JP2023541456A - がん治療用キメラ抗原受容体 - Google Patents

がん治療用キメラ抗原受容体 Download PDF

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Abstract

ＣＤ３３に対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)が提供される。ＣＡＲに関連する核酸、ベクター、宿主細胞、ＣＡＲを発現する細胞群、および医薬組成物も開示され、例えば特に急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)などの白血病など、ＣＤ３３に関連する疾患の治療を含む方法も開示される。

Description

関連出願
本出願は、2020年9月14日に出願された米国仮特許出願第63/078,237号の35 U.S.C.119(e)に基づく優先権を主張するものであり、当該仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
急性骨髄性白血病は非常に悪性度の高い急性白血病であり、小児、ならびに青年および若年成人(ＡＹＡ:adolescents and young adults)で二番目に多い白血病となっている。現行の治療レジメンには多剤併用化学療法の集中的なサイクルや、治癒を目的とした同種ドナーの幹細胞移植を用いた頻繁な地固め療法があるが、それでも長期的な寛解を達成するのはＡＭＬの小児およびＡＹＡの６０％のみである。寛解率を高め、再発を減少させ、全生存を改善するための新たな治療戦略が必要とされている。
本開示の態様は、ＣＤ３３に特異的な抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ:chimeric antigen receptor)を提供する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、リンカー領域、ヒンジ領域、および一つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインなどの一つ以上の追加のドメインを含む。本開示の態様は、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含むＣＡＲ構築物を提供する。
本開示のさらなる態様は、本開示のＣＡＲ構築物に関連する関連核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞群、および医薬組成物、またはかかるＣＡＲ構築物を発現する細胞を提供するものである。
本発明の追加的な実施形態は、対象の造血器悪性腫瘍(例えば、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ))を、ＣＤ３３に特異的なＣＡＲを含む免疫細胞群を単独で対象に投与することにより、または造血系細胞群と組み合わせて対象に投与することにより、治療する方法を提供するものであり、当該造血系細胞は遺伝子操作され、ＣＤ３３をコードする遺伝子は、ＣＤ３３の発現が低下するように、または消失するように操作されている。
本開示の態様は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子を提供する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、コードされるＣＤ３３結合ドメインは、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、コードされる膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａまたはＣＤ２８から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、リンカー領域、ヒンジ領域、および一つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインなどの一つ以上の追加のドメインを含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、リンカーによって結合されている。一部の実施形態では、コードされるＣＤ３３結合ドメインは、一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、Nanobody(登録商標)(単一ドメイン抗体、ＶＨとも呼ばれる)、またはトリアボディを含む。
一部の実施形態では、コードされるＣＤ３３結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続される。一部の実施形態では、コードされるヒンジ領域は、ＣＤ８ａ、ＩｇＧ４またはＣＤ２８から選択されるタンパク質のヒンジ領域を含む。
一部の実施形態では、コードされるＣＡＲは、一つ以上の共刺激性ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、一つ以上の共刺激性ドメインは、４-１ＢＢおよび/またはＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、単離核酸配列は、プロモーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ＳＦＦＶ(サイレンシングしやすい傾向のある脾臓フォーカス形成ウイルス(spleen focus forming virus)のプロモーター配列、またはＥＦ１αプロモーター配列である。
一部の実施形態では、コードされるＣＡＲは、(ｉ)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７および６０～９２のいずれか一つのアミノ酸配列、または(ｉｉ)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７および６０～９２のいずれか一つに対して９５～９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、(ｉ)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３および５６のいずれか一つから選択されるヌクレオチド配列、または(ｉｉ)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３および５６のいずれか一つに対して９５～９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む。
一部の実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、発現ベクターは、(ｉ)配列番号１１、１４、１７、２０、２３、２６、３０、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５および５８のいずれか一つから選択されるヌクレオチド配列、または(ｉｉ)配列番号１１、１４、１７、２０、２３、２６、３０、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５および５８のいずれか一つに対して９５～９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸分子のいずれかを含む免疫エフェクター細胞を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを含む免疫エフェクターを提供する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、およびリンパ系細胞が分化され得る多能性幹細胞からなる群から選択される。本開示はまた、本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含む免疫エフェクター細胞を少なくとも一つ含む細胞群を提供する。本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを含む免疫エフェクター細胞を少なくとも一つ含む細胞群を提供する。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の核酸および/またはＣＡＲのいずれかを含む免疫エフェクター細胞群のいずれか、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、造血器悪性腫瘍を治療する方法を特徴とする。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ３３を標的とする剤の有効量を、その必要のある対象に投与することを含む。一部の実施形態では、剤は、キメラ受容体(ＣＡＲ)を発現する免疫細胞である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む、ＣＤ３３に結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ８ａまたはＣＤ２８から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、リンカー領域、ヒンジ領域、および一つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインなどの一つ以上の追加のドメインを含む。
一部の実施形態では、方法は、造血系細胞群を投与することをさらに含み、当該造血系細胞は遺伝子操作されており、それにより、抗原結合ドメインにより標的とされるＣＤ３３コード遺伝子は、ＣＤ３３の発現が低下するように、または消失するように操作されている。一部の実施形態では、免疫細胞、造血系細胞、またはその両方は、同種または自家である。
一部の実施形態では、造血系細胞は、造血系幹細胞である。一部の実施形態では、造血系細胞は、造血系前駆細胞である。一部の実施形態では、造血系細胞は、造血系の幹細胞および前駆細胞である。一部の実施形態では、造血系幹細胞は、骨髄細胞または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)に由来する。一部の実施形態では、造血系幹細胞は、ＣＤ３４+/ＣＤ３３-である。
一部の実施形態では、造血系細胞は、ＣＤ３３の発現が低下または消失するように、ＣＤ３３をコードする内因性遺伝子を編集することによって調製される。一部の実施形態では、内因性遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して(例えば、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ１２ａなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより)、編集される。
一部の実施形態では、対象は、悪性細胞または前悪性細胞でのＣＤ３３の発現を特徴とする造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍と診断されたか、または診断されている。一部の実施形態では、対象は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、白血病、または多発性骨髄腫を有する。一部の実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、または骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)である。
一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、およびリンパ系細胞が分化され得る多能性幹細胞からなる群から選択される細胞型を一つ以上含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、Nanobody(登録商標)(単一ドメイン抗体)、またはＣＤ３３に特異的に結合するトリアボディである。一部の実施形態では、抗原結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、リンカーによって結合されている。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続される。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８ａ、ＩｇＧ４またはＣＤ２８から選択されるタンパク質のヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、一つ以上の共刺激性ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、一つ以上の共刺激性ドメインは、４-１ＢＢおよび/またはＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、コードされるＣＡＲは、(ｉ)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７および６０～９２のいずれか一つのアミノ酸配列、または(ｉｉ)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７および６０～９２のいずれか一つに対して９５～９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、(ｉ)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３および５６のいずれか一つから選択されるヌクレオチド配列、または(ｉｉ)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３および５６のいずれか一つに対して９５～９９％同一であるヌクレオチド配列、によりコードされる。
定義
より容易に本発明を理解できるように、以下において特定の用語が最初に定義される。以下の用語および他の用語の追加の定義は、本明細書全体に記載されている。本発明の背景を説明し、その実践に関する追加的な詳細を提供するために、本明細書において参照される公表文献および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
冠詞の「a」および「an」は、本明細書において、当該冠詞の文法上の目的語のうちの一つ、または複数(すなわち、少なくとも一つ)を指すために使用される。例示として、「an element」とは、一つの要素、または複数の要素を意味する。
およそまたは約:
本明細書で使用される場合、一つ以上の対象となる値に適用されるときの「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値と類似した値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、記載される参照値のいずれか方向に(参照値よりも大きく、または小さく)２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下にある範囲の値を指す(かかる数値が、可能値の１００％を超える場合を除く)。
剤:
本明細書で使用される場合、「剤」(または「生物学的な剤」または「治療剤」)という用語は、本明細書に記載される改変細胞(例えば、キメラ抗原受容体を含む免疫細胞)によって、標的に発現され得る、放出され得る、分泌され得る、または送達され得る分子を指す。剤としては、限定されないが、核酸、抗生物質、抗炎症剤、抗体またはその断片、キメラ抗原受容体、抗体剤またはその断片、成長因子、サイトカイン、酵素、タンパク質(例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤)、ペプチド、融合タンパク質、合成分子、有機分子(例えば、低分子)、炭水化物、脂質、ホルモン、ミクロソーム、それらの任意の誘導体または変形体、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。剤は、例えば、受容体、抗原決定基、または標的もしくは標的細胞上に存在する他の結合部位などの任意の細胞部分に結合し得る。剤は、細胞内に拡散され、または輸送されてもよく、その細胞内で作用してもよい。
抗体:
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原に対する特異的結合を付与するのに充分な、標準の免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当分野で公知であるように、自然界で生産されるインタクトな抗体は、およそ１５０ｋＤの四量体の物質であり、二つの同一の重鎖ポリペプチド(それぞれ約５０ｋＤ)と二つの同一の軽鎖ポリペプチド(それぞれ約２５ｋＤ)を含み、それらが互いに会合して、一般的に「Ｙ字型」構造と呼ばれるものとなる。各重鎖は、少なくとも四個のドメイン(それぞれ約１１０アミノ酸の長さ)を含む。すなわちアミノ末端可変(ＶＨ)ドメイン(Ｙ構造の先端に位置する)、続いて三個の定常ドメイン:ＣＨ１、ＣＨ２およびカルボキシ末端のＣＨ３(Ｙの幹の基部に位置する)を含む。短い領域は「スイッチ」としても知られており、重鎖の可変領域と定常領域を接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを抗体の残りの部分に接続する。インタクトな抗体において、このヒンジ領域中の二つのジスルフィド結合が、二つの重鎖ポリペプチドを互いに接続させる。各軽鎖は、二つのドメインを含む。すなわちアミノ末端の可変(ＶＬ)ドメイン、続いてカルボキシ末端の定常(ＣＬ)ドメインを含み、それらは互いに別の「スイッチ」によって分離されている。インタクトな抗体四量体は、重鎖-軽鎖の二量体を二つ含み、その二量体において、重鎖と軽鎖は一つのジスルフィド結合により互いに結合されている。二つの他のジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を互いに接続させ、それにより二量体が互いに接続し、四量体が形成される。天然の抗体もグリコシル化されており、典型的にはＣＨ２ドメイン上でグリコシル化されている。天然抗体中の各ドメインは、「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有しており、免疫グロブリンフォールドは、圧縮された逆平行性のベータバレルに互いに詰め込まれた二つのベータシート(例えば、３-、４-、または５-ストランドのシート)から形成される。各可変ドメインは、「相補性決定領域」としても知られる超可変ループを三個(ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３)、およびやや非可変性の「フレームワーク」領域を四個(ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４)含む。天然抗体が折りたたまれると、ＦＲ領域はベータシートを形成し、ドメインの構造フレームワークを提供する。重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲループ領域は三次元空間中に集まり、Ｙ構造の先端に一つの超可変抗原結合部位を生成する。天然抗体のＦｃ領域は、補体系の成分に結合し、また細胞傷害性を介在するエフェクター細胞をはじめとするエフェクター細胞上の受容体にも結合する。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域のアフィニティおよび/または他の結合属性は、グリコシル化または他の改変を介して調節することができる。一部の実施形態では、本発明に従って(例えば、ＣＡＲの構成要素として)作製される、および/または利用される抗体は、改変されたグリコシル化または操作されたグリコシル化を伴うＦｃドメインを含む、グリコシル化Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態では、天然抗体に存在するような充分な免疫グロブリンドメイン配列を含むポリペプチド、またはポリペプチド複合体は、かかるポリペプチドが天然であるか(例えば、抗原に反応する生物によって産生される)か、または組換え工学、化学合成、もしくは他の人工的なシステムまたは方法によって作製されるかに関わらず、「抗体」と呼称され、および/または「抗体」として使用され得る。一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒトの抗体に特徴的な定常領域配列を有する。一部の実施形態では、抗体配列の要素は、当分野で公知であるように、ヒト化され、霊長類化され、キメラなどである。さらに本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、(別段であることが記載されない限り、または文脈から明らかでない限り)適切な実施形態において、代替的な提示において抗体の構造および機能的特徴の利用に関して当分野で公知の、もしくは当分野で開発された構築物またはフォーマットのいずれかを指し得る。例えば一部の実施形態では、本発明に従って利用される抗体は、限定されるものではないが、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体(例えば、Zybodies(登録商標)など)、例えば最も広義の意味で本明細書で使用される抗体断片、から選択されるフォーマットであり、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および/または抗体断片(好ましくは、所望の抗原結合活性を呈する断片)を含む、様々な抗体構造を包含する。本明細書に記載される抗体は、免疫グロブリン、重鎖抗体、軽鎖抗体、ＬＲＲ系抗体、または抗体に似た性能を有する他のタンパク質スキャホールド、ならびに当分野で公知の他の免疫学的な結合部分であってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、Ｆａｂ２，Ｆａｂ３、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ(単一ドメイン抗体、ＶＨＨ)、マキシボディ、ｔａｎｄａｂ、ＤＶＤ、ＢｉＴｅ、ＴａｎｄＡｂなど、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。様々なクラスの抗体のサブユニット構造および三次元立体構造が当分野で公知である。一部の実施形態では、抗体は、天然に産生された場合には有するであろう共有結合的改変(例えば、グリカンの結合)を欠く場合がある。一部の実施形態では、抗体は、共有結合的改変(例えば、グリカン、ペイロード(例えば、検出部分、治療用部分、触媒部分など)、または他のペンダント基(例えば、ポリエチレングリコールなど)の結合)を含む場合がある。
抗原結合断片:
「抗原結合断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の部分を指す。抗体の抗原結合断片には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれか天然の、酵素処理により取得可能な、合成の、もしくは遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。例示的な抗体断片としては限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子(例えば、ｓｃＦｖ、またはＶＨＨもしくはＶＨもしくはＶＬドメインのみ)、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片は、ＶＨＨドメインのみである。完全抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、一特異性または多重特異性(例えば二重特異性)であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合断片は、少なくとも二つの異なる可変ドメインを含有してもよく、この場合において各可変ドメインは、別個の抗原に特異的に結合することができるか、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。
抗体重鎖:
本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」という用語は、その自然な立体構造では全抗体分子に存在する二種類のポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。
抗体軽鎖:
本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」という用語は、その自然な立体構造では全抗体分子に存在する二種類のポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。
合成抗体:
本明細書で使用される場合、「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書に記載されるようにバクテリオファージまたは酵母によって発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成される抗体を意味すると解釈され、そのＤＮＡ分子は、抗体タンパク質、または抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、当該ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列は当分野で利用可能であり、かつ公知の合成ＤＮＡ技術またはアミノ酸配列技術を使用して取得される。
抗原:
本明細書で使用される場合、「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫反応を誘発することができる分子を指す。この免疫反応には、抗体産生、特定の免疫学的な能力を有する細胞の活性化のいずれか、またはその両方が含まれ得る。当業者であれば、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原としての機能を果たし得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導されてもよい。当業者であれば、免疫反応を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書で当該用語が使用される場合の「抗原」をコードすると理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明は、限定されるものではないが、複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらヌクレオチド配列は、所望の免疫反応を惹起するように様々な組み合わせで配置されることが容易に明らかであろう。さらに当業者であれば、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が合成で生成され得るか、または生体試料から誘導され得ることは容易に明白である。かかる生体試料としては限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞、または体液が挙げられる。
自家:
本明細書で使用される場合、「自家」という用語は、個体から誘導され、後に同じ個体に再導入される任意の物質(例えば、細胞群)を指す。
同種:
本明細書で使用される場合、「同種」という用語は、同じ種の別の動物から誘導された任意の物質(例えば、細胞群)を指す。
異種:
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、異なる種の動物から誘導された任意の物質(例えば、細胞群)を指す。
がん:
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、急速で制御不能な異常細胞の増殖を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を通して、身体の他の部分に拡散され得る。様々ながんの例としては限定されないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎がん、肝がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられる。特定の実施形態では、がんは、甲状腺髄様がんである。
保存的配列改変:
本明細書で使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、当該アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に大きな影響を与えることがない、または変化させることがないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、例えば部位特異的変異導入およびＰＣＲによる変異導入など、当分野で公知の標準的な技術によって、様々な実施形態に適合した抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、抗体のＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換することができる。改変された抗体は、本明細書に記載される機能的アッセイを使用して、抗原に結合する能力について試験することができる。
共刺激リガンド:
本明細書で使用される場合、「共刺激性リガンド」という用語は、抗原提示細胞(例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など)上の分子を指し、当該分子は、免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球)上の同系共刺激性分子に特異的に結合する。それによってシグナルが発され、シグナルは限定されないが増殖、活性化、分化などをはじめとする免疫細胞応答を介在する。共刺激性リガンドとしては限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７-１(ＣＤ８０)、Ｂ７-２(ＣＤ８６)、ＣＤ２８、ＰＤ-Ｌ１、ＰＤ-Ｌ２、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導型共刺激性リガンド(ＩＣＯＳ-Ｌ)、細胞間接着分子(ＩＣＡＭ)、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ-Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３/ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７-Ｈ３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。共刺激リガンドには特に免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球)上に提示される共刺激性分子に特異的に結合する抗体も包含され、免疫細胞上に提示される共刺激性分子としては限定されないが例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４-１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１(ＬＦＡ-１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。
細胞傷害性:
本明細書で使用される場合、「細胞傷害性の」または「細胞傷害性」という用語は、細胞を殺傷または損傷させることを指す。一つの実施形態では、代謝的に増強された細胞の細胞傷害性は、改善され、例えば、免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球)の細胞溶解活性が増加される。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞(すなわち、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞)の細胞傷害性が改善され、例えば、免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球)の細胞溶解活性が増加される。一部の実施形態では、ＣＤ３３を発現する標的細胞に対する、本明細書に記載の細胞(すなわち、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞)の細胞傷害性が改善され、例えば、免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球)の細胞溶解活性が増加される。
有効量:
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の「有効量」とは、個体のがんを予防または治療するのに適切な用量を指す。治療的用途または予防的用途に有効な量は、例えば、治療される疾患または障害の段階および重症度、患者の年齢、体重、および全般的な健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。用量のサイズは、選択された活性、投与方法、投与のタイミングおよび頻度、特定の活性物質の投与に付随する可能性のある任意の有害な副作用の存在、性質、および範囲、ならびに望ましい生理学的効果によっても決定される。当業者であれば、様々な疾患または障害が長期的な治療を必要とする可能性があることを理解するであろう。そのような長期的な治療は、各投与または様々な投与ラウンドで本明細書に記載されるＣＡＲを使用するなど、複数回の投与が伴う。一例であり、本発明を限定することは意図していないが、本明細書に記載のＣＡＲが、ＣＡＲを発現する宿主細胞中で提供される場合、宿主細胞の用量の例は、最小で百万個の細胞(１×１０６細胞/用量)であってもよい。
本発明の目的に対し、本明細書に記載のＣＡＲ構築物を含有する免疫細胞を含む剤の量または用量は、合理的な時間枠にわたり、対象または動物において治療的応答または予防的応答を発揮させるのに充分なものでなくてはならない。例えば、用量は、例えば、投与時点から約２時間以上、例えば、約１２時間～約２４時間またはそれ以上、抗原に結合する、またはがん、造血器の悪性腫瘍もしくは前悪性腫瘍を検出、治療または予防するのに充分なものでなくてはならない。特定の実施形態では、期間は、さらに長い場合もある。用量は、本明細書に記載される特定のＣＡＲの有効性、および動物(例えば、ヒト)の状態、ならびに治療される動物(例えば、ヒト)の体重によって決定される。
エフェクター機能:
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」または「エフェクター活性」という用語は、免疫細胞の刺激に応じて、免疫細胞により実行される特定の活性を指す。例えば、Ｔリンパ球のエフェクター機能としては、抗原を認識し、当該抗原を発現する細胞を死滅させることが挙げられる。
コードする:
本明細書で使用される場合、「コードする」とは、生物学的プロセスにおいて他のポリマーや高分子の合成の鋳型としての役割を果たす、例えば遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定の配列に固有の特性を指し、それら特定配列は、規定されるヌクレオチド配列(すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)、または規定されるアミノ酸配列と、それらから生じる生物学的性能を有している。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、当該遺伝子は、タンパク質をコードしている。コード鎖はそのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表において提供されている。非コード鎖は遺伝子またはｃＤＮＡの転写用鋳型として使用される。コード鎖と非コード鎖の両方が、当該遺伝子もしくはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼称され得る。
内因性:
本明細書で使用される場合、「内因性」とは、特定の生物体、細胞、組織、またはシステムに由来する、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
外因性:
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、特定の生物体、細胞、組織またはシステムから導入される、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
拡張する:
本明細書で使用される場合、「拡張する」という用語は、例えばＴリンパ球および/または造血系細胞などの免疫細胞などの細胞の数における増加など、数の増加を指す。一つの実施形態では、拡張される免疫細胞、例えばＴリンパ球、ＮＫ細胞および/または造血系細胞は、培養物中に元々存在した数と比較して、生体外(ex vivo)で数が増加する。一部の実施形態では、拡張される免疫細胞、例えばＴリンパ球、ＮＫ細胞および/または造血系細胞は、培養物中の他の細胞型と比較して、生体外(ex vivo)で数が増加する。一部の実施形態では、拡張は、インビボで発生し得る。本明細書で使用される場合、「生体外(ex vivo)」という用語は、生きている生物体(例えば、ヒト)から取り出され、当該生物体の外側(例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクター中)で増幅された細胞を指す。
発現:
本明細書で使用される場合、核酸配列に関する「発現」という用語は、核酸配列から任意の遺伝子産物の生成することを指す。一部の実施形態では、遺伝子産物は、転写物であってもよい。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、核酸配列の発現は、以下のうちの一つ以上を伴う:(１)ＤＮＡ配列からの(例えば転写による)ＲＮＡ鋳型の生成、(２)ＲＮＡ転写物のプロセッシング(例えば、スプライシング、編集、５'キャップ形成、および/または３'末端形成による)、(３)ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、および/または(４)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
発現ベクター:
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」または「組み換え発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に結合される、発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に充分なシス作用エレメントを含み、発現用の他のエレメントは、宿主細胞によって供給されてもよく、またはインビトロ発現系によって供給されてもよい。発現ベクターとしては、当分野に公知のものすべてが挙げられ、例えば、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドのプラスミド、またはリポソーム内に含有されるプラスミド)、およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)などが挙げられる。
断片:
本明細書で使用される場合、「断片」または「部分」という用語は、全体のうちの個別部分を含むが、構造全体においてみられる一つ以上の部分を欠く構造を指す。一部の実施形態では、断片は、そのような個別部分からなる。一部の実施形態では、断片は、全体においてみられる特徴的な構造的な要素または部分からなり、またはそれらを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体においてみられたときに、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個、またはそれ以上の単量体単位(例えば核酸)を含み、またはそれらからなる。一部の実施形態では、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体においてみられる単量体単位(例えば、残基)の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、物質全体または実体全体は、全体の「親」と呼称される場合もある。
機能的部分:
本明細書で使用される場合、ＣＡＲに関連して使用されるときの「機能的部分」という用語は、本発明のＣＡＲ構築物の任意の部分または断片を指し、それら部分または断片は、自身がその一部となるＣＡＲ構築物(親ＣＡＲ構築物)の生物学的活性を保持している。機能的部分は例えば、標的細胞を認識する能力、または例えば造血器の悪性腫瘍もしくは前悪性腫瘍などのがんを検出する、治療する、または予防する能力を、親ＣＡＲ構築物と類似した程度に、同程度に、またはより高く保持するＣＡＲ構築物の部分を包含する。親ＣＡＲ構築物を参照にすると、機能的部分は例えば、親ＣＡＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６８％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を含み得る。
機能的部分は、当該部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方に追加のアミノ酸を含んでもよく、それら追加のアミノ酸は、親ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列中には存在しない。追加のアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能、例えば、標的細胞を認識する、例えば造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍などのがんを検出する、治療する、または予防するなどの生物学的機能に干渉しないことが望ましい。追加のアミノ酸によって、親ＣＡＲ構築物の生物学的活性と比較して、生物学的活性が強化されることがさらに望ましい。
機能的バリアント:
本明細書で使用される場合、「機能的バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、親ＣＡＲ構築物に対して実質的もしくは有意な配列同一性または類似性を有するＣＡＲ構築物、ポリペプチド、またはタンパク質を指し、当該機能的バリアントは、自身がそのバリアントとなるＣＡＲの生物学的活性を保持している。機能的バリアントは、親ＣＡＲ構築物と類似した程度に、同程度に、またはより高く、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物(親ＣＡＲ構築物)のバリアントを包含する。親ＣＡＲ構築物を参照にすると、機能的バリアントは例えば、親ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列において、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上同一であり得る。
機能的バリアントは、例えば、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する、親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、または追加的に、機能的バリアントは、少なくとも一つの非保存的アミノ酸置換を有する、親ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性に干渉しない、または阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を強化してもよく、それにより、機能的バリアントの生物学的活性は、親ＣＡＲ構築物と比較して高まる。
相同性:
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、例えば核酸分子(例えばＤＮＡ分子および/またはＲＮＡ分子)の間、および/またはポリペプチド分子の間などのポリマー分子の間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、相互に「相同」であると見なされる。一部の実施形態では、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％類似である場合(例えば、対応する位置で関連する化学特性の残基を含有する)、相互に「相同」であると見なされる。当業者であれば理解されるように、配列を比較して相同性の程度を決定する様々なアルゴリズムが利用可能であり、当該アルゴリズムは、異なる配列において互いにどの残基が「対応する」かを検討する場合に、別の配列に対して、ある配列において指定される長さのギャップを許容することを含む。二つの核酸配列またはポリペプチド配列の相動性のパーセントの計算は、例えば、最適比較を目的とした二つの配列のアライメント(例えば、最適アライメントを目的として第一の核酸配列と第二の核酸配列のうちの一つまたは両方にギャップが導入されてもよく、比較目的に対し、対応しない配列は無視されてもよい)を行うことにより実施することができる。特定の実施形態では、比較目的のためにアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第一の配列での位置が、第二の配列での対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合、当該分子は、当該位置で同一である。第一の配列での位置が、第二の配列での対応する位置と類似したヌクレオチドによって占められる場合、当該分子は、当該位置で類似している。二つの配列間の相同性パーセントは、当該配列によって共有される同一の位置および類似の位置の数の関数であり、当該二つの配列を最適に位置合わせするために導入が必要なギャップ数、および各ギャップの長さを考慮する。当業者には明らかであろうように、相同性パーセントは、アミノ酸配列の全長または核酸配列の全長にわたって評価されてもよく、またはその一部(例えば、一つ以上のドメインまたは領域)にわたって評価されてもよい。
同一性:
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、例えば二つのポリペプチド分子間など、二つのポリマー分子間、特に二つのアミノ酸分子間のサブユニットの配列同一性を指す。二つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合、例えば、二つの各ポリペプチド分子において位置がアルギニンによって占められている場合、それらは当該位置で同一である。二つのアミノ酸配列が、アライメントにおいて同じ位置で同じ残基を有する同一性、または程度はしばしばパーセントで表される。二つのアミノ酸配列間の同一性は、合致する位置または同一の位置の数の一次関数であり、例えば二つの配列中の半分の位置(例えば１０アミノ酸長のポリマー中の五か所の位置)が同一である場合、当該二つの配列は５０％同一であり、９０％の位置(例えば、１０分の９)が合致または同一である場合、当該二つのアミノ酸配列は、９０％同一である。当業者には明らかであろうように、同一性パーセントは、アミノ酸配列の全長または核酸配列の全長にわたって評価されてもよく、またはその一部(例えば、一つ以上のドメインまたは領域)にわたって評価されてもよい。
実質的な同一性:
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」という用語は、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば理解するように、二つの配列は、対応する位置で同一の残基を含有する場合、概して「実質的に同一である」とみなされる。当分野で公知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、例えばヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＮ、アミノ酸配列に対してはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ-ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータープログラムで利用可能なアルゴリズムをはじめとする様々なアルゴリズムのいずれかを使用して比較されてもよい。一部の実施形態では、二つの配列は、関連する残基区間にわたって、その対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連区間は、完全配列である。一部の実施形態では、関連区間は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。ＣＤＲに関する文脈において、「実質的な同一性」への言及は通常、参照ＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。
免疫細胞:
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、例えば免疫応答の促進など、免疫応答に関与する細胞を指す。免疫細胞の例としては限定されないが、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、好酸球、マスト細胞、血小板、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、またはＢリンパ球が挙げられる。免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球)のソースは、例えば健康なドナー対象、または造血器の悪性腫瘍もしくは前悪性腫瘍と診断された対象などの対象から取得することができる。
免疫反応:
本明細書で使用される場合、「免疫反応」とは、リンパ球が外来性と抗原性分子を認識し、抗体形成を誘導し、および/またはリンパ球を活性化させて抗原を取り除くときに発生する、抗原に対する細胞性の応答および/または全身性の応答を指す。
免疫グロブリン:
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するあるクラスのタンパク質を指す。Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ(Ｂ細胞受容体)または抗原受容体と呼称される場合もある。このクラスのタンパク質に含まれる五種は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。ＩｇＡは、例えば唾液、涙液、母乳、消化器分泌物、ならびに気道および泌尿生殖器の粘液分泌物などの身体の分泌物中に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象において、一次免疫応答において産生されるメインの免疫グロブリンである。ＩｇＭは、凝集、補体結合、および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御において重要である。ＩｇＤは、抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体としての機能を果たす可能性がある。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝露時にマスト細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型の過敏症を介在する免疫グロブリンである。
単離された:
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、自然な状態から変更された、または取り出されたものを指す。例えば、生きている動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されていない」が、その自然の状態で共存する物質から部分的に、または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在することができ、または例えば宿主細胞など自然ではない環境中で存在することができる。
改変された:
本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、本発明の分子または細胞が変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的をはじめとする多くの方法で改変され得る。細胞は、核酸の導入を介して改変されてもよい。
調節すること:
本明細書で使用される場合、「調節すること」という用語は、処置または化合物の非存在下での対象の応答のレベルおよび/または性質と比較した、対象の応答のレベルにおける検出可能な増加もしくは減少、および/または応答の性質の変化を介在することを指す。この用語は、天然のシグナル伝達または応答をかき乱し、および/またはそれらに影響を及ぼして、対象、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を介在することを包含する。
モノクローナル抗体:
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、実質的に均質な抗体の群から取得される抗体を指す。すなわち、当該群を構成する個々の抗体は同一であるか、および/または同じエピトープに結合する。ただし、潜在的なバリアント抗体(例えば、天然の突然変異を含有する抗体、またはモノクローナル抗体調製物を作製する間に生じる抗体)は除く。そのようなバリアントは一般的に少量存在する。ポリクローナル抗体調製物とは対照的である。ポリクローナル抗体は、典型的には、異なる決定基(エピトープ)に指向する異なる抗体を含んでおり、一方でモノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。
核酸:
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、少なくともヌクレオチドが三個のポリマーを指す。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含む。一部の実施形態では、核酸は、一つ以上のホスホジエステル結合を含む骨格を含む。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合と、非ホスホジエステル結合の両方を含む骨格を含む。例えば、一部の実施形態では、核酸は、一つ以上のホスホロチオエート結合もしくは５'-Ｎ-ホスホロアミダイト結合、および/または例えば「ペプチド核酸」のように一つ以上のペプチド結合を含む、骨格を含んでもよい。一部の実施形態では、核酸は、一つ以上、またはすべての天然残基(例えば、アデニン、シトシン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、グアニン、チミン、ウラシル)を含む。一部の実施形態では、核酸は、一つ以上、またはすべての非天然残基を含む。一部の実施形態では、非天然残基には、ヌクレオシドアナログ(例えば、２-アミノアデノシン、２-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、３-メチルアデノシン、、５-メチルシチジン、Ｃ-５プロピニル-シチジン、Ｃ-５プロピニル-ウリジン、２-アミノアデノシン、Ｃ５-ブロモウリジン、Ｃ５-フルオロウリジン、Ｃ５-ヨードウリジン、Ｃ５-プロピニル-ウリジン、Ｃ５-プロピニル-シチジン、Ｃ５-メチルシチジン、２-アミノアデノシン、７-デアザアデノシン、７-デアザグアノシン、８-オキソアデノシン、８-オキソグアノシン、０(６)-メチルグアニン、２-チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート化塩基(intercalated base)、およびそれらの組み合わせ)が含まれる。一部の実施形態では、非天然残基は、天然残基のものと比較して、一つ以上の改変糖(例えば、２'-フルオロリボース、リボース、２'-デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース)を含む。一部の実施形態では、核酸は、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの機能的な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、一つ以上のイントロンを含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、天然源からの単離、酵素合成(例えば、相補的鋳型に基づく重合、例えば、インビトロもしくはインビボでの組み換え細胞または組み換え系での複製、または科学的合成により調製されてもよい。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基、またはそれ以上の残基長である。
動作可能に連結される:
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結される」という用語は、例えば、制御配列と異種核酸配列の間を機能的に連結し、異種核酸配列の発現を生じさせることを指す。例えば、第一の核酸配列が、第二の核酸配列と機能的に関連付けられて配置される場合、第一の核酸配列は、第二の核酸配列と動作可能に連結される。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に動作可能に連結される。一般的に、動作可能に連結されるＤＮＡ配列は連続的であり、二つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合には、同じリーディングフレーム内にある。
ポリヌクレオチド:
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語、はヌクレオチドの鎖を指す。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互互換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、「ヌクレオチド」単量体へと加水分解され得るという一般常識を有する。ヌクレオチド単量体を、ヌクレオシドに加水分解することもできる。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドとしては限定されないが、当分野で利用可能な任意の手段、および合成手段により取得されるすべての核酸配列が挙げられ、手段としては限定されないが、組換え法、すなわち、通常のクローニング技術およびポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法などを使用して組み換えライブラリまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすることが挙げられる。
ポリペプチド:
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、任意の残基(例えば、アミノ酸)のポリマー鎖を指し、典型的には、それらはペプチド結合によって連結される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界には存在しないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、人工的作用を介して設計および/または作製されるという点で操作されているアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含むか、またはそれからなっていてもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみ、または非天然アミノ酸のみを含むか、またはそれからなってもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ-アミノ酸、Ｌ-アミノ酸、またはその両方を含んでもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ-アミノ酸のみを含んでもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ-アミノ酸のみを含んでもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、一つ以上のペンダント基または他の改変を含んでもよく、例えばそれらは、当該ポリペプチドのＮ末端で、当該ポリペプチドのＣ末端で、またはそれらの任意の組み合わせで、一つ以上のアミノ酸側鎖を改変する、またはそれらに結合される。一部の実施形態では、かかるペンダント基または改変は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、ペグ化などからなる群から選択されてもよく、それらの組み合わせも含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、環状であってもよく、および/または環状部分を含んでもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、環状ではなく、および/または環状部分を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、直鎖状である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ステープルポリペプチドであってもよく、またはそれを含んでもよい。一部の実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、参照ポリペプチド、活性、または構造の名称に付加されてもよく、そのような例では本明細書において、関連する活性または構造を共有し、それに伴い同じポリペプチドのクラスまたはファミリーの一種であるとみなされ得るポリペプチドを指すために当該用語は使用される。そのような各クラスについて、本明細書は、そのアミノ酸配列および/または機能が公知であるクラスの範囲内の例示的なポリペプチドについて提供するものであり、当業者はそれを認識するであろう。一部の実施形態では、かかる例示的なポリペプチドは、ポリペプチドのクラスまたはファミリーの参照ポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドのクラスまたはファミリーのメンバーは、当該クラスの参照ポリペプチドと、さらには一部の実施形態では当該クラス内のすべてのポリペプチドと、有意な配列相同性を示し、もしくは有意な配列同一性を示し、共通の配列モチーフ(例えば、特徴的な配列要素)を共有し、および/または共通の活性(一部の実施形態では、比較可能なレベルで、または指定範囲内で)を共有する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドのメンバーは、参照ポリペプチドと、少なくとも約３０～４０％であり、しばしば約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える、全体的な配列相同性または配列同一性の程度を示し、および/または非常に高い配列同一性を示し、しばしば９０％を超える、またはさらには９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える配列同一性を示す領域(例えば、一部の実施形態では、特徴的な配列要素であり、または特徴的な配列要素を含み得る保存領域)を少なくとも一つ含む。そのような保存領域は通常、少なくとも３～４個、多くの場合は最大で２０個以上のアミノ酸を包含する。一部の実施形態では、保存領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の連続するアミノ酸の区間を少なくとも一つ包含する。一部の実施形態では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含んでもよく、またはそれからなってもよい。一部の実施形態では、有用なポリペプチドは、複数の断片を含んでもよく、またはそれからなってもよい。各断片は、対象ポリペプチド中に存在するときとは互いに異なる空間配置で、同じ親ポリペプチド中に存在し(例えば、親において直接的に連結されている断片が、対象ポリペプチドにおいては空間的に分かれていてもよく、逆もしかりであり、および/または断片は、親とは異なる順序で対象ポリペプチド中に存在してもよい)、それによって、当該対象ポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体となる。
タンパク質:
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド(すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２アミノ酸のストリング)を指す。タンパク質はアミノ酸以外の部分を含んでもよく(例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであってもよい)、および/または別段により処理され、もしくは改変されてもよい。当業者であれば、「タンパク質」は、細胞により産生される完全なポリペプチド鎖(シグナル配列を有する、または有さない)であり得ること、またはその特徴的な部分であり得ることを理解するであろう。当業者であれば、タンパク質は、例えば、一つ以上のジスルフィド結合によって連結される、または別手段により会合される複数のポリペプチド鎖を含む場合があることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ-アミノ酸、Ｄ-アミノ酸、またはその両方を含有してもよく、当野で公知の様々なアミノ酸改変またはアナログのいずれを含有してもよい。有用な改変としては例えば、末端のアセチル化、アミド化、メチル化などが挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。「ペプチド」という用語は一般的に約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物活性部分、および/またはその特徴的な部分である。
シグナル伝達経路:
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の一部から細胞の別の部分へシグナルを伝達する役目を果たす様々なシグナル伝達分子の間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という文言は、シグナルを受信し、細胞膜を横切ってシグナルを伝達することができる分子、および分子の複合体を含む。
一本鎖抗体:
本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体」という用語は、免疫グロブリンの重鎖断片と軽鎖断片がアミノ酸の操作スパンを介してＦｖ領域に連結される組み換えＤＮＡ技法により形成される抗体を指す。一本鎖抗体を作製する様々な方法が公知であり、米国特許第4,694,778号;Bird(1988)Science 242:423-442;Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;Ward et al.(1989)Nature 334:54454;Skerra et al.(1988)Science 242:1038-1041に記載される方法が挙げられる。
特異的に結合する:
本明細書で使用される場合、例えば抗体剤など、抗原結合ドメインに関する場合の「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、サンプル中の他の分子は実質的に認識しない、または結合しない抗原結合ドメインまたは抗体剤を指す。例えば、ある種に由来する抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは抗体剤は、一つ以上の種に由来する当該抗原にも結合する可能性がある。しかし、そのような種を超えた反応性それ自体は、抗原結合ドメインまたは抗体ドメインの特異的であるとする分類を変化させるものではない。別の例では、ある抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは抗体剤は、当該抗原の異なるアレル型にも結合する可能性がある。しかし、そのような交差反応性それ自体は、抗原結合ドメインまたは抗体ドメインの特異的であるとする分類を変化させるものではない。一部の例では、「特異的結合」または「特異的に結合すること」という用語は、抗原結合ドメイン、または抗体剤、タンパク質もしくはペプチドと、第二の化学的種との相互作用に関して使用されて、当該相互作用が、当該化学種上の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味する場合もある。例えば、抗原結合ドメインまたは抗体剤は概して、タンパク質ではなく、むしろ特定のタンパク質構造を認識し、結合する。抗原結合ドメインまたは抗体剤が、エピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗原結合ドメインまたは抗体剤を含む反応において、エピトープ「Ａ」(または遊離型の非標識Ａ)を含有する分子が存在すると、抗体に結合される標識「Ａ」の量が減少する。例えばそのＣＤ３３結合断片などのリガンド、およびその各受容体(例えば、特異的標的抗原)に関する場合の「特異的に結合する」とは、サンプル中の例えば他の抗原などの他の分子を実質的に認識しない、または結合しない抗原結合ドメインを指す。
対象:
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物体、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ネコまたはイヌ)を指す。一部の実施形態では、ヒト対象は、成人、青年、または小児の対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態、例えば、本明細書に提示されるように治療され得る疾患、障害または状態、例えば造血器の悪性腫瘍もしくは前悪性腫瘍などのがんに罹患している。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の影響を受けやすい。一部の実施形態では、感受性の対象は、疾患、障害、または状態を発症するリスクの(参照対象または参照群において観察される平均リスクと比較した)増加する傾向があり、および/または増加を示す。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の一つ以上の症状を呈する。一部の実施形態では、対象は、特定の症状(例えば、疾患の臨床兆候)、または疾患、障害もしくは状態の特徴を呈さない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害もしくは状態の症状または特徴を呈さない。一部の実施形態では、対象は、患者である。一部の実施形態では、対象は、診断および/もしくは治療が行われる、ならびに/または行われている個体である。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態と診断されている。
実質的に精製された:
本明細書で使用される場合、例えば細胞に適用される場合の「実質的に精製された」という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その自然発生的な状態では通常関連付けられている他の細胞型から分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞の群とは、均質的な細胞群を指す。他の例では、当該用語は、単に、その自然な状態では本来関連付けられる細胞から分離されている細胞を指す。一部の実施形態では、細胞は、インビトロで培養される。他の実施形態では、細胞は、インビトロで培養されない。
標的:
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、提供される方法、システムおよび/または組成物の対象である身体内の細胞、組織、器官または部位を指し、例えば、治療の必要のある身体内の、または抗体(またはその断片)もしくはＣＡＲに優先的に結合される、細胞、組織、器官または部位が挙げられる。
標的部位:
本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、結合分子(例えば、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかのＣＤ３３結合断片など、ＣＡＲの抗原結合ドメイン)が、結合が発生するのに充分な条件下で特異的に結合し得る核酸部分を規定するゲノム核酸配列を指す。
Ｔ細胞受容体:
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、抗原提示に応答したＴ細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合された抗原を認識する役割を担っている。ＴＣＲは、アルファ(ａ)鎖とベータ(β)鎖のヘテロ二量体を含むが、一部の細胞では、ＴＣＲはガンマ鎖とデルタ鎖(γ/δ)を含む。ＴＣＲは、アルファ/ベータ型およびガンマ/デルタ型で存在し得、それらは構造的に類似しているが、明白に異なる解剖学的な配置と機能を有している。各鎖は、可変ドメインと定常ドメインの二つの細胞外ドメインを含んでいる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、例えばヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、およびガンマデルタＴ細胞を含む、ＴＣＲを含む任意の細胞上で改変され得る。
治療的:
本明細書で使用される場合、「治療的」という用語は、治療を指す。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、または消滅によって得られる。治療効果は、防御(予防)によって得られてもよい。
トランスフェクトされた:
本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外来性の核酸が宿主細胞内に移送される、または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」細胞または「形質転換された」細胞または「形質導入された」細胞は、外来性の核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。当該細胞は、初代対象細胞と、その子孫細胞を含む。
治療:
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、疾患、障害、および/または状態の一つ以上の症状もしくは特徴の部分的または完全な緩和、改善、発生遅延、阻害、軽減、および/または発生率の低下、および/または重症度の低下を指す。一部の実施形態では、治療は、疾患、障害、および/または状態の兆候または特徴を示さない対象に行われてもよい(例えば、予防的であってもよい)。一部の実施形態では、治療は、例えば、疾患、障害、および/または状態に関連する病的状態の発現リスクを減少させる目的など、疾患、障害、および/または状態の早期もしくは軽度の兆候または特徴のみを示す対象に与えられてもよい。一部の実施形態では、治療は、疾患、障害、または状態が確立した、重度である、および/または後期の徴候を示す対象に与えられてもよい。一部の実施形態では、治療することは、免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞)に投与すること、または免疫細胞と、インビトロ転写されたｍＲＮＡにより活性化される経路の調節因子とを接触させることを含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、疾患、障害、および/または状態の予防、または疾患、障害、および/もしくは状態の一つ以上の症状または特徴の予防を目的としてもよい。
腫瘍:
本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、細胞または組織の異常な増殖を指す。一部の実施形態では、腫瘍は、前がん性(例えば、良性)、悪性、前転移性、転移性、および/または非転移性である細胞を含み得る。一部の実施形態では、腫瘍は、がんと関連付けられ、またはがんの兆候である。一部の実施形態では、腫瘍は、分散性の腫瘍または液性の腫瘍であり得る。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍であり得る。
ベクター:
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、単離核酸を含む物質の組成物を指し、ベクターを使用して、単離核酸を細胞内部に送達することができる。当分野において多くのベクターが公知であり、限定されないが、直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物、プラスミド、およびウイルスに関連付けられたポリヌクレオチドが挙げられる。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。当該用語には、例えば、ポリリシン化合物やリポソームなど、細胞内への核酸輸送を促進する非プラスミド性化合物および非ウイルス性化合物も含まれると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
本開示の全体を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示される場合がある。範囲形式での記述は単に便宜上および簡潔性を目的としており、本発明の範囲に対して柔軟性のない限定であると解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、当該範囲内のすべての可能性のある部分範囲、ならびに個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびに当該範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６などを具体的に開示しているとみなされるべきである。当該範囲の幅にかかわらず、これが適用される。
図１Ａ～１Ｃは、本明細書に記載されるレポーター細胞例のフローサイトメトリー分析のプロットを示す。図１Ａは、構造的に活性なＥ１Ｆアルファプロモーターの制御下にあるmOrangeレポーター分子、および本明細書に記載されるＩＬ-２レポーターシステムの制御下にあるmTurqoiseレポーター分子(mTurq)を含有するJurkat細胞を示す。細胞は、活性化されていない(「-PMA/Ion」、上段)、またはホルボールミリスタートアセテート(ＰＭＡ)およびイオノマイシンを使用して活性化される(「+PMA/Ion」、下段)のいずれかとした。プロットの左列は、mOrangeレポーター分子を発現する細胞を示している。真ん中の列は、mTurquoiseレポーター分子を発現する細胞を示している。右列は、Ｔ細胞活性化の指標であるＣＤ６９を発現する細胞を示している。 図１Ｂは、構造的に活性なＥ１Ｆアルファプロモーターの制御下にあるmTurquoiseレポーター分子(mTurq)、および本明細書に記載されるＩＬ-２レポーターシステムの制御下にあるmOrangeレポーター分子を含有するJurkat細胞を示す。細胞は、活性化されていない(「-PMA/Ion」、上段)、またはホルボールミリスタートアセテート(ＰＭＡ)およびイオノマイシンを使用して活性化される(「+PMA/Ion」、下段)のいずれかとした。プロットの左列は、mTurquoiseレポーター分子を発現する細胞を示している。真ん中の列は、mOrangeレポーター分子を発現する細胞を示している。右列は、Ｔ細胞活性化の指標であるＣＤ６９を発現する細胞を示している。 図１Ｃは、図１Ａおよび１Ｂの定量的フローサイトメトリー分析のプロットを示す。ｙ軸は、構造的に活性なプロモーターであるＥＦ１ａの制御下にある第一のレポーター分子(ＦＰ１)を発現する細胞に基づく、本明細書に記載のＩＬ-２レポーターシステムの制御下にある第二のレポーター分子(ＦＰ２)を発現する細胞の割合を示す。細胞は、活性化されていない(「-PMA/Ion」)、またはホルボールミリスタートアセテート(ＰＭＡ)およびイオノマイシンを使用して活性化される(「+PMA/Ion」)のいずれかとした。「EF1a_mOrange_IL-2_mTurq」とは、構造的に活性なＥ１Ｆアルファプロモーターの制御下にあるmOrangeレポーター分子(ＦＰ１)、および本明細書に記載されるＩＬ-２レポーターシステムの制御下にあるmTurqoiseレポーター分子(mTurq)(ＦＰ２)を含有するJurkat細胞を示す。「EF1a_mTurq_IL-2_mOrange」とは、構造的に活性なＥ１Ｆアルファプロモーターの制御下にあるmTurquoiseレポーター分子(ＦＰ１)、および本明細書に記載されるＩＬ-２レポーターシステムの制御下にあるmOrangeレポーター分子(ＦＰ２)を含有するJurkat細胞を示す。
図２は、Jurkat細胞を、MOLM13 ＣＤ３３発現細胞に曝露したときの、ＩＬ-２誘導性蛍光タンパク質(ＦＰ２；黒色のmTurq、または明灰色のmOrangeのいずれか)における倍率増加のグラフを示す。Jurkat細胞は、示されるＣＡＲまたは共刺激性タンパク質を発現する。
図３は、Jurkat細胞を、MOLM13 ＣＤ３３発現細胞に曝露したときの、ＩＬ-２誘導性蛍光(ΔＦＰ２)(黒色のmTurq、または明灰色のmOrangeのいずれか)における絶対数変化のグラフを示す。Jurkat細胞は、示されるＣＡＲまたは共刺激性タンパク質を発現する。
図４Ａおよび４Ｂは、構造的に活性なＥＦ-１ａプロモーターの制御下にあるレポーター分子を含有する遺伝子構築物の例の概略を示す。図４Ａは、構造的に活性なＥＦ-１ａプロモーターの制御下にあるmOrangeを示す。図４Ａは、構造的に活性なＥＦ-１ａプロモーターの制御下にあるmTurquoiseを示す。これらの構築物は、トランスフェクトされた細胞において、関連蛍光タンパク質を構造的に発現させる。 図４Ａおよび４Ｂは、構造的に活性なＥＦ-１ａプロモーターの制御下にあるレポーター分子を含有する遺伝子構築物の例の概略を示す。図４Ａは、構造的に活性なＥＦ-１ａプロモーターの制御下にあるmOrangeを示す。図４Ａは、構造的に活性なＥＦ-１ａプロモーターの制御下にあるmTurquoiseを示す。これらの構築物は、トランスフェクトされた細胞において、関連蛍光タンパク質を構造的に発現させる。
図５Ａおよび５Ｂは、本明細書に記載されるＩＬ-２レポーターシステムの例示的な遺伝子構築物の概略を示す。図５Ａは、６個のＮＦＡＴ結合部位を含有する最小ＮＦＡＴ応答性プロモーター、および最小ＩＬ-２プロモーター(ｍｉｎＰ)の制御下にあるmOrangeレポーター分子、および構造的に活性なＥ１Ｆアルファプロモーターの制御下にあるmTurqｏｉｓｅレポーター分子(mTurq)を示す。 図５Ｂは、６個のＮＦＡＴ結合部位を含有する最小ＮＦＡＴ応答性プロモーター、および最小ＩＬ-２プロモーター(ｍｉｎＰ)の制御下にあるmTurquoiseレポーター分子、および構造的に活性なＥ１Ｆアルファプロモーターの制御下にあるmOrangeレポーター分子を示す。これらの構築物は、ＣＡＲが活性化された際にＩＬ-２レポーターシステムの制御下でレポーター分子を発現させる。この発現を、構造的プロモーターの制御下にあるレポーター分子の発現と比較して評価することができる。
詳細な記載
本明細書において、抗ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含有するキメラ抗原受容体(本明細書において、ＣＡＲとも呼称される)を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ヒンジドメイン、リンカー領域、および共刺激性シグナル伝達ドメインのうちいずれか一つ以上をさらに含有する。また本明細書において、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードする核酸構築物およびベクターが提供される。また本明細書において、ＣＡＲを発現する細胞、および/または本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸のいずれかを含む細胞(例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞などの免疫細胞)も提供される。さらに本開示は一部の実施形態において、例えば造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍などの疾患または障害を治療するための、ＣＡＲの投与、ＣＡＲをコードする核酸もしくはベクターの投与、またはＣＡＲを発現する細胞群の投与が提供される。
一部の態様では、本開示は、悪性細胞または前悪性細胞上のＣＤ３３の発現を特徴とする疾患、障害、または状態を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを投与することを含み、当該ＣＡＲは、ＣＤ３３を標的とし、ＣＤ３３結合ドメインを介してＣＤ３３に結合する。
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)は進行性の悪性腫瘍であり、通常、集中的な細胞傷害性の化学療法レジメンを使用して治療されるが、疾患が細胞傷害性化学療法剤に対して難治性となった場合には、それに代わる治療選択肢が限定されてしまう。急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)は骨髄のがんであり、効果の高い治療法を必要とする。国立がん研究所によると、米国において６万人を超える人々がＡＭＬに罹患しており、診断から５年後の患者生存率は３０％未満である。
ＣＤ３３およびＡＭＬ
Ｓｉｇｌｅｃ(シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン:Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin)としても知られるＣＤ３３は、細胞-細胞間の相互作用を介在し、免疫細胞を休止状態に維持する役割を果たす。ＣＤ３３は、アルファ-２，３-を優先的に認識および結合し、アルファ-２，６結合型シアル酸を担持するグリカンをより強く認識および結合する。例えばＣ１ｑやシアル酸化糖タンパク質などのリガンドに係合すると、ＣＤ３３の細胞質尾部に位置する二個のimmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs(ＩＴＩＭ)が、例えばＬＣＫなどのＳｒｃ様キナーゼによりリン酸化される。これらのリン酸化によって、タンパク質-チロシンホスファターゼのＰＴＰＮ６/ＳＨＰ-１およびＰＴＰＮ１１/ＳＨＰ-２のリクルートと活性化のためのドッキング部位が生じる。次いでこれらのホスファターゼは、シグナル伝達分子の脱リン酸化を介して下流経路を調節する。単球活性化に対するＣＤ３３の抑制効果のうちの一つは、ホスホイノシチド３-キナーゼ/ＰＩ３Ｋを必要とする。
ＣＤ３３は、ＡＭＬ芽球の大部分の表面上、および急性転化期の慢性骨髄性白血病で発現される。また、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病のサブセット上でも異常発現される。正常な組織発現は、正常な骨髄細胞に限定される。現在のところ、ＣＤ３３を標的とする治療法を用いたＡＭＬ治療は効果的であるが、この治療法は正常な血液や骨髄に対する毒性があるため、有用性が制限される場合がある。
抗ＣＤ３３モノクローナル抗体を基にした治療法を使用した臨床試験によって、ＡＭＬ患者のサブセットにおいて標準化学療法と組み合わせた場合の生存率が改善されたことが示されているが、これらの効果にも、安全性と有効性の懸念が付随している。ＡＭＬ細胞を標的とすることを目指した他の取り組みには、ＡＭＬにおいてＣＤ３３を選択的に標的とするキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するＴ細胞の生成がある。Buckley et al.,Curr.Hematol.Malig.Rep.(2015)(2):65。しかしデータは限定的であり、このアプローチが患者の治療においてどの程度効果的であり得るか(すべての標的細胞が除去されているかどうか)については不確実性がある。さらに、骨髄系統の細胞は生命にとって必須であるため、対象の骨髄系統細胞を枯渇させてしまうと患者の生存に有害な影響を及ぼす可能性がある。
本開示の態様は、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。抗原結合ドメインは、ＣＤ３３に特異的に結合する。これに関して、本開示のＣＡＲは、抗原結合ドメインの一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)を含む、からなる、または本質的にからなる、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む。さらに本明細書に記載のＣＤ３３ ＣＡＲは、例えば、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および一つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(一つ以上の共刺激性ドメインを含む)など、任意の一つ以上の追加ドメインを含んでもよい。さらに本開示は、一部の実施形態では、造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍、例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳを治療するために、本明細書に記載されるＣＤ３３ ＣＡＲのいずれかを含むように改変された免疫細胞群の投与を提供する。
さらに本開示は、一部の実施形態では、系統特異的細胞表面抗原(ＣＤ３３)が欠損している造血系細胞群の投与を提供する。治療の組み合わせは、少なくとも部分的には、系統特異的細胞表面抗原に結合する抗原結合断片を含む剤(例えば、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体を発現する免疫細胞)が、当該系統特異的細胞表面抗原を発現する細胞には選択的に細胞死をもたらし、一方で当該抗原を欠損する細胞(例えば、遺伝子操作された造血系細胞)は当該剤による細胞死を回避するという発見に基づいている。
このように一部の実施形態では、本開示は、系統特異的細胞表面抗原に結合する抗原結合断片を含む剤(例えば、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体を発現する免疫細胞)、および当該系統特異的細胞表面抗原(ＣＤ３３)を欠損している造血系細胞群を含む、治療剤の組み合わせを投与する方法を提供する。
キメラ抗原受容体
概してＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された一つ以上の抗体(例えば、一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ))の抗原結合ドメインを含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはハイブリッドポリペプチドである。ＣＡＲの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、非ＭＨＣ拘束性の様式で、選択された標的に対してＴ細胞の特異性と反応性を再指向化させる能力が挙げられる。非ＭＨＣ拘束性の抗原認識であることによって、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原処理に依存しない抗原認識能力が与えられる。それに伴い、主要な腫瘍エスケープ機序が回避される。さらに、Ｔ細胞で発現される場合、有益なことにＣＡＲは内因性Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)のアルファ鎖およびベータ鎖とは二量体化しない。本明細書で使用される場合、「抗原特異性」および「抗原特異的反応を惹起する」という文言は、ＣＡＲが抗原に結合することで、免疫応答が惹起されるように、ＣＡＲが抗原に特異的に結合し、そして免疫学的に抗原に認識し得ることを意味する。
抗体の抗原結合ドメインを含有する従来的なＣＡＲには、三世代のＣＡＲがある。「第一世代」のＣＡＲは、典型的には、細胞質/細胞内シグナル伝達ドメインに融合される膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインに融合される細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から構成される。第一世代のＣＡＲは、新たな抗原認識をもたらすものであり、単一融合分子中のそのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを介して、ＨＬＡ介在型の抗原提示とは無関係にＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の両方を活性化することができる。「第二世代」のＣＡＲは、様々な共刺激性シグナル伝達分子(例えば、ＣＤ２８、４-１ＢＢ、ＩＣＯＳ、０Ｘ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０/Ｍｙ８８およびＮＫＧＤ２)に由来する細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質尾部に付加して、Ｔ細胞に追加のシグナルを送るものである。第二世代のＣＡＲには、共刺激(例えば、ＣＤ２８または４-１ＢＢ)と活性化(ＣＤ３ζ)の両方を提供するＣＡＲが含まれる。「第三世代」のＣＡＲには、複数の共刺激性ドメイン(例えば、ＣＤ２８および４-１ＢＢ)と、活性化をもたらすシグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ζ)を提供するＣＡＲが含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、抗ＣＤ３３結合ドメインを含有するＣＡＲの細胞外部分、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、リンカー領域、ヒンジ領域、および共刺激性シグナル伝達ドメインのうちの一つ以上をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチド/シグナル配列をさらに含む。
ＣＡＲは、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列からなり、または本質的にそれらからなってもよく、それによって、機能的バリアントの生物学的活性は、例えば他のアミノ酸などの他の構成要素によってほとんど変化しない。
本開示のＣＡＲ(機能的部分および機能的バリアントを含む)は、任意の長さであってもよい。すなわち、任意の数のアミノ酸を含んでもよいが、ただし、ＣＡＲ(または機能的部分またはその機能的バリアント)は、標的抗原(例えば、ＣＤ３３)に特異的に結合する能力、哺乳動物において疾患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を治療もしくは予防する能力などを保持しているものとする。例えば、ＣＡＲは、約５０～約５０００アミノ酸長であってもよく、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。
一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物(本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む)は、一つ以上の天然アミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでもよい。そのような合成アミノ酸は当分野に公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、ａ-アミノｎ-デカン酸、ホモセリン、Ｓ-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-３-およびトランス-４-ヒドロキシプロリン、４-アミノフェニルアラニン、４-ニトロフェニルアラニン、４-クロロフェニルアラニン、４-カルボキシフェニルアラニン、ｂ-フェニルセリンｂ-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-２-カルボン酸、１，２，３，４-テトラヒドロイソキノリン-３-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ'-ベンジル-Ｎ'-メチル-リシン、Ｎ'，Ｎ'-ジベンジル-リシン、６-ヒドロキシリシン、オルニチン、ａ-アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ-アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ-アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ-(２-アミノ-２-ノルボルナン)-カルボン酸、ａ，ｇ-ジアミノ酪酸、ａ，ｂ-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびａ-ｔｅｒｔ-ブチルグリシンが挙げられる。
一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物(機能的部分および機能的バリアントを含む)は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ-アシル化、例えばジスルフィド架橋を介して環化、または酸付加塩に変換されてもよく、および/または任意選択的に二量体化もしくは多量体化されてもよく、またはコンジュゲートされてもよい。
一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物(その機能的部分および機能的バリアントを含む)は当分野で公知の方法により取得されてもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、デノボ合成を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を作製するための任意の適切な方法によって作製されてもよい。ＣＡＲ構築物は、標準的な組み換え法を使用して、本明細書に記載の核酸を使用して組み換え作製されてもよい。例えば、Green et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2012を参照のこと。さらに本明細書に記載されるＣＡＲ構築物の一部分(その機能的部分および機能的バリアントを含む)は、例えば、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、例えばラットやヒトなどの源から単離されてもよく、および/または精製されてもよい。単離および精製の方法は、当分野で公知である。あるいは、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物(その機能部分および機能バリアントを含む)は、Synpep(カリフォルニア州ダブリン)、Peptide Technologies Corp.(メリーランド州ゲイサーズバーグ)、およびMultiple Peptide Systems(カリフォルニア州サンディエゴ)などの企業により商業的に合成されてもよい。これに関して、ＣＡＲ構築物は、合成であっても、組換えであっても、単離されても、および/または精製されてもよい。
さらに本明細書において、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物(その機能的部分および機能的バリアントを含む)のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸がさらに提供される。本明細書に記載される核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列(例えば、シグナルペプチド)、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、リンカー領域、共刺激性シグナル伝達ドメイン、および/または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかは、標的細胞上の抗原(例えば、系統特異的細胞表面抗原)に結合する抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「系統特異的細胞表面抗原」および「細胞表面系統特異的抗原」という用語は相互交換可能に使用され得、細胞表面上に充分に存在して、細胞系統の一つ以上の群と関連付けられている任意の抗原を指す。例えば、抗原は、細胞系統の一つ以上の集団上に存在してもよく、他の細胞群の細胞表面上には存在しなくてもよい(またはレベルが低くてもよい)。
概して系統特異的細胞表面抗原は、例えば、当該抗原および/または当該抗原を提示する細胞群が、宿主生物の生存および/または発達に必要であるかどうかなど、多数の因子に依存して分類され得る。
一部の実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、がん抗原であってもよく、例えば、がん細胞上では異なって存在する細胞表面系統特異的抗原であってもよい。一部の実施形態では、がん抗原は、組織または細胞系統に特異的な抗原である。特定のタイプのがんと関連付けられている細胞表面系統特異的抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２(非ホジキン)リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ))、ＣＤ５２(Ｂ細胞性ＣＬＬ)、ＣＤ３３(急性骨髄性白血病(ＡＭＬ))、ＣＤ１０(ｇｐ１００)(共通(前Ｂ)急性リンパ性白血病および悪性黒色腫)、ＣＤ３/Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)(Ｔ細胞リンパ腫および白血病)、ＣＤ７９/Ｂ細胞受容体(ＢＣＲ)(Ｂ細胞リンパ腫および白血病)、ＣＤ２６(上皮悪性腫瘍およびリンパ系悪性腫瘍)、ＲＣＡＳ１(婦人科癌腫、胆管腺がん、および膵臓の導管腺がん)、ならびに前立腺特異的膜抗原が挙げられる。一部の実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３３であり、ＡＭＬ細胞と関連付けられている。
当分野で公知の任意の抗体またはその抗原結合断片を、本明細書に記載されるＣＡＲの構築に使用することができる。抗原結合ドメインは、抗体の任意の抗原結合部分を含んでもよい。抗原結合部分は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、Nanobody(登録商標)、およびトリアボディ(triabody)など、少なくとも一つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。一部の実施形態では、抗原結合部分は、一本鎖可変領域断片(ｓｃＦｖ)型の抗原結合断片である。ｓｃＦｖは短縮型Ｆａｂ断片であり、合成ペプチドリンカーを介して抗体軽鎖のＶドメインに連結された抗体重鎖の可変(Ｖ)ドメインを含む。通常の組み換えＤＮＡ技法を使用して作製することができる。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片(dsFv:disulfide-stabilized variable region fragments)は、組換えＤＮＡ技法によって調製することができる。
抗原結合ドメインとしては限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、およびそれらの任意の断片が挙げられる。したがって一つの実施形態では、抗原結合ドメイン部分は、哺乳動物の抗体またはその断片を含む。
一部の例では、抗原結合ドメインは、本明細書においてＣＡＲが最終的に使用されるであろう種と同じ種に由来する。例えばヒトでの使用に関しては、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはその断片を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用したファージディスプレイ法をはじめとする当分野に公知の様々な方法(これらの技法に対する改善も含まれる)により作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号、ならびにPCT出願公開WO 98/46645、WO15 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741を参照のこと。これら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書においてＣＡＲが最終的に使用されるであろう種とは異なる種に由来する。例えば、抗原結合ドメインは、ラクダ種に由来し得るが、ヒトで使用されてもよい。
例えば、対象の系統特異的抗原に特異的な抗体は、従来的なハイブリドーマ技術によって作製されてもよい。例えばＫＬＨなどの担体タンパク質に結合され得る系統特異的抗原を使用して、宿主動物を免疫化し、当該複合体に結合する抗体を作製してもよい。宿主動物の免疫化に関する経路およびスケジュールは概して、本明細書に詳述されるように、抗体の刺激および産生に関して確立された従来的な技法に従う。マウス抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体の作製に関する一般的な技術は、当分野で公知であり、本明細書に記載される。ヒトを含む任意の哺乳動物対象、または当該対象に由来する抗体産生細胞を操作して、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の作製の基盤として役立ててもよい。典型的には、宿主動物は、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および/または皮内に、本明細書に記載されるものを含む、ある量の免疫原を接種される。
ハイブリドーマは、Kohler.B.and Milstein.C.Nature(1975)256:495-497の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション法、またはBuck,D.W.,et al.,In Vitro(1982),18:377-381による改変法を使用して、リンパ球と不死化ミエローマ細胞から作製することができる。利用可能なミエローマ細胞株としては限定されないが、X63-Ag8.653、およびSalk Institute,Cell Distribution Center、米国カリフォルニア州サンディエゴの細胞株が挙げられ、これらをハイブリダイゼーションに使用してもよい。概して、本技術は、例えばポリエチレングリコールなどの融合剤を使用して、または当業者に公知の電気的手段により、ミエローマ細胞とリンパ系細胞を融合させることを含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、例えばヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(ＨＡＴ)培地などの選択増殖培地中で増殖させ、ハイブリダイゼーションしていない親細胞を取り除く。血清を補充した、または補充されていない、本明細書に記載の培地のいずれかを、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの培養に使用することができる。細胞融合技術に代わる別の方法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、本明細書に記載されるＴＣＲ様モノクローナル抗体を産生してもよい。ハイブリドーマは必要に応じて拡張およびサブクローニングされ、上清は、従来的な免疫アッセイ法(例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ)によって抗免疫原活性についてアッセイされる。
抗体の供給源として使用され得るハイブリドーマには、系統特異的抗原に結合することができるモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの全ての誘導体、子孫細胞が包含される。そのような抗体を産生するハイブリドーマを、公知の方法を使用してインビトロで、またはインビボで増殖させてもよい。モノクローナル抗体は必要に応じて、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来的な免疫グロブリン精製法によって、培養培地または体液から単離されてもよい。もし望ましくない活性がある場合、例えば、固相に結合された免疫原から作製された吸着体上に調製物を流して、免疫原から所望の抗体を溶出または放出させることによって、除去することができる。例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介してコンジュゲート)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ(式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である)などの二官能性剤または誘導体化剤を使用した大豆トリプシン阻害剤など、免疫化される種で免疫原性があるタンパク質にコンジュゲートされた標的抗原、または標的アミノ酸配列を含有する断片を用いた宿主動物の免疫化を行うことで、抗体群(例えば、モノクローナル抗体群)が得られる。
必要に応じて、対象の抗体(例えば、ハイブリドーマによって産生された抗体)を配列解析してもよく、次いでポリヌクレオチド配列を、発現用ベクターまたは増殖用ベクターにクローニングしてもよい。対象の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクター内で維持されてもよく、次いで宿主細胞を増殖、凍結させて、将来的に使用してもよい。あるいは、ポリヌクレオチド配列を使用して、抗体を「ヒト化する」ため、またはアフィニティを改善する(アフィニティ成熟)ため、または当該抗体の他の特徴を改善するための遺伝子操作を行ってもよい。例えば、定常領域を操作して、よりヒト定常領域に似せて、ヒトでの臨床試験や治療で抗体が使用された際の免疫応答を回避してもよい。抗体配列を遺伝子操作して、系統特異的抗原に対してより高いアフィニティを得ることが望ましい場合もある。当業者には、抗体の一つ以上のポリヌクレオチドを変化させることで、標的抗原に対するその結合特異性を維持させることができることは明白である。
他の実施形態では、完全ヒト抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することによって、取得することができる。より望ましい(例えば、完全ヒト抗体)またはより安定的な免疫応答を生じさせるよう設計されたトランスジェニック動物を、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生に使用してもよい。そのような技術の例としては、Amgen社のXenomouse(登録商標)(カリフォルニア州フレモント)、およびMedarex,Inc.(ニュージャージー州プリンストン)のHuMAb-Mouse(登録商標)およびTC Mouse(商標)がある。別の代替法では、抗体は、ファージディスプレイ法または酵母技術によって組み換え作製され得る。例えば、米国特許第5,565,332号、第5,580,717号、第5,733,743号、および第6,265,150号、ならびにWinter et al.,Annu.Rev.Immunol.(1994)12:433-455を参照のこと。あるいはファージディスプレイ法(McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-553)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体や抗体断片を作製することができる。
インタクトな抗体(全長抗体)の抗原結合断片は、日常的な方法によって調製することができる。例えば、Ｆ(ａｂ')２断片は、抗体分子のペプシン消化によって作製することができ、Ｆａｂ断片は、Ｆ(ａｂ')２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作製することができる。
遺伝子操作された抗体、および二重特異性抗体は、例えば、従来的な組み換え技術によって作製することができる。一例では、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来的な方法を使用して(例えばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、容易に単離し、配列解析することができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。ＤＮＡを単離したら、一つ以上の発現ベクターにＤＮＡを配置してもよく、次いで発現ベクターは例えば大腸菌、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、または別手段により免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、当該組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体が合成される。例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８７/０４４６２を参照のこと。次いで、例えばヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代わりに置換することにより、ＤＮＡを改変してもよい。Morrison et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.(1984)81:6851。または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部と免疫グロブリンコード配列を共有結合することにより、ＤＮＡを改変してもよい。このようにして例えば「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体など、標的抗原への結合特異性を有する遺伝子操作された抗体を作製することができる。
「キメラ抗体」作製のために開発された技術は、当分野で公知である。例えば、Morrison et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81,6851;Neuberger et al.Nature(1984)312,604;およびTakeda et al.Nature(1984)314:452を参照のこと。
ヒト化抗体を構築するための方法も、当分野で公知である。例えば、Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:10029-10033(1989)を参照のこと。一例では、当分野の公知の方法に従い、親の非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域に三次元分子モデリング解析が行われる。次に、正しいＣＤＲ構造の形成に重要であると予測されるフレームワークのアミノ酸残基を、同じ分子モデリング解析を使用して特定する。並行して、親非ヒト抗体のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するヒトのＶＨ鎖およびＶＬ鎖を、検索クエリとして親ＶＨおよび親ＶＬ配列を使用して、任意の抗体遺伝子データベースから特定する。次いで、ヒトのＶＨおよびＶＬのアクセプター遺伝子を選択する。
選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域を、親の非ヒト抗体またはその機能的バリアントのＣＤＲ領域と置き換えることができる。必要に応じて、ＣＤＲ領域との相互作用に重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基(上記の説明を参照)を使用して、ヒトアクセプター遺伝子中の対応する残基を置換することができる。
一本鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列とを連結することによって、組み換え技術により作製することができる。柔軟性のあるリンカーをこの二つの可変領域の間に組み込むことが好ましい。あるいは、一本鎖抗体の作製に関して記載される技術(米国特許第4,946,778号及び第4,704,692号)を適合させて、ファージまたは酵母のｓｃＦｖライブラリを作製することができ、系統特異的抗原に特異的なｓｃＦｖクローンは、通常の手順に従ってライブラリから特定することができる。陽性クローンにさらにスクリーニングを行って、系統特異的抗原に結合するクローンを特定することができる。
一部の態様では、抗原結合ドメインをＣＡＲの別のドメイン、例えば膜貫通ドメインや細胞内ドメインに動作可能に連結して、細胞で発現させる。一部の実施形態では、抗原結合ドメインをコードする核酸は、膜貫通ドメインをコードする核酸、および細胞内ドメインをコードする核酸に動作可能に連結される。
例示的なＣＤ３３抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲはＣＤ３３を標的とし、抗ＣＤ３３結合ドメインを含む細胞外領域を含む。一部の実施形態では、対象の系統特異的抗原は、ＣＤ３３であり、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えばヒトＣＤ３３などのＣＤ３３に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、例えば抗原結合ドメインの一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)などの抗原結合断片を含む、からなる、または本質的にからなる、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、hP67.6(Cowan et al.,Front.Biosci.(2013)(Landmark Ed.),18:1311-1334および米国特許第5,739,116号(各文献は、参照により本明細書に組み込まれる)、M195(Co et al.,J.Immunol.,(1992)148:1149-1154、参照により本明細書に組み込まれる)、またはＨｕ１９５(Co et al.、上記)の抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ｈＰ６７．６、Ｍ１９５もしくはＨｕｌ９５、またはその一部の抗原結合ドメインの一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)を含む、からなる、または本質的にからなる、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を含み、それにより当該断片は、ＣＤ３３に結合する能力を保持する。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、ｈＰ６７．６、Ｍ１９５またはＨｕｌ９５の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を含み、それにより当該断片は、ＣＤ３３に結合する能力を保持する。
一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片の例としては限定されないが、配列番号６０～１０１が挙げられる。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、抗体軽鎖のｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、抗体重鎖のｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６０～１０１のいずれか一つに示されるアミノ酸配列、または配列番号６０～１０１のいずれか一つに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列(または配列番号６０のいずれか一つに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する配列)を含む抗体重鎖のｓｃＦｖ、および配列番号９０のアミノ酸配列(または配列番号９０のいずれか一つに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する配列)を含む抗体軽鎖のｓｃＦｖ、を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列(または配列番号９１のいずれか一つに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する配列)を含む抗体重鎖のｓｃＦｖ、および配列番号９２のアミノ酸配列(または配列番号９２のいずれか一つに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する配列)を含む抗体軽鎖のｓｃＦｖ、を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列(または配列番号１００のいずれか一つに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する配列)を含む抗体重鎖のｓｃＦｖ、および配列番号１０１のアミノ酸配列(または配列番号１０１のいずれか一つに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する配列)を含む抗体軽鎖のｓｃＦｖ、を含む。
Ｍｙｌｏ結合配列の例:
ｓｃＦｖ重鎖:EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSS［配列番号６０］
ｓｃＦｖ軽鎖:DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKR［配列番号９０
Ｍ１９５バインダー配列の例:
ｓｃＦｖ重鎖:QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS［配列番号９１］
ｓｃＦｖ軽鎖:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK［配列番号９２］
ｈ１９５結合配列の例:
ｓｃＦｖ重鎖:QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS［配列番号１００］
ｓｃＦｖ軽鎖:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK［配列番号１０１］
一部の実施形態では、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインをコードする核酸は、リンカー領域をコードする核酸、膜貫通ドメインをコードする核酸、および/または細胞内ドメイン(例えば、共刺激性シグナル伝達ドメイン、シグナル伝達ドメイン)をコードする核酸に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、リンカー領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、リンカーによって互いに結合されてもよい。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、リンカー領域で、例えば膜貫通ドメイン、ヒンジ、および/または細胞内ドメインなどの別のドメインに連結されてもよい。リンカーは、任意の適切なアミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーは、約１～約１００、約３～約２０、約５～約３０、約５～約１８、または約３～約８アミノ酸長であり、配列中はグリシン残基および/またはセリン残基からなるＧｌｙ/Ｓｅｒリンカーである。したがって、Ｇｌｙ/Ｓｅｒリンカーは、グリシン残基および/またはセリン残基からなってもよい。Ｇｌｙ/Ｓｅｒリンカーは、GGGGSのアミノ酸配列(配列番号１)を含むことが好ましく、リンカー内に複数の配列番号１が存在してもよい。抗原結合ドメインと、例えば膜貫通ドメインなどのＣＡＲの任意の他のドメインとの間のスペーサーとして、任意のリンカー配列を使用してもよい。一部の実施形態では、領域リンカーは、(［Ｇ］ｘ［Ｓ］ｙ)ｚであり、例えば式中、ｘは、１～１０であってもよく、７は、１～３であってもよく、ｚは、１～５であってもよい。一部の実施形態では、リンカー領域は、アミノ酸配列GGGGSGGGGS(配列番号９３)を含む。一部の実施形態では、リンカー領域は、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号９９)を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば本明細書に記載されるものなどの一つ以上のリーダー配列(シグナルペプチド、シグナル配列)を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、ＣＡＲ構築物内のＣＡＲのアミノ末端に位置付けられてもよい。リーダー配列は、任意の適切なリーダー配列を含んでもよく、例えば、本明細書に記載される任意のＣＡＲは、例えば本明細書に記載されるものなどの任意のリーダー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、リーダー配列は、細胞表面上に放出されたＣＡＲの発現を促進し得るが、発現されたＣＡＲにおいて、リーダー配列の存在は、ＣＡＲの機能に必須ではない。一部の実施形態では、細胞表面上でのＣＡＲの発現時に、リーダー配列が切り離されてもよい。したがって一部の実施形態では、放出されたＣＡＲ(例えば、表面で発現されたＣＡＲ)は、リーダー配列を欠く。一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物内のＣＡＲは、リーダー配列を欠く。
ヒンジ
一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを例えば膜貫通ドメインなどの別のドメインに連結するヒンジ/スペーサー領域を含む。ヒンジ/スペーサー領域は、標的抗原の認識を促進するために、抗原結合ドメインが様々な方向を向くのに充分な柔軟性があってもよい。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８のヒンジドメインの一部であり、例えば、ＣＤ８αまたはＣＤ２８のヒンジドメインの少なくとも１５(例えば、２０、２５、３０、３５、または４０)個の連続アミノ酸を含有する断片である。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはＩｇＧ４のヒンジドメインなどのヒンジドメインを含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８ａ)のヒンジドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、ヒト(例えば、ヒトタンパク質配列から取得された/誘導された)である。一部の実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２を含み、からなり、または本質的にからなる。
ＣＤ８ヒンジ領域
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD［配列番号２］
一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８ヒンジドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、ヒト(例えば、ヒトタンパク質配列から取得された/誘導された)である。一部の実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号３を含み、からなり、または本質的にからなる。
ＣＤ２８ヒンジ領域
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP［配列番号３］
例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジドメインも、本明細書に記載されるキメラ受容体での使用に適合している。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１とＣＨ２を結合させるヒンジドメインである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインであり、抗体のヒンジドメインと、抗体の一つ以上の定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体のＣＨ３定常領域とを含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域、およびＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４のヒンジドメインである。
非天然ペプチドであるヒンジドメインを含むＣＡＲも本開示の範囲内にある。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と、膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、例えば、(ＧｌｙｘＳｅｒ)ｎリンカーなどのペプチドリンカーであり、式中、ｘおよびｎは独立して、３～１２の整数であってもよく、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上が含まれる。
本明細書に記載されるキメラ受容体のヒンジドメインで使用され得る追加的なペプチドリンカーは、当分野に公知である。例えば、Wriggers et al.Current Trends in Peptide Science(2005)80(6):736-74、およびＰＣＲ出願公開WO2012/088461を参照のこと。
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲのヒンジ/スペーサー領域は、本明細書に記載されるＣＤ２８ポリペプチドの天然ヒンジ領域または改変されたヒンジ領域を含む。特定の実施形態では、本開示のＣＡＲ構築物のヒンジ/スペーサー領域は、本明細書に記載されるＣＤ８αポリペプチドの天然ヒンジ領域または改変されたヒンジ領域を含む。特定の実施形態では、本開示のＣＡＲ構築物のヒンジ/スペーサー領域は、本明細書に記載されるＩｇＧ４ポリペプチドの天然ヒンジ領域または改変されたヒンジ領域を含む。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをＣＡＲの細胞内領域に接続する膜貫通ドメインを含むように設計されてもよい。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲのドメインの一つ以上と自然に関連付けられている。一部の例では、膜貫通ドメインをアミノ酸置換によって選択または改変して、当該ドメインが、同じ、または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合してしまうことを回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限とすることができる。
膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれから誘導されてもよい。源が天然である場合、ドメインは、いずれの膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質から誘導されてもよい。本発明において特に有用な膜貫通領域は、少なくともＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、Ｔｏｌｌ様受容体１(ＴＬＲ１)、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９の膜貫通領域から誘導されてもよい(すなわち、含んでもよい)。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、その場合、膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの優性疎水性残基を含む。フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端に存在することが好ましい。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８ａ)の膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、ヒト(例えば、ヒトタンパク質配列から取得された/誘導された)である。一部の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号４を含み、からなり、または本質的にからなる。
ＣＤ８膜貫通領域
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC［配列番号４］
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ヒト(例えば、ヒトタンパク質配列から取得された/誘導された)である。一部の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号５を含み、からなり、または本質的にからなる。
ＣＤ２８膜貫通ドメイン
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS［配列番号５］
細胞内シグナル伝達ドメイン
一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、一つ以上のシグナル伝達ドメインおよび共刺激性ドメインから構成されてもよい。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、当該ＣＡＲが発現される細胞の活性化に関与する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ構築物の細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞の活性化に関与する。一部の塞栓では、本明細書に記載のＣＡＲ構築物のシグナル伝達ドメインは、シグナル活性化および/または形質導入に関与するドメインを含む。
本明細書に記載されるＣＡＲ構築物で使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては限定されないが、表面受容体、共刺激性分子、および細胞(例えば、免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球)、ＮＫ細胞)中でシグナル伝達を開始するために協調して作用する任意の分子の細胞質部分、ならびにこれらの要素の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能を有する任意の合成配列が挙げられる。
本明細書に記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに使用され得るシグナル伝達ドメインの例としては限定されないが、ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ(ＣＤ３ζ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８６、共通ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ(Fc Epsilon Rib)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ １２、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４-１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１(ＬＦＡ-１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ-１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ-６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ ｌ ｉｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ-１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ-１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ/ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭｌ、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬｌ、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ-Ａ、Ｌｙｌ０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ-３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ-７６、ＰＡＧ/Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔｏｌｌ様受容体１(ＴＬＲ１)、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、本明細書に記載される他の共刺激性分子、それらの任意の誘導体、バリアントまたは断片、同じ機能を有する共刺激性分子の任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせをはじめとする、一つ以上の分子または受容体に由来する断片またはドメインが挙げられる。
任意の細胞質シグナル伝達ドメインを、本明細書に記載されるＣＡＲに使用することができる。概して細胞質シグナル伝達ドメインは、例えば細胞外リガンド結合ドメインとそのリガンドとの相互作用などのシグナルを中継し、例えば細胞のエフェクター機能(例えば、細胞傷害性)を誘導するなど、細胞応答を刺激する。
当分野の当業者には明白であるように、Ｔ細胞活性化に関与する因子は、細胞質シグナル伝達ドメインの免疫受容体活性化チロシンモチーフ(ＩＴＡＭ:immunoreceptor tyrosine-based activation motif)のリン酸化である。当分野に公知の任意のＩＴＡＭ含有ドメインを使用して、本明細書に記載されるキメラ受容体を作製してもよく、またＩＴＡＭ含有ドメインを細胞質シグナル伝達ドメインの一部として含有してもよい。概してＩＴＡＭモチーフはアミノ酸配列ＹｘｘＬ/Ｉの二つのリピートを含み得、それらリピートは６～８アミノ酸で分離される。各ｘは独立して任意のアミノ酸であり、保存されたモチーフのＹｘｘＬ/Ｉｘ(６-８)ＹｘｘＬ/Ｉが生成される。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。
ＣＤ３ζは、ＴＣＲと会合してシグナルを生じさせ、免疫受容体活性化チロシンモチーフ(ＩＴＡＭ)を含有する。一部の実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列は、ヒトである(例えば、ヒトタンパク質から取得される、またはヒトタンパク質から誘導される)。一部の実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列は、配列番号６もしくは９８のアミノ酸配列、または配列番号６もしくは９８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、からなり、または本質的にからなる。一部の実施形態では、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、一つ以上の変異した、および/または欠失したＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζを含む。
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン(バリアントＡ)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR［配列番号６］
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン(バリアントＢ)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR［配列番号９８］
特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも一つの(例えば、１、２、３またはそれ以上の)共刺激性シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激性シグナル伝達ドメインは、最適なリンパ球活性化を提供することができる共刺激性分子を少なくとも一つ含む。概して多くの免疫細胞は、細胞の増殖、分化および生存を促進し、当該細胞のエフェクター機能を活性化するためには、抗原特異的シグナルの刺激に加えて共刺激も必要とする。宿主細胞(例えば、免疫細胞)での共刺激性シグナル伝達ドメインの活性化によって、細胞に、サイトカインの産生と分泌、貪食性能、増殖、分化、生存および/または細胞傷害性を増加させ、または減少させ得る。任意の共刺激性タンパク質の共刺激性シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるキメラ受容体での使用に対して適合性があり得る。共刺激性シグナル伝達ドメインのタイプは、例えばＣＡＲが発現される細胞のタイプ(例えば、初代Ｔ細胞、Ｔ細胞株、ＮＫ細胞株)、および望まれる免疫エフェクター機能(例えば、細胞傷害性)などの因子に応じて選択され得る。
そのような共刺激性シグナル伝達ドメインの例としては、限定されないが、上記段落に列記されるシグナル伝達ドメインのいずれかと任意の組み合わせで、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＣＤ１１６受容体ベータ鎖、ＣＳＦ１-Ｒ、ＬＲＰ１/ＣＤ９１、ＳＲ-Ａ１、ＳＲ-Ａ２、ＭＡＲＣＯ、ＳＲ-ＣＬ１、ＳＲ-ＣＬ２、ＳＲ-Ｃ、ＳＲ-Ｅ、ＣＲ１、ＣＲ３、ＣＲ４、デクチン１、ＤＥＣ-２０５、ＤＣ-ＳＩＧＮ、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＬＯＸ-１、ＣＤ１１ｂをはじめとする一つ以上の分子または受容体に由来する断片またはドメインが挙げられる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３、ＦｃイプシロンＲＩガンマ鎖、それらの任意の誘導体またはバリアントに由来する少なくとも一つのシグナル伝達ドメイン(同じ機能を有するそれらの任意の合成配列を含む)、およびそれらの任意の組み合わせなど、一つ以上の共刺激性シグナル伝達分子の任意の部分を含む。
一部の実施形態では、一つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、１、２、３、またはそれ以上)は、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列とともにＣＡＲ構築物内に含有される。一部の実施形態では、一つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)およびＣＤ２８、またはそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、４-１ＢＢ(ＣＤ１３７)共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、４-１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインの両方を含む。
ＣＤ１３７としても知られる４-１ＢＢは強力な共刺激性シグナルをＴ細胞に伝達し、Ｔリンパ球の分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を強化する。一部の実施形態では、４-１ＢＢ細胞内シグナル伝達配列は、ヒトである(例えば、ヒトタンパク質配列から取得される/由来する)。一部の実施形態では、４-１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる。一部の実施形態では、４-１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、からなり、または本質的にからなる。
４-１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメイン
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL［配列番号７］
一部の適切な共刺激性ドメインが本明細書に提供されており、他の適切な共刺激性ドメインおよび共刺激性ドメイン配列は、当分野の知見に照らし、本開示に基づくことで当業者に明らかであろう。適切な共刺激性ドメインとしては例えば、Weinkove et al.,Selecting costimulatory domains for chimeric antigen receptors:functional and clinical considerations,Clin Transl Immunology.2019;8(5):e1049に記載されるものが挙げられ、当該文献の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＡＲの抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサードメインが組み込まれてもよい。本明細書で使用される場合、「スペーサードメイン」という用語は概して、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中の抗原結合ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかに連結するよう機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、スペーサードメインは、最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、好ましくは２～１０アミノ酸の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーで、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間の結合が形成され得る。リンカーの例としては、グリシン-セリンのダブレットが挙げられる。
シグナルペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかは、シグナルペプチド(シグナル配列)をさらに含み得る。概してシグナルペプチドは、細胞中の部位にポリペプチドを標的化する短いアミノ酸配列である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＡＲを細胞の分泌経路に向けさせ、細胞表面の脂質二重層内にＣＡＲを統合させ、固定させる。本明細書に記載されるキメラ受容体での使用に対して適合性がある、天然タンパク質のシグナル配列、または合成の非天然シグナル配列を含むシグナル配列が、当業者には明らかであろう。
本明細書に記載のＣＡＲは、例えば、自己切断ペプチドとともに構築物中で調製されてもよく、それによって、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構成要素を含有するＣＡＲ構築物は、２シストロン性、３シストロン性などとなる。
様々なＣＡＲ構築物、およびＣＡＲ構築物の多数の要素(例えば、様々なＣＤ３３結合ドメイン、シグナルペプチド、リンカー、ヒンジ配列、膜貫通ドメイン、共刺激性ドメイン、およびシグナル伝達ドメイン)が本明細書に開示される。当業者は、当分野の知見に照らして、本開示に基づき、当分野に公知のこれら要素および追加の適切な要素の配列を確認することができるであろう。例えば、ＣＤ３３結合ドメイン、シグナルペプチド、リンカー、ヒンジ配列、膜貫通ドメイン、共刺激性ドメイン、およびシグナル伝達ドメインなどのＣＡＲ要素の配列の例は、WO/2019/178382として公開されたPCT/US2019/022309において、当該明細書全体を通じて、および表１～６において開示されている。当該文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ベクター
本明細書に記載のＣＡＲ構築物のいずれかをコードする核酸を、例えば組換え発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。これに関して、本発明の実施形態は、本発明の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的に対し、「組み換え発現ベクター」および「ベクター」という用語は、相互交換可能に使用され得、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を指し、当該構築物がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが発現されるのに充分な条件下で、当該ベクターが細胞に接触する場合、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現が可能となる。
一部の実施形態では、ベクターは、全体として自然のものではない。しかしながら、ベクターの一部は、自然由来のものである。本発明の組み換え発現ベクターは、限定されないが、ＤＮＡおよびＲＮＡをはじめとする任意のタイプのヌクレオチドを含んでもよく、それらは一本鎖または二本鎖であってもよく、合成であっても、または部分的に天然源から取得されてもよく、そして天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、または改変ヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ＲＮＡベクターである。ベクターは、天然もしくは非天然のヌクレオチド間結合、または両タイプの結合を含んでもよい。一部の実施形態では、非天然の、もしくは改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、ベクターの転写または複製を妨げない。
ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであってもよく、ベクターを使用して、任意の好適な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトしてもよい。適切なベクターとしては、例えばプラスミドやウイルスなど、増殖および拡張、または発現、またはその両方を目的として設計されたものが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ(Fermentas Life Sciences社、メリーランド州グレンバーニー)、pBluescriptシリーズ(Stratagene社、カリフォルニア州ラホヤ)、ｐＥＴシリーズ(Novagen社、ウィスコンシン州マジソン)、ｐＧＥＸシリーズ(Pharmacia Biotech社、スウェーデン、ウプサラ)、およびｐＥＸシリーズ(Clontech社、カリフォルニア州パロアルト)からなる群から選択されてもよい。バクテリオファージベクターの例えば、ＬＧＴｌＯ、λＧＴ１１、ＬＺａｐＩＩ(Stratagene社)、λＥＭＢＴ４、およびλＮＭＩ１４９を使用してもよい。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩＯ１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＨ２１、およびｐＢＩＮ１９(Clontech社)が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ-ＣＩ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏ(Clontech社)が挙げられる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであってもよい。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
一部の実施形態では、本発明のベクターは、例えば、上記のＧｒｅｅｎらに記載される標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製されてもよい。環状または線状である発現ベクター構築物を調製して、原核宿主細胞または真核宿主細胞において機能する複製システムを含有させてもよい。複製システムは、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどから誘導されてもよい。
組み換え発現ベクターは、必要に応じて、およびベクターがＤＮＡ系であるか、またはＲＮＡ系であるかを考慮して、例えば転写および翻訳の開始、ならびに終結のコドンなどの制御配列を含んでもよく、制御配列は、ベクターが導入される宿主細胞のタイプ(例えば、細菌、真菌、植物または動物)に特異的である。組み換え型発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限酵素部位を含んでもよい。
ベクターは、形質転換された宿主細胞またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を一つ以上含んでもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性などの殺生物剤耐性、栄養要求性宿主において原栄養性を提供するための相補性が挙げられる。本発明の発現ベクターに適したマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン/Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
さらに、ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製されてもよい。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞に死をもたらす遺伝子を指す。自殺遺伝子は、当該遺伝子が発現される細胞に対して、例えば薬剤などの剤に対する感受性を与えて、当該細胞が当該剤に接触したとき、または暴露されたときに、当該細胞に死をもたらす遺伝子であってもよい。自殺遺伝子は当分野で公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびニトロレダクターゼが挙げられる。
プロモーター
一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、ＣＡＲ構築物(機能性部分およびその機能性バリアントを含む)をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された、またはＣＡＲ構築物をコードするヌクレオチド配列に対して相補的な、もしくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に動作可能に連結された天然型または非天然型のプロモーターを含んでもよい。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、および発生段階特異的など、プロモーターの選択は、当業者の通常の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組合せも、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルス性プロモーターまたはウイルス性プロモーターであってもよく、例えば、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＳＦＦＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復配列に存在するプロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、ＳＦＦＶプロモーター(例えば、配列番号８に記載される)である。
ＳＦＦＶプロモーター
GTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCG［配列番号８］
本明細書に記載されるベクターは、一過性の発現、安定的な発現、またはその両方のために設計されてもよい。あるいは、またはさらに、組み換え発現ベクターは、構造的発現用または誘導性発現用に作製されてもよい。
本明細書に記載されるＣＡＲ構築物(機能性部分またはそのバリアントのいずれかを含む)、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、または宿主細胞群のいずれかを含む、例えばバイオコンジュゲートなどのコンジュゲートも本発明に含まれる。コンジュゲート、ならびにコンジュゲートを合成する方法は概して当分野に公知である。
改変細胞の作製
本開示の態様は、細胞を改変する方法を提供するものであり、当該方法は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を細胞(例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞などの免疫細胞)に導入することを含み、当該ＣＡＲは、例えば共刺激性分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、当該免疫細胞は、ＣＡＲを発現し、標的とされるエフェクター活性を保有している。一部の実施形態では、ＣＡＲは、リンカー領域、ヒンジ領域、および/または少なくとも一つの共刺激性ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、細胞内にＣＡＲを導入することは、ＣＡＲをコードする核酸配列を導入することを含む。一部の実施形態では、核酸配列を導入することは、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションすることを含む。
一部の実施形態では、細胞は、例えばＴリンパ球またはＮＫ細胞などの免疫細胞であってもよい。Ｔリンパ球は、例えば、培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養されたＴ細胞株由来のＴ細胞、例えば、ＴＩＢ-１５３(商標)、Jurkat、ＳｕｐＴｌなど、または哺乳動物から取得されたＴ細胞など、任意のＴ細胞であってもよい。哺乳動物から取得される場合、Ｔ細胞は、限定されないが、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液を含む多数の源から取得され得る。Ｔ細胞は、濃縮されてもよく、または精製されてもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であってもよく、限定されないが、ＣＤ４+/ＣＤ８+二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞(例えば、細胞傷害性Ｔ細胞)、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などをはじめとする、任意の発生段階のＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ＣＤ８+Ｔ細胞またはＣＤ４+Ｔ細胞であってもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、アルファ/ベータＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ガンマ/デルタＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞(ＮＫＴ細胞)である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)である。
例えばＣＡＲなどの遺伝子を細胞内に導入および発現する方法は、当分野で公知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当分野の任意の方法によって、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞などの宿主細胞内に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段によって宿主細胞内へと移送され得る。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、形質導入(例えば、レンチウイルス形質導入、レトロウイルス形質導入)、エレクトロポレーション(例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのエレクトロポレーション)などが挙げられる。ベクターおよび/または外来性核酸を含む細胞を作製する方法は、当分野で公知である。例えば、Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)を参照のこと。核酸は、エレクトロポレーション法(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems社、ドイツ、ケルン))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments社、マサチューセッツ州)、またはGene Pulser II(BioRad社、コロンビア州デンバー)、Multiporator(Eppendort社、ドイツ、ハンブルク)をはじめとする市販の利用可能な方法を使用して標的細胞内に導入することができる。またはリポフェクションを使用したカチオン性リポソーム介在トランスフェクション法、ポリマー封入法、ペプチド介在トランスフェクション法、または例えば「遺伝子銃」(例えば、Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)を参照)などのバイオリスティック粒子送達システムを使用して、核酸を細胞内に導入することもできる。
一つの態様では、ＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物は、エレクトロポレーション法によって細胞内に導入される。例えば、米国特許出願公開US2004/0014645、US2005/0052630A1、US2005/0070841Al、US2004/0059285A1、およびUS2004/0092907A1に教示される、哺乳動物細胞内への核酸構築物のエレクトロポレーションに関する設計および方法などを参照のこと。当該文献は、参照により本明細書に組み込まれる。任意の公知の細胞型のエレクトロポレーションに必要とされる電界強度をはじめとする様々なパラメータは、関連する研究文献、ならびに当分野の多くの特許および特許出願において一般的に公知である。例えば、米国特許第6,678,556号、第7,171,264号および第7,173,116号を参照のこと。エレクトロポレーションの治療適用のための装置も市販されており、例えば、MedPulser(商標)DNA Electroporation Therapy System(Inovio/Genetronics社、カリフォルニア州サンディエゴ)があり、例えば米国特許第6,567,694号、第6,516,223号、第5,993,434号、第6,181,964号、第6,241,701号、および第6,233,482号などの特許に記載されている。エレクトロポレーション法は、米国特許出願公開US2007/0128708A1に記載されるように、インビトロでの細胞のトランスフェクションにも使用され得る。エレクトロポレーション法は、インビトロで核酸を細胞内に送達するためにも利用され得る。したがって、当業者に公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用して、発現構築物を含む核酸を、細胞にエレクトロポレーション介在的に投与することは、標的細胞に対象のＤＮＡまたはＲＮＡを送達するための追加的手段である。
対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを目的とした生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ＲＮＡベクターとしては、ＲＮＡプロモーター、およびＲＮＡ転写物を産生するための他の関連ドメインを有するベクターが挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターも、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどから誘導され得る。例えば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照のこと。
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入することを目的とした化学的な方法としては、コロイド分散、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質を基にしたシステムが挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして使用されるコロイド系システムの例は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
非ウイルス送達システムを利用する場合の例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。宿主細胞内への核酸の導入(インビトロ、生体外(エクスビボ)またはインビボ)に脂質製剤の使用は予期される。別の態様では、核酸は、脂質と関連付けられてもよい。脂質と関連付けられた核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と関連付けられる結合分子を介してリポソームに結合され、リポソーム内に捕捉され、リポソームと複合体化され、脂質含有溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルと含有され、もしくはミセルと複合体化され、または別手段により脂質と関連付けられてもよい。脂質、脂質/ＤＮＡ、または脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中で任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは二層構造で存在してもよく、ミセルとして存在してもよく、または「崩壊した」構造で存在してもよい。また、おそらくサイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成しながら、シンプルに溶液中に散在していてもよい。脂質は、脂肪物質であり、天然の脂質または合成脂質であってもよい。例えば、脂質には、細胞質中に自然に存在する脂肪小滴、ならびに例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素ならびにその誘導体を含有する化合物種が含まれる。
使用に適した脂質は、市販のものから取得することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)は、ミズーリ州セントルイスのSigma社から取得することができ、リン酸ジセチル(ＤＣＰ)は、K&K Laboratories社(ニューヨーク州プレインビュー)から取得することができ、コレステロール(Ｃｈｏｉ)は、Calbiochem-Behring社から取得することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(ＤＭＰＧ)および他の脂質は、Avanti Polar Lipid Inc.(アラバマ州バーミンガム)から取得することができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液を、約-２０°Ｃで保存してもよい。クロロホルムはメタノールより蒸発しやすいため、唯一の溶剤として使用される。「リポソーム」は、様々な単層および多重層の脂質ビヒクルを包含する一般的な用語であり、閉鎖型の脂質二重層または脂質凝集体を生成することによって形成される。リポソームは、リン脂質二重層膜と内側の水性媒体を含む小胞構造を有することを特徴とし得る。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離される複数の脂質層を有している。過剰な水溶液中にリン脂質が懸濁されると、リポソームが自発的に形成される。脂質成分は自己再配置を経て、閉鎖構造を形成し、脂質二重層の間に水と溶解溶質を閉じ込める(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505-10)。しかし、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造であると仮定され、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在している可能性がある。また、リポフェクタミン-核酸複合体も予期される。
宿主細胞内に外来性核酸を導入するために使用される方法、または別手段により本明細書に記載される分子に細胞を暴露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞中の核酸の存在を確認するために、様々なアッセイ法を実施してもよい。そのようなアッセイとしては例えば、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ-ＰＣＲおよびＰＣＲなどの当業者に公知の「分子生物学的」アッセイ法、例えば免疫学的手段(例えば、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティング)により、または本発明の範囲内にある物質を特定するための本明細書に記載されるアッセイ法により、特定のペプチドの存在または非存在を検出するなどの「生化学的」アッセイ法が挙げられる。一部の実施形態では、方法はさらに、外来性核酸が導入された(および発現された)細胞を、例えば選択マーカーを使用して、細胞群から選択することを含む。
ＣＡＲ構築物
一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、抗原結合ドメイン(例えば、ＣＤ３３結合ドメイン)、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、および一つ以上の共刺激性/細胞内シグナル伝達ドメインを含む特定の構成要素を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、リンカー領域、ヒンジドメイン領域、および/または一つ以上の共刺激性/細胞内シグナル伝達ドメインのうちの一つ以上をさらに含む。ＣＡＲ構築物は、本明細書に記載される例示的な要素の任意の組み合わせ、例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメインのいずれか、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、および任意の一つ以上の共刺激/細胞内シグナル伝達ドメインの組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかは、シグナルペプチド(シグナル配列)をさらに含み得る。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、(ａ)抗ＣＤ３３抗原結合ドメイン、(ｂ)膜貫通領域、および(ｃ)シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲのＮ末端にシグナルペプチド/シグナル配列をさらに含み、当該シグナル配列は、表面に提示されたときにタンパク質から取り除かれてもよい。
本発明の追加の実施形態は、以下に記載される核酸配列配列のいずれか一つ以上によってコードされる全長の例示的なＣＡＲ構築物を提供する。
１．Ｍｙｌｏ-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ＭｙｌｏＴａｒｇ(ｈ６７．６とも呼称される))、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号９に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号９に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
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一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ＣＡＲ構築物のセクションで列挙されるアミノ酸配列において、以下の注釈が使用される場合がある:下線部分は、リーダー配列を示す。太字部分は、抗体または抗原結合ドメインの重鎖を示す。斜体は、リンカーを示す。点線の下線部分は、抗体または抗原結合ドメインの軽鎖を示す。長い破線の下線部分は、ヒンジドメインを示す。二重下線部分は、膜貫通ドメインを示す。斜体で点線の下線部分は、共刺激性ドメインを示す。太字の下線部分は、細胞内シグナル伝達ドメインを示す。

［配列番号１０］
一部の実施形態では、配列番号９に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号９のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号１１に示される配列、または配列番号１１に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号４のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号９に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号４に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
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２．Ｍｙｌｏ-ＣＤ２８-ＣＤ２８-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ＭｙｌｏＴａｒｇ(ｈ６７．６))、Ｃ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１２に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号１２に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCATCACCGACAGCAACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCCAGAGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGAACCGGGCCACCCTGACCGTGGACAACCCCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGTGAACGGCAACCCCTGGCTGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGAGGGGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCCTGGACAACTACGGCATCCGGTTTCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATGTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGAACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAAAGAGGTGCCCTGGTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAGTGAAGCGGACTAGTTCCGGAGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGATAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGTCCCAGCCCCCTGTTTCCCGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGCGGAGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGTCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACCCCCAGAAGGCCCGGCCCCACCAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTTGCCGCCTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCATGACGGCCTGTACCAAGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCAGGGGATCC［配列番号１２］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号１３］
一部の実施形態では、配列番号１２に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号１２のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号１４に示される配列、または配列番号１４に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号５のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号１４に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号１４に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCATCACCGACAGCAACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCCAGAGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGAACCGGGCCACCCTGACCGTGGACAACCCCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGTGAACGGCAACCCCTGGCTGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGAGGGGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCCTGGACAACTACGGCATCCGGTTTCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATGTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGAACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAAAGAGGTGCCCTGGTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAGTGAAGCGGACTAGTTCCGGAGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGATAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGTCCCAGCCCCCTGTTTCCCGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGCGGAGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGTCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACCCCCAGAAGGCCCGGCCCCACCAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTTGCCGCCTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCATGACGGCCTGTACCAAGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCAGGGGATCCgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaat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TTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACTGGATAACTCAAGCTAACCAAAATCATCCCAAACTTCCC
ACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号１４］
３．Ｍｙｌｏ-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ_２
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ＭｙｌｏＴａｒｇ(ｈ６７．６))、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１５に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号１５に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCATCACCGACAGCAACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCCAGAGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGAACCGGGCCACCCTGACCGTGGACAACCCCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGTGAACGGCAACCCCTGGCTGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGAGGGGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCCTGGACAACTACGGCATCCGGTTTCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATGTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGAACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAAAGAGGTGCCCTGGTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAGTGAAGCGGACTAGTTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC［配列番号１５］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１６に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号１６］
一部の実施形態では、配列番号１５に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号１５のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号１７に示される配列、または配列番号１７に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号１５のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号１７に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号１７に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCATCACCGACAGCAACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCCAGAGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGAACCGGGCCACCCTGACCGTGGACAACCCCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGTGAACGGCAACCCCTGGCTGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGAGGGGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCCTGGACAACTACGGCATCCGGTTTCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATGTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGAACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAAAGAGGTGCCCTGGTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAGTGAAGCGGACTAGTTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataag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CCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号１７］
４．ｈＭ１９５-ＣＤ２８-ＣＤ２８-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ｈＭ１９５(Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ))、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１８に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号１８に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCTCTGCCCGTCACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCTCAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAGGCAAGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCTTACAACGGCGGCACAGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCCAAGGCCACCATCACCGCCGATGAGTCCACCAATACCGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCCGAGGACACAGCCGTCTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGGTGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTTCCGTGGGAGACAGGGTGACCATCACATGCAGGGCCTCCGAGAGCGTGGACAATTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATCAGGGCTCCGGCGTGCCTAGCAGGTTTTCCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGACGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCTTGGACCTTTGGACAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGTCCGGAGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGATAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGTCCCAGCCCCCTGTTTCCCGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGCGGAGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGTCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACCCCCAGAAGGCCCGGCCCCACCAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTTGCCGCCTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCATGACGGCCTGTACCAAGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCAGGGGATCC［配列番号１８］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１９に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号１９］
一部の実施形態では、配列番号１８に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号１８のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号２０に示される配列、または配列番号２０に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号１８のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号２０に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号２０に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCTCTGCCCGTCACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCTCAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAGGCAAGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCTTACAACGGCGGCACAGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCCAAGGCCACCATCACCGCCGATGAGTCCACCAATACCGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCCGAGGACACAGCCGTCTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGGTGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTTCCGTGGGAGACAGGGTGACCATCACATGCAGGGCCTCCGAGAGCGTGGACAATTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATCAGGGCTCCGGCGTGCCTAGCAGGTTTTCCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGACGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCTTGGACCTTTGGACAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGTCCGGAGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGATAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGTCCCAGCCCCCTGTTTCCCGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGCGGAGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGTCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACCCCCAGAAGGCCCGGCCCCACCAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTTGCCGCCTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCATGACGGCCTGTACCAAGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCAGGGGATCCgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgc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CCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号２０］
５．ｈＭ１９５-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ｈＭ１９５(Lintuzumab))、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２１に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号２１に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCTCTGCCCGTCACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCTCAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAGGCAAGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCTTACAACGGCGGCACAGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCCAAGGCCACCATCACCGCCGATGAGTCCACCAATACCGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCCGAGGACACAGCCGTCTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGGTGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTTCCGTGGGAGACAGGGTGACCATCACATGCAGGGCCTCCGAGAGCGTGGACAATTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATCAGGGCTCCGGCGTGCCTAGCAGGTTTTCCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGACGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCTTGGACCTTTGGACAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC［配列番号２１］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２２に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号２２に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号２２］
一部の実施形態では、配列番号２１に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号２１のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号２３に示される配列、または配列番号２３に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号２１のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号２３に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号２３に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーターを含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCTCTGCCCGTCACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCTCAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAGGCAAGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCTTACAACGGCGGCACAGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCCAAGGCCACCATCACCGCCGATGAGTCCACCAATACCGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCCGAGGACACAGCCGTCTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGGTGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGACATTCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTTCCGTGGGAGACAGGGTGACCATCACATGCAGGGCCTCCGAGAGCGTGGACAATTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATCAGGGCTCCGGCGTGCCTAGCAGGTTTTCCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGACGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCTTGGACCTTTGGACAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgcttt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ATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号２３］
６．Ｍ１９５-ＣＤ２８-ＣＤ２８-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍ１９５)、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２４に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号２４に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTATGGCTCTGCCCGTGACCGCTCTCCTCCTGCCACTGGCACTGCTCCTCCACGCTGCTAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGCGCCAGGCTCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATCACCGCCGACGAGAGCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCAGACCCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGCAGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGACTAGTTCCGGAGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGATAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGTCCCAGCCCCCTGTTTCCCGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGCGGAGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGTCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACCCCCAGAAGGCCCGGCCCCACCAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTTGCCGCCTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCATGACGGCCTGTACCAAGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCAGGGGATCC［配列番号２４］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２５に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号２５］
一部の実施形態では、配列番号２４に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号２４のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号２６に示される配列、または配列番号２６に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号２４のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号２６に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号２６に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTATGGCTCTGCCCGTGACCGCTCTCCTCCTGCCACTGGCACTGCTCCTCCACGCTGCTAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGCGCCAGGCTCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATCACCGCCGACGAGAGCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCAGACCCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGCTCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGCAGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAAGAGGTGCCCTGGACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGACTAGTTCCGGAGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGATAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGTCCCAGCCCCCTGTTTCCCGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGCGGAGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGTCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACCCCCAGAAGGCCCGGCCCCACCAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTTGCCGCCTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCATGACGGCCTGTACCAAGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCAGGGGATCCgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatc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７．Ｍｙ９．６-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍｙ９．６、この場合において当該ＶＨ-ＣＤＲ３は、ＬＧＧＳＬＰＤＹＧＭＤＶ［配列番号２７］のアミノ酸配列を含む)、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２８に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号２８に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAAGTGCAACTCGTCCAGTCCGGTGCAGAAGTCAAGAAGCCAGGAGAATCACTCAAGATTAGCTGCAAAGGCAGCGGCTACTCCTTCACTTCCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGAAAGGGACTGGAGTGGATGGGAATCATCTACCCTGGCGATAGCGACACCAGATACTCCCCGAGCTTTCAAGGCCAAGTGACCATTTCGGCCGACAAGTCGATCTCCACCGCGTATCTGCAGTGGAGCTCACTGAAGGCTTCGGACACCGCCATGTACTACTGTGCCCGGCTGGGGGGAAGCCTGCCCGATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACTGTGTCCTCCGCCTCCGGGGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGGGGGTCCGGTGGTGGAGGATCAGAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGCTGTCCTTGCCTGTGACCCCGGGCGAACCCGCAAGCATCTCCTGCCGGTCGTCGCAGTCCCTGCTTCACTCCAACGGCTACAACTACCTCGATTGGTACCTCCAGAAGCCTGGACAGAGCCCACAGCTGTTGATCTACCTGGGCTCGAACCGGGCCTCAGGAGTGCCGGACAGGTTCTCCGGCTCCGGGTCGGGAACCGACTTCACGCTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCATGCAGGCGCTGCAGACCCTTATTACATTCGGACAGGGGACTAAGGTCGATATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG［配列番号２８］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号２９に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号２９］
一部の実施形態では、配列番号２８に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号２８のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号３０に示される配列、または配列番号３０に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号２８のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号３０に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号３０に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAAGTGCAACTCGTCCAGTCCGGTGCAGAAGTCAAGAAGCCAGGAGAATCACTCAAGATTAGCTGCAAAGGCAGCGGCTACTCCTTCACTTCCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGAAAGGGACTGGAGTGGATGGGAATCATCTACCCTGGCGATAGCGACACCAGATACTCCCCGAGCTTTCAAGGCCAAGTGACCATTTCGGCCGACAAGTCGATCTCCACCGCGTATCTGCAGTGGAGCTCACTGAAGGCTTCGGACACCGCCATGTACTACTGTGCCCGGCTGGGGGGAAGCCTGCCCGATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACTGTGTCCTCCGCCTCCGGGGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGGGGGTCCGGTGGTGGAGGATCAGAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGCTGTCCTTGCCTGTGACCCCGGGCGAACCCGCAAGCATCTCCTGCCGGTCGTCGCAGTCCCTGCTTCACTCCAACGGCTACAACTACCTCGATTGGTACCTCCAGAAGCCTGGACAGAGCCCACAGCTGTTGATCTACCTGGGCTCGAACCGGGCCTCAGGAGTGCCGGACAGGTTCTCCGGCTCCGGGTCGGGAACCGACTTCACGCTGAAGATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCATGCAGGCGCTGCAGACCCTTATTACATTCGGACAGGGGACTAAGGTCGATATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaac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CTTCCCACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号３０］
８．Ｍｙ９．６-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ_２
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍｙ９．６、この場合において当該ＶＨ-ＣＤＲ３配列は、ＲＧＧＹＳＤＹＤＹＹＦＤＦ［配列番号３１］のアミノ酸配列を含む)、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３２に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号３２に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAAGTGCAGCTCGTCCAATCCGGTGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAATCCCTGAAGATCTCATGCAAAGGCTCGGGATACAGCTTCACCTCATATTGGATTGGATGGGTCAGACAGATGCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGATGGGAATCATCTACCCGGGAGACAGCGATACCCGGTACTCCCCGAGCTTCCAGGGACAGGTCACCATCTCGGCCGACAAGTCCATTACTACTGCCTACTTGCAATGGTCCTCGCTGCGCGCCTCCGATAGCGCCATGTACTACTGCGCGAGAGGCGGCTACTCCGACTACGACTACTACTTCGATTTCTGGGGACAGGGGACACTCGTGACTGTGTCCTCCGCGTCGGGTGGCGGCGGCTCGGGTGGAGGAGGAAGCGGAGGGGGAGGCTCCGAAATTGTGATGACCCAGTCACCCCTGTCGCTCCCTGTGACTCCTGGGGAACCGGCCTCCATCTCCTGCCGGAGCTCACAGAGCCTGCTGCACTCCAACGGATACAACTACCTCGATTGGTACCTTCAGAAGCCCGGCCAGTCGCCCCAGCTGCTGATCTACCTGGGGTCCAACCGGGCTAGCGGCGTGCCGGACCGCTTCTCCGGTTCCGGGTCTGGAACCGACTTCACGCTGAAAATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGAGTGTATTACTGTATGCAGGCCCTGCAAACCCCCTTCACCTTTGGCGGGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG［配列番号３２］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３３に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３３に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号３３］
一部の実施形態では、配列番号３２に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号３２のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号３４に示される配列、または配列番号３４に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号３２のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号３４に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号３４に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAAGTGCAGCTCGTCCAATCCGGTGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAATCCCTGAAGATCTCATGCAAAGGCTCGGGATACAGCTTCACCTCATATTGGATTGGATGGGTCAGACAGATGCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGATGGGAATCATCTACCCGGGAGACAGCGATACCCGGTACTCCCCGAGCTTCCAGGGACAGGTCACCATCTCGGCCGACAAGTCCATTACTACTGCCTACTTGCAATGGTCCTCGCTGCGCGCCTCCGATAGCGCCATGTACTACTGCGCGAGAGGCGGCTACTCCGACTACGACTACTACTTCGATTTCTGGGGACAGGGGACACTCGTGACTGTGTCCTCCGCGTCGGGTGGCGGCGGCTCGGGTGGAGGAGGAAGCGGAGGGGGAGGCTCCGAAATTGTGATGACCCAGTCACCCCTGTCGCTCCCTGTGACTCCTGGGGAACCGGCCTCCATCTCCTGCCGGAGCTCACAGAGCCTGCTGCACTCCAACGGATACAACTACCTCGATTGGTACCTTCAGAAGCCCGGCCAGTCGCCCCAGCTGCTGATCTACCTGGGGTCCAACCGGGCTAGCGGCGTGCCGGACCGCTTCTCCGGTTCCGGGTCTGGAACCGACTTCACGCTGAAAATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGAGTGTATTACTGTATGCAGGCCCTGCAAACCCCCTTCACCTTTGGCGGGGGCACCAAGGTCGAGATTAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaac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CTTCCCACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号３４］
９．Ｍｙ９．６-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ_３
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍｙ９．６、この場合において当該ＣＤ３３結合ドメインは、ＶＬ-ＶＨの方向性を含む)、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３５に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号３５に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCATCTACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG［配列番号３５］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３６に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号３６］
一部の実施形態では、配列番号３５に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号３５のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号３７に示される配列、または配列番号３７に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号３５のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号３７に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号３７に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCATCTACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaat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ACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号３７］
１０．Ｍｙ９．６-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ_４
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍｙ９．６、この場合において当該ＣＤ３３結合ドメインは、ＶＬ-ＶＨの方向性を含む)、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３８に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号３８に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCATCTTCCGGAGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATGATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC［配列番号３８］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３９に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号３９に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号３９］
一部の実施形態では、配列番号３８に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号３８のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４０に示される配列、または配列番号４０に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号３８のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４０に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号４０に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCATCTTCCGGAGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATGATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcat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１１．ｈＭ１９５-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ_２
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ｈＭ１９５(Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ))、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４１に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号４１に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATCACCGCCGACGAGAGCACCAACACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG［配列番号４１］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４２に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号４２］
一部の実施形態では、配列番号４１に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号４１のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４３に示される配列、または配列番号４３に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号４１のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４３に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号４３に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATCACCGCCGACGAGAGCACCAACACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagct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TGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号４３］
１２．Ｍ１９５-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍ１９５)ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４４に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号４４に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAACAGCAGCAGCACCGCCTACATGGACGTGAGGAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCAGCTGCAGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCAGGGCAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCAGCCTGAACATCCACCCCATGGAGGAGGACGACACCGCCATGTACTTCTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG［配列番号４４］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４５に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号４５に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号４５］
一部の実施形態では、配列番号４４に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４６に示される配列、または配列番号４６に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号４４のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４６に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号４６に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAACAGCAGCAGCACCGCCTACATGGACGTGAGGAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGCCCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCAGCTGCAGGGCCAGCGAGAGCGTGGACAACTACGGCATCAGCTTCATGAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCAGGGCAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCAGCCTGAACATCCACCCCATGGAGGAGGACGACACCGCCATGTACTTCTGCCAGCAGAGCAAGGAGGTGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagct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TGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号４６］
１３．Ｍｙ９．６-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ_５
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍｙ９．６)ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４７に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号４７に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGGTGAGGCTGAGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAACATCATGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGGCCGTGAGCGCCGGCGAGAAGGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCAGCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCAGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG［配列番号４７］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４８に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号４８に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号４８］
一部の実施形態では、配列番号４７に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号４７のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４９に示される配列、または配列番号４９に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号４７のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号４９に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号４９に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGGTGAGGCTGAGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAACATCATGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGGCCGTGAGCGCCGGCGAGAAGGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCAGCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCAGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagc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ATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号４９］
１４．Ｍ２Ｈ１２-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(Ｍ２Ｈ１２)ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５０に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号５０に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAGGCCCGGCACCTTCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGACATCAACTGGGTGAACCAGAGGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGGCGACGGCAGCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACCTGCAGCTGAACAACCTGACCAGCGAGAACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGCGGCTACGAGGACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCATGTACGCCAGCCTGGGCGAGAGGGTGATCATCAACTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCCAAGACCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTGGTGGACGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCCAGGACTACAGCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGTACGAGGACATGGGCATCTACTACTGCCTGCAGTACGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGAGGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG［配列番号５０］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５１に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号５１に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号５１］
一部の実施形態では、配列番号５０に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号５０のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号５２に示される配列、または配列番号５２に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号５０のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号５２に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号５２に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAGGCCCGGCACCTTCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACGACATCAACTGGGTGAACCAGAGGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGGCGACGGCAGCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACCTGCAGCTGAACAACCTGACCAGCGAGAACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGCGGCTACGAGGACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCAAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCATGTACGCCAGCCTGGGCGAGAGGGTGATCATCAACTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCCAAGACCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTGGTGGACGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCCAGGACTACAGCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGTACGAGGACATGGGCATCTACTACTGCCTGCAGTACGACGAGTTCCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGAGGGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgcctt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ACAAACTTAGTAG［配列番号５２］
１５．ＤＲＢ２-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ＤＲＢ２)ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５３に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号５３に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAAGTTCACCGACTACGTGGTGCACTGGCTGAAGCAGAAGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCTACAACGACGGCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCAGCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGGTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACTACAGGTACGAGGTGTACGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCACCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAGGGTGACCATGACCTGCACCGCCAGCAGCAGCGTGAACTACATCCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCGACAGCCCCCTGAGGTGGATCTTCGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCACCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGGAGCTACCCCCTGACCTTCGGCGACGGCACCAGGCTGGAGCTGAAGAGGGCCGACGCCGCCCCCACCGTGAGCGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG［配列番号５３］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５４に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号５４］
一部の実施形態では、配列番号５３に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号５３のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号５５に示される配列、または配列番号５５に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号５３のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号５５に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号５５に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAAGTTCACCGACTACGTGGTGCACTGGCTGAAGCAGAAGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCTACAACGACGGCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCAGCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGGTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACTACAGGTACGAGGTGTACGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCACCATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAGGGTGACCATGACCTGCACCGCCAGCAGCAGCGTGAACTACATCCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCGACAGCCCCCTGAGGTGGATCTTCGACACCAGCAAGGTGGCCAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCACCATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGGAGCTACCCCCTGACCTTCGGCGACGGCACCAGGCTGGAGCTGAAGAGGGCCGACGCCGCCCCCACCGTGAGCGGCCTGGCCGTGAGCACCATCAGCAGCTTCTTCCCCCCCGGCTACCAGATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacc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TAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAG［配列番号５５］
１６．ＣＡＲ３３ＶＨ-ＣＤ８-４１ＢＢ-ＣＤ３ｚ
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３結合ドメイン(ＣＡＲ３３ＶＨ)、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５６に示される配列を含む核酸配列によってコードされ、または配列番号５６に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG［配列番号５６］
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５７に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号５７に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号５７］
一部の実施形態では、配列番号５６に示されるＣＡＲ構築物は、組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、プロモーター(例えば、ＳＦＦＶプロモーターまたはＥＦ１αプロモーター)を含む。一部の実施形態では、配列番号５６のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号５８に示される配列、または配列番号５８に示される核酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号５６のＣＡＲを含む組み換え発現ベクターは、配列番号５８に示される配列を含むが、ＳＦＦＶプロモーター配列(配列番号８に示される)を含まない。一部の実施形態では、組み換え発現ベクターは、配列番号５８に示される核酸配列を含むが、ＳＦＦＶ配列(配列番号８に示される)を含まず、その代わりにＥＦ１αプロモーター配列を含む。
TgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagaattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtggatctGCGATCGCGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGTCTAGAgctagcGGATCCCCGGAATTCGACGCCACCATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGGgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccttccgggatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaATTAATTAACCAATTGaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcaCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGACAATATGTACAAGCCTAATTGTGTAGCATCTGGCTTACTGAAGCAGACCCTATCATCTCTCTCGTAAACTGCCGTCAGAGTCGGTTTGGTTGGACGAACCTTCTGAGTTTCTGGTAACGCCGTCCCGCACCCGGAA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１７．ＣＡＲ ５
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、配列番号６０に含まれるＣＤ３３結合ドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体のＶ-Ｄ-Ｊ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ(例えば、Ｖ-Ｄ-Ｊ領域)は、配列番号６１に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、第一の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ１)、第二の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ２)、および第三の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ３)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号７２に示されるアミノ酸配列、または配列番号７２に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列、または配列番号７７に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列、または配列番号７８に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１、２、３、または４個の重鎖フレームワーク領域(例えば、４個の重鎖フレームワーク領域)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域１(ＦＲ１)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ１は、配列番号７９に示されるアミノ酸配列、または配列番号７９に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域２(ＦＲ２)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ２は、配列番号８０に示されるアミノ酸配列、または配列番号８０に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域３(ＦＲ３)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ３は、配列番号８１に示されるアミノ酸配列、または配列番号８１に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域４(ＦＲ４)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ４は、配列番号８２に示されるアミノ酸配列、または配列番号８２に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６０に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号６０に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号６０］

１８．ＣＡＲ ６
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、配列番号９０に含まれるＣＤ３３結合ドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体のＶ-Ｄ-Ｊ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ(例えば、Ｖ-Ｄ-Ｊ領域)は、配列番号８３に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号８３に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、第一の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ１)、第二の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ２)、および第三の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ３)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、または配列番号６２に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列、または配列番号６３に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列、または配列番号６４に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１、２、３、または４個の重鎖フレームワーク領域(例えば、４個の重鎖フレームワーク領域)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域１(ＦＲ１)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ１は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列、または配列番号６５に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域２(ＦＲ２)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ２は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列、または配列番号６６に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域３(ＦＲ３)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ３は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列、または配列番号６７に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域４(ＦＲ４)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ４は、配列番号６８に示されるアミノ酸配列、または配列番号６８に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。


一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号９０に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号９０に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号９０］

１９．ＣＡＲ ７
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、配列番号９１に含まれるＣＤ３３結合ドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体のＶ-Ｄ-Ｊ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ(例えば、Ｖ-Ｄ-Ｊ領域)は、配列番号６９に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号６９に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、第一の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ１)、第二の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ２)、および第三の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ３)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列、または配列番号７０に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号７１に示されるアミノ酸配列、または配列番号７１に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列、または配列番号７３に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１、２、３、または４個の重鎖フレームワーク領域(例えば、４個の重鎖フレームワーク領域)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域１(ＦＲ１)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ１は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列、または配列番号７４に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域２(ＦＲ２)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ２は、配列番号７５に示されるアミノ酸配列、または配列番号７５に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域３(ＦＲ３)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ３は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列、または配列番号７６に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域４(ＦＲ４)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ４は、配列番号６８に示されるアミノ酸配列、または配列番号６８に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。


一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号９１に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号９１に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号９１］

２０．ＣＡＲ ８
本明細書に記載される例示的なＣＡＲ構築物は、配列番号９２に含まれるＣＤ３３結合ドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ１３７(４-１ＢＢ)共刺激性ドメイン、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体のＶ-Ｄ-Ｊ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ(例えば、Ｖ-Ｄ-Ｊ領域)は、配列番号６１に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号６１に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、第一の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ１)、第二の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ２)、および第三の重鎖ＣＤＲ(ＣＤＲ３)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号７２に示されるアミノ酸配列、または配列番号７２に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列、または配列番号７７に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列、または配列番号７８に対して１、２、もしくは３個の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１、２、３、または４個の重鎖フレームワーク領域(例えば、４個の重鎖フレームワーク領域)を含む抗体を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域１(ＦＲ１)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ１は、配列番号７９に示されるアミノ酸配列、または配列番号７９に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域２(ＦＲ２)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ２は、配列番号８０に示されるアミノ酸配列、または配列番号８０に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域３(ＦＲ３)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ３は、配列番号８１に示されるアミノ酸配列、または配列番号８１に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、重鎖フレームワーク領域４(ＦＲ４)を含む。一部の実施形態では、重鎖ＦＲ４は、配列番号８２に示されるアミノ酸配列、または配列番号８２に対して１、２、３、４、５、６、７、または８個以下の変化(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含む。


一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号９２に示される配列を含むアミノ酸配列、または配列番号９２に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

［配列番号９２］
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のヌクレオチド配列は、コドン最適化されてもよい。特定の理論または機序に拘束されないが、ヌクレオチド配列をコドン最適化することによって、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率が増加する。ヌクレオチド配列のコドン最適化には、天然コドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でさらに容易に利用効率が高くｔＲＮＡにより翻訳され得る別のコドンに置き換えて、翻訳効率を増加させることが含まれてもよい。ヌクレオチド配列の最適化には、翻訳を妨害するｍＲＮＡ二次構造を減少させ、それによって翻訳効率を増加させることが含まれてもよい。本発明のある実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載される核酸配列のいずれか一つを含む、からなる、または本質的にからなる場合がある。
本明細書に記載される核酸のいずれかは、組換え体であってもよい。本明細書で使用される場合、「組み換え体」という用語は、(ｉ)生細胞で複製することができる核酸分子に、天然または合成の核酸セグメントを結合することによって、生細胞の外側で構築される分子、または(ｉｉ)上記(ｉ)に記載されるものの複製から生じる分子、を指す。本明細書の目的に対し、複製は、インビトロ複製またはインビボ複製であってもよい。
組み換え型核酸は、天然ではない配列を有するもの、または別手段により分離された二つの配列セグメントの人工的な組み合わせにより作製される配列を有するもの、であってもよい。この人工的な組み合わせは多くの場合、化学合成によって行われ、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人工的な操作、例えば、上記のＧｒｅｅｎらに記載される技術などの遺伝子操作技術によって行われる。核酸は、当分野で公知の手順を使用して、化学合成および/または酵素ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、上記のＧｒｅｅｎらを参照のこと。例えば、核酸は、天然ヌクレオチドまたは様々に改変されたヌクレオチドを使用して科学的に合成されてもよい。改変ヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を高める、またはハイブリダイゼーション時に形成される二重鎖の物理的安定性を高めるよう設計される(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド)。核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては限定されないが、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、５-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-Ｄ-ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２，２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-置換アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、ベータ-Ｄ-マンノシルキューオシン、５'-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、３-(３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル)ウラシル、および２，６-ジアミノプリンが挙げられる。あるいは本発明の核酸の一つ以上は、例えばMacromolecular Resources社(コロラド州フォートコリンズ)およびSynthegen社(テキサス州ヒューストン)などの企業から購入することができる。
核酸は、ＣＡＲ構築物またはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする、任意の単離された、または精製されたヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、ヌクレオチド配列は、当該配列のいずれかに対して縮重された、または縮重配列の組み合わせであるヌクレオチド配列を含んでもよい。
また本明細書において、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列、または本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された、または精製された核酸も提供される。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェント条件」という用語は、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列(本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列)に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を指す。高ストリンジェント条件には、正確な相補的配列を有するポリヌクレオチド、または少数の散在するミスマッチのみを含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列に合致する小さな領域(例えば、３～１０塩基)を偶然に有するランダム配列から識別する条件が含まれる。そのような小さな相補的領域は、１４～１７個以上の塩基の全長相補鎖よりも簡単に溶解するため、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって、簡単にそれらを識別することができる。比較的高いストリンジェントな条件には、例えば、低塩および/または高温の条件、例えば、約０．０２～０．１Ｍ ＮａＣｌまたは同等のもの、約５０～７０℃の温度で提供される条件が含まれる。そのような高ストリンジェントな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型または標的配列の間にミスマッチが存在する場合、それが許容されることがほとんどなく、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物のいずれかの発現の検出に特に好適である。ホルムアミドの量を増やして添加することによって、条件はよりストリンジェントになり得ると一般に認識されている。
本開示は、本明細書に記載される核酸のいずれかに対して、少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。また、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物の機能的部分も本開示の範囲内である。
治療方法
本開示の態様は、対象において疾患、障害または状態を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に記載されるＣＡＲ、核酸、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物のいずれかの治療有効量を当該対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する細胞(例えば、細胞群)を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。一部の態様では、本開示は、対象においてがんを治療する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に記載されるＣＡＲ、核酸、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物のいずれかの治療有効量を当該対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、対象において造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍を治療するための方法であり、当該方法は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する細胞(例えば、細胞群)を含む医薬組成物の治療有効量を当該対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、対象において標的の細胞または組織(例えば、がん細胞、腫瘍細胞または腫瘍組織)に対する免疫応答を刺激する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する細胞(例えば、細胞集団)を含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本開示は、その必要のある対象において免疫応答を刺激するための医薬品の製造における、本明細書に記載される改変細胞の使用を含む。一部の実施形態では、本開示は、その必要のある対象におけるがん治療のための医薬品の製造における、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物のいずれかの使用を含む。一部の実施形態では、方法は、その必要のある対象における腫瘍治療またはがん治療のための医薬品の製造における、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物のいずれかの使用を含む。一部の実施形態では、方法は、その必要のある対象における造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍の治療のための医薬品の製造における、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物のいずれかの使用を含む。
本明細書に記載されるように作製された改変細胞(例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞などの免疫細胞)は、標的とされるエフェクター活性を保有する。一部の実施形態では、改変細胞は、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインへの特異的結合を介してなど、標的細胞上の抗原に対して指向される標的のエフェクター活性を有する。一部の実施形態では、標的のエフェクター活性としては限定されないが、貪食作用、標的細胞の細胞傷害性、抗原提示、およびサイトカイン分泌が挙げられる。
本明細書に記載されるＣＡＲ構築物(その機能的部分およびバリアントを含む)、核酸、ベクター、および本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する例えば免疫細胞、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞(その群を含む)などの宿主細胞は、「ＣＡＲ構築物質」と集合的に呼称される。
医薬組成物
本明細書に記載されるＣＡＲ構築物質は、例えば医薬組成物などの組成物に製剤化されてもよい。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物質のいずれかと、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。ＣＡＲ構築物物質のいずれかを含有する医薬組成物は、複数のＣＡＲ構築物質、例えば、ＣＡＲ構築物と核酸、または二つ以上の異なるＣＡＲ構築物を含んでもよい。あるいは医薬組成物は、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学療法剤など、他の薬学的に活性な剤または薬品と組み合わせたＣＡＲ構築物を含んでもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物のいずれかを発現する細胞、または当該細胞の群を含む。
医薬組成物に関して、薬学的に許容可能な担体は、従来から使用されている任意の担体であってもよく、例えば溶解性、および活性剤との反応性の欠落などの化学-物理的な検討事項、および投与経路によってのみ、制限される。本明細書に記載される薬学的に許容可能な担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は、当業者に公知であり、一般的に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性を有しない担体であることが好ましい。
担体の選択は、特定のＣＡＲ構築物質によって、ならびに例えば対象にＣＡＲ構築物質を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、本発明の医薬組成物に関して、様々な適した製剤がある。投与可能な(例えば、非経口的に投与可能な)組成物を調製する方法は、当業者には公知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Pharmaceutical Press;22nd ed.(2012)に詳細に記載されている。
ＣＡＲ物質のいずれかを含む医薬組成物を含むＣＡＲ構築物質は、任意の適切な方法で投与され得る。一部の実施形態では、ＣＡＲ物質のいずれかを含む医薬組成物を含むＣＡＲ物質は、注射(例えば、皮下注射、静脈内注射、腫瘍内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、または髄腔内注射)によって投与される。一部の実施形態では、ＣＡＲ物質のいずれかを含む医薬組成物を含むＣＡＲ構築物質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、ＣＡＲ物質のいずれかを含む医薬組成物を含むＣＡＲ物質は、点滴により投与される。本明細書に記載されるＣＡＲ構築物質に適した、注射用の薬学的に許容可能な担体としては、例えば、通常の生理食塩水(約０．９０％ｗ/ｖ ＮａＣｌの水溶液、約３００ｍＯｓｍ/Ｌ ＮａＣｌの水溶液、または約９．０ｇ ＮａＣｌ/Ｌの水溶液)、NORMOSOL R電解質溶液(Abbott社、イリノイ州シカゴ)、PLASMA-LYTE A(Baxter社、イリノイ州ディアフィールド)、約５％デキストロース水溶液、または乳酸リンゲルなどの任意の等張性の単体が挙げられる。一部の実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、ヒト血清アルブメン(albumen)を補充される。
治療的用途または予防的用途に有効な量は、例えば、治療される疾患または障害の段階および重症度、患者の年齢、体重、および全般的な健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。用量のサイズは、選択された活性、投与方法、投与のタイミングおよび頻度、特定の活性物質の投与に付随する可能性のある任意の有害な副作用の存在、性質、および範囲、ならびに望ましい生理学的効果によっても決定される。当業者であれば、様々な疾患または障害が長期的な治療を必要とする可能性があることを理解するであろう。そのような長期的な治療は、各投与または様々な投与ラウンドで本明細書に記載されるＣＡＲ構築物質を使用するなど、複数回の投与が伴う。一例であり、本発明を限定することは意図していないが、ＣＡＲ構築物質が、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する宿主細胞である場合、宿主細胞の用量の例は、最小で百万個の細胞(１×１０６細胞/用量)であってもよい。
本発明の目的に対し、投与されるＣＡＲ構築物質の量または用量は、合理的な時間枠にわたり、対象または動物において治療的応答または予防的応答を発揮させるのに充分なものでなくてはならない。例えば、ＣＡＲ構築物質の用量は、抗原(すなわち、ＣＤ３３)に結合するのに充分でなければならず、または、約２時間以上、例えば約１２時間～約２４時間以上、例えば投与時から約１日～６か月などの期間、疾患の一つ以上の症状の低減、および/または疾患の進行の遅延を含む、がん、または造血器の悪性腫瘍もしくは前悪性腫瘍を検出、治療または予防するのに充分でなければならない。一部の実施形態では、期間はさらに長くなる場合がある。用量は、例えば特定のＣＡＲ構築物質の有効性、治療される動物(例えば、ヒト)の体重を含む動物(例えば、ヒト)の状態、および対象の疾患の重症度などの因子によって決定される。
例えば、対象にかかる細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の所与の用量を投与した際に、それぞれが異なる用量の細胞を投与される一連の対象の間で、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する細胞により、標的細胞が溶解される程度を比較すること、および/またはＩＦＮ-ガンマまたはＩＬ-２が分泌される程度を比較することなどを含むアッセイを使用して、対象に投与される開始用量を決定し得る。特定の用量の投与の際に、標的細胞が溶解される程度、および/またはＩＦＮ-ガンマもしくはＩＬ-２が分泌される程度は、当分野に公知の方法で分析することができる。
ＣＡＲ構築物質が一つ以上の追加的な治療剤とともに投与される場合、一つ以上の追加の治療剤は、対象に同時投与されてもよい。「同時投与すること」という用語は、ＣＡＲ構築物質が、一つ以上の追加的治療剤の効果を高めることができるよう、一つ以上の追加的な治療剤と、ＣＡＲ構築物質とを充分に近い時間内に投与することを指し、逆もまた然りである。これに関して、ＣＡＲ構築物質が最初に投与され、一つ以上の追加的治療剤は二番目に投与されてもよく、逆もまた然りである。あるいは、ＣＡＲ構築物質と一つ以上の追加的治療剤は、同時に投与されてもよい。ＣＡＲ構築物質と同時投与され得る治療剤の例は、ＩＬ-２である。
本明細書に記載されるＣＡＲ構築物質は、対象において疾患を治療または予防する方法において使用され得ることが予期される。特定の理論または機序に拘束されないが、ＣＡＲ構築物は、例えばＣＤ３３などの抗原を認識するＣＡＲなど、生物学的活性を有しており、それによって、ＣＡＲは、細胞により発現されたとき、例えばＣＤ３３など当該抗原を発現している細胞に対する免疫応答を介在することができる。これに関し、一部の実施形態では、対象(例えば、ＡＭＬ、ＭＤＳ)の疾患、障害または状態(例えば、造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍などのがん)を治療または予防する方法は、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞群、および/または医薬組成物のいずれかを、当該対象において、対象の疾患、障害または状態(例えば、がん、造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍)を治療または予防するのに有効な量で、哺乳動物に投与することを含む。
一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物質のいずれかを投与する前に、対象(例えば、哺乳動物)をリンパ球枯渇させることをさらに含む。リンパ球枯渇の例としては限定されないが、非骨髄破壊的なリンパ球枯渇的化学療法、骨髄破壊的なリンパ球枯渇的化学療法、全身放射線照射などが挙げられる。
一部の実施形態では、細胞または当該細胞群を発現する細胞が投与され、当該細胞は、対象に対して自家または同種である細胞であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、対象に対して自家である。
治療方法に関して、一部の実施形態では、疾患、障害、または状態は、がんである。がんは、任意のがんであってもよく、急性リンパ球性のがん、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、胞巣型横紋筋肉腫(alveola rhabdomyosarcoma)、膀胱がん(例えば、膀胱がん腫)、骨がん、脳腫瘍(例えば、髄芽腫)、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、首、胆嚢または胸膜のがん、鼻、鼻腔または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、慢性骨髄がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん(例えば、頭頚部の扁平上皮細胞がん腫)、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん腫)、リンパ腫、悪性中皮腫、マスト細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞型慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前駆型急性リンパ芽球性白血病(B-ALL:B-precursor acute lymphoblastic leukemia)、前駆Ｂ細胞前駆型急性リンパ芽球性白血病(BCP-ALL:pre-B cell precursor acute lymphoblastic leukemia)、Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、およびバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網、および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、ならびに尿管がんのいずれかが挙げられる。好ましくは、がんは、血液の悪性腫瘍(例えば限定されないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ、急性リンパ球性のがん、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、Ｂ細胞型慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)(急性リンパ芽球性白血病とも呼称ｓあれる)、Ｂ-ＡＬＬ、ＢＣＰ-ＡＬＬ、Ｂ細胞リンパ腫、およびバーキットリンパ腫を含む白血病またはリンパ腫)である。好ましくは、がんは、ＣＤ３３の発現を特徴とする。
一部の実施形態では、疾患、障害、または状態は、造血器の悪性腫瘍または血液のがんである。一部の実施形態では、悪性腫瘍は、リンパ性の悪性腫瘍または骨髄性の悪性腫瘍である。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態は、造血器の悪性腫瘍である。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態は、例えば、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)などの白血病である。ＡＭＬは、重要な分化経路および増殖制御経路を破壊する重大な遺伝子変化を徐々に獲得した形質転換細胞を起源とする不均一でクローン性の腫瘍性疾患を特徴とする。(Dohner et al.,NEJM,(2015)373:1136)。理論に拘束されることは望まないが、一部の実施形態では、ＣＤ１２３が骨髄性白血病細胞ならびに正常な骨髄前駆体と単球前駆体上で発現されており、ＡＭＬ治療の有望な標的となると考えられている。
一部の実施形態では、ＣＤ１２３と関連付けられた造血器の悪性腫瘍または血液疾患は、例えば骨髄異形成、骨髄異形成症候群または前白血病などの前がん性の状態である。骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)は、無秩序で無効な造血または血液産生を特徴とする血液の疾患である。したがって、血液形成細胞の数と質が不可逆的に低下している。ＭＤＳ患者の一部は重度の貧血を発症し、他の患者は無症候性である。ＭＤＳの分類スキームは当分野に公知であり、例えば骨髄芽球、単球および赤血球の前駆体など、特定の血液細胞型の比率または頻度を指定する基準がある。ＭＤＳには、難治性の貧血、環状鉄芽球を伴う難治性貧血、過剰な芽球を伴う難治性貧血、形質転換した過剰な芽球を伴う難治性貧血、慢性骨髄単球性白血病(ＣＭＬ)が含まれる。一部の実施形態では、ＭＤＳは、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)に進行する可能性がある。
さらに、本明細書に記載される方法によって提供される治療または予防には、例えばがんなど、治療される、または予防される疾患の一つ以上の状態または症状を治療または予防することが含まれ得る。
本開示の態様はまた、対象において疾患、障害または状態(例えば、がん)の存在を検出する方法を提供するものであり、当該方法は、(ａ)当該対象からの一つ以上の細胞を含むサンプルと、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物のいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する宿主細胞、当該細胞群、または医薬組成物のいずれかとを接触させ、それにより複合体を形成させること、および(ｂ)当該複合体を検出すること、を含み、当該複合体の検出は、対象において疾患、障害または状態が存在することを示す。
サンプルは、任意の適切な方法、例えば、生検または剖検によって取得されてもよい。生検は、個体から組織および/または細胞を取り出すことである。そのような取り出しは、取り出された組織および/または細胞に対して実験を実施するために、個体から組織および/または細胞を収集することであってもよい。この実験には、個体が特定の状態または疾患状態を有する、および/または罹患しているかを判定するための実験を含んでもよい。状態または疾患は、例えば、がん、例えば、造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍であってもよい。
一部の実施形態では、対象の細胞を含むサンプルは、全細胞、細胞溶解物、または全細胞溶解物の画分であってもよく、例えば、核画分または細胞質画分、細胞可溶化物全体の画分、例えば、核もしくは細胞質画分、全タンパク質画分、または核酸画分を含むサンプルであってもよい。サンプルが全細胞を含む場合、当該細胞は、対象の任意の細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の器官または組織の細胞であってもよい。
一部の実施形態では、サンプルと、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、当該細胞群、または医薬組成物のいずれかとの接触は、対象に関してインビトロまたはインビボで行われてもよい。接触は、インビトロであることが好ましい。
複合体の検出は、当分野で公知の様々な方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ構築物のいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する宿主細胞、または当該細胞の群、または医薬組成物のいずれかを、例えば、放射性同位元素、フルオロフォア(例えばフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、フィコエリトリン(ＰＥ))、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ)、および元素粒子(例えば、金粒子)などの検出可能な標識で標識されてもよい。
標的細胞を認識する能力、および抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当分野で公知である。例えば、Clay et al.,J.Immunol.(1999)163:507-513には、サイトカイン(例えば、インターフェロン-ｇ、顆粒球/単球コロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ-ａ)、またはインターロイキン２(ＩＬ-２)の放出を測定する方法について教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Zhao et al.,J.Immunol.(2005)174:4415-4423に記載される細胞傷害性の測定法によって評価されてもよい。
ＣＤ３３を欠損した造血系細胞
また本開示の態様は、ＣＤ３３標的抗原の阻害についても、組成物および方法を提供する。そのような治療レジメンには例えば、以下の工程が含まれ得る:(１)患者に例えば免疫細胞(例えばＴリンパ球、ＮＫ細胞)などの細胞または細胞群の治療有効量を投与することであって、当該細胞は、本明細書に記載されるＣＤ３３を標的とするＣＡＲのいずれかをコードする核酸配列を含むこと、および(２)患者に、自家または自己のいずれかである造血系幹細胞を投与する(例えば、注入する、または再注入する)ことであって、当該造血系細胞は、ＣＤ３３の発現が低下していること。一部の実施形態では、造血系細胞は、ＣＤ３３の発現が低下または消失するように遺伝子改変される。
一部の実施形態では、造血系細胞は、造血系幹細胞(ＨＳＣ)である。一部の実施形態では、造血系細胞は、造血系前駆細胞(ＨＰＣ)である。造血系幹細胞(ＨＳＣ)は、骨髄系前駆細胞およびリンパ系前駆細胞の両方を生じさせることができる幹細胞であり、それら前駆細胞はさらに骨髄系細胞(例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など)およびリンパ系細胞(例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞)をそれぞれ生じさせることができる。ＨＳＣは、細胞表面マーカーのＣＤ３４の発現を特徴としており(例えば、ＣＤ３４+)、これをＨＳＣの特定および/または単離に使用することができ、細胞表面マーカーの不在は、細胞系統への傾倒に関連付けられる。一部の実施形態では、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。
一部の実施形態では、造血系細胞(例えば、ＨＳＣ)は、例えば哺乳動物対象などの対象から取得される。一部の実施形態では、哺乳動物対象は、非ヒト霊長類、齧歯類(例えば、マウスまたはラット)、ウシ、ブタ、ウマ、または家畜である。
一部の実施形態では、造血系細胞(例えば、ＨＳＣ)は、例えば造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍を有するヒト患者などのヒト患者から取得される。一部の実施形態では、造血系細胞(例えば、ＨＳＣ)は、健康なドナーから取得される。一部の実施形態では、造血系細胞(例えば、ＨＳＣ)は、その後にキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞が投与される対象から取得される。
ＨＳＣは、当分野で公知の慣習的手段を使用して、任意の適切な供給源から取得されてもよい。一部の実施形態では、ＨＳＣは、例えば骨髄サンプルまたは血液サンプルなど、対象に由来するサンプルから取得される。代替的に、またはさらに、ＨＳＣは、へその帯から取得されてもよい。一部の実施形態では、ＨＳＣは、骨髄または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)に由来する。概して骨髄細胞は、対象の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の髄腔から取得されてもよい。骨髄は、患者から採取されてもよく、当分野で公知の様々な分離手順および洗浄手順によって単離されてもよい。骨髄細胞の単離に関する手順例は、以下の工程を含む:ａ)骨髄サンプルの抽出、ｂ)骨髄懸濁液を三分割に遠心分離し、中間の画分またはバフィーコートを収集すること、ｃ)工程(ｂ)のバフィーコート画分を分離液、一般的にはFicoll(商標)中でもう一度遠心分離し、骨髄細胞を含有する中間の画分を収集すること、およびｄ)工程ｃ)から収集した画分を洗浄して、再輸血用骨髄細胞を回収すること。造血系幹細胞などの哺乳動物細胞を取得する方法は、例えば、PCT/US2016/057339に記載されており、当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
ＨＳＣは典型的には骨髄内に存在するが、末梢血からＨＳＣを採取するための動員作用剤を投与することによって循環血液内に動員させることができる。一部の実施形態では、ＨＳＣが取得される対象は、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ)などの動員作用剤が投与される。動員作用剤を使用して動員した後に収集されるＨＳＣの数は、典型的には、動員作用剤を使用せずに取得される細胞の数よりも多い。
一部の実施形態では、サンプルは、対象から取得され、次いで、所望の細胞型(例えば、ＣＤ３４+/ＣＤ３３-細胞)に濃縮される。例えば、ＰＢＭＣおよび/またはＣＤ３４+造血系細胞は、本明細書に記載されるように血液から単離することができる。また細胞は、例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体を用いて単離および/または活性化することによって、他の細胞から単離することもできる。使用され得る別の方法例は、細胞表面マーカーに対する抗体を使用して、受容体の係合によって細胞を活性化することなく特定の細胞型を選択的に濃縮するネガティブ選択を含む。
標的抗原(すなわち、ＣＤ３３)を欠損するようにＨＳＣを遺伝子操作する前、または後に、ＨＳＣ集団を拡張させてもよい。細胞は、例えば、幹細胞因子(ＳＣＦ)、Ｆｌｔ-３リガンド(ＦＬｔ３Ｌ)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、インターロイキン３(ＩＬ-３)、またはインターロイキン６(ＩＬ-６)など、一つ以上のサイトカインを含む拡張培地を含む条件下で培養されてもよい。細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２５日間、または任意の必要な期間、拡張されてもよい。一部の実施形態では、ＨＳＣは、対象から取得されたサンプルから所望の細胞群(例えば、ＣＤ３４+/ＣＤ３３-)の単離後、および遺伝子操作前に、拡張される。一部の実施形態では、ＨＳＣは、遺伝子操作された後に拡張され、それにより、遺伝子改変を受けて、系統特異的細胞表面抗原を欠損する細胞が選択的に拡張される。一部の実施形態では、遺伝子改変後に望ましい特性(例えば、表現型または遺伝子型)を有する細胞(クローン)またはいくつかの細胞が選択され、独立して拡張されてもよい。
一部の実施形態では、造血系細胞は、例えば、細胞表面系統特異的抗原などの標的抗原を欠損するよう遺伝子操作される。一部の実施形態では、造血系細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲの標的とされる抗原と同じ標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)を欠損するよう遺伝子操作される。一部の実施形態では、造血系細胞は、ＣＤ３３を欠損するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、造血系細胞は、ＣＤ３３のドメインを欠損するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、造血系細胞は、ＣＤ３３のＩｇＶドメインを欠損するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、造血系細胞は、ＣＤ３３のＩｇＣ２ドメインを欠損するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、造血系細胞は、ＣＤ３３の免疫グロブリンＣドメインを欠損するように遺伝子操作される。
本明細書で使用される場合、遺伝子操作された造血系細胞と同型の天然造血系細胞(例えば、ＣＤ３４などの同じ細胞表面マーカーの存在を特徴とする)と比較して標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現が大幅に低下している場合、当該造血系細胞は、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)を欠損しているとみなされる。一部の実施形態では、造血系細胞は、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現が検出できない。標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現レベルは、当分野に公知の任意の手段により分析され得る。例えば、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現レベルは、抗原特異的抗体を用いた抗原の検出(例えば、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング法)により、および/または当該抗原をコードする転写物のレベルを測定すること(例えば、ＲＴ-ｑＰＣＲ、マイクロアレイ)により、評価され得る。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血系細胞上の標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現は、天然の造血系細胞上の標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現と比較される。一部の実施形態では、遺伝子操作によって、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現レベルが、天然造血系細胞上の標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％まで低下する。
一部の実施形態では、造血系細胞は、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)をコードする内因性遺伝子全体が欠損している。一部の実施形態では、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)をコードする内因性遺伝子全体が欠失している。一部の実施形態では、造血系細胞は、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)をコードする内因性遺伝子の一部を含む。一部の実施形態では、造血系細胞は、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の一部(例えば、短縮型タンパク質)を発現する。他の実施形態では、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)をコードする内因性遺伝子の一部が欠失している。一部の実施形態では、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)をコードする遺伝子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、またはそれ以上が欠失している。
当業者に理解されるように、造血系細胞が抗原を欠損する(例えば、抗原の発現が大幅に低下する)ように、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)をコードするヌクレオチド配列の一部、または一つ以上の非コード配列が欠失していてもよい。
一部の実施形態では、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)は、ＣＤ３３である。予測されているＣＤ３３の構造には、ＩｇＶドメインとＩｇＣ２ドメインの二つの免疫グロブリンドメインが含まれる。一部の実施形態では、ＣＤ３３の免疫グロブリンＣドメインの一部が欠失される。
標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)を欠損するＨＳＣなど、任意の遺伝子操作造血系細胞は、通常の方法または本明細書に記載される方法により調製することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作は、ゲノム編集を使用して実施される。本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」とは、生物の任意のタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはコードしないヌクレオチド配列を含むゲノムを改変して、当該標的遺伝子の発現をノックアウトする方法を指す。概してゲノム編集法には、例えば、標的とするヌクレオチド配列でゲノムの核酸を切断することができるエンドヌクレアーゼの使用が伴う。ゲノム中の二本鎖切断の修復は、変異を導入して修復されてもよく、および/または外来性核酸が当該標的部位に挿入されてもよい。
概してゲノム編集法は、標的核酸中の二本鎖切断の生成に関与するエンドヌクレアーゼのタイプに基づいて分類される。これらの方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクチベーター様エフェクター系ヌクレアーゼ(TALEN:transcription activator-like effector-based nuclease)、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓシステムの使用が含まれる。本明細書に記載されるＨＳＣのゲノムを編集する方法は、例えば、WO 2017/066760に見出すことができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
併用療法
本明細書に記載される場合、本明細書に記載される細胞表面系統特異的抗原(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲ)に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、および/または医薬組成物は、抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原(すなわち、ＣＤ３３))を欠損する造血系細胞と組み合わされて対象に投与されてもよい。
一部の実施形態では、剤および/または造血系細胞は、薬学的に許容可能な担体と混合されて医薬組成物を形成してもよく、これもまた本開示の範囲内である。
本明細書に記載される方法を実施するために、本明細書に記載されるＣＤ３３を標的とするＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、および/または医薬組成物の有効量、および造血系細胞の有効量は、治療の必要のある対象に同時投与されてもよい。
本明細書に記載される場合、造血系細胞、および/またはキメラ抗原受容体を発現する細胞(例えば、免疫細胞)は、対象に対して自家であってもよい。すなわち、細胞は、治療の必要のある対象から取得され、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現が欠損するように遺伝子操作されて、またはキメラ抗原受容体構築物を発現するよう遺伝子操作されて、その後、同対象に投与される。対象に自家細胞を投与することによって、自家ではない細胞を投与する場合と比較して、宿主細胞の拒絶が減少する。あるいは、造血系細胞、および/またはキメラ抗原受容体を発現する細胞(例えば、免疫細胞)は、対象に対して同種であってもよい。すなわち、細胞は、第一の対象から取得され、標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原)の発現が欠損するように遺伝子操作されて、またはキメラ抗原受容体構築物を発現するよう遺伝子操作されて、同種であるが第一の対象とは異なる第二の対象に投与される。例えば、同種の免疫細胞は、ヒトドナー(例えば、健康なドナー)に由来してもよく、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する細胞(例えば、免疫細胞)、および/または造血系細胞は、同種の細胞であり、移植片対宿主病が減少するようにさらに遺伝子操作される。例えば、本明細書に記載される場合、造血系幹細胞は、ＣＤ４５ＲＡの発現が減少するように(例えば、ゲノム編集を使用して)遺伝子操作されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のいずれかを発現する細胞(例えば、免疫細胞)は、標的細胞(例えば、がん細胞、悪性細胞)の数が、少なくとも２０％、例えば、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上減少するのに有効な量で、対象に投与される。
哺乳動物(例えば、ヒト)に投与される細胞、すなわち本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかを発現する細胞(例えば、免疫細胞)、または造血系細胞の典型的な量は、例えば、１００万～１，０００億個の細胞の範囲内であってもよいが、この例示的な範囲を下回る、または上回る量も、本開示の範囲内である。例えば、細胞の１日用量は、約１００万～約５００億個の細胞(例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、または前述の値のいずれか二つにより規定される範囲)、好ましくは約１０００万～約１０００億個の細胞(例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、または前述の値のいずれか二つにより規定される範囲)、より好ましくは、約１億個の細胞～約５００億個の細胞(例えば、約１億２０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞、または前述の値のいずれか二つにより規定される範囲)であってもよい。
一部の実施形態では、キメラ受容体(例えば、キメラ受容体をコードする核酸)は、細胞(例えば、免疫細胞)に導入され、対象(例えば、ヒト患者)は、キメラ抗原受容体を発現する細胞の初回投与または初回用量を受ける。キメラ抗原受容体を発現する細胞のその後の一回以上の投与は、前回の投与から１５日後、１４日後、１３日後、１２日後、１１日後、１０日後、９日後、８日後、７日後、６日後、５日後、４日後、３日後、または２日後の間隔で患者に提供されてもよい。キメラ抗原受容体を発現する細胞の複数回の用量を、１週間当たり、例えば、２、３、４回、またはそれ以上の細胞投与で、対象に投与されてもよい。対象は、１週間当たり複数回の用量の細胞(例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞)を投与されてもよく、続いて１週間は細胞投与を行わず、続いて最後に一回以上の追加的用量の細胞を投与されてもよい(例えば、１週間当たり、キメラ受容体を発現する免疫細胞を複数回投与)。キメラ抗原受容体を発現する細胞(例えば、免疫細胞)は、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、またはそれ以上の期間、１週間当たり３回の投与を１日おきに投与されてもよい。
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ３３を標的とするＣＡＲを発現する細胞(例えば、免疫細胞)、および抗原(例えば、ＣＤ３３)を欠損する造血系細胞群の投与を伴う。したがって、かかる治療法において、ＣＡＲは、標的抗原を発現する標的細胞を認識(結合)し、標的化殺傷を行う。標的抗原に欠損している造血系細胞によって、細胞/ＣＡＲによって標的とされる細胞型が再増殖され得る。一部の実施形態では、患者の治療には以下の工程が含まれ得る:(１)ＣＤ３３を標的とするＣＡＲを発現する細胞(例えば、免疫細胞)の治療有効量を患者に投与すること、および(２)自家または同種である造血系幹細胞を患者に注入または再注入することであって、造血系細胞は、標的抗原の発現が低下していること。一部の実施形態では、患者の治療には以下の工程が含まれ得る:(１)キメラ抗原受容体を発現する細胞(例えば、免疫細胞)の治療有効量を患者に投与することであって、当該細胞は、細胞表面系統特異的である、疾患関連抗原(すなわち、ＣＤ３３)に結合するキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むこと、および(２)自家または同種である造血系細胞(例えば、造血系幹細胞)を患者に注入または再注入することであって、当該造血系細胞は、系統特異的な疾患関連抗原(すなわち、ＣＤ３３)の発現が低下していること。
本明細書に記載される前述のいずれかの抗原を含む、ＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物と、標的抗原が欠損した造血系細胞群を使用した治療方法の有効性は、当分野に公知の任意の方法により評価されてもよく、熟練した医学分野の専門家には明白である。例えば、治療法の有効性は、対象の生存、または対象もしくは組織またはそのサンプル中のがんの量によって評価されてもよい。一部の実施形態では、治療法の有効性は、細胞の特定の集団または系統に属する細胞の数を定量化することによって評価される。一部の実施形態では、治療法の有効性は、標的抗原を提示する細胞の数を定量化することによって評価される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲ、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物、および造血系細胞群が同時に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物が投与され、その後に造血系細胞が投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物は、造血系細胞の投与から少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれ以上前に投与される。
一部の実施形態では、造血系細胞は、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物の前に投与される。一部の実施形態では、造血系細胞群は、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物の投与から少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれ以上前に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物、および造血系細胞群が実質的に同時に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物が投与され、患者が期間について評価され、造血系細胞群が投与され、患者が期間について評価され、その後、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物が投与される。
また、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物、および/または造血系細胞群の複数回の投与(例えば、用量)も本開示の範囲内である。一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物、および/または造血系細胞群が、対象に一回投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物、および/または造血系細胞群が、対象に複数回(例えば、少なくとも２、３、４、５回、またはそれ以上の回数)投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される前述のいずれかを含むＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、ＣＡＲのいずれかを発現する細胞、または医薬組成物、および/または造血系細胞群が、一定間隔、例えば６か月ごとに対象に投与される。
一部の実施形態では、対象は、造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍を有するヒト対象である。一部の実施形態では、対象は、造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍と診断されているヒト対象である。本明細書で使用される場合、造血器の悪性腫瘍とは、造血系細胞(例えば、前駆細胞および幹細胞を含む、血液細胞)を伴う悪性の異常性を指す。造血器の悪性腫瘍および/または前悪性腫瘍の例としては限定されないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫が挙げられる。白血病には、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ球性白血病が含まれる。一部の実施形態では、造血器の悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)である。一部の実施形態では、造血器の悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)である。
治療用キット
また標的抗原(例えば、細胞表面系統特異的抗原(例えば、ＣＤ３３))を欠損している造血系細胞群と組み合わされた、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、および/またはＣＡＲのいずれかを発現する細胞の使用のためのキットも本開示の範囲内である。かかるキットには、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか、核酸、ベクター、および/またはＣＡＲのいずれかを発現する細胞、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む第一の医薬組成物、ならびに標的抗原(すなわち、ＣＤ３３)またはその一部を欠損する造血系細胞群および薬学的に許容可能な担体を含む第二の医薬組成物を含む一つ以上の容器を含んでもよい。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のための説明書を含み得る。含まれる説明書は、対象において意図される活性を実現するために、第一の医薬組成物および第二の医薬組成物を対象に投与することに関する説明を含み得る。キットは、対象が当該治療を必要とするかどうかの識別に基づいて、治療に適した対象を選択することに関する記載をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、説明書は、当該治療を必要とする対象に、第一および第二の医薬組成物を投与することに関する記載を含む。
本明細書に記載されるＣＡＲ、核酸、ベクター、および/またはＣＡＲのいずれかを発現する細胞、ならびに本明細書に記載される第一および第二の医薬組成物の使用に関する説明書は概して、意図される治療に対する用量、投与スケジュール、および投与経路についての情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ(例えば、複数用量パッケージ)またはサブユニット用量であってもよい。本開示のキットにおいて供給される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書に書面で記述された説明書である。ラベルまたは添付文書は、当該医薬組成物が、対象における疾患または障害を治療する、発症を遅延させる、および/または緩和するために使用されることを示す。
本明細書に提供されるキットは、適切なパッケージ内にある。適切なパッケージとしては限定されないが、バイアル、ボトル、瓶、柔軟性のある包装などが挙げられる。また例えば吸入器、鼻腔投与用デバイス、または点滴装置などの特定のデバイスと組み合わせて用いられるパッケージも予期される。キットには、滅菌アクセスポートがあってもよい(例えば、容器は、皮下注射用針により穿刺可能なストッパーを伴う静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい)。また容器は、滅菌アクセスポートを有してもよい。医薬組成物中の少なくとも一つの活性剤は、本明細書に記載されるキメラ受容体バリアントである。
キットは任意で、例えば緩衝剤および解説情報などの追加の構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上の、もしくは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書を含む。一部の実施形態では、本開示は、上述のキットの内容物を含む製造品を提供する。
ＮＦＡＴ応答レポーターシステム
本開示の態様は、例えば、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)、およびＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化を評価するために使用され得る、minimal nuclear factor of activated T cells(ＮＦＡＴ)応答性プロモーターを含む核酸構築物に関する。ＣＡＲの活性化は細胞内経路で開始され、Ｔ細胞の活性化と、Ｔ細胞のエフェクター機能が発生する。これにはＮＦＡＴシグナル伝達と遺伝子の発現が含まれる(例えば、Hogan,Cell Calcium.(2017)63:66-9を参照のこと)。本明細書で使用される場合、「ＮＦＡＴ応答性プロモーター」という用語は、ＮＦＡＴにシグナル伝達によって活性化されるプロモーター領域を指し、活性化された際にＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に連結されている遺伝子の発現を促進する。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に連結された(制御下にある)遺伝子は、レポーター分子をコードする。
Nuclear factor of activated T-cells(ＮＦＡＴ)は、転写因子のファミリーであり、インターロイキン-２の制御(ＩＬ-２発現)ならびにＴ細胞の分化および自己寛容を含む免疫応答の制御に関与するＮＦＡＴ１-ＮＦＡＴ-５が含まれる。例えば、Macian Nat.Rev.Immunol.(2005)5:472-484を参照のこと。ＮＦＡＴ転写因子には、細胞質Ｒｅｌドメインタンパク質(ＮＦＡＴファミリーのメンバー)と、様々な転写因子を含む核成分の二つの成分が含まれる(Chow,Molecular and Cellular Biology,1999;19(3):2300-7)。ＮＦＡＴ１およびＮＦＡＴ２は主にＩＬ-２を産生する末梢Ｔ細胞で発現されており、ＮＦＡＴ結合部位は一般的に例えばＩＬ-２などのＮＦＡＴ制御下遺伝子の上流(５')に見出される。例えば、Chow,Molecular and Cellular Biology,(1999)19(3):2300-7;Rooney et al.,Molecular and Cellular Biology,(1995)15(11):6299-310;およびShaw et al.,Journal of Immunology,(2010)185(9):4972-5を参照のこと。当該文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
当業者であれば理解されるように、真核細胞において、遺伝子に動作可能に連結されたプロモーターは通常、当該遺伝子(コード配列)の転写開始部位に隣接し、５'側にあるコアプロモーターを含む。コアプロモーターのさらに上流(５')は、例えば転写因子結合部位などのシス調節性の領域であり得る。
一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、複数のＮＦＡＴ結合部位を含む。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のＮＦＡＴ結合部位を含む。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、６個のＮＦＡＴ結合部位を含む。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターの各ＮＦＡＴ結合部位は、同じＮＦＡＴ結合部位であってもよく(例えば、同タイプのＮＦＡＴ転写因子に結合する)、または異なるＮＦＡＴ結合部位であってもよい(例えば、異なるタイプのＮＦＡＴ転写因子に結合する)。一部の実施形態では、各ＮＦＡＴ結合部位は、同じヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ結合部位は、異なるヌクレオチド配列を含む。
ＮＦＡＴ結合部位の例は、配列番号８４に示されるヌクレオチド配列により提供される。
５'-ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴ-３'(配列番号８４)。
一部の実施形態では、ＮＦＡＴ結合部位のうちの少なくとも一つは、配列番号８４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、各ＮＦＡＴ結合部位は、配列番号８４のヌクレオチド配列を含む。
各ＮＦＡＴ結合部位は、互いに隣接して配置される(例えば、ＮＦＡＴ結合部位の間に追加のヌクレオチドを全く挟まず、直列に配置される)。あるいは、一つ以上の追加のヌクレオチドが、ＮＦＡＴ結合部位の二つ以上の間に存在してもよい。
一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、ＩＬ-２プロモーター、またはその一部を含む。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、最小ＩＬ-２プロモーターを含む。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、コアＩＬ-２プロモーターを含む。概して天然のＩＬ-２プロモーターは比較的コンパクトであり、ＴＡＴＡボックスと上流制御領域を含むコアプロモーターを含む。コアプロモーターは、転写開始部位のおよそ-４０および+４０ヌクレオチド(例えば、４０ヌクレオチド上流(５')～４０ヌクレオチド下流(３'))以内の領域とみなされる。例えば、Weaver et al.Mol.Immunol.(2007)44(11)2813-2819を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「最小ＩＬ-２プロモーター」という用語は、転写に必要とするＩＬ-２プロモーターの最小限の部分を指す。一部の実施形態では、最小ＩＬ-２プロモーターは、ＩＬ-２コアプロモーターである。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含むコアＩＬ-２プロモーターを含む。ＴＡＴＡボックス(Goldberg-Hognessボックスとも呼称される)は、転写開始部位の上流に見出されるＴ/Ａリッチ配列である(Shi&Zhou,BMC Bioinformatics(2006)7,Article number S2)。一部の実施形態では、ＴＡＴＡボックスは、コンセンサス配列の５'-ＴＡＴＡ(Ａ/Ｔ)Ａ(Ａ/Ｔ)-３'を含む。ＴＡＴＡボックスは、遺伝子転写のためのプレ開始複合体の形成に関与し、ＴＡＴＡ結合タンパク質(ＴＢＰ)に結合すると考えられている。
一部の実施形態では、最小ＩＬ-２プロモーターは、配列番号８５のヌクレオチド配列を含む。
最小ＩＬ-２プロモーターの例は、配列番号８５により示されるヌクレオチド配列によって提供される。
５'-ＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡ-３'(配列番号８５)。
一部の実施形態では、ＮＦＡＴ結合部位は、最小ＩＬ-２プロモーターの５'側(上流)に位置する。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ結合部位は、最小ＩＬ-２プロモーターの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチド、またはそれ以上に５'側(上流)に位置する。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、最後のＮＦＡＴ結合部位と最小ＩＬ-２プロモーターの間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチド、またはそれ以上を含む。
最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターのヌクレオチド配列の例は、配列番号８６によって提供される。一部の実施形態では、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号８６のヌクレオチド配列を含み、からなり、または実質的にからなり、または配列番号８６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、からなり、または本質的にからなる。
６個のＮＦＡＴ結合部位を含む最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターのヌクレオチド配列の例(配列番号８６)。
５'-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGATCTAGACTTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTCCA-３'(配列番号８６)。
本明細書に記載されるＩＬ-２レポーターシステムをコードする核酸構築物のいずれかは、構造的プロモーター(構造的に活性なプロモーターとも呼称される)に動作可能に連結された(制御下にある)第二のレポーター分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。好ましくは、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に連結されたレポーター分子は、構造的に活性なプロモーターに動作可能に連結された第二のレポーター分子とは異なり、それによって、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に連結されたレポーター分子の検出は、ＮＦＡＴ応答性プロモーターの活性を示すものであり、構造的に活性なプロモーターに動作可能に連結されたレポーター分子の検出は、構造的に活性なプロモーターの活性を示すものである。
一部の実施形態では、構造的プロモーターは、第二のレポーター分子の発現を制御しており、「参照プロモーター」とも呼称される。構造的に活性なプロモーターの例としては限定されないが、ＥＦ-１アルファ(ＥＦ１ａ)、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＵＡＳプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、およびＵ６プロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、構造的に活性プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターである。
伸長因子１アルファ(ＥＦ-１アルファ:elongation factor 1 alpha)プロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号８７のヌクレオチド配列によって提供される。
ＥＦ１アルファプロモーター(配列番号８７)
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
本明細書に記載される核酸構築物は、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に連結された(制御下にある)レポーター分子を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、構造的に活性なプロモーターに動作可能に連結された(制御下にある)第二のレポーター分子を含む。任意の適切なレポーター分子を、本明細書に記載される核酸構築物に使用してもよい。レポーター分子(レポータータンパク質)は、発現した際に容易に(直接的または間接的に)検出可能であることが好ましい。一部の実施形態では、レポーター分子は、スクリーニング可能なマーカーとも呼称される場合もある。レポーター分子の例としては限定されないが、酵素、例えば、β-グルクロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、およびチロシナーゼ；ルシフェラーゼ；蛍光マーカー/蛍光タンパク質が挙げられる。蛍光タンパク質としては限定されないが、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)、ＥＢＦＰ、シアン蛍光タンパク質、ＥＣＦＰ、ＥＧ蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、mWasabi、ＺｓＧｒｅｅｎ、黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)、ZsYellow、mHoneydew、mApple、mRuby、mBanana、mOrange、mCherry、mCerulean、mTurquoise、mTangerine、mStrawberry、mGrape、mRaspberry、およびmPlumが挙げられる。例えば蛍光タンパク質など、好適なレポーター分子の選択は、レポーター分子を検出する手段および/または定量するための手段などの要因に依存し得る。
本明細書に記載される核酸構築物は、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に連結された(制御下にある)レポーター分子を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、構造的に活性なプロモーターに動作可能に連結された(制御下にある)第二のレポーター分子を含む。任意の適切なレポーター分子を、本明細書に記載される核酸構築物に使用してもよい。レポーター分子(レポータータンパク質)は、発現した際に容易に(直接的または間接的に)検出可能であることが好ましい。一部の実施形態では、レポーター分子は、スクリーニング可能なマーカーとも呼称される場合もある。レポーター分子の例としては限定されないが、酵素、例えば、β-グルクロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、およびチロシナーゼ；ルシフェラーゼ；蛍光マーカー/蛍光タンパク質が挙げられる。蛍光タンパク質としては限定されないが、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)、ＥＢＦＰ、シアン蛍光タンパク質、ＥＣＦＰ、ＥＧ蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、mWasabi、ZsGreen、黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)、ZsYellow、mHoneydew、mApple、mRuby、mBanana、mOrange、mCherry、mCerulean、mTurquoise、mTanerine、mStrawberry、mGrape、mRaspberry、およびmPlumが挙げられる。例えば蛍光タンパク質など、好適なレポーター分子の選択は、レポーター分子を検出する手段および/または定量するための手段などの要因に依存し得る。
一部の実施形態では、レポーター分子は、蛍光タンパク質である。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に結合されたレポーター分子は、蛍光タンパク質である。一部の実施形態では、蛍光タンパク質は、mTurquoiseまたはmOrangeである。
mTurquoiseをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８８に示されている。
mTurquoise(配列番号８８)。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGTCCTGGGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACTTTAGCGACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
mOrangeをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８９に示されている。
mOrange(配列番号８９)
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCTTTCAGACCGCTAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCATTTCACCTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTCAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTACGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGTGCCCTGAAGGGCAAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTCCGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACATCGTCGACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
一般的技術
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技能範囲内にある分子生物学(組み換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を採用する。かかる技術は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1989)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.1993-8)J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.):Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987;Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,et al.,eds.1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:a practice approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000);Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.Harwood Academic Publishers,1995);DNA Cloning:A practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985);Transcription and Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984);Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,(1986);およびB.Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel et al.(eds.)などの文献中にすべて説明されている。
更なる詳述することなく、当業者であれば、上記の記述内容に基づき、本開示をその最大限まで利用し得ると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は単に例示として解釈されるべきであり、いかなる場合であっても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書に引用される全ての公開文献は、本明細書に参照される目的または主題に対し、参照により援用される。
実施例１:ＣＡＲ構築物の作製と評価
ＣＡＲ構築物
ＣＡＲ構築物は、ＣＤ８ａまたはＣＤ２８の膜貫通ドメインのいずれかと連結され、４-１ＢＢまたはＣＤ２８の共刺激性ドメインのいずれか、およびＣＤ３ζ(ゼータ)シグナル伝達ドメインと対形成された、ＣＤ３３特異的な一本鎖断片可変配列(ｓｃＦｖ)、または単一ドメイン抗体断片(ｓｄＡｂ)を用いて開発される。ＣＡＲ配列を、第三世代のレンチウイルスプラスミド中でクローニングした。ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物のｓｃＦｖまたはｓｄＡｂは、以下から誘導された:
リンツズマブ(Lintuzumab)(Hul95、SGN-33)(Co et al.,J.Immunol.(1992),148:1149-54(1992))Ｍ１９５、これは、リンツズマブの非ヒト化型である。
ＣＤ３３Ｍｙｌｏ(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin)、商標名:Mylotarg、企業:Wyeth社、ヒト化ｍＡｂ/カリケアミシン、ＣＤ３３；米国特許第5,739,116号;Cowan et al.,Front Biosci(Landmark Ed)(2013),18:1311-34)。また場合によっては、「ｈＰ６７．６」としても記載される。
Ｍ９．６結合ドメイン。Ｍ９．６の抗原結合ドメインを使用した三種の構成を評価し、および以下を含有した:
(ｉ)ＶＨ-ＣＤＲ３:ＬＧＧＳＬＰＤＹＧＭＤＶ(配列番号２７)
(ｉｉ)ＶＨ-ＣＤＲ３:ＲＧＧＹＳＤＹＤＹＹＦＤＦ(配列番号３１)
(ｉｉｉ)ＶＬ-ＶＨの方向性(交換型)
Ｍ２Ｈ１２結合ドメイン(ｓｃＦｖ)
ＤＲＢ２結合ドメイン(ｓｃＦｖ)
ＶＨのみのバインダーであるＣＡＲ３３ＶＨ
生成された以下のＣＡＲ構築物は、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、および５７のアミノ酸配列中に示され、ならびに配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３および５６に示される核酸配列によりコードされる。
これらのＣＡＲを、レンチウイルスベクター骨格にサブクローニングした。すべての制限酵素は、New England Biolabs社(米国、マサチューセッツ州イプスウィッチ)から購入した。すべてのＣＡＲ構築物の配列を、Ｍａｃｒｏｇｅｎ(米国、メリーランド州ロックビル)で配列解析を行うことにより確認した。生成された各構築物の完全なベクター配列は、配列番号１１、１４、１７、２０、２３、２６、３０、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、および５８に示される。
細胞株
ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現するＡＭＬ細胞株のＭＶ４１１、ＴＨＰ１、およびＭＯＬＭ１４は、様々なレベルのＣＤ３３発現、およびエクソン２スプライスバリアントに関して異なる遺伝子型(Laszlo et al.,Oncotarget,7:43281-94(2016))を含んでおり、これを使用して、上述のＣＡＲ構築物の有効性を試験する。ＤＮＡを単離することによって、ＭＯＬＭ１４はＣＣ遺伝子型を有し、ＳＮＰを含まないこと、一方でＴＥ１Ｐ１およびＭＶ４１１は両方とも、ＣＴ遺伝子型でＳＮＰに関してヘテロ接合性であることが判明した(Lamba et al.,J.Clin.Oncol.,35:2674-82(2017))。この細胞株は、ＣＤ３３もＣＤ１２３も発現しない。ＭＶ４１１は、急性単球性白血病(ＡＭＬ ＦＡＢ Ｍ５)を有する１０歳の男児から確立された急性単球性白血病株である。ＭＯＬＭ１４は、初期の骨髄異形成症候群(ＭＤＳ、過剰な芽球を伴う難治性貧血、ＲＡＥＢ(refractory anemia with excess of blasts))後の１９９５年に再発した、急性骨髄性白血病ＡＭＬ ＦＡＢ Ｍ５ａを有する２０歳の男性の末梢血から確立された急性骨髄性白血病株である。ＴＨＰ-１は、急性単球性白血病患者から誘導されたヒト単球の細胞株である。Ｋ５６２は、５３歳の女性の慢性骨髄性白血病患者から確立され、誘導されたヒト赤白血病株である。
ＣＡＲ Ｔ細胞の作製
ＣＤ３３ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、Ｌｅｎｔｉ-Ｘ ２９３Ｔレンチパッケージング細胞株のＬｅｎｔｉ-Ｘ ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより作製し、ポリ-Ｄリジンでコーティングされた１５ｃｍプレート(BD Biosciences社、米国カリフォルニア州サンノゼ)に播種した。翌日、Ｌｅｎｔｉ-Ｘ ２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン３０００(Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を使用し、パッケージングベクターおよびエンベロープベクター(ｐＭＤＬｇ/ｐＲＲＥ、ｐＭＤ-２Ｇ、およびｐＲＳＶ-Ｒｅｖ)とともに、ＣＡＲをコードするプラスミドでトランスフェクトされた。レンチウイルスの上清をトランスフェクションから２４時間後および４８時間後に回収し、３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去して、ドライアイス上で凍結させ、-８０℃で保存した。正常なドナーからのヒトＰＢＭＣを、ＮＩＨの承認を受けたプロトコルを用いて取得し、４０ＩＵ/ｍＬの組換えＩＬ-２および５％ＦＢＳを含むＡＩＭ-Ｖ培地中、１:３の比率のＣＤ３/ＣＤ２８マイクロビーズ(Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28、Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号１１１４１Ｄ)を用いて２４時間活性化した。活性化されたＴ細胞を、２ｍＬのレンチウイルス上清に加えて、１０ｍｃｇ/ｍＬの硫酸プロタミンおよび１００ＩＵ/ｍＬ ＩＬ-２を含む１ｍＬの新鮮なＡＩＭ-Ｖ培地当たり、２００万個の細胞で、６ウェルプレート中で再懸濁する。プレートを３２℃で２時間、１０００×ｇで遠心分離し、３７℃で一晩インキュベートした。第二の形質導入は、翌日、上述と同じ形質導入手順を繰り返すことにより行われる。形質導入から３日後にＣＤ３/ＣＤ２８ビーズを除去し、１００ＩＵ/ｍＬのＩＬ２を含有するＡＩＭ-Ｖ中で、３００，０００細胞/ｍＬで細胞を培養し、８日目または９日目の回収まで２～３日毎に新鮮なＩＬ２含有培地を追加した。
フローサイトメトリー
ＣＤ３３ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の表面発現は、protein-L(Themo Fisher社)またはビオチン化ヒトＳｉｇｌｅｃ-３/ＣＤ３３タンパク質(Aero Biosystems社、米国デラウェア州ニューアーク)を使用し、続いてストレプトアビジン-ＰＥ(BioLegend社、米国カリフォルニア州サンディエゴ)を用いたインキュベーションを行うことによりフローサイトメトリーで決定された。
ＰＤＸ
ＣＡＲ Ｔ細胞の要旨免疫伝達の１週間前に、１００万個のＰＤＸ白血病細胞株ＪＭＭ１１７の細胞をＮＳＧマウスに注射する。０日目にＣＡＲ Ｔ細胞を用いてマウスを処置する。２週間後、マウスを剖検し、分析を実施する。
細胞傷害性アッセイ
１００μｌのＲＰＭＩ培地中の５Ｅ４の標的腫瘍細胞を、９６ウェルプレート(Corning(登録商標)(Croning社、NY)BioCoat(商標)ポリ-Ｌ-リジン９６ウェル透明ＴＣ処理平底アッセイプレート)にローディングする。翌日、等量のＣＡＲ Ｔ細胞を指定されるウェルに追加する。最初のｉｎｃｕｃｙｔｅアポトーシスマーカー(Essen BioScience社、米国ミシガン州アナーバー)をｌ００μｌ ＰＢＳで希釈し、１μｌの希釈液を各ウェルに添加する。３０分ごとに４０時間にわたって、IncuCyte ZOOM(登録商標)システムを使用し、ＧＦＰおよび/またはＲＦＰの蛍光の発現についてプレートをスキャンし、細胞アポトーシスを監視する。各時点での細胞死滅の割合パーセントをベースライン補正する。
サイトカイン産生の分析
標的腫瘍細胞および形質導入されたＣＡＲ陽性Ｔ細胞を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、１Ｅ６/ｍＬでＲＰＭＩに再懸濁する。１００μＬのＣＡＲ陽性Ｔ細胞とともに１００μＬの腫瘍細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにローディングする。Ｔ細胞のみ、および腫瘍細胞のみの対照が設定される。全ての試験は二重または三重で実施する。細胞を３７℃で１８時間インキュベートし、１２０μＬの培養上清を回収してサイトカイン産生を検出する。上清中のサイトカインレベルを、ＥＬＩＳＡキット(R&D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス、ＥＩＳＡ)、またはマルチプレックスアッセイ(Meso Scale Discovery社、メリーランド州ロックビル、ＥＩＳＡ)のいずれかを使用して測定した。
生体エネルギー分析
解糖ストレス試験については、ＣＡＲ-Ｔ細胞を、Ｌ-グルタミン(２００ｍＭ)およびＮａＣｌ(１４３ｍＭ)を補充した無血清非緩衝ＤＭＥＭ培地(Sigma-Aldrich社、米国ミズーリ州セントルイス)中に懸濁する。０．６ｍＬの０．５％フェノールレッド溶液(ＳｉｇｍａＰ０２９０)を加えて最終濃度を３ｍｇ/Ｌとし、ｐＨを７．３５+/-０．０５に調整する。ＣＡＲ-Ｔ細胞をSeahorse細胞プレートに播種し(１ウェル当たり３Ｅ５細胞)、Cell-Tak(Corning社)でコーティングしてＴ細胞接着を促進する。簡潔に述べると、カートリッジは、アッセイの前日に水和される。アッセイ当日、プレートをCell-Takでコーティングし、Cell-Takコーティングされたプレートに細胞を播種して、ＸＦ２４分析器上において分析を行う。詳細な手順は以下のとおりである。最初に２００μＬ/ウェルのＸＦ較正溶液でアッセイカートリッジを水和し、ハイドロブースタを添加して、パラフィルムで包み、センサーカートリッジをユーティリティプレートの上において、ＣＯ２なしで一晩、３７℃でインキュベートする。次いで、細胞培養プレートを以下のようにCell-Takでコーティングする:１プレートにつき、４６ｍＬのCell-Takを、２０４ｍＬのＴＣ水および１ｍｌのＮａＨＣＯ３で希釈した。ミキサーを各ウェルに５０ｍＬ分注し、プレートを室温で少なくとも２０分間インキュベートする。Cell-Tak溶液を除去した後、２５０ｍＬのＴＣ水を使用して各ウェルを洗浄する。ＣＡＲ-Ｔ細胞(３Ｅ５/ウェル)を、１５８ｍＬのアッセイ培地中に播種する。次いで細胞培養プレートをゆっくりとした加速、減速なしで４５０ｒｐｍで１秒間スピンさせ、その後プレートの向きを逆にして、ゆっくりとした加速、減速なしで６５０ｒｐｍで１秒間スピンさせる。次いでプレートを２５～３０分間、３７℃、０％ ＣＯ２でインキュベートする。２５～３０分のインキュベーションの後、１５８μＬの温かいアッセイ培地を、手でＰ２００ピペッタを使用して壁の側面に沿って各ウェルの上部にゆっくりと穏やかに添加する。細胞プレートを１５～２５分間インキュベートする。１５～２５分後、プレートをＸＦ２４分析器に置く(キャリブレーション終了後)。ＸＦアッセイを実施する。溶液は、三つのポートを通して順次注入される:ポートＡ:グルコース８０ｍＭ(３ｍＬアッセイ培地中、９６ｍＬのストック溶液)。ポートＢ:オリゴマイシン１８ｍＭ(３ｍＬアッセイ培地中、１０．８ｍＬのストック溶液)。ポートＣ:２ＤＧは、ストック溶液を使用する。解糖ストレス試験は、カートリッジポートに７５ｍＬの薬剤溶液をローディングした後、定常状態でＥＣＡＲ(ｍｐＨ/分)を測定することによって実施する。ミトコンドリアストレス試験については、ＣＡＲ Ｔ細胞を、Ｄ-グルコース(２５ｍＭ)およびピルビン酸ナトリウム(１ｍＭ)を含む無血清非緩衝ＤＭＥＭ培地に懸濁する。ミトコンドリアストレス試験は、定常状態で、ならびにオリゴマイシン(０．５ｍＭ)、ＦＣＣＰ(０．５ｍＭ)、ロテノン(１ｍＭ)、およびアンチマイシンＡ(１ｍＭ)(Sigma-Aldrich社)を順次注入した後にＯＣＲ(ｐｍｏｌ/分)を測定することによって、上記と同様にミトコンドリアストレス試験を実施する。Ｓｅａｈｏｒｓｅシステムを用いた実験では、以下のアッセイ条件を利用する:２分間の混合物、２分間の待機、および３分間の測定。すべてのサンプルを、６回の反復で試験する。
蛍光顕微鏡による撮像および解析
ＭＯＬＭ１４(４×１０ｓ)腫瘍細胞を、１ｍＬの温かいＲＰＭＩ中、ibidi m-Dish 35mmのCell-takコーティングされた内部ウェルに播種し、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートする。次いで腫瘍細胞をヘキスト染料(２．５μｇ/ｍＬ)で染色する。Ｔ細胞を、ＣＡＲ-mCherry融合タンパク質を発現するように形質導入される。ＣＡＲ-Ｔ陽性細胞をソーティングし、次いで７．５Ｅ５のこれらのＣＡＲ-Ｔ細胞を、ディッシュ内の固定されたＭＯＬＭ１４細胞とともに１時間インキュベートする。続いて細胞を洗浄し、新たに調製された４％パラホルムアルデヒドで固定し、撮像用の調製として非硬化封入培地中に封入する。
免疫シナプスでのアクチン発現を評価するために、上記プロトコルを修正し、パラホルムアルデヒド固定後に０．１％triton xでサンプルを透過処理する。細胞をファロイジン６４０(１６５ｎＭ)で染色し、次いで洗浄して封入する。Airyscan画像は、Zeiss LSM 880を使用して取得される。露出設定は、実験全体で同じである。画像はｚ軸のスタックとして収集され、免疫シナプスの体積全体がカバーされる。
いくつかの画像は、６３ｘ対物レンズを備えたNikon Eclipse Ti2スピンディスク共焦点顕微鏡を使用して取得される。０．５ｕＭのｚ軸スタックは、３チャネル(４０５、４８８、６４０ｎｍ)に対し、焦点面の上および下の１０μＭの範囲にわたり並行して取得される。各チャネルは、それぞれ４０５、４８８、および６４０に対して、３００ｍｓ、ｌｓ、および３００ｍｓの露光時間で、５０％のレーザー強度で励起される。ImageJソフトウェアをデータ解析に使用する。
各ＣＡＲに対して、ｎ＞１０個の免疫シナプスについて定量的解析が行われ、ＣＡＲおよびアクチン蓄積が評価される。具体的には、シナプスでの平均蛍光強度(ＭＦＩ)の比率と、Ｔ細胞表面の残りの部分でのＭＦＩの比率を比較したものを判定する。追加パラメータには、ＩＳでのＭＦＰ体積と、Ｔ細胞表面の残りの部分のＭＦＩ＊体積の比率の比較、ＩＳのＭＦ体積とＴ細胞のＭＦＩ＊体積の比較が含まれ、細胞内ＣＡＲシグナルと細胞外ＣＡＲシグナルの比較も評価される。アクチンについては、ＩＳでの蛍光強度は、基準アクチンＴ細胞発現に対して正規化される。ＩＳでのアクチンのＭＦＰ体積を決定し、係合していないＴ細胞と腫瘍細胞のＭＦＩ＊体積を差し引いて、基準アクチン発現とする。
mCherryレポーター配列は、ＭＦＩ測定のために含まれる。
mCherryの配列は、以下である:
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG［配列番号５９］
インビボ実験
動物実験は、NCI Bethesda動物実験委員会により承認されたプロトコルに基づいて実施する。ＡＭＬ細胞株、および異種移植されたヒトＡＭＬの標本を、ＮＳＧマウスにＩＶ注射する。ルシフェラーゼ発現株については、白血病は、Xenogen IVIS Lumina(Caliper Life Sciences社、米国マサチューセッツ州ホプキントン)を使用して検出される。ＮＳＧは、３ｍｇ Ｄ-ルシフェリン(Caliper Life Sciences社)を腹腔内注射され、４分後にＡＭＬ細胞株について、１分間の露光時間で撮像される。Living Image Version 4.1ソフトウェア(Caliper Life Sciences社)を使用して、各マウスの生体発光シグナルフラックスを光子として分析する。剖検時に、マウスの骨髄、脾臓、および肝臓を採取して、フローサイトメトリーにより評価する。
統計解析
統計解析は、Prism 7.0ソフトウェアを使用して実施される。プロットは、平均+/-ＳＤとして表される。すべてのデータの統計的有意性は、対応のないスチューデントｔ検定を使用して計算される。ｐ＜０．０５は有意とみなされる。
実施例２:Ｔ細胞活性化レポーターシステムの確立
例示的な核酸構築物は、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターに動作可能に連結されたレポーター分子、および構造的プロモーター(例えば、ＥＦ１ａ)に動作可能に連結された第二のレポーター分子をコードするように設計された。最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスおよびレポーター分子のコード配列を含む最小ＩＬ-２プロモーターの上流に６個のＮＦＡＴ結合部位を含有した。核酸は、当分野に公知の従来法を使用して作製された。
第一の核酸構築物(EF1a_mOrange_IL-2_mTurq)は、構造的に活性なＥＦ１アルファプロモーターの制御下にあるmOrangeレポーター分子、および最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターの制御下にあるmTurquoiseレポーター分子(mTurq)を含有した。第二の核酸構築物(EF1a_mTurq_IL-2_mOrange)は、構造的に活性なＥＦ１アルファプロモーターの制御下にあるmTurquoiseレポーター分子、および最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターの制御下にあるmOrangeレポーター分子を含有した。
二つのＩＬ-２レポーター細胞株は、レンチウイルスベクターをJurkat細胞に形質導入することによって作製された。１ｘ１０６細胞/ｍＬを、２μＬのホルボールミリスタートアセテート(ＰＭＡ)およびイオノマイシン(Ｔ細胞活性化カクテル(例えば、BioLegend Activation Cocktailを参照のこと))を使用して２４時間活性化され、フローサイトメトリーを使用して各レポーター分子ならびにＴ細胞活性化の指標であるＣＤ６９の発現について評価した。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターの制御下にあるレポーター分子の発現は、細胞が活性化されなかった場合には最小限しか検出されず、ＰＭＡ/イオノマイシンで細胞が活性化された場合には有意に上昇した。対照的に、ＥＦ１ａ(構造的プロモーター)の制御下にあるレポーター分子の発現は、細胞活性化の有無にかかわらず検出された。最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターの制御下にあるレポーター分子の発現は、ＥＦ１ａ(構造的プロモーター)の制御下にあるレポーター分子の発現に対して正規化された。図１Ｃを参照のこと。
これらの結果から、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターは、活性化されたときにレポーター分子の発現を誘導することが示された。ＥＦ１ａ(構造的プロモーター)の制御下にあるレポーター分子の発現と比較した、最小ＮＦＡＴ応答性プロモーターの制御下にあるレポーター分子の発現によって、例えば、構築物間のなんらかの異なる形質導入効率などの要因を考慮して発現を正規化する手段が提供される。
実施例３:レポーターシステムを使用したＣＡＲ構築物の評価
表１および５に示すように、ＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３を標的とするように設計した。Ｓｉｇｌｅｃ(シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン:Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin)としても知られるＣＤ３３は、細胞-細胞間の相互作用を介在し、免疫細胞を休止状態に維持する役割を果たす。ＣＤ３３は、ＡＭＬ芽球の大部分の表面上、および急性転化期の慢性骨髄性白血病で発現される。また、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病のサブセット上でも異常発現される。正常な組織発現は、正常な骨髄細胞に限定される。現在のところ、ＣＤ３３を標的とする治療法を用いたＡＭＬ治療は効果的であるが、この治療法は正常な血液や骨髄に対する毒性があるため、有用性が制限される場合がある。本明細書に記載される方法は、例えば、ＣＡＲ構築物の活性および機能など、ＣＡＲ構築物の比較を可能とする方法であり、ならびに望ましい性能(例えば、Ｔ細胞の活性化レベル)を有するＣＡＲ構築物を特定するためのハイスループットスクリーニング法を可能にする方法である。ＣＡＲ構築物の例は、当分野に公知である。例えば、PCT国際出願公開WO 2019/178382 A1、ならびにKenderian,et al.Leukemia(2015)29:1637-1647を参照のこと。
例示的な核酸構築物であるEF1a_mOrange_IL-2_mTurqまたはEF1a_mTurq_IL-2_mOrangeを含むレポーター細胞を実施例２に記載されるように作製した。表１および５に示される８つの異なるＣＤ３３ ＣＡＲを用いて細胞を形質導入した。細胞を、野生型ＭＯＬＭ-１３細胞(ＣＤ３３+)、またはＣＤ３３を欠損しているＭＯＬＭ-１３細胞(ＭＯＬＭ-１３ ＣＤ３３ＫＯ)のいずれかとともに２４時間共培養した。
共培養後、レポーター分子の発現をフローサイトメトリーにより評価した。ＥＦ１ａプロモーターに連結された蛍光マーカーを呈するJurkat細胞に対して、細胞を予めゲーティングした。この細胞は、核酸構築物で形質導入され、当該構築物を発現する能力を有する細胞を示す。次に、ＩＬ２連結蛍光レポーターの発現を、構造的蛍光陽性細胞の割合パーセントとして、ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物のそれぞれに対し、各共培養物において判定した(例えば、EF1a_mOrange_IL-2_mTurqを形質導入された細胞では、mOrange陽性細胞の割合パーセントとしてmTurqの発現が判定された)。ＣＤ３３ ＣＡＲの活性を判定するために、ＭＯＬＭ-１３ ＣＤ３３ＫＯ細胞の存在下で共培養されたときのＮＦＡＴ誘導性レポーターの発現と比較した、野生型ＭＯＬＭ-１３細胞の存在下で共培養されたときのＮＦＡＴ誘導性レポーターの発現の比率を判定した(ＣＤ３３特異的活性化)。表２を参照のこと。
結果から、ＩＬ-２レポーターシステムは、ＣＡＲ構築物の活性比較について、客観的で信頼性のあるレポーターシステムとして使用できることが示される。構造的に発現されるレポーターシステムの発現を評価することで、潜在的な形質導入効率の変化を原因とする誤った結果を排除し、レポーター構築物の形質導入の成功が検証される。活性化細胞においてのみ誘導されるレポーター分子の発現は、ＣＡＲ構築物による抗原認識およびＣＡＲ構築物の活性を表すものである。
表１:試験されたＣＤ３３ ＣＡＲ構築物
表２:表１のＣＤ３３-ＣＡＲのＴ細胞活性化の結果
結果から、本開示の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ(ＣＤ３３ ＣＣＤ３３ ＣＡＲＣＤ３３ ＣＡＲ５～８)は、少なくとも一種の公知の抗ＣＤ３３ ＣＡＲよりも高いＴ細胞活性化の活性を示すことが示される。ＣＤ３３-ＣＡＲ５は、試験されたすべてのＣＤ３３ ＣＡＲのなかで最も高いＴ細胞活性化の活性を示した。これらの結果は、ＣＤ３３を発現するがんを標的化するＣＡＲ Ｔ治療法の構築において、本開示のＣＤ３３ ＣＡＲの可能性を実証するものである。
８個のＣＤ３３ ＣＡＲについてＴ細胞を活性化する程度を、ＮＦＡＴ誘導性蛍光の増加倍率(図２、表３のデータ)、およびＮＦＡＴ誘導性蛍光の絶対変化(ΔＦＰ２)(図３)を検証することによりさらに評価した。対照として、公知の共刺激性因子または共阻害性因子(ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、またはＣＤ２８に対するＶＨ/ＶＬ)をコードするレンチウイルスベクターを、予めEF1a_mOrange_IL-2_mTurq構築物またはEF1a_mTurq_IL-2_mOrange構築物が形質導入されたJurkat細胞に形質導入した。
表３:試験されたＣＡＲにおけるＦＰ２の増加倍率とデルタ増加


図２および図３の結果から、本開示のすべてのＣＤ３３-ＣＡＲ５～８が、ＣＡＲ-ＩＲＳアッセイにおいて、様々な程度までＴ細胞活性化の活性を示すことが示される。例えば、ＣＤ３３-ＣＡＲ５は、高いＦＰ２倍率増加を示した(図２)。このことから、試験された他のＣＡＲよりも高いＴ細胞活性化の活性が示唆される。
表４．実施例２におけるＣＡＲ構築物および対照の配列





本明細書に引用される公開文献、特許出願および特許を含むすべての参照文献は、各参照文献が個々に、および具体的に参照により本明細書に組み込まれることが示唆され、本明細書にその全体が記載されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に別段の示唆がない限り、または文脈から相反することが明白でないかぎり、本発明を記載する文脈において(特に以下の請求の範囲の文脈において)、「a」および「an」および「the」および「at least one(少なくとも一つ)」ならびに類似の指示対象の用語の使用は、単数および複数の両方を包含するとみなされる。本明細書に別段の示唆がない限り、または文脈から相反することが明白でないかぎり、一つ以上の項目に続く「少なくとも一つ」という用語(例えば、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一つ」)は、列記される項目から選択される一つの項目(ＡまたはＢ)または列記される項目のうちの二つ以上の任意の組み合わせ(Ａおよび)を意味すると解釈されるものとする。別段の記載がない限り、「備える」、「有する」、「含む」、および「含有する」という用語は、オープンエンドの用語と解釈されるものとする(すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する)。本明細書において別段の示唆が無い限り、本明細書において値の範囲の列挙は、当該範囲内にある個別の値のそれぞれを個々に言及するための簡潔表現法としての機能を果たすことが意図されているにすぎず、個別の値のそれぞれが、それらが個々に本明細書において列挙されているように本明細書内に組み込まれる。本明細書に別段の示唆が無い限り、または文脈から相反することが明白でないかぎり、本明細書に記載されるすべての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に提示される任意の、およびすべての例の使用、または例示的文言(「例えば」)は、本発明をより詳細に解説することを意図しているにすぎず、別段であることが請求されない限り、本発明範囲に対して限定を与えるものではない。本明細書において、任意の請求されていない要素を、本発明の実施に必須の要素と示唆するものと解釈されるべき文言はない。
本発明の実施を目的として、発明者に対して公知のベストモードを含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記述される。それら好ましい実施形態の変更例は、前述の記載を読むことで、当業者には明白なものとなるであろう。本発明者らは、当業者がかかる変更例を適宜採用することを期待し、そして本発明者らは、本明細書に具体的に記述されるもの以外で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法により許容される、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変および均等を含む。さらに、本明細書に別段の示唆がない限り、または文脈から相反することが明白でない限り、すべての可能性のある変更例において、上述の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
均等
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等を認識し、または日常的な実験を超えることなく確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されておらず、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

Claims (39)

  1. キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子であって、前記ＣＡＲが、ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
    前記コードされるＣＤ３３結合ドメインは、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含み、
    前記コードされる膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａまたはＣＤ２８から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含み、および
    前記コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインを含む、単離核酸分子。
  2. 前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域がリンカーによって結合される、請求項１に記載の単離核酸分子。
  3. 前記コードされるＣＤ３３結合ドメインが、一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、ｄｓＦｖ、ダイアボディまたはトリアボディを含む、請求項１または請求項２に記載の単離核酸分子。
  4. 前記コードされるＣＤ３３結合ドメインが、ヒンジ領域によって前記膜貫通ドメインに接続される、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
  5. 前記コードされるヒンジ領域が、ＣＤ８ａ、ＩｇＧ４またはＣＤ２８から選択されるタンパク質のヒンジ領域を含む、請求項４に記載の単離核酸分子。
  6. 前記コードされるＣＡＲが、一つ以上の共刺激性ドメインをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
  7. 前記一つ以上の共刺激性ドメインが、４-１ＢＢおよび/またはＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項９に記載の単離核酸分子。
  8. 前記単離される核酸配列が、プロモーター配列をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
  9. 前記プロモーター配列が、ＳＦＦＶ(サイレンシングしやすい傾向のある脾臓フォーカス形成ウイルス(spleen focus forming virus))プロモーター配列またはＥＦ１αプロモーター配列である、請求項８に記載の単離核酸分子。
  10. 前記コードされるＣＡＲが、
    (ｉ)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、および６０～９２のいずれか一つのアミノ酸配列、または
    (ii)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、および６０～９２のいずれか一つに対して９５～９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
  11. 前記核酸分子が、
    (ｉ)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、および５６のいずれか一つから選択されるヌクレオチド配列、または
    (ｉｉ)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、および５６のいずれか一つに対して９５～９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現ベクター。
  13. 前記ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項１２に記載の発現ベクター。
  14. 前記発現ベクターが、
    (ｉ)配列番号１１、１４、１７、２０、２３、２６、３０、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、および５８のいずれか一つから選択されるヌクレオチド配列、または
    (ii)配列番号１１、１４、１７、２０、２３、２６、３０、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、および５８のいずれか一つに対して、９５～９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項１２または請求項１３に記載の発現ベクター。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、免疫エフェクター細胞。
  16. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、およびリンパ系細胞が分化され得る多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の免疫エフェクター細胞。
  17. 請求項１５または請求項１６に記載の免疫エフェクター細胞を少なくとも一つ含む細胞群。
  18. 請求項１７に記載の細胞群、および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  19. 造血器の悪性腫瘍を治療する方法であって、ＣＤ３３を標的とする剤の有効量をその必要のある対象に投与することを含み、前記剤が、キメラ受容体(ＣＡＲ)を発現する免疫細胞であり、前記ＣＡＲが、
    重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む、ＣＤ３３に結合する抗原結合ドメイン、
    ＣＤ８ａまたはＣＤ２８から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、および
    ＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、を含む、方法。
  20. 前記方法は、造血系細胞群を投与することをさらに含み、前記造血系細胞は遺伝子操作されており、それにより、前記抗原結合ドメインにより標的とされるＣＤ３３コード遺伝子は、ＣＤ３３の発現が低下するように、または消失するように操作されている、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記免疫細胞、前記造血系細胞、またはその両方は、同種または自家である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記造血系細胞が、造血系幹細胞である、請求項２０または２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記造血系幹細胞は、骨髄細胞または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)に由来する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記造血系幹細胞が、ＣＤ３４+/ＣＤ３３-である、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
  25. 前記造血系細胞は、ＣＤ３３の発現が低下または消失するように、ＣＤ３３をコードする内因性遺伝子を編集することによって調製される、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記内因性遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９によって編集される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記対象は、悪性細胞または前悪性細胞でのＣＤ３３の発現を特徴とする造血器の悪性腫瘍または前悪性腫瘍と診断されたか、または診断されている、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記対象が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有する、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記白血病が、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、およびリンパ系細胞が分化され得る多能性幹細胞からなる群から選択される細胞型を一つ以上含む、請求項１９～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ナノボディ、またはＣＤ３３に特異的に結合するトリアボディである、請求項１９～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記抗原結合ドメインの前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、リンカーによって結合される、請求項１９～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって前記膜貫通ドメインに接続される、請求項１９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ヒンジ領域が、ＣＤ８ａ、ＩｇＧ４またはＣＤ２８から選択されるタンパク質のヒンジ領域を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＣＡＲが、一つ以上の共刺激性ドメインをさらに含む、請求項１９～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記一つ以上の共刺激性ドメインが、４-１ＢＢおよび/またはＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記コードされるＣＡＲが、
    (ｉ)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、および６０～９２のいずれか一つのアミノ酸配列、または
    (ii)配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２９、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、および６０～９２のいずれか一つに対して９５～９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む、請求項１９～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ＣＡＲが、
    (ｉ)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、および５６のいずれか一つから選択される、または
    (ii)配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、および５６のいずれか一つに対して９５～９９％同一である、ヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１９～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ＣＤ３３を標的とする前記剤が、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１９～３８のいずれか一項に記載の方法。
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