ES2861435T3 - Composiciones específicas de B7-H4 aisladas y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo anti-B7-H4 humano o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones específicas de B7-H4 aisladas y métodos de uso de las mismas

Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos n.° de serie 61/555406, presentada el 3 de noviembre de 2011.

Antecedentes de la invención

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) inhiben las respuestas inmunitarias antitumorales mediante la liberación de mediadores humorales tales como citocinas, prostaglandinas, factores de crecimiento y metaloproteasas. Los TAM también pueden proteger a los tumores del reconocimiento inmunitario al obstaculizar las respuestas inmunitarias mediadas por células a través de la expresión en superficie celular de moléculas inhibidoras tales como B7-H4 (Kryczek et al., 2006, J Exp Med 203 (4): 871-81). Los T^a M derivan de macrófagos residentes o de monocitos reclutados por el microambiente tumoral y polarizados en el sitio del tumor (Qia y Pollard, 2010, Cell 141 (1): 39-51; Allavena y Mantovani, 2012, Clin Exp Immunol 167 (2): 195-205). La infiltración tumoral con TAM se ha asociado con una escasa supervivencia del paciente y una mayor densidad de microvasos (Coffelt et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1796 (1): 11-8). El direccionamiento a los TAM representa una estrategia prometedora contra el cáncer y ya se han desarrollado varios enfoques, incluyendo el agotamiento con liposomas de clodronato (Zeisberger et al., 2006, Br J Cancer 95 (3): 272-81); la inhibición del reclutamiento de tumores mediante el direccionamiento de CFSR-1 y CCL2 (Loberg et al., 2007, Cancer Res 67 (19): 9417-24); y la "reeducación" mediante activación, a través de CD40 con mAb anti-CD40 (Beatty et al., 2011, Science 331 (6024): 1612-6) o a través de la proteína plasmática HRG (Rolny et al., 2011, Cancer Cell 19 (1): 31-44) o el receptor de manosa (Dangaj et al., 2011, ^p L^oS One 6 (12): e28386).

B7-H4 o B7x/B7s es un miembro de la superfamilia B7 y recientemente se ha identificado como un modulador inhibidor de la respuesta de linfocitos T (Sica et al., 2003, Immunity 18 (6): 849-61; Prasad et al., 2003, Immunity 18 (6): 863-73; Zang et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA, 100 (18): 10388-92). Cuando está presente en la superficie de células presentadoras de antígenos, B7-H4 regula negativamente la activación de linfocitos T, posiblemente a través de la interacción con un ligando que aún no se ha identificado (Kryczek et al., 2006, J Immunol 177 (1): 40-4). La sobreexpresión adenovírica de B7-H4 en islotes pancreáticos protegió a los ratones de la diabetes autoinmunitaria manteniendo la tolerancia periférica (Wei et al., 2011, J Exp Med, 208 (8): 1683-94). Conforme a esta observación, los ratones con supresión de B7-H4 son más resistentes a la infección por Listeria monocytogenes que sus compañeros de camada de tipo silvestre debido a una mayor proliferación de neutrófilos en los órganos periféricos (Zhu et al., 2009, Blood, 113 (8): 1759-67).

B7-H4 se expresa ampliamente a nivel de ARNm, pero su patrón restringido de expresión de proteínas en tejidos normales sugiere una regulación postranscripcional. Se observó expresión de B7-H4 en tejidos tumorales en diversos tipos de cánceres humanos tales como el de mama (Tringler et al., 2005, Clin Cancer Res 11 (5): 1842-8), de ovario (Kryczek et al., 2006, J Exp Med 203 (4): 871-81), de páncreas, de pulmón (Choi et al., 2003, J Immunol 171 (9): 4650-4; Sun et al., 2006, Lung Cancer 53 (2): 143-51) melanoma (Quandt et al., 2011, Clin Cancer Res 17 (10): 3100-11) y carcinoma de células renales (Jung et al., 2011, Korean J Urol 52 (2): 90-5; Krambeck et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103 (27): 10391-6). La expresión de B7-H4 se evaluó mediante inmunohistoquímica en la mayoría de los estudios, ya sea como citoplasma o como proteína de la membrana plasmática (Quandt et al., 2011, Clin Cancer Res 17 (10): 3100-11; Krambeck et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103 (27): 10391-6; Jiang et al., 2010, Cancer Immunol Immunother 59 (11): 1707-14; Zang et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA, 104 (49): 19458­ 63; Miyatake et al., 2007, Gynecol Oncol 106 (1): 119-27). En las células de cáncer de ovario, se evaluó la expresión de B7-H4 mediante citometría de flujo y también se señaló que era principalmente intracelular (Kryczek et al., 2006, J Exp Med 203 (4): 871-81), a excepción de algunas líneas celulares donde se observó expresión en la superficie celular (Choi et al., 2003, J Immunol 171 (9): 4650-4). B7-H4 también se ha detectado en forma soluble en muestras de sangre de pacientes con cáncer (Simon et al., 2006, Cancer Res 66 (3): 1570-5; Thompson et al., 2008, Cancer Res 68 (15): 6054-8). La amplia presencia en diversos cánceres de un regulador negativo de la activación de linfocitos T sugiere una función de B7-H4 en la regulación negativa de la inmunidad antitumoral. De hecho, los TAM B7-H4+ derivados de cáncer de ovario suprimen la proliferación y citotoxicidad de linfocitos T específicos del antígeno HER2 y el bloqueo de la expresión de B7-H4 en macrófagos utilizando oligonucleótidos antisentido de morfolino in vitro e in vivo mejora las respuestas de linfocitos T del antígeno asociado al tumor (Kryczek et al., 2006, J Exp Med 203 (4): 871-81). El documento US 2011/085970 desvela anticuerpos y fragmentos de anticuerpos específicos para B7-H4 y métodos para tratar el cáncer. Dangaj et al. (J. Immunol. Vol. 18846.43, 2012) desvela un anticuerpo recombinante anti-B7-H4 que supera la inhibición de linfocitos T mediada por TAM.

Conjuntamente, estos resultados apoyan el valor de traducción de B7-H4 como molécula diana para la inmunoterapia antitumoral. Sin embargo, el uso de ácidos nucleicos antisentido sigue siendo limitante en las clínicas, en parte debido a una baja estabilidad in vivo debido a la inactivación del suero, la degradación enzimática y la activación inmunitaria innata, sino también debido a la falta de direccionamiento específico y eliminación rápida cuando los oligonucleótidos se administran en forma desnuda (Zhang et al., 2012, Mol Ther 20 (7): 1298-304). Es necesario desarrollar otros medios para bloquear la actividad de B7-H4 para aplicaciones clínicas. La presente invención aborda esta necesidad.

Sumario de la invención

La materia objeto de la invención es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

La invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo anti-B7-H4 humano o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4. En una realización, el polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo anti-B7-H4 humano o un fragmento del mismo comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8.

En una realización, el polipéptido aislado que codifica un anticuerpo anti-B7-H4 humano o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un fragmento seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fvy un Fv monocatenario (scFv).

También se desvela un método para diagnosticar una enfermedad, un trastorno o una afección asociados con la expresión de B7-H4 en una célula, comprendiendo el método a) poner en contacto la célula con un anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4; y b) detectar la presencia de B7-H4 en donde la presencia de B7-H4 diagnostica la enfermedad, el trastorno o la afección asociados con la expresión de B7-H4.

En una realización, la enfermedad, el trastorno o la afección asociados con la expresión de B7-H4 es cáncer.

La divulgación también incluye un método para diagnosticar, pronosticar o determinar el riesgo de una enfermedad relacionada con B7-H4 en un mamífero, comprendiendo el método detectar la expresión de B7-H4 en una muestra procedente del mamífero que comprende: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-B7-H4 humano o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4; y b) detectar la presencia de B7-H4 en donde la presencia de B7-H4 diagnostica una enfermedad relacionada con B7-H4 en el mamífero.

La invención también proporciona un método no terapéutico para inhibir la inhibición de linfocitos T dependiente de B7-H4, comprendiendo el método poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4. En una realización, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa B7-H4, un macrófago asociado a tumor (TAM) y cualquier combinación de los mismos.

La invención también proporciona una composición para su uso en un método para bloquear la inhibición de linfocitos T mediada por una célula que expresa B7-H4 y alterar el microambiente tumoral para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4. En una realización, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa B7-H4, un macrófago asociado a tumor (TAM) y cualquier combinación de los mismos.

La invención también proporciona una composición para su uso en un método para inhibir, suprimir o prevenir la inmunosupresión de una respuesta inmunitaria antitumoral o antineoplásica en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la interacción entre una primera célula con un linfocito T, en donde la primera célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa B7-H4, un macrófago asociado a tumor (TAM) y cualquier combinación de los mismos.

También se desvela una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de un dominio de unión a B7-H4 humano y la secuencia de un dominio de señalización zeta de CD3. En una realización, la secuencia de ácido nucleico aislada comprende además la secuencia de un dominio de señalización coestimulante.

En un aspecto de la presente divulgación, el dominio de señalización coestimulante se selecciona del grupo que consiste en el dominio de señalización de CD28, el dominio de señalización de 4-1BB y cualquier combinación de los mismos.

En un aspecto de la presente divulgación, el dominio de unión a B7-H4 humano es un anticuerpo humano o un fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv y un Fv monocatenario (scFv).

En una realización, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4. En otra realización, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8.

La divulgación también incluye un receptor quimérico de antígeno (CAR) aislado que comprende un dominio de unión a B7-H4 humano y un dominio de señalización zeta de CD3. En un aspecto de la presente divulgación, el CAR comprende además la secuencia de un dominio de señalización coestimulante.

En un aspecto de la presente divulgación, el dominio de señalización coestimulante se selecciona del grupo que consiste en el dominio de señalización de CD28, el dominio de señalización de 4-1BB y cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto de la presente divulgación, el dominio de unión a B7-H4 humano es un anticuerpo humano o un fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv y un Fv monocatenario (scFv). En un aspecto, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-4.

La divulgación también incluye un método para proporcionar inmunidad antitumoral en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula modificada genéticamente que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de un dominio de unión a B7-H4 humano y la secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización zeta de CD3.

En un aspecto de la presente divulgación, la célula es un linfocito T autólogo.

En una realización, el mamífero es un ser humano.

La divulgación también incluye un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección asociados con la expresión desregulada de B7-H4, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula modificada genéticamente que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR), en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de un dominio de unión a B7-H4 humano y la secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización zeta de CD3.

En un aspecto de la presente divulgación, la enfermedad, el trastorno o la afección asociados con la expresión desregulada de B7-H4 se selecciona del grupo que consiste en cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de endometrio, carcinoma hepatocelular y cualquier combinación de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. A fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos realizaciones que se prefieren actualmente.

La figura 1, que comprende las figuras 1A y 1B, es una serie de imágenes que muestran un análisis de citometría de flujo de la expresión en superficie celular de B7-H4 en muestras de cáncer de ovario. Tinción de mAb anti-B7-H4 marcado con PE de células tumorales CD45-EpCam+ (figura 1A) monocitos CD45+CD14+, de 5 pacientes con cáncer de ovario (figura 1B).

La figura 2, que comprende las figuras 2A a 2D, es una serie de imágenes que muestran la regulación positiva de B7-H4 en macrófagos in vitro. La figura 2A es una imagen de la morfología de los macrófagos M1 y M2 después de maduración de citocinas in vitro. Las figuras 2B-2D demuestran que la inducción de la expresión de B7-H4 de macrófagos se determinó mediante (figura 2B) qRT-PCR; y citometría de flujo (figura 2C, 2D), después (figura 2B carriles 1-2) y (figura 2C) estimulación con citocinas, o (figura 2B carril 3) y (figura 2D) cocultivo con la línea celular tumoral Ovcar3.

La figura 3, que comprende las figuras 3A y 3B, es una serie de imágenes que muestran la validación de scFv anti-B7-H4. La figura 3A demuestra la unión de scFv anti-B7-H4 a diluciones en serie de B7-H4 recombinante frente a un antígeno irrelevante medido mediante ELISA de captura. La figura 3B es una imagen de un análisis de citometría de flujo de biocuerpos anti-B7-H4 que se unen a macrófagos M1 y M2 después del preacoplamiento a perlas de estreptavidina fluorescentes (Myltenyi).

La figura 4, que comprende las figuras 4A a 4E, es una serie de imágenes que demuestran el bloqueo de la supresión de linfocitos T mediada por B7-H4 usando scFv anti-B7-H4 in vitro. Las figuras 4A-4D demuestran que se evaluó la proliferación de linfocitos T después de analizar la dilución de CFSE en linfocitos T estimulados con anti-CD3/CD28 solos (figura 4A); linfocitos T con macrófagos M1 (figura 4B); linfocitos T en cocultivo transwell con ovcar3 (figura 4C); linfocitos T con TAM en cocultivo transwell con ovcar3 (figura 4D). La figura 4E demuestra que la activación de linfocitos T se evaluó en función de la expresión de CD69 después de la estimulación anti-CD3/CD28 de linfocitos T solos o en presencia de M1 o TAM.

La figura 5, que comprende las figuras 5A a 5D, es una serie de imágenes que demuestran la expresión de B7-H4 en células de cáncer de ovario humano. La figura 5A es una imagen de una citometría de flujo y un análisis de transferencia de Western de la expresión de B7-H4 en líneas celulares de cáncer de ovario. Las líneas celulares (como se indica) se marcaron con mAb anti-B7-H4 conjugado con PE (histograma abierto) o control de isotipo conjugado con PE (histograma relleno de gris). Se usaron linfocitos B EBV, macrófagos M2 y células C3O transducidas con B7-H4 como control positivo (panel superior). El panel inferior muestra un análisis de transferencia de Western de la expresión de B7-H4 en cuatro líneas celulares de cáncer de ovario (OVCAR5, SKOV3, A1857, OVCAR3). Se usaron macrófagos maduros in vitro IL4-IL10 (M2 MO) como controles positivos para la expresión de B7-H4. La detección de p-actina se usó como control de carga de proteínas endógenas. La figura 5B muestra una evaluación de citometría de flujo de la expresión en superficie de B7-H4 en muestras de tumores sólidos y ascitis de cáncer de ovario humano. Las células muertas se excluyeron del total de células basándose en la captación de 7-AAD. Las células tumorales y los leucocitos se distinguieron mediante la detección de marcadores de superficie Epcam y CD45. La población de macrófagos que expresó B7-H4 de superficie se caracterizó por la coexpresión de CD45+^c D14+CD206+B7-H4+. Las células tumorales que expresaban B7-H4 de superficie se caracterizaron por la coexpresión de Epcam+B7-H4+. La figura 5C-5D representa la expresión en superficie celular de B7-H4 en células tumorales en muestras de ascitis y tumores sólidos procedentes de un modelo de ratón xenogénico de cáncer de ovario humano. La figura 5C muestra un análisis de citometría de flujo representativo de la expresión en superficie celular de B7-H4 en células tumorales Epcam+ sin cultivar, recién recogidas (paneles superiores) frente a células tumorales Epcam+ después de cultivo in vitro corto (paneles inferiores). La figura 5D es una imagen de un gráfico de porcentajes de células B7-H4+ EpCAM+ procedentes de ascitis y tumores sólidos antes y después del cultivo a corto plazo, medidos por citometría de flujo (n = 6). Se usó el isotipo IgG1 PE como control de tinción para B7-H4.

La figura 6, que comprende las figuras 6A y 6C, es una serie de imágenes que demuestran el aislamiento de scFv anti-B7-H4 de una nueva biblioteca de presentación en levaduras de pacientes con cáncer de ovario y validación. La figura 6A es una representación esquemática de estrategias de aislamiento basadas en proteínas (figura 6B) y basadas en células (figura 6C). Los scFv anti-B7-H4 aislados basados en proteínas y basados en células se inmovilizaron en plástico y se incubaron con diluciones en serie de B7-H4 recombinante biotinilado (diamantes negros) o antígeno de control irrelevante (BSA, triángulos grises). La unión de proteínas a scFv se detectó con SA-HRP. La señal colorimétrica se desarrolló con una solución de sustrato TMB, se inactivó con ácido sulfúrico y se leyó a 450 nm en un lector de ELISA Biotek.

La figura 7, que comprende las figuras 7A a 7D, es una serie de imágenes que demuestran que la proteína B7-H4 recombinante inhibe la estimulación de linfocitos T policlonales y los scFv anti-B7-H4 invierten la inhibición de linfocitos T. Se estimularon linfocitos T con anti-CD3 y/o anti-CD28 unidos a placa en presencia de B7-H4 recombinante inmovilizado (barras negras) o proteína de control irrelevante (FOLRl, barras grises). La figura 7A representa la producción de IFN-y (ensayos ELISA). p = 0,032 para linfocitos T estimulados con CD3 y p = 0,097 para linfocitos T estimulados con CD3/CD28 en ausencia o en presencia de B7-H4. Las barras de error representan el error típico de la media (ETM). La figura 7B representa un análisis de citometría de flujo de la expresión de linfocitos T CD69 y la proliferación de linfocitos T medida por diluciones de CFSE, como se indica. Se estimularon linfocitos T con anti-CD3 unido a placa en presencia de B7-H4 recombinante inmovilizado (barras negras) o de proteína de control irrelevante (FOLRl, barras grises) en medio regular (sin tratar) o en presencia de los clones de scFv anti-B7-H4 n.° 26, n.° 56, 3 n.° 54 o 3 n.° 68, como se indica. La figura 7C representa la producción de IFN-^y (ensayos ELISA). Muestras sin tratar, p = 0,0014; n.° 26, p = 0,0019; n.° 56, p < 0,0001; 3 n.° 54 p = 0,0406; 3 n.° 68, p = 0,1305. Las barras de error representan el error típico de la media (ETM). La figura 7D representa un análisis de citometría de flujo de la expresión de linfocitos T CD69 y la proliferación de linfocitos T medida por diluciones de CFSE, como se indica.

La figura 8, que comprende las figuras 8A a 8E, es una serie de imágenes que demuestran que las APC B7-H4+ inhiben linfocitos T específicos de antígeno y los scFv anti-B7-H4 invierten la inhibición de linfocitos T. La figura 8A representa un análisis de citometría de flujo de la expresión en superficie de B7-H4 en APC de tipo silvestre o T2 transducidas con B7-H4 usando mAb PE anti-B7-H4 (histograma abierto) o isotipo PE (histograma relleno de gris). Producción de IFN-y de linfocitos T específicos de TCR HER-2 (figura 8B) y MART-1 (figura 8C) después de la estimulación con ^a P^c T2 transducidas con B7-H4 (T2 B7-H4, barras negras) o T2 de tipo silvestre (T2, barras grises) pulsadas con péptidos MART-1 o HER-2. p = 0,0362 para linfocitos T TCR HER-2 estimulados con T2 pulsado con HER-2 frente a T2 B7-H4; p = 0,0024 para linfocitos T TCR MART-1 estimulados con T2 pulsado con MART-1 frente a T2 B7-H4; D-E. Producción de IFN-^y de linfocitos T específicos de TCR HER-2 (figura 8D) y MART-1 (figura 8E) después de la estimulación con APC T2 que expresan B7-H4 (T2 B7-H4, barras negras) o APC T2 transducidas con GFP (T2 GFP, barras grises oscuras), pulsadas con péptidos HER-2 (figura 8D) o MART-1 (figura 8E), en presencia de scFv anti-B7-H4, como se indica, o en medio regular (sin tr.). Análisis Anova de una vía para la producción de IFN^y de linfocitos T específicos de antígeno estimulados por APC T2 GFP cargadas con péptidos, p = 0,7893 (figura 8D, barras grises oscuras) y p = 0,2931 (figura 8E, barras grises oscuras). Análisis Anova de una vía para la producción de IFN^y de linfocitos T específicos de antígeno estimulados por APC T2 B7-H4 cargadas con péptidos, p = 0,0066 (figura 8D, barras negras) y p < 0,0001 (figura 8E, barras negras). En presencia de scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4, p = 0,5748 para linfocitos T TCR He R-2 estimulados por APC cargadas con péptido GFP frente a T2 B7-H4 (figura 8D) y p = 0,2892 para linfocitos T TCR MART-1 estimuladas por APC cargadas con péptido GFP frente a T2 B7-H4 (figura 8E). Las barras de error representan el error típico de la media (ETM).

La figura 9, que comprende las figuras 9A a 9C, es una serie de imágenes que demuestran que las células tumorales B7-H4+HER2+ inhiben la activación de linfocitos T transducidos con TCR-HER2 y el scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4 supera la inhibición de linfocitos T. La figura 9A representa un análisis de citometría de flujo de la expresión en superficie de B7-H4 en células 624 de tipo silvestre (624 TS) o 624 HLA A2+HER2+ transducidas con B7-H4 (624 B7-H4 ) y células MDA231 de tipo silvestre (MDA231 TS) o HLA A2altoHER2+ transducidas con B7-H4 (MDA231 B7-H4 ), con mAb PE anti-B7-H4 (histograma abierto) o isotipo PE (histograma relleno de gris). La figura 9B muestra la secreción de IFN-^y de linfocitos T específicos de TCR HER-2 después de la estimulación con 624 TS frente a 624 B7-H4+ (N/D), y con MDA231 TS frente a MDA231 B7-H4 (p = 0,0451). La figura 9C representa la secreción de IFN-y de linfocitos T específicos de TCR HER-2 después de la estimulación con MDA231 TS frente a MDA231 B7-H4 en presencia de scFv anti-B7-H4, como se indica. Análisis Anova de una vía para la producción de IFN^y de linfocitos T específicos de antígeno estimulados por NMA231 TS, p = 0,1726 (barras grises oscuras). Análisis Anova de una vía para la producción de IFN^y de linfocitos T específicos de antígeno estimulados por MDA231 B7-H4+, p = 0,0066 (barras negras). Con estimulación de scFv 3 n.° 54 anti-B7-H4 con MDA231 TS frente a B7-H4+, p = 0,4393; con estimulación de scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4 con MDA231 TS frente a B7-H4+, p = 0,2179. Las barras de error representan el error típico de la media (ETM).

La figura 10, que comprende las figuras 10A y 10B, es una serie de imágenes que demuestran que los TAM B7-H4+ inhiben linfocitos T específicos de antígeno y los scFv anti-B7-H4 invierten la inhibición de linfocitos T. La figura 10A representa la producción de IFN-^y de linfocitos T específicos de TCR MART-1 en presencia (barras negras) o en ausencia (barras grises) de TAM B7-H4+ durante la estimulación con APC T2 pulsadas con diluciones en serie de péptido MART-1 o concentración constante (1 pM) de péptido HER-2 para controlar la estimulación específica de linfocitos T TCR MART-1. A una dilución de 0,0025 pM, p = 0,0287; a una dilución de 0,05 pM, p = 0,2777; a una dilución de 1 pM, p = 0,1268. La figura 10B representa la producción de IFN-y de linfocitos T específicos de TCR MART-1 en presencia (barras negras) o en ausencia (barras grises) de TAM B7-H4+ durante la estimulación con APC T2 pulsadas con péptido MART-1 en presencia de scFvs anti-B7-H4, como se indica. ANOVA para calcular. Las barras de error representan el error típico de la media (ETM).

La figura 11, que comprende las figuras 11A y 11C, representa la clonación, expresión y purificación de B7-H4 recombinante. La figura 11A representa la expresión de ADNc de B7-H4 en macrófagos (1) después de 2 y 5 horas de estimulación con IL10/IL4 o (2) después de 72 horas en cocultivo transwell con la línea celular OVCAR3. Se usó amplificación simultánea de p-actina como control. La figura 11B es un esquema del vector de clonación de mamíferos (pTT28) que codifica la proteína B7-H4 recombinante soluble fusionada con un marcador HIS 6x. La figura 11C representa la detección de B7-H4 recombinante (1) por transferencia de western en el sobrenadante de células 293-F usando una sonda HIS seguida de HRP anti-ratón o (2) después de la purificación usando un Ab policlonal de cabra anti-B7-H4 humano seguido de HRP policlonal de conejo anti­ cabra; (3) por tinción de coumassie después de la electroforesis.

La figura 12, que comprende las figuras 12A y 12B, es una serie de imágenes que demuestran que los TAM B7-H4+ regulan negativamente la proliferación y la coestimulación de linfocitos T específicos de antígeno. Las linfocitos T específicos de TCR MART-1 se estimularon con APC T2 de tipo silvestre pulsadas con diluciones en serie (0,0025-1 uM) de MART-1 o concentración constante (1 uM) de péptido irrelevante HER-2 para controlar la estimulación específica de linfocitos T TCR MART-1. La proliferación se analizó mediante dilución de CFSE (figura 12A); la coestimulación se analizó mediante la detección de la expresión de CD137 (figura 12B).

La figura 13 es una imagen que demuestra que los linfocitos T que portan CAR de B7-H4 comprendidos por scFv se unen a B7-H4 humano y recombinante con diferente afinidad.

La figura 14 es una imagen que demuestra que los CAR se unen a proteínas B7-H4 tanto humanas como de ratón.

La figura 15, que comprende las figuras 15A y 15B, es una serie de imágenes que demuestran que los linfocitos T que portan CAR de B7-H4 reaccionan específicamente contra células B7H4+. La figura 15A demuestra que los CAR de B7-H4 reaccionan específicamente contra células de cáncer de ovario B7H4+. La figura 15B demuestra el reconocimiento diferencial de CAR de scFv para B7H4 de diferentes líneas celulares de tumores sólidos que expresan B7H4 y una línea celular tumoral de linfoma.

La figura 16, que comprende las figuras 16A y 16B, es una serie de imágenes que demuestran la reactividad de linfocitos T transducidos con CAR de B7-H4. La figura 16A es una imagen que demuestra que los linfocitos T transducidos con CAR de B7-H4 son reactivos contra macrófagos que expresan niveles diferenciales de B7H4. La figura 16B es una imagen que demuestra que el CAR n.° 68 de B7H4 es comparable al CAR anti-CD19 bien establecido en respuesta al antígeno tumoral respectivo.

La figura 17, que comprende las figuras 17A y 17B, es una serie de imágenes que demuestran la inhibición de los CAR de B7-H4. La figura 17A es una imagen que demuestra que los linfocitos T con CAR de B7-H4 no son inhibidos por la proteína B7-H4 inmovilizada. La figura 17B es una imagen que representa que la adición de scFv n.° 68 soluble al cultivo inhibe específicamente la actividad de CAR n.° 68 de B7H4 (secreción de IFNy) contra la proteína B7-H4 inmovilizada, demostrando de este modo que el CAR de B7-H4 está bloqueado de forma específica.

La figura 18 es una imagen que demuestra que la adición de scFv 68 en presencia de CD3 conduce a la inhibición específica de la secreción de IFN-y de CAR 68 de B7-H4 y al rescate moderado específico de la secreción de IFN-^y de CAR 56 de B-7H4.

La figura 19 es una imagen que demuestra que la secreción de citocina MIP1a de CAR de scFv 68 de B7H4 no disminuye como resultado de la señalización de CAR de B7H4-Ag B7H4.

Descripción detallada

La presente invención se basa en parte en la identificación de anticuerpos de origen humano que se dirigen a B7-H4. Los anticuerpos de la invención se usan para diagnóstico y aplicaciones terapéuticas in vivo y se definen en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a B7-H4. En otra realización, los anticuerpos de la invención bloquean la inhibición de la proliferación de linfocitos T. En otra realización más, los anticuerpos anti-B7-H4 de la invención invierten la inhibición de linfocitos T mediada por una señalización de B7-H4. En una realización, los anticuerpos bloquean la inhibición de linfocitos T dependiente de B7-H4.

En otra realización, los anticuerpos de la invención restauran la proliferación de linfocitos T contra células tumorales en presencia de macrófagos y, por tanto, son una composición terapéutica útil contra el cáncer. Por ejemplo, el bloqueo de B7-H4 usando un anticuerpo de la invención supera la inhibición de linfocitos T específica de antígeno mediada por B7-H4 expresado en la superficie de la célula tumoral.

En una realización, los anticuerpos de la invención son anticuerpos scFv. Los anticuerpos se pueden usar para diagnosticar la presencia de B7-H4 en una muestra biológica.

En una realización, los anticuerpos de la invención se usan para terapia contra una enfermedad, un trastorno o una afección asociados con la desregulación de la expresión de B7-H4. En una realización, los anticuerpos de la invención se utilizan para terapia del cáncer contra cánceres asociados con la expresión desregulada de B7-H4. La presente divulgación también se refiere en general al tratamiento de un paciente que tiene un cáncer asociado con la expresión desregulada de B7-H4, o en riesgo de tener un cáncer asociado con la expresión desregulada de B7-H4, usando infusión celular. En un aspecto de la presente divulgación, se usa en el tratamiento infusión de linfocitos, preferentemente infusión de linfocitos autólogos.

En un aspecto de la divulgación, se recogen PBMC de un paciente que necesita tratamiento y se modifican y expanden linfocitos T de las mismas usando los métodos descritos en el presente documento y después se infunden de nuevo en el paciente. La divulgación no se limita a una célula o un tipo celular determinado. En su lugar, cualquier célula o tipo celular puede modificarse y expandirse usando los métodos descritos en el presente documento y después infundirse de nuevo en el paciente.

La presente divulgación también enseña en general el uso de linfocitos T modificados para expresar un receptor quimérico de antígeno (CAR). Los CAR combinan un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con una molécula de señalización intracelular. Por ejemplo, la molécula de señalización intracelular incluye, pero sin limitación, cadena zeta de CD3, módulos de señalización 4-1BB y CD28 y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el dominio de reconocimiento de antígeno se une a B7-H4. Más preferentemente, el dominio de reconocimiento de antígeno comprende un anti-B7-H4 completamente humano. Por consiguiente, se desvelan un CAR anti-B7-H4 completamente humano introducido por ingeniería genética en un linfocito T y métodos para su uso en terapia adoptiva.

En un aspecto, la divulgación incluye células autólogas que se transfectan con un vector que comprende un transgén de CAR anti-B7-H4 completamente humano. Preferentemente, el vector es un vector retrovírico. Más preferentemente, el vector es un vector lentivírico autoinactivante como se describe en otra parte del presente documento.

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica para el análisis de la presente invención también se puede usar cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, se describen en el presente documento los materiales y métodos preferentes. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.

También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Se entiende que "aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, abarca variaciones de hasta ±20 % o ±10 %, más preferentemente ±5 %, incluso más preferentemente ±1 % y aún más preferentemente ±0,1 % con respecto al valor especificado, ya que dichas variaciones son adecuadas para realizar los métodos desvelados.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente con un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas procedentes de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son normalmente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en diversas formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos monocatenarios y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1999, en: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, en: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426).

La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Una "cadena pesada de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones de origen natural. Una "cadena ligera de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere al más pequeño de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales. Las cadenas ligeras k y A se refieren a los dos isotipos principales de cadenas ligeras de anticuerpos.

Por la expresión "anticuerpo sintético", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado mediante un bacteriófago como se describe en el presente documento. La expresión también debe interpretarse como un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y que la molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en donde la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido usando tecnología de ADN sintético o de secuencia de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.

El término "antígeno" o "Ag", como se usa en el presente documento, se define como una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la materia comprenderá que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede actuar como antígeno. Asimismo, los antígenos pueden proceder de ADN recombinante o genómico. Un experto en la materia comprenderá que cualquier ADN, que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial que codifique una proteína que induzca una respuesta inmunitaria, por lo tanto, codifica un "antígeno" como se usa ese término en el presente documento. Asimismo, un experto en la técnica comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Resulta evidente que la presente invención incluye, pero sin limitación, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos se disponen en diversas combinaciones para provocar la respuesta inmunitaria deseada. Por otra parte, un experto en la técnica comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado por un "gen" en absoluto. Resulta evidente que un antígeno se puede generar sintetizado o se puede obtener de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero sin limitación, una muestra tisular, una muestra tumoral, una célula o un líquido biológico.

La expresión "efecto antitumoral", como se usa en el presente documento, se refiere a un efecto biológico que se puede manifestar como una disminución en el volumen tumoral, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la esperanza de vida o mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un "efecto antitumoral" también se puede manifestar en la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la invención en la prevención de la aparición de tumores en primer lugar.

La expresión "enfermedad autoinmunitaria", como se usa en el presente documento, se define como un trastorno que resulta de una respuesta autoinmunitaria. Una enfermedad autoinmunitaria es el resultado de una respuesta inadecuada y excesiva a un autoantígeno. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmunitaria, parotiditis autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitÍligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa, entre otras.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "autólogo" se refiere a cualquier material procedente del mismo individuo al que luego se va a reintroducir en el individuo.

"Alogénico" se refiere a un injerto procedente de un animal diferente de la misma especie.

"Xenogénico" se refiere a un injerto procedente de un animal de una especie diferente.

Como se usa en el presente documento, el término "B7-H4" se refiere a B7-H4 de cualquier especie de mamífero y el término "hB7-H4" se refiere a B7-H4 humano. Se proporcionan más detalles sobre polipéptidos y ácidos nucleicos de B7-H4 en la patente de los Estados Unidos n.° 6.891.030. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de hB7-H4 se pueden encontrar en GenBank con los números de referencia AY280972 y AAP37283, respectivamente. B7-H4 es un regulador negativo de la inmunidad mediada por linfocitos T.

El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los ejemplos de diversos cánceres incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.

Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión "modificaciones conservadoras de secuencia" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. En un anticuerpo de la invención pueden introducirse modificaciones mediante técnicas convencionales conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Son sustituciones conservadoras de aminoácidos aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento, uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden reemplazarse por otros restos de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede analizarse para determinar la capacidad unión a B7-H4 usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

"Ligando coestimulante", como se usa la expresión en el presente documento, incluye una molécula en una célula presentadora de antígenos (p. ej., una aAPC, célula dendrítica, linfocito B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimulante afín en un linfocito T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, media en una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulante puede incluir, pero sin limitación, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulante inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, un agonista o anticuerpo que se une con el receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulante también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimulante presente en un linfocito T, tal como, pero sin limitación, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83.

Una "molécula coestimulante" se refiere al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulante, mediando de este modo en una respuesta coestimulante mediante el linfocito T, tal como, pero sin limitación, proliferación. Las moléculas coestimulantes incluyen, pero sin limitación, una molécula del MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll.

El término "desregulado" cuando se usa en el contexto del nivel de expresión o actividad de B7-H4 se refiere al nivel de expresión o actividad que es diferente del nivel de expresión o actividad de B7-H4 en un animal, organismo, tejido, célula o componente de los mismos sano por lo demás idéntico. El término "desregulado" también se refiere a la regulación alterada del nivel de expresión y actividad de B7-H4 en comparación con la regulación en un animal, organismo, tejido, célula o componente de los mismos sano por lo demás idéntico.

"Codificante" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para actuar como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. Por tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm correspondiente a ese gen producen la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y, habitualmente, se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, usada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, se pueden denominar codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

A menos que se especifique otra cosa, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones redundantes entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones. "Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, como se describe en el presente documento, eficaz para lograr un resultado biológico determinado. Dichos resultados pueden incluir, pero sin limitación, la inhibición de la infección por virus determinada por cualquier medio adecuado en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "endógeno" se refiere a cualquier material de o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

Como se usa en el presente documento, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido desde o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos determinada dirigida por su promotor.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (p. ej., desnudos o contenidos en liposomas) y virus (p. ej., lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

"Homólogo", como se usa en el presente documento, se refiere a la identidad de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, p. ej., entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; p. ej., si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; p. ej., si la mitad (p. ej., cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50 % homólogas; si el 90 % de las posiciones (p. ej., 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son 90 % homólogas.

Son formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima procedente de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan restos de región marco conservada (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana por restos no humanos correspondientes. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o marco conservado importadas. Estas modificaciones se efectúan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente, la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op.

Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

"Completamente humano" se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, donde la molécula completa es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, un "material de formación" incluye una publicación, un registro, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad de las composiciones y métodos de la invención. El material de formación del equipo de la invención puede, por ejemplo, fijarse a un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición de la invención o enviarse junto con un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición. Como alternativa, el material de formación puede enviarse por separado del recipiente con la intención de que el material de formación y el compuesto sean utilizados conjuntamente por el receptor.

"Aislado" significa alterado o eliminado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada o pueden existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico habituales. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

A menos que se especifique otra cosa, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones redundantes entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La expresión secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener, en alguna versión, uno o más intrones.

Un "lentivirus", como se usa en el presente documento, se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son particulares entre los retrovirus al ser capaces de infectar células que no se dividen; pueden administrar una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula hospedadora, por lo que son uno de los métodos más eficientes de un vector de administración de genes. El VIH, SIV y FIV son ejemplos de lentivirus. Los vectores procedentes de lentivirus ofrecen los medios para lograr niveles significativos de transferencia génica in vivo.

La expresión "unido operativamente" se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da lugar a la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN unidas operativamente están contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.

La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, p. ej., inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, o técnicas de infusión.

El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, se define como una cadena de nucleótidos. Asimismo, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por tanto, ácidos nucleicos y polinucleótidos, como se usan en el presente documento, son intercambiables. Un experto en la materia tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que se pueden hidrolizar en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos. Como se usan en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen mediante cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o un genoma celular, usando de tecnología de clonación habitual y PCR™, y similares, y mediante medios sintéticos.

Como se usan en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto comprendido por restos de aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos y no se limita el número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o un péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan habitualmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que se denominan en general en la técnica proteínas, de las que existen muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

El término "promotor", como se usa en el presente documento, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que es necesaria para la expresión de un producto génico unido operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que son necesarios para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, ser una que exprese el producto génico de una manera específica de tejido.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o la totalidad de las condiciones fisiológicas de la célula.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente con un polinucleótido codificado o especificado por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo tisular correspondiente al promotor.

Una "ruta de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señales que desempeñan una función en la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra parte de una célula. La expresión "receptor de superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitirla a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" es el B7-H4 humano.

Los "anticuerpos monocatenarios" se refieren a anticuerpos formados mediante técnicas de ADN recombinante en las que los fragmentos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina se unen a la región Fv mediante un tramo de aminoácidos obtenido por ingeniería genética. Se conocen diversos métodos para generar anticuerpos monocatenarios, incluyendo los descritos en la patente de los Estados Unidos n.° 4.694.778; Bird (1988) Science 242: 423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334: 54454; Skerra et al. (1988) Science 242: 1038-1041.

Se entiende que el término "sujeto" incluye organismos vivos en los que se puede inducir una respuesta inmunitaria (p. ej., mamíferos).

Como se usa en el presente documento, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente exenta de otros tipos celulares. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que se ha separado de otros tipos celulares con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, esta expresión se refiere simplemente a células que se han separado de las células con las que están naturalmente asociadas en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivan in vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivan in vitro.

El término "terapéutico", como se usa en el presente documento, significa un tratamiento y/o profilaxis. Se obtiene un efecto terapéutico mediante supresión, remisión o erradicación de una patología.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el que se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula hospedadora. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es una que se ha transfectado, transformado o transducido con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto principal y su descendencia.

La expresión "bajo control transcripcional" o "unido operativamente", como se usa en el presente documento, significa que el promotor está en la ubicación y orientación correcta en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede usar para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores, que incluyen, pero sin limitación, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por tanto, el término "vector" incluye un plásmido o un virus que se replica de forma autónoma. También debe interpretarse que el término incluye compuestos no plasmídicos y no víricos que faciliten la transferencia de ácido nucleico a las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores víricos incluyen, pero sin limitación, vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos y similares.

Por la expresión "se une específicamente", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une con una proteína compañera de unión afín (p. ej., una molécula estimulante y/o coestimulante presente en un linfocito T) presente en una muestra, pero dicho anticuerpo o ligando no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de la muestra.

Por el término "estimulación", se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimulante (p. ej., un complejo TCR/CD3) con su ligando afín mediando de este modo en un acontecimiento de transducción de señal, tal como, pero sin limitación, transducción de señal a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar en la expresión alterada de determinadas moléculas, tal como la regulación negativa de TGF-p, y/o la reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.

Una "molécula estimulante", como se usa la expresión en el presente documento, significa una molécula en un linfocito T que se une específicamente con un ligando estimulante afín presente en una célula presentadora de antígenos.

Un "ligando estimulante", como se usa en el presente documento, significa un ligando que, cuando está presente en una célula presentadora de antígenos (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, un linfocito B y similares), se puede unir específicamente con un compañero de unión afín (denominado en el presente documento "molécula estimulante") en un linfocito T, mediando de este modo en una respuesta primaria por el linfocito T, incluyendo, pero sin limitación, activación, iniciación de una respuesta inmunitaria, proliferación y similares. Los ligandos estimulantes son bien conocidos en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula del MHC de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo superagonista anti-CD28 y un anticuerpo superagonista anti-CD2.

Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, se pueden presentar diversos aspectos de la invención en un formato de intervalo. Debería entenderse que la descripción en formato de intervalo es únicamente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible. Por consiguiente, debería considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debería considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos desvelados específicamente tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

La presente invención proporciona anticuerpos aislados, en particular anticuerpos humanos que se unen específicamente a B7-H4 como se describe en las reivindicaciones adjuntas. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden elementos estructurales determinados tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos determinadas como se define en las reivindicaciones. La invención también proporciona métodos para preparar dichos anticuerpos.

En una realización, la invención proporciona varios anticuerpos o fragmentos de los mismos obtenidos por ingeniería genética para mejorar la unión a una proteína B7-H4 expresada en una superficie celular. En otra realización, dichos fragmentos de anticuerpos son funcionales porque proporcionan una respuesta biológica incluyendo, pero sin limitación, activación de una respuesta inmunitaria, inhibición del origen de la transducción de señal a partir de su antígeno diana, inhibición de la actividad cinasa y similares, como entenderá un experto en la materia. Preferentemente, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la invención pueden bloquear la inhibición de la proliferación de linfocitos T. En otra realización más, los anticuerpos anti-B7-H4 de la invención pueden invertir la inhibición de linfocitos T mediada por una señalización de B7-H4. En otra realización más, los anticuerpos pueden bloquear la inhibición de linfocitos T dependiente de B7-H4.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden incorporarse en un inmunoconjugado, un receptor quimérico de antígeno (CAR), una composición farmacéutica y similares. Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones para tratar, entre otras enfermedades, cáncer o cualquier neoplasia maligna o enfermedad autoinmunitaria en la que la expresión de B7-H4 esté desregulada.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una célula (p. ej., linfocito T) obtenida por ingeniería genética para expresar un receptor quimérico de antígeno (CAR) en donde el linfocito T CAR presenta una propiedad antitumoral. Un antígeno preferido es B7-H4. En un aspecto de la divulgación, el dominio de reconocimiento de antígeno del CAR comprende un anti-B7-H4 completamente humano. Por consiguiente, la divulgación proporciona un CAR anti-B7-H4 completamente humano introducido por ingeniería genética en un linfocito T y métodos para su uso para terapia adoptiva.

En un aspecto de la divulgación, el CAR anti-B7-H4 comprende uno o más dominios intracelulares seleccionados del grupo de un dominio de señalización de CD137 (4-1BB), un dominio de señalización de CD28, un dominio de señal de CD3zeta y cualquier combinación de los mismos. Esto se debe a que la presente divulgación se basa en parte en el descubrimiento de que las respuestas de linfocitos T mediadas por CAR de los linfocitos T se pueden mejorar adicionalmente con la adición de dominios coestimulantes.

Anticuerpos anti-B7-H4

Los anticuerpos de la invención se caracterizan por características o propiedades funcionales determinadas de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a B7-H4 humano. En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo humano aislado o un fragmento funcional del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína B7-H4 o un fragmento de la misma, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo está codificado por una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

En un aspecto de la divulgación, el polipéptido clon 56 de scFv anti-B7H4 está codificado por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido clon 56 de scFv anti-B7H4 se expone en la SEQ ID NO: 5.

En una realización, el polipéptido clon 26 de scFv anti-B7H4 está codificado por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido clon 26 de scFv anti-B7H4 se expone en la SEQ ID NO: 6.

En una realización, el polipéptido clon 3 n.° 54 de scFv anti-B7H4 (también denominado en el presente documento clon 54 de scFv anti-B7H4) está codificado por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido clon 3 n.° 54 de scFv anti-B7H4 se expone en la SEQ ID NO: 7.

En una realización, el polipéptido clon 3 n.° 68 de scFv anti-B7H4 (también denominado en el presente documento clon 54 de scFv anti-B7H4) está codificado por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido clon 3 n.° 68 de scFv anti-B7H4 se expone en la SEQ ID NO: 8.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una proteína B7-H4 recombinante, en donde la proteína recombinante está codificada por la secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9. En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína B7-H4 recombinante se expone en la SEQ ID NO: 10.

En una realización, el fragmento de anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). En otra realización, los anticuerpos de la invención pueden existir en diversas formas adicionales, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y (Fab')2, así como anticuerpos híbridos bifuncionales (es decir, biespecíficos) (p. ej., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). En una realización, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la invención se unen a una proteína B7-H4 con afinidad de tipo silvestre o mejorada. En una realización, los scFv anti-B7-H4 proporcionados en el presente documento son de origen humano. En otra realización, los scFv anti-B7-H4 proporcionados en el presente documento se aislaron de una biblioteca de presentación en levadura de fragmentos de anticuerpos generados a partir de linfocitos B aislados de ascitis de pacientes con cáncer de ovario. En otra realización, los scFv anti-B7-H4 se seleccionan usando una proteína B7-H4 recombinante tal como la ilustrada por la SEQ ID NO: 9. En otra realización, los scFv anti-B7-H4 proporcionados en el presente documento se analizan en sistemas modelo de cocultivo in vitro de macrófagos, linfocitos T y células tumorales. En otra realización, los scFv anti-B7-H4 proporcionados en el presente documento tienen la ventaja de que pueden unirse a B7-H4 expresado en la superficie tanto de monocitos como de células tumorales tales como macrófagos y células de cáncer de ovario.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-B7-H4 de la invención.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se prepara adicionalmente usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o V^l desveladas en el presente documento que se pueden usar como material de partida para obtener por ingeniería genética un anticuerpo modificado, pudiendo tener dicho anticuerpo modificado propiedades alteradas en comparación con el anticuerpo de partida. En diversas realizaciones, el anticuerpo se obtiene por ingeniería genética modificando uno o más aminoácidos en una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones marco conservadas. Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo se obtiene por ingeniería genética modificando restos en una o más regiones constantes, por ejemplo, para alterar una o más funciones efectoras del anticuerpo.

Métodos

En una realización, se usan scFv proporcionados en el presente documento para detectar o dirigirse a B7-H4, permitiendo de este modo las pruebas de diagnóstico in vitro y/o in vivo (captura de imágenes), así como la producción de tratamientos dirigidos. En algunos casos, los anticuerpos de la invención se acoplan con reactivos terapéuticos, por ejemplo, se acoplan en nanopartículas con carga útil o como receptor quimérico de antígeno (CAR) para la terapia con linfocitos T. Por lo tanto, debido a sus propiedades funcionales in vitro, los scFv proporcionados en el presente documento también se pueden usar in vivo como reactivo desnudo para estimular la inmunidad antitumoral.

En una realización, la invención se refiere a medios para diagnosticar una enfermedad relacionada con B7-H4 en un sujeto, que comprenden la etapa de a) administrar a un sujeto una cantidad eficaz de composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo unido operativamente a un agente de marcaje, b) obtener una muestra biológica del sujeto, c) detectar la unión de la composición a la muestra biológica, d) en donde la detección de la unión de la composición a la muestra biológica del sujeto es indicativa de que el sujeto tiene una enfermedad relacionada con B7-H4 y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En otra realización, la invención se refiere a medios para diagnosticar una enfermedad relacionada con B7-H4 en un sujeto, que comprenden la etapa de a) obtener una muestra biológica del sujeto b) poner en contacto la muestra con una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo unido operativamente a un agente de marcaje, c) detectar la unión de la composición a la muestra biológica, d) en donde la detección de la unión de la composición a la muestra biológica del sujeto es indicativa de que el sujeto tiene una enfermedad relacionada con B7-H4 y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En una realización, la invención incluye medios para inhibir, suprimir o prevenir la inmunosupresión de una respuesta inmunitaria antitumoral o antineoplásica en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otra realización, la inhibición de la inmunosupresión evita la interacción entre macrófagos que expresan la proteína B7-H4 y linfocitos T que, de otro modo, actuarían para producir una respuesta antitumoral. Por lo tanto, en otra realización, la inhibición de la interacción entre macrófagos y linfocitos T inhibe la inmunosupresión de la respuesta inmunitaria antitumoral del sujeto.

En una realización, la invención incluye medios para tratar un cáncer o un crecimiento tumoral, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde la administración de la composición bloquea una inmunosupresión mediada por células tumorales o macrófagos asociada a un tumor de una respuesta antitumoral y permite la activación de una respuesta antitumoral, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En una realización, la invención proporciona medios para prevenir una metástasis de cáncer, que comprenden administrar a un sujeto una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo, en donde la administración del anticuerpo o fragmento del mismo bloquea una inmunosupresión mediada por macrófagos o células tumorales asociada a un tumor de una respuesta antitumoral y previene la metástasis del cáncer, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En otra realización, la invención proporciona un método no terapéutico para bloquear la inhibición de linfocitos T mediada por una célula que expresa B7-H4 y alterar el microambiente tumoral para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En el presente documento se desvela un método para regular negativamente la expresión de un receptor o proteína de B7-H4 en la superficie celular que comprende poner en contacto el receptor o proteína con un anticuerpo específico de B7-H4 o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, Se Q ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Un experto en la materia debe entender que se puede lograr un nivel deseado específicamente de regulación negativa poniendo en contacto el receptor o proteína de B7-H4 proporcionados en el presente documento, con una dosis determinada empíricamente del anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo. La expresión "regulación negativa" se refiere a la inhibición o reducción de la expresión de la proteína B7-H4 de superficie celular, que da lugar a un efecto preventivo, diagnóstico o terapéutico. Por ejemplo, la regulación negativa es doble, triple, quíntuple o mayor. En otro aspecto, la ruta de señalización que comienza en el receptor oncogénico que conduce a la expresión de más receptor oncogénico se regula negativamente al entrar en contacto el receptor con el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención.

En una realización, la invención proporciona medios para bloquear una interacción entre un receptor y un ligando que comprenden poner en contacto el receptor con un anticuerpo específico de B7-H4 o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otra realización, la inhibición de la interacción entre células tumorales y macrófagos que expresan B7-H4 en su superficie y linfocitos T, inhibe la inmunosupresión de la respuesta inmunitaria antitumoral del sujeto. En otra realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria antitumoral mediada por células, donde en otra realización la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. En otra realización, la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T es una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 o CD8.

También se describe un método para suministrar un agente biológicamente activo a una célula que expresa B7-H4 en su superficie, comprendiendo el método poner en contacto la célula con una composición de bioconjugado que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo unido operativamente al agente biológicamente activo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, el método comprende además el suministro de uno o más agentes biológicamente activos. Por ejemplo, el agente biológicamente activo es un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, una citocina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente antihormonal, un inhibidor de la cinasa, un agente antiangiogénico, un cardioprotector, una toxina, un radioisótopo o una combinación de los mismos.

En un ejemplo adicional, el método proporciona un método para marcar una célula que expresa B7-H4 en su superficie celular, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto la célula con una composición de bioconjugado que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo unido operativamente a un agente de marcaje, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otro ejemplo, el marcaje se lleva a cabo in vivo. En otro ejemplo, el marcaje permite capturar imágenes de la célula, donde, en otro ejemplo, el marcaje permite capturar imágenes de la célula y supervisar la progresión de una enfermedad relacionada con la expresión de B7-H4 en la superficie de la célula. En otro ejemplo, la célula es una célula tumoral o un macrófago asociado a tumor (TAM). En un ejemplo, los TAM inhiben la proliferación y activación de linfocitos T de una manera dependiente de B7H4.

En un ejemplo, la divulgación proporciona un método para restaurar la replicación de linfocitos T asociada con una respuesta inmunitaria antitumoral en un sujeto después de la supresión inmunitaria mediada por macrófagos asociados a tumores (TAM) en el sujeto, comprendiendo el método la etapa de administrar al sujeto una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En un ejemplo, la divulgación proporciona un método para supervisar la frecuencia de una célula tumoral en un sujeto que tiene un crecimiento tumoral, comprendiendo el método la etapa de a) obtener una muestra biológica del sujeto, b) poner en contacto la muestra biológica con una composición de bioconjugado que comprende el anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo unido operativamente a un agente de marcaje y c) supervisar la progresión de la expresión en superficie celular de B7-H4 en una muestra biológica, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En otro ejemplo, el agente de marcaje proporcionado en el presente documento es un punto cuántico de nanopartícula, un fluoróforo, un cianuro, un péptido con marcaje radioactivo, una nanopartícula magnética, un cromóforo o un marcador de localización. En otro ejemplo, el marcaje se lleva a cabo in vivo y permite la captura de imágenes de la célula.

En otro ejemplo, la captura de imágenes de células incluye cualquier tipo de técnica de captura de imágenes conocida en este campo, incluyendo captura de imágenes in vivo e in vitro. En otro ejemplo, la captura de imágenes es captura de imágenes óptica, captura de imágenes de fluorescencia, captura de imágenes de dispersión, captura de imágenes de lapso temporal, captura de imágenes en vivo, captura de imágenes colorimétrica, captura de imágenes de microscopia electrónica, captura de imágenes por resonancia magnética o una combinación de las mismas.

En otro ejemplo, la divulgación se refiere a un método para efectuar una respuesta inmunitaria terapéutica antitumoral mediada por linfocitos T en un sujeto que tenga una supresión de la respuesta inmunitaria antitumoral, en donde la inmunosupresión está mediada por una célula que expresa B7-H4 en el sujeto, comprendiendo el método la etapa de administrar al sujeto una composición que comprende un linfocito T recombinante específico para la célula que expresa B7-H4, en donde el linfocito T recombinante comprende un receptor quimérico de antígeno que comprende a) un ectodominio que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 o fragmento del mismo, b) un dominio transmembrana y c) un endodominio del receptor de linfocitos T, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está codificado por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

Composición de CAR

La presente divulgación abarca una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias de un anticuerpo de la invención que se une específicamente a B7-H4 humano, en donde la secuencia del anticuerpo o un fragmento del mismo está unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico de un dominio intracelular. El dominio intracelular o, de otro modo, el dominio citoplasmático comprende una región de señalización coestimulante y/o una porción de cadena zeta. La región de señalización coestimulante se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimulante. Las moléculas coestimulantes son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que son necesarias para una respuesta eficiente de los linfocitos al antígeno.

La presente divulgación abarca una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias de un CAR completamente humano, en donde la secuencia comprende la secuencia de ácido nucleico de un dominio de unión a B7-H4 unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico de un dominio intracelular. Un dominio intracelular ilustrativo que puede usarse en el CAR incluye, pero sin limitación, el dominio intracelular de CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares. En algunos casos, el CAR puede comprender cualquier combinación de CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares.

Entre el dominio extracelular y el dominio transmembrana del CAR, o entre el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana del CAR, se puede incorporar un dominio espaciador. Como se usa en el presente documento, la expresión "dominio espaciador" significa en general cualquier oligo o polipéptido que actúe para ligar el dominio transmembrana a, ya sea el dominio extracelular o el dominio citoplasmático, en la cadena polipeptídica. Un dominio espaciador puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente de 10 a 100 aminoácidos y más preferentemente de 25 a 50 aminoácidos.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener usando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, explorando bibliotecas de células que expresan el gen, obteniendo el gen de un vector que se sabe que lo incluye o aislando directamente de células y tejidos que lo contienen, usando técnicas convencionales. Como alternativa, el gen de interés se puede producir de manera sintética, en lugar de clonarse.

Resto de unión a antígeno

En un aspecto de la divulgación, el CAR comprende un elemento de unión específico de diana, también denominado resto de unión a antígeno. La elección del resto depende del tipo y el número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular en células diana asociadas con una patología determinada. De este modo, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos para el dominio de resto antigénico en el CAR incluyen los asociados con infecciones víricas, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas.

En un aspecto, la respuesta de linfocitos T mediada por CAR puede dirigirse a un antígeno de interés por medio de introducción por ingeniería genética de un antígeno deseado en el CAR. En el contexto de la presente divulgación, "antígeno tumoral" o "antígeno de trastorno hiperproliferativo" o "antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo" se refiere a antígenos que son comunes a trastornos hiperproliferativos específicos. En determinados aspectos, los antígenos de trastornos hiperproliferativos se obtienen de cánceres que incluyen, pero sin limitación, melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y similares.

En un aspecto, el antígeno tumoral de la presente divulgación comprende uno o más epítopos antigénicos de cáncer reconocidos inmunológicamente por linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) procedentes de un tumor canceroso de un mamífero.

Por ejemplo, la parte del resto de unión a antígeno del CAR se dirige a B7-H4, preferentemente B7-H4 humana. El dominio de unión a antígeno puede ser cualquier dominio que se una al antígeno, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión a antígeno proceda de la misma especie en la que finalmente se utilizará el CAR. Por ejemplo, para su uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión a antígeno del CAR comprenda un anticuerpo humano o fragmento del mismo. Por tanto, la parte del dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.

Para el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos, puede ser preferible usar anticuerpos humanos. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos se pueden preparar mediante diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación en fagos usando bibliotecas de anticuerpos procedentes de secuencias de inmunoglobulina humana, incluyendo mejoras de estas técnicas. Véase, también, las patentes de los Estados Unidos n.° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Un anticuerpo humano también puede ser un anticuerpo en donde las cadenas pesadas y ligeras están codificadas por una secuencia de nucleótidos procedente de una o más fuentes de ADN humano.

También se pueden producir anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana pueden introducirse aleatoriamente o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Como alternativa, la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes de cadenas pesadas y ligeras humanas. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se crían después para producir descendencia homocigota que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera normal con un antígeno seleccionado, p. ej., todo o parte de un polipéptido de la invención. Pueden obtenerse anticuerpos anti-B7-H4 dirigidos contra el antígeno B7-H4 humano de los ratones transgénicos inmunizados usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se redisponen durante la diferenciación de linfocitos B y experimentan posteriormente cambio de clase y mutación somática. Por tanto, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles, incluyendo, pero sin limitación, IgG1 (gamma 1) e IgG3. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase, Lonberg y Huszar (Int. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)). Para un análisis detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y los protocolos para producir dichos anticuerpos, véase, p. ej., las publicaciones PCT n.° WO 98/24893, WO 96/34096 y WO 96/33735; y las patentes de los Estados Unidos n.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; y 5.939.598. Además, se puede contactar con compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, California) y Genpharm (San José, California) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente. Para un análisis específico de la transferencia de una matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana en ratones mutantes de línea germinal que dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno, véase, p. ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993); y Duchosal et al., Nature, 355: 258 (1992).

Los anticuerpos humanos también pueden proceder de bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech., 14: 309 (1996)). Se puede usar tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al., Nature, 348: 552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes sin inmunizar. Según esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo en el marco de un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. La presentación en fagos puede realizarse en diversos formatos; para su revisión, véase, p. ej., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación en fagos. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos antioxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V procedentes de los bazos de ratones sin inmunizar. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos sin inmunizar y pueden aislarse anticuerpos para una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) o Griffith et al., Em BO J., 12: 725-734 (1993). Véanse, también, las patentes de los Estados Unidos n.° 5.565.332 y 5.573.905.

También pueden generarse anticuerpos humanos mediante linfocitos B activados in vitro (véanse, las patentes de los Estados Unidos n.° 5.567.610 y 5.229.275). También pueden generarse anticuerpos humanos in vitro usando técnicas de hibridoma tales como, pero sin limitación, las descritas por Roder et al. (Methods Enzymol., 121: 140-167 (1986)).

Como alternativa, en algunas realizaciones, se humaniza un anticuerpo no humano, donde se modifican secuencias o regiones específicas del anticuerpo para aumentar la similitud con un anticuerpo producido de forma natural en un ser humano. En una realización, se humaniza la parte de dominio de unión a antígeno.

Se puede producir un anticuerpo humanizado usando diversas técnicas conocidas en este campo, incluyendo, pero sin limitación, injerto con CDR (véanse, p. ej., la patente europea n.° EP 239.400; la publicación internacional n.° WO 91/09967; y las patentes de los Estados Unidos n.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), rechapado o rebarnizado (véanse, p. ej., las patentes europeas n.° EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7 (6): 805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, 91: 969-973, redistribución de cadenas (véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos n.° 5.565.332), y técnicas desveladas en, p. ej., la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° US2005/0042664, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° US2005/0048617, la patente de los Estados Unidos n.° 6.407.213, la patente de los Estados Unidos n.° 5.766.886, la publicación internacional n.° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002)), Caldas et al., Protein Eng., 13 (5): 353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20 (3): 267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272 (16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9 (10): 895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 sup): 5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55 (8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150 (2): 409-10 (1994) y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235 (3): 959-73 (1994). Con frecuencia, los restos del marco conservado en las regiones de marco conservado se sustituirán por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones de marco conservado se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante modelado de las interacciones de la CDR y los restos del marco conservado para identificar los restos del marco conservado importantes para la unión a antígenos y comparación de secuencias para identificar restos del marco conservado inusuales en posiciones determinadas. (Véanse, p. ej., Queen et al., patente de los Estados Unidos n.° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323).

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan con frecuencia restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". Por tanto, los anticuerpos humanizados comprenden una o más CDR de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones marco conservadas de seres humanos. La humanización de anticuerpos es bien conocida en la técnica y esencialmente se puede realizar siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo con CDR o secuencias de CDR de roedor las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicación PCT n.° Wo 91/09967; y las patentes de los Estados Unidos n.° 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640). En dichos anticuerpos quiméricos humanizados, se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos del marco conservado (FR) se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de anticuerpos también se puede lograr mediante rebarnizado o rechapado (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7 (6): 805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91: 969-973 (1994)) o redistribución de cadenas (patente de los Estados Unidos n.° 5.565.332).

En algunos casos, un scFv humano también puede obtenerse de una biblioteca de presentación en levadura.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. Según el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta entonces como el marco conservado (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método usa un marco conservado determinado procedente de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo determinado de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco conservado se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

En algunas realizaciones, el anticuerpo se humaniza con conservación de alta afinidad por el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. Según otro aspecto de la invención, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están habitualmente disponibles y son conocidos para los expertos en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite un análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno diana. De esta manera, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias receptoras y de importación para que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el antígeno diana. En general, los restos de la CDR están implicados directa y más sustancialmente en la influencia sobre la unión al antígeno.

Un anticuerpo humanizado conserva una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, es decir, en la presente invención, la capacidad de unirse a B7-H4 humana. Sin embargo, usando determinados métodos de humanización, la afinidad y/o especificidad de unión del anticuerpo por B7-H4 humano puede aumentarse usando métodos de "evolución dirigida", como se describe en Wu et al., J. Mol. Biol., 294: 151 (1999).

Dominio transmembrana

Con respecto al dominio transmembrana, el CAR se puede diseñar para que comprenda un dominio transmembrana que se fusione con el dominio extracelular del CAR. En un ejemplo, se puede usar el dominio transmembrana que se asocia de forma natural a uno de los dominios en el CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se puede seleccionar o modificar mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana superficial para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede proceder de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Pueden obtenerse regiones transmembrana de uso determinado (es decir, comprenden al menos la región o regiones transmembrana) del receptor de linfocitos T de cadena alfa, beta o zeta, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunos casos, se pueden emplear diversas bisagras humanas, incluyendo también la bisagra de Ig humana (inmunoglobulina).

En un ejemplo, el dominio transmembrana puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá restos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. Preferentemente, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. Opcionalmente, un conector oligo o polipeptídico corto, preferentemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado.

Dominio citoplasmático

El dominio citoplasmático o, de lo contrario, el dominio de señalización intracelular del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha colocado el CAR. La expresión "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluyendo la secreción de citocinas. Por tanto, la expresión "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige a la célula a realizar una función especializada. Si bien, habitualmente, se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar toda la cadena. En la medida en que se use una parte truncada del dominio de señalización intracelular, dicha parte truncada se puede usar en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de función efectora. Por tanto, se entiende que la expresión dominio de señalización intracelular incluye cualquier parte truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

Los ejemplos preferidos de dominios de señalización intracelular para su uso en el CAR incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de linfocitos T (TCR) y los correceptores que actúan en concierto para iniciar la transducción de la señal después de la activación del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación total del linfocito T y que también es necesaria una señal secundaria o coestimulante. Por tanto, se puede decir que la activación de los linfocitos T está mediada por dos clases definidas de secuencia de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimulante (secuencias de señalización citoplasmáticas secundarias).

Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias regulan la activación primaria del complejo TCR, ya sea de forma estimulante o inhibidora. Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que actúan de manera estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM.

Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que son de uso particular en la invención incluyen los derivados de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Se prefiere en particular que la molécula de señalización citoplasmática en el CAR comprenda una secuencia de señalización citoplasmática derivada de CD3-zeta.

Por ejemplo, el dominio citoplasmático del CAR puede diseñarse para que comprenda el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio o dominios citoplasmáticos deseados útiles en el contexto del CAR. Por ejemplo, el dominio citoplasmático del CAR puede comprender una parte de cadena CD3 zeta y una región de señalización coestimulante. La región de señalización coestimulante se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimulante. Una molécula coestimulante es una molécula de superficie celular que no es un receptor de antígeno o sus ligandos que es necesaria para una respuesta eficaz de linfocitos hacia un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares. Por tanto, aunque la divulgación se ilustra principalmente con CD28 y 4-1BB como elemento de señalización coestimulante, son posibles otros elementos coestimulantes.

Las secuencias de señalización citoplasmáticas dentro de la parte de señalización citoplasmática del CAR de la invención pueden estar unidas entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un conector oligo o polipeptídico corto, preferentemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado.

En un ejemplo, el dominio citoplasmático está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En otro ejemplo, el dominio citoplasmático está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB.

Vectores

La presente divulgación también proporciona vectores en los que se inserta un ADN de la presente invención. Los vectores que provienen de retrovirus tales como el lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia génica a largo plazo, ya que permiten la integración estable, a largo plazo, de un transgén y su propagación en células descendientes. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja añadida sobre los vectores procedentes de onco-retrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferativas, tales como hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de baja inmunogenicidad.

En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican CAR se logra normalmente uniendo operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o partes del mismo a un promotor, e incorporando la construcción en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación y la integración en eucariotas. Los vectores de clonación habituales contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

El ácido nucleico se puede clonar en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, pero sin limitación, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de especial interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

Adicionalmente, el vector de expresión se puede proporcionar a una célula en forma de un vector vírico. La tecnología de vectores víricos es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-3 (3a ed., Cold Spring Harbor Press, NY 2001) y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus, que son útiles como vectores, incluyen, pero sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios convenientes de endonucleasas de restricción y uno o más marcadores seleccionables, (p. ej., documentos WO 01/96584; WO 01/29058; y patente de los Estados Unidos n.° 6.326.193).

Elementos promotores adicionales, p. ej., potenciadores, regulan la frecuencia de iniciación de la transcripción. Normalmente, estos se ubican en la región de 30-110 pb cadena arriba del sitio de inicio, aunque recientemente se ha mostrado que varios promotores contienen también elementos funcionales cadena abajo del sitio de inicio. La separación entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de modo que se conserva la función del promotor cuando los elementos se invierten o se mueven unos con respecto a los otros. En el promotor de timidina cinasa (tk), la separación entre los elementos promotores se puede aumentar a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden actuar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción.

Un ejemplo de un promotor es la secuencia promotora de citomegalovirus (CMV) temprana inmediata. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica unida operativamente a la misma. Sin embargo, también se pueden usar otras secuencias promotoras constitutivas, incluyendo, pero sin limitación, promotor temprano del virus de los simios 40 (SV40), virus de tumor mamario de ratón (MMTV), promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), promotor de MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, pero sin limitación, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina cinasa. Adicionalmente, la divulgación no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la divulgación. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica que está unida operativamente cuando se desea dicha expresión o inactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero sin limitación, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

Para evaluar la expresión de un polipéptido CAR o partes del mismo, el vector de expresión que se introducirá en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células con expresión de la población de células que se busca transfectar o infectar a través de vectores víricos. En otros aspectos, el marcador seleccionable se puede transportar en una pieza separada de ADN y se puede usar en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras adecuadas para permitir la expresión en las células hospedadoras. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.

Se usan genes indicadores para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen indicador es un gen que no está presente en ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, p. ej., actividad enzimática. La expresión del gen indicador se analiza en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican la luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (p. ej., Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y se pueden preparar usando técnicas conocidas o se pueden obtener comercialmente. En general, la construcción con la región mínima flanqueante 5' que muestra el nivel de expresión más alto del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden estar ligadas a un gen indicador y se pueden usar para evaluar la capacidad de los agentes de modular la transcripción impulsada por el promotor.

Los métodos para introducir y expresar genes en una célula son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, el vector se puede introducir fácilmente en una célula hospedadora, p. ej., una célula de mamífero, bacteriana, de levadura o de insecto por cualquier método en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL volúmenes 1-3 (4a ed., Cold Spring Harbor Press, NY 2012).

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos, se han convertido en el método más utilizado para insertar genes en células de mamíferos, p. ej., humanas. Otros vectores víricos pueden proceder de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 5.350.674 y 5.585.362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ilustrativo para su uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (p. ej., una vesícula de membrana artificial). En el caso en el que se utilice un sistema de suministro no vírico, un vehículo de suministro ilustrativo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, inmovilizado en un liposoma, en complejo con un liposoma, disperso en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o en complejo con una micela o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no están limitadas a ninguna estructura determinada en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden simplemente entremezclarse en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos naturales o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas de grasa que se dan de manera natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Se pueden obtener lípidos adecuados para su uso de fuentes comerciales. Por ejemplo, se puede obtener dimiristil fosfatidilcolina ("Dm Pc ") de Sigma, San Luis, MO; se puede obtener fosfato de dicetilo ("DCP") de K & K Laboratories (Plainview, NY); se puede obtener colesterol ("Choi") de Calbiochem-Behring; se pueden obtener dimiristilfosfatidilglicerol ("DM-PG") y otros lípidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Las soluciones de reserva de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20 °C. Se usa cloroformo como el único disolvente ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca diversos vehículos lipídicos simples y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos cerrados. Los liposomas se pueden caracterizar por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan complejos de lipofectamine-ácido nucleico.

Fuentes de linfocitos T

Antes de la expansión y modificación genética, se obtiene una fuente de linfocitos T de un sujeto. Se entiende que el término "sujeto" incluye organismos vivos en los que se puede inducir una respuesta inmunitaria (p. ej., mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Se pueden obtener linfocitos T de varias fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinados aspectos de la presente divulgación, puede usarse cualquiera de varias líneas de linfocitos T disponibles en la técnica. En determinados aspectos de la presente divulgación, se pueden obtener linfocitos T de una unidad de sangre recogida de un sujeto usando cualquiera de varias técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como la separación con Ficoll™. Por ejemplo, se obtienen células de la sangre en circulación de un individuo por aféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluyendo linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Por ejemplo, las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio adecuado para las etapas de procesamiento posteriores. En un aspecto de la divulgación, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En un aspecto alternativo, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no todos, los cationes divalentes. De nuevo, sorprendentemente, las etapas iniciales de activación en ausencia de calcio conducen a un aumento de la activación. Como apreciarán fácilmente los expertos en la materia, se puede realizar una etapa de lavado mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, tal como mediante el uso de una centrífuga semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) según las instrucciones del fabricante. Tras el lavado, las células se pueden resuspender en diversos tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS sin Ca, sin Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Como alternativa, los componentes indeseables de la muestra de aféresis se pueden eliminar y las células se pueden resuspender directamente en medios de cultivo.

En otro ejemplo, los linfocitos T se aíslan de linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™ o mediante elutriación centrífuga a contraflujo. Una subpoblación específica de linfocitos T, tal como linfocitos T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, se aíslan linfocitos T mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3x28), tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de los linfocitos T deseados. En un ejemplo, el periodo de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En un ejemplo adicional, el periodo de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros entre ellos. En un ejemplo adicional, el periodo de tiempo es de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otro ejemplo más, el periodo de tiempo es de 10 a 24 horas. En un ejemplo preferido, el periodo de tiempo de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de linfocitos T de pacientes con leucemia, el uso de tiempos de incubación más largos, tales como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Se pueden usar tiempos de incubación más largos para aislar linfocitos T en cualquier situación en la que haya pocos linfocitos T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de tejido tumoral o de individuos inmunodeprimidos. Adicionalmente, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficiencia de captura de linfocitos T CD8+. Por tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo que se permite que los linfocitos T se unan a las perlas CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la relación de perlas con respecto a linfocitos T (como se describe más adelante en el presente documento), las subpoblaciones de linfocitos T pueden seleccionarse preferentemente positiva o negativamente al inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Adicionalmente, aumentando o disminuyendo la relación de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, las subpoblaciones de linfocitos T pueden seleccionarse preferentemente positiva o negativamente al inicio del cultivo o en otros momentos deseados. El experto en la materia reconocerá que también se pueden usar múltiples ciclos de selección en el contexto de la presente divulgación. En determinados aspectos, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y usar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a ciclos adicionales de selección.

El enriquecimiento de una población de linfocitos T por selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas negativamente. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, una mezcla de anticuerpos monoclonales incluye normalmente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En determinados aspectos, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente los linfocitos T reguladores que normalmente expresan CD4+, CD25+, CD62Lalto, GITR+ y FoxP3+. Como alternativa, en determinados aspectos, los linfocitos T reguladores se agotan mediante perlas conjugadas anti-C25 u otro método similar de selección.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, la concentración de células y superficie (p. ej., partículas tales como perlas) puede variar. En determinadas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las perlas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de células y perlas. Por ejemplo, se usa una concentración de 2 mil millones de células/ml. En un ejemplo, se usa una concentración de 1 mil millones de células/ml. En una realización adicional, se usan más de 100 millones de células/ml. En un ejemplo adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otro ejemplo más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En ejemplos adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede dar lugar a un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Adicionalmente, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como linfocitos T CD28 negativos, o de muestras donde hay muchas células tumorales presentes (es decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de alta concentración de células permite una selección más eficiente de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En un aspecto relacionado, puede ser deseable usar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de linfocitos T y la superficie (p. ej., partículas tales como perlas), las interacciones entre las partículas y las células se minimizan. Esto selecciona las células que expresan altas cantidades de antígenos deseados para unirse a las partículas. Por ejemplo, los linfocitos T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y se capturan más eficazmente que los linfocitos T CD8+ en concentraciones diluidas. En un ejemplo, la concentración de células usada es de 5x106/ml. En otros ejemplos, la concentración usada puede ser de aproximadamente 1 x 105/ml a 1 x 106/ml y cualquier valor entero intermedio.

En otro ejemplo, las células se pueden incubar en un rotador durante periodos de tiempo variables a velocidades variables a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

Los linfocitos T para la estimulación también se pueden congelar después de una etapa de lavado. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, la etapa de congelación y descongelación posterior proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos en la población celular. Después de la etapa de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Aunque muchas soluciones y parámetros de congelación se conocen en la técnica y serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contiene 20 % de DMSO y 8 % de albúmina de suero humano, o medios de cultivo que contienen 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de seroalbúmina humana y 7,5 % de DMSO, o 31,25 % de Plasmalyte-A, 31,25 % de dextrosa 5 %, 0,45 % de NaCl, 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de seroalbúmina humana y 7,5 % de DMSO u otro medio de congelación celular adecuado que contenga, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, después, las células se congelan a -80 °C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden usar otros métodos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

En determinados aspectos, las células crioconservadas se descongelan y lavan como se describe en el presente documento y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación usando los métodos de la presente divulgación.

También se contempla en el contexto de la divulgación la recogida de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un periodo de tiempo anterior a cuando las células expandidas como se describen en el presente documento podrían ser necesarias. Como tal, la fuente de las células que se van a expandir se puede recoger en cualquier momento necesario, y las células deseadas, tales como linfocitos T, se aíslan y congelan para su uso posterior en la terapia con linfocitos T para cualquiera de varias enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con linfocitos T, tales como las descritas en el presente documento. Como ejemplo, se puede tomar una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto en general sano. En determinados ejemplos, se puede tomar una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto en general sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y congelan para su uso posterior. En determinados ejemplos, los linfocitos T pueden expandirse, congelarse y utilizarse en un momento posterior. En determinados ejemplos, se recogen muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad determinada como se describe en el presente documento pero antes de cualquier tratamiento. Como ejemplo adicional, las células pueden aislarse de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivíricos, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, cytoxan, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316­ 321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993). En un ejemplo adicional, las células se aíslan para un paciente y se congelan para su uso posterior junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después de) trasplante de médula ósea o de células madre, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes quimioterapéuticos tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otro ejemplo, las células se pueden aislar antes y se pueden congelar para su uso posterior para el tratamiento después de la terapia ablativa de linfocitos B, tales como agentes que reaccionan con CD20, p. ej., Rituxan.

En un aspecto adicional de la presente divulgación, se obtienen linfocitos T de un paciente directamente después del tratamiento. A este respecto, se ha observado que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en particular, tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el periodo en el que los pacientes normalmente se estarían recuperando del tratamiento, la calidad de los linfocitos T obtenidos puede ser óptima o mejorada para su capacidad de expandirse ex vivo. De manera análoga, tras la manipulación ex vivo usando los métodos descritos en el presente documento, estas células pueden estar en un estado preferido para un injerto mejorado y expansión in vivo. Por tanto, se contempla recoger células sanguíneas, incluyendo linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Adicionalmente, se pueden usar movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y regímenes de acondicionamiento para crear una condición en un sujeto en donde la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de determinados tipos celulares se favorece, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia. Los tipos de células ilustrativas incluyen linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

Activación y expansión de linfocitos T

Los linfocitos T se activan y expanden en general usando métodos como se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20060121005.

En general, los linfocitos T de la invención se pueden expandir por contacto con una superficie que tiene unido un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimulante en la superficie de los linfocitos T. En particular, las poblaciones de linfocitos T se pueden estimular como se describe en el presente documento, tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína cinasa C (p. ej., briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de linfocitos T se puede poner en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones adecuadas para estimular la proliferación de los linfocitos T. Para estimular la proliferación de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besanzón, Francia) se pueden utilizar al igual que otros métodos habitualmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30 (8): 3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190 (9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227 (1-2): 53-63, 1999).

En determinados aspectos, la señal estimulante primaria y la señal coestimulante para los linfocitos T se pueden proporcionar por diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes se pueden acoplar a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies separadas (es decir, en trans). Como alternativa, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En una realización, el agente que proporciona la señal coestimulante está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. Por ejemplo, ambos agentes pueden estar en solución. En otro ejemplo, los agentes pueden estar en forma soluble y después reticulados en una superficie, tal como una célula que expresa receptores de Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, véase, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de linfocitos T.

En un ejemplo, los dos agentes pueden inmovilizarse en perlas, ya sea en la misma perla, es decir, en cis, o en perlas separadas, es decir, en trans. A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimulante es un anticuerpo anti-CD28 o fragmento de unión a antígeno del mismo; y ambos agentes se inmovilizan conjuntamente en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un ejemplo, se usa una relación de 1:1 de cada anticuerpo unido a las perlas para expansión de linfocitos T CD4+ y crecimiento de linfocitos T. En determinados aspectos de la presente divulgación, se usa una relación de anticuerpos anti-CD3:CD28 unidos a las perlas de manera que se observa un aumento en la expansión de linfocitos T en comparación con la expansión observada usando una relación de 1:1. En un ejemplo particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada usando una relación de 1:1. En un ejemplo, la relación de anticuerpo CD3:CD28 unido a las perlas varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto de la presente divulgación, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación de CD3:CD28 es menor de uno. En determinados aspectos de la divulgación, la relación de anticuerpo anti-CD28 con respecto a anticuerpo anti-CD3 unido a las perlas es mayor de 2:1. En un ejemplo determinado, se usa una relación de CD3:CD28 1:100 de anticuerpo unido a perlas. En otro ejemplo, se usa una relación de CD3:CD28 1:75 de anticuerpo unido a perlas. En un ejemplo adicional, se usa una relación de CD3:CD281:50 de anticuerpo unido a perlas. En otro ejemplo, se usa una relación de CD3:CD281:30 de anticuerpo unido a perlas. En un ejemplo preferido, se usa una relación de CD3:CD28 1:10 de anticuerpo unido a perlas. En otro ejemplo, se usa una relación de CD3:CD28 1:3 de anticuerpo unido a las perlas. En otro ejemplo más, se usa una relación de CD3:CD283:1 de anticuerpo unido a las perlas.

Las relaciones de partículas con respecto a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero en el medio se puede usar para estimular linfocitos T u otras células diana. Como pueden apreciar fácilmente los expertos habituales en la materia, la relación de partículas con respecto a células puede depender del tamaño de partícula en relación con la célula diana. Por ejemplo, las perlas de pequeño tamaño solo podrían unirse a algunas células, mientras que perlas mayores podrían unirse a muchas. En determinados ejemplos, la relación de células frente a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio y en realizaciones adicionales, la relación comprende de 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero intermedio, también se puede usar para estimular linfocitos T. La relación de partículas acopladas anti-CD3 y anti-CD28 frente a linfocitos T que dan lugar a la estimulación de linfocitos T puede variar como se ha indicado anteriormente, sin embargo, determinados valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 y 15:1 con una relación preferida de al menos 1:1 partículas por linfocito T. En un ejemplo, se usa una relación de partículas frente a células de 1:1 o menos. En un ejemplo determinado, una relación preferida de partículas:células es 1:5. En ejemplos adicionales, la relación de partículas con respecto a células puede variar dependiendo del día de la estimulación. Por ejemplo, la relación de partículas con respecto a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células todos los días o cada dos días a partir de entonces durante un máximo de 10 días, a relaciones finales de 1:1 a 1:10 (basado en recuentos celulares el día de la adición). En un ejemplo determinado, la relación de partículas con respecto a células es de 1:1 el primer día de estimulación y ajustada a 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En otro ejemplo, se añaden partículas diariamente o cada dos días en una relación final de 1:1 el primer día y 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En otro ejemplo, la relación de partículas con respecto a células es de 2:1 el primer día de estimulación y ajustada a 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. En otro ejemplo, las partículas se añaden diariamente o cada dos días a una relación final de 1:1 el primer día y 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que pueden ser adecuadas diversas otras relaciones. En particular, las relaciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y del tamaño y tipo de célula.

En aspectos adicionales de la presente divulgación, las células, tales como linfocitos T, se combinan con perlas recubiertas de agente, las perlas y las células se separan posteriormente y después las células se cultivan. Como alternativa, antes del cultivo, las perlas y las células recubiertas con agente no se separan sino que se cultivan juntas. En un ejemplo adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, que da lugar a un aumento de la fijación de marcadores de la superficie celular, induciendo de este modo la estimulación celular.

A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden ligarse permitiendo que las perlas paramagnéticas a las que se unen los anti-CD3 y anti-CD28 (3x28 perlas) entren en contacto con los linfocitos T. En un ejemplo, las células (por ejemplo, de 104 a 109 linfocitos T) y las perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M450 CD3/CD28 T en una relación de 1:1) se combinan en un tampón, preferentemente PBS (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). De nuevo, los expertos en la materia pueden apreciar fácilmente que se puede usar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy infrecuente en la muestra y comprender solo el 0,01 % de la muestra o toda la muestra (es decir, el 100 %) puede comprender la célula diana de interés. Por consiguiente, cualquier número de células está dentro del contexto de la presente divulgación. En determinados ejemplos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de células y partículas. Por ejemplo, se usa una concentración de aproximadamente 2 mil millones de células/ml. En otro ejemplo, se usan más de 100 millones de células/ml. En un ejemplo adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otro ejemplo más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En ejemplos adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede dar lugar a un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Adicionalmente, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como linfocitos T CD28 negativos. Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en determinados ejemplos. Por ejemplo, el uso de alta concentración de células permite una selección más eficiente de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En un aspecto de la presente divulgación, la mezcla se puede cultivar durante varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 días o cualquier valor entero de horas intermedio. En otro ejemplo, la mezcla se puede cultivar durante 21 días. En un ejemplo, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante aproximadamente ocho días. En otro ejemplo, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante 2-3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación de modo que el tiempo de cultivo de los linfocitos T pueda ser de 60 días o más. Las condiciones adecuadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio adecuado (p. ej., medio mínimo esencial o medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluyendo suero (p. ej., suero bovino fetal o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-Y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la materia. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero sin limitación, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o complementados con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina o citocinas suficiente para el crecimiento y la expansión de los linfocitos T. Se incluyen antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina, solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (p. ej., 37 °C) y atmósfera (p. ej., aire más CO2 al 5 %) adecuadas.

Los linfocitos T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden presentar características diferentes. Por ejemplo, los productos de células mononucleares de sangre periférica sometida a aféresis o típica tienen una población de linfocitos T auxiliares (T^h, CD4+) que es mayor que la población de linfocitos T citotóxicos o supresores (T^c, CD8+). La expansión ex vivo de linfocitos T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de linfocitos T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en linfocitos Th, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de linfocitos T comprende una población cada vez mayor de linfocitos T^c. Por consiguiente, dependiendo del fin del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto con una población de linfocitos T que comprende predominantemente linfocitos Th. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto específico de antígeno de linfocitos T^c, puede ser beneficioso expandir este subconjunto en mayor grado.

Adicionalmente, además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero, en gran parte, de manera reproducible durante el trascurso del proceso de expansión celular. Por tanto, dicha reproducibilidad permite la capacidad de personalizar un producto de linfocitos T activados para fines específicos.

Aplicación terapéutica

En una realización, la invención se refiere a medios para inhibir el crecimiento de una célula tumoral que expresa B7-H4, que comprenden poner en contacto la célula tumoral con al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo de la invención de manera que se inhiba el crecimiento de la célula tumoral.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para inhibir el crecimiento de una célula tumoral que expresa B7-H4, que comprende poner en contacto la célula tumoral con un linfocito T CAR anti-B7-H4 de la presente divulgación de manera que se inhiba el crecimiento de la célula tumoral.

En otro aspecto, la invención se refiere a medios para tratar el cáncer en un sujeto. Estos comprenden administrar al sujeto un anticuerpo o un fragmento de la invención o un linfocito T CAR anti-B7-H4 de la presente invención de manera que se trate el cáncer en el sujeto. Son cánceres particularmente preferidos para el tratamiento los carcinomas hepatocelulares, cánceres pancreáticos, cánceres de ovario, cánceres de estómago, cánceres de pulmón y cánceres de endometrio. En otras realizaciones más, el cáncer que se va a tratar se selecciona del grupo que consiste en carcinomas hepatocelulares, adenocarcinomas serosos papilares de ovario, carcinomas de ovario de células claras, carcinomas de ovario mixtos de Muller, carcinomas endometroides mucinosos de ovario, adenocarcinomas de páncreas, adenocarcinomas ductales de páncreas, carcinomas serosos de útero, adenocarcinomas de pulmón, carcinomas extrahepáticos de las vías biliares, adenocarcinomas gástricos, adenocarcinomas de esófago, adenocarcinomas colorrectales y adenocarcinomas de mama.

La presente divulgación incluye un tipo de terapia celular en la que los linfocitos T se modifican genéticamente para expresar un receptor quimérico de antígeno (CAR) y el linfocito T CAR se infunde a un receptor que lo necesite. La célula infundida puede eliminar células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, los linfocitos T modificados con CAR son capaces de replicarse in vivo dando lugar a una persistencia a largo plazo que puede llevar a un control tumoral sostenido. Los linfocitos T administrados al paciente, o su descendencia, persisten en el paciente durante al menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, trece meses, catorce meses, quince meses, dieciséis meses, diecisiete meses, dieciocho meses, diecinueve meses, veinte meses, veintiún meses, veintidós meses, veintitrés meses, dos años, tres años, cuatro años o cinco años después de la administración del linfocito T al paciente.

Sin desear quedar ligados a teoría particular alguna, la respuesta de inmunidad antitumoral inducida por los linfocitos T modificados con CAR puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva. Los linfocitos T transducidos con CAR completamente humanos presentan una secreción de citocinas proinflamatorias específicas y una potente actividad citolítica en respuesta a las células cancerosas humanas que expresan la B7-H4, resisten la inhibición de B7-H4 soluble, median en la muerte por vecindad y median en la regresión de un tumor humano establecido. Por ejemplo, las células tumorales sin antígeno dentro de un campo heterogéneo de tumor que expresa B7-H4 pueden ser susceptibles de destrucción indirecta por linfocitos T redirigidos a B7-H4 que han reaccionado previamente contra células cancerosas positivas para antígeno adyacentes.

Los linfocitos T modificados con CAR completamente humanos pueden ser un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

Con respecto a la inmunización ex vivo, se produce in vivo al menos uno de los siguientes antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR a las células o iii) crioconservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son bien conocidos en la técnica y se analizan más detalladamente a continuación. En resumen, las células se aíslan de un mamífero (preferentemente un ser humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR desvelado en el presente documento. La célula modificada con CAR se puede administrar a un receptor de mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor de mamífero puede ser humano y la célula modificada con CAR puede ser autóloga con respecto al receptor. Como alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

El procedimiento para la expansión ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 5.199.942. Otros métodos adecuados son conocidos en la técnica, por lo tanto, la presente invención no se limita a ningún método determinado de expansión ex vivo de las células. En resumen, el cultivo y la expansión ex vivo de los linfocitos T comprende: (1) recoger células madre hematopoyéticas CD34+ y células progenitoras de un mamífero de extracción de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir dichas células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente de los Estados Unidos n.° 5.199.942, otros factores tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, se pueden usar para el cultivo y la expansión de las células.

Además de usar una vacuna basada en células con respecto a inmunización ex vivo, la presente divulgación también proporciona composiciones y métodos para inmunización in vivo para inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno en un paciente.

En general, las células activadas y expandidas como se describe en el presente documento se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, los linfocitos T modificados con CAR pueden usarse en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión desregulada de B7-H4. Las células pueden usarse en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión desregulada de B7-H4. Por tanto, la presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión desregulada de B7-H4 que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de los linfocitos T modificados con CAR completamente humanos.

Los linfocitos T modificados con CAR se pueden administrar solos o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. En resumen, las composiciones farmacéuticas pueden comprender una población de células diana como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención se formulan preferentemente para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de una manera adecuada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de la administración estarán determinadas por factores tales como la condición del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis adecuadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos.

Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una cantidad eficaz antitumoral", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se va a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales de la edad, el peso, el tamaño del tumor, el grado de infección o metástasis, y la condición del paciente (sujeto). En general, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en el presente documento se puede administrar a una dosis de 104 a 109 células/kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos T también se pueden administrar múltiples veces a estas dosis. Las células se pueden administrar mediante el uso de técnicas de infusión que se conocen habitualmente en inmunoterapia (véase, p. ej., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Un experto en la materia de la medicina puede determinar fácilmente la dosis óptima y el régimen de tratamiento para un paciente en particular haciendo un seguimiento del paciente en busca de signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.

Se puede desear administrar linfocitos T activados a un sujeto y después volver a extraer sangre posteriormente (o realizar una aféresis), activar linfocitos T a partir de ella y reinfundir al paciente con estos linfocitos T activados y expandidos. Este proceso se puede llevar a cabo varias veces cada pocas semanas. Los linfocitos T se pueden activar a partir de extracciones de sangre de 10 cm3 a 400 cm3. Por ejemplo, los linfocitos T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cm3, 30 cm3, 40 cm3, 50 cm3, 60 cm3, 70 cm3, 80 cm3, 90 cm3 o 100 cm3. Sin desear quedar ligado a la teoría, usando este protocolo de extracción de sangre múltiple/reinfusión múltiple, se pueden seleccionar determinadas poblaciones de linfocitos T.

La administración de las composiciones objeto se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodular, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o por vía intraperitoneal. Las composiciones de linfocitos T se pueden administrar a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. Las composiciones de linfocitos T se administran preferentemente mediante inyección i.v. Las composiciones de linfocitos T se pueden inyectar directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

Las células activadas y expandidas usando los métodos descritos en el presente documento, u otros métodos conocidos en la técnica donde los linfocitos T se expanden a niveles terapéuticos, se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después de) cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como la terapia antivírica, cidofovir e interleucina-2, el tratamiento con citarabina (también conocido como ARA-C) o natalizumab para pacientes con EM o el tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. Los linfocitos T pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316­ 321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993). Las composiciones celulares de la presente divulgación se puede administrar a un paciente junto con (p. ej., antes, de manera simultánea o después de) trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes quimioterapéuticos tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. Por ejemplo, las composiciones celulares pueden administrarse tras una terapia ablativa de linfocitos B, tal como agentes que reaccionan con CD20, p. ej., Rituxan. Por ejemplo, los sujetos se pueden someter a un tratamiento convencional con altas dosis de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de sangre periférica. Por ejemplo, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En un ejemplo adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos anteriores que se va a administrar a un paciente variará según la naturaleza precisa de la afección que se está tratando y el receptor del tratamiento. Se puede variar la escala de las dosis para la administración en seres humanos según las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis para CAMPATH, por ejemplo, estará, en general, en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, administrado de forma habitual diariamente durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día, aunque en algunos casos se pueden usar dosis mayores de hasta 40 mg al día (descrita en la patente de los Estados Unidos n.° 6.120.766).

EJEMPLOS EXPERIMENTALES

La invención se describe adicionalmente en detalle por referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos.

Sin descripción adicional, se cree que un experto en la materia puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, preparar y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados.

Ejemplo 1: Anticuerpos anti-B7-H4

Los siguientes experimentos se diseñaron para aislar y caracterizar anticuerpos que se unen a B7-H4. Estos anticuerpos son óptimos para el desarrollo de aplicaciones terapéuticas in vivo y de diagnóstico.

Los materiales y métodos empleados en estos experimentos se describen a continuación.

Anticuerpos

Se detectó la expresión de scFv de presentación en levadura con anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón anti-cmyc, 9E10 y fragmento F(ab')2 Alexa-488 de cabra anti-IgG de ratón (H+L) (488 anti-IgG) o F(ab')2 de cabra PE-Cy7 anti-IgG de ratón (H+L) (PE-Cu5 anti-IgG). Se detectó la unión del antígeno biotinilado al scFv de presentación en levadura con anti-biotina-FITC de cabra o estreptavidina-PE. Se detectó la unión de ScFv a líneas celulares con mAb de ratón anti-V5 conjugado con APC y se detectó la unión de scFv al antígeno inmovilizado en plástico mediante mAb de ratón anti-V5 conjugado con HRP. Se detectó la unión de biocuerpos a células que expresaban B7-H4 con estreptavidina marcada con APC.

Identificación de scFv anti-B7-H4

La biblioteca scFv de presentación en levadura procedente de pacientes con cáncer de ovario se exploró en primer lugar mediante clasificación magnética y de flujo para scFv anti-B7-H4 usando concentraciones cada vez menores de proteína recombinante B7-H4 biotinilada humana (rhB7-H4). En resumen, la biblioteca se enriqueció magnéticamente 3 veces con respecto a scFv que se unió a 1 ug/ml de rhB7-H4 biotinilado y se clasificó en flujo dos veces con 1 ug/ml y 0,5 ug/ml de rhB7-H4 biotinilado. Los scFv de presentación en levadura seleccionados se clasificaron en flujo con respecto a clones positivos dobles de c-myc/B7-H4. Los plásmidos de ADN se extrajeron de fragmentos de scFv de presentación en levadura usando cebadores que permitían la recombinación homóloga con el vector de secreción de levadura p416-BCCP. Los cebadores usados fueron: Cebador de redistribución directo: 5'-ggttctggtggtggaggttctggtggtggtggatctg-3' (SEQ ID NO: 11); Cebador de redistribución inverso: 5'-gagaccgaggagagggttagggataggcttaccgtcgaccaagtcttcttcagaaataagctt-3' (SEQ ID NO: 12). Se cotransfectaron fragmentos de scFv y p416-BCCP linealizado en YVH10 mediante transformación química. El cribado de scFv soluble con respecto a la unión específica a B7-H4 biotinilado se realizó mediante ELISA de captura usando sobrenadantes de levadura purificados de alto rendimiento de 100 transformantes aleatorios inmovilizados en placas de amino. La unión a diluciones en serie de rB7-H4 biotinilado o proteína de control se detectó usando estreptavidina-HRP. Las señales colorimétricas se desarrollaron con solución de sustrato TMB inactivada con ácido sulfúrico y se leyeron a 450 nm en desviaciones de un Fluoroskan. La secuenciación de los clones de scFv 26 y 56 identificó 2 clones únicos que después se produjeron y se purificaron con Ni.

Medición de la afinidad de scFv por ELISA

Para evaluar la afinidad de scFv, se recubrieron placas de ELISA con rhB7-H4 a concentraciones decrecientes al doble de 0,4 a 0,05 pg/ml, en tampón de carbonato-bicarbonato. Después de bloquear con PBSM, los pocillos se incubaron con diluciones en serie de diez veces de scFv, a partir de 1 pM. La unión de scFv a proteínas inmovilizadas se detectó con HRP anti-V5. A continuación se desarrollaron señales colorimétricas.

Análisis de citometría de flujo

Se realizó análisis de la expresión de scFv por levadura. En resumen, se evaluó la unión de scFv anti-B7-H4 y biocuerpos a macrófagos y células tumorales que expresaban B7-H4. Se preincubaron scFv anti-B7-H4 durante 30 min a TA con APC-anti-V5 a una relación de 1/1 y se preincubaron biocuerpos anti-B7-H4 con perlas de estreptavidina marcadas con FITC. Se usó un scFv o biocuerpo no relevante como control negativo para la unión.

Modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

La línea celular de cáncer de ovario de ratón MOVI se obtiene de un cáncer de ovario que surge espontáneamente en ratones transgénicos hembras que expresan la región transformadora de SV40 bajo el control del promotor del gen del receptor de tipo II de la sustancia inhibidora de Muller (Tg-MISIIR-Tag). La línea celular MOV1 expresa el antígeno SV40. Para emular el cáncer de ovario se inyectaron células de cáncer de ovario de ratón, MOVI, ortotópicamente en la bolsa ovárica de ratones con anulación de NOD-Scid-Y (NSG). Se anestesian hembras multíparas de cuatro meses de edad según el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania (IAC^uC). Se hizo una incisión dorsolateral en la parte caudal izquierda del dorso del animal. Se diseca el retroperitoneo para exponer el ovario izquierdo usando las pinzas para agarrar, retraer, situar y fijar el órgano para inyección. Se inyectan cinco millones de células MOVI en la bolsa ovárica en un volumen de 20 pl de PBS usando una jeringa de insulina. Se cierran las incisiones retroperitoneales, se les administran antibióticos y líquidos a los animales y se supervisa el crecimiento tumoral mediante captura de imágenes in vivo.

Análisis de la distribución in vivo de biocuerpos anti-B7-H4 por microscopía confocal

El biocuerpo-26 anti-B7-H4 de alta afinidad se inyecta por vía intravenosa (IV) 3 semanas después de la implantación de las células tumorales. Como control del efecto de Retención y Permeabilidad Mejorada (EPR, por su siglas en inglés), se usan los biocuerpos anti-B7-H4 de baja afinidad. El bazo, el hígado, el riñón y los ovarios se extraen 24 o 48 h después de la inyección del biocuerpo y se conservan en un compuesto OCT de matriz de tejido congelado. Se cortan láminas de 5 pm de grosor de secciones congeladas, se secan al aire durante 1 h a TA y se fijan por inmersión en acetona fría al 100 % durante 5 min. Después de 2 lavados en PBS, las láminas se bloquean para la biotina endógena mediante un pretratamiento con una solución de bloqueo de avidina/biotina (avidina-leche desnatada al 0,001 % en PBS). La unión del biocuerpo anti-B7-H4 se detecta con estreptavidina conjugada con rodamina. Las células tumorales MOVI procedentes de un tumor Tg-MISIIR-TAg expresan SV40 y, por lo tanto, podrían detectarse con anticuerpo anti-marcador de SV40 (2 pg/ml) durante 30 min a TA, seguido de 1 pg/ml de Alexa-488 de cabra anti-IgG1K de ratón durante 30 min a TA. Las láminas se incuban con DAPI diluido 1/2000 durante 30 min a TA para visualizar los núcleos. Se adquieren señales fluorescentes mediante análisis confocal a aumento 63x.

Los resultados de los experimentos se describen a continuación.

Las células tumorales y los monocitos de ascitis y tumores sólidos de pacientes con cáncer de ovario expresan B7-H4 en las superficies celulares

Se ha mostrado la expresión en superficie celular de B7-H4 en macrófagos asociados a tumores, pero no en células de cáncer de ovario. Sin quedar ligados a teoría particular alguna, se cree que la expresión de B7-H4 en la superficie de las células tumorales permite el direccionamiento y sugiere la existencia de funciones inmunoinhibidoras alternativas de las células tumorales de ovario.

El análisis de la expresión en superficie de B7-H4 en células tumorales usando citometría de flujo reveló que estas células tumorales de hecho expresaban B7-H4 en la superficie celular (figura 1). Por lo tanto, se confirmó que B7-H4 se expresa en la superficie celular de células de cáncer de ovario nuevas (figura 1A) y monocitos (figura 1B).

Los macrófagos regulan positivamente la expresión de B7-H4 después del cocultivo con células de cáncer de ovario El análisis de la expresión en superficie de B7-H4 en monocitos de ascitis y tumores sólidos de pacientes con cáncer de ovario usando citometría de flujo reveló que estas células tumorales de hecho expresaban B7-H4 en la superficie celular (figura 2). Por lo tanto, se confirmó que B7-H4 se expresa en la superficie celular de macrófagos recién aislados de ascitis ovárica o tumores sólidos (figura 2A), así como de macrófagos madurados en presencia de IL4 e IL10 (figura 2B). Además, se demostró que el cocultivo con la línea de células tumorales OvCar3 que expresa B7-H4 también regula positivamente la expresión de B7-H4 (figura 2B).

Los macrófagos regulan de forma positiva fuertemente la expresión de B7-H4 después del cocultivo con línea celular de cáncer de ovario B7-H4+

Se llevó a cabo un sistema modelo in vitro de cocultivo celular en transwell, permitiendo intercambios químicos entre macrófagos derivados de monocitos humanos y la línea celular de cáncer de ovario humano Ovcar3. Cocultivo de macrófagos con macrófagos polarizados Ovcar3 hacia el fenotipo TAM.

El cocultivo Transwell de macrófagos con células tumorales permite una regulación positiva superior de B7-H4 en macrófagos en comparación con la estimulación con citocinas (IL4/IL10). Este sistema modelo permite estudiar la inducción de células tumorales de B7-H4 en macrófagos.

Aislamiento de anticuerpos recombinantes (scFv) anti-B7-H4 de una biblioteca de scFv de presentación en levadura El dominio extracelular de B7-H4 se clonó a partir de macrófagos cocultivados con ovcar3 y se expresó en células de mamífero. Se aislaron scFv contra B7-H4 explorando una biblioteca de scFv de presentación en levadura. Los scFv se convirtieron en forma soluble y se validó la unión específica en la proteína B7-H4 recombinante (figura 3A) y en macrófagos (figura 3B).

Estos resultados demuestran que los nuevos biocuerpos anti-B7-H4 en complejo con perlas marcadas con FITC de óxido de hierro de estreptavidina son más sensibles que el mAb anti-B7-H4 disponible en el mercado. Además, demuestra que la línea celular ovcar5 expresa B7-H4 ya que utilizando los nuevos scFv puede detectarse B7-H4 incluso a niveles bajos de expresión (ovcar5) que no pueden detectarse con mAb comercial anti-B7-H4.

Los resultados demuestran además que una línea celular de cáncer de ovario establecida, OvCar3, expresa B7-H4 en la superficie celular; y una subpoblación de la línea celular OvCar5 también expresa B7-H4.

Expresión de B7-H4 en macrófagos y frecuencia de células tumorales

Después de medir la expresión de B7-H4 en macrófagos y la frecuencia de las células tumorales, se encontró que los dos estaban correlacionados positivamente, porque la expresión de B7-H4 en monocitos se correlacionó con el porcentaje de células tumorales en muestras de cáncer de ovario.

El bloqueo mediado por anti-B7-H4 de la supresión de linfocitos T mediada por B7-H4 por macrófagos promueve la proliferación de linfocitos T

Se ha demostrado además que el clon scFv n.° 26 anti-B7-H4 podría bloquear la supresión de linfocitos T mediada por B7-H4 por macrófagos y promover la proliferación de linfocitos T antitumorales (figura 4).

Por lo tanto, scFv 26, puede restaurar inesperadamente la proliferación de linfocitos T contra células tumorales en presencia de macrófagos y, por los tanto, puede ser una composición terapéutica útil contra estas células tumorales.

Ejemplo 2: Nuevos anticuerpos recombinantes humanos anti-B7-H4 superan la inhibición de linfocitos T mediada por B7-H4 y potencian las respuestas antitumorales de linfocitos T

B7-H4 (B7x/B7s), uno de los miembros identificados más recientemente de la superfamilia B7, actúa como modulador inhibidor de las respuestas de linfocitos T. B7-H4 es expresado por diversos cánceres humanos y la expresión de B7-H4 por macrófagos se ha correlacionado significativamente con estadios avanzados de cáncer de ovario y con una gran cantidad de linfocitos T reguladores que se infiltran en tumores. B7-H4 expresado en la superficie de macrófagos asociados a tumores (TAM) o APC sustitutas regula negativamente la activación de linfocitos T, posiblemente a través de la interacción con un ligando potencial y el bloqueo de B7-H4 por oligonucleótidos antisentido inhibió la supresión de macrófagos asociados a tumores y habilitó linfocitos T antitumorales in vitro e in vivo. Sin embargo, hasta la fecha, la expresión en superficie celular de B7-H4 no se ha entendido bien.

Los siguientes experimentos se diseñaron para estudiar la expresión en superficie celular de B7-H4 en muestras de ascitis y tumores sólidos de cáncer de ovario, así como en líneas celulares de cáncer de ovario humano después del pase y cultivo a corto plazo. Se expresó B7-H4 en la superficie celular de monocitos/macrófagos que se infiltran en tumores y de células tumorales Epcam+ recién recogidas de pacientes con cáncer o de un modelo de ratón de xenoinjerto, pero la expresión de B7-H4 en células tumorales se reguló negativamente después de cultivo in vitro a corto plazo.

Se aislaron cuatro anticuerpos recombinantes anti-B7-H4 (scFv) mediante cribados diferenciales de una biblioteca de scFv de presentación en levadura procedente de linfocitos B humanos de pacientes con cáncer de ovario. Tres de cada cuatro scFv anti-B7-H4 podrían revertir la inhibición de linfocitos T mediada por una proteína recombinante B7-H4, como lo demuestra la secreción de IFN-y, expresión de CD69 y proliferación de linfocitos T en respuesta a la estimulación anti-CD3. Asimismo, las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno fueron inhibidas por APC cargadas con antígeno B7-H4+ o células tumorales B7-H4+ (presentación en cis), y por APC B7-H4+ en presencia de células tumorales (presentación en trans). La presencia de scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4 en cocultivos de linfocitos T específicos de antígeno con APC B7-H4+ cargadas con antígeno, células tumorales B7-H4+ o TAM B7-H4+ y células tumorales, restauró completamente la inhibición dependiente de B7-H4. Estos datos presentados en el presente documento demuestran que la expresión en superficie celular de B7-H4 es inducible in vivo por el microambiente tumoral y muestran que el bloqueo de B7-H4 con un anticuerpo restaura las respuestas de linfocitos T antitumorales in vitro. Los scFv anti-B7-H4 de la invención se pueden usar para inmunoterapia contra tumores sólidos.

Los materiales y métodos empleados en estos experimentos se describen a continuación.

Muestras humanas

Se obtuvieron muestras de ascitis y tumores sólidos de pacientes con cáncer de ovario del depósito de muestras de pacientes del Centro de Investigación del Cáncer de Ovario de la Universidad de Pensilvania. Se obtuvieron linfocitos T purificados y monocitos de donantes sanos del Centro de Inmunología Humana de la Universidad de Pennsylvania.

Líneas celulares de cáncer de ovario humano

A1847, OVCAR3, C30, T2, 624, MDA231, OVCAR5 se obtuvieron de ATCC. Los macrófagos M2 se generan como se ha descrito anteriormente (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386). Las células EBV-B fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Raj Somasundaram (Instituto Wistar, Filadelfia, PA).

Modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario

Se obtuvieron ratones desnudos Balb/c de Charles River Laboratories. Se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones de 6-8 semanas 3x106 de la línea celular de cáncer de ovario OVCAR5. Los ratones se sacrificaron a las 6-9 semanas después de la implantación del tumor. Se recogieron muestras de ascitis y tumores sólidos y se analizaron mediante citometría de flujo.

Generación de una biblioteca de anticuerpos recombinantes de presentación en levadura (scFv) procedente de linfocitos B de ascitis de pacientes con cáncer de ovario

Se aislaron linfocitos B usados para la amplificación de VL/VH de ascitis de cinco pacientes con cáncer de ovario (estadios III o IV) después del gradiente de Ficoll y la purificación usando perlas magnéticas CD19 (Miltenyi). Se extrajo ARN total (1,25 mg) y se aislaron veintidós |jg de ARNm (1,7 %) (equipo de purificación de ARNm, Qiagen), en consonancia con el hecho de que el ARNm normalmente representa del 1 al 5 % del ARN total. Se realizaron cincuenta reacciones de transcripción inversa para permitir la amplificación por PCR de los fragmentos de los genes de VH y VL. Se diseñó un conjunto de cebadores para amplificar subfamilias humanas de fragmentos de genes de VH y VL en función de la base de datos MIGT (Sblattero y Bradbury, 1998, Immunotechnology 3 (4): 271-8). Se añadieron secuencias de hibridación a cebadores que amplifican los fragmentos VH y VL para permitir la reparación del hueco con el vector pAGA2 y la generación de un conector largo entre VL y VH (Gg Ss r Ss SSGGGg Sg GGG; SEQ ID NO: 13) (Andris-Widhopf et al., 2011, Cold Spring Harb Protoc, 2011 (9)). La secuencia de ADN de conector largo se modificó para codificar codones optimizados para levadura (5'-ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtgg ctcgggcggtggtggg-3'; SEQ ID NO: 14).

Se añadieron las siguientes secuencias de hibridación a los cebadores: 5'-ggtggtggaggttctggtggtggtggatctgtc-3'; SEQ ID NO: 15 para cebadores de VL directos (hibridación con el extremo 5' del vector pAGA2 Nhe I-Xho I linealizado); 5'-cgctgccaccgccgccgctggaacttgacctagaggatccgcc-3'; SEQ ID NO: 16 para cebadores de VL inversos (hibridación con conector largo); 5'-ctaggtcaagttccagcggcggcggtggcagcggaggcg gcggt-3'; SEQ ID NO: 17 para cebadores de VH directos (hibridación con conector largo); y 3'-gtcttcttcagaaataagcttttgttcggatccctcgaa-5'; SEQ ID NO: 18 para cebadores de VH inversos (hibridación con el extremo 3' del vector pAGA2 Nhe I-Xho I linealizado). Se realizó amplificación por PCR usando un inicio en caliente de 5 min a 94 °C, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, hibridación a 55 °C durante 1 min y extensión a 72 °C durante 1 min, con una etapa final de extensión de 7 min a 72 °C. El vector de presentación en levadura pAGA2 fue linealizado por Nhe I y Xho I. El vector linealizado y los productos de PCR se separaron por electroforesis, se purificaron con un equipo de extracción en gel (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transfectaron en células de levadura EBY100 en una relación de 1/3/3 (figura 6A). La eficacia de reparación de huecos se evaluó mediante la secuenciación de cincuenta clones, como se ha descrito anteriormente (Zhao et al., 2011, J Immunol Methods 363 (2): 221-32).

Clonación de B7-H4 recombinante, expresión y purificación de proteínas

El dominio extracelular de B7-H4 (IgC+IgV) se amplificó a partir de ADNc de macrófagos humanos después de polarización tumoral in vitro (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386), usando el cebador directo de B7-H45'-ggttctggtggtggaggttc tggtggtggtggatctgagtttggtatttcagggagacactccatca-3'; SEQ ID NO: 19 y cebador inverso de B7-H45'-agaccgaggagagggttagggataggcttaccgtcgacagaagcctttgagtttagca gctgtag-3'; SEQ ID N^o 20. El ADNc de B7-H4 se verificó mediante secuenciación y se clonó en un vector de expresión de mamífero (pTT28, proporcionado amablemente por Yves Durocher, Consejo Nacional de Investigación de Canadá) (figura 2B) para la expresión de mamíferos fusionada con marcador HIS 6X en células de mamíferos 293-F. Se purificó B7-H4 recombinante (rB7-H4) con perlas de sepharose de níquel (Sigma) y fue detectable mediante transferencia de Western como un fragmento de 75 Kb con un anticuerpo policlonal anti-B7-H4 (figura 11).

Construcción de lentivirus pELNS-B7-H4

Para la producción de ADNc que codifica B7-H4 completo, se aisló ARN de células tumorales de ovario OVCAR-3 y transcripción inversa con el equipo "Ready-to-go you-prime First-Strand Beads" (GE Healthcare, Piscataway, NY, Estados Unidos). Se usó ADNc resultante como molde para la amplificación por PCR del fragmento de ADNc de B7 H4 de 795 pb con los cebadores B7-H4-F 5'-ACGCTCTAGAATGGCTTCCCTGGGGCAGATC CTCT-3'; SEQ ID NO: 21 y B7-H4 -R: 5'-ACGCGTCGACTTATTTTAGCATCA GGTAAGGGCTG-3'; SEQ ID NO 22. Los productos de PCR resultantes contenían un sitio XbaI (B7-H4 -F) y un sitio SalI (B7-H4 -R) y digirieron para clonación en un vector de expresión lentivírica autoinactivante de tercera generación (pELNS, (Lanitis et al., 2012, Mol Ther 20 (3): 633-43)) en el que la expresión del transgén está dirigida por el promotor EF-1a, para obtener pELNS-B7-H4.

Producción de lentivirus recombinantes

Se produjeron y concentraron títulos altos de vectores lentivíricos defectuosos en replicación como se ha descrito anteriormente (Lanitis et al., 2012, Mol Ther 20 (3): 633-43). Se sembraron células renales embrionarias humanas 293T a 10 x 106 por matraz de cultivo tisular T-15024 h antes de la transfección. Todo el ADN plasmídico se purificó usando el equipo de Maxi prep sin Endo de QIAGEN. Las células se transfectaron con 7 |jg de pVSV-G (plásmido de expresión de glucoproteína de VSV), 18 jg de pRSV.REV (plásmido de expresión de Rev), 18 jg de pMDLg/p.RRE (plásmido de expresión de Gag/Pol) y 15 jg de plásmido de transferencia pELNS usando Express Inn (Open Biosytems). Se recogió el sobrenadante vírico a las 24 y 48 h después de la transfección. Las partículas víricas se concentraron por ultracentrifugación durante 3 h a 25000 rpm con un rotor Beckman SW28 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) y se resuspendieron en 4 ml de medio completo RPMI.

Transducción lentivírica de líneas celulares cancerosas y células T2 con PELNS-B7-H4

Para la transducción de las líneas celulares cancerosas C30, MDA 231 y 624 con partículas lentivíricas pELNS-B7-H4 se sembraron 1,5 x 105 células tumorales en una placa de seis pocillos un día antes de su transducción. Al día siguiente, el medio se reemplazó con 1 ml de lentivirus cuando las células alcanzaron una confluencia de aproximadamente 30%. El medio se reemplazó veinticuatro horas después de la transducción con medio RPMI nuevo (C30 y 624) o medio DMEM (MDA231). Para la transducción de células T2, se aplicó 1 ml de lentivirus a 3 X 105 células en una placa de 24 pocillos. La expresión de B7-H4 se evaluó el día 5 después de la transducción. Producción de partículas retrovíricas mediante transfección transitoria de células 293 GP

El TCR HER-2 y el TCR MART-1 (DF5a) (Johnson et al., 2006, J Immunol 177 (9): 6548-59) usados en este estudio estaban en la cadena principal del vector pMSGV1 que es un derivado del vector pMSGV (vector de corte y empalme-gag basado en virus de células madre murinas (MSCV)) y utiliza una repetición terminal larga de MSCV (LTR) (Zhao et al., 2005, J Immunol 174 (7): 4415-23). Para producir sobrenadantes retrovíricos, se cotransfectaron 1x106 de células 293-GP (células productoras víricas transitorias) en una placa de 6 pocillos con 1,5 jg de ADN de vector retrovírico de cada una de las construcciones y 0,5 jg de ADN de envoltura (RD114) usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y medio Optimem (BD Biosciences). El medio se cambió a DMEM con FBS al 10 % después de 18 h, y se recogieron los sobrenadantes víricos en el punto temporal de 48 h. Estos sobrenadantes se usaron después para transducir linfocitos T para la expresión de un TCR que se dirige a péptido derivado de HER-2 o MART-1.

Aislamiento de scFv anti-B7-H4 de la biblioteca de scFv de presentación en levadura

Los scFv anti-B7-H4 se seleccionaron primero mediante clasificación magnética y de flujo usando rB7-H4 frente a la proteína de control, como se ha descrito anteriormente (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386; Zhao et al., 2011, J Immunol Methods 363 (2): 221-32). Además, la subpoblación seleccionada de scFv de presentación en levadura se seleccionó adicionalmente mediante cribado usando un protocolo derivado de Wang et al. (Wang et al., 2007, Nat Methods 4 (2): 143-5) con las siguientes especificaciones: La línea celular de cáncer de ovario C30 se transdujo con pELNS-B7-H4 o con pELNS-GFP como control negativo, y se cultivó en monocapa hasta una confluencia del 90 % en placas recubiertas con poli-L-lisina. Se indujo que las levaduras expresaran scFv, se lavaron con PBE y se les redujo la unión inespecífica mediante 2 incubaciones con células C30 GFP+ en una relación de 30-60:1 (levadura:células) durante 30 min a TA con rotación suave para evitar aglutinaciones (velocidad 1-2). Después se recogió levadura no unida y se incubó con células C30 B7-H4+ inmovilizadas en plástico durante 30 min a TA con rotación suave. Las placas se lavaron dos veces con PBS durante 5 min a TA con rotación suave y se examinaron al microscopio. Los grupos de levadura que todavía se unían a las células se recogieron y se cultivaron en la placa de células durante una noche y se transfirieron a un nuevo matraz para mayor amplificación. El cribado de levadura se repitió 4 veces. Los scFv presentados en levadura se convirtieron en formas solubles como se ha descrito anteriormente (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386; Zhao et al., 2011, J Immunol Methods 363 (2): 221­ 32).

Transducción de linfocitos T humanos

Se adquirieron linfocitos T humanos primarios del Centro de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania y se aislaron de donantes voluntarios sanos después de la leucocitaféresis mediante selección negativa. Todas las muestras se recogieron según un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada donante. Los linfocitos T se sembraron en placas a una concentración de 1 x 106/ml en placas de 24 pocillos (Costar) en medio completo (RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10%, penicilina 100U/ml, sulfato de estreptomicina 100|jg/ml, HEPES 10 mM) y se estimularon con perlas recubiertas con mAb anti-CD3 y anti-CD28 como describe el fabricante (Invitrogen) (Levine et al., 1997, J Immunol, 159 (12): 5921-30) durante 18-24 h antes de la transducción. Se trataron placas de 12 pocillos no tratadas con cultivo tisular (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) con 25 ug/ml de fragmento de retronectina recombinante a 4 °C como lo indica el fabricante (RetroNectin, Takara, Otsu, Japón). Después de una incubación durante una noche, se eliminó la retronectina y se bloqueó la placa con BSA al 2 % en PBS a TA durante 30 minutos. A continuación, se aplicó el sobrenadante del vector retrovírico (2-3 ml) por centrifugación (2000 x g durante 2 horas) y después de descartar el sobrenadante se añadieron 5 x 105 linfocitos T estimulados a cada pocillo en un volumen final de 1 ml de medio de crecimiento RMPI por pocillo. Las placas se centrifugaron durante 10 min a 1000 x g y se incubaron durante una noche. El proceso de transducción se repitió al día siguiente. Después de la transducción, las células se cultivaron en el RMPI con FBS al 10% y se añadió interleucina-2 recombinante humana (Novartis) cada dos días hasta una concentración final de 100UI/ml. Se mantuvo densidad celular de 0,5-1x106 células/ml. La expresión del TCR exógeno HER-2 y MART-1 se validó 5 días después de la transducción usando tetrámeros de péptido-MHC conjugado con APC (Becton Dickinson, San José, CA) con especificidades para HLA-A2-HER2369 y HLA-A2-MART-1 (26-35).

Activación de linfocitos T

Se realizó inhibición de B7-H4 de la activación y proliferación de linfocitos T usando B7-H4 recombinante inmovilizado en placa. Un día antes de la activación de linfocitos T, los anticuerpos (mAb anti-CD3 (clon OKT3) y/o anti-CD28 (eBiosciences) se inmovilizaron en plástico a 5 jg/ml y 2 jg/ml respectivamente, en 100 jl/pocillo de tampón de bicarbonato en placas de cultivo tisular planas de 96 pocillos, durante una noche. La solución de anticuerpo se eliminó el día de activación de linfocitos T y se aplicaron 10 jg/ml de proteína rB7-H4 en 100 jl/pocillo de tampón de bicarbonato durante 2 horas a 37 °C. Se usó una proteína recombinante no relevante (receptor de folato alfa) como proteína de control. Mientras tanto, los linfocitos T se marcaron con 3 jM de CFSE, según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). A continuación, las placas se lavaron dos veces con PBS y los linfocitos T marcados se cultivaron a 1 x105 en 150 jl/pocillo en presencia de scFv anti-B7-H4 añadidos el día 0 a una concentración de 2,5 jg/ml. Las respuestas de linfocitos T se analizaron cinco días después de la activación. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Cocultivo de linfocitos T con APC T2

Se resuspendieron APC T2 tipo silvestre, transducidas con GFP o B7-H4 a 10x106/ml y se cargaron con péptidos HER-2 o MART-1 a diversas concentraciones de péptidos a 37 °C durante 2 horas. Se realizó cocultivo de APC cargadas con péptidos con linfocitos T específicos de TCR HER-2 o MART-1 en una relación de 1:1 (1x105 células T2/1x105 linfocitos T) en 200 j l de medio RPMI en placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron scFv anti-B7-H4 el día 0 a 5 jg/ml de concentración. Las respuestas de linfocitos T se analizaron dos días después del cocultivo. Los ensayos se realizaron por triplicado.

El ensayo de inhibición de linfocitos T TCR mediado por TAM se realizó en cocultivos de transwell de 24 pocillos en una relación de 1:1:1 (1x105 células T2/1x105 linfocitos T/1x105 TAM). Los TAM se diferenciaron y polarizaron como se ha descrito anteriormente (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386). En resumen, se cocultivaron macrófagos polarizados M1 en transwell con la línea de cáncer de ovario OVCAR3 durante 3 días. El día 3 de la polarización tumoral de los macrófagos, se añadieron linfocitos T TCR y células T2 de tipo silvestre pulsadas con péptidos en los transwell que contenían o no macrófagos. Se añadieron scFv anti-B7-H4 el día 0 a una concentración de 5 ug/ml. Las respuestas de linfocitos T se analizaron tres días después del cocultivo. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Cocultivo de linfocitos T con células tumorales

La línea celular de melanoma de tipo silvestre o B7-H4+ 624 y/o de tipo silvestre o B7-H4+ MDA231, se cocultivaron con linfocitos T específicos de Tc R HER-2 o MART-1 en una relación de 1:1 (1x105 células T2/1x105 linfocitos T) en 200 j l de medio RPMI. Se añadieron 5 jg/ml de scFv anti-B7-H4 el día 0 y se analizaron las respuestas de linfocitos T dos días después del cocultivo. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Citometría de flujo

La citometría de flujo se realizó como se ha descrito (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386). Antes de marcar las células, se incubaron con mIgG para bloquear la unión inespecífica de los receptores Fcy. Se usó 7-AAD para excluir células muertas.

ELISA

El ELISA de IFN-^y se realizó según lo indicado por el fabricante (Biolegend).

Transferencia de Western

La transferencia de Western se realizó como se ha descrito (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386).

Estadística

Los valores de P se calcularon usando análisis Anova de una vía y prueba de T para datos independientes.

Los resultados de los experimentos se describen a continuación.

La expresión de B7-H4 en la superficie celular de los monocitos que se infiltran en tumores y las células tumorales está regulada positivamente in vivo y regulada negativamente por cultivo in vitro

El direccionamiento a la superficie celular requiere la presencia de moléculas unidas a la membrana. Expresión en superficie celular de B7-H4 en líneas celulares de cáncer de ovario establecidas (n = 5) y en muestras de cáncer de ovario (ascitis y tumores sólidos) (n = 16) analizadas usando citometría de flujo. Se observó que la expresión en superficie celular de B7-H4 estaba limitada en líneas celulares de cáncer de ovario establecidas (1 de cada 5, OVCAR3, figura 5A), en consonancia con una información anterior (Choi et al., 2003, J Immunol 171 (9): 4650-4). Como controles positivos de la expresión en superficie celular de B7-H4, se usaron linfocitos B EBV (Quandt et al., 2011, Clin Cancer Res 17 (10): 3100-11), macrófagos diferenciados in vitro estimulados con IL4 e IL-10 y células C3O transducidas con B7-H4 (figura 5A, como se indica). Por el contrario, se observó una expresión en superficie celular amplia de B7-H4 entre 16 tumores sólidos y ascitis de muestras de pacientes con cáncer de ovario (figura 5B; tablas 1 y 2). La expresión media de B7-H4 en células tumorales CD45- Epcam+ fue de 28 %± 17,84 en ascitis (tabla 1) y 9,44 % ± 8,31 en tumores sólidos (tabla 2). El veinticinco por ciento de los pacientes tenían más del 30 % de células tumorales CD45- Epcam+ que expresaban B7-H4 y más de la mitad de los pacientes expresaron B7-H4 en del 4 al 15% de sus células tumorales. También se observó expresión de B7-H4 en células CD45'Epcam procedentes de tumores sólidos (tabla 2). Además, se confirmó la expresión en superficie celular de B7-H4 en monocitos CD45+CD14+ asociados a tumor, según lo indicado por Cryczek et al. (Kryczek et al., 2006, J Exp Med 203 (4): 871-81) y del 3 al 40 % de células CD45+CD14+ expresaron tanto B7-H4 como CD206/receptor de manosa, un marcador de macrófagos M2 maduros y de TAM (tabla 2). Para abordar si la expresión de B7-H4 en células tumorales es un efecto inducible in vivo, una línea celular de cáncer de ovario humano con expresión indetectable de B7-H4 en superficie, se usó OVCAR5 (figura 5A) para establecer tumores intraperitoneales en ratones Balb C/desnudos. Nueve semanas después de la inyección del tumor, se recogieron 6 ascitis y tumores sólidos y se analizaron para determinar la expresión de B7-H4 mediante citometría de flujo. La expresión en superficie celular de B7-H4 en Epcam+ las células tumorales se regularon positivamente en todos los tumores OVCAR5 recién recogidos (n = 6), variando del 4 al 38 % (media = 12,8 ±5,18) (figuras 5C y 5D). Sin embargo, después de un cultivo a corto plazo de células OVCAR5 de ascitis o tumor sólido, la expresión en superficie celular de B7-H4 volvió a niveles indetectables (figuras 5C y 5D). Estos resultados demostraron que se induce la expresión en superficie celular de B7-H4 en células de tumor de ovario in vivo y se está regulada negativamente por el cultivo a corto plazo.

Tabla 1: Expresión de B7H4 en monocitos que se infiltran en tumores y células tumorales en ascitis de cáncer de v ri h m n

Tabla 2: Expresión de B7H4 en monocitos que se infiltran en tumores y células tumorales en tumores sólidos de v ri h m n

continuación

Generación de una biblioteca de presentación en levadura procedente de linfocitos B asociados a tumor de pacientes con cáncer de ovario

Se construyó una nueva biblioteca de presentación en levadura de anticuerpos recombinantes (scFv) procedente de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de linfocitos B aislados de ascitis de cáncer de ovario humano (n = 10) y PBMC (n = 1). La inserción de fragmentos Vh-Vl que codifican el scFv en el vector pAGA2 (Zhao et al., 2011, J Immunol Methods 363 (2): 221-32) se realizó usando recombinación homóloga en levadura que combina fragmentos de PCR Vh, fragmentos de PCR Vl y vector pAGA2 linealizado. Vh y Vl se ligaron entre sí mediante el conector (GGSSRSSSSGGGGSGGGG; SEQ ID NO: 13 (Zhang et al., 2012, Mol Ther 20 (7): 1298-304; Andris-Widhopf et al., 2011, Cold Spring Harb Protoc, 2011 (9)). La diversidad de la biblioteca se estimó en 109.

Aislamiento y validación mediante ELISA de captura de nuevos scFv anti-B7-H4

El método de aislamiento de scFv soluble se describe en otra parte del presente documento y se recapitula en la figura 6A. En resumen, se realizaron 3 clasificaciones magnéticas y 2 de flujo de la biblioteca de scFv de presentación en levadura a partir de las cuales se aisló una subpoblación de scFv de presentación en levadura que se unieron a B7-H4 recombinante soluble (rB7-H4). La subpoblación seleccionada de scFv de presentación en levadura se transformó después directamente en scFv solubles mediante recombinación homóloga en el vector p416-BCCP, como se ha descrito anteriormente (Zhao et al., 2011, J Immunol Methods 363 (2): 221-32; Scholler et al., 2006, J Immunol Methods 317 (1-2): 132-43; Bergan et al., 2007, Cancer Lett 255 (2): 263-74), denominada "estrategia de exploración basada en proteínas". Como alternativa, la exploración se completó mediante un enriquecimiento adicional con cuatro ciclos de cribado en la línea celular C30 transducida para expresar B7-H4 en la superficie celular o GFP como control negativo. Este método de exploración se denomina "estrategia de exploración basada en células". Después de la transformación en formas solubles, los scFv aislados se purificaron con alto rendimiento a partir de sobrenadantes de levadura (Zhao et al., 2011, J Immunol Methods 363 (2): 221-32; Bergan et al., 2007, Cancer Lett 255 (2): 263-74) y se exploraron mediante ELISA de captura para determinar la unión específica a 500 ng/ml de rB7-H4 (datos no mostrados). Se seleccionaron dos scFv (n.° 26 y n.° 56) obtenidos por la estrategia de exploración basada en proteínas y 2 scFv (3 n.° 54 y 3 n.° 68) producidos por la estrategia de exploración basada en células para un análisis adicional. Los scFv seleccionados se ensayaron mediante ELISA de captura para determinar la unión a diluciones en serie de rB7-H4 con resultados similares; se usó BSA como proteína de control (figura 6B, 6C). Los scFv se secuenciaron y analizaron para determinar su uso de genes de inmunoglobulina de la línea germinal de la secuencia de aminoácidos predicha por el sistema Kabat (tabla 3). La comparación del uso del gen de inmunoglobulina de los clones de scFv aislados basados en proteínas n.° 26 y n.° 56 demostró diferencias sustanciales en el uso de genes de inmunoglobulina en cadenas pesadas y ligeras. Los clones de scFv 3 n.° 54 y 3 n.° 68 presentaron diferentes usos de genes de inmunoglobulina para cadenas pesadas, pero esencialmente las mismas cadenas ligeras. Los clones n.° 26 y 3 n.° 68 compartieron el mismo uso de genes de IGHV e IGHD pero diferentes genes de IGHJ para las cadenas pesadas y diferente uso para las cadenas ligeras. Los identificadores de secuencia para los scFv se representan en la tabla 4:

Tabla 3: Usos de genes de inmunoglobulina de la línea germinal de la secuencia de aminoácidos predicha de los Fv ni-B7-H4

T l 4: I nifi r n i r ni r ni-B7-H4

La proteína recombinante B7-H4 (rB7-H4) inhibe la activación policlonal de linfocitos T y los scFv anti-B7-H4 bloquean la inhibición de linfocitos T dependiente de rB7-H4

Se estimularon linfocitos T de donantes normales con anticuerpos (Ab) inmovilizados anti-CD3 y/o anti-CD28 en presencia de rB7-H4 soluble o de una proteína de control (receptor de alfa-folato recombinante soluble). Los linfocitos T estimulados por Ab anti-CD3 y/o anti-CD28 secretaron IFN-^y, expresaron el marcador de activación CD69 y proliferaron según se evaluó mediante el marcaje de CFSE (figura 7A-7B). Sin embargo, la presencia de rB7-H4 unido a la placa inhibió la secreción de IFN-^y (p = 0,03 comparando rB7-H4 con la proteína de control), la expresión de CD69 y la proliferación mediada por estimulación de CD3. Aunque rB7-H4 inhibió la activación de linfocitos T en respuesta a la estimulación de CD3, la secreción de IFN-y de linfocitos T y la proliferación mediada por una combinación de mAb anti-CD3 y anti-CD28 no se inhibieron significativamente por la presencia de rB7-H4 (p = 0,09) (figura 7A-7B). Por tanto, se eligió la estimulación de linfocitos T mediada por CD3 para caracterizar funcionalmente los scFv anti-B7-H4 en el resto del estudio. La figura 7C-D muestra que varios scFv anti-B7-H4 podrían invertir la inhibición de rB7-H4 de la activación policlonal de linfocitos T (figura 7c y 7D). Los scFvs n.° 26 anti-B7-H4 redujeron significativamente la inhibición de la secreción de linfocitos T de IFN-^y (P = 0,0128 en comparación con la condición sin tratamiento) pero no superaron completamente la inhibición mediada por B7-H4 de la secreción de IFN-y ni la proliferación de linfocitos T reconstituidos (figura 7D). Por el contrario, los scFv 3 n.° 54 y 3 n.° 68 anti-B7-H4 restauraron la secreción de IFN-^y de linfocitos T (figura 7C) e invirtieron la inhibición dependiente de rB7-H4 de la proliferación de linfocitos T a niveles normales (p = 0,0406 para 3 n.° 54; p = 0,1305 para 3 n.° 68) (figura 7D). Cabe destacar que la presencia de scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4 en linfocitos T activados por CD3 desencadenó una mayor secreción de IFN-^y en ausencia de cualquier proteína o en presencia de proteína de control (figura 7C) pero no modificó la proliferación de linfocitos T (figura 7^d ). Estos resultados apoyan la hipótesis de que la interferencia de scFv con interacciones funcionales entre B7-H4 y el ligando de linfocitos T potencial de B7-H4 puede bloquear la inhibición de linfocitos T dependiente de B7-H4.

La activación de linfocitos T específicos de antígeno es inhibida por APC pulsadas por péptidos que expresan B7-H4 y puede ser restaurada por scFv anti-B7-H4

Se ha informado de la expresión de B7-H4 en CD infiltradas por tumores (Cheng et al., 2011, J Immunoassay Immunochem 32 (4): 353-64). Para modelar in vitro la función de B7-H4 en un sistema de presentación de antígenos que induce respuestas de linfocitos T específicos de antígenos tumorales, se transdujeron células presentadoras de antígenos T2 (APC T2 (Salter y Cresswell, 1986, EMBO J 5 (5): 943-9; Levine et al., 1997, J Immunol, 159 (12): 5921-30) con B7-H4 de longitud completa (Figura 8A), y se transdujeron linfocitos T humanos periféricos con TCR específico de HER-2 (Lanitis E. et al., manuscrito en preparación) (figura 8B) o TCR específico de MART-1 (Johnson et al., 2006, J Immunol 177 (9): 6548-59) (figura 8C). Como control negativo, se transdujo APC T2 con GFP. Las APC T2 se pulsaron con péptidos MART-1 o HER-2 y se usaron para activar linfocitos T transducidos con TCR. Se activaron linfocitos T transducidos con TCR HER-2 y MART-1 con APC T2 transducidas con B7-H4 (T2 B7-H4) o transducidas con GFP (T2), pulsadas con péptidos y se midió la producción de IFN-y. Se usó el péptido MART-1 como péptido irrelevante para la estimulación de los linfocitos T TCR HER-2 y el péptido HER-2 como péptido irrelevante para la estimulación de los linfocitos T TCR MART-1. Las figuras 8B y 8C muestran que la expresión de B7-H4 en APC T2 regulaba negativamente la activación de linfocitos T específicos de antígeno en linfocitos T específicos tanto de HER-2 como de MART-1 (p = 0,0362 para los linfocitos T TCR HER-2 y p = 0,0024 para MART-I ) , lo que demuestra que la inhibición dependiente de B7-H4 no estaba restringida por antígenos. La inhibición mediada por B7-H4 de los linfocitos T específicos de HER-2 y MART-1 fue parcialmente invertida por los scFv n.° 56 y 3 n.° 54 anti-B7-H4, pero el scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4 pudo superar completamente la inhibición mediada por B7-H4 y restauró las respuestas de linfocitos T específicos de MART-1 y HER-2 (p = 0,5748 y p = 0,2892 respectivamente para T2 B7-H4+ frente a T2) (figuras 8D y 8E). El análisis Anova de una vía de las condiciones de T2 GFP+ tratadas de manera diferente no dio lugar a una diferencia estadística significativa (p = 0,7893 para HER-2 y p = 0,2931 para linfocitos T TCR MART-1) mientras que el mismo análisis para T2 B7-H4 dio lugar a diferencias estadísticamente significativas entre las diferentes condiciones (p = 0,0066 para HER-2 y p < 0,0001 para linfocitos T TCR MART-1). Estos resultados confirmaron que el bloqueo de las interacciones funcionales entre las APC que expresan B7-H4 y los linfocitos T usando scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4 podría superar la inhibición de linfocitos T dependiente de B7-H4. Además, las variaciones funcionales observadas entre los diferentes scFv anti-B7-H4 sugirieron que el mecanismo subyacente a la inhibición de linfocitos T mediada por B7-H4 depende de un epítopo específico.

La activación de linfocitos T específicos de antígeno es inhibida por células tumorales que expresan B7-H4 y puede ser restaurada por scFv anti-B7-H4

Ya que B7-H4 también se puede expresar en las superficies de las células tumorales (figura 5), se diseñaron experimentos para abordar si la B7-H4 expresada por las células tumorales podría inhibir la función de los linfocitos T específicos de antígeno. Se transdujo B7-H4 de longitud completa en la línea celular de cáncer de mama MDA231 HER-2+/HLA-A2+ (diana positiva) y en la línea celular de melanoma 624 HER-2+/HLA-A2bajo (diana negativa) (figura 9A). Estas líneas celulares se ensayaron para el reconocimiento por linfocitos T TCR específicos de HER-2. Los linfocitos T TCR HER-2 secretaron IFN-^y en presencia de células tumorales que expresan HER-2 (MDA231, barra gris oscura) pero no en presencia de células tumorales negativas para HER-2 (624, barra gris claro). Asimismo, la secreción de IFN-^y se inhibió sustancialmente en presencia de células MDA231 transducidas con B7-H4 (barra negra; p = 0,0451) (figura 9B). Como se ha observado anteriormente, los scFv 3 n.° 54 y 3 n.° 68 anti-B7-H4 pudieron restaurar completamente la secreción de IFN-y de los linfocitos T HER-2, eludiendo de este modo aparentemente la función inhibidora de MDA231 transducida con B7-H4 (p = 0,4393 para scFv 3 n.° 54; p = 0,2179 para scFv 3 n.° 68) (figura 9C). Estos resultados corroboraron adicionalmente la hipótesis de que el bloqueo de B7-H4 puede superar la inhibición de linfocitos T específicos de antígeno mediada por B7-H4 expresado en la superficie de células tumorales.

La activación de linfocitos T específicos de antígeno es inhibida por macrófagos polarizados para tumores que expresan B7-H4 en presencia de APC T2 pulsadas por péptidos y puede ser restaurada por scFv anti-B7-H4

Los macrófagos se pueden polarizar hacia TAM mediante cocultivo en transwell con células tumorales mediante el intercambio de factores solubles (Dangaj et al., 2011, PLoS One 6 (12): e28386; Hagemann et al., 2006, J Immunol 176 (8): 5023-32). Por tanto, para estudiar el efecto de B7-H4 expresado en trans por macrófagos polarizados para tumores, se diseñaron experimentos para configurar cocultivos en transwell de células de cáncer de ovario y macrófagos M1 diferenciados in vitro. Los macrófagos polarizados para tumores in vitro expresaron B7-H4 (figura I I ) y se denominan en el presente documento TAM B7-H4+. Se ensayó la capacidad de los TAM B7-H4+ para inhibir los linfocitos T específicos de MART estimulados con APC T2 pulsadas por péptidos. Las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno se regularon negativamente en presencia de TAM B7-H4+ pulsados con bajas concentraciones de péptido MART (p = 0,0287 para 0,0025 pM) (figura 10A). La activación y proliferación de linfocitos T específicos de antígeno medidos por tinción con CFSE y expresión de CD137 se redujeron más evidentemente a baja concentración de péptido (0,0025 pM y 0,05 pM) (como se ha observado anteriormente, los scFvs 3 n.° 54 y 3 n.° 68 anti-B7-H4 pudieron restaurar completamente la secreción de IFN-^y de los linfocitos T HER-2, eludiendo de este modo aparentemente la función inhibidora de MDA231 transducida con B7-H4 (p = 0,4393 para scFv 3 n.° 54; p = 0,2179 para scFv 3 n.° 68) (figura 9C). Estos resultados corroboraron adicionalmente la hipótesis de que el bloqueo de B7-H4 puede superar la inhibición de linfocitos T específicos de antígeno mediada por B7-H4 expresado en la superficie de células tumorales). Los scFv anti-B7-H4 podrían invertir las señales inhibidoras de linfocitos T mediadas por TAM B7-H4+. Aunque el scFv n.° 26 anti-B7-H4 restauró y mejoró significativamente la secreción de IFN-y por linfocitos T en 1,5 veces (p = 0,0144), los scFv 3 n.° 54 y 3 n.° 68 anti-B7-H4 mejoraron aún más la producción de IFN-^y de linfocitos T en >2 veces (p = 0,0037 para scFv 3 n.° 54 y p = 0,0061 para scFv 3 n.° 68) (figura 10B).

Terapia dirigida basada en B7-H4

La expresión de B7-H4 en diversos tipos de tejidos cancerosos humanos y la correlación con estadios avanzados, escasa supervivencia de los pacientes e infiltración tumoral de linfocitos T reguladores (Zang et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA, 104 (49): 19458-63), lo convierten en un candidato de preferencia para la terapia dirigida. Sin embargo, se ha señalado que la expresión de B7-H4 es principalmente intracelular para las células de cáncer de ovario (Kryczek et al., 2006, J Exp Med 203 (4): 871-81; Choi et al., 2003, J Immunol 171 (9): 4650-4), lo que limita las estrategias terapéuticas dirigidas.

Los resultados presentados en el presente documento demuestran que B7-H4 estaba presente en la superficie de células cancerosas Epcam+ recién recogidas de ascitis y tumores sólidos de pacientes con cáncer de ovario, así como en monocitos que se infiltran en tumores. Conforme a esta observación, los xenoinjertos de cáncer de ovario desarrollados a partir de líneas celulares de cáncer de ovario cultivadas a largo plazo regularon positivamente la expresión de B7-H4 en tumores recién recogidos y la regularon negativamente de forma drástica después de cultivo in vitro a corto plazo. Sin quedar ligado a ninguna teoría particular, estos resultados apoyan la hipótesis de que la expresión en superficie celular de B7-H4 está regulada por las condiciones ambientales, posiblemente porque la expresión de B7-H4 mejora específicamente la capacidad de las células tumorales para escapar del reconocimiento inmunitario in vivo, pero podría no ser esencial para la supervivencia celular in vitro (Pardoll, 2012, Nat Rev Cancer 12 (4): 252-64). Una posible condición ambiental capaz de desencadenar la presentación en superficie de B7-H4 puede ser la tensión hipóxica que aparece habitualmente en el microambiente tumoral. Sin embargo, las condiciones de cultivo hipóxicas no regularon positivamente la expresión en superficie celular de B7-H4 en ninguna de las líneas celulares de cáncer de ovario probadas, incluyendo OVCAR5. El medio de citocinas del microambiente tumoral podría ser otro posible mecanismo y, de hecho, Chen et al. informaron recientemente de que el TNF-a procedente de macrófagos inducía la expresión en superficie celular de B7-H4 en el carcinoma de pulmón de ratón (Chen et al., 2012, Cancer Lett 317 (1): 99-105).

La demostración de que B7-H4 se expresa en la superficie celular de células tumorales y que se infiltran en tumores abre un nuevo paradigma para la inmunomodulación simultánea del microambiente tumoral y la erradicación directa de las células de cáncer de ovario usando direccionamiento basado en B7-H4. Para aislar anticuerpos recombinantes específicos para B7-H4 humano, se construyó una nueva biblioteca de scFv de presentación en levadura procedente de linfocitos B de ascitis de cáncer de ovario humano. A continuación, se evaluaron los scFv anti-B7-H4 seleccionados para determinar su capacidad funcional para invertir la inhibición de linfocitos T mediada por B7-H4, a través de la proteína rB7-H4, APC B7-H4+ o células tumorales B7-H4+. Los resultados presentados en el presente documento demuestran que la activación de linfocitos T específicos de TCR de antígeno tumoral fue inhibida por la presentación de B7-H4 en cis en APC o en células tumorales y en trans en macrófagos polarizados para tumores. Estos resultados confirmaron que B7-H4 es una molécula reguladora que participa en la señalización negativa que influye en las respuestas antitumorales de los linfocitos T. Asimismo, mientras que las APC transducidas con B7-H4 alteran la activación de los linfocitos T específicos de antígeno, las células tumorales transducidas para expresar B7-H4 en la superficie celular también pueden alterar significativamente las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno tumoral. Además, los resultados presentados en el presente documento demuestran que la inhibición mediada por B7-H4 en cis o en trans podría invertirse parcialmente por el clon 3 de scFv n.° 54 anti-B7-H4 y restaurarse completamente por scFv 3 n.° 68 anti-B7-H4. De hecho, en cocultivos de transwell, incluyendo el bloqueo con scFv anti-B7-H4, las respuestas de linfocitos T específicos de MART-TCR no solo se restauraron en presencia de TAM, sino que se mejoraron adicionalmente. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, se cree que además de bloquear B7-H4, anti-B7-H4 también restauró el ambiente proinflamatorio Th1 que podría polarizar adicionalmente los macrófagos en un fenotipo de tipo M1 y estimular los linfocitos T específicos de antígeno. Se obtuvieron resultados similares cuando se usaron linfocitos T específicos de TCR HER-2.

Se usaron dos estrategias para aislar los scFv anti-B7-H4, una que representa el enriquecimiento convencional de la biblioteca de presentación en levadura en proteína recombinante soluble mediante clasificaciones magnéticas y de flujo y una segunda en la que la biblioteca de scFv de presentación en levadura se enriqueció adicionalmente usando células que expresan diferencialmente B7-H4 en superficie. El análisis de la unión de scFv a B7-H4 recombinante mediante ELISA de captura no destacó las diferencias entre las categorías de scFv aisladas diferencialmente. Sin embargo, al probar su capacidad funcional para bloquear la inhibición mediada por B7-H4, los scFv aislados basados en células mostraron una capacidad de bloqueo superior. Esto puede deberse al epítopo que reconoce cada scFv, que en el caso de scFv 3 n.° 68 podría ser idéntico al del ligando B7-H4 potencial. También sugiere fuertemente que el aislamiento de scFv por selección diferencial de la biblioteca de scFv de presentación en levadura en células podría permitir el acceso a epítopos que no están fácilmente disponibles en antígenos solubles recombinantes. Además, el enfoque anterior podría no ser posible en el caso del aislamiento de anticuerpos monoclonales, ya que las células hospedadoras o de hibridoma se inmunizan con antígenos solubles.

Los anticuerpos de la invención presentan actividades en el bloqueo de B7-H4 in vitro y su secuencia humana podría evitar una posible respuesta HAMA y una posible inhibición por anticuerpos endógenos in vivo. Es notable que estos anticuerpos recombinantes tienen un tamaño más pequeño que los anticuerpos convencionales, lo que favorece su unión potencial a las células diana que expresan B7-H4 incluso en áreas de penetración pequeña.

El direccionamiento a B7-H4 puede modificar simultáneamente componentes críticos del microambiente tumoral, incluyendo los macrófagos asociados a tumores, CD y células tumorales. El bloqueo de las señales inhibidoras mediadas por B7-H4 puede potenciar las respuestas antitumorales de linfocitos T y también podría disminuir la barrera de linfocitos T endoteliales tumorales porque también se ha observado la expresión de B7-H4 en células endoteliales tumorales en tejidos de RCC (Krambeck et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103 (27): 10391-6). La dirección a moléculas de puntos de control inmunitarios tales como CTLA-4 y PD-1 ha inducido resultados clínicos, especialmente en pacientes con respuestas inmunitarias preexistentes. El cáncer de ovario es una enfermedad que implica en gran medida circuitos inmunitarios que podrían predecir una mejor supervivencia del paciente (Zhang et al., 2003, N Engl J Med 348 (3): 203-13) o peor resultado (Kryczek et al., 2007, Cancer Res 67 (18): 8900-5; Curiel et al., 2004, Nat Med 10 (9): 942-9).

Ejemplo 3: CAR específico de B7-H4

Se realizaron los siguientes experimentos para validar un receptor quimérico de antígeno para redirigir los linfocitos T contra dianas que expresan B7-H4 usando los anticuerpos de la presente invención.

Construcción de CAR específico de B7-H4

Se seleccionaron clones de scFv anti-B7H4 n.° 56, n.° 26, 3 n.° 54 y 3 n.° 68 para construir CAR específico de B7-H4 debido a la afinidad relativamente alta de unión al antígeno entre los scFv identificados. El vector lentivírico expresado en CAR usado actualmente en el experimento se ha optimizado antes (Carpenito, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106: 3360-3365) y constituyen una bisagra CD8a y una región transmembrana, seguido de un resto de señalización CD3^ y en conjunto con el motivo de señalización intracelular de CD28. El ADNc del scFv respectivo se subclonó en estos vectores de CAR lentivíricos. Adicionalmente, estos vectores se transformaron en células 293T y la transferencia de western explorada para CD3^ confirmó la expresión satisfactoria de estos vectores.

Para una transducción lentivírica eficaz, se activaron linfocitos T humanos de sangre periférica mediante perlas CD3/CD28. Para probar la eficiencia de transducción, los linfocitos T se transdujeron con un vector lentivírico expresado en GFP y se puede observar la expresión de GFP uniforme y estable después de 5 días de transducción. La figura 13 muestra esa creación de 4 CAR anti-B7-H4 de diferentes afinidades de unión (de baja a alta 26, 56, 68, 54) en construcciones de primera o segunda generación (+/-coestim). Los CAR con diferentes cadenas simples de B7-H4 presentaron afinidad variable por el antígeno B7-H4 humano. Los CAR B7-H4 se unen a proteínas B7-H4 tanto humanas como de ratón (figura 14).

Los linfocitos T 3E11-CAR+ mostraron citotoxicidad específica de B7-H4 in vitro

Se cocultivaron linfocitos T modificados por ingeniería genética con células de cáncer de ovario B7-H4+ para determinar los efectos de la citotoxicidad específica de antígeno. Los linfocitos T se transdujeron mediante un vector lentivírico del scFv-28z de B7-H4 respectivo (CD28 y CD3zeta) y se aplicaron a ensayos de citotoxicidad medidos por la concentración de IFN-^y (figura 15). Como se muestra en la figura 15, los linfocitos T transducidos con B7-H4-28z tienen una lisis celular significativa de OVCAR3, mientras que no hay efectos de lisis en los linfocitos T transducidos con CD19-28z. Los CAR 68, 54 y 26 reaccionaron contra una línea celular de cáncer humano que expresa B7-H4 en la superficie (A1847), pero no contra una línea negativa para B7-H4 (c30) (figura 15A). La Figura 15B demuestra que cAr 68 reacciona contra diversas células cancerosas humanas que expresan B7-H4 en la superficie. CAR 56 tiene baja actividad contra una línea celular de cáncer EBV.

Estos resultados demuestran que los linfocitos T transducidos con CAR pueden usarse para dirigirse a tumores que expresan B7-H4 como un tipo de inmunoterapia del cáncer de ovario basada en linfocitos T. Los resultados presentados en el presente documento proporcionan un scFv específico y de origen humano para la inmunoterapia basada en linfocitos T transducidos con CAR.

Se realizaron experimentos para evaluar si los linfocitos T transducidos con CAR de B7H4 son reactivos contra macrófagos que expresan B7H4. La figura 16A demuestra que los linfocitos T transducidos con CAR de B7H4 (p. ej., 68-28z) son reactivos contra macrófagos que expresan diferentes niveles de B7H4 medidos por la concentración de IFN-y. CAR 68 reaccionó contra macrófagos humanos que expresan niveles altos o bajos de B7-H4 de superficie y, por lo tanto, son adecuados para dirigirse a macrófagos inmunosupresores asociados a tumores (TAM).

Los resultados presentados en el presente documento demuestran que los CAR de B7H4 son capaces de responder a líneas de células tumorales que expresan el antígeno B7H4 endógeno, incluyendo líneas celulares sólidas y de linfoma. Se observó un nivel de reconocimiento más sólido por CAR 68 de B7H4, comparable al CAR de CD19 bien caracterizado contra la línea celular de linfoma de linfocitos B (figura 16B). Los CAR de B7H4 también reconocieron macrófagos que expresaban niveles altos y bajos de B7H4, lo que puede ayudar a reducir los macrófagos asociados al tumor B7-H4+ en el microambiente tumoral.

El siguiente conjunto de experimentos se realizó para evaluar si los CAR de B7-H4 pueden inhibirse mediante la adición de un scFv de B7-H4 correspondiente (figura 17A). Todos los linfocitos T se estimularon con Ab OKT-3 anti-CD3 (1 ug/ml) en presencia de concentraciones crecientes de proteína B7-H4. Los valores se normalizaron con respecto a Ab anti-CD3 más proteína de control (receptor de folato) a concentraciones equivalentes ("normalizadas con respecto a % de IFN-y con OKT3 Ag aFolato (irrelevante) como 100% de actividad). Se observó inhibición específica de la secreción de CAR 68 de B7H4 IFN-^y mediante la adición de scFv 68 (figura 17B). También se observó que la secreción de CAR 68 de B7H4 IFN-y en respuesta a Ag B7H4 no se reduce significativamente por la

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo anti-B7-H4 humano o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8.

3. Un anticuerpo anti-B7-H4 humano aislado o un fragmento del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

4. Un anticuerpo anti-B7-H4 humano o un fragmento del mismo para su uso en un método in vivo para diagnosticar una enfermedad, un trastorno o una afección asociados con la expresión de B7-H4 en una célula, comprendiendo el método a) poner en contacto la célula con el anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4; y b) detectar la presencia de B7-H4 en donde la presencia de B7-H4 diagnostica la enfermedad, el trastorno o la afección asociados con la expresión de B7-H4.

5. El anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo para su uso como en la reivindicación 4, en donde la enfermedad, el trastorno o la afección asociados con la expresión de B7-H4 es cáncer.

6. Un método no terapéutico para inhibir la inhibición de linfocitos T dependiente de B7-H4, comprendiendo el método poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

7. El método no terapéutico de la reivindicación 6, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa B7-H4, un macrófago asociado a tumor (TAM) y cualquier combinación de los mismos.

8. Un anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo para su uso en un método terapéutico para inhibir la inhibición de linfocitos T dependiente de B7-H4, comprendiendo el método poner en contacto una célula con el anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

9. El anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo para su uso como en la reivindicación 8, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa B7-H4, un macrófago asociado a tumor (TAM) y cualquier combinación de los mismos.

10. Una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo para su uso en un método de bloqueo de la inhibición de linfocitos T mediada por una célula que expresa B7-H4 y alteración del microambiente tumoral para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

11. La composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo para su uso como en la reivindicación 10, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa B7-H4, un macrófago asociado a tumor (TAM) y cualquier combinación de los mismos.

12. Una composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo para su uso en un método para inhibir, suprimir o prevenir la inmunosupresión de una respuesta inmunitaria antitumoral o antineoplásica en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H4 aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4.

13. La composición para su uso como en la reivindicación 12, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la interacción entre una primera célula con un linfocito T, en donde la primera célula se selecciona del grupo que consiste en una célula tumoral que expresa B7-H4, un macrófago asociado a tumor (TAM) y cualquier combinación de los mismos.

14. Un método para diagnosticar una enfermedad, un trastorno o una afección asociados con la expresión de B7-H4 en un sujeto, comprendiendo el método a) poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo anti-B7-H4 humano o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-4; y b) detectar la presencia de B7-H4, en donde la presencia de B7-H4 diagnostica la enfermedad, el trastorno o la afección asociados con la expresión de B7-H4.