CN108290955A - 人源化抗-cll-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了CLL‑1特异性人源化抗体。

Description

人源化抗-CLL-1抗体
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2015年11月24日提交的美国临时专利申请第62/259,100号的优先权的权益，将其为了所有目的通过引用并入。
发明背景
C型凝集素样分子1(CLL-1)表达于AML细胞和癌症干细胞(CSC)上，所述癌症干细胞是能够产生另外的癌细胞的细胞。
化疗的一个主要限制是抗癌药物通常无法区分正常细胞和癌细胞。几乎所有主要类别的抗肿瘤药剂成员对正常细胞都具有相当大的毒性。
特异性靶向癌细胞的组合物可避免该问题。然而，现有癌症靶标不靶向CSC。由于这一原因，现有化疗策略并未有效清除癌症，即使当特异性地递送至癌细胞时亦如此。由于存活的CSC可产生新的癌细胞，仍存在复发风险。
与造血干细胞(HSC)类似，CSC表达CD34，但是在HSC上不表达CLL-1。这允许能够通过靶向CLL-1来特异性地选择CSC。
发明概述
本文提供了人源化抗-CLL-1抗体，其识别高比例表达CLL-1的细胞，但具有比鼠或嵌合抗体更弱的免疫原性和更好的耐受性。本申请的人源化抗-CLL-1抗体对表达CLL-1的细胞的补体依赖性毒性和抗体依赖性毒性都有效，并抑制表达CLL-1的癌细胞的肿瘤生长。目前所述的抗体为靶向CLL-1相关性病症提供了新的诊断和治疗策略。
在一个方面，本文提供了结合CLL-1并且包含可变轻链和可变重链的人源化抗体，其中：a.所述可变轻链还包含鼠M26的CDRL1、CDRL2和CDRL3，以及IgKv1-16的人框架序列，除了其中：i.Kabat残基21可以是鼠的或人的；ii.Kabat残基36可以是鼠的或人的，iii.Kabat残基44可以是鼠的或人的，iv.Kabat残基46可以是鼠的或人的，v.Kabat残基65可以是鼠的或人的，vi.Kabat残基66可以是鼠的或人的，vii.Kabat残基67可以是人的或Ala(“A”)，viii.Kabat残基71可以是鼠的或人的，以及b.所述可变重链包含鼠M26的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及IGHV1-46的人框架序列，除了其中：i.Kabat残基1可以是鼠的或人的，ii.Kabat残基20可以是鼠的或人的，iii.Kabat残基48可以是鼠的或人的，iv.Kabat残基67可以是鼠的或人的，v.Kabat残基69可以是鼠的或人的，vi.Kabat残基71可以是鼠的或人的，vii.Kabat残基73可以是鼠的或人的，viii.Kabat残基93可以是鼠的或人的。在一个实施方案中，可变重链Kabat残基103-113是鼠的。在另一实施方案中，可变重链Kabat残基残基1、20、48、67、69、71、73和93中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个是鼠的。在另一实施方案中，抗-CLL-1人源化抗体包含可变轻链和可变重链，其中：a.所述可变轻链包含选自HuM26L4、HuM26L4D和HuM26L4DR的序列，以及b.所述可变重链包含序列HuM26VH4。
在一个方面，本文提供了结合CLL-1的人源化抗体，其包含可变轻链和可变重链，其中：a.所述可变轻链包含鼠M31的CDRL1、CDRL2和CDRL3，以及X02990的人框架序列，除了其中：i.Kabat残基60可以是人的或D(“Asp”)，以及ii.Kabat残基68可以是鼠的或人的；以及b.所述可变重链包含鼠M31的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及以下的人框架序列：i.AF174092，除了其中：1.Kabat残基43可以是人的或R(“Arg”)，2.Kabat残基48是鼠的，3.Kabat残基58-65是鼠的，4.Kabat残基66可以是鼠的或人的，5.Kabat残基67可以是鼠的或人的，6.Kabat残基69可以是鼠的或I(“Ile”)，7.Kabat残基71是鼠的，8.Kabat残基75可以是人的或T(“Thr”)，9.Kabat残基82A可以是人的或R(“Arg”)，10.Kabat残基85可以是鼠的或人的，或ii.M17751，除了其中：1.Kabat残基43可以是人的或R(“Arg”)，2.Kabat残基48是鼠的，3.Kabat残基58-65是鼠的，4.Kabat残基66可以是鼠的或人的，5.Kabat残基67可以是鼠的或人的，6.Kabat残基69可以是鼠的或人的，7.Kabat残基71是鼠的，8.Kabat残基75可以是人的或T(“Thr”)，9.Kabat残基82A可以是人的或R(“Arg”)，10.Kabat残基85可以是人的或D(“Asp”)。
为了本公开内容的目的，“鼠”框架氨基酸残基分别是图1A-B或2A-C中示出的M26或M31中的那些框架氨基酸残基。M26的“人”框架氨基酸残基是图1A轻链可变链中的“IGKv1-16”以及图1B重链可变链中的“IGHV1-26”所示出的那些，M31的“人”框架氨基酸残基是图2A轻链可变链中的“X02990VL”以及图2B-2C重链可变链中“AF174092_VH”或“M17751_VH”所示出的那些。
在另一方面，本公开内容提供了包含可变轻链和可变重链的抗-CLL-1人源化抗体，其中：a.所述可变轻链包含选自HuM31VL1和HuM31VL2的序列；以及b.所述可变重链包含选自HuM31VH1、HuM31VH2、HuM31VH3和HuM31VH4的序列。
在本公开内容的抗体的另一实施方案中，所述可变轻链包含HuM26L4。在另一实施方案中，所述可变轻链包含HuM26L4D。在另一实施方案中，所述可变轻链包含HuM26L4DR。在另一实施方案中，所述抗体包含HuM31VH2(SEQ ID NO:16)和HuM31VL2(SEQ ID NO:12)，或HuM31VH3(SEQ ID NO:17)和HuM31VL2(SEQ ID NO:12)。在另一实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人恒定区。在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体，其包含结合CLL-1的第一臂以及结合第二靶抗原如，CD33、CD123、IL1Rap、GPR114的第二臂。在另一实施方案中，所述抗体是双特异性抗体，其包含结合CLL-1的第一臂以及结合T细胞上的CD3抗原的第二臂。在另一实施方案中，所述抗体是半胱氨酸取代的抗体。
还提供了结合CLL-1的抗体，所述抗体包含：含有SEQ ID NO:21的可变轻链，其中SEQ ID NO:21中的至少一个可变位点是来自SEQ ID NO:6中相同位点的氨基酸；以及含有SEQ ID NO:23的可变重链，其中SEQ ID NO:23中的至少一个可变位点是来自SEQ ID NO:9中相同位点的氨基酸。在一些实施方案中，
i.所述可变轻链包含SEQ ID NO:22，
ii.所述可变重链包含SEQ ID NO:24，或
iii.所述可变轻链包含SEQ ID NO:22并且所述可变重链还包含SEQ ID NO:24。
在一些实施方案中，可变重链Kabat残基1、20、48、67、69、71、73和93中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个是鼠的。在一些实施方案中，可变重链Kabat残基1、20、48、67、69、71、73和93中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个是人的。在一些实施方案中，可变重链Kabat残基21、36、44、46、65、66、67或71中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个是鼠的。在一些实施方案中，可变重链Kabat残基21、36、44、46、65、66、67或71中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个是人的。
在一些实施方案中，轻链Kabat残基65-67是NRA或NGA。
在一些实施方案中，所述可变轻链包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，以及所述可变重链包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，所述可变轻链包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述可变轻链包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述可变轻链包含SEQ ID NO:5。
还提供了结合CLL-1的抗体，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:25的可变轻链，其中SEQ ID NO:25中的至少一个可变位点是来自SEQ ID NO:13中相同位点的氨基酸；以及包含以下的可变重链：SEQ ID NO:26，其中SEQ ID NO:26中的至少一个可变位点是来自SEQ IDNO:19中相同位点的氨基酸，或SEQ ID NO:27，其中SEQ ID NO:27中的至少一个可变位点是来自SEQ ID NO:20中相同位点的氨基酸。在一些实施方案中，所述可变轻链包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12；以及所述可变重链包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，所述抗体包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体，其包含结合CLL-1的第一臂以及结合第二靶抗原，例如，CD33、CD123、IL1Rap、GPR114的第二臂。在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体，其包含结合CLL-1的第一臂以及结合T细胞上的CD3抗原的第二臂。
在一些实施方案中，所述抗体是半胱氨酸取代的抗体，例如，包括但不限于在恒定(Fc)区中具有半胱氨酸取代。
在一些实施方案中，所述抗体与细胞毒性剂连接。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是苯二氮类(benzodiazepine)。在一些实施方案中，所述苯二氮类选自吡咯并苯二氮(pyrrolobenzodiazepine)、吲哚啉苯二氮(indolinobenzodiazepine)和异喹啉苯二氮(isoquinolidinobenzodiazepine)或者它们的杂二聚体或同二聚体。
在另一方面，本文提供了嵌合抗原受体，其包含：a.靶标结合结构域，其结合CLL-1并且包含选自权利要求1或3的可变轻链和可变重链的结合部分(例如，scFv结构域)；b.铰链区；c.跨膜结构域(TM)；以及d.包含至少一个信号转导结构域(例如，CD3ζ)的胞内结构域。
在另一方面，本文提供了核酸，其包含编码本公开内容中的任一种的抗体或嵌合抗原受体的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。在另一实施方案中，所述核酸包含在表达载体中。
在另一方面，本文提供了重组细胞，其包含本公开内容的核酸。在一个实施方案中，所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体，并且所述细胞是淋巴或骨髓谱系细胞。
在另一方面，本文提供了制备抗体或嵌合抗原受体的方法，其包括培养本公开内容的重组细胞。在一个实施方案中，所述方法还包括分离所述抗体。
在另一方面，本文提供了组合物，其包含本公开内容的抗体和佐剂。在一个实施方案中，组合物为药学可接受的。
在另一方面，本文提供了检测表达CLL-1的细胞的方法，其包括：
a.使细胞与有效量的能够结合所述细胞的本公开内容的抗体接触，以及b.检测所述抗体与所述细胞的结合，其中结合指示目的细胞的存在。
在另一方面，本文提供了诊断疾病的方法，其包括：a.使来自个体的生物样品与有效量的能够结合病变细胞的本公开内容中的的抗体接触，以及b.检测所述抗体与病变细胞的结合，其中结合指示所述疾病的存在。在一个实施方案中，所述抗体与可检测部分缀合。在另一实施方案中，所述疾病是癌症。在另一实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞或癌症干细胞。在另一实施方案中，所述疾病是骨髓增生性病症。在另一实施方案中，所述骨髓增生性病症选自：AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
在另一方面，本文提供了抑制细胞分裂的方法，其包括使细胞与至少有效量的能够结合所述细胞的本公开内容的抗体接触。在一个实施方案中，细胞分裂的抑制导致细胞死亡。在另一实施方案中，所述细胞是肿瘤或癌症干细胞。在另一实施方案中，所述肿瘤或癌症干细胞来自骨髓增生性病症。在另一实施方案中，所述骨髓增生性病症选自：AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
在另一方面，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本公开内容的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体缀合物，其经由可切割的、不可切割的或无痕接头与有效的细胞毒性药物缀合。在另一实施方案中，所述药物选自：美登素类(maytansinoid)、奥里斯他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、tubulysin、念珠藻素(cryptophycin)、吡咯并苯二氮(PBD)二聚体、吲哚啉苯二氮二聚体、α-鹅膏蕈碱、单端孢霉烯(trichothene)、SN-38、倍癌霉素(duocarmycin)、CC1065、加利车霉素(calicheamincin)、烯二炔类(enediyne)抗生素、紫杉烷类(taxane)、多柔比星(doxorubicin)衍生物、蒽环类、以及它们的立体异构体、azanofide、电子等排体、类似物或衍生物。在另一实施方案中，所述癌症是骨髓增生性病症。在另一实施方案中，所述骨髓增生性病症选自：AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。在另一实施方案中，所述肿瘤相关抗原或癌症干细胞抗原是CLL-1。
在另一方面，本文提供了治疗癌症的方法，所述癌症的特征是表达CLL-1的癌细胞，所述方法包括向对象施用表达本公开的嵌合抗原受体的细胞。在一个实施方案中，所述癌症是白血病，例如，选自AML(急性骨髓性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)和CML(慢性骨髓性白血病)。在另一实施方案中，所述细胞是淋巴或骨髓谱系细胞。
附图简述
图1A和图1B显示多种人源化M26抗体的比较，显示了有阴影的(浅灰或深灰)和加粗加下划线的CDR序列以及AbM和Kabat形式的依序编号。用相应的小鼠氨基酸替换人氨基酸的位置加框。图1A显示以下的可变轻链序列：(i)鼠M26(SEQ ID NO:1)，(ii)人源化HuM26_L1(SEQ ID NO:2)，HuM26_L4(SEQ ID NO:3)，HuM26_L4D(SEQ ID NO:4)，HuM26_L4DR(SEQ ID NO:5)和(iii)人供体序列IGKv1-16(SEQ ID NO:6)。也可由下述表示M26的可变轻链序列：
SEQ ID NO:21
轻链人源化M26
SEQ ID NO:22
直接在SEQ ID NO:21之后轻链人源化M26的另外框架序列：FGQGTKLEIK。
图1B显示以下的可变重链序列：(i)鼠M26(SEQ ID NO:7)，(ii)人源化HuM26_H4a(SEQ ID NO:8)和人供体序列IGHV1-46(SEQ ID NO:9)。也可由下述表示M26的可变重链序列：
SEQ ID NO:23
重链人源化M26(CDRS加粗并加下划线，同一位点的不同选择在括号中显示)
SEQ ID NO:24
直接在SEQ ID NO:23之后重链人源化M26的另外框架序列：WGQGTLVTVSS。
图2A、图2B和图2C显示多种人源化M31抗体的比较，显示了有阴影的(浅灰或深灰)和加粗加下划线的HVR序列以及IMGT和Kabat形式的依序编号。用相应的小鼠氨基酸替换人氨基酸的位置加框。图2A显示以下的可变轻链序列：(i)鼠M31(SEQ ID NO:10)，(ii)人源化HuM31VL_v1(SEQ ID NO:11)，HuM31VL_v2(SEQ ID NO:12)和(iii)X02990VL人供体序列(SEQ ID NO:13)。也可由下述表示M31的可变轻链序列：
SEQ ID NO:25
轻链M31(CDRS加粗并加下划线，同一位点的不同选择在括号中显示)
图2B和图2C显示以下的可变重链序列：(i)鼠M31(SEQ ID NO:14)，(ii)人源化HuM31VH_v1(SEQ ID NO:15)，HuM31VH_v2(SEQ ID NO:16)，HuM31VH_v3(SEQ ID NO:17)，HuM31VH_v4(SEQ ID NO:18)，和(iii)人供体序列AF174092_VH(SEQ ID NO:19)和M17751_VH(SEQ ID NO:20)。也可由下述表示M31的可变重链序列：
SEQ ID NO:26
基于修饰的人框架AF174092_VH的重链人源化M31(CDRS加粗并加下划线，同一位点的不同选择在括号中显示)
SEQ ID NO:27
基于修饰的人框架M17751_VH的重链人源化M31(CDRS加粗并加下划线，同一位置的不同选择在括号中显示)
图3是瞬时表达CLL-1的293细胞中不同M26抗体的结合强度的图。还显示了EC50值和平均荧光强度(MFI)。相对于IgG对照，显示的抗体是嵌合M26(人恒定，小鼠可变)，具有VH4A重链(SEQ ID NO:8)和L4(SEQ ID NO:3)、L4D(SEQ ID NO:4)、L4DR(SEQ ID NO:5)的HuM26。
图4是在不同细胞系(即HL-60、OCI-AML-5、OCI-AML-5敲除)中不同M26抗体的结合强度的图。相对于IgG对照，显示的抗体是嵌合M26，具有VH4A重链(SEQ ID NO:8)和L4(SEQID NO:3)，和L4DR(SEQ ID NO:5)，和嵌合M26轻链，以及嵌合M26重链和轻链的HuM26。
图5是M26、嵌合M26和人源化M26在恒河猴MPC细胞上结合的覆盖直方图(黑色＝IgG，深灰色＝HuM26，浅灰色＝嵌合M26)。这显示嵌合M26和人源化M26具有类似的结合特征。
图6是瞬时表达的ChM31(嵌合--M31)、M31-ChVH/HuVL1(SEQ ID NO:14/SEQ IDNO:11)和M31-ChVH/HuVL2(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:12)抗体与具有His标签的CLL抗原的结合的ELISA分析。每种抗体在不同浓度下进行测试，从250ng/ml开始并连续2倍稀释。在图中所测试的每种抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。
图7是瞬时表达的ChM31(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:10)、HuM31-VH1/VL2(SEQ IDNO:15/SEQ ID NO:12)、HuM31-VH2/VL2(SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:12)、HuM31-VH3/VL2(SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:12)和HuM31-VH4/VL2(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:12)抗体与具有His标签的CLL-1结合的ELISA分析。每种抗体在不同浓度下进行测试，从500ng/ml开始并连续2倍稀释。在图中所测试的每种抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。
图8是纯化的ChM31(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:10)、HuM31-VH2/VL2(SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:12)、HuM31-VH3/VL2(SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:12)和HuM31-VH4/VL2(SEQID NO:18/SEQ ID NO:12)抗体与具有His标签的CLL-1结合的ELISA分析。每种抗体在不同浓度下进行测试，从1μg/ml开始并连续2倍稀释。在图中所测试的每种抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。
图9是ChM31(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:10)、HuM31-VH1/VL2(SEQ ID NO:15/SEQID NO:12)、HuM31-VH2/VL2(SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:12)、HuM31-VH3/VL2(SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:12)和HuM31-VH4/VL2(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:12)抗体与具有His标签的CLL-1的竞争结合亲和力的ELISA分析。分析了在从25μg/ml开始并连续3倍稀释的ChM31、HuM31-VH2/VL2、HuM31-VH3/VL2或HuM31-VH4/VL2抗体存在的情况下小鼠M31抗体的结合。在图中所测试的每种抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。使用GraphPad Prism计算IC50值。
图10是竞争性结合293CLL1细胞的ELISA分析。用Alex488标记ChiM31。分析了在从30μg/ml开始并连续3倍稀释的ChiM31、HuM31和小鼠M31存在的情况下ChiM31-Alex488抗体的结合。在图中所测试的每种抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值MFI(Y轴)。使用GraphPadPrism计算IC50值。
图11是显示食蟹猴细胞标志物上各种标志物相对于鼠对比人源化抗-M31抗体的结合的柱状图。
图12A、图12B、图12C和图12D显示CLT-D202的合成方案。
图13显示抗-CLL1-D202缀合物的靶标依赖性细胞杀伤。
图14A和图14B显示CLL1-ADC在MDR+ve细胞系中显示出靶标依赖性细胞杀伤。
图15显示CLL1-ADC的杀伤和结合的比较。
图16A和图16B显示CLL1-ADC杀伤静止和增殖细胞。
发明详述
I.定义
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同含义。参见，例如Lackie,Dictionary of Cell and Molecular Biology,Elsevier(4th ed.2007)；Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。术语“一个/一种(a/an)”旨在意为“一个或多个/一种或多种”。当在所叙述的步骤或要素之前时，术语“包含(comprise)”及其变型(如包含comprises/comprising)旨在意为添加另外的步骤或要素是任选的，并且是不被排除的。与本文所述的方法、装置和材料类似或等价的任何方法、装置和材料都可用于实施本发明。提供了下述定义以促进理解本文频繁使用的某些术语，并且不意在限制本公开内容的范围。
C型凝集素样分子1(CLL-1)，也被称为CLEC12A、DCAL-2和MICL，是一种II型膜蛋白(ITIM结构域–TM结构域-茎结构域-凝集素样结构域)。CLL-1的胞外结构域是高度糖基化的，并且其仅在骨髓谱系的细胞中表达。CLL-1也在AML、MDS和CML细胞上表达。CLL-1表达可用于区分不表达CLL-1的正常造血干细胞(HSC)和表达CLL-1的白血病干细胞(LSC)。LSC是白血病患者中导致癌细胞产生和癌症复发的CD34+细胞。参见Bakker等，(2004)CancerRes.64:8443。
许多物种的CLL-1的核苷酸序列和蛋白质序列是已知的。例如，人序列可在Genbank登录号AF247788.1(SEQ ID NO:1中示出的编码序列)和Uniprot登录号Q5QGZ9(SEQID NO:2)处找到。对于SEQ ID NO:2所示的人CLL-1蛋白，胞外结构域大致包含氨基酸65-265，跨膜结构域大致包含氨基酸44-64，并且细胞质结构域大致包含氨基酸1-43。人CLL-1的茎结构域跨越氨基酸65-139，并且C凝集素结构域跨越氨基酸140-249，二者都参考SEQID NO:2所示的序列。本领域技术人员将理解，可对CLL-1变体(例如物种同源物、等位基因变体等)进行最佳比对，例如用于鉴定保守的残基和结构域。
术语“CLL-1特异性抗体”、“抗CLL-1抗体”、“CLL-1抗体”和“抗CLL-1”在本文同义使用，是指特异性结合CLL-1的抗体，包括CLL-1的各种糖基化形式。本文所述的CLL-1抗体特异性结合例如某些癌细胞表面上表达的CLL-1多肽，但是不与HSC结合。如下文更详细论述的，本发明的抗CLL-1抗体能够结合表达CLL-1的细胞、结合相比其它靶向AML的抗体更大百分比的AML细胞、抑制AML细胞增殖并且介导它们的破坏。
“CLL-1相关病症”(或“CLL-1有关病症”、“CLL-1病症”、CLL-1有关病况或疾病等)是指与标准对照(例如，正常细胞、非病变细胞、非癌细胞)中的CLL-1表达相比，与升高的或降低的CLL-1的细胞表面表达相关的病况和疾病。升高的CLL-1水平与癌细胞，特别是白血病如AML(急性骨髓性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)和CML(慢性骨髓性白血病)以及造血性CSC(例如LSC)相关。
术语“抗体”是指多肽结构，例如，完整的免疫球蛋白(两条轻链和两条重链，例如四聚体)、免疫球蛋白多肽(轻链或重链)、缀合物或其保留了抗原结合活性的片段。该术语包括但不限于来源于人或其它哺乳动物细胞的同种型类型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的多克隆抗体或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化的、人的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、移植的以及体外生成的抗体。该术语涵盖缀合物，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白(例如嵌合抗体或双特异性抗体或scFv)和片段，如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和其它组合物。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指这样的多肽，其包含(1)靶标结合结构域(例如，抗体的结合部分，如scFV)；(2)铰链区；(3)跨膜结构域(TM)；以及(4)包含至少一个信号转导结构域(例如，CD4)的胞内结构域。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对都具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端都限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链的区域。可变区含有抗体的抗原结合区(或其功能等价物)，并且对结合的特异性和亲和力最为重要。参见Paul,Fundamental Immunology(2003)。
抗体可作为完整的免疫球蛋白存在，或作为任意数量的包括特异性抗原结合活性的良好表征的片段存在。为了清楚起见，具有重链和轻链的四聚体抗体在本文中称为“完整的免疫球蛋白”，并且可以为天然存在的、多克隆的、单克隆的或重组产生的。可通过用多种肽酶消化来产生片段。胃蛋白酶在铰链区中二硫键下方消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)'2，Fab本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)'2可以在温和条件下被还原而破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分铰链区的Fab。虽然各抗体片段按照完整抗体的消化来定义，但是本领域技术人员将理解，这些片段可以以化学方法或通过使用重组DNA方法来从头合成。因此，本文使用术语抗体还包括通过修饰整个抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段，或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见例如，McCafferty等，Nature 348:552-554(1990))。
如本文所用，术语“Fv”是指一价或二价的可变区片段，并且可仅涵盖可变区(例如，VL和/或VH)，以及较长的片段，例如Fab、Fab'或F(ab')2，其也包含CL和/或CH1。除非特别指明，术语“Fc”是指包含CH1和CH2区的重链单体或二聚体。
单链Fv(scFv)是指包含通过接头，例如肽接头连接的VL和VH的多肽。ScFv还可用于形成串联(或二价)scFv或双链抗体。串联scFv和双链抗体的产生和特性描述于例如Asano等，(2011)J Biol.Chem.286:1812；Kenanova等，(2010)Prot Eng Design Sel 23:789；Asano等，(2008)Prot Eng Design Sel 21:597中。
如本文所用，“单克隆抗体”是指对抗原上的给定表位具有单一结合特异性和亲和力的抗体克隆制备物。“多克隆抗体”是指针对单一抗原产生但具有不同结合特异性和亲和力的抗体制备物。
如本文所用，“V区”是指抗体可变区结构域，其包含框架1、CDR1、框架2、CDR2和框架3、CDR3和框架4的区段，在B细胞分化期间，所述区段由于重链和轻链V区基因重排而添加至V区段。
如本文所用，“互补决定区(CDR)”是指每条链中的三个高变区，其间插于由轻链和重链可变区建立的四个“框架”区。CDR主要负责结合抗原表位。从N端开始顺序编号，每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，并且也通常通过具体CDR所位于的链来鉴定。因此，VHCDR3位于其所存在的抗体重链的可变结构域中，然而VL CDR1是来自其所存在的抗体轻链可变结构域的CDR1。
在物种内，不同的轻链或重链的框架区序列相对保守。抗体的框架区，即组成型轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中安置并匹配CDR。
可使用多种本领域众所周知的定义来确定CDR和框架区的氨基酸序列，例如，Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见例如，Johnson等，同上；Chothia&Lesk,(1987)J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia等，(1989)Nature 342,877-883；Chothia等，(1992)J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol 1997,273(4))。对使用Kabat系统来定位CDR的有用指南可在可获得的网址bioinf.org.uk/abs处找到。抗原组合位点的定义在下述中也有描述：Ruiz等.Nucleic Acids Res.,28,219–221(2000)；和Lefranc Nucleic Acids Res.Jan 1；29(1):207-9(2001)；MacCallum等,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268–9272(1989)；Martin等,Methods Enzymol.,203:121–153,(1991)；Pedersen等,Immunomethods,1,126,(1992)；和Rees等,In Sternberg M.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction.OxfordUniversity Press,Oxford,141–172 1996)。
“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中(a)恒定区或其一部分被改变、取代或互换，使得抗原结合位点(可变区、CDR或其一部分)与不同的或改变的类型、效应子功能和/或物种的恒定区连接；或(b)可变区或其一部分被用具有不同或改变的抗原特异性的可变区(例如，来自不同物种的CDR或框架区)来改变、取代或互换。嵌合抗体可包含可变区片段，例如重组抗体包含两个Fab区或Fv区或scFv。如上文所示，嵌合还可包含来自与连接的Fv区不同来源的Fc区。在一些情况下，嵌合抗体包含Fv区内的嵌合性。此类嵌合抗体的实例为其中框架区和CDR来自不同来源的人源化抗体。
人源化抗体是其中获自非人抗体VH区和VL区的抗原结合环(即，CDR)被移植到人框架序列中的抗体。人源化，即将非人CDR序列取代为人抗体中的相应序列，其可根据以下所述的方法来进行，例如，美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,633,425号；第5,661,016号；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology14:845-51(1996)。如在美国专利第6,673,986号中所公开的，转基因小鼠或其它生物体如其它哺乳动物，也可用于表达人源化抗体或人抗体。
术语“抗原”、“免疫原”、“抗体靶标”、“靶标分析物”等术语在本文中用于指被抗体识别(即可被抗体特异性结合)的分子、化合物或复合物。该术语可指可被抗体特异性识别的任何分子，例如多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、化学部分或它们的组合(例如，磷酸化或糖基化的多肽等)。本领域技术人员将理解，该术语并不表示该分子在每种环境中都具有免疫原性，而仅表示其可被抗体靶向。
抗体与抗原上的“表位”结合。表位是抗原上的被抗体识别并结合的局部位点。表位可包括一些氨基酸或一些氨基酸的一部分，例如，5个或6个或更多，例如20个或更多个氨基酸，或这些氨基酸的一部分。在一些情况下，表位包含非蛋白质组分，例如，来自碳水化合物、核酸或脂质的组分。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，在靶标是蛋白质的情况下，表位可包含连续的氨基酸或来自通过蛋白质折叠而邻近蛋白质的不同部分的氨基酸(例如，不连续的表位)。形成三维结构的其它类型的靶标分子亦如此。
术语“对……具有特异性”、“特异性结合”等是指这样的分子(例如抗体或抗体片段)，其以比非靶标化合物至少更大2倍的亲和力，例如至少更大4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍中的任一个亲和力结合靶标。例如，特异性结合第一抗体的抗体通常以比非第一抗体靶标(例如，来自不同物种的抗体或不同同种型的抗体或非抗体靶标)更大至少2倍的亲和力结合第一抗体。
术语关于抗体靶标(例如，抗原、分析物、免疫复合物)的“捕获”，通常表示抗体结合纯的群体中的大部分抗体靶标(假定适当的摩尔比率)。例如，结合给定抗体靶标的抗体通常与溶液中至少2/3的抗体靶标结合(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任意百分比)。本领域技术人员应认识到，根据确定结合的方法和/或阈值会产生一些变化。
术语关于抗体的“交联”，是指将抗体连接于固体或半固体基质(例如，琼脂糖、珠粒、培养板)，或者连接于另一种蛋白质或抗体。例如，抗体可被多聚化以产生具有多个(大于2个)抗原结合位点的抗体复合物。可通过将抗体表达为高价同种型(例如IgA或IgM，其通常分别形成2个或5个抗体的复合物)来将抗体多聚化。抗体多聚化还可通过使用包含能够连接蛋白质的反应基团的交联剂(例如碳二亚胺、NHS酯等)来实施。用于使抗体与基质交联的方法和组合物描述在例如Abcam和New England Biolab的产品目录和网址(可在abcam.com和neb.com获得)中。具有多个反应基团的交联剂化合物描述在例如ThermoFisher Scientific的产品目录和网址(可在piercenet.com获得)中。
本文使用的术语“半胱氨酸取代的抗体”是指这样的抗体，其包含已经用非天然存在的半胱氨酸取代的至少一个恒定区免疫球蛋白氨基酸残基。非天然存在的取代为非同型的取代。在一个实施方案中，取代的残基是重链恒定区残基T153C、S156C、V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436C和L441C。在一些实施方案中，恒定区是同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
如本文所用，当与第一抗体不存在情况下的第二抗体与靶标的结合相比，第一抗体存在情况下的第二抗体与靶标的结合可检测地降低时，第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分“竞争”结合靶标。可选地，其中在第二抗体存在的情况下第一抗体与靶标的结合也可检测地降低，也可能是这种情况但并非一定是这种情况。即，在第一抗体不抑制第二抗体与靶标的结合的情况下，第二抗体可抑制第一抗体与靶标的结合。然而，在每种抗体都可检测地抑制另外的抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论这种抑制是相同程度、更大程度或更小程度，都认为抗体彼此“相互竞争”结合其各自的表位。本发明涵盖竞争和相互竞争抗体。术语“竞争剂”抗体可应用于第一抗体或第二抗体，其可由本领域技术人员确定。在一些情况下，竞争剂抗体(例如第一抗体)的存在使第二抗体与靶标的结合降低至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更高中的任一个，例如使得在第一(竞争剂)抗体存在的情况下，无法检测到第二抗体与靶标的结合。
术语“标记物”、“可检测部分”以及类似术语是指可通过光谱学、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理学手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料、冷光剂、放射性同位素(例如，32P、3H)、高电子密度试剂、酶(例如，在ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或者可以例如通过将放射性标记掺入与靶标分析物特异性反应的肽或抗体中使其可被检测到的其它实体。可使用本领域已知的用于将抗体与标记物缀合的任何方法，例如使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press，Inc.,SanDiego中所述的方法。术语“标签”可与术语“标记物”同义使用，但通常是指基于亲和力的部分，例如用于纯化的“His标签”或与生物素相互作用的“链霉亲和素标签”。
“标记的”分子(例如核酸、蛋白质或抗体)是通过接头或化学键与标记物共价结合，或者通过离子键、范德华力、静电力或氢键与标记物非共价结合的分子，使得可以通过检测结合该分子的标记物的存在来检测该分子的存在。
术语“差异化表达”或“差异化调控”通常是指与至少一个其它样品相比，在一个样品中过表达(上调)或低表达(下调)的蛋白质或核酸生物标志物。在本公开内容的上下文中，该术语通常指与正常非癌细胞相比，CLL-1在癌细胞(例如AML细胞或AML CSC)上的过表达。
例如，术语“过表达的”或“上调的”可互换地指蛋白质或核酸，通常为以可检测地高于对照水平进行转录或翻译的生物标记物。该术语包括由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)以及RNA和蛋白质稳定性而导致的过表达。可使用检测生物标志物的常规技术来检测过表达，无论是mRNA(即，RT-PCR、杂交)还是蛋白质(即，流式细胞术、成像、ELISA、免疫组织化学技术)。与正常细胞相比，过表达可以为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。
术语“激动剂”、“活化剂”、“诱导剂”以及类似术语是指与对照相比，能提高活性或表达的分子。激动剂是例如结合、刺激、提高、活化、增强活化、敏化或上调靶标活性的试剂。与在对照中的表达或活性相比，该表达或活性可提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高中的任一个。在某些情况下，与对照相比，活化是1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多中的任一个。
术语“抑制剂”、“阻遏剂”或“拮抗剂”或“下调剂”可互换地指与对照相比导致可检测地较低表达或活性水平的物质。与对照中的表达或活性相比，该受抑制的表达或活性可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更少中的任一个。在某些情况下，与对照相比，抑制为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多中的任一个。
“对照”样品或“对照”值是指为了比较测试样品而充当参照物的样品，通常是已知的参照物。例如，测试样品可采自测试条件(例如，在测试化合物存在的情况下)，并且与来自已知条件，例如，在测试化合物不存在的情况下(阴性对照)或已知化合物存在的情况下(阳性对照)的样品进行比较。在本公开内容的上下文中，阴性对照的实例为来自已知健康(非癌症)个体的生物样品，并且阳性对照的实例为来自已知的AML患者的生物样品。对照还可表示由许多测试或结果收集的平均值或范围。本领域技术人员将认识到，可设计对照用于评估任何数量的参数。例如，对照可被设计成基于药理学数据(例如半衰期)或治疗性测量(例如，益处和/或副作用的比较)来比较治疗性益处。可设计对照用于体外应用。本领域技术人员将理解，在给定的情况下哪些对照是有价值的，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果对照中给定参数的值广泛变化，则测试样品中的变化将被视为不显著的。
术语“诊断”是指对象患有诸如癌症的病症的相对可能性。类似地，术语“预后”是指对象中某些未来的结果可能发生的相对可能性。例如，在本公开内容的上下文中，预后可指个体将发展癌症、具有复发、被治愈的可能性，或者疾病可能的严重程度(例如，症状的严重程度、功能下降的比率、存活等)。如医学诊断学领域技术人员将理解的，该术语不意图绝对化。
本文使用的“活检”或“来自患者的生物样品”是指获自患有或疑似患有CLL-1相关病症的患者的样品。样品还可为血液样品或血液级分，例如白细胞级分、血清或血浆。在一些实施方案中，样品可为组织活检，如针吸活检、细针吸活检、手术活检等。样品可包括含有病变或疑似病变的组织样品，但是生物样品还可来源于另一部位，例如疑似转移的部位、淋巴结或来自血液。在一些情况下，生物样品还可来自与病变或疑似病变相邻的区域。
“生物样品”可获自患者(例如活检)、获自动物(如动物模型)、或获自培养的细胞(例如从患者移除并在培养物中培养用于观察的细胞系或细胞)。生物样品包括组织和体液，例如血液、血液级分、淋巴液、唾液、尿、粪便等。
术语“治疗”、“处理”和“改善”是指症状严重程度的任何减轻。在治疗癌症(例如AML)的情况下，治疗可指例如，减小肿瘤大小、癌细胞数量、生长速率、转移活性、减少非癌细胞的细胞死亡、减轻恶心及其它化疗或放疗的副作用等。术语“治疗”和“预防”不意图作为绝对化的术语。治疗和预防可指发病的任何延迟、症状的改善、患者存活的改善、存活时间或存活率的增加等。治疗和预防可为完全的(未检测到瘤细胞水平)或部分的，使得与不使用本发明的情况下将出现的瘤细胞相比，在患者中存在更少的瘤细胞。可将治疗的效果与未接受治疗的个体或个体群进行比较，或者同一患者在治疗前或治疗期间不同时间进行比较。在一些方面，与例如施用前的个体或与未进行治疗的对照个体相比，疾病的严重程度减轻至少10％。在一些方面，疾病的严重程度减轻至少25％、50％、75％、80％或90％，或者在一些情况下，使用标准诊断技术不再能检测到。
术语“有效量”、“有效剂量”、“治疗有效量”等是指足以如上文所述改善病症的治疗剂的量。例如，对于给定参数，治疗有效量将显示出治疗效果增加或降低至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％中的任一个。治疗功效还可以表示为“倍数”增加或降低。例如，与对照相比，治疗有效量可具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍效果中的任一个。
短语“药学可接受的”在本文用于指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型，其在可靠的医学判断范围内，适合用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、变态反应或者其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相当。如本文所用，术语“药学可接受的”与生理学可接受的和药理学可接受的同义使用。药物组合物通常包含用于缓冲以及在储存期间保存的试剂，并且可根据施用途径包含适于递送的缓冲剂和载体。
术语“剂量(dose)”和“用量(dosage)”可在本文互换使用。剂量是指每次施用时给予个体的活性成分的量。对于本发明，剂量可指抗体或相关组分的浓度，例如治疗剂的量或放射标记的剂量。剂量会根据许多因素而变化，包括施用频率；个体大小和耐受性；病况的严重程度；副作用的风险；施用途径；以及可检测部分(如果存在的话)的成像形式。本领域技术人员将认识到，可根据上述因素或基于治疗进展来改变剂量。术语“剂型”是指具体的药物形式，并且其依赖于施用途径。例如，剂型可为液体，例如注射用盐水溶液。
“对象”、“患者”、“个体”以及类似术语可互换使用，并且是指(除非另有说明)哺乳动物，如人和非人灵长类，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪以及其它哺乳动物物种。本术语并非一定指对象已被诊断出患有具体疾病，而通常指在医疗监督下的个体。患者可为寻求治疗、监测、调节或改变现有治疗方案等的个体。“癌症患者”或“AML患者”可指已被诊断出患有癌症、目前正在接受治疗方案或处于复发风险(例如在通过手术切除肿瘤后)的个体。在一些实施方案中，癌症患者已被诊断出患有癌症，并且是治疗的候选者。癌症患者可包括未接受治疗、目前正在接受治疗、已经进行了手术的患者，以及已经中断了治疗的患者。
在治疗癌症的上下文中，需要治疗的对象可指患有癌症或癌前病况、患过癌症并处于复发的风险中、疑似患有癌症、正接受癌症标准治疗(例如放疗或化疗)等的个体。
“癌症”、“肿瘤”、“转化的”以及类似术语包括癌前的、瘤的、转化的和癌细胞，并且可指实体瘤或非实体瘤(参见例如，Edge等，AJCC Cancer Staging Manual(第7版，2009)；Cibas and Ducatman Cytology:Diagnostic principles and clinical correlates(第3版，2009))。癌症包括良性赘生物和恶性赘生物(异常生长)。“转化”是指自发或诱导的表型变化，例如，细胞的永生化、形态学变化、细胞生长异常、接触抑制和锚定降低，和/或恶性化(参见Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(第3版，1994))。虽然转化可起因于转化病毒的感染和新基因组DNA的掺入或外源DNA的摄取，但是其也可自发产生或在暴露于致癌物后产生。
术语“癌症”可指白血病、癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、实体瘤和淋巴样癌症等。不同类型的癌症实例包括但不限于急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(liver cancer)(即，肝癌(hepatocarcinoma))、肾癌(即，肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、肋膜癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胰腺癌、胆管癌、胃肠道类癌肿瘤、食管癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃(胃部)癌、中枢神经系统的癌症、皮肤癌、绒毛膜癌；头颈癌、骨源性(osteogenic)肉瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和黑色素瘤。
“癌症靶标”或“癌症标志物”是在癌症中(例如在癌细胞上或在癌症环境中)差异化表达或加工的分子。示例性的癌症靶标为细胞表面蛋白如CLL-1(另外，例如细胞粘附分子和受体)；细胞内的受体、激素和分子，如由细胞分泌至癌症环境中的蛋白酶。具体癌症的标志物是本领域已知的，例如，AML的CD45、AML CSC的CD34+CD38-、结肠癌和结肠直肠癌上的MUC1表达、肺癌中的蛙皮素受体以及前列腺癌上的前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
在一些实施方案中，癌症靶标可与某些癌细胞类型相关，例如，AML、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、非小细胞肺癌细胞、前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌或卵巢癌。细胞类型特异性靶标在该细胞类型中的表达通常比在参照细胞群中更大至少2倍的水平。在一些实施方案中，细胞类型特异性标志物的存在比其在参照群体中的平均表达更高至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或1000倍中的任一个的水平。因此，可检测或测量该靶标以将目的细胞类型与其它细胞区分开来。例如，AML癌症靶标包括Cll-1、IL1Rap、GPR114、Ly86、LILRA1和CD180。
癌症干细胞(CSC)是存在于肿瘤和血癌中的细胞，其可产生构成大部分癌症的细胞。CSC还可自我更新，这与正常(非癌)干细胞类似。因此，CSC可通过移动至个体的非肿瘤组织中并启动“新”肿瘤来介导转移。根据检测到的癌症阶段，CSC占任何给定癌症的非常小的百分比。例如，AML细胞样品中CSC的平均频率被认为是约1:10,000。造血性CSC可被鉴定为CD34+，这与正常造血干细胞(HSC)类似。
术语“使……内化”、“内化”、“内吞”、“内吞作用”、“吞噬”以及类似术语是指由细胞进行的物质摄取，例如，通过抗体(或受体)介导的内吞作用或吞噬作用来进行。实施例5中ADC测定的结果指示本公开的CLL-1抗体可被内化。
术语“移植(engraft/engraftment)”是指细胞在引入至个体或组织中后存活、增殖和/或恰当定位的能力。在癌症干细胞(CSC)的情况下，该术语可指CSC重新生成肿瘤或扩散至不同部位的能力。该术语通常用于描述细胞群体在异种移植模型(例如人细胞在小鼠中的移植)中的存活和发挥功能的能力。可如，例如WO2006/047569中所述来确定造血细胞的移植。可如，例如Beckhove等，(2003)Int.J.Cancer 105:444中所述来确定肿瘤细胞的移植。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，以及它们的互补物。术语“多核苷酸”是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单一单元，即单体。核苷酸可为天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或者它们的合成形式或修饰形式。本文预期的多核苷酸的实例包括单链DNA和双链DNA、单链RNA和双链RNA(包含siRNA)，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。
词语“互补”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A是互补的。互补性可为部分的，其中仅一些核酸根据碱基配原则匹配；或者可为完全的，其中所有核酸都根据碱基配对原则匹配。
使用核酸杂交技术的特异性DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的(参见Sambrook,Id.)。一些方法包括电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是DNA和RNA的测量也可在未进行电泳分离的情况下实施(例如，定量PCR、点印迹或阵列)。
词语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，表示氨基酸聚合物或者一系列两个或更多个相互作用或结合的氨基酸聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物、包含修饰的残基的氨基酸聚合物、以及非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸、修饰的氨基酸或合成的氨基酸，以及发挥与天然存在的氨基酸类似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码子编码的氨基酸。修饰的氨基酸包括例如羟脯氨酸、γ-羟基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如其α碳原子与氢原子、羧基、氨基以及R基团结合，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫鎓。此类类似物可具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的整体化学结构不同的结构，但是发挥与天然存在的氨基酸类似功能的化合物。
氨基酸在本文中可通过其公知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可通过其普遍接受的单字母密码来提及。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同或相关的(例如天然连续的)序列。由于遗传密码子的简并性，许多功能相同的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子确定的每个位置处，该密码子可被改变为所述的相应密码子中的另一个而不改变所编码的多肽。此类核酸变体是“沉默变体”，其为保守修饰的变体中的一个种类。本文中的每个编码多肽的核酸序列同样描述了该核酸的沉默变体。本领域技术人员将认识到，在某些情况下，可修饰核酸中的每个密码子(通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG除外)，以产生功能相同的分子。因此，针对表达产物所描述的序列隐含了编码多肽的核酸的沉默变体，但是针对实际的探针序列并非如此。
对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的单个取代、缺失或添加从而改变、添加或缺失所编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸是“保守修饰的变体”，其中该改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸所取代。具有功能类似的氨基酸的保守替换表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体另外也是并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。下述氨基酸彼此通常是保守取代：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,Proteins(1984))。
在两种或更多种核酸或者两种或更多种多肽的上下文中，术语“同一性”或“同一性百分比”是指如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法以默认参数或通过手动比对和目测所测量的，相同的或具有特定百分比的核苷酸，或者相同氨基酸(即，当在比较窗或指定区上针对最大一致性比较和比对时，在特定区域上具有约60％同一性，例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比同一性中的任一个)的两个或更多个序列或者子序列。参见例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。此类序列则被称为“基本相同的”。通常在最佳比对的序列上确定同一性百分比，以使该定义适用于具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。本领域通常使用的算法涵盖缺口等。通常，同一性存在于包含抗体表位的区域中或者长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的序列中，或者长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域中，或者参考序列的整个长度上。
当在提及例如细胞或核酸、蛋白质或载体而使用时，术语“重组体”表示已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰的细胞、或核酸、蛋白质或载体，或者表示细胞来源于如此修饰过的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)的细胞形式中未发现的基因，或者表达在其它方面异常表达、下调表达或根本不表达的天然基因。
关于多核苷酸或多肽的术语“异源”，表示多核苷酸或多肽包含在自然界中未发现彼此具有相同关系的两个或更多个子序列。例如，通常重组产生异源多核苷酸或多肽，其具有来自不相关基因的两个或更多个序列排列形成新的功能单位，例如启动子来自一个来源，而编码区来自另一个来源。类似地，异源蛋白表示蛋白质包含自然界中未发现彼此具有相同关系的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。
II.CLL-1相关病症
本文所述的抗体可用于检测和治疗CLL-1相关的病症，即，与标准对照(例如，正常细胞、非病变细胞、非癌细胞)中的CLL-1表达相比，与升高或降低的CLL-1细胞表面表达相关的疾病。在外周血和脾中，CLL-1表达通常限制于骨髓谱系细胞，例如树突状细胞、粒细胞和单核细胞。升高的CLL-1水平与癌症特别是造血性CSC(例如LSC)以及骨髓增生性病症相关，所述骨髓增生性病症包括诸如AML(急性骨髓性白血病或骨髓增生性白血病)等白血病、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、CMML(慢性骨髓单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性骨髓性白血病或骨髓增生性白血病)。参见Bakker等，(2004)CancerRes.64:8443；Van Rhenen等，(2007)Blood 110:2659-66；Zhao等，(2010)Haematologica(2010)95:71；Van Rhenen等，(2007)Leukemia 21:1700；以及Herrmann等，(2012)Haematologica 97:219。
可通过检测细胞表面标志物的表达来表征AML细胞，并将其与其它细胞区分开来。除了CLL-1+外，AML细胞还可为CD33+(虽然一些是CD33-)、CD45+和CDw52+。AML母细胞(包括LSC)通常是CD34+CD38-。HSC和LSC的特征可为表达CD34，但是前者不表达CLL-1。MDS细胞的特征可为表达CD5、CD7、CD13和CD34。CML细胞的特征可为表达7-ADD、CD33、CD34和CD38。
骨髓增生异常综合征(MDS)包括一组密切相关的血液形成病症，其中骨髓显示出暗示白血病前期过程，但是具有不一定最终发展为急性白血病的慢性过程的定性和定量变化。已经有包括白血病前期、顽固性贫血、顽固性骨髓造血异常性贫血、潜袭型白血病或亚急性白血病、骨髓造血异常综合征(DMPS)和骨髓发育不良在内的多种术语被用于描述MDS。这些病况的特征都在于髓细胞成熟受损(骨髓发育不良)和血细胞数量减少。DMPS的特征是，存在巨幼红细胞(megablastoid)、巨核细胞发育异常以及异常的母细胞数量增加，反映了粒细胞成熟过程增强。患有DMPS的患者显示出与某些部分受折磨患者的急性骨髓性白血病和急性骨髓性白血病进展中所发现的类似的染色体异常。
慢性骨髓增生性病症是病况的集合，其特征是成熟的和未成熟的粒细胞、红细胞和血小板数量增加。慢性骨髓增生性病症可转变为该组中的其它形式，趋势是最终发展为急性骨髓性白血病。该组中的具体疾病包括真性红细胞增多症、慢性骨髓性白血病、不明原因的骨髓性白血病、特发性血小板增多症和慢性中性粒细胞性白血病。
骨髓纤维化的特征是骨髓的瘢痕化，其导致红细胞和白细胞以及血小板数量减少。骨髓纤维化瘢痕化可由白血病引起，但是可具有其它原因，例如血小板增多症或药物不良作用。
III.人源化抗-CLL-1抗体
本文提供了人源化抗-CLL-1抗体(即，CLL-1特异性抗体，抗-CLL-1)，其特异性结合人CLL-1，例如，结合表达CLL-1的细胞的胞外结构域。
在一个实施方案中，本文提供结合CLL-1且包含可变轻链和可变重链的人源化抗体，其中所述可变轻链还包含鼠M26的CDRL1、CDRL2和CDRL3，以及IgKv1-16的人框架序列，并且可变重链包含鼠M26的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及IGHV1-46的人框架序列，除了在每种情况下具有本公开内容中所提供的取代之外。在一些实施方案中，抗体轻链Kabat残基65-67为NRA或NGA。这会缺失糖基化位点(NRS)。用NGS替换NRS消除了抗体结合活性。用NGA替换维持抗体结合，但引入潜在的脱氨信号序列。用NRA替换维持抗体结合活性而不引入潜在的脱氨信号序列。
在另一实施方案中，本文提供结合CLL-1的包含可变轻链和可变重链的人源化抗体，其中所述可变轻链包含鼠M31的CDRL1、CDRL2和CDRL3，以及X02990的人框架序列，并且所述可变重链包含鼠M31的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及AF174092或M17751的人框架序列，除了在每种情况下具有本公开内容中所提供的取代之外。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合包含C凝集素结构域外的组分的表位，使得所述抗体结合由C凝集素结构域组成的多肽的亲和力比其结合由CLL-1的C凝集素和茎结构域或CLL-1的胞外结构域组成的多肽的亲和力更低。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以比由CLL-1的C-凝集素和茎结构域组成的多肽更高至少5倍的Kd来结合由CLL-1的C-凝集素结构域组成的多肽(例如，10倍、20倍、50倍、100倍或更高倍数中的任一个)。例如，命名为M26和M31的CLL-1抗体以比人CLL-1的氨基酸141-265更高的亲和力结合人CLL-1的氨基酸101-265(参考SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以比全长CLL-1(或CLL-1的全长胞外结构域)更高至少5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的Kd结合C凝集素结构域。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体对人CLL-1具有亲和力，其Kd为1000pM或更小，例如800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM或更小中的任一个。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体对人CLL-1具有亲和力，其Kd为10nM或更小，例如1nM或更小、1-10nM、100-1000pM、10-1000pM、约1nM或更小、1-500pM。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体还结合灵长类CLL-1，例如食蟹猴CLL-1，其Kd为10nM、1nM、500pM或更小。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合食蟹猴CLL-1，其Kd在对于人CLL-1的Kd的量级中。本领域技术人员将理解较小的Kd值指示较高的亲和力。
在一些实施方案中，所述CCL-1抗体结合广泛范围的CLL-1糖基化变体。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合表达于AML细胞上的CLL-1形式(例如糖基化变体)。例如，本文所述的CLL-1抗体可捕获AML细胞培养物(例如HL60、THP1和U937细胞系)中的细胞至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高百分比中的任一个。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体可结合AML患者样品(例如来自AML患者的PBMC样品或活检)中的细胞至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高百分比中的任一个。本领域技术人员将理解，在此类细胞结合测定中，添加适当浓度的抗体，例如以使得存在足够的抗体分子来结合培养物或样品中的大量细胞。
出人意料的是，本文所述的CLL-1抗体可在体外和体内抑制表达CLL-1的细胞的生长，即使在缀合的细胞毒性剂不存在的情况下亦如此。考虑到与来自患者样品的AML细胞高百分比的结合，本文所述的抗体为AML患者以及罹患CLL-1+MDS或CML的患者提供了有用的治疗选择。
本文所述的CLL-1抗体还显示了补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体药物缀合物(ADC)活性。因此，这些CLL-1抗体还可用于例如在缀合的细胞毒性剂不存在的情况下靶向表达CLL-1的细胞用于破坏。
在其它实施方案中，CLL-1抗体是具有第一臂和第二臂的双特异性抗体，第一臂具有结合CLL-1的抗原结合区，第二臂具有结合第二靶抗原的抗原结合区。第二靶抗原可以是任何目的抗原。例如，第二靶抗原可以是癌症标志物，即(例如，细胞表面蛋白质)在癌细胞上比在非癌细胞上以更高水平(例如，超过2x)表达的蛋白质。例如，第二靶抗原可以选自CD33、CD123/IL3Ra、IL1RAP、GPR-114、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPVE6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGE A3TCR、TCRSLITRK6、ENPP3、粘连蛋白-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、组织因子(TF)、CanAg、EGFR、αv-整联蛋白、CD37、叶酸受体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV1(ZIP6)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座E(LY6E)和B7-H4。在一些实施方案中，第二靶抗原选自IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD123/IL3Ra、GPR114、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGE A3TCRSLITRK6、ENPP3、粘连蛋白-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、组织因子(TF)、CanAg、EGFR、αv-整联蛋白、CD37、叶酸受体-α、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4或内皮唾液酸蛋白/CD248。
与先前表征的抗体相比，本文所述的CLL-1抗体具有独特的细胞结合活性。例如，本文所述的抗体结合以较高百分比存在于来自AML患者的原代细胞上的表位。这些抗体可用于检测展示被至少一种本文公开的CLL-1抗体以高亲和力靶向的表位的癌细胞。在一些实施方案中，这些癌细胞随后可被同样的CLL-1抗体靶向破坏。此类方法可包括治疗具有表达CLL-1的癌细胞的个体，其包括向所述个体施用所述CLL-1抗体。
许多类型的竞争性结合测定是已知的，包括固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、三明治竞争性测定(参见Stahli等，Methods inEnzymology 9:242-253(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.137:3614-3619(1986))；固相直接标记的测定；固相直接标记的三明治测定(参见Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见Morel等，Molec.Immunol.25(1):7-15(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，Virology 176:546-552(1990))；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32:77-82(1990))。通常，此类测定包括使用与固体表面结合的纯化的抗原或携带这些中任一个的细胞、未标记的测试免疫球蛋白以及标记的参照免疫球蛋白。在测试免疫球蛋白存在的情况下，通过确定与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通过竞争性测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合至与参照抗体相同的表位的抗体，以及结合至离参照抗体所结合的表位足够近的相邻表位以发生位阻的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，其以至少50％或75％抑制参照抗体与共同抗原的特异性结合。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体具有轻链CDR序列和重链CDR序列，相对于选自M26和M3的抗体的CDR序列，其具有多至1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失/CDR。在一些实施方案中，相对于上述CLL-1抗体的轻链CDR序列，所述轻链CDR序列包含多至1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失/CDR。在一些实施方案中，相对于上述CLL-1抗体的重链CDR序列，所述重链CDR序列包含多至1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失/CDR。在一些实施方案中，取代、添加或缺失仅发生于总共6个CDR中的1、2、3、4或5个CDR中。
在一些实施方案中，所述抗体还具有选自以下的至少一种活性：
·以10nM或更小的Kd，例如1nM或更小、1-10nM、100-1000pM、10-1000pM、约1nM或更小、1-500pM等结合人CLL-1；
·在使用HL60细胞或来自AML患者的表达CLL-1的AML细胞的CDC测定中，EC50为200ng/ml或更小；
·在使用HL60细胞或来自AML患者的表达CLL-1的AML细胞的ADC测定中，EC50为100pM或更小；和
·与所述抗体不存在的情况下的细胞生长相比，表达CLL-1的细胞(例如，HL60、AML细胞)的细胞生长降低。
本文所述的抗体中的任一种都可为嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是结合CLL-1的抗体片段，例如Fab。在一些实施方案中，用例如下文所述的可检测试剂标记所述CLL-1抗体。在一些实施方案中，将所述CLL-1抗体例如共价连接至治疗剂，例如，如下文所述的化学治疗剂或细胞毒性剂。
A.制备抗体的方法
对于本文所述的抗体例如重组抗体、单克隆抗体或多克隆抗体的制备，可使用本领域已知的许多技术(参见例如，Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy中的第77-96页,Alan R.Liss,Inc.(1985)；Coligan,Current Protocols inImmunology(1991)；Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual(1988)；以及Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版，1986))。编码目的抗体的重链和轻链的基因可克隆自细胞，例如，编码单克隆抗体的基因可克隆自杂交瘤细胞并且用于生产重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库还可由杂交瘤细胞或浆细胞制备。重链和轻链基因产物的随机组合产生了具有不同抗原特异性的大抗体库(参见例如Kuby,Immunology(第3版，1997))。用于生产单链抗体或重组抗体的技术(美国专利4,946,778、美国专利第4,816,567号)可适于生产本发明多肽的抗体。此外，转基因小鼠或诸如其它哺乳动物的其它生物体，可用于表达人源化抗体或人抗体(参见例如，美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号，Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368:856-859(1994)；Morrison，Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；以及Lonberg&Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。可选地，可使用噬菌体展示技术来鉴定能够特异性结合所选抗原的抗体和异聚性Fab片段(参见例如，McCafferty等，Nature 348:552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10:779-783(1992))。还可将抗体制备成双特异性的，即能够识别两种不同抗原(参见例如，WO 93/08829，Traunecker等，EMBO J.10:3655-3659(1991)；以及Suresh等，Methods in Enzymology 121:210(1986))。抗体还可为杂缀合物(heteroconjugate)，例如，两种共价连接的抗体或免疫毒素(参见例如，美国专利第4,676,980号、WO 91/00360；WO 92/200373；和EP 03089)。
还可使用任何数量的表达系统来生产抗体，所述表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。在一些实施方案中，所述表达系统是哺乳动物细胞表达系统，如杂交瘤或CHO细胞表达系统。许多此类系统可广泛地获自供应商。在抗体包含VH和VL区的实施方案中，可使用单一载体，例如在双顺反子表达单元中或在不同启动子的控制下来表达VH区和VL区。在其它实施方案中，可使用单独的载体来表达VH区和VL区。本文所述的VH区或VL区可任选包含位于N端的甲硫氨酸。
本发明的抗体还可以产生为多种形式，包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。抗体片段可通过多种方法获得，包括用酶消化完整的抗体，如用胃蛋白酶(生成(Fab')2片段)或木瓜酶(生成Fab片段)；或从头合成。还可使用重组DNA方法来合成抗体片段。在一些实施方案中，CLL-1抗体包含特异性结合CLL-1的F(ab')2片段。本发明的抗体还可包含人恒定区。参见例如，Fundamental Immunology(Paul ed.，第4版，1999)；Bird等，Science 242:423(1988)；以及Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879(1988)。
用于人源化非人抗体(即，使用来自非人抗体的CDR)的方法也是本领域已知的。通常，人源化抗体具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为引入(import)残基，其通常取自引入可变结构域。人源化可基本上按照Winter及其同事的方法通过将啮齿类CDR或CDR序列取代为人抗体的相应序列来进行(参见例如，Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988)以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中比完整的人可变结构域显著更小的结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。事实上，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被来自啮齿类抗体的类似位点的残基取代。
在一些情况下，抗体或抗体片段可与另一个分子(例如聚乙二醇(PEG化)或血清白蛋白)缀合，以提供延长的体内半衰期。抗体片段的PEG化实例提供于Knight等，Platelets15:409,2004(阿昔单抗)；Pedley等，Br.J.Cancer 70:1126,1994(抗CEA抗体)；Chapman等，Nature Biotech.17:780,1999；以及Humphreys等，Protein Eng.Des.20:227,2007)中。还可对所述抗体或抗体片段进行标记或与下文所述的治疗剂缀合。
B.结合亲和力
结合的特异性可根据与相对于抗体与环境中其它物质或通常不相关分子的解离常数(Kd)相比，抗体(或其它靶向部分)对靶标的比较性解离常数来定义。通常，抗体针对不相关物质的Kd相比其针对靶标的Kd为至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍或更高倍。
抗体的期望亲和力(Kd)，例如，高(pM至低nM)、中(低nM至100nM)或低(约100nM或更高)，可根据其是否被用作诊断剂或治疗剂而不同。不受理论的限制，在一个实例中，与具有高亲和力的抗体相比，具有中等亲和力的抗体可更成功地定位肿瘤。因此，具有不同亲和力的抗体可用于诊断和治疗应用。
靶向部分通常以小于约1000nM，例如小于250nM、100nM、50nM、20nM或更小的nM的Kd结合。在一些实施方案中，亲和试剂的Kd小于15nM、10nM、5nM或1nM。在一些实施方案中，所述Kd为1-100nM、0.1-50nM、0.1-10nM或1-20nM。解离常数(Kd)的值可通过众所周知的方法来确定，并且对于复杂混合物的Kd值，可通过例如在Caceci等，Byte(1984)9:340-362中公开的方法来计算。
抗体或任何靶向剂对靶标的亲和力可根据本领域已知的方法来确定，例如，如Ernst等，Determination of Equilibrium Dissociation Constants,Therapeutic Monoclonal Antibodies(Wiley&Sons ed.2009)中综述的。
可使用定量ELISA和类似的基于阵列的亲和方法。ELISA(酶联免疫吸附信号传导测定)是基于抗体的方法。在一些情况下，使对目的靶标具有特异性的抗体附着于基质上，并使其与疑似含有靶标的样品接触。然后洗涤该表面以去除未结合的物质。靶标结合可以以多种方式来检测，例如，使用具有标记的抗体的第二步骤、直接标记靶标或用在抗原结合后可检测的标记来标记第一抗体。在一些情况下，使抗原附着于基质(例如，使用对蛋白质具有高亲和力的基质，或链霉亲和素-生物素相互作用)，并使用标记的抗体(或其他靶向部分)对其进行检测。已经开发了原始ELISA方法的一些变换方法，并且这些方法是本领域已知的(综述参见Lequin(2005)Clin.Chem.51:2415-18)。
Kd、Kon和Koff也可通过使用表面等离子共振(SPR)来确定，例如，通过使用Biacore T100系统来测量。SPR技术综述在例如Hahnfeld等，Determination of KineticData Using SPR Biosensors,Molecular Diagnosis of Infectious Diseases(2004)中。在典型的SPR实验中，在流动池中将一种相互作用物(靶标或靶向试剂)固定于具有SPR活性的金包被的载玻片上，并引入包含其它相互作用物的样品，使其流过表面。当将给定频率的光照射在该表面上时，金的光学反射率的变化指示结合以及结合的动力学。
结合亲和力还可通过将生物素化的相互作用物锚定于链霉亲和素(SA)传感器芯片来确定。然后使其它相互作用物与芯片接触，并对其进行检测，例如，如Abdessamad等，(2002)Nuc.Acids Res.30:e45中所述。
C.确定CLL-1表位
可使用已知的表位作图技术来对结合CLL-1的抗体的位置进行作图。本领域技术人员将理解，用于表位作图的方法可根据抗原而不同，例如，当其表达于细胞中时，初级多肽序列的翻译后修饰，以及不同细胞上或不同环境中抗原结构之间的差异。
CLL-1是具有大约200个胞外氨基酸的跨膜蛋白。使胞外结构域糖基化，并且包含C凝集素结构域。可通过改变CLL-1的初级序列或糖基化状态，并且比较CLL-1抗体与不同CLL-1变体的亲和力来确定或部分确定CLL-1抗体的表位。
此类表位作图可在体外进行，例如，通过筛选噬菌体展示文库或合成肽文库，例如使用珠粒或其它固体基质。线性表位通常为约六个氨基酸，但是这可稍微变化。为了模拟蛋白质中存在的线性表位，可制备与序列对应的合成肽。在一些实施方案中，在N端和/或C端延伸该序列，以提供处于蛋白质侧翼序列中的另外的氨基酸残基。这可更接近地模拟表位的初级结构环境，并且在某种程度上模拟表位的二级结构环境。此外，包含但不限于一个或多个甘氨酸或γ氨基丁酸的残基可附加于任一端以提供间隔子，从而使其与例如用于免疫测定的固相的空间相互作用最小化。通常改变间隔子的长度以根据经验确定最佳结构。
由于表位的可变性质以及因侧翼序列导致的潜在影响，在一些实施方案中，可使用通过延伸N端或C端一定数量的残基而改变长度的肽。另一种方法利用重复肽表位，或具有介入的间隔子残基的交替表位。这些肽的长度通常根据期望的重复单元数量而变化。
一种用于表位作图的方法是合成例如具有六个残基重叠的长度为20个残基的重叠肽，其覆盖CLL-1胞外区的初级序列。如果使用此类肽筛选来对表位进行作图，则可对肽进行修饰以克服与免疫测定中所使用的固相支持物的不期望的相互作用。一种方法是用亲水残基取代肽中的疏水残基，以降低疏水相互作用或使其最小化，并且提高肽的可及性。类似地，可用不带电的残基取代带电的肽残基，以消除与固相的离子相互作用。还可通过添加多种结构的间隔子基团将肽表位远离固相定位并使空间位阻最小化，来对肽进行修饰。
可合成肽来反映在天然蛋白质或靶标细胞上的天然蛋白质存在的翻译后修饰。修饰包括但不限于在蛋白质的特定位点进行糖基化和磷酸化。
另一种用于确定表位的方法是在细胞中表达CLL-1变体，并比较不同变体之间的CLL-1抗体亲和力。可以如肽研究中所述来设计CLL-1变体。此外，可取代糖基化残基(例如，天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)以确定表位是否包含糖基化位点。类似地，可取代磷酸化残基(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。
还可通过比较不同类型的表达CLL-1的细胞的抗体亲和力来确定或部分确定表位。例如，可确定并比较以下细胞的抗体亲和力：原代AML细胞，例如AML母细胞和移植的AML肿瘤细胞；AML细胞系；其它非癌性骨髓细胞等。
D.CDC、ADCC和ADC测定
本文所述的抗体对表达CLL-1的细胞的细胞依赖性细胞毒性(“CDC”)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)和抗体药物缀合物细胞毒性(“ADC”)是有效的。表达CLL-1的示例性细胞包括表达异源、重组CLL-1(例如人CLL-1)的细胞系；人AML细胞系，例如HL60、THP1、TF1-α、U937和OCI AML-5(前四个可获自ATCC)；来自一名或多名AML患者的原代细胞(例如PBMC细胞或移植肿瘤细胞)；人CML细胞系，例如K562和KU812(可获自ATCC)；以及来自一名或多名CML患者或MDS患者的原代细胞。
如果抗体导致表达抗体靶标的细胞的补体依赖性杀伤，则该抗体被描述为具有CDC活性并介导CDC。CDC测定是本领域已知的，并且描述在例如Gazzano-Santoro等，(1997)J.Immunol.Methods 202:163；Idusogie等，(2000)J.Immunol.164:4178中。CDC试剂盒和服务是可商购获得的，例如可购自和Cell Technology Inc。
简言之，该测定通常在体外进行，并且包括使抗体结合于在其表面上表达该抗体靶标的细胞。添加包括结合至抗体Ch区的C1q在内的补体成分。然后补体成分相互作用以杀死靶标细胞。通常在4小时至24小时的孵育时间后，例如通过比较起始靶细胞群和终止靶细胞群，确定已知存在于靶细胞中的胞内酶或颗粒的释放等来测量CDC。
如果抗体导致结合抗体的细胞(例如表达CLL-1的细胞)被效应细胞的杀伤，则该抗体被描述为具有ADCC活性并介导ADCC。效应细胞通常是自然杀伤细胞，但也可为巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。还开发了基因工程化的效应细胞系用于ADCC测定(参见例如，Schnueriger等，(2011)Mol.Immunol.48:1512)。ADCC测定是本领域已知的，并且描述在例如Perussia和Loza(2000)Methods in Mol.Biol.121:179；Bretaudeau和Bonnaudet(2011)BMC Proceedings 5(Suppl 8):P63中。ADCC试剂盒和服务是可商购获得的，例如可购自和
简言之，该测定通常在体外进行，并且包括使抗体结合于在其表面上表达该抗体靶标的细胞。添加效应细胞，其通常通过Fc受体如CD16来识别结合抗体的细胞。效应细胞通过例如释放引起凋亡的细胞毒素来杀伤结合抗体的细胞。通过释放靶细胞中的可检测元件(例如Cr51)或通过检测细胞介导的毒性中涉及的元件(例如效应细胞中NFAT信号传导的活化)来检测细胞死亡。
如果在与细胞毒性剂(药物)缀合时，抗体导致表达该抗体的靶标(在本案中为CLL-1)的细胞被杀伤(抑制存活)，则该抗体被描述为具有抗体-药物缀合物(ADC)活性(或介导ADC)。适当的细胞毒性剂是本领域已知的，例如，皂草素、多柔比星、道诺霉素、长春花生物碱类(vinca-alkaloid)、紫杉烷类、微管蛋白试剂(例如美登素、奥里斯他汀)和DNA试剂(例如，加利车霉素、倍癌霉素、吡咯并苯二氮二聚体)等。ADC测定是本领域已知的，例如描述在Gerber等，(2009)3:247以及下文的实施例中。
E.内化
本文所述的CLL-1抗体可被内化至包括CLL-1AML细胞在内的表达CLL-1的细胞中。即，表达CLL-1的细胞可内化本文所述的抗体。本文所述的CLL-1抗体提供了用于靶向此类细胞的有效手段，例如使用可检测缀合物或细胞毒性缀合物。
可通过使用本领域已知的方法来评价抗体的内化百分比和内化率，包括例如流式细胞术(FACS)和共聚焦荧光显微镜。此类方法描述在例如Lue等，(2007)Nature Protocols(Nature Med.13:587-96)；Cho等，(2010)Biomacromolecules以及Corbani等(2004)Endocrinology 145:2876-85中，并且如本文所述。
对于FACS和共聚焦显微镜，将细胞与荧光标记的靶向剂(例如抗体)一起孵育。通常选择细胞来表达标记抗体的靶标(例如CLL-1)。然后，对照细胞可使用不表达该靶标的细胞。内化通常发生于37℃，但不发生于4℃，这提供了该反应的另一个对照。因此，可使细胞与标记的试剂接触并在37℃或4℃孵育(例如，以检测未进行内化的结合)。
通过例如，在酸洗液中洗涤细胞来去除未结合的试剂和表面结合的试剂，然后用正常pH的缓冲剂洗涤。
如果使用贴壁细胞，则在进行流式细胞术之前将细胞从基质中移出。荧光细胞的百分比指示荧光标记的试剂的内化百分比。内化百分比还可表示为例如添加至细胞中的初始标记试剂的百分比。
试剂的内化还可通过共聚焦显微镜确定荧光标记的试剂的定位来评估。使用共聚焦显微镜确定内化的方法描述在例如Xiao等，(2008)Chem.Eur.J.,14:1769-1775中。简言之，如上文所述，使细胞与标记的试剂接触并孵育。在孵育后，可将细胞于冰上孵育，于4℃下在PBS缓冲剂中洗涤，用0.25％的胰蛋白酶处理(如果适用，以去除基质)。然后可将细胞悬液施加于载玻片上用于共聚焦荧光显微镜检查。合适的共聚焦显微镜包括FV500-IX81共聚焦显微镜(Olympus America Inc.；Center Valley,PA)和Eclipse Ti-E(NikonInstruments Inc.；Melville,NY)。
IV.嵌合抗原受体
本文还提供了嵌合抗原受体，其包含与CLL-1结合并含有如所述的轻链和重链的人源化部分的抗原结合结构域。在一些实施方案中，公开的CAR的铰链区可选自CD8、CD4或CD28胞外结构域，或者IgG1抗体的Fc区。跨膜结构域可包含免疫球蛋白家族受体的跨膜结构域，如CD8。胞内结构域可选自T细胞上的任何跨膜分子。例如，所公开的CAR的跨膜(TM)结构域可以包含CD2、CD3、CD16、CD32、CD64、CD28、CD247、4-1BBL、CD4或CD8的TM结构域。一个或多个细胞内信号转导结构域可包含CD3ζ信号转导结构域，Fc-α，Fc-γ，Fc-ε，Fc-μ和Fc-δ受体中的任何一个的信号转导结构域，来源于例如CD28、4-1BB、CD2、CD27、CD30、OX40、CD40、PD-1、PD-L1、PD-L2、ICOS、LFA-1、CD7、LIGHT、NKG2C、CD83L、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3、B7-H4等的共刺激结构域。在一个实施方案中，一个信号转导结构域包含来自CTLA4的信号转导结构域。
编码嵌合抗原受体的多核苷酸可用于转导各种免疫细胞，包括淋巴或骨髓谱系的细胞，如造血干细胞，T细胞(CD4T细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、T记忆干细胞)，B细胞，骨髓祖细胞(MPC)，淋巴祖细胞，巨噬细胞，粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)，巨核细胞，单核细胞和树突状细胞。
此类细胞可用于例如治疗方法中。施用于对象的细胞可以靶向并与宿主免疫系统结合，对携带抗原结合部分结合的靶标的细胞发动攻击。例如，此类细胞可用于治疗癌症，如选自AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化的骨髓增生性病症。
V.诊断应用
本文所述的CLL-1抗体特异性结合表达CLL-1的细胞。因此，CLL-1抗体可用于体外和体内诊断测定，以检测表达CLL-1的细胞(例如AML细胞和AML CSC)。例如，样品(例如血液样品或组织活检)可获自患者，将其与CLL-1抗体接触，并且可通过检测抗体结合来确定患者样品中表达CLL-1的细胞的存在。可直接(例如，当抗体本身被标记时)检测或通过使用第二检测试剂如第二抗体来检测抗体结合。可检测标记物可与本发明的抗体直接结合或者例如经由螯合剂或接头间接结合。
在一些实施方案中，将CLL-1抗体与来自患有或疑似患有CLL-1相关病症的个体的生物样品接触，并确定抗体与样品中的细胞的结合，其中高于或低于正常抗体结合指示该个体患有CLL-1相关病症。在一些实施方案中，生物样品是血液样品或血液级分(例如，血清、血浆、血小板、红细胞、白细胞、PBMC)。在一些实施方案中，生物样品是组织样品(活检)，例如来自疑似肿瘤部位，或来自已知受到影响的组织，例如以确定已知肿瘤的边界。
通常进行活检以获得来自组织的样品，即，非流体细胞类型。所应用的活检技术将取决于待评估的组织类型(例如，乳腺、皮肤、结肠、前列腺、肾、肺、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、气道或肺)。对于癌症的情况，该技术还取决于肿瘤的大小和类型(例如，实体的、悬浮的或血液)以及其它因素。代表性的活检技术包括但不限于切除活检、切口活检、针吸活检、手术活检和骨髓活检。“切除活检”是指去除整个肿瘤块，其边缘有小的环绕肿瘤的正常组织。“切口活检”是指去除包含肿瘤截面直径的组织楔。通过内窥镜或荧光镜进行的诊断或预后可能需要对肿瘤块进行“粗针吸活检(core-needle biopsy)”，或需要进行“细针吸活检”，这通常从肿瘤块内获得细胞悬液。活检技术论述在例如Harrison’s Principles ofInternal Medicine,Kasper等,eds.，第16版，2005,第70章，以及整个第V部分中。
检测抗体结合至样品中细胞的任何方法都可用于本文的诊断测定。检测抗体结合的方法是本领域公知的，例如，流式细胞术、荧光显微镜、ELISA等。在一些实施方案中，所述方法包括在确定步骤之前制备用于检测的生物样品。例如，细胞亚群(例如，白细胞、CD34+细胞、CD45+细胞等)可与来自个体的样品的其余部分(例如，其它血液组分)分离，或可使组织中的细胞悬浮以便更容易检测。
在一些实施方案中，确定样品中表达CLL-1的细胞的百分比，并与对照进行比较，所述对照例如来自已知患有CLL-1相关病症的个体或个体组的样品(阳性对照)，或者来自已知未患有CLL-1相关病症的个体或个体组的样品(正常、健康、非病变或阴性对照)。在一些实施方案中，对照是为给定组织建立的CLL-1表达的标准范围。高于或低于表达CLL-1细胞的正常百分比，或者高于或低于表达水平，指示该个体患有CLL-1相关病症。
在一些实施方案中，可向个体提供(施用)标记的CLL-1抗体以确定对预期治疗的适用性。例如，可使用标记的抗体来检测病变区域中的CLL-1密度，其中相对于非病变组织，该密度通常较高。标记的抗体还可指示病变区是治疗可及的。因此，可基于成像结果来选择用于治疗的患者。可使用标准的成像技术(例如，CT扫描、MRI、PET扫描等)来实现解剖学表征，如确定癌症的准确边界。
在一些实施方案中，本文所述的标记的CLL-1抗体还可与治疗性化合物结合，例如形成“治疗诊断性”组合物。例如，CLL-1抗体可(直接或间接地)连接至可检测标记和治疗剂，例如，连接至细胞毒性剂以杀伤表达CLL-1的癌细胞。在一些实施方案中，标记的CLL-1抗体用于诊断和/或定位表达CLL-1的癌细胞，然后用单独的治疗性CLL-1特异性抗体来靶向表达CLL-1的癌细胞。在一些实施方案中，诊断性CLL-1特异性抗体是不以高速率或百分比内化于表达CLL-1的细胞中的抗体。在一些实施方案中，治疗性CLL-1抗体以高速率或百分比内化于表达CLL-1的细胞中。
A.标记物
包含CLL-1抗体的诊断剂可包括本领域已知的例如在以下文献中所提供的任何诊断试剂：Armstrong等,Diagnostic Imaging,第5版,Blackwell Publishing(2004)；Torchilin,V.P.,Ed.,Targeted Delivery of Imaging Agents,CRC Press(1995)；Vallabhajosula,S.,Molecular Imaging:Radiopharmaceuticals for PET and SPECT,Springer(2009)。可通过多种方法来检测诊断剂，包括作为提供和/或增强可检测信号的试剂。可检测信号包括但不限于，γ发射信号、放射性信号、回波信号、光学信号、荧光信号、吸收信号、磁信号或断层摄影信号。用于对诊断剂成像的技术可包括但不限于单光子发射计算机断层摄影(SPECT)、磁共振成像(MRI)、光学成像、正电子发射断层摄影(PET)、计算机断层摄影(CT)、x-射线成像、γ射线成像等。术语“可检测试剂”、“可检测部分”、“标记”、“成像剂”和类似术语在本文中同义使用。
在一些实施方案中，标记物可包括光学试剂，如荧光剂、磷光剂、化学发光试剂等。许多试剂(例如，染料、探针、标记物或指示剂)是本领域已知的，并且可用于本发明(参见例如，Invitrogen,The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies,第10版(2005))。荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子，或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于菁、酞菁、卟啉、吲哚菁、罗丹明、吩嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素、苯并卟啉、方酸菁(squaraine)、二吡咯嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮鎓(croconium)、吖啶酮、菲啶、罗丹明、吖啶、蒽醌、氧族吡喃鎓类似物、二氢卟酚、萘菁(naphthalocyanine)、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰菁、苯并吲哚羰菁和BODIPYTM衍生物。荧光染料论述在例如美国专利第4,452,720号、美国专利第5,227,487号和美国专利第5,543,295号中。
标记物也可为放射性同位素，例如，发射γ射线、正电子、β粒子和α粒子以及X射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在一些实施方案中，放射性试剂可包括111In-DTPA、99mTc(CO)3-DTPA、99mTc(CO)3-ENPy2、62/64/67Cu-TETA、99mTc(CO)3-IDA以及99mTc(CO)3三胺(环状或线性的)。在一些实施方案中，所述试剂可包括DOTA及其具有111In、177Lu、153Sm、88/90Y、62/64/67Cu或67/68Ga的多种类似物。在一些实施方案中，纳米颗粒可通过掺入与螯合剂连接的脂质(如DTPA-脂质)来标记，如在下述文献中所提供的：Phillips等,Wiley Interdisciplinary Reviews:Nanomedicine and Nanobiotechnology,1(1):69-83(2008)；Torchilin,V.P.&Weissig,V.,Eds.Liposomes第2版.:Oxford Univ.Press(2003)；Elbayoumi,T.A.&Torchilin,V.P.,Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging 33:1196–1205(2006)；Mougin-Degraef,M.等,Int’l J.Pharmaceutics 344:110-117(2007)。
在一些实施方案中，可将诊断剂与第二结合配体或与发色底物接触后生成有颜色的产物的酶(酶标签)结合。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。第二结合配体包括例如，如本领域已知的生物素和亲和素或链霉亲和素化合物。
在一些实施方案中，如在下文中更详细描述的，还可将标记的抗体与提高体内稳定性的组合物相结合，例如PEG或纳米颗粒如脂质体。
B.标记方法
用于将可检测试剂和治疗剂缀合至抗体的技术是众所周知的(参见例如，Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(eds.),第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等，"Antibodies For Drug Delivery"in Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等(eds.),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review"MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(eds.)，第475-506页(1985)；以及Thorpe等，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982))。
通常，抗体在不干扰与表位结合的区域连接至可检测部分。因此，在一些情况下，使可检测部分连接至恒定区，或可变区中CDR的外侧。本领域技术人员将认识到，可检测部分可定位于抗体上的其它地方，并且可检测部分的位置可相应地被调整。在一些实施方案中，在连接可检测部分之前和之后对抗体与表位结合的能力进行比较，以确保该连接不过度地破坏结合。
在一些实施方案中，抗体可与另外的靶向部分结合。例如，可将结合靶分子或靶细胞上的不同位点的抗体片段、肽或适配子与抗体缀合以优化例如至癌细胞的靶标结合。
VI.治疗应用
可使用本文所述的CLL-1抗体来靶向表达CLL-1的细胞如AML细胞。CLL-1在AML细胞和CSC(例如AML CSC)上的表达升高。CLL-1在正常CD34+造血干细胞(HSC)上表达不显著，因此，可使用本发明的CLL-1抗体来区分HSC和CSC。识别与AML细胞共同的CLL-1表位，并因此能够普遍地结合AML细胞的高亲和力CLL-1抗体，是特别有价值的，因为AML具有非常高的复发率。如上文所述，包含CLL-1抗体的治疗组合物还可包含可检测标记物以形成治疗诊断性组合物，例如用于检测和定位表达CLL-1的细胞，并监测治疗效果。
如本文所示，本发明的CLL-1抗体可抑制癌细胞生长(增殖和/或移植)，因此可被视为单独的化疗剂。下述公开内容提供了可连接至CLL-1抗体以对表达CLL-1的细胞产生其他作用的化疗剂和细胞毒性剂的实例。
化疗(抗癌)剂可为能够降低癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀伤癌细胞、降低转移、降低肿瘤血液供应等的任何试剂。因此，化疗剂包括细胞毒性剂。细胞毒性剂包括但不限于皂草素、紫杉烷类、长春花生物碱、蒽环类和铂基试剂。化疗剂的种类包括但不限于烷化剂、抗代谢物例如甲氨蝶呤、植物生物碱例如长春新碱，和抗生素例如多柔比星，以及未落入在特定种类中的众多药物，如羟基脲。以顺铂和奥沙利铂示例的铂基药物代表了一类主要的化疗剂。这些药物结合DNA并干扰复制。以紫杉醇示例的紫杉烷类代表了另一主要种类的化疗剂。这些化合物通过干扰细胞骨架和纺锤体形成抑制细胞分裂，从而阻止快速分裂的癌细胞的生长来发挥作用。其它化疗药物包括激素疗法。其它的化学治疗药物包括但不限于吡咯并苯二氮吲哚啉苯二氮和异喹啉苯二氮包括例如WO 2016/149546中所述的那些，将其通过引用并入。苯二氮类可为例如同二聚体或异二聚体。
可在同一组合物中或单独的组合物中组合多于一种的治疗剂。还可使治疗剂与适于特定个体的其它治疗试剂组合。向癌症患者提供的常用治疗剂包括克服疼痛、恶心、贫血、感染、炎症和癌症患者通常经受的其它症状的药物。
可使用多种已知的交联剂使抗体连接至治疗剂、可检测试剂或纳米载体。用于多肽的共价连接或非共价连接的方法是本领域众所周知的。此类方法可包括但不限于，使用化学交联剂、光活化的交联剂和/或双官能交联剂。用于交联分子的示例性方法在美国专利第5,603,872号和美国专利第5,401,511号中公开。交联剂的非限制实例包括戊二醛、双官能环氧乙烷、乙二醇二缩水甘油醚、碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或二环己基碳二亚胺、双亚胺酯、二硝基苯、辛二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、二甲基-3,3'-二硫-双丙亚胺酯、叠氮乙二醛(azidoglyoxal)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯和4-(溴代氨乙基)-2-叠氮硝基苯。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗体片段(“Ab”)经由接头缀合至药物单元以提供药物-接头-Ab缀合物。“接头”是指通过化学键将第一分子与第二分子连接的部分。接头可用于连接药物单元和抗体或抗体片段以形成药物-接头-抗体(或抗体片段)缀合物。接头单元的各种非限制性实例示于美国专利第5,635,483号；第5,780,588号；第5,663,149号；第7,964,566号；以及美国专利申请公开第2011/0020343号(美国专利第12/933,364号)中，将其各自在此通过引用整体明确地并入)。抗体或抗体片段可包含可与接头的官能团形成键的官能团。有用的官能团的非限制性实例包括巯基(--SH)、氨基、羟基、羧基、碳水化合物的端羟基和羧基。接头可任选地包括在此通过引用明确并入的美国专利第7,964,566号中所限定的“延伸物(stretcher)”单元。
在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸部分。例如，接头可以包括二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。接头可任选包含缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基缬氨酸-瓜氨酸、5-氨基戊酸、高苯丙氨酸赖氨酸、四异喹啉羧酸赖氨酸、环己基丙氨酸赖氨酸、异哌啶酸赖氨酸(isonepecotic acid lysine)、β-丙氨酸-赖氨酸、甘氨酸丝氨酸缬氨酸谷氨酰胺和异哌啶酸。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。
在一些实施方案中，接头可以包括乙二醇重复单元以及一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，接头包括下式：
-(CH2CH2O)1-50-XAA-
其中XAA是氨基酸序列。
任何合适数量的乙二醇单元可用于接头中。例如，接头可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、16、19、20、23、24、35、36、37、48、49个或更多个乙二醇单元。在一些实施方案中，接头L包括下式：
-HN-PEG-C(O)-XAA-
其中PEG具有1-50个乙二醇单元，并且XAA是氨基酸序列。
如上所述，接头的氨基酸部分可包括任何合适数量的氨基酸部分。例如，氨基酸序列XAA可以包括1至100个氨基酸部分、或1至10个氨基酸部分、或1至5个氨基酸部分。在一些实施方案中，接头可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸部分。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与纳米载体结合。对于缀合至纳米载体(例如脂质体)的抗体，表面上将存在一定数量的抗体，即，以给定的表面密度存在。在一些实施方案中，所述纳米载体中的每个纳米载体将具有至少5个抗体，例如每个纳米载体具有至少10、30、40、50、75、100或更多个抗体。本领域技术人员将理解，表面密度表示平均范围，因为对于群体的所有成员，每个纳米载体的抗体数量不会绝对一致。
纳米载体包括囊泡，如脂质体和胶束，以及聚合纳米颗粒等。纳米载体可用于递送治疗剂和诊断剂，但是特别是保护用于治疗癌症的细胞毒性剂。纳米载体可包括脂质(例如磷脂)、亲水聚合物、疏水聚合物、两性化合物、交联聚合物和聚合基质(参见例如WO2009/110939)。根据应用，纳米载体可被设计成具有特定的大小、半衰期、保存期限和泄漏率。
诸如抗体靶向的脂质体、聚合纳米颗粒或延长的保存期限的脂质体的纳米载体的制备在例如美国专利第6465188号、第7122202号、第7462603号和第7550441号中描述。
在一些实施方案中，所述抗体与稳定性部分如PEG或脂质体或其它纳米载体连接。美国专利第4,732,863号和第7892554号以及Chattopadhyay等，(2010)Mol Pharm 7:2194描述了用于将选择的抗体连接至PEG、PEG衍生物和纳米颗粒(例如脂质体)的方法。含有磷脂酰-乙醇胺(PE)的脂质体可通过本文所述的建立的程序来制备。PE的内含物提供了脂质体表面上用于连接的活性官能位点。
抗体缀合物还可被配制成提供多于一种的活性化合物，例如，另外的化疗剂和细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。所述活性成分还可被制备为缓释制备物(例如固体疏水聚合物的半透性基质(例如，聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸)。在胶质药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米囊)中或在巨乳液中，抗体和免疫缀合物可被包埋于例如通过凝聚技术或界面聚合制备的纳米颗粒(分别为例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中。
本文所述的CLL-1抗体可单独或与细胞毒性试剂组合杀伤表达CLL-1的细胞。在一些实施方案中，治疗的方法包括向个体施用有效量的治疗性CLL-1抗体或CLL-1抗体缀合物，例如与治疗试剂连接的CLL-1抗体。在一些实施方案中，所述个体已被诊断出患有癌症，例如AML。在一些实施方案中，所述个体正在接受或已经接受了癌症治疗，例如手术、放疗或化疗。在一些实施方案中，所述个体已被诊断出患有癌症，但是癌症处于缓解期。
在一些实施方案中，所述方法还包括监控个体的癌症进展。在一些实施方案中，基于个体的治疗进展来确定每次施用的CLL-1抗体或CLL-1抗体缀合物的剂量，例如，如果个体对治疗的响应不充分，则施用更高的化疗剂量。
在一些实施方案中，本发明可包含抗体或抗体靶向组合物以及生理学(即，药学)可接受的载体。术语“载体”是指用作诊断剂或治疗剂的稀释剂或媒介物的通常为惰性的物质。该术语还涵盖赋予组合物粘性性质的通常为惰性的物质。生理学可接受的载体可为液体，例如生理盐水、磷酸盐缓冲剂、标准缓冲盐水(135mM-150mM NaCl)、水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、糖蛋白(例如，白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)，以提供增强的稳定性等。因为生理学可接受的载体部分地通过正施用的具体组合物以及通过用于施用组合物的具体方法来确定，有大量适于本发明的药物组合物的制剂(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版，1989)。
本发明的组合物可通过常规的众所周知的灭菌技术来灭菌，或可在无菌条件下生产。可包装水溶液以供使用，或在无菌条件下过滤并冻干，在施用前先将冻干的制备物与无菌水溶液混合。组合物可按需要包含药学可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨酸单月桂酸酯以及三乙醇胺油酸酯。还可包含糖以用于稳定组合物，如用于冻干的抗体组合物的稳定剂。
可制备用于粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、口腔或直肠)、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌内或动脉内注射，弹丸或输注)、经口或透皮施用至患者的剂型。剂型的实例包括但不限于：分散剂；栓剂；软膏剂；糊剂(膏剂)；贴剂；粉剂；敷料剂；霜剂；膏剂；溶液；贴片(patch)；气溶胶(例如鼻用喷雾剂或吸入剂)；凝胶剂；适于经口或粘膜施用至患者的液体剂型，包括混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适于肠胃外施用至患者的液体剂型；以及可复溶以提供适于肠胃外施用至患者的液体剂型的无菌固体(例如，晶状固体或非晶形固体)。
可注射(例如静脉内)组合物可包含悬浮于可接受载体(如水性载体)中的抗体或抗体靶向组合物的溶液。可使用多种水性载体中的任一种，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.9％等渗盐水、0.3％甘氨酸、5％葡萄糖等，并且可包含用于增强稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，将使用标准缓冲盐水(135mM-150mM NaCl)。组合物可含有药学可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨酸单月桂酸酯以及三乙醇胺油酸酯等。在一些实施方案中，抗体靶向组合物可配制于用于静脉内施用的试剂盒中。
适于肠胃外施用，如例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂，包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，以及水性和非水性的无菌混悬剂，其中等渗无菌注射溶液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，无菌混悬剂可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
药物制备物可以以单位剂型来包装或制备。在此类剂型中，例如根据治疗剂的剂量或抗体浓度，将制备物再分成含有适当量的有效组分的单位剂量。单位剂型可为包装的制备物，所述包装物含有在单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中的分离量的制备物。如果需要，组合物还可含有其它相容的治疗剂。
可通过使用任何合适的途径通过注射或输注来施用抗体(或抗体靶向组合物)，所述合适的途径包括但不限于静脉内途径、皮下途径、肌内途径或腹膜内途径。施用药物组合物的实例包括于4℃将抗体以10mg/ml储存在注射用无菌等渗盐水溶液中，并在施用至患者之前将其稀释于100ml或200ml注射用的0.9％氯化钠中。通过历经1小时过程的静脉内输注以0.2mg/kg至10mg/kg的剂量来施用抗体。在其它实施方案中，通过历经15分钟至2小时时段的静脉内输注来施用抗体。在其它实施方案中，施用程序是经由皮下弹丸注射。
选择抗体剂量以为患者提供有效治疗，并且抗体剂量范围为小于0.1mg/kg体重至约25mg/kg体重，或1mg-2g/名患者。在一些情况下，剂量范围为1-100mg/kg，或大约50mg-8000mg/患者。剂量可以以适当的频率重复施用，根据抗体的药代动力学(例如，抗体在循环系统中的半衰期)和药效动力学响应(例如，抗体治疗效果的持续时间)，所述频率范围可为每天一次至每三个月一次。在一些实施方案中，体内半衰期为约7天至约25天，并且抗体剂量每周一次至每三个月一次重复施用。
施用可为周期性的。根据施用途径，剂量可以例如每1、3、5、7、10、14、21或28天或更长时间一次(例如，每2、3、4或6个月一次)来施用。在一些情况下，施用更频繁，例如每天2次或3次。如本领域技术人员认识到的，可监测患者以根据治疗进展和任何不良副作用来调整施用剂量和频率。
因此，在一些实施方案中，根据患者的进展来进行另外的施用，例如在每次施用之间监测患者。例如，在第一次施用或第一轮施用后，可监测患者的肿瘤生长速率、复发(例如，在术后患者的情况下)或一般疾病相关症状，如虚弱、疼痛、恶心等。
对于癌症的治疗，可以以约每天0.001mg/kg至约1000mg/kg的初始剂量施用抗体或抗体靶向组合物(例如，包含治疗剂和/或诊断剂)，并随着时间调整。可使用约0.01mg/kg至约500mg/kg、或约0.1mg/kg至约200mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。本文所述的体内异种移植结果指示，5-20mg抗体/kg体重的剂量对大幅降低肿瘤生长是有效的。
剂量根据患者的需求、正治疗病况的严重程度和所使用的靶向组合物而变化。例如，剂量可考虑具体患者中诊断的癌症类型和阶段来根据经验确定。在本发明的上下文中，施用至患者的剂量应足以在患者中随时间而引起有益的治疗响应。如有经验的医生所认识到的，剂量大小还通过在具体患者中施用具体靶向组合物时所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。
VII.实施例
A.实施例1:HuM26变体在293-CLL1细胞上的表征
参考图3：分析多种M26抗体，ChiM26；VH4a+L4；VH4A+L4D和VH4A+L4DR以不同抗体浓度与293-CLL1细胞的结合。将293-CLL1细胞与抗-CLL1抗体在4℃孵育1h。在孵育之后，将细胞洗涤/离心，并重悬浮在PBS中，然后与山羊-抗-人抗体-FITC缀合物一起孵育。通过流式细胞术分析细胞，并通过Flowjo程序处理数据。同时平行处理同种型HuIgG1作为未结合对照。
B.实施例2:HuM26变体在多种AML细胞系((即HL-60、OCI-AML-5和OCI-AML5KO(CLL1-敲除)上的表征
参考图4：通过CRISPR/CAS技术产生具有CLL1敲除的AML5细胞。将OCI-AML5KO细胞通过FACS富集，并在与亲本OCI-AML-5细胞相同的条件下培养。用不同浓度的多种M26抗体，ChiM26；VH4a+L4；VH4A+L4D和VH4A+L4DR对HL-60、OCI-AML5和OCI-AML5KO细胞系进行染色。孵育之后，将细胞洗涤/离心，并重悬浮在PBS中，然后与山羊-抗-人抗体-FITC缀合物一起孵育。通过流式细胞术分析细胞，并通过Flowjo程序处理数据。在y-轴上绘制的MFI由总MFI-减去未结合同种型HuIgG1对照的MFI来计算。
C.实施例3:HuM26与恒河猴MPC结合的表征
参考图5：分离的恒河猴MPC用Alexa488-ChiM26、Alexa488-HuM26和未结合的Alexa488-HuIgG1对照进行染色。在孵育之后，将细胞洗涤/离心，并重悬浮在PBS中。通过流式细胞术分析细胞，并通过Flowjo程序处理数据。
D.实施例4：瞬时表达的ChM31、M31-ChVH/HuVL1和M31-ChVH/HuVL2抗体与CLL1His标签抗原的结合的ELISA分析
参考图6：比较了嵌合M26和两种形式的人源化M26的结合。每种抗体以不同浓度进行测试，从250ng/mL开始并连续2倍稀释。在图中，在所测试的各抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。
E.实施例5：瞬时表达的ChM31、HuM31-VH1/VL2、HuM31-VH2/VL2、HuM31-VH3/VL2和HuM31-VH4/VL2抗体与CLL1His标签抗原的结合的ELISA分析
参考图7，比较了嵌合M31和三种形式的人源化M31的结合。每种抗体以不同浓度进行测试，从500ng/mL开始并连续2倍稀释。在图中，在所测试的各抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。
F.实施例6：纯化的ChM31、HuM31-VH2/VL2、HuM31-VH3/VL2和HuM31-VH4/VL2抗体与His标签抗原的结合的ELISA分析
参考图8，每种抗体以不同浓度进行测试，从1μg/mL开始并连续2倍稀释。在图中，在所测试的各抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。
G.实施例7：竞争性结合ELISA以分析ChM31、HuM31-VH2/VL2、HuM31-VH3/VL2和HuM31-VH4/VL2抗体与His标签抗原的亲和力
参考图9，分析了小鼠M31抗体在从25μg/mL开始并连续3倍稀释的ChM31、HuM31-VH2/VL2、HuM31-VH3/VL2或HuM31-VH4/VL2抗体存在的情况下的结合。在图中，在所测试的各抗体浓度(X轴)上绘制吸光度值(Y轴)。使用GraphPad Prism计算IC50值。
H.实施例8：HuM31和ChiM31的竞争性测定
参考图10，用Alexa488标记ChiM31。将293-CLL1细胞与1μg标记的ChiM31预先孵育，然后与不同量的ChiM31和HuM31竞争。进行FACS，分析数据并计算EC50。
I.实施例9：HuM31和ChiM31与食蟹猴PBMC的结合特征
参考图11，从三只食蟹猴外周血样品中通过聚蔗糖梯度分离PBMC并合并。用3％的正常人血清封闭PBMC(0.2x106个合并的)，然后用对食蟹猴谱系标志物特异的抗体染色。针对谱系标志物对活细胞进行门控。针对HuM31和ChiM31对谱系群体进行门控。
J.实施例10-C6-CLT-D202(抗体-药物缀合物)的制备。
实施例10-15的详细内容可见于WO 2016/149646中，将其通过引用并入。使用Millipore，15mL，30kDa装置，经由2个循环的截留分子量过滤(MWCO)，将人源化的239位cys取代的抗-CLL1抗体(“C6-S239C-CYSM26”)(5.0mg,1.68mg/mL,PBS)交换至硼酸盐缓冲液(50mM,pH 8.5,1mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))中。向新的C6-S239C-CYSMAB抗体溶液(5.0mg/mL,硼酸盐缓冲液(50mM,pH8.5,1mM DTPA))中添加二硫苏糖醇(DTT)溶液(33μL,50.0当量,50mM)，并将所得溶液轻轻摇动过夜。
抗体C6具有以下轻链可变区序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRATQELSGYLSWLQQKPGKAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGNRAGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYAIYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:1)。
抗体C6具有以下重链可变区序列：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVRQAPGQGLEWIGFINPYNDGSKYAQKFQGRATLTSDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYGYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)。
如早先所述(Junutula等,2008,Nature Biotech,26,925-932)，通过rp-LCMS确认链间双硫桥的完全还原和S239C半胱氨酸/谷胱甘肽加合物的去除。然后使用Millipore，15mL，30kDa装置，用PBS作为交换缓冲液，经由3个循环的截留分子量过滤(MWCO)从溶液中去除DTT。向5mg/ml完全还原的C6-S239C-CYSMAB抗体溶液中添加脱氢抗坏血酸(dhAA)溶液(33μL,50.0当量,50mM)。将所得溶液轻轻摇动3小时。经由rp-LCMS监测再氧化。一旦认为再氧化完成，用丙二醇将反应混合物稀释至50％v/v，并添加在DMSO溶液中的CLT-D202(18，图12D)(10.0当量，10mM于DMSO中)。使反应在环境温度下搅拌1小时。然后在环境温度下，将混合物用活性炭处理1小时。接着经由过滤去除活性炭。然后使用Millipore，15mL，30kDa装置经由多个循环的截留分子量过滤(MWCO)将缀合物交换至PBS中。接着将溶液进行无菌过滤以产生期望的缀合物(0.974mL,2.16mg/mL)。体积：0.974mL。浓度：2.16mg/mL(A280＝0.145,20倍稀释)。药物与抗体的比率(DAR)：1.7(通过rp-LCMS确定)。通过尺寸排阻色谱(SEC)确认ADC的单体形式：96％。
K.实施例11-C0-CLT-D202抗体-药物缀合物(ADC)的制备
帕利珠单抗用作对照抗体C0。C0抗体是未结合的对照IgG1。ADC具有C0和CLT-D202。使用硼酸盐缓冲液(50mM,pH 8.5,1mM DTPA)将C0抗体(12.0mg，100mg/mL，PBS)稀释至5mg/mL。为了缀合CLT-D202，将铰链二硫化物如下还原。向新的C0抗体溶液(5.0mg/mL,硼酸盐缓冲液(50mM,pH 8.5,1mM DTPA))中添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液(136μL,1.7当量,1mM)，并将所得溶液在37℃轻轻摇动1小时。然后将反应冷却至环境温度，并用丙二醇稀释至50％v/v，此时添加在DMSO溶液中的CLT-D202(12.0当量,10mM于DMSO中)(18,图12D)。使反应在环境温度下搅拌1小时。然后在环境温度下，将混合物用活性炭处理1小时。接着经由过滤去除活性炭。然后经由PD-10凝胶过滤(GE Healthcare)将缀合物交换至PBS中。使用Millipore,15mL,30kDa装置，用截留分子量过滤(MWCO)浓缩合并的级分。然后将溶液进行无菌过滤以产生期望的缀合物(3.144mL,3.2mg/mL)。体积：3.144mL。浓度：3.2mg/mL(A280＝0.237,20倍稀释)。药物与抗体的比率(DAR)：2.6(通过rp-LCMS确定)。通过SEC确认ADC的单体形式：87％。
L.实施例12-C6-CLT-D202ADC选择性细胞毒性。
C6-CLT-D202 ADC的选择性示于图13A-13B中。在37℃，用不同浓度的CLL-1选择性细胞毒性抗体-药物缀合物C6-CLT-D202 ADC和对照抗体-药物缀合物C0-D202ADC处理表达范围为约30,000-50,000拷贝数/细胞的CLL-1的HL-60细胞(人早幼粒细胞白血病细胞)，持续五天。图13A显示相对于对照C0-CLT-D202 ADC的靶标依赖性细胞杀伤，C6-CLT-D202 ADC的靶标依赖性细胞杀伤超过500倍。图13B显示对于表达非-CLL-1的细胞系，如TF1(人红系白血病细胞系)，C6-CLT-D202 ADC和C-CLT-D202 ADC具有类似的非细胞毒性作用，从而证明了CLL-1靶向的C6-CLT-D202 ADC在体外的选择性。
M.实施例13-C6-CLT-D202ADC靶标依赖性细胞毒性
TF1是一种多重耐药(MDR)阳性的急性骨髓性白血病(AML)细胞系。CLL-1在TF1中过表达以证明包含抗CLL1抗体的抗体-药物缀合物(“CLL1-ADC”，或更具体地，“C6-CLT-D202 ADC”)的效力。如图14A和14B所示，在37℃，分别用不同浓度的C6-CLT-D202 ADC和C0-CLT-D202 ADC处理过表达的TF1细胞系(TF1-CLL1)和标准TF1细胞系。在图14A中，CLL-1靶向的C6-CLT-D202 ADC显示出对TF1CLL-1 MDR(+)系有效的细胞毒性，而对照C0-CLT-D202ADC具有非常小的有效作用。每种ADC对标准TF1细胞系的活性显示在图14B中，其中可以看出C6-CLT-D202 ADC和C0-CLT-D202 ADC具有更类似的作用。表3中示出的IC50结果显示，当CLL-1在肿瘤细胞靶标中表达时，细胞杀伤效应具有显著差异，提供的IC50降低约103倍。
表2.所选择的ADC对TF1 CLL-1和TF1细胞系的IC50
IC50ug/mL C0-D202 C6-D202
TF1-CLL1 23.27 0.008
TF1 12.93 9.47
N.实施例14-C6-CLT-D202 ADC的结合与细胞毒性之间的相关性
测试了结合细胞与杀伤靶细胞的能力之间的相关性。在表4中，第一列数字是C6-CLT-D202 ADC与各特定细胞系结合的平均荧光强度相对于C0-CLT-D202 ADC(对照ADC)的结合的平均荧光强度的比率。较大的MFI比率反映了相比对照ADC的结合，靶标ADC的结合增加。第二列显示C6-CLT-D202ADC针对特定细胞系的IC50(ng/mL)。在图15中，对于各细胞系，对这两组数作图，相对平均荧光指数(MFI)的对数沿着X轴和是IC50值的对数沿着Y轴。图15显示相对结合对比细胞杀伤的良好相关性，其中所示线的拟合的R2是0.701。这显示C6-CLT-D202在与AML疾病相关的许多细胞系中具有良好的靶标依赖性细胞毒性活性。
表3.细胞系、相对结合强度和IC50
O.实施例15-C6-CLT-D202 ADC靶向增殖细胞和静止细胞。
将表达CLL-1的AML-5细胞在增殖或静止条件下培养五(5)天。在该期间，用不同浓度的C6-CLT-202 ADC处理第一组增殖型表达CLL-1的细胞。用同种型对照处理第二组增殖型表达CLL-1的细胞。相应地，用C6-CLT-D202或同种型对照处理相应组的静止型表达CLL-1的细胞。图16A显示C6-CLT-D202在IC50下(0.03ug/mL(增殖)和0.02ug/mL(静止)细胞)有效杀伤表达CLL-1的细胞，而同种型对照具有至少100倍更高的浓度的IC50。静止细胞杀伤随着培养时间的增加而提高。
相比之下，如图16B中所示，当CLL-1-敲除细胞经受相同条件时，C6-CLT-D202 ADC的靶标依赖性细胞毒性效应被消除。增殖和静止AML-5细胞的IC50类似于同种型对照的IC50，范围为2.34ug/mL(静止的)和5.54ug/mL(增殖的)。
应理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且鉴于此而做出的各种改进或改变将被建议给本领域技术人员，且包含于本申请的精神和范围以及所附的权利要求的范围内。为了所有目的，在此将本文引用的全部出版物、专利和专利申请通过引用的方式整体并入。

Claims (49)

1.结合CLL-1的抗体，所述抗体包含：
含有SEQ ID NO:21的可变轻链，其中SEQ ID NO:21中的至少一个可变位点是来自SEQID NO:6中相同位点的氨基酸；以及
含有SEQ ID NO:23的可变重链，其中SEQ ID NO:23中的至少一个可变位点是来自SEQID NO:9中相同位点的氨基酸。
2.如权利要求1所述的抗体，其中
i.所述可变轻链包含SEQ ID NO:22，
ii.所述可变重链包含SEQ ID NO:24，或
iii.所述可变轻链包含SEQ ID NO:22并且所述可变重链包含SEQ ID NO:24。
3.如权利要求1所述的抗体，其中可变重链Kabat残基1、20、48、67、69、71、73和93中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个是鼠的。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中轻链Kabat残基65-67是NRA或NGA。
5.如权利要求1所述的抗体，其中
所述可变轻链包含SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，以及
所述可变重链包含SEQ ID NO:8。
6.如权利要求1所述的抗体，其中所述可变轻链包含SEQ ID NO:3。
7.如权利要求1所述的抗体，其中所述可变轻链包含SEQ ID NO:4。
8.如权利要求1所述的抗体，其中所述可变轻链包含SEQ ID NO:5。
9.结合CLL-1的抗体，所述抗体包含：
含有SEQ ID NO:25的可变轻链，其中SEQ ID NO:25中的至少一个可变位点是来自SEQID NO:13中相同位点的氨基酸；以及
含有以下的可变重链：
SEQ ID NO:26，其中SEQ ID NO:26中的至少一个可变位点是来自SEQ ID NO:19中相同位点的氨基酸，或
SEQ ID NO:27，其中SEQ ID NO:27中的至少一个可变位点是来自SEQ ID NO:20中相同位点的氨基酸。
10.如权利要求9所述的抗体，其中
所述可变轻链包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12；以及
所述可变重链包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
11.如权利要求10所述的抗体，其包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:12；或者SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:12。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗体，其还包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人恒定区。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗体，其是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含结合CLL-1的第一臂，以及结合第二靶抗原如CD33、CD123、IL1Rap、GPR114的第二臂。
14.如权利要求1-12中任一项所述的抗体，其是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含结合CLL-1的第一臂，以及结合T细胞上的CD3抗原的第二臂。
15.如权利要求1-12中任一项所述的抗体，其是半胱氨酸取代的抗体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的抗体，其与细胞毒性剂连接。
17.如权利要求16所述的抗体，其中所述细胞毒性剂是苯二氮类。
18.如权利要求17所述的抗体，其中所述苯二氮类选自吡咯并苯二氮吲哚啉苯二氮和异喹啉苯二氮或者它们的杂二聚体或同二聚体。
19.嵌合抗原受体，其包含：
靶标结合结构域，其结合CLL-1并且包含选自权利要求1-11中任一项所述的可变轻链和可变重链的结合部分(如scFv结构域)；
铰链区；
跨膜结构域(TM)；以及
胞内结构域，其包含至少一个信号转导结构域(如CD3ζ)。
20.核酸，其包含编码权利要求1-19中任一项所述的抗体或嵌合抗原受体的核苷酸序列。
21.如权利要求20所述的核酸，其中所述核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。
22.如权利要求21所述的核酸，其包含于表达载体中。
23.重组细胞，其包含权利要求22所述的核酸。
24.如权利要求23所述的重组细胞，其中所述核苷酸序列编码嵌合抗原受体，并且所述细胞是淋巴或骨髓谱系的细胞。
25.制备抗体或嵌合抗原受体的方法，其包括培养权利要求23所述的重组细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其还包括分离所述抗体。
27.组合物，其包含权利要求1-15中任一项所述的抗体和佐剂。
28.如权利要求27所述的组合物，其是药学可接受的。
29.检测表达CLL-1的细胞的方法，其包括：
使细胞与有效量的能够结合所述细胞的权利要求1-15所述的抗体接触，以及
检测所述抗体与所述细胞的结合，
其中结合指示目的细胞的存在。
30.诊断疾病的方法，其包括：
使来自个体的生物样品与有效量的能够结合病变细胞的权利要求1-15所述的抗体接触，以及
检测所述抗体与病变细胞的结合，
其中结合指示所述疾病的存在。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述抗体与可检测部分缀合。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述疾病是癌症。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞或癌症干细胞。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述疾病是骨髓增生性病症。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述骨髓增生性病症选自AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
36.抑制细胞分裂的方法，其包括使细胞与能够结合所述细胞的至少有效量的权利要求1-15所述的抗体接触。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述抑制细胞分裂导致细胞死亡。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述细胞是肿瘤或癌症干细胞。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述肿瘤或癌症干细胞来自骨髓增生性病症。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述骨髓增生性病症选自：AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
41.治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的权利要求1-15所述的抗体。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述抗体是抗体缀合物，其经由可切割的、不可切割的或无痕接头与有效的细胞毒性药物缀合。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述药物选自：美登素类、奥里斯他汀、多拉司他汀、tubulysin、念珠藻素、吡咯并苯二氮(PBD)二聚体、吲哚啉苯二氮二聚体、α-鹅膏蕈碱、单端孢霉烯、SN-38、倍癌霉素、CC1065、加利车霉素、烯二炔类抗生素、紫杉烷类、多柔比星衍生物、蒽环类、以及它们的立体异构体、azanofide、电子等排体、类似物或衍生物。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述癌症是骨髓增生性病症。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述骨髓增生性病症选自：AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
46.如权利要求45所述的方法，其中肿瘤相关抗原或癌症干细胞抗原是CLL-1。
47.治疗以表达CLL-1的癌细胞为特征的癌症的方法，其包括向对象施用表达权利要求19所述的嵌合抗原受体的细胞。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述癌症是白血病，如选自AML(急性骨髓性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)和CML(慢性骨髓性白血病)。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述细胞是淋巴或骨髓谱系细胞。
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