KR20150023355A - Ｃｌｌ-1 에 특이적인 항체 - Google Patents

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Abstract

고율의, CLL-1 을 발현하는 AML 환자로부터의 1 차 세포에 결합하는 CLL-1 에 특이적인 항체 ("CLL-1 항체")가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 10 nM 아하의 Kd 로 인간 CLL-1 의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 이하의 Kd 로 사이노몰거스 CLL-1 에 결합한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 사이노몰거스 CLL-1 및 인간 CLL-1 은 CLL-1 항체와의 결합에 대해 경쟁한다. 당업자는 더 높은 친화도 결합이 더 낮은 Kd (결합에 필수적인 항체 표적의 더 낮은 농도) 로서 표현된다는 점을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소와 연결된다.

Description

ＣＬＬ-1 에 특이적인 항체 {ANTIBODIES SPECIFIC FOR CLL-1}
관련 출원의 교차 인용
본 출원은 그 전문이 참조로서 인용되는, 2012 년 5 월 7 일에 제출된 미국 가 출원 제 61/643,739 호, 2012 년 9 월 10 일에 제출된 미국 가 출원 제 61/699,134 호 및 2013 년 3 월 11 일에 제출된 미국 가 출원 제 13/794,525 호에 대한 우선권을 주장한다.
C 유형 렉틴 유사 분자 1 (C type Lectin Like molucule 1; CLL-1) 은 AML 세포 및 추가적인 암 세포를 야기할 수 있는 세포인 암 줄기 세포 (CSC) 에서 발현된다.
화학요법의 주된 한계 중 하나는 항암 약물이 일반적으로 정상 세포와 암 세포를 구별하지 못한다는 점이다. 항신생물제의 주 카테코리 중 거의 모든 멤버는 정상 세포에 대해서도 상당한 독성을 갖는다.
특이적으로 암 세포를 표적하는 조성물이야말로 상기 문제를 모면시킬 수 있다. 그러나, 기존의 암 표적은 CSC 는 표적하지 않는다. 이런 이유로, 기존의 화학요법 전술은, 심지어 암 세포로 특이적으로 전달되는 경우에도 암을 효과적으로 제거하지 못한다. 살아남은 CSC 가 새로운 암 세포를 야기할 수 있기 때문에 재발의 위험이 잔존한다.
CSC 는 조혈 줄기 세포 (HSC) 와 유사한 CD34 를 발현하나, HSC 상에 CLL-1 은 발현하지 않는다. 이로써, CLL-1 을 이용해 CSC 를 특이적으로 표적가능하게 할 수 있다. 본원에서는 고비율의 CLL-1 발현 세포를 인지하는 CLL-1 항체가 제공된다. 본 발명의 CLL-1 항체는 CLL-1 발현 세포의 보체 의존적 및 항체 의존적 세포독성 양자 모두에 효과적이고, CLL-1 발현 암 세포의 종양 성장을 저해한다. 현재 기술된 항체는 CLL-1-연관 장애를 표적하기 위한 신규한 진단 및 치료 전략을 제공한다.
본 발명의 간략한 개요
본원에서는, 고율의 AML 환자 샘플로부터의 CLL-1 발현 1 차 세포에 결합하는 CLL-1 에 특이적인 항체 ("CLL-1 항체") 가 제공된다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 10 nM 이하, 예를 들어 5 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM 이하 중 어느 하나의 Kd 로 인간 CLL-1 의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 사이노몰거스 (cynomolgus) CLL-1 에 100 nM, 10nM, 1 nM, 100 pM 이하의 Kd 로 결합한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 사이노몰거스 CLL-1 및 인간 CLL-1 은 CLL-1 항체와의 결합에 대해 경쟁한다. 당업자는 더 높은 친화도 결합이 더 낮은 Kd (결합에 필수적인 더 낮은 농도의 항체 표적) 로서 표현된다는 점을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 2중특이적 (bispecific) 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소와 연결된다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 의 C-렉틴 도메인으로 이루어진 폴리펩티드에, CLL-1 의 C-렉틴 및 줄기 (stalk) 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드보다 5 배 이상 높은 Kd 로, 예를 들어 10, 20, 50 또는 100 배 이상 중 적어도 어느 하나의 Kd 로 결합한다. 즉, 항체는 C-렉틴 도메인 단독 또는 줄기 도메인 단독에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 CLL-1 의 줄기 및 C-렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 C-렉틴 도메인의 일부 및 줄기 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 인간 C-유형 렉틴 유사 분자 (CLL-1) 의 C-렉틴 및 줄기 도메인으로 이루어진 폴리펩티드에 (a) 인간 CLL-1 의 C-렉틴 도메인으로 이루어진 폴리펩티드 또는 (b) 인간 CLL-1 의 줄기 도메인으로 이루어진 폴리펩티드와 결합하는 것보다 더 큰 친화도로 결합한다. 예를 들어, M26 및 M31 로서 지정된 CLL-1 항체는 인간 CLL-1 의 아미노산 101-265 에 인간 CLL-1 의 아미노산 141-265 (SEQ ID NO:2) 보다 더 높은 친화도로 결합한다 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소와 연결된다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 전장 CLL-1 세포외 도메인과 결합하는 것보다 적어도 5-배 이상 더 높은 Kd 로, 예를 들어 10, 20, 50, 또는 100-배 이상 중 적어도 어느 하나로 CLL-1 의 C-렉틴 도메인과 결합한다. 즉, 상기 CLL-1 항체의 친화도는 전장 CLL-1 세포외 도메인에 대한 것보다 5, 10, 20, 50, 또는 100 배 중 적어도 어느 하나 더 낮다 (예, 세포 상 발현). 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 휴지 (quiescent) CLL-1 발현 세포에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 10 nM 이하, 예를 들어 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM 이하 중 어느 하나의 Kd 로 휴지 CLL-1 발현 세포에 결합한다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 HL60 세포의 배양물에서 60% 이상의, 예를 들어 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상 중 적어도 어느 하나의 세포에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 AML 환자로부터의 1 차 세포의 샘플에서 30% 이상의 유핵 세포에 (예를 들어, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 이상 % 중 어느 하나) 결합하고, 이때 1 차 세포의 샘플은 종양 조직의 생검 또는 말초 혈액이다. 당업자는 예를 들어 상기 세포 결합 검정에서 배양물 또는 샘플에서 다수의 세포에 결합되게끔 충분한 항체 분자가 존재하도록 적절 농도의 항체가 첨가된다는 점을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소에 결합한다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 발현 세포로, 예를 들어 HL60 세포 또는 1차 AML 세포로, 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC) 세포독성 검정에서 1 nM 미만의 E50 을 갖는다. 일부 구현예에서, ADC 검정에서의 EC50 은 500, 200, 100, 50 pM 또는 그 미만 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 ADC 세포독성 검정에서 50% 이상, 예를 들어 적어도 60%, 70%, 80% 이상 AML 세포의 콜로니 (colongy) 형성을 저하시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 환자 AML 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 AML 암 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 정상 CD34+ 조혈 줄기 세포 (HSC) 에 영향을 미치지 않거나, 또는 ADC 세포독성 검정에서 정상 CD34+ HSC 의 콜로니 형성을 현저히 감소시킨다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 발현 세포, 예를 들어 HL60 세포 또는 1 차 AML 세포로 보체 의존적 세포독성 (CDC) 검정에서 1 ug/ ml 이하의 EC50 을 갖는다. 일부 구현예에서, CDC 검정에서 EC50 은 500, 200, 100, 50, 20, 10 ng/ml 이하 중 어느 하나의 것이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 발현 세포, 예를 들어, CLL-1 트랜스펙션된 293 세포, HL60 세포, 또는 1 차 AML 세포로 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 검정에서 1ug/ml 이하의 EC50 을 갖는다. 일부 구현예에서, ADCC 검정에서 EC50 는 500, 200, 100 ng/ml 이하 중 어느 하나의 것이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 4 주 이상 동안 AML 이종이식편을 갖는 마우스에 투여되는 경우, 미처리된 대조군 (즉, AML 이종이식편을 갖지만 CLL-1 항체로 치료되지 않은 마우스) 과 비교시, 10-배 이상 종양 크기 (tumor burden) 를 감소시킨다. 일부 구현예에서, AML 이종이식편은 인간 AML 세포주, 예를 들어 HL60 또는 OCI AML-5 세포 유래의 것이다. 일부 구현예에서, AML 이종이식편은 1 차 인간 또는 영장류 (예, 사이노몰거스) AML 세포 유래의 것이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소와 연결된다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 CLL-1 (예, CLL 발현 세포 또는 AML 세포) 와의 결합에 대해 경쟁하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다:
· M26 의 중쇄 및 경쇄 CDR 을 포함하는 항체 (실시예 1 참조);
· M31 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G4 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M22 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M29 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M2 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M5 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G12 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M41 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· E3 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· B10 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G2 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G6 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G8 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G10 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G14 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G16 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G23 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G26 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G28 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체; 및
· G30 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체로부터 선택되고:
· M26 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체 (실시예 1 참조);
· M31 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G4 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M22 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M29 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M2 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M5 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G12 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· M41 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· E3 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· B10 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G2 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G6 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G8 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G10 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G14 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G16 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G23 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G26 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체;
· G28 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체; 및
· G30 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함하는 항체,
이때, 선택된 CDR 중 임의의 것 하나 이상은 본래의 CDR 서열과 비교시 1, 2 또는 3 개의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소와 연결된다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 M26 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 M31 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 G4 의 중쇄 및 경쇄 CDR 를 포함한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소에 연결된다.
일부 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 CLL-1 항체는 CLL-1 의 C-렉틴 및 줄기 도메인으로 이루어진 폴리펩티드보다 5배 이상 더 큰 (예, 10, 20, 50, 100 또는 그 이상의 배수 중 어느 하나의) Kd 로 CLL-1 의 C-렉틴 도메인으로 이루어진 폴레펩티드와 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 전장 CLL-1 세포외 도메인에 결합하는 것보다 5-배 이상 큰 (예, 10, 20, 50, 100 배 이상 중 적어도 어느 하나의) Kd 로 CLL-1 의 C-렉틴 도메인과 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 CLL-1 항체는 HL60 세포의 배양물에서 80% 이상의 세포와 추가로 결합한다 (예, 85, 90, 95 이상 % 중 어느 하나). 일부 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 CLL-1 항체는 AML 을 앓고 있는 개체로부터의 AML 세포의 샘플에서 30% 이상의 유핵세포 (예, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 그 이상 % 중 적어도 어느 하나) 에 추가로 결합한다. 다시, 그러한 세포 결합 검정에서, 예를 들어 배양물 또는 샘플에서 여러 세포에 결합하기에 항체 분자가 충분히 존재하도록 적절한 농도의 항체가 첨가되고, 항체 농도는 제한 요소가 아니다.
일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 예를 들어 IgG1 으로부터의 인간 Fc 영역을 갖는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 Fv 단편 (예, Fab, Fab', 또는 F(ab')2) 이다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 라벨링, 예를 들어 검출가능한 모이어티 (moiety) 와 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 은 치료적 화합물, 예를 들어 세포독소 또는 세포 성장 저해제에 부착된다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
· M26 의 것과 실질적인 동일성 (85, 90, 95, 또는 98% 상동성 중 적어도 어느 하나) 을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:4; Vl = SEQ ID NO:6) 을 포함하는 항체;
· M31 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:8; Vl = SEQ ID NO:10) 을 포함하는 항체 ;
· G4 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:12; Vl = SEQ ID NO:14) 을 포함하는 항체;
· M22 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:16; Vl = SEQ ID NO:18) 을 포함하는 항체 ;
· M29 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:20; Vl = SEQ ID NO:22) 을 포함하는 항체 ;
· M2 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:24; Vl = SEQ ID NO:26) 을 포함하는 항체 ;
· M5 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:28; Vl = SEQ ID NO:30) 을 포함하는 항체 ;
· G12 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:32; Vl = SEQ ID NO:34) 을 포함하는 항체
· M41 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· E3 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· B10 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G2 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G6 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G8 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G10 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G14 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G16 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G23 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G26 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G28 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G30 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
일부 구현예에서, 실질적으로 동일한 항체는 본래 항체의 CDR 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 결합에 있어서 경쟁한다:
· M26 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:4; Vl = SEQ ID NO:6)
· M31 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:8; Vl = SEQ ID NO:10);
· G4 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:12; Vl = SEQ ID NO:14);
· M22 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:16; Vl = SEQ ID NO:18);
· M29 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:20; Vl = SEQ ID NO:22);
· M2 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:24; Vl = SEQ ID NO:26);
· M5 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:28; Vl = SEQ ID NO:30);
· G12 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:32; Vl = SEQ ID NO:34)
· M41 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· E3 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· B10 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G2 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G6 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G8 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G10 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G14 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G16 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G23 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G26 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G28 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 및
· G30 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
· M26 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:4; Vl = SEQ ID NO:6)
· M31 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:8; Vl = SEQ ID NO:10);
· G4 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:12; Vl = SEQ ID NO:14);
· M22 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:16; Vl = SEQ ID NO:18);
· M29 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:20; Vl = SEQ ID NO:22);
· M2 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:24; Vl = SEQ ID NO:26);
· M5 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:28; Vl = SEQ ID NO:30);
· G12 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (Vh = SEQ ID NO:32; Vl = SEQ ID NO:34)
· M41 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· E3 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· B10 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G2 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G6 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G8 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G10 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G14 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G16 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G23 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G26 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
· G28 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 및
· G30 의 가변 영역 서열을 포함하는 항체. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 이중특이적 항체의 일부이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 세포독소와 연결된다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 M26 의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 M31 의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 G4 의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상술된 CLL-1 항체는 CLL-1 의 C-렉틴 및 줄기 도메인으로 이루어진 폴레핍테드보다 적어도 5 배 (예, 10, 20, 50, 100 배 이상 중 어느 하나) 높은 Kd 로 CLL-1 의 C-렉틴 도메인으로 이루어진 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 전장 CLL-1 세포외 도메인에 결합하는 것보다 적어도 5 배 (예, 10, 20, 50, 100 배 이상 중 어느 하나) 더 높은 Kd 로 CLL-1 의 C-렉틴 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 HL60 세포의 배양물에서 적어도 80% (예, 85, 90, 95% 이상 중 어느 하나) 의 세포에 추가 결합한다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 AML 개체로부터의 AML 세포의 샘플에서 적어도 30% (예, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95% 이상 중 어느 하나) 의 유핵 세포에 추가로 결합한다.
일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 Fv 단편 (예, Fab, Fab', 또는 F(ab')2) 이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일 항체 구축물 내 2 개의 별개의 결합 서열 (예, M26, M31, G4, 또는 M22 로부터의 하나의 에피토프 결합 영역 및 M26, M31, G4, 또는 M22 으로부터의 하나의 에피토프 결합 영역을 임의 조합함) 을 갖는 2 개의 별개의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 항체는 라벨링, 예를 들어 검출가능한 모이어티에 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 상술된 바와 같은 CLL-1 은 치료적 화합물, 예를 들어 세포독소 또는 세포 성장 저해제에 부착된다.
본원에서 기재된 바와 같은 CLL-1 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 추가로 제공된다.
하기를 포함하는, 세포가 CLL-1 을 발현하는지 여부를 확인하는 방법이 제공된다: CLL-1 항체 (즉, 상술된 서열 또는 활성 중 임의의 것을 갖는 CLL-1 항체) 를 세포와 접촉; 항체의 세포와의 결합 검정 (이때 항체의 세포와의 결합은 세포가 CLL-1 을 발현한다는 점을 지시함); 및 세포가 CLL-1 을 발현하는지 여부를 확인함. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포가 CD34 을 발현하는지 여부를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포가 CD38 을 발현하는지 여부를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포가 CD45 을 발현하는지 여부를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포가 개체로부터 수득된 생물학적 샘플 (예, 혈액 샘플 또는 종양 또는 조직에서부터의 생검) 에 존재한다. 일부 구현예에서, 항체 결합은 FACS 에 의해 검출된다.
하기를 포함하는 골수 암 세포 (골수증식 장애, 예컨대 AML, CML, CMML, 다발 골수종, 형질세포종, 또는 MDS 로부터의 CLL-1 발현 암 세포) 또는 CSC (예, LSC 또는 골수 암 모세포 (cell blast)) 를 동정하는 방법이 또한 제공된다: CLL-1 항체 (즉, 상술된 임의 활성 또는 서열을 갖는 CLL-1 항체) 를 세포와 접촉; 항체의 세포와의 결합 검출; 및 항체가 세포와 결합시 CSC 또는 골수 암 세포의 동정. 일부 구현예에서, 골수 암 세포는 AML, CML, CMML, 다발 골수종, 형질세포종, 또는 MDS 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포가 CD45 를 발현하는지 여부를 확인하고 세포가 CD45 를 발현시 AML 세포를 동정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포가 CD34 를 발현하는지 여부를 확인하고 세포가 CD34 를 발현하는 경우 CSC 를 동정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포가 개체로부터의 생물학적 샘플에 존재한다. 일부 구현예에서, 항체 결합은 FACS 에 의해 검출된다.
CLL-1 항체 (즉, 상술된 임의의 활성 또는 서열을 갖는 CLL-1 항체) 를 개체로부터의 생물학적 샘플과 접촉하고; 생물학적 샘플에서 세포와의 항체의 결합을 검출하고; 항체가 세포와 결합하는 경우 골수 증식 장애가 있는 개체를 진단하는 것을 포함하는 골수 증식 장애 (예, AML, CML, MDS, CMML, 다발 골수종, 형질세포종 골수섬유증) 에 대한 개체의 진단 방법이 추가적으로 제공된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 (예, 말초 유핵 혈액 세포) 또는 종양 또는 조직으로부터의 생검이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포가 CD34 을 발현하는지 여부를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 골수증식 장애가 진단되는 경우 개체에 대한 치료 과정을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 과정은 유효량의 CLL-1 항체의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 유효량의 CLL-1 항체는 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 골수증식 장애가 진단되는 경우, 또는 개체가 이전에 골수증식 장애 진단을 받은 바 있으나 질환 치료를 받지 못한 경우 개체를 모니터링하는 것을 추가 포함한다.
추가적으로, CLL-1 항체 (즉, 상술된 임의 활성 또는 서열을 갖는 CLL-1 항체) 를 세포와 접촉시키고 그 세포의 생존을 저해하는 것을 포함하는 CLL-1 발현 세포의 생존 저해 방법 (예, 세포 성장 또는 분열, ADC 매개, CDC 매개 저하) 이 제공된다. 일부 구현예에서, 접촉은 항체 (예, 약학적 조성물로) 를 개체에, 예를 들어 골수증식 장애 (예, AML, CML, MDS, CMML, 다발 골수종, 형질세포종 골수섬유증) 로 진단 받은 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 발현 세포의 생존을 저해하는데 유효한 용량으로 투여된다.
유효량의 CLL-1 항체 (즉, 상술된 임의의 활성 또는 서열을 갖는 CLL-1 항체) 를 개체에 투여하고, 이로써 개체의 골수증식 장애를 치료하는 것을 포함하는 개체에서의 골수증식 장애의 치료 방법 (예, 비치료 대조군과 비교시, 종양 성장 또는 생착 (engraftment) 저하) 이 제공된다. 일부 구현예에서, 골수증식 장애는 AML, CML, MDS, CMML, 다발 골수종, 형질세포종, 및 골수섬유증으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유효량의 CLL-1 항체가 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 예를 들어 본원에서 기재된 바와 같은 CLL-1 항체를 이용해 골수증식 장애로 진단받은 바 있다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 개체에서 예를 들면 본원에서 기재된 바와 같은 CLL-1 항체를 이용해 세포 성장 (예, 종양 성장 또는 순환 골수 암 세포) 을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 치료적 화합물, 예를 들어 세포독소 또는 세포 성장 저해제에 부착된다.
도 1 은 3 명의 상이한 AML 환자, #49 (A), #50 (B), 및 #52 (C) 로부터의 1 차 세포를 이용한 보체 의존적 세포독성 (CDC) 검정의 결과를 나타낸다. A 및 B 는 CLL-1 항체 클론 M26 이 10 내지 100 ng/mL 의 EC50 을 갖는다는 점을 나타낸다. 도 1C 는 CLL-1 항체 클론 M26, M31, 및 음성 대조군 E12 (관련 없는 항체) 및 IgG 에 대한 결과를 나타낸다. M26 및 M31 양자 모두는 10 내지 100 ng/mL 의 EC50 을 갖는다.
도 2 는 마우스 이종이식 모델에서 CLL-1 항체 클론의 항종양 효과를 나타낸다. HL60 AML 세포를 마우스에 피하 주사하였다. 마우스를 그룹 당 n=6 마우스로 5 그룹으로 나누었다: (1) IgG2a 대조군; (2) M5; (3) M13; (4) M26; 및 (5) M31. 마우스는 7 주 동안 1 주 마다 200 ug 항체를 1 회 수여 받았다. P< 0.05 vs 대조군 (모든 치료 그룹에 대함).
도 3 은 마우스 동소 이종이식 모델에서 CLL-1 항체 클론의 항종양 효과를 나타낸다. AML 세포를 면역약화된 NSG (NOD/ SCID/ IL2 수용체 감마 사슬 녹아웃 (knockout)) 마우스에 정맥내 주사하였다. 마우스를 그룹 당 n=6 마우스로 5 그룹으로 나누었다: (1) IgG2a 대조군; (2) M5; (3) M13; (4) M26; 및 (5) M31. 마우스는 2 주간 주마다 200 ug 항체를 2 회 수여 받았고, 4 주 이식후 희생되었다. 골수에서 종양 크기 (CD45+ CLL-1+ 세포) 를 FACS 로 측정하였다.
도 4 는 CLL-1 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC) 가 정상 조혈 줄기 세포 (CD34+ HSC) 가 아닌 AML 줄기 세포로써 콜로니 형성을 저해한다는 점을 나타낸다. 도 4A 는 음성 대조군 (항체 또는 항체 약물 컨쥬게이트 부재) 의 수준에서 항체 약물 컨쥬게이트의 존재 하에서 시딩된 CD34+ HSC 가 콜로니를 형성한다는 점을 나타낸다. 도 4B 는 시딩된 전체 PBMC 에 있어서, AML 암 줄기 세포 (CSC) 가 음성 대조군 (항체 또는 항체 약물 컨쥬게이트 부재) 과 비교시 사포린에 컨쥬게이션된 CLL-1 항체 M26 의 존재 하에서 80% 미만의 콜로니 형성을 갖는다는 점을 나타낸다.
도 5 는 CLL-1 항체 클론 M26, M31, 및 G4 (또한 라벨링된 31.G4) 가 마우스 및 키메라 인간 (Chi) 형태 모두에서 인간 PBMC 에 결합한다는 점을 나타낸다. 음성 대조군은 각 CLL-1 항체에 상응하나 관련없는 항원에 특이적인 IgG 를 포함한다. 단핵 세포를 PBMC 샘플에서 분리하고, FACS 를 이용해 CD89 (과립구), CD14 (단핵구 및 과립구), CD3 (림프구), 및 CD19 (B 세포) 의 발현에 따라 세포를 특성화하였다. 각 집단에 대한 CLL-1 양성 염색의 백분율을, 각 CLL-1 항체에 대해 좌에서 우로 그 차례대로 나타낸다.
도 6 은 CLL-1 항체 클론 M26, M31, 및 G4 (라벨링된 31G4) 가 본래 마우스 및 키메라 인간 (Chi) 형태 양자 모두에서 사이노몰거스 PBMC 에 결합한다는 점을 나타낸다. 음성 대조군은 각 CLL-1 항체에 상응하나 관련없는 항원에 대해서 특이적인 IgG 를 포함한다. 단핵 세포를, PBMC 샘플으로부터 분리하고, FACS 를 이용해, CD3 (림프구), CD19 (B 세포), CD14 (과립구), CD14 (단핵구), 및 CD89 (과립구) 의 발현에 따라 세포를 특성화하였다. 각 집단에 대한 CLL-1 양성 염색의 백분율을, 각 CLL-1 항체에 대해 좌에서 우로 그 차례대로 나타낸다.
도 7 는 마우스 및 키메라 인간 CLL-1 양자 모두가 시험관 내 CLL-1 트랜스펙션된 293 세포 상 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC) 활성을 갖는다는 점을 나타낸다. 도 7A 는 음성 대조군 마우스 IgG2a 와 비교되는 마우스 CLL-1 항체 클론 M26, M31, 및 G4 (31G4) 에 대한 결과를 나타낸다. 도 7B 는 상응하는 키메라 인간 CLL-1 항체 클론에 대한 결과를 나타낸다.
도 8 은 키메라 인간 CLL-1 항체 클론 M26, M31, 및 G4 (31G4) 이 CLL-1 트랜스펙션된 293 세포 상 항체-의존적 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 를 매개한다는 점을 나타낸다. ChiM26, ChiM31, 및 Chi31G4 에 대한 EC50 (ng/ml) 는 각각 79, 143, 및 105 이다.
도 9 는 마우스 이종이식 모델에서 CLL-1 항체 클론의 항종양 효과를 나타낸다. NOD/SCID 마우스를 제 -1 일 및 제 0 일에 방사선으로 처리하고, HL60 세포를 꼬리 정맥에 주사했다 (마우스 당 3x106 세포). 마우스를 그룹 당 n=6 마우스로, 3 그룹으로 나누었다: (1) huIgG 대조군; (2) M26; (3) ChiM31. 마우스는 22 일의 과정 동안 8 종의 항체 주사 (200ug) 를 수여 받았고, 제 26 일에 희생시켰다. 골수에서 종양 크기를 FACS 로 측정했다. 도 9A 는 % huCD45+CD33+ AML 세포를 나타내고, 도 9B 는 % huCD45+ CLL-1+ AML CSC 를 나타낸다.
도 10 은 마우스 이종이식 모델에서 CLL-1 항체 클론의 항종양 효과를 나타낸다. NOD/SCID 마우스를 제 -1 일 및 제 0 일에 방사선으로 처리하고, OCI AML-5 세포를 꼬리 정맥에 주사했다 (마우스 당 5x106 세포). 마우스를 그룹 당 n=6 마우스로 5 그룹으로 나누었다: (1) huIgG 대조군; (2) M26; (3) ChiM26; (4) ChiM31; (5) ChiG4. 마우스는 19 일의 과정 동안 8 항체 주사 (200ug) 를 수여 받았고, 24 일 후에 희생시켰다. 골수에서의 종양 크기를 FACS 로써 측정하였다. 도 10A 는 huCD45+CD33+ AML 세포의 백분율을 나타낸다. 도 10B 는 결과들 사이에서 더 나은 해상도를 관측하도록, huCD45+ CD33+ AML 세포의 log10 백분율을 나타낸다. 데이타는 테스트된 모든 4 종의 CLL-1 항체가 효과적으로 종양 크기를 감소시켰으며, M26, ChiM26, 및 ChiM31 가 가장 큰 항종양 효과를 지님을 나타낸다.
I. 도입
다양한 이로운 특징을 갖는 CLL-1 에 대해 특이적인 항체가 본원에서 제공된다. 이러한 항체는 하기의 기준들 중 적어도 하나를 바탕으로 하여 선택되었다:
· 피코몰 내지 나노몰 범위의 인간 CLL-1 에 대한 친화도;
· AML 환자로부터 수득된 비교적 높은 백분율의 샘플에 대한 결합 (예, X357 또는 X1057 CLL-1 항체보다 더 높은 백분율의 AML 환자, 또는 50% 이상의 AML 환자 샘플);
· AML 환자 샘플에서의 비교적 높은 백분율의 세포 (예, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)) 와의 결합 (예, X357 또는 X1057 CLL-1 항체보다 더 높은 백분율의 세포, 또는 50% 이상의 AML 환자 샘플 내 세포);
· 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC) 세포독성 검정에서의 활성 (active);
· 보체 의존적 세포독성 (CDC) 검정에서의 활성;
· 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC) 검정에서의 활성;
· 시험관 내 또는 생체 내 (이종이식 마우스 모델) 항종양 활성도;
· 정상 HSC 가 아닌 AML 세포에서 ADC 활성도 및 이에 대한 특이적 결합;
· 동물 모델 (예, 사이노몰거스 CLL-1) 의 종 상동체에 대한 결합;
· 키메라 인간 형태의 항체에 있어서 보유된 상기 활성도.
현재 기술된 CLL-1 항체는 선택적인 특성들 전부를 모두 갖는 것이 아니라 예를 들어 하기에 서열에 따라 추가로 기술된다. 본 CLL-1 항체는 예를 들어 AML 과 같은 CLL-1 발현 암의 치료에서, 또는 개체에서의 CLL-1 발현 암 세포의 진단 또는 모니터링에서와 같이, CLL-1 발현 세포의 검출에 사용될 수 있다.
II. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적 및 과학적인 용어는 당업자가 통상 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어 문헌 [Lackie, Dictionary of Cell and Molecular Biology, Elsevier (4th ed. 2007); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)] 을 참고한다. 용어 "하나의" 또는 "한" 또는 단수형태는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함한다" 및 그의 변형, 예컨대 "포함한" 및 "포함하는"이 단계 또는 요소의 열거 보다 앞서 사용되는 경우, 이는 추가의 단계들 또는 요소들의 부가가 선택적이고 배제되는 것이 아니라는 점을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에서 기재되거나 또는 그와 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 하기의 정의들은 본원에서 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 돕고자 제공되는 것으로 본 개시의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
C-유형 렉틴-유사 분자 1 (CLL-1) (또한, CLEC12A, DCAL-2, 및 MICL 로도 공지되어 있음) 는 유형 II 막 단백질이다 (ITIM 도메인 - TM 도메인-줄기 도메인-렉틴-유사 도메인). CLL-1 의 세포외 도메인은 고 글리코실화되고, 골수 계통 세포에서 배타적으로 발현된다. CLL-1 은 또한 AML, MDS, 및 CML 세포에서 발현된다. CLL-1 발현은 CLL-1 을 발현하지 않는 정상 조혈 줄기 세포 (HSC) 와 이것이 발현되는 백혈병 줄기 세포 (LSC) 사이를 구별하는데 사용될 수 있다. LSC 는 암 세포의 생성 및 암 재발을 유발하는 백혈병 환자 내 CD34+ 세포이다. 문헌 [Bakker et al. (2004) Cancer Res. 64:8443] 을 참조한다.
CLL-1 의 뉴클레오티드 및 단백질 서열은 다수 종에서 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 서열은 Genbank accession number AF247788.1 (SEQ ID NO:1 로 나타낸 코딩 서열) 및 Uniprot accession number Q5QGZ9 (SEQ ID NO:2) 에서 발견될 수 있다. SEQ ID NO:2 로 나타낸 인간 CLL-1 단백질에 있어서, 세포외 도메인은 약 아미노산 65-265 을 포함하고, 트랜스멤브레인 도메인은 약 아미노산 44-64 를 포함하고, 세포질 도메인은 약 아미노산 1-43 을 포함한다. 인간 CLL-1 의 줄기 도메인은 아미노산 65-139 을 포괄하고, C 렉틴 도메인은 아미노산 140-249 를 포괄하고, 양자 모두 SEQ ID NO: 2 로 나타낸 서열을 기준으로 한다. 당업자는 CLL-1 변이체 (예, 종 상동체, 대립유전자 변이체 등) 가 예를 들어 보존된 잔기 및 도메인의 동정을 위해 최적으로 정렬될 수 있다.
용어 "CLL-1 특이적 항체", "항-CLL-1 항체", "CLL-1 항체" 및 "항-CLL-1" 은 다양한 글리코실화 형태의 CLL-1 를 비롯한 CLL-1 에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭하도록 본원에서 동의어로 사용된다. 본원에 기재된 CLL-1 항체는 예를 들어 HSC 가 아닌 특정 암 세포의 표면 상에 발현된 CLL-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 하기에 더 자세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항- CLL-1 항체는 CLL-1 발현 세포를 결합할 수 있고, 기타 AML-표적 항체와 비교시 더 큰 백분율의 AML 세포에 결합할 수 있고, AML 세포 증식을 저해 및 그의 파괴를 중재할 수 있다.
"CLL-1 연관 장애" (또는 CLL-1 관련 장애, CLL-1 장애, CLL-1 관련 병태 또는 질환, 등) 는 표준 대조군 (예, 정상, 비(非)질환, 비(非)암 세포) 에서 CLL-1 발현과 비교시, 상승 또는 감소된 CLL-1 의 세포 표면 발현과 상관있는 병태 및 질환을 지칭한다. 상승된 CLL-1 수준은 암 세포, 특히 백혈병, 예컨대 AML (급성 골수성 백혈병), MDS (골수형성 이상 증후군), 및 CML (만성 골수성 백혈병), 및 조혈 CSC (예, LSC) 와 연관된다.
용어 "항체"는 폴리펩티드 구조, 예를 들어 면역글로불린, 컨쥬게이트 또는 그 단편 (항원 결합 활성을 보유) 을 지칭한다. 상기 용어는 인간화, 인간, 단쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이화, 그라프팅 및 시험관내 제조된 항체와 같이 천연 또는 유전적 개질된 형태를 비롯해, 인간 또는 기타 포유동물 세포로부터 유래된, 이소타입 부류 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어는 면역글로불린 모이어티 (예, 키메라 또는 이중특이적 항체 또는 scFv's) 및 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb 및 기타 조성물을 포함하는 융합 단백질을 비제한적으로 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다.
예의 면역글로불린 (항체) 구조적 단위는 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 폴리펩티드 쇄의 2 개의 동일한 쌍으로 이루어지며, 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄 (약 25 kD) 및 하나의 "중"쇄 (약 50-70 kD) 를 갖는다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인지를 주로 담당하는 약 100 내지 110 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다. 가변 영역은 항체 (또는 이의 기능적 등가물) 의 항원-결합 영역을 포함하고, 이는 결합 특이성 및 친화도에 있어 가장 중요하다. 문헌 [Paul, Fundamental Immunology (2003)] 을 참고한다.
항체는 특이적 항원-결합 활성을 포함하는 다수의 익히-특성화된 단편 중 임의의 것으로서 또는 온전한 (intact) 면역글로불린으로서 존재할 수 있다. 명확하기 위해, 중쇄 및 경쇄를 갖는 테트라머 항체가 본원에서 "온전한 면역글로불린"으로서 지칭되고, 이는 자연 발생, 폴리클로날, 모노클로날일 수 있거나 또는 재조합적으로 제조될 수 있다. 단편은 각종 펩티다아제로의 분해에 의해 제조될 수 있다. 펩신은 힌지 영역 내 디술파이드 결합 아래에서 항체를 분해해 F(ab)'2 (그 자체가 디술파이드 결합에 의해 VH-CH1 에 결합된 경쇄인 Fab 의 다이머) 를 제조한다. F(ab)'2 는 힌지 영역에서 디술파이드 결합을 분쇄하는 약한 조건 하에서 환원되어 F(ab)'2 다이머를 Fab' 모노머로 전환할 수 있다. Fab' 모노머는 필수적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab 이다. 각종 항체 단편이 온전한 항체의 분해 측면에서 정의되는 한편, 당업자는 그러한 단편이 재조합 DNA 방법을 이용하거나 또는 화학적으로 데노보 합성될 수 있음을 인지한다. 따라서, 용어 항체는 본원에서 이용되는 바와 같이 또한 전체 항체의 개질에 의해 제조된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 이용한 데노보 합성된 것, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용해 동정된 것을 포함한다 (예, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990) 참조).
본원에서 이용되는 바, 용어 "Fv" 는 1가 또는 2가 가변 영역 단편을 지칭하고, 이는 더 긴 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 또는 F(ab')2 (또한 CL 및/또는 CH1 포함) 뿐 아니라 오로지 가변 영역 (예, VL 및/또는 VH ) 를 포함할 수 있다. 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 용어 "Fc" 는 CH1 및 CH2 영역을 포함하는 중쇄 모노머 또는 다이머를 지칭한다.
단일 쇄 Fv (scFv) 는 링커, 예를 들어 펩티드 링커에 의해 결합된 VL 및 VH 을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. ScFv 는 또한 탠덤 (또는 2가) scFv 또는 디아바디를 형성하는데 사용될 수 있다. 탠덤 scFv 및 디아바디의 제조 및 특성은 예를 들어 문헌 [Asano et al. (2011) J Biol. Chem. 286:1812; Kenanova et al. (2010) Prot Eng Design Sel 23:789; Asano et al. (2008) Prot Eng Design Sel 21:597] 에 기재되어 있다.
이중특이적 또는 2가 항체는 2 개의 상이한 표적 항원 또는 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 하나의 항체 팔 (V 영역) 은 CLL-1 에 특이적일 수 있는 반면 나머지 팔은 또 다른 표적, 예를 들어 백혈병 또는 AML 표적, 또는 효과기 세포, 예를 들어 CD3 을 모집하는 표적에 특이적일 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 제 1 의 CLL-1 에피토프에 대해 특이적인 하나의 팔을 가질 수 있는 반면, 나머지 팔은 제 2 의 CLL-1 에피토프에 대해 특이적이다. 이중특이적 항체는 Fv 영역, 또는 온전한 또는 키메라 면역글로불린일 수 있다. 이중특이적 항체는 예를 들어 문헌 [Lum et al. (2011) BioDrugs 25:365 및 Mabry et al. (2010) IDrugs 13:543] 에 기재되어 있다.
"모노클로날 항체"는 항체 상 주어진 에피토프에 대한 단일의 결합 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 클로날 제제를 지칭한다. "폴리클로날 항체"는 상이한 결합 특이성 및 친화성을 갖는, 단일 항원에 대항해 야기되는 항체의 제제를 지칭한다.
본원에서 이용된 바, "V-영역"은 골격부 1, CDR1, 골격부 2, CDR2, 및 CDR3 포함 골격부 3 및 골격부 4 의 분절을 포함하는 항체 가변 영역 도메인을 지칭하며, 이때 상기 분절은 B-세포 분화 동안 중쇄 및 경쇄 V-영역 유전자의 재배열 결과로서 V-분절에 부가된다.
본원에서 이용되는 바, "상보성 결정 영역 (CDR)" 은 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 의해 확립된 4 개의 "골격부" 영역을 방해하는 각 쇄에서의 3 종의 고가변 영역을 지칭한다. CDR 은 항원의 에피토프와의 결합을 주로 담당한다. 각 쇄의 CDR 은 N-말단으로부터 시작해 순차적으로 넘버링되는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 로 지칭되는 것이 전형적이며, 이는 또한 전형적으로 특정 CDR 이 위치된 쇄에 의해 동정된다. 따라서, VH CDR3 는 이것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치되는 반면에 VL CDR1 는 이것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR1 이다.
상이한 경쇄 또는 중쇄의 골격부 영역의 서열은 종 내에서 비교적 보존된다. 항체의 골격부 영역, 즉 구성성분인 경쇄 및 중쇄의 조합된 골격부 영역은 3 차원 공간에서 CDR 을 포지셔닝하고 정렬한다.
CDR 및 골격부 영역의 아미노산 서열은 당업계에 익히 여러 공지된 정의, 예를 들어 Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database (IMGT), 및 AbM (예를 들어, Johnson et al., supra; Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342, 877-883; Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4) 참조) 를 이용해 결정될 수 있다. Kabat 시스템을 이용한 CDR 의 위치부여를 위한 도움되는 지침은 웹사이트 bioinf.org.uk/abs 에서 발견될 수 있다. 항원 조합 부위의 정의는 하기에 기재되어 있다: Ruiz et al. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); 및 Lefranc Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996); 및 Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203: 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); 및 Rees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).
"키메라 항체"는 (a) 불변 영역 또는 그의 부분이, 항원 결합 부위 (가변 영역, CDR 또는 그의 부분) 가 상이한 또는 변경된 부류, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 영역에 연결되도록 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역, 또는 그의 부분이, 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역 (예, 상이한 종으로부터의 골격부 영역 및 CDR) 으로 변경, 대체 또는 교환되는 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 가변 영역 단편을 포함한다. 그 예로 2 개의 Fab 또는 Fv 영역 또는 scFv 를 포함하는 재조합 항체가 있다. 키메라는 또한 상기 지시된 바와 같이 부착된 Fv 영역과 상이한 공급원으로부터의 Fc 영역을 포함할 수도 있다. 일부 경우, 키메라 항체는 Fv 영역 내 키메라 현상 (chimerism) 을 포함한다. 이러한 키메라 항체의 예는 인간화 항체일 수 있으며, 여기서 FR 및 CDR 은 상이한 공급원으로부터의 것이다.
인간화 항체는 비(非)인간 항체의 VH 및 VL 영역으로부터 수득된, 항원 결합 루프, 즉 CDR 이 인간 골격부 서열에 그라프팅된 항체이다. 인간화, 즉 인간 항체의 상응 서열에 대한 비인간 CDR 서열의 치환은 예를 들어 [U.S. Patent Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,633,425; 5,661,016; Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)] 에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 트랜스제닉 마우스 또는 기타 유기체, 예컨대 기타 포유류가 또한 US Patent No. 6,673,986 에 개시된 바와 같이 인간화 또는 인간 항체를 발현하는데 사용될 수 있다.
용어 "항원", "면역원", "항체 표적", "표적 분석물" 및 유사 용어가 본원에서 항체에 의해 인지되는, 즉 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자, 화합물 또는 복합체를 지칭하는데 사용된다. 상기 용어는 항체에 의해 특이적으로 인지될 수 있는 임의의 분자, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 지질, 화학적 모이어티, 또는 그의 조합 (예, 인산화 또는 글리코실화 폴리펩티드, 등) 을 지칭할 수 있다. 당업자는 분자가 모든 맥락에서 면역원성인 것을 지시하는 것이 아닌 이것이 항체에 의해 표적화될 수 있음을 지시한다는 점을 이해할 것이다.
항체는 "에피토프" 또는 항원에 결합한다. 에피토프는 항체에 의해 인지 및 결합되는 항원 상에 국소화된 자리이다. 에피토프는 몇몇의 아미노산 또는 몇몇의 아미노산의 부위, 예를 들어 5 또는 6 이상, 예를 들어 20 이상의 아미노산 또는 이들 아미노산의 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우, 에피토프는 비(非)단백질 성분, 예를 들어 탄수화물, 핵산 또는 지질로부터의 성분을 포함한다. 일부 경우, 에피토프는 3차원 모이어티이다. 따라서, 예를 들어 표적이 단백질인 경우, 에피토프는 연속 아미노산, 또는 단백질 폴딩에 의해 근접하게 되는 단백질의 상이한 부위로부터의 아미노산으로 이루어질 수 있다 (예, 불연속성 에피토프). 3차원 구조를 형성하는 표적 분자의 다른 유형에서도 마찬가지이다.
용어 "~ 에 대해 특이적", "특이적으로 결합하다" 및 유사 용어는 비표적 화합물보다 2-배 이상 큰 친화도, 예를 들어, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 100-배 더 큰 친화도 중 적어도 어느 하나로 표적에 결합하는 분자 (예, 항체 또는 항체 단편) 를 지칭한다. 예를 들어, 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체는 전형적으로 비(非)1차 항체 표적 (예, 상이한 종, 또는 상이한 이소타입의 항체, 또는 비항체 표적) 보다 2 배 이상 더 큰 친화도로 1 차 항체에 전형적으로 결합할 것이다
항체 표적 (예, 항원, 분석물, 면역 복합체) 와 관련하여, 용어 "결합"이란 항체가 (가령 적절한 몰 비인 경우) 순수 집단에서 대다수의 항체 표적을 결합하는 것을 지시하는 것이 일반적이다. 예를 들어, 주어진 항체 표적을 결합하는 항체는 전형적으로 용액 중 항체 표적의 적어도 2/3 에 결합한다 (예, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 중 적어도 어느 하나). 당업자는 방법 및/또는 결합 결정 역치에 따라 일부 변화가 야기될 것이라는 점은 인지할 것이다.
항체와 관련하여 용어 "가교"란, 고체 또는 반고체 매트릭스 (예, 세파로오스, 비즈, 배양 플레이트), 또는 또 다른 단백질 또는 항체에 대한 항체의 부착을 지칭한다. 예를 들어, 항체는 멀티머화되어 다중 (2 종 초과) 항원-결합 부위를 갖는 항체 복합체를 형성할 수 있다. 항체는 고가 이소타입으로서의 항체 (예, IgA 또는 IgM, 이는 전형적으로 2 또는 5 개의 항체의 복합체를 각각 형성함) 를 발현시킴으로써 멀티머화될 수 있다. 항체 멀티머화는 또한 단백질을 결합할 수 있는 반응성기 (예, 카르보디이미드, NHS 에스테르 등) 을 포함하는 가교-링커를 이용함으로써 실시될 수 있다. 매트릭스에 대한 항체의 가교에 대한 방법 및 조성은 예를 들어 Abcam 및 New England Biolab 카탈로그 및 웹사이트 (abcam.com 및 neb.com) 에 기재되어 있다. 각종 반응성기를 갖는 가교-링커 화합물은 예를 들어 Thermo Fisher Scientific 카탈로그 및 웹사이트 (piercenet.com) 에 기재되어 있다.
본원에서 이용되는 바, 제 2 항체의 제 1 항체 부재하에서의 결합과 비교시, 제 1 항체의 존재 하 표적과의 제 2 항체의 결합이 검출가능하게 감소되는 경우, 제 1 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 제 2 항체 또는 그의 항원-결합 부위와 표적에 대한 결합을 "경쟁한다". 표적에 대한 제 1 항체의 결합은 또한 제 2 항체의 존재 하에서 검출가능하게 감소되는 대안이 사실일 수 있으나, 그러할 필요가 있는 것은 아니다. 즉, 제 2 항체는 표적에 대한 제 2 항체의 결합을 저해하는 제 1 항체 없이, 표적에 대한 제 1 항체의 결합을 저해할 수 있다. 그러나, 동일하게, 더 크게 또는 더 적게, 항체가 서로 그들의 각 에피토프(들)의 결합에 대해 "교차-경쟁"한다고 지칭되는지 여부와 관계없이, 여기서 각 항체는 기타 항체의 그의 동계 에피토프 또는 리간드에 대한 결합을 검출가능하게 저해한다. 경쟁중인 및 교차 경쟁중인 항체 양자 모두는 본원에 의해 포함된다. 용어 "경쟁자" 항체는 당업자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 제 1 또는 제 2 항체에 적용될 수 있다. 일부 경우, 경쟁자 항체 (예, 제 1 항체) 의 존재는, 제 2 항체의 표적과의 결합이 제 1 (경쟁자) 항체의 존재 하에서 감지할 수 없을 정도가 되도록, 제 2 항체의 표적과의 결합을, 적어도 10%, 예를 들어 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상 중 적어도 어느 한 퍼센트로 감소시킨다.
용어 "라벨", "검출가능 모이어티" 및 유사 용어는 분광분석, 광화학, 생화학, 면역화학, 화학 또는 기타 물리적 수단으로써 검출가능한 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 유용한 라벨은 형광 염료, 발광제, 방사성 동위원소 (예, 32P, 3H), 전자-밀도 시약 (electron dense reagent), 효소 (예, 통상 ELISA 에서 사용), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 헵텐 및 예를 들어 표적 분석물과 특이적으로 반응성인 펩티드 또는 항체에 방사성 동위원소를 혼입함으로써 검출가능하게 만들 수 있는 단백질 또는 기타 실재물이 포함된다. 항체의 라벨과의 컨쥬게이션을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법은 예를 들어 [Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego] 에 기재된 방법을 이용하여 활용될 수 있다. 용어 "태그"는 용어 "라벨"과 동의어로 사용될 수 있으나, 일반적으로는 친화도-바탕 모이어티, 예를 들어 정제를 위한 "His 태그" 또는 비오틴과의 상호작용하는 "스트렙타비딘 태그"를 지칭한다.
"라벨링된" 분자 (예, 핵산, 단백질 또는 항체) 는, 라벨에, 상기 분자의 존재가 분자와 결합된 라벨의 존재 검출에 의해 검출될 수 있도록, 링커 또는 화학적 결합을 통해 공유 결합되거나 또는 이온성, 반데르발스, 정전기 또는 수소 결합을 통해 비공유결합되는 것이다.
용어 "달리 발현된" 또는 "달리 조절된" 이란, 일반적으로 적어도 하나의 다른 샘플과 비교시 한 샘플에서 과발현 (상향 조절) 또는 저발현(하향조절)된 단백질 또는 핵산 바이오마커를 지칭한다. 본 개시의 문맥 하에서, 상기 용어는 일반적으로 정상의 비(非)암 세포와 비교시 암 세포 (예, AML 세포 또는 AML CSC) 상 CLL-1 의 과발현을 지칭한다.
예를 들어, 용어 "과발현된" 또는 "상향조절된"은 대조군 수준보다 검출가능하게 더 큰 수준으로 전사 또는 번역되는 단백질 또는 핵산, 일반적으로 바이오마커를 상호교환하여 지칭한다. 상기 용어는 전사, 전사후 프로세싱, 번역, 번역후 프로세싱, 세포 국소화 (예, 세포소기관, 세포질, 핵, 세포 표면) 및 RNA 및 단백질 안정성으로 인한 과발현을 포함한다. 과발현은 mRNA (즉, RT-PCR, 하이브리드화) 또는 단백질 (즉, 유동 세포 분석법, 이미징, ELISA, 면역조직화학 기법) 과 관계 없이 바이오마커를 검출하는 통상적인 기법을 이용해 검출될 수 있다. 과발현은 정상 세포와 비교시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 중 적어도 어느 하나일 수 있다.
용어 "아고니스트", "활성화제", "유도자" 및 유사 용어는 대조군과 비교시 활성 또는 발현을 증대시키는 분자를 지칭한다. 아고니스트는 예를 들어 표적에 결합, 표적의 활성을 자극, 증대, 활성화, 활성 증강, 민감화 또는 상향조절하는 물질이다. 발현 또는 활성은 대조군에서의 발현 또는 활성 보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 100% 이상 중 적어도 어느 하나로 증대될 수 있다. 특정 예에서, 활성화는 대조군과 비교시 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 이상 중 어느 하나이다.
용어 "저해제", "억제자" 또는 "안타고니스트" 또는 "하향조절자"는 서로 교환해서, 대조군과 비교시 검출가능하게 더 낮은 발현 또는 활성 수준을 도모하는 물질을 지칭한다. 저해된 발현 또는 활성은 대조군에서의 발현 또는 활성보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이하 중 적어도 어느 하나 일 수 있다. 특정 예에서, 저해는 대조군과 비교시 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 이상 중 어느 하나이다.
"대조군" 샘플 또는 값은 테스트 샘플과의 비교를 위한 기준, 통상 공지되어 있는 기준으로서 역할하는 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 테스트 샘플은 테스트 조건으로부터, 예를 들어 테스트 화합물의 존재에서 취해질 수 있고 공지된 조건으로부터의 샘플과, 예를 들어 테스트 화합물의 부재 하에서 (음성 대조군) 또는 공지된 화합물의 존재 (양성 대조군) 하에서 비교될 수 있다. 본 개시의 맥락 하에서, 음성 대조군의 예는 공지된 건강한 (비(非)암) 개체에서 취한 생물학적 샘플일 수 있고, 양성 대조군의 예는 공지되니 AML 환자로부터 취한 생물학적 샘플일 수 있다. 대조군은 또한 평균치 또는 다수의 테스트 또는 결과로부터 모은 범위를 나타낼 수 있다. 당업자는 대조군이 임의 개수의 매개변수의 평가를 위해 고안될 수 있다는 점을 인식할 것이다. 예를 들어, 대조군은 약물학적 데이타 (예, 반감기) 또는 치료학적 측정 (예, 이익 및/또는 부작용 비교) 를 기반으로 치료학적 이득을 비교하도록 고안될 수 있다. 대조군은 시험관 내 적용을 위해 설계될 수 있다. 당업자는 어느 대조군이 주어진 상황에서 가치있고 대조값과의 대조를 바탕으로 데이타를 분석할 수 있다는 점을 이해할 것이다. 대조군은 또한 데이타 유의성 결정에 중요하다. 예를 들어, 주어진 매개변수에 대한 값이 대조군에서 광범위하게 변동이 있는 경우, 테스트 샘플 내 편차가 중요한 것으로 고려되지 않을 것이다.
용어 "진단"은 대상체가 암과 같은 장애를 가질 상대적 확률을 지칭한다. 유사하게, 용어 "예후"는 대상체에서 특정한 미래의 결과가 발생될 상대적 확률을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시의 문맥에서, 예후는 개체가 암이 발달하거나, 재발하거나 또는 질환의 중증 공산 (예, 증후군의 심각도, 기능 쇠퇴 속도, 생존 등) 이 클 가능성을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 의학 진단 분야에서 당업자에 의해 평가되는 바와 같이 절대적인 것으로 의도되지는 않는다.
본원에서 이용되는 바와 같이 "생검" 또는 "환자로부터의 생물학적 샘플"은 CLL-1 연관 장애가 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 환자로부터 수득된 샘플을 지칭한다. 상기 샘플은 또한 혈액 세포 분획, 혈청 또는 혈청과 같이 혈액 샘플 또는 혈액 분획일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 조직 생검, 예컨대 바늘 (needle) 생검, 미세 바늘 생검, 수술적 생검 등일 수 있다. 샘플은 생물학적 샘플이 또한 또 다른 자리, 예를 들어 의심되는 전이, 림프절, 또는 혈액으로부터 유래될 수 있으나, 병변 또는 의심되는 병변 보유 조직 샘플을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 생물학적 샘플은 또한 병변 또는 의심되는 병변과 인접한 영역의 것일 수 있다.
"생물학적 샘플"은 환자로부터, 예를 들어, 생검, 동물로부터, 예를 들어 동물 모델, 또는 배양된 세포, 예를 들어 세포주 또는 환자에서 제거한 세포 및 관찰을 위한 배지에서 성장된 세포로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 혈액, 혈액 분획, 림프, 침, 뇨, 배설물 등과 같이 조직 및 신체 유체를 포함한다.
용어 "요법", "치료" 및 "개선" 은 증상 중증도의 임의 감소를 지칭한다. 암 (예, AML) 치료의 경우, 치료는 예를 들어 종양 크기, 암세포수, 성장 속도, 전이 활성도의 감소, 비(非)암 세포의 세포사 감소, 메스꺼움 감소 및 기타 화학요법 또는 방사선 요법 부작용 감소를 지칭할 수 있다. 용어 "치료" 및 "예방"은 절대적인 용어로 의도되지는 않는다. 치료 및 예방은 개시의 임의 지연, 증후군 개선, 환자 생존 개선, 생존 시간 또는 속도 증가 등을 지칭할 수 있다. 치료 및 예방은 본 발명 없이 발생되는 바 보다 더 적은 신생물 세포가 환자에게서 발견되도록 하는, 완전 (검출가능하지 않은 수준의 신생물 세포) 또는 부분적일 수 있다. 치료 효과는 치료를 받지 않은 개체 또는 개체 풀과, 또는 치료 전 동일 환자 또는 상이한 시간에서 치료 동안 대조될 수 있다. 일부 측면에서, 질환의 중증도는 예를 들어 치료를 겪지 않은 대조군 개체 또는 투여 전 개체와 비교시 10% 이상 감소된다. 일부 측면에서, 질환 중증도는 25%, 50%, 75%, 80%, 또는 90% 이상 감소되고, 일부 경우에서는 표준 진단 기술을 이용해 더이상 검출되지 않는다.
용어 "유효량", "유효 용량", "치료학적 유효량" 등은 상기 기재된 바와 같은 장애를 개선하는데 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 매개변수에 있어서, 치료적 유효량은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 중 적어도 하나, 또는 적어도 100% 로 치료 효과의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 치료적 효능은 "-배" 증가 또는 감소로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 대조군보다 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배 이상의 효과 중 적어도 어느 하나의 효과를 가질 수 있다.
본원에서 이용되는 바, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 약리학적으로 허용가능한 및 약물학적으로 허용가능한과 동의어로 사용된다. 약학적 조성물은 일반적으로 보관시 버퍼링 및 보존제를 포함하고 투여 경로에 따라 적절한 경로를 위한 버퍼 및 담체를 포함할 수 있다.
용어 "용량" 및 "투약량"은 본원에서 상호 교환해 사용된다. 용량은 각 투여시 개체에 주어진 활성 성분의 양을 지칭한다. 본 발명에 있어서, 용량은 항체 또는 관련 성분의 농도, 예를 들어 치료제의 양 또는 방사성 동위원소 양을 지칭할 수 있다. 용량은 투여 횟수; 개체 크기 및 내약성; 병태 중증도; 부작용 위험; 투여 경로; 및 검출가능 모이어티 (존재하는 경우) 의 이미징 양상을 비롯한 다양한 인자에 따라 다양할 수 있다. 당업자는 상기 인자에 따라 또는 치료적 진행을 바탕으로 용량이 변경될 수 있다는 점을 인지할 것이다. 용어 "투약 형태"는 약품의 특정 포맷을 지칭하고 이는 투여 경로에 좌우된다. 예를 들어, 투약 형태는 액체, 예를 들어 주사용 식염수일 수 있다.
"대상체", "환자", "개체" 및 유사 용어는 지시되는 것을 제외하고 포유류, 예컨대 인간 및 비(非)인간 영장류뿐 아니라 토끼, 래트, 마우스, 염소, 돼지 및 기타 포유류 종을 상호 교환하여 지칭한다. 상기 용어는 대상체가 특정 질환으로 진단받은 바를 반드시 지시하는 것은 아니나, 전형적으로 의학적 감시 하의 개체를 지칭한다. 환자는 기존의 치료적 요법 등의 치료, 모니터링, 조절 또는 변경을 구하는 개체일 수 있다. "암 환자" 또는 "AML 환자" 는 암 진단 받은 바 있어, 현재 치료 요법을 따르고 있거나, 또는 예를 들어 종양 제거 수술 후 재발 위험이 있는 개체를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 암 환자는 암으로 진단 받은 바 있어 치료 요법의 후보자이다. 암 환자는 치료를 받은 바 없고 현재 치료를 수여 받는 중이며, 수술 받은적 있는 개체, 및 치료 중단된 바 있는 개체를 포함할 수 있다.
암 치료 맥락 하에서, 치료가 필요한 대상체는 암 또는 전암성 병태를 지닌 개체, 암을 앓은 바 있는 개체 및 재발 위험이 있는 개체, 암이 의심되는 개체, 암에 대한 표준 치료법, 예컨대 방사선 치료 또는 화학요법 등을 겪은 개체를 지칭할 수 있다.
"암", "종양", "형질전환된" 및 유사 용어는 전암성, 신생물, 변형된 암 세포를 포함하고, 고체 종양 또는 비고체 암를 지칭할 수 있다 (예, 문헌 [Edge et al. AJCC Cancer Staging Manual (7th ed. 2009); Cibas and Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinical correlates (3rd ed. 2009))] 참조). 암은 양성 및 악성 신생물 (비정상 성장) 모두를 포함한다. "형질전환"은 자발적 또는 유도된 표현형 변화, 예를 들어 세포의 불멸, 형태학적 변화, 비정상적 세포 성장, 감소된 접촉 저해 및 정박, 및/또는 악성종양을 지칭한다 (Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994) 참조). 형질전환은 형질전환 바이러스로의 감염 및 새로운 게놈 DNA 의 혼입, 또는 외인성 DNA 의 흡수로 야기될 수 있으나, 이것은 또한 자발적으로 또는 발암물질로의 노출에 따라 발생될 수 있다.
용어 "암"은 백혈병, 암종, 육종, 샘암종, 림프종, 고체 및 림프구 암 등을 지칭할 수 있다. 상이한 유형의 암의 예에는 이에 제한되는 것은 아니나, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), B-세포 림프종, 비(非)호지킨스 림프종, 버킷 림프종, 소세포 림프종, 대 세포 림프종, 단핵구 백혈병, 골수성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 다발 골수종, 폐암 (예, 비 소세포 폐암 또는 NSCLC), 난소암, 전립선암, 직장결장암, 간암 (즉, 간암종), 신장암 (즉, 신장 세포 암종), 방광암, 유방암, 갑상선암, 흉막암, 췌장암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 항문암, 췌장암, 쓸개관 암, 위창자 카르시노이드 종양, 식도암, 쓸개 담낭암, 충수암, 소장암, 위장(위)암, 중추신경계암, 피부암, 융모막샘종; 두경부암, 골육종, 섬유육종, 신경모세포종, 교종, 및 흑색종을 들 수 있다.
"암 표적" 또는 "암 마커"는 암에서, 예를 들어 암 세포 상 또는 암 환경에서 상이하게 발현 또는 프로세싱된 분자이다. 예의 암 표적은 세포 표면 단백질, 예컨대 CLL-1 (또한, 예를 들어 세포 부착 분자 및 수용체), 세포내 수용체, 호르몬 및 암 환경으로 세포에 의해 분비되는 프로테아제와 같은 분자이다. 특이적 암 마커, 예를 들어 AML 에 대해서는 CD45, AML CSC 에 대해서는 CD34+CD38-, 결장 및 직장결장암 상 MUC1 발현, 폐암에서 보베신 수용체 및 전립선암 상 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 이 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 암 표적이 예를 들어, AML, 백혈병, 흑색종, 림프종, 비소세포 폐암 세포, 전립선암, 직장결장암, 유방암 또는 난소암과 같이 특정 유형의 암 세포와 연관될 수 있다. 세포 유형 특이적 표적이 전형적으로 세포의 기준 집단에서보다 상기 세포 유형에서 적어도 2 배 더 큰 수준에서 발현된다. 일부 구현예에서, 세포 유형 특이적 마커는 기준 집단에서 그의 평균 발현보다 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 또는 1000 배 더 높은 것 중 적어도 어느 하나에서의 수준에서 존재한다. 따라서, 표적은 검출 또는 측정되어 다른 세포로부터 관심되는 세포 유형 또는 유형들을 구별할 수 있다. 예를 들어, AML 암 표적은 Ly86, LILRA1, 및 CD180 을 포함한다.
암 줄기 세포 (CSC) 는 암 덩어리를 구성하는 세포를 야기할 수 있는 종양 또는 혈액 암에서 발견된 세포이다. CSC 는 또한 정상 (비(非)암) 줄기 세포와 유사하게 자가-재생할 수 있다. 그리하여, CSC 는 개체에서 비(非)종양 조직으로 이동시키고 "새로운" 종양을 개시시킴으로써 전이를 매개할 수 있다. CSC 는 암이 검출되는 단계에 따라, 매우 적은 퍼센트의 임의 주어진 암을 구성한다. 예를 들어, AML 세포의 샘플에서 CSC 의 평균 횟수는 약 1: 10,000 인 것으로 여겨진다. 조혈 CSC 는 정상의 조혈 줄기 세포 (HSC) 와 유사하게 CD34+ 로서 동정될 수 있다.
용어 "내재화되다", "내재화", "세포내 흡수 (endocytose)", "세포내이입 (endocytosis)", "포식" 및 유사 용어가 세포에 의한, 예를 들어 항체 (또는 수용체)-매개 세포내이입 또는 식작용에 의한 물질의 흡수를 지칭한다. 실시예 5 에서 ADC 검정 결과는 현재 개시된 CLL-1 항체가 내재화될 수 있음을 나타낸다.
용어 "생착하다" 또는 "생착"은 개체 또는 조직으로의 도입시 생존, 증식 및/또는 적절히 국소화하는 세포의 능력을 지칭한다. 암 줄기 세포 (CSC) 의 경우, 상기 용어는 CSC 의 데노보 종양 생성 능력 또는 상이한 자리에서의 퍼짐 능력을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 이종이식 모델 (예, 마우스 내 인간 세포의 생착) 에서 세포 집단의 생존 및 기능 능력을 기술하는데 통상적으로 사용된다. 조혈 세포의 생착은 예를 들어 WO2006/047569 에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 종양 세포의 생착은 예를 들어 문헌 [Beckhove et al. (2003) Int. J. Cancer 105:444] 에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태에서 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체 및 그의 보체를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 선형 서열을 지칭한다. 용어 "뉴클레오티드"는 전형적으로 단일 단위의 폴리뉴클레오티드, 즉 모노머를 지칭한다. 뉴클레오티드는 천연 발생 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그의 합성 또는 개질 버젼일 수 있다. 본원에서 고려되는 폴리뉴클레오티드의 예는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA (si RNA 포함) 및 단일과 이중 가닥 DNA 및 RNA 의 혼합물을 갖는 하이브리드 분자를 포함한다.
단어 "상보적" 또는 "상보성"은 폴리뉴클레오티드 내 핵산의 제 2 폴리뉴클레오티드 내 또 다른 핵산과의 염기 쌍 형성 능력을 지칭한다. 예를 들어, 서열 A-G-T 는 서열 T-C-A 와 상보적이다. 상보성은 핵산의 단지 일부만이 염기쌍에 따라 매치되는 경우에는 부분적일 수 있고, 또는 모든 핵산이 염기쌍에 따라 매치되는 경우에는 완전할 수 있다.
핵산 하이브리드화 기술을 이용하는 다양한 특이적 DNA 및 RNA 측정 방법이 당업자에게 공지되어 있다 (Sambrook, Id. 참조). 일부 방법은 전기영동 분리 (예, DNA 검출을 위한 써던 블롯, 및 RNA 검출을 위한 노던 블롯) 을 수반하나, DNA 및 RNA 측정은 또한 전기영동 부재 하에서 실시될 수 있다 (예, 정량적 PCR, 도트 블롯, 또는 어레이).
단어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 서로 교환해 아미노산 중합체 또는 2 개 이상의 상호작용하거나 또는 결합된 아미노산 중합체 세트를 지시하는데 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인위 화학적 모방체인 아미노산 중합체뿐 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 (개질된 잔기 포함) 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체뿐 아니라 천연 발생 아미노산, 개질되거나 합성된 아미노산을 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 것이다. 개질된 아미노산은 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린을 포함한다. 아미노산 유사체는 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄과 같이 예를 들어 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기처럼 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 상기 유사체는 개질된 R 기 (예, 노르류신) 또는 개질된 펩티드 백본을 가질 수 있으나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 가지나, 천연 발생 아미노산과 유사하게 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.
아미노산은 본원에서 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission 에 의해 권고되는 1문자 기호에 의해 또는 통상 공지된 3 문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그들의 통상 받아들인 단일 문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"보존적 개질된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열 양자 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련해서, 보존적 개질된 변이체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 이때 핵산이 아미노산 서열을 본질적으로 동일하거나 또는 연관된, 예를 들어 천연적으로 인접한 서열로 인코딩하지 않는 것을 지칭한다. 유전자 코드 축퇴성 때문에, 대다수의 작용적으로 동일한 핵산은 대부분의 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 명시되어 있는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않고 기술된 또다른 해당 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변동은 "침묵 변동"이며, 이는 1 종의 보존적으로 개질된 변동이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 침묵 변동을 기술한다. 당업자는 특정 환경 하에서 핵산 내 각 코돈 (흔히 메티오닌을 위한 유일한 코돈인 AUG 및 원래 트립토판을 위한 유일한 코돈인 TGG 는 제외) 이 개질되어 작동적으로 동일한 분자를 생산할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 침묵 변동은 발현 생성물과 관련하여 (실질적인 프로브 서열과 관련해서는 아님) 기술된 서열에 내포된다.
아미노산에 관해, 당업자는 인코딩된 서열 내 단일 아미노산 또는 적은 퍼센트의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실하는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적 개질된 변이체" (여기서, 변경은 화학적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 초래함) 임을 인지할 것이다. 작동적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 익히 공지되어 있다. 그러한 보존적 개질 변이체는 부가적으로 본 발명의 다형 변이체, 종간 동종체 및 대립유전자를 배제하지 않는다. 하기의 아미노산은 전형적으로 서로에 대한 보존적 치환이다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (X), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, Creighton, Proteins (1984) 참조).
2 이상의 핵산 또는 2 이상의 폴리펩티드의 문맥에서, 용어 "동일한" 또는 "퍼센트 동일성"은 수동 정렬 및 육안 검사로써, 또는 디폴트 매개변수를 이용한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용해 측정된 바, 동일하거나 또는 규정된 퍼센트의 동일한 (즉, 약 60% 동일성, 예를 들어 규정된 영역에 걸쳐 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 중 적어도 어느 하나의 동일성) 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 예를 들어, NCBI 웹 사이트: ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 참조. 이때, 상기 서열을 "실질적으로 동일하다"고 한다. 퍼센트 동일성은 상기 정의가 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐 아니라 치환을 갖는 서열에도 적용되도록 최적으로 배열된 서열들에 대해 결정되는 것이 전형적이다. 당업계에서 통상 사용되는 알고리즘은 갭 등을 설명한다. 전형적으로 동일성은, 50-100 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐, 또는 적어도 약 25 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 서열 또는 항체 에피토프를 포함하는 영역에 걸쳐, 또는 기준 서열 전장에 걸쳐 존재한다.
용어 "재조합체"는 세포 또는 핵산, 단백질 또는 벡터에 대하여 사용되는 경우, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해, 또는 본래의 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 개질된 바 있거나, 또는 상기 세포가 그렇게 개질된 세포로부터 유래되는 것을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 원 (비(非)재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않은 유전자를 발현하거나, 또는 달리 비정상적으로 발현되거나, 발현하에 있거나 또는 전혀 발현되지 않은 원 유전자를 발현한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련해서 용어 "이종"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 자연에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2 이상의 하위서열을 포함한다는 점을 나타낸다. 예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 새로운 작동 단위, 예를 들어 한 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 코딩 영역을 만들도록 배열된 관련없는 유전자들로부터의 2 이상의 서열을 갖게 재조합적으로 제조된다. 마찬가지로, 이종 단백질은 그 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2 종 이상의 하위 서열을 포함한다는 점을 지시한다 (예, 융합 단백질).
III. CLL-1 연관 장애
현재 기재된 항체를 사용하여, CLL-1 연관 장애, 즉 표준 대조군 (예, 정상, 비질환 비암 세포) 에서의 CLL-1 발현과 비교되는 상승 또는 감소된 CLL-1 의 세포 표면 발현과 상관있는 질환을 검출 및 치료할 수 있다. CLL-1 발현은 통상 골수 계통 세포, 예를 들어 수지상 세포, 과립구 및 단핵구 (말초 혈액 및 비장 내) 에 한정된다. 상승된 CLL-1 수준은 암, 특히 조혈 CSC (예, LSC) 및 골수 증식 장애 (백혈병, 예컨대 AML (급성 골수성 또는 골수증식 백혈병), MDS (골수형성 이상 증후군), 골수섬유증, CMML (만성 골수성 단구백혈병), 다발 골수종, 형질세포종, 및 CML (만성 골수성 또는 골수증식 백혈병) 포함) 에서 암과 연관있다. 문헌 [Bakker et al. (2004) Cancer Res. 64:8443; Van Rhenen et al. (2007) Blood 110:2659-66; Zhao et al. (2010) Haematologica (2010) 95:71; Van Rhenen et al. (2007) Leukemia 21:1700; 및 Herrmann et al. (2012) Haematologica 97:219] 을 참고한다.
AML 세포는 세포 표면 마커 발현을 검출함으로써 다른 세포와 구별되고 특성화될 수 있다. CLL-1+ 외에, AML 세포가 CD33+ (비록 일부는 CD33- 임), CD45+, 및 CDw52+ 일 수 있다. AML 모세포 (LSC 포함) 는 전형적으로 CD34+CD38- 이다. HSC 및 LSC 는 CD34 의 발현에 의해 특성화될 수 있으나, 전자는 CLL-1 을 발현하지 않는다. MDS 세포는 CD5, CD7, CD13, 및 CD34 의 발현에 의해 특성화될 수 있다. CML 세포는 7-ADD, CD33, CD34, 및 CD38 의 발현에 의해 특성화될 수 있다.
골수형성 이상 증후군 (MDS) 은 밀접하게 관련 있는 혈액 형성 장애 그룹을 포함하는데, 여기서 골수는 전백혈병 프로세스를 연상시키나 반드시 급성 백혈병으로서 종결되는 것은 아닌 만성 코스를 갖는 정량적 및 정성적 변화를 보인다. 전백혈병, 난치성 빈혈, 난치성 골수형성이상 빈혈, 아급성 (Smoldering/subacute) 백혈병, 골수형성이상 증후군 (DMPS), 및 골수이형성증을 비롯한 각종 용어는 모두 MDS 를 기술하는데 사용된 바 있다. 이들 병태는 모두, 성숙도가 손상된 세포 골수 (골수조혈이형성) 및 혈액 세포수 감소를 특징으로 한다. DMPS 는 거적아구의 존재, 거핵구 형성이상 및 비정상 모세포의 수 증가, 강화된 과립구 성숙 프로세스의 속성을 특징으로 한다. DMPS 환자는 급성 골수성 백혈병에서 발견되는 것과 유사한 염색체 이상 및 괴로워하는 환자의 특정 일부에서 급성 골수성 백혈병으로의 진행을 보인다.
만성 골수증식 장애는 성숙 및 미성숙 과립구, 적혈구 및 혈소판의 수 증가를 특징으로 하는 병태 무리이다. 만성 골수증식 장애는 급성 골수성 백혈병으로 종결되는 경향이 있는 상기 그룹 내 기타 형태로 이행될 수 있다. 상기 그룹 내에서 구체적인 질환에는 진성 적혈구 증가증, 만성 골수성 백혈병, 원인불명의 골수성 백혈병, 본태성 혈소판증가증, 및 만성 호중구성 백혈병이 포함된다.
골수섬유증은 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 수 감소를 야기하는 골수의 반흔형성을 특징으로 한다. 골수섬유증 반흔형성은 백혈병으로부터 야기될 수 있으나, 혈소판증가증 또는 약물 부작용과 같은 다른 원인이 있을 수 있다.
IV. CLL-1 항체
인간 CLL-1, 특히 CLL-1 발현 세포의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 CLL-1 항체 (즉, CLL-1 특이적 항체, 항-CLL-1) 이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는, 항체가 C 렉틴 도메인으로 이루어진 폴리펩티드에 CLL-1 의 C 렉틴 및 줄기 도메인 또는 CLL-1 의 세포외 도메인으로 이루어진 폴리펩티드보다 낮은 친화도로 결합하도록 하는 C 렉틴 도메인 밖의 성분을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 의 C-렉틴 및 줄기 도메인으로 이루어진 폴리펩티드보다 CLL-1 의 C-렉틴 도메인으로 이루어진 폴리펩티드에 적어도 5-배 (예, 10, 20, 50, 100 배 이상 중 어느 하나) 더 큰 Kd 로 결합한다. 예를 들어, M26 및 M31 로서 지명된 CLL-1 항체는 인간 CLL-1 의 아미노산 141-265 보다 (SEQ ID NO:2) 더 큰 친화도로 인간 CLL-1 의 아미노산 101-265 에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 전장 CLL-1 (또는 CLL-1 의 전장 세포외 도메인) 보다 적어도 5, 10, 20, 50, 또는 100-배 더 높은 Kd 로 C 렉틴 도메인에 결합한다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 1000 pM 이하, 예를 들어 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 이하 중 어느 하나의 Kd 로 인간 CLL-1 에 대한 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 10 nM 이하, 예를 들어 1 nM 이하, 1-10 nM, 100-1000 pM, 10-1000 pM, 약 1 nM 이하, 1-500 pM 의 Kd 로 인간 CLL-1 에 대한 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 또한 10 nM, 1 nM, 500 pM 이하인 Kd 로 영장류 CLL-1, 예를 들어 사이노몰거스 CLL-1 에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 인간 CLL-1 에 대한 Kd 의 자릿수 내에 있는 Kd 로 사이노몰거스 CLL-1 에 결합한다. 당업자는 더 적은 Kd 값이 더 높은 친화도를 지시한다는 점을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 광범위한 CLL-1 글리코실화 변이체에 결합한다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 AML 세포 상에 발현되는 CLL-1 의 형태 (예, 글리코실화 변이체) 에 결합한다. 예를 들어, 현재 기술된 CLL-1 항체는 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 이상 퍼센트 중 적어도 어느 하나의 AML 세포 배양물 내 세포에 결합할 수 있다 (예, HL60, THP1, 및 U937 세포주). 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 이상 퍼센트 중 적어도 어느 하나의 AML 환자 샘플 (예, PBMC 샘플 또는 AML 환자의 생검) 내 세포에 결합할 수 있다. 당업자는 이러한 세포 결합 검정에서 적절 농도의 항체가 예를 들어 배양물 또는 샘플 내 다수의 세포에 충분한 항체 분자가 결합되도록 첨가된다는 점을 이해할 것이다.
놀랍게도, 본원에서 기술된 CLL-1 항체는 컨쥬게이션된 세포독성제의 부재 하에서도 시험관 내 및 생체 내에서 CLL-1 발현 세포의 성장을 저해할 수 있다. 고율의 환자 샘플로부터의 AML 세포와의 결합을 고려해볼 때, 현재 기술된 항체는 AML 환자뿐 아니라 CLL-1+ MDS 또는 CML 을 앓고 있는 환자에게 유용한 치료 옵tus이 제공된다.
본원에서 기재된 CLL-1 항체는 또한 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성 (예, 도 1 참고) 및 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC) 활성 (실시예 5 참고) 을 보인다. 이들 CLL-1 항체는 그에 따라 예를 들어 컨쥬게이션된 세포독성제의 부재하에서 파괴를 위해 CLL-1 발현 세포를 표적하는데 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 CLL-1 항체는 앞서 특성화된 항체와 비교했을 때 독특한 세포 결합 활성을 갖는다. 예를 들어, 현재 기술된 항체는 고율의 AML 환자로부터의 1차 세포 상에 존재하는 에피토프에 결합한다. 이들 항체는 본원에 개시된 CLL-1 항체 중 하나 이상에 의해 고 친화도로 표적화된 에피토프를 전시하는 암 세포를 검출하는데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 암 세포는 이때 동일 CLL-1 항체로의 파괴를 위해 표적화될 수 있다. 이러한 방법은 CLL-1 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는 CLL-1 발현 암 세포를 갖는 개체의 치료를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쟁자 항체와 CLL-1 과의 결합에 대해 경쟁하는 CLL-1 항체를 포함한다:
· M26 의 CDR 서열을 갖는 항체 (실시예 1, 표 3 참조)
· M31 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· G4 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M22 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M29 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M2 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M5 의 CDR 서열을 갖는 항체; 및
· G12 의 CDR 서열을 갖는 항체.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 CLL-1 과의 결합에 대해 경쟁한다:
· M26 의 것과 실질적 동일성 (적어도 85, 90, 95, 또는 98% 동일성) 을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:4; Vl = SEQ ID NO:6) 을 포함하는 항체;
· M31 의 것과 실질적 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:8; Vl = SEQ ID NO:10) 을 포함하는 항체;
· G4 의 것과 실질적 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:12; Vl = SEQ ID NO:14) 을 포함하는 항체;
· M22 의 것과 실질적 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:16; Vl = SEQ ID NO:18) 을 포함하는 항체;
· M29 의 것과 실질적 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:20; Vl = SEQ ID NO:22) 을 포함하는 항체;
· M2 의 것과 실질적 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:24; Vl = SEQ ID NO:26) 을 포함하는 항체;;
· M5 의 것과 실질적 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:28; Vl = SEQ ID NO:30) 을 포함하는 항체; 및
· G12 의 것과 실질적 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:32; Vl = SEQ ID NO:34) 을 포함하는 항체. 일부 구현예에서, 실질적으로 동일한 항체는 원 항체와 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는다.
고체 상 직접 또는 간접적 방사면역검정 (RIA); 고체 상 직접 또는 간접적 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983) 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986) 참조); 고체 상 직접 라벨링된 검정; 고체 상 직접 라벨링된 샌드위치 검정 (Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조); I-125 라벨을 이용하는 고체 상 직접 라벨 RIA (Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988) 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); 및 직접 라벨링된 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)) 을 비롯한 여러 유형의 경쟁적 결합 검정이 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 검정은 비(非)라벨링된 테스트 면역글로불린 및 라벨링된 참조 면역글로불린의 이들 중 어느쪽을 갖는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 저해는 테스트 면역글로불린의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 라벨 양을 확인함으로써 측정된다. 통상 상기 테스트 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 동정된 항체 (경쟁 항체) 는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 발생되도록 기준 항체에 의해 결합된 에피토프와 충분하게 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이것은 기준 항체의 통상의 항원과의 특이적 결합을 적어도 50 또는 75% 저해할 것이다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다:
· M26 의 CDR 서열 (실시예 1, 표 3 참조) 을 갖는 항체;
· M31 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· G4 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M22 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M29 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M2 의 CDR 서열을 갖는 항체;
· M5 의 CDR 서열을 갖는 항체; 및
· G12 의 CDR 서열을 갖는 항체.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 M26, M31, G4, M22, M29, M2, M5, 및 G12 로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 CDR 서열과 비교시 1, 2 또는 3 이하의 아미노산 치환, 부가 또는 결실/ CDR 을 갖는 경쇄 CDR 서열 및 중쇄 CDR 서열을 가진다 . 일부 구현예에서, 경쇄 CDR 서열은 상술된 CLL-1 항체의 경쇄 CDR 과 비교시 1, 2 또는 3 이하의 아미노산 치환, 부가 또는 결실/CDR 을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 CDR 서열은 상술된 CLL-1 항체의 중쇄 CDR 서열과 비교시 1, 2 또는 3 이하의 아미노산 치환, 부가 또는 결실/CDR 을 포함한다. 일부 구현예에서, 전체 6 개의 CDR 중 오로지 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 CDR 에서 치환, 부가 또는 결실이 일어난다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
· M26 의 CDR 의 서열 (실시예 1, 표 3 참조) 을 갖는 항체;
· M31 의 CDR 의 서열을 갖는 항체;
· G4 의 CDR 의 서열을 갖는 항체;
· M22 의 CDR 의 서열을 갖는 항체;
· M29 의 CDR 의 서열을 갖는 항체;
· M2 의 CDR 의 서열을 갖는 항체;
· M5 의 CDR 의 서열을 갖는 항체; 및
· G12 의 CDR 의 서열을 갖는 항체. 일부 구현예에서, CDR 서열 중 임의 하나 이상은 원 항체 CDR 서열과 비교시 1, 2, 또는 3 개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
· M26 의 것과 실질적인 동일성 (적어도 (85, 90, 95, 또는 98% 동일성) 을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:4; Vl = SEQ ID NO:6) 을 포함하는 항체;
· M31 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:8; Vl = SEQ ID NO:10) 을 포함하는 항체;
· G4 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:12; Vl = SEQ ID NO:14) 을 포함하는 항체;
· M22 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:16; Vl = SEQ ID NO:18) 을 포함하는 항체;
· M29 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:20; Vl = SEQ ID NO:22) 을 포함하는 항체;
· M2 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:24; Vl = SEQ ID NO:26) 을 포함하는 항체;
· M5 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:28; Vl = SEQ ID NO:30) 을 포함하는 항체; 및
· G12 의 것과 실질적인 동일성을 갖는 가변 영역 서열 (Vh = SEQ ID NO:32; Vl = SEQ ID NO:34) 을 포함하는 항체.
일부 구현예에서, 항체는 또한 하기로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖는다:
· 10 nM 이하, 예를 들어, 1 nM 이하, 1-10 nM, 100-1000 pM, 10-1000 pM, 약 1 nM 이하, 1-500 pM, 등의 Kd 로 인간 CLL-1 과의 결합;
· AML 환자의 CLL-1 발현 AML 세포 또는 HL60 세포로의 CDC 검정에서 200 ng/ml 이하의 EC50;
· AML 환자의 CLL-1 발현 AML 세포 또는 HL60 세포로의 ADC 검정에서 100 pM 이하의 EC50; 및
· 항체 부재하 세포 성장과 비교시 CLL-1-발현 세포 (예, HL60, AML 세포) 의 세포 성장 감소.
본원에서 기재된 임의 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 CLL-1-결합 항체 단편, 예를 들어 Fab 이다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 검출제로 라벨링된다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 치료제, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 화학치료제 또는 세포독성제에 부착된다.
A. 항체 제조 방법
현재 기재된 항체, 예를 들어 재조합, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위해, 당업계에 공지된 많은 기술이 이용될 수 있다 (예를 들어, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); 및 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles 및 Practice (2d ed. 1986) 참조). 관심 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자는 세포로부터 클로닝될 수 있고, 예를 들면 모노클로날 항체를 인코딩하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝될 수 있고 재조합 모노클로날 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자 라이브러리는 또한 하이브리도마 또는 형질세포로부터 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 생성물의 랜덤 조합으로 상이한 항원 특이성을 갖는 거대 풀 (pool) 의 항체가 제조된다 (예, Kuby, Immunology (3rd ed. 1997) 참조). 단쇄 항체 또는 재조합 항체의 제조 기법 (미국 특허 4,946,778, 미국 특허 No. 4,816,567) 이 본 발명의 항체 내지 폴리펩티드 제조에 맞추어 적용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스 또는 기타 유기체, 예컨대 기타 포유동물이 인간화 또는 인간 항체 발현에 사용될 수 있다 (예, 미국 특허 Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); 및 Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995) 참조). 대안적으로, 파아지 디스플레이 기법이 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 헤테로머 Fab 단편을 동정하는데 사용될 수 있다 (예, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992) 참조). 항체는 또한 이중특이적으로, 즉 2 개의 상이한 항원을 인지할 수 있게 제조될 수 있다 (예, WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); 및 Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986) 참조). 항체는 또한 헤테로컨쥬게이트, 예를 들어 2 개의 공유 결합된 항체 또는 면역독소일 수 있다 (예를 들어, U.S. Patent No. 4,676,980 , WO 91/00360; WO 92/200373; 및 EP 03089 참조).
원핵 및 진핵 발현 시스템을 비롯한 임의 수의 발현 시스템을 이용하여 항체를 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 포유동물 세포 발현, 예컨대 하이브리도마 또는 CHO 세포 발현 시스템이다. 많은 이러한 시스템은 시중의 공급자에게서 폭넓게 입수가능하다. 항체가 VH 및 VL 영역 모두를 포함하는 구현예에서, VH 및 VL 영역은 단일의 벡터를 이용해, 예를 들어 디-시스트로닉 발현 단위에서, 또는 상이한 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다. 기타 구현예에서, VH 및 VL 영역은 별도의 벡터를 이용해 발현될 수 있다. 본원에서 기재된 바와 같은 VH 또는 VL 영역은 임의로는 N-말단에서 메티오닌을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 또는 dAB 를 비롯해 각종 포맷으로 제조될 수도 있다. 항체 단편은 효소, 예컨대 펩신 ((Fab')2 단편 생성) 또는 파파인 (Fab 단편 생성) 을 이용한 온전한 항체의 소화; 또는 데노보 합성을 비롯해 다양한 방법으로써 수득될 수 있다. 항체 단편은 또한 재조합 DNA 방법을 이용해 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 에 특이적으로 결합하는 F(ab')2 단편을 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Fundamental Immunology (Paul ed., 4d ed. 1999); Bird, et al., Science 242:423 (1988); 및 Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 (1988)] 참조.
비(非)인간 항체의 인간화 방법 (즉, 비인간 항체로부터의 CDR 이용) 이 또한 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 수입 잔기로서 지칭되며, 이는 전형적으로 수입 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 Winter 와 동료의 방법에 따라 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 상응하는 인간 항체 서열에 대해 치환함으로써 수행될 수 있다 (예, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참조). 이러한 인간화 항체는 키메라 항체로 (U.S. Patent No. 4,816,567), 이때 실질적으로 결코 온전하지 않은 인간 가변 도메인이 비인간 종의 상응하는 서열에 의해 치환된 바 있다. 실제, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사 부위의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
일부 경우에서, 항체 또는 항체 단편은 또 다른 분자, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG화) 또는 혈청 알부민에 컨쥬게이션되어 생체 내 연장된 반감기를 제공할 수 있다. 항체 단편의 PEG화의 예는 문헌 [Knight et al. Platelets 15:409, 2004 (for abciximab); Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994 (for an anti-CEA 항체); Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999; 및 Humphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227,2007)] 에 제공되어 있다. 항체 또는 항체 단편은 또한 라벨링될 수 있거나 또는 하기 기술된 바와 같은 치료제에 컨쥬게이션될 수 있다.
B. 결합 친화도
결합 특이성은 표적용 항체 (또는 기타 표적 모이어티) 의 비교 분해 상수 (Kd) 의 측면에서, 그 환경에서의 항체 및 기타 물질, 또는 일반적으로 관련 없는 분자에 대한 상기 분해 상수와 비교하여 정의될 수 있다. 전형적으로 관련 없는 물질에 대해 항체의 Kd 는 표적에 대한 Kd 보다 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 200-배 이상일 것이다.
항체에 대한 바람직한 친화도, 예를 들어 고 (pM 내지 저 nM), 중 (저 nM 내지 100 nM), 또는 저 (약 100 nM 이상) 는 이것이 진단 또는 치료용으로서 사용되는지 여부에 따라 달라질 수 있다. 이론에 얽매임 없이, 한 예에서, 중 친화도의 항체가 고 친화도의 항체와 비교시 종양으로의 국소화에 보다 성공적일 수 있다. 따라서, 상이한 친화도를 갖는 항체가 진단 및 치료 용으로 사용될 수 있다.
표적 모이어티는 약 1000 nM 미만, 예를 들면 250, 100, 50, 20 또는 그 이하의 숫자 미만의 nM 의 Kd 로 결합할 것이다. 일부 구현예에서, 친화도 제제의 Kd 는 15, 10, 5, 또는 1 nM 미만이다. 일부 구현예에서, Kd 는 1-100 nM, 0.1-50 nM, 0.1-10 nM, 또는 1-20 nM 이다. 분해 상수 (Kd) 의 값은 익히 공지된 방법에 의해 측정될 수 있고, 이는 예를 들어 문헌 [Caceci et al., Byte (1984) 9:340-362] 에 개시된 바와 같은 방법에 의해 복합체 혼합물에 대해서도 컴퓨터링될 수 있다.
항체 또는 임의 표적 제제의 표적에 대한 친화도는 예를 들어 [Ernst et al. Determination of Equilibrium Dissociation Constants, Therapeutic Monoclonal Antibodies (Wiley & Sons ed. 2009)] 에 리뷰된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다.
정량적 ELISA, 및 유사 어레이-기반 친화도 방법이 이용될 수 있다. ELISA (효소 결합 면역흡착 시그널링 검정) 는 항체-기반 방법이다. 일부 경우에서, 관심 표적에 대해 특이적인 항체가 기질에 부착되고 표적을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉한다. 이후 표면은 세정되어 비결합된 물질을 제거한다. 표적 결합은 다양한 방식으로, 예를 들어 라벨링된 항체를 이용한 제 2 단계, 표적의 직접 라벨링, 또는 항원 결합시 검출가능한 라벨로의 1차 항체의 라벨링을 이용해 검출될 수 있다. 일부 경우에, 항원은 기질에 부착되고 (예, 단백질에 대한 고 친화도를 갖는 기질, 또는 스트렙타비딘-비오틴 상호작용 이용), 라벨링된 항체 (또는 기타 표적 모이어티) 를 이용해 검출된다. 원 ELISA 방법의 몇몇의 치환이 개발된 바 있고 당업계에 공지되어 있다 (리뷰를 위해, Lequin (2005) Clin. Chem. 51:2415-18 참조).
Kd, Kon, 및 Koff 가 또한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 를 이용해, 예를 들어 Biacore T100 시스템을 이용해 측정된 바와 같이 측정될 수 있다. SPR 기술은 예를 들어 문헌 [Hahnfeld et al. Determination of Kinetic Data Using SPR Biosensors, Molecular Diagnosis of Infectious Diseases (2004)] 에서 검토된다. 전형적인 SPR 실험에서, 하나의 상호작용제 (표적 또는 표적제) 가 유동 세포에서 SPR-활성, 금-코팅된 유리 슬라이드 상에 고정되어 기타 상호작용제 함유 샘플을 표면을 건너 유동되게 도입한다. 주어진 주파수의 빛을 표면에 비추는 경우, 금의 시각적 반사능은 결합 및 결합 역학을 지시한다.
결합 친화도는 또한 스트렙타비덴 (SA) 센서 칩에 비오티닐화된 상호작용제를 고정시킴으로써 측정될 수 있다. 기타 상호작용제를 이때 예를 들면 [Abdessamad et al. (2002) Nuc. Acids Res. 30:e45] 에 기재된 바와 같이 상기 칩과 접촉시켜 검출한다.
C. CLL-1 에피토프 확인
CLL-1 에 대한 항체 결합 부위가 공지된 에피토프 맵핑 기술을 이용해 맵핑될 수 있다. 당업자는 에피트포 맵핑에 사용된 접근법이 항원, 예를 들어 이의 세포 내 발현 위치, 1 차 폴리펩티드 서열의 번역후 개질, 및 상이한 세포 또는 상이한 환경에서 항원 구조의 차이에 따라 가변적일 수 있다.
CLL-1 은 약 200 세포외 아미노산을 가진 트랜스멤브레인 단백질이다. 세포외 도메인은 글리코실화되고, C 렉틴 도메인을 포함한다. CLL-1 항체에 대한 에피토프는 CLL-1 의 1 차 서열 또는 글리코실화 상태를 변경시키고 CLL-1 항체의 CLL-1 의 상이한 변이체와의 친화도를 비교함으로써 결정 또는 부분적으로 결정될 수 있다.
이러한 에피토프 맵핑은 시험관 내에서, 예를 들면 파아지 디스플레이 라이브리 또는 합성 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써, 예를 들면 비즈 또는 기타 고체 매트릭스를 이용해 수행할 수 있다. 선형 에피토프는 비록 이것이 다소 가변적일 수 있지만 전형적으로 약 6 개의 아미노산이다. 단백질 내 존재하는 선형 에피토프를 모방하기 위해, 합성 펩티드를 서열에 상응되게 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 이 서열은 N 및/또는 C 말단 상에 뻗어져 있어 단백질 내 측면 (flanking) 서열에 존재하는 추가적인 아미노산 잔기를 제공한다. 이는 보다 밀접하게 에피토프의 1 차 구조 환경을 모방할 수 있고, 어느 정도로는 에피토프의 2차 구조 환경을 모방할 수 있다. 추가적으로, 비제한적으로 하나 이상의 글리신 또는 감마 아미노 부티르산을 포함하는 잔기는 어느 한쪽의 말단에 덧붙여져 예를 들면 면역검정에서 이용되는 고체 상과의 입체 상호작용을 최소화하는 스페이서를 제공할 수 있다. 스페이서 길이는 종종 최고의 구조를 실험적으로 결정하기 위해 달라진다.
측면 서열로 인한 잠재적 효과 및 에피토프의 가변적 성질 때문에, 일부 구현예에서, 일정 수의 잔기로써 N 또는 C 말단을 연장함으로써 길이 변화시킨 펩티드를 이용할 수 있다. 또 다른 접근법은 반복 펩티드 에피토프 또는 개입 스페이서 잔기와의 교차 에피토프를 이용할 수 있다. 이들 펩티드의 길이는 종종 목적되는 반복 단위 수에 따라 가변적이다.
하나의 에피토프 맵핑 접근법은 오버랩핑 펩티드, 예를 들면 20 잔기 길이를, CLL-1 세포외 영역의 1차 서열을 커버하는 6 잔기를 오버랩하여 합성하는 것이다. 이러한 펩티드 스크리닝을 이용해 에피토프를 맵핑하는데 이용하는 경우, 펩티드가 개질되어 면역검정에서 사용된 고체 상 지지체와의 바람직하지 않은 상호작용을 극복할 수 있다. 한 가지 방식은 증가된 펩티드 접근성 및 소수성 상호작용을 감소 또는 최소화하도록 소수성 잔기를 갖는 펩티드에서 소수성 잔기를 치환하는 것이다. 마찬가지로, 하전된 펩티드 잔기는 비(非)하전된 잔기로 치환되어 고체 상과의 이온성 상호작용을 없앨 수 있다. 펩티드는 또한 입체 장애를 최소화하고 고체 상으로부터 더 펩티드 에피토프를 포지셔닝하도록 각종 구조의 스페이서기를 첨가함으로써 개질될 수 있다.
펩티드는 천연 단백질 또는 표적화 세포 상 천연 단백질에 존재하는 번역후 개질을 반영하도록 합성될 수 있다. 개질은 이에 제한되는 것은 아니나 단백질에서 특정 자리에 글리코실화 및 인산화를 포함한다.
에피토프 확인을 위한 또 다른 접근법은 세포에서 CLL-1 변이체를 발현시키고 상이한 변이체들 간 CLL-1 항체 친화도를 대조하는 것이다. CLL-1 변이체는 펩티드 연구에 기재된 바와 같이 설계될 수 있다. 나아가, 글리코실화 잔기 (예, 아스파라긴, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 티로신) 가 치환되어 에피토프가 글리코실화 부위를 포함하는지 여부를 확인할 수 있다. 마찬가지로, 인산화된 잔기 (세린, 트레오닌, 티로신) 가 치환될 수 있다.
에피토프는 또한 상이한 유형의 CLL-1 발현 세포에 대한 항체 친화도를 대조함으로써 확인 또는 부분적으로 확인될 수 있다. 예를 들어 항체 친화도는 1 차 AML 세포, 예를 들어 AML 모세포 및 생착된 AML 종양 세포에 대해; AML 세포주에 대해, 기타 비암성 골수 세포 등에 대해 측정 및 비교될 수 있다.
D. CDC, ADCC, 및 ADC 검정
현재 기술된 항체는 CLL-1 을 발현하는 세포의 세포 의존적 세포독성 (CDC), 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 항체 약물 컨쥬게이트 세포독성 (ADC) 에 유효하다. CLL-1 을 발현하는 예의 세포에는 이종, 재조합 CLL-1 (예, 인간 CLL-1) 을 발현하는 세포주; 인간 AML 세포주, 예컨대 HL60, THP1, TF1-알파, U937, 및 OCI AML-5 (이들 중 앞의 4 개는 ATCC 에서 이용가능); 한 명 이상의 AML 환자의 1 차 세포 (예, PBMC 또는 생착된 종양 세포); 인간 CML 세포주, 예컨대 K562 및 KU812 (ATCC 에서 이용가능); 및 한 명 이상의 CML 또는 MDS 환자로부터의 1차 세포가 포함된다.
항체는 이것이 항체 표적을 발현하는 세포의 보체 의존적 사멸을 도모하는 경우 CDC 활성을 갖고 CDC 를 매개하는 것으로서 기술된다. CDC 검정은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면 문헌 [Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol. Methods 202:163; Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178]; 및 하기 실시예 6 에 기술되어 있다. CDC 키트 및 서비스는 예를 들면 GeneScript® 및 Cell Technology Inc 에서 시판중이다.
요약하면, 상기 검정은 전형적으로 시험관 내에서 실시되고, 이는 그의 표면 상 항체 표적을 발현하는 세포와 결합하는 항체를 포함한다. 항체의 Ch 영역에 결합하는 C1q 를 포함하는 보체 성분이 첨가된다. 이때, 보체 성분은 상호작용하여 표적화된 세포를 사멸시킨다. CDC 는 일반적으로 4 내지 24 시간의 인큐베이션 기간 후에, 출발 및 종료 표적 세포 집단 등의 비교에 의해 표적화된 세포 내 존재하는 것으로 공지된 세포내 효소 또는 과립의 방출을 확인하여 측정된다.
항체는 효과기 세포에 의해 항체-결합된 세포 (예, CLL-1 발현 세포) 의 사멸을 도모하는 경우 ADCC 활성을 갖고 ADCC 를 매개하는 것으로서 기술된다. 효과기 세포는 전형적으로 자연 살해 세포이나, 또한 대식세포, 중성구 또는 호산구일 수 있다. 유전자 조작된 효과기 세포주는 또한 ADCC 검정에서 사용되도록 개발된 바 있다 (예, Schnueriger et al. (2011) Mol. Immunol. 48:1512 참조). ADCC 검정은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Perussia 및 Loza (2000) Methods in Mol. Biol. 121:179; Bretaudeau 및 Bonnaudet (2011) BMC Proceedings 5(Suppl 8):P63]; 및 하기 실시예 12 에 기술되어 있다. ADCC 키트 및 서비스는 예를 들어 GeneScript® 및 Promega® 로부터 시판중이다.
요약컨대, 상기 검정은 전형적으로 시험관 내에서 실시되고 그 표면 상 항체 표적을 발현하는 세포와 결합하는 항체를 포함한다. 전형적으로 Fc 수용체, 예컨대 CD16 을 통해 항체-결합된 세포를 인지하는 효과기 세포가 첨가된다. 효과기 세포는 항체-결합된 세포를, 예를 들면 세포자멸사를 야기하는 세포독소를 방출시킴으로써 사멸시킨다. 세포사는 표적 세포 (예, Cr51) 내 검출가능한 요소의 방출에 의해, 또는 세포 매개된 독성에 수반되는 요소의 검출에 의해 (예, 효과기 세포에서 NFAT 시그널링의 활성화) 검출된다.
항체는 세포독성제 (약물) 과 컨쥬게이션시 항체의 표적을 발현하는 세포, 이 경우 CLL-1 을 사멸 (생존 저해) 시키는 경우, 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 활성을 갖는 것으로서 (또는 ADC 매개) 기술된다. 적절한 세포독성제, 예를 들어 사포린, 독소루비신, 다우노마이신, 빈카-알칼로이드, 탁소이드, 튜불린제 (예, Maytansin, 아우리스타틴) 및 DNA 시약 (예, 칼리케아마이신, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀 다이머) 등이 당업계에 공지되어 있다. ADC 검정이 예를 들면 문헌 [Gerber et al. (2009) 3:247] 및 하기 실시예에 기술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
E. 내재화
본원에 기재된 CLL-1 항체는 CLL-1 AML 세포를 비롯해 CLL-1-발현 세포에 내재화될 수 있다. 즉, CLL-1 발현 세포는 본원에 기재된 항체를 내재화할 수 있다. 본원에 기재된 CLL-1 항체는 이러한 세포를, 예를 들면 검출가능하거나 또는 세포독성인 컨쥬게이트를 이용해 표적화하는데 유효한 수단을 제공한다.
항체의 내재화% 및 내재화 비율은 예를 들면 유동세포측정 (FACS) 및 동일초점 형광 현미경을 비롯한 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 평가될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 문헌 [Lue et al. (2007) Nature Protocols (Nature Med. 13:587-96); Cho et al. (2010) Biomacromolecules 및 Corbani et al. (2004) Endocrinology 145:2876-85] 및 본원에서 기재한 바와 같이 기술되어 있다.
FACS 및 동일초점 현미경 측정을 위해서는, 세포가 형광-라벨링된 표적제, 예를 들어 항체와 함께 인큐베이션된다. 세포는 전형적으로 라벨링된 항체의 표적, 예를 들어 CLL-1 을 발현하는 것이 선택된다. 이때, 대조군 세포는 표적을 발현하지 않는 것이 이용될 수 있다. 내재화는 전형적으로 37℃ 에서 (그러나 4℃ 에서는 아님, 이는 반응의 또 다른 대조군을 제공함) 일어난다. 그에 따라 세포를 라벨링제와 접촉할 수 있고, 37℃ 또는 4℃ 에서 (예를 들어, 내재화 없이 결합 측정을 위해서) 인큐베이션할 수 있다.
비결합 및 표면-결합된 제제는 세포를 예를 들어 산 세정에서 세정한 후 정상 pH 에서의 버퍼를 이용한 세정에 의해 제거된다.
유착 세포가 이용되는 경우, 세포는 유동세포측정 이전에 기질에서부터 제거된다. 형광 세포의 백분율은 형광-라벨링된 제제의 내재화% 를 지시한다. 내재화% 는 또한 예를 들어 세포에 첨가된 초기 라벨링된 제제의 퍼센트로서 표현될 수도 있다.
제제의 내재화는 또한 동일초점 현미경에 의해 형광 라벨링된 제제의 국소화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 내재화 확인을 위한 동일초점 현미경을 이용하는 방법은 예를 들어 문헌 [Xiao et al. (2008) Chem. Eur. J., 14:1769-1775] 에 기술되어 있다. 요약컨대, 세포는 라벨링제와 접촉되고 상기 기재된 바와 같이 인큐베이션된다. 인큐베이션 후, 세포는 얼음위에서 인큐베이션되고, 4℃ 에서 PBS 버퍼 중 세정되고, 0.25% 트립신으로 처리될 수 있다 (적용가능한 경우, 기질로부터 제거하기 위함). 이때 세포 현탁물은 동일초점 형광 현미경의 슬라이드에 적용될 수 있다. 적합한 동일초점 현미경에는 FV500-IX81 동일초점 현미경 (Olympus America Inc.; Center Valley, PA) 및 Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc.; Melville, NY) 이 있다.
V. 진단 적용
본원에 기재된 바와 같은 CLL-1 항체는 CLL-1-발현 세포에 특이적으로 결합한다. 그에 따라 CLL-1 항체는 CLL-1-발현 세포 (예, AML 세포 및 AML CSC) 를 검출하기 위한 시험관 내 및 생체 내 진단 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플 (예, 혈액 샘플 또는 조직 검정) 은 환자로부터 수득되고 CLL-1 항체와 접촉될 수 있고, 환자 샘플에서 CLL-1-발현 세포의 존재가 항체 결합 검출에 의해 확인될 수 있다. 항체 결합은 직접적으로 (예를 들어, 항체 그 자체가 라벨링된 경우) 또는 제 2 검출제, 예컨대 2 차 항체를 이용함으로써 검출될 수 있다. 검출가능한 라벨은 본 발명의 항체와, 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들면 킬레이트제 또는 링커를 통해 연합될 수 있다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 CLL-1 연관 장애가 있거나 또는 있다고 의심되는 개체의 생물학적 샘플과 접촉되고, 상기 샘플에서 세포와의 항체 결합이 측정되는데, 이때 정상 항체 결합보다 더 높거나 더 낮은 결합이 개체가 CLL-1 연관 장애가 있다는 것을 시사한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 혈액 분획 (예, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구, 백혈구, PBMC) 이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 예를 들어 공지된 종양의 경계를 결정하기 위한 조직 샘플 (생검), 예를 들어 의심되는 종양 부위의 샘플, 또는 병 발생된 것으로 공지된 조직의 생검이다.
생검은 전형적으로 조직, 즉 비(非)유체 세포 유형으로부터의 샘플을 수득하도록 행해진다. 적용된 생검 기술은 평가될 조직 유형 (예, 유방, 피부, 결장, 전립선, 신장, 폐, 방광, 림프절, 간, 골수, 기도 또는 폐) 에 의존할 것이다. 암의 경우, 상기 기술은 또한 다른 인자들 중에서도 종양의 크기 및 유형 (예, 고체, 현탁된 또는 혈액) 에 의존할 것이다. 대표적인 생검 기술은 이에 제한되는 것은 아니나 적출된 생검, 절개된 생검, 바늘 생검, 수술적 생검 및 골수 생검을 포함한다. "적출된 생검"은 종양 덩어리를 이를 둘러싼 정상 조직의 적은 주변부와 함께 제거하는 것을 지칭한다. "절개된 생검"은 종양의 단면 직경을 포함하는 쐐기 모양의 조직의 제거를 지칭한다. 내시경 또는 형광투시법에 의해 행해진 진단 또는 예후는 종양 덩어리의 "코어-바늘 생검" 또는 "미세-바늘 흡인 생검" 을 요구할 수 있는데, 이는 일반적으로 종양 덩어리 내에서부터 세포의 현탁액을 수득한다. 생검 기술은 예를 들어 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70, 및 throughout Part V] 에 논의되어 있다.
샘플에서 세포와의 항체 결합을 검출하는 임의 방법은 현재 진단 검정에 사용될 수 있다. 항체 결합 검정 방법, 예를 들어 유동세포측정, 형광 현미경, ELISA 등이 익히 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 측정 단계 이전에 생물학적 샘플 제조를 포함한다. 예를 들어, 세포의 부차집단 (예, 백혈구 세포, CD34+ 세포, CD45+ 세포 등) 이 개체의 샘플 나머지 (예, 다른 혈액 성분) 으로부터 분리될 수 있거나, 또는 조직 내 세포는 더욱 용이한 검출을 위해 현탁될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플 내 CLL-1-발현 세포의 퍼센트는 확인되고, 대조군, 예를 들면 CLL-1 연관 장애로 공지된 개체 또는 개체 군의 샘플 (양성 대조군) 또는 CLL-연관 장애를 갖지 않은 것으로 공지된 개체 또는 개체군의 샘플 (정상, 건강한, 비질환 또는 음성 대조군) 과 비교된다. 일부 구현예에서, 대조군이 주어진 조직에 대해 확립된 CLL-1 발현의 표준 범위이다. 정상 퍼센트보다 더 높거나 낮은 퍼센트의 CLL-1 발현 세포, 또는 더 높거나 낮은 발현 수준은 개체가 CLL-1 연관 장애가 있다는 점을 지시한다.
일부 구현예에서, 라벨링된 CLL-1 항체가 개체에 제공 (투여) 되어, 의도된 치료의 적용성을 확인할 수 있다. 예를 들어, 라벨링된 항체가 질병 영역 (밀도가 전형적으로 비질병 조직에 비해 높음) 내 CLL-1 밀도를 검출하는데 사용될 수 있다. 라벨링된 항체는 또한 질병에 걸린 영역이 치료요법에 대해 접근가능함을 지시할 수 있다. 환자는 그에 따라 이미징 결과를 바탕으로 하는 치료 요법에 대해 선택될 수 있다. 해부학적 특성화, 예컨대 암의 명확한 경계를 결정하는 것이 표준 이미징 기술 (예, CT 스캐닝, MRI, PET 스캐닝 등) 을 이용해 성공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같은 라벨링된 CLL-1 항체가 치료적 화합물과 추가로 연관될 수 있어, 예를 들어 "치료진단" 조성물을 형성할 수 있다. 예를 들어, CLL-1 항체는 검출성 라벨 및 치료제, 예를 들어 세포독성제 모두에 (직접 또는 간접적으로) 연결되어 CLL-1 발현 암 세포를 사멸할 수 있다. 일부 구현예에서, 라벨링된 CLL-1 항체는 CLL-1 발현 암 세포의 국소화 및/또는 진단에 사용되고, CLL-1 발현 암 세포가 이때 개별 치료적 CLL-1 특이적 항체로 표적화된다. 일부 구현예에서, 진단성 CLL-1 특이적 항체는 높은 비율 또는 퍼센트로 CLL-1 발현 세포에 내재화되지 않은 것이다. 일부 구현예에서, 치료성 CLL-1 항체는 높인 비율 또는 퍼센트로 CLL-1-발현 세포에 내재화된다.
A. 라벨
CLL-1 항체를 포함하는 진단제는 예를 들면 하기 참고서에 제공된 바와 같이 공지된 임의의 진단제를 포함할 수 있다: Armstrong et al., Diagnostic Imaging, 5th Ed., Blackwell Publishing (2004); Torchilin, V. P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995); Vallabhajosula, S., Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET and SPECT, Springer (2009). 진단제는 검출가능 신호를 제공 및/또는 강화하는 물질을 비롯해 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 검출가능 신호는 이에 제한되는 것은 아니나, 감마-방출, 방사선, 에코발생, 광학적, 형광, 흡수성, 자석 또는 단층 신호를 포함한다. 진단제의 이미지화 기술에는 이에 제한되는 것은 아니나, 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층 촬영 (SPECT), 자기 공명 이미징 (MRI), 광학 이미징, 양전자 방사 단층촬영 (PET), 컴퓨터 단층 촬영 (CT), x-선 이미징, 감마선 이미징 등이 있다. 용어 "검출제", "검출성 모이어티", 및 유사 용어가 본원에서 동의어로 사용된다.
일부 구현예에서, 라벨은 형광제, 인광제, 화학발광제 등과 같은 광학제를 포함할 수 있다. 수많은 물질 (예, 염료, 프로브, 라벨 또는 지시자) 이 당업계에 공지되어 있으며 이는 본 발명에서 사용될 수 있다 (예, Invitrogen, The Handbook - Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition (2005) 참조). 형광제는 각종 유기 및/또는 무기 소분자 또는 각종 형광 단백질 및 그 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 형광제는 이에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함할 수 있다: 시아닌, 프탈로시아닌, 포르피린, 인도시아닌, 로다민, 페녹사진, 페닐잔텐, 페노티아진, 페노셀레나진, 플루오레신, 벤조포르피린, 스쿠아라인, 디피롤로 피리미돈, 테트라센, 퀴놀린, 피라진, 코린, 크로코늄, 아크리돈, 페난트리딘, 로다민, 아크리딘, 안트라퀴논, 찰코게노피릴륨 유사체, 클로린, 나프탈로시아닌, 메틴 염료, 인돌레늄 염료, 아조 화합물, 아줄렌, 아자줄렌, 트리페닐 메탄 염료, 인돌, 벤조인돌, 인도카르보시아닌, 벤조인도카르보시아닌 및 BODIPY™ 유도체. 형광 염료는 예를 들어 U.S. Pat. No. 4,452,720, U.S. Pat. No. 5,227,487, 및 U.S. Pat. No. 5,543,295 에 논의되어 있다.
라벨은 또한 방사능동위원소, 예를 들어 감마선, 양전자, 베타 및 알파 입자 및 X 선을 방사하는 방사성 핵종일 수 있다. 적합한 방사성 핵종에는 이에 제한되는 것은 아니나 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 166Ho, 123I, 124I, 125I, 130I, 131I, 111In, 177Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y 및 90Y 이 포함된다. 일부 구현예에서, 방사능제는 111In-DTPA, 99mTc(CO)3-DTPA, 99mTc(CO)3-ENPy2, 62/64/67Cu-TETA, 99mTc(CO)3-IDA, 및 99mTc(CO)3트리아민 (시클릭 또는 선형) 을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상게 제제는 DOTA 및 111In, 177Lu, 153Sm, 88/90Y, 62/64/67Cu, 또는 67/68Ga 를 갖는 각종 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 나노입자는 하기 문헌에 제공된 바와 같이 DTPA-지질과 같이 킬레이트와 부착된 지질의 혼입에 의해 라벨링될 수 있다: Phillips et al., Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, 1(1): 69-83 (2008); Torchilin, V.P. & Weissig, V., Eds. Liposomes 2nd Ed.: Oxford Univ. Press (2003); Elbayoumi, T.A. & Torchilin, V.P., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 33:1196-1205 (2006); Mougin-Degraef, M. et al., Int'l J. Pharmaceutics 344:110-117 (2007).
일부 구현예에서, 진단제는 발색 기질과 접촉시 착색된 생성물을 생성시키는 효소 (또는 효소 태그) 또는 2차 결합 리간드와 연합될 수 있다. 적절한 효소의 예에는 우레아제, 알칼린 포스파타아제 (서양고추냉이) 과산화수소효소 및 글루코오스 옥시다아제가 포함된다. 2차 결합 리간드에는, 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘 화합물이 포함된다.
일부 구현예에서, 라벨링된 항체는 하기에 상세히 기재되는 바와 같이, 예를 들어 PEG 또는 나노입자, 예컨대 리포솜과 같이 생체 내 안정성을 개선시키는 조성물에 추가 연합될 수 있다.
B. 라벨링 방법
항체와의 검출성 및 치료적 제제의 컨쥬게이션 기술은 익히 공지되어 있다 (예, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies 및 Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery"in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological 및 Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982) 참조).
전형적으로, 항체는 에피토프와의 결합이 방해받지 않는 영역에서 검출성 모이어티에 부착된다. 따라서, 일부 경우에서, 검출성 모이어티는 불변 영역에 또는 가변 영역 내 CDR 외부에 부착된다. 당업자는 검출성 모이어티가 항체 내 어디에라도 위치될 수 있고, 검출성 모이어티의 위치는 그에 따라 조절될 수 있음을 알 것이다. 일부 구현예에서, 항체의 에피토프와의 연합 능력은 검출성 모이어티와의 부착 전후 비교되어 부착이 결합을 지나치게 방해하지 않는다는 점을 보장한다.
일부 구현예에서, 항체는 추가 표적화 모이어티와 연합될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자 또는 표적 세포 상 상이한 부위와 결합하는 항체 단편, 펩티드 또는 압타머는 항체와 컨쥬게이션되어 예를 들어 암 세포로의 표적 결합을 최적화할 수 있다.
VI. 치료적 적용
CLL-1-발현 세포, 예컨대 AML 세포가 본원에서 기재된 CLL-1 항체를 이용하여 표적화될 수 있다. CLL-1 발현은 AML 세포 및 CSC (예, AML CSC) 에서 상승된다. CLL-1 은 정상 CD34+ 조혈 줄기 세포 (HSC) 상에서 유의미하게 발현되지 않으므로, CSC 는 본 발명의 CLL-1 항체를 이용해 HSC 와 구분될 수 있다. AML 은 재발 발생율이 매우 높기 때문에, AML 세포에 공통적인 CLL-1 에피토프를 인지하여 AML 세포에 보편적으로 결합할 수 있는 높은 친화도 CLL-1 항체가 특히 가치있다. 상기 주목된 바, CLL-1 항체를 포함하는 치료학적 조성물은 예를 들어 CLL-1 발현 세포의 검출 및 국소화, 및 치료 효과의 모니터링을 위해, 검출가능한 라벨을 추가로 포함하여 치료진단적 조성물을 형성할 수 있다.
본원에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 CLL-1 항체는 암 세포 성장 (증식 및/또는 생착) 을 저해할 수 있고 그에 따라 단독으로 화학요법제로서 고려될 수 있다. 하기의 개시는 CLL-1-발현 세포에 있어서 추가적인 효과를 위해 CLL-1 항체에 결합할 수 있는 화학요법제 및 세포독성제의 예를 제공한다.
화학요법 (항암)제는 직접적으로 또는 간접적으로 암 세포를 사멸, 전이 감소, 종양 혈액 공급 감소 등 암 세포 복제를 방해하면서 암 성장을 감소시킬 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 화학요법제는 따라서 세포독성제를 포함한다. 세포독성제는 이에 제한되는 것은 아니나 사포린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 안트라시클린, 및 플라티늄-기재 물질을 포함한다. 화학요법제 부류에는 이에 제한되는 것은 아니나 알킬화제, 항대사성물질, 예를 들어 메토트렉세이트, 식물 알칼로이드, 예를 들어 빈크리스틴 및 항생제, 예를 들어 독소루비신뿐 아니라 히드록시우레아와 같은 특정 부류에 속하지 않는 여러 종류의 약물이 포함된다. 시스팔라틴 및 옥살리플라틴에 의해 예시되는 플라티늄-기재 약물은 주 부류의 화학요법을 대표한다. 이들 약물은 DNA 에 결합하고 복제를 방해한다. 탁솔로 예시되는 탁산은 또 다른 주부류의 화학요법을 나타낸다. 이들 화합물은 세포 분열을 저해하여 빠르게 분열하는 암 세포의 성장을 막도록 세포골격 및 방추 형성을 방해함으로써 작용한다. 기타 화학요법 약물은 호르몬 요법을 포함한다.
1 초과의 치료제는 동일한 조성 또는 별개의 조성으로 조합될 수 있다. 치료제(들)는 또한 특정 개체에 적합한 경우 추가적인 치료제와 조합될 수도 있다. 암 환자에게 제공되는 통상의 치료제는 통증, 메스꺼움, 빈혈, 감염, 염증, 및 암환자들이 통상 경험하는 기타 증상을 다루는 약을 포함한다.
항체는 치료제, 검출제 또는 나노담체에 각종 공지된 가교제를 이용해 부착될 수 있다. 폴리펩티드의 공유 또는 비공유 부착 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이러한 방법은 이에 제한되는 것은 아니나 화학적 가교제, 광활성화 가교제 및/또는 2관능성 가교 시약의 이용을 포함할 수 있다. 분자들의 가교를 위한 예의 방법은 US Patent No. 5,603,872 및 U.S. Pat. No. 5,401,511 에 개시되어 있다. 가교 시약의 비제한적인 예에는 글루타르알데히드, 2관능성 옥시란, 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 카르보디이미드, 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 또는 디시클로헥실카르보디이미드, 비스이미데이트, 디니트로벤젠, 수베르산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디숙신이미딜 타르타레이트, 디메틸-3,3'-디티오-비스프로피온이미데이트, 아지도글리옥살, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 및 4-(브로모아드미노에틸)-2-니트로페닐아지드가 있다.
일부 구현예에서, CLL-1 항체는 나노담체와 연합된다. 나노담체 (예, 리포솜) 와 컨쥬게이션된 항체에 있어서, 특정 수의 항체가 표면 상에, 즉 주어진 표면 밀도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 나노담체는 나노담체 당 5 이상, 예를 들어 나노답체 당 적어도 10, 30, 40, 50, 75, 100 이상의 항체를 가질 것이다. 당업자는 나노담체 당 항체수가 모든 멤버의 집단에 대해서 절대적으로 획일적인 것은 아니기 때문에 표면 밀도가 평균 범위를 나타낸다는 점을 이해할 것이다.
나노담체는 중합체성 나노입자뿐 아니라 리포솜 및 미셀 등과 같은 소포를 포함한다. 나노담체는 치료 및 진단제의 전달에 유용하나, 암 치료에 사용된 세포독성제를 보호하는데 특히 유용할 수 있다. 나노담체는 지질 (예, 인지질), 친수성 중합체, 소수성 중합체, 양쪽친매성 화합물, 가교 중합체 및 중합체성 매트릭스를 포함할 수 있다 (예, WO2009/110939 참조). 적용에 따라, 나노담체는 특정 크기, 반감기, 보관 수명 및 누출 속도를 갖도록 고안될 수 있다.
항체 표적화 리포솜, 중합체성 나노입자 또는 확장된 보관수명 리포솜과 같은 나노담체의 제조는 예를 들어 US Patent Nos. 6465188, 7122202, 7462603 및 7550441 에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 항체는 안정화 모이어티, 예컨대 PEG, 또는 리포솜 또는 기타 나노담체에 연결된다. 문헌 [US Patent Nos. 4,732,863 및 7892554 및 Chattopadhyay et al. (2010) Mol Pharm 7:2194] 는 선택된 항체의 PEG, PEG 유도체 및 나노입자 (예, 리포솜) 로의 부착 방법을 기술하고 있다. 포스파티딜-에탄올아민 (PE) 를 함유하는 리포솜은 본원에서 기재된 바와 같은 확립된 절차에 의해 제조될 수 있다. PE 의 봉입은 부착을 위한 리포솜 표면 상 활성 작동 부위를 제공한다.
항체 컨쥬게이트는 또한 하나 초과의 활성 화합물, 예를 들어 추가적인 화학요법 또는 세포독성제, 사이토카인, 또는 성장 저해제를 제공하도록 제형화될 수 있다. 활성 성분은 또한 서방성 제제 (예, 고체 소수성 중합체 (예, 폴리에스테르, 하이드로젤 (예, 폴리(20히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)) 의 반투과성 매트릭스), 폴리락티드로서 제조될 수 있다. 항체 및 면역컨쥬게이트는 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 코아세르베이션 기술로써 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리- (메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 의해 제조된 나노입자에서 포획될 수 있다.
본원에 기재된 CLL-1 항체는 CLL-1-발현 세포를 단독으로 또는 세포독성제와 조합하여 사멸시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 개체에 유효량의 치료적 CLL-1 항체 또는 CLL-1 항체 컨쥬게이트, 예를 들어 치료제에 부착된 CLL-1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 암, 예를 들어 AML 으로 진단받은 바 있다. 일부 구현예에서, 개체는 암 치료요법, 예를 들어 수술, 방사선치료, 또는 화학치료를 받고 있는 중이거나 받은 바 있다. 일부 구현예에서, 개체는 진단받은 바 있으나 암에 대해 차도가 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 암 진행에 대해 개체를 모니터링하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 각 투여를 위한 CLL-1 항체 또는 CLL-1 항체 컨쥬게이트의 용량은 개체의 치료적 진행 상황을 근간으로 하여 결정되는데, 그 예로 개체가 치료요법에 충분히 반응하지 않는 경우 고용량의 화학요법이 적용된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항체 또는 항체-표적화 조성물 및 생리학적으로 (즉 약학적으로) 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어 "담체"는 전형적으로 진단 또는 치료제를 위한 희석제 또는 비히클로서 이용된 불활성 물질을 지칭한다. 상기 용어는 또한 전형적으로 조성물에 응집 품질을 부여하는 불활성 물질을 포함한다. 생리학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예를 들어 생리학적 식염수, 포스페이트 버퍼, 통상의 버퍼 식염수 (135-150 mM NaCl), 물, 버퍼수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 증강된 안정성을 제공하는 당단백질 (예, 알부민, 지질단백질, 글로불린 등) 등일 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 담체는 투여되는 특정 조성물뿐 아니라 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정되므로, 본 발명의 약학적 조성물의 적합한 제형은 다양하게 존재한다 (예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조).
본 발명의 조성물은 통상적인 익히 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 또는 멸균 조건 하에서 제조될 수 있다. 수성 용액은 사용을 위해 패키징되거나 또는 무균 상태에서 여과 및 동결건조될 수 있고, 이때 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 용액과 조합된다. 조성물은 pH 조절 및 버퍼링제, 긴장 (tonicity) 조절제, 습윤제 등과 같이, 근사치의 생물학적 조건을 필요로 하는 바, 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트 및 트리에탄올아민 올레이트를 포함할 수 있다. 당, 예를 들어 동결건조된 항체 조성물의 안정화제가 또한 조성물을 안정화시키기 위해 포함될 수 있다.
투약 형태는 환자에게 점막 (예, 비강, 설하, 질, 입속 또는 직장), 비경구 (예, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내 주사, 볼러스 또는 인퓨전으로), 경구 또는 경피 투여 되도록 제조될 수 있다. 투약 형태의 예에는 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함된다: 분산물; 좌제; 연고; 습포제 (찜질약); 페이스트; 분말; 드레싱; 크림; 석고; 용액; 패치; 에어로졸 (예, 비강 스프레이 또는 흡입기); 겔; 환자의 경구 또는 점막 투여에 적합한 액체 투여 형태, 현탁액 (예, 수성 또는 비수성 액체 현탁물, 수중유 에멀젼, 또는 유중수 액체 현탁물), 용액 및 엘릭세르; 환자의 비경구 투여에 적합한 액체 투여 형태; 및 환자의 비경구 투여에 적합한 액체 투여 형태를 제공하도록 재구성화될 수 있는 멸균 고체 (예, 결정질 또는 무정형 고체) 를 포함한다.
주사가능 (예, 정맥내) 조성물은 수성 담체와 같은 허용가능한 담체에 현탁된 항체 또는 항체-표적화 조성물의 용액을 포함할 수 있다. 임의의 각종 수성 담체, 예를 들어 물, 버퍼수, 0.4% 식염수, 0.9% 등장성 식염수, 0.3% 글리신, 5% 덱스트로오스 등이 이용될 수 있고, 안정성 증강을 위해 당단백질, 예컨대 알부민, 지질단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다. 흔히, 정상의 버퍼 식염수 (135-150 mM NaCl) 가 이용될 것이다. 조성물은 pH 조절 및 버퍼링제, 긴장 조절제, 습윤제 등과 같이 근사치의 생물학적 조건을 필요로 하는 바, 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트 및 트리에탄올아민 올레이트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체-표적화 조성물이 정맥내 투여 키트에 제형화될 수 있다.
비경구 투여, 예를 들면 동맥내 (관절에), 정맥내, 근육내, 종양내, 피내, 복강내 및 피하 루트에 적합한 제형은 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사 용액 (이는 항산화제, 버퍼, 세균발육 저지제, 및 목적 수용체의 혈액을 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있음) 및 수성 및 비수성 멸균 현탁물 (현탁제, 가용화제, 증후제, 안정화제 및 보존제 포함할 수 있음) 을 포함한다.
약학적 제제는 패키징될 수 있거나 또는 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 이 형태에서, 제제는 예를 들어 치료제의 용량 또는 항체 농도에 따라 적절량의 활성 성분을 포함하는 단위 용량으로 세분된다. 단위 투여 형태는 패키징된 제제일 수 있고, 상기 패키지는 단위-용량 또는 다수용량의 밀봉 용기, 예컨대 앰플 또는 바이알에 구별되는 양의 제제를 포함한다. 조성물은 바람직한 경우 기타 융화가능한 치료제를 포함할 수 있다.
항체 (또는 항체- 표적화 조성물) 는 정맥내, 피하, 근육내 또는 복강내 루트를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 루트를 통해 주사 또는 투입에 의해 투여될 수 있다. 약학적 조성물의 투여예는 4℃ 주사를 위한 멸균 등장성 수성 식염수 용액 중 항체를 10 mg/ml 로 보관하고 이것을 환자에게 투여하기 전에 주입을 위해 100 ml 또는 200 ml 0.9% 나트륨 클로라이드에 희석시킨다. 항체는 0.2 내지 10 mg/kg 의 용량으로 1 시간의 코스에 걸쳐 정맥내 투입에 의해 투여된다. 기타 구현예에서, 항체는 15 분 내지 2 시간의 기간에 걸쳐 정맥내 투입에 의해 투여된다. 기타 구현예에서, 투여 절차는 피하 볼러스 주사를 통한다.
항체의 용량이 환자의 유효한 치료요법을 제공하도록 선택되고 그 범위는 환자 당 1 mg - 2 g 범위 또는 0.1 mg/kg 체중 내지 약 25 mg/kg 체중 미만의 범위이다. 일부 경우에서, 용량은 1 - 100 mg/kg 범위이거나 또는 대략 50 mg - 8000 mg/ 환자이다. 상기 투약량은 항체의 약물동태학 (예, 순환 내 항체의 반감기) 및 약역학적 반응 (예, 항체의 치료적 효과 기간) 에 따라, 매일 1 회 내지 3 개월마다 1 회의 범위일 수 있는 적절한 횟수로 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 약 7 내지 약 25 일의 생체내 반감기 및 항체 투약은 1 주일 마다 1 회 내지 3 개월 마다 1 회 반복된다.
투여는 주기적일 수 있다. 투여 경로에 따라, 용량은 예를 들어 매 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 또는 28 일 이상 중 1 회 (예, 매 2, 3, 4 또는 6 개월마다 1 회) 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 투여는 매일 2 또는 3 회와 같이 더 자주 있다. 환자는 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 치료 진행 및 임의 부작용에 따라 투여 용량 및 횟수를 조절하도록 모니터링될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 추가적인 투여는 환자 진행에 의존하고, 예를 들면 환자는 투여 사이에 모니터링된다. 예를 들어, 1차 투여 또는 투여 1 라운드 후에, 환자는 종양 성장 속도, 재발 (예, 수술후 환자의 경우), 또는 약화, 통증, 메스꺼움 등과 같은 일반 질병-관련 증상에 관해 모니터링될 수 있다.
암 치료를 위해서, 항체 또는 항체-표적화 조성물 (예, 치료 및/또는 진단제 포함) 이 매일 약 0.001 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg 의 초기 투약량으로 투여될 수 있고, 시간 경과에 따라 조절될 수 있다. 약 0.01 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 5 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 의 1일 용량 범위가 사용될 수 있다. 본원에 기재된 생체 내 이종이식 결과는 체중 kg 당 5-20 mg 항체의 용량이 종양 성장의 극적인 감소에 효과적이다.
투약량은 환자의 요건, 치료되는 병태의 중증도 및 활용되는 표적화 조성물에 따라 가변적이다. 예를 들어, 투약량은 특정 환자에서 진단된 암의 유형 및 단계를 고려해 실증적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락 하에서 환자에게 투여되는 용량은 시간 경과에 따라 환자에게서 유익한 치료적 반응을 이끌기에 충분해야 한다. 투약 크기는 또한 당업 실행자에게 인지되는 바와 같이, 특정 환자에서 특정 표적화된 조성물의 투여에 수반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다.
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로서, 다양한 수정 또는 변경이 이 관점에서 당업자에게 제시될 것이며, 첨부된 청구항의 범위 및 본 출원의 취지 및 권한 내에 포함된다는 점은 자명하다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 어떠한 용도로도 그 전문이 참조로 혼입된다.
VII. 실시예
A. 실시예 1: CLL-1 항체 서열 및 구조의 특성화
인간 CLL-1 을 이용해 마우스에 항체를 생성시켰다. CLL-1 에 특이적인 항체를 선택하고, 모노클로날 항체의 안정한 생산을 위해 하이브리도마로 클로닝시켰다. CLL-1 에 특이적인 다수의 항체를 클로닝하고 이를 서열 및 항체 구조에 대해 특성화하였다. 이들 데이트는 하기 표 1-3 에 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 서열 목록에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
B. 실시예 2: 에피토프 결합 연구
특정 클론에 있어서, 에피토프 맵핑을 실시하고, 공지된 항체에 대한 CLL-1 으로의 결합 위치를 비교했다. 이들 항체는 Nuvelo/ X1057 (US20100285037), Crucell/ X357 (US Patent No. 7741443), 및 염소 항 CLL-1 을 포함한다. 그 요약은 하기 표 4 에 나타낸다. CLL-1 또는 CLL-1 의 C 렉틴 도메인을 293T 세포에서 발현하였다. 트랜스펙션되지 않은 293T 세포, 또는 마우스 CLL-1 로 트랜스펙션한 293T 세포를 대조군으로서 이용했다.
Figure pct00004
상기 데이타는 클론 M26 및 M31 이 인간 CLL-1 에 결합하나, C 렉틴 도메인은 유의한 결합에 있어 충분하지 않다는 점을 보여준다.
M26 및 M31 항체를 또한 사이노몰거스 원숭이 CLL-1 과의 결합에 대해 테스트했다. 이들 동물들은 임상 연구에 이용할 수 있고, 따라서 인간 항체 표적의 사이노몰거스 종 상동체에 결합하는 표적-특이적 항체를 갖는 것이 유용하다. M26 은 고 친화도로 사이노몰거스 CLL-1 에 결합한다는 점이 밝혀졌다.
추가적인 사이노몰거스 CLL-1 결합 연구를 ELISA 를 이용해 실시했다. 그 결과는 하기 표 5 에 나타낸다.
Figure pct00005
C. 실시예 3: 친화도 테스트
친화도 테스트를 CLL-1 항체 클론에 대해 실시했다. 요약하면, 비오티닐화 CLL-1 (25ug/ml) 은 2 시간 동안 22℃ 에서 스트렙파비딘 센서 팁에 로딩했다. Ab-Ag 분해 커브를 각 항체의 상이한 농도에서 (10, 30, 및 90 ug/ml) 글로벌 1:1 곡선 핏팅을 이용해 작성했다. 그 결과를 하기 표 6 에 나타낸다.
Figure pct00006

D. 실시예 4: AML 세포주 및 AML 환자 샘플과의 결합
CLL-1 항체를, 인간 CLL-1 을 발현하는 재조합 293 세포, 및 2 종의 AML 세포주인 HL60 및 OCI AML-5 에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 항체와 결합하는 생 세포의 퍼센트를 FACS 로써 검출된 바, 하기 표 7 에 나타낸다.
Figure pct00007
앞서 특성화된 CLL-1 항체는 전형적으로 높은 가변성을 가진 1 차 AML 세포에 결합하는데, 이는 환자 샘플을 광범위하게 사용하는데 있어서 문제 발생의 소지가 있다. 일부는 특정 환자의 샘플에 검출가능하게 결합하지 않는다. 현재 개시된 항체를 FACS 에 의해 AML 환자 샘플의 1차 세포와의 결합에 대해 테스트하였다. 2 그룹의 샘플을 연구했다: 첫 번째 그룹은 6 명의 환자로 이루어지고, 나머지 한 그룹은 더 많은 37 명의 집단 (cohort) 으로 이루어진다. 각 항체 클론을 상기 그룹들 내 모든 샘플과의 결합에 대해 테스트하지 않았다. 결합 결과는 표 8 에 나타낸다. M26 및 M31 은 FACS 에 의해 AML 환자 1 차 세포 샘플로부터의 90% 이상의 세포에 결합한다는 점이 추가로 밝혀졌다.
Figure pct00008

E. 실시예 5: 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 검정
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 검정을, AML 세포주인 HL60 및 OCI AML-5 에서뿐 아니라 CLL-1 발현 재조합 293 세포에서 실시했다. 요약하면, 세포를 37℃ 에서 48~ 72 시간 동안 다양한 농도의 사포린-컨쥬게이션된 항체와 인큐베이션하였다. 세포 생존력은 DHL 비색분석 검정으로써 확인하여 EC50 값을 확인했다.
그 결과는 하기 표 9 에 나타낸다.
Figure pct00009

F. 실시예 6: 보체 의존적 세포독성 (CDC) 검정
보체 의존적 세포독성 검정을 AML 환자의 1 차 세포에서 실시했다. 1차 AML 세포는 보체의 존재 하 37℃ 에서 2 시간 동안 각종 농도로 CLL1 항체와 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 비색 Cellglow 검정 (Promega) 로써 측정하였다.
도 1 은 3 종의 AML 환자 샘플 (A-C) 의 결과를 나타낸다. 이들 세포 샘플로 CLL-1 항체 클론 M26 은 약 10 ~ 100 ng/mL 의 EC50 을 가진다. AML 샘플 #52 를 나타내는 도 1C 는 또한 E12 (관련없는 mAb) 및 IgG 대조군과 비교되는 클론 M31 의 효과를 나타낸다.
10 ug/mL 항체를 이용하는 CDC 검정의 또 다른 라운드로부터의 결과는 표 10 에 나타낸다.
Figure pct00010
상기 데이타는 CLL-1 항체 클론이 1 차 AML 환자 샘플에서 유의한 CDC 활성을 지님을 나타낸다. CLL-1 항체 클론은 환자 샘플에서 CLL-1 항원 밀도가 5 배 이상 차이나게 효과적이다.
G. 실시예 7: AML 종양 성장의 생체 내 저해
2 세트의 생체 내 효능 연구를 실시했다. 제 1 세트 연구는 마우스에서 CLL-1 양성 HL60 AML 인간 세포주를 이용하는 피하 (SC) 종양 생착 및 성장 모델이었다. 제 2 세트 연구는 마우스에서 CLL-1 양성 OCI AML-5 인간 AML 세포주를 이용하는 동소 (골수, 혈액, 비장 및 림프절) 종양 생착 및 증식 모델이었다.
SC HL60 연구를 하기와 같이 실시했다. 4 종의 CLL-1 항체 클론 (M5, M13, M26, 및 M31) 중 하나, 또는 IgG 대조군을 5x106 또는 107 HL60 세포의 SC 접종 약 24 시간 이전에 200 ug/동물의 투약량으로 i.p. 투여하였다. 동물은 다음 6 주 동안 매주 1 회 추가적인 항체 용량을 수여받았다. 상기 연구는 HL60 세포 투여 후 45 일 후에 종료하였다. 도 2 는 대조군과 비교되는 각종 CLL1 항체 클론 (M5, M13, M26, 및 M31) 에 대한 효능 곡선을 나타낸다.
OCI AML-5 세포 동위 연구를 하기와 같이 실시했다. 면역결핍 NSG 마우스를 그룹 당 6 동물의 5 그룹으로 나누었다. 4 종의 CLL-1 항체 클론 (M5, M13, M26, 및 M31) 중 하나 또는 IgG 대조군을 5x106 또는 107 OCI AML-5 세포의 정맥내 접종 대략 24 시간 전에 200 ug/동물의 용량으로 i.p. 투여했다. 이때 동물은 다음 2 주 동안 매주 2 회 추가적인 항체 용량을 투여받았다. 상기 연구는 OCI AML-5 세포 투여 후 4 주에 마쳤다. 도 3 은 CLL-1 항체 클론이 생체 내 OCI AML-5 세포 (라벨링된 hCD45+ CSC-030+ 및 AML CSC030+) 의 개수를 급감시킨다는 점을 나타낸다.
H. 실시예 8: CLL 항체는 ADC 검정에서 AML 줄기 세포에 특이적이다
사포린과 컨쥬게이션한 M26 CLL-1 항체를 ADC 검정에서 특이적 사멸에 대해 테스트하였다. 1차 환자 AML 세포 또는 정상 CD34 양성 조혈 줄기 세포를 인간 대상체의 골수에서 단리해 소프트 아가 (soft agar) 콜로니 형성 검정으로 시딩하였다 (100,000 세포/플레이트). 이때 세포를 14 일 동안 CLL-1-사포린 독소-컨쥬게이션된 모노클로날 항체 클론 M26 의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 도 4 에 나타낸 바와 같이, CLL-1 항체 - 사포린 컨쥬게이트는 AML 줄기 세포 클론원성 성장의 선택 특이적 저해를 야기하는 반면에 정상 HSC 는 영향 받지 않았다. 음성 대조군은 관련없는 IgG-사포린 컨쥬게이트로 치료 또는 비치료하였다. 그 결과는 세포독소와 컨쥬게이션된 CLL-1 항체가 HSC 콜로니 형성 저해 없이 AML 세포 콜로니 형성을 약 80% 저해함을 증명한다. 상기 결과는 현재 개시된 CLL-1 항체를 AML 세포 상 발현된 CLL-1 에 특이적으로 표적할 수 있도록 치료학적으로 안전하게 이용할 수 있다는 점을 나타낸다.
I. 실시예 9: 인간 키메라 CLL-1 항체는 마우스 CLL-1 항체 클론과 유사한 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 에 결합한다
CLL-1 항체 클론 M26, M31 및 G4 의 가변 영역 (Fab) 을, 인간 IgG1 의 불변 영역 (Fc) 을 가진 키메라 항체 제조에 이용하였다. 이들 인간 키메라 항체는 ChiM26, ChiM31, 및 ChiG4 (또는 Chi31G4) 로서 지칭된다. 부모 마우스 항체와 비교되는 인간 키메라 항체의 특이성을 테스트하기 위해, 항체를 상이한 인간 PBMC 집단 염색에 이용했다. PBMC 를 2 종의 인간 공여체로부터 수득하고, Ficoll 구배로써 분리하고 풀링하였다. 약 2x105 단핵구 세포를 3% 인간 혈청으로 블로킹한 다음 직계 마커 CD89 (과립구), CD14 (단핵구 및 과립구), CD3 (림프구), 및 CD19 (B 세포) 에 대해 특이적인 항체로 염색했다. 도 5 는 생-게이트화 세포에 대한 FACS 결과를 나타낸다. 인간 키메라 CLL-1 항체가 마우스 CLL-1 항체와 동일한 골수 계통 집단을 염색한다.
J. 실시예 10: 인간 키메라 CLL-1 항체는 마우스 CLL-1 항체 클론과 유사한 사이노몰거스 PBMC 에 결합한다
부모 마우스 항체와 비교하여 인간 키메라 항체의 특이성을 테스트하기 위해, 항체를 사이노몰거스 PBMC 의 상이한 집단을 염색하는데 이용했다. PBMC 를 이들 공여체로부터 수득하고, Ficoll 구배로써 분리하고 풀링하였다. 약 2x105 단핵구 세포를 3% 인간 혈청으로 블로킹한 다음 직계 마커 CD3 (림프구), CD19 (B cell), CD14 (과립구), CD14 (단핵구), 및 CD89 (과립구) 에 특이적인 항체로 염색하였다. 도 6 은 생-게이트화 세포에 대한 FACS 결과를 나타낸다. 인간 키메라 CLL-1 항체는 마우스 CLL-1 항체와 동일한 골수 직계 집단을 염색하였다.
K. 실시예 11: 인간 키메라 CLL-1 항체는 시험관 내 항체-약물 컨쥬게이트 활성을 갖는다
인간 키메라 CLL-1 항체의 ADC 내재화 및 매개 능력을 시험관 내 CLL-1 발현 293 세포에서 테스트하였다. 세포를 지시된 항체로 각 농도에서 접촉하였다. 매칭 IgG 이소타입 항체를 음성 대조군으로 이용했다. 이어서, 사포린 컨쥬게이션된 2차 항체 (Mousezap® 또는 Humzap®) 을 2:1 비율로 첨가하고 세포를 72 시간 인큐베이션하였다. Cell Titre-Glo® 을 각 배양 웰에 첨가하고 5-10 분 혼합하고 발광 프레이트 리더에서 검출하였다. 세포 생존력을 발광 신호로써 측정하였다. 도 7 은 인간 키메라 CLL-1 항체 (7B) 가 마우스 CLL-1 항체 클론 (7A) 와 거의 동일한 ADC 활성을 가짐을 나타낸다.
L. 실시예 12: 인간 키메라 CLL-1 항체는 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성을 매개한다
인간 키메라 CLL-1 항체 ChiM26, ChiM31, 및 ChiG4 (Chi31G4) 의 ADCC 매개능을, CLL-1 발현 293 세포 상에서 확인하였다. 표적 세포를 96 라운드 바닥 웰에 첨가하고, 37℃ 에서 6 시간 동안 효과기 세포 (Promega®) 및 다양한 농도의 지시된 항체로 인큐베이션하였다. 생세포를 Promega ADCC Reporter Assay®을 이용해 검출했다. 결과를 도 8 에 나타낸다. 인간 IgG 이소타입 대조군은 검출가능한 활성을 갖지 않았으나, ChiM26, ChiM31, 및 Chi31G4 에 대한 EC50 (ng/ml) 은 각각 79, 143, 및 105 인 것으로 확인되었다.
M. 실시예 13: AML 종양 성장의 생체 내 저해
2 세트의 생체 내 이종이식 연구를 마우스 및 인간 키메라 CLL-1 항체로 실시했다. 양 연구는 제 0 일에 인간 AML 세포로 꼬리 정매 주사 1 일 전에 방사선 처리한 NOD/SCID 마우스를 이용했다. 양 연구는 약 3 주의 코스에 걸쳐 8 종의 항체 주사 후 골수 세포 내 종양 성장의 검출을 포함한다.
첫번째 연구에서, 마우스를 각각 6 마리의 마우스의 3 그룹으로 분리했다: (1) 인간 IgG 이소타입 대조군; (2) M26; 및 (3) ChiM31. 마우스를 제 0 일에 3x106 HL60 세포로 주입했다. 항체를 제 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 및 22 일에 200 ug/마우스로 투여했다. 마우스를 제 26 일에 희생시켰다. 결과는 도 9 에 나타낸다. 도 9A 는 CLL-1 항체가 huCD45+CD33+ AML 세포의 퍼센트를 유의하게 감소시키는 점을 나타내고, 도 9B 는 CLL-1 항체가 huCD45+CLL-1+ AML CSC 의 퍼센트를 유의하게 감소시킨다는 점을 나타낸다.
두번째 연구에서, 마우스를 각각 6 마리의 마우스의 5 그룹으로 나누었다: (1) 인간 IgG 이소타입 대조군; (2) M26; (3) ChiM26; (4) ChiM31; 및 (5) ChiG4. 마우스를 제 0 일에 5x106 OCI AML-5 세포로 주사했다. 항체를 제 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 및 24 일에 200 ug/마우스로 투여했다. 마우스를 제 28 일에 희생시켰다. 결과를 도 10 에 나타낸다. 도 10 A 는 CLL-1 항체가 분명히도 huCD45+CD33+ AML 세포를 제거한다는 점을 나타낸다. log10 스케일을 이용해 도 10B 에 나타낸 바와 같이 더 나은 결과 해상도를 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> Jiang, Ping Karsunky, Holger Tressler, Rob Cellerant Therapeutics, Inc. <120> Antibodies Specific for CLL-1 <130> 92950-874248 <140> WO Not yet assigned <141> Not yet assigned <150> US 61/643,739 <151> 2012-05-07 <150> US 61/699,134 <151> 2012-09-10 <150> US 13/794,525 <151> 2013-03-11 <160> 98 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human C-type lectin-like molecule 1 (CLL-1), C-type lectin domain family 12 member A (CLEC12A), dendritic cell-associated lectin 2 (DCAL-2), myeloid inhibitory C-type lectin-like receptor (MICL), C-type lectin protein <400> 1 atgtctgaag aagttactta tgcagatctt caattccaga actccagtga gatggaaaaa 60 atcccagaaa ttggcaaatt tggggaaaaa gcacctccag ctccctctca tgtatggcgt 120 ccagcagcct tgtttctgac tcttctgtgc cttctgttgc tcattggatt gggagtcttg 180 gcaagcatgt ttcatgtaac tttgaagata gaaatgaaaa aaatgaacaa actacaaaac 240 atcagtgaag agctccagag aaatatttct ctacaactga tgagtaacat gaatatctcc 300 aacaagatca ggaacctctc caccacactg caaacaatag ccaccaaatt atgtcgtgag 360 ctatatagca aagaacaaga gcacaaatgt aagccttgtc caaggagatg gatttggcat 420 aaggacagct gttatttcct aagtgatgat gtccaaacat ggcaggagag taaaatggcc 480 tgtgctgctc agaatgccag cctgttgaag ataaacaaca aaaatgcatt ggaatttata 540 aaatcccaga gtagatcata tgactattgg ctgggattat ctcctgaaga agattccact 600 cgtggtatga gagtggataa tataatcaac tcctctgcct gggttataag aaacgcacct 660 gacttaaata acatgtattg tggatatata aatagactat atgttcaata ttatcactgc 720 acttataaac aaagaatgat atgtgagaag atggccaatc cagtgcagct tggttctaca 780 tattttaggg aggcatgagg c 801 <210> 2 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human C-type lectin-like molecule 1 (CLL-1), C-type lectin domain family 12 member A (CLEC12A), dendritic cell-associated lectin 2 (DCAL-2), myeloid inhibitory C-type lectin-like receptor (MICL), C-type lectin protein <220> <221> DOMAIN <222> (1)...(43) <223> cytoplasmic domain <220> <221> DOMAIN <222> (44)...(64) <223> transmembrane domain <220> <221> DOMAIN <222> (65)...(139) <223> stalk domain <220> <221> DOMAIN <222> (140)...(249) <223> C lectin domain <220> <221> DOMAIN <222> (65)...(265) <223> extracellular domain <400> 2 Met Ser Glu Glu Val Thr Tyr Ala Asp Leu Gln Phe Gln Asn Ser Ser 1 5 10 15 Glu Met Glu Lys Ile Pro Glu Ile Gly Lys Phe Gly Glu Lys Ala Pro 20 25 30 Pro Ala Pro Ser His Val Trp Arg Pro Ala Ala Leu Phe Leu Thr Leu 35 40 45 Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ile Gly Leu Gly Val Leu Ala Ser Met Phe 50 55 60 His Val Thr Leu Lys Ile Glu Met Lys Lys Met Asn Lys Leu Gln Asn 65 70 75 80 Ile Ser Glu Glu Leu Gln Arg Asn Ile Ser Leu Gln Leu Met Ser Asn 85 90 95 Met Asn Ile Ser Asn Lys Ile Arg Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr 100 105 110 Ile Ala Thr Lys Leu Cys Arg Glu Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Glu His 115 120 125 Lys Cys Lys Pro Cys Pro Arg Arg Trp Ile Trp His Lys Asp Ser Cys 130 135 140 Tyr Phe Leu Ser Asp Asp Val Gln Thr Trp Gln Glu Ser Lys Met Ala 145 150 155 160 Cys Ala Ala Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Ile Asn Asn Lys Asn Ala 165 170 175 Leu Glu Phe Ile Lys Ser Gln Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Trp Leu Gly 180 185 190 Leu Ser Pro Glu Glu Asp Ser Thr Arg Gly Met Arg Val Asp Asn Ile 195 200 205 Ile Asn Ser Ser Ala Trp Val Ile Arg Asn Ala Pro Asp Leu Asn Asn 210 215 220 Met Tyr Cys Gly Tyr Ile Asn Arg Leu Tyr Val Gln Tyr Tyr His Cys 225 230 235 240 Thr Tyr Lys Lys Arg Met Ile Cys Glu Lys Met Ala Asn Pro Val Gln 245 250 255 Leu Gly Ser Thr Tyr Phe Arg Glu Ala 260 265 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M26 heavy chain coding sequence <400> 3 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatttta tacactgggt gaagcagaag 120 cctggacagg gccttgagtg gattggattt attaatcctt acaatgatgg ttctaagtac 180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgac ctctgaagac tcagcggtct attactgtac aagagatgat 300 ggttattacg gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac 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monoclonal antibody M2 heavy chain J sequence <400> 40 Cys Thr Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M5 heavy chain J sequence <400> 41 Cys Thr Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody G12 heavy chain J sequence <400> 42 Cys Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp Val Trp 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M26 light chain J sequence <400> 43 Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M31 light chain J sequence <400> 44 Cys Gln Gln Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal 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monoclonal antibody G12 CDR H3 <400> 74 Ala Arg Val Tyr Asn Trp His Phe Asp Val 1 5 10 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M26 CDR L1 <400> 75 Gln Glu Leu Ser Gly Tyr 1 5 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M31 CDR L1 <400> 76 Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe 1 5 10 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody G4 CDR L1 <400> 77 His Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M22 CDR L1 <400> 78 Gln Asn Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Lys Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M29 CDR L1 <400> 79 Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 1 5 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M2 CDR L1 <400> 80 Gln Glu Ile Ser Val Tyr 1 5 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M5 CDR L1 <400> 81 Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Asn 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody G12 CDR L1 <400> 82 Glu Ser Val Asp Gly Tyr Gly Asp Ile Phe 1 5 10 <210> 83 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M26 CDR L2 <400> 83 Ala Ala Ser 1 <210> 84 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M31 CDR L2 <400> 84 Leu Ala Ser 1 <210> 85 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody G4 CDR L2 <400> 85 Tyr Thr Ser 1 <210> 86 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-CLL-1 monoclonal antibody M22 CDR L2 <400> 86 Trp Ala Ser 1 <210> 87 <211> 3 <212> PRT 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Claims (22)

  1. 인간 C-유형 렉틴 유사 분자 1 (CLL-1) 의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 이때 상기 항체는 인간 CLL-1 의 C-렉틴 및 줄기 도메인으로 이루어진 폴리펩티드보다 5-배 이상 더 높은 Kd 로 인간 CLL-1 의 C-렉틴 도메인으로 이루어진 폴리펩티드와 결합하는 단리된 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체는 인간 또는 사이노몰거스 CLL-1 와 1000 pM 이하의 Kd 로 결합하는 단리된 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 항체는 급성 골수성 백혈병 (AML) 을 앓는 개체로부터의 AML 세포의 샘플에서 50% 이상의 세포와 결합하는 단리된 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 항체는 휴지 CLL-1 발현 세포와 결합하는 단리된 항체.
  5. 제 1 항에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 항체:
    SEQ ID NO:51, 59, 및 67 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), 및 SEQ ID NO:75, 83, 및 91 의 경쇄 CDR 을 포함하는 항체;
    SEQ ID NO:52, 60, 및 68 의 중쇄 CDR, 및 SEQ ID NO:76, 84, 및 92 의 경쇄 CDR 을 포함하는 항체; 및
    SEQ ID NO:53, 61, 및 69 의 중쇄 CDR 및 SEQ ID NO:77, 85, 및 93 의 경쇄 CDR 를 포함하는 항체.
  6. 제 1 항에 있어서, 항체는 인간화되는 단리된 항체.
  7. 제 1 항에 있어서, 항체는 Fv 항체 단편인 단리된 항체.
  8. 제 1 항에 있어서, 치료적 화합물에 컨쥬게이션된 단리된 항체.
  9. 제 1 항에 있어서, 검출가능 모이어티에 컨쥬게이션된 단리된 항체.
  10. 하기를 포함하는, 세포의 C-유형 렉틴 유사 분자 1 (CLL-1) 의 발현 여부를 확인하는 방법:
    제 9 항의 항체를 세포와 접촉시키고;
    항체의 세포와의 결합을 검출하고 (이때 항체의 세포와의 결합은 세포가 CLL-1 을 발현한다는 점을 지시함);
    세포가 CLL-1 을 발현하는지 여부를 확인함.
  11. 제 10 항에 있어서, 세포는 조혈 세포를 포함하는 개체로부터의 생물학적 샘플 내에 존재하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 세포가 CD34 또는 CD38 을 발현하는지 여부를 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 하기를 포함하는, C-유형 렉틴 유사 분자 1 (CLL-1) 발현 세포의 생존을 저해하는 방법:
    제 1 항의 항체를 세포와 접촉시키고,
    이로써, 세포의 생존을 저해함.
  14. 제 13 항에 있어서, 접촉은 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 세포가 개체 내에 존재하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 개체가 골수증식 장애로 진단받은 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 골수증식 장애는 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수성 단구 백혈병 (CMML), 골수 형성 이상 증후군 (MDS), 다발 골수종, 형질세포종, 및 골수섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제 1 항의 단리된 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  18. 하기를 포함하는 개체에서의 골수증식 장애의 치료 방법:
    개체에 제 17 항의 약학적 조성물을 투여하고,
    이로써, 개체에서 AML 을 치료함.
  19. 제 18 항에 있어서, 항체는 치료적 화합물에 컨쥬게이션되는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 개체는 골수증식 장애로 진단받은 바 있거나, 또는 골수증식 장애에 대한 치료요법을 경험한 바 있는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 골수증식 장애는 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수성 단구 백혈병 (CMML), 골수 형성 이상 증후군 (MDS), 다발 골수종, 형질세포종, 및 골수섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 C-유형 렉틴 유사 분자 1 (CLL-1) 에 결합하는 단리된 항체:
    SEQ ID NO:51, 59, 및 67 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), 및 SEQ ID NO:75, 83, 및 91 의 경쇄 CDR 을 포함하는 항체;
    SEQ ID NO:52, 60, 및 68 의 중쇄 CDR, 및 SEQ ID NO:76, 84, 및 92 의 경쇄 CDR 을 포함하는 항체; 및
    SEQ ID NO:53, 61, 및 69 의 중쇄 CDR 및 SEQ ID NO:77, 85, 및 93 의 경쇄 CDR 을 포함하는 항체.
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