CN109789177A

CN109789177A - 腺病毒和免疫调节剂组合治疗

Info

Publication number: CN109789177A
Application number: CN201780046497.2A
Authority: CN
Inventors: 弗兰克·图法罗; 胡安·富埃约-马加雷托; 坎德拉里亚·戈麦斯-曼扎诺; 查尔斯·康拉德; W·K·阿尔弗雷德·扬; 江虹
Original assignee: University of Texas System; DNAtrix Inc
Current assignee: University of Texas System; DNAtrix Inc
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2017-05-30
Publication date: 2019-05-21
Also published as: US20190201462A1; EP3463405A4; US11090344B2; WO2017205875A1; EP3463405A1

Abstract

某些实施方案包括腺病毒癌症治疗的有效性的增强。

Description

腺病毒和免疫调节剂组合治疗

背景

I.相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年5月27日提交的美国临时专利申请序列号62/342,482的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。

II.通过引用并入以文本文件提供的序列表

与此一起以文本文件“011863-5006WO-DNAtrix_ST25.txt”提供了序列表，其于2017年5月30日创建并且具有2KB的大小。该文本文件的内容通过引用整体并入本文。

III.技术领域

本发明一般性地涉及肿瘤学和癌症治疗领域。更具体地，其涉及用于治疗癌症的经遗传修饰以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如PD-1或PD-L1抑制剂)和/或免疫细胞刺激性受体激动剂的复制性溶瘤病毒和包含以下的药物组合：(i)经遗传修饰以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂和/或免疫细胞共刺激性受体激动剂的复制性溶瘤病毒，和(ii)单独施用的免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫检查点抑制剂。

IV.背景技术

癌症仍然是全世界人类发病率和死亡率的主要原因之一。虽然已经利用手术、化学治疗和放射来治愈癌症取得了一些成功，但是仍需要新的策略。在肿瘤细胞中比在正常细胞中复制得更好的病毒已显示出其作为溶瘤剂(oncolytic agent)的前景。已经很好地确立了使用腺病毒进行基因转移和肿瘤溶解的可行性。

仍然需要另外的抗癌症治疗。

发明内容

本发明涉及表达免疫细胞的抑制信号的一种或更多种拮抗剂的新的可复制型溶瘤病毒(replication competent oncolytic virus)、包含所述可复制型溶瘤病毒的药物组合物以及它们在治疗多种癌症中的用途。本发明还涉及药物组合，其包含(i)表达免疫细胞的抑制信号的一种或更多种拮抗剂和/或一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂的可复制型溶瘤病毒和(ii)免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂。在一些优选的实施方案中，提供了药物组合，其包含(i)表达免疫细胞刺激性受体激动剂(例如OX40L和/或GITL)的可复制型腺病毒和(ii)免疫检查点抑制剂，其中所述腺病毒和免疫检查点抑制剂用于单独、依次或同时施用。可复制型溶瘤病毒将在第一次复制周期中呈递免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂，通过活化识别肿瘤抗原的淋巴细胞和逆转肿瘤周围的免疫抑制环境来触发持续的效应物抗肿瘤免疫应答。在某些方面，与未经修饰的病毒(即不表达免疫细胞刺激性受体激动剂或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂)和当单独施用免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂相比，向患有癌症的对象施用经工程改造的可复制型溶瘤病毒提供了增强的甚至协同的抗肿瘤免疫力。在相关方面，即使在病毒清除之后可复制型溶瘤病毒的抗肿瘤作用仍然存在并且甚至延伸至一个或更多个未感染的肿瘤。

在数个实施方案中，可复制型溶瘤病毒被工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂。免疫细胞的抑制信号的拮抗剂优选为以下免疫检查点蛋白的抑制剂，例如但不限于：细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)、B7-H3、B7-H4、T细胞膜蛋白3(Tcell membrane protein 3，TIM3)、半乳凝素9(galectin，GAL9)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG3)、T细胞活化的含V结构域免疫球蛋白(Ig)抑制子(V-domain immunoglobulin(Ig)-containing suppressor of T-cell activation，VISTA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer-Cell Immunoglobulin-Like Receptor，KIR)、B和T淋巴细胞弱化子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)或具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain，TIGIT)。溶瘤病毒可以被工程改造以表达免疫检查点蛋白的配体的抑制剂，包括但不限于CTLA4、PD-1、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR或BTLA的配体。

在某些优选的实施方案中，提供了表达PD-1的拮抗剂和/或其配体PD-L1和PD-L2任一个的拮抗剂的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)。PD-L1已被鉴定为抗肿瘤T细胞的负调节子，并且在达50％的人类癌症中表达。肿瘤细胞上的PD-L1与活化的效应T细胞上的PD-1的结合导致活化PI3激酶-信号转导级联，其转而阻断杀伤肿瘤细胞所需的细胞毒性介质的产生。本文中使用的PD-L1、PD-L2或PD-1拮抗剂是破坏PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之一或两者之间的相互作用的分子。在一个方面，可复制型溶瘤病毒是腺病毒，其包含插入腺病毒基因组非必需区中的编码PD-L1、PD-L2和/或PD-1拮抗剂的异源核酸。在相关方面，异源核酸编码抗PD-L1单克隆抗体，例如美国专利No.8,217,149中公开的BMS-936559(MDX-1105)、阿替珠单抗(atezolizumab)(Tecentriq；MPDL3280A)，美国专利No.8,779,108中公开的度伐单抗(durvalumab)(MEDI4736)，其内容通过引用并入本文，M1HI(Affymetrix，可通过eBioscience(16.5983.82)获得)或阿维单抗(avelumab)(MSB0010718C；Merck KgaA)，或抗PD-1单克隆抗体，例如纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558)、派姆单抗(pembrolizumab)或兰利珠单抗(lambrolizumab)。在另一些实施方案中，异源核酸编码PD-L1或PD-1拮抗剂，例如在美国专利申请公开No.2009/0217401、20110195068和20120251537以及美国专利No.8,217,149中描述的那些，其各自的内容均通过引用并入本文。在一个优选的实施方案中，可复制型溶瘤病毒是表达PD-L1和/或PD-1拮抗剂的腺病毒。在一个优选的实施方案中，腺病毒是Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒。

在另一些优选的实施方案中，提供了表达CTLA4的拮抗剂的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)。在一个方面，可复制型溶瘤病毒是包含插入腺病毒基因组非必需区中的编码CTLA4拮抗剂的异源核酸的腺病毒。在相关方面，异源核酸编码抗CTLA4单克隆抗体，例如伊匹单抗或替西木单抗(tremelimumab)。

在一些相关的实施方案中，提供了被工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂并且还表达免疫细胞刺激性受体的激动剂的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)。在某些实施方案中，可复制型溶瘤病毒表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂，并且还表达选自以下的免疫细胞刺激性受体的激动剂：CD28、OX40(CD134)、糖皮质激素诱导的TNF受体(glucocorticoid-induced TNF-receptor，GITR)、CD137(4-1BB)、疱疹病毒进入介质A(herpes virus entry mediator A，HVEM)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS或CD278)、CD27、CD40、CD226、细胞毒性和调节性T细胞分子(cytotoxic and regulatory T cellmolecule，CRTAM)、死亡受体3(death receptor 3，DR3)、淋巴毒素-β受体(lymphotoxin-beta receptor，LTBR)、跨膜活化剂和CAML相互作用物(transmembrane activator andCAML interactor，TACI)、B细胞活化因子受体(B cell-activating factor receptor，BAFFR)和B细胞成熟蛋白(B cell maturation protein，BCMA)。在一个优选的实施方案中，提供了表达(i)GITR多肽配体和/或OX40多肽配体和(ii)PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA4抑制剂的可复制型腺病毒。在一些实施方案中，除了表达免疫细胞刺激性激动剂例如GITR多肽配体和/或OX40多肽配体之外，可复制型溶瘤病毒还表达PD-L1或PD-1拮抗剂。

在某些实施方案中，可复制型溶瘤病毒除了表达免疫检查点抑制剂和任选的免疫细胞刺激性受体激动剂之外，还表达一种或更多种肿瘤抗原。在一些优选的实施方案中，一种或更多种肿瘤抗原在病毒的表面上表达，在这种情况下，编码肿瘤抗原的核酸插入病毒基因组中应“在框内(in frame)”进行。在某些方面，1、2、3、4或5种抗原在病毒的表面上表达，例如，通过将编码各抗原的核酸插入编码腺病毒表面蛋白的单独基因中。在一个优选的实施方案中，肿瘤相关抗原是EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)和/或NY-ESO-1(纽约食道鳞状细胞癌1)。肿瘤抗原可作为衣壳或纤维蛋白的一部分表达，或者作为与自噬相关蛋白(例如LC3)连接的外源蛋白产生，以增加外源蛋白在腺病毒感染和复制期间的呈递。靶向多种抗原将有助于产生持久且有效的免疫应答。

在某些方面，可复制型溶瘤病毒由并入病毒基因组非必需区中的异源核酸表达免疫细胞刺激性受体激动剂和/或表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂，所述异源核酸包含编码免疫细胞刺激性受体激动剂或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的核酸序列，其受允许在细胞中表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂或免疫细胞刺激性受体激动剂的序列的控制。在一些实施方案中，可复制型溶瘤病毒是腺病毒，并且免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的表达受内源腺病毒启动子(例如E3启动子)或晚期腺病毒启动子(例如主要晚期启动子)的控制。在另一些实施方案中，可复制型溶瘤病毒是腺病毒，并且编码免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的核酸受非腺病毒转录和/或翻译控制序列例如来自以下的增强子、启动子和/或前导序列的控制(即与其有效连接)：巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)(例如CMV启动子)、劳斯肉瘤病毒(rous sarcomavirus，RSV)(例如RSV启动子)或猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)(例如SV40启动子)。构建体的“异源”区域是较大核酸分子内的核酸的可鉴定区段，在性质上未发现其与所述较大分子相关。由溶瘤病毒表达的免疫细胞刺激性受体激动剂和/或由溶瘤病毒表达的免疫细胞的抑制信号的拮抗剂可以在肿瘤细胞的表面上表达(即可以插入肿瘤细胞的膜中)或可以从肿瘤细胞分泌。

肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen，TAA)包括但不限于已经鉴定为在患有脑癌(例如神经胶质瘤)的患者中存在的肿瘤相关抗原，其代表性实例包括：AIM2(在黑素瘤2中不存在)、BMI1(BMI1多梳环指癌基因)、COX-2(环加氧酶-2)、TRP-1(酪氨酸相关蛋白2)、TRP-2(酪氨酸相关蛋白2)、GP100(糖蛋白100)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、EZH2(zeste增强子同源物2)、LICAM(人LI细胞黏附分子)、Livin、Livinβ、MRP-3(多药抗性蛋白3)、巢蛋白、OLIG2(少突胶质细胞转录因子)、SOX2(SRY相关HMG-框2)、ART1(T细胞所识别的抗原1，antigen recognized by T cells 1)、ART4(T细胞所识别的抗原4)、SART1(T细胞所识别的鳞状细胞癌抗原1)、SART2、SART3、B-细胞周期蛋白、b-联蛋白、Gli1(神经胶质瘤相关癌基因同源物1)、Cav-1(窖蛋白-1)、组织蛋白酶B、CD74(分化簇74)、E-钙黏着蛋白(上皮钙依赖性黏附)、EphA2/Eck(EPH受体A2/上皮激酶)、Fra-1/Fosl 1(fos相关抗原1)、GAGE-1(G抗原1)、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1，6-N(乙酰葡糖胺基转移酶-V)、Her2/neu(人表皮生长因子受体2)、Ki67(抗体Ki67的核增殖相关抗原)、Ku70/80(人Ku异二聚体蛋白质亚基)、IL-13Ra2(白细胞介素-13受体亚基α-2)、MAGE-A(黑素瘤相关抗原1)、MAGE-A3(黑素瘤相关抗原3)、NY-ESO-1(纽约食道鳞状细胞癌1)、MART-1(T细胞所识别的黑素瘤抗原)、PROX1(prospero同源异型框蛋白1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、SOX10(SRY相关的HMG-框10)、SOX11、存活蛋白、UPAR(尿激酶型纤溶酶原激活物受体)和WT-1(维尔姆斯瘤蛋白1)。可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)可表达全长肿瘤相关抗原或其免疫原性肽。

在一个方面，可复制型溶瘤病毒除了表达免疫检查点抑制剂和任选的免疫细胞刺激性受体激动剂之外，还在其表面上表达EGFRvIII或其免疫原性肽。美国专利No.6,455,498中描述了EGFRvIII的序列，其内容在此通过引用并入。免疫原性EGFRvIII肽包括美国专利申请公开No.2009/0155282(其内容在此通过引用并入)中描述的那些，特别是第[0362]段和表4.1至4.3中的那些。优选地，溶瘤病毒是腺病毒并且EGFRvIII或其免疫原性肽插入编码纤维蛋白的基因中，优选HI环中。编码EGFRvIII或其免疫原性肽的核酸可以插入编码任何腺病毒的一种或更多种表面蛋白的基因中。本文中使用的术语“免疫原性EGFRvIII肽”意指适当长度的肽，例如至少10或12个氨基酸以及多达15、20、25或30个氨基酸或更多，其跨越对应EGFRvIII蛋白(优选人EGFRvIII)的突变剪接接点。在一个优选的实施方案中，插入腺病毒表面蛋白中的核酸编码8至20个氨基酸肽，其由序列EKKGNYVV(SEQ ID NO：1)组成、基本上由其组成或包含其。在一个特别优选的实施方案中，EGFRvIII免疫原性肽是LEEKKGNYVVT(SEQ ID NO：2)并且被插入编码纤维蛋白的基因中，优选HI环中。在另一些实施方案中，将编码整个EGFRvIII胞外结构域的核酸插入编码腺病毒的表面蛋白的基因中。

在相关方面，可复制型溶瘤病毒除了表达免疫检查点抑制剂和任选的免疫细胞刺激性受体激动剂之外，还在其表面上表达NY-ESO-1(GenBank U87459.1)或其免疫原性肽(例如SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO：3))。优选地，可复制型溶瘤病毒是腺病毒并且将编码NY-ESO-1或其免疫原性肽的核酸插入编码表面蛋白的基因中，由此腺病毒表达包含NY-ESO-1或其免疫原性肽的嵌合表面蛋白。在一个方面，将编码NY-ESO-1或其免疫原性肽的核酸插入编码腺病毒六邻体的基因的高变区5中。

某些实施方案涉及治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移的方法，其包括向肿瘤施用有效量的如上所述的表达一种或更多种免疫检查点抑制剂和/或表达一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂并且任选地还表达一种或更多种肿瘤抗原的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)，或施用有效量的包含所述可复制型溶瘤病毒的药物组合物。在某些方面，所述方法包括向肿瘤施用Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒，其包含插入Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒骨架的一个或更多个非必需区中的编码一种或更多种免疫检查点抑制剂和/或编码一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂和/或一种或更多种肿瘤抗原的一种或更多种异源核酸序列。在一个优选的实施方案中，Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒基因组的部分E3区或全部E3区缺失并且被异源核酸替换。在一些实施方案中，通过一次或更多次瘤内注射将可复制型腺病毒施用至肿瘤。在某些优选的实施方案中，癌症是神经胶质瘤、原发性或转移性乳腺癌或原发性或转移性肺癌。在一些实施方案中，向有癌症倾向或易患癌症的人对象施用本文中所述的可复制型溶瘤病毒以预防癌症的发作。在另一些实施方案中，向诊断患有癌症的人对象施用本文中所述的可复制型溶瘤病毒。在相关的实施方案中，对象患有转移性癌症。

在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了通过向对象施用有效量的Δ-24-RGD腺病毒用于在人对象中治疗癌症(例如神经胶质瘤)的方法，所述Δ-24-RGD腺病毒包含插入腺病毒骨架非必需区(例如缺失的E3区)中的编码免疫检查点抑制剂的异源核酸序列和/或包含编码免疫细胞刺激性受体激动剂(例如OX40L)的异源核酸序列和/或编码肿瘤抗原的异源核酸。在某些优选的实施方案中，癌症是神经胶质瘤、原发性或转移性乳腺癌或原发性或转移性肺癌。在相关的优选实施方案中，提供了用于在诊断患有癌症的对象中治疗和/或预防转移的方法，其包括向对象施用有效量的表达免疫检查点抑制剂和/或表达免疫细胞刺激性受体激动剂和/或肿瘤抗原的可复制型溶瘤病毒。在一些实施方案中，向有癌症倾向或易患癌症的对象施用本文中所述的溶瘤病毒以预防癌症的发作。在另一些实施方案中，向诊断患有癌症的对象施用本文中所述的溶瘤病毒。在相关的实施方案中，对象患有转移性癌症。

在某些优选的实施方案中，提供了用于在人对象中治疗和/或预防癌症(例如神经胶质瘤或原发性或转移性乳腺癌或肺癌)的方法，所述方法包括向对象施用有效量的Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒，其包含编码PD-L1、PD-1和/或CTLA4抑制剂的一种或更多种异源核酸序列，其中PD-L1、PD-1和/或CTLA4抑制剂在对象的癌细胞中表达。

在另一些优选的实施方案中，提供了用于在人对象中治疗和/或预防癌症(例如神经胶质瘤或原发性或转移性乳腺癌或肺癌)的方法，所述方法包括向对象施用有效量的Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒，其包含(i)编码PD1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA4抑制剂的一种或更多种异源核酸序列和/或(ii)编码OX40配体多肽和/或GITR配体多肽的一种或更多种异源核酸序列，其中OX40配体多肽和/或GITR配体多肽和/或PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂和/或CTLA4抑制剂在对象的癌细胞中表达。

在一个方面，待治疗的对象是患有癌症的人，所述癌症对于用一种或更多种化学治疗剂的治疗是难治的和/或用一种或更多种抗体的治疗是难治的。例如，可以向被鉴定为检查点抑制剂治疗的候选者的患有癌症的人施用表达免疫检查点抑制剂的溶瘤病毒(例如腺病毒)。

在一些方面，治疗由例如但不限于以下的临床结果决定：T细胞的抗肿瘤活性的提高、增强或延长，与治疗之前的数目相比抗肿瘤T细胞或活化T细胞的数目增加，或其组合。在另一方面，临床结果是肿瘤稳定、肿瘤消退或肿瘤缩小。

本发明还涉及用于治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移的药物组合。

因此，在一些实施方案中，提供了用于在对象中治疗和/或预防癌症和/或确立转移的组合治疗，其包括向对象共同施用(i)表达一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂(例如OX40L和/或GITRL)的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)与(ii)一种或更多种免疫检查点抑制剂的组合。在某些优选的实施方案中，组合治疗的溶瘤病毒是经工程改造以表达CD28、OX40(CD134)、GITR、CD137(4-1BB)、HVEM、ICOS(CD278)、CD27、CD40、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR或BCMA的激动剂的腺病毒。在一些特别优选的实施方案中，组合治疗的溶瘤病毒是经修饰的Ad5病毒，例如工程改造以表达OX40激动剂(例如OX40L)和/或GITR激动剂(例如GITRL)的Δ-24或Δ-24-RGD。在另一些优选的实施方案中，组合治疗的免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA4特异性结合的单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、融合蛋白或其组合。在一些特别优选的实施方案中，提供了用于在对象中治疗和/或预防癌症(例如神经胶质瘤)和/或确立转移的组合治疗，其包括向对象共同施用(i)经工程改造以表达OX40L和/或GITRL的可复制型Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒与(ii)抗PD-1和/或抗PD-L1单克隆抗体的组合。在一些实施方案中，所述组合的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)还表达免疫检查点抑制剂，在这种情况下，由所述组合的溶瘤病毒表达的免疫检查点抑制剂和所述组合的免疫检查点抑制剂优选地抑制不同的免疫检查点蛋白质。所述组合的溶瘤病毒(例如腺病毒)和免疫检查点抑制剂同时或依次以任一顺序施用于有此需要的对象，并且可作为相同制剂的一部分或以不同的制剂施用。在一些优选的实施方案中，在第一剂量的免疫检查点蛋白抑制剂之前施用第一剂量的溶瘤病毒。在另一些优选的实施方案中，经瘤内施用溶瘤病毒和免疫检查点蛋白抑制剂。

在另一些实施方案中，提供了用于在对象中治疗和/或预防癌症和/或确立转移的组合治疗，其包括向对象共同施用(i)表达免疫检查点抑制剂的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)与(ii)免疫细胞刺激性受体的一种或更多种激动剂的组合。在某些优选的实施方案中，组合治疗的溶瘤病毒是经工程改造以表达CTLA4、PD-1、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、TIGIT或BTLA的抑制剂或其配体的抑制剂的腺病毒。在一些特别优选的实施方案中，组合治疗的溶瘤病毒是经修饰的Ad5病毒，例如经工程改造以表达PD-1、PD-L1或CTLA4抑制剂的Δ-24或Δ-24-RGD。在另一些优选的实施方案中，组合治疗的免疫细胞刺激性受体激动剂是GITR或OX40的激动剂。在一些特别优选的实施方案中，提供了用于在对象中治疗和/或预防癌症和/或确立转移的组合治疗，其包括向对象共同施用(i)经工程改造以表达PD-1、PD-L1或CTLA4抑制剂的可复制型Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒与(ii)GITR或OX40激动剂的组合。在一些实施方案中，所述组合的可复制型溶瘤病毒(例如腺病毒)还表达免疫细胞刺激性受体激动剂，在这种情况下，由所述组合的溶瘤病毒表达的免疫细胞刺激性受体激动剂与所述组合的免疫细胞刺激性受体激动剂相比优选地结合不同的免疫细胞刺激性受体。所述组合的溶瘤病毒(例如腺病毒)和免疫细胞刺激性受体激动剂同时或依次以任一顺序施用于有此需要的对象，并且可作为相同制剂的一部分或以不同的制剂施用。在一些优选的实施方案中，经瘤内施用溶瘤病毒和免疫细胞刺激性受体激动剂。

在一些实施方案中，本文中所述的组合的可复制型溶瘤病毒还表达一种或更多种肿瘤抗原。

在一个方面，待用本文中所述的组合治疗来治疗的对象是患有癌症的人，所述癌症对于用一种或更多种化学治疗剂的治疗是难治的和/或对于用一种或更多种抗体的治疗是难治的。例如，可以向被鉴定为检查点抑制剂治疗的候选者的患有癌症的人或甚至向已在用免疫检查点抑制剂的一次或更多次治疗中失败的患有癌症的人共同施用检查点抑制剂(例如抗PD-1和/或抗PD-L1)和表达免疫细胞刺激性受体激动剂(例如OX40L)的溶瘤病毒(例如腺病毒)。

在另一些实施方案中，表达免疫细胞刺激性受体激动剂和/或表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的可复制型溶瘤病毒与另外的癌症治疗(例如放射治疗、化学治疗、激素治疗、手术及其组合)进行组合以在对象中治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移。

编码免疫细胞刺激性受体激动剂或编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的DNA可以插入到例如溶瘤病毒中的任何非必需的位置处，只要溶瘤病毒保持复制能力即可。在一个实施方案中，溶瘤病毒是具有异源核酸的腺病毒，所述异源核酸包含插入腺病毒纤维蛋白基因的下游的编码免疫细胞刺激性受体激动剂的序列或编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的序列，从而所编码的蛋白质的表达由腺病毒主要晚期启动子驱动。在一个优选的实施方案中，将包含编码免疫细胞刺激性受体激动剂的序列或编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的序列的异源核酸插入可复制型腺病毒骨架的E3区中。E3区对于病毒复制是非必需的；但是E3蛋白在调节宿主免疫应答中发挥作用。可复制型腺病毒可包含完整或部分的E3缺失。例如，可复制型腺病毒可包含E3区中一个、两个、三个或更多个开放阅读框(openreading frame，ORF)的缺失以及插入其位置的异源核酸。在一个实施方案中，缺失gpl9k和6.7K基因并且异源核酸插入gpl9k/6.7K缺失的E3区中。在一个相关的实施方案中，可缺失腺病毒5型基因组的78.3和85.8图距单位(map unit)处BglII限制酶位点之间的区域并且异源核酸插入在缺失的E3区中，如Bett等，J.Virol.，67(10)：5911-5922(1993)中所描述的，其内容通过引用并入本文。在相关方面，全部E3区从可复制型腺病毒骨架中缺失，并且异源核酸插入包含全部E3缺失的位置中。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒，其包含插入部分或完全缺失的E3区位置处的一个或更多个异源核酸序列，其中所述一个或更多个异源核酸序列包含编码OX40激动剂(优选OX40L)的序列和/或编码GITR激动剂(优选GITRL)的序列和/或编码PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA4抑制剂的序列，并且OX40激动剂、GITR激动剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂和/或CTLA4抑制剂的表达受一种或更多种非腺病毒启动子(例如CMV启动子)的控制。

在一些实施方案中，人对象表现出Th1白细胞介素模式。在另一些实施方案中，人对象表现出Th2白细胞介素模式。如果对象具有小于约20、小于约15或小于约10的IL-12/IL-4比，则确定该对象表现出Th2白细胞介素模式。表现出Th1白细胞介素模式的对象通常表现出大于20的IL-12/IL-4比，并且在一些情况下大于50、大于100并且甚至大于300。对象中的IL-12/IL-4比可以通过以下确定：从对象获得样品(例如血液或血清样品)，使样品与针对IL-12和IL-4的抗体接触以及确定作为抗体与其各自抗原结合的量的函数的样品中IL-12和IL-4的量(例如通过ELISA)。

在相关的实施方案中，一种或更多种Th1刺激剂与如上所述的表达一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫检查点抑制剂的可复制型溶瘤病毒共同施用以在对象中治疗癌症(例如胶质母细胞瘤)。在一些实施方案中，对象具有小于约20的IL-12/IL-4比(即表现出Th2白细胞介素模式)。在另一些实施方案中，对象具有大于约20的IL-12/IL-4比(即表现出Th1白细胞介素模式)。Th1刺激剂包括但不限于：(i)Th1细胞因子，例如IL-12p70、IL-2和IFN-γ，(ii)增加Th1细胞因子产生的试剂，例如REVLIMID(来那度胺(lenalidomide))，(iii)抑制调节性T细胞的试剂(例如烷化剂，例如替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧代-2，3，4，6，8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2，7，9-三烯-9-甲酰胺)、环磷酰胺((RS)-N，N-双(2-氯乙基)-1，3，2-磷杂环己烷-2-胺基2-氧化物)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU；N-(2-氯乙基)-N’-环己基-N-亚硝基脲)、双氯乙基亚硝基脲(BCNU)、美法仑盐酸盐(4[双(氯乙基)氨基]苯丙氨酸)、白消安(丁烷-1，4-二基二甲磺酸酯)、二氯甲基二乙胺(氮芥)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosfamide)、链脲霉素(streptozocin)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、噻替哌(thiotepa)、六甲密胺(altretamine)(六甲基三聚氰胺)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和奥沙拉铂(oxalaplatin))和(iv)刺激细胞介导的免疫应答的试剂(例如伊匹单抗、替西木单抗、MDX-1106、MK-3475、AMP-224、匹利珠单抗和MDX-1105)。用于与本发明的可复制型溶瘤病毒共同施用的优选Th1刺激剂包括IFN-γ(优选重组的)和替莫唑胺。本发明的可复制型溶瘤病毒和Th1刺激剂可以单独、同时或相继地施用于患有癌症的对象以治疗癌症。在一个实施方案中，向对象施用Th1刺激剂，并且然后施用可复制型溶瘤病毒。在另一些相关的实施方案中，提供了组合物或试剂盒，其包含(i)Th1刺激剂和(ii)本文中所述的表达一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂和/或一种或更多种免疫检查点抑制剂的可复制型溶瘤腺病毒，每种都以在对象中有效治疗癌症的量与另一种组合。在一个优选的实施方案中，组合物或试剂盒包含(i)选自重组IFN-γ、替莫唑胺、CCNU、BCNU、美法仑盐酸盐和白消安的Th1刺激剂和(ii)表达OX40激动剂(例如OX40L)和/或GITR激动剂(例如GITRL)的可复制型溶瘤腺病毒(例如Δ-24或Δ-24-RGD)。

在另一些相关的实施方案中，提供了用于监测使用表达一种或更多种免疫检查点抑制剂的可复制型溶瘤病毒的治疗的响应性的方法，其包括测量来自用所述病毒治疗的患者的样品(例如外周血)中的Th1细胞因子(例如IFNγ)，其中与参照(例如治疗前的水平)相比，样品中Th1细胞因子水平升高表明对治疗的响应性。

在另一个相关的实施方案中，提供了用于监测用以下进行的组合治疗的响应性的方法：(i)经遗传修饰以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂和/或免疫细胞共刺激性受体激动剂的复制性溶瘤病毒，和(ii)单独施用的免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫检查点抑制剂，所述方法包括测量来自用所述组合治疗的患者的样品(例如外周血)中的Th1细胞因子(例如IFNγ)，其中与参照(例如治疗前的水平)相比，样品中Th1细胞因子的水平升高表明对组合治疗的响应性。

在另外的方面，提供了用于在哺乳动物中诱导免疫应答的试剂盒，其包含(i)经工程改造以表达一种或更多种免疫细胞刺激性激动剂和/或免疫检查点抑制剂的可复制型溶瘤病毒(优选腺病毒)和(ii)免疫细胞刺激性激动剂或免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，试剂盒包含(i)可复制型溶瘤腺病毒，其包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架或杂合核酸骨架，其包含Ad5组分和插入腺病毒基因组非必需区中的编码GITR激动剂或OX40激动剂的异源核酸序列，其中插入的异源核酸序列受允许在细胞中表达GITR激动剂或OX40激动剂的序列的控制，和(ii)与PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA4特异性结合的单克隆抗体。所述试剂盒还可包含使用所述组合用于治疗癌症的说明书。某些方面并不需要完全切除肿瘤，这是以其他途径招募患者的限制因素。此外，当前方法和组合物的某些方面具有在免疫系统中产生记忆的潜力并且预防肿瘤复发或降低其概率。

术语“可复制型(replication competent)”是指对于在特定的细胞或组织中病毒复制所需的任何基因功能方面没有缺陷的任何病毒载体。所述载体必须能够复制并且被包装，但可仅在特定的细胞或组织中有条件地复制。如本文中所述将本发明的可复制型腺病毒载体工程改造以降低或消除其在正常细胞中复制的能力，同时保留其在特定的肿瘤疾病细胞类型中有效复制的能力。通常，可复制型腺病毒包含足够的E1、E2和E4区域使得腺病毒能够复制并被包装而不需要反式提供元件。

术语“治疗益处”或“治疗”是指促进或增强对象在其病症的医药治疗方面的健康的任何事情，其包括初癌(pre-cancer)、癌症和过度增殖性疾病的治疗。其非穷举性实例的列表包括：使对象的生命延长任意时间段、降低或延迟疾病的肿瘤发展、减少过度增殖、降低肿瘤生长、延迟转移、降低癌细胞或肿瘤细胞增殖率以及减少可归因于对象病症的对象的疼痛。

“T调节性细胞”或“调节性T细胞”是指可以抑制T细胞应答的细胞。调节性T细胞表达转录因子Foxp3，其在T细胞活化后不上调并且将调节性T细胞与活化的效应物细胞区分开。通过细胞表面标志物CD25、CD45RB、CTLA4和GITR鉴定调节性T细胞。通过骨髓抑制细胞活性诱导调节性T细胞形成。已经鉴定了数种调节性T细胞亚群，其具有抑制自身免疫和慢性炎症应答以及在携带肿瘤的宿主中维持免疫耐受的能力。这些亚群包括白细胞介素10-(IL-10-)分泌型1型调节性T(Tr1)细胞、转化生长因子-β(TGF-β)分泌型3型辅助性T(Th3)细胞和“天然”CD4+/CD25+Tregs(Tm)(Fehervari和Sakaguchi.J.Clin.Invest.2004，1 14：1209-1217；Chen等，Science.1994，265：1237-1240；Groux等，Nature.1997，389：737-742)。

本文中使用的“激动剂”(例如OX40激动剂)是增强其靶标(例如OX40)的生物活性的分子。在某些方面，OX40激动剂包括例如抗OX40抗体或OX40配体组合物，其显著增强OX40的生物活性。期望地，生物活性被增强10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在某些方面，本文中公开的OX40激动剂包括与OX40(例如人OX40)特异性结合的OX40结合分子，例如结合多肽、抗OX40抗体、OX40L或这些分子的片段或衍生物。通过“特异性结合”其意指结合分子基本上表现出与非靶标(例如非OX40)分子结合的背景。然而，与OX40特异性结合的分离的结合分子可与来自其他物种的OX40分子具有交叉反应性。在一个实施方案中，免疫细胞共刺激性受体激动剂增强由或通过免疫细胞上表达的细胞表面蛋白介导的共刺激信号。

本文中使用的“拮抗剂”(例如PD-1拮抗剂)是通过抑制靶标(例如PD-1)与其一个或更多个结合伴侣(例如PD-L1或PD-L2)的相互作用而降低其靶标(例如PD-1)的生物活性的分子。在某些方面，PD-1拮抗剂(包括例如抗PD-1抗体)显著降低PD-1的生物活性。期望地，生物活性被降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在某些方面，本文中公开的PD-1拮抗剂包括与PD-1(例如人PD-1)特异性结合的PD-1结合分子，例如结合多肽、抗PD-1抗体或这些分子的片段或衍生物。在一个实施方案中，免疫细胞的抑制信号的拮抗剂减少由或通过免疫细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号。

本文中使用的“检查点抑制剂”或“免疫检查点抑制剂”意指作用于表面蛋白(其是TNF受体或B7超家族的成员)的试剂，包括与负共刺激分子(包括但不限于CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和/或其各自的配体，包括PD-L1)结合的试剂。

术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”和“PD1”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同工型、物种同源物和与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以在GenBank登录No.U64863下找到。

术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”和“CTLA-4抗原”可互换使用，并且包括人CTLA-4的变体、同工型、物种同源物和与CTLA-4具有至少一个共同表位的类似物。完整的CTLA-4核酸序列可以在GenBank登录No.L15006下找到。

应理解，“组合治疗”设想同时、依次或单独地施用组合的组分。在本发明的一个方面，“组合治疗”设想同时施用溶瘤病毒和检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂。在本发明的另一个方面，“组合治疗”设想依次施用溶瘤病毒和检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂。在本发明的另一个方面，“组合治疗”设想单独地施用溶瘤病毒和检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂。当溶瘤病毒和检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂的施用是依次施用或单独施用时，溶瘤病毒和检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂在允许治疗剂显示出共同的(例如协同的)作用的时间间隔内施用。在一些优选的实施方案中，溶瘤病毒和检查点抑制剂在彼此的1、2、3、6、12、24、48、72小时内，或4、5、6或7天内或8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天内施用。

贯穿本申请，讨论了本发明的另一些实施方案。关于本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适用于本发明的其他方面，并且反之亦然。本文中所描述的每个实施方案应理解为可应用于本发明所有方面的本发明的实施方案。预期对于本发明的任何方法或组合物都可以实施本文中所讨论的任何实施方案，并且反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。

在权利要求书和/或说明书中，当与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可意指“一个/种”，但其也与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。

贯穿本申请，术语“约/大约”用于表示一个值包括用于测定所述值的装置或方法之误差的标准差。

虽然本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义，但是在权利要求书中使用的术语“或/或者”用于意指“和/或”，除非明确地表明仅指替代方案或替代方案是相互排斥的。

本说明书和权利要求书中使用的词语“包含(comprising)”(以及“包含”的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(以及“具有”的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及“包括”的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及“含有”任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。

从以下详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，虽然详细描述和具体实例指出了本发明的一些具体实施方案，但是其仅以举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，对于本领域技术人员而言，本发明的精神和范围内的多种变化和修改方案将变得明显。

附图简述

图1.Δ-24-RGDOX基因组的示意性图示，其包括在编码RB结合区的E1A基因中的24-碱基对缺失和编码蛋白质的HI环中的整联蛋白结合基序(RGD-4C)的纤维蛋白基因中的插入。小鼠OX40L(mOX40L)表达盒，包括巨细胞病毒(CMV)启动子(pCMV)、mOX40L cDNA、牛生长激素多腺苷酸化信号(bovine growth hormone poly-adenylation signal，BGH pA)，替代了人腺病毒5基因组的E3区。ITR(inverted terminal repeat)：反向末端重复。在另一种构建体中，编码小鼠OX40L的cDNA插入在腺病毒基因组的纤维蛋白基因的下游，并且OX40L的表达由内源性腺病毒晚期启动子驱动。

图2A至2B.通过小鼠神经胶质瘤GL261细胞(图2A)和人U-87MG神经胶质瘤细胞(图2B)中的Δ-24-RGD-OX40L(在图中称为D24-RGDOX)表达小鼠OX4L(mOX40L)。用Δ-24-RGD或Δ-24-RGDOX以50pfu/细胞(GL261)或10pfu/细胞(U-87MG)感染细胞。48小时之后，收获细胞并用流式细胞术分析mOX40L表达(α-mOX40L抗体(1∶100稀释))和细胞死亡(用乙啶同源二聚体-1(8μM)染色的膜破裂的细胞)。示出了每个分析的代表性点图。右下角的数字表示在其细胞膜上表达mOX40L的活细胞的百分比。

图3.通过小鼠黑素瘤B16细胞上的D24-RGDOX表达小鼠OX40L(mOX40L)。方法与图2A至2B所描述的相同。

图4A至4C.通过来自病毒处理的肿瘤的异种移植细胞上的D24-RGDOX体内表达小鼠OX40L(mOX40L)。在C57BL/6小鼠中颅内注射GL261-EGFP细胞(5×10⁴个细胞)，并且12天之后瘤内注射D24-RGDOX或D24-RGD(5×10⁷ pfu)。根据图4A所描述的方案，注射后3天，收获来自经处理小鼠(每组3只小鼠)的含有肿瘤的半球，使细胞解离并用大鼠单克隆α-mOX40L-APC抗体(1∶100稀释)染色。用流式细胞术分析经染色的细胞。肿瘤细胞进行EGFP⁺设门(gate)。代表性的点图如图4B所示。右上角的数字表示表达mOX40L的肿瘤细胞的百分比。相同的数据在图4C中用图表示出。示出了两个独立实验的结果。

图5.在U-87MG和GL261细胞中D24-RGD和D24-RGDOX的复制。用病毒以10pfu/细胞感染细胞。感染后48小时，滴定感染的病毒后代，并且以pfu/ml确定最终的病毒滴度。

图6A至6E.由Δ-24-RGDOX诱导的免疫原性细胞死亡。图6A：D24-RGD和D24-RGDOX诱导HMGB1的释放。用指定的病毒以200pfu/细胞感染GL261细胞。24小时后，FBS的浓度从10％降至2％。在指定的时间点收集培养基(M)和全细胞裂解物(W)，并用免疫印迹分析HSP90和HMGB1表达水平。培养基中HMGB1的相对水平在图的底部示出。图6B：用指定的病毒以100pfu/细胞感染GL261细胞。72小时后，用免疫印迹分析细胞裂解物的胞质溶胶形式的微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3I)或其磷脂酰乙醇胺缀合物(LC3II)。LC3II/I之比用于监测自噬。E1A水平用作相对病毒剂量的指标，并相对于D24-RGD组中设定为1的值进行归一化。α-微管蛋白水平示出为蛋白质上样对照。AdGFP用作复制缺陷型病毒载体对照。图6C：用指定的病毒以100pfu/细胞感染GL261细胞。在72小时后收获细胞，并且用乙啶同源二聚体-1染色监测细胞裂解(细胞死亡)并用流式细胞术进行分析。图6D和6E：为了评价由病毒诱导的免疫原性细胞死亡，用指定的病毒以100pfu/细胞感染GL261细胞。72小时后，收集培养基并测定ATP(图6D)或HMGB1(图6E)的量。示出了相对ATP水平(图6D，1＝模拟处理的细胞中ATP的平均量)和HMGB1浓度(图6E)。值代表平均值±标准差(n＝3)。NS：不显著(P≥0.05)；*P＜0.0002，**P＝0.001，双尾学生t检验。模拟：PBS；D24RGD；Δ-24-RGD；D24-RGDOX；Δ-24-RGDOX。

图7A至7G.D24-RGDOX增强抗神经胶质瘤活性。图7A：治疗方案的卡通描绘。i.c.：颅内；i.t.：瘤内。图7B至7C：将GL261细胞植入C57BL/6小鼠的脑中。将动物随机分组(n＝9至10)并用PBS、D24-RGDOX(5×10⁷pfu)、D24-RGD(5×10⁷ pfu)、OX86(小鼠OX40抗体)(25μg)或D24-RGD与OX86的组合(分别为5×10⁷ pfu+25μg)进行处理(在肿瘤植入后第3、6和8天通过瘤内注射)。示出了C57BL/6(免疫活性，图7B)或无胸腺(免疫缺陷，图7C)小鼠(每组n＝10，除了对于图7B中OX86+Δ-24-RGD每组n＝9之外)中不同处理组的存活图。图7D：将特征在于较慢生长速率的来自所选的GL261克隆(GL261-5)的细胞植入C57BL/6小鼠的脑中。将动物随机分组(n＝10，除了对于D-24-RGD n＝8之外)，并在肿瘤植入后第6、8和10天通过瘤内注射用PBS、D24-RGDOX或D24-RGD进行处理。示出了携带缓慢生长的GL261-5神经胶质瘤(n＝6)的处理组中小鼠的存活图。图7E：当用GL261-5(n＝6)再攻击时，如图7D所示用Δ-24-RGDOX处理的组的存活成员的存活图。图7F：当用B16-F10细胞(n＝4)再攻击时，用Δ-24-RGDOX处理的组的存活成员的存活图。图7G：Δ-24-RGDQX诱导取自C57BL/6小鼠的神经胶质瘤中的坏死(necr.)。上图：来自显示肿瘤(T)和正常脑(N)组织的处理组的脑的代表性苏木精和伊红染色切片。下图：肿瘤内区域的放大图像。示出了来自图7B中每组的至少6只小鼠的代表性结果。底部的数字表示肿瘤植入与小鼠处死之间的天数。比例尺：上图，200μm；下图，50μm。NS：不显著(P≥0.05)；*P＜0.001，对数秩检验。D24RGD：Δ-24-RGD；D24-RGDOX；Δ-24-RGDOX。

图8A至8D.由Δ-24-RGDOX介导的抗神经胶质瘤免疫。图8A：由Δ-24-RGDOX诱导的肿瘤部位的淋巴细胞浸润。将GL261细胞(5×10⁴)移植到C57BL/6小鼠的尾状核中。在GL261细胞颅内植入后第6、8和10天，用指定的病毒(瘤内施用的D24-RGD或D24-RGDOX)或PBS处理C57BL/6小鼠中的神经胶质瘤。在实验的第14天，收集脑并进行分析。分离来自脑半球的脑浸润性白细胞(Brain-infiltrating leukocyte，BIL)，所述脑半球具有用PBS或指定病毒处理的携带神经胶质瘤的小鼠的肿瘤，并且使用流式细胞术检查指定的细胞表面标志物以评估肿瘤部位的肿瘤浸润性淋巴细胞(CD45+CD3+)、辅助性T淋巴细胞(CD45+CD3+CD4+)和细胞毒性T淋巴细胞(CD45+CD3+CD8+)的数目。指明了P值(学生t检验，双侧)。显示与D24-RGD相比，D24-RGDOX处理导致将免疫细胞更多地募集到肿瘤床中。图8B和8C：由Δ-24-RGDOX诱导针对神经胶质瘤细胞的免疫应答。如图8A所述处理神经胶质瘤。在肿瘤植入后第14天，用未感染的或已经被指定的病毒感染的预固定的GL261细胞刺激取自上述三组小鼠(每组5只小鼠)的BIL(图8B)或脾细胞(图8C)。40小时后，使用标准ELISA评估上清液中IFNγ的浓度。图8D：通过抗小鼠OX40L抗体抑制Δ-24-RGDOX介导的BIL的活化。分离来自具有Δ-24-RGDOX处理的肿瘤的半球(取自9只小鼠)的BIL，并如图8B所述在存在对照免疫球蛋白G(IgG)或抗小鼠OX40L抗体(4μg/ml)的情况下，用已经被Δ-24-RGD或Δ-24-RGDOX感染的预固定的GL261细胞进行刺激。使用ELISA评估上清液中IFNγ的浓度。值代表平均值±SD(n＝3)。NS：不显著(P≥0.05)；*P＜0.0001，**P＜0.05，双尾学生t检验。D24RGD：Δ-24-RGD；D24-RGDOX；Δ-24-RGDOX。

图9A至9C.由Δ-24-RGDOX介导的肿瘤特异性免疫。图9A：D24-RGDOX诱导识别肿瘤相关抗原(TAA)的淋巴细胞的体外增殖。将用CFSE预染色的OVA特异性CD8+T细胞(来自4只OT-I小鼠的脾脏；Hogquist等，Cell，76：17-27(1994)中描述的小鼠的OVA特异性TCR转基因系)与指定的预固定靶细胞一起孵育。4天后，用流式细胞术分析细胞的CFSE量以测量细胞增殖。右图：细胞进行CD8+设门，并示出了代表性的点图。左上角的数字表示增殖性T细胞的百分比。未刺激的T细胞(无刺激)用作阴性对照，并且用OVA(257-264)肽致敏的预固定小鼠树突细胞(mDC)(mDC/OVA(257-264))刺激的T细胞用作阳性对照。左图：增殖性T细胞的定量。示出了用以下指定的预固定靶细胞刺激之后增殖性CD8+细胞的百分比：GL261-OVA细胞(第1栏)；用Δ-24-RGD感染的GL261-OVA细胞(第2栏)；用D24-RGDOX感染的GL261-OVA细胞(第3栏)；和用D24-RGDOX感染的GL261细胞(第4栏)。图9B至9C：由Δ-24-RGDOX诱导的肿瘤特异性免疫。将GL261-OVA细胞(5×10⁴)移植到C57BL/6小鼠的尾状核中。如图8A中那样建立肿瘤。在肿瘤植入后第6、8和10天，瘤内注射D24-RGD或D24-RGDOX(5×10⁷ pfu)或PBS(对照)。图9B：在肿瘤植入后第14天，从携带GL261-OVA神经胶质瘤的小鼠的小鼠脾脏(每个处理组5个小鼠脾脏)中分离OVA特异性CD8+T细胞，然后用OVA(257-264)肽致敏的预固定的小鼠树突细胞(mDC)刺激(共培养)40小时。图9C：用预固定的小鼠星形胶质细胞(MA)或GL261-OVA细胞刺激(共培养)从上述处理组分离的脾细胞40小时。用标准ELISA评估每种情况下上清液中IFNγ的浓度。值代表平均值±SD(n＝3)。P≤0.001，双尾学生t检验。D24-RGD：Δ-24-RGD；D24-RGDOX：Δ-24-RGDOX。磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作稀释病毒原液的载剂。

图10.展示了在用Δ-24-RGD-OX40L(在图中称为Δ-24-RGDOX)感染之后感染的宿主细胞中OX40L的表达的图。用根据图1构建的Δ-24-RGD-OX40L以50pfu/细胞的感染复数(m.o.i.)感染HeLa(人宫颈表皮腺癌)细胞。简言之，将病毒原液稀释至指定的m.o.i.，添加至细胞单层(0.5mL/60mm培养皿或5mL/100mm培养皿)，并在37℃下孵育30分钟，每隔5分钟进行短暂搅拌。此后，添加必要量的培养基，并将细胞放回培养箱中持续规定的时间。在用病毒感染后48小时，用针对mOX40L的抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术分析表达mOX40L的细胞的百分比。使用EthD-1染色(FL3-H)排除死细胞。在右下象限中示出mOX40L阳性细胞。图像说明用Δ-24-RGD-OX40L感染的细胞表达OX40L。

图11.示出了在用Δ-24-RGD-OX40L(在图中称为Δ-24-RGDOX)处理之后小鼠神经胶质瘤模型中增强的′I′H1应答的图。将GL261细胞植入C57BL/6小鼠的脑中。用瘤内注射Δ-24-GFP或Δ-24-RGD-OX40L处理小鼠(肿瘤细胞植入后第7、9、11天)。在第14天，从每组3至5只小鼠收获小鼠脾细胞并与野生型小鼠胚胎成纤维细胞(wild type mouse embryonicfibroblast，wtMEF)、GL261或Δ-24-RGD感染的GL261细胞一起孵育40小时。通过ELISA测量由脾细胞分泌的IFNγ浓度，作为脾细胞活化的指标。底部图示出了对于使用不同比例范围的实验的前两组的顶部图中描绘的类似结果。该数据表明用Δ-24-RGD-OX40L处理增强了小鼠模型中对肿瘤的′I′H1免疫应答。此外，该数据表明除了启动抗腺病毒免疫之外，用Δ-24-RGD-OX40L处理的携带神经胶质瘤的小鼠产生针对感染和未感染的肿瘤细胞的特异性细胞应答。因此，由Δ-24-RGDOX引起的感染导致针对癌细胞(甚至其未被感染)的抗肿瘤免疫应答的形成，并且表明通过感染少数肿瘤细胞，Δ-24-RGDOX将引发潜在地能够根除肿瘤的免疫应答。

图12A至12E.组合Δ-24-RGDOX和抗PD-L1抗体的治疗效果。图12A：人神经胶质瘤干细胞(具有序列号的GSC)中的PD-L1表达。将细胞与或不与人IFN7(200U/ml)一起培养48小时，然后用抗人PD-L1 APC(eBiosciences)对其进行染色，并通过中位荧光强度(medianfluorescence intensity，MFI)分析PD-L1表达。数据示出为平均值±SD(n＝3)。图12B：小鼠神经胶质瘤GL261-5细胞中的PD-L1表达。在存在或不存在小鼠IFNγ(100单位/ml)的情况下，用PBS模拟感染细胞或用Δ-24-RGDOX(100PFU/细胞)感染细胞48小时，然后用抗小鼠PD-L1 APC对其进行染色并用流式细胞术分析PD-L1表达。关于MFI的数据以数值示出。图12C：根据所示方案，在携带GL261.GFP来源的颅内异种移植物的小鼠体内评估PD-L1表达。图12D：来自植入的肿瘤的神经胶质瘤细胞中的PD-L1表达。在植入表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的GL261细胞后14天，瘤内注射Δ-24-RGDOX(D24-RGDOX)。24小时后，收获、解离肿瘤(取自3只小鼠/组)并用流式细胞术分析PD-L1表达。肿瘤细胞进行EGFP+设门。IgG染色用作阴性对照。彩色的数字表示图12B和12C中相同颜色的曲线的MFI(图12B“模拟”：37.4＝α-PD-L1；661＝IFNγ/α-PD-L1；图12B“D24-RGDOX”：59.7＝α-PD-L1；529＝IFNγ/α-PD-L1)(图12C：750＝模拟/α-PD-L1；1176＝D24-RGDOX/α-PD-L1)。图12E：Δ-24-RGDOX对在CD8+T细胞中CTLA-4和PD-1表达的作用。用流式细胞术评估T细胞上CTLA-4或PD-1的表达，所述T细胞来自如图8A所示的用PBS或Δ-24-RGDOX处理的携带神经胶质瘤的小鼠中的BIL。示出了相对表达水平。来自模拟处理(PBS)组的值设置为100％。数据显示为相对MFI(平均值±SD)。NS：不显著(P≥0.05)；*P＝0.0007，双尾学生t检验。

图13A至13D.组合Δ-24-RGDOX和抗PD-L1抗体的治疗效果。图13A：GL261-5鼠神经胶质瘤模型中的方案治疗和抗肿瘤免疫记忆测试的方案。i.c.：颅内；i.t.：瘤内。在如治疗方案中说明的，在肘瘤植入后第6天和第10天用2剂量的D24-RGDOX(瘤内注射5×10⁷ pfu)和/或第8天和第13天用大鼠IgG或抗PD-L1(瘤内注射25μg)处理神经胶质瘤。图13B：在长期存活的小鼠中由Δ-24-RGDOX和抗PD-L1抗体的组合诱导完全肿瘤消退。示出了来自用该组合处理的长期存活小鼠的代表性苏木精和伊红染色的整装冠状小鼠脑切片(左，在肿瘤植入后第104天处死)。箭头标记了用于引导肿瘤植入和病毒注射的螺钉留下的残留凹痕。在肿瘤植入部位存在肿瘤遗症(tumor sequel)(左图中用短划线标记，也在右侧进行放大)。图13C：模拟处理的(n＝19)或用抗PD-L1抗体(αPD-L1)(n＝20)、Δ-24-RGDOX(n＝18)或Δ-24-RGDOX和αPD-L1的组合(n＝20)处理的携带GL261-5神经胶质瘤的C57BL/6小鼠的总存活结果的Kaplan-Meier存活图。使用对数秩检验获得P值。图13D：当用对侧半球而不是具有最初经处理的肿瘤的半球中的GL261-5再攻击时，图13C中用Δ-24-RGDOX与α-PD-L1一起处理的组的Kaplan-Meier存活图。未处理者()：n＝10；存活者：n＝6。*P≤0.0001，对数秩检验。D24-RGDOX：Δ-24-RGDOX。

图14A至14D.由Δ-24-RGDOX表达mOX40L。用指定的病毒感染细胞(对于CT-2A和B16为50pfu/细胞，对于GSC20为20pfu/细胞，对于CMT64为25pfu/细胞)。48小时后，用抗mOX40L-APC或抗mOX40L抗体然后是FITC标记的第二山羊抗大鼠IgG抗体对细胞进行染色。使用乙啶同源二聚体-1染色监测细胞膜破裂(细胞死亡)。使用流式细胞术分析经染色的细胞。右下角的数字是表达mOX40L的CT-2A(图14A)、GSC20(图14B)、B16-F10(图14C)和CMT64(图14D)细胞的百分比。示出了来自两个实验的代表性结果。D24-RGD：Δ-24-RGD；D24-RGDOX：Δ-24-RGDOX。

图15.来自C57BL/6小鼠的神经胶质瘤中Δ-24-RGDOX诱导的坏死(necr.)。示出了来自图7A至7B中每组至少6只小鼠的脑的代表性苏木精和伊红染色的整装冠状切片。底部的数字表示在肿瘤植入后多少天小鼠被处死。T：肿瘤；N：正常组织；ve：侧脑室(箭头)。比例尺：1mm。

图16.小鼠神经胶质瘤GL261-EGFP细胞中的PD-L1表达。在存在和不存在小鼠IFNγ(100U/ml)的情况下，模拟感染或用D24-RGDOX(100pfu/细胞)感染细胞48小时，然后用流式细胞术分析PD-L1表达。彩色的数字表示相同颜色曲线的MFI：“模拟”：59.1＝α-PD-L1；1153＝IFNγ/α-PD-1；“D24-RGDOX”：88.2＝α-PD-L1；1272＝IFNγ/α-PD-L1。

发明详述

本发明的方法和组合物包括溶瘤病毒(例如腺病毒)的构建和验证，所述溶瘤病毒包含编码一种或更多种免疫检查点蛋白抑制剂和/或一种或更多种免疫细胞共刺激性受体激动剂和/或肿瘤抗原的异源核酸序列，与未修饰的溶瘤病毒(即不包含编码免疫检查点蛋白抑制剂的异源核酸的遗传类似或相同的溶瘤病毒)和当单独施用免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫检查点抑制剂时相比，其表现出增强的甚至协同的抗肿瘤作用。还提供了用于治疗和/或预防癌症以及用于治疗和/或预防转移的药物组合，其包含(i)表达免疫细胞刺激性受体激动剂和/或免疫检查点抑制剂的可复制型溶瘤病毒和(ii)免疫细胞刺激性受体拮抗剂或免疫检查点抑制剂。

在几个方面，可复制型腺病毒经工程改造以包含编码选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂的异源核酸：CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、T1M3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、TIGIT和BTLA，提供了包含这样的可复制型腺病毒的药物组合物和这样的可复制型腺病毒在治疗和/或预防癌症中的用途及其在治疗和/或预防转移中的用途。

在另一些方面，可复制型腺病毒经工程改造以包含编码选自以下的免疫细胞刺激性受体的激动剂的异源核酸：CD28、OX40、GITR、CD137、HVEM、ICOS、CD27、CD40、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA。提供了包含这样的可复制型腺病毒的药物组合物和这样的可复制型腺病毒在治疗和/或预防癌症中的用途及其在治疗和/或预防转移中的用途。在一些优选的实施方案中，可复制型腺病毒经工程改造以包含编码特异性结合(和抑制)免疫检查点蛋白的抗体或抗体片段的异源核酸。编码V_H区或V_L区之一或两者的异源核酸可用于产生特异性结合免疫检查点抑制剂的抗体或抗体片段。例如，异源核酸可包含编码单链蛋白的单个基因，所述单链蛋白包含通过接头(例如scFv)连接的V_H区和V_L区，或可包含不同的区域以例如产生V_H和V_L区二者。在一些实施方案中，可复制型腺病毒包含异源核酸，所述异源核酸包含编码人单克隆抗体的重链和轻链的序列，所述人单克隆抗体在指导其表达的调控元件的控制下特异性结合(和抑制)免疫检查点蛋白。

特异性结合(和阻断)CTLA4的单克隆抗体包括但不限于伊匹单抗和替西木单抗(CP 675,206)以及美国专利申请公开No.2005/0201994、2002/0039581和2002/086014中公开的抗体，其各自的内容通过引用并入本文。

特异性结合(和阻断)PD-1的单克隆抗体包括但不限于兰利珠单抗和美国专利No.8,354,509(通过引用并入本文)中描述的其他人源化抗体(纳武单抗(BMS-936558)、派姆单抗和匹利珠单抗(CT-011))。

特异性结合(和阻断)PD-L1的单克隆抗体包括但不限于BMS-936559(MDX-1105)、派姆单抗(MK-3475)、阿替珠单抗(MPDL33280A)、度伐单抗(MEDI4736)、MIH1和阿维单抗(MSB0010718C)以及美国专利No.8,779,108和8,217,149(其内容通过引用并入本文)中公开的抗体。

特异性结合(和阻断)人LAG3的抗体包括BMS-986016以及美国专利申请公开No.2010-0233183和2011-0150892(其各自通过引用并入本文)中描述的那些抗体。

特异性结合(和阻断)BLTA的抗体包括美国专利No.8,563,694(其内容通过引用并入本文)中公开的抗体4C7。

特异性结合(和阻断)B7H4的抗体包括美国专利申请公开No.2014/0294861(其内容通过引用并入本文)中公开的抗体。

特异性结合(和阻断)B7-H3的抗体包括抗体MGA271和美国专利申请公开No.20120294796(其内容通过引用并入本文)中公开的其他抗体。

特异性结合(和阻断)TIM3的抗体包括美国专利No.8,841,418(通过引用并入本文)中公开的抗体和由Jones等，J.Exp.Med.，205(12)：2763-79(2008)公开的TIM3阻断抗体F38-2E2。

特异性结合(和阻断)KIR的抗体包括抗体利瑞单抗(lirilumab)(描述于Romagne等，Blood，114(13)：2667-2677(2009)中)。

在一个优选的实施方案中，可复制型溶瘤病毒包含(i)腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架(ii)编码PD-1抑制剂的异源核酸序列和/或(iii)编码PD-L1抑制剂的异源核酸序列和/或(iv)编码PD-L2抑制剂的异源核酸序列和/或(v)编码CTLA4抑制剂的异源核酸序列和任选的(vi)在E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)以及任选的(vii)插入纤维结节蛋白(fiber knob protein)的HI环中的RGD-4C序列。在一个特别优选的实施方案中，可复制型溶瘤病毒包含Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒核酸骨架，所述核酸骨架经工程改造以包含编码PD1、PD-L1或CTLA-4抑制剂的一个或更多个异源核酸序列，其各自均与合适的启动子有效地连接。在相关的实施方案中，编码PD1、PD-L1或CTLA-4抑制剂的异源核酸序列在缺失的E3区(例如腺病毒基因gp19K/6.7K)的位置。在另一些相关的实施方案中，异源核酸序列编码抗体或抗体片段。

在另一些优选的实施方案中，可复制型腺病毒经工程改造以包含编码可溶形式的检查点蛋白或包含与另一个阻断免疫检查点蛋白的多肽(例如人IgG的Fc区)融合的可溶形式的检查点蛋白的融合蛋白的异源核酸。非限制性实例包括AMP-224(包含PD-L2的胞外结构域和阻断PD-1的人IgG的Fc区的重组融合蛋白)、IMP321(阻断LAG3的可溶性LAG3Ig融合蛋白)以及在美国专利申请公开No.20120177645(通过引用并入本文)中公开的阻断LAG3的可溶重组形式的B7H4。

在一些方面，提供了可复制型腺病毒，其经工程改造以包含(i)编码选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂的异源核酸序列：CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR和BTLA；和(ii)编码选自以下的免疫细胞刺激性受体的激动剂的异源核酸序列：CD28、OX40、GITR、4-1BB、HVEM、ICOS、CD27、CD40、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA，包含这样的可复制型腺病毒的药物组合物以及这样的可复制型腺病毒在治疗和/或预防癌症中的用途及其在治疗和/或预防转移中的用途。

在一个实施方案中，可复制型腺病毒表达免疫检查点抑制剂并且还表达CD28激动剂，例如人CD80(B7.1)(GenBank登录号NM_005191(mRNA)和NP_005182(蛋白质))或CD86(B7.2)(GenBank登录号NM_175862(mRNA)和Swiss-Prot数据库中的登录号P42081)。在另一个实施方案中，可复制型腺病毒表达免疫检查点抑制剂并且还表达4-1BB的激动剂例如人4-1BBL，其全长氨基酸序列可以在Swiss-Prot数据库中的登录号P41273下找到。在另一个实施方案中，可复制型腺病毒表达免疫检查点抑制剂并且还表达HVEM的激动剂例如人淋巴毒素样(LIGHT)，其全长氨基酸序列可以在Swiss-Prot数据库中的登录号043557下找到。

在一个优选的实施方案中，可复制型腺病毒表达免疫检查点抑制剂并且还表达GITR的激动剂，例如人GITR配体或GITR配体的GITR受体结合片段或GITR配体融合蛋白(例如由与免疫球蛋白的Fc片段融合的人GITRL的第50至177位氨基酸组成)。人GITR配体(也就是GITR-L，TNFSF18(肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员18))是含有177个氨基酸的II型膜蛋白(参见Swiss Prot标识号Q9UNG2中的序列)。GITR配体含有在残基1至28处的胞质结构域、在残基29至49处的跨膜结构域和在残基50至177处的胞外结构域。GITR-L的核苷酸序列是公众可获得的(例如Genbank登录号NM 005092.2)。优选地，GITR配体与Swiss Prot标识号Q9UNG2中限定的GITR-L共有至少80％的氨基酸序列同一性、优选至少90％的序列同一性、更优选至少95％的序列同一性、甚至更优选至少98％的序列同一性。可以由可复制型溶瘤腺病毒表达的另一些GITR激动剂包括针对GITR的抗体，例如在美国专利申请公开No.2015/0353637(其内容通过引用并入本文)中描述的那些以及在美国专利No.8,709,424(其内容通过引用并入本文)中描述的那些。可由可复制型溶瘤腺病毒表达的抗GITR抗体的其他非限制性实例包括DTA-1(抗小鼠GITR mAb)、TRX518(人源化抗GITR mAb)和MK-4166(抗人GITR mAb)。

在另一个优选的实施方案中，可复制型腺病毒表达免疫检查点抑制剂并且还表达OX40的激动剂，例如OX40配体(OX40L或gp34)或OX40L的OX40受体结合片段或OX40L融合蛋白，例如在美国专利申请No.7,959,925(其内容通过引用并入本文)中描述的那些。如美国专利No.5,457,035和WO 95/21915中所述，可通过删除胞内结构域和跨膜结构域来产生功能活性的可溶形式的OX40配体。制备和使用OX40配体及其衍生物的方法如WO 95/21915所述，其还描述了包含与其他肽(例如人Ig Fc区)连接的可溶形式的OX-40配体的蛋白质，这些肽可以被产生以例如在向哺乳动物体内施用后增强分子的稳定性。人OX40L的氨基酸序列描述于GenBank登录号NP_003317.1和Swiss Prot标识号P23510。编码人OX40L的全长cDNA位于NCBI参考序列：NM_003326.3。人OX40L与其小鼠对应物共有46％的氨基酸序列同一性。优选地，OX40配体与Swiss Prot标识号P23510中限定的OX40配体共有至少80％的氨基酸序列同一性、优选至少90％的序列同一性、更优选至少95％的序列同一性、甚至更优选至少98％的序列同一性。可由可复制型溶瘤腺病毒表达的另一些OX40激动剂包括针对OX40的抗体(例如抗人OX40抗体)，例如在美国专利申请No.6,312,700、7,504,101、7,291,331、7,550,140、7,807,156和7,960,515(其各自的全部内容均通过引用并入本文)中描述的那些。OX40抗体的具体非限制性实例包括MEDI6469、MEDI0562、MEDI6383、LI06BD、112F32、112V8、112Y55、112Y131、112Z5、mAb 315、mAb131、mAb 2G2、IF7、ACT35、mAbL106和mAbOX86。另一些OX40激动剂包括美国专利申请公开No.US20060281072(其全部内容通过引用并入本文)中描述的那些。

在另一个优选的实施方案中，所述可复制型溶瘤病毒包含(i)腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架，(ii)编码OX40激动剂和/或GITR激动剂的异源核酸序列，(iii)编码PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA4抑制剂的异源核酸序列和任选的(iv)E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)和任选的(v)插入纤维结节蛋白的HI环中的RGD-4C序列。在一个特别优选的实施方案中，可复制型溶瘤病毒包含Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒核酸骨架，所述核酸骨架经工程改造以包含(i)编码OX40配体多肽和/或GITR配体多肽的的异源核酸序列和(ii)编码PD-1和/或PD-L1和/或CTLA4抑制剂的异源核酸序列，在每种情况下所述异源核酸序列均与合适的启动子有效连接。在相关的实施方案中，编码OX40配体多肽和/或GITR配体多肽的异源核酸序列和编码PD-1和/或PD-L1和/或CTLA4抑制剂的异源核酸序列在缺失的E3区(例如腺病毒基因gp19K/6.7K)的位置。在另一些相关的实施方案中，编码免疫细胞刺激性受体激动剂的异源核酸序列编码可溶性或膜结合的OX40配体多肽和/或可溶性或膜结合的GITR配体多肽，并且编码免疫检查点抑制剂的异源核酸序列编码特异性结合PD-1和/或PD-L1和/或CTLA4的单克隆抗体或抗体片段。

在另一个优选的实施方案中，可复制型腺病毒表达GITR的激动剂，例如人GITR配体或GITR配体的GITR受体结合片段或GITR配体融合蛋白(例如，由与免疫球蛋白Fc片段融合的人GITRL的第50至177位氨基酸组成)。优选地，GITR配体与Swiss Prot标识号Q9UNG2中限定的GITR-L共有至少80％的氨基酸序列同一性、优选至少90％的序列同一性、更优选至少95％的序列同一性、甚至更优选至少98％的序列同一性。可由可复制型溶瘤腺病毒表达的另一些GITR激动剂包括针对GITR的抗体，例如在美国专利申请公开No.2015/0353637(其内容通过引用并入本文)中描述的那些以及美国专利No.8,709,424(其内容通过引用并入本文)中描述的那些。可由可复制型溶瘤腺病毒表达的抗GITR抗体的另一些非限制性实例包括DTA-1(抗小鼠GITR mAb)、TRX518(人源化抗GITR mAb)和MK-4166(抗人GITR mAb)。

在另一个优选的实施方案中，可复制型腺病毒表达OX40的激动剂，例如OX40配体(OX40L或gp34)或OX40L的OX40受体结合片段或OX40L融合蛋白，例如在美国专利No.7,959,925(其内容通过引用并入本文)中描述的那些。优选地，OX40配体与Swiss Prot标识号P23510中限定的OX40配体共有至少80％的氨基酸序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，甚至更优选至少98％的序列同一性。可由可复制型溶瘤腺病毒表达的另一些OX40激动剂包括针对OX40的抗体(例如，抗人OX40抗体)，例如在美国专利申请No.6,312,700、7,504,101、7,291,331、7,550,140、7,807,156和7,960,515(其各自的全部内容均通过引用并入本文)中描述的那些。OX40抗体的具体非限制性实例包括MEDI6469、MEDI0562、MEDI6383、LI06BD、112F32、112V8、112Y55、112Y131、112Z5、mAb 315、mAb131、mAb 2G2、IF7、ACT35、mAb L106和mAb OX86。另一些OX40激动剂包括美国专利申请公开No.US20060281072(其全部内容通过引用并入本文)中描述的那些。

在一些方面，提供了用于治疗和/或预防癌症和/或用于治疗和/或预防转移的组合疗法，其包括向有此需要的对象共同施用有效量的：(i)经工程改造以包含编码选自以下的免疫细胞刺激性受体的激动剂的异源核酸的可复制型腺病毒：CD28、OX40、GITR、4-1BB、HVEM、ICOS、CD27、CD40、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA；和(ii)选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂：CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、TIGIT和BTLA。

用于本文中所述药物组合的免疫检查点抑制剂是能够抑制免疫检查点蛋白的功能的任何化合物。抑制包括降低功能以及完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白是人检查点蛋白。因此，免疫检查点抑制剂优选是人免疫检查点的抑制剂。

在一些优选的实施方案中，组合的免疫检查点抑制剂是抗体。本文中使用的术语“抗体”包括天然存在的和经工程改造的抗体以及全长抗体或能够结合例如靶免疫检查点或表位(即保留抗原结合部分)的其功能片段或类似物。根据本文中描述的方法使用的抗体可来自任何来源，包括但不限于人、人源化、动物或嵌合，并且可以是优选IgG1或IgG4同种型的任何同种型，并且还可以是糖基化的或非糖基化的。术语抗体还包括双特异性抗体或多特异性抗体，只要表现出本文中所述的结合特异性即可。

人源化抗体是指非人(例如鼠、大鼠等)抗体，其蛋白质序列已被修饰以提高与人抗体的相似性。嵌合抗体是指包含同一物种的一种或更多种元件和其他物种的一种或更多种元件的抗体，例如包含人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分的非人抗体。

可以工程改造许多形式的抗体以用于本发明的组合，其代表性实例包括Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)、F(ab’)2片段(包含通过铰链区的至少一个二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)、Fd片段(由VH和CH1结构域组成)、Fv片段(由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成)、dAb片段(由单个可变结构域片段(VH或VL结构域)组成)、包含融合在一起的Fv片段的两个结构域(VL和VH)的单链Fv(scFv)，最终与接头一起形成单个蛋白质链。

所述组合的一种优选免疫检查点抑制剂是对免疫检查点抑制剂(例如CTLA4、PD-1、PD-L1或PD-L2)具有特异性的抗体或抗体片段。在一些特别优选的实施方案中，免疫检查点抑制剂是能够至少部分地拮抗PD-1、PD-L1或PD-L2的单克隆抗体、完全人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其片段。在一些实施方案中，PD-1、PD-L1和PD-L2是人PD-1、PD-L1和PD-L2。示例性人PD-1的氨基酸序列以UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q15116示出。示例性人PD-L1的氨基酸序列以UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1示出。示例性人PD-L2的氨基酸序列以UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9BQ51示出。在一个相关的实施方案中，CTLA4是人CTLA4。示例性人CTLA4(前体)的氨基酸序列以Swiss-Prot登录号P16410示出。

针对PD-1的单克隆抗体包括但不限于兰利珠单抗(例如在美国专利No.8,354,509中(其通过引用并入本文)作为hPD109A及其人源化衍生物h409A11、h409A16和h409A17公开)、在美国专利No.8,008,449(其通过引用并入本文)中公开的纳武单抗(Bristol-Myers Squibb；代码名称BMS-936558)，派姆单抗和匹利珠单抗(CT-011；在Rosenblatt等，Immunother.34：409-418(2011)中公开)或包含这些抗体的重链和轻链区的抗体。另一些抗PD-1抗体在例如WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2013/043569和WO2014/047350中进行描述。在一个相关的实施方案中，药物组合的检查点抑制剂是抗PD-1融合蛋白例如AMP-224(由PD-L2的胞外结构域和人IgG1的Fc区构成)。

针对PD-L1的单克隆抗体包括但不限于在美国专利NO.8,217,149(其内容通过引用并入本文)中公开的BMS-936559(MDX-1105)、阿替珠单抗(Genentech/Roche；MPDL33280A)，在美国专利8,779,108(其通过引用并入本文)中公开的度伐单抗(AstraZeneca/MedImmune；MEDI4736)，MIH1(通过eBioscience(16.5983.82)可获得的Affymetrix)和阿维单抗(MSB0010718C；Merck KGaA)或包含任何这些抗体的重链和轻链可变区的抗体。在一个相关的实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1融合蛋白，例如被称为AMP-224的PD-L2-Fc融合蛋白(在Mkritchyan M.，等，J.Immunol.，189：2338-47(2010)中公开)。

在一些优选的实施方案中，所述组合的可复制型溶瘤腺病毒包含经工程改造以包含编码OX40配体多肽的异源核酸和/或编码GITR配体多肽的异源核酸的Ad5核酸骨架，所述异源核酸与合适的启动子有效连接，并且所述组合的免疫检查点抑制剂是抑制CTLA4、PD1、PD-L1或PD-L2的抗体。在一个特别优选的实施方案中，所述组合的可复制型溶瘤腺病毒包含经工程改造以包含编码OX40配体的异源核酸和/或编码GITR配体多肽的异源核酸的Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒核酸骨架，所述异源核酸与合适的启动子有效连接，并且所述组合的检查点抑制剂是抑制PD1、PD-L1和/或PD-L2的单克隆抗体。

在一些方面，提供了用于治疗和/或预防癌症和/或用于治疗和/或预防转移的组合疗法，其包括向有此需要的对象共同施用有效量的：(i)经工程改造以包含编码选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂的异源核酸的可复制型腺病毒：CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR和BTLA；和(ii)选自以下的免疫细胞刺激性受体的激动剂：CD28、OX40、GITR、4-1BB、HVEM、ICOS、CD27、CD40、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA。

免疫细胞刺激性受体激动剂可以是特异性结合免疫细胞刺激性受体的抗体或抗体片段，或者可以是免疫细胞刺激性受体的配体。在一些优选的实施方案中，免疫细胞刺激性受体激动剂是特异性结合OX40或GITR的抗体、抗体片段或配体。

在一些实施方案中，所述组合的可复制型溶瘤腺病毒包含经工程改造以包含编码PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA4抑制剂的异源核酸的Ad5核酸骨架，所述异源核酸在各种情况下与合适的启动子有效连接，并且所述组合的免疫细胞刺激性受体激动剂是特异性结合OX40或GITR的抗体、抗体片段或配体。在一个特别优选的实施方案中，所述组合的可复制型溶瘤腺病毒包含经工程改造以包含编码PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA4单克隆抗体或抗体片段的异源核酸的Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒核酸骨架，所述异源核酸在各种情况下与合适的启动子有效连接，并且所述组合的检查点抑制剂是特异性结合OX40或GITR的抗体、抗体片段或配体。

在一些实施方案中，如上所述的可复制型溶瘤病毒还表达一种或更多种肿瘤相关抗原。在一些方面，可复制型溶瘤病毒包含Ad5核酸骨架以及包含编码肿瘤相关抗原的异源核酸序列，其中所述肿瘤相关抗原展示在腺病毒的表面(衣壳)上。在另一些方面，可复制型溶瘤病毒包含Ad5核酸骨架并且包含编码肿瘤相关抗原的异源核酸序列，其中所述肿瘤相关抗原在感染的靶(即癌)细胞中表达。在相关的实施方案中，提供了包含这样的可复制型溶瘤病毒的药物组合物以及这样的组合物在治疗和/或预防癌症和/或预防和/或治疗转移中的用途。在一个优选的实施方案中，可复制型溶瘤病毒包含经工程改造以包含编码肿瘤相关抗原或其免疫原性表位(例如EGFR或NY-ESO-1)的异源核酸序列的Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒核酸骨架和(i)编码PD-1和/或PD-L1和/或CTLA4抑制剂的异源核酸序列以及任选的(ii)编码OX40配体多肽和/或GITR配体多肽的异源核酸序列。

本文中所述的任何可复制型溶瘤病毒可以与本文中所述的任何其他可复制型溶瘤病毒组合施用于对象以治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移。因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移的方法，其包括向需要这样治疗的对象施用有效量的(i)表达第一免疫检查点抑制剂的第一溶瘤病毒和(ii)表达第二免疫检查点抑制剂的第二溶瘤病毒。在另一些实施方案中，提供了用于治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移的方法，其包括向需要这样治疗的对象施用有效量的(i)表达免疫检查点抑制剂的第一溶瘤病毒和(ii)表达免疫细胞刺激激动剂的第二溶瘤病毒。优选地，第一和第二溶瘤病毒是腺病毒，每个腺病毒包含经修饰的Ad5核酸骨架。

在另一些实施方案中，将包含编码免疫检查点蛋白的抑制剂的异源核酸和任选地包含编码免疫细胞共刺激性受体激动剂的异源核酸的溶瘤病毒(例如腺病毒)与另外的癌症治疗剂共同施用于对象以在对象中治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移。在一个实施方案中，将表达特异性结合PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段的可复制型腺病毒与有效量的IDO抑制剂共同施用于对象。合适的IDO抑制剂包括但不限于NLG919(NewLink Genetics)、色氨酸的分子类似物例如D-1-甲基-色氨酸(NLG8189)和羟基脒抑制剂例如羟脒1(epacadostat；INCB024360)。

I.可复制型溶瘤病毒

表达根据本发明的一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂的可复制型溶瘤病毒包括任何天然存在的(例如来自“野外来源(field source)”)或经修饰的可复制型溶瘤病毒。除了表达一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂之外，溶瘤病毒可以例如经修饰以提高病毒对癌细胞的选择性。

根据本发明的可复制型溶瘤病毒包括但不限于以下家族成员的溶瘤病毒：肌尾噬菌体科(myoviridae)、长尾噬菌体科(siphoviridae)、短尾噬菌体科(podpviridae)、复层噬菌体科(teciviridae)、覆盖噬菌体科(corticoviridae)、芽生噬菌体科(plasmaviridae)、脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)、微小纺锤形噬菌体科(fuselloviridae)、痘病毒科(poxyiridae)、虹彩病毒科(iridoviridae)、藻类去氧核糖核酸DNA病毒科(phycodnaviridae)、杆状病毒科(baculoviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、腺病毒科(adnoviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、多分体DNA病毒科(polydnaviridae)、丝状噬菌体科(inoviridae)、微小噬菌体科(microviridae)、双生病毒科(geminiviridae)、圆环病毒科(circoviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、囊状噬菌体科(cyctoviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、DNA病毒科(birnaviridae)，副粘病毒科(paramyxoviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、光滑噬菌体科(leviviridae)、小RNA病毒科(picomaviridae)、半生病毒科(sequiviridae)、豇豆花叶病毒科(comoviridae)、马铃薯Y病毒科(potyviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、星状病毒科(astroviridae)、野田病毒科(nodaviridae)、四病毒科(tetraviridae)、番茄丛矮病毒科(tombusviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(glaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)和杆状RNA病毒科(barnaviridae)。

用于实施本发明的可复制型溶瘤病毒的具体实例包括腺病毒、逆转录病毒(retrovirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、弹状病毒(rhabdovirus)、新城疫病毒(NewcastleDisease virus，NDV)、多瘤病毒(polyoma virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、小核糖核酸病毒(picornavirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)和细小病毒(parvovirus)。

在一个实施方案中，可复制型溶瘤病毒是选自水疱性口炎病毒(vesicularstomatitis virus，VSV)和Maraba毒株的弹状病毒，其任选地经修饰以提高癌症选择性。这样的修饰包括但不限于使病毒易受宿主IFN应答影响的基质(M)基因中的突变。

在另一个实施方案中，可复制型溶瘤病毒是痘苗病毒，其非限制性实例包括任选地经修饰以提高癌症选择性的Western Reserve、Wyeth和Copenhagen毒株。这样的修饰包括但不限于：非功能性胸苷激酶基因、非功能性痘苗生长因子基因和非功能性1型干扰素结合基因。

在另一个方面，可复制型溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)病毒(例如HSV-1或HSV1716)和新城疫病毒(NDV)。

腺病毒是特别优选的可复制型溶瘤病毒。

腺病毒(Ad)是感染人的大(～36kb)DNA病毒，但其表现出宽的宿主范围。生理上，腺病毒是含有双链线性DNA基因组的二十面体病毒。人腺病毒存在大约50种血清型，其基于分子、免疫学和功能标准被分为六个家族。到成年时，实际上每个人都已经感染较常见的腺病毒血清型，主要效应为感冒样症状。

宿主细胞的腺病毒感染导致腺病毒DNA保持游离(episomally)，这降低了与整合载体相关的潜在基因毒性。此外，腺病毒是结构稳定的，并且在大量扩增后没有检测到基因组重排。腺病毒可感染几乎大部分的上皮细胞，不论其细胞周期阶段。迄今为止，腺病毒感染似乎仅与轻微疾病(例如人急性呼吸疾病)有关。

57种人腺病毒血清型(HAdV-1至57)中任一种的成员可并入根据本发明的编码免疫细胞刺激性受体激动剂的异源核酸。人Ad5在遗传和生物化学上进行了很好地表征(GenBank M73260；AC_000008)。因此，在一个优选的实施方案中，溶瘤腺病毒是可复制型Ad5血清型或包含Ad5组分的杂合血清型。腺病毒可以是野生型毒株，但优选经遗传修饰以增强肿瘤选择性，例如通过减弱病毒在正常静息细胞内复制的能力而不影响病毒在肿瘤细胞中复制的能力。本发明涵盖的可复制型溶瘤腺病毒的非限制性实例包括Δ-24、Δ-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、ONYX-015、ColoAd1、H101和AD5/3-D24-GMCSF。Onyx-015是病毒血清型Ad2和Ad5的杂合体，其在E1B-55K和E3B区中有缺失，以增强癌症选择性。H101是Onyx-015的一种修饰形式。ICOVIR-5和ICOVIR-7包含E1A的Rb结合位点缺失并且E1A启动子被替换为E2F启动子。ColoAd1是嵌合Add11p/Ad3血清型。AD5/3-D24-GMCSF(CGTG-102)是编码GM-CSF的经血清型5/3衣壳修饰的腺病毒(Ad5衣壳蛋白结节(knob)被替换为血清型3的结节结构域)。

在一个特别优选的实施方案中，可复制型溶瘤腺病毒是Δ-24或Δ-24-RGD。美国专利申请公开No.20030138405和No.20060147420中对Δ-24进行了描述，其各自通过引用并入本文。Δ-24腺病毒来自5型腺病毒(Ad-5)并且在E1A基因的CR2部分内含有24碱基对缺失，所述E1A基因的CR2部分包含负责结合对应于编码的E1A蛋白中的第122至129位氨基酸的Rb蛋白(923至946位核苷酸)的区域(Fueyo J等，Oncogene，19：2-12(2000))。Δ-24-RGD还包含将RGD-4C序列(其与ανβ3和ανβ5整联蛋白强结合)插入纤维结节蛋白的HI环中(Pasqualini R.等，Nat Biotechnol，15：542-546(1997))。E1A缺失提高了病毒对癌细胞的选择性；RGD-4C序列提高了神经胶质瘤中病毒的感染性。

注射到肿瘤中的溶瘤腺病毒诱导细胞死亡并释放新的腺病毒后代，其通过感染邻近细胞产生处理波(treatment wave)，如果不停止的话，可以导致肿瘤的完全破坏。在细胞培养物系统和恶性神经胶质瘤异种移植物模型中已显示出Δ-24的显著抗肿瘤作用。Δ-24-RGD在1期临床试验中已显示出出乎意料的抗肿瘤作用并且目前是另一些临床试验的对象。虽然肿瘤细胞的裂解是提出的Δ-24-RGD溶瘤腺病毒的主要抗癌机制，但来自复发性神经胶质瘤患者的1期临床试验数据和其他观察结果表明腺病毒介导的抗肿瘤免疫应答的触发可以增强直接的溶瘤作用。因此，约10％用Δ-24-RGD处理的患者显示免疫细胞浸润肿瘤，在某些情况下这种浸润相当大。在这些情况下，代表了少数的经处理者，观察到Th1主导的免疫应答似乎与最佳的抗肿瘤应答相关。本发明的多个方面涉及增强大多数患者的这种抗肿瘤效力。设计本发明的可复制型溶瘤腺病毒以通过(i)增强针对腺病毒和肿瘤抗原二者的Th1免疫应答和(2)逆转肿瘤的免疫抑制环境来实现这一目的。本发明的溶瘤腺病毒的施用导致识别具有或不具有病毒感染的癌细胞的淋巴细胞群的活化，从而提供甚至在根除病毒后仍然存在的增强和延长的抗肿瘤效应。与单独施用腺病毒和检查点抑制剂相比，本发明的溶瘤腺病毒提供了显著的优势，通过将抑制剂定位于肿瘤的部位，从而减少了伴随全身施用抑制剂的不希望的副作用。

腺病毒的感染周期分2个步骤发生：早期阶段，其在腺病毒基因组复制开始之前并且其允许产生调节蛋白以及参与病毒DNA复制和转录的蛋白质；以及后期阶段，其导致结构蛋白的合成。早期基因分布在分散于腺病毒基因组中的4个区域中，称为E1至E4(E表示“早期”)。早期区域包含至少六个转录单元，其各自具有其自身的启动子。早期基因的表达是自身调节的，一些基因在另一些基因之前表达。三个区域E1、E2和E4对病毒的复制是必需的。因此，如果腺病毒对于这些功能之一而言是缺陷的，则必须反式供给该蛋白质，否则病毒就不能复制。

E1早期区域位于腺病毒基因组的5’末端，并含有2个病毒转录单位，E1A和E1B。这个区域编码在病毒周期中非常早参与的蛋白质并且对腺病毒的几乎所有其他基因的表达都是必需的。特别地，E1A转录单元编码反式激活其他病毒基因之转录的蛋白质，诱导来自E1B、E2A、E2B、E3、E4区域和晚期基因的启动子的转录。通常，整合外源序列以代替E3区域的全部或部分。

腺病毒经由细胞表面受体进入许可的宿主细胞，然后其被内在化。与复制周期第一步所需的某些病毒蛋白质相关的病毒DNA进入受感染细胞的细胞核中，在这里开始转录。腺病毒DNA的复制在受感染细胞的细胞核中发生而不需要细胞复制。组装新的病毒颗粒或病毒体，这之后其从受感染细胞中释放出来并且可感染其他允许的细胞。

腺病毒是具有吸引力的递送系统。本发明的一些实施方案可以利用平均产量为1×10¹⁶个病毒颗粒/批的悬浮细胞方法。该方法可不含或基本不含蛋白质、血清和动物来源的成分，使得其适于宽范围的预防性和治疗性疫苗产品二者。

多个因素有助于溶瘤腺病毒用于脑肿瘤治疗的用途。第一，神经胶质瘤通常是局部化的，因此有效的局部方法应足以治愈该疾病。第二，神经胶质瘤具有多个表达不同遗传异常的细胞群。因此，可限制对单一基因向癌细胞转移敏感的肿瘤谱。第三，可复制型腺病毒可以感染和破坏停滞在G0的癌细胞。因为神经胶质瘤总是包含非周期性细胞，所以这个性质是重要的。最后，p16-Rb途径在大多数神经胶质瘤中是异常的，因而使得Δ-24腺病毒对于治疗这些肿瘤特别有效，虽然视网膜母细胞瘤肿瘤阻抑基因功能的丧失与多种类型肿瘤的原因相关，但是并不受限于神经胶质瘤的治疗。

如果腺病毒已经突变使得其为有条件地复制(在某些条件下为可复制型)，则病毒复制可能需要辅助细胞。需要时，辅助细胞系可来源于人细胞，例如人胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或者其他人胚胎间充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可来源于许可人腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括例如Vero细胞或者其他猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。在某些方面中，辅助细胞系是293。在本技术领域中可发现培养宿主和辅助细胞的多种方法，例如Racher等，1995。

在某些方面，溶瘤腺病毒在具有突变Rb途径的细胞中为可复制型。在转染之后，从琼脂糖覆盖的细胞中分离腺病毒噬斑并且使病毒颗粒扩增以进行分析。对于详细方案，技术人员参考Graham和Prevac，1991。

用于产生腺病毒载体的替代技术包括利用细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome，BAC)系统(利用包含互补腺病毒序列的两个质粒在recA+细菌菌株中进行体内细菌重组)以及酵母人工染色体(YAC)系统(PCT公开95/27071和96/33280，其通过引用并入本文)。

腺病毒易于生长和操作并且在体外和体内都表现出宽的宿主范围。这组病毒可以以高滴度(例如，大于10⁹个噬斑形成单位(pfu)/ml)获得，并且它们具有高感染性。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。

可对本文中描述的溶瘤腺病毒进行修饰以改进溶瘤腺病毒治疗癌症的能力。Jiang等(Curr Gene Ther.2009Oct 9(5)：422-427)已经描述了溶瘤腺病毒的这样的修饰，另参见美国专利申请No.20060147420，其各自通过引用并入本文。

多种肿瘤类型上的柯萨奇病毒和腺病毒受体(adenovirus receptor，CAR)不存在或低水平存在可限制溶瘤腺病毒的效力。可将多种肽基序添加至纤维结节，例如RGD基序(RGD序列模拟细胞表面整联蛋白的正常配体)、Tat基序、聚赖氨酸基序、NGR基序、CTT基序、CNGRL基序、CPRECES基序或strept-标签基序(Rouslahti和Rajotte，2000)。可将基序插入腺病毒纤维蛋白的HI环中。修饰衣壳允许不依赖于CAR的靶细胞感染。这允许更高复制、更有效感染以及肿瘤细胞裂解的增加(Suzuki等，2001，通过引用并入本文)。也可添加结合特定人神经胶质瘤受体(例如EGFR或uPR)的肽序列。仅存在于或优选存在于癌细胞表面上的特定受体可用作腺病毒结合和感染的靶标，例如EGFRvIII。

II.表达盒

在本发明的某些实施方案中，本文中所述的方法涉及编码免疫细胞刺激性受体激动剂的核酸序列，其中所述核酸包含在“表达盒”中。术语“表达盒”意在包括包含编码基因产物之核酸的任何类型的遗传构建体，其中所述核酸编码序列的部分或全部能够被转录。

启动子和增强子-为了使表达盒实现转录物的表达，核酸编码基因将受启动子的转录控制。“启动子”是控制序列，其是控制转录起始和速率的核酸序列的区域。短语“有效定位”、“有效连接”、“受......控制”和“受......转录控制”意指启动子相对于核酸序列处在正确功能位置和/或方向中，以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可与“增强子”结合使用或者也可不与其结合使用，增强子是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。

本领域普通技术人员已知的在对象细胞中具有活性的任意启动子都可被考虑为可应用于本发明方法和组合物的启动子。本领域普通技术人员将熟悉可应用于本发明方法和组合物的多种类型的启动子。在某些实施方案中，例如，启动子是组成型启动子、诱导型启动子或阻抑型启动子。启动子还可以是组织选择性启动子。本文中定义的组织选择性启动子是指与其他组织类型相比，在某些组织类型中具有相对更多活性的任意启动子。启动子的实例包括CMV启动子。

启动子将是在细胞中具有活性的启动子，并且来自所述启动子的表达导致抗原决定簇向对象的免疫系统呈递。例如，当细胞是上皮细胞时，用于本实施方案的启动子将是在该特殊细胞类型中具有活性的启动子。

启动子可以与基因或序列天然缔合，因为其可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这样的启动子可被称为“内源性”的。类似地，增强子可以与核酸序列天然缔合、位于该序列的上游或下游。或者，将编码核酸去段定位在重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述启动子指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子也指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。这样的启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，从任意其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子以及非“天然存在”的启动子或增强子(即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变)。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以利用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR^TM)来产生序列(参见美国专利No.4,683,202和5,928,906，其各自通过引用并入本文)。

当然，利用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中进行表达的启动子和/或增强子将是非常重要的。分子生物学领域的技术人员通常理解使用启动子、增强子和细胞类型组合来进行蛋白质表达，例如参见Sambrook等(2001)，其通过引用并入本文。启动子可以是异源的或内源的。

用于控制目的核酸表达的特定启动子并不被认为是关键的，只要其能够在靶细胞中以足够的水平表达多核苷酸即可。因此，当靶向人细胞时，优选地使多核苷酸编码区定位于邻近能够在人细胞中表达的启动子并且受所述启动子控制。一般而言，这样的启动子可包括人启动子或病毒启动子。

在多个实施方案中，可使用人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)长末端重复。只要表达水平足以产生免疫应答，还考虑使用本领域公知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现多核苷酸的表达。

在本发明的上下文中可使用的启动子/元件的另一些实例包括以下，其并非旨在穷举所有可能的启动子和增强子元件，而是仅是其示例性的：免疫球蛋白重链；免疫球蛋白轻链；T细胞受体；HLA DQ α和/或DQ β；β干扰素；白细胞介素-2；白细胞介素-2受体；II类MHC；II类MHC HLA-DRα；β-肌动蛋白；肌肉肌酸激酶(Muscle Creatine Kinase，MCK)；前白蛋白(甲状腺素视黄质运载蛋白)；弹性蛋白酶I；金属硫蛋白(Metallothionein，MTII)；胶原酶；白蛋白；甲胎蛋白；t-珠蛋白；β-珠蛋白；c-fos；c-HA-ras；胰岛素；神经细胞黏着分子(Neural Cell Adhesion Molecule，NCAM)；α1-抗胰蛋白酶；H2B(TH2B)组蛋白；小鼠和/或I型胶原蛋白；葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)；大鼠生长激素；人血清淀粉样蛋白A(HumanSerum Amyloid A，SAA)；肌钙蛋白I(Troponin I，TN I)；血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)；杜兴肌肉营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy)；SV40；多瘤病毒；逆转录病毒；乳头瘤病毒；乙型肝炎病毒；人免疫缺陷病毒；巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)；和长臂猿白血病病毒。

增强子最初被检测为增加从位于同一DNA分子远处位置上之启动子转录的遗传元件。增强子与启动子之间的基本区别是可操作性。增强子区作为整体必须能够在远端刺激转录；对于启动子区域或其组成元件则不必具备这点。在另一方面，启动子必须具有在特定位点并且以特定方向指导RNA合成起始的一个或更多个元件，而增强子缺乏这些特征。启动子和增强子经常重叠且相邻，经常看起来具有非常类似的模块结构。此外，任意启动子/增强子组合(根据真核生物启动子数据库(Eukaryotic Promoter Data Base)EPDB)也可用来驱动基因表达。对响应于特定生理信号而调节的启动子的进一步选择可允许构建体的诱导型表达。例如，受人PAI-1启动子控制的多核苷酸，通过肿瘤坏死因子诱导表达。可响应于特定刺激而活化的核酸序列的区域的诱导型元件的实例包括(元件/诱导物)：MT II/佛波醇酯(TFA)或重金属；MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)/糖皮质激素；β-干扰素/聚(rI)x或聚(rc)；腺病毒5E2/E1A；胶原酶/佛波醇酯(TPA)；溶基质素/佛波醇酯(TPA)；SV40/佛波醇酯(TPA)；鼠科MX基因/干扰素、新城疫病毒；GRP78基因/A23187；α-2-巨球蛋白/IL-6；波形蛋白/血清；I类MHC基因H-2κb/干扰素；HSP70/E1A、SV40大T抗原；增殖蛋白/佛波醇酯-TPA；肿瘤坏死因子/PMA；以及促甲状腺激素a基因/甲状腺激素。

起始信号-编码序列的有效翻译还可能需要特定起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必需的信号。

IRES-在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件用来产生多基因或多顺反子信息(message)。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件，以及来自哺乳动物信息的IRES。IRES元件可与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起转录，各自由IRES分隔，产生多顺反子信息(参见美国专利No.5,925,565和5,935,819)。

多克隆位点-表达盒可包含多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，其是包含多个限制酶位点的核酸区域，可使用其中的任一区域与标准重组技术结合以消化载体。

多腺苷酸化信号-在表达中，通常将包括多腺苷酸化信号来实现转录物适当的多腺苷酸化。多腺苷酸化信号的性质并不被认为是成功实践本发明的关键，和/或可采用任意这样的序列。一些优选的实施方案包括SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号，其在多种靶细胞中是方便的和/或已知能发挥良好的功能。还考虑表达盒的一个元件是转录终止位点。这些元件可用来提高信息水平和/或使从该盒通读到其他序列中减至最小。

其他表达盒组件-在本发明的某些实施方案中，可通过在表达载体中包含报道基因来在体外鉴定被腺病毒载体感染的细胞。一般来说，可选择的报道基因是赋予允许进行选择之性质的基因。阳性可选择报道基因是其中报道基因的存在允许其选择的基因，而阴性可选择报道基因是其中报道基因的存在阻止其选择的基因。阳性可选择标志物的一个实例是药物抗性标志物(赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素(zeocin)和组氨醇抗性的基因)。报道基因的其他类型包括可筛选的报道基因，例如GFP。

本发明的一些实施方案可以使用目前的腺病毒平台技术来制备包含编码肿瘤相关抗原的异源核酸区段的腺病毒核酸。腺病毒疫苗构建的方面包括将遗传物质插入腺病毒载体中并且通过核酸、病毒和病毒产物的表征和测序来确定构建体。然后对腺病毒疫苗进行一系列旨在评估可扩展性(scalability)的可行性研究。

III.癌症

本发明的方法可用来治疗癌症。癌症类型的具体实例包括但不限于神经胶质瘤、黑素瘤、转移瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、非-霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌(kidneycancer)、胰腺癌、头颈癌、结肠直肠癌、肾癌(renal cancer)、甲状腺癌、肝细胞癌等。术语“神经胶质瘤”是指源于脑部或脊髓之神经胶质的肿瘤。神经胶质瘤来源于神经胶质细胞类型，例如星形胶质细胞和少突胶质细胞，因此神经胶质瘤包括星形细胞瘤和少突神经胶质瘤，以及间变性胶质瘤、胶质母细胞瘤和室管膜瘤。星形细胞瘤和室管膜瘤可发生在儿童和成人二者之脑和脊髓的所有区域中。少突胶质细胞瘤通常发生在成人的大脑半球中。神经胶质瘤在儿科中占脑肿瘤的75％并且在成人中占脑肿瘤的45％。其他脑肿瘤为脑膜瘤、室管膜瘤、松果体区肿瘤、脉络丛肿瘤、神经上皮肿瘤、胚胎性肿瘤、外周神经母细胞瘤、颅神经肿瘤、造血系统肿瘤、生殖细胞肿瘤和星状区肿瘤(tumors of the stellar region)。本发明方法可用于治疗任何脑癌。

术语黑素瘤包括但不限于，黑素瘤、转移性黑素瘤、来源于黑素细胞或黑素细胞相关痣细胞的黑素瘤、黑素癌、黑素上皮癌、黑素肉瘤、原位黑素瘤、表浅扩散性黑素瘤(superficial spreading melanoma)、结节性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣黑素瘤、侵袭性黑素瘤或家族性非典型痣和黑素瘤(FAM-M)综合征。哺乳动物中这样的黑素瘤可由染色体异常、退行性生长和发育紊乱、促有丝分裂剂、紫外辐射(UV)、病毒感染、基因的不适当组织表达、基因表达改变和细胞上的呈递或致癌剂引起。

可通过本发明的方法对上述癌症进行评估或治疗。在癌症的情况下，编码与癌症相关的抗原(例如肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA))的基因可以与编码一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂分子的核酸一起并入重组病毒基因组或其部分中。可使癌症相关的抗原在癌细胞的表面上表达，其可以是分泌型或者可以是内部抗原。

在一些优选的实施方案中，药物组合包含(a)可复制型溶瘤腺病毒，所述可复制型溶瘤腺病毒包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架或杂合核酸骨架，其包含Ad5组分和编码插入腺病毒基因组非必需区中的OX40激动剂的异源核酸序列，其中插入的异源核酸序列受允许在细胞中表达OX40激动剂的序列的控制以及(b)一种或更多种PD-L1和/或PD-1抑制剂，其被共同施用以治疗和/或预防对象中的神经胶质瘤。优选地，所述对象是人。在相关的实施方案中，人对于神经胶质瘤和/或一种或更多种疗法难治的神经胶质瘤和/或在手术后切除和替莫唑胺治疗后复发的神经胶质瘤已经历了一种或更多种先前的治疗。

IV.药物组合物

本发明还提供了包含本发明的任何组合物以及可药用载体的药物组合物。本发明还提供了包含本发明的任何组合物的疫苗组合物。所述疫苗组合物还可包含至少一种佐剂。

本发明还提供了在对象中刺激抗肿瘤免疫应答的方法，其包括将本发明的组合物施用于对象。

根据本发明，将表达一种或更多种免疫检查点抑制剂和任选的一种或更多种免疫细胞刺激性受体激动剂和任选的一种或更多种肿瘤相关抗原的腺病毒施用于对象以诱导用于治疗或预防目的的免疫应答。因此，在某些实施方案中，将表达构建体配制到适合于此目的的组合物中。短语“药用地”或“可药用的”是指当施用于动物或人时不产生不利反应、变态反应或其他不良反应的组合物。本文中使用的“可药用载体”包括任何以及所有的溶剂、载体、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的表达构建体不相容，否则可考虑将其用于治疗组合物。还可将补充活性成分并入到组合物中。例如，补充活性成分可以是另外的免疫原性剂。

适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有的情况下，该形式必须是无菌的并且必须是在某种程度上以易注射性的流体存在。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须保护其免受微生物(例如细菌和真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。如果需要，可使用多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，其将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可实现可注射组合物的延长吸收。

通过在适当溶剂中将所需量的化合物与以上列举所需的多种其他成分合并在一起，然后经过滤除菌来制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将多种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自以上列举的那些所需的其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所期望成分的粉末。

在配制后，溶液将以与剂型相容的方式并且以治疗或预防有效的量施用。对于以水溶液的肠胃外施用而言，应对溶液进行适当缓冲(如果必要的话)，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释液变成等渗的。这些特殊的水溶液特别适合于血管内和瘤内施用。就此而言，根据本公开内容，可采用的无菌水介质对于本领域技术人员是已知的。

根据待治疗对象的状况，将必然会发生剂量上的某些变化。在任何情况下，负责施用的人员都将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应满足FDA所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

剂量-基于预期目的(例如刺激针对肿瘤的免疫应答)来确定治疗剂或预防剂的有效量。本领域技术人员清楚地知道如何在体内和离体情况下应用基因递送。对病毒载体而言，通常将制备病毒载体原液。根据病毒的种类和可达到的滴度，可向对象提供至少约、至多约或约1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或1×10¹²个感染性颗粒，或二者之间的任何值或范围。在另一些方面中，根据本发明的腺病毒可以以单次施用或多次施用来施用。病毒可以以1×10⁵噬斑形成单位(PFU)、5×10⁵PFU、至少1×10⁶PFU、5×10⁶或约5×10⁶PFU、1×10⁷、至少1×10⁷PFU、1×10⁸或约1×10⁸PFU、至少1×10⁸PFU、约或至少5×10⁸PFU、1×10⁹或至少1×10⁹PFU、5×10⁹或至少5×10⁹PFU、1×10¹⁰PFU或至少1×10¹⁰PFU、5×10¹⁰或至少5×10¹⁰PFU、1×10¹¹或至少1×10¹¹、1×10¹²或至少1×10¹²、1×10¹³或至少1×10¹³PFU的剂量施用。例如，病毒可以以约10⁷至10¹²PFU、约10⁷至10¹³PFU、约10⁸至10¹³PFU、约10⁹至10¹²PFU或约10⁸至10¹²PFU的剂量施用。

根据本发明的可复制型溶瘤病毒可以局部或全身施用。例如，非限制的，根据本发明的溶瘤病毒可通过以下途径施用：血管内(动脉内或静脉内)、瘤内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、经口、肠胃外、鼻内、气管内、经皮、脊髓内、经眼或颅内。在一些优选的实施方案中，本发明的腺病毒经血管内或瘤内施用。在另一些优选的实施方案中，本发明的腺病毒经颅内施用。

在一些实施方案中，根据本发明的可复制型溶瘤病毒通过瘤内注射到脑中施用。通过例如细导管或插管可实现直接注射到脑内的肿瘤中(例如以治疗胶质母细胞瘤)。在本发明的某些实施方案中，可在MRI程序内指导下通过微机电(microelectromechanical，MEMS)系统递送可复制型溶瘤病毒。优选地，通过使用插管(例如Alcyone Lifesciences的Alcyone MEMS Cannula(AMC))实现瘤内注射到脑中而没有显著的回流(reflux)或回流(back flow)。装置的代表性实例描述于美国专利No.8,992,458和美国公开No.2013-0035660、2013-0035574和2013-0035560中，其全部通过引用整体并入。

根据本发明的可复制型溶瘤病毒还可以在细胞载体中施用。在此方面，神经元干细胞(neuronal stem cell)和间充质干细胞具有高迁移潜力，但是仍只限于肿瘤组织。已经显示出成人间充质细胞(源于骨髓的肿瘤浸润细胞或BM-TIC)亚群在注射到神经胶质瘤中之后，浸润整个肿瘤。因此，根据本发明的溶瘤病毒可以在产生病毒的神经元或间充质干细胞(例如BM-TIC)载体中施用(例如通过将载体细胞注射到肿瘤中)。

本文中公开的免疫检查点蛋白抑制剂和免疫细胞刺激性受体激动剂(当作为药物组合的一部分与溶瘤病毒分开施用时)可以通过多种途径施用，包括例如经口或肠胃外，例如血管内(静脉内或动脉内)、肌内、皮下、眼眶内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内(intracisternally)、瘤内、血管内、皮内或分别使用例如皮肤贴剂或透皮离子导入疗法通过皮肤被动或促进吸收。免疫检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂还可以施用于病理状况的部位，例如，通过静脉或动脉注射到给肿瘤供血的血管中。在一个优选的实施方案中，免疫检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂经瘤内施用。

在实施本发明的方法时施用的免疫检查点抑制剂或免疫细胞刺激性受体激动剂的总量可以通过推注(bolus)或者通过在相对较短的时间内输注以单次剂量施用于对象或可以使用分段治疗方案施用(其中在延长的时间段内施用多次剂量)。本领域技术人员应知道治疗对象的病理状况的组合物的量取决于许多因素，包括对象的年龄和一般健康状况以及施用途径和待施用的治疗次数。鉴于这些因素，技术人员将根据需要调整特定剂量。通常，组合物的剂型、施用途径和频率最初是使用I期和II期临床试验确定的。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂或免疫细胞刺激性激动剂以0.01至0.05mg/kg、0.05至0.1mg/kg、0.1至0.2mg/kg、0.2至0.3mg/kg、0.3至0.5mg/kg、0.5至0.7mg/kg、0.7至1mg/kg、1至2mg/kg、2至3mg/kg、3至4mg/kg、4至5mg/kg、5至6mg/kg、6至7mg/kg、7至8mg/kg、8至9mg/kg、9至10mg/kg、至少10mg/kg或其任意组合的剂量施用。检查点抑制剂的合适剂量为约0.5mg/kg至25mg/kg，优选约1mg/kg至约20mg/kg，更优选约2mg/kg至约15mg/kg。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂或免疫细胞刺激性激动剂以至少每周一次、至少每周两次、至少每周三次、至少每两周一次或者至少每月或多月一次施用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂或免疫细胞刺激性激动剂以单剂量、二剂量、三剂量、四剂量、五剂量或者六剂量或更多剂量施用。优选地，检查点抑制剂经静脉内(例如通过静脉内输注或注射)或瘤内施用。作为非限制性实例，伊匹单抗可以通过静脉内输注，以每三周3mg/kg的剂量，共四次剂量施用。

根据治疗次数和剂量二者，待施用的量取决于待治疗对象、对象的状态和期望的保护。治疗性组合物的精确量还取决于医师的判断并且对每个个体是独特的。

实施例

以下实施例以及附图包括在内以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，实施例或附图中公开的技术代表本发明人发现的能很好实施本发明的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行多种改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1和2的材料和方法

Δ-24-RGDOX的构建和病毒的增殖-首先，使用穿梭载体pAB26(MicrobixBiosystems，Inc.)通过定点诱变将编码RGD-4C基序的DNA引入编码纤维蛋白的纤维HI环的区域中，从而得到质粒pAB26-RGD。将小鼠OX40L(mOX40L)(Origene)亚克隆到pcDNA3.1(+)(Life Technologies)的KpnI/XbaI位点中，然后将mOX40L的表达盒(包括CMV启动子和牛生长激素多腺苷酸化序列)亚克隆到pAB26-RGD的ClaI/BamHI位点(在E3区的位置)中，从而产生pAB26-RGD-mOX40L。通过同源DNA重组pAB26-RGD-mOX40L和SwaI线性化的pVK500C产生最终的腺病毒基因组。缺失24bp DNA的Δ-24编码大肠杆菌BJ5183中E1A基因的RB结合区。为了挽救Δ-24-RGDOX(Delt24-RGD-mOX40L)病毒，用PacI消化所得的病毒骨架载体，然后用XtremeGENE HP DNA转染试剂(Roche Diagnostics Corporation)转染到293细胞中。因此，所得病毒Δ-24-RGDOX或Δ-24-RGD-GREAT含有以下修饰：用mOX40L表达盒替换人腺病毒5型(hAd5)基因组的E3区；E1A基因中24bp的缺失；和在纤维蛋白基因中插入RGD-4C基序编码序列。通过经PCR扩增修饰的区域然后对产物进行测序来确认病毒基因组的修饰。病毒在A549细胞(可复制型病毒)或293细胞(复制缺陷型AdGFP)中繁殖，通过Adenopure试剂盒(Puresyn，Inc.)纯化，并在-80℃下储存。用Adeno-X-Rapid滴定试剂盒(Clonetech)测定病毒滴度并以pfu/ml确定。

病毒复制测定-将细胞以5×10⁴个细胞/孔接种到12孔板中，并用病毒以10pfu/细胞进行感染。感染后48小时，根据制造商的说明，使用Adeno-X-Rapid滴定试剂盒(Clonetech)确定整个培养物中感染性病毒后代的滴度。最终的病毒滴度以PFU/毫升确定。

细胞系和培养条件-在补充有10％胎牛血清(MyClone Laboratories，Inc.)的Dulbecco改良的Eagle培养基-营养混合物F12(DMEM/F12)中培养人胶质母细胞瘤-星形细胞瘤U-87MG和肺癌A549细胞(ATCC)、小鼠神经胶质瘤GL261细胞(NCI-Frederick CancerResearch Tumor Repository)、GL261-5细胞(分离的GL261细胞克隆，当经颅内植入时，其导致小鼠的寿命比亲本GL261细胞更长)；GL261-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)细胞和GL261-OVA细胞。添加100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素，除了GL261-OVA培养物外，还向其中添加1μl/ml的嘌呤霉素(Life Technologies)。将小鼠黑素瘤细胞系B16-F10(ATCC)维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养基中。将人胚胎肾293(Qbiogene，Inc.)、小鼠神经胶质瘤CT-2A和小鼠肺癌CMT64(Culture Collections，Public Health England，UK)细胞维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的DMEM中。将小鼠原代星形胶质细胞(AllCells，LLC)在AGM星形胶质细胞生长培养基(Lonza)中培养。已经从人胶质母细胞瘤手术试样的急性细胞分离建立了人胶质母细胞瘤细胞(Human glioblastoma cell，GSC)。将GSC维持在补充有B27(Invitrogen)、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(各20ng/ml，Sigma-Aldrich)的DMEM/F12培养基中。将所有细胞保持在37℃、含有5％CO₂的湿润气氛中。通过短串联重复(short-tandem repeat，STR)指纹印迹验证所有GSC系。实验在从细胞库(B16-F10和CMT64)获得细胞系后6个月内或经验证(GSC)后进行。

小鼠-C57BL/6和无胸腺小鼠由MD Anderson Cancer Center Mouse ResourceFacility提供。OT-I小鼠(C57BL/6-Tg[TcraTcrb]1100Mjb/J)购自Jackson Laboratory。

动物研究-对于肿瘤植入，使用导螺杆系统将GL261细胞及其衍生物(5×10⁴细胞/小鼠)细胞移植到7至10周龄小鼠的尾状核中。将植入肿瘤的小鼠随机分配到实验组。然后瘤内注射病毒(5×10⁷ pfu/小鼠)、OX40激动剂抗体OX86(25μg/小鼠；由MD AndersonCancer Center的单克隆抗体核心机构(Monoclonal Antibody Core Facility)提供)、抗小鼠PD-L1抗体和/或大鼠IgG(25μg/小鼠；Bio X Cell)。为了再攻击存活的小鼠，将GL261-5(5×10⁴细胞/小鼠)或B16-F10(1×10³细胞/小鼠)细胞植入先前植入有治愈肿瘤的同一半球中或小鼠脑的对侧半球中。除了无胸腺小鼠的存活研究之外，所有的动物研究均在C57BL/6小鼠中进行。

流式细胞术分析-为了监测由病毒诱导的细胞膜的破裂(细胞死亡)，用PBS溶液中8μM乙啶同源二聚体1(Sigma-Aldrich)在室温下对细胞(2×10⁵至5×10⁵)染色15分钟。为了分析细胞表面蛋白质表达，首先在PBS加3％牛血清白蛋白中稀释的100μl第一抗体溶液和1mM乙二胺四乙酸中孵育细胞(2×10⁵至5×10⁵)。在4℃下在黑暗中孵育30分钟后，用1ml冷PBS将细胞洗涤一次。如果要施加第二抗体，则对第二抗体重复孵育过程。在用PBS洗涤一次后，最后将细胞重悬于0.5ml PBS中。然后使用流式细胞术分析经染色的细胞。研究中使用的抗体如下：抗小鼠CD252(OX40L)腺瘤性结肠息肉(adenomatous polyposis coli)(APC，17-5905-80)、抗小鼠CD45APC-eFluor 780(47-0451-82)、抗小鼠CD3异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)(FITC，11-0031-81)、抗小鼠CD4450(48-0041-80)、抗小鼠CD8a PerCP-Cyanine 5.5(45-0081-82)、抗人PD-L1APC(17-5983-41)和抗小鼠CD8APC(17-0081-81)、抗小鼠CD279(PD-1)PE-Cyanine7(25-9985-80)、抗小鼠CD152(CTLA-4)APC(17-1522-80)获自eBioscience；山羊抗大鼠IgG-FITC(ab6115)来自abcam，经纯化的抗小鼠CD252(OX40L)(108802)和抗小鼠PD-L1APC(124311)获自BioLegend。

ATP和HMGB1释放分析-从细胞培养物中收集培养基。用ENLITEN ATP测定系统(Promega)测定培养基中ATP的量。培养基中的HMGB1用HMGB1酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(IBL International)定量。

脾细胞和CD8+淋巴细胞的制备-收集小鼠脾脏，置于具有RPMI1640培养基的培养皿中的100-μm细胞过滤器中，然后通过细胞过滤器粉碎到培养皿中。将培养皿中的混合物轻轻地上下吹吸并使其达到5ml/脾。通过在室温下以350g离心7分钟沉淀细胞，然后根据制造商的说明书，将其重悬于红细胞裂解缓冲液Hybri-Max(Sigma-Aldrich)中以裂解红细胞。最后，用小鼠CD8a⁺T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Inc.)富集CD8⁺T细胞。

脑浸润淋巴细胞(BIL)的制备-使用Percoll(GE Healthcare Bio-Sciences)从髓磷脂碎片(myelin debris)中分离BIL(来自5至9个小鼠脑半球的组)并梯度离心。然后按照制造商的说明，使用具有Lympholyte-M细胞分离介质(Cedarlane)的梯度离心机富集BIL。

骨髓来源的树突细胞(mDC)的制备-从小鼠股骨和胫骨的骨髓中分离mDC。培养7天后，收集mDC并在培养的最后18小时添加1μg/ml脂多糖(Sigma-Aldrich)以诱导成熟。成熟的mDC用10μg/ml OVA(257至264)肽在37℃下致敏1小时。

免疫细胞的刺激-为了制备靶细胞，用病毒以100pfu/细胞感染GL261或GL261-OVA细胞。4小时后，向培养物添加100单位/ml的小鼠IFNγ(Prospec Protein Specialists)。病毒感染后48小时，用1％多聚甲醛固定细胞。为了活化免疫细胞，将预先固定的靶细胞(2×10⁴/孔)与脾细胞(5×10⁵/孔)或BIL(5×10⁴/孔)一起孵育。为了测量OVA特异性T细胞反应，用经OVA 257-264肽(InvivoGen)致敏的预先固定的小鼠树突细胞(1×10⁵/孔)刺激CD8⁺T细胞(3×10⁵/孔)。在圆底96孔板中共培养后40小时，用ELISA(小鼠IFNγDuoSet，R&DSystems)评估上清液中的IFNγ的浓度。

体外淋巴细胞增殖-从OT-I小鼠的脾中分离OVA特异性CD8⁺T细胞，并用5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Life Technologies)标记5分钟。在圆底96孔板中用靶细胞(5×10⁴/孔)刺激标记的T细胞(1×10⁵/孔)。四天后，用抗小鼠CD8a别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)对细胞进行染色，并用流式细胞术分析CD8+细胞中的绿色荧光(CFSE量)。增殖性细胞被限定为表现出比未刺激细胞更低的CFSE量的细胞。

脑肿瘤的组织病理学分析-从安乐死的小鼠中分离脑，用福尔马林固定并包埋在石蜡中。按照常规方法，将脑的整装冠状切片用苏木精和伊红染色。

统计学-在培养细胞的定量研究中，每组由一式三份样品组成。每项研究至少重复一次。使用双尾学生t检验评估组之间的差异。根据Kaplan-Meier方法绘制动物存活曲线。使用对数秩检验比较不同处理组中的存活率。基于正常的存活模型，使用R中的函数survreg分析存活研究中药剂的协同相互作用，并使用残差图检验模型的参数假设。P值＜0.05被认为有显著性。

实施例1-Δ-24-RGDOX的构建和表征

产生了Δ-24-RGDOX，一种在Δ-24-RGD骨架上包含小鼠OX40L(mOX40L)的表达盒的可复制型腺病毒。参见图1。具有CMV启动子的小鼠OX40L表达盒替换了人腺病毒5型基因组的E3区。缺失了负责结合Rb蛋白的E1A基因的CR2部分内的24-bp序列(对应于编码的E1A蛋白中的第122至129位氨基酸)。将RGD-4C整联蛋白结合基序编码序列插入纤维蛋白的HI环中。得到的包含小鼠OX40L表达盒的可复制型腺病毒被称为Δ-24-RGDOX(或D24-RGDOX)。

评估D24-RGDOX对GL261(小鼠神经胶质瘤)和小鼠黑素瘤B16细胞的小鼠OX40L(mOX40L)的表达。用D24-RGDOX以50pfu/细胞感染GL261或B16细胞。48小时后，将细胞用α-mOX40L抗体(1∶100稀释)(eBioscience，San Diego，CA)进行染色，然后用FITC标记的第二抗体山羊抗大鼠IG(1∶100稀释)(Santa Cruz Biotechnology)染色。用乙啶同源二聚体-1染色(8μM)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)监测细胞膜完整性。用流式细胞术分析经染色的细胞。图2A、2B和3右下角的数字表示表达mOX40L的小鼠GL261、人U-87MG和小鼠黑素瘤B16细胞的百分比。D24-RGDOX在GL261细胞、U-87MG细胞和黑素瘤B16细胞上均有效表达OX40L。使用相同的方法在CT-2A小鼠星形细胞瘤细胞(图14A)、GSC20细胞(人间充质神经胶质瘤细胞)(图14B)和CMT64细胞(小鼠肺癌细胞)中也证实了D24-RGDOX对mOX40L的表达(图14D)。因此，D24-RGDOX在活体培养的小鼠和人癌细胞的细胞膜上有效表达mOX40L。

在体内环境中，评估了来自颅内注射稳定表达增强的绿色荧光蛋白的GL261细胞(GL261-EGFP，图)的神经胶质瘤的细胞中mOX40L的表达(图4A)。将GL261-EGFP(表达增强的绿色荧光蛋白的GL261)肿瘤细胞(5×10⁴个细胞)经颅内注射到C57BL/6小鼠中。12天后，瘤内注射D24-RGDOX(5×10⁷ pfu)。注射后3天，收获肿瘤并用ACCUMAX细胞分离溶液(EMDMillipore，Billerica，MA)分离。然后用大鼠单克隆α-mOX40L APC抗体(1∶40)(eBioscience)对细胞进行染色。用流式细胞术分析经染色的细胞。将肿瘤细胞设门为EGFP阳性。图4B右上角的数字表示表达mOX40L的肿瘤细胞的百分比。这些体内数据表明在注射D24-RGDOX后72小时，OX40L在约9％至11％的异种移植细胞中表达(图4C)。

测试了D24-RGD和D24-RGDOX在U87MG(具有上皮形态的人原代胶质母细胞瘤细胞系；American Type Culture Collection，Manassas，VA)或GL261细胞中的复制。将细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并用病毒以10pfu/细胞进行感染。感染后48小时，根据制造商的说明书，使用ADENO-X Rapid滴定试剂盒(Clontech，Mountain View，CA)滴定感染性病毒后代。最终的病毒滴度确定为pfu/ml，并在图5中显示为三次独立测量的平均值±SD。使用学生T检验(双侧)比较两种病毒的复制。显示D24-RGDOX在人神经胶质瘤U-87MG细胞中与其亲本病毒D24-RGD一样有效地复制，而这两种病毒在GL261细胞中复制非常差。因此，本文中所述的小鼠神经胶质瘤模型的抗肿瘤作用显著低于预期的病毒(表达OX40L)在人中的抗肿瘤作用。病毒基因组的修饰不会显著改变其在人U-87MG神经胶质瘤细胞(P＝0.05)和小鼠GL261神经胶质瘤细胞(P＝0.44)中的复制能力。

腺病毒有效地诱导自噬性细胞死亡。这种能力在Δ-24-RGDOX中发现，其比Δ-24-RGD更稳健地诱导自噬和细胞裂解，如通过增加的LCII/I比(图6B)和细胞膜中的破裂(图6C)所示。报道称这种类型的细胞死亡通过胞外释放损伤(或危险)相关分子模式(DAMP)分子(例如三磷酸腺苷(ATP)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1))吸引免疫细胞。评估了D-24-RGD和D24-RGDOX诱导HSP90和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)分泌的能力。用病毒以200pfu/细胞感染GL261细胞。24小时后，FBS的浓度从10％变为2％。在图6A中所示的时间点收集培养基(M)和全细胞裂解物(W)。用蛋白质浓缩器(9K MWCO，Thermo Scientific)将培养基浓缩10倍。然后用免疫印迹分析HSP90和HMGB1表达水平。简言之，用4％至20％梯度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自全细胞裂解物或40ul/泳道浓缩的培养基的等量蛋白质，经电泳转移至硝酸纤维素膜，并用兔多克隆抗HSP90和抗HMGB1(1∶1000稀释)(CellSignaling Technology，Beverly，MA)、山羊多克隆抗肌动蛋白(1∶1000稀释)(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)探测膜。使用增强的化学发光蛋白质印迹检测系统(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)使蛋白质-抗体复合物可视化。肌动蛋白用作全细胞裂解物的上样对照。图6A的底部的数字表示分泌到培养基的相对HMGB1水平。另见图6E。尽管病毒在GL261细胞中的复制效率低，但两种病毒均诱导ATP和HMGB1的释放，其是在免疫原性细胞死亡期间触发炎症和免疫的内源性损伤相关分子模式(DAMP)分子的原型。Δ-24-RGDOX比Δ-24-RGD更有效地诱导HMGB1释放(25％增量)。复制缺陷型病毒AdCMV-GFP不诱导从感染的细胞释放ATP和HMGB1。因此，Δ-24-RGD和Δ-24-RGDOX二者均诱导从感染的细胞释放ATP和HMGB1(图6D和6E)并且Δ-24-RGDOX介导的HMGB1释放比Δ-24-RGD更有效(图6E)，很可能是因为其在感染的细胞中诱导自噬和裂解的能力增强(图6B和6C)。

实施例2-D24-RGDOX诱导的治疗作用增强

在病毒治疗期间，通过瘤内病毒注射诱导的DAMP将免疫细胞吸引到肿瘤部位并引发导致产生适应性抗肿瘤免疫的先天性免疫应答。为了测试这一点，使用具有肿瘤浸润的OX40+T细胞的同基因GL-261-C57BL/6免疫活性的神经胶质瘤模型。在C57BL/6小鼠中(第0天)经颅内注射GL261细胞(5×10⁴个细胞)，并且在肿瘤植入后第6、8和10天使小鼠接受3次瘤内病毒注射，以部分地补偿病毒在GL261细胞中相对较差的复制。在第14天，首先用Percoll(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA)梯度离心机将脑浸润的白细胞(来自9只小鼠的组)与髓磷脂碎片分离，并直接用于流式细胞术分析。使用的抗体如下：抗小鼠CD45APC-EFLUOR 780(1∶200稀释)、抗小鼠CD3FITC(1∶200稀释)、抗小鼠CD8a PerCP-Cyanine5.5(1∶80稀释)(eBioscience)、BRILLIANT VIOLET650抗小鼠CD4抗体(1∶100稀释)(BioLegend，San Diego，CA)。与注射有磷酸盐缓冲盐水(PBS)的小鼠相比，在注射有Δ-24-RGD或Δ-24-RGDOX的小鼠中，在肿瘤部位存在更多的T淋巴细胞(CD45+^/CD3⁺)、T辅助细胞(CD45⁺/CD3⁺/CD4⁺)和细胞毒性T细胞(CD45⁺/CD3⁺/CD8⁺)。此外，与注射Δ-24-RGD的小鼠相比，注射Δ-24-RGDOX的小鼠中存在显著更多的这些细胞(图8A)。其次，通过评估当用肿瘤细胞刺激这些细胞时这些细胞的IFNγ分泌来检测免疫细胞的抗肿瘤活性。因此，与来自Δ-24-RGD-或PBS处理组的BIL相比，来自注射有Δ-24-RGDOX肿瘤的半球的脑浸润淋巴细胞(BIL)对有或没有病毒感染的肿瘤细胞显示出显著更高的活性(图8B)，这表明与Δ-24-RGD相比，Δ-24-RGDOX在肿瘤部位确实介导了更强的抗肿瘤免疫应答。在来自处理组的脾细胞中观察到相同的作用(图8C)，但是由Δ-24-RGDOX诱导的活化的增量没有在BIL中那么大。与OX40L的共刺激活性一致，Δ-24-RGDOX感染的肿瘤细胞比Δ-24-RGD感染的细胞触发更高的BIL的活化(图8B)，并且这种作用被OX40L抗体的存在阻断(图8D)。

为了进一步证明Δ24-RGDOX刺激针对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫的能力，使用卵白蛋白(OVA)作为模型抗原。使用CFSE染色追踪T细胞增殖，发现感染有Δ-24-RGDOX的GL261-OVA细胞比感染有Δ-24-RGD的GL261-OVA细胞更稳健地诱导OVA特异性CD8+T细胞的增殖(图9A)。因此，与来自用Δ-24-RGD处理的小鼠的细胞相比，从已用Δ-24-RGDOX处理的携带GL261-OVA神经胶质瘤的小鼠中分离的CD8+T细胞对用OVA(257-264)肽致敏的小鼠树突细胞表现出显著更高的活性(图9B)。这种针对OVA的病毒引发的免疫与来自病毒处理的具有神经胶质瘤小鼠的脾细胞的肿瘤细胞刺激的活化相关，当脾细胞与原代小鼠星形胶质细胞共培养时未观察到这一点(图9C)，这表明Δ-24-RGDOX引发的免疫是肿瘤特异性的。因此，Δ-24-RGDOX比Δ-24-RGD更有效地增强肿瘤内癌症特异性T细胞群的原位扩增。

其次，使用GL261-C57BL/6小鼠神经胶质瘤模型进行存活研究以评估Δ-24-RGDOX的抗神经胶质瘤活性(图7A)。结果显示，与PBS相比，用三个剂量的Δ-24-RGD单独处理的GL261肿瘤不影响存活(中位存活：17天相对于16天，图7B)。然而，添加OX40激动剂抗体OX86显著延长了存活(中位存活24天相对于17天，图7B)。用Δ-24-RGDOX处理肿瘤进一步延长了中位存活(中位存活：28.5天相对于17天)，得到20％的长期存活率(图7B)。

为了确定抗癌免疫对存活率的作用，在免疫缺陷型无胸腺小鼠中重复治疗。当与PBS相比时，Δ-24-RGDOX或Δ-24-RGD与OX86的组合均未显示出治疗益处(中位存活16天相对于16天，图7C)。Δ-24-RGDOX在免疫活性小鼠和免疫缺陷小鼠之间的治疗作用的显著差异突出了病毒治疗诱导的免疫所起的重要作用。

与这些结果一致，小鼠脑的组织病理学研究显示，Δ-24-RGDOX诱导C57BL/6小鼠中的肿瘤坏死，而在用Δ-24-RGD处理的C57BL/6小鼠和用Δ-24-RGDOX处理的无胸腺小鼠(图7G)中均未观察到肿瘤坏死，这表明坏死是由抗肿瘤免疫诱导的，而不是通过溶瘤作用诱导的。此外，Δ-24-RGDOX处理的小鼠的脑的形态学和组织学显示在正常脑组织中没有急性或慢性炎症的病状(图7G和图15)。这些数据与Δ-24-RGDOX诱导的肿瘤特异性免疫的观察结果一致(图9C)。

因为Δ-24-RGDOX在GL261-C57BL/6模型中仅诱导20％的长期存活，所以其治疗效力可能已受到肿瘤快速生长的损害。因此，与Δ-24-RGD相比，Δ-24-RGDOX在生长缓慢的GL261-5神经胶质瘤模型中显示出好得多的治疗效力(中位存活：不明确相对于50至52天)，导致70％的长期存活率(图7D)。

用GL-261-5细胞再攻击Δ-24-RGDOX处理的小鼠的存活者，在6只动物中4只中未能产生神经胶质瘤，而所有未处理小鼠均显示出颅内疾病的病状并死于神经胶质瘤(中位存活：不明确相对于47天，图7E)。这些结果表明，Δ-24-RGDOX针对已用病毒处理的相同类型肿瘤能有效地诱导特异性免疫记忆，病毒介导的OX40L表达加强了这种免疫记忆。

本发明人首次将溶瘤腺病毒D24-RGD与靶向晚期共刺激OX40L/OX40途径结合以治疗免疫活性同源小鼠模型中的神经胶质瘤。提供直接证据表明，通过可复制型溶瘤腺病毒表达OX40L增强了肿瘤细胞的抗原呈递功能，同时产生针对肿瘤相关抗原提高的免疫和针对肿瘤细胞而非正常细胞的特异性免疫应答。瘤内注射D24-RGDOX引起先天性和适应性免疫细胞的浸润，在肿瘤部位引发ThI免疫，引起特异性抗神经胶质瘤免疫，缩小肿瘤并延长存活。重要的是，D24-RGDOX比其亲本病毒D24-RGD表现出更优越的引发抗神经胶质瘤免疫的能力。来自用D24-RGDOX处理的小鼠的脾细胞对感染和未感染的GL261细胞的刺激程度显著高于用Δ-24-RGD和OX40抗体的组合处理的小鼠的脾细胞。用Δ-24-RGDOX处理没有延长具有颅内GL261肿瘤的免疫抑制小鼠的寿命，表明存活效果主要是由于病毒引发的抗神经胶质瘤免疫。此外，在Δ-24-RGDOX处理后超过110天，大多数存活的小鼠对肿瘤的再攻击具有抗性，表明该病毒诱导针对肿瘤的免疫记忆，因为OX40共刺激信号增强了效应T细胞的记忆承诺(memory commitment)。由于D24-RGD的癌症选择性，OX40L应优先在癌细胞上表达。此外，与同样结合CTLA4的CD28的配体不同，OX40配体选择性地结合OX40。因此，OX40L通过TCR识别肿瘤相关病毒抗原刺激T淋巴细胞上的OX40，导致肿瘤特异性T细胞群的扩增。因此，与OX40激动剂抗体、CTLA-4和PD-1的拮抗剂抗体或使用溶瘤病毒表达免疫调节剂以全面活化免疫细胞不同，由D24-RGDOX表达的OX40L对T细胞的调节更局限于肿瘤特异性T细胞。因此，D24-RGDOX不太可能引起与这些治疗相关的全身毒性。基于本示例，预期具有完全响应的人癌症患者的百分比将随D24-RGDOX显著增加。由于OX40L/OX40途径刺激的免疫记忆增强，因此预期临床应答的持续时间也将随D24-RGDOX增加。

这与癌症疫苗策略不同，所述癌症疫苗策略由于肿瘤内的免疫抑制环境而不能确保肿瘤特异性T细胞可以归巢至肿瘤和/或在肿瘤内发挥其功能。与癌症疫苗治疗中仅通过专职抗原呈递细胞呈递抗原不同，Δ-24-RGDOX的作用是多重的。病毒感染癌细胞释放PAMP和DAMP以诱导肿瘤内的先天免疫应答，将肿瘤微环境从免疫抑制转变为免疫活性，并且扩大了来自天然库(repertoire)的肿瘤特异性T细胞组(pool)并重新活化可能处于休眠或无反应状态的现有肿瘤特异性T细胞。在通过专职抗原呈递细胞呈递来自通过病毒溶解的癌细胞碎片的TAA之前，由病毒诱导的肿瘤细胞上的OX40L表达和IFNγ介导的MHC表达增强了癌细胞作为特别的(ad hoc)抗原呈递细胞的作用。此外，由于疫苗策略仅涵盖一部分癌抗原库，在治疗期间免疫编辑后，具有不同抗原的癌细胞可以逃逸并产生对疫苗疗法具有抗性的新肿瘤细胞群。相比之下，Δ-24-RGDOX被设计用于感染整个癌细胞群，并且可以在治疗期间介导整个癌抗原库向免疫系统的呈递。这使得病毒能够克服由于肿瘤细胞的异质性和治疗诱导的演化而导致的癌症抗性，这是开发靶向癌症治疗的主要挑战。

实施例3-D24-RGDOX与免疫检查点抑制剂的协同作用

在8个人神经胶质瘤干细胞(glioma stem cell，GCS)系中检查PD-L1的表达。在所有情况下，这些细胞表达相对低水平的PD-L1，其随着IFNγ刺激而显著增加(图12A，P＜0.002)。类似地，小鼠神经胶质瘤GL261-5细胞也表达低水平的PD-L1(中位荧光强度[MFI]＝37.4)，其通过用Δ-24-RGDOX感染略微增强(MFI＝59.7，图12B)。然而，在有(MFI＝529)和没有(MFI＝661)Δ-24-RGDOX感染的情况下，IFNγ都显著提高GL261-5细胞中的PD-L1表达(图12B)。基础PD-L1表达水平在GL261-EGFP细胞中略高，并且还响应于IFNγ处理而提高(图16)。此外，来源于GL261-EGFP细胞的神经胶质瘤中的Δ-24-RGDOX注射进一步上调肿瘤细胞中的PD-L1水平，其已经高于培养的细胞中的PD-L1水平(MFI从750提高至1176，图12D)。此外，在Δ-24-RGDOX处理后，肿瘤浸润性CD8+T细胞上PD-1的表达提高了58％，而另一种免疫检查点抑制剂CTLA-4的表达保持不变(图12E)。这些结果表明，病毒治疗导致PD-L1/PD-1途径的反馈激活，从而损害由病毒诱导的抗肿瘤免疫。

为了进一步加强效力，将Δ-24-RGDOX与抗PD-L1抗体组合以治疗来源于C57BI/6小鼠中GL261-5细胞的神经胶质瘤。在第一次病毒剂量后2天和第二次后3天，通过瘤内注射抗体以限制其主要在肿瘤中的作用，从而减少抗体对病毒的潜在不利影响(图13A)。该组合导致85％的长期存活率，而单独注射2次病毒使中位存活时间延长了19天，这相当于长期存活率仅为28％(中位存活：不明确相对于57天)；抗体单独将中位存活时间延长了11天，相当于长期存活率仅为15％(中位存活：不明确相对于49天)。这些结果证明了这两种药剂协同作用以排斥肿瘤(图13C)。

在用该组合处理的长期存活小鼠中，在肿瘤植入部位的脑中发现肿瘤残余物(图13B)，表明该处理诱导了完全消退。此外，组合处理组中的六只存活小鼠中的五只也在对侧半球中的相同肿瘤细胞的再攻击中存活，而所有未处理小鼠死于神经胶质瘤(中位存活：不明确相对于35天，图13D)。这些发现表明，组合治疗诱导了免疫记忆的产生，阻止了在远端部位的生长。

Δ-24-RGDOX与抗PD-L1抗体的组合协同地增加了抗肿瘤效力并促进了可以攻击远端位置癌细胞的全身免疫记忆的产生，在经处理的具有神经胶质细胞瘤的小鼠中实现100％的长期存活率。这在术后切除和替莫唑胺治疗的胶质母细胞瘤中尤为重要，在远端部位的复发是常见的(如果不是必然发生的话)。虽然这些治疗局部递送至肿瘤，但其抗肿瘤作用不限于处理的肿瘤部位。接受组合治疗的存活小鼠对植入脑另一半球的肿瘤细胞具有抗性，这表明肿瘤特异性记忆T细胞可以迁移至新的肿瘤部位并攻击那里的癌细胞。用可复制型溶瘤腺病毒和免疫检查点蛋白抑制剂(例如PD-L1)的组合治疗实现了超常的癌症特异性效力。由于人腺病毒在小鼠细胞中的复制效率较低，因此在小鼠的后续再感染中可获得的病毒体较少，小鼠肿瘤细胞中存在的针对病毒抗原的免疫力较弱，预期人类患者中组合治疗的出人意料的效力比在小鼠模型中更为显著。

序列表

<110> Tufaro, Frank

Fueyo-Margareto, Juan

Jiang, Hong

Yung, WK Alfred

Conrad, Charles

Gomez-Manzano, Candelaria

<120> 腺病毒和免疫调节剂组合治疗

<130> 011863-5006 WO

<150> US 62/342,482

<151> 2016-05-27

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫原性 EGFRvIII 肽

<400> 1

Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val

1 5

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫原性 EGFRvIII 肽

<400> 2

Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫原性 NY-ESO-1 肽

<400> 3

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe

1 5 10

Claims

1.用于在有此需要的哺乳动物中治疗和/或预防癌症的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的组合，所述组合包含(a)可复制型溶瘤腺病毒，所述可复制型溶瘤腺病毒包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架或杂合核酸骨架，其包含Ad5组分和(i)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码OX40激动剂的异源核酸序列和/或(ii)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码GITR激动剂的异源核酸序列，其中所述插入的异源核酸序列受允许在细胞中表达所述OX40激动剂和/或GITR激动剂的序列的控制，以及(b)一种或更多种免疫检查点抑制剂。

2.权利要求1所述的方法，其中所述可复制型溶瘤腺病毒包含插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码GITR激动剂的异源核酸序列。

3.权利要求2所述的方法，其中所述GITR激动剂是GITR配体多肽。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述可复制型溶瘤腺病毒包含插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码OX40激动剂的异源核酸序列。

5.权利要求4所述的可复制型溶瘤腺病毒，其中所述OX40激动剂是OX40配体多肽。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述腺病毒包含E3基因区的部分或全部缺失，并且其中所述编码GITR激动剂的异源核酸序列和/或所述编码OX40激动剂的异源核酸序列插入所述腺病毒的所述E3区中缺失的腺病毒基因的位置。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述允许表达所述GITR激动剂和/或OX40激动剂的序列是CMV或RSV启动子。

8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述腺病毒包含Δ-24或Δ-24-RGD核酸骨架。

9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述腺病毒基因组还包含编码肿瘤抗原的异源核酸序列。

10.权利要求9所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自：MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、酪氨酸酶、中期因子、BAGE、CASP-8、β-联蛋白、CA-125、CDK-1、ESO-1、gp75、gp100、MART-1、MUC-1、MUM-1、p53、PAP、PSA、PSMA、ras、trp-1、HER-2、TRP-1、TRP-2、IL13Rα、IL13Rα2、AIM-2、AIM-3、NY-ESO—1、C9orfll2、SARI1、SART2、SART3、BRAP、RTN4、GLEA2、TNKS2、KIAA0376、ING4、HSPH1、C13orf24、RBPSUH、C6orf153、NKTR、NSEP1、U2AF1L、CYNL2、TPR、SOX2、GOLGA、BMI1、COX-2、EGFRvIII、EZH2、LICAM、Livin、Livin、MRP-3、巢蛋白、OLIG2、ART1、ART4、B-细胞周期蛋白、Glil、Cav-1、组织蛋白酶B、CD74、E-钙黏着蛋白、EphA2/Eck、Fra-1/Fosl 1、GAGE-1、神经节苷脂/GD2、GnT-V、β1，6-N、Ki67、Ku70/80、PROX1、PSCA、SOX10、SOX11、存活蛋白、UPAR和WT-1、或其免疫原性肽。

11.权利要求9或10所述的方法，其中所述编码肿瘤抗原的异源核酸插入所述腺病毒的六邻体基因的高变区5中或插入所述腺病毒纤维蛋白基因的HI环区中。

12.权利要求11所述的方法，其中所述腺病毒包含插入所述腺病毒的纤维蛋白基因的HI环区中的编码EGFRvIII或其免疫原性肽的异源核酸和/或插入所述腺病毒的六邻体基因的高变区5中的编码NY-ESO-1或其免疫原性肽的异源核酸。

13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自以下的检查点蛋白：PD-L1、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA4)、B7-H3、B7-H4、T细胞膜蛋白3(TIM3)、半乳凝素9(GAL9)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、T细胞活化的含V结构域免疫球蛋白(Ig)抑制子(VISTA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、及其组合，并且其中所述免疫检查点抑制剂优选是抗体或选自Fab、Fab’、Fv、scFv和(Fab’)₂片段的抗体片段。

14.权利要求13所述的方法，其中所述检查点抑制剂抑制PD-1、PD-L1或CTLA4，并且优选是人源化抗体或人抗体。

15.权利要求14所述的方法，其中所述检查点抑制剂抑制CTLA-4并且选自伊匹单抗和替西木单抗。

16.权利要求14所述的方法，其中所述检查点抑制剂抑制PD-1并且选自纳武单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、兰利珠单抗和AMP-224。

17.权利要求14所述的方法，其中所述检查点抑制剂抑制PD-L1并且选自BMS-936559、MEDI-4736、MPDL33280A、M1H1、阿替珠单抗、度伐单抗和阿维单抗。

18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中同时施用所述可复制型溶瘤腺病毒和所述检查点抑制剂。

19.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中依次施用所述可复制型溶瘤腺病毒和所述检查点抑制剂，并且其中在第一次施用检查点抑制剂之前进行溶瘤腺病毒的第一次施用，并且优选在检查点抑制剂第一次施用的30天内进行。

20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗体或融合蛋白，并且以0.01至10mg/kg、0.1至10mg/kg、1至10mg/kg、2至8mg/kg、3至7mg/kg、4至5mg/kg或至少10mg/kg的一个或更多个剂量施用。

21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有选自以下的癌症：原发性或转移性脑癌、黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、原发性或转移性肺癌、肝癌、结肠癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、原发性或转移性乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌。

22.权利要求21所述的方法，其中所述哺乳动物患有原发性或转移性脑癌、原发性或转移性肺癌或者原发性或转移性乳腺癌。

23.权利要求21所述的方法，其中所述哺乳动物已被诊断患有胶质母细胞瘤，并且其中所述腺病毒优选通过直接注射到所述哺乳动物脑中的肿瘤中施用。

24.权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述腺病毒经瘤内、血管内、瘤内和血管内或在神经元或间充质干细胞载体中施用。

25.权利要求24所述的方法，其中所述腺病毒经瘤内施用。

26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述腺病毒以10⁸至10¹⁴个噬斑形成单位(pfu)的剂量施用一次或多次。

27.权利要求25或26所述的方法，其包括将有效量的所述腺病毒注射到所述哺乳动物的肿瘤块或肿瘤血管系统中。

28.权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

29.权利要求28所述的方法，其中所述人已经历了一次或更多次免疫检查点抑制剂治疗的失败。

30.可复制型溶瘤腺病毒，其包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架或杂合核酸骨架，其包含Ad5组分和插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码免疫检查点抑制剂的异源核酸序列和任选的插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码免疫细胞共刺激性受体激动剂的异源核酸序列，其中所述插入的异源核酸序列受允许在细胞中表达所述免疫检查点抑制剂和任选的免疫细胞共刺激性受体激动剂的序列的控制。

31.权利要求30所述的可复制型溶瘤腺病毒，其包含编码选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂的异源核酸序列：CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR和BTLA。

32.权利要求31所述的可复制型溶瘤腺病毒，其中所述编码免疫检查点抑制剂的异源核酸序列编码CTAL4、PD-1和/或PD-L1的抑制剂。

33.权利要求32所述的可复制型溶瘤腺病毒，其中所述编码免疫检查点抑制剂的核酸序列编码PD-1的抑制剂。

34.权利要求30至33中任一项所述的可复制型溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含编码选自以下的免疫共刺激性受体的激动剂的异源核酸序列：CD28、OX40(CD134)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、CD137(4-1BB)、疱疹病毒进入介质A(HVEM)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS或CD278)、CD27、CD40、CD226、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、死亡受体3(DR3)、淋巴毒素-β受体(LTBR)、跨膜活化剂和CAML相互作用物(TACI)、B细胞活化因子受体(BAFFR)和B细胞成熟蛋白(BCMA)。

35.权利要求34所述的可复制型溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含编码OX40激动剂和/或GITR激动剂的异源核酸序列。

36.权利要求35所述的可复制型溶瘤腺病毒，其中所述OX40激动剂和/或GITR激动剂是OX40配体多肽和/或GITR配体多肽。

37.药物组合物，其包含可药用载体和根据权利要求30至37中任一项所述的可复制型溶瘤腺病毒。

38.用于在有此需要的人对象中治疗和/或预防癌症和/或治疗和/或预防转移的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1至36中任一项所述的可复制型溶瘤腺病毒或根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂和任选的所述免疫细胞共刺激性受体激动剂在所述对象的癌细胞中表达。

39.权利要求38所述的方法，其中所述对象患有选自以下的癌症：原发性或转移性脑癌、黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌、头颈癌、结直肠癌、肾癌、甲状腺癌和肝细胞癌。

40.权利要求39所述的方法，其中所述对象患有低水平或高水平的神经胶质瘤、转移性或原发性乳腺癌或者原发性或转移性肺癌。

41.权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述腺病毒经瘤内、血管内或瘤内和血管内施用。

42.权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述腺病毒以10⁸至10¹⁴个噬斑形成单位(pfu)的剂量施用一次或多次。

43.治疗组合，其包含(a)可复制型溶瘤腺病毒，所述可复制型溶瘤腺病毒包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架或杂合核酸骨架，其包含Ad5组分和(i)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码GITR激动剂的异源核酸序列和/或(ii)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码OX40激动剂的异源核酸序列，其中所述插入的异源核酸序列受允许在细胞中表达所述GITR激动剂和/或OX40激动剂的序列的控制，以及(b)一种或更多种免疫检查点抑制剂，优选选自PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L2抑制剂。

44.组合产品，其包含(a)可复制型溶瘤腺病毒，所述可复制型溶瘤腺病毒包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架或杂合核酸骨架，其包含Ad5组分和(i)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码GITR激动剂的异源核酸序列和/或(ii)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码OX40激动剂的异源核酸序列，其中所述插入的异源核酸序列受允许在细胞中表达所述GITR激动剂和/或OX40激动剂的序列的控制，以及(b)一种或更多种免疫检查点抑制剂，优选选自PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L2抑制剂，以及相关的可药用的佐剂、稀释剂或载体。

45.成套试剂盒，其包含以下组分：(a)可复制型溶瘤腺病毒，所述可复制型溶瘤腺病毒包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架或杂合核酸骨架，其包含Ad5组分和(i)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码GITR激动剂的异源核酸序列和/或(ii)插入所述腺病毒基因组非必需区中的编码OX40激动剂的异源核酸序列，其中所述插入的异源核酸序列受允许在细胞中表达所述GITR激动剂和/或OX40激动剂的序列的控制，以及相关的可药用的佐剂、稀释剂或载体，以及(b)一种或更多种免疫检查点抑制剂以及相关的可药用的佐剂、稀释剂或载体，其中所述组分以适于依次、单独和/或同时施用的形式提供。

46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述可复制型溶瘤腺病毒和一种或更多种免疫检查点抑制剂以组合施用时在哺乳动物中有效治疗癌症的量存在。