 620 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 625 630 635 640 Val Met Gly Thr Ser Leu Met Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 645 650 655 Gly Lys Trp Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 660 665 670 Glu Ile Thr Ala Arg Pro 675 <210> 324 <211> 1668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 324 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtg aagaagcccg gcgagagcgt gaaggtgagc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccaac tacggcatga actgggtgaa gcaggccccc 180 ggccagggcc tggagtggat gggctggatc aacacctaca ccggcgagcc cacctacgcc 240 gacaagttcc agggcagggt gaccatgacc accgacacca gcaccagcac cgcctacatg 300 gagatcagga acctgggcgg cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gtggagctgg 360 agcgacggct actacgtgta cttcgactac tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgagc 420 agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga catcgtgatg 480 acccagagcc ccgacagcct gaccgtgagc ctgggcgaga ggaccaccat caactgcaag 540 agcagccaga gcgtgctgga cagcagcacc aacaagaaca gcctggcctg gtaccagcag 600 aagcccggcc agccccccaa gctgctgctg agctgggcca gcaccaggga gagcggcatc 660 cccgacaggt tcagcggcag cggcagcggc accgacttca ccctgaccat cgacagcccc 720 cagcccgagg acagcgccac ctactactgc cagcagagcg cccacttccc catcaccttc 780 ggccagggca ccaggctgga gatcaaggga ggaggtgggt ctggaggtgg aggatctggt 840 ggaggtgggt ctggaggagg tggatccccc gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag 900 ggagataccg ctgccctgtg gtgcctcaag gggacctcag atggccccac tcagcagctg 960 acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc ttcttaaaat acagcctggg ggtgccaggc 1020 ctgggagtgc acgtgaggcc cgacgccatc agcgtggtta tccggaacgt ctctcaacag 1080 atggggggct tctacctgtg ccagccgggg cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc 1140 tggacagtca atgtggaggg cagcggggag ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt 1200 ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag 1260 ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag 1320 cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg aaccagagcc tcagccggga cctcaccgtt 1380 gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc 1440 cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag gggcctaagt cattgctgag cctagagctg 1500 aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg gtaatgggca cgagcctgat gttgccccgg 1560 gccacagctc aagacgctgg aaagtggtat tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc 1620 cacctggaga tcactgctcg gccatctaga catcatcacc atcaccat 1668 <210> 325 <211> 556 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 325 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 195 200 205 Leu Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro 225 230 235 240 Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe 245 250 255 Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Thr Ala 290 295 300 Ala Leu Trp Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu 305 310 315 320 Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr Ser Leu 325 330 335 Gly Val Pro Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile Ser Val 340 345 350 Val Ile Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln 355 360 365 Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn 370 375 380 Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly 385 390 395 400 Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser 405 410 415 Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp 420 425 430 Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp 435 440 445 Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Arg Asp Leu Thr Val Ala Pro Gly Ser 450 455 460 Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly 465 470 475 480 Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu 485 490 495 Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met 500 505 510 Gly Thr Ser Leu Met Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys 515 520 525 Trp Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile 530 535 540 Thr Ala Arg Pro Ser Arg His His His His His His 545 550 555 <210> 326 <211> 3696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 326 atgaggcttc tggtgcttct ttggggttgc ttgctgttgc ccggttacga agcagacatc 60 cagatgacac agactacatc ctccctgtct gcctctctgg gagacagagt caccatcagt 120 tgcagggcaa gtcaggacat tagtaaatat ttaaattggt atcagcagaa accagatgga 180 actgttaaac tcctgatcta ccatacatca agattacact caggagtccc atcaaggttc 240 agtggcagtg ggtctggaac agattattct ctcaccatta gcaacctgga gcaagaagat 300 attgccactt acttttgcca acaaggtaat acgcttccgt acacgttcgg aggggggact 360 aagttggaaa taacaggagg cggcgggtct ggaggtggag gatctggtgg tggcgggtct 420 ggaggcggcg ggtctgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 480 cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 540 tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 600 accacatact acaactcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 660 agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 720 gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 780 gtcaccgtct cctcaattga agttatgtat cctcctcctt acctagacaa tgagaagagc 840 aatggaacca ttatccatgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct atttcccgga 900 ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 960 ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtccgcagta agaggagcag gctcctgcac 1020 agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 1080 tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1140 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1200 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1260 agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1320 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1380 ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1440 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1500 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1560 atgcaagccc tgccccctcg ccgcgcgaaa cgcagcggca gcggcgcgac caactttagc 1620 ctgctgaaac aggcgggcga tgtggaagaa aacccgggcc cgatggagtt tgggctgagc 1680 tgggttttcc tcgttgctct ttttagaggt gtccagtgtg acatggccca ggtgcagctg 1740 caggagagcg gccccggcct ggtgaagccc agcgagaccc tgagcctgac ctgcgtggtg 1800 agcggcggca gcatcagcag cagcaactgg tggagctggg tgaggcagcc ccccggcaag 1860 ggcctggagt ggatcggcga gatctaccac agcggcagcc ccgactacaa ccccagcctg 1920 aagagcaggg tgaccatcag cgtggacaag agcaggaacc agttcagcct gaagctgagc 1980 agcgtgaccg ccgccgacac cgccgtgtac tactgcgcca aggtgagcac cggcggcttc 2040 ttcgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gcggcggcgg cggcagcggc 2100 ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgag atcgagctga cccagagccc cagcagcctg 2160 agcgccagcg tgggcgacag ggtgaccatc acctgcaggg ccagccagag catcagcagc 2220 tacctgaact ggtaccagca gaagcccggc aaggccccca agctgctgat ctacgccgcc 2280 agcagcctgc agagcggcgt gcccagcagg ttcagcggca gcggcagcgg caccgacttc 2340 accctgacca tcagcagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagagc 2400 tacagcaccc cccccacctt cggccccggc accaaggtgg agatcaagag gaccggcggc 2460 ggaggatctg gcggaggtgg aagcggaggc ggaggaagcg gtggcggcgg atctcaggtg 2520 cagctgcagg agtctggggg aggcttggtg caggctgggg ggtcccttag actctcctgt 2580 gtagcctctg gaagcatcag aagtatcaat gtcatgggct ggtaccgcca ggctccaggg 2640 aagcagcgcg agttggtcgc agcttgtgct agtgatggca acacatacta tgcggactcc 2700 gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aacgccgaga aaacggtgta tctgcagatg 2760 aacaacctga aacctgacga cacagccgtc tattactgtg atgcgaattc gagggggaat 2820 tattattcgg gccaggggac ccaggtcacc gtttcctcag gaggaggggg gtctgggggt 2880 ggaggatctg gtggaggtgg gtctggagga ggtggatccc ccgaggaacc tctagtggtg 2940 aaggtggaag agggagatac cgctgccctg tggtgcctca aggggacctc agatggcccc 3000 actcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc ccgcttaaac ccttcttaaa atacagcctg 3060 ggggtgccag gcctgggagt gcacgtgagg cccgacgcca tcagcgtggt tatccggaac 3120 gtctctcaac agatgggggg cttctacctg tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc 3180 tggcagcctg gctggacagt caatgtggag ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt 3240 tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc 3300 ccttccggga agctcatgag ccccaagctg tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc 3360 tgggagggag agcctccgtg tctcccaccg agggacagcc tgaaccagag cctcagccgg 3420 gacctcaccg ttgcccctgg ctccacactc tggctgtcct gtggggtacc ccctgactct 3480 gtgtccaggg gccccctctc ctggacccat gtgcacccca aggggcctaa gtcattgctg 3540 agcctagagc tgaaggacga tcgcccggcc agagatatgt gggtaatggg cacgagcctg 3600 atgttgcccc gggccacagc tcaagacgct ggaaagtggt attgtcaccg tggcaacctg 3660 accatgtcat tccacctgga gatcactgct cggcca 3696 <210> 327 <211> 1232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 327 Met Arg Leu Leu Val Leu Leu Trp Gly Cys Leu Leu Leu Pro Gly Tyr 1 5 10 15 Glu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser 35 40 45 Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 50 55 60 Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu 100 105 110 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 145 150 155 160 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp 165 170 175 Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 195 200 205 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 210 215 220 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro 260 265 270 Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys 275 280 285 Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 290 295 300 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 305 310 315 320 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 325 330 335 Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 340 345 350 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 355 360 365 Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 370 375 380 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 385 390 395 400 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 405 410 415 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 420 425 430 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 435 440 445 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln 450 455 460 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 465 470 475 480 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 485 490 495 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 500 505 510 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg 515 520 525 Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln 530 535 540 Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Phe Gly Leu Ser 545 550 555 560 Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly Val Gln Cys Asp Met Ala 565 570 575 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 580 585 590 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 595 600 605 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 610 615 620 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 625 630 635 640 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Arg Asn Gln Phe Ser 645 650 655 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 660 665 670 Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 675 680 685 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 690 695 700 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 705 710 715 720 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 725 730 735 Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 740 745 750 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 755 760 765 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 770 775 780 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 785 790 795 800 Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 805 810 815 Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 820 825 830 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly 835 840 845 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 850 855 860 Ser Ile Arg Ser Ile Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly 865 870 875 880 Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 885 890 895 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 900 905 910 Glu Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr 915 920 925 Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly 930 935 940 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 945 950 955 960 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Glu Glu 965 970 975 Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Thr Ala Ala Leu Trp Cys 980 985 990 Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg 995 1000 1005 Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Tyr Ser Leu Gly Val Pro 1010 1015 1020 Gly Leu Gly Val His Val Arg Pro Asp Ala Ile Ser Val Val Ile 1025 1030 1035 Arg Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro 1040 1045 1050 Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn 1055 1060 1065 Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu 1070 1075 1080 Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 1085 1090 1095 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp 1100 1105 1110 Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu 1115 1120 1125 Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Arg Asp Leu Thr 1130 1135 1140 Val Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro 1145 1150 1155 Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro 1160 1165 1170 Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg 1175 1180 1185 Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Gly Thr Ser Leu Met Leu Pro 1190 1195 1200 Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Trp Tyr Cys His Arg Gly 1205 1210 1215 Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro 1220 1225 1230 <210> 328 <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Met Trp Ile Asp Phe Phe Thr Tyr Ser Ser Met Ser Glu Glu Val Thr 1 5 10 15 Tyr Ala Asp Leu Gln Phe Gln Asn Ser Ser Glu Met Glu Lys Ile Pro 20 25 30 Glu Ile Gly Lys Phe Gly Glu Lys Ala Pro Pro Ala Pro Ser His Val 35 40 45 Trp Arg Pro Ala Ala Leu Phe Leu Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu 50 55 60 Ile Gly Leu Gly Val Leu Ala Ser Met Phe His Val Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Glu Met Lys Lys Met Asn Lys Leu Gln Asn Ile Ser Glu Glu Leu Gln 85 90 95 Arg Asn Ile Ser Leu Gln Leu Met Ser Asn Met Asn Ile Ser Asn Lys 100 105 110 Ile Arg Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ile Ala Thr Lys Leu Cys 115 120 125 Arg Glu Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Glu His Lys Cys Lys Pro Cys Pro 130 135 140 Arg Arg Trp Ile Trp His Lys Asp Ser Cys Tyr Phe Leu Ser Asp Asp 145 150 155 160 Val Gln Thr Trp Gln Glu Ser Lys Met Ala Cys Ala Ala Gln Asn Ala 165 170 175 Ser Leu Leu Lys Ile Asn Asn Lys Asn Ala Leu Glu Phe Ile Lys Ser 180 185 190 Gln Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Trp Leu Gly Leu Ser Pro Glu Glu Asp 195 200 205 Ser Thr Arg Gly Met Arg Val Asp Asn Ile Ile Asn Ser Ser Ala Trp 210 215 220 Val Ile Arg Asn Ala Pro Asp Leu Asn Asn Met Tyr Cys Gly Tyr Ile 225 230 235 240 Asn Arg Leu Tyr Val Gln Tyr Tyr His Cys Thr Tyr Lys Lys Arg Met 245 250 255 Ile Cys Glu Lys Met Ala Asn Pro Val Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Phe 260 265 270 Arg Glu Ala 275 <210> 329 <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Met Trp Ile Asp Phe Phe Thr Tyr Ser Ser Met Ser Glu Glu Val Thr 1 5 10 15 Tyr Ala Asp Leu Gln Phe Gln Asn Ser Ser Glu Met Glu Lys Ile Pro 20 25 30 Glu Ile Gly Lys Phe Gly Glu Lys Ala Pro Pro Ala Pro Ser His Val 35 40 45 Trp Arg Pro Ala Ala Leu Phe Leu Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu 50 55 60 Ile Gly Leu Gly Val Leu Ala Ser Met Phe His Val Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Glu Met Lys Lys Met Asn Lys Leu Gln Asn Ile Ser Glu Glu Leu Gln 85 90 95 Arg Asn Ile Ser Leu Gln Leu Met Ser Asn Met Asn Ile Ser Asn Lys 100 105 110 Ile Arg Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ile Ala Thr Lys Leu Cys 115 120 125 Arg Glu Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Glu His Lys Cys Lys Pro Cys Pro 130 135 140 Arg Arg Trp Ile Trp His Lys Asp Ser Cys Tyr Phe Leu Ser Asp Asp 145 150 155 160 Val Gln Thr Trp Gln Glu Ser Lys Met Ala Cys Ala Ala Gln Asn Ala 165 170 175 Ser Leu Leu Lys Ile Asn Asn Lys Asn Ala Leu Glu Phe Ile Lys Ser 180 185 190 Gln Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Trp Leu Gly Leu Ser Pro Glu Glu Asp 195 200 205 Ser Thr Arg Gly Met Arg Val Asp Asn Ile Ile Asn Ser Ser Ala Trp 210 215 220 Val Ile Arg Asn Ala Pro Asp Leu Asn Asn Met Tyr Cys Gly Tyr Ile 225 230 235 240 Asn Arg Leu Tyr Val Gln Tyr Tyr His Cys Thr Tyr Lys Gln Arg Met 245 250 255 Ile Cys Glu Lys Met Ala Asn Pro Val Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Phe 260 265 270 Arg Glu Ala 275 <210> 330 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 330 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgc aggagtctgg gggaggcttg gtgcaggctg gggggtccct tagactctcc 120 tgtgtagcct ctggaagcat cagaagtatc aatgtcatgg gctggtaccg ccaggctcca 180 gggaagcagc gcgagttggt cgcagcttgt gctagtgatg gcaacacata ctatgcggac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgccg agaaaacggt gtatctgcag 300 atgaacaacc tgaaacctga cgacacagcc gtctattact gtgatgcgaa ttcgaggggg 360 aattattatt cgggccaggg gacccaggtc accgtttcct caactagtgg cccgggaggc 420 caaggcgcag actacaaaga cgatgacgac aagattgaag ttatgtatcc tcctccttac 480 ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca 540 agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 600 ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt ccgcagtaag 660 aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 720 cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccaaacgg 780 ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 840 caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 900 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 960 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1020 cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1080 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1140 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1200 acctacgacg cccttcacat gcaagccctg ccccctcgc 1239 <210> 331 <211> 413 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 331 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg 35 40 45 Ser Ile Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg 50 55 60 Glu Leu Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Lys Thr 85 90 95 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Asp 130 135 140 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 145 150 155 160 Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 165 170 175 His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp 180 185 190 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 195 200 205 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 210 215 220 Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 225 230 235 240 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 245 250 255 Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 260 265 270 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 275 280 285 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 290 295 300 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 305 310 315 320 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 325 330 335 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg 340 345 350 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 355 360 365 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 370 375 380 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 385 390 395 400 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 405 410 <210> 332 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 332 Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala 1 5 <210> 333 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 333 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 334 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 334 His His His His His His 1 5 <210> 335 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 335 Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 1 5 10 15 Glu Asp Leu Gly Ala His His His His His His Gly Ala Ser 20 25 30 <210> 336 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 336 Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn Glu Ile 1 5 10 <210> 337 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 337 Cys Val Val Ser Gly Asp Thr Arg Ser Ile 1 5 10 <210> 338 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 338 Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile 1 5 10 <210> 339 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 339 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala 1 5 10 <210> 340 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 340 Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 10 <210> 341 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 341 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 10 <210> 342 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 342 Cys Val Val Ser Gly Ala Thr Ser Asn Val Asn Ala 1 5 10 <210> 343 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 343 Cys Val Val Ser Gly Thr Met Phe Ser Gly Lys Asp 1 5 10 <210> 344 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 344 Cys Val Ala Ser Gly Asn Asp Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 10 <210> 345 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 345 Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala 1 5 10 <210> 346 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 346 Cys Val Val Ser Gly Asn Met Leu Asp Leu Asn Thr 1 5 10 <210> 347 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 347 Gly Ser Asp Arg Ser Ile Asn Val 1 5 <210> 348 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 348 Gly Arg Thr Ile Asp Asn Gly Ala 1 5 <210> 349 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 349 Val Ala Ala Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 350 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 350 Trp Val Ser Asp Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Asn 1 5 10 <210> 351 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 351 Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp 1 5 10 <210> 352 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 352 Trp Val Ser Ser Ile Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr 1 5 10 <210> 353 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 353 Leu Val Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser 1 5 10 <210> 354 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 354 Val Ala Thr Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr Asp 1 5 10 <210> 355 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 355 Val Ala Val Asp Ala Pro Arg Glu Arg Pro Phe 1 5 10 <210> 356 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 356 Val Ala Val Val Ser Arg Phe Gly Glu Thr Thr 1 5 10 <210> 357 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 357 Leu Val Ala Ala Leu Gly Ile Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 358 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 358 Ile Thr Ser Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 359 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 359 Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ala Thr 1 5 <210> 360 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 360 Asp Ala Asn Ser Arg Gly Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 361 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 361 Ala Thr Glu Leu Arg Gly Ser Asp Tyr Tyr Arg Gly Pro Ile Arg Glu 1 5 10 15 Tyr Ala Tyr <210> 362 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 362 Ala Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Ile Thr Val Val Val Thr Pro Asp Glu 1 5 10 15 Tyr His Tyr <210> 363 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 363 Val Lys Leu Val Asp Ser Gly Trp Tyr Ser Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 364 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 364 Ala Ala Gln Asp Trp Ala Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 365 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 365 His Phe Leu Trp Gly Arg His Tyr 1 5 <210> 366 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 366 Gly Pro Ser Leu Arg Thr Phe His Gly Arg Glu Trp Tyr Arg Pro Pro 1 5 10 15 Trp Phe Thr Ser 20 <210> 367 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 367 Asn Ala Arg Ile Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Arg Ile Asp Tyr 1 5 10 <210> 368 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 368 Ala Arg Asp Tyr Asn Phe Glu Ser 1 5 <210> 369 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 369 Lys Ala Asp Thr Arg Trp Gly Gly Met Tyr 1 5 10 <210> 370 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 370 Ala Ser Arg Arg Gly Val Asp Leu Arg Arg Asn Ser Tyr Glu Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 371 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 371 Gly Ser Ile Phe Ala Ile Asn Glu Ile Asn Leu 1 5 10 <210> 372 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 372 Gly Asp Thr Arg Ser Ile Asn Leu 1 5 <210> 373 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 373 Gly Ser Ile Arg Ser Ile Asn Val 1 5 <210> 374 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 374 Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala 1 5 <210> 375 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 375 Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 376 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 376 Gly Phe Ala Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 377 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 377 Gly Ala Thr Ser Asn Val Asn Ala 1 5 <210> 378 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 378 Gly Thr Met Phe Ser Gly Lys Asp 1 5 <210> 379 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 379 Gly Asn Asp Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 <210> 380 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 380 Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala 1 5 <210> 381 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 381 Gly Asn Met Leu Asp Leu Asn Thr 1 5 <210> 382 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 382 Cys Ala Ser Asp Gly Asn Thr 1 5 <210> 383 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 383 Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 384 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 384 Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 385 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 385 Ile Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 386 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 386 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 387 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 387 Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr 1 5 <210> 388 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 388 Val Asp Ala Pro Arg Glu Arg Pro 1 5 <210> 389 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 389 Val Ser Arg Phe Gly Glu Thr 1 5 <210> 390 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 390 Leu Gly Ile Ser Thr 1 5

Claims (116)

  1. 이중파라토프 융합 단백질로서, (a) 종양 항원에 결합하는 제1 항원-결합 단백질 또는 절편; (b) 종양 항원에 결합하는 제2 항원-결합 단백질 또는 절편; 및 (c) 세포성 치료제, 항체 또는 항체-약물 접합물에 대한 표적인 폴리펩티드 항원을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA)인, 이중파라토프 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 종양 항원은 종양 관련 항원(TAA)인, 이중파라토프 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv인, 이중파라토프 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 이중파라토프 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 이중파라토프 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv, 아피바디, 아드넥틴, 또는 안키린 반복 단백질인, 이중파라토프 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원은 CLL-1인, 이중파라토프 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원은 서열 번호: 2의 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체인, 이중파라토프 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하되, 상기 일부는 서열 번호: 203-225의 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없는, 이중파라토프 융합 단백질.
  13. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 그룹 1의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포성 치료제는 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포 또는 자가 유래 NK 세포인, 이중파라토프 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 동종이계인, 이중파라토프 융합 단백질.
  16. 제14항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 자가 유래인, 이중파라토프 융합 단백질.
  17. 세포로서,
    (i) 제1 종양 항원, 막통과 도메인 및 세포질 신호전달 도메인에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체; 및
    (ii)(a) 제2 종양 항원에 결합하는 제1 항원-결합 단백질 또는 절편; (b) 제2 종양 항원에 결합하는 제2 항원-결합 단백질 또는 절편; 및 (c) 세포성 치료제, 항체, 또는 항체-약물 접합물에 대한 표적인 폴리펩티드 항원을 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 항시성 발현 제작물을 포함하는, 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제1 종양 항원은 CD19인, 세포.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)인, 세포.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 종양 항원은 종양 관련 항원(TAA)인, 세포.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv인, 세포.
  22. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 세포.
  23. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 세포.
  24. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv, Fab, 아피바디, 아드넥틴, 또는 안키린 반복 단백질인, 세포.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양 항원은 CLL-1인, 세포.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원은 서열 번호: 2의 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체인, 세포.
  27. 제26항에 있어서, 상기 CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 세포.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는, T-세포.
  29. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하되, 상기 일부는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없는, 세포.
  30. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 그룹 1의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 세포.
  31. 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포성 치료제는 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 또는 자가 유래 NK 세포인, 세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 동종이계인, 세포.
  33. 제31항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 자가 유래인, 세포.
  34. 세포로서,
    (i) 제1 종양 항원, 막통과 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체; 및
    (ii)(a) 제2 종양 항원에 결합하는 제1 항원-결합 단백질 또는 절편; (b) 제2 종양 항원에 결합하는 제2 항원-결합 단백질 또는 절편; 및 (c) 세포성 치료제, 항체, 또는 항체-약물 접합물에 대한 표적인 폴리펩티드 항원을 포함하는 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 유도성 발현 제작물을 포함하는, 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1 종양 항원은 CD19인, 세포.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 제2 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)인, 세포.
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 제2 종양 항원은 종양 관련 항원(TAA)인, 세포.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv인, 세포.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 세포.
  40. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 세포.
  41. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv, Fab, 아피바디, 아드넥틴, 또는 안키린 반복 단백질인, 세포.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양 항원은 CLL-1인, 세포.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원은 서열 번호: 2의 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체인, 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 세포.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는, 세포.
  46. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하되, 상기 일부는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS 모두가 없는, 세포.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 그룹 1의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 세포.
  48. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포성 치료제는 자가 유래 CAR-T 세포, 동종이계 CAR-T 세포, 동종이계 CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 자가 유래 NK 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 IPSC 유래 세포 치료성 세포인, 세포.
  49. 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도성 발현 제작물은 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드에 작용가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 프로모터는 IL-2 프로모터, 세포 표면 단백질 프로모터(예를 들어, CD69 프로모터), 사이토카인 프로모터(예를 들어, TNF 프로모터), 세포 활성화 프로모터(예를 들어, CTLA4, OX40, CD40L), 또는 세포 표면 접착 단백질 프로모터(예를 들어, VLA-1 프로모터)인, 세포.
  51. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중파라토프 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
  52. 제51항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV, AAVP, 또는 암 살상 벡터)인, 벡터.
  53. 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로써, 대상체에 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중파라토프 융합 단백질, 또는 제51항 또는 제52항의 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 항체, 항체 약물 접합물, 또는 CAR-T 세포를 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 항체, 상기 항체 약물 접합물, 또는 상기 CAR-T 세포는 폴리펩티드 항원을 표적화하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 투여 시, 상기 항체, 상기 항체 약물 접합물, 또는 상기 CAR-T 세포는 상기 폴리펩티드 항원을 포함하는 이중파라토프 융합 단백질에 결합하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원을 포함하는 상기 이중파라토프 융합 단백질에 대한 상기 항체, 상기 항체 약물 접합물, 또는 상기 CAR-T 세포의 결합은 종양의 사멸을 유도하는, 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 CAR-T 세포는 동종이계인, 방법.
  58. 제54항에 있어서, 상기 CAR-T 세포는 자가 유래인, 방법.
  59. 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로써, 상기 대상체에 제17항 내지 제50항 중 어느 한 항의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  60. 이중파라토프 융합 단백질로서,
    (a) 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체;
    (b) 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는 VHH; 및
    (c) 서열 번호: 307의 아미노산 20 내지 265를 포함하는 scFv를 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  61. 이중파라토프 융합 단백질로서,
    (a) 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나타난, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체;
    (b) 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는 VHH; 및
    (c) 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는 VHH를 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  62. 서열 번호 307을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  63. 서열 번호 311을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  64. 서열 번호 323을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  65. 서열 번호 327을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  66. 서열 번호 321을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  67. 이중파라토프 융합 단백질로서, (a) 제1 종양 항원에 결합하는 제1 항원-결합 단백질 또는 절편; (b) 제1 종양 항원에 결합하는 제2 항원-결합 단백질 또는 절편; (c) 제2 종양 항원에 결합하는 제3 항원-결합 단백질 또는 절편; 및 (d) 세포성 치료제, 항체, 또는 항체-약물 접합물에 대한 표적인 폴리펩티드 항원을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  68. 제67항에 있어서, 상기 제1 종양 항원과 상기 제2 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA)인, 이중파라토프 융합 단백질.
  69. 제67항에 있어서, 상기 제1 종양 항원과 상기 제2 종양 항원은 종양 관련 항원(TAA)인, 이중파라토프 융합 단백질.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv인, 이중파라토프 융합 단백질.
  71. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 이중파라토프 융합 단백질.
  72. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 이중파라토프 융합 단백질.
  73. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv인, 이중파라토프 융합 단백질.
  74. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 이중파라토프 융합 단백질.
  75. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편과 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv, 아피바디, 아드넥틴, 또는 안키린 반복 단백질인, 이중파라토프 융합 단백질.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 종양 항원은 CLL-1인, 이중파라토프 융합 단백질.
  77. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양 항원은 CD33인, 이중파라토프 융합 단백질.
  78. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양 항원은 IL1RAP인, 이중파라토프 융합 단백질.
  79. 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원은 서열 번호: 2의 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체인, 이중파라토프 융합 단백질.
  80. 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  81. 제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  82. 제81항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하되, 상기 일부는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없는, 이중파라토프 융합 단백질.
  83. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 그룹 1의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 이중파라토프 융합 단백질.
  84. 제67항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포성 치료제는 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 또는 자가 유래 NK 세포인, 이중파라토프 융합 단백질.
  85. 제84항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 동종이계인, 파라토프 융합 단백질.
  86. 제84항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 자가 유래인, 이중파라토프 융합 단백질.
  87. (a) 종양 항원의 동일한 에피토프에 각각 결합하는 둘 이상의 동일한 항원-결합 단백질(들), 또는 절편(들); 및 (b) 세포성 치료제, 항체, 또는 항체-약물 접합물에 대한 표적인 폴리펩티드 항원을 포함하는, 융합 단백질.
  88. 제87항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질 또는 절편은, scFv, VHH, 아피바디, 아드넥틴, 또는 안키린 반복 단백질인, 융합 단백질.
  89. 제87항에 있어서, 상기 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA)인, 융합 단백질.
  90. 제87항에 있어서, 상기 종양 항원은 종양 관련 항원(TAA)인, 융합 단백질.
  91. 제88항에 있어서, 상기 항원-결합 단백질, 또는 절은 VHH인, 융합 단백질.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원은 CLL-1은, 융합 단백질.
  93. 제87항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원은 서열 번호: 2의 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체인, 융합 단백질.
  94. 제93항에 있어서, 상기 CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는, 융합 단백질.
  96. 제95항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하되, 상기 일부는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없는, 융합 단백질.
  97. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 그룹 1의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 융합 단백질.
  98. 제87항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포성 치료제는 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 또는 자가 유래 NK 세포인, 융합 단백질.
  99. 제98항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 동종이계인, 융합 단백질.
  100. 제98항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 자가 유래인, 융합 단백질.
  101. 융합 단백질로서, (a) 종양 항원에 결합하는 제1 항원-결합 단백질 또는 절편; (b) 제2 종양 항원에 결합하는 제2 항원-결합 단백질 또는 절편; 및 (c) 세포성 치료제, 항체, 또는 항체-약물 접합물에 대한 표적인 폴리펩티드 항원을 포함하는, 융합 단백질.
  102. 제101항에 있어서, 상기 제1 종양 항원 또는 상기 제2 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA)인, 융합 단백질.
  103. 제1항에 있어서, 상기 제1 종양 항원 또는 상기 제2 종양 항원은 종양 관련 항원(TAA)인, 융합 단백질.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단백질 또는 절편은 scFv인, 융합 단백질.
  105. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단백질 또는 절편은 VHH인, 융합 단백질.
  106. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 종양 항원은 CD33인, 융합 단백질.
  107. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 종양 항원은 IL1RAP인, 융합 단백질.
  108. 제101항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양 항원은 CLL-1인, 융합 단백질.
  109. 제101항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원은 서열 번호: 2의 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CD19 변이체인, 융합 단백질.
  110. 제101항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD19 변이체는 표 1A, 표 1B, 표 2A, 표 2B, 표 3, 표 6, 도 3, 도 4b, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 또는 도 6에 나열된, 서열 번호: 2에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  111. 제105항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 절편을 포함하는, 융합 단백질.
  112. 제111항에 있어서, 상기 VHH는 서열 번호: 203-225 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부(예를 들어, CLL-1 결합 부분)를 포함하되, 상기 일부는 서열 번호: 203-225 각각에 나타난 C-말단 아미노산 TSGPGGQGAEQKLISEEDLGAHHHHHHGAS가 모두 없는, 융합 단백질.
  113. 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VHH는 표 5A 및/또는 표 5B에 나타난 그룹 1의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 2의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 3의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 4의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 5의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 6의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 7의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 8의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 9의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그룹 10의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는 그룹 13의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 융합 단백질.
  114. 제101 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포성 치료제는 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 또는 자가 유래 NK 세포인, 융합 단백질.
  115. 제114항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 동종이계인, 융합 단백질.
  116. 제114항에 있어서, 상기 CAR-T 또는 상기 CAR-NK는 자가 유래인, 융합 단백질.
KR1020217038771A 2019-04-26 2020-04-24 암 치료를 위한 조성물 및 방법 KR20220003045A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962839376P 2019-04-26 2019-04-26
US62/839,376 2019-04-26
PCT/US2020/029967 WO2020219989A1 (en) 2019-04-26 2020-04-24 Compositions and methods for treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220003045A true KR20220003045A (ko) 2022-01-07

Family

ID=72941772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217038771A KR20220003045A (ko) 2019-04-26 2020-04-24 암 치료를 위한 조성물 및 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220387487A1 (ko)
EP (1) EP3958876A4 (ko)
JP (1) JP2022532994A (ko)
KR (1) KR20220003045A (ko)
CN (1) CN114007626A (ko)
AU (1) AU2020262956A1 (ko)
BR (1) BR112021021299A2 (ko)
CA (1) CA3137962A1 (ko)
IL (1) IL287538A (ko)
MX (1) MX2021013117A (ko)
WO (1) WO2020219989A1 (ko)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2322547A1 (en) * 2003-06-25 2011-05-18 Crucell Holland B.V. Myeloid cell-specific lectin
US8623369B2 (en) * 2010-04-27 2014-01-07 National Research Council Of Canada Anti-ICAM-1 single domain antibody and uses thereof
CN115058395A (zh) * 2015-06-25 2022-09-16 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
WO2017075537A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
CN108290955A (zh) * 2015-11-24 2018-07-17 塞勒兰特治疗公司 人源化抗-cll-1抗体
US20210139579A1 (en) * 2017-07-20 2021-05-13 Nbe-Therapeutics Ag Multispecific antibody product that binds to different ror1 epitopes
MX2020006297A (es) * 2017-12-15 2020-12-07 Aleta Biotherapeutics Inc Variantes de cd19.
AU2019337759A1 (en) * 2018-09-10 2021-03-11 Legend Biotech Ireland Limited Single-domain antibodies against CD33 and constructs thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3958876A1 (en) 2022-03-02
MX2021013117A (es) 2022-02-11
CN114007626A (zh) 2022-02-01
EP3958876A4 (en) 2023-04-26
IL287538A (en) 2021-12-01
US20220387487A1 (en) 2022-12-08
AU2020262956A1 (en) 2021-12-16
WO2020219989A1 (en) 2020-10-29
JP2022532994A (ja) 2022-07-21
BR112021021299A2 (pt) 2021-12-14
CA3137962A1 (en) 2020-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11807691B2 (en) Compositions and methods for treatment of cancer
US20210130494A1 (en) Compositions and methods for treatment of cancer
US11891426B2 (en) CD19 variants
JP2023518049A (ja) 新規な抗原結合ドメインおよびそれを組み込んだ合成抗原受容体
JP2023087005A (ja) Ｓｔｒｅｐ－タグ特異的結合タンパク質およびその使用
EP3730519B1 (en) Antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes b cell malignancies, chimeric antigen receptor comprising same, and uses thereof
US20230220095A1 (en) Compositions and methods for treatment of cancer
KR20220003045A (ko) 암 치료를 위한 조성물 및 방법
JP2023541456A (ja) がん治療用キメラ抗原受容体
JP2023548555A (ja) 抗ｃｄ１９／ｃｄ２２免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法