CN104736562A - Cll-1特异性的抗体 - Google Patents

Cll-1特异性的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN104736562A
CN104736562A CN201380035351.XA CN201380035351A CN104736562A CN 104736562 A CN104736562 A CN 104736562A CN 201380035351 A CN201380035351 A CN 201380035351A CN 104736562 A CN104736562 A CN 104736562A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cll
cell
aml
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380035351.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104736562B (zh
Inventor
蒋英萍
霍尔戈尔·卡尔苏恩基
罗布·特莱斯勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Uk Medical Ltd
Original Assignee
Cellerant Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellerant Therapeutics Inc filed Critical Cellerant Therapeutics Inc
Publication of CN104736562A publication Critical patent/CN104736562A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104736562B publication Critical patent/CN104736562B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本文提供了CLL-1特异性的抗体(“CLL-1抗体”)，其结合来自AML患者样品的、高百分比的表达CLL-1的原代细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以10nM或更小的Kd特异性结合人CLL-1的胞外结构域。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以100ηΜ、10ηΜ、1nM、100pM或更小的kd结合食蟹猴CLL-1。例如，在一些实施方案中，食蟹猴CLL-1和人CLL-1竞争结合所述CLL-1抗体。本领域技术人员将理解，较高亲和力的结合表示为较低的kd(较低浓度的结合所必需的抗体靶标)。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。

Description

CLL-1特异性的抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年5月7日提交的美国临时申请第61/643,739号、于2012年9月10日提交的美国临时申请第61/699,134号以及2013年3月11日提交的美国申请第13/794,525号的优先权，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明背景
C型凝集素样分子1(CLL-1)表达于AML细胞和癌症干细胞(CSC)上，所述癌症干细胞为能产生额外的癌细胞的细胞。
化疗的一个主要限制是抗癌药物无法区分正常细胞和癌细胞。主要类别的抗肿瘤药剂的几乎所有成员都对正常细胞具有相当大的毒性。
特异性靶向癌细胞的组合物可避免该问题。然而，现有癌症靶向物不靶向CSC。由于这一原因，现有化疗策略并未有效清除癌症，即使当特异性地递送至癌细胞时亦如此。由于存活的CSC可产生新的癌细胞，因此仍存在复发风险。
与造血干细胞(HSC)相似，CSC表达CD34，但是在HSC上不表达CLL-1。这使得能够使用CLL-1来特异性地靶向CSC。本文提供了识别高百分比的表达CLL-1的细胞的CLL-1抗体。本CLL-1抗体对表达CLL-1细胞的补体依赖性毒性和抗体依赖性毒性都有效，并且抑制表达CLL-1的癌细胞的肿瘤生长。本文描述的抗体为靶向CLL-1相关疾病提供了新的诊断策略和治疗策略。
发明概述
本文提供了CLL-1特异性的抗体(“CLL-1抗体”)，其结合来自AML患者样品的、高百分比的表达CLL-1的原代细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以10nM或更小的Kd，例如5nM、1nM、500pM、200pM、100pM、50pM中的任何Kd或更小的Kd，特异性结合人CLL-1的胞外结构域。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以100nM、10nM、1nM、100pM或更小的Kd结合食蟹猴CLL-1。例如，在一些实施方案中，食蟹猴CLL-1和人CLL-1竞争结合所述CLL-1抗体。本领域技术人员将理解，较高亲和力的结合表示为较低的Kd(较低浓度的结合所必需的抗体靶标)。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合由CLL-1的C-凝集素结构域组成的多肽的Kd为其结合包含或由CLL-1的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5倍，例如，至少10倍、20倍、50倍或100倍中的任一倍数。换言之，所述抗体结合含有CLL-1的茎结构域和C-凝集素结构域的多肽的亲和力比其结合单独的C-凝集素结构域或单独的茎结构域的亲和力高。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合包含部分茎结构域和部分C-凝集素结构域的表位。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合由人C型凝集素样分子(CLL-1)的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的亲和力，比其结合(a)由人CLL-1的C-凝集素结构域组成的多肽或(b)由人CLL-1的茎结构域组成的多肽的亲和力更大。例如，命名为M26和M31的CLL-1抗体结合人CLL-1的101位至265位氨基酸的亲和力比其结合人CLL-1的141位至265位氨基酸(参照SEQ ID NO:2)的亲和力高。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合CLL-1的C-凝集素结构域的Kd为其结合全长CLL-1胞外结构域的Kd的至少5倍，例如，至少10倍、20倍、50倍或100倍中的任一倍数。换言之，所述CLL-1抗体的亲和力是对全长CLL-1胞外结构域(例如，如在细胞上表达的)的亲和力的1/5、1/10、1/20、1/50或1/100中的任一项。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合静止期的表达CLL-1的细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以10nM或更小的Kd，例如，以1nM、500pM、200pM、100pM、50pM中的任何Kd或更小的Kd结合静止期的表达CLL-1的细胞。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合HL60细胞培养物中至少60％的细胞，例如HL60细胞的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％中的任意百分比或更高。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合来自AML患者的原代细胞样品中至少30％(例如40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％中的任意百分比或更高的百分比)的有核细胞，其中所述原代细胞样品是外周血或肿瘤组织活检样品。本领域技术人员将理解，在这样的细胞结合测定中，添加合适浓度的抗体，例如以使得存在足够的抗体分子来结合培养物或样品中的众多细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
在一些实施方案中，在以表达CLL-1的细胞(例如，HL60细胞或原代AML细胞)进行的抗体-药物缀合物(ADC)细胞毒性测定中，所述CLL-1抗体具有小于1nM的EC50。在一些实施方案中，在ADC测定中的EC50为500pM、200pM、100pM、50pM中的任一项或更小。在一些实施方案中，在ADC细胞毒性测定中，所述CLL-1抗体将AML细胞集落的形成降低了至少50％，例如至少60％、70％、80％或更多。在一些实施方案中，所述细胞是原代患者AML细胞。在一些实施方案中，所述细胞是AML癌症干细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体不影响正常的CD34+造血干细胞(HSC)，或者在ADC细胞毒性测定中显著减少正常CD34+HSC集落的形成。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体在以表达CLL-1的细胞如HL60细胞或原代AML细胞进行的补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有1μg/ml或更小的EC50。在一些实施方案中，在CDC测定中，EC50为500ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml中的任何一项或更小。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体在以表达CLL-1的细胞如CLL-1转染的293细胞、HL60细胞或原代AML细胞进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定中，具有1μg/ml或更小的EC50。在一些实施方案中，在ADCC测定中，EC50为500ng/ml、200ng/ml、100ng/ml中的任一项或更小。在一些实施方案中，当向携带有AML异种移植物的小鼠给予至少4周时，与未处理对照(即，携带AML异种移植物但未用CLL-1抗体处理的小鼠)相比，所述CLL-1抗体将肿瘤负荷降低的倍数为至少10倍。在一些实施方案中，所述AML异种移植物来自人AML细胞系，例如HL60细胞或OCI AML-5细胞。在一些实施方案中，所述AML异种移植物来自原代人AML或原代灵长类(例如食蟹猴)AML细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体选自与选自以下的抗体竞争结合CLL-1(例如，表达CLL-1的细胞或AML细胞)的抗体：
·包含M26的重链和轻链CDR的抗体(参见实施例1)；
·包含M31的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G4的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M22的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M29的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M2的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M5的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G12的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M41的重链和轻链CDR的抗体；
·包含E3的重链和轻链CDR的抗体；
·包含B10的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G2的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G6的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G8的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G10的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G14的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G16的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G23的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G26的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G28的重链和轻链CDR的抗体；以及
·包含G30的重链和轻链CDR的抗体。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体选自：选自以下的抗体：
·包含M26的重链和轻链CDR的抗体(参见实施例1)；
·包含M31的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G4的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M22的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M29的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M2的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M5的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G12的重链和轻链CDR的抗体；
·包含M41的重链和轻链CDR的抗体；
·包含E3的重链和轻链CDR的抗体；
·包含B10的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G2的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G6的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G8的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G10的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G14的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G16的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G23的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G26的重链和轻链CDR的抗体；
·包含G28的重链和轻链CDR的抗体；以及
·包含G30的重链和轻链CDR的抗体，
其中所选CDR中的任何一种或多种可比初始CDR序列具有1、2或3个保守氨基酸替换。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含M26的重链和轻链CDR。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含M31的重链和轻链CDR。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含G4的重链和轻链CDR。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
在一些实施方案中，上述CLL-1抗体结合由CLL-1的C-凝集素结构域组成的多肽的Kd为其结合由CLL-1的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5倍(例如，至少10倍、20倍、50倍、100倍中的任一倍数或更高倍数)。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合CLL-1的C-凝集素结构域的Kd为其结合全长CLL-1胞外结构域的Kd的至少5倍(例如，10倍、20倍、50倍或100倍中的任一倍数或更高倍数)。在一些实施方案中，上述CLL-1抗体还结合HL60细胞培养物中至少80％的细胞(例如85％、90％、95％中的任意百分比或更高百分比)。在一些实施方案中，上述CLL-1抗体还结合来自患有AML个体的AML细胞样品中至少30％的有核细胞(例如40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％中的任意百分比或更高百分比)。再次地，在这样的细胞结合测定中，添加合适浓度的抗体，例如以使得存在足够的抗体分子来结合培养物或样品中的众多细胞，并且抗体浓度不是限制因素。
在一些实施方案中，上述CLL-1抗体是具有例如来自IgGl的人Fc区的嵌合抗体。在一些实施方案中，上述CLL-1抗体是人源化的。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，上述CLL-1抗体是Fv片段(例如，Fab、Fab'或F(ab')2)。在一些实施方案中，对上述CLL-1抗体进行标记，例如，与可检测部分缀合。在一些实施方案中，上述CLL-1被连接于治疗化合物，例如细胞毒素或细胞生长抑制剂。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体选自：
·包含与M26的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:4；Vl＝SEQ ID NO:6)基本相同(至少85％、90％、95％或98％的同一性中的任意项)的可变区序列的抗体；
·包含与M31的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:8；Vl＝SEQ ID NO:10)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G4的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:12；Vl＝SEQ ID NO:14)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M22的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:16；Vl＝SEQ ID NO:18)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M29的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:20；Vl＝SEQ ID NO:22)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M2的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:24；Vl＝SEQ ID NO:26)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M5的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:28；Vl＝SEQ ID NO:30)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G12的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:32；Vl＝SEQ ID NO:34)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M41的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与E3的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与B10的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G2的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G6的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G8的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G10的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G14的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G16的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G23的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G26的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G28的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；以及
·包含与G30的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体。
在一些实施方案中，所述基本相同的抗体具有初始抗体的CDR序列。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与选自以下的抗体竞争结合：
·包含M26的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:4；Vl＝SEQ ID NO:6)的抗体；
·包含M31的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:8；Vl＝SEQ ID NO:10)的抗体；
·包含G4的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:12；Vl＝SEQ ID NO:14)的抗体；
·包含M22的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:16；Vl＝SEQ ID NO:18)的抗体；
·包含M29的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:20；Vl＝SEQ ID NO:22)的抗体；
·包含M2的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:24；Vl＝SEQ ID NO:26)的抗体；
·包含M5的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:28；Vl＝SEQ ID NO:30)的抗体；
·包含G12的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:32；Vl＝SEQ ID NO:34)的抗体；
·包含M41的可变区序列的抗体；
·包含E3的可变区序列的抗体；
·包含B10的可变区序列的抗体；
·包含G2的可变区序列的抗体；
·包含G6的可变区序列的抗体；
·包含G8的可变区序列的抗体；
·包含G10的可变区序列的抗体；
·包含G14的可变区序列的抗体；
·包含G16的可变区序列的抗体；
·包含G23的可变区序列的抗体；
·包含G26的可变区序列的抗体；
·包含G28的可变区序列的抗体；以及
·包含G30的可变区序列的抗体。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体选自：
·包含M26的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:4；Vl＝SEQ ID NO:6)的抗体；
·包含M31的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:8；Vl＝SEQ ID NO:10)的抗体；
·包含G4的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:12；Vl＝SEQ ID NO:14)的抗体；
·包含M22的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:16；Vl＝SEQ ID NO:18)的抗体；
·包含M29的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:20；Vl＝SEQ ID NO:22)的抗体；
·包含M2的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:24；Vl＝SEQ ID NO:26)的抗体；
·包含M5的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:28；Vl＝SEQ ID NO:30)的抗体；
·包含G12的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:32；Vl＝SEQ ID NO:34)的抗体；
·包含M41的可变区序列的抗体；
·包含E3的可变区序列的抗体；
·包含B10的可变区序列的抗体；
·包含G2的可变区序列的抗体；
·包含G6的可变区序列的抗体；
·包含G8的可变区序列的抗体；
·包含G10的可变区序列的抗体；
·包含G14的可变区序列的抗体；
·包含G16的可变区序列的抗体；
·包含G23的可变区序列的抗体；
·包含G26的可变区序列的抗体；
·包含G28的可变区序列的抗体；以及
·包含G30的可变区序列的抗体。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含M26的重链和轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含M31的重链和轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含G4的重链和轻链可变区序列。
在一些实施方案中，上述CLL-1抗体结合由CLL-1的C-凝集素结构域组成的多肽的Kd为其结合由CLL-1的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5倍(例如，至少10倍、20倍、50倍、100倍中的任一倍数或更高倍数)。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合CLL-1的C-凝集素结构域的Kd为其结合全长CLL-1胞外结构域的Kd的至少5倍(例如，10倍、20倍、50倍或100倍中的任一倍数或更高倍数)。在一些实施方案中，上述CLL-1抗体还结合HL60细胞培养物中至少80％细胞(例如85％、90％、95％中的任意百分比或更高百分比)。在一些实施方案中，上述CLL-1抗体还结合来自患有AML个体的AML细胞样品中至少30％的有核细胞(例如40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％中的任意百分比或更高百分比)。
在一些实施方案中，上述CLL-1抗体是Fv片段(例如，Fab、Fab'或F(ab')2)。在一些实施方案中，在单个抗体构建体中，所述抗体包含具有两种不同表位结合序列的两个不同的可变区(例如，一个表位结合区来自M26、M31、G4或M22，并且一个表位结合区来自M26、M31、G4或M22的任意组合)。在一些实施方案中，对上述CLL-1抗体进行标记，例如，与可检测部分缀合。在一些实施方案中，上述CLL-1被连接于治疗化合物，例如细胞毒素或细胞生长抑制剂。
本发明还提供了包含本文所述CLL-1抗体和药学可接受的赋形剂或载体的药物组合物。
本发明提供了用于确定细胞是否表达CLL-1的方法，其包括：将CLL-1抗体(即，具有上述活性或序列中的任意项的CLL-1抗体)与细胞接触；检测所述抗体与所述细胞的结合，其中所述抗体与所述细胞的结合指示所述细胞表达CLL-1；以及确定所述细胞是否表达CLL-1。在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述细胞是否表达CD34。在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述细胞是否表达CD38。在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述细胞是否表达CD45。在一些实施方案中，所述细胞处于获自个体的生物样品(例如，血液样品或来自肿瘤或组织的组织活检样品)中。在一些实施方案中，通过FACS来检测抗体结合。
本发明还提供了鉴定骨髓癌细胞(表达CLL-1的癌细胞，例如来自诸如AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤或MDS等的骨髓增生性疾病)或CSC(例如，LSC或骨髓癌母细胞)的方法，其包括：将CLL-1抗体(即，具有上述活性或序列中的任意项的CLL-1抗体)与细胞接触；检测所述抗体与所述细胞的结合；以及在所述抗体结合所述细胞时鉴定CSC或骨髓癌细胞。在一些实施方案中，所述骨髓癌细胞选自AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤或MDS细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述细胞是否表达CD45，以及在所述细胞表达CD45时鉴定AML细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述细胞是否表达CD34，以及在所述细胞表达CD34时鉴定CSC。在一些实施方案中，所述细胞处于来自个体的生物样品中。在一些实施方案中，通过FACS来检测抗体结合。
本发明还提供了诊断个体骨髓增生性疾病(例如，AML、CML、MDS、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤骨髓纤维变性)的方法，其包括：将CLL-1抗体(即，具有上述活性或序列中的任意项的CLL-1抗体)与来自个体的生物样品接触；检测所述抗体与所述生物样品中细胞的结合；以及在所述抗体结合所述细胞时诊断所述个体的骨髓增生性疾病。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品(例如，外周有核血细胞)或来自肿瘤或组织的组织活检样品。在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述细胞是否表达CD34。在一些实施方案中，所述方法还包括在诊断出骨髓增生性疾病时确定个体的治疗过程。在一些实施方案中，所述治疗过程包括给予有效剂量的CLL-1抗体。在一些实施方案中，在包含药学可接受的赋形剂的药物组合物中给予所述有效剂量的CLL-1抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括，例如在诊断出骨髓增生性疾病或在个体以前被诊断出骨髓增生性疾病但接受了该疾病的治疗时，监测个体。
本发明还提供了抑制表达CLL-1细胞的存活(例如，降低细胞生长或分裂、介导ADC、介导CDC)的方法，其包括，将CLL-1抗体(即，具有上述活性或序列中任一项的CLL-1抗体)与所述细胞接触，并抑制细胞存活。在一些实施方案中，所述接触包括向诊断患有骨髓增生性疾病(例如，AML、CML、MDS、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤骨髓纤维变性)的个体给予所述抗体(例如，在药物组合物中)。在一些实施方案中，以有效抑制表达CLL-1的细胞存活的剂量给予所述CLL-1抗体。
本发明提供了治疗个体中的骨髓增生性疾病(例如，与未治疗的对照相比，降低肿瘤生长或定植)的方法，其包括向所述个体给予有效剂量的CLL-1抗体(即，具有上述活性或序列中任一项的CLL-1抗体)，从而治疗所述个体中的所述骨髓增生性疾病。在一些实施方案中，所述骨髓增生性疾病选自AML、CML、MDS、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。在一些实施方案中，在包含药学可接受的赋形剂的药物组合物中给予所述有效剂量的CLL-1抗体。在一些实施方案中，所述个体已经例如通过使用本文所述的CLL-1抗体被诊断出患有骨髓增生性疾病。在一些实施方案中，所述治疗方法还包括例如通过使用本文所述CLL-1抗体来监测所述个体中的细胞生长(例如，肿瘤生长或循环骨髓癌细胞)。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体被连接于治疗化合物，例如细胞毒素或细胞生长抑制剂。
附图说明
图1示出了使用来自3名不同AML患者#49(A)、#50(B)和#52(C)的原代细胞进行的补体依赖性细胞毒性(CDC)测定的结果。A和B示出，CLL-1抗体克隆M26具有10ng/mL至100ng/mL的EC50。图1C示出了CLL-1抗体克隆M26、M31以及阴性对照E12(不相关的抗体)和IgG的结果。M26和M31都具有10ng/mL至100ng/mL的EC50。
图2示出了CLL-1抗体克隆在小鼠异种移植模型中的抗肿瘤效果。将HL60AML细胞经皮下注射至小鼠中。将小鼠分为5组，每组n＝6只小鼠：(1)IgG2a对照；(2)M5；(3)M13；(4)M26；和(5)M31。小鼠每周接受一次200μg抗体，持续7周。对于所有治疗组，相对于对照组P<0.05。
图3示出了CLL-1抗体克隆在小鼠原位异种移植模型中的抗肿瘤效果。将AML细胞经静脉内注射至免疫功能受损的NSG(NOD/SCID/IL2受体γ链敲除)小鼠中。将小鼠分为5组，每组n＝6只小鼠：(1)IgG2a对照；(2)M5；(3)M13；(4)M26；和(5)M31。小鼠每周接受两次200μg抗体，持续2周，并且在移植4周后处死。通过FACS来确定骨髓中的肿瘤负荷(CD45+CLL-1+细胞)。
图4示出，CLL-1抗体-药物缀合物(ADC)抑制AML干细胞的集落形成，但不抑制正常造血干细胞(CD34+HSC)的集落形成。图4A示出，接种的CD34+HSC在抗体-药物缀合物以阴性对照水平(无抗体或抗体-药物缀合物)存在下形成集落。图4B示出，对于接种的总PBMC，AML癌症干细胞(CSC)在与皂草素缀合的CLL-1抗体M26存在下具有比阴性对照(无抗体或抗体-药物缀合物)低80％的集落形成。
图5示出，CLL-1抗体克隆M26、M31和G4(还有经标记的31.G4)以小鼠形式和嵌合人(Chi)形式与人PBMC结合。阴性对照包括每个CLL-1抗体相应的但是对不相关的抗原具有特异性的IgG。单核细胞分离自PBMC样品，并且根据CD89(粒细胞)、CD14(单核细胞和粒细胞)、CD3(淋巴细胞)和CD19(B细胞)的表达使用FACS来表征细胞。对于各CLL-1抗体，以从左至右的顺序示出了每个群体CLL-1阳性染色的百分比。
图6示出，CLL-1抗体克隆M26、M31和G4(经标记的31G4)以原代小鼠形式和嵌合人(Chi)形式与食蟹猴PBMC结合。阴性对照包括每个CLL-1抗体相应的但是对不相关的抗原具有特异性的IgG。单核细胞分离自PBMC样品，并且根据CD3(淋巴细胞)、CD19(B细胞)、CD14(粒细胞)、CD14(单核细胞)和CD89(粒细胞)的表达使用FACS来表征细胞。对于各CLL-1抗体，以从左至右的顺序示出了每个群体CLL-1阳性染色的百分比。
图7示出，小鼠CLL-1和嵌合人CLL-1都对CLL-1转染的293细胞具有体外抗体-药物缀合物(ADC)活性。图7A示出了小鼠CLL-1抗体克隆M26、M31和G4(31G4)相比阴性对照小鼠IgG2a的结果。图7B示出了相应的嵌合人CLL-1抗体克隆的结果。
图8示出，嵌合人CLL-1抗体克隆M26、M31和G4(31G4)介导对经CLL-1转染的293细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ChiM26、ChiM31和Chi31G4的EC50分别是79、143和105。
图9示出了CLL-1抗体克隆在小鼠异种移植模型中的抗肿瘤效果。在第1天辐照NOD/SCID小鼠，并且在第0天将HL60细胞注射至尾静脉(每只小鼠3×106个细胞)。将小鼠分为3组，每组n＝6只小鼠：(1)huIgG对照；(2)M26；(3)ChiM31。小鼠在过程的22天中接受了8次抗体注射(200μg)，并且在第26天处死。通过FACS来确定骨髓中的肿瘤负荷。图9A示出了huCD45+CD33+AML细胞的百分比，并且图9B示出了huCD45+CLL-1+AML CSC的百分比。
图10示出了CLL-1抗体克隆在小鼠异种移植模型中的抗肿瘤效果。在第1天辐照NOD/SCID小鼠，并且在第0天将OCI AML-5细胞注射至尾静脉(每只小鼠5×106个细胞)。将小鼠分为5组，每组n＝6只小鼠：(1)huIgG对照；(2)M26；(3)ChiM26；(4)ChiM31；(5)ChiG4。小鼠在19天的过程中接受了8次抗体注射(200μg)，并且在第24天后处死。通过FACS来确定骨髓中的肿瘤负荷。图10A示出了huCD45+CD33+AML细胞的百分比。图10B示出了huCD45+CD33+AML细胞的log10百分比，以观察结果间的更好的解析度。该数据示出，所有4种受试的CLL-1抗体都有效地降低了肿瘤负荷，并且M26、ChiM26和ChiM31具有最大的抗肿瘤效果。
发明详述
I.介绍
本文提供了具有多种有利性质的CLL-1特异性抗体。这样的抗体基于以下标准中的至少一种来选择：
·在皮摩尔至纳摩尔范围内的对人CLL-1的亲和力；
·与获自AML患者的相对较高百分比的样品结合(例如，相比X357CLL-1抗体或X1057CLL-1抗体更高百分比的AML患者，或至少50％的AML患者样品)；
·与AML患者样品中相对较高百分比的细胞(例如外周血单核细胞(PBMC))结合(例如，相比X357CLL-1抗体或X1057CLL-1抗体更高百分比的细胞，或AML患者样品中至少50％的细胞)；
·在抗体-药物缀合物(ADC)细胞毒性测定中具有活性；
·在补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中具有活性；
·在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定中具有活性；
·体外或体内(异种移植小鼠模型)的抗肿瘤活性；
·与AML细胞特异性结合并且在AML细胞中具有ADC活性，但是不作用于正常HSC；
·与动物模型的物种同源物(例如，食蟹猴CLL-1)结合；
·抗体在嵌合人形式中保留有上述活性。
本文所描述的CLL-1抗体并非都具备所有这些选择的性质，但是将例如根据序列在下文中进行进一步的描述。本发明的CLL-1抗体可用于检测表达CLL-1的细胞，例如，用于诊断或监测个体中表达CLL-1的癌细胞，或者用于治疗表达CLL-1的癌症，例如AML。
II.定义
除非另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的相同含义。参见，例如Lackie,DICTIONARY OFCELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier(第四版，2007)；Sambrook等，MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold SpringsHarbor出版社(Cold Springs Harbor,NY 1989)。术语“一(a/an)”旨在意为“一或多”。当处于所叙述的步骤或要素之前时，术语“包含(comprise)”及其变体形式(如comprises和comprising)旨在意为增加额外步骤或要素是任选的，并且是不被排除的。与本文所述的方法、装置和材料相似或相同的任何方法、装置和材料都可用于实施本发明。提供了以下定义以便于理解本文频繁使用的某些术语，并且不旨在限制本公开内容的范围。
C型凝集素样分子1(CLL-1)，也被称为CLEC12A、DCAL-2和MICL，是一种II型膜蛋白(ITIM结构域–TM结构域-茎结构域-凝集素样结构域)。CLL-1的胞外结构域是高度糖基化的，并且其仅在骨髓系的细胞中表达。CLL-1还表达于AML、MDS和CML细胞上。CLL-1表达可用于区分不表达CLL-1的正常造血干细胞(HSC)和表达CLL-1的白血病干细胞(LSC)。LSC是白血病患者中导致癌细胞产生和癌症复发的CD34+细胞。参见Bakker等，(2004)Cancer Res.64:8443。
许多物种的CLL-1的核苷酸序列和蛋白质序列是已知的。例如，人序列可在Genbank登录号AF247788.1(编码序列在SEQ ID NO:1中示出)和Uniprot登录号Q5QGZ9(SEQ ID NO:2)处找到。对于SEQ ID NO:2所示的人CLL-1蛋白，胞外结构域包含约第65位至265位的氨基酸，跨膜结构域包含约第44位至64位的氨基酸，并且细胞质结构域包含约第1位至43位的氨基酸。人CLL-1的茎结构域跨越第65位至139位氨基酸，并且C凝集素结构域跨越第140位至249位氨基酸，这二者都参考SEQ IDNO:2所示的序列。本领域技术人员将理解，可任选地对CLL-1变体(例如物种同源物、等位基因变体等)进行比对，例如用于鉴定保守的残基和结构域。
在本文中，所有的术语“CLL-1特异性抗体”、“抗CLL-1抗体”、“CLL-1抗体”和“抗CLL-1”是同义的，表示特异性结合CLL-1的抗体，包括CLL-1的各种糖基化形式。本文描述的CLL-1抗体特异性结合例如某些癌细胞表面上表达的CLL-1多肽，但是不与HSC结合。如在下文中更详细描述的，本发明的抗CLL-1抗体可结合表达CLL-1的细胞、结合相比其他AML靶向抗体更大百分比的AML细胞、抑制AML细胞增殖并且介导AML的破坏。
“CLL-1相关疾病”(或CLL-1有关疾病、CLL-1疾病、CLL-1相关病况或病症等)是指与CLL-1细胞表面表达相比标准对照(例如，正常的细胞、非疾病细胞、非癌细胞)中的CLL-1表达而升高或降低相关的病况和病症。升高的CLL-1水平与癌细胞，特别是白血病例如AML(急性骨髓性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)和CML(慢性骨髓性白血病)以及造血性CSC(例如LSC)有关。
术语“抗体”是指多肽结构，例如，免疫球蛋白、缀合物或其保留了抗原结合活性的片段。该术语包括但不限于衍生自人其他哺乳动物细胞的同种型类型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的多克隆抗体或单克隆抗体，包括天然形式或遗传改造形式，例如人源化的、人的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、移植的以及体外生成的抗体。该术语涵盖缀合物，包括但不限于包含免疫球蛋白部分的融合蛋白质(例如嵌合抗体或双特异性抗体或scFv's)和片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他组合物。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对都具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50kD至70kD)。每条链的N端都限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。可变区包含抗体的抗原结合区(或其功能等价物)，并且对结合的特异性和亲和力最为重要。参见Paul,Fundamental Immunology(2003)。
抗体可作为完整的免疫球蛋白存在，或作为任意数量良好表征的具有特异性抗原结合活性的片段存在。为了清楚的目的，具有重链和轻链的四聚体抗体在本文中称为“完整的免疫球蛋白”，并且可为天然存在的、多克隆的、单克隆的或重组产生的。可通过用多种肽酶消化来产生片段。胃蛋白酶在铰链区中二硫键连接的下方消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)'2，Fab本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)'2可在温和条件下还原而破坏铰链区中的二硫键连接，从而将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分铰链区的Fab。虽然各抗体片段依据完整抗体的消化来定义，但是本领域技术人员将理解，这些片段可以化学方法或通过使用重组DNA方法来从头合成。因此，本文所用术语抗体还包括通过改造整个抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段，或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见例如，McCafferty等，Nature 348:552-554(1990))。
本文所用，术语“Fv”是指一价或二价的可变区片段，并且可仅涵盖可变区(例如，VL和/或VH)，以及较长的片段，例如Fab、Fab'或F(ab')2，其也包含CL和/或CH1。除非另有说明，否则术语“Fc”是指包含CH1和CH2区的重链单体或二聚体。
单链Fv(scFv)是指包含通过诸如肽连接子等连接子连接的VL和VH的多肽。ScFv还可用于形成串联(或二价)scFv或双体。串联scFv和双体的生产和性质在例如Asano等，(2011)J Biol.Chem.286:1812；Kenanova等，(2010)Prot Eng Design Sel 23:789；Asano等，(2008)Prot Eng DesignSel 21:597中有描述。
双特异性抗体或二价抗体是指对两种不同靶标抗原或靶标表位具有特异性的抗体。例如，一个抗体臂(V区)可对CLL-1具有特异性，同时另一个臂可对另一种靶标(例如白血病靶标或AML靶标，或招募效应细胞的靶标如CD3)具有特异性。双特异性抗体还可具有这样的性质，一个臂对第一CLL-1表位具有特异性，同时另一个臂对第二CLL-1表位具有特异性。双特异性抗体可为Fv区或者完整免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白。双特异性抗体在Lum等，(2011)BioDrugs 25:365和Mabry等，(2010)IDrugs 13:543中有描述。
“单克隆抗体”是指对抗原上的指定表位具有单一结合特异性和亲和力的抗体克隆制备物。“多克隆抗体”是指针对单一抗原产生的，但是具有不同结合特异性和亲和力的抗体制备物。
本文所用“V区”是指抗体可变区结构域，其包含框架1、CDR1、框架2、CDR2和框架3区段，包含CDR3和框架4，其在B细胞分化期间因重链和轻链V区基因重排而附加至V区段的区段。
本文所用“互补决定区(CDR)”是指每条链中的三个高变区，其间插于由轻链和重链可变区建立的四个“框架”区。CDR主要负责结合抗原表位。每条链的CDR一般称为从N末端开始编号的CDR1、CDR2和CDR3，并且也一般通过具体CDR所位于的链来鉴定。因此，VH CDR3位于发现其的抗体重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现其的抗体轻链可变结构域的CDR1。
在物种内，不同的轻链或重链的框架区序列相对保守。抗体框架区，即所组成性轻链和重链的组合框架区，在三维空间中起排布并对齐CDR的作用。
可使用多种本领域公知的定义来确定CDR和框架区的氨基酸序列，例如，Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见例如，Johnson等，同上；Chothia&Lesk,(1987)J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia等，(1989)Nature 342,877-883；Chothia等，(1992)J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol 1997,273(4))。对使用Kabat系统来定位CDR有帮助的指南可在可用网址bioinf.org.uk/abs处找到。抗原组合位点的定义在以下文献中也有描述：Ruiz等，Nucleic Acids Res.,28,219-221(2000)；以及Lefranc Nucleic Acids Res.Jan 1；29(1):207-9(2001)；MacCallum等，J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；以及Martin等，Proc.NatlAcad.Sci.USA,86,9268-9272(1989)；Martin等，Methods Enzymol.,203:121-153,(1991)；Pedersen等，Immunomethods,1,126,(1992)；以及Rees等，Sternberg M.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction.Oxford UniversityPress,Oxford,141-172(1996)。
“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区、CDR或其一部分)与不同的或改变的类型、效应子功能和/或物种的恒定区连接；或(b)可变区或其一部分被用具有不同或改变的抗原特异性的可变区(例如，来自不同物种的CDR或框架区)来改变、替换或交换。嵌合抗体可包含可变区片段，例如重组抗体包含两个Fab区或Fv区或scFv。所上文所示，嵌合还可包含来自与附加的Fv区不同的来源的Fc区。在一些情况下，嵌合抗体包含Fv区内的嵌合性。这样的嵌合抗体的实例为，其中FR和CDR来自不同来源的人源化抗体。
人源化抗体是指其中获自非人抗体VH区和VL区的抗体结合环(即，CDR)被移植到人框架序列中的抗体。人源化，即将非人CDR序列替换为人抗体中的相应序列，其可根据以下文献中描述的方法来进行，例如，美国专利第5,545,806；5,569,825；5,633,425；5,661,016号；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology 14:845-51(1996)。如在美国专利第6,673,986号中所公开的，转基因小鼠或其他生物例如其他哺乳动物，也可用于表达人源化的抗体或人抗体。
术语“抗原”、“免疫原”、“抗体靶标”、“靶标分析物”以及类似的术语在本文中用于指被抗体识别的，即，可被抗体特异性结合的分子、化合物或复合物。该术语可指可被抗体特异性识别的任何分子，例如多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、化学部分或其组合(例如，磷酸化或糖基化的多肽等)。本领域技术人员将理解，该术语不表示在每一种环境中该分子都具有免疫原性，而是简单地表示其可被抗体靶向。
抗体与抗原上的“表位”结合。表位为抗原上的被抗体识别并结合的位点。表位可包括一些氨基酸或一些氨基酸的一部分，例如，5个或6个或更多，例如20个或更多个氨基酸，或这些氨基酸的一部分。在一些情况下，表位包含非蛋白质组分，例如，来自碳水化合物、核酸或脂质。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，在靶标是蛋白质的情况下，表位可由连续的氨基酸或通过蛋白质折叠而邻近的蛋白质的不同部分组成(例如，不连续的表位)。其他类型的形成三维结构的靶标分子亦如此。
术语“对……具有特异性”、“特异性结合”以及相似术语是指这样的分子(例如抗体或抗体片段)，其对靶标的结合亲和力是其对非靶标化合物亲和力的至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍中的任意倍数。例如，特异性结合第一抗体的抗体对第一抗体的结合亲和力通常是其对非第一抗体靶标(例如，来自不同物种的抗体或不同同种型的抗体或非抗体靶标)的结合亲和力的至少2倍。
术语相对于抗体靶标(例如，抗原、分析物、免疫复合物)的“结合”通常表示抗体结合纯的群体(假定合适的摩尔比率)中的大部分抗体靶标。例如，结合指定抗体靶标的抗体通常与溶液中至少2/3的抗体靶标结合(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任意百分比)。本领域技术人员认可，根据确定结合的方法和/或阈值将产生一些变异性。
术语相对于抗体的“交联”是指将抗体连接于固体基质或半固体基质(例如，琼脂糖、珠子、培养板)，或者连接于另一种蛋白质或抗体。例如，抗体可多聚化以形成具有多个(大于2个)抗原结合位点的抗体复合物。可通过将抗体表达为高价同种型(例如，通常分别形成2个或5个抗体的复合物的IgA或IgM)来将抗体多聚化。抗体多聚化还可通过使用包含能够连接蛋白质的反应性基团的交联子(例如碳二亚胺、NHS酯等)来进行。用于使抗体与基质交联的方法和组合物例如在Abcam和New EnglandBiolab的产品目录和网址(abcam.com和neb.com可用)中有描述。具有多个反应基团的交联子化合物在例如Thermo Fisher Scientific的产品目录和网址(piercenet.com可用)中有描述。
如本文所用，当相比第一抗体不存在下的第二抗体与靶标的结合，第一抗体存在下的第二抗体与靶标的结合可检测地降低时，第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分“竞争”结合靶标。可选地，所述情况可为但不一定为，其中第二抗体存在下的第一抗体与靶标的结合也可检测地降低。换言之，第二抗体可抑制第一抗体与靶标的结合，而第一抗体无需抑制第二抗体与靶标的结合。然而，在每种抗体都可检测地抑制另一种抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论这种抑制是相同程度、更大程度或更小程度，即认为这两种抗体彼此“相互竞争”结合其各自的表位。竞争和相互竞争抗体都涵盖于本发明中。术语“竞争剂”抗体可适用于第一抗体或第二抗体，其可由本领域技术人员确定。在一些情况下，竞争剂抗体(例如第一抗体)的存在使第二抗体与靶标的结合降低至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％中的任意百分比或更高百分比，例如使得第一(竞争剂)抗体的存在下的第二抗体与靶标的结合检测不到。
术语“标记”、“可检测部分”和相似术语是指能够通过光谱学、光化学、生化、免疫化学、化学或其他物理学方法来检测的组合物。例如，可用的标记包括荧光染料、冷光剂、放射性同位素(例如，32P、3H)、高电子密度试剂、酶(例如，在ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或者其他能够使得可被检测到的实体，例如通过将放射性标记掺入与靶标分析物特异性反应的肽或抗体中。可使用任何本领域已知的用于将抗体与标记缀合的方法，例如使用Hermanson,BioconjugateTechniques 1996,Academic Press，Inc.,San Diego中描述的方法。术语“标签”可与术语“标记”同义使用，但一般是指基于亲和力的部分，例如用于纯化的“His标签”或与生物素相互作用的“链霉亲和素标签”。
“经标记”的分子(例如核酸、蛋白质或抗体)是通过连接子或化学键与标记共价结合的分子，或通过离子力、范德华力、静电力或氢键与标记非共价结合的分子，使得可通过检测结合于该分子的标记的存在来检测该分子的存在。
术语“差异化表达”或“差异化调控”一般是指在一个样品中比在至少另一个样品中过表达(上调)或低表达(下调)的蛋白质或核酸生物标记。在本公开内容的上下文中，该术语一般指相比正常、非癌细胞，癌细胞(例如AML细胞或AML CSC)上CLL-1的过表达。
例如，术语“过表达的”或“上调的”可互换地表示一般作为生物标记的蛋白质或核酸的转录或翻译可检测地比对照水平高。该术语包括由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)以及RNA和蛋白质稳定性而导致的过表达。可使用检测生物标记的常规技术来检测过表达，无论是mRNA(即，RT-PCR、杂交)或蛋白质(即，流式细胞术、成像、ELISA、免疫组化技术)。过表达可比正常细胞高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任意百分比或更高百分比。
术语“促效剂”、“活化剂”、“诱导剂”和相似术语是指相比对照能提高活性或表达的分子。促效剂是例如结合、刺激、提高、活化、增强活化、敏化或上调靶标活性的试剂。该表达或活性可比对照提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％中的任意百分比或更高百分比。在某些情况下，活化是对照的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍中的任意倍数或更高倍数。
术语“抑制剂”、“阻遏剂”或“拮抗剂”或“下调剂”可互换地表示相比对照能引起可检测的更低表达或活性水平的物质。该受抑制的表达或活性可为对照的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％中的任意百分比或更小。在某些情况下，抑制与对照之间的倍数为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍中的任意倍数或更高倍数。
“对照”样品或“对照”值是指为了比较测试样品而充当参照物的样品，通常是已知的参照物。例如，测试样品可采自测试条件(例如，在存在测试化合物的情况下)，并且与来自已知条件——例如，不存在测试化合物的情况下(阴性对照)或存在已知化合物的情况下(阳性对照)——的样品进行比较。在本公开内容的上下文中，阴性对照的实例为来自已知为健康(非癌症)个体的生物样品，并且阳性对照的实例为来自已知的AML患者的生物样品。对照还可表示由众多测试或结果收集的平均值或范围。本领域技术人员认可，可设计对照用于评估任何数量的参数。例如，对照可设计成比较基于药学数据(例如半衰期)或治疗性量度(例如，益处和/或副作用的比较)的治疗性益处。可设计对照用于体外应用。本领域技术人员将理解，在给定的情况下那些对照是有价值的，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果对照中给定参数的值存在广泛变异，则测试样品中的变异将不被视为具有显著性。
术语“诊断”是指对象患有诸如癌症等疾病的相对可能性。类似地，术语“预后”是指对象中某些未来的结果可能发生的相对可能性。例如，在本公开内容的上下文中，预后可指个体将发展癌症、具有复发的可能性，或者疾病可能的严重程度(例如，症状的严重程度、功能下降的比率、存活等)。如医学诊断学领域技术人员将理解的，该术语不意图绝对化。
本文所用的“组织活检样品”或“来自患者的生物样品”是指获自患有或疑似患有CLL-1相关疾病的患者的样品。所述样品还可为血液样品或血液级分，例如白细胞级分、血清或血浆。在一些实施方案中，所述样品可为组织活检样品，例如针吸活组织检查样品、细针吸活组织检查样品、手术组织活检样品等。所述样品可包括含有损伤或疑似损伤的组织样品，尽管所述生物样品还可来源于另一部位，例如疑似转移部位、淋巴结或来自血液。在一些情况下，生物样品还可来自损伤或疑似损伤旁边的区域。
“生物样品”可获自患者(例如组织活检)、获自动物(例如动物模型)或获自培养的细胞(例如从患者移除并在培养物中生长用于观察的细胞系或细胞)。生物样品包括组织和体液，例如血液、血液级分、淋巴、唾液、尿、粪便等。
术语“治疗”、“处理”和“改善”是指在症状严重程度方面的任何减轻。在治疗癌症(例如AML)的情况下，治疗可指例如，减小肿瘤大小、癌细胞数量、生长速率、转移活性、减少非癌细胞的细胞死亡、减轻恶心及其他化疗或放疗的副作用等。术语“治疗”和“预防”不意图作为绝对化的术语。治疗和预防可指发病的任何延迟、症状的改善、患者存活的改善、存活时间或存活率的增加等。治疗和预防可为完全的(肿瘤细胞处于检测不到的水平)或部分的，以使在患者中发现比不使用本发明的情况下将出现的肿瘤细胞更少的肿瘤细胞。可将治疗的效果与未接受治疗的个体或个体群进行比较，或与治疗前或治疗期间的不同时间的相同患者进行比较。在一些方面，与例如给药前的个体或与未进行治疗的对照个体相比，疾病的严重程度减轻至少10％。在一些方面，疾病的严重程度减轻至少25％、50％、75％、80％或90％，或在一些情况下，使用标准诊断技术再也检测不到。
术语“有效量”、“有效剂量”、“治疗有效量”等是指足以如上文所述改善疾病的治疗剂的量。例如，对于给定参数，治疗有效量将示出治疗效果至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％中任意百分比的升高或降低。治疗功效还可用“倍数”升高或降低来表示。例如，治疗有效量可比对照具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍中任意倍数或更高倍数的效果。
本文所用术语“药学可接受的”与生理学可接受的和药理学可接受的同义使用。药物组合物一般包含用于缓冲以及在储存期间保存的试剂，并且可根据给药途径包含适于递送的缓冲剂和载体。
在本文中，术语“剂量(dose)”和“用量(dosage)”可互换使用。剂量是指每次给药时向个体给予的活性成分的量。对于本发明，剂量可指抗体或相关组分的浓度，例如治疗剂的量或放射标记的剂量。剂量将根据一些因素而变化，包括给药频率；个体尺寸和耐受度；病况的严重程度；副作用的风险；给药途径；以及可检测部分(如果存在的话)的成像模式。本领域技术人员认可，可根据上述因素或基于治疗进展来改变剂量。术语“剂型”是指具体的药物形式，并且其依赖于给药途径。例如，剂型可为液体，例如注射用盐水溶液。
“对象”、“患者”、“个体”以及类似术语可互换使用，并且除非另有说明，否则都指哺乳动物，例如人和非人灵长类，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪以及其他哺乳动物物种。本术语并非一定指对象已被诊断出患有特定的疾病，而一般是指处于医疗监测下的个体。患者可为寻求治疗、监测、调节或改变现有治疗方案等的个体。“癌症患者”或“AML患者”可指已被诊断出患有癌症、目前正在接受治疗方案或处于复发风险(例如在通过手术去除肿瘤后)的个体。在一些实施方案中，癌症患者已被诊断出患有癌症，并且是治疗的候选者。癌症患者可包括未接受治疗、目前正在接受治疗、已经进行了手术的患者，以及已经中断了治疗的患者。
在治疗癌症的上下文中，需要治疗的对象可指患有癌症或癌前病况、患过癌症并处于复发的风险中、疑似患有癌症、正接受癌症标准治疗(例如放疗或化疗)等的个体。
“癌”、“肿瘤”、“转化的”以及类似术语包括癌前的、肿瘤性的、转化的和癌细胞，并且可指实体瘤或非实体瘤(参见例如，Edge等，AJCCCancer Staging Manual(第7版，2009)；Cibas and Ducatman Cytology:Diagnostic principles and clinical correlates(第3版，2009))。癌症包括良性肿瘤和恶性肿瘤(异常生长)。“转化”是指自发或诱导的表型变化，例如，细胞的不灭化、形态学变化、细胞生长异常、接触抑制和锚定降低，和/或恶性化(参见Freshney,Culture of Animal Cells a Manual of BasicTechnique(第3版，1994))。虽然转化可起因于转化型病毒的感染和新基因组DNA的掺入或外源DNA的摄取，但是其还可自发产生或在暴露于致癌物后产生。
术语“癌症”可指白血病、肿瘤、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、实体瘤和淋巴样癌症等。不同类型的癌症实例包括但不限于急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(即，肝癌(hepatocarcinoma))、肾癌(即，肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、肋膜癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胰腺癌、胆管癌、胃肠道类癌肿瘤、食管癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃(胃部)癌、中枢神经系统的癌症、皮肤癌、绒毛膜癌；头颈癌、骨原性肉瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和黑色素瘤。
“癌症靶标”或“癌症标记”是指在癌症中(例如在癌细胞上或在癌症环境中)差异化表达或加工的分子。示例性的癌症靶标有，细胞表面蛋白例如CLL-1(还有例如，细胞粘着分子和受体)；细胞内的受体、激素和分子，例如由细胞分泌至癌症环境中的蛋白酶。特定癌症的标记是本领域已知的，例如，AML的CD45、AML CSC的CD34+CD38-、结肠癌和结肠直肠癌上的MUC1表达、肺癌中的蛙皮素受体以及前列腺癌上的前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
在一些实施方案中，癌症靶标可与某些癌细胞类型相关，例如，AML、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、非小细胞肺癌细胞、前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌或卵巢癌。细胞类型特异性靶标在该细胞类型中的的表达水平通常是参照细胞群体中的至少2倍。在一些实施方案中，细胞类型特异性标记以其参照群体中的平均表达的3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或1000倍中任意倍数的水平存在。因此，可检测或测量该靶标以将目的细胞类型与其他细胞区分开来。例如，AML癌症靶标包括Ly86、LILRA1和CD180。
癌干细胞(CSC)是在肿瘤和血癌中发现的可产生组成癌块的细胞。CSC还可自我再生，与正常(非癌)干细胞相似。因此，CSC可通过转移至个体的非肿瘤组织中并起始“新”肿瘤来介导转移。CSC根据检测到的癌症阶段占任何指定癌症的非常小的百分比。例如，AML细胞样品中CSC的平均频率被认为是约1:10,000。造血CSC可鉴定为CD34+，这与正常造血干细胞(HSC)相似。
术语“使……内化”、“内化”、“内吞”、“内吞作用”、“吞噬”以及类似术语是指由细胞进行的物质摄取，例如，通过抗体(或受体)介导的内吞作用或吞噬作用来进行。实施例5中ADC测定的结果指示，当前公开的CLL-1抗体可被内化。
术语“进行移植”或“移植”是指在引入至个体或组织中后细胞存活、增殖和/或适当定位的能力。在癌症干细胞(CSC)的情况下，该术语可指CSC重新生成肿瘤或散布至不同部位的能力。该术语通常用于描述细胞群体在异种移植模型(例如人细胞在小鼠中的移植)中的存活和发挥功能的能力。造血细胞的移植可按照例如WO2006/047569中所描述的来确定。肿瘤细胞的移植可按照例如Beckhove等，(2003)Int.J.Cancer 105:444中所描述的来确定。
术语“核酸”是指单链形式或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，以及其互补物。术语“多核苷酸”是指核酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单一单元，即，单体。核苷酸可为天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或其合成版本或改造版本。本文涉及的多核苷酸的实施例包括单链DNA和双链DNA、单链RNA和双链RNA(包含siRNA)，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。
词语“互补”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一个核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A是互补的。互补可为部分的，其中仅一些核酸根据碱基配原则匹配；或者可为完全的，其中所有核酸都根据碱基配对原则匹配。
使用核酸杂交技术的多种特异性DNA和RNA测量方法是本领域技术人员已知的(参见Sambrook,Id.)。一些方法包括电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是DNA和RNA的测量也可在不进行电泳分离的情况下进行(例如，定量PCR、点印迹或阵列)。
词语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，表示氨基酸聚合物或一系列两个或更多个相互作用或键合的氨基酸聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物、包含经改造的残基的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸、经改造的氨基酸或合成氨基酸，以及与天然存在的氨基酸具有相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码子编码的氨基酸。经改造的氨基酸包括例如羟脯氨酸、γ-羟基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如其α碳原子与氢原子、羧基、氨基以及R基团结合，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫鎓。这样的类似物可具有经改造的R基团(例如正亮氨酸)或经改造的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的整体化学结构不同的结构，但是功能与天然存在的氨基酸相似的化合物。
本文可通过氨基酸的公知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的一字母符号来引用氨基酸。类似的，可通过核苷酸的普遍接受的单字母密码子来引用核苷酸。
“保守改造的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。针对特定的核酸序列，保守改造的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同或相关(例如天然连续的)的序列。由于遗传密码子的简并性，许多功能相同的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸——丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子确定的每个位置处，该密码子可改变为所述的相应密码子的另一个而不改变所编码的多肽。这样的核酸变体是“沉默变体”，其为保守改造变体的一种。本文中的每个编码多肽的核酸序列还都描述了该核酸的沉默变体。本领域技术人员认可，在某些情况下，可改造核酸中的每个密码子(通常作为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常作为色氨酸的唯一密码子的TGG除外)，以得到功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变体隐含在针对表达产物所描述的序列中，但是不隐含在针对实际的探针序列所描述的序列中。
对于氨基酸序列，本领域技术人员认可，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的单个替换、缺失或添加从而改变、添加或缺失所编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸是“保守改造变体”，其中该改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸所替换。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。这样的保守改造变体补充了并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下氨基酸对于彼此通常是保守替换的：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,Proteins(1984))。
在两种或更多种核酸或两种或更多种多肽的上下文中，术语“相同”或“百分比同一性”是指如通过使用BLAST或BLAST 2.0序列比对算法以默认参数或通过手动对齐并进行目测所测量的，相同的或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸(即，当在比较窗或指定区上针对最大一致性比较和对齐时，在特定区域上具有约60％同一性，例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％中的任意百分比或更高的百分比同一性)的两个或更多个序列或子序列。参见例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。这样的序列则被视为“基本相同的”。通常在经最佳对齐的序列上确定百分比同一性，以使该定义适用于具有缺失和/或添加的序列，并且适用于具有替换的那些序列。本领域通常使用的算法涵盖缺口等。一般而言，同一性存在于包含抗体表位或长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的序列的区域上，或存在于50至100个氨基酸或核苷酸长的区域上，或存在于引用序列的全长上。
当在涉及例如细胞、核酸、蛋白质或载体而使用时，术语“重组体”表示已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而改造的细胞、核酸、蛋白质或载体，或者表示细胞来源于经如此改造过的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)的细胞形式中发现的基因，或者表达本应异常表达、下调表达或根本不表达的天然基因。
在涉及多核苷酸或多肽时，术语“异源”表示多核苷酸或多肽包含天然下未发现彼此具有相同关系的两种或更多种子序列。例如，异源多核苷酸或多肽通常是以重组的方式产生的，并且具有来自不相关基因的两条或更多条序列排布成新的功能单位，例如启动子来自一个来源并且编码区来自另一个来源。类似地，异源蛋白表示蛋白质包含天然下未发现彼此具有相同关系的两种或更多种子序列
III.CLL-1相关疾病
当前描述的抗体可用于检测和治疗CLL-1相关的疾病，即，与相比标准对照(例如，正常的细胞、非疾病细胞、非癌细胞)中的CLL-1表达具有升高或降低的CLL-1细胞表面表达相关的疾病。在外周血和脾中，CLL-1表达通常限制于髓系细胞，例如树突状细胞、粒细胞和单核细胞。CLL-1水平的提高与癌症特别是造血CSC(例如LSC)以及骨髓增生性疾病有关，后者包括诸如AML(急性骨髓性白血病或骨髓增生性白血病)等白血病、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维变性、CMML(慢性骨髓单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性骨髓性白血病或骨髓增生性白血病)。参见Bakker等，(2004)Cancer Res.64:8443；VanRhenen等，(2007)Blood 110:2659-66；Zhao等，(2010)Haematologica(2010)95:71；Van Rhenen等，(2007)Leukemia 21:1700；以及Herrmann等，(2012)Haematologica 97:219。
可通过检测细胞表面标记的表达来表征AML细胞，并将其与其他细胞区分开来。除了是CLL-1+外，AML细胞还可为CD33+(虽然有些是CD33-)、CD45+和CDw52+。AML母细胞(包括LSC)通常是CD34+CD38-。HSC和LSC特征可为表达CD34，但是前者不表达CLL-1。MDS细胞特征可为表达CD5、CD7、CD13和CD34。CML细胞特征可为表达7-ADD、CD33、CD34和CD38。
骨髓增生异常综合征(MDS)包括一组关系紧密的形成血液的疾病，其中骨髓显示出提示白血病前期进展的质和量的变化，但是具有不一定最终发展为急性白血病的慢性过程。已经有包括白血病前期、顽固性贫血、顽固性骨髓造血异常性(dysmyelopoietic)贫血、潜袭型(smoldering)白血病或亚急性白血病、骨髓造血异常综合征(DMPS)和骨髓发育不良在内的众多术语被用于描述MDS。这些病况的特点都在于髓细胞成熟受损(骨髓发育不良)和血细胞数目减少。DMPS的特征是，存在巨类母细胞(megablastoid)、巨核细胞发育异常以及异常的母细胞数量增加，反应粒细胞成熟进展增强。患有DMPS的患者显示出与某些部分的受影响患者的急性骨髓性白血病和急性骨髓性白血病进展阶段中所发现的相似的染色体异常。
慢性骨髓增生性疾病是一些病症的集合，其特征是成熟的和未成熟的粒细胞、红细胞和血小板数目增加。慢性骨髓增生性疾病可转变为该组的其他形式，趋势是最终发展为急性骨髓性白血病。该组中的具体疾病包括真性红细胞增多症、慢性骨髓性白血病、不明原因的骨髓性白血病、特发性血小板增多症和慢性中性粒细胞性白血病。
骨髓纤维变性的特征是骨髓形成瘢痕，导致红细胞和白细胞以及血小板数量减少。骨髓纤维化瘢痕可由白血病引起，但是可具有其他原因，例如血小板增多症或药物不良作用。
IV.CLL-1抗体
本文提供了特异性结合人CLL-1的CLL-1抗体(即，CLL-1特异性抗体、抗CLL-1)，特别是表达CLL-1的胞外结构域的细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合包含C凝集素结构域外的组分的表位，从而使得所述抗体结合由C凝集素结构域组成的多肽的亲和力比其结合由CLL-1的C凝集素和茎结构域或CLL-1的胞外结构域组成的多肽的亲和力低。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合由CLL-1的C-凝集素结构域组成的多肽的亲和力为其结合由CLL-1的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的亲和力的至少5倍(例如，10倍、20倍、50倍、100倍中的任一倍数或更高倍数)。例如，命名为M26和M31的CLL-1抗体结合人CLL-1的101位至265位氨基酸的亲和力比其结合人CLL-1的141位至265位氨基酸(参照SEQ ID NO:2)的亲和力高。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合C凝集素结构域的Kd是全长CLL-1(或CLL-1的全长胞外结构域)的至少5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体具有对人CLL-1的亲和力，其Kd为1000pM或更小，例如800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM中的任意一项或更小。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体具有对人CLL-1的亲和力，其Kd为10nM或更小，例如1nM或更小、1nM至10nM、100pM至1000pM、10pM至1000pM、约1nM更小、1pM至500pM。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体还结合灵长类CLL-1，例如食蟹猴CLL-1，其Kd为10nM、1nM、500pM或更小。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合食蟹猴CLL-1，并且Kd为对于人CLL-1的Kd的量级。本领域技术人员认可，更小的Kd值指示更高的亲和力。
在一些实施方案中，所述CCL-1抗体结合较广范围的CLL-1糖基化变体。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合表达于AML细胞上的CLL-1形式(例如糖基化变体)。例如，当前描述的CLL-1抗体可结合AML细胞培养物(例如HL60、THP1和U937细胞系)中至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％中任意百分比或更高百分比的细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体可结合AML患者样品(例如来自AML患者的PBMC样品或组织活检样品)中至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％中任意百分比或更高百分比的细胞。本领域技术人员将理解，在这样的细胞结合测定中，添加合适浓度的抗体，例如以使得存在足够的抗体分子来结合培养物或样品中的众多细胞。
出人意料的是，本文描述的CLL-1抗体可在体外和体内抑制表达CLL-1的细胞的生长，即使在不含缀合的细胞毒性试剂的情况下亦如此。考虑到高百分比的与来自患者样品的AML细胞的结合，当前描述的抗体为AML患者以及患有CLL-1+MDS或CML的患者提供了有用的治疗选择。
本文描述的CLL-1抗体还显示了补体依赖性细胞毒性(CDC)活性(参见例如图1)和抗体-药物缀合物(ADC)活性(参见实施例5)。因此，这些CLL-1抗体还可用于例如在没有缀合细胞毒性试剂的情况下靶向表达CLL-1的细胞并进行破坏。
与先前表征的抗体相比，本文描述的CLL-1抗体具有独特的细胞结合活性。例如，当前描述的抗体结合以较高百分比存在于来自AML患者的原代细胞上的表位。这些抗体可用于检测展示被至少一种本文公开的CLL-1抗体以高亲和力靶向的表位的癌细胞。在一些实施方案中，这些癌细胞随后可被同样的CLL-1抗体靶向并进行破坏。这样的方法可包括治疗具有表达CLL-1的癌细胞的个体，包括向所述个体给予所述CLL-1抗体。
在一些实施方案中，本发明包括与选自以下的竞争剂抗体竞争结合CLL-1的CLL-1抗体：
·具有M26的CDR序列的抗体(参见实施例1、表3)
·具有M31的CDR序列的抗体；
·具有G4的CDR序列的抗体；
·具有M22的CDR序列的抗体；
·具有M29的CDR序列的抗体；
·具有M2的CDR序列的抗体；
·具有M5的CDR序列的抗体；以及
·具有G12的CDR序列的抗体。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与选自以下的抗体竞争结合CLL-1：
·包含与M26的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:4；Vl＝SEQ ID NO:6)基本相同(至少85％、90％、95％或98％的同一性)的可变区序列的抗体；
·包含与M31的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:8；Vl＝SEQ ID NO:10)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G4的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:12；Vl＝SEQ ID NO:14)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M22的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:16；Vl＝SEQ ID NO:18)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M29的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:20；Vl＝SEQ ID NO:22)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M2的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:24；Vl＝SEQ ID NO:26)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M5的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:28；Vl＝SEQ ID NO:30)基本相同的可变区序列的抗体；以及
·包含与G12的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:32；Vl＝SEQ ID NO:34)基本相同的可变区序列的抗体。在一些实施方案中，所述基本相同的抗体具有与初始抗体相同的重链和轻链CDR序列。
许多类型的竞争性结合测定是已知的，包括固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、三明治竞争性测定(参见Stahli等，Methods in Enzymology 9:242-253(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.137:3614-3619(1986))；固相直接标记测定；固相直接标记三明治测定(参见Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等，Molec.Immunol.25(1):7-15(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等，Virology176:546-552(1990))；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32:77-82(1990))。通常，这样的测定包括使用与固体表面或携带任意这些的细胞结合的纯化的抗原、未标记的测试免疫球蛋白以及经标记的参照免疫球蛋白。通过在测试免疫球蛋白的存在下确定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通过竞争性测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合至与参照抗体相同的表位的抗体，以及结合至离参照抗体所结合的表位足够近的相邻表位以发生位阻的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将抑制参照抗体与共同抗原至少50％或75％的结合。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体结合与选自以下的抗体相同的表位：
·具有M26的CDR序列的抗体(参见实施例1、表3)
·具有M31的CDR序列的抗体；
·具有G4的CDR序列的抗体；
·具有M22的CDR序列的抗体；
·具有M29的CDR序列的抗体；
·具有M2的CDR序列的抗体；
·具有M5的CDR序列的抗体；以及
·具有G12的CDR序列的抗体。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含相对于选自M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5和G12的抗体的CDR序列，具有多至1、2或3个氨基酸替换、添加或缺失/CDR的轻链CDR序列和重链CDR序列。在一些实施方案中，所述轻链CDR序列包含相对于上述CLL-1抗体的轻链CDR序列，具有多至1、2或3个氨基酸替换、添加或缺失/CDR的轻链CDR序列。在一些实施方案中，所述重链CDR序列包含相对于上述CLL-1抗体的重链CDR序列，具有多至1、2或3个氨基酸替换、添加或缺失/CDR的重链CDR序列。在一些实施方案中，替换、添加或缺失仅发生于总共6个CDR中的1、2、3、4或5个CDR。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体选自：
·具有M26的CDR序列的抗体(参见实施例1、表3)；
·具有M31的CDR序列的抗体；
·具有G4的CDR序列的抗体；
·具有M22的CDR序列的抗体；
·具有M29的CDR序列的抗体；
·具有M2的CDR序列的抗体；
·具有M5的CDR序列的抗体；以及
·具有G12的CDR序列的抗体。在一些实施方案中，与初始抗体CDR序列相比，所述CDR序列中的任意一个或多个包含1、2或3个保守氨基酸替换。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体选自：
·包含与M26的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:4；Vl＝SEQ ID NO:6)基本相同(至少85％、90％、95％或98％的同一性)的可变区序列的抗体；
·包含与M31的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:8；Vl＝SEQ ID NO:10)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与G4的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:12；Vl＝SEQ ID NO:14)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M22的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:16；Vl＝SEQ ID NO:18)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M29的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:20；Vl＝SEQ ID NO:22)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M2的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:24；Vl＝SEQ ID NO:26)基本相同的可变区序列的抗体；
·包含与M5的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:28；Vl＝SEQ ID NO:30)基本相同的可变区序列的抗体；以及
·包含与G12的可变区序列(Vh＝SEQ ID NO:32；Vl＝SEQ ID NO:34)基本相同的可变区序列的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体还具有选自以下的至少一种活性：
·以10nM或更小的Kd结合人CLL-1，例如1nM或更小、1nM至10nM、100pM至1000pM、10pM至1000pM、约1nM或更小、1pM至500pM等。
·在使用HL60细胞或来自AML患者的表达CLL-1的AML细胞的CDC测定中，200ng/ml或更小的EC50；
·在使用HL60细胞或来自AML患者的表达CLL-1的AML细胞的ADC测定中，100pM或更小的EC50；和
·与不存在所述抗体的情况下的细胞生长相比，表达CLL-1的细胞(例如，HL60、AML细胞)的细胞生长降低。
本文描述的抗体中的任意一种都可为嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是结合CLL-1的抗体片段，例如Fab。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体经可检测试剂标记，例如，如下文所述。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体连接至治疗剂，例如，如下文描述的化学治疗剂或细胞毒性试剂。
A.制备抗体的方法
对于当前描述的抗体如重组抗体、单克隆抗体或多克隆抗体的制备，可使用为本领域已知的许多技术(参见例如，Kohler和Milstein,Nature256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中的第77-96页,Alan R.Liss,Inc.(1985)；Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)；以及Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice(第2版，1986))。编码目的抗体的重链和轻链的基因可克隆自细胞，例如，编码单克隆抗体的基因可克隆自杂交瘤细胞并且用于生产重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库还可由杂交瘤细胞或浆细胞制成。重链和轻链基因产品的随机组合产生了具有不同抗原特异性的大抗体库(参见例如Kuby,Immunology(第3版，1997))。可对用于生产单链抗体或重组抗体的技术(美国专利4,946,778、美国专利第4,816,567号)进行调整以生产本发明多肽的抗体。此外，转基因小鼠或诸如其他哺乳动物的其他生物，可用于表达人源化抗体或人抗体(参见例如，美国专利第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016号，Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368:856-859(1994)；Morrison，Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。可选地，可使用噬菌体展示技术来鉴定抗体和特异性结合所选抗原的异聚性Fab片段(参见例如，McCafferty等，Nature 348:552-554(1990)；Marks等，Biotechnology10:779-783(1992))。还可将抗体制成双特异性的，即能够识别两种不同抗原(参见例如，WO 93/08829，Traunecker等，EMBO J.10:3655-3659(1991)；以及Suresh等，Methods in Enzymology 121:210(1986))。抗体还可为杂缀合物(heteroconjugate)，例如，两种共价连接的抗体或免疫毒素(参见例如，美国专利第4,676,980号、WO 91/00360；WO 92/200373；和EP 03089)。
还可使用任何数量的表达系统来生产抗体，包括原核表达系统和真核表达系统。在一些实施方案中，所述表达系统是哺乳动物细胞表达系统，例如杂交瘤或CHO细胞表达系统。许多这样的系统可广泛地获自供应商。在抗体包含VH和VL区的一些实施方案中，可使用单一载体来表达VH区和VL区，例如在二顺反子表达单元中或在不同启动子的控制下。在其他实施方案中，可使用分离的载体来表达VH区和VL区。本文描述的VH区或VL区可任选包含位于N端的甲硫氨酸。
本发明的抗体还可生成为多种形式，包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。所述抗体片段可通过多种方法得到，包括用酶消化完整的抗体，例如用胃蛋白酶(生成(Fab')2片段)或木瓜酶(生成Fab片段)；或从头合成。抗体片段还可使用重组DNA方法来合成。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体包含特异性结合CLL-1的F(ab')2片段。本发明的抗体还可包含人恒定区。参见例如，Fundamental Immunology(Paul ed.，第4版，1999)；Bird等，Science 242:423(1988)；以及Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879(1988)。
用于人源化非人抗体(即使用来自非人抗体的CDR)的方法也为本领域已知。一般而言，人源化抗体具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为引入(import)残基，其通常取自引入可变结构域。人源化基本上可根据Winter及其同事的以下方法来进行(参见例如，Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988)以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，通过将啮齿类CDR或CDR序列替换为相应的人抗体序列。这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中来自非人物种的相应序列的替换显著小于完整的人可变结构域。事实上，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被来自啮齿类抗体的类似位点的残基替换。
在一些情况下，抗体或抗体片段可与另一个分子缀合，例如聚乙二醇(PEG化)或血清白蛋白，以提供延长的体内半衰期。抗体片段的PEG化实例在以下文献中有提供：Knight等，Platelets 15:409,2004(阿昔单抗)；Pedley等，Br.J.Cancer 70:1126,1994(抗CEA抗体)；Chapman等，NatureBiotech.17:780,1999；以及Humphreys等，Protein Eng.Des.20:227,2007)。还可对所述抗体或抗体片段进行标记或与下文描述的治疗剂缀合。
B.结合亲和力
结合的特异性可根据相比关于抗体与环境中其他物质或整体不相关分子的解离常数，抗体(或其他靶向部分)对靶标的比较性解离常数(Kd)来定义。一般而言，抗体针对不相关物质的Kd将为其针对靶标的Kd的至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍或更高倍。
抗体期望的亲和力——例如，高(pM至低nM)、中(低nM至100nM)或低(约100nM或更高)——可根据其是否被用作诊断剂或治疗剂而存在差异。不受理论的限制，在一个实例中，具有中亲和力的抗体可比具有高亲和力的抗体更成功地定位肿瘤。因此，具有不同亲和力的抗体可用于诊断用途和治疗用途。
靶向部分通常以小于约1000nM的Kd结合，例如小于250nM、100nM、50nM、20nM或更小的nM。在一些实施方案中，亲和试剂的Kd小于15nM、10nM、5nM或1nM。在一些实施方案中，所述Kd为1nM至100nM、0.1nM至50nM、0.1nM至10nM或1nM至20nM。离解常数(Kd)的值可通过公知方法来确定，并且可通过例如在Caceci等，Byte(1984)9:340-362中公开的方法来计算甚至复杂混合物的Kd值。
抗体或任何靶向试剂对靶标的亲和力可根据本领域已知的方法来确定，例如，如Ernst等，Determination of Equilibrium Dissociation Constants,Therapeutic Monoclonal Antibodies(Wiley和Sons ed.，2009)中综述的。
可使用定量ELISA和类似的基于阵列的亲和方法。ELISA(酶联免疫吸附信号转导测定)是基于抗体的方法。在一些情况下，使对目的靶标具有特异性的抗体贴附于基质上，并使其与疑似包含靶标的样品接触。然后洗涤该表面以去除未结合的物质。靶标结合可以多种方式来检测，例如，使用具有经标记抗体的第二步骤、直接标记靶标或用在抗原结合后可检测的标记来标记第一抗体。在一些情况下，使抗原贴附于基质(例如，使用对蛋白质具有高亲和力的基质，或链霉亲和素-生物素相互作用)，并使用经标记的抗体(或其他靶向部分)对其进行检测。已经开发了原始ELISA法的一些替换方法，并且这些方法是本领域已知的(其综述参见Lequin(2005)Clin.Chem.51:2415-18)。
Kd、Kon和Koff也可通过使用表面等离子共振(SPR)来确定，例如，通过使用Biacore T100系统来测量。SPR技术在Hahnfeld等，Determinationof Kinetic Data Using SPR Biosensors,Molecular Diagnosis of InfectiousDiseases(2004)中有综述。在典型的SPR实验中，将一种相互作用试剂(靶标或靶向试剂)固定于流式细胞仪中的具有SPR活性的金包被的玻璃片上，并引入包含另一种相互作用试剂的样品，使其流过表面。当将指定频率的光照射在该表面上时，金的光学反射率的变化指示结合以及结合的动力学。
结合亲和力还可通过将生物素化的相互作用试剂锚定于链霉亲和素(SA)传感器芯片来确定。然后使另一种相互作用试剂与芯片接触，并对其进行检测，例如Abdessamad等，(2002)Nuc.Acids Res.30:e45中所描述的。
C.确定CLL-1表位
可使用用于表位作图的已知技术来对结合CLL-1的抗体的位点进行作图。本领域技术人员将理解，用于表位作图的方法可根据抗原而不同，例如，当其表达于细胞中时，第一多肽序列的翻译后修饰，以及不同细胞上或不同环境中抗原结构之间的差异。
CLL-1是具有约200个胞外氨基酸的跨膜蛋白。胞外结构域被糖基化，并且包含C凝集素结构域。可通过改变CLL-1的初级序列或糖基化状态，并且比较CLL-1抗体与不同CLL-1变体的亲和力来确定或部分确定CLL-1抗体的表位。
这样的表位作图可在体外进行，例如，通过筛选噬菌体展示文库或合成肽文库，例如使用珠子或其他固体基质。线性表位通常为约六个氨基酸，但是这可稍微变化。为了模拟蛋白质中存在的线性表位，可制得序列所对应的合成肽。在一些实施方案中，在N端和/或C端延伸该序列，以提供处于蛋白质侧翼序列中的额外的氨基酸残基。这可更接近地模拟表位的初级结构，并且一定程度地模拟表位的二级结构环境。此外，包含但不限于一个或多个甘氨酸或γ氨基丁酸的残基可附加于任一末端以提供间隔子，从而使其与例如用于免疫测定的固相的空间相互作用最小化。常常改变间隔子的长度以根据经验确定最佳结构。
由于表位的可变性质以及因侧翼序列导致的潜在影响，在一些实施方案中，可使用通过以一定数量的残基延伸N端或C端而使得长度发生变化的肽。另一种方法利用重复肽表位，或用介入的间隔子残基改变表位。这些肽的长度一般根据期望的重复单元数而不等。
一种用于表位作图的方法是合成例如20个残基长度的重叠肽，其具有覆盖CLL-1胞外区的初级序列的六个残基。如果使用这样的肽筛选来对表位进行作图，则可改造肽从而克服与免疫测定中所使用的固相载体的不期望的相互作用。一种方法是用亲水残基替换肽中的疏水残基，以降低疏水相互作用或使其最小化，并且提高肽的可触及性。类似地，可用不带电的残基替换带电的肽残基，以消除与固相的离子相互作用。还可通过添加多种结构的间隔子基团将肽表位置于离固相较远的位置并使位阻最小化，来对肽进行修饰。
可合成肽来反映在天然蛋白质上或靶标细胞上的天然蛋白质上存在的翻译后修饰。修饰包括但不限于在蛋白质的特定位点进行糖基化和磷酸化。
另一种用于确定表位的方法是在细胞中表达CLL-1变体，并比较不同变体之间的CLL-1抗体亲和力。可按肽研究中所描述的来设计CLL-1变体。此外，可替换糖基化的残基(例如，天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)以确定表位是否包含糖基化位点。类似地，可替换磷酸化的残基(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。
还可通过比较不同类型的表达CLL-1的细胞的抗体亲和力来确定或部分确定表位。例如，可确定并比较以下细胞的抗体亲和力：原代AML细胞，例如AML母细胞和移植的AML肿瘤细胞；AML细胞系；其他非癌性骨髓细胞等。
D.CDC、ADCC和ADC测定
当前描述的抗体对表达CLL-1的细胞的细胞依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体药物缀合物细胞毒性(ADC)是有效的。表达CLL-1的示例性细胞包括表达异源、重组CLL-1(例如人CLL-1)的细胞系；人AML细胞系，例如HL60、THP1、TF1-α、U937和OCI AML-5(前四个可获自ATCC)；来自一个或多个AML患者的原代细胞(例如PBMC细胞或移植肿瘤细胞)；人CML细胞系，例如K562和KU812(可获自ATCC)；以及来自一名或多名CML患者或MDS患者的原代细胞。
如果抗体造成表达该抗体靶标的细胞受到补体依赖性杀伤，则该抗体被视为具有CDC活性并介导CDC。CDC测定是本领域已知的，并且在例如Gazzano-Santoro等，(1997)J.Immunol.Methods 202:163；Idusogie等，(2000)J.Immunol.164:4178；以及下文的实施例6中有描述。CDC试剂盒和服务是市售的，例如可购自和Cell Technology Inc。
简言之，该测定通常在体外进行，并且包括使抗体结合于在其表面上表达该抗体靶标的细胞。添加包括结合至抗体Ch区的C1q在内的补体成分。然后补体成分相互作用以杀死靶标细胞。在一般4小时至24小时的孵育时间后，测量CDC，例如通过确定已知存在于靶标细胞中的胞内酶或颗粒的释放、通过比较起始靶标细胞群体和终止靶标细胞群体等来测量。
如果抗体导致结合抗体的细胞(例如表达CLL-1的细胞)受到效应细胞的杀伤，则该抗体被视为具有ADCC活性并介导ADCC。效应细胞通常是自然杀伤细胞，但也可为巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。也开发了基因改造的效应细胞系用于ADCC测定(参见例如，Schnueriger等，(2011)Mol.Immunol.48:1512)。ADCC测定是本领域已知的，并且在例如Perussia和Loza(2000)Methods in Mol.Biol.121:179；Bretaudeau和Bonnaudet(2011)BMC Proceedings 5(Suppl 8):P63；以及下文的实施例12中有描述。ADCC试剂盒和服务是市售的，例如可购自和
简言之，该测定通常在体外进行，并且包括使抗体结合于在其表面上表达该抗体靶标的细胞。添加效应细胞，其通常通过Fc受体如CD16来识别结合抗体的细胞。效应细胞通过例如释放引起凋亡的细胞毒素来杀伤结合抗体的细胞。通过释放靶细胞中的可检测元素(例如Cr51)或通过检测细胞介导的毒性中涉及的元素(例如效应细胞中NFAT信号转导的活化)来检测细胞死亡。
如果在与细胞毒性试剂(药物)缀合时，抗体导致表达该抗体的靶标(在本案中为CLL-1)的细胞被杀伤(抑制存活)，则该抗体被视为具有抗体-药物缀合物(ADC)活性(或介导ADC)。合适的细胞毒性试剂是本领域已知的，例如，皂草素、多柔比星、道诺霉素、长春花生物碱(vinca-alkaloid)、紫杉烷类、微管蛋白试剂(例如美登素、阿里他汀(auristatin))和DNA试剂(例如，加利车霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯苯并二吖庚因二聚体)等。ADC测定是本领域已知的，例如在Gerber等，(2009)3:247以及下文的实施例中所描述的。
E.内化
本文描述的CLL-1抗体可内化至包括CLL-1AML细胞在内的表达CLL-1的细胞中。即，表达CLL-1的细胞可内化本文描述的抗体。本文描述的CLL-1抗体提供了用于靶向这样的细胞的有效方式，例如使用可检测缀合物或细胞毒性缀合物。
可通过使用本领域已知的方法来评价抗体的内化百分比和内化率，包括例如流式细胞术(FACS)和共聚焦荧光显微镜。这样的方法在例如Lue等，(2007)Nature Protocols(Nature Med.13:587-96)；Cho等，(2010)Biomacromolecules以及Corbani等(2004)Endocrinology 145:2876-85中有描述，并且如本文中所描述。
对于FACS和共聚焦显微镜，用荧光标记的靶向试剂(例如抗体)来孵育细胞。通常选择细胞来表达经标记抗体的靶标(例如CLL-1)。然后，可使用不表达该靶标的对照细胞。内化通常发生于37℃，但不发生于4℃，这提供了该反应的另一个对照。因此，可使细胞与经标记的试剂接触并在37℃或4℃下孵育(例如，以检测未进行内化的结合)。
通过洗涤细胞来去除未结合的试剂或表面结合的试剂，例如，在酸洗液中洗涤，然后用正常pH的缓冲剂洗涤。
如果使用粘附细胞，则在进行流式细胞术之前从基质移除细胞。荧光细胞的百分比指示经荧光标记的试剂的内化百分比。内化百分比还可表示为例如添加至细胞中的初始标记试剂的百分比。
试剂的内化还可通过使用共聚焦显微镜定位荧光标记的试剂来确定。使用共聚焦显微镜的方法在例如Xiao等，(2008)Chem.Eur.J.,14:1769-1775中有描述。简言之，如上文所述，使细胞与经标记的试剂接触并孵育。在孵育后，可将细胞孵育于冰上，于4℃下在PBS缓冲剂中洗涤，用0.25％的胰蛋白酶处理(如果适用，以除去基质)。然后可将细胞悬液施加于玻片上用于共聚焦荧光显微镜检测。合适的共聚焦显微镜包括FV500-IX81共聚焦显微镜(Olympus America Inc.；Center Valley,PA)和Eclipse Ti-E(Nikon Instruments Inc.；Melville,NY)。
V.诊断应用
本文描述的CLL-1抗体特异性结合表达CLL-1的细胞。因此，CLL-1抗体可用于体外和体内诊断测定，以检测表达CLL-1的细胞(例如AML细胞和AML CSC)。例如，样品(例如血液样品或组织活检样品)可获自患者，并将其与CLL-1抗体接触，并且，可通过检测抗体结合来确定患者样品中表达CLL-1的细胞的存在。可直接(例如，当抗体本身被标记时)检测或通过使用第二检测试剂如第二抗体来检测抗体结合。可检测标记可与本发明的抗体直接相关或间接相关，例如通过螯合剂或连接子。
在一些实施方案中，将CLL-1抗体与来自患有或疑似患有CLL-1相关疾病的个体的生物样品接触，并确定抗体与样品中的细胞的结合，其中比正常抗体结合更高或更低指示该个体患有CLL-1相关疾病。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品或血液级分(例如，血清、血浆、血小板、红细胞、白细胞、PBMC)。在一些实施方案中，所述生物样品是组织样品(组织活检)，例如来自疑似肿瘤部位，或来自已知受到影响的组织，以例如确定已知肿瘤的边界。
通常进行组织活检以得到来自组织的样品，即，非流体细胞类型。所使用的组织活检技术将依赖于待评价的组织类型(例如，乳腺、皮肤、结肠、前列腺、肾、肺、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、气道或肺)。在癌症的情况下，该技术还取决于肿瘤的大小和类型(例如，实体的、悬浮的或血液的)以及其他因素。代表性的组织活检技术包括但不限于切除活组织检查、切口活组织检查、针吸活组织检查、手术活组织检查和骨髓活组织检查。“切除活组织检查”是指去除整个肿瘤块，其边缘有小的环绕肿瘤的正常组织。“切口活组织检查”是指去除包含肿瘤截面直径的组织楔。通过内窥镜或荧光镜进行的诊断或预后可能需要对肿瘤块进行“粗针穿刺组织活检(core-needle biopsy)”，或需要进行“细针穿刺组织活检”，这一般得到来自肿瘤块内的细胞悬液。组织活检技术在例如Harrison’sPrinciples of Internal Medicine,Kasper等,eds.，第16版，2005,第70章，以及整个第V部分中有论述。
检测抗体结合至样品中细胞的任何方法都可用于当前的诊断测定。检测抗体结合的方法是本领域公知的，例如，流式细胞术、荧光显微镜、ELISA等。在一些实施方案中，所述方法包括制备用于确定步骤之前的检测的生物样品。例如，可从来自个体的样品的其余部分(例如，其他血液组分)分离出细胞的子群体(例如，白细胞、CD34+细胞、CD45+细胞等)，或可使组织中的细胞悬浮以便更容易检测。
在一些实施方案中，确定样品中表达CLL-1的细胞的百分比，并与对照进行比较，所述对照例如来自已知患有CLL-1相关疾病的个体或个体组的样品(阳性对照)，或来自已知没有患CLL-1相关疾病的个体或个体组的样品(正常、健康、非疾病或阴性对照)。在一些实施方案中，所述对照是对指定组织建立的CLL-1的标准表达范围。高于或低于表达CLL-1细胞的正常百分比，或者高于或低于表达水平，指示该个体患有CLL-1相关疾病。
在一些实施方案中，可向个体提供(给予)经标记的CLL-1抗体以确定对预期治疗的适应性。例如，可使用标记的抗体来检测病变区域中的CLL-1密度，其中该密度一般相对于非病变组织较高。标记的抗体还可指示病变区对治疗是可达到的。因此，可基于成像结果来选择用于治疗的患者。可使用标准的成像技术(例如，CT扫描、MRI、PET扫描等)来实现解剖学表征，例如确定癌症的准确边界。
在一些实施方案中，本文所述的经标记的CLL-1抗体还可与治疗性化合物结合，例如形成“治疗诊断性”组合物。例如，CLL-1抗体可连接(直接或间接)至可检测标记和治疗剂，例如，连接至细胞毒性试剂以杀伤表达CLL-1的癌细胞。在一些实施方案中，经标记的CLL-1抗体用于诊断和/或定位表达CLL-1的癌细胞，然后用单独的治疗性CLL-1特异性抗体来靶向表达CLL-1的癌细胞。在一些实施方案中，诊断性的CLL-1特异性抗体是不以高速率或百分比内化于表达CLL-1的细胞中的抗体。在一些实施方案中，治疗性CLL-1抗体以高速率或百分比内化于表达CLL-1的细胞中。
A.标记
包含CLL-1抗体的诊断试剂可包括本领域已知的任何诊断试剂，例如在以下文献中所提供的：Armstrong等，Diagnostic Imaging,第5版，Blackwell Publishing(2004)；Torchilin,V.P.,Ed.，Targeted Delivery ofImaging Agents,CRC Press(1995)；Vallabhajosula,S.,Molecular Imaging:Radiopharmaceuticals for PET and SPECT,Springer(2009)。可通过多种方法来检测诊断试剂，包括作为提供和/或增强可检测信号的试剂。可检测信号包括但不限于，γ发射信号、放射性信号、回波信号、光学信号、荧光信号、吸收信号、磁信号或断层摄影信号。用于对诊断试剂成像的技术可包括但不限于单光子发射计算机断层摄影(SPECT)、磁共振成像(MRI)、光学成像、正电子发射断层摄影(PET)、计算机断层摄影(CT)、x-射线成像、γ射线成像等。术语“可检测试剂”、“可检测部分”、“标记”、“成像试剂”和类似术语在本文中同义使用。
在一些实施方案中，所述标记可包括光学试剂，例如荧光剂、磷光剂、化学发光试剂等。许多试剂(例如，染料、探针、标记或指示剂)是本领域已知的，并且可用于本发明。(参见例如，Invitrogen,The Handbook—AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,第10版(2005))。荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子，或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于菁、酞菁、卟啉、吲哚菁、罗丹明、吩嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素、苯并卟啉、方酸菁(squaraine)、二吡咯嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮鎓(croconium)、吖啶酮、菲啶、罗丹明、吖啶、蒽醌、氧族吡喃鎓类似物、二氢卟酚、萘菁(naphthalocyanine)、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰菁、苯并吲哚羰菁和BODIPYTM衍生物。荧光染料在例如美国专利第4,452,720号、美国专利第5,227,487号和美国专利第5,543,295号中有描述。
所述标记也可为放射性同位素，例如，发射γ射线、正电子、β粒子和α粒子以及X射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在一些实施方案中，放射性试剂可包括111In-DTPA、99mTc(CO)3-DTPA、99mTc(CO)3-ENPy2、62/64/67Cu-TETA、99mTc(CO)3-IDA以及99mTc(CO)3三胺(环状或线性的)。在一些实施方案中，所述试剂可包括DOTA及其与111In、177Lu、153Sm、88/90Y、62/64/67Cu或67/68Ga的多种类似物。在一些实施方案中，可通过掺入与螯合剂连接的脂质(例如DTPA-脂质)来标记纳米颗粒，如在以下文献中所提供的：Phillips等，WileyInterdisciplinary Reviews:Nanomedicine and Nanobiotechnology,1(1):69-83(2008)；Torchilin,V.P.&Weissig,V.,Eds.Liposomes第2版:OxfordUniv.Press(2003)；Elbayoumi,T.A.&Torchilin,V.P.,Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging 33:1196–1205(2006)；Mougin-Degraef,M等，Int’l J.Pharmaceutics344:110-117(2007)。
在一些实施方案中，可将诊断试剂与第二结合配体或酶(酶标签)结合，其在与发色底物接触后生成有颜色的产物。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)氢过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。第二结合配体包括例如，如本领域已知的生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素化合物。
在一些实施方案中，如在下文中更详细描述的，还可将经标记的抗体与改进体内稳定性的组合物结合，例如PEG或纳米颗粒如脂质体。
B.标记方法
用于将可检测试剂和治疗剂缀合至抗体的技术是公知的(参见例如，Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy",Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(eds.),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等，"Antibodies For DrugDelivery"in Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等(eds.),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review"Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(eds.)，第475-506页(1985)；以及Thorpe等，"The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982))。
通常，抗体在不干扰结合至表位的区域连接至可检测部分。因此，在一些情况下，使可检测部分连接至恒定区，或可变区中CDR的外侧。本领域技术人员认可，可检测部分可定位于抗体上的其他地方，并且可检测部分的位置可相应调节。在一些实施方案中，在连接之前和之后对抗体与表位结合的能力进行比较，以确保该连接不过度地破坏结合。
在一些实施方案中，所述抗体可与附加的靶向部分结合。例如，可将结合靶分子或靶细胞上的不同位点的抗体片段、肽或适体与抗体缀合以优化靶标结合至例如癌细胞。
VI.治疗应用
可使用本文描述的CLL-1抗体来靶向表达CLL-1的细胞如AML细胞。针对AML细胞和CSC(例如AML CSC)评价CLL-1的表达。CLL-1不显著性地在正常CD34+造血干细胞(HSC)上表达，因此，可使用本CLL-1抗体来从HSC中区分CSC。识别与AML细胞相同的CLL-1表位，并因此能够普遍地结合AML细胞的高亲和力CLL-1抗体，是特别有价值的，因为AML具有非常高的复发率。如上文所述，包含CLL-1抗体的治疗组合物还可包含可检测标记以形成治疗诊断性组合物，例如用于检测和定位表达CLL-1的细胞，并监测治疗效果。
如本文所述，所述CLL-1抗体可抑制癌细胞生长(增殖和/或移植)并且因此可视为单独的化疗剂。以下公开内容提供了可连接至CLL-1抗体以对表达CLL-1的细胞产生额外作用的化疗试剂和细胞毒性试剂的实例。
化疗(抗癌)剂可为能够降低癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀伤癌细胞、降低转移、降低肿瘤血液供应等的任何试剂。因此，化疗试剂包括细胞毒性试剂。细胞毒性试剂包括但不限于皂草素、紫衫烷、长春花生物碱、蒽环霉素和铂基试剂。化疗试剂的种类包括但不限于烷基化试剂、抗代谢物例如甲氨蝶呤、植物生物碱例如长春新碱，和抗生素例如多柔比星，以及不落在特定类型中的众多药物例如羟基脲。由顺铂和奥沙利铂例示的铂基药物代表了化疗试剂的主要种类。这些药物结合DNA并干扰复制。由紫杉醇例示的紫杉烷类代表了化疗试剂的另一个主要种类。这些化合物通过干扰细胞骨架和纺锤体形成抑制细胞分裂，并从而阻止快速分裂的癌细胞的生长来发挥作用。其他化疗药物包括激素治疗。
可在同一组合物中或单独的组合物中组合多于一种治疗试剂。还可使治疗试剂与适于特定个体的其他治疗试剂组合。向癌症患者提供的常用的治疗试剂包括克服疼痛、恶心、贫血、感染、炎症和癌症患者通常经受的其他症状的药剂。
可使用多种已知的交联剂使抗体连接至治疗试剂、可检测试剂或纳米载体。用于多肽的共价连接或非共价连接的方法是本领域公知的。这样的方法可包括但不限于，使用化学交联剂、光活化的交联剂和/或双官能交联剂。用于交联分子的示例性方法在美国专利第5,603,872号和美国专利第5,401,511号中有公开。交联剂的非限制实例包括戊二醛、双官能环氧乙烷、乙二醇二缩水甘油醚、碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或二环己基碳二亚胺、双亚胺酯、二硝基苯、辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、二琥珀酰亚氨基酒石酸酯、二甲基-3,3'-二硫-双丙亚胺酯、叠氮乙二醛(azidoglyoxal)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯和4-(溴代氨乙基)-2-叠氮硝基苯。
在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与纳米载体结合。对于缀合至纳米载体(例如脂质体)的抗体，表面上将存在一定数量的抗体，即，以给定的表面密度存在。在一些实施方案中，所述纳米载体中的每个纳米载体将具有至少5个抗体，例如每个纳米载体至少10、30、40、50、75、100或更多个抗体。本领域技术人员将理解，表面密度表示平均范围，因为对于群体的所有成员，每个纳米载体的抗体数量将不会绝对一致。
纳米载体包括囊，例如脂质体和胶束，以及聚合纳米颗粒等。纳米载体可用于递送治疗试剂和诊断试剂，但是特别可用于遮挡用于治疗癌症的细胞毒性试剂。纳米载体可包括脂质(例如磷脂)、亲水性聚合物、疏水性聚合物、两性化合物、交联聚合物和聚合基质(参见例如WO2009/110939)。根据应用，纳米载体可设计成具有特定的大小、半衰期、贮藏寿命和泄漏率。
诸如抗体靶向的脂质体、聚合纳米颗粒或延长的贮藏期限的脂质体等纳米载体的制备在例如美国专利第6465188、7122202、7462603和7550441号中有描述。
在一些实施方案中，所述抗体连接至稳定性部分如PEG或脂质体或其他纳米载体。美国专利第4,732,863和7892554号以及Chattopadhyay等，(2010)Mol Pharm 7:2194描述了用于将选择的抗体连接至PEG、PEG衍生物和纳米颗粒(例如脂质体)的方法。包含磷脂酰-乙醇胺(PE)的脂质体可通过确立的如本文所述的方法来制备。PE的夹杂物提供了脂质体表面上用于连接的活性官能位点。
抗体缀合物还可配制成提供多于一种活性化合物，例如，另外的化疗试剂和细胞毒性试剂、细胞因子或生长抑制剂。所述活性成分还可制备为缓释制备物(例如固体疏水聚合物的半透性基质(例如，聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸)。在胶质药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米囊)中或在大乳液中，抗体和免疫缀合物可包埋于例如通过凝聚技术或界面聚合制备的纳米颗粒(分别例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基甲酰基)微囊)中。
本文描述的CLL-1抗体可单独或与细胞毒性试剂组合杀伤表达CLL-1的细胞。在一些实施方案中，治疗的方法包括向个体给予有效量的治疗性CLL-1抗体或CLL-1抗体缀合物，例如与治疗试剂连接的CLL-1抗体。在一些实施方案中，所述个体已被诊断出患有癌症，例如AML。在一些实施方案中，所述个体正在接受或已经接受了癌症治疗，例如手术、放疗或化疗。在一些实施方案中，所述个体已被诊断出患有癌症，但是癌症正在减轻。
在一些实施方案中，所述方法还包括监视个体的癌症进展。在一些实施方案中，基于个体的治疗进展来确定每次给予的CLL-1抗体或CLL-1抗体缀合物的剂量，例如，如果个体对治疗没有足够的响应，则给予更高的化疗剂量。
在一些实施方案中，本发明可包含抗体或抗体靶向的组合物以及生理学(即，药学)可接受的载体。术语“载体”是指用作诊断试剂或治疗试剂的稀释剂或载体的通常为惰性的物质。该术语还涵盖赋予组合物粘性性质的通常为惰性的物质。生理学可接受的载体可为液体，例如生理盐水、磷酸盐缓冲剂、标准的缓冲盐水(135mM至150mM NaCl)、水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、糖蛋白，以提供增强的稳定性(例如，白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)等。因为生理学可接受的载体部分地通过所给予的特定组合物以及通过用于给予组合物的特定方法来确定，所以存在大量适于本发明的药物组合物的制剂(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences,第17版，1989)。
本发明的组合物可通过常规方法、公知的消毒技术消毒，或可在无菌条件下生产。可包装水溶液以供使用，或在无菌条件下过滤并冻干，在给药前先将冻干的制备物与无菌水溶液组合。所述组合物可按需要包含药学可接受的辅料物质以接近生理学条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨酸单月桂酸酯以及三乙醇胺油酸酯。还可包含糖以用于稳定组合物，例如用于冻干的抗体组合物的稳定剂。
剂型可制备用于黏膜(例如，鼻的、舌下、阴道、口腔或直肠)、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌内或动脉内注射，大丸剂或输注)、经口或透皮给予至患者。剂型的实例包括但不限于：分散剂；栓剂；软膏；糊剂(膏剂)；贴剂；粉剂；敷料；霜剂；膏剂；溶液剂；贴片(patch)；气溶胶(例如鼻用喷雾剂或吸入剂)；凝胶剂；适于经口使用或黏膜给予至患者的液体剂型，包括混悬剂(例如，水性混悬剂或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水乳剂)、溶液剂和酏剂；适于肠胃外给药至患者的液体剂型；以及可重构以提供适于肠胃外给药至患者的无菌固体(例如，晶形固体或非晶形固体)。
可注射(例如静脉内)组合物可包含悬浮于可接受载体(例如水性载体)中的抗体或抗体靶向的组合物的溶液。可使用多种水性载体的任意一种，例如水、经缓冲的水、0.4％盐水、0.9％等渗盐水、0.3％甘氨酸、5％葡萄糖等，并且可包含用于增强的稳定性的糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常而言，将使用标准缓冲的盐水(135mM至150mM NaCl)。所述组合物可包含药学可接受的辅料物质以接近生理学条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨酸单月桂酸酯以及三乙醇胺油酸酯等。在一些实施方案中，所述抗体靶向的组合物可配制于用于静脉内给药的试剂盒中。
适于肠胃外给药的制剂，例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径给药的制剂，包括可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质的水性和非水性的等渗无菌注射溶液，以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性的无菌混悬剂。
药物制备物可以单位剂型形式来包装或制备。在这样的形式中，例如根据治疗试剂的剂量或抗体浓度，将制备物再分成包含合适量的有效组分的单位剂量。所述单位剂型可为包装的制备物，所述包装物包含处于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中的不连续量的制备物。所述组合物还可按需要包含其他相容的治疗试剂。
可通过使用任意合适的途径注射或输注来给予抗体(或抗体靶向的组合物)，包括但不限于静脉内、皮下、肌内或腹膜内途径。给予药物组合物的实例包括将抗体以10mg/ml储存于4℃的注射用无菌等渗的水性盐水溶液中，并在给予至患者之前将其稀释于100ml或200ml注射用的0.9％氯化钠中。通过经1小时过程的静脉内输注来给予0.2mg/kg至10mg/kg剂量的抗体。在其他实施方案中，通过经15分钟至2小时时段的静脉内输注来给予抗体。在其他实施方案中，给药方案是经皮下大丸剂注射。
选择抗体剂量以为患者提供有效治疗，并且抗体剂量范围为小于0.1mg/kg体重至约25mg/kg体重，或1mg至2g每名患者。在一些情况下，所述剂量范围为1mg/kg至100mg/kg，或约50mg/患者至8000mg/患者。可以合适的频率重复该剂量，所述频率范围根据抗体的药代动力学(例如，抗体在循环系统中的半衰期)和药效动力学响应(例如，抗体治疗效果的持续时间)，可为每天一次至每三个月一次。在一些实施方案中，体内半衰期为约7天至约25天，并且每周一次至每三个月一次重复抗体给药。
给药可为周期性的。根据给药途径，可以例如每1、3、5、7、10、14、21或28天或更长时间一次(例如，每2、3、4或6个月一次)来给予剂量。在一些情况下，给药更频繁，例如每天2次或3次。如本领域技术人员认可的，可监视患者以根据治疗进展和任何不良副作用来调节给药剂量和频率。
因此，在一些实施方案中，根据患者的进展来进行附加给药，例如在各次给药之间监视患者。例如，在第一次给药或第一轮给药后，可监视患者的肿瘤生长速率、复发(例如，在术后患者的情况下)或一般疾病相关症状，例如虚弱、疼痛、恶心等。
对于癌症的治疗，可以约0.001mg/kg至约1000mg/kg每天的初始剂量给予抗体或抗体靶向的组合物(例如，包含治疗试剂和/或诊断试剂)，并随着时间调整。可使用约0.01mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约200mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，约5mg/kg至约10mg/kg，或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。本文描述的体内异种移植结果指示，5mg至20mg抗体/kg体重的剂量对大幅降低肿瘤生长是有效的。
剂量根据患者的需求、所治疗病况的严重程度和所使用的靶向组合物而不等。例如，可考虑具体患者中诊断的癌症类型和阶段来根据经验确定剂量。在本发明的上下文中，给予至患者的剂量应足以在患者中随时间而引起有益的治疗响应。如有经验的医生认可的，剂量大小还根据将具体靶向组合物在具体患者中给药时所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。
应理解，本文中所描述的实例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且由此启发的多种改造和变化将提供给本领域技术人员，并且将包含于本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本文中，用于所有目的。
VII.实施例
A.实施例1：CLL-1抗体序列和结构的表征
使用人CLL-1在小鼠中生成了抗体。选择对CLL-1具有特异性的抗体，并将其克隆到杂交瘤中用于稳定产生单克隆抗体。克隆一些对CLL-1具有特异性的抗体，并表征其序列和抗体结构。这些数据在下表1至3中示出。在序列表中示出了重链和轻链可变区序列。
表1抗体结构
克隆 同种型 VH DH JH VK JK
M26 IgG2b VhJ558.b14 假D3 JH4 IGKV9-124*01 JK2
M31 IgG2a VhJ558.b14 DSP2.2 JH2 IGKV3-10*01 JK1
G4 IgG1 VHJ558 DSP2.2 JH4 IGKV10-96*01 JK1
M22 IgG2a IGHV1-61*01 DSP2.5 JH4 IGKV8-19*01 JK5
M29 IgG1 VhJ558.b14 DSP2.2 JH2 IGKV19-93*01 JK1
M2 IgG1 IGHV1-36*01 DSP2.9 JH4 IGKV9-124*01 JK2
M5 IgG2a 14-1-39 DQ52a.1 JH2 IGKV8-30*01 JK1
G12 IgG1 DFL16.3 JH1 IGKV3-10*01 JK2
表2J序列
克隆 J HC J LC
M26 CTRDDGYYGYAMDYW CLQYAIYPYTF
M31 CARPIYFDNDYFDYW CQQNNYDPWTF
G4 CARTDDYDDYTMDYW CQQGKTLLWTF
M22 CAIYYGNPSYYAMDYW CQNDYSYPFTF
M29 CARYYDYDYYFDYW CLQYDYLWTF
M2 CTRDDGYYDYAMDYW CLQYASYPYTF
M5 CTLTGRFDYW CQQYYSYRTF
G12 CARVYNWHFDVW CQQNNEDPYTF
J HC:SEQ ID NO:35-42(由上至下)
J HC:SEQ ID No:43-50
表3CDR序列
克隆 CDR H1 CDR H2 CDR H3 CDR L1 CDR L2 CDR L3
M26 GYTFTSYF INPYNDGS TRDDGYYGYAMDY QELSGY AAS LQYAIYPYT
M31 GYTFTSYV INPYNDGT ARPIYFDNDYFDY ESVDSYGNSF LAS QQNNYDPWT
G4 GYSFTGYT INPYNDGT ARTDDYDDYTMDY HDISNY YTS QQGKTLLWT
M22 GYTFTRYW IDPSDTET AIYYGNPSYYAMDY QNLLNSGNQKKY WAS QNDYSYPFT
M29 GYIFTSYV INPYNDGT ARYYDYDYYFDY QDINKY YTS LQYDYLWT
M2 GYTFTSYF INPYNDGT TRDDGYYDYAMDY QEISVY AAS LQYASYPYT
M5 GFNIKDDY IDPEKGDT TLTGRFDY QSLLYSSNQKNN WAS QQYYSYRT
G12 GYTFPSSN IYPGNGDT ARVYNWHFDV ESVDGYGDIF FAS QQNNEDPYT
CDR H1:SEQ ID NO:51-58
CDR H2:SEQ ID NO:59-66
CDR H3:SEQ ID NO:67-74
CDR L1:SEQ ID NO:75-82
CDR L2:SEQ ID NO:83-90
CDR L3:SEQ ID NO:91-98
B.实施例2：表位结合研究
对于某些克隆，进行了表位作图，并且比较了已知抗体结合CLL-1的位置。这些抗体包括Nuvelo/X1057(US20100285037)、Crucell/X357(美国专利第7741443号)和山羊抗CLL-1。下表4示出了总结。在293T细胞中表达了CLL-1或CLL-1的C凝集素结构域。使用未转染的293T细胞或用小鼠CLL-1转染的293T细胞作为对照。
表4：表位结合
克隆 293T 293T mCLL-1 293T hCLL-1 293T C凝集素结构域
M13 - - + +
M26 - - + -
M31 - - + -
X357 - - + +
X1057 - - + +
山羊抗CLL-1 - - + +
数据显示克隆M26和M31结合至人CLL-1，但是C凝集素结构域不足以显著性结合。
还测试了M26和M31抗体与食蟹猴CLL-1的结合。这些动物可用于临床研究，因此具有结合人抗体靶标的食蟹猴物种同源物的靶标特异性抗体是有用的。发现M26以高亲和力结合食蟹猴CLL-1。
使用ELISA进行了另外的食蟹猴CLL-1结合研究。结果在下表5中示出。
表5：食蟹猴CLL-1结合
克隆 相对结合
M26 ++++
M31 ++
G4 ++++
M2 +++
M5 +++
M13 -
M22 -
M29 +
M41 +
C.实施例3：亲和力测试
针对CLL-1抗体克隆进行了亲和力测试。简言之，将生物素化的CLL-1(25μg/ml)于22℃下加载于链霉亲和素传感器尖端2小时。使用全局1:1曲线拟合，在三种不同浓度(10μg/ml、30μg/ml和90μg/ml)下针对每种抗体生成Ab-Ag解离曲线。结果在下表6中示出。
表6：亲和力Kd(pM)
克隆 hCLL-1的亲和力
M26 214
M31 611
G4 53
M2 205
M5 553
M13 854
M22 388
M29 1480
M41 387
D11 436
E3 447
G2 4640
G6 1492
G8 980
G10 194
G12 70
G14 187
G16 2357
G23 543
G26 134
G30 241
D.实施例4：与AML细胞系和AML患者样品的结合
测试了CLL-1抗体与表达人CLL-1的重组293细胞以及两种AML细胞系HL60和OCI AML-5的结合。通过FACS检测的与抗体结合的活细胞百分比在下表7中示出。
表7：抗体与细胞系的结合(％)
克隆 293CLL-1 HL60 OCI AML-5
M26 99.9 91 92.7
M31 76 91 89.7
G4 83.2 83.2
M2 99.9 90.3 96.3
M5 1.1 1.7 2.3
M13 90 13.6 35.3
M22 97 37.2 57.6
M29 99.9 84.6 87.6
M41 99 95.2 87.1
B10 99.9 92 16
D11 82
E3 99.9 86 8
G2 99.9 10 88.8
G6 99.9 83.7
G8 98 65.5
G10 99.9 88.5
G12 99.9 88.3
G14 99.9 86.2
G16 56.4
G23 81.4
G26 99.9 92.3
G30 99.9 89.2
先前表征的CLL-1抗体通常以高的变异性结合原代AML细胞，这给广泛使用患者样品带来了问题。一些检测不到与来自某些患者的样品的结合。通过FACS测试了当前公开的抗体与来自AML患者的原代细胞的结合。研究了两组样品：第一组由6名患者组成，另一种由37人的较大群体组成。未测试每个抗体克隆与组中的每个样品的结合。结合结果在表8中示出。通过FACS还发现M26和M31与来自AML患者原代细胞样品中90％或更多的细胞结合。
表8：原代AML样品的结合
(测试患者样品的阳性/总数)
克隆 组1 组2
M26 6/6 32/37
M31 2/3 5/12
G4 2/2 4/6
M2 2/2
M5 1/6 0/20
M13 2/3 0/20
M22 3/5 1/35
M29 4/26
M41 6/6
B10 5/6
D11
E3 4/6 2/6
G2 1/2
G6 1/2
G8 2/2
G10 1/1 2/5
G12 2/2
G14 2/2
G16 2/2
G23 2/2
G26 2/2
G30 1/1
E.实施例5：抗体-药物缀合物(ADC)测定
对AML细胞系HL60和OCI AML-5以及表达CLL-1的重组293细胞进行抗体-药物缀合物(ADC)测定。简言之，于37℃下用多种浓度的皂草素缀合的抗体孵育细胞48小时至72小时。通过DHL比色测定确定EC50值，从而确定细胞生存力。
结果在下表9中示出。
表9：ADC测定
克隆 ADC EC50(pM)
M26 90.23
M31 34.28
G4 44.35
M2 20.95
M5 149.5
M29 91.39
B10 54.72
D11 15.85
E3 13.37
G2 28.23
G6 34.07
G10 27.94
G12 19.43
G26 34.86
G30 29.33
F.实施例6：补体依赖性细胞毒性(CDC)测定
对来自AML患者的原代细胞进行补体依赖性细胞毒性测定。于37℃在存在补体的情况下用多种浓度的CLL1抗体孵育原代AML细胞2小时。通过比色度Cellglow测定(Promega)确定细胞生存力。
图1示出了来自3个AML患者样品(A-C)的结果。CLL-1抗体克隆M26对这些细胞样品具有约10ng/mL至100ng/mL的EC50。表示AML样品#52的图1C还示出了克隆M31与E12(不相关mAb)和IgG对照相比的效果。
使用10μg/mL抗体进行的另一轮CDC测定的结果在表10中示出。
表10：CDC测定
克隆 CDC(％杀伤)
M26 17.18
M31 12.14
M5 17.87
M22 14.49
D11 18.52
该数据显示，CLL-1抗体克隆对原代AML患者样品具有显著的CDC活性。CLL-1抗体克隆在CLL-1抗原密度具有至少5倍差异的患者样品中是有效的。
G.实施例7：AML肿瘤生长的体内抑制
进行了两组体内效力研究。第一组是在小鼠中利用CLL-1阳性HL60AML人细胞系的皮下(SC)肿瘤移植和生长模型。第二组是利用CLL-1阳性OCI AML-5人AML细胞系的原位(骨髓、血液、脾和淋巴结)肿瘤移植和生长模型。
SC HL60研究按如下进行。在SC接种5×106或5×107HL60细胞前约24小时，以200μg/动物的剂量经腹膜内给予4种CLL-1抗体克隆(M5、M13、M26和M31)中的一种或IgG对照。将动物每周接受一次额外的抗体剂量，持续接下来的6周。在给予HL60细胞45天后终止研究。图2示出了各种CLL1抗体克隆(M5、M13、M26和M31)与对照相比的效力曲线。
按如下进行OCI AML-5细胞的原位研究。将免疫缺陷的小鼠分成5组，6只动物/组。在经静脉内接种5×106或5×107OCI AML-5细胞前约24小时，以200μg/动物的剂量经腹膜内给予4种CLL-1抗体克隆(M5、M13、M26和M31)中的一种或IgG对照。然后将动物每周接受两次额外的抗体剂量，持续接下来的2周。在给予OCI AML-5细胞4周后终止研究。图3示出了CLL-1抗体克隆降低了体内OCI AML-5细胞(经标记的hCD45+CSC-030+和AML CSC030+)的数量。
H.实施例8：在ADC测定中CLL-1抗体对AML干细胞具有特异性
在ADC测定中测定了与皂草素缀合的M26CLL-1抗体的特异性杀伤。将分离自人对象骨髓的原代患者AML细胞或正常CD34阳性造血干细胞接种至软琼脂集落形成测定中(100,000个细胞/板)。然后在CLL-1-皂草素毒素缀合的单克隆抗体克隆M26的存在下孵育细胞14天。如图4所示，CLL-1抗体–皂草素缀合物导致对AML干细胞的克隆生长的选择性、特异性抑制，而正常的HSC不受影响。阴性对照未处理或用不相关的IgG-皂草素缀合物处理。结果证实，缀合至细胞毒素的CLL-1抗体使AML细胞集落形成降低了约80％，同时不抑制HSC集落形成。该结果显示，当前公开的CLL-1抗体可安全地进行治疗性应用，以特异性靶向AML细胞上表达的CLL-1。
I.实施例9：人嵌合CLL-1抗体结合与小鼠CLL-1抗体克隆相似的人外周血单核细胞(PBMC)
将CLL-1抗体克隆M26、M31和G4的可变区(Fab)用于与来自人IgG1的恒定区(Fc)一起制备嵌合抗体。这些人嵌合抗体称为ChiM26、ChiM31和ChiG4(或Chi31G4)。为了测试人嵌合抗体与亲本小鼠抗体相比的特异性，将所述抗体用于染色不同的人PBMC群体。PBMC获自两名人供体，通过聚蔗糖(Ficoll)梯度分离，并合并。用3％人血清封闭约2×105个单核细胞，然后用对世系标记物CD89(粒细胞)、CD14(单核细胞和粒细胞)、CD3(淋巴样细胞)和CD19(B细胞)具有特异性的抗体进行染色。图5示出了活的门化的(live-gated)细胞的FACS结果。人嵌合CLL-1抗体染色与小鼠CLL-1抗体相同的骨髓世系群体。
J.实施例10：人嵌合CLL-1抗体结合与小鼠CLL-1抗体克隆相似的食蟹猴PBMC
为了测试人嵌合抗体与亲本小鼠抗体相比的特异性，将所述抗体用于染色不同的食蟹猴PBMC群体。PBMC获自三名供体，通过聚蔗糖梯度分离，并合并。用3％人血清封闭约2×105个单核细胞，然后用对世系标记物CD3(淋巴样细胞)、CD19(B细胞)、CD14(粒细胞)、CD14(单核细胞)和CD89(粒细胞)具有特异性的抗体进行染色。图6示出了活的门化的细胞的FACS结果。人嵌合CLL-1抗体染色与小鼠CLL-1抗体相同的骨髓世系群体。
K.实施例11：人嵌合CLL-1抗体具有体外抗体-药物缀合物活性
在体外针对表达CLL-1的293细胞，测试人嵌合CLL-1抗体内化和介导ADC的能力。使细胞与多种浓度的指定抗体接触。使用匹配性IgG同种型抗体，以用于阴性对照。以2:1的比率添加皂草素缀合的第二抗体(或)，并将细胞孵育72小时。向每个培养孔中添加Cell Titre-并混合5分钟至10分钟，并在冷光板读取计上进行检测。通过冷光信号确定细胞生存力。图7示出人嵌合CLL-1抗体(7B)具有几乎与小鼠CLL-1抗体克隆(7A)相同的ADC活性。
L.实施例12：人嵌合CLL-1抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性
针对表达CLL-1的293细胞，测定人嵌合CLL-1抗体ChiM26、ChiM31和ChiG4(Chi31G4)介导ADCC的能力。将靶细胞添加至96个圆底孔中，并用不同浓度的指定抗体和效应细胞于37℃孵育6小时。使用Promega ADCC Reporter检测有活力的细胞。结果在图8中示出。人IgG同种型对照没有可检测到的活性，而ChiM26、ChiM31和Chi31G4以ng/ml为单位的EC50分别确定为79、143和105。
M.实施例13：AML肿瘤生长的体内抑制
用小鼠和人嵌合CLL-1抗体进行了两组体内异种移植研究。两组研究都使用在第0天进行尾静脉注射人AML细胞前1天辐照了的NOD/SCID小鼠。两组研究都包括8次抗体注射，持续约3周的过程，然后检测骨髓细胞中的肿瘤生长。
在第一组研究中，将小鼠分成3组，每组6只小鼠：(1)人IgG同种型对照；(2)M26；以及(3)ChiM31。在第0天用3×106个HL60细胞注射小鼠。在第1、4、7、10、13、16、19和22天以200μg/小鼠来给予抗体。在第26天处死小鼠。结果在图9中示出。图9A示出，CLL-1抗体显著降低huCD45+CD33+AML细胞的百分比，并且图9B示出，CLL-1抗体显著降低huCD45+CLL-1+AML CSC的百分比。
在第二组研究中，将小鼠分成5组，每组6只小鼠：(1)人IgG同种型对照；(2)M26；(3)ChiM26；(4)ChiM31；以及(5)ChiG4。在第0天用5×106个OCI AML-5细胞注射小鼠。在第1、4、7、10、13、16、19和24天以200μg/小鼠来给予抗体。在第28天处死小鼠。结果在图10中示出。图10A示出，CLL-1抗体明显地消除了huCD45+CD33+AML细胞。如图10B所示，使用log10尺度来更好地解析结果。

Claims (22)

1.分离的抗体，其特异性结合人C型凝集素样分子1(CLL-1)的胞外结构域，其中所述抗体结合由人CLL-1的C-凝集素结构域组成的多肽的Kd为其结合由人CLL-1的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5倍。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体以1000pM或更小的Kd结合人CLL-1或食蟹猴CLL-1。
3.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体结合来自患有急性骨髓性白血病(AML)个体的AML细胞样品中至少50％的细胞。
4.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体结合静止期的表达CLL-1的细胞。
5.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体选自：
包含重链互补决定区(CDR)SEQ ID NO:51、59和67的和轻链CDR SEQ ID NO:75、83和91的抗体；
包含重链CDR SEQ ID NO:52、60和68和轻链CDR SEQ ID NO:76、84和92的抗体；以及
包含重链CDR SEQ ID NO:53、61和69和轻链CDR SEQ ID NO:77、85和93的抗体。
6.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体为人源化的。
7.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体是Fv抗体片段。
8.如权利要求1所述的分离的抗体，其与治疗性化合物缀合。
9.如权利要求1所述的分离的抗体，其与可检测的部分缀合。
10.确定细胞是否表达C型凝集素样分子1(CLL-1)的方法，其包括：
将权利要求9所述的抗体与所述细胞接触；以及
检测所述抗体与所述细胞的结合，其中所述抗体与所述细胞的结合指示所述细胞表达CLL-1；以及
确定所述细胞是否表达CLL-1。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞处于来自个体的包含造血细胞的生物样品中。
12.如权利要求10所述的方法，其还包括确定所述细胞是否表达CD34或CD38。
13.抑制表达C型凝集素样分子1(CLL-1)的细胞的存活的方法，其包括：
将权利要求1所述的抗体与所述细胞接触，
从而抑制所述细胞的存活。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述接触包括向个体给予所述抗体，并且所述细胞处于所述个体中。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述个体已经被诊断出患有骨髓增生性疾病。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述骨髓增生性疾病选自：急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。
17.包含权利要求1所述的分离的抗体和药学可接受的载体的药物组合物。
18.治疗个体骨髓增生性疾病的方法，其包括：
向所述个体给予权利要求17所述的药物组合物，
从而治疗所述个体的AML。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述抗体与治疗性化合物缀合。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述个体已经被诊断出患有骨髓增生性疾病或已经经历过针对骨髓增生性疾病的治疗。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述骨髓增生性疾病选自：急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。
22.与人C型凝集素样分子1(CLL-1)结合的分离的抗体，所述抗体选自：
包含重链互补决定区(CDR)SEQ ID NO:51、59和67和轻链CDRSEQ ID NO:75、83和91的抗体；
包含重链CDR SEQ ID NO:52、60和68和轻链CDR SEQ ID NO:76、84和92的抗体；以及
包含重链CDR SEQ ID NO:53、61和69和轻链CDR SEQ ID NO:77、85和93的抗体。
CN201380035351.XA 2012-05-07 2013-05-06 Cll-1特异性的抗体 Active CN104736562B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261643739P 2012-05-07 2012-05-07
US61/643,739 2012-05-07
US201261699134P 2012-09-10 2012-09-10
US61/699,134 2012-09-10
US13/794,525 2013-03-11
US13/794,525 US9163090B2 (en) 2012-05-07 2013-03-11 Antibodies specific for CLL-1
PCT/US2013/039645 WO2013169625A1 (en) 2012-05-07 2013-05-06 Antibodies specific for cll-1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104736562A true CN104736562A (zh) 2015-06-24
CN104736562B CN104736562B (zh) 2018-05-01

Family

ID=49512686

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380035351.XA Active CN104736562B (zh) 2012-05-07 2013-05-06 Cll-1特异性的抗体

Country Status (11)

Country Link
US (3) US9163090B2 (zh)
EP (1) EP2847222B1 (zh)
JP (1) JP6262724B2 (zh)
KR (1) KR20150023355A (zh)
CN (1) CN104736562B (zh)
AU (1) AU2013259850B2 (zh)
BR (1) BR112014027659A2 (zh)
CA (1) CA2872513A1 (zh)
ES (1) ES2699244T3 (zh)
IL (1) IL235397B (zh)
WO (1) WO2013169625A1 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108290955A (zh) * 2015-11-24 2018-07-17 塞勒兰特治疗公司 人源化抗-cll-1抗体
CN109641008A (zh) * 2016-04-01 2019-04-16 凯德药业股份有限公司 嵌合受体及其方法和用途
CN110036028A (zh) * 2016-10-16 2019-07-19 塞勒兰特治疗公司 抗il1-rap抗体
WO2020083406A1 (zh) 2018-10-26 2020-04-30 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cll1的抗体及其应用
CN111432832A (zh) * 2017-09-14 2020-07-17 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和c-型凝集素样分子-1(cll-1)的蛋白质
CN113507937A (zh) * 2018-11-30 2021-10-15 艾丽塔生物治疗剂公司 针对cll-1的单结构域抗体
CN113980134A (zh) * 2020-12-11 2022-01-28 广州百暨基因科技有限公司 抗cll1抗体及其应用
CN114641503A (zh) * 2019-09-13 2022-06-17 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 抗cd371抗体及其用途

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9163090B2 (en) * 2012-05-07 2015-10-20 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies specific for CLL-1
EP3572425A1 (en) 2013-12-17 2019-11-27 AIMM Therapeutics B.V. Means and methods for counteracting myeloproliferative or lymphoproliferative disorders
JP6405103B2 (ja) * 2014-03-18 2018-10-17 日本製粉株式会社 ソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体
RU2741120C2 (ru) 2014-07-21 2021-01-22 Новартис Аг Лечение рака с использованием химерного антигенного рецептора cll-1
CA2958479A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
EP3250606B1 (en) * 2015-01-26 2020-11-25 Cellectis Anti-cll1 specific single-chain chimeric antigen receptors (sccars) for cancer immunotherapy
MX2017015380A (es) 2015-05-29 2018-03-28 Amphivena Therapeutics Inc Metodos para utilizar proteinas de enlace biespecificas cd3 y cd33.
TW201718647A (zh) * 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
AU2016293606A1 (en) * 2015-07-16 2018-02-08 Cellerant Therapeutics, Inc. Cysteine-substituted immunoglobulins
KR102584280B1 (ko) 2016-04-01 2023-10-04 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 및 t 세포 수용체 및 사용 방법
AU2017240150C1 (en) 2016-04-01 2022-10-27 Kite Pharma, Inc. BCMA binding molecules and methods of use thereof
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
WO2018148445A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Adimab, Llc Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
KR20240060739A (ko) 2017-02-20 2024-05-08 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Her2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
EP3694553A4 (en) * 2017-10-12 2021-08-11 Amphivena Therapeutics, Inc. CD3 BINDING PROTEIN DOSAGE SCHEDULE
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
CN112203725A (zh) 2018-06-13 2021-01-08 诺华股份有限公司 Bcma嵌合抗原受体及其用途
GB201813178D0 (en) 2018-08-13 2018-09-26 Autolus Ltd Cell
AU2019337759A1 (en) * 2018-09-10 2021-03-11 Legend Biotech Ireland Limited Single-domain antibodies against CD33 and constructs thereof
KR102191896B1 (ko) * 2019-03-14 2020-12-17 주식회사 메디안디노스틱 구제역 바이러스 혈청형 o 진천주의 구조단백질에 대한 항체 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도
WO2020205579A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 University Of Southern California Genetically modified exosomes for immune modulation
EP4048696A1 (en) * 2019-10-23 2022-08-31 Kite Pharma, Inc. Anti-idiotypic antigen binding molecules and methods of use thereof
US20230014398A1 (en) * 2019-11-18 2023-01-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-b7-h3 monoclonal antibody and methods of use thereof
US20220119534A1 (en) * 2020-05-06 2022-04-21 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and clec12a
JP2023524997A (ja) * 2020-05-06 2023-06-14 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｌｅｃ１２ａを標的とする抗体及びその使用
EP4251652A1 (en) * 2020-11-27 2023-10-04 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Cldn18.2 antibody and use thereof
KR102393776B1 (ko) * 2020-12-30 2022-05-04 (주)이노베이션바이오 Cd22에 특이적인 인간화 항체 및 이를 이용한 키메라 항원 수용체
EP4023408B1 (de) * 2021-01-05 2023-08-02 Promix Solutions AG Verfahren zur herstellung eines geschäumten extrudats
TW202346333A (zh) * 2022-03-18 2023-12-01 美商長典生物晶片股份有限公司 抗豬繁殖與呼吸道綜合症病毒的抗體及其用途
WO2023201238A1 (en) * 2022-04-11 2023-10-19 Vor Biopharma Inc. Binding agents and methods of use thereof
GB202209920D0 (en) 2022-07-06 2022-08-17 Autolus Ltd Cell
GB202214132D0 (en) 2022-09-27 2022-11-09 Coding Bio Ltd CLL1 binding molecules

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100285037A1 (en) * 2007-10-17 2010-11-11 Arie Abo Antibodies to cll-1

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2526284C (en) * 2003-06-25 2014-11-18 Crucell Holland B.V. Binding molecules for the treatment of myeloid cell malignancies
US7820511B2 (en) 2004-07-08 2010-10-26 Semisouth Laboratories, Inc. Normally-off integrated JFET power switches in wide bandgap semiconductors and methods of making
KR100890463B1 (ko) 2006-09-19 2009-03-26 성균관대학교산학협력단 동물 세포 감염 바이러스에 대한 항바이러스제
CA2665528C (en) 2006-10-12 2018-01-23 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
EP2014680A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
EP2332994A1 (en) 2009-12-09 2011-06-15 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Trispecific therapeutics against acute myeloid leukaemia
US9163090B2 (en) * 2012-05-07 2015-10-20 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies specific for CLL-1

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100285037A1 (en) * 2007-10-17 2010-11-11 Arie Abo Antibodies to cll-1

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108290955A (zh) * 2015-11-24 2018-07-17 塞勒兰特治疗公司 人源化抗-cll-1抗体
CN109641008A (zh) * 2016-04-01 2019-04-16 凯德药业股份有限公司 嵌合受体及其方法和用途
CN110036028A (zh) * 2016-10-16 2019-07-19 塞勒兰特治疗公司 抗il1-rap抗体
CN110036028B (zh) * 2016-10-16 2023-09-08 坎塔吉亚有限责任公司 抗il1-rap抗体
CN111432832A (zh) * 2017-09-14 2020-07-17 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和c-型凝集素样分子-1(cll-1)的蛋白质
WO2020083406A1 (zh) 2018-10-26 2020-04-30 科济生物医药（上海）有限公司 靶向cll1的抗体及其应用
CN113507937A (zh) * 2018-11-30 2021-10-15 艾丽塔生物治疗剂公司 针对cll-1的单结构域抗体
CN114641503A (zh) * 2019-09-13 2022-06-17 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 抗cd371抗体及其用途
CN113980134A (zh) * 2020-12-11 2022-01-28 广州百暨基因科技有限公司 抗cll1抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013259850B2 (en) 2017-10-05
JP6262724B2 (ja) 2018-01-17
US10723805B2 (en) 2020-07-28
EP2847222A1 (en) 2015-03-18
EP2847222A4 (en) 2016-01-13
US9163090B2 (en) 2015-10-20
BR112014027659A2 (pt) 2017-08-08
KR20150023355A (ko) 2015-03-05
JP2015519336A (ja) 2015-07-09
WO2013169625A1 (en) 2013-11-14
US9850314B2 (en) 2017-12-26
CA2872513A1 (en) 2013-11-14
AU2013259850A1 (en) 2014-11-20
US20150376290A1 (en) 2015-12-31
ES2699244T3 (es) 2019-02-08
IL235397B (en) 2018-12-31
US20130295118A1 (en) 2013-11-07
CN104736562B (zh) 2018-05-01
US20180273633A1 (en) 2018-09-27
EP2847222B1 (en) 2018-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104736562B (zh) Cll-1特异性的抗体
US11939377B2 (en) Affinity matured CD22-specific monoclonal antibody and uses thereof
CN104955845B (zh) 间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法
CN104395344B (zh) 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法
US11078286B2 (en) Monoclonal antibodies specific for fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) and methods of their use
CN108290955A (zh) 人源化抗-cll-1抗体
JP7032394B2 (ja) 抗ｉｌ１－ｒａｐ抗体
US11389480B2 (en) Human monoclonal antibody targeting TNFR2 for cancer immunotherapy
US20220064324A1 (en) Cross species single domain antibodies targeting mesothelin for treating solid tumors
EP3494135A1 (en) Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof
US20220127367A1 (en) Human monoclonal antibodies specific for flt3 and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220902

Address after: Ireland Galway

Patentee after: UK Medical Ltd.

Address before: California, USA

Patentee before: CELLERANT THERAPEUTICS, Inc.