ES2699244T3 - Anticuerpos específicos para la CLL-1 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une específicamente al dominio extracelular de la molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1) humana, en donde el anticuerpo se une a un polipéptido que consiste en el dominio C de lectina de la CLL-1 humana con una Kd al menos 5 veces mayor que un polipéptido que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de la CLL-1 humana, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:51, 59 y 67, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID NO:75, 83 y 91; y un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:52, 60 y 68, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID NO:76, 84 y 92.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos específicos para la CLL-1
Antecedentes de la invención
La molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1, del inglés C type Lectin Like molecule 1) se expresa en células de LMA, y en células madre cancerosas (CMC), que son células que pueden generar células cancerosas adicionales.
Una de las principales limitaciones de la quimioterapia es la incapacidad general de los fármacos anticancerosos para discriminar entre células normales y cancerosas. Casi todos los miembros de las principales categorías de agentes antineoplásicos tienen una toxicidad considerable para las células normales.
Las composiciones que se dirigen de forma específica a las células cancerosas pueden evitar este problema. Sin embargo, las dianas de cáncer existentes no se dirigen a las CMC. Por este motivo, las estrategias quimioterapéuticas existentes, incluso cuando se administran de manera específica a las células cancerosas, no eliminan de forma eficaz el cáncer. El riesgo de recaída persiste porque las CMC que sobreviven pueden generar nuevas células cancerosas.
Las CMC expresan CD34, similar a las células madre hematopoyéticas (CMH), pero la CLL-1 no se expresa en las CMH. Esto permite que se direccione de manera específica a las CMC usando c LL-1. El documento WO2009051974 describe anticuerpos para CLL-1. En el presente documento se proporcionan anticuerpos de CLL-1 que reconocen un alto porcentaje de células que expresan CLL-1. Los presentes anticuerpos de CLL-1 son eficaces tanto para la citotoxicidad dependiente del complemento como para la citotoxicidad dependiente de anticuerpos de células que expresan CLL-1 e inhiben el crecimiento tumoral de células cancerosas que expresan CLL-1. Los anticuerpos actualmente descritos proporcionan nuevas estrategias de diagnóstico y estrategias terapéuticas para direccionar trastornos asociados con CLL-1.
Breve sumario de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
La invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a la molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1) seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad (c Dr ) de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:51,59 y 67, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID n O:75, 83 y 91; y un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:52, 60 y 68, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID NO:76, 84 y 92. Tal anticuerpo de la invención se une a un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C de la CLL-1 humana con una Kd de al menos 5 veces mayor que un polipéptido que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de la CLL-1 humana.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos específicos para CLL-1 ("anticuerpos de CLL-1") que se unen a un alto porcentaje de células primarias que expresan CLL-1 de muestras de pacientes de LMA. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une específicamente al dominio extracelular de la CLL-1 humana con una Kd de 10 nM o menos, por ejemplo, cualquiera de 5 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM o menos. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a la CLL-1 de cinomolgo con una Kd de 100 nM, 10nM, 1 nM, 100 pM o menos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la CLL-1 de cinomolgo y la CLL-1 humana compiten por la unión al anticuerpo de CLL-1. Un experto en la materia entenderá que una mayor afinidad de unión se expresa como una Kd más baja (menor concentración de diana de anticuerpos necesaria para la unión). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 está unido a una citotoxina.
De acuerdo con la invención, el anticuerpo de CLL-1 se une a un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C de CLL-1 con una Kd al menos 5 veces mayor que un polipéptido que comprende o que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de CLL-1, por ejemplo, al menos cualquiera de 10, 20, 50 o 100 veces mayor. Es decir, el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende los dominios de pedúnculo y de lectina C de CLL-1 con una mayor afinidad que con la que se une solo al dominio de lectina C y, opcionalmente, solo al dominio de pedúnculo. El anticuerpo de CLL-1 se une a un epítopo que incluye parte de los dominios de pedúnculo y de lectina C. El anticuerpo de CLL-1 se une a un polipéptido que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de la molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1) humana con mayor afinidad que con la que se une un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C de la CLL-1 humana. Por ejemplo, los anticuerpos de CLL-1 designados como M26 y M31 se unen a los aminoácidos 101-265 de la CLL-1 humana con mayor afinidad que a los aminoácidos 141-265 de la CLL-1 humana (con referencia a la SEQ ID NO:2). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 está unido a una citotoxina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une al dominio de lectina C de la CLL-1 con una Kd al menos 5 veces mayor que con la que se une al dominio extracelular de la CLL-1 de longitud completa, por ejemplo, al menos cualquiera de 10, 20, 50 o 100 veces mayor. Es decir, la afinidad del anticuerpo de CLL-1 por el dominio de lectina C de CLL-1 es al menos cualquiera de 5, 10, 20, 50 o 100 veces que por el dominio extracelular de CLL-1 de longitud completa (por ejemplo, tal como se expresa en una célula). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a células quiescentes que expresan CLL-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a las células quiescentes que expresan CLL-1 con una Kd de 10 nM o menos, por ejemplo, cualquiera de 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM o menos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a al menos el 60 % de las células en un cultivo de células HL60, por ejemplo, al menos cualquiera de 70, 75, 80, 85, 90, 95 o un % mayor de las células HL60. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a al menos el 30 % de las células nucleadas en una muestra de células primarias de un paciente de LMA (por ejemplo, cualquiera de 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 o un % mayor), en el que la muestra de células primarias es sangre periférica o biopsia de tejido tumoral. Un experto entenderá que, en tal ensayo de unión, se añade una concentración apropiada de anticuerpo, por ejemplo, de modo que haya suficientes moléculas de anticuerpos presentes para unirse al número de células en el cultivo o muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 está unido a una citotoxina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tiene una CE50 de menos de 1 nM en un ensayo de citotoxicidad de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) con células que expresan CLL-1, por ejemplo, células HL60 o células primarias de LMA. En algunas realizaciones, la CE50 en el ensayo de CAF es cualquiera de 500, 200, 100, 50 pM o menos. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 reduce la formación de colonias de células de LMA en al menos el 50 %, por ejemplo, al menos el 60 %, el 70 %, el 80 % o más en un ensayo de citotoxicidad de CAF. En algunas realizaciones, las células son células primarias del paciente de LMA. En algunas realizaciones, las células son células madre cancerosas de LMA. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 no afecta a las células madre hematopoyéticas (CMH) CD34+ normales, o reduce de manera significativa la formación de colonias de las CMH CD34+ normales en un ensayo de citotoxicidad de CAF. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tiene una CE50 de 1 ug/ml o menos en un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) con células que expresan CLL-1, por ejemplo, células HL60 o células primarias de LMA. En algunas realizaciones, la CE50 en el ensayo de CDC es cualquiera de 500, 200, 100, 50, 20, 10 ng/ml o menos. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tiene una CE50 de 1 ug/ml o menos en un ensayo de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA) con células que expresan CLL-1, por ejemplo, células 293 transfectadas con CLL-1, células HL60 o células primarias de LMA. En algunas realizaciones, la CE50 en el ensayo de CCDA es cualquiera de 500, 200, 100 ng/ml o menos. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1, cuando se administra a un ratón que lleva un xenoinjerto de LMA durante al menos 4 semanas, reduce la carga tumoral al menos 10 veces en comparación con un control no tratado (es decir, un ratón que lleva el xenoinjerto de LMA pero que no se trata con el anticuerpo de CLL-1). En algunas realizaciones, el xenoinjerto de LMA es de una línea celular de LMA humana, por ejemplo, células HL60 o células OCI AML-5. En algunas realizaciones, el xenoinjerto de LMA es de células primarias de LMA humana o de primate (por ejemplo, de cinomolgo). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 está unido a una citotoxina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo que compite por la unión a CLL-1 (por ejemplo, una célula que expresa CLL-1 o una célula de LMA) con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada y ligera de M26 (véase el Ejemplo 1);
• un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada y ligera de M31 (véase el Ejemplo 1).
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se selecciona de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada y ligera de M26 (véase el Ejemplo 1);
• un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada y ligera de M31 (véase el Ejemplo 1).
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 está unido a una citotoxina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y comprende las CDR de cadena pesada y ligera de M26. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y comprende las CDR de cadena pesada y ligera de M31. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 está unido a una citotoxina.
Un anticuerpo de CLL-1 de acuerdo con la invención se une a un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C de CLL-1 con una Kd al menos 5 veces mayor que un polipéptido que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de CLL-1 (por ejemplo, cualquiera de 10, 20, 50, 100 o más veces). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une al dominio de lectina C de la CLL-1 con una Kd al menos 5 veces mayor que con la que se une al dominio extracelular de la CLL-1 de longitud completa (por ejemplo, cualquiera de 10, 20, 50, 100 o más veces). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente se une adicionalmente a al menos el 80 % de las células en un cultivo de células HL60 (por ejemplo, cualquiera de 85, 90, 95 o un % mayor). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente se une adicionalmente a al menos el 30 % de las células nucleadas en una muestra de células de LMA de un individuo con LMA (por ejemplo, cualquiera de 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 o un % mayor). De nuevo, en tal ensayo de unión, se añade una concentración apropiada de anticuerpo, por ejemplo, de modo que haya suficientes moléculas de anticuerpos presentes para unirse al número de células en el cultivo o muestra, y la concentración de anticuerpos no sea el factor limitante.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente es un anticuerpo quimérico con una región de Fc humana, por ejemplo, de IgG1. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente es humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente es un fragmento de Fv (por ejemplo, Fab, Fab', o F(ab')2). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente está marcado, por ejemplo, conjugado con un resto detectable. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente se une a un compuesto terapéutico, por ejemplo, una citotoxina o un inhibidor de crecimiento celular.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y se selecciona del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable con identidad sustancial (al menos cualquiera de 85, 90, 95 o 98 % de identidad) con las de M26 (Vh = SEQ ID NO:4; VI = SEQ ID NO:6)
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable con identidad sustancial con las de M31 (Vh = SEQ ID NO:8; V1 = SEQ ID NO: 10).
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y compite por la unión a CLL-1 con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable de M26 (Vh = SEQ ID NO:4; VI = SEQ ID NO:6) • un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable de M31 (Vh = SEQ ID NO:8; VI = SEQ ID NO: 10).
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y se selecciona del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable de M26 (Vh = SEQ ID NO:4; VI = SEQ ID NO:6) • un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable de M31 (Vh = SEQ ID NO:8; VI = SEQ ID NO:10).
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es parte de un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 está unido a una citotoxina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y comprende las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera de M26. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y comprende las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera de M31.
El anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y se une a un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C de CLL-1 con una Kd al menos 5 veces mayor que un polipéptido que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de CLL-1 (por ejemplo, cualquiera de 10, 20, 50, 100 o más veces). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une al dominio de lectina C de la CLL-1 con una Kd al menos 5 veces mayor que con la que se une al dominio extracelular de la CLL-1 de longitud completa (por ejemplo, cualquiera de 10, 20, 50, 100 o más veces). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y se une adicionalmente a al menos el 80 % de las células en un cultivo de células HL60 (por ejemplo, cualquiera de 85, 90, 95 o un % mayor). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 es tal como se indica en las reivindicaciones y se une adicionalmente a al menos el 30 % de las células nucleadas en una muestra de células de LMA de un individuo con LMA (por ejemplo, cualquiera de 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 o un % mayor).
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se indica en las reivindicaciones es un fragmento de Fv (por ejemplo, Fab, Fab', o F(ab')2). En algunas realizaciones, el anticuerpo es tal como se indica en las reivindicaciones y comprende dos regiones variables distintas, con dos secuencias de unión a epítopos distintas, en una única construcción de anticuerpo (por ejemplo, con una región de unión a epítopo de M26 o M31 y una región de unión a epítopo de M26, M31, G4 o M22 en cualquier combinación). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente está marcado, por ejemplo, conjugado con un resto detectable. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 tal como se describe anteriormente se une a un compuesto terapéutico, por ejemplo, una citotoxina o un inhibidor de crecimiento celular.
Adicionalmente se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de CLL-1 tal como se indica en las reivindicaciones y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se proporcionan procedimientos para determinar si una célula expresa CLL-1 que comprenden: poner en contacto un anticuerpo de CLL-1 tal como se indica en las reivindicaciones con la célula; detectar la unión del anticuerpo a la célula, en donde la unión del anticuerpo a la célula indica que la célula expresa CLL-1; y determinar si la célula expresa CLL-1. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende determinar si la célula expresa CD34. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende determinar si la célula expresa CD38. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende determinar si la célula expresa CD45. En algunas realizaciones, la célula está en una muestra biológica obtenida de un individuo (por ejemplo, una muestra de sangre o una biopsia de un tumor o tejido). En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo se detecta mediante FACS.
También se proporcionan procedimientos de identificación de una célula cancerosa mieloide (una célula cancerosa que expresa CLL-1, por ejemplo, de un trastorno mieloproliferativo tal como LMA, LMC, LMMC, mieloma múltiple, plasmacitoma o SMD) o una CMC (por ejemplo, CML o blastocito mieloide canceroso) que comprende: poner en contacto un anticuerpo de CLL-1 tal como se indica en las reivindicaciones con una célula; detectar la unión del anticuerpo a la célula; e identificar una CMC o célula mieloide cancerosa cuando el anticuerpo se une a la célula. En algunas realizaciones, la célula mieloide cancerosa se selecciona de una célula de LMA, LMC, LMMC, mieloma múltiple, plasmacitoma o SMD. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente determinar si la célula expresa CD45 e identificar una célula de LMA cuando la célula expresa CD45. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende determinar si la célula expresa CD34 e identificar una CMC cuando la célula expresa CD34. En algunas realizaciones, la célula está en una muestra biológica de un individuo. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo se detecta mediante FACS.
Adicionalmente se proporcionan procedimientos para diagnosticar a un individuo de un trastorno mieloproliferativo (por ejemplo, LMA, LMC, SMD, LMMC, mieloma múltiple, plasmacitoma y mielofibrosis) que comprenden poner en contacto un anticuerpo de CLL-1 tal como se indica en las reivindicaciones con una muestra biológica del individuo; detectar la unión del anticuerpo a una célula en la muestra biológica; y diagnosticar al individuo con un trastorno mieloproliferativo cuando el anticuerpo se une a la célula. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre (por ejemplo, células sanguíneas nucleadas periféricas) o una biopsia de un tumor o tejido. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende determinar si la célula expresa CD34. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente determinar una pauta de tratamiento para el individuo cuando se diagnostica el trastorno mieloproliferativo. En algunas realizaciones, la pauta de tratamiento incluye la administración de una dosis eficaz de un anticuerpo de CLL-1. En algunas realizaciones, la dosis eficaz del anticuerpo de CLL-1 se administra en una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la revisión del individuo, por ejemplo, cuando se diagnostica un trastorno mieloproliferativo, o cuando se ha diagnosticado previamente al individuo con un trastorno mieloproliferativo pero recibe tratamiento para la enfermedad.
Adicionalmente se desvelan procedimientos de inhibición de la supervivencia de una célula que expresa CLL-1 (por ejemplo, reducción del crecimiento o de la división, mediación con CAF, mediación con CDC) que comprenden poner en contacto un anticuerpo de CLL-1 (es decir, un anticuerpo de CLL-1 que tiene cualquiera de las actividades o secuencias descritas anteriormente) con la célula e inhibir la supervivencia de la célula. En algunos aspectos, la puesta en contacto comprende administrar el anticuerpo (por ejemplo, en una composición farmacéutica) a un individuo, por ejemplo, un individuo diagnosticado con un trastorno mieloproliferativo (por ejemplo, LMA, LMC, SMD, LMMC, mieloma múltiple, plasmacitoma y mielofibrosis). En algunos aspectos, el anticuerpo de CLL-1 se administra en una dosis eficaz para inhibir la supervivencia de células que expresan CLL-1.
Se proporcionan anticuerpos tal como se indica en las reivindicaciones para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno mieloproliferativo en un individuo (por ejemplo, reducción del crecimiento o incorporación del injerto en comparación con un control no tratado) que comprende la administración al individuo de una dosis eficaz de anticuerpo de CLL-1 tal como se indica en las reivindicaciones, tratando de este modo el trastorno mieloproliferativo en el individuo. En algunas realizaciones, el trastorno mieloproliferativo se selecciona de LMA, LMC, SMD, LMMC, mieloma múltiple, plasmacitoma y mielofibrosis. En algunas realizaciones, la dosis eficaz del anticuerpo de CLL-1 se administra en una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el individuo se ha diagnosticado con un trastorno mieloproliferativo, por ejemplo, usando un anticuerpo de CLL-1 tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el procedimiento de tratamiento comprende adicionalmente la revisión del crecimiento celular (por ejemplo, crecimiento tumoral o de células mieloides cancerosas en circulación) en el individuo, por ejemplo, usando un anticuerpo de CLL-1 tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a un compuesto terapéutico, por ejemplo, una citotoxina o un inhibidor de crecimiento celular.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados de los ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) usando células primarias de 3 pacientes de LMA diferentes, n.° 49 (A), n.° 50 (B) y n.° 52 (C). A y B muestran que el clon M26 del anticuerpo de CLL-1 tiene una CE50 de entre 10 y 100 ng/ml. La Figura 1C muestra los resultados de los clones de anticuerpo de CLL-1 M26, M31, y los controles negativos E12 (anticuerpo no relacionado) e IgG. Tanto M26 como M31 tienen una CE50 de entre 10 y 100 ng/ml.
La Figura 2 muestra el efecto antitumoral de los clones de anticuerpo de CLL-1 en un modelo de xenoinjerto de ratón. Las células HL60 de LMA se inyectaron por vía subcutánea a ratones. Los ratones se dividieron en 5 grupos, con n=6 ratones por grupo: (1) IgG2a control; (2) M5; (3) M13; (4) M26; y (5) M31. Los ratones recibieron 200 ug de anticuerpos una vez por semana durante 7 semanas. P< 0,05 frente al control para todos los grupos de tratamiento.
La Figura 3 muestra el efecto antitumoral de los clones de anticuerpo de CLL-1 en un modelo de xenoinjerto ortotópico de ratón. Las células de LMA se inyectaron por vía intravenosa en ratones inmunocomprometidos NSG (con genes inactivados, NOD/SCID/ cadena Gamma del receptor IL2). Los ratones se dividieron en 5 grupos, con n=6 ratones por grupo: (1) IgG2a control; (2) M5; (3) M13; (4) M26; y (5) M31. Los ratones recibieron 200 ug de anticuerpos dos veces por semana durante 2 semanas, y se sacrificaron 4 semanas después del trasplante. La carga tumoral (células CD45+ CLL-1) en la médula ósea se determinó mediante FACS.
La Figura 4 muestra que los conjugados de anticuerpo de CLL-1-fármaco (CAF) inhiben la formación de colonias mediante las células madre de LMA pero no la de células madre hematopoyéticas (CMH CD34+). La Figura 4A muestra que las CMH CD34+ cultivadas forman colonias en presencia de conjugados anticuerpo-fármaco a nivel del control negativo (sin anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco). La Figura 4B muestra que, para el total de PBMC cultivados, las células madre cancerosas (CMC) de LMA tienen el 80 % menos de formación de colonias en presencia de anticuerpo de CLL-1 M26 conjugado con saporina en comparación con el control negativo (sin anticuerpo o conjugado de anticuerpo-fármaco).
La Figura 5 muestra que los clones de anticuerpos de CLL-1 M26, M31 y G4 (también 31.G4 marcado) se unen a las PBMC humanas tanto en las formas de ratón como en quiméricas (Chi, de chimeric, quimérico) humanas. Los controles negativos incluyen la IgG que se corresponde con cada anticuerpo de CLL-1, pero específica para un antígeno no relacionado. Las células mononucleares se separaron de las muestras de PBMC, y se usó FACS para caracterizar las células de acuerdo con la expresión de CD89 (granulocitos), CD14 (monocitos y granulocitos), CD3 (linfocitos) y CD19 (células B). El porcentaje de tinción positiva de CLL-1 para cada población de muestra en ese orden de izquierda a derecha para cada anticuerpo de CLL-1.
La Figura 6 muestra que los clones de anticuerpos de CLL-1 M26, M31 y G4 (31G4 marcado) se unen a las PBMC de cinomolgo tanto en las formas de ratón como en las quiméricas (Chi) humanas. Los controles negativos incluyen la IgG que se corresponde con cada anticuerpo de CLL-1, pero específica para un antígeno no relacionado. Las células mononucleares se separaron de las muestras de PBMC, y se usó FACS para caracterizar las células de acuerdo con la expresión de CD3 (linfocitos), CD19 (células B), CD14 (granulocitos), CD14 (monocitos) y CD89 (granulocitos). El porcentaje de tinción positiva de CLL-1 para cada población de muestra en ese orden de izquierda a derecha para cada anticuerpo de CLL-1.
La Figura 7 muestra que tanto la CLL-1 de ratón como la quimérica humana tienen actividad de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) sobre células 293 transfectadas n vitro con CLL-1. La Figura 7A muestra los resultados de los clones de anticuerpos de CLL-1 de ratón M26, M31 y G4 (31G4) en comparación con una IgG2a de ratón de control negativo. La Figura 7B muestra los resultados para los correspondientes clones de anticuerpos de CLL-1 humanos quiméricos.
La Figura 8 muestra que los clones de anticuerpos de CLL-1 humanos M26, M31 y G4 (31G4) median la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA) en células 293 transfectadas con CLL-1. La CE50 (ng/ml) para ChiM26, ChiM31 y Chi31G4 es 79, 143 y 105, respectivamente.
La Figura 9 muestra el efecto antitumoral de los clones de anticuerpo de CLL-1 en un modelo de xenoinjerto de ratón. los ratones NOD/SCID se irradiaron el día -1 y el día 0, las células HL60 se inyectaron en las venas de la cola (3x106 células por ratón). Los ratones se dividieron en 3 grupos, con n=6 ratones por grupo: (1) huIgG control; (2) M26; (3) ChiM31. Los ratones recibieron 8 inyecciones de anticuerpos (200 ug) durante el trascurso de 22 días, y se sacrificaron el día 26. La carga tumoral en la médula ósea se determinó mediante FACS. La Figura 9A muestra el porcentaje de células de LMA huCD45+CD33+ y la Figura 9B muestra el porcentaje de CMC de LMA huCD45+ CLL-1+.
La Figura 10 muestra el efecto antitumoral de los clones de anticuerpo de CLL-1 en un modelo de xenoinjerto de ratón. los ratones NOD/SCID se irradiaron el día -1 y el día 0, las células OCI AML-5 se inyectaron en las venas de la cola (5x106 células por ratón). Los ratones se dividieron en 5 grupos, con n=6 ratones por grupo: (1) huIgG control; (2) M26; (3) ChiM26; (4) ChiM31; (5) ChiG4. Los ratones recibieron 8 inyecciones de anticuerpos (200 ug) durante el trascurso de 19 días, y se sacrificaron el día 24 después de que se determinase la carga tumoral en la médula ósea mediante FACS. La Figura 10A muestra el porcentaje de células de LMA huCD45+CD33+. La Figura 10B muestra el porcentaje de log10 de células de LMA huCD45+CD33+, para observar una mejor resolución entre los resultados. Los datos muestras que los 4 anticuerpos de CLL-1 probados redujeron de manera eficaz la carga tumoral, y que M26, ChiM26 y ChiM31 tuvieron el mayor efecto antitumoral.
Descripción detallada de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
I. Introducción
En el presente documento se proporcionan anticuerpos específicos para CLL-1 con diversas propiedades ventajosas. Tales anticuerpos se seleccionaron basándose en al menos uno de los siguientes criterios:
• Afinidad por la CLL-1 humana en el intervalo de picomolar a nanomolar;
• Unión a un porcentaje relativamente alto de muestras obtenidas de pacientes de LMA (por ejemplo, un porcentaje de muestras de pacientes de LMA mayor que el anticuerpo de CLL-1 X357 o X1057, o al menos el 50 % de muestras de pacientes de LMA);
• Unión a un porcentaje relativamente alto de células (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC)) en una muestra de paciente de LMA (por ejemplo, un mayor porcentaje de células que el anticuerpo de CLL-1 C357 o X1057, o al menos el 50 % de las células en una muestra de paciente de LMA);
• Activo en ensayo de citotoxicidad de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF);
• Activo en ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC);
• Activo en ensayo de citotoxicidad de células dependientes de anticuerpos (CCDA);
La actividad antitumoral, in vitro o in vivo (modelo de xenoinjerto de ratón);
Unión específica a y actividad de CAF en células de LMA, pero no CMH normales;
Unión a especies homólogas de un modelo animal (por ejemplo, CLL-1 de cinomolgo);
Anteriores actividades mantenidas para anticuerpos en forma humana quimérica.
No todos los anticuerpos de CLL-1 actualmente descritos tienen todas las características selectivas, pero se describen adicionalmente, por ejemplo, de acuerdo con la secuencia, a continuación. Los presentes anticuerpos de CLL-1 se pueden usar para la detección de células que expresan CLL-1, por ejemplo, para el diagnóstico o la revisión de células cancerosas que expresan CLL-1 en un individuo, o para el tratamiento de cáncer que expresa CLL-1 tal como LMA.
II. Definiciones
Salvo que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4a ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). El término "uno" o "una" pretende significar "uno o más". El término "comprender" y variaciones del mismo tales como "comprende" o "que comprende", cuando precede a la mención de una etapa o de un elemento, pretende significar que la adición de etapas o de elementos adicionales es opcional y no se excluye. Cualquiera de los procedimientos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de determinados términos utilizados frecuentemente en el presente documento, y no deben considerarse como limitantes del alcance de la presente divulgación.
La molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1) también conocida como CLEC12A, DCAL-2 y MICL, es una proteína de membrana de tipo II (dominio de ITIM - dominio de TM - dominio de pedúnculo - dominio semejante a lectina). El dominio extracelular de CLL-1 está altamente glucosilado, y se expresa exclusivamente en células del linaje mieloide. La CLL-1 también se expresa en células de LMA, SMD y LMC. La expresión de CLL-1 se puede usar para distinguir entre células madre hematopoyéticas (CMH) normales, que no expresan la CLL-1, y células madre leucémicas (CML), en las que se expresa. Las CML son células CD34+ en pacientes de leucemia que llevan a la producción de células cancerosas y a la recaída del cáncer. Véase Bakker et al. (2004) Cancer Res. 64:8443.
Se conocen las secuencias de nucleótidos y de proteínas de CLL-1 para muchas especies. Por ejemplo, las secuencias humanas se pueden encontrar en el número de registro de Genbank AF247788.1 (secuencia codificante mostrada en la SEQ ID NO:1) y en el número de registro de Uniprot Q5QGZ9 (SEQ ID NO:2). Para la proteína CLL-1 humana mostrada como la SEQ ID NO:2, el dominio extracelular comprende aproximadamente los aminoácidos 65-265, el dominio transmembrana comprende aproximadamente los aminoácidos 44-64, y el dominio citoplasmático comprende aproximadamente los aminoácidos 1-43. El dominio de pedúnculo de la CLL-1 humana abarca los aminoácidos 65­ 139, y el dominio de lectina C abarca los aminoácidos 140-249, ambos con referencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:2. Un experto en la materia entenderá que las variantes de CLL-1 (por ejemplo, especies homólogas, variantes alélicas, etc.) se pueden alinear de forma óptima, por ejemplo, para la identificación de restos conservados y de dominios.
Las expresiones "anticuerpo específico de CLL-1", "anticuerpo anti-CLL-1", "anticuerpo de CLL-1", y "anti-CLL-1" se usan de forma sinónima en el presente documento para referirse a un anticuerpo que se une de manera específica a CLL-1, incluyendo diversas formas glucosiladas de CLL-1. Los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento se unen de manera específica al polipéptido de CLL-1 expresado, por ejemplo, obre la superficie de determinadas células cancerosas, pero no a CMH normales. Tal como se trata a continuación en más detalle, los presentes anticuerpos anti-CLL-1 se pueden unir a células que expresan CLL-1, se pueden unir a n gran porcentaje de células de LMA en comparación con otros anticuerpos dirigidos a LMA, inhibir la proliferación de células de LMA y mediar su destrucción.
Un "trastorno asociado a CLL-1" (o trastorno relacionado con CLL-1, trastorno de CLL-1, afección o enfermedad relacionada con CLL-1, etc.) se refiere a afecciones y enfermedades que se correlacionan con elevadas o reducidas expresiones de CLL-1 en superficie celular en comparación con la expresión de CLL-1 en un control convencional (por ejemplo, una célula normal no cancerosa, no enferma). Los elevados niveles de CLL-1 se asocian con células cancerosas, en particular, leucemias tales como LMA (leucemia mielógena aguda), SMD (síndrome mielodisplásico) y LMC (leucemia mieloide crónica), y en CMC hematopoyéticas (por ejemplo, CML).
El término "anticuerpo" se refiere a una estructura de polipéptido, por ejemplo, una inmunoglobulina, un conjugado o un fragmento del mismo que mantiene la actividad de unión a antígeno. El término incluye pero no se limita a anticuerpos policlonales o monoclonales de las clases de isotipos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que derivan de células humanas o de otros mamíferos, que incluyen formas naturales o modificadas genéticamente tales como anticuerpos humanizados, humanos, de cadena simple, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados y generados in vitro. El término abarca conjugados, incluyendo, pero sin limitación, proteínas de fusión que contienen un resto de inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpos quiméricos o biespecíficos o scFv), y fragmentos, tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb y otras composiciones.
Una unidad estructural de una inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Las expresiones de cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a dichas cadenas ligera y pesada, respectivamente. La región variable contiene la región de unión a antígeno del anticuerpo (o su equivalente funcional) y es más crítica en especificidad y afinidad de unión. Véase Paul, Fundamental Immunology (2003).
Los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas o como cualquiera de una serie de fragmentos bien caracterizados que incluyen la actividad de unión a antígeno específico. Con motivo de claridad, un anticuerpo tetramérico con cadenas pesada y ligera se denomina en el presente documento "inmunoglobulina intacta", y puede ser de origen natural, policlonal, monoclonal o producido de manera recombinante. Los fragmentos se pueden producir mediante digestión con diversas peptidasas. La pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región de bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que, en sí, es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 se puede reducir en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra, convirtiendo de esta forma el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de bisagra. Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, el experto en la materia apreciará que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo bien químicamente o usando la metodología del ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, también produce fragmentos de anticuerpos bien producidos mediante la modificación de anticuerpos completos, o bien aquellos sintetizados de novo usando metodologías del ADN recombinante o bien aquellos identificados usando bibliotecas de presentación en fago (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).
Tal como se usa en el presente documento, el término "Fv" se refiere a un fragmento monovalente o bivalente de la región variable, y puede abarcar solo las regiones variables (por ejemplo, Vl y/o Vh), así como fragmentos más largos, por ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab')2, que también incluye Cl y/o Ch1. Salvo que se especifique otra cosa, el término "Fc" se refiere a un monómero o dímero de cadena pesada que comprende las regiones de Ch1 y Ch2.
Un Fv de cadena simple (scFv) se refiere a un polipéptido que comprende una Vl y una Vh unidas mediante un enlazador, por ejemplo, un enlazador peptídico. Los scFv también se pueden usar para formar scFv en tándem (o divalentes) o diacuerpos. La producción y las propiedades de los scFv en tándem y de los diacuerpos se describe, por ejemplo, en Asano et al. (2011) J Biol. Chem. 286:1812; Kenanova et al. (2010) Prot Eng Design Sel 23:789; Asano et al. (2008) Prot Eng Design Sel 21:597.
Un anticuerpo biespecífico o bivalente se refiere a un anticuerpo que tiene especificidad por dos antígenos diana o epítopos diferentes. Por ejemplo, un brazo del anticuerpo (región V) podría ser específico para CLL-1, mientras que el otro brazo podría ser específico para otra diana, por ejemplo, una diana de leucemia o de LMA, o una diana para reclutar una célula efectora, por ejemplo, CD3. El anticuerpo biespecífico también puede tener un brazo específico para un primer epítopo de CLL-1, mientras que el otro brazo es específico para un segundo epítopo de c LL-1. El anticuerpo biespecífico puede ser una región de Fv o una inmunoglobulina intacta o quimérica. Los anticuerpos biespecíficos se describen, por ejemplo, en Lum et al. (2011) BioDrugs 25:365 y en Mabry et al. (2010) IDrugs 13:543.
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación clonal de anticuerpos con una única especificidad y afinidad de unión por un epítopo dado en un antígeno. Un "anticuerpo policlonal" se refiere a una preparación de anticuerpos que se generan frente a un único antígeno, pero con diferentes especificidades y afinidades de unión.
Tal como se usa en el presente documento, la "región V" se refiere al dominio de la región variable del anticuerpo que comprende los segmentos de Marco 1, CDR1, Marco 2, CDR2, y Marco 3, que incluye CDR3 y Marco 4, cuyos segmentos se añaden al segmento V como consecuencia del reordenamiento de los genes de la región V de la cadena pesada y la cadena ligera durante la diferenciación de linfocitos B.
Tal como se usa en el presente documento, "región determinante de complementariedad (CDR)" se refiere a las tres regiones hipervariables en cada cadena que interrumpen las cuatro regiones "marco" establecidas mediante las regiones variables de cadena ligera y pesada. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena normalmente se denominan CDR1, c DR2 y CDR3, numeradas de manera secuencial partiendo del extremo N-terminal y también se identifican normalmente mediante la cadena en la que se localiza la CDR en particular. Por lo tanto, una CDR3 de Vh se localiza en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 de Vh es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra.
Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. Las regiones marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirven para posicionar y alinear las CDR en las tres dimensiones del espacio.
Las secuencias de aminoácidos de las CDR y de las regiones marco se pueden determinar usando diversas definiciones bien conocidas en la materia, por ejemplo, Kabat, Chothia, base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT), y AbM (véase, por ejemplo, Johnson et al., citado anteriormente; Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196, 901­ 917; Chothia et al. (1989) Nature 342, 877-883; Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4)). Una guía útil para localizar las CDR usando el sistema Kabat se puede hallar en la página web disponible en bioinf.org.uk/abs. Las definiciones de sitios de combinación de antígeno también se describen en las siguientes referencias: Ruiz et al. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); y Lefranc Nucleic Acids Res. Ene 1;29(1):207-9 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996); y Martin et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203: 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); y Rees et al, En Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que (a) la región constante o una parte de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada, de manera que el sitio de unión a antígeno (la región variable, la CDR o parte de la misma) está unida a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada; o (b) la región variable, o una parte de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada con una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada (por ejemplo, regiones CDR o marco de diferentes especies). Los anticuerpos quiméricos pueden incluir fragmentos de regiones variables, por ejemplo, un anticuerpo recombinante que comprende dos regiones Fab o Fv o un scFv. Un anticuerpo quimérico también puede, tal como se indica anteriormente, incluir una región Fc de un origen diferente al de las regiones Fv unidas. En algunos casos, el anticuerpo quimérico incluye quimerismo dentro de la región Fv. Un ejemplo de tal anticuerpo quimérico sería un anticuerpo humanizado en el que las FR (del inglés framework región, región marco) y las CDR sean de orígenes diferentes.
Los anticuerpos humanizados son anticuerpos en los que los bucles de unión a antígeno, es decir, las CDR, obtenidas de las regiones Vh y Vl de un anticuerpo no humano se injertan a una secuencia marco. La humanización, es decir, la sustitución de secuencias de CDR no humanas por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano, se puede realizar siguiendo los procedimientos descritos en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 5.545.806; 5.569.825; 5.633.425; 5.661.016; Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996). Los ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos, también se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados o humanos, tal como se desvela en la Patente de EE.UU. N.° 6.673.986.
Los términos "antígeno", "inmunógeno", "diana de anticuerpo", "analito diana", y términos similares se usan en el presente documento para referirse a una molécula, compuesto o complejo que es reconocido por un anticuerpo, es decir, que se pude unir de manera específica por el anticuerpo. El término se puede referir a cualquier molécula que pueda ser reconocida de manera específica por un anticuerpo, por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido, hidrato de carbono, lípido, resto químico o combinaciones de los mismos (por ejemplo, polipéptidos fosforilados o glucosilados, etc.). Un experto entenderá que el término no indica que la molécula es inmunogénica en todos los contextos, sino que simplemente indica que se puede direccionar mediante un anticuerpo.
Los anticuerpos se unen a un "epítopo" en un antígeno. El epítopo es el sitio localizado en el antígeno que es reconocido por y al que se une el anticuerpo. Los epítopos pueden incluir unos pocos aminoácidos o partes de unos pocos aminoácidos, por ejemplo, 5 o 6, o más, por ejemplo, 20 aminoácidos o más, o partes de estos aminoácidos. En algunos casos, el epítopo incluye componentes no proteínicos, por ejemplo, de un hidrato de carbono, de un ácido nucleico o de un lípido. En algunos casos, el epítopo es un resto tridimensional. Por lo tanto, por ejemplo, cuando la diana es una proteína, el epítopo puede estar comprendido de aminoácidos consecutivos o aminoácidos de diferentes partes de la proteína que se aproximan mediante plegamiento proteico (por ejemplo, un epítopo discontinuo). Lo mismo es cierto para otros tipos de moléculas diana que forman estructuras tridimensionales.
Las expresiones "específico para", "se une de manera específica", y términos similares se refieren a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que se une a una diana con una afinidad al menos 2 veces mayor que a los compuestos no diana, por ejemplo, al menos cualquiera de una afinidad 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces o 100 veces mayor. Por ejemplo, un anticuerpo que se une de manera específica a un anticuerpo primario se unirá típicamente a un anticuerpo primario con al menos una afinidad 2 veces mayor que a una diana de anticuerpo no primario (por ejemplo, un anticuerpo de una especie diferente o de un isotipo diferente o una diana que no es anticuerpo).
La expresión "se une" con respecto a una diana de anticuerpo (por ejemplo, antígeno, analito, complejo inmunitario), típicamente indica que un anticuerpo se une a una mayoría de las dianas de anticuerpo en una población pura (asumiendo proporciones molares apropiadas). Por ejemplo, un anticuerpo que se une a una diana de anticuerpo dada típicamente se une a al menos 2/3 de las dianas de anticuerpo en una solución (por ejemplo, al menos cualquiera de 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 %). Un experto reconocerá que surgirá alguna variabilidad dependiendo del procedimiento y/o del umbral de determinación de la unión.
El término "reticulado" con respecto a un anticuerpo se refiere a la unión del anticuerpo a una matriz sólida o semisólida (por ejemplo, sefarosa, perlas, placa de cultivo) o a otra proteína o anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede multimerizar para crear un complejo de anticuerpo con múltiples sitios de unión a antígeno (más de 2). El anticuerpo se puede multimerizar mediante la expresión del anticuerpo como un isotipo de valencia alta (por ejemplo, IgA o IgM, que típicamente forma complejos de 2 o 5 anticuerpos, respectivamente). La multimerización del anticuerpo también se puede llevar a cabo usando un reticulador que comprende un grupo reactivo capaz de unir proteínas (por ejemplo, carbodiimida, ésteres de NHS, etc). Los procedimientos y las composiciones para reticular un anticuerpo a una matriz se describen, por ejemplo, en los catálogos y páginas web de Abcam y de New England Biolab (disponibles en abcam.com y neb.com). Los compuestos reticuladores con diversos grupos reactivos se describen, por ejemplo, en el catálogo y en la página web de Thermo Fisher Scientific (disponible en piercenet.com).
T al como se usa en el presente documento, un primer anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, "compite" por la unión a una diana con un segundo anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, cuando la unión del segundo anticuerpo con la diana disminuye de manera detectable en presencia del primer anticuerpo en comparación con la unión del segundo anticuerpo en ausencia del primer anticuerpo. La alternativa, en donde la unión del primer anticuerpo a la diana también disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo, puede, pero no necesariamente, ser el caso. Es decir, un segundo anticuerpo puede inhibir la unión de un primer anticuerpo a la diana sin que ese primer anticuerpo inhiba la unión del segundo anticuerpo a la diana. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de manera detectable la unión del otro anticuerpo a su epítopo o ligando afines, tanto en la misma, mayor o menor medida, se dice que los anticuerpos"compiten de forma cruzada" entre sí por la unión de su(s) respectivo(s) epítopo(s). Tanto los anticuerpos de competencia como de competencia cruzada se abarcan en la presente invención. El término anticuerpo "competidor" se puede aplicar al primer o segundo anticuerpo tal como lo puede determinar un experto en la materia. En algunos casos, la presencia del anticuerpo competidor (por ejemplo, el primer anticuerpo) reduce la unión del segundo anticuerpo a la diana en al menos el 10 %, por ejemplo, al menos cualquiera del 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o más, por ejemplo, de manera que la unión del segundo anticuerpo a la diana es indetectable en presencia del primer anticuerpo (competidor).
Los términos "marcador", "resto detectable", y términos similares se refieren a una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen colorantes fluorescentes, agentes luminiscentes, radioisótopos (por ejemplo, 32P, 3H), reactivos densos en electrones, enzimas, (por ejemplo, las usadas normalmente en un ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas u otras entidades que se pueden volver detectables, por ejemplo, mediante la incorporación de un radiomarcador en un péptido o anticuerpo específicamente reactivo con un analito diana. Se puede emplear cualquier procedimiento conocido en la materia para conjugar un anticuerpo con el marcador, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego. El término "etiqueta" se puede usar indistintamente con el término "marcador", pero generalmente se refiere a un resto basado en afinidad, por ejemplo, una "etiqueta de His" para la purificación o una "etiqueta de estreptavidina" que interactúa con biotina.
Una molécula "marcada" (por ejemplo, un ácido nucleico, una proteína o un anticuerpo) es uno que se une, bien covalentemente, a través de un enlazador o un enlace químico o no covalentemente, mediante enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a un marcador de manera que la presencia de la molécula se pueda detectar mediante la detección de la presencia del marcador unido a la molécula.
La expresión "expresado de manera diferencial" o "regulado de manera diferencial" se refiere generalmente a un biomarcador de proteína o de ácido nucleico que se sobreexpresa (se regula positivamente) o se infraexpresa (se regula negativamente) en una muestra en comparación con al menos una otra muestra. En el contexto de la presente divulgación, el término generalmente se refiere a la sobreexpresión de CLL-1 en una célula cancerosa (por ejemplo, una célula de LMA o una CMC de LMA) en comparación con una célula normal, no cancerosa.
Por ejemplo, las expresiones "sobreexpresado" o "regulado positivamente" se refieren de manera intercambiable a una proteína o ácido nucleico, generalmente un biomarcador, que se transcribe o se traduce a un nivel detectablemente mayor que el nivel de control. La expresión incluye la sobreexpresión debido a la transcripción, al procesamiento postranscripcional, a la traducción, al procesamiento postraduccional, a la localización celular (por ejemplo, orgánulo, citoplasma, núcleo, superficie celular) y a la estabilidad del ARN y de la proteína. La sobreexpresión se puede detectar usando técnicas convencionales para detectar biomarcadores, bien ARNm (es decir, RT-PCR, hibridación) o proteína (es decir, citometría de flujo, obtención de imágenes, ELISA, técnicas inmunohistoquímicas). La sobreexpresión puede ser al menos cualquiera del 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o más en comparación con una célula normal.
Los términos "agonista", "activador", "inductor" y términos similares se refieren a moléculas que aumentan la actividad o la expresión en comparación con un control. Los agonistas son agentes que, por ejemplo, se unen a, estimulan, aumentan, activan, potencian la activación, sensibilizan o regulan positivamente la actividad de la diana. La expresión o actividad puede aumentar al menos en cualquiera del 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 100 % o más que la del control. En ciertos casos, la activación es cualquiera de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más en comparación con un control.
Los términos "inhibidor", "represor" o "antagonista" o "regulador negativo" se refieren de manera intercambiable a una sustancia que da como resultado un nivel de expresión o de actividad detectablemente menor en comparación con un control. La expresión o actividad inhibida puede ser cualquiera del 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o menos de la del control. En ciertos casos, la inhibición es cualquiera de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más en comparación con un control.
Una muestra o valor "de control" se refiere a una muestra que sirve como una referencia, normalmente una referencia conocida, para la comparación con una muestra de ensayo. Por ejemplo, una muestra de ensayo se puede tomar a partir de una condición de ensayo, por ejemplo, en presencia de un compuesto de ensayo, y se puede comparar con muestras procedentes de condiciones conocidas, por ejemplo, en ausencia del compuesto de ensayo (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). En el contexto de la presente divulgación, un ejemplo de un control negativo sería una muestra biológica de un individuo del que se sabe que es sano (sin cáncer), y un ejemplo de un control positivo sería una muestra biológica de un paciente del que se sabe que tiene LMA. Un control también puede representar un valor promedio o un intervalo recopilado a partir de una serie de ensayos o de resultados. Un experto en la materia reconocerá que los controles se pueden diseñar para evaluar cualquier número de parámetros. Por ejemplo, se puede diseñar un control para comparar el beneficio terapéutico basado en datos farmacológicos (por ejemplo, la semivida) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de beneficios y/o de efectos secundarios). Los controles se pueden diseñar para aplicaciones in vitro. Un experto en la materia sabrá qué controles son valiosos en una situación dada, y será capaz de analizar los datos basándose en comparaciones con los valores del control. Los controles también son valiosos para determinar la significación de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado son ampliamente variables en los controles, la variación en las muestras de ensayo no se considerará significativa.
El término "diagnóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un sujeto tenga un trastorno tal como un cáncer. De manera similar, el término "pronóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un determinado resultado futuro pueda producirse en el sujeto. Por ejemplo, en el contexto de la presente divulgación, el pronóstico se puede referir a la probabilidad de que un individuo desarrolle cáncer, tenga recidiva, o a la probable gravedad de la enfermedad (por ejemplo, la gravedad de los síntomas, la tasa de descenso funcional, la supervivencia, etc.). No se pretende que los términos sean absolutos, como apreciará cualquier experto en el campo de los diagnósticos médicos.
"Biopsia" o "muestra biológica de un paciente" tal como se usa en el presente documento se refiere a una muestra obtenida de un paciente que tiene, o que se sospecha que tiene, un trastorno asociado con la CLL-1. La muestra también puede ser una muestra de sangre o una fracción de sangre, por ejemplo, la fracción de glóbulos blancos, de suero o de plasma. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una biopsia de tejido, tal como una biopsia con aguja, una biopsia con aguja fina, una biopsia quirúrgica, etc. La muestra puede comprender una muestra de tejido que alberga una lesión o sospecha de lesión, aunque la muestra biológica también puede provenir de otro sitio, por ejemplo, un sitio de sospecha de metástasis, un nódulo linfático o de la sangre. En algunos casos, la muestra biológica también puede ser de una región adyacente a la lesión o a la sospecha de lesión.
Una "muestra biológica" se puede obtener de un paciente, por ejemplo, una biopsia, de un animal, tal como un modelo animal, o de células de cultivo, por ejemplo, una línea celular o células extraídas de un paciente y crecidas en cultivo para la observación. Las muestras biológicas incluyen tejidos y fluidos corporales, por ejemplo, sangre, fracciones de sangre, linfa, saliva, orina, heces, etc.
Los términos "terapia", "tratamiento", y "mejora" se refieren a cualquier reducción en la gravedad de los síntomas. En el caso de tratamiento de cáncer (por ejemplo, LMA), el tratamiento puede referirse a, por ejemplo, la reducción del tamaño tumoral, del número de células cancerosas, de la tasa de crecimiento, de la actividad metastásica, a la reducción de muerte celular de células no cancerosas, a las náuseas reducidas y otros efectos secundarios de la quimioterapia o de radioterapia, etc. Los términos "tratar" y "prevenir" no pretenden ser términos absolutos. El tratamiento y la prevención se pueden referir a cualquier retraso en la aparición, mejora de los síntomas, mejora en la supervivencia del paciente, aumento en el tiempo o en la tasa de supervivencia, etc. El tratamiento y la prevención pueden ser completos (niveles indetectables de células neoplásicas) o parciales, de manera que se encuentren menos células neoplásicas en un paciente de las que se habrían dado sin la presente invención. El efecto del tratamiento se puede comparar con un individuo o grupo de individuos que no reciben el tratamiento, o con el mismo paciente antes del tratamiento o en diferentes momentos durante el tratamiento. En algunos aspectos, la gravedad de la enfermedad se reduce en al menos el 10 %, en comparación, por ejemplo, con el individuo antes de la administración o con un individuo de control que no se esté sometiendo al tratamiento. En algunos aspectos la gravedad de la enfermedad se reduce en al menos el 25 %, el 50 %, el 75 %, el 80 % o el 90 % en algunos casos, ya no siendo detectable usando técnicas de diagnóstico convencionales.
Las expresiones "cantidad eficaz", "dosis eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz", etc. se refieren a aquella cantidad del agente terapéutico suficiente para mejorar un trastorno, tal como se describe anteriormente. Por ejemplo, para un determinado parámetro, una cantidad eficaz mostrará un aumento o una disminución del efecto terapéutico de al menos el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 75 %, el 80 %, el 90 % o al menos el 100 %. La eficacia terapéutica también se puede expresar como "veces" de aumento o de disminución. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede tener cualquiera de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o más de efecto en comparación con un control.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se usa como sinónimo de fisiológicamente aceptable y de farmacológicamente aceptable. Una composición farmacéutica comprenderá por lo general agentes para tamponamiento y conservación en almacenamiento, y puede incluir tampones y vehículos para la administración adecuada, dependiendo de la vía de administración.
Los términos "dosis" y "dosificación" se usan de manera intercambiable en el presente documento. Una dosis se refiere a la cantidad de principio activo dada a un individuo en cada administración. Para la presente invención, la dosis se puede referir a la concentración del anticuerpo o a los componentes asociados, por ejemplo, la cantidad del agente terapéutico o dosificación del radiomarcador. La dosis variará dependiendo de una serie de factores, que incluyen la frecuencia de administración; la talla y la tolerancia del individuo; la gravedad de la afección; el riesgo de efectos secundarios; la vía de administración; y la modalidad de obtención de imágenes del resto detectable (si está presente). Un experto en la materia reconocerá que la dosis se puede modificar dependiendo de los factores anteriores o basándose en el progreso terapéutico. La expresión "forma de dosificación" se refiere al formato particular del producto farmacéutico y depende de la vía de administración. Por ejemplo, una forma de dosificación puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina para inyección.
"Sujeto", "paciente", "individuo" y términos similares se usan de manera intercambiable y se refieren a, salvo cuando se indique, mamíferos tales como seres humanos y primates no humanos, así como conejos, ratas, ratones, cabras, cerdos y otras especies de mamíferos. El término no indica necesariamente que el sujeto se ha diagnosticado con una enfermedad particular, pero típicamente se refiere a un individuo bajo supervisión médica. Un paciente puede ser un individuo que está solicitando tratamiento, supervisión, ajuste o modificación de un régimen terapéutico existente, etc. Un "paciente de cáncer" o un "paciente de l Ma " se puede referir a un individuo que ha sido diagnosticado de cáncer, actualmente está siguiendo un régimen terapéutico o está en riesgo de recaída, por ejemplo, tras la cirugía para extraer un tumor. En algunas realizaciones, el paciente de cáncer ha sido diagnosticado de cáncer y es un candidato para terapia. Los pacientes de cáncer pueden incluir individuos que no han recibido tratamiento, que están recibiendo tratamiento actualmente, que se han sometido a cirugía y los que han interrumpido el tratamiento.
En el contexto del tratamiento de cáncer, un sujeto que necesita tratamiento se puede referir a un individuo que tiene cáncer o una afección precancerosa, que ha tenido cáncer y está en riesgo de recaída, que se sospecha que tiene cáncer, que se está sometiendo a un tratamiento convencional para el cáncer, tal como radioterapia o quimioterapia, etc.
"Cancerosa", "tumoral", "transformada" y términos similares incluyen células precancerosas, neoplásicas, transformadas y cancerosas, y se pueden referir a un tumor sólido o a un cáncer no sólido (véase, por ejemplo, Edge et al. AJCC Cancer Staging Manual (7a ed. 2009); Cibas y Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinical correlates (3a ed. 2009)). Cáncer incluye tanto neoplasias benignas como neoplasias malignas (de crecimiento anómalo). "Transformación" se refiere a cambios fenotípicos espontáneos o inducidos, por ejemplo, inmortalización de células, cambios morfológicos, crecimiento celular anómalo, inhibición por contacto y anclaje reducido y/o neoplasia maligna (véase, Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3a ed. 1994)). Aunque la transformación puede surgir a partir de la infección con un virus transformante y la incorporación de nuevo ADN genómico, o la absorción de a Dn exógeno, también puede surgir de manera espontánea o tras la exposición a un carcinógeno.
El término "cáncer" se puede referir a leucemias, carcinomas, sarcomas, adenocarcinomas, linfomas, cánceres sólidos y linfoides, etc. Los ejemplos de los diferentes tipos de cánceres incluyen, pero sin limitación, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma de linfocitos B, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma de células pequeñas, linfoma de células grandes, leucemia monocítica, leucemia mielógena, leucemia linfocítica aguda, mieloma múltiple, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico o NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de hígado (es decir, hepatocarcinoma), cáncer renal (es decir, carcinoma de células renales), cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de pleura, cáncer de páncreas, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de testículos, cáncer de ano, cáncer de páncreas, cáncer del conducto biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de apéndice, cáncer del intestino delgado, cáncer de estómago (gástrico), cáncer del sistema nervioso central, cáncer de piel, coriocarcinoma; cáncer de cabeza y cuello, sarcoma osteogénico, fibrosarcoma, neuroblastoma, glioma y melanoma.
Una "diana de cáncer" o "marcador de cáncer" es una molécula que se expresa o se procesa de manera diferencial en el cáncer, por ejemplo, en una célula cancerosa o en el medio de cáncer. Las dianas de cáncer ejemplares son proteínas de superficie celular tales como CLL-1 (también, por ejemplo, moléculas de adhesión celular y receptores), receptores intracelulares, hormonas y moléculas tales como proteasas que se secretan por las células en el medio de cáncer. En la materia se conocen marcadores para cánceres específicos, por ejemplo, CD45 para LMA, CD34+CD38-para las CMC de LMA, la expresión de MUC1 en cánceres de colon y colorrectales, receptores de bombesina en cáncer de pulmón y antígenos de membrana específicos de próstata (PSMA, del inglés prostate specific membrane antigen) en cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, la diana de cáncer se puede asociar con un determinado tipo de célula cancerosa, por ejemplo, células de LMA, leucemia, mieloma, linfoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama o cáncer de ovario. Una diana específica del tipo celular normalmente se expresa a niveles al menos 2 veces mayor en ese tipo celular que en una población de células de referencia. En algunas realizaciones, el marcador específico del tipo celular está presente a niveles de al menos cualquiera de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100 o 1000 veces mayores que su expresión promedio en una población de referencia. Por lo tanto, la diana se puede detectar o medir para distinguir el tipo o tipos celulares de interés de otras células. Por ejemplo, las dianas de cáncer de LMA incluyen Ly86, LILRA1 y c D180.
Una célula madre cancerosa (CMC) es una célula hallada en un tumor o cáncer sanguíneo que puede generar células que constituyen la mayor parte del cáncer. La CMC también puede ser autorrenovable, similar a una célula madre normal (no cancerosa). Las CMC pueden, por lo tanto, mediar la metástasis migrando a un tejido no tumoral en un individuo e iniciar un "nuevo" tumor. Las CMC constituyen un porcentaje muy pequeño de cualquier cáncer dado, dependiendo de la etapa a la que se detecta el cáncer. Por ejemplo, se cree que la frecuencia promedio de CMC en una muestra de células de LMA es de aproximadamente 1: 10.000. Las CMC hematopoyéticas se pueden identificar como CD34+, similar a las células madre hematopoyéticas (CMH) normales.
Los términos "internalizar", "internalización", "endocitar", "endocitosis", "engullir", y términos similares se refieren a la ingesta de una sustancia por una célula, por ejemplo, mediante endocitosis o fagocitosis mediada por anticuerpo (o receptor). Los resultados de los ensayos de c A f en el Ejemplo 5 indican que los anticuerpos de CLL-1 actualmente desvelados se pueden internalizar.
Los términos "injerto" o "incorporación de injerto" se refieren a la capacidad de una célula para sobrevivir, proliferar y/o localizarse de manera adecuada tras la introducción en un individuo o tejido. En el caso de una célula madre cancerosa (CMC), el término se puede referir a la capacidad de la CMC para generar un tumor de novo o para propagarse a un sitio diferente. El término se usa normalmente para describir la capacidad de una población de células para sobrevivir y funcionar en un modelo de xenoinjerto (por ejemplo, la incorporación de injerto de células humanas en un ratón). La incorporación del injerto de células hematopoyéticas se puede determinar tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO2006/047569. La incorporación del injerto de células tumorales se puede determinar tal como se describe, por ejemplo, en Beckhove et al. (2003) Int. J. Cancer 105:444.
El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma tanto monocatenaria como bicatenaria, y complementos de las mismas. El término "polinucleótido" se refiere a una secuencia lineal de nucleótidos. El término "nucleótido" típicamente se refiere a una unidad única de un polinucleótido, es decir, un monómero. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos de origen natural o sintético, o versiones modificadas de los mismos. Los ejemplos de polinucleótidos contemplados en el presente documento incluyen ADN monocatenario y bicatenario, ARN monocatenario y bicatenario (incluyendo ARNip), y moléculas híbridas que tienen mezclas de ADN y ARN monocatenario y bicatenario.
Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido para formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia A-G-T es complementaria a la secuencia T-C-A. La complementariedad puede ser parcial, en la que solamente parte de los ácidos nucleicos se emparejan según el emparejamiento de bases, o bien completa, en donde todos los ácidos nucleicos se emparejan según el emparejamiento de bases.
Los expertos en la materia conocen una variedad de procedimientos de medición específicos de ADN y de ARN que usan técnicas de hibridación de ácidos nucleicos (véase, Sambrook, Id.). Algunos procedimientos implican la separación por electroforesis (por ejemplo, transferencia de Southern para la detección de ADN y transferencia de Northern para la detección de ARN), pero la medición de ADN y de ARN también se puede llevar a cabo en ausencia de separación por electroforesis (por ejemplo, PCR cuantitativa, transferencia de puntos o matriz).
Las palabras "proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan de manera intercambiable para denotar un polímero de aminoácidos o un conjunto de dos o más polímeros de aminoácidos unidos o que interactúan. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en donde uno más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural, aquellos que contienen restos modificados, y polímeros de aminoácidos de origen no natural.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural, aminoácidos modificados o sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético. Los aminoácidos modificados incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, por ejemplo, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metilsulfonio. Tales análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales de péptidos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.
Los aminoácidos se pueden citar en el presente documento bien por sus símbolos habitualmente conocidos de tres letras, o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, asimismo, se pueden citar mediante sus códigos de una letra habitualmente aceptados.
"Variantes modificadas de forma conservativa" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas de forma conservativa se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas o asociadas, por ejemplo, secuencias contiguas de forma natural. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican la mayoría de las proteínas. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón se puede alterar a otro de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservativa. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá que, en determinados contextos, cada codón en un ácido nucleico (salvo AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que es normalmente el único codón del triptófano) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido están implícitas en una secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias de sonda actual.
Para las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, a un péptido, a un polipéptido o a una secuencia de proteína que altere, añada o elimine un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la materia. Dichas variantes modificadas conservativamente son adicionales, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos interespecíficos, y los alelos de la invención. Los siguientes aminoácidos son típicamente sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).
Las expresiones "idéntica" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o dos o más polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o que tienen un porcentaje específico de nucleótidos, o aminoácidos, que son los mismos (es decir, aproximadamente el 60 % de identidad, por ejemplo, al menos cualquiera del 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o una identidad mayor en una región especificada, cuando se comparan y se alinean para obtener una correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada) tal como se determina utilizando algoritmos de comparación de secuencias como BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros por defecto o mediante alineación manual e inspección visual. Véase, por ejemplo, la página web del NCBI en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Por lo tanto, se dice que tales secuencias son "sustancialmente idénticas". El porcentaje de identidad se determina típicamente sobre secuencias alineadas de manera óptima, de manera que la definición se aplica a secuencias que tiene deleciones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones. Los algoritmos usados normalmente en la materia explican los huecos y similares. Típicamente, la identidad existe sobre una región que comprende un epítopo de anticuerpo, o una secuencia que es al menos de aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o sobre una región que es de 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o sobre toda la longitud de la secuencia de referencia.
El término "recombinante" cuando se utiliza en referencia, por ejemplo, a una célula, o a un ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector, se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína natural, o que la célula proviene de una célula modificada de esta forma. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que de otra forma se expresarían de forma anómala, que se expresarían en baja cantidad, o que no se expresarían en absoluto.
El término "heterólogo", con referencia a un polinucleótido o polipéptido, indica que el polinucleótido o el polipéptido comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido heterólogo típicamente se produce de manera recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para fabricar una nueva unidad funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
III. Trastornos asociados con la CLL-1
Los anticuerpos descritos actualmente se pueden usar para detectar y tratar trastornos asociados con la CLL-1, es decir, enfermedades que se correlacionan con elevadas o reducidas expresiones de CLL-1 en superficie celular en comparación con la expresión de CLL-1 en un control convencional (por ejemplo, una célula normal no cancerosa, no enferma). La expresión de CLL-1 normalmente se limita a células del linaje mieloide, por ejemplo, células dendríticas, granulocitos y monocitos en la sangre periférica y en el bazo. Los elevados niveles de CLL-1 se asocian con cáncer, en particular, en CMC (por ejemplo, c Ml ) y en trastornos mieloproliferativos, que incluyen leucemias tales como LMA (leucemia mielógena aguda o leucemia mieloproliferativa), SMD (síndrome mielodisplásico), mielofibrosis, LMMC (leucemia mielomonocítica crónica), mieloma múltiple, plasmacitoma y LMC (leucemia mielógena crónica o leucemia mieloproliferativa). Véase Bakker et al. (2004) Cancer Res. 64:8443; Van Rhenen et al. (2007) Blood 110:2659-66; Zhao et al. (2010) Haematologica (2010) 95:71; Van Rhenen et al. (2007) Leukemia 21:1700; y Herrmann et al. (2012) Haematologica 97:219.
Las células de LMA se pueden caracterizar y distinguir de otras células detectando la expresión del marcador de superficie celular. Aparte de ser CLL-1+, las células de LMA pueden ser CD33+ (aunque algunas son CD33-), CD45+ y CDw52+. Los blastocitos de LMA (incluyendo CML) típicamente son CD34+CD38-. Las CMH y las CML se pueden caracterizar mediante la expresión de c D34, pero las primeras no expresan CLL-1. Las células de SMD se pueden caracterizar mediante la expresión de CD5, CD7, CD13 y CD34. Las células de LMC se pueden caracterizar mediante la expresión de 7-ADD, CD33, CD34 y CD38.
Los síndromes mielodisplásicos (SMD) incluyen un grupo de trastornos de formación de sangre estrechamente relacionados, en los que la médula ósea presenta cambios cualitativos y cuantitativos que sugieren un proceso preleucémico, pero que tienen un desarrollo crónico que no necesariamente termina como leucemia aguda. Una variedad de términos, que incluyen preleucemia, anemia refractaria, anemia dismielopoyética refractaria, leucemia quiescente o subaguda, síndrome dismielopoyético (SDMP) y mielodisplasia, se han usado todos para describir el SMD. Estas afecciones se caracterizan todas por una médula celular con maduración alterada (dismielopoyesis) y una reducción en el número de células sanguíneas. El SDMP se caracteriza por la presencia de megablastoides, displasia megacariocítica y un aumento en el número de blastocitos anómalos, reflejo del proceso potenciado de maduración de granulocitos. Los pacientes con SDMP muestran anomalías cromosómicas similares a las halladas en leucemia mieloide aguda y progresa a leucemia mieloide aguda en una determinada parte de los pacientes afligidos.
Los trastornos mieloproliferativos crónicos son una colección de afecciones caracterizadas por un elevado número de granulocitos maduros e inmaduros, eritrocitos y plaquetas. Los trastornos mieloproliferativos crónicos pueden hacer transición a otras formas dentro de este grupo, con una tendencia a terminar en leucemia mieloide aguda. Las enfermedades específicas dentro de este grupo incluyen policitemia vera, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide agnogénica, trombocitemia esencial y leucemia neutrofílica crónica.
La mielofibrosis se caracteriza por la cicatrización de la matriz ósea que da como resultado un número reducido de glóbulos rojos, de glóbulos blancos y de plaquetas. La cicatrización mielofibrótica puede ser resultado de la leucemia, pero puede tener otras causas, tales como trombocitosis o efectos adversos de los fármacos.
IV. Anticuerpos de CLL-1
En el presente documento se proporcionan anticuerpos de CLL-1 (es decir, anticuerpos específicos de CLL-1, anti-CLL-1) que se unen de manera específica a la CLL-1 humana, en particular, al dominio extracelular de una célula que expresa CLL-1. De acuerdo con la invención, los anticuerpos de CLL-1 son tal como se indica en las reivindicaciones y se unen a un epítopo que incluye un componente que está fuera del dominio de lectina C de manera que los anticuerpos se unen a un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C con mejor afinidad que un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C y en el dominio de pedúnculo de la CLL-1 o el dominio extracelular de la CLL-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a un polipéptido que consiste en el dominio de lectina C de CLL-1 con una Kd al menos 5 veces mayor que un polipéptido que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de CLL-1 (por ejemplo, cualquiera de 10, 20, 50, 100 o más veces). Por ejemplo, los anticuerpos de CLL-1 designados como M26 y M31 se unen a los aminoácidos 101-265 de la CLL-1 humana con mayor afinidad que a los aminoácidos 141-265 de la CLL-1 humana (con referencia a la SEQ ID NO:2). En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une al dominio de lectina C con una Kd que es al menos 5, 10, 20, 50 o 100 veces mayor que la CLL-1 de longitud completa (o el dominio extracelular de longitud completa de la CLL-1).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 tienen una afinidad por la CLL-1 humana con una Kd de 1000 pM o menor, por ejemplo, cualquiera de 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM o menor. En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 tienen una afinidad por la CLL-1 humana con una Kd de 10 nM o menor, por ejemplo, 1 nM o menor, 1-10 nM, 100-1000 pM, 10-1000 pM, aproximadamente 1 nM o menor, 1-500 pM. En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 también se unen a la CLL-1 de primate, por ejemplo, CLL-1 de cinomolgo, con una Kd que es 10 nM, 1 nM, 500 pM o menor. En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 se unen a CLL-1 de cinomolgo con una Kd que está dentro de un orden de magnitud de la Kd para la CLL-1 humana. Un experto en la materia entenderá que los valores de Kd más bajos indican una mayor afinidad.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 se unen a un amplio intervalo de variantes de glucosilación de CLL-1. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la CLL-1 se unen a una forma (por ejemplo, una variante de glucosilación) de CLL-1 que se expresa en células de LMA. Por ejemplo, los anticuerpos de CLL-1 descritos actualmente se pueden unir al menos a cualquiera de 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o un porcentaje mayor de células en un cultivo de células de LMA (por ejemplo, las líneas celulares HL60, THP1 y U937). En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 se pueden unir al menos a cualquiera de 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o un porcentaje mayor de células en una muestra de un paciente de LMA (por ejemplo, una muestra de PBMC o biopsia de un paciente de LMA). Un experto entenderá que, en tal ensayo de unión celular, se añade una concentración apropiada de anticuerpo, por ejemplo, de modo que haya suficientes moléculas de anticuerpos presentes para unirse al número de células en el cultivo o muestra.
Sorprendentemente, los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento pueden inhibir el crecimiento in vitro e in vivo de células que expresan CLL-1 incluso en ausencia de un agente citotóxico conjugado. Dado el alto porcentaje de unión a células de LMA de muestras de pacientes, los anticuerpos descritos actualmente proporcionan una opción terapéutica útil para pacientes de LMA, así como para aquellos que padecen SMD o LMC con CLL-1+.
Los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento también presentan actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (véase, por ejemplo, la Figura 1) y actividad de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) (véase el Ejemplo 5). Estos anticuerpos de CLL-1, por lo tanto, se pueden usar para direccionar a las células que expresan CLL-1 a la destrucción, por ejemplo, en ausencia de un agente citotóxico conjugado.
Los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento tienen actividades de unión a células únicas en comparación con los anticuerpos caracterizados anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos descritos actualmente se unen a un epítopo que está presente en un mayor porcentaje de células primarias de pacientes de LMA. Estos anticuerpos se pueden usar para detectar células cancerosas que presentan un epítopo que se direcciona con alta afinidad por al menos uno de los anticuerpos de CLL-1 desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, aquellas células cancerosas, por lo tanto, se pueden direccionar para la destrucción con el mismo anticuerpo de CLL-1. Tales procedimientos pueden incluir el tratamiento de un individuo que tiene células cancerosas que expresan CLL-1 que comprende la administración del anticuerpo de CLL-1 al individuo.
En algunas realizaciones, la invención incluye anticuerpos de CLL-1 que compiten por la unión a CLL-1 con un anticuerpo competidor seleccionado del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de M26 (véase el Ejemplo 1, Tabla 3).
• un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de M31 (véase el Ejemplo 1, Tabla 3).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 compiten por la unión a CLL-1 con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable con identidad sustancial (al menos el 85, 90, 95 o 98 % de identidad) con las de M26 (Vh = SEQ ID NO:4; VI = SEQ ID NO:6)
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable con identidad sustancial con las de M31 (Vh = SEQ ID NO:8; V1 = SEQ ID NO:10).
Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, incluyendo radioinmunoensayo (RIA, del inglés radioimmunoassay) directo o indirecto en fase sólida; inmunoensayo enzimático (EIA, del inglés enzyme immunoassay) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich (véase Stahli et al., Methods in Enzimology 9:242-253 (1983)); EIA en fase sólida directa de biotina-avidina (véase, Kirkland et al., J. Immuno.
137:3614-3619 (1986)); ensayo de marcaje directo en fase sólida; ensayo de tipo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcaje directo de fase sólida usando un marcador 1-125 (véase Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); EIA en fase sólida directa de biotina-avidina (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); y RIA de marcaje directo (Moldenhauer et al., Scand J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Típicamente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o a células que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Normalmente, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante ensayo de competición (anticuerpos de competición) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que tenga lugar un impedimento estérico. Normalmente, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia con un antígeno común en al menos el 50 o el 75 %.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se selecciona del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de M26 (véase el Ejemplo 1, Tabla 3);
• un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de M31 (véase el Ejemplo 1, Tabla 3).
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se selecciona del grupo que consiste en:
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable con identidad sustancial (al menos el 85, 90, 95 o 98 % de identidad) con las de M26 (Vh = SEQ ID NO:4; VI = SEQ ID NO:6)
• un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable con identidad sustancial con las de M31 (Vh = SEQ ID NO:8; V1 = SEQ ID NO:10).
En algunas realizaciones, el anticuerpo también tiene al menos una actividad seleccionada de
• Unión a una CLL-1 humana con una Kd de 10 nM o menor, por ejemplo, 1 nM o menor, 1-10 nM, 100-1000 pM, 10-1000 pM, aproximadamente 1 nM o menor, 1-500 pM, etc.;
• Una CE50 de 200 ng/ml o menos en un ensayo de CDC con células H60 o células de LMA que expresan CLL-1 de un paciente de LMA;
• Una CE50 de 100 pM o menos en un ensayo de CAF con células H60 o células de LMA que expresan CLL-1 de un paciente de LMA; y
• Reducción del crecimiento celular de células que expresan CLL-1 (por ejemplo, células HL60, células de LMA), en comparación el crecimiento celular en ausencia del anticuerpo.
Cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a CLL-1, por ejemplo, un Fab. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se marca con un agente detectable, por ejemplo, tal como se describe a continuación. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se une a un agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico o citotóxico tal como se describe a continuación.
A. Procedimientos para preparar anticuerpos
Para la preparación de los anticuerpos descritos actualmente, por ejemplo, anticuerpos recombinantes, monoclonales o policlonales, se pueden usar muchas técnicas conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); y Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed. 1986)). Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de interés se pueden clonar a partir de una célula, por ejemplo, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal se pueden clonar a partir de un hibridoma y utilizarse para producir un anticuerpo monoclonal recombinante. Las bibliotecas de genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar a partir de hibridomas o células plasmáticas. Las combinaciones aleatorias de productos génicos de cadena pesada y ligera generan un gran grupo de anticuerpos con diferentes especificidades antigénicas (véase, por ejemplo, Kuby, Immunology (3a ed. 1997)). Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple o anticuerpos recombinantes (Patente de los Estados Unidos N.° 4.946.778; Patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567) se pueden adaptar para producir anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención. También, los ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados o humanos (véansepor ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)). Como alternativa, la tecnología de presentación en fago se puede usar para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen de manera específica a los antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). Los anticuerpos también se pueden hacer biespecíficos, es decir, capaces de reconocer dos antígenos diferentes (véase, por ejemplo, el documento WO 93/08829, Traunecker et al. EMBO J. 10:3655-3659 (1991); y Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). Los anticuerpos también pueden ser heteroconjugados, por ejemplo, dos anticuerpos o inmunotoxinas unidos covalentemente (véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 4.676.980, el documento WO 91/00360; el documento WO 92/200373; y el documento EP 03089).
Los anticuerpos se pueden producir usando cualquier número de sistemas de expresión, incluyendo sistemas de expresión procariota y eucariota. En algunas realizaciones, el sistema de traducción es una expresión en célula de mamífero, tal como un hibridoma o un sistema de expresión en células CHO. Muchos de estos sistemas están ampliamente disponibles de proveedores comerciales. En realizaciones en las que un anticuerpo comprende tanto una región de Vh como una región de Vl, las regiones Vh y Vl se pueden expresar usando un único vector, por ejemplo, una unidad de expresión dicistrónica o bajo el control de diferentes promotores. En otras realizaciones, las regiones Vh y Vl se pueden expresar usando vectores separados. Una región Vh o Vl tal como se describe en el presente documento puede comprender opcionalmente una metionina en el extremo N-terminal.
Un anticuerpo de la invención también se puede producir en diversos formatos, que incluyen un Fab, un Fab', un F(ab')2, un scFv o un dAB. Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos mediante una variedad de procedimientos, que incluyen, la digestión de un anticuerpo intacto con una enzima, tal como pepsina (para generar fragmentos (Fab')2) o papaína (para generar fragmentos Fab); o síntesis de novo. Los fragmentos de anticuerpo también se pueden sintetizar usando la metodología del ADN recombinante. En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 comprende fragmentos F(ab')2 que se unen de manera específica a CLL-1. Un anticuerpo de la invención también puede incluir una región constante humana. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology (Paul ed., 4a ed. 1999); Bird, et al., Science 242:423 (1988); y Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879 (1988).
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos (es decir, usar CDR de anticuerpos no humanos) también se conocen en la materia. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se citan a menudo como restos importados, que se toman normalmente de un dominio variable donante. La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (véanse, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
2:593-596 (1992)), sustituyendo las CDR o las secuencias de CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos N.° 4.816.567) en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la CDR y posiblemente algunos restos de la FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se puede conjugar con otra molécula, por ejemplo, polietilenglicol (PEGilación) o albúmina sérica, para proporcionar una semivida prolongada in vivo. Los ejemplos de PEGilación de fragmentos de anticuerpos se proporcionan en Knight et al. Platelets 15:409, 2004 (para abciximab); Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994 (para un anticuerpo anti-CEA); Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999; y Humphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227,2007). El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo también se pueden marcar o conjugar con un agente terapéutico tal como se describe a continuación.
B. Afinidad de unión
La especificidad de unión se puede definir en términos de las constantes de disociación (Kd) comparativa del anticuerpo (u otro resto de direccionamiento) por la diana, en comparación con la constante de disociación con respecto al anticuerpo y otros materiales en el ambiente o moléculas no relacionadas en general. Típicamente, la Kd para el anticuerpo con respecto al material no relacionado será al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces o más que la Kd con respecto a la diana.
La afinidad deseada para un anticuerpo, por ejemplo, alta (pM a bajo nM), media (bajo nM a 100 nM) o baja (aproximadamente 100 nM o mayor), puede diferir en función de si se está usando como un agente de diagnóstico o como producto terapéutico. Sin quedar limitado a ninguna teoría, en un ejemplo, un anticuerpo con afinidad media puede ser más exitoso en la localización de un tumor en comparación con uno de alta afinidad. Por lo tanto, los anticuerpos que tienen diferentes afinidades se pueden usar para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.
Un resto de direccionamiento típicamente se unirá con una Kd de menos de aproximadamente 1000 nM, por ejemplo, menos de 250, 100, 50, 20 nM o menos. En algunas realizaciones, la Kd del agente de afinidad es de menos de 15, 10, 5 o 1 nM. En algunas realizaciones, la Kd es 1-100 nM, 0,1-50 nM, 0,1-10 nM o 1-20 nM. El valor de la constante de disociación (Kd) se puede determinar mediante procedimientos bien conocidos, y se puede calcular incluso para mezclas complejas mediante los procedimientos tal como se desvela, por ejemplo, en Caceci et al., Byte (1984) 9:340-362.
La afinidad de un anticuerpo o de cualquier agente de direccionamiento por una diana se puede determinar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la materia, por ejemplo, tal como se revisa en Ernst et al. Determination of Equilibrium Dissociation Constants, Therapeutic Monoclonal Antibodies (Wiley y Sons ed. 2009).
Se puede usar ELISA cuantitativo y procedimientos de afinidad similares basados en matrices. El ELISA (ensayo de señalización inmunoabsorbente ligado a enzimas) es un procedimiento basado en anticuerpos. En algunos casos, un anticuerpo específico para una diana de interés se fija a un sustrato, y se pone en contacto con una muestra de la que se sospecha que contiene la diana. La superficie se lava posteriormente para retirar las sustancias no unidas. La unión a la diana se puede detectar en una variedad de formas, por ejemplo, usando una segunda etapa con un anticuerpo marcado, marcaje directo de la diana, o marcaje del anticuerpo primario con un marcador que es detectable tras la unión al antígeno. En algunos casos, el antígeno se fija al sustrato (por ejemplo, usando un sustrato con alta afinidad por proteínas o una interacción estreptavidina-biotina) y se detecta usando un anticuerpo marcado (u otro resto de direccionamiento). Se han desarrollado varias permutaciones de los procedimientos originales de ELISA y se conocen en la materia (véase Lequin (2005) Clin. Chem. 51:2415-18 para una revisión).
La Kd, la Kon y la Koff también se pueden determinar usando resonancia de plasmón superficial (RPS), por ejemplo, tal como se mide usando el sistema Biacore T100. Las técnicas de RPS se revisan, por ejemplo, en Hahnfeld et al. Determination of Kinetic Data Using SPR Biosensors, Molecular Diagnosis of Infectious Diseases (2004). En un experimento típico de RPS, una molécula de interacción (diana o agente de direccionamiento) se inmoviliza en un portaobjetos activo para RPS, de vidrio, recubierto de oro, en una celda de flujo, y se introduce una muestra que contiene la otra molécula de interacción para que fluya a través de la superficie. Cuando la luz de una frecuencia dada brilla en la superficie, los cambios en la reflectividad óptica del oro indican la unión y la cinética de la unión.
La afinidad de unión también se puede determinar anclando una molécula de interacción biotinilada a una placa de sensor de estreptavidina (SA). La otra molécula de interacción se pone después en contacto con la placa y se detecta, por ejemplo, tal como se describe en Abdessamad et al. (2002) Nuc. Acids Res. 30:e45.
C. Determinación del epítopo de CLL-1
El sitio de unión del anticuerpo a la CLL-1 se puede mapear usando técnicas conocidas para el mapeo del epítopo. Un experto en la materia apreciará que la estrategia usada para el mapeo del epítopo puede variar dependiendo del antígeno, por ejemplo, cuando se expresa en la célula, las modificaciones postraduccionales de la secuencia primaria de los polipéptidos, y las diferencias entre la estructura del antígeno en diferentes células o en diferentes ambientes.
La CLL-1 es una proteína transmembrana con aproximadamente 200 aminoácidos extracelulares. El dominio extracelular está glucosilado, e incluye un dominio de lectina C. El epítopo para un anticuerpo de CLL-1 se puede determinar o determinar parcialmente variando la secuencia primaria o el estado de glucosilación de la CLL-1, y comparando la afinidad del anticuerpo de CLL-1 por las diferentes variantes de CLL-1.
Tal mapeo del epítopo se puede llevar a cabo in vitro, por ejemplo, mediante exploración de bibliotecas de presentación en fago o de bibliotecas de péptidos sintéticos, por ejemplo, usando perlas u otras matrices sólidas. Los topos lineales típicamente tienen aproximadamente seis aminoácidos, aunque esto puede variar algo. Con el fin de imitar a los epítopos lineales presentes en una proteína, se pueden preparar péptidos sintéticos que se corresponden con la secuencia. En algunas realizaciones, esta secuencia se extiende sobre los extremos N-terminal y/o C-terminal para proporcionar restos de aminoácidos adicionales que están presentes en las secuencias flanqueantes en la proteína. Esto puede imitar más estrechamente el entorno de la estructura primaria y, en cierta medida, de la estructura secundaria del epítopo. Además, los restos que incluyen, pero sin limitación, una o más glicinas o ácido gamma aminobutírico, se pueden adjuntar a cualquiera de los extremos terminales para proporcionar un espaciador para minimizar las interacciones estéricas con, por ejemplo, una fase sólida usada en un inmunoensayo. La longitud del espaciador a menudo varía para determinar de forma empírica la mejor estructura.
Debido a la naturaleza variable del epítopo y a los posibles efectos debido a las secuencias flanqueantes, en algunas realizaciones, se pueden usar péptidos que varían en longitud alargando los extremos N-terminal o C-terminal en un determinado número de restos. Otra estrategia utiliza la repetición de epítopos del péptido o la alternancia de los epítopos con los restos espaciadores intermedios. La longitud de estos péptidos a menudo varía de acuerdo con el número deseado de unidades de repetición.
Una estrategia para el mapeo del epítopo es sintetizar péptidos solapantes, por ejemplo de 20 restos de longitud, con un solapamiento de seis restos, que abarca la secuencia primara de la región extracelular de la CLL-1. Si tal selección sistemática de péptidos se usa para mapear el epítopo, los péptidos se pueden modificar para que superen las interacciones indeseables con los soportes de fase sólida usados en los inmunoensayos. Un modo es sustituir los restos hidrófobos en el péptido con los hidrófilos, con el fin de reducir o minimizar las interacciones hidrófobas y aumentar la accesibilidad de los péptidos. De manera similar, los restos del péptido cargados se pueden sustituir con restos no cargados para eliminar las interacciones iónicas con la fase sólida. T ambién se pueden modificar los péptidos añadiendo grupos de espaciadores de una variedad de estructuras para colocar el epítopo del péptido más lejos de la fase sólida y minimizar el impedimento estérico.
Se pueden sintetizar péptidos para que reflejen las modificaciones postraduccionales que están presentes sobre la proteína natural o la proteína natural sobre células direccionadas. Las modificaciones incluyen, pero sin limitación, la glucosilación y la fosforilación en sitios específicos en la proteína.
Otra estrategia para determinar el epítopo es expresar variantes de CLL-1 en células, y comparar las afinidades del anticuerpo de CLL-1 entre las diferentes variantes. Las variantes de CLL-1 se pueden diseñar tal como se describe para los estudios de péptidos. Además, los restos glucosilados (por ejemplo, asparagina, arginina, serina, treonina, tirosina) se pueden sustituir para determinar si el epítopo incluye un sitio de glucosilación. De manera similar, los restos fosforilados (serina, treonina, tirosina) se pueden sustituir.
El epítopo también se puede determinar o determinar parcialmente comparando la afinidad de los anticuerpos por diferentes tipos de células que expresan CLL-1. Por ejemplo, la afinidad del anticuerpo se puede determinar y comparar con células primarias de LMA, por ejemplo, blastocitos de LMA y células tumorales de LMA; con líneas celulares de LMA, con otras células mieloides no cancerosas, etc.
D. Ensayos CDC, CCDA y CAF
Los anticuerpos descritos actualmente son eficaces para la citotoxicidad dependiente de células (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA), y citotoxicidad de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) de células que expresan CLL-1. Las células ejemplares que expresan CLL-1 incluyen líneas celulares que expresan CLL-1 heterólogo, recombinante (por ejemplo, CLL-1 humano); líneas celulares de LMA humana tales como HL60, THP1, TF1-alfa, U937 y OCI AML-5 (las cuatro primeras están disponibles de ATCC); las células primarias de uno o más pacientes de LMA (por ejemplo, PBMC o células tumorales injertadas); líneas celulares de LMC humana tales como K562 y KU812 (disponibles de ATCC); y células primarias de uno o más pacientes de LMC o SMD.
Se describe que un anticuerpo tiene actividad CDC y que media CDC si da como resultado la eliminación dependiente del complemento de células que expresan la diana del anticuerpo. Los ensayos de CDC se conocen en la materia y se describen, por ejemplo, en Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol. Methods 202:163; Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178; y en el Ejemplo 6, a continuación. Los kits y servicios de CDC están comercialmente disponibles, por ejemplo, de GeneScript® y Cell Technology Inc.
En resumen, el ensayo típicamente se lleva a cabo in vitro e incluye anticuerpos que se unen a una célula que expresa el anticuerpo diana en su superficie. Los componentes del complemento, que incluyen C1q que se une a la región Ch del anticuerpo, se añaden. Los componentes del complemento después interactúan para eliminar la célula diana. La CDC se mide tras un período de incubación de generalmente entre 4 y 24 horas, por ejemplo, determinando la liberación de enzima intracelular o gránulos conocidos por estar presentes en la célula diana, mediante comparación de la población de célula diana inicial y final, etc.
Se describe que un anticuerpo tiene actividad CCDA y que media CCDA si da como resultado la eliminación de células unidas al anticuerpo (por ejemplo, células que expresan CLL-1) por células efectoras. Las células efectoras típicamente son células citolíticas naturales, pero también pueden ser macrófagos, neutrófilos o eosinófilos. Las líneas de células efectoras diseñadas genéticamente también se han desarrollado para su uso en ensayos de CCDA (véase, por ejemplo, Schnueriger et al. (2011) Mol. Immunol. 48:1512). Los ensayos de ADCC se conocen en la materia y se describen, por ejemplo, en Perussia y Loza (2000) Methods in Mol. Biol. 121:179; Bretaudeau y Bonnaudet (2011) BMC Proceedings 5 (Supl 8):P63; y en el Ejemplo 12, a continuación. Los kits y servicios de ADCC están comercialmente disponibles, por ejemplo, de GeneScript® y Promega®.
En resumen, el ensayo típicamente se lleva a cabo in vitro e incluye anticuerpos que se unen a una célula que expresa el anticuerpo diana en su superficie. Se añaden células efectoras que reconocen las células unidas al anticuerpo, típicamente a través de un receptor de Fc tal como CD16. Las células efectoras eliminan a la célula unida al anticuerpo, por ejemplo, liberando citotoxinas que provocan la apoptosis. La muerte celular se detecta mediante la liberación de un elemento detectable en las células diana (por ejemplo, Cr51) o mediante la detección de un elemento implicado en la toxicidad mediada por células (por ejemplo, la activación de señalización de NFAT en células efectoras).
Se describe que un anticuerpo tiene actividad de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) (o que medina CAF) si el anticuerpo, cuando se conjuga con un agente citotóxico (fármaco), da como resultado la eliminación (inhibición de la supervivencia) de una célula que expresa la diana del anticuerpo, en este caso, CLL-1. Los agentes citotóxicos apropiados se conocen en la materia, por ejemplo, saporina, doxorrubicina, daunomicina, alcaloides de la vinca, taxoides, agentes de tubulina (por ejemplo, maitansina, auristatina), y agentes de ADN (por ejemplo, caliqueamicina, duocarmicina, dímeros de pirrolobenzodiacepina), etc. Los ensayos de CAF se conocen en la materia, por ejemplo, tal como se describe en Gerber et al. (2009) 3:247, y en los ejemplos a continuación.
E. Internalización
Los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento se pueden internalizar en células que expresan CLL-1, incluyendo células de LMA de CLL-1. Es decir, la célula que expresa CLL-1 puede internalizar los anticuerpos descritos en el presente documento. Los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento proporcionan un medio eficaz para el direccionamiento de tales células, por ejemplo, con conjugados detectables o citotóxicos.
La internalización porcentual y la tasa de internalización de un anticuerpo se puede evaluar usando procedimientos conocidos en la materia, que incluyen, por ejemplo, citometría de flujo (FACS) y microscopía confocal de fluorescencia. Tales métodos se describen, por ejemplo, en Lue et al. (2007) Nature Protocols (Nature Med. 13:587-96); Cho et al. (2010) Biomacromolecules y Corbani et al. (2004) Endocrinology 145:2876-85, y tal como se describe en el presente documento.
Para FACS y microscopía confocal, las células se incuban con un agente de direccionamiento marcado por fluorescencia, por ejemplo, un anticuerpo. Las células se seleccionan típicamente para expresar la diana del anticuerpo marcado, por ejemplo, CLL-1. Después se pueden usar células de control que no expresan la diana. La internalización típicamente tiene lugar a 37 °C, pero no a 4 °C, lo que proporciona otro control para la reacción. Por lo tanto, las células se pueden poner en contacto con el agente marcado e incubarse a 37 °C o a 4 °C (por ejemplo, para detectar la unión sin la internalización).
El agente no unido y el unido a la superficie se retiran mediante el lavado de las células, por ejemplo, en un lavado ácido, seguido por un lavado con un tampón a pH normal.
Si se usan células adherentes, las células se retiran del sustrato antes de la citometría de flujo. El porcentaje de células fluorescentes indica el porcentaje de internalización del agente marcado de manera fluorescente. El porcentaje de internalización también se puede expresar, por ejemplo, como un porcentaje de agente marcado inicial añadido a las células.
La internalización de un agente también se puede evaluar determinando la localización del agente marcado por fluorescencia mediante microscopía confocal. Los procedimientos de uso de microscopía confocal para determinar la internalización se describen en, por ejemplo, Xiao et al. (2008) Chem. Eur. J., 14:1769-1775. Brevemente, las células se ponen en contacto con agente marcado y se incuban tal como se describe anteriormente. Después de la incubación, las células se pueden incubar en hielo, lavar en tampón PBS a 4 °C, tratar con tripsina al 0,25 % (para eliminarlo del sustrato, si procede). La suspensión celular se puede aplicar entonces a portaobjetos para microscopía confocal de fluorescencia. Los microscopios confocales adecuados incluyen el microscopio confocal FV500-IX81 (Olympus America Inc.; Center Valley, PA) y Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc.; Melville, NY).
V. Aplicaciones de diagnóstico
Los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento se unen de manera específica a células que expresan CLL-1. Los anticuerpos de CLL-1, por lo tanto, se pueden usar para ensayos de diagnóstico in vitro e in vivo para detectar las células que expresan CLL-1 (por ejemplo, células de LMA y CMC de LMA). Por ejemplo, se puede obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre o de biopsia de tejido) de un paciente y ponerla en contacto con un anticuerpo de CLL-1, y se puede determinar la presencia de una célula que expresa CLL-1 en la muestra del paciente detectando la unión del anticuerpo. La unión del anticuerpo se puede determinar directamente (por ejemplo, cuando el propio anticuerpo está marcado) o usando un segundo agente de detección, tal como un anticuerpo secundario. El marcador detectable se puede asociar con un anticuerpo de la invención, tanto directa como indirectamente, por ejemplo, mediante un quelante o enlazador.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se pone en contacto con una muestra biológica de un individuo que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno asociado con la CLL-1, y se determina la unión del anticuerpo a una célula en la muestra, en donde una unión del anticuerpo mayor o menor de lo normal indica que el individuo tiene un trastorno asociado con la CLL-1. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre o una fracción de sangre (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, glóbulos rojos, glóbulos blancos, PBMC). En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de tejido (biopsia), por ejemplo, de un sitio de sospecha de tumor, o de un tejido del que se sabe que está afectado, por ejemplo, para determinar los límites de un tumor conocido.
Normalmente, las biopsias se realizan para obtener muestras de tejidos, es decir, tipos celulares no de fluidos. La técnica de biopsia aplicada dependerá del tipo de tejido a evaluar (por ejemplo, mama, piel, colon, próstata, riñón, pulmón, vejiga, nódulo linfático, hígado, médula ósea, vía respiratoria o pulmón). En el caso de un cáncer, la técnica también dependerá del tamaño y del tipo de tumor (por ejemplo, sólido, en suspensión o sanguíneo), entre otros factores. Las técnicas de biopsia representativas incluyen, pero sin limitación, biopsia excisional, biopsia incisional, biopsia con aguja, biopsia quirúrgica y biopsia de médula ósea. Una "biopsia excisional" se refiere a la extirpación de una masa completa de tumor con un pequeño margen de tejido normal que lo rodea. Una "biopsia incisional" se refiere a la extirpación de una porción de tejido que incluye un diámetro en sección transversal del tumor. Un diagnóstico o pronóstico hecho mediante endoscopia o fluoroscopia puede requerir una "biopsia con aguja gruesa" de la masa tumoral, o una "biopsia de aspiración con aguja fina" que generalmente obtiene una suspensión de células de dentro de la masa tumoral. Las técnicas de biopsia se tratan, por ejemplo, en Principles of Internal Medicine, de Harrison, Kasper, et al., eds., 16a ed., 2005, Capítulo 70 y a lo largo de la Parte V.
Cualquier procedimiento de detección de la unión del anticuerpo a una célula en una muestra se puede usar para los presentes ensayos de diagnóstico. Los procedimientos de detección de la unión de anticuerpos son bien conocidos en la materia, por ejemplo, citometría de flujo, microscopia de fluorescencia, ELISA, etc. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la preparación de la muestra biológica para la detección antes de la etapa de determinación. Por ejemplo, una subpoblación de células (por ejemplo, glóbulos blancos, células CD34+, células CD45+, etc.) se pueden separar del resto de la muestra del individuo (por ejemplo, otros componentes de la sangre) o las células en un tejido se pueden suspender para una detección más fácil.
En algunas realizaciones, el porcentaje de células que expresan CLL-1 en la muestra se determina y se compara con un control, por ejemplo, una muestra de un individuo o de un grupo de individuos de los que se sabe que tienen un trastorno asociado con la CLL-1 (control positivo) o de un individuo o grupo de individuos de los que se sabe que no tienen un trastorno asociado con la CLL-1 (normal, sano, no enfermo o control negativo). En algunas realizaciones, el control es un intervalo estándar de expresión de CLL-1 establecido para un tejido dado. Un porcentaje mayor o menor que el porcentaje normal de las células que expresan CLL-1 o un nivel de expresión mayor o menor, indica que el individuo tiene un trastorno asociado con la CLL-1.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de CLL-1 marcado se puede proporcionar (administrar) a un individuo para determinar la aplicabilidad de una terapia pensada. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo marcado para detectar la densidad de CLL-1 dentro de un área deseada, en donde la densidad es típicamente alta en relación con el tejido no enfermo. Un anticuerpo marcado también puede indicar que el área enferma es accesible para la terapia. Por lo tanto, los pacientes se pueden seleccionar para la terapia basándose en los resultados de las imágenes. La caracterización anatómica, tal como la determinación de los límites concretos de un cáncer, se puede realizar usando técnicas convencionales de obtención de imágenes (por ejemplo, tomografía computarizada (CT), IRM, tomografía por emisión de positrones (PET), etc.).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de CLL-1 marcados tal como se describen en el presente documento se pueden asociar adicionalmente con un compuesto terapéutico, por ejemplo, para formar una composición de "teranóstico". Por ejemplo, un anticuerpo de CLL-1 se puede unir (directa o indirectamente) tanto a un marcador detectable como a un agente terapéutico, por ejemplo, un agente citotóxico para eliminar células cancerosas que expresan CLL-1. En algunas realizaciones, un anticuerpo de CLL-1 marcado se usa para el diagnóstico y/o la localización de una célula cancerosa que expresa CLL-1 y la célula cancerosa que expresa CLL-1 después se direcciona con un anticuerpo terapéutico único específico de CLL-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo de diagnóstico específico de CLL-1 es uno que no se internaliza en células que expresan CLL-1 a una alta tasa o porcentaje. En algunas realizaciones, el anticuerpo terapéutico de CLL-1 se internaliza en células que expresan CLL-1 a una alta tasa o porcentaje.
A. Marcadores
Un agente de diagnóstico que comprende un anticuerpo de CLL-1 puede incluir cualquier agente de diagnóstico conocido en la materia, tal como se proporciona, por ejemplo, en las siguientes referencias: Armstrong et al., Diagnostic Imaging, 5a edición, Blackwell Publishing (2004); Torchilin, V. P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995); Vallabhajosula, S., Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET and SPECT, Springer (2009). Un agente de diagnóstico se puede detectar mediante una variedad de formas, que incluyen un agente que proporciona y/o que mejora una señal detectable. Las señales detectables incluyen, pero sin limitación, señales de emisión gamma, radioactivas, ecogénicas, ópticas, fluorescentes, de absorción, magnéticas o de tomografía. Las técnicas para la obtención de imágenes del agente de diagnóstico pueden incluir, pero sin limitación, tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), formación de imágenes mediante resonancia magnética (IRM), obtención de imágenes ópticas, tomografía de emisión por positrones (PET), tomografía computarizada (CT), obtención de imágenes de rayos x, obtención de imágenes de rayos gamma y similares. Las expresiones "agente detectable", "resto detectable", "marcador", "agente de obtención de imágenes", y términos similares se usan de forma sinónima en el presente documento.
En algunas realizaciones, el marcador puede incluir agentes ópticos tales como agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimioluminiscentes y similares. Numerosos agentes (por ejemplo, colorantes, sondas, marcadores o indicadores) son conocidos en la materia y se pueden usar en la presente invención. (Véanse, por ejemplo, Invitrogen, The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Décima Edición (2005)). Los agentes fluorescentes pueden incluir una variedad de moléculas orgánicas y/o inorgánicas pequeñas o una variedad de proteínas fluorescentes y derivados de las mismas. Por ejemplo, los agentes fluorescentes pueden incluir, pero sin limitación, cianinas, ftalocianinas, porfirinas, indocianinas, rodaminas, fenoxazinas, fenilxantenos, fenotiazinas, fenoselenazinas, fluoresceínas, benzoporfirinas, escuaraínas, dipirrolopirimidonas, tetracenos, quinolinas, piracinas, corrinas, croconios, acridonas, fenantridinas, rodaminas, acridinas, antraquinonas, análogos de calcogenopirilio, clorinas, naftalocianinas, colorantes de metina, colorantes de indolenio, compuestos azo, azulenos, azaazulenos, colorantes de trifenilmetano, indoles, benzoindoles, indocarbocianinas, benzoindocarbocianinas y derivados de BODIPY™. Los colorantes fluorescentes se tratan, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 4.452.720, la patente de Estados Unidos N.° 5.227.487 y la patente de Estados Unidos N.° 5.543.295.
El marcador también puede ser un radioisótopo, por ejemplo, radionucleidos que emiten rayos gamma, positrones, partículas beta y alfa, y rayos X. Los radionucleidos adecuados incluyen, pero sin limitación, 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 166Ho, 123I, 124I, 125I, 130I, 131I, 111In, 177Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTC, 88Y y 90Y. En algunas realizaciones, los agentes radiactivos pueden incluir 111In-DTPA, 99mTc(CO)3-DTPA, 99mTc(CO)3-ENPy2, 62/64/67Cu-TETA, 99mTc(CO)3-IDA, y 99mTc(CO)3triaminas (cíclicas o lineales). En algunas realizaciones, los agentes pueden incluir DOTA y sus diversos análogos con 111In, 177Lu, 153Sm, 88/90Y, 62/64/67Cu o 67/68Ga. En algunas realizaciones, una nanopartícula se puede marcar mediante la incorporación de lípidos unidos a quelatos, tal como DTPA-lípido, tal como se proporciona en las siguientes referencias: Phillips et al., Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, 1(1): 69­ 83 (2008); Torchilin, V.P. y Weissig, V., Eds. Liposomes 2a Ed.: Oxford Univ. Press (2003); Elbayoumi, T.A. y Torchilin, V. P., Eur. J. Nucl. Med Mol. Imaging 33:1196-1205 (2006); Mougin-Degraef, M. et al., Int'l J. Pharmaceutics 344:110-117 (2007).
En algunas realizaciones, el agente de diagnóstico se puede asociar con un ligando de unión secundario o a una enzima (una etiqueta de enzima) que generará un producto de color tras el contacto con un sustrato cromogénico. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, hidrógeno peroxidasa (de rábano picante) y glucosa oxidasa. Los ligandos de unión secundarios incluyen, por ejemplo, biotina y avidina o compuestos de estreptavidina tal como se conoce en la materia.
En algunas realizaciones, el anticuerpo marcado se puede asociar adicionalmente con una composición que mejora la estabilidad in vivo, por ejemplo, p Eg o una nanopartícula tal como un liposoma, tal como se describe con mayor detalle a continuación.
B. Procedimientos de mareaje
Las técnicas para conjugar agentes detectables y terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas (véanse, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).
Típicamente, el anticuerpo se une a un resto detectable en una zona que no interfiere con la unión al epítopo. Por lo tanto, en algunos casos, el resto detectable está unido a la región constante, o fuera de las CDR en la región variable. Un experto en la materia reconocerá que el resto detectable se puede localizar en cualquier parte del anticuerpo, y la posición del resto detectable se puede ajustar en consecuencia. En algunas realizaciones, la capacidad el anticuerpo para asociarse con el epítopo se compara antes y después del acoplamiento con el resto detectable para asegurar que el acoplamiento sin duda no interrumpe unión.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se puede asociar con un resto adicional de direccionamiento. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un péptido o un aptámero que se une a un sitio diferente en la molécula diana o en la célula diana se puede conjugar con el anticuerpo para optimizar la unión a la diana, por ejemplo, a una célula cancerosa.
VI. Aplicaciones terapéuticas
Las células que expresan CLL-1 tales como células de LMA se pueden direccionar usando los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento. La expresión de CLL-1 es elevada en células de LMA y en CMC (por ejemplo, CMC de LMA). La CLL-1 no se expresa de manera significativa en células madre hematopoyéticas (CMH) CD34+, por lo tanto, las CMC se pueden distinguir de las CMH usando los presentes anticuerpos de CLL-1. Los anticuerpos de CLL-1 de alta afinidad que reconocen un epítopo de CLL-1 común para las células de LMA y, por lo tanto, capaces de unirse de forma universal a las células de l Ma , son particularmente de valor, dado que la LMA tiene una tasa de recaída muy alta. Tal como se ha indicado anteriormente, una composición terapéutica que comprende anticuerpos de CLL-1 puede incluir adicionalmente un marcador detectable para formar una composición de teranóstico, por ejemplo, para la detección y la localización de células que expresan CLL-1, y el control del efecto terapéutico.
Tal como se demuestra en el presente documento, los presentes anticuerpos de CLL-1 pueden inhibir el crecimiento de células cancerosas (proliferación y/o incorporación del injerto) y se pueden considerar, por lo tanto, solo agentes quimioterapéuticos. La siguiente divulgación proporciona ejemplos de agentes quimioterapéuticos y citotóxicos que se pueden unir a anticuerpos de CLL-1 para el efecto adicional sobre las células que expresan CLL-1.
Un agente quimioterapéutico (anticanceroso) puede ser cualquier agente capaz de reducir el crecimiento del cáncer, interferir en la replicación de células cancerosas, eliminar directa o indirectamente células cancerosas, reducir la metástasis, reducir el suministro de sangre al tumor, etc. Los agentes quimioterapéuticos, por lo tanto, incluyen agentes citotóxicos. Los agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, saporina, taxanos, alcaloides de la vinca, antraciclina y agentes a base de platino. Las clases de agentes quimioterapéuticos incluyen pero sin limitación agentes alquilantes, antimetabolitos, por ejemplo, metotrexato, alcaloides vegetales, por ejemplo, vincristina y antibióticos, por ejemplo, doxorrubicina así como fármacos misceláneos que no entran dentro de una clase particular tal como hidroxiurea. Los fármacos a base de platino, ejemplificados con cisplatino y oxaliplatino, representan una clase principal de quimioterapéuticos. Estos fármacos se unen al ADN e interfieren con la replicación. Los taxanos, ejemplificados con taxol, representan otra clase principal de quimioterapéuticos. Estos compuestos actúan interfiriendo con el citoesqueleto y la formación del huso para inhibir la división celular y prevenir, por lo tanto, el crecimiento de células cancerosas que se dividen rápidamente. Otros fármacos quimioterapéuticos incluyen la terapia hormonal.
Se puede combinar más de un agente terapéutico, bien en la misma composición o en composiciones separadas. El(los) agente(s) terapéutico(s) también se puede(n) combinar con agentes terapéuticos adicionales según sea necesario para el individuo en particular. Los agentes terapéuticos comunes proporcionados a pacientes de cáncer incluyen medicaciones para tratar el dolor, náuseas, la anemia, la infección, la inflamación y otros síntomas que comúnmente experimentan los pacientes de cáncer.
Los anticuerpos se pueden unir a un agente terapéutico, a un agente detectable o a un nanovehículo usando una variedad de agentes de reticulación conocidos. Los procedimientos para la unión covalente o no covalente de polipéptidos son bien conocidos en la materia. Tales procedimientos pueden incluir, pero sin limitación, el uso de reticuladores, de reticuladores fotoactivos y/o de reactivos de reticulación bifuncionales. Los procedimientos ejemplares para las moléculas de reticulación se desvelan en la Patente de Estados Unidos N.° 5.603.872 y la Patente de Estados Unidos N.° 5.401.511. Los ejemplos no limitantes de reactivos de reticulación incluyen glutaraldehído, oxirano bifuncional, etilenglicol diglicidil éter, carbodiimidas tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida o diciclohexilcarbodiimida, bisimidatos, dinitrobenceno, éster de N-hidroxisuccinimida de ácido subérico, disuccinimidil tartarato, dimetil-3,3'-ditio-bispropionimidato, azidoglioxal, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato y 4-(bromoadminoetil)-2-nitrofenilazida.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de CLL-1 se asocia con un nanovehículo. Para los anticuerpos conjugados con nanovehículos (por ejemplo, liposomas), un determinado número de anticuerpos estará presente sobre la superficie, es decir, a una densidad de superficie dada. En algunas realizaciones, el nanovehículo tendrá al menos 5 anticuerpos por nanovehículo, por ejemplo, al menos 10, 30, 40, 50, 75, 100 o más anticuerpos por nanovehículo. Un experto en la materia entenderá que la densidad de superficie representa un intervalo promedio, ya que el número de anticuerpos por nanovehículo no será absolutamente uniforme para todos los miembros de la población.
Los nanovehículos incluyen vesículas tales como liposomas y micelas, así como nanopartículas poliméricas, etc. Los nanovehículos son útiles para la administración de los agentes terapéuticos y de diagnóstico, pero pueden ser particularmente útiles para proteger los agentes citotóxicos usados para tratar el cáncer. El nanovehículo puede comprender lípidos (por ejemplo, fosfolípidos), polímeros hidrófilos, polímeros hidrófobos, compuestos anfipáticos, polímeros de reticulación y una matriz polimérica (véase, por ejemplo, el documento WO2009/110939). Dependiendo de la aplicación, se puede diseñar el nanovehículo para que tenga un tamaño, semivida, duración y tasa de filtración particulares.
La preparación de los nanovehículos, tal como un liposoma direccionado por anticuerpos, una nanopartícula polimérica o un liposoma de duración prolongada, se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 6465188, 7122202, 7462603 y 7550441.
En algunas realizaciones, el anticuerpo está unido a un resto de estabilización tal como PEG o un liposoma u otro nanovehículo. Las Patentes de Estados Unidos N.° 4.732.863 y 7892554 y Chattopadhyay et al. (2010) Mol Pharm 7:2194 describen procedimientos para unir el anticuerpo seleccionado a PEG, a derivados de PEG y a nanopartículas (por ejemplo, liposomas). Los liposomas que contienen fosfatidiletanolamina (PE) se pueden preparar mediante procedimientos establecidos tal como se describe en el presente documento. La inclusión de PE proporciona un sitio funcional activo en la superficie del liposoma para la unión.
El conjugado de anticuerpo también se puede formular para que proporcione más de un compuesto activo, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos o citotóxicos adicionales, citocinas o agentes inhibidores del crecimiento. Los principios activos también se pueden preparar como preparaciones de liberación sostenida (por ejemplo, matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos (por ejemplo, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas. Los anticuerpos y los inmunoconjugados se pueden atrapar en una nanopartícula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Los anticuerpos de CLL-1 descritos en el presente documento pueden eliminar las células que expresan CLL-1 solos o en combinación con un agente citotóxico. En algunas realizaciones, el procedimiento de tratamiento comprende la administración a un individuo de una cantidad eficaz de un anticuerpo de CLL-1 terapéutico o de un conjugado de anticuerpo de CLL-1, por ejemplo, un anticuerpo de CLL-1 unido a un agente terapéutico. En algunas realizaciones, al individuo se le ha diagnosticado cáncer, por ejemplo, LMA. En algunas realizaciones, el individuo está recibiendo o ha recibido terapia de cáncer, por ejemplo, cirugía, radioterapia o quimioterapia. En algunas realizaciones, al individuo se le ha diagnosticado, pero el cáncer está en remisión.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la revisión del individuo en la progresión del cáncer. En algunas realizaciones, la dosis del anticuerpo de CLL-1 o el conjugado del anticuerpo de c LL-1 para cada administración se determina basándose en el progreso terapéutico del individuo, por ejemplo, cuando se administra una dosis alta de quimioterapéutico si el individuo no está respondiendo lo suficiente a la terapia.
En algunas realizaciones, la invención puede incluir un anticuerpo o una composición dirigida por anticuerpos y un vehículo fisiológicamente (es decir, farmacéuticamente) aceptable. El término "vehículo" se refiere a una sustancia típicamente inerte usada como un diluyente o vehículo para un agente de diagnóstico o terapéutico. El término también abarca una sustancia típicamente inerte que proporciona cualidades cohesivas a la composición. Los vehículos fisiológicamente aceptables pueden ser líquidos, por ejemplo, solución salina fisiológica, tampón de fosfato, solución salina tamponada normal (NaCl 135-150 mM), agua, agua tamponada, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 %, glucoproteínas para proporcionar una estabilidad mejorada (por ejemplo, albúmina, lipoproteína, globulina, etc.) y similares. Dado que los vehículos fisiológicamente aceptables se determinan en parte mediante la composición particular que se está administrando así como mediante el procedimiento particular usado para administrar la composición, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (véase, por ejemplo, Pharmaceutical Sciences, de Remington, 17a edición, 1989).
Las composiciones de la presente invención se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas o se pueden producir en condiciones estériles. Las soluciones acuosas se pueden empaquetar para su uso o se pueden filtrar y liofilizar en condiciones asépticas, combinándose la preparación liofilizada con una solución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán y oleato de trietanolamina. También se pueden incluir azúcares para estabilizar las composiciones, tales como un estabilizante para composiciones de anticuerpos liofilizadas.
Se pueden preparar formas de dosificación para la administración mucosal (por ejemplo, nasal, sublingual, vaginal, bucal o rectal), parenteral (por ejemplo, subcutánea, intravenosa o inyección intraarterial, bien por bolo o por infusión), oral o transdérmica a un paciente. Los ejemplos de formas de dosificación incluyen, pero sin limitación: dispersiones; supositorios; pomadas; cataplasmas (emplastos); pastas; polvos; apósitos; cremas; escayolas; soluciones; parches; aerosoles (por ejemplo, pulverizadores nasales o inhaladores); geles; formas de dosificación líquidas adecuadas para administración oral o mucosal a un paciente, que incluyen suspensiones (por ejemplo suspensiones líquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua o emulsiones líquidas de agua en aceite), soluciones y elixires; formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración parenteral a un paciente; y sólidos estériles (por ejemplo, sólidos cristalinos o amorfos) que se pueden reconstituir para proporcionar formas de dosificación líquida adecuadas para la administración parenteral a un paciente.
Las composiciones inyectables (por ejemplo, intravenosas) pueden comprender una solución del anticuerpo o de la composición dirigida por anticuerpos suspendida en un vehículo aceptable, tal como un vehículo acuoso. Se puede usar cualquiera de una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4 %, solución salina isotónica al 0,9 %, glicina al 0,3 %, dextrosa al 5 % y similares, y puede incluir glucoproteínas para una estabilidad mejorada, tales como albúmina, lipoproteína, globulina, etc. A menudo, se usará solución salina tamponada normal (NaCl 135-150 mM). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. En algunas realizaciones, la composición dirigida por anticuerpos se puede formular en un kit para la administración intravenosa.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, mediante las vías intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas isotónicas para inyección, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor pensado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes.
La preparación farmacéutica puede estar envasada o preparada en forma de dosificación unitaria. En dicha forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades adecuadas del componente activo, por ejemplo, de acuerdo con la dosis del agente terapéutico o la concentración de anticuerpo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades concretas de preparación, en envases sellados de unidosis o de multidosis, tales como ampollas y frascos. La composición puede, si se desea, contener también otros agentes terapéuticos compatibles.
El anticuerpo (o la composición dirigida por el anticuerpo) se puede administrar mediante la inyección o la infusión a través de cualquier vía adecuada que incluye pero no se limita a las vías intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Un ejemplo de administración de una composición farmacéutica incluye almacenar el anticuerpo a 10 mg/ml en solución salina acuosa isotónica estéril para inyección a 4 °C, y diluirla bien en 100 ml o en 200 ml de cloruro de sodio al 0,9 % para la inyección antes de la administración al paciente. El anticuerpo se administra mediante infusión intravenosa durante el trascurso de 1 hora a una dosis de entre 0,2 y 10 mg/kg. En otras realizaciones, el anticuerpo se administra mediante infusión intravenosa durante un período de entre 15 minutos y 2 horas. En otras realizaciones más, el procedimiento de administración es una inyección de bolo por vía subcutánea.
La dosis de anticuerpo se elige con el fin de proporcionar una terapia eficaz para el paciente y está en el intervalo de menos de 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 1 mg- 2 g por paciente. En algunos casos, la dosis está en el intervalo de 1- 100 mg/kg o aproximadamente 50 mg- 8000 mg / paciente. La dosis se puede repetir a una frecuencia apropiada que puede estar en el intervalo de una vez al día o una vez cada tres meses, en función de la farmacocinética del anticuerpo (por ejemplo, la semivida del anticuerpo en la circulación) y la respuesta farmacodinámica (por ejemplo, la duración del efecto terapéutico del anticuerpo). En algunas realizaciones, la semivida in vivo es de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 25 días y la dosificación del anticuerpo se repite entre una vez por semana y una vez cada 3 meses.
La administración puede ser periódica. Dependiendo de la vía de administración, se puede administrar la dosis, por ejemplo, una vez cada 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 o 28 días o más (por ejemplo, una vez cada 2, 3, 4 o 6 meses). En algunos casos, la administración es más frecuente, por ejemplo, 2 o 3 veces por día. Se puede revisar al paciente para ajustar la dosificación y la frecuencia de administración en función del progreso terapéutico y de cualquier efecto secundario adverso, tal como reconocerá un experto en la materia.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la administración adicional depende del progreso del paciente, por ejemplo, se supervisa al paciente entre las administraciones. Por ejemplo, después de la primera administración o ronda de administraciones, se puede supervisar la tasa de crecimiento tumoral del paciente, la recaída (por ejemplo, en el caso de un paciente postquirúrgico) o de síntomas generales relacionados con la enfermedad tales como debilidad, dolor, náuseas, etc.
Para el tratamiento del cáncer, un anticuerpo o una composición dirigida por anticuerpos (por ejemplo, que incluye un agente terapéutico y/o de diagnóstico) se puede administrar a la dosificación inicial de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg diariamente y ajustarse a lo largo del tiempo. Se puede usar un intervalo de dosis diaria de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Los resultados del xenoinjerto in vivo descritos en el presente documento indican que una dosis de entre 5-20 mg de anticuerpo/kg de peso corporal es eficaz para la reducción drástica del crecimiento tumoral.
La dosificación varía dependiendo de los requisitos del paciente, de la gravedad de la afección que se está tratando y de la composición dirigida que se esté empleando. Por ejemplo, las dosificaciones se pueden determinar de forma empírica considerando el tipo y la etapa de cáncer diagnosticada en un paciente particular. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debería ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. El tamaño de la dosis también se determinará por la existencia, naturaleza y medida de cualquiera de los efectos secundarios adversos que acompañan a la administración de una composición dirigida particular en un paciente en particular, tal como reconocerá el médico experto.
Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritas en el presente documento son solo con fines ilustrativos.
VII. Ejemplos
A. Ejemplo 1: Caracterización de las secuencias del anticuerpo de CLL-1 y estructura
Se usó la CLL-1 humana para generar anticuerpos en ratones. Los anticuerpos específicos para CLL-1 se seleccionaron y se clonaron en hibridomas para la producción estable de anticuerpos monoclonales. Se clonó una serie de anticuerpos específicos para la CLL-1 y se caracterizó la secuencia y la estructura del anticuerpo. Estos datos se muestran a continuación en las Tablas 1-3. Las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera se muestran en el listado de secuencias.
Tabla 1. Estructuras de los anticuer os
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Tabla 2. Secuencias de J
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Tabla 3. Secuencias de CDR
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B. Ejemplo 2: Estudios de unión a epítopo
Para determinados clones, se llevó a cabo el mapeo de epítopos, y se comparó con la localización de la unión a CLL-1 para anticuerpos conocidos. Estos anticuerpos incluyen Nuvelo/ X1057 (documento US20100285037), Crucell/ X357 (Patente de Estados Unidos N.° 7741443) y anti-CLL-1 de cabra. A continuación se muestra un resumen en la Tabla 4. La CLL-1 o el dominio de lectina C de la CLL-1 se expresaron en células 293T. Las células 293T no transfectadas o las células 293T transfectadas con CLL-1 de ratón se usaron como controles.
Tabla 4: Unión al e íto o
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Los datos muestran que los clones M26 y M31 se unen a la CLL-1 humana, pero que el dominio de lectina C no es suficiente para la unión significativa.
También se ensayó la unión de los anticuerpos M26 y M31 a la CLL-1 de mono cinomolgo. Estos animales se pueden usar para estudios clínicos, por lo tanto, es útil tener anticuerpos específicos de diana que se unen al homólogo de mono cinomolgo de un anticuerpo humano. Se descubrió que la diana de M26 se unía a la CLL-1 de cinomolgo con alta afinidad.
Se llevaron a cabo estudios de unión a CLL-1 de cinomolgo usando ELISA. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 5.
Tabla 5: Unión a CLL-1 de cinomol o
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C. Ejemplo 3: Ensayo de afinidad
Se llevó a cabo un ensayo de afinidad para los clones de anticuerpo de CLL-1. Brevemente, la CLL-1 biotinilada (25 ug/ml) se carga en las puntas de los sensores de estreptavidina durante 2 horas a 22 °C. Se generaron curvas de disociación Ac-Ag a tres concentraciones diferentes para cada anticuerpo (10, 30 y 90 ug/ml) usando un ajuste de curva global de 1:1. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 6.
Tabla 6: Kd^ de afinidad M
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D. Ejemplo 4: Unión a líneas celulares de LMA y a muestras de pacientes de LMA
Se ensayó la unión de los anticuerpos de CLL-1 a células 293 recombinantes que expresan la CLL-1 humana, y a dos líneas celulares de LMA, HL60 y OCI AML-5. El porcentaje de células vivas con unión de anticuerpos, tal como se detecta mediante FACS, se muestra en la Tabla 7 a continuación.
Tabla 7: Unión de anticuer os a líneas celulares %
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Los anticuerpos de CLL-1 previamente caracterizados se unen típicamente a las células primaras de LMA con alta variabilidad, lo que es problemático par un amplio uso con muestras de pacientes. Algunos no se unen de manera detectable a muestras de determinados pacientes. Se ensayó la unión de los anticuerpos desvelados actualmente a células primarias de muestras de pacientes de LMA mediante FACS. Se estudiaron dos grupos de muestras: el primero, que consiste en 6 pacientes, y el segundo, que consiste en una cohorte mayor de 37. No se ensayó la unión de cada clon de anticuerpo a todas las muestras en los grupos. Los resultados de la unión se muestran en la Tabla 8. Se descubrió adicionalmente que M26 y M31 se unían al 90 % o más de las células de muestras de células primarias de un paciente de LMA mediante FACS.
T l : ni n m r LMA rim ri
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E. Ejemplo 5: Ensayos de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF)
Los ensayos de conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) se llevaron a cabo en las líneas celulares de LMA HL60 y OCI AML-5, así como células 293 recombinantes que expresan CLL-1. Brevemente, las células se incubaron con diversas concentraciones de anticuerpos conjugados con saporina durante 48-72 horas a 37 °C. La viabilidad celular se determinó mediante ensayo colorimétrico de HL para determinar los valores de CE50.
Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 9.
Tabla 9: Ensa os de CAF
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F. Ejemplo 6: Ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
Los ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento se llevaron a cabo en células primarias de pacientes de LMA. Las células primarias de LMA se incubaron con anticuerpos de CLL-1 a diversas concentraciones durante 2 horas a 37 °C en presencia del complemento. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo colorimétrico Cellglow (Promega).
La Figura 1 muestra resultados de 3 muestras de pacientes de LMA (A-C). El clon M26 del anticuerpo de CLL-1 tiene una CE50 de aproximadamente 10-100 ng/ml con estas muestras de células. La Figura 1C, que representa la muestra de LMA n.° 52, también muestra el efecto del clon M31 en comparación con la E12 (mAb no relacionado) y la IgG control.
Los resultados de otra ronda de ensayos d CDC, usando 10 ug/ml de anticuerpo, se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10: Ensa os de CDC
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Los datos muestran que los clones de anticuerpos de CLL-1 tienen una actividad de CDC significativa sobre muestras de pacientes de LMA primaria. Los clones de anticuerpos de CLL-1 son eficaces en al menos una diferencia de 5 veces en la densidad del antígeno CLL-1 en muestras de pacientes.
G. Ejemplo 7: Inhibición in vivo del crecimiento tumoral de LMA
Se llevaron a cabo dos conjuntos de estudios de eficacia in vivo. El primero fue un modelo de injerto y de crecimiento de tumor subcutáneo (SC) que utiliza la línea celular humana de LMA positiva en CLL-1 HL60 en ratones. El segundo fue un modelo de injerto ortotópico (médula ósea, sangre, bazo y nódulo linfático) y de crecimiento de tumor que utiliza la línea celular de LMA humana OCI AML-5 positiva en CLL-1.
El estudio de HL60 SC se llevó a cabo tal como sigue. Uno de los 4 clones de anticuerpos de CLL-1 (M5, M13, M26 y M31), o una IgG de control, se administraron por vía i.p. a una dosis de 200 ug/ animal aproximadamente 24 horas antes de la inoculación SC de 5x106 o 107 células HL60. Los animales recibieron dosis adicionales de anticuerpos una vez por semana durante las próximas 6 semanas. El estudio finalizó 45 días después de la administración de células HL60. La Figura 2 muestra las curvas de eficacia para diversos clones de anticuerpos de CLL-1 (M5, M13, M26 y M31) en comparación con el control.
Los estudios ortotópicos de OCI AML-5 se llevaron a cabo tal como sigue. Los ratones NSG inmunodeficientes se dividieron en 5 grupos de 6 animales/grupo. Uno de los 4 clones de anticuerpos de CLL-1 (M5, M13, M26 y M31), o una IgG de control, se administraron por vía i.p. a una dosis de 200 ug/ animal aproximadamente 24 horas antes de la inoculación intravenosa de 5x106 o 107 células OCI AML-5. Los animales recibieron después dosis adicionales de anticuerpos dos veces por semana durante las próximas 2 semanas. El estudio finalizó 4 semanas después de la administración de las células OCI AML-5. La Figura 3 muestra que los clones de anticuerpos de CLL-1 redujeron de forma considerable el número de células OCI AML-5 (hCD45+ CMC-030+ y CMC030+ de LMA) in vivo.
H. Ejemplo 8: Los anticuerpos de CLL-1 son específicos para células madre de LMA en ensayos de CAF
Se probó la eliminación específica por anticuerpos de CLL-1 M26 en un ensayo de CAF, conjugado con saponina. Las células primarias de pacientes de LMA o las células madre hematopoyéticas CD34 positivas aisladas de la médula ósea de sujetos humanos, se cultivaron en un ensayo de formación de colonias de agar blando (100.000 células/placa). Las células se incubaron en presencia del clon M26 de anticuerpo monoclonal de CLL-1 conjugado con toxina saporina durante 14 días. Tal como se muestra en la Figura 4, el conjugado anticuerpo de CLL-1 - saporina provocó una inhibición selectiva y específica del crecimiento clonogénico de células madre de LMA, mientras que las CMH no se vieron afectadas. Los controles negativos no se trataron o se trataron con un conjugado de saporina-IgG no relacionada. Los resultados demuestran que el anticuerpo de CLL-1 conjugado con la citotoxina reduce la formación de colonias de células de LMA en aproximadamente el 80 %, sin inhibir la formación de colonias de CMH. Los resultados indican que los anticuerpos de CLL-1 desvelados actualmente se pueden usar de forma segura y terapéutica para el direccionamiento específico de CLL-1 expresada en células de LMA.
L Ejemplo 9: Los anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos se unen a las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) similares a los clones de anticuerpos de CLL-1 de ratón
Las regiones variables (Fab) de los clones del anticuerpo de CLL-1 M26, M31 y G4 se usaron para preparar anticuerpos quiméricos con una región constante (Fc) de una IgG1 humana. Estos anticuerpos quiméricos humanos se denominan ChiM26, ChiM31 y ChiG4 (o Chi31G4). Para probar la especificidad de los anticuerpos quiméricos humanos con los anticuerpos parentales de ratón, se usaron los anticuerpos para teñir diferentes poblaciones de PBMC humanas. Las PBMC se obtuvieron de dos donantes humanos, se separaron mediante gradiente de Ficoll y se agruparon. Se bloquearon aproximadamente 2x105 células mononucleares con suero humano al 3 % y después se tiñeron con anticuerpos específicos para los marcadores del linaje CD89 (granulocitos), CD14 (monocitos y granulocitos), CD3 (linfoide) y CD19 (células B). La Figura 5 muestra los resultados de FACS para células vivas separadas. Los anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos tiñen las mismas poblaciones del linaje mieloide que los anticuerpos de CLL-1 de ratón.
J. Ejemplo 10: Los anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos se unen a las PBMC de cinomolgo de forma similar a los clones de anticuerpo de CLL-1 de ratón
Para probar la especificidad de los anticuerpos quiméricos humanos con los anticuerpos parentales de ratón, se usaron los anticuerpos para teñir diferentes poblaciones de PBMC de cinomolgo. Las PBMC se obtuvieron de tres donantes, se separaron mediante gradiente de Ficoll y se agruparon. Se bloquearon aproximadamente 2x105 células mononucleares con suero humano al 3 % y después se tiñeron con anticuerpos específicos para los marcadores del linaje CD3 (linfoide), CD19 (células B), c D14 (granulocitos), CD14 (monocitos) y CD89 (granulocitos). La Figura 6 muestra los resultados de FACS para células vivas separadas. Los anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos tiñen las mismas poblaciones del linaje mieloide que los anticuerpos de CLL-1 de ratón.
K. Ejemplo 11: Los anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos tienen actividad de conjugado anticuerpofármaco in vitro
Se probó in vitro la capacidad de los anticuerpos de CLL-1 humanos quiméricos para internalizar y mediar la CAF en células 293 que expresan CLL-1. Las células se pusieron en contacto con los anticuerpos indicados a diversas concentraciones. Se utilizaron anticuerpos de isotipo IgG coincidentes para los controles negativos. Después se añadió anticuerpo secundario conjugado con saponina (Mousezap ® o Humzap®) a una proporción de 2:1, y se incubaron las células durante 72 horas. Se añadió Cell Titre-Glo® a cada pocillo de cultivo y se mezcló durante 5-10 minutos y se detectó sobre un lector de placa luminiscente. Se determinó la viabilidad celular mediante señal luminiscente. La Figura 7 muestra que los anticuerpos de CLL-1 quiméricos (7B) tienen actividad de CAF casi idéntica a la de los clones de anticuerpos de CLL-1 de ratón (7A).
L. Ejemplo 12: Los anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos median la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA)
La capacidad de los anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos ChiM26, ChiM31 y ChiG4 (Chi31G4) para mediar la CCDA se determinó en células 293 que expresan CLL-1. Las células se añadieron a 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con los anticuerpos indicados a diversas concentraciones y células efectoras (Promega®) durante 6 horas a 37 °C. Las células viables se detectaron usando el ensayo Promega ADCC Reporter Assay®. Los resultados se muestran en la Figura 8. El control del isotipo IgG humano no tuvo actividad detectable, mientras que se determinó que la CE50 en ng/ml para ChiM26, ChiM31 y Chi31G4 eran 79, 143 y 105, respectivamente.
M. Ejemplo 13: Inhibición in vivo del crecimiento tumoral de LMA
Se llevaron a cabo dos estudios in vivo de xenoinjerto con anticuerpos de CLL-1 quiméricos humanos y de ratón. Ambos estudios utilizaron ratones NOD/SCID irradiados 1 día antes de la inyección en la vena de la cola con células de LMA humanas en el día 0. Ambos estudios incluyeron 8 inyecciones durante el trascurso de aproximadamente 3 semanas, seguido por la detección del crecimiento tumoral en células de la médula ósea.
En el primer estudio, se separaron los ratones en tres grupos de 6 ratones cada uno: (1) Isotipo de IgG humana de control; (2) M26; y (3) ChiM31. Se inyectó a los ratones con 3x106 células HL60 el día 0. Los anticuerpos se administraron a 200 ug/ ratón en los días 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 y 22. Los ratones se sacrificaron el día 26. Los resultados se muestran en la Figura 9. La Figura 9A muestra que los anticuerpos de CLL-1 reducen de manera significativa el porcentaje de células LMA huCD45+CD33+, y la Figura 9B muestra que los anticuerpos de CLL-1 reducen de manera significativa el porcentaje de CMC de LMA huCD45+CLL-1+.
En el segundo estudio, se separaron a los ratones en cinco grupos de 6 ratones cada uno: (1) Isotipo de IgG humana de control; (2) M26; (3) ChiM26; (4) ChiM31; y (5) ChiG4. Se inyectó a los ratones con 5x106 células OCI AML-5 el día 0. Los anticuerpos se administraron a 200 ug/ ratón en los días 1,4, 7, 10, 13, 16, 19 y 24. Los ratones se sacrificaron el día 28. Los resultados se muestran en la Figura 10. La Figura 10A muestra que los anticuerpos de CLL-1 aparentemente eliminaron las células LMA huCD45+CD33+. Se usó una escala log 10 para resolver mejor los

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente al dominio extracelular de la molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1) humana, en donde el anticuerpo se une a un polipéptido que consiste en el dominio C de lectina de la CLL-1 humana con una Kd al menos 5 veces mayor que un polipéptido que consiste en los dominios de lectina C y de pedúnculo de la CLL-1 humana, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
un anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:51, 59 y 67, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID NO:75, 83 y 91; y
un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:52, 60 y 68, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID NO:76, 84 y 92.
2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo:
(a) se une a una CLL-1 humana o de cinomolgo con una Kd de 1000 pM o menos;
(b) se une a al menos el 50 % de las células en una muestra de células de leucemia mielógena aguda (LMA) de un individuo con LMA;
(c) se une a células quiescentes que expresan CLL-1;
(d) es humanizado; o
(e) es un fragmento de Fv de anticuerpo.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 conjugado con un compuesto terapéutico.
4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 conjugado con un resto detectable.
5. Un procedimiento in vitro de determinación de si una célula expresa la molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1), que comprende, poner en contacto el anticuerpo de la reivindicación 4 con la célula; y
detectar la unión del anticuerpo con la célula, en donde la unión del anticuerpo a la célula indica que la célula expresa CLL-1; y
y de determinación de si la célula expresa CLL-1;
en donde opcionalmente la célula está en una muestra biológica de un individuo que incluye células hematopoyéticas.
6. El anticuerpo de la reivindicación 4 para su uso en un procedimiento in vivo de determinar si una célula expresa molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1) que comprende
poner en contacto el anticuerpo con la célula; y
detectar la unión del anticuerpo con la célula, en donde la unión del anticuerpo a la célula indica que la célula expresa CLL-1; y
determinar si la célula expresa CLL-1.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 o el anticuerpo para su uso en el procedimiento de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente determinar si la célula expresa CD34 o CD38.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1 para su uso como un medicamento.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno mieloproliferativo en un individuo que comprende administrar la composición farmacéutica al individuo.
11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo se conjuga con un compuesto terapéutico.
12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en donde se ha diagnosticado al individuo con un trastorno mieloproliferativo o se ha sometido a terapia para un trastorno mieloproliferativo, en donde opcionalmente el trastorno mieloproliferativo se selecciona del grupo que consiste en: leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), síndrome mielodisplásico (SMD), mieloma múltiple, plasmacitoma y mielofibrosis.
13. Un anticuerpo aislado que se une a la molécula 1 semejante a lectina de tipo C (CLL-1) humana seleccionada del grupo que consiste en:
un anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:51, 59 y 67, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID NO:75, 83 y 91; y
un anticuerpo que comprende las CDR de cadena pesada H1-H3 de las SEQ ID NO:52, 60 y 68, y las CDR de cadena ligera L1-L3 de las SEQ ID NO:76, 84 y 92.
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