KR20170128525A - 항muc16 항체 및 그의 용도 - Google Patents
항muc16 항체 및 그의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20170128525A KR20170128525A KR1020177029700A KR20177029700A KR20170128525A KR 20170128525 A KR20170128525 A KR 20170128525A KR 1020177029700 A KR1020177029700 A KR 1020177029700A KR 20177029700 A KR20177029700 A KR 20177029700A KR 20170128525 A KR20170128525 A KR 20170128525A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- antibody
- antigen
- Prior art date
Links
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 claims abstract description 195
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims abstract description 193
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 78
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 1455
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 633
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 614
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 614
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 614
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 507
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 473
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 115
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 104
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 96
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 91
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 68
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims description 64
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 61
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 61
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 60
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 57
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 52
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 49
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 48
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 claims description 46
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 38
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 37
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 36
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 36
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 36
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 35
- 230000036252 glycation Effects 0.000 claims description 33
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 18
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 17
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 15
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 13
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 12
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 12
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 10
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 claims description 10
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 10
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 10
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 10
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 9
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 claims description 8
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 7
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N N-methylformamide Chemical class CNC=O ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 claims description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims 145
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 44
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims 10
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 201000001342 Fallopian tube cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000013452 Fallopian tube neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 208000026149 Primary peritoneal carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 221
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 28
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 28
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 21
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 20
- 102000000802 Galectin 3 Human genes 0.000 description 19
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 description 19
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 14
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 14
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 13
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 11
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 8
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 8
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 8
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 7
- 102100037982 Alpha-1,6-mannosylglycoprotein 6-beta-N-acetylglucosaminyltransferase A Human genes 0.000 description 7
- 101000951392 Homo sapiens Alpha-1,6-mannosylglycoprotein 6-beta-N-acetylglucosaminyltransferase A Proteins 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 6
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 5
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 3
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 3
- 238000007807 Matrigel invasion assay Methods 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- VYEWZWBILJHHCU-OMQUDAQFSA-N (e)-n-[(2s,3r,4r,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5s,6s)-3-acetamido-5-amino-4-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[2-[(2r,3s,4r,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl]-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]-5-methylhex-2-enamide Chemical compound N1([C@@H]2O[C@@H]([C@H]([C@H]2O)O)C(O)C[C@@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@H]([C@@H](O2)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)C=CC(=O)NC1=O VYEWZWBILJHHCU-OMQUDAQFSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- 102220558444 Proteinase-activated receptor 2_N30A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTOKCBJDEGPICW-GWPISINRSA-N alpha-D-Manp-(1->3)-[alpha-D-Manp-(1->6)]-beta-D-Manp-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->4)-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)[C@@H](CO)O1 ZTOKCBJDEGPICW-GWPISINRSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108091005996 glycated proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000055862 human MUC16 Human genes 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100022622 Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010057649 Endometrial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100027286 Fanconi anemia group C protein Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229940122966 Glycoprotein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000972916 Homo sapiens Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101150001976 MUC16 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 241000282576 Pan paniscus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101000930003 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N carbachol Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(N)=O AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 201000006828 endometrial hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000006508 oncogene activation Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 201000008017 ovarian lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108040008338 receptor ligand activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000019107 receptor ligand activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
- A01K2217/203—Animal model comprising inducible/conditional expression system, e.g. hormones, tet
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본원에서는 당화된 형태의 MUC16인 테더링된 뮤신 단백질에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물, 방법, 및 용도를 제공한다. 본원에서는 또한 장애, 예컨대, 암을 관리, 치료 또는 예방하기 위한 용도 및 방법을 제공한다.
Description
1. 분야
본 출원은 2015년 3월 17일자로 출원된 미국 가출원 제 62/134,402호의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 출원은 2016년 3월 14일자로 작성되고, 375 Kbytes의 크기를 갖는 텍스트 파일 "Sequence_Listing_13542-016-228.txt"로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.
테더링된 뮤신 단백질 (tethered mucin protein)인 MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 암과 같은 장애의 관리, 치료 또는 예방을 위해, MUC16의 발현 및/또는 활성을 조절하는 조성물, 방법 및 용도가 본 명세서에서 제공된다.
2. 배경기술
뮤신은 세포 항상성 및 상피 표면 보호에 중요한 생체분자이다. 난소암에서 뮤신의 발현 변화는 진단, 예후 및 치료에 이용될 수 있다 (문헌 [Singh AP, et al. Lancet Oncol 2008;9(11):1076-85]). MUC16은 대부분의 난소 암종에서 과다 발현되고, 난소암의 검출 및 진행에 대한 확립된 대용 혈청 마커 (CA-125)인 뮤신 중 하나이다 (문헌 [Badgwell D, et al., Dis Markers 2007;23(5-6):397410; Bast RC, Jr, et al., Int J Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274-81; Fritsche HA, et al., Clin Chem 1998;44(7):1379-80; 및 Krivak TC, et al., Gynecol Oncol 2009;115(1):81-5]). MUC16은 다수의 반복 서열로 이루어진 CA-125라 일컬어지는 절단되어, 방출되는 큰 도메인 및, 잔여 비반복 세포 외 단편, 막 관통 도메인 및 세포질 테일(cytoplasmic tail)를 포함하는 보유 도메인 (MUC-CD)으로 구성된 고도로 당화된 뮤신이다 (문헌 [O'Brien TJ, et al. Tumour Biol 2001;22(6):348-66]). 상기 항원은 달리는 자궁, 자궁내막, 나팔관, 난소 및 복강 및 흉강의 장막 (serosa)에서 단지 낮은 수준으로 발현되므로, MUC16은 면역-기반 치료법에 대한 잠재적으로 매력적인 표적이다.
그러나, MUC16의 세포 외 도메인의 대부분이 절단되어, 분비된다는 사실은 난소 암종에서 표적 항원으로서 MUC16의 유용성을 제한한다. 실제로, 현재까지 보고된 대부분의 MUC16 단일클론 항체는 당단백질의 분비된 큰 CA-125 분획 상에 존재하는 에피토프와 결합하며, 상기 항원의 보유된 세포 외 분획 (MUC-CD)과 결합하는 것으로 알려진 것은 없다 (문헌 [Bellone S, Am J Obstet Gynecol 2009;200(1):75 el-10, Berek JS. Expert Opin Biol Ther 2004;4(7):1159-65; O'Brien TJ, et al. Int J Biol Markers 1998;13(4):188-95]). 따라서, MUC16의 비쉐딩 영역 (non-shed region)에 대한 새로운 항체의 생성이 진단 및 치료 접근법에 필요하다.
3. 요약
이러한 항체 또는 항원 결합 단편, 예를 들어 융합 단백질, 접합체, 및/또는 키메라 항원 수용체뿐만 아니라, 이를 발현하는 세포를 포함하는 항체 및 그의 항원 결합 단편 및 폴리펩티드가 제공된다. 상기 항체 및 항원 결합 단편 중에는, MUC16 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것이 존재한다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "MUC16 당화 항체"로 지칭된다. 이러한 에피토프는 전형적으로, MUC16 분자, 대체적으로 MUC16의 비쉐딩 형태의 세포 외 부분 내 또는 실질적으로 상기 세포 외 부분 내의 에피토프이며; 일부 실시형태에서, 상기 에피토프가 MUC16의 탠덤 반복 영역 및/또는 MUC16의 분비된 형태 내에 존재하지 않거나, 상기 항체 또는 단편이 그와 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 에피토프는 MUC16c114 내에 존재하거나, MUC16c114 내의 잔기를 포함하고, 전형적으로 그 내부에 하나 이상의 당화된 잔기 또는 당화 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 에피토프는 하나 이상의 당화 부위, 예를 들어 N-당화 부위를 포함한다. 일부 양상에서, 상기 에피토프는 서열 번호 150에 제시된 MUC16 서열의 Asn1806 또는 Asn1800에 상응하는 아스파라긴 잔기 (및/또는 그의 당화된 형태(들))를 포함하고; 일부 양상에서, 상기 에피토프는 서열 번호 150의 Asn1806에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하나, 서열 번호 150의 Asn1800에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하지 않으며; 일부 양상에서, 상기 에피토프는 서열 번호 150의 Asn1800에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하나, 서열 번호 150의 Asn1806에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하지 않는다. 일부 임의의 이러한 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아스파라긴은 당화, 예를 들어 N-당화되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 131 내의 것이거나, 서열 번호 131 내의 잔기를 포함하는 에피토프와 결합하고; 서열 번호 130 내의 것이거나, 서열 번호 131 내의 잔기를 포함하는 에피토프 또는 그의 조합과 결합하며; 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 단편은 서열 번호 168에 상응하는 MUC16의 영역 내 또는 서열 번호 168의 잔기 2 내지 19 내에서 면역특이적으로 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에 개시된 항체 서열, 예를 들어 MUC16-당화 부위-표적화된 항체 서열, 예를 들어 18C6으로 명명된 항체, 10C6으로 명명된 항체, 및/또는 19C11로 명명된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR에 상응하는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 단편은 본 명세서에서 제공되는 중쇄 서열, 예를 들어 18C6으로 명명된 항체, 10C6으로 명명된 항체, 19C11로 명명된 항체, 및/또는 7B12로 명명된 항체의 중쇄 서열 중 하나의 HCDR3에 상응하는 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)를 갖는다. 일부 양상에서, HCDR3은 IGTAQATDALDY (서열 번호 105), GTAQATDALD (서열 번호 111); X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S; 서열 번호 5; 서열 번호 25; 서열 번호 45; 서열 번호 65; 및 서열 번호 85; 서열 번호 31, 51, 71 및 91; 서열 번호 17; 서열 번호 37; 서열 번호 57; 서열 번호 77; 및 서열 번호 97임) 중에서 선택되는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 제공되는 중쇄 서열, 예를 들어 18C6으로 명명된 항체, 10C6으로 명명된 항체, 19C11로 명명된 항체, 및/또는 7B12로 명명된 항체의 중쇄 서열 중 하나의 HCDR1에 상응하는 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함한다. 일부 양상에서, HCDR1은 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임), 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임), GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임), 서열 번호 3으로 제시된 서열; 및 서열 번호 9로 제시된 서열; 및 서열 번호 15로 제시된 서열; 및 임의의 서열 번호 23, 43, 63, 83으로 제시된 서열; 및 임의의 서열 번호 29, 49, 69 및 89로 제시된 서열; 및 임의의 서열 번호 35, 55, 75 및 95로 제시된 서열 중에서 선택되는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 제공되는 중쇄 서열, 예를 들어 18C6으로 명명된 항체, 10C6으로 명명된 항체, 19C11로 명명된 항체, 및/또는 7B12로 명명된 항체의 중쇄 서열 중 하나의 HCDR2에 상응하는 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함한다. 일부 양상에서, HCDR2는 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임); WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함); IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함); 서열 번호 4로 제시된 서열; 서열 번호 10으로 제시된 서열; 및 서열 번호 16으로 제시된 서열; 및 임의의 서열 번호 24, 44, 64, 84로 제시된 서열; 및 임의의 서열 번호 30, 50, 70, 90으로 제시된 서열; 및 임의의 서열 번호 36, 56, 76, 96으로 제시된 서열 중에서 선택되는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 임의의 전술된 실시형태를 포함하며, 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 제공되는 경쇄 서열, 예를 들어 18C6으로 명명된 항체, 10C6으로 명명된 항체, 19C11로 명명된 항체, 및/또는 7B12로 명명된 항체의 경쇄 서열 중 하나의 LCDR3에 상응하는 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3)를 포함하며, 예를 들어 추가로 포함한다. 일부 양상에서, LCDR3은 MQX6LEX7PLT (서열 번호 108) (X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y임); X13LEX14PL (서열 번호 114) (X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y임) 중에서 선택되는 서열; 및 MQSLEYPLT (서열 번호 120); 서열 번호 8, 28, 48, 68 및 88 중에서 선택되는 서열; 서열 번호 14, 34, 54, 74 및 94 중에서 선택되는 서열; 및 서열 번호 20, 4, 60, 80 및 100 중에서 선택되는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 임의의 전술된 실시형태를 포함하며, 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 제공되는 경쇄 서열, 예를 들어 18C6으로 명명된 항체, 10C6으로 명명된 항체, 19C11로 명명된 항체, 및/또는 7B12로 명명된 항체의 경쇄 서열 중 하나의 LCDR1에 상응하는 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함하며, 예를 들어 추가로 포함한다. 일부 양상에서, LCDR1은 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호 106); SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호 112) (X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K임); KSLX19X20SNGNTY (서열 번호 118) (X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K임); 서열 번호 6, 26, 46, 66 및 86 중에서 선택되는 서열; 서열 번호 12, 32, 52, 72 및 92 중에서 선택되는 서열; 및 서열 번호 18, 38, 58, 78 및 98 중에서 선택되는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 임의의 전술된 실시형태를 포함하며, 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 제공되는 경쇄 서열, 예를 들어 18C6으로 명명된 항체, 10C6으로 명명된 항체, 19C11로 명명된 항체, 및/또는 7B12로 명명된 항체의 경쇄 서열 중 하나의 LCDR2에 상응하는 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함하며, 예를 들어 추가로 포함한다. 일부 양상에서, LCDR2는 YMSNLAS (서열 번호 107); YMS (서열 번호 113); 및 임의의 서열 번호 7, 27, 47, 67, 87; 13, 33, 53, 73, 93, 19, 39, 59, 79, 99, 119에 제시된 서열 중에서 선택되는 서열을 갖는다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 (a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임)을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 (CDR)1; (b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 (a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1; (b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 (a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1; (b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 (a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호 106) (X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호 107)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호 108) (X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 (a) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호 112) (X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 113)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호 114) (X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호 118) (X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 119)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호 120)을 포함하는 VL CDR3을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는 (a) (i) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1; 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호 106) (X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H임)을 포함하는 VL CDR1; 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호 107)을 포함하는 VL CDR2; 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호 108) (X6 은 G 또는 S이고, X7 은 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (b) (i) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1; 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호 112) (X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; 아미노산 서열 YMS (서열 번호 113)을 포함하는 VL CDR2; 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호 114) (X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (c) (i) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1; 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3; 및 (ii) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호 118) (X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; 아미노산 서열 YMS (서열 번호 119)을 포함하는 VL CDR2; 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호 120)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (d) (i) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (e) (i) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (f) (i) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (g) (i) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (h) (i) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (i) (i) 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (j) (i) 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (k) (i) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (l) (i) 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (m) (i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (n) (i) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (o) (i) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (p) (i) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (q) (i) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 (r) (i) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 갖는 것이 존재한다.
임의의 실시형태의 항체 및 항원 결합 단편 중에는: (a) (i) QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 101) (X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나 부재하고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이고, X35는 T, S, 또는 A임)의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (서열 번호 102) (X36은 I 또는 V이고, X37은 P 또는 S이고, X38은 R 또는 L이고, X39는 K 또는 H이고, X40은 R 또는 K이고, X41은 E 또는 G이고, X42는 S 또는 G이고, X43은 Y 또는 H임)의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (b) (i) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (c) (i) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (d) (i) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (e) (i) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는 (f) (i) 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 것이 존재한다.
또한, 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편 중에는 표 1 및 2에 제시된 임의의 이러한 항체 및/또는 임의의 항체의 VH 및/또는 VL 서열(들)과 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 갖는 것이 존재한다. 또한, 제공되는 항체 및 그의 단편 중에는 임의의 이러한 항체의 MUC16 및/또는 그의 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하는 것이 존재한다.
또한, 융합 단백질, 예를 들어 임의의 항체를 포함하는 키메라 분자, 및/또는 접합체, 예를 들어 이러한 항체 또는 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 이러한 분자를 발현하는 세포가 제공된다. 또한, 임의의 이러한 항체의 인간화된 버전이 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 항체가 (a) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (b) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (c) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, (i) MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이고; (ii) MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이고; (iii) 단계 (c)의 세포는 SKOV3 세포이다. 구체적 실시형태에서, 상기 항체는, 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있다. 특정 실시형태에서, (i) MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이고; (ii) MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이고; (iii) 단계 (c)의 세포는 SKOV3 세포이다. 특정 실시형태에서, (i) MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이고; (ii) MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이고; (iii) MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이며; (iv) 단계 (c)의 세포는 SKOV3 세포이다.
또한, 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 항체가 (a) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (b) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (c) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, (i) MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이고; (ii) MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이며; (iii) 단계 (c)의 세포는 SKOV3 세포이다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 150의 N-당화된 아스파라긴 1806을 포함하는 에피토프와 면역특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)과 면역특이적으로 결합하며, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)의 아미노산 잔기 번호 4 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10 (N10)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)과 면역특이적으로 결합하며, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)의 아미노산 잔기 번호 7 (N7)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편과 세포의 접촉 시에, MUC16의 제1 형태를 발현하는 세포 내로 내재화된다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 SKOV3 세포이다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MUC16의 당화된 형태를 발현하는 종양의 성장을 억제한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103)을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 (CDR)1 (X1은 L 또는 V임); (b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1; (b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1; (b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 101) (X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나 부재하고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이고, X35는 T, S, 또는 A임)의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호 106) (X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호 107)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호 108) (X6은 G 또는 S이고, X7 은 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호 112) (X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 113)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호 114) (X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (a) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호 118) (X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 119)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호 120)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (서열 번호 102) (X36은 I 또는 V이고, X37은 P 또는 S이고, X38은 R 또는 L이고, X39는 K 또는 H이고, X40은 R 또는 K이고, X41은 E 또는 G이고, X42는 S 또는 G이고, X43은 Y 또는 H임)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 인간-유래 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 감마1, 감마2, 감마3 및 감마4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아이소타입을 갖는다. 특정 실시형태에서, 경쇄 불변 영역은 카파 및 람다로 이루어진 군으로부터 선택되는 아이소타입을 갖는다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간화된. 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 설치류 항체의 인간화된 형태이다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는 면역글로불린이다. 특정 실시형태에서, 상기 면역글로불린은 IgG이다.
또한, 제제에 접합된 본 명세서에서 제공되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 접합체가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 제제는 영상화제 또는 세포독성제이다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 이중특이적 항체이다. 특정 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 CD3과 면역특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체는 MUC16과 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린을 포함하고, 상기 면역글로불린의 경쇄는, CD3과 면역특이적으로 결합하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)과 펩티드 링커를 통해 접합된다. 또한, 제제에 접합된 본 명세서에서 제공되는 이중특이적 항체를 포함하는 이중특이적 항체 접합체가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 제제는 영상화제 또는 세포독성제이다.
특정 실시형태에서, 상기 그의 항원 결합 단편은 단일 사슬 가변 단편 (scFv). 또한, 제제에 접합된 본 명세서에서 제공되는 scFv를 포함하는 scFv 접합체가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 제제는 영상화제 또는 세포독성제이다.
또한, 상기 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 키메라 분자 및 접합체가 본 명세서에서 제공된다. 제공되는 임의의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 하나 이상을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR), 예를 들어 본 명세서에서 제공되는 임의의 scFv 또는 본 명세서에서 제공되는 scFv 접합체를 포함하는 CAR; 및/또는 MUC16과의 결합에 대해, 그와 함께 경쟁하는 항원-결합 도메인을 포함하는 CAR이 제공된다.
또한, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분이 본 명세서에서 제공된다. 제공되는 항체 및 그의 항원 결합 단편 중에는 중쇄 및/또는 그의 항원 결합 부분, 예를 들어 그의 VH 영역을 갖는 것이 존재하고; 또한, 이러한 중쇄 및 그의 항원 결합 부분이 제공된다. 일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 (a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1; (b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고; 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 (a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1; (b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고; 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 (a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1; (b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고; 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 101) (X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나 부재하고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이고, X35는 T, S, 또는 A임)의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 인간-유래 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 감마1, 감마2, 감마3 및 감마4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아이소타입을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 중쇄는 인간화된다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 중쇄는 설치류 중쇄의 인간화된 형태이다.
또한, 본 명세서에서 제공되는 항체 중쇄를 포함하고, 상기 항체 중쇄가 제제에 접합된 항체 중쇄 접합체가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 제제는 영상화제 또는 세포독성제이다.
제공되는 항체 및 그의 항원 결합 단편 중에는 경쇄 및/또는 그의 일부, 예를 들어 그의 VL 영역을 갖는 것이 있고; 또한, 이러한 경쇄 및 그의 항원 결합 부분이 제공된다. 일부 실시형태에서, 경쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 (a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호 106) (X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호 107)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호 108) (X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 경쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 (a) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호 112) (X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 113)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호 114) (X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
일부 실시형태에서, 경쇄 또는 그의 항원 결합 부분은 (a) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호 118) (X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1; (b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 119)을 포함하는 VL CDR2; 및 (c) 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호 120)을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, 선택적으로, 상기 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다.
병용 치료법의 구체적 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 제1 항체의 치료 유효량을 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1806을 포함하나, 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1800을 포함하지 않는 MUC16의 에피토프를 인식하고, 추가의 치료제는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1806을 포함하고, 또한 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1800을 포함하는 MUC16의 에피토프를 인식한다. 구체적 실시형태에서, 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) MUC16의 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; (ii) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여; 및 (iii) 제4 형태가 당화되어 있고, 제4 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 152인 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력에 의해 확인되고, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포, MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포 및 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 동일한 세포 유형의 것이고, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; 및 (ii) 제5 형태가 당화되어 있고, 제5 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 172인 MUC16의 제5 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여에 의해 확인되며, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 MUC16의 제5 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 동일한 유형의 세포이다.
병용 치료법의 구체적 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 치료 유효량을 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1806을 포함하나, 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1800을 포함하지 않는 MUC16의 에피토프를 인식하고, 추가의 치료제는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 치료 유효량이고, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1800을 포함하나, 서열 번호 150의 N-당화된 Asn1806을 포함하지 않는 MUC16의 에피토프를 인식한다. 구체적 실시형태에서, 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) MUC16의 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; (ii) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여; 및 (iii) 제4 형태가 당화되어 있고, 제4 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 152인 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력에 의해 확인되고, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포, MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포 및 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 동일한 세포 유형의 것이고, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; (ii) MUC16의 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; 및 (iii) 제4 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 152인 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여에 의해 확인되며, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포, MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포 및 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 동일한 세포 유형이다.
또한, 하나 이상의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드가 본 명세서에서 제공되며, 여기서 (i) 면역원성 당펩티드는 10 내지 60개의 아미노산 잔기, 10 내지 30개의 아미노산 잔기, 15 내지 25개의 아미노산 잔기, 15 내지 20개의 아미노산 잔기, 또는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이고, (ii) 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 탄수화물과 연결된다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 1, 2 또는 3개의 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는, 탄수화물과 연결된 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 탄수화물과 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 탄수화물은 N- 또는 O-연결된 탄수화물이다. 특정 실시형태에서, 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 또는 오당류이다. 특정 실시형태에서, 탄수화물은 이당류이다. 특정 실시형태에서, 이당류는 키토비오스이다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드의 N 말단은 아세틸화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당펩티드의 N 말단은 N-메틸카르복사미드 유도체의 형태이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 면역원성 담체 단백질에 접합된다. 특정 실시형태에서, 상기 면역원성 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌이다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 키토비오스와 연결된 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스와 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스와 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15개의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 키토비오스와 연결된 당화 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 150의 아미노산 서열의 적어도 10개의 아미노산 부분을 포함하고, 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 상기 아미노산 서열의 상기 부분에 존재한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는, 키토비오스와 연결된 서열 번호 129의 제30 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는, Man3GlcNAc2 모이어티와 연결된 서열 번호 129의 제30 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스와 연결된 서열 번호 130의 제4 잔기 (Asn) 및 제10 잔기 (Asn)에서 2개의 당화 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는, 키토비오스와 연결된 서열 번호 131의 제7 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다.
또한, 글리콜-단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하는 방법으로서, 하나 이상의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드에 의해 대상체를 면역화하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, (i) 면역원성 당펩티드는 10 내지 60개의 아미노산 잔기, 10 내지 30개의 아미노산 잔기, 15 내지 25개의 아미노산 잔기, 15 내지 20개의 아미노산 잔기, 또는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이고, (ii) 면역원성 당펩티드는 상기 당단백질의 아미노산 서열의 적어도 10개의 아미노산 부분을 포함하고, (iii) 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 탄수화물에 연결되며, (iv) 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 상기 아미노산 서열의 상기 부분에 존재한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 당단백질의 비당화된 형태와의 특이적 결합이 결여되어 있다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 염소, 양, 당나귀, 닭, 기니아 피그, 래트, 토끼 또는 마우스이다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 래트, 토끼, 또는 마우스이다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 마우스이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 1, 2 또는 3개의 당화 부위를 포함한다. 청구항 190-195 중 어느 하나의 방법에서, 면역원성 당펩티드는, 탄수화물과 연결된 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 탄수화물과 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 탄수화물은 N- 또는 O-연결된 탄수화물이다. 특정 실시형태에서, 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 또는 오당류이다. 특정 실시형태에서, 탄수화물은 이당류이다. 특정 실시형태에서, 이당류는 키토비오스이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드의 N 말단은 아세틸화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당펩티드의 N 말단은 N-메틸카르복사미드 유도체의 형태이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 면역원성 담체 단백질과 접합된다. 특정 실시형태에서, 상기 면역원성 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 키토비오스와 연결된 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스와 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스와 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15개의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 키토비오스와 연결된 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 당단백질은 서열 번호 150의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 키토비오스와 연결된 서열 번호 129의 제30 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 Man3GlcNAc2 모이어티와 연결된 서열 번호 129의 제30 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스와 연결된 서열 번호 130의 제4 잔기 (Asn) 및 제10 잔기 (Asn)에서 2개의 당화 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 키토비오스와 연결된 서열 번호 131의 제7 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다.
또한, MUC16과 면역특이적으로 결합하고, 본 명세서에 개시된 항체 (예를 들어, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6)의 VH, VL, VH CDR, 및/또는 VL CDR 서열을 갖는 항체 및 그의 항원 결합 단편뿐만 아니라, (예를 들어, 영상화제 또는 세포독성제에 대한) 그의 접합체가 본 명세서에서 제공된다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1a 내지 도 1i. MUC16 작제물. 도 1a: MUC16의 개략도. 도 1b: 상단: MUC16c344의 개략도. 하단: 절두된 MUC16c344 작제물의 직쇄형 표시. 제1 탠덤 반복부의 N 말단의 아미노산 서열은 서열 번호 155에 제시된 바와 같다. 제1 탠덤 반복부의 C 말단 아미노산 서열은 서열 번호 156에 제시된 바와 같다. 엑토도메인 (ectodomain)의 N 말단 아미노산 서열은 서열 번호 157에 제시된 바와 같다. 엑토도메인의 C 말단 아미노산 서열은 서열 번호 158에 제시된 바와 같다. 도 1c: 상단: MUC16c114의 개략도. 하단: MUC16c114의 직쇄형 표시. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 161에 제시된 바와 같다. 막관통체의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 세포질 테일의 아미노산 서열은 서열 번호 160에 제시된 바와 같다. 도 1d: 상단: MUC16c80의 개략도. 하단: MUC16c80의 직쇄형 표시. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 162에 제시된 바와 같다. 막관통체의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 세포질 테일의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 도 1e: 상단: MUC16c86의 개략도. 하단: MUC16c86의 직쇄형 표시. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 163에 제시된 바와 같다. 막관통 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 164에 제시된 바와 같다. 세포질 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 165이다. 도 1f: MUC16c114 -N123의 직쇄형 표시. 3(N→A) 변이된 엑토도메인 58 aa의 아미노산 서열은 서열 번호 166에 제시된 바와 같다. 막관통 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 세포질 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 160에 제시된 바와 같다. 도 1g, 도 1h 및 도 1i는 FACS 분석을 통해 4H11에 의해 검출된 세포의 퍼센트를 도시하며, 세포주는 표시된 MUC16 작제물을 발현한다.
도 2a 내지 도 2c. MUC16 형질감염체(transfectant)의 시험관내 성장 곡선. 도 2a는 3T3 세포에서 대조군 세포주 (phrGFP)와 비교하여, MUC16c114 및 MUC16c344 세포주의 시험관내 성장 곡선을 도시한다. 도 2b는 A2780 세포에서 대조군 세포주 (phrGFP)와 비교하여, MUC16c114 및 MUC16c344 세포주의 시험관내 성장 곡선을 도시한다. 도 2c는 3T3 세포에서 대조군 세포주 (phrGFP)와 비교하여, MUC16c114, MUC16c80 및 MUC16c86 세포주의 시험관내 성장 곡선을 도시한다.
도 3a 내지 도 3e. 3T3 세포에서의 MUC16의 효과. 도 3a는 60mm 접시에서 3T3 형질감염체의 연질 아가 (soft agar) 성장을 도시한다. 14일 후, 콜로니를 계수하여, 도식화하였다. 표에 나타낸 데이터는 phrGFP 대조군 벡터를 발현하는 세포의 연질 아가 성장과 비교한 세 가지 유사한 실험 중 하나 (*** p <0.0001)를 도시한다. 도 3b는 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114 또는 MUC16c344 카르복시 말단 작제물에 의한 안정적 형질감염 후, 3T3 세포주의 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였고, 수작업으로 계수하였다. MUC16c114 및 MUC16c344 세포주 둘 모두는 phrGFP 벡터 대조군을 발현하는 세포의 침입과 비교하여, 유의하게 침입적이었고 (*** p <0.0001), MUC16c344 세포주에 의한 결과는 MUC16c114 세포주에 의한 결과와 유의하게 상이하였다 (# p=0.0354). 도 3c는 MUC16c114 및 MUC16c344 발현에 의해 유도된 전이 및 침입 유전자의 발현을 도시한다. 80개의 침입/전이 유전자 전사체의 슈퍼어레이 패널을 MUC16-작제물-양성 및 벡터만의 세포주에서 조사하였다. 3T3 MUC16c114 또는 3T3-MUC16c344 세포주에서, 선택된 주화성, 부착 및 침입 전사체를 측정하였다 (세 개의 삼중치 각각을 이중으로 조사하고, 카이 제곱 분석 (chi square testing)에 의해, phr 벡터만의 대조군과 비교하였음). 반복 측정치로 조정된 각 전사체의 p 값을 표로 나타내었다. 0.05 미만의 p 수준에서 변화된 모든 유전자가 포함된다. 도 3d: 형질감염된 3T3 세포를 벡터만의 대조군에 비교하여, ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. phr 벡터의 발현과 비교하여, MUC16c114 및 MUC16c344 작제물의 발현 후, ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화가 증가하였다. 두 경로 모두의 활성화가 각 세포주에서 나타났다. B-액틴 정규화된 덴시토미트리 정량화 값 (B-actin normalized densitometry quantification value)은 도면에서 각각의 웨스턴 블롯 아래에 나타내었다. 도 3e는 흉선 제거 누드 마우스 (athymic nude mouse)의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 15 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 MUC16-작제물-양성 종양을 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다 (phrGFP 대조군 벡터를 발현하는 세포와 비교하여, 두 세포주 모두 p<0.0001임).
도 4a 내지 도 4c. MUC16 단편의 발암성. 도 4a는 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16 카르복시 말단 발현 벡터, MUC16c114 또는 MUC16c344로 형질감염된 A2780 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 결과를 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114를 발현하는 벡터의 매트리겔 침입과 비교하였다. MUC16c114 또는 MUC16c34 세포주는 phrGFP 벡터 대조군과 비교하여 유의한 매트리겔 침입을 나타내었고, MUC16c344 세포주에 의한 결과는 MUC16c114 세포주에 의한 결과와 유의하게 상이하였다 (##p=0.0018). 도 4b는 ERK/AKT 신호전달에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. A2780 세포를 ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화는 각각의 MUC16 발현 작제물의 발현 후에 증가하였다. 두 경로 모두 각 세포주에서 활성화되었다. β-액틴 정규화된 덴시토미트리 정량화 값은 도면에서 각각의 웨스턴 블롯 아래에 나타내었다. 도 4c는 흉선 제거 누드 마우스의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 15 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 도면에 나타낸 바와 같이, MUC16c114- 또는 MUC16c344-양성 종양 중 어느 하나를 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다.
도 5a 내지 도 5d: 절두된 MUC16c114 변이체의 효과. 도 5a: 연질 아가 성장. 섹션 6.1.2에 개시된 바와 같이, MUC16c114의 내부 또는 외부 도메인 부분을 발현하는 3T3 형질감염체를 연질 아가 상에 층층이 배치하였다. 콜로니를 계수하여, 도식화하였다. 나타낸 데이터는 세 가지 실험 중 하나를 표시한다. MUC16c80 및 MUC16c86에 대한 연질 아가 성장 속도는 MUC16c114의 성장 속도와 비교하여 유의하게 상이하였으나 (각각, # p=0.0111 및 ## p=0.0258), MUC1680 형질감염체의 성장 속도를 MUC16c86 형질감염체의 성장 속도와 비교하는 경우, 높은 수준의 유의성이 나타났다 (### p<0.0001). 도 5b는 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16 카르복시 말단 작제물로 형질감염된 3T3 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. MUC16c80 형질감염 세포의 침입은 MUC16c114 세포주의 침입과 비교하여, 유의하였다 (# p=0.0172). 도 5c는 ERK/AKT 신호전달에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. 형질감염된 3T3 세포를 ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화는 MUC16c114 후에 증가하였으나; 신호는 MUC16c80 또는 MUC16c86 작제물로 형질감염된 세포에서 더 낮았다. β-액틴 정규화된 덴시토미트리 정량화 값은 도면에서 각각의 웨스턴 블롯 아래에 나타내었다. 도 5D는 흉선 제거 누드 마우스의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 20 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 MUC16+ 종양을 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다. 3T3 MUC16c114 및 3T3 MUC16c86 형질감염체는 MUC16c80 형질감염체와 비교하여, 유의하게 상이하였다 (### p<0.0001).
도 6a 내지 도 6b. MUC16c114의 아미노산 서열 (아미노산 잔기 1777 내지 1890 (서열 번호 133), 도 6a) 및 MUC16c344의 아미노산 서열 (아미노산 잔기 1547 내지 1890 (서열 번호 132), 도 6b). N- 및 O-당화 부위는 밝게 표시되고, 막관통 도메인 (아미노산 잔기 1835 내지 1859)은 밑줄이 그어져 있으며, "막관통 도메인"으로 표시되어 있다. 아미노산 잔기 1857 내지 1884는 MUC16c86 작제물에 존재하는 28개의 아미노산의 내부 도메인 결실을 표시한다 (도 1 참조). 아미노산 잔기 1798 내지 1831은 MUC16c80 작제물에 존재하는 34개의 아미노산의 엑토도메인 결실을 표시한다 (도 1 참조).
도 7a 내지 도 7h. MUC16 형질감염에 대한 N-당화의 효과. 도 7a는 phrGFP 대조군 벡터, 또는 MUC16c114 또는 MUC16c114 -N123 및 0.1 μg/mL 투니카마이신으로 처리된 MUC16c114에 의해 형질감염된 3T3 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. MUC16c114 세포주에 의한 결과는 phrGFP 벡터 대조군 세포주에 의한 결과와 유의하게 상이하였다 (### p<0.0001). MUC16c114 -N123 세포주에 의한 결과는 phrGFP 벡터 대조군 세포주에 의한 결과와 비교하여, 유의하게 상이하였다 (** p=0.007). N-당화 억제제 투니카마이신에 의한 처리는 비처리된 MUC16c114와 비교하여, 매트리겔 침입을 유의하게 억제하였다 (p=0.004). 도 7b는 phrGFP 대조군 벡터와 비교하여, 3T3 형질감염된 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. MUC16c114로 형질감염된 3T3 세포를 도 8에 상술된 바와 같이, 배지 단독으로 처리하거나, 5 μg/mL의 대조군 pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질, 또는 5 μg/mL의 MUC16c57 -c114-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질 또는 5 μg/mL의 117- 244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질로 처리하였다. MUC16c114 세포주는 phrGFP 벡터 대조군을 발현하는 대조군 3T3 세포보다 훨신 더 침입적이었으며 (*** p<0.0001), 이는 pFUSE 벡터 단독의 단백질에 대한 노출에 의해 영향을 받지 않았다. 반대로, MUC16c57 -c114-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질 또는 117- 244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질로 처리된 MUC16c114 세포주는 MUC16c114 대조군 세포와 비교하여, 매트리겔 침입의 유의한 억제를 나타내었다. 도 7c는 ERK/AKT 신호전달에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. 형질감염된 3T3 세포를 또한 ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화는 MUC16c114로 형질감염된 3T3에서 증가하였으나; 그 효과는 MUC16c114 -N123 벡터로 형질감염된 3T3 세포에서 감소하였다 ("MUC16c114-N123" 및 "MUC163(N-->A )c114"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨). 3 아스파라긴의 알라닌으로의 변이에도 불구하고, 항-MUC16 항체 (4H11 mAb)의 웨스턴 블롯은 phrGFP 벡터 대조군 또는 천연 MUC16c114-형질감염된 세포보다 더 높은 신호를 나타내었으며, 이는, 높은 수준의 MUC163(N-->A )c114 단백질이 형질감염된 3T3 세포에서 발현됨을 시사한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "4H11"은 문헌 [Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72] 및 국제 특허 출원 공개 WO 2011/119979에서, 4H11로 명명된 단일클론 항-MUC16 항체를 지칭한다. 도 7d는 흉선 제거 누드 마우스의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 20 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 MUC16c114 종양을 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다 (p<0.0001). 3T3-MUC16c114 형질감염체에 의한 결과는 phrGFP 대조군 벡터 세포주에 의한 결과와 비교하여, 매우 유의하였다 (*** p<0.0001). 그러나, MUC16c114 -N123 3T3 형질감염체는 phrGFP 벡터 대조군 3T3 세포 이상의 유의성을 나타내지 않았으며, 이는, N-당화의 변이가 종양 성장 및 침입을 급격하게 저하시켰음을 시사한다. 도 7e는 MUC16c57-114-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 직쇄형 표시를 도시한다. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 161에 제시된 바와 같다. 도 7f는 지정된 항체에 의해 결정된 MUC16c57 -114-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 단백질 수준을 도시한다. 도 7g는 117-244LGALS3-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 직쇄형 표시를 도시한다. 당 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 167에 제시된 바와 같다. 도 7h는 지정된 항체에 의해 결정된 17- 244LGALS3-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 단백질 수준을 도시한다.
도 8. 가짜 수용체 (sham receptor)로서, 작제물 MUC16c57 - c114pFUSE에 대한 pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터 내로 삽입된 엑토도메인-MUC16c57 ->c114 (서열 번호 161; MUC16의 아미노산 잔기 1777 내지 1834) 아미노산 서열 및 117- 244LGALS3pFUSE 벡터를 생성하는 것으로서, pFUSE-hIgG1-Fc2 내로 삽입되는 117- 244LGALS3 아미노산 서열 (서열 번호 167)의 서열.
도 9a 내지 도 9e. MUC16c354 트랜스제닉 마우스. 도 9a는 MUC16c354 조건부 작제물에 대한 전략을 도시한다. CMV 초기 인핸서에 더한 닭의 β 액틴 프로모터 (CAG)를 2개의 loxP 및 하류의 MUC16c354 서열 사이의 hrGFP의 전사를 유도하는데 사용하였다. 도 9b: 서던 블롯은 미량 주사 절차 후, 99마리의 동물 중 MUC16c354 양성 시조 (founder)의 12개의 후보를 나타낸다. 도 9c: 항-MUC16 항체 4H11에 의한 웨스턴 블롯을 MUC16c354 마우스 콜로니 생성을 위한 시조 9 (약 50개의 카피) 및 36 (약 10개의 카피)을 확인하는데 사용하였으며; A5는 MUC16c354에 의한 안정한 형질감염 SKOV3의 양성 대조군이다. 도 9d: 이중 MUC16c354:p53+/-트랜스제닉 마우스로부터의 종양의 조직학적 분석. 다중 육종 및 림프종을 이중 MUC16c354:p53+/- 트랜스제닉 마우스에서 확인하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)에 의해 염색하였다. 종양은 자궁 내 조직 육종 (I, 스케일 바:100 μm), 간 (II, 스케일 바:50μm), 난소 (III, 스케일 바:50 μm) 및 골수 (IV, 스케일 바:50 μm)뿐만 아니라, 난소의 림프종 (V, 스케일 바:50 μm), 신장 (VI, 스케일 바:50 μm), 및 폐 (VIII, 스케일 바:50μm)에 암종이 있는 폐 (VII, 스케일 바:50 μm)를 포함한다. 도 9e: 트랜스제닉 마우스 암 특이적 카플란-마이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier Survival Curve): MUC16c354 마우스는 야생형 (WT)과 유사하게, 최초 18개월 동안 자발적인 종양 생성을 나타내었다. 그러나, MUC16c354 마우스를 p53+/- 마우스와 교배시킨 경우, 이중 트랜스제닉 MUC16c354:p53+/- 마우스는 p53+/- 마우스 (p<0.014) 또는 MUC16c354 마우스와 비교하여, 자발적인 종양 생성으로 인해, 유의하게 악화된 총 생존을 나타내었다.
도 10. 12개월령의 수컷 및 암컷 MUC16c354 트랜스제닉 마우스로부터의 대표적인 조직의 조직학. 조직 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E, 스케일 바: 50μm)으로 염색하였다. 자궁내막 과형성 (hyperplasia)이 두 유전자형 모두에서 유사한 발생률 및 중증도로 관찰되었다 (여기서는 트랜스제닉 동물에서만 나타남). 트랜스제닉 동물 (Tg)의 난소, 폐, 결장 및 간은 모 세포주 (야생형, WT)와 유사하였다.
도 11a 내지 도 11c. 인간 난소암에서 MUC16의 영향. 도 11a는 MUC16 전사체 수를 도시한다. 도 11b: 확인된 MUC16 변이를 갖는 18명의 환자와 조합한 최고 MUC16 발현을 갖는 환자의 5분위수는 카플란-마이어 분석에서, 더 낮은 MUC16 발현을 갖는 환자와 비교하여, 유의하게 (p=0.02117) 악화된 생존을 갖는다. 도 11c는 난소암에서 MUC16 유전자 변형과 PI3K 변이 사례의 관계를 도시한다.
도 12a 내지 도 12c. MUC16 매트리겔 침입을 위한 당화 필요조건. 도 12a는 SKOV3 형질감염된 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. phrGFP는 대조군 벡터를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114는 MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. N3은 MUC16c114 -N3을 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. N1-2는 MUC16c114-N12를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. N1-2-3은 MUC16c114 -N123을 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114-shControl은 MUC16c114 및 대조군 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. phrGFP shRNA MGAT 집단 #4는 대조군 벡터 및 MGAT5에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. phrGFP shRNA LGALS3 집단 #15는 대조군 벡터 및 LGALS3에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114-shMGAT5는 MUC16c114 및 MGAT5에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114-shLGALS3은 MUC16c114 및 LGALS3에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. 도 12b는 대조군 벡터, phrGFP 또는 지정된 MUC16c114 작제물을 발현하는 3T3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 도 12c는 지정된 작제물을 발현하는 SKOV3 세포가 이식된 흉선 제거 누드 마우스에서 종양 부피에 의해 결정된 바와 같은 종양 성장을 도시한다.
도 13a 내지 도 13d. MUC16 당화 패턴 및 펩티드. 도 13a는 MUC16c114 -N12를 발현하는 SKOV3 세포의 N-연결된 프로파일을 도시한다. 삼각형은 푸코오스 (fucose)를 표시한다. 사각형은 N-아세틸글루코사민을 표시한다. 회색 원은 만노스를 표시한다. 백색 원은 갈락토스를 표시한다. 마름모는 N-아세틸뉴라민산을 표시한다. 도 13b는 55-머 (서열 번호 129) 면역원을 도시한다. 도 13c는 15-머 (서열 번호 131) 면역원을 도시한다. 도 13d는 18-머 (서열 번호 130) 면역원을 도시한다.
도 14는 면역원 및 스크리닝 항원 표적으로 사용되는 15-머 및 18-머 둘 모두에 대한 당화 항원 및 비당화 항원을 갖는 MUC16 당화 항체를 포함하는 생물반응성 상청액의 상대적인 반응성에 대한 상세한 ELISA 분석을 제공한다.
도 15a 내지 도 15b. MUC16 당화 항체는 매트리겔 침입을 억제한다. 도 15a는 MUC16 당화 항체의 생성으로부터의 생물반응성 상청액의 존재 또는 부재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 라인은 상대수 200에 대한 참조 라인이다. 도 15b는 정제된 MUC16 당화 항체의 존재 또는 부재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 라인은 상대수 90에 대한 참조 라인이다.
도 16a 내지 도 16e. MUC16 당화 항체는 매트리겔 침입을 억제한다. 도 16a는 (i) 대조군 항체; (ii) 4H11; 또는 (iii) MUC16 당화 항체 클론 10C6.E4의 존재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 지정된 MUC16c114 작제물을 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 도 16b는 (i) 대조군 항체; (ii) 4H11; 또는 (iii) MUC16 당화 항체 클론 10C6.E4의 존재하에 4H11을 사용한 제3 FAC 분류 (sort) 후의 phrGFP 대조군 벡터 또는 지정된 MUC16c114 작제물을 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 도 16c는 (i) 대조군 항체; (ii) 4H11; 또는 (iii) MUC16 당화 항체 클론 10C6.E4의 존재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 지정된 MUC16c344 작제물을 발현하는 3T3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 도 16d는 MUC16c344를 발현하는 SKOV3 세포를 이식하고, 모의 처리하거나 (MUC16c344), MUC16 당화 항체 10C6.E4(MUC16c344 +10C6.E4)로 처리한 흉선 제거 누드 마우스에서의 종양 성장을 종양 부피로 나타낸 바와 같이 도시한다. 화살표는, 100 μg의 MUC16 당화 항체가 투여된 날을 나타낸다. 도 16e는 지정된 항체에 의한 인간 난소 종양 샘플의 염색을 도시한다.
도 17은 표지된 MUC16 당화 항체가 지정된 온도 및 시점에서 내재화된 세포의 백분율을 도시한다.
도 18a는 MUC16 형질감염체에 대한 시험관내 성장 곡선을 도시한다. 96 웰 평평 바닥 플레이트에서 1000개의 SKOV3 세포/웰을 phrGFP 벡터 대조군, MUC16c114 (서열 번호 133)을 발현하는 phrGFP 벡터, 또는 MUC16c344를 발현하는 phrGFP 벡터와 함께 배양하고, 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 매일, 플레이트를 Alamar Blue로 염색하고, 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 CytoFluor 형광 플레이트 판독기에서 판독하였다. 곡선들 사이에는 통계적 차이가 나타나지 않았다. 도 18b는 SKOV3 phrGFP 세포, SKOV3 MUC16c114-GFP 세포, 또는 SKOV3-MUC16c344-GFP 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 결과는 침입적 세포의 상대수로 표현된다. c114 및 c344는 phrGFP와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 도 18c는 흉선 제거 암컷 누드 마우스에서 SKOV3 형질감염체 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 10 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 phrGFP 종양과 비교하여, MUC16c344 종양 (p<0.0001) 및 MUC16c114 종양 (p=0.002)을 보유하는 마우스에서 통계적으로 유의하게 더 컸다. 도 18a 내지 도18c의 약어: "SKOV3 phrGFP" 및 "phrGFP"는 대조군 phrGFP 벡터를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭하고; "SKOV3 MUC16c114-GFP" 및 "c114"는 MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭하며; "SKOV3 MUC16c344-GFP" 및 "c344"는 MUC16c344 (서열 번호 132)를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다.
도 19a 내지 도 19f는 SKOV3 난소암 세포에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. 도 19a는 하기와 같이 처리되거나, 처리되지 않은 MUC16c114 (서열 번호 133; "c114")를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 대조군 phrGFP 대조군 벡터 ("phrGFP")를 발현하는 SKOV3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다: (1) 5 μg/mL 투니카마이신; (2) 5 μg/mL의 대조군 pFUSE 단백질; (3) 5 μg/mL의 MUC16c57 -114-pFUSE 융합 단백질; 또는 (4) 5 μg/mL의 117- 244LGALS3-pFUSE 융합 단백질. 결과는 처리 48시간 후의 침입적 세포의 수로 표현된다. c114 세포는 phrGFP 세포보다 더 침입적이었다 (p <0.0001). c114 세포의 침입성은 pFUSE 벡터만의 단백질에 의한 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 투니카마이신 (N-당화 억제제)에 의한 처리는 c114 세포의 침입성을 저하시켰다. MUC16c57 -114-pFUSE 융합 단백질 또는 117- 244LGALS3-pFUSE에 의한 처리는 c114 세포의 침입성을 저하시켰다 (p <0.0001). 도 19b는 lamelli 대조군 shRNA, MGAT5-특이적 shRNA, 또는 LGALS3-특이적 shRNA의 존재 또는 부재하에 MUC16c114 (서열 번호 133) ("c114")를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 벡터 대조군 ("phrGFP")에 의해 형질감염된 SKOV3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. MGAT5-특이적 shRNA 또는 LGALS3-특이적 shRNA로 처리된 c114 세포는 shRNA로 처리된 phrGFP 세포와 비교하여 침입을 저하시켰다. 대조 shRNA는 c114 세포 침입에 영향을 주지 않는다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 도 19c는 SKOV3-MUC16c114 매트리겔 침입의 당화 의존성을 도시한다. SKOV3 세포를 하기의 MUC16 변이를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 대조군 벡터로 형질감염시켰다: c114 (서열 번호 133), N1 mut c114 (서열 번호 151), N24 muc c114 (서열 번호 152), N30 mut c114 (서열 번호 139), N1-N24 mut c114 (서열 번호 153), N1-N24-N30 mut c114 (서열 번호 154). c114-발현 세포는 대조군 phrGFP 세포와 비교하는 경우, 증가된 침입을 나타내었다. c114-발현 세포의 증가된 침입성은 MUC16c114 (서열 번호 133)의 아미노산 위치 24 및 30에서의 아스파라긴의 N-당화에 의존적이었다. N24와 N30 부위 둘 모두가 중요하지만, 이러한 효과에서, N30 부위가 N24 부위보다 더 중요하다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 결과는 phrGFP 벡터 대조군과 비교한 %로 표현된다. 도 19d는 SKOV3-MUC16c344 매트리겔 침입의 당화 의존성을 도시한다. SKOV3 세포를 하기의 MUC16 변이를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 대조군 벡터로 형질감염시켰다: c344 (서열 번호 132), N24 mut c344 (서열 번호 173), N30 mut c344 (서열 번호 174), 또는 N24-N30 mut c344 (서열 번호 175). c344-발현 세포는 대조군 phrGFP 세포와 비교하는 경우, 증가된 침입을 나타내었다. c344-발현 세포의 증가된 침입성은 MUC16c114 (서열 번호 133)의 아미노산 위치 24 및 30에서의 아스파라긴의 N-당화에 의존적이었다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 도 19e는 선택된 신호전달 경로에 대한 MUC16-발현의 효과를 도시한다. MUC16c114 (서열 번호 133)로 형질감염된 SKOV3 세포를 대조군 shRNA ("shLamelli") 또는 MGAT5 ("shMGAT5") 또는 LGALS3 ("shLGALLS3")에 대한 shRNA로 처리하거나, 처리하지 않고, phrGFP 벡터 대조군 ("phrGFP") 또는 MUC16c114 - N30mut (서열 번호 139) ("N30 mut")를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포와 비교하고, 상기 세포를 pAKT, pERK1/2, pSRC 및 pEGF 수용체 (pEGFR) 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. AKT (S473) 및 ERK1/2 (pT202/Y204)의 인산화가 MUC16c114 세포에서 증가하였다. MGAT5 (shMGAT5)의 녹다운, 갈렉틴-3 (Galectin-3) (shLGALLS3)의 녹다운 및 N30A 변이는 각각 SKOV3 세포주에서 MUC16c114-유도된 온코진(oncogene) 활성화를 감소시켰다. 도 19f는 흉선 제거 암컷 누드 마우스에서, SKOV3 형질감염체 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 (하기에서 개시됨) 세포를 각각의 조건에서 10 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. c114 종양 세포의 생체내 성장은 훨씬 더 적극적이었다 (p<0.0001). N1-N24-N30-mut c114, c114-sh-MGAT5 및 c114-sh-LGALS3 종양 세포는 phrGFP 종양 세포와 비교하여, 성장 증강을 나타내지 않았다. 종양 세포의 설명: "phrGFP"는 phrGFP 벡터 대조군으로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "c114"는 MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "N1-N24-N30-mut c114"는 MUC16c114 -N1-N24-N30- mut (서열 번호 154)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "c114-sh-MGAT5"는 MGAT5에 대한 shRNA로 처리되고, MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "c114-sh-LGALS3"은 LGALS3에 대한 shRNA로 처리되고, MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭한다.
도 20a는 EGFR 표면 발현에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. SKOV3-phrGFP 및 SKOV3-MUC16c114 형질감염체를 24시간 동안 사이클로헥시미드 (CHX)의 처리의 존재 또는 부재하에 조사하였다. 기저 수준 및 CHX 처리 후 수준에서의 EGFR 및 MUC16 발현의 기하학적 평균 형광이 나타나 있다. SKOV3-phrGFP 샘플에서의 EGFR은 CHX 처리 24시간 후에 미처리 수준의 58%로 감소되었다. 이들 세포에서, 유의한 MUC16 발현은 존재하지 않았다. 반대로, SKOV3-MUC16c114 세포에서, EGFR의 기하학적 평균 형광이 대략 25% 증가하였고, CHX 노출 후에 대조군의 83%로 저하되었다. MUC16c114 평균 형광은 CHX에 의해 유의하게 감소되지 않았다. 도 20b는 총 세포성 EGFR의 웨스턴 블롯으로부터의 EGFR/β-액틴 비의 덴시토미트리 (densitometry)을 도시하고, CHX로 처리된 SKOV3-phrGFP 세포에서 시간 경과에 따라 EGFR의 꾸준한 손실이 있었음을 예시한다. 반대로, SKOV3-MUC16c114 세포에서의 EGFR의 총 수준은 유지되었으며, 이는 MUC16(-) 대조군 세포주 ("phrGFP (-)")와 비교하여, EGFR 안정화를 나타낸다. 도 20c는 대조군 세포 침입의 분획으로서 발현된 phrGFP 대조군 벡터 ("안정한 phrGFP"), SKOV3-MUC16c114 및 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 테트라사이클린-유도성 세포주에 의해 형질감염된 SKOV3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포의 테트라사이클린 유도는 안정한 SKOV3-MUC16c114 (SKOV3c114)와 유사한 침입적 표현형을 야기하였고, 비유도된 세포는 MUC16-phrGFP 대조군 세포에 매칭되었다. 매트리겔 침입에서의 이러한 MUC16-유도된 증가는 EGFR에 전적으로 의존적이었다. 그러나, EGFR (shEGFR)의 헤어핀 RNA 녹다운이 SKOV3 세포 내로 도입되는 경우, MUC16 (웨스턴 블롯에서의 4H11 양성 단백질)의 테트라사이클린 유도된 발현은 매트리겔 침입을 증가시키지 않았다. 각 분석은 삼중으로 수행되었으며, 수작업으로 계수하였다. 도 20d: MUC16c114(+) 및 MUC16c114(-) 세포에서의 EGFR 안정성. 24시간 동안 CHX로 처리하고, 총 세포성 EGFR에 대해 프로빙한 테트라사이클린-유도되거나, 비유도된 SKOV3-MUC16c114(tet) 세포주의 세포 추출물을 덴시토미트리 비로서 표현하고, β-액틴으로 정규화한다. 테트라사이클린-유도된 SKOV3-MUC16c114 세포에서의 EGFR 감소의 기울기를 MUC16c114(-) 세포주와 비교하여, MUC16c114 발현의 EGFR 안정화 효과를 반복검증한다. 결과는 도 20b에 나타낸 안정한 형질감염의 효과와 유사하다.
도 21은 24시간 동안 사이클로헥시미드로 처리된 테트라사이클린-유도되거나, 비유도된 SKOV3c114 세포주 (각각 "Tet-유도된 MUC16c114" 및 "유도된 MUC16c114")의 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석의 덴시토미트리을 도시한다. 웨스턴 블롯을 pEGFR 및 단백질 수준에 대해 프로빙하고, β-액틴 수준으로 정규화하였다. 테트라사이클린-유도된 SKOV3c114 pEGFR 신호의 기울기는 비유도된 SKOV3c114 세포주와 비교하여, 안정한 pEGFR을 나타내었다.
도 22a 내지 도 22c는 MUC16 엑토도메인 N-당화된 종의 확인 및 화학적 합성을 도시한다. 도 22a: N1-N24 변이된 MUC16c114 (서열 번호 서열 번호 153)를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포의 N-글리칸 프로파일링. 글리칸은 조지아 대학의 복합 탄수화물 연구 센터 (Complex Carbohydrate Research Center)에서 총 이온 매핑을 통해 검출 및 특성화되었다. 삼각형: 푸코오스; 사각형: N-아세틸 글루코사민; 어둡게 채색된 원: 만노스; 밝게 채색된 원: 갈락토스; 마름모: N-아세틸뉴라민산. 도 22b는 N30 위치에서 단일 키토비오스 (GlcNAc2) 글리칸을 갖는 55-머 MUC16 항원의 도식적 구조를 도시한다. 이러한 N-당펩티드 항원을 항체의 형성을 위해, 마우스를 면역화하는데 사용하였다. 아미노산 서열은 서열 번호 129에 제시되어 있다. 사각형은 N-아세틸글루코사민을 표시하고; 원은 만노스를 표시한다. 도 22c는 N30 위치에서 키토비오스에 의해 모노당화된 KLH-접합된 15-머 MUC16 항원 및 각각 N24 및 N30 위치에서 2개의 키토비오스 단위에 의해 bis-당화된 KLH-접합된 18-머 MUC16 항원의 도식적 구조를 도시한다. 후속하여, 이들 N-당펩티드-KLH 작제물을 MUC16 엑토도메인 내의 GlcNAc2-펩티드 에피토프에 대한 단일클론 항체의 형성을 위해, 마우스를 면역화하는데 사용하였다. 4H11 단일클론 항체를 유도하기 위한 MUC16-비관련된 당펩티드 및 비당화된 MUC16 펩티드 2의 서열이 또한 포함되어 있다. KLH-15-머(키토비오스)[C-G25-V38]의 아미노산 서열은 서열 번호 131에 제시된 바와 같다. KLH-18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]의 아미노산 서열은 서열 번호 130에 제시된 바와 같다. MUC16 비당화된 펩티드2의 아미노산 서열은 서열 번호 168에 제시된 바와 같다. MUC16 비관련된 펩티드 18-머 및 MUC16 비관련된 펩티드 18-머 + GlcNAc2의 아미노산 서열은 서열 번호 169에 제시된 바와 같다. 사각형은 N-아세틸글루코사민을 표시한다.
도 23a 내지 도 23h는 MUC16 당화 항체 특성화를 도시한다. 도 23a는 샌드위치 ELISA에 의한 다양한 MUC16 및 GlcNAc2-당화된 펩티드에 대한 4H11 및 4개의 리드 GlcNAc2-MUC16-엑토도메인 단일클론 항체 (MUC16 당화 항체)의 반응성을 도시한다. 비당화된 MUC16 펩티드 2 (서열 번호 168), 또는 비관련된 펩티드 (서열 번호 169) 중 어느 하나와의 글리칸-MUC16 엑토도메인 교차 반응성은 나타나지 않았다. 유사하게, 4H11은 본질적으로 GlcNAc2-MUC16 15-머 (서열 번호 131) 또는 (GlcNAc2)2-18-머 (서열 번호 130) N-당펩티드에 대한 친화도를 갖지 않았다. 사각형은 N-아세틸글루소아민 (N-acetylglusoamin)을 표시하고; 삼각형은 프코오스를 표시하며; 원은 만노스를 표시한다. 도 23b, 도 23c 및 도 23d는 MUC16-증강된 매트리겔 침입에 대한 MUC16 당화 항체의 효과를 도시한다. 결과는 대조군과 비교한 %로서 표현된다. 5 μg/mL에서의 (대조군) 정제된 4H11 또는 4개의 글리칸-MUC16-엑토도메인 항체 18C6, 10C6, 19C22, 또는 7B12의 존재 또는 부재하에, MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포 (도 23B), CAOV3 세포 (도 23C) 및 OVCA-433 세포 (도 23D)의 매트리겔 분석. 4개의 항-글리칸-MUC16-엑토도메인 항체 (MUC16 당화 항체) 각각은 세 가지의 상이한 MUC16(+) 난소암 세포주 (CAOV3 및 OVCA-433)의 침입을 억제하였으나, 4H11은 SKOV3-MUC16c114 세포의 침입의 억제에 대한 효과를 거의 갖지 않았다. 도 23e는 MUC16 당화 항체 단일클론 항체 ("MAB") 10C6에 의한 EGFR 안정화의 억제를 도시한다. CHX로 처리된 후, 지정된 시간 (hr) 동안 총 EGFR에 대해 프로빙된 테트라사이클린-유도된 SKOV3-MUC16c114 ( tet ), 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6-처리된, 테트라사이클린-유도된 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 또는 비유도된 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포주의 세포 추출물로부터의 웨스턴 블롯 분석의 덴시토미트리. 도 20a에 나타낸 바와 같이, 덴시토미트리 곡선의 기울기는 세포 표면 상의 MUC16c114의 존재가 EGFR을 안정화시켰다는 것을 나타낸다. MUC16 당화 항체 10C6은 총 EGFR 단백질의 MUC16c114 안정화를 폐기하여, 이를 MUC16(-) 비유도된 대조군과 유사하게 한다. 도 23f는 4H11, OC125 (상업용), 또는 단일클론 MUC16 당화 항체 (10C6 및 19C11)에 의해 염색된 인간 난소 조직 마이크로어레이를 도시한다. 장액성 난소암에서의 MUC16의 발현은 OC125 및 4H11과 일치하며, 그와 중첩된다. 도 23g 및 도 23h는 흉선 제거 암컷 누드 마우스에서의 종양 성장에 대한 MUC16 당화 항체의 효과를 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포 (MUC16c344 (서열 번호 132; "c344")를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 벡터 ("phrGFP")에 의해 형질감염된 SKOV3 세포)를 20 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하였다. 10마리의 마우스를 4주 동안 주 2회 100 μg/마우스로 정제된 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6에 의해 0일부터 정맥내 처리하였다. 모든 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 도 23g에는 10 μg/mL의 정제된 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6의 존재 및 부재하에 수행된 동일한 세포에 의한 매트리겔 침입 분석이 나타나 있다. 도 23h는, 평균 종양 부피의 차이가 비처리된 MUC16c344 종양과 비교하여, MUC16c344 종양을 보유하는 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6-처리된 마우스에 의해, 유의하게 저하되었음 (p=0.0004)을 입증하며, 이는 종양 성장에 대한 MUC16의 효과에 대한 보호를 시사한다.
도 24a 내지 도24d는 갈렉틴-매개된 MUC16 단백질-단백질 상호작용을 도시한다. 도 24a는 세 가지의 당화된 단백질 (EGFR DDK-His; MUC16c57 -114-pFUSE; 및 LGALS3Myc-DDK)의 면역블롯 (IB) 및 면역침전 (IP)을 도시한다. MUC16c57 -114-pFUSE 당화된 단백질을 LGALS3 단백질 (0.13 μg) 및 EGFR (0.13 μg)과 조합시킨 후, 1시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 사전 블로킹된 단백질 A/G PLUS 아가로스 비드를 첨가하고, 4℃에서 밤새 회전시켰다. IP 펠릿을 다량으로 세척하고, 로딩 완충액 중에서 끓이고, 10% SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 나이트로셀룰로스 막 상으로 옮겼다. 상기 막을 항-EGFR-v3, 항-4H11-HRP, 또는 다클론 항-LGALS3 항체에 의해 프로빙하였다. 나타낸 바와 같이, 4H11 결합은 MUC16c57 -114-pFUSE가 일정하게 존재하였다는 것을 나타내었다. LGALS3은 MUC16c57 -114-pFUSE에 대해 양성인 레인에서 결합하였으나, EGFR은 LGALS3 및 MUC16c57 -114-pFUSE 둘 모두가 존재하는 경우에만, 검출되었다. 단일클론 MUC16 당화 항체 18C6의 존재는 이들 LGALS3, EGFR 및 MUC16 단백질 복합체의 형성을 억제하였다 (우측 레인). 도 24b는 MUC16 및 EGFR 단백질 공동-위치화를 도시한다. 야생형 OVCAR3 세포 또는 MUC16c344 (서열 번호 132; "SKOV3c344")를 발현하는 phrGFP 또는 MUC16c114 (서열 번호 133; "SKOV3c114")를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포의 MUC16에 대한 EGFR-A647 및 4H11-PE 또는 MUC16에 대한 시약 EGFR-A647 및 4H11-PE 둘 모두의 조합에 의한 면역형광 염색. 현미경 이미지 (50 μm 스케일)는 세 가지 세포주 모두에서 EGFR 및 MUC16c114의 공동-위치화를 나타내었다 (화살표 참조). 도 24c는 세 가지의 당화된 단백질 (인테그린 β1Myc-DDK; MUC16c57 -114-pFUSE 및 LGALS3Myc-DDK)의 면역블롯 (IB) 및 면역침전 (IP)을 도시한다. 대체적으로, 도 24a와 동일한 방법이 사용되었다. 면역블롯 및 면역침전된 모든 샘플의 웨스턴 블롯 분석은 10% SDS-PAGE 겔 상에서 구동시키고, 나이트로셀룰로스 막 상으로 옮겼으며, 인테그린 β1에 대한 항-4C5-DDK 또는 항-4H11-HRP 또는 항-4C5-DDK에 의해 LGALS3 항체에 대해 프로빙하였다. EGFR에 의한 경우와 같이, 인테그린 β1 단백질을 공동-침전시키기 위해, 세 가지 단백질이 모두 필요하였다. 3개의 우측 레인에 나타낸 바와 같이, MUC16 당화 항체 18C6은 또한 MUC16, LGALS3 및 인테그린 β1의 조합을 블로킹하였다. 도 24d는 MUC16 및 인테그린 β1 단백질 공동-위치화를 도시한다. 야생형 OVCAR3 세포 또는 MUC16c344 (서열 번호 132; "SKOV3c344")를 발현하는 phrGFP 또는 MUC16c114 (서열 번호 133; "SKOV3c114")를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포의 MUC16에 대한 인테그린 β1-A647 또는 4H11-PE 또는 MUC16에 대한 시약 인테그린 β1-A647 또는 4H11-PE 둘 모두의 조합에 의한 면역형광 염색. 현미경 이미지 (50 μm 스케일)는 OVCAR3, SKOV3c344 및 SKOV3c114 세포에서의 인테그린 β1 및 MUC16의 공동-위치화를 나타내었다 (화살표 참조).
도 25a는 야생형 OVCAR3 세포 또는 MUC16c344 (서열 번호 132; "SKOV3c344")를 발현하는 phrGFP 또는 MUC16c114 (서열 번호 133; "SKOV3c114")를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포 또는 SKOV3c344 또는 SKOV3c114 세포주의 MUC16에 대한 EGFR-A647 또는 4H11-PE 또는 두 시약 모두의 조합에 의한 면역형광 염색을 도시한다. 현미경 이미지 (스케일 100 μm)는 EGFR 및 MUC16의 공동-위치화를 명확하게 나타내었다 (화살표 참조). 도 25b: 야생형 OVCAR3 또는 SKOV3c344 또는 세포주의 MUC16에 대한 인테그린 β1-A647 또는 4H11-PE 또는 두 시약 모두의 조합에 의한 면역형광 염색. 현미경 이미지 (스케일 100 μm)는 인테그린 β1 및 MUC16의 공동-위치화를 명확하게 나타내었다 (화살표 참조).
도 26a 내지 도 26d는 MUC16 종양 촉진의 모델을 도시한다. 도 26a는 EGFR-LGALS3-MUC16 및 LGALS3-인테그린 β1-MUC16 관계의 예시이다. EGFR에 의한 SRC/ERK/AKT의 신호 변환 또는 인테그린 β1에 의한 SRC/FAK의 신호 변환은 LGALS3 오량체와의 MUC16 및 신호전달-분자 상호작용에 의존적이었다. 도 26b는 당화 손실에 대한 모델을 도시하였다: shMGAT5-형질감염된 세포주에서, MUC16, EGFR 및 인테그린 β1 상의 부위의 N-당화는 테트라-안테나 구조 (tetra-antennary structure)의 손실에 의해 감소되었으며, LGALS3과의 비결합을 야기하였다. 도 26c는 갈렉틴-3 손실에 대한 모델을 도시하였다: shLGALS3 형질감염된 세포주에서, MUC16 상에 N-당화 부위가 존재하였고, LGALS3의 결합의 부재는 MUC16/EGFR 또는 MUC16/인테그린 β1 연관의 손실 및 인사이드-아웃 신호 (inside-out signal)의 감소를 야기하였다. 도 26d는 MUC16/LGALS3 상호작용에 대한 잠재적 억제제의 모델을 도시한다. MUC16 당화 항체 또는 "더미" (dummy) 가짜 수용체 (항-MUC16c57 - 114pFUSE 또는 117-244LGALS3-pFUSE)에 노출된 MUC16(+) 세포는 LGALS3 겔과의 결합에 실패하였고, 후속하여, 또한 EGFR 또는 인테그린 β1과의 결합에 실패하였다.
도 27a는 측쇄 보호되고, N-아세틸화된 55-머 펩티드 아미드 (서열 번호 129)를 도시한다. 도 27b는 당펩티드 p55-머[N1-S55]에 대한 UPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C486H760N84O111S8에 대한 계산치, 9812.25 (평균 동위원소) [M+5H]5+ m/z 1963.45, 실측치 1963.20; [M+6H]6+ m/z 1636.38, 실측치 1636.24; [M+7H]7+ m/z 1402.75, 실측치 1402.74. BEH C4 컬럼, 구배: 0.3 mL/min의 유속에서 6분에 걸친 80-99% 아세토나이트릴/물.
도 28a는 키토비오스-보유 55-머 당펩티드인 "55-머(키토비오스)[N1-S55]" (GlcNAc2-55-머) (서열 번호 129)를 도시한다. 도 28b는 당펩티드 "55-머(키토비오스) [N1-S55]" (GlcNAc2-55-머)에 대한 UPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C291H463N87O97S에 대한 계산치, 6764.38 (평균 동위원소) [M+4H]4+ m/z 1692.10, 실측치 1692.01; [M+5H]5+ m/z 1353.88, 실측치 1353.86; [M+6H]6+ m/z 1128.40, 실측치 1128.41; [M+7H]7+ m/z 967.34, 실측치 967.45; [M+8H]8+ m/z 846.55, 실측치 846.27. BEH C4 컬럼, 구배: 0.3 mL/min의 유속에서 6분에 걸친 20-40% 아세토나이트릴/물.
도 29a는 Man3GlcNAc2-보유 55-머 당펩티드인 "55-머(Man3GlcNAc2)[N1-S55]" (Man3GlcNAc2-55-머) (서열 번호 129)를 도시한다. 도 29b는 당펩티드 "55-머(Man3GlcNAc2)[N1-S55]" (Man3GlcNAc2-55-머)에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C309H493N87O112S에 대한 계산치, 7250.80 (평균 동위원소) [M+4H]4+ m/z 1813.70, 실측치 1813.52; [M+5H]5+ m/z 1451.16, 실측치 1451.02; [M+6H]6+ m/z 1209.47, 실측치 1209.33; [M+7H]7+ m/z 1036.83, 실측치 1036.74. Waters X-Bridge C18 컬럼, 구배: 0.2 mL/min의 유속에서 30분에 걸친 25-35% 아세토나이트릴/물.
도 30a는 측쇄 보호된 15-머 펩티드 (p15-머[C-G25-V38]) (서열 번호 131)를 도시한다. 도 30b는 키토비오스-모노당화된 15-머 당펩티드인 15-머(키토비오스)[C-G25-V38] (GlcNAc2-15-머) (서열 번호 132)를 도시한다. 도 30c는 당펩티드 "15-머(키토비오스)[C-G25-V38]" (GlcNAc2-15-머)에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C87H142N24O35S에 대한 계산치, 2116.26 (평균 동위원소) [2M+3H]3+ m/z 1411.84, 실측치 1412.02; [M+2H]2+ m/z 1059.13, 실측치 1059.15; [M+3H]3+ m/z 706.42, 실측치 706.46. Varian Microsorb 300-5 C18 컬럼, 구배: 0.2 mL/min의 유속에서 30분에 걸친 15-30% 아세토나이트릴/물.
도 31a는 측쇄 보호된 18-머 펩티드 (p18-머[C-G22-V38]) (AF-I-165) (서열 번호 130)를 도시한다. 도 31b는 키토비오스-bis당화된 18-머 당펩티드인 "18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]" [(GlcNAc2)2-18-머] (서열 번호 130)를 도시한다. 도 31c는 당펩티드 "18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]" [(GlcNAc2)2-18-머]에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C117H193N33O50S에 대한 계산치, 2894.04 (평균 동위원소) [2M+3H]3+ m/z 1930.36, 실측치 1930.22; [M+2H]2+ m/z 1448.02, 실측치 1447.65; [M+3H]3+ m/z 965.68, 실측치 965.25. Varian Microsorb 300-5 C8 컬럼, 구배: 0.2 mL/min의 유속에서 30분에 걸친 15-30% 아세토나이트릴/물.
도 32a는 KLH (서열 번호 131)에 접합된 당펩티드 "15-머(키토비오스)[C-G25-V38]"을 도시한다. 도 32b는 KLH (서열 번호 130)에 접합된 당펩티드 "18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]"을 도시한다.
도 1a 내지 도 1i. MUC16 작제물. 도 1a: MUC16의 개략도. 도 1b: 상단: MUC16c344의 개략도. 하단: 절두된 MUC16c344 작제물의 직쇄형 표시. 제1 탠덤 반복부의 N 말단의 아미노산 서열은 서열 번호 155에 제시된 바와 같다. 제1 탠덤 반복부의 C 말단 아미노산 서열은 서열 번호 156에 제시된 바와 같다. 엑토도메인 (ectodomain)의 N 말단 아미노산 서열은 서열 번호 157에 제시된 바와 같다. 엑토도메인의 C 말단 아미노산 서열은 서열 번호 158에 제시된 바와 같다. 도 1c: 상단: MUC16c114의 개략도. 하단: MUC16c114의 직쇄형 표시. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 161에 제시된 바와 같다. 막관통체의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 세포질 테일의 아미노산 서열은 서열 번호 160에 제시된 바와 같다. 도 1d: 상단: MUC16c80의 개략도. 하단: MUC16c80의 직쇄형 표시. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 162에 제시된 바와 같다. 막관통체의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 세포질 테일의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 도 1e: 상단: MUC16c86의 개략도. 하단: MUC16c86의 직쇄형 표시. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 163에 제시된 바와 같다. 막관통 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 164에 제시된 바와 같다. 세포질 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 165이다. 도 1f: MUC16c114 -N123의 직쇄형 표시. 3(N→A) 변이된 엑토도메인 58 aa의 아미노산 서열은 서열 번호 166에 제시된 바와 같다. 막관통 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 159에 제시된 바와 같다. 세포질 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 160에 제시된 바와 같다. 도 1g, 도 1h 및 도 1i는 FACS 분석을 통해 4H11에 의해 검출된 세포의 퍼센트를 도시하며, 세포주는 표시된 MUC16 작제물을 발현한다.
도 2a 내지 도 2c. MUC16 형질감염체(transfectant)의 시험관내 성장 곡선. 도 2a는 3T3 세포에서 대조군 세포주 (phrGFP)와 비교하여, MUC16c114 및 MUC16c344 세포주의 시험관내 성장 곡선을 도시한다. 도 2b는 A2780 세포에서 대조군 세포주 (phrGFP)와 비교하여, MUC16c114 및 MUC16c344 세포주의 시험관내 성장 곡선을 도시한다. 도 2c는 3T3 세포에서 대조군 세포주 (phrGFP)와 비교하여, MUC16c114, MUC16c80 및 MUC16c86 세포주의 시험관내 성장 곡선을 도시한다.
도 3a 내지 도 3e. 3T3 세포에서의 MUC16의 효과. 도 3a는 60mm 접시에서 3T3 형질감염체의 연질 아가 (soft agar) 성장을 도시한다. 14일 후, 콜로니를 계수하여, 도식화하였다. 표에 나타낸 데이터는 phrGFP 대조군 벡터를 발현하는 세포의 연질 아가 성장과 비교한 세 가지 유사한 실험 중 하나 (*** p <0.0001)를 도시한다. 도 3b는 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114 또는 MUC16c344 카르복시 말단 작제물에 의한 안정적 형질감염 후, 3T3 세포주의 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였고, 수작업으로 계수하였다. MUC16c114 및 MUC16c344 세포주 둘 모두는 phrGFP 벡터 대조군을 발현하는 세포의 침입과 비교하여, 유의하게 침입적이었고 (*** p <0.0001), MUC16c344 세포주에 의한 결과는 MUC16c114 세포주에 의한 결과와 유의하게 상이하였다 (# p=0.0354). 도 3c는 MUC16c114 및 MUC16c344 발현에 의해 유도된 전이 및 침입 유전자의 발현을 도시한다. 80개의 침입/전이 유전자 전사체의 슈퍼어레이 패널을 MUC16-작제물-양성 및 벡터만의 세포주에서 조사하였다. 3T3 MUC16c114 또는 3T3-MUC16c344 세포주에서, 선택된 주화성, 부착 및 침입 전사체를 측정하였다 (세 개의 삼중치 각각을 이중으로 조사하고, 카이 제곱 분석 (chi square testing)에 의해, phr 벡터만의 대조군과 비교하였음). 반복 측정치로 조정된 각 전사체의 p 값을 표로 나타내었다. 0.05 미만의 p 수준에서 변화된 모든 유전자가 포함된다. 도 3d: 형질감염된 3T3 세포를 벡터만의 대조군에 비교하여, ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. phr 벡터의 발현과 비교하여, MUC16c114 및 MUC16c344 작제물의 발현 후, ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화가 증가하였다. 두 경로 모두의 활성화가 각 세포주에서 나타났다. B-액틴 정규화된 덴시토미트리 정량화 값 (B-actin normalized densitometry quantification value)은 도면에서 각각의 웨스턴 블롯 아래에 나타내었다. 도 3e는 흉선 제거 누드 마우스 (athymic nude mouse)의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 15 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 MUC16-작제물-양성 종양을 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다 (phrGFP 대조군 벡터를 발현하는 세포와 비교하여, 두 세포주 모두 p<0.0001임).
도 4a 내지 도 4c. MUC16 단편의 발암성. 도 4a는 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16 카르복시 말단 발현 벡터, MUC16c114 또는 MUC16c344로 형질감염된 A2780 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 결과를 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114를 발현하는 벡터의 매트리겔 침입과 비교하였다. MUC16c114 또는 MUC16c34 세포주는 phrGFP 벡터 대조군과 비교하여 유의한 매트리겔 침입을 나타내었고, MUC16c344 세포주에 의한 결과는 MUC16c114 세포주에 의한 결과와 유의하게 상이하였다 (##p=0.0018). 도 4b는 ERK/AKT 신호전달에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. A2780 세포를 ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화는 각각의 MUC16 발현 작제물의 발현 후에 증가하였다. 두 경로 모두 각 세포주에서 활성화되었다. β-액틴 정규화된 덴시토미트리 정량화 값은 도면에서 각각의 웨스턴 블롯 아래에 나타내었다. 도 4c는 흉선 제거 누드 마우스의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 15 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 도면에 나타낸 바와 같이, MUC16c114- 또는 MUC16c344-양성 종양 중 어느 하나를 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다.
도 5a 내지 도 5d: 절두된 MUC16c114 변이체의 효과. 도 5a: 연질 아가 성장. 섹션 6.1.2에 개시된 바와 같이, MUC16c114의 내부 또는 외부 도메인 부분을 발현하는 3T3 형질감염체를 연질 아가 상에 층층이 배치하였다. 콜로니를 계수하여, 도식화하였다. 나타낸 데이터는 세 가지 실험 중 하나를 표시한다. MUC16c80 및 MUC16c86에 대한 연질 아가 성장 속도는 MUC16c114의 성장 속도와 비교하여 유의하게 상이하였으나 (각각, # p=0.0111 및 ## p=0.0258), MUC1680 형질감염체의 성장 속도를 MUC16c86 형질감염체의 성장 속도와 비교하는 경우, 높은 수준의 유의성이 나타났다 (### p<0.0001). 도 5b는 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16 카르복시 말단 작제물로 형질감염된 3T3 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. MUC16c80 형질감염 세포의 침입은 MUC16c114 세포주의 침입과 비교하여, 유의하였다 (# p=0.0172). 도 5c는 ERK/AKT 신호전달에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. 형질감염된 3T3 세포를 ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화는 MUC16c114 후에 증가하였으나; 신호는 MUC16c80 또는 MUC16c86 작제물로 형질감염된 세포에서 더 낮았다. β-액틴 정규화된 덴시토미트리 정량화 값은 도면에서 각각의 웨스턴 블롯 아래에 나타내었다. 도 5D는 흉선 제거 누드 마우스의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 20 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 MUC16+ 종양을 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다. 3T3 MUC16c114 및 3T3 MUC16c86 형질감염체는 MUC16c80 형질감염체와 비교하여, 유의하게 상이하였다 (### p<0.0001).
도 6a 내지 도 6b. MUC16c114의 아미노산 서열 (아미노산 잔기 1777 내지 1890 (서열 번호 133), 도 6a) 및 MUC16c344의 아미노산 서열 (아미노산 잔기 1547 내지 1890 (서열 번호 132), 도 6b). N- 및 O-당화 부위는 밝게 표시되고, 막관통 도메인 (아미노산 잔기 1835 내지 1859)은 밑줄이 그어져 있으며, "막관통 도메인"으로 표시되어 있다. 아미노산 잔기 1857 내지 1884는 MUC16c86 작제물에 존재하는 28개의 아미노산의 내부 도메인 결실을 표시한다 (도 1 참조). 아미노산 잔기 1798 내지 1831은 MUC16c80 작제물에 존재하는 34개의 아미노산의 엑토도메인 결실을 표시한다 (도 1 참조).
도 7a 내지 도 7h. MUC16 형질감염에 대한 N-당화의 효과. 도 7a는 phrGFP 대조군 벡터, 또는 MUC16c114 또는 MUC16c114 -N123 및 0.1 μg/mL 투니카마이신으로 처리된 MUC16c114에 의해 형질감염된 3T3 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. MUC16c114 세포주에 의한 결과는 phrGFP 벡터 대조군 세포주에 의한 결과와 유의하게 상이하였다 (### p<0.0001). MUC16c114 -N123 세포주에 의한 결과는 phrGFP 벡터 대조군 세포주에 의한 결과와 비교하여, 유의하게 상이하였다 (** p=0.007). N-당화 억제제 투니카마이신에 의한 처리는 비처리된 MUC16c114와 비교하여, 매트리겔 침입을 유의하게 억제하였다 (p=0.004). 도 7b는 phrGFP 대조군 벡터와 비교하여, 3T3 형질감염된 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. MUC16c114로 형질감염된 3T3 세포를 도 8에 상술된 바와 같이, 배지 단독으로 처리하거나, 5 μg/mL의 대조군 pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질, 또는 5 μg/mL의 MUC16c57 -c114-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질 또는 5 μg/mL의 117- 244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질로 처리하였다. MUC16c114 세포주는 phrGFP 벡터 대조군을 발현하는 대조군 3T3 세포보다 훨신 더 침입적이었으며 (*** p<0.0001), 이는 pFUSE 벡터 단독의 단백질에 대한 노출에 의해 영향을 받지 않았다. 반대로, MUC16c57 -c114-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질 또는 117- 244LGALS3-pFUSE hIgG1-Fc2 융합 단백질로 처리된 MUC16c114 세포주는 MUC16c114 대조군 세포와 비교하여, 매트리겔 침입의 유의한 억제를 나타내었다. 도 7c는 ERK/AKT 신호전달에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. 형질감염된 3T3 세포를 또한 ERK/AKT 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. ERK1/2 (pT202/Y204) 및 AKT (S473)의 인산화는 MUC16c114로 형질감염된 3T3에서 증가하였으나; 그 효과는 MUC16c114 -N123 벡터로 형질감염된 3T3 세포에서 감소하였다 ("MUC16c114-N123" 및 "MUC163(N-->A )c114"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨). 3 아스파라긴의 알라닌으로의 변이에도 불구하고, 항-MUC16 항체 (4H11 mAb)의 웨스턴 블롯은 phrGFP 벡터 대조군 또는 천연 MUC16c114-형질감염된 세포보다 더 높은 신호를 나타내었으며, 이는, 높은 수준의 MUC163(N-->A )c114 단백질이 형질감염된 3T3 세포에서 발현됨을 시사한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "4H11"은 문헌 [Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72] 및 국제 특허 출원 공개 WO 2011/119979에서, 4H11로 명명된 단일클론 항-MUC16 항체를 지칭한다. 도 7d는 흉선 제거 누드 마우스의 MUC16-작제물-양성 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 20 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 MUC16c114 종양을 보유하는 마우스에서 유의하게 더 컸다 (p<0.0001). 3T3-MUC16c114 형질감염체에 의한 결과는 phrGFP 대조군 벡터 세포주에 의한 결과와 비교하여, 매우 유의하였다 (*** p<0.0001). 그러나, MUC16c114 -N123 3T3 형질감염체는 phrGFP 벡터 대조군 3T3 세포 이상의 유의성을 나타내지 않았으며, 이는, N-당화의 변이가 종양 성장 및 침입을 급격하게 저하시켰음을 시사한다. 도 7e는 MUC16c57-114-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 직쇄형 표시를 도시한다. 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 161에 제시된 바와 같다. 도 7f는 지정된 항체에 의해 결정된 MUC16c57 -114-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 단백질 수준을 도시한다. 도 7g는 117-244LGALS3-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 직쇄형 표시를 도시한다. 당 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 167에 제시된 바와 같다. 도 7h는 지정된 항체에 의해 결정된 17- 244LGALS3-pFUSE-인간-IgG1-Fc2 작제물의 단백질 수준을 도시한다.
도 8. 가짜 수용체 (sham receptor)로서, 작제물 MUC16c57 - c114pFUSE에 대한 pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터 내로 삽입된 엑토도메인-MUC16c57 ->c114 (서열 번호 161; MUC16의 아미노산 잔기 1777 내지 1834) 아미노산 서열 및 117- 244LGALS3pFUSE 벡터를 생성하는 것으로서, pFUSE-hIgG1-Fc2 내로 삽입되는 117- 244LGALS3 아미노산 서열 (서열 번호 167)의 서열.
도 9a 내지 도 9e. MUC16c354 트랜스제닉 마우스. 도 9a는 MUC16c354 조건부 작제물에 대한 전략을 도시한다. CMV 초기 인핸서에 더한 닭의 β 액틴 프로모터 (CAG)를 2개의 loxP 및 하류의 MUC16c354 서열 사이의 hrGFP의 전사를 유도하는데 사용하였다. 도 9b: 서던 블롯은 미량 주사 절차 후, 99마리의 동물 중 MUC16c354 양성 시조 (founder)의 12개의 후보를 나타낸다. 도 9c: 항-MUC16 항체 4H11에 의한 웨스턴 블롯을 MUC16c354 마우스 콜로니 생성을 위한 시조 9 (약 50개의 카피) 및 36 (약 10개의 카피)을 확인하는데 사용하였으며; A5는 MUC16c354에 의한 안정한 형질감염 SKOV3의 양성 대조군이다. 도 9d: 이중 MUC16c354:p53+/-트랜스제닉 마우스로부터의 종양의 조직학적 분석. 다중 육종 및 림프종을 이중 MUC16c354:p53+/- 트랜스제닉 마우스에서 확인하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)에 의해 염색하였다. 종양은 자궁 내 조직 육종 (I, 스케일 바:100 μm), 간 (II, 스케일 바:50μm), 난소 (III, 스케일 바:50 μm) 및 골수 (IV, 스케일 바:50 μm)뿐만 아니라, 난소의 림프종 (V, 스케일 바:50 μm), 신장 (VI, 스케일 바:50 μm), 및 폐 (VIII, 스케일 바:50μm)에 암종이 있는 폐 (VII, 스케일 바:50 μm)를 포함한다. 도 9e: 트랜스제닉 마우스 암 특이적 카플란-마이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier Survival Curve): MUC16c354 마우스는 야생형 (WT)과 유사하게, 최초 18개월 동안 자발적인 종양 생성을 나타내었다. 그러나, MUC16c354 마우스를 p53+/- 마우스와 교배시킨 경우, 이중 트랜스제닉 MUC16c354:p53+/- 마우스는 p53+/- 마우스 (p<0.014) 또는 MUC16c354 마우스와 비교하여, 자발적인 종양 생성으로 인해, 유의하게 악화된 총 생존을 나타내었다.
도 10. 12개월령의 수컷 및 암컷 MUC16c354 트랜스제닉 마우스로부터의 대표적인 조직의 조직학. 조직 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E, 스케일 바: 50μm)으로 염색하였다. 자궁내막 과형성 (hyperplasia)이 두 유전자형 모두에서 유사한 발생률 및 중증도로 관찰되었다 (여기서는 트랜스제닉 동물에서만 나타남). 트랜스제닉 동물 (Tg)의 난소, 폐, 결장 및 간은 모 세포주 (야생형, WT)와 유사하였다.
도 11a 내지 도 11c. 인간 난소암에서 MUC16의 영향. 도 11a는 MUC16 전사체 수를 도시한다. 도 11b: 확인된 MUC16 변이를 갖는 18명의 환자와 조합한 최고 MUC16 발현을 갖는 환자의 5분위수는 카플란-마이어 분석에서, 더 낮은 MUC16 발현을 갖는 환자와 비교하여, 유의하게 (p=0.02117) 악화된 생존을 갖는다. 도 11c는 난소암에서 MUC16 유전자 변형과 PI3K 변이 사례의 관계를 도시한다.
도 12a 내지 도 12c. MUC16 매트리겔 침입을 위한 당화 필요조건. 도 12a는 SKOV3 형질감염된 세포주에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. phrGFP는 대조군 벡터를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114는 MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. N3은 MUC16c114 -N3을 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. N1-2는 MUC16c114-N12를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. N1-2-3은 MUC16c114 -N123을 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114-shControl은 MUC16c114 및 대조군 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. phrGFP shRNA MGAT 집단 #4는 대조군 벡터 및 MGAT5에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. phrGFP shRNA LGALS3 집단 #15는 대조군 벡터 및 LGALS3에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114-shMGAT5는 MUC16c114 및 MGAT5에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. MUC16c114-shLGALS3은 MUC16c114 및 LGALS3에 대한 shRNA를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. 도 12b는 대조군 벡터, phrGFP 또는 지정된 MUC16c114 작제물을 발현하는 3T3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 도 12c는 지정된 작제물을 발현하는 SKOV3 세포가 이식된 흉선 제거 누드 마우스에서 종양 부피에 의해 결정된 바와 같은 종양 성장을 도시한다.
도 13a 내지 도 13d. MUC16 당화 패턴 및 펩티드. 도 13a는 MUC16c114 -N12를 발현하는 SKOV3 세포의 N-연결된 프로파일을 도시한다. 삼각형은 푸코오스 (fucose)를 표시한다. 사각형은 N-아세틸글루코사민을 표시한다. 회색 원은 만노스를 표시한다. 백색 원은 갈락토스를 표시한다. 마름모는 N-아세틸뉴라민산을 표시한다. 도 13b는 55-머 (서열 번호 129) 면역원을 도시한다. 도 13c는 15-머 (서열 번호 131) 면역원을 도시한다. 도 13d는 18-머 (서열 번호 130) 면역원을 도시한다.
도 14는 면역원 및 스크리닝 항원 표적으로 사용되는 15-머 및 18-머 둘 모두에 대한 당화 항원 및 비당화 항원을 갖는 MUC16 당화 항체를 포함하는 생물반응성 상청액의 상대적인 반응성에 대한 상세한 ELISA 분석을 제공한다.
도 15a 내지 도 15b. MUC16 당화 항체는 매트리겔 침입을 억제한다. 도 15a는 MUC16 당화 항체의 생성으로부터의 생물반응성 상청액의 존재 또는 부재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 라인은 상대수 200에 대한 참조 라인이다. 도 15b는 정제된 MUC16 당화 항체의 존재 또는 부재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 라인은 상대수 90에 대한 참조 라인이다.
도 16a 내지 도 16e. MUC16 당화 항체는 매트리겔 침입을 억제한다. 도 16a는 (i) 대조군 항체; (ii) 4H11; 또는 (iii) MUC16 당화 항체 클론 10C6.E4의 존재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 지정된 MUC16c114 작제물을 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 도 16b는 (i) 대조군 항체; (ii) 4H11; 또는 (iii) MUC16 당화 항체 클론 10C6.E4의 존재하에 4H11을 사용한 제3 FAC 분류 (sort) 후의 phrGFP 대조군 벡터 또는 지정된 MUC16c114 작제물을 발현하는 SKOV3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 도 16c는 (i) 대조군 항체; (ii) 4H11; 또는 (iii) MUC16 당화 항체 클론 10C6.E4의 존재하에 phrGFP 대조군 벡터 또는 지정된 MUC16c344 작제물을 발현하는 3T3 세포의 매트리겔 침입을 도시한다. 도 16d는 MUC16c344를 발현하는 SKOV3 세포를 이식하고, 모의 처리하거나 (MUC16c344), MUC16 당화 항체 10C6.E4(MUC16c344 +10C6.E4)로 처리한 흉선 제거 누드 마우스에서의 종양 성장을 종양 부피로 나타낸 바와 같이 도시한다. 화살표는, 100 μg의 MUC16 당화 항체가 투여된 날을 나타낸다. 도 16e는 지정된 항체에 의한 인간 난소 종양 샘플의 염색을 도시한다.
도 17은 표지된 MUC16 당화 항체가 지정된 온도 및 시점에서 내재화된 세포의 백분율을 도시한다.
도 18a는 MUC16 형질감염체에 대한 시험관내 성장 곡선을 도시한다. 96 웰 평평 바닥 플레이트에서 1000개의 SKOV3 세포/웰을 phrGFP 벡터 대조군, MUC16c114 (서열 번호 133)을 발현하는 phrGFP 벡터, 또는 MUC16c344를 발현하는 phrGFP 벡터와 함께 배양하고, 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 매일, 플레이트를 Alamar Blue로 염색하고, 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 CytoFluor 형광 플레이트 판독기에서 판독하였다. 곡선들 사이에는 통계적 차이가 나타나지 않았다. 도 18b는 SKOV3 phrGFP 세포, SKOV3 MUC16c114-GFP 세포, 또는 SKOV3-MUC16c344-GFP 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 결과는 침입적 세포의 상대수로 표현된다. c114 및 c344는 phrGFP와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 도 18c는 흉선 제거 암컷 누드 마우스에서 SKOV3 형질감염체 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포를 10 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 평균 종양 부피의 차이는 phrGFP 종양과 비교하여, MUC16c344 종양 (p<0.0001) 및 MUC16c114 종양 (p=0.002)을 보유하는 마우스에서 통계적으로 유의하게 더 컸다. 도 18a 내지 도18c의 약어: "SKOV3 phrGFP" 및 "phrGFP"는 대조군 phrGFP 벡터를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭하고; "SKOV3 MUC16c114-GFP" 및 "c114"는 MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭하며; "SKOV3 MUC16c344-GFP" 및 "c344"는 MUC16c344 (서열 번호 132)를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다.
도 19a 내지 도 19f는 SKOV3 난소암 세포에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. 도 19a는 하기와 같이 처리되거나, 처리되지 않은 MUC16c114 (서열 번호 133; "c114")를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 대조군 phrGFP 대조군 벡터 ("phrGFP")를 발현하는 SKOV3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다: (1) 5 μg/mL 투니카마이신; (2) 5 μg/mL의 대조군 pFUSE 단백질; (3) 5 μg/mL의 MUC16c57 -114-pFUSE 융합 단백질; 또는 (4) 5 μg/mL의 117- 244LGALS3-pFUSE 융합 단백질. 결과는 처리 48시간 후의 침입적 세포의 수로 표현된다. c114 세포는 phrGFP 세포보다 더 침입적이었다 (p <0.0001). c114 세포의 침입성은 pFUSE 벡터만의 단백질에 의한 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 투니카마이신 (N-당화 억제제)에 의한 처리는 c114 세포의 침입성을 저하시켰다. MUC16c57 -114-pFUSE 융합 단백질 또는 117- 244LGALS3-pFUSE에 의한 처리는 c114 세포의 침입성을 저하시켰다 (p <0.0001). 도 19b는 lamelli 대조군 shRNA, MGAT5-특이적 shRNA, 또는 LGALS3-특이적 shRNA의 존재 또는 부재하에 MUC16c114 (서열 번호 133) ("c114")를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 벡터 대조군 ("phrGFP")에 의해 형질감염된 SKOV3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. MGAT5-특이적 shRNA 또는 LGALS3-특이적 shRNA로 처리된 c114 세포는 shRNA로 처리된 phrGFP 세포와 비교하여 침입을 저하시켰다. 대조 shRNA는 c114 세포 침입에 영향을 주지 않는다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 도 19c는 SKOV3-MUC16c114 매트리겔 침입의 당화 의존성을 도시한다. SKOV3 세포를 하기의 MUC16 변이를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 대조군 벡터로 형질감염시켰다: c114 (서열 번호 133), N1 mut c114 (서열 번호 151), N24 muc c114 (서열 번호 152), N30 mut c114 (서열 번호 139), N1-N24 mut c114 (서열 번호 153), N1-N24-N30 mut c114 (서열 번호 154). c114-발현 세포는 대조군 phrGFP 세포와 비교하는 경우, 증가된 침입을 나타내었다. c114-발현 세포의 증가된 침입성은 MUC16c114 (서열 번호 133)의 아미노산 위치 24 및 30에서의 아스파라긴의 N-당화에 의존적이었다. N24와 N30 부위 둘 모두가 중요하지만, 이러한 효과에서, N30 부위가 N24 부위보다 더 중요하다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 결과는 phrGFP 벡터 대조군과 비교한 %로 표현된다. 도 19d는 SKOV3-MUC16c344 매트리겔 침입의 당화 의존성을 도시한다. SKOV3 세포를 하기의 MUC16 변이를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 대조군 벡터로 형질감염시켰다: c344 (서열 번호 132), N24 mut c344 (서열 번호 173), N30 mut c344 (서열 번호 174), 또는 N24-N30 mut c344 (서열 번호 175). c344-발현 세포는 대조군 phrGFP 세포와 비교하는 경우, 증가된 침입을 나타내었다. c344-발현 세포의 증가된 침입성은 MUC16c114 (서열 번호 133)의 아미노산 위치 24 및 30에서의 아스파라긴의 N-당화에 의존적이었다. 각 분석은 삼중으로 2회 이상 수행하였으며, 수작업으로 계수하였다. 도 19e는 선택된 신호전달 경로에 대한 MUC16-발현의 효과를 도시한다. MUC16c114 (서열 번호 133)로 형질감염된 SKOV3 세포를 대조군 shRNA ("shLamelli") 또는 MGAT5 ("shMGAT5") 또는 LGALS3 ("shLGALLS3")에 대한 shRNA로 처리하거나, 처리하지 않고, phrGFP 벡터 대조군 ("phrGFP") 또는 MUC16c114 - N30mut (서열 번호 139) ("N30 mut")를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포와 비교하고, 상기 세포를 pAKT, pERK1/2, pSRC 및 pEGF 수용체 (pEGFR) 신호전달 경로의 활성화에 대해 조사하였다. AKT (S473) 및 ERK1/2 (pT202/Y204)의 인산화가 MUC16c114 세포에서 증가하였다. MGAT5 (shMGAT5)의 녹다운, 갈렉틴-3 (Galectin-3) (shLGALLS3)의 녹다운 및 N30A 변이는 각각 SKOV3 세포주에서 MUC16c114-유도된 온코진(oncogene) 활성화를 감소시켰다. 도 19f는 흉선 제거 암컷 누드 마우스에서, SKOV3 형질감염체 종양 성장을 도시한다. 2 x 106개의 종양 (하기에서 개시됨) 세포를 각각의 조건에서 10 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. c114 종양 세포의 생체내 성장은 훨씬 더 적극적이었다 (p<0.0001). N1-N24-N30-mut c114, c114-sh-MGAT5 및 c114-sh-LGALS3 종양 세포는 phrGFP 종양 세포와 비교하여, 성장 증강을 나타내지 않았다. 종양 세포의 설명: "phrGFP"는 phrGFP 벡터 대조군으로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "c114"는 MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "N1-N24-N30-mut c114"는 MUC16c114 -N1-N24-N30- mut (서열 번호 154)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "c114-sh-MGAT5"는 MGAT5에 대한 shRNA로 처리되고, MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭하고; "c114-sh-LGALS3"은 LGALS3에 대한 shRNA로 처리되고, MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP 벡터로 형질감염된 SKOV3 세포를 지칭한다.
도 20a는 EGFR 표면 발현에 대한 MUC16 발현의 효과를 도시한다. SKOV3-phrGFP 및 SKOV3-MUC16c114 형질감염체를 24시간 동안 사이클로헥시미드 (CHX)의 처리의 존재 또는 부재하에 조사하였다. 기저 수준 및 CHX 처리 후 수준에서의 EGFR 및 MUC16 발현의 기하학적 평균 형광이 나타나 있다. SKOV3-phrGFP 샘플에서의 EGFR은 CHX 처리 24시간 후에 미처리 수준의 58%로 감소되었다. 이들 세포에서, 유의한 MUC16 발현은 존재하지 않았다. 반대로, SKOV3-MUC16c114 세포에서, EGFR의 기하학적 평균 형광이 대략 25% 증가하였고, CHX 노출 후에 대조군의 83%로 저하되었다. MUC16c114 평균 형광은 CHX에 의해 유의하게 감소되지 않았다. 도 20b는 총 세포성 EGFR의 웨스턴 블롯으로부터의 EGFR/β-액틴 비의 덴시토미트리 (densitometry)을 도시하고, CHX로 처리된 SKOV3-phrGFP 세포에서 시간 경과에 따라 EGFR의 꾸준한 손실이 있었음을 예시한다. 반대로, SKOV3-MUC16c114 세포에서의 EGFR의 총 수준은 유지되었으며, 이는 MUC16(-) 대조군 세포주 ("phrGFP (-)")와 비교하여, EGFR 안정화를 나타낸다. 도 20c는 대조군 세포 침입의 분획으로서 발현된 phrGFP 대조군 벡터 ("안정한 phrGFP"), SKOV3-MUC16c114 및 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 테트라사이클린-유도성 세포주에 의해 형질감염된 SKOV3 세포에 대한 매트리겔 침입 분석을 도시한다. SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포의 테트라사이클린 유도는 안정한 SKOV3-MUC16c114 (SKOV3c114)와 유사한 침입적 표현형을 야기하였고, 비유도된 세포는 MUC16-phrGFP 대조군 세포에 매칭되었다. 매트리겔 침입에서의 이러한 MUC16-유도된 증가는 EGFR에 전적으로 의존적이었다. 그러나, EGFR (shEGFR)의 헤어핀 RNA 녹다운이 SKOV3 세포 내로 도입되는 경우, MUC16 (웨스턴 블롯에서의 4H11 양성 단백질)의 테트라사이클린 유도된 발현은 매트리겔 침입을 증가시키지 않았다. 각 분석은 삼중으로 수행되었으며, 수작업으로 계수하였다. 도 20d: MUC16c114(+) 및 MUC16c114(-) 세포에서의 EGFR 안정성. 24시간 동안 CHX로 처리하고, 총 세포성 EGFR에 대해 프로빙한 테트라사이클린-유도되거나, 비유도된 SKOV3-MUC16c114(tet) 세포주의 세포 추출물을 덴시토미트리 비로서 표현하고, β-액틴으로 정규화한다. 테트라사이클린-유도된 SKOV3-MUC16c114 세포에서의 EGFR 감소의 기울기를 MUC16c114(-) 세포주와 비교하여, MUC16c114 발현의 EGFR 안정화 효과를 반복검증한다. 결과는 도 20b에 나타낸 안정한 형질감염의 효과와 유사하다.
도 21은 24시간 동안 사이클로헥시미드로 처리된 테트라사이클린-유도되거나, 비유도된 SKOV3c114 세포주 (각각 "Tet-유도된 MUC16c114" 및 "유도된 MUC16c114")의 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석의 덴시토미트리을 도시한다. 웨스턴 블롯을 pEGFR 및 단백질 수준에 대해 프로빙하고, β-액틴 수준으로 정규화하였다. 테트라사이클린-유도된 SKOV3c114 pEGFR 신호의 기울기는 비유도된 SKOV3c114 세포주와 비교하여, 안정한 pEGFR을 나타내었다.
도 22a 내지 도 22c는 MUC16 엑토도메인 N-당화된 종의 확인 및 화학적 합성을 도시한다. 도 22a: N1-N24 변이된 MUC16c114 (서열 번호 서열 번호 153)를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포의 N-글리칸 프로파일링. 글리칸은 조지아 대학의 복합 탄수화물 연구 센터 (Complex Carbohydrate Research Center)에서 총 이온 매핑을 통해 검출 및 특성화되었다. 삼각형: 푸코오스; 사각형: N-아세틸 글루코사민; 어둡게 채색된 원: 만노스; 밝게 채색된 원: 갈락토스; 마름모: N-아세틸뉴라민산. 도 22b는 N30 위치에서 단일 키토비오스 (GlcNAc2) 글리칸을 갖는 55-머 MUC16 항원의 도식적 구조를 도시한다. 이러한 N-당펩티드 항원을 항체의 형성을 위해, 마우스를 면역화하는데 사용하였다. 아미노산 서열은 서열 번호 129에 제시되어 있다. 사각형은 N-아세틸글루코사민을 표시하고; 원은 만노스를 표시한다. 도 22c는 N30 위치에서 키토비오스에 의해 모노당화된 KLH-접합된 15-머 MUC16 항원 및 각각 N24 및 N30 위치에서 2개의 키토비오스 단위에 의해 bis-당화된 KLH-접합된 18-머 MUC16 항원의 도식적 구조를 도시한다. 후속하여, 이들 N-당펩티드-KLH 작제물을 MUC16 엑토도메인 내의 GlcNAc2-펩티드 에피토프에 대한 단일클론 항체의 형성을 위해, 마우스를 면역화하는데 사용하였다. 4H11 단일클론 항체를 유도하기 위한 MUC16-비관련된 당펩티드 및 비당화된 MUC16 펩티드 2의 서열이 또한 포함되어 있다. KLH-15-머(키토비오스)[C-G25-V38]의 아미노산 서열은 서열 번호 131에 제시된 바와 같다. KLH-18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]의 아미노산 서열은 서열 번호 130에 제시된 바와 같다. MUC16 비당화된 펩티드2의 아미노산 서열은 서열 번호 168에 제시된 바와 같다. MUC16 비관련된 펩티드 18-머 및 MUC16 비관련된 펩티드 18-머 + GlcNAc2의 아미노산 서열은 서열 번호 169에 제시된 바와 같다. 사각형은 N-아세틸글루코사민을 표시한다.
도 23a 내지 도 23h는 MUC16 당화 항체 특성화를 도시한다. 도 23a는 샌드위치 ELISA에 의한 다양한 MUC16 및 GlcNAc2-당화된 펩티드에 대한 4H11 및 4개의 리드 GlcNAc2-MUC16-엑토도메인 단일클론 항체 (MUC16 당화 항체)의 반응성을 도시한다. 비당화된 MUC16 펩티드 2 (서열 번호 168), 또는 비관련된 펩티드 (서열 번호 169) 중 어느 하나와의 글리칸-MUC16 엑토도메인 교차 반응성은 나타나지 않았다. 유사하게, 4H11은 본질적으로 GlcNAc2-MUC16 15-머 (서열 번호 131) 또는 (GlcNAc2)2-18-머 (서열 번호 130) N-당펩티드에 대한 친화도를 갖지 않았다. 사각형은 N-아세틸글루소아민 (N-acetylglusoamin)을 표시하고; 삼각형은 프코오스를 표시하며; 원은 만노스를 표시한다. 도 23b, 도 23c 및 도 23d는 MUC16-증강된 매트리겔 침입에 대한 MUC16 당화 항체의 효과를 도시한다. 결과는 대조군과 비교한 %로서 표현된다. 5 μg/mL에서의 (대조군) 정제된 4H11 또는 4개의 글리칸-MUC16-엑토도메인 항체 18C6, 10C6, 19C22, 또는 7B12의 존재 또는 부재하에, MUC16c114 (서열 번호 133)를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포 (도 23B), CAOV3 세포 (도 23C) 및 OVCA-433 세포 (도 23D)의 매트리겔 분석. 4개의 항-글리칸-MUC16-엑토도메인 항체 (MUC16 당화 항체) 각각은 세 가지의 상이한 MUC16(+) 난소암 세포주 (CAOV3 및 OVCA-433)의 침입을 억제하였으나, 4H11은 SKOV3-MUC16c114 세포의 침입의 억제에 대한 효과를 거의 갖지 않았다. 도 23e는 MUC16 당화 항체 단일클론 항체 ("MAB") 10C6에 의한 EGFR 안정화의 억제를 도시한다. CHX로 처리된 후, 지정된 시간 (hr) 동안 총 EGFR에 대해 프로빙된 테트라사이클린-유도된 SKOV3-MUC16c114 ( tet ), 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6-처리된, 테트라사이클린-유도된 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 또는 비유도된 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포주의 세포 추출물로부터의 웨스턴 블롯 분석의 덴시토미트리. 도 20a에 나타낸 바와 같이, 덴시토미트리 곡선의 기울기는 세포 표면 상의 MUC16c114의 존재가 EGFR을 안정화시켰다는 것을 나타낸다. MUC16 당화 항체 10C6은 총 EGFR 단백질의 MUC16c114 안정화를 폐기하여, 이를 MUC16(-) 비유도된 대조군과 유사하게 한다. 도 23f는 4H11, OC125 (상업용), 또는 단일클론 MUC16 당화 항체 (10C6 및 19C11)에 의해 염색된 인간 난소 조직 마이크로어레이를 도시한다. 장액성 난소암에서의 MUC16의 발현은 OC125 및 4H11과 일치하며, 그와 중첩된다. 도 23g 및 도 23h는 흉선 제거 암컷 누드 마우스에서의 종양 성장에 대한 MUC16 당화 항체의 효과를 도시한다. 2 x 106개의 종양 세포 (MUC16c344 (서열 번호 132; "c344")를 발현하는 phrGFP 벡터 또는 phrGFP 벡터 ("phrGFP")에 의해 형질감염된 SKOV3 세포)를 20 nu/nu 마우스의 옆구리 내로 도입하였다. 10마리의 마우스를 4주 동안 주 2회 100 μg/마우스로 정제된 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6에 의해 0일부터 정맥내 처리하였다. 모든 마우스를 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스에 의해 주 2회 측정하였다. 도 23g에는 10 μg/mL의 정제된 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6의 존재 및 부재하에 수행된 동일한 세포에 의한 매트리겔 침입 분석이 나타나 있다. 도 23h는, 평균 종양 부피의 차이가 비처리된 MUC16c344 종양과 비교하여, MUC16c344 종양을 보유하는 단일클론 MUC16 당화 항체 10C6-처리된 마우스에 의해, 유의하게 저하되었음 (p=0.0004)을 입증하며, 이는 종양 성장에 대한 MUC16의 효과에 대한 보호를 시사한다.
도 24a 내지 도24d는 갈렉틴-매개된 MUC16 단백질-단백질 상호작용을 도시한다. 도 24a는 세 가지의 당화된 단백질 (EGFR DDK-His; MUC16c57 -114-pFUSE; 및 LGALS3Myc-DDK)의 면역블롯 (IB) 및 면역침전 (IP)을 도시한다. MUC16c57 -114-pFUSE 당화된 단백질을 LGALS3 단백질 (0.13 μg) 및 EGFR (0.13 μg)과 조합시킨 후, 1시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 사전 블로킹된 단백질 A/G PLUS 아가로스 비드를 첨가하고, 4℃에서 밤새 회전시켰다. IP 펠릿을 다량으로 세척하고, 로딩 완충액 중에서 끓이고, 10% SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 나이트로셀룰로스 막 상으로 옮겼다. 상기 막을 항-EGFR-v3, 항-4H11-HRP, 또는 다클론 항-LGALS3 항체에 의해 프로빙하였다. 나타낸 바와 같이, 4H11 결합은 MUC16c57 -114-pFUSE가 일정하게 존재하였다는 것을 나타내었다. LGALS3은 MUC16c57 -114-pFUSE에 대해 양성인 레인에서 결합하였으나, EGFR은 LGALS3 및 MUC16c57 -114-pFUSE 둘 모두가 존재하는 경우에만, 검출되었다. 단일클론 MUC16 당화 항체 18C6의 존재는 이들 LGALS3, EGFR 및 MUC16 단백질 복합체의 형성을 억제하였다 (우측 레인). 도 24b는 MUC16 및 EGFR 단백질 공동-위치화를 도시한다. 야생형 OVCAR3 세포 또는 MUC16c344 (서열 번호 132; "SKOV3c344")를 발현하는 phrGFP 또는 MUC16c114 (서열 번호 133; "SKOV3c114")를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포의 MUC16에 대한 EGFR-A647 및 4H11-PE 또는 MUC16에 대한 시약 EGFR-A647 및 4H11-PE 둘 모두의 조합에 의한 면역형광 염색. 현미경 이미지 (50 μm 스케일)는 세 가지 세포주 모두에서 EGFR 및 MUC16c114의 공동-위치화를 나타내었다 (화살표 참조). 도 24c는 세 가지의 당화된 단백질 (인테그린 β1Myc-DDK; MUC16c57 -114-pFUSE 및 LGALS3Myc-DDK)의 면역블롯 (IB) 및 면역침전 (IP)을 도시한다. 대체적으로, 도 24a와 동일한 방법이 사용되었다. 면역블롯 및 면역침전된 모든 샘플의 웨스턴 블롯 분석은 10% SDS-PAGE 겔 상에서 구동시키고, 나이트로셀룰로스 막 상으로 옮겼으며, 인테그린 β1에 대한 항-4C5-DDK 또는 항-4H11-HRP 또는 항-4C5-DDK에 의해 LGALS3 항체에 대해 프로빙하였다. EGFR에 의한 경우와 같이, 인테그린 β1 단백질을 공동-침전시키기 위해, 세 가지 단백질이 모두 필요하였다. 3개의 우측 레인에 나타낸 바와 같이, MUC16 당화 항체 18C6은 또한 MUC16, LGALS3 및 인테그린 β1의 조합을 블로킹하였다. 도 24d는 MUC16 및 인테그린 β1 단백질 공동-위치화를 도시한다. 야생형 OVCAR3 세포 또는 MUC16c344 (서열 번호 132; "SKOV3c344")를 발현하는 phrGFP 또는 MUC16c114 (서열 번호 133; "SKOV3c114")를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포의 MUC16에 대한 인테그린 β1-A647 또는 4H11-PE 또는 MUC16에 대한 시약 인테그린 β1-A647 또는 4H11-PE 둘 모두의 조합에 의한 면역형광 염색. 현미경 이미지 (50 μm 스케일)는 OVCAR3, SKOV3c344 및 SKOV3c114 세포에서의 인테그린 β1 및 MUC16의 공동-위치화를 나타내었다 (화살표 참조).
도 25a는 야생형 OVCAR3 세포 또는 MUC16c344 (서열 번호 132; "SKOV3c344")를 발현하는 phrGFP 또는 MUC16c114 (서열 번호 133; "SKOV3c114")를 발현하는 phrGFP에 의해 형질감염된 SKOV3 세포 또는 SKOV3c344 또는 SKOV3c114 세포주의 MUC16에 대한 EGFR-A647 또는 4H11-PE 또는 두 시약 모두의 조합에 의한 면역형광 염색을 도시한다. 현미경 이미지 (스케일 100 μm)는 EGFR 및 MUC16의 공동-위치화를 명확하게 나타내었다 (화살표 참조). 도 25b: 야생형 OVCAR3 또는 SKOV3c344 또는 세포주의 MUC16에 대한 인테그린 β1-A647 또는 4H11-PE 또는 두 시약 모두의 조합에 의한 면역형광 염색. 현미경 이미지 (스케일 100 μm)는 인테그린 β1 및 MUC16의 공동-위치화를 명확하게 나타내었다 (화살표 참조).
도 26a 내지 도 26d는 MUC16 종양 촉진의 모델을 도시한다. 도 26a는 EGFR-LGALS3-MUC16 및 LGALS3-인테그린 β1-MUC16 관계의 예시이다. EGFR에 의한 SRC/ERK/AKT의 신호 변환 또는 인테그린 β1에 의한 SRC/FAK의 신호 변환은 LGALS3 오량체와의 MUC16 및 신호전달-분자 상호작용에 의존적이었다. 도 26b는 당화 손실에 대한 모델을 도시하였다: shMGAT5-형질감염된 세포주에서, MUC16, EGFR 및 인테그린 β1 상의 부위의 N-당화는 테트라-안테나 구조 (tetra-antennary structure)의 손실에 의해 감소되었으며, LGALS3과의 비결합을 야기하였다. 도 26c는 갈렉틴-3 손실에 대한 모델을 도시하였다: shLGALS3 형질감염된 세포주에서, MUC16 상에 N-당화 부위가 존재하였고, LGALS3의 결합의 부재는 MUC16/EGFR 또는 MUC16/인테그린 β1 연관의 손실 및 인사이드-아웃 신호 (inside-out signal)의 감소를 야기하였다. 도 26d는 MUC16/LGALS3 상호작용에 대한 잠재적 억제제의 모델을 도시한다. MUC16 당화 항체 또는 "더미" (dummy) 가짜 수용체 (항-MUC16c57 - 114pFUSE 또는 117-244LGALS3-pFUSE)에 노출된 MUC16(+) 세포는 LGALS3 겔과의 결합에 실패하였고, 후속하여, 또한 EGFR 또는 인테그린 β1과의 결합에 실패하였다.
도 27a는 측쇄 보호되고, N-아세틸화된 55-머 펩티드 아미드 (서열 번호 129)를 도시한다. 도 27b는 당펩티드 p55-머[N1-S55]에 대한 UPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C486H760N84O111S8에 대한 계산치, 9812.25 (평균 동위원소) [M+5H]5+ m/z 1963.45, 실측치 1963.20; [M+6H]6+ m/z 1636.38, 실측치 1636.24; [M+7H]7+ m/z 1402.75, 실측치 1402.74. BEH C4 컬럼, 구배: 0.3 mL/min의 유속에서 6분에 걸친 80-99% 아세토나이트릴/물.
도 28a는 키토비오스-보유 55-머 당펩티드인 "55-머(키토비오스)[N1-S55]" (GlcNAc2-55-머) (서열 번호 129)를 도시한다. 도 28b는 당펩티드 "55-머(키토비오스) [N1-S55]" (GlcNAc2-55-머)에 대한 UPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C291H463N87O97S에 대한 계산치, 6764.38 (평균 동위원소) [M+4H]4+ m/z 1692.10, 실측치 1692.01; [M+5H]5+ m/z 1353.88, 실측치 1353.86; [M+6H]6+ m/z 1128.40, 실측치 1128.41; [M+7H]7+ m/z 967.34, 실측치 967.45; [M+8H]8+ m/z 846.55, 실측치 846.27. BEH C4 컬럼, 구배: 0.3 mL/min의 유속에서 6분에 걸친 20-40% 아세토나이트릴/물.
도 29a는 Man3GlcNAc2-보유 55-머 당펩티드인 "55-머(Man3GlcNAc2)[N1-S55]" (Man3GlcNAc2-55-머) (서열 번호 129)를 도시한다. 도 29b는 당펩티드 "55-머(Man3GlcNAc2)[N1-S55]" (Man3GlcNAc2-55-머)에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C309H493N87O112S에 대한 계산치, 7250.80 (평균 동위원소) [M+4H]4+ m/z 1813.70, 실측치 1813.52; [M+5H]5+ m/z 1451.16, 실측치 1451.02; [M+6H]6+ m/z 1209.47, 실측치 1209.33; [M+7H]7+ m/z 1036.83, 실측치 1036.74. Waters X-Bridge C18 컬럼, 구배: 0.2 mL/min의 유속에서 30분에 걸친 25-35% 아세토나이트릴/물.
도 30a는 측쇄 보호된 15-머 펩티드 (p15-머[C-G25-V38]) (서열 번호 131)를 도시한다. 도 30b는 키토비오스-모노당화된 15-머 당펩티드인 15-머(키토비오스)[C-G25-V38] (GlcNAc2-15-머) (서열 번호 132)를 도시한다. 도 30c는 당펩티드 "15-머(키토비오스)[C-G25-V38]" (GlcNAc2-15-머)에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C87H142N24O35S에 대한 계산치, 2116.26 (평균 동위원소) [2M+3H]3+ m/z 1411.84, 실측치 1412.02; [M+2H]2+ m/z 1059.13, 실측치 1059.15; [M+3H]3+ m/z 706.42, 실측치 706.46. Varian Microsorb 300-5 C18 컬럼, 구배: 0.2 mL/min의 유속에서 30분에 걸친 15-30% 아세토나이트릴/물.
도 31a는 측쇄 보호된 18-머 펩티드 (p18-머[C-G22-V38]) (AF-I-165) (서열 번호 130)를 도시한다. 도 31b는 키토비오스-bis당화된 18-머 당펩티드인 "18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]" [(GlcNAc2)2-18-머] (서열 번호 130)를 도시한다. 도 31c는 당펩티드 "18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]" [(GlcNAc2)2-18-머]에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 ESI-MS 및 UV 추적을 도시한다. C117H193N33O50S에 대한 계산치, 2894.04 (평균 동위원소) [2M+3H]3+ m/z 1930.36, 실측치 1930.22; [M+2H]2+ m/z 1448.02, 실측치 1447.65; [M+3H]3+ m/z 965.68, 실측치 965.25. Varian Microsorb 300-5 C8 컬럼, 구배: 0.2 mL/min의 유속에서 30분에 걸친 15-30% 아세토나이트릴/물.
도 32a는 KLH (서열 번호 131)에 접합된 당펩티드 "15-머(키토비오스)[C-G25-V38]"을 도시한다. 도 32b는 KLH (서열 번호 130)에 접합된 당펩티드 "18-머(키토비오스)2[C-T22-V38]"을 도시한다.
5. 상세한 설명
이러한 항체 또는 단편, 예를 들어 융합 단백질, 접합체, 및/또는 키메라 항원 수용체뿐만 아니라, 이를 발현하는 세포를 포함하는 항체 및 그의 항원 결합 단편 및 폴리펩티드가 제공된다. 항체 및 단편 중에는, MUC16 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것이 존재한다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "MUC16 당화 항체"로 지칭된다. 이러한 에피토프는 전형적으로, MUC16 분자, 대체적으로 MUC16의 비쉐딩 형태의 세포 외 부분 내 또는 실질적으로 상기 세포 외 부분 내의 에피토프이며; 일부 실시형태에서, 상기 에피토프는 MUC16의 탠덤 반복 영역 및/또는 MUC16의 분비된 형태 내에 존재하지 않거나, 항체 또는 단편이 그와 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 에피토프는 MUC16c114 내에 존재하거나, MUC16c114 내의 잔기를 포함하고, 전형적으로 그 내부에 하나 이상의 당화된 잔기 또는 당화 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 에피토프는 하나 이상의 당화 부위, 예를 들어 N-당화 부위를 포함한다. 일부 양상에서, 상기 에피토프는 서열 번호 150에 제시된 MUC16 서열의 Asn1806 또는 Asn1800에 상응하는 아스파라긴 잔기 (및/또는 그의 당화된 형태(들))를 포함하고; 일부 양상에서, 상기 에피토프는 서열 번호 150의 Asn1806에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하나, 서열 번호 150의 Asn1800에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하지 않으며; 일부 양상에서, 상기 에피토프는 서열 번호 150의 Asn1800에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하나, 서열 번호 150의 Asn1806에 상응하는 아스파라긴 잔기를 포함하지 않는다. 일부 임의의 이러한 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아스파라긴은 당화, 예를 들어 N-당화되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 단편은 서열 번호 131 내의 것이거나, 서열 번호 131 내의 잔기를 포함하는 에피토프와 결합하고; 서열 번호 130 내의 것이거나, 서열 번호 131 내의 잔기를 포함하는 에피토프 또는 그의 조합과 결합하며; 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 단편은 서열 번호 168에 상응하는 MUC16의 영역 내 또는 서열 번호 168의 잔기 2 내지 19 내에서 면역특이적으로 결합하지 않는다.
일 양상에서, (a) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (b) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (c) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제하는 항체 (예를 들어, 단일클론 항체) 및 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 양상에서, (a) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (b) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (c) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제하는 항체 (예를 들어, 단일클론 항체) 및 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 및 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 150의 아미노산 잔기 1806 (Asn1806)을 포함하는 에피토프오 면역특이적으로 결합하고, Asn1806은 N-당화되어 있다 (본 명세서에서 "Asn1806 당화"로서 지칭됨). 본 명세서의 섹션 6의 실시예에 나타낸 바와 같이, Asn1806 당화는 종양 세포의 MUC16-매개된 침입 및 성장에 필수적이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 및 그의 항원 결합 단편은 결합하여, 종양 세포의 이러한 침입 및 성장을 블로킹할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MUC16과의 결합을 위해, N-당화된 Asn1806에 더하여, N-당화된 Asn1800을 필요로 한다 (즉, N-당화된 부위 둘 모두 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의해 인식되는 에피토프의 일부임). "Asn1800"은 서열 번호 150의 아미노산 잔기 1800을 지칭한다. 이러한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; 및 (ii) 제5 형태가 당화되어 있고, 제5 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 172인 MUC16의 제5 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여에 의해 확인될 수 있으며, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 MUC16의 제5 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 동일한 유형의 세포이다.
일 실시형태에서, 상기 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MUC16과의 결합을 위해, N-당화된 Asn1806을 필요로 하나, N-당화된 Asn1800은 필요로 하지 않는다 (즉, N-당화된 Asn1806은 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의해 인식되는 에피토프의 일부이나, N-당화된 Asn1800은 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의해 인식되는 에피토프의 일부가 아님). 이러한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; (ii) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여; 및 (iii) 제4 형태가 당화되어 있고, 제4 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 152인 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력에 의해 확인될 수 있고, (iii) MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포, MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포 및 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 동일한 세포 유형이다.
서열 번호 133의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114로서 지칭되고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기 (성숙한 MUC16의 서열은 서열 번호 150임)로 이루어진다. MUC16c114는 서열 번호 133의 위치 1, 24 및 30의 아스파라긴 아미노산 잔기 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1777, Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화될 수 있다.
서열 번호 139의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114 -N3으로서 지칭된다. MUC16c114 -N3은, 아미노산 위치 30의 아스파라긴 (서열 번호 150의 아미노산 위치 1806에 상응함)이 알라닌으로 변이된 것을 제외하고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기 (성숙한 MUC16의 서열은 서열 번호 150임)로 이루어진다. 따라서, MUC16c114 -N3은 서열 번호 139의 아미노산 위치 30 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1806에 상응함)에서 N-당화될 수 없다.
서열 번호 152의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114 -N2로서 지칭된다. MUC16c114 -N2는, 아미노산 위치 24의 아스파라긴 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1800에 상응함)이 알라닌으로 변이된 것을 제외하고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기 (성숙한 MUC16의 서열은 서열 번호 150임)로 이루어진다. 따라서, MUC16c114 -N2는 서열 번호 152의 아미노산 위치 24 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1800에 상응함)에서 N-당화될 수 없다.
서열 번호 172의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114 -N23으로서 지칭된다. MUC16c114 -N23은, 아미노산 위치 24 및 30의 아스파라긴 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1800 및 Asn1806에 상응함)이 알라닌으로 변이된 것을 제외하고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기 (성숙한 MUC16의 서열은 서열 번호 150임)로 이루어진다. 따라서, MUC16c114 -N23은 서열 번호 157의 아미노산 위치 24 및 30 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화될 수 없다.
또한, 중쇄 및 경쇄가 본 명세서에서 제공되고, 상기 중쇄 및 경쇄를 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다. 또한, 이러한 항체 및 그의 항원 결합 단편, 중쇄, 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 상보적 DNA (cDNA))을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드)가 본 명세서에서 제공된다. 이러한 항체 및 그의 항원 결합 단편, 중쇄, 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 상보적 DNA (cDNA))을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 및 세포 (예를 들어, 단리된 세포 또는 생체 외 세포)가 추가로 제공된다. 또한, 이러한 항체, 그의 항원 결합 단편, 중쇄, 경쇄, 벡터 및 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 다른 양상에서, MUC16 활성 및/또는 MUC16-유래 종양 성장, 또는 본 명세서에 개시된 특정 병증 또는 장애의 치료 또는 관리, 예를 들어 암의 치료 또는 관리를 위한 방법 및 용도가 본 명세서에서 제공된다. 관련 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물), 키트 및 진단 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "MUC16" 또는 "MUC16 폴리펩티드" 또는 "MUC16 펩티드"는 문헌 [Yin BW 및 Lloyd KO, 2001, J Biol Chem. 276(29):27371-5]에 개시된 바와 같은 테더링된 뮤신 단백질인 MUC16을 지칭한다. GenBank™ 수탁 번호 NM_024690.2 (서열 번호 137)는 예시적 인간 MUC16 핵산 서열을 제공한다. GenBank™ 수탁 번호 NP_078966.2 (서열 번호 136)는 예시적 인간 MUC16 아미노산 서열을 제공한다. 천연 MUC16은 추정 절단 부위에 근접한 세포 내 도메인, 막관통 도메인, 엑토도메인 및 각각 156개의 아미노산 길이의 12 내지 20개의 반복체의 광범위한 대량 당화된 영역을 포함한다 (도 1a). "비성숙한" MUC16은 MUC16 신호 서열 (서열 번호 136의 아미노산 잔기 1 내지 60)을 포함하는 서열 번호 136을 지칭한다. "성숙한 MUC16"은 세포 표면 상에 발현되는 바와 같은 것으로, 즉, 신호 서열이 세포 가공에 의해 제거된 천연 MUC16, 예를 들어, 서열 번호 136의 처음 60개의 아미노산 잔기가 제거된 서열 번호 150을 지칭한다 (즉, 서열 번호 136은 MUC16의 "비성숙한" 형태임).
항체 명칭과 관련하여, (i) 18C6 및 18C6.D12는 상호교환적으로 사용되고, (ii) 10C6 및 10C6.E4는 상호교환적으로 사용되고, (iii) 19C11 및 19C11.H6은 상호교환적으로 사용되며, (iv) 7B12 및 7B12.B3은 상호교환적으로 사용된다. 항체 서브클론 (즉, 18C6.D12, 10C6.E4, 19C11.H6 및 7B12.B3)을 섹션 6에 개시된 실험에 사용하였다.
5.1 항체
MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (이중특이적 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 카멜화된 항체, 아피바디 및 이황화물-연결된 Fvs (dsFv), 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
다중특이적 항체 또는 그의 단편은 상이한 구조의 적어도 2개의 표적, 예를 들어, 2개의 상이한 항원, 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프, 또는 합텐 및 항원 또는 에피토프와 동시에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 하나의 특이성은, 예를 들어 CD3와 같은, 예를 들어, B-세포, T-세포, 골수-, 혈장-, 또는 마스트-세포 항원 또는 에피토프에 대한 것일 수 있다. 또 다른 특이성은, 예를 들어, MUC16과 같은 동일하거나 상이한 세포 유형의 상이한 항원에 대한 것일 수 있다. 다중특이적 다가 항체는 상이한 특이성의 하나 이상의 결합 부위 및 결합 부위들을 갖는 작제물, 예를 들어, 하나의 결합 부위는 하나의 항원과 결합하고, 다른 결합 부위는 또 다른 항원과 결합하는 이중특이적 디아바디이다.
이중특이적 항체는 상이한 구조의 2개의 표적과 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 이중특이적 항체 (bsAb) 및 이중특이적 항체 단편 (bsFab)은 제1 표적, 예를 들어, MUC16과 면역특이적으로 결합하는 적어도 하나의 아암 (arm) 및 예를 들어, CD3와 같은 제2 표적과 면역특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 아암을 갖는다. 다양한 이중특이적 융합 단백질이 분자 공학을 사용하여, 생성될 수 있다. 일 형태에서, 예를 들어, (i) 하나의 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 scFv 및 (ii) 제2 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 항체 또는 Fab 단편으로 이루어진 이중특이적 융합 단백질은 2가이다. 또 다른 형태에서, 예를 들어, 하나의 항원에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 IgG 및 제2 항원에 대한 2개의 동일한 scFv로 이루어진 이중특이적 융합 단백질은 4가이다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 공개 WO 2011/1160119를 참조한다.
이중특이적 단일클론 항체를 생성하는 최근 방법은 더 일반적인 면역글로불린 아이소타입보다 더 강하게 가교결합되도록, 추가의 시스테인 잔기를 갖는 조작된 재조합 단일클론 항체의 사용을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225, 1997]을 참조한다. 또 다른 접근법은 필요한 두 부분의 특이성을 갖는 둘 이상의 상이한 단일 사슬 항체 또는 항체 단편 절편이 연결된 재조합 융합 단백질을 조작하는 것이다. 예를 들어, [Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997]을 참조한다. 다양한 이중특이적 융합 단백질이 분자 공학을 사용하여, 생성될 수 있다.
둘 이상의 상이한 단일 사슬 항체 또는 항체 단편이 연결된 이중특이적 융합 단백질은 유사한 방법으로 생성될 수 있다. 재조합 방법은 다양한 융합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 양상에서, 가요성 링커 (flexible linker)는 scFv (예를 들어, CD3를 표적화하는 scFv)를 단일클론 항체 (예를 들어, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체; 섹션 5.1 참조)의 경쇄의 불변 영역에 연결한다. 중쇄 Fc와 scFv의 인프레임 연결 (in-frame connection)에 필요한 적당한 링커 서열을 PCR 반응을 통해 VL 및 V카파 도메인 내로 도입한다. scFv를 인코딩하는 DNA 단편을 CHI 도메인을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 스테이징 벡터 (staging vector) 내로 결찰시킨다. 생성된 작제물을 절제하고, 항체 (예를 들어, MUC16 당화 항체)의 VH 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터 내로 결찰시킨다. 생성된 벡터는 이중특이적 융합 단백질의 발현을 위해, 적당한 숙주 세포, 예를 들어 포유류 세포를 형질감염시키는데 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 또한, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 (섹션 5.1 참조) 및 그의 단편은 또한 디아바디로 일컬어지는 기능성 이중특이적 단일 사슬 항체 (bscAb)의 제조에 사용될 수 있으며, 재조합 방법을 사용하여, 포유류 세포에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 참조로서 포함되는 문헌 [Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995]을 참조한다. 예를 들어, bscAb는 재조합 방법을 사용하여, 글리신-세린 링커를 통해 2개의 단일 사슬 Fv 단편을 결합시킴으로써, 생성될 수 있다. 관심대상의 2개의 항체의 VL 및 VH 도메인을 당업계에 공지된 표준 PCR 방법을 사용하여, 단리한다. 이중특이적 단일 사슬 항체 및 이중특이적 융합 단백질은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 scFv를 지칭한다. scFv는 당업계에서 인정되는 용어이다. scFv는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 포함하며, 상기 융합 단백질은 전체 면역글로불린과 동일한 항원 특이성을 보유한다. VH는 펩티드 링커를 통해 VL에 융합된다. 특정 실시형태에서, 상기 펩티드 링커는 5 내지 25, 5 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 15, 또는 15 내지 25개의 아미노산 잔기 길이이다. 특정 실시형태에서, 상기 scFv 펩티드 링커는 당업자에게 알려진 펩티드 링커에 적합한 하나 이상의 특징을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 상기 scFv 펩티드 링커는 scFv 펩티드 링커 가용성을 허용하는 아미노산, 예를 들어, 예를 들어, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 scFv 펩티드 링커는 scFv 펩티드 링커 가요성을 허용하는 아미노산, 예를 들어, 예를 들어, 글리신을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 scFv 펩티드 링커는 VH의 N 말단과 VL의 C 말단을 연결시킨다. 특정 실시형태에서, 상기 scFv 펩티드 링커는 VH의 C 말단과 VL의 N 말단을 연결시킨다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 지칭한다. CAR는 당업계에서 인정되는 용어이다. CAR은 종양 관련 항원 (예를 들어, MUC16)으로 표적화될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 CAR은 전형적으로, 일부 실시형태에서, T 세포 공동 자극 분자-유래 막관통 도메인 (예를 들어, CD28, CD8, CD38, OX-40, 또는 4-1BB로부터 유래된 막관통 도메인) 및 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 T 세포 수용체 (TCR) 제타 (ζ) 사슬 세포질 신호전달 도메인인 막관통 도메인인 MUC16 당화 항체로부터 유래된 scFv로 구성된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포 외 스페이서, 예를 들어 항체 또는 다른 세포-표면 분자로부터 유래된 것, 예를 들어 항체 CH2, CH3, 및/또는 힌지 영역 중 하나 이상을 함유하는 스페이서 또는 CD28 분자 또는 CD8 분자로부터 유래된 스페이서, 또는 다른 스페이서를 포함하는 하나 이상의 추가의 영역 또는 도메인, 예를 들어 하나 이상의 스페이서 또는 링커를 추가로 포함한다. 또한, 이러한 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포, 예를 들어 이러한 CAR을 재조합적으로 발현하는 것과 같은 세포가 본 명세서에서 제공된다. MUC16 발현 종양의 인식 시에, CAR-발현 T 세포는 바람직하게는 T 세포 활성화, 증식, 및/또는 이러한 종양 세포의 용해를 유도한다.
MUC16 당화 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 하위부류 (예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG 항체, 또는 그의 부류 또는 하위부류이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG1 항체이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG2 항체이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG2a 항체이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG2b 항체이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG2a 및 IgG2b 항체의 혼합물이다. 구체적 실시형태에서, 상기 항체는 설치류 단일클론 항체의 인간화된 형태이다.
구체적 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 항원은, 당화되어 있고, 예를 들어, MUC16의 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 형태이다. 서열 번호 133의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114로서 지칭되고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기로 이루어진다. MUC16c114는 서열 번호 133의 위치 1, 24 및 30의 아스파라긴 아미노산 잔기 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1777, Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화될 수 있다. 성숙한 MUC16 (서열 번호 150)은, 신호 서열이 제거되고, 상기 신호 서열이 서열 번호 136의 처음 60개의 아미노산 잔기로 이루어진 전장의 MUC16을 지칭한다 (즉, 서열 번호 136은 MUC16의 "비성숙한" 형태임).
MUC16 당화 항체의 항원 결합 단편은, MUC16 당화 항체에 항원에 대한 특이성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 MUC16 당화 항체의 Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 일부분 (예를 들어, 상보성 결정 영역 (CDR))일 수 있다. MUC16 당화 항체는 임의의 동물 종, 예를 들어 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 햄스터) 및 인간으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호교환적으로 사용되며, 당업계에서 통용되는 것이다. 가변 영역은 전형적으로, 항체 간에 서열이 광범위하게 상이하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용되는 항체의 일부, 대체적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부, 전형적으로 성숙한 중쇄의 아미노 말단의 약 110 내지 120개의 아미노산 및 성숙한 경쇄의 아미노 말단의 약 90 내지 100개의 아미노산을 지칭한다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 일컬어지는 영역에 집중되며, 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 일컬어진다. CDR은 FR에 의해 플랭킹된다. 대체적으로, CDR 및 FR의 공간적 배향은 하기와 같다: N 말단에서 C 말단 방향으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 임의의 특정 메커니즘 또는 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 경쇄 및 중쇄의 CDR은 항체와 항원과의 상호작용 및 특이성에 주로 관여하는 것으로 여겨진다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 가변 영역이다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 실시형태에서, 상기 가변 영역은 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) CDR 및 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 영장류 (예를 들어, 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 설치류 또는 쥣과 동물 CDR 및 영장류 (예를 들어, 비-인간 영장류) 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
CDR은 카밧, 코티아 및 IMGT 및 예시적 정의를 포함하여, 당업계에서 다양한 방식으로 정의되어 있다. 카밧 정의는 서열의 가변성을 기반으로 한다 (문헌 [Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983]). 카밧 넘버링 시스템과 관련하여, (i) VH CDR1은 전형적으로, 아미노산 위치 35 이후에 하나 또는 2개의 추가의 아미노산 (카밧 넘버링 도식에서 35A 및 35B로 지칭됨)을 선택적으로 포함할 수 있는 중쇄의 아미노산 위치 31 내지 35에 존재하고; (ii) VH CDR2는 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 50 내지 65에 존재하며; (iii) VH CDR2는 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 95 내지 102에 존재한다 (문헌 [Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983]). 카밧 넘버링 시스템과 관련하여, (i) VL CDR1은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 24 내지 34에 존재하고; (ii) VL CDR2는 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 50 내지 56에 존재하며; (iii) VL CDR3은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 89 내지 97에 존재한다 (문헌 [Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983]). 당업자에 잘 알려진 바와 같이, 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 가변 도메인의 실제 직쇄형 아미노산 서열은 FR 및/또는 CDR의 단축 또는 연장으로 인해, 더 소수의 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있으며, 이와 같이, 아미노산의 카밧 번호는 그의 직쇄형 아미노산 수와 반드시 동일할 필요는 없다.
코티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 한다 (문헌 [Chothia et al., (1987) J Mol Biol 196: 901-917; 및 미국 특허 제 7,709,226호). 용어 "코티아 CDR," 및 유사한 용어는 당업계에 인식되어 있고, 문헌 [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917]의 방법에 따라 결정되는 바와 같은 항체 CDR 서열을 지칭하며, 본 명세서에서 "코티아 CDR"로 지칭될 것이다 (또한, 예를 들어, 미국 특허 제 7,709,226호 및 문헌 [Martin, A., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)] 참조). 코티아 넘버링 시스템과 관련하여, VH 영역의 아미노산 잔기 넘버링의 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, (i) VH CDR1은 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 26 내지 32에 존재하고; (ii) VH CDR2는 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 53 내지 55에 존재하며; (iii) VH CDR3은 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 96 내지 101에 존재한다. 구체적 실시형태에서, 코티아 넘버링 시스템과 관련하여, VH 영역의 아미노산 잔기 넘버링의 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, (i) VH CDR1은 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 26 내지 32 또는 34에 존재하고; (ii) VH CDR2는 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 52 내지 56 (일 실시형태에서, CDR2는 위치 52A-56에 존재하고, 여기서, 52A는 위치 52를 후행함)에 존재하며; (iii) VH CDR3은 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 95 내지 102에 존재한다 (일 실시형태에서, 위치 번호 96 내지 100에는 아미노산이 존재하지 않음). 코티아 넘버링 시스템과 관련하여, VL 영역의 아미노산 잔기 넘버링의 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, (i) VL CDR1은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 26 내지 33에 존재하고; (ii) VL CDR2는 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 50 내지 52에 존재하며; (iii) VL CDR3은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 91 내지 96에 존재한다. 구체적 실시형태에서, 코티아 넘버링 시스템과 관련하여, VL 영역의 아미노산 잔기 넘버링의 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, (i) VL CDR1은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 24 내지 34에 존재하고; (ii) VL CDR2는 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 50 내지 56에 존재하며; (iii) VL CDR3은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 89 내지 97에 존재한다 (일 실시형태에서, 위치 번호 96 내지 100에는 아미노산이 존재하지 않음). 이들 코티아 CDR 위치는 항체에 따라 달라질 수 있으며, 당업계에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다.
IMGT 정의는 IMGT로부터의 것이다 (둘 모두 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 ["IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® website imgt.org, founder and director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France; 예를 들어, 문헌 [Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136 and Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212] 참조). IMGT 넘버링 시스템과 관련하여, (i) VH CDR1은 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 25 내지 35에 존재하고; (ii) VH CDR2는 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 51 내지 57에 존재하며; (iii) VH CDR2는 전형적으로 중쇄의 아미노산 위치 93 내지 102에 존재한다. IMGT 넘버링 시스템과 관련하여, (i) VL CDR1은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 27 내지 32에 존재하고; (ii) VL CDR2는 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 50 내지 52에 존재하며; (iii) VL CDR3은 전형적으로 경쇄의 아미노산 위치 89 내지 97에 존재한다.
5.1.1 서열 및 구조
특정 실시형태에서, 예를 들어, 표 1, 3 및 5에 제시된 바와 같은 본 명세서에서 제공되는 임의의 MUC16 당화 항체의 VH CDR을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 표 1, 3, 또는 5에 제시된 바와 같은 MUC16 당화 항체의 VH CDR1을 포함하는 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 표 1, 3, 또는 5에 제시된 바와 같은 MUC16 당화 항체의 VH CDR2를 포함하는 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 표 1, 3, 또는 5에 제시된 바와 같은 MUC16 당화 항체의 VH CDR3을 포함하는 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 1, 3, 또는 5에 제시된 바와 같은 MUC16 당화 항체의 VH CDR 중 하나, 2개 또는 3개 모두 (예를 들어, 항체 10C6의 경우, 표 1의 2행의 VL CDR, 예를 들어, VH CDR 모두)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 예를 들어, 표 2, 4 및 6에 제시된 바와 같은 본 명세서에서 제공되는 임의의 항-MUC16 항체의 VL CDR을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 표 2, 4, 또는 6에 제시된 바와 같은 MUC16 당화 항체의 VH CDR1을 포함하는 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 표 2, 4, 또는 6에 제시된 바와 같은 MUC16 당화 항체의 VH CDR2를 포함하는 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 표 2, 4, 또는 6에 제시된 바와 같은 MUC16 당화 항체의 VH CDR3을 포함하는 본 명세서에서 제공되는 항-MUC16 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 2, 4, 또는 6의 MUC16 당화 항체의 VL CDR 중 하나, 2개 또는 3개 모두 (예를 들어, 항체 10C6의 경우, 표 2의 2행의 VL CDR, 예를 들어, VH CDR 모두)를 포함한다.
VH CDR 아미노산 서열 (카밧).
VL CDR 아미노산 서열 (카밧).
VH CDR 아미노산 서열 (코티아).
VL CDR 아미노산 서열 (코티아).
VH CDR 아미노산 서열 (IMGT).
VL CDR 아미노산 서열 (IMGT).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함하는 VH를 포함한다:
(a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함하는 VH를 포함한다:
(a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함하는 VH를 포함한다:
(a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16 은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 본 명세서에 개시된 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호 106) (X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H임)을 포함하는 VL CDR1;
(b) 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호 107)을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호 108) (X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호 112) (X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 113)을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호 114) (X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호 118) (X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K임)을 포함하는 VL 상보성 결정 영역 (CDR)1;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 119)을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호 120)을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호 106) (X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H임)을 포함하는 VL CDR1;
(b) 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호 107)을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호 108) (X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호 112) (X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 113)을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호 114) (X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y임)을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호 118) (X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K임)을 포함하는 VL CDR1;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호 119)을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호 120)을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8은 N 또는 S이고, X9는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호 103) (X1은 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호 104) (X2는 E이거나, 부재하고, X3은 Y 또는 N임)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호 105)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호 109) (X8 은 N 또는 S이고, X9 는 L 또는 V임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호 110) (X10은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호 111)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기의 것을 포함한다:
(i) 하기의 것을 포함하는 VH:
(a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호 115) (X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L임)을 포함하는 VH CDR1;
(b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호 116) (X17은 E이거나, 부재함)을 포함하는 VH CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호 117) (X18은 T, A, 또는 S임)을 포함하는 VH CDR3; 및
(ii) 하기의 것을 포함하는 VL:
(d) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(f) 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
VH 도메인 아미노산 서열
VL 도메인 아미노산 서열
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 101) (X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나 부재하고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이며, X35는 T, S, 또는 A임)의 VH 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (서열 번호 102) (X36은 I 또는 V이고, X37은 P 또는 S이고, X38은 R 또는 L이고, X39는 K 또는 H이고, X40은 R 또는 K이고, X41은 E 또는 G이고, X42는 S 또는 G이며, X43은 Y 또는 H임)의 VL 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
(a) QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 101)을 포함하는 VH 영역 (X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나 부재하고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이며, X35는 T, S, 또는 A임); 및
(b) DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (서열 번호 102)을 포함하는 VL 영역 (X36은 I 또는 V이고, X37은 P 또는 S이고, X38은 R 또는 L이고, X39는 K 또는 H이고, X40은 R 또는 K이고, X41은 E 또는 G이고, X42는 S 또는 G이고, X43은 Y 또는 H임)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
(a) QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 101)을 포함하는 VH 영역 (X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나 부재하고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이며, X35는 T, S, 또는 A임); 및
(b) 서열 번호 2를 포함하는 VL 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
(a) QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호 101)을 포함하는 VH 영역 (X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나 부재하고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이며, X35는 T, S, 또는 A임); 및
(b) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 10C6의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 21의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 7B12의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 41의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 19C11의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 61의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 16C5의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 81의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 18C6의 VH의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 2의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 10C6의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 22의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 7B12의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 42의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 19C11의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 62의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 16C5의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 82의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 18C6의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 표 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (b) 표 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 (표 7) (예를 들어, 항체 10C6의 VH)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 10C6의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 21의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 7B12의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 (b) 서열 번호 22의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 7B12의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 41의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 19C11의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 (b) 서열 번호 42의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 19C11의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 61의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 16C5의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 (b) 서열 번호 62의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 16C5의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 81의 아미노산 서열 (표 7) (예를 들어, 항체 18C6의 VH)을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 (b) 서열 번호 82의 아미노산 서열 (표 8) (예를 들어, 항체 18C6의 VL)을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH의 VH CDR (예를 들어, 표 1, 3, 또는 5에 제시된 바와 같음) 및 표 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL의 VL CDR (예를 들어, 표 2, 4, 또는 6에 제시된 바와 같음)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 그의 VH 도메인 단독, 또는 그의 VL 도메인 단독, 또는 그의 세 가지 VH CDR 단독, 또는 그의 세 가지 VL CDR 단독에 의해 개시될 수 있다. 예를 들어, 각각, 인간 경쇄 또는 중쇄 라이브러리로부터 상보적인 경쇄 또는 중쇄를 확인하여, 높은 친화도 또는 본래의 항체의 친화도보다 더 높은 친화도를 갖는 인간화된 항체의 생성에 의한 마우스 항-αvβ3 항체의 인간화를 개시하고 있으며, 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915]을 참조한다. 또한, 특이적 VH 도메인 (또는, VL 도메인)을 사용하여, 상보적 가변 도메인에 대해 라이브러리를 스크리닝함으로써, 특이적 항원과 결합하는 항체를 생성하는 방법을 개시하고 있으며, 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628]을 참조한다. 또한, 특이적 VH 도메인을 사용하여, 상보적 VL 도메인에 대해 라이브러리 (예를 들어, 인간 VL 라이브러리)를 스크리닝하고; 선택된 VL 도메인이 그 후 추가의 상보적 (예를 들어, 인간) VH 도메인의 선택의 가이드를 위해 사용될 수 있는, 특이적 항원과 결합하는 항체를 생성하는 방법을 개시하고 있으며, 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간화된 항체, 예를 들어, 설치류 항체의 인간화된 형태일 수 있다. 인간화된 항체는, 이로 제한되는 것은 아니나, CDR-이식 (유럽 특허 EP 239,400호; 국제 공개 WO 91/09967호; 및 미국 특허 제 5,225,539호, 제 5,530,101호 및 제 5,585,089호), 사슬 셔플링 (shuffling) (미국 특허 제 5,565,332호), 베니어링 (veneering) 또는 재표면화 (유럽 특허 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973]) 및 예를 들어, 미국 특허 제 6,407,213호, 미국 특허 제 5,766,886호, WO 9317105, 문헌 [Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)], Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), 및 Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002)]에 기재된 기법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여, 생성할 수 있다. 또한, 미국 특허 공개 US 2005/0042664 A1 (2005, 2, 24)를 참조하며, 각각의 상기 문헌은 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 복합 인간 항체일 수 있다. 복합 인간 항체는, 예를 들어, T 세포 에피토프를 회피함으로써, 생성된 항체의 면역원성을 최소화하는 방식으로 다중 인간 항체 가변 영역 서열의 단편으로부터 가변 영역 서열을 설계하여, 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Baker et al., 2010, Self Nonself., 1(4):314-322; Bryson et al., 2010, BioDrugs, 24(1):1-8; 및 Jones et al., 2009, Methods Mol Biol., 525:405-23] 참조). 이러한 항체는 인간 불변 영역 서열, 예를 들어, 인간 경쇄 및/또는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 탈면역화된 항체일 수 있다. 탈면역화된 항체는, T-세포 에피토프가 제거된 항체이다. 탈면역화된 항체의 제조 방법은 개시된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Methods Mol Biol. 2009;525:405-23, xiv, 및 De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148-153(2006)]을 참조한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 각각 표 1, 표 2 및 표 3 및 표 4, 표 5 및 표 6의 임의의 항체의 3 VH CDR 및 3 VL CDR (즉, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3), 간 유래 프레임워크 영역 및 인간 유래 불변 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린이다. 인간 프레임워크 영역의 비제한적인 예는 당업계에 개시되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]을 참조한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 인간 프레임워크 영역이거나, 인간 프레임워크 영역으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, VL 도메인 및/또는 VH 도메인의 프레임워크 영역)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 영장류 (예를 들어, 비-인간 영장류) 프레임워크 영역이거나, 영장류 (예를 들어, 비-인간 영장류) 프레임워크 영역으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, VL 도메인 및/또는 VH 도메인의 프레임워크 영역)을 포함한다. 예를 들어, 전형적으로 설치류 유래 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 항원-특이적 비-인간 항체 CDR이 상동성 인간 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 올드 월드 유인원 (Old World ape), 예를 들어, 판 트로글로디테스 (Pan troglodytes), 판 파니스쿠스 (Pan paniscus) 또는 고릴라 고릴라 (Gorilla gorilla), 판 트로글로디테스 (Pan troglodytes), 올드 월드 원숭이 (Old World monkey), 예를 들어, 마카카 (Macaca) 속의, 또는 사이노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey)인 마카카 사이노몰거스 (Macaca cynomolgus))로 이식된다. 비-인간 영장류 프레임워크 서열은 미국 특허 출원 공개 US 2005/0208625호에 개시되어 있다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 영역에서의 VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3의 위치 및/또는 VL 영역에서의 VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR2의 위치는, (i)제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 유지되고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여가 유지되고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입의 억제가 유지되는 한 (예를 들어, 실질적으로, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 유지되는 한), 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 아미노산 위치에 의해, 달라질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH 영역에서의 VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3의 길이 및/또는 VL 영역에서의 VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR2의 길이는, (i)제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 유지되고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여가 유지되고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입의 억제가 유지되는 한 (예를 들어, 실질적으로, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 유지되는 한), 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 아미노산에 의해, 달라질 수 있다 (예를 들어, 더 짧아지거나, 더 길어질 수 있음). 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3의 카르복시 말단은, (i)제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 유지되고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여가 유지되고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입의 억제가 유지되는 한 (예를 들어, 실질적으로, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 유지되는 한), 본 명세서에 개시된 하나 이상의 CDR과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 아미노산에 의해, 연장되거나, 짧아질 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역특이적으로 결합하다" "면역특이적으로 인식하다" "특이적으로 결합하다" 및 "특이적으로 인식하다"는 항체의 맥락에서 유사한 용어이고, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원-결합 부위를 통해 항원 (예를 들어, 에피토프 또는 면역 복합체)과 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 지칭하며, 항원과 항체 또는 항원 결합 단편의 교차 반응성을 배제하지 않는다. (i)제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 유지되고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여가 유지되고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입의 억제가 유지되는지를 확증하기 위해, 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, ELISA 결합 분석 또는 FAC 분석이 사용될 수 있다.
구체적 양상에서, 항체 중쇄 및/또는 경쇄, 예를 들어, 중쇄 단독, 경쇄 단독, 또는 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 중쇄와 관련하여, 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄는 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 무 (μ) 중쇄일 수 있다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄는 인간 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 무 (μ) 중쇄를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하고; (ii) 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있고; (iii) MUC16의 상기 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 103, 서열 번호 104 및 서열 번호 105, 각각 서열 번호 109, 서열 번호 110 및 서열 번호 111, 또는 각각 서열 번호 115, 서열 번호 116 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, 중쇄의 불변 영역이 인간 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 무 (μ) 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호교환적이며, 당업계에서의 그의 통상의 의미를 갖는다. 상기 불변 영역은 항체의 일부, 예를 들어, 항체의 항원과의 결합에 직접 관여하지 않으나, Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 효과기 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복시 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 대체적으로, 면역글로불린 가변 도메인과 비교하여 더 보존된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 표 1, 표 3, 또는 표 5에 열거된 것)을 포함하고, 중쇄의 불변 영역이 인간 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 무 (μ) 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄의 불변 영역이 인간 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 무 (μ) 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은,중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 21, 서열 번호 41, 서열 번호 61, 또는 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄의 불변 영역인 인간 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 무 (μ) 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 103, 서열 번호 104 및 서열 번호 105, 또는 각각 서열 번호 109, 서열 번호 110; 또는 서열 번호 111, 또는 각각 서열 번호 115, 서열 번호 116, 또는 서열 번호 117의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, 중쇄의 불변 영역이 인간 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 임의의 하나의 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 VH CDR의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 표 1, 표 3 및 표 5에 열거된 것)을 포함하고, 중쇄의 불변 영역이 인간 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄의 불변 영역이 인간 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 임의의 하나의 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 VH CDR의 아미노산 서열 (즉, 표 7에 열거된 것)을 포함하고, 중쇄의 불변 영역이 인간 중쇄 불변 영역인 중쇄를 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 당업계에 개시되어 있고, 예를 들어, 전술된 문헌 [Kabat EA et al., (1991)]을 참조한다.
경쇄와 관련하여, 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄는 카파 경쇄이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄는 람다 경쇄이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 항체 서열 번호 106, 서열 번호 107 및 서열 번호 108, 또는 각각 서열 번호 112, 서열 번호 113 및 서열 번호 114, 또는 각각 서열 번호 118, 서열 번호 119 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, 경쇄의 불변 영역이 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역인 경쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3 (즉, 표 2, 표 4, 또는 표 6에 열거된 것)을 포함하고, 경쇄의 불변 영역이 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역인 경쇄를 포함한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄의 불변 영역이 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역인 경쇄를 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 2, 서열 번호 22, 서열 번호 42, 서열 번호 62, 또는 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄의 불변 영역이 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역인 경쇄를 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 106, 서열 번호 107 및 서열 번호 108, 또는 각각 서열 번호 112, 서열 번호 113 및 서열 번호 114, 또는 각각 서열 번호 118, 서열 번호 119 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, 경쇄의 불변 영역이 인간 경쇄 불변 영역의 아미노산을 포함하는 경쇄를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 임의의 하나의 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 VL CDR의 아미노산 서열 (즉, 표 2, 표 4 및 표 6에 열거된 것)을 갖는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, 경쇄의 불변 영역이 인간 경쇄 불변 영역인 경쇄를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄의 불변 영역이 인간 경쇄 불변 영역인 경쇄를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이 임의의 하나의 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 VL CDR의 아미노산 서열 (즉, 표 8에 열거된 것)을 포함하고, 경쇄의 불변 영역인 인간 경쇄 불변 영역인 경쇄를 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 당업계에 개시되어 있고, 예를 들어, 전술된 문헌 [Kabat EA et al., (1991)]을 참조한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본 명세서에 개시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자, 또는 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자에서 발견되는 유형이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본 명세서에서 제공되는 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하고, 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자, 임의의 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 임의의 하위부류 (예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)의 면역글로불린 분자에서 발견되는 유형이다. 특정 실시형태에서, 불변 영역은 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자, 임의의 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 임의의 하위부류 (예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)의 면역글로불린 분자에서 발견되는 유형이다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 중쇄가 (a) 각각 서열 번호 103, 서열 번호 104 및 서열 번호 105, 각각 서열 번호 109, 서열 번호 110 및 서열 번호 111, 또는 각각 서열 번호 115, 서열 번호 116 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하고, (b) 인간 IgG 중쇄의 불변 도메인인 불변 중쇄 도메인을 포함하고/하거나; (ii) 경쇄가 (a) 각각 서열 번호 106, 서열 번호 107 및 서열 번호 108, 또는 각각 서열 번호 112, 서열 번호 113 및 서열 번호 114, 또는 각각 서열 번호 118, 서열 번호 119 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 가변 영역 및 (b) 인간 IgG의 불변 도메인인 불변 경쇄 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 중쇄가 (a) 임의의 하나의 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 VH CDR의 아미노산 서열 (즉, 표 1, 표 3 및 표 5에 열거된 것)을 갖는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하고, (b) 인간 IgG 중쇄의 불변 도메인인 불변 중쇄 도메인을 포함하고/하거나; (ii) 경쇄가 (a) 임의의 하나의 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 VL CDR의 아미노산 서열 (즉, 표 2, 표 4 및 표 6에 열거된 것)을 갖는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 가변 영역 및 (b) 인간 IgG의 불변 도메인인 불변 경쇄 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 중쇄가 (a) 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 및 (b) 인간 IgG의 불변 도메인인 불변 중쇄 도메인을 포함하고/하거나; (ii) 경쇄가 (a) 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 및 (b) 인간 카파 경쇄의 불변 도메인인 불변 경쇄 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 중쇄가 (a) 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VH의 아미노산 서열 (즉, 표 7에 열거된 것)을 포함하는 가변 영역 및 (b) 인간 IgG의 불변 도메인인 불변 중쇄 도메인을 포함하고/하거나; (ii) 경쇄가 (a) 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VL의 아미노산 서열 (즉, 표 8에 열거된 것)을 포함하는 가변 영역 및 (b) 인간 카파 경쇄의 불변 도메인인 불변 경쇄 도메인을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 1 내지 100 중 임의의 하나와 비교하여, 하기에서 개시되는 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 2개의 서열 (예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 사이의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 수학적 알고리즘이 사용될 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예는 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877]의 것에서 변형된 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 통합된다. 본 명세서에 개시된 핵산 분자에 대한 뉴클레오티드 서열 상동성을 얻기 위해, BLAST 뉴클레오티드 검색이 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어, 점수=100, 단어길이=12로 수행될 수 있다. 본 명세서에 개시된 단백질 분자에 대한 아미노산 서열 상동성을 얻기 위해, BLAST 단백질 검색이 XBLAST 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어, 점수=50, 단어길이=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬 (gapped alignment)을 얻기 위해, 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402]에 개시된 바와 같은 갭 BLAST가 사용될 수 있다. 대안적으로, 분자 사이의 거리 유지 관계를 검출하는 반복 검색 (iterated search)은 PSI BLAST (Id.)에 의해 수행될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI Blast 프로그램이 사용되는 경우, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다 (예를 들어, 월드와이드 웹 [ncbi.nlm.nih.gov]의 [National Center for Biotechnology Information (NCBI)] 참조). 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비제한적인 예는 문헌 [Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열의 비교를 위해 ALIGN 프로그램이 사용되는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티가 사용될 수 있다. 또한, 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는, 전술된 것과 유사한 것으로서, 갭이 허용되거나, 허용되지 않는 기법을 사용하여, 결정될 수 있다. 전형적으로, 동일성 퍼센트의 계산 시에, 단지 정확한 매칭 (matching)만이 계수된다.
특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 101의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 1B5 중 어느 하나의 VH의 아미노산 서열 (즉, 표 7에 열거된 것)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 101의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하며, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 제시된 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)과 동일한 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)을 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VH의 아미노산 서열 (즉, 표 7에 열거된 것)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하며, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 제시된 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)과 동일한 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)을 포함한다.
특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 1B5 중 어느 하나의 VL의 아미노산 서열 (즉, 표 8에 열거된 것)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 제시된 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)과 동일한 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)을 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VL의 아미노산 서열 (즉, 표 7에 열거된 것)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 제시된 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)과 동일한 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)을 포함한다.
특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은: (i) 서열 번호 101의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인; 및 (ii) 서열 번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은: (i) 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VH의 아미노산 서열 (즉, 표 8에 열거된 것)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인; 및 (ii) 각각 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VL의 아미노산 서열 (즉, 표 7에 열거된 것)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은: (i) 서열 번호 101의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인; 및 (ii) 서열 번호 102의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 제시된 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)과 동일한 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)을 포함한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은: (i) 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VH의 아미노산 서열 (즉, 표 8에 열거된 것)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인; 및 (ii) 각각 항체 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 18C6 중 어느 하나의 VL (즉, 표 7에 열거된 것)의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 또는 표 6에 제시된 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)과 동일한 CDR (예를 들어, VH CDR 및/또는 VL CDR)을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 및/또는 16C5)의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 항체가 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 당업계의 용어이고, 항체가 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소 영역을 지칭할 수 있다. 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드의 인접 아미노산일 수 있거나 (직쇄형 또는 인접 에피토프), 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 둘 이상의 비인접 영역으로부터 함께 유래할 수 있다 (입체형태, 비-직쇄형, 불연속, 또는 비인접 에피토프). 특정 실시형태에서, 상기 항체의 에피토프는, 예를 들어, NMR 분광분석법, X-선 회절 결정학 연구, ELISA 분석, 질량 분광분석법 (예를 들어, MALDI 질량 분광분석법)에 커플링된 수소/중수소 교환, 어레이-기반 올리고-펩티드 스캐닝 분석, 및/또는 돌연변이유발 매핑 (예를 들어, 부위-유도 돌연변이유발 매핑)에 의해 결정될 수 있다. X-선 결정학의 경우, 결정화는 당업계에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 문헌 [Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303])을 사용하여 달성될 수 있다. 항체:항원 결정은 잘 알려진 X-선 회절 기법을 사용하여, 연구될 수 있으며, 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 X-PLOR (문헌 [Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.; 예를 들어, 문헌 [Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; 미국 특허 출원 제 2004/0014194호), 및 BUSTER (문헌 [Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323])를 사용하여, 정련될 수 있다.
돌연변이유발 매핑 연구는 당업자에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기법을 포함하는 돌연변이유발 기법의 설명을 위해, 예를 들어 문헌 [Champe M et al., (1995) and Cunningham BC & Wells JA (1989)]을 참조한다. 또한, 동일하거나, 중첩되는 에피토프를 인식 및 결합하는 항체는, 예를 들어 하나의 항체의 항원을 표적화하는 또 다른 항체의 결합을 블로킹하는 능력을 나타냄으로써, 즉 경쟁 결합 분석에 의해, 면역분석과 같은 일상적인 기법을 사용하여, 확인될 수 있다. 경쟁 결합 분석은 또한, 2개의 항체가 에피토프에 대한 유사한 결합 특이성을 갖는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 경쟁 결합은, 시험대상 면역글로불린이 공통 항원에 대한 기준 항체의 면역특이적 결합을 억제하는 분석에서 결정될 수 있다. 다양한 유형의 경쟁 결합 분석, 예를 들어: 고상의 직접적 또는 간접적 방사성면역분석 (RIA), 고상의 직접적 또는 간접적 효소 면역분석 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (문헌 [Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253] 참조); 고상의 직접적 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614-9] 참조); 고상의 직접적 표지 분석, 고상의 직접적 표지 샌드위치 분석 (문헌 [Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용한 고상의 직접적 표지 RIA (문헌 [Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15] 참조); 고상의 직접적 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546-52]); 및 직접적 표지 RIA (문헌 [Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82])가 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 이들 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린을 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁 억제는 시험 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써, 측정될 수 있다. 일반적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 일반적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 공통 항원에 대한 기준 항체의 면역특이적 결합을 적어도 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75% 이상 억제할 것이다. 경쟁 결합 분석은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여, 다양한 상이한 형태로 구성될 수 있다. 이러한 분석의 통상적인 버전에서, 항원은 96 웰 플레이트 상에 고정화된다. 그 후, 비표지된 항체의 항원에 대한 표지된 항체의 결합을 블로킹하는 능력을 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다. 추가의 상세 사항을 위해, 예를 들어, 문헌 [Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editors supra, pp. 386-389]을 참조한다.
특정 양상에서, 경쟁 결합 분석은, 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여, 다양한 상이한 형태로 구성될 수 있는 경쟁 ELISA 분석과 같은 경쟁 결합 분석에서, 항체가 또 다른 항체에 의해, 예를 들어 투여량 의존적 방식으로, 경쟁적으로 블로킹되는지 여부, 예를 들어, 2개의 항체가 동일하거나, 입체구조적으로 중첩되는 에피토프를 인식하는 경우, 항체가 기준 항체와 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프와 필수적으로 결합하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 16C5의 가변 영역을 함유하는 쥣과 동물 IgG 항체)에 의한 경쟁 결합 분석에서 시험될 수 있다.
또 다른 양상에서, 당업자에 공지되거나, 본 명세서에 개시된 분석 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 결정되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 16C5의 가변 영역을 함유하는 쥣과 동물 IgG 항체)과 MUC16에 대한 결합에서 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 항체가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 양상에서, 당업자에 공지되거나, 본 명세서에 개시된 분석 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 결정되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 10C6, 7B12, 19C11, 16C5, 또는 16C5의 가변 영역을 함유하는 쥣과 동물 IgG 항체)을 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁적으로 억제하는 항체가 본 명세서에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 MUC16에 대한 결합에서 자체-경쟁하는 것과 동일한 정도로 결합에 대해 본 명세서에 개시된 항체와 경쟁하는 항체가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16에 대한 결합에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 경쟁하는 제1 항체가 본 명세서에서 제공되며, 경쟁은, 에피토프에 대한 제1 항체의 결합이 80% 초과 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 98%, 또는 80% 내지 85%, 80% 내지 90%, 85% 내지 90%, 또는 85% 내지 95%)에 의해 감소된 바와 같이 나타난다.
구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 표 1, 표 3, 또는 표 5에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 10C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 7B12의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 19C11의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 16C5의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 18C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 표 2, 표 4, 또는 표 6에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 10C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 7B12의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 19C11의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 16C5의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 18C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a)표 1, 표 3, 또는 표 5에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 표 2, 표 4, 또는 표 6에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 10C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 10C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 7B12의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 7B12의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 19C11의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 19C11의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 16C5의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 16C5의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 18C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 18C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 표 7에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 표 8에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 서열 번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 표 7에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 표 8에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, (a) 서열 번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, 표 1, 표 3, 또는 표 5에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 10C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 7B12의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, MUC16과의 면역특이적 결합에 대해, 19C11의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 경쟁 (예를 들어, 투여량 의존적 방식)하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 16C5의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 18C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, 표 2, 표 4, 또는 표 6에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 10C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 7B12의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 19C11의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 16C5의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 18C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, (a) 표 1, 표 3, 또는 표 5에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 표 2, 표 4, 또는 표 6에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, (a) 10C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 10C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, (a) 7B12의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 7B12의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, (a) 19C11의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 19C11의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, (a) 16C5의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 16C5의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, (a) 18C6의 VH CDR (표 1, 표 3 및 표 5 참조); 및 (b) 18C6의 VL CDR (표 2, 표 4 및 표 6 참조)을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 표 7에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, 표 8에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, 서열 번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
구체적 양상에서, (a) 표 7에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b)표 8에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, (a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, (a) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, (a) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, (a) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 양상에서, (a) 서열 번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 본 명세서에서 제공된다.
2개의 항체가 동일한 에피토프와 결합하는지를 결정하는데, 당업자에 공지되거나, 본 명세서에 개시된 분석 (예를 들어, X-선 결정학, ELISA 분석 등)이 사용될 수 있다. 친화도는, 이에 제한되는 것은 아니나, 평형 해리 상수 (KD) 및 평형 결합 상수 (KA)를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. KD는 생물학적 층 간섭계법 (biolayer interferometry)과 같은 당업자에 공지 된 기법에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 에피토프는 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용된다. 예를 들어, 항체 생성 방법을 위해, 섹션 5.3 및 섹션 6.2를 참조한다.
5.1.2 기능적 특성
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 0.5x10-3/s, 1x10-3/s, 1.5x10-3/s, 2x10-3/s, 2.5x10-3/s, 3x10-3/s, 4x10-3/s, 5x10-3/s, 6x10-3/s, 7x10-3/s, 8x10-3/s, 9x10-3/s, 1x10-4/s, 2x10-4/s, 3x10-4/s, 4x10-4/s, 5x10-4/s, 6x10-4/s, 7x10-4/s, 또는 8x10-4/s 미만의 kd로 MUC16과 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 0.5x10-3/s, 1x10-3/s, 1.5x10-3/s, 2x10-3/s, 2.5x10-3/s, 3x10-3/s, 4x10-3/s, 5x10-3/s, 6x10-3/s, 7x10-3/s, 8x10-3/s, 9x10-3/s, 1x10-4/s, 2x10-4/s, 3x10-4/s, 4x10-4/s, 5x10-4/s, 6x10-4/s, 7x10-4/s, 또는 8x10-4/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 0.5x10-3/s 내지 8x10-4/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 1x10-3/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 1.5x10-3/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 2x10-3/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 2x10-4/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 7x10-4/s의 kd로 MUC16과 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 2.5x104/s, 3x104/s, 3.5x104/s, 4x104/s, 4.5x104/s, 5x104/s, 5.5x104/s, 6x104/s, 6.5x104/s, 7x104/s, 7.5x104/s, 8x104/s, 9x104/s, 또는 9x105/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 2.5x104/s, 3x104/s, 3.5x104/s, 4x104/s, 4.5x104/s, 5x104/s, 5.5x104/s, 6x104/s, 6.5x104/s, 7x104/s, 7.5x104/s, 8x104/s, 9x104/s, 또는 9x105/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 4x104/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 6x104/s의 kd로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 7.5x104/s의 kd로 MUC16과 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 또는 0.05 nM 미만의 KD로 MUC16과 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 또는 0.05 nM의 KD로 MUC16과 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 500 nM 내지 1000 nM의 KD로 MUC16과 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 5 nM 내지 75 nM의 KD로 MUC16과 결합한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 7 nM의 KD로 MUC16과 결합한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 10 pM의 KD로 MUC16과 결합한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 15 pM의 KD로 MUC16과 결합한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 20 pM의 KD로 MUC16과 결합한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 25 pM의 KD로 MUC16과 결합한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 65 pM의 KD로 MUC16과 결합한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 수치 또는 수적 범위를 수식하기 위해 사용되는 경우, 용어 "약"은, 상기 값 또는 범위의 5% 내지 10% 초과 및 5% 내지 10% 미만의 편차가 열거된 값 또는 범위의 의도된 의미 내에 있다는 것을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 결합한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 암세포 (예를 들어, 난소암 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 유방암 세포, 나팔관암 세포, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막암) 세포, 또는 원발성 복막암 세포)이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 난소암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 폐암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 췌장암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 유방암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 자궁암 (예를 들어, 자궁내막암) 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 나팔관암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 원발성 복막암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 SKOV3 세포이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 아이소타입 대조군 항체가 상기 세포와 결합하는 것보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 또는 1000배 더 많이 결합한다. 아이소타입 대조군 항체는 당업계에서 인정되는 용어이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 아이소타입 대조군 항체가 상기 세포와 결합하는 것보다 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 또는 1000배 더 많이 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 아이소타입 대조군 항체가 상기 세포와 결합하는 것보다 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 250, 250 내지 500, 또는 500 내지 1000배 더 많이 결합한다.
서열 번호 133의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114로서 지칭되고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기 (성숙한 MUC16의 서열은 서열 번호 150임)로 이루어진다. MUC16c114는 서열 번호 133의 위치 1, 24 및 30의 아스파라긴 아미노산 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1777, Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합이 결여되어 있다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 난소암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 폐암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 췌장암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 유방암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 자궁 (예를 들어, 자궁내막) 암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 나팔관 암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 원발성 복막암 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 SKOV3 세포이다. 특정 실시형태에서, MUC16의 제2 형태는 검출 가능한 단백질, 예를 들어, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질에 융합된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 아이소타입 대조군 항체가 상기 세포와 결합하는 것보다 최대한 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 또는 5배 더 많이 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 아이소타입 대조군 항체가 상기 세포와 결합하는 것보다 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 또는 5배 더 많이 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 아이소타입 대조군 항체가 상기 세포와 결합하는 것보다 0 내지 1.1, 1.1 내지 1.5, 1.5 내지 3, 또는 3 내지 5배 더 많이 결합한다.
서열 번호 139의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114 -N3으로서 지칭된다. MUC16c114 -N3은, 아미노산 위치 30의 아스파라긴 (서열 번호 150의 아미노산 위치 1806에 상응함)이 알라닌으로 변이된 것을 제외하고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기 (성숙한 MUC16의 서열은 서열 번호 150임)로 이루어진다. 따라서, MUC16c114 -N3은 서열 번호 139의 아미노산 위치 30 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1806에 상응함)에서 N-당화될 수 없다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 4H11이 상기 세포와 결합하는 것보다 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 또는 40배 더 적게 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 4H11이 상기 세포와 결합하는 것보다 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 또는 40배 더 적게 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 제2 형태가 비당화되어 있고, 제2 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제2 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와, 4H11이 상기 세포와 결합하는 것보다 3 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 또는 20 내지 40배 더 적게 결합한다.
본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 세포의 결합을 측정하기 위한 분석, 예를 들어, 예를 들어, FAC는 당업자게 공지되어 있다. 예를 들어, 섹션 6.2에 개시된 방법을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "4H11"은 문헌 [Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72] 및 국제 특허 출원 공개 WO 2011/119979호에 4H11로 명명된 단일클론 항-MUC16 항체를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)을 포함하는 펩티드와 결합하고, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)의 아미노산 잔기 번호 4 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10 (N10)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 펩티드는 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)로 이루어지고, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)의 아미노산 잔기 번호 4 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10 (N10)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스로 이루어진다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)을 포함하는 펩티드와 결합하고, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)의 아미노산 잔기 번호 7 (N7)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 펩티드는 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)로 이루어지고, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)의 아미노산 잔기 번호 7 (N7)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스로 이루어진다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 펩티드의 혼합물과 결합하고, 상기 펩티드의 혼합물은 (a) 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)을 포함하고, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)의 아미노산 잔기 번호 4 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10 (N10)이 당화된 제1 펩티드 및 (b) 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)을 포함하고, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)의 아미노산 잔기 번호 7 (N7)가 당화된 제2 펩티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 펩티드는 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)로 이루어지고, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)의 아미노산 잔기 번호 4 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10 (N10)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 제2 펩티드는 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)로 이루어지고, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)의 아미노산 잔기 번호 7 (N7)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스로 이루어진다.
예를 들어, ELISA와 같은, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 세포의 결합을 결정하기 위한 분석은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, 섹션 6.2에 개시된 방법을 참조한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 펩티드(들)에 대해, 상기 펩티드와 항-MUC16 단일클론 항체 4H11의 결합보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 30배 더 많이 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 펩티드(들)에 대해, 상기 펩티드와 항-MUC16 단일클론 항체 4H11의 결합보다 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 30배 더 많이 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 0.5x10-3/s, 1x10-3/s, 1.5x10-3/s, 2x10-3/s, 2.5x10-3/s, 3x10-3/s, 4x10-3/s, 5x10-3/s, 6x10-3/s, 7x10-3/s, 8x10-3/s, 9x10-3/s, 1x10-4/s, 2x10-4/s, 3x10-4/s, 4x10-4/s, 5x10-4/s, 6x10-4/s, 7x10-4/s, 또는 8x10-4/s 미만의 kd로 펩티드(들)와 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 0.5x10-3/s, 1x10-3/s, 1.5x10-3/s, 2x10-3/s, 2.5x10-3/s, 3x10-3/s, 4x10-3/s, 5x10-3/s, 6x10-3/s, 7x10-3/s, 8x10-3/s, 9x10-3/s, 1x10-4/s, 2x10-4/s, 3x10-4/s, 4x10-4/s, 5x10-4/s, 6x10-4/s, 7x10-4/s, 또는 8x10-4/s의 kd로 펩티드(들)와 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 0.5x10-3/s 내지 8x10-4/s의 kd로 펩티드(들)와 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 2.5x104/s, 3x104/s, 3.5x104/s, 4x104/s, 4.5x104/s, 5x104/s, 5.5x104/s, 6x104/s, 6.5x104/s, 7x104/s, 7.5x104/s, 8x104/s, 9x104/s, 또는 9x105/s의 kd로 펩티드(들)와 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 2.5x104/s, 3x104/s, 3.5x104/s, 4x104/s, 4.5x104/s, 5x104/s, 5.5x104/s, 6x104/s, 6.5x104/s, 7x104/s, 7.5x104/s, 8x104/s, 9x104/s, 또는 9x105/s의 kd로 펩티드(들)와 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 2.5x104/s 내지 9x105/s의 kd로 펩티드(들)와 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 또는 0.05 nM 미만의 KD로 펩티드(들)와 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 또는 0.05 nM의 KD로 펩티드(들)와 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 500 nM 내지 1000 nM의 KD로 펩티드(들)와 결합한다.
특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 항원 결합 단편은 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)과의 면역특이적 결합이 결여되어 있고, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)의 아미노산 잔기 번호 4 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10 (N10)은 당화되어 있지 않다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)과의 면역특이적 결합이 결여되어 있고, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)의 아미노산 잔기 번호 7 (N7)은 당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 펩티드의 혼합물과의 면역특이적 결합이 결여되어 있고, 상기 펩티드의 혼합물은 (a) 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)로 이루어지고, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 130)의 아미노산 잔기 번호 4 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10 (N10)이 당화된 제1 펩티드 및 (b) 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)로 이루어지고, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호 131)의 아미노산 잔기 번호 7 (N7)이 당화된 제2 펩티드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 당화되어 있고, MUC16의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 형태 (MUC16c114)를 제조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제한다. 특정 실시형태에서, 당화된 MUC16c114를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 아미노산 잔기 Asn30 (성숙한 MUC16 (서열 번호 150)의 Asn1806에 상응함)에서 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 아미노산 잔기 Asn24 및 Asn30 (각각, 성숙한 MUC16 (서열 번호 150)의 Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 아미노산 잔기 Asn1, Asn24 및 Asn30 (각각, 성숙한 MUC16 (서열 번호 150)의 Asn1777, Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 매트리겔 침입은, 세포가 대조군 항체 (예를 들어, MUC16을 표적화하지 않는 항체) 또는 4H11로 처리된 세포의 시험관내 매트리겔 침입과 비교하여, 적어도 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 억제된다. 특정 실시형태에서, 매트리겔 침입은, 세포가 대조군 항체 (예를 들어, MUC16을 표적화하지 않는 항체) 또는 4H11로 처리된 세포의 시험관내 매트리겔 침입과 비교하여, 약 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 억제된다.
매트리겔 침입의 MUC16 당화 항체- 또는 항원 결합 단편-매개된 억제를 측정하기 위한 분석은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, 섹션 6.2에 개시된 방법을 참조한다. 예를 들어, BD BioCoat™ Matrigel™ 침입 삽입물 또는 챔버 (24 웰 플레이트의 카탈로그 # 354480) 및 대조군 삽입물 (24 웰 플레이트의 카탈로그 # 354578)은 미국 미주리주 소재의 BD Biosciences로부터 구입할 수 있다. 매트리겔 침입 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 간략히 말하면, 24 웰 플레이트의 매트리겔 챔버 (-20℃에서 저장됨) 및 대조군 삽입물 (4℃에서 저장됨)이 실온이 되도록 한다. 삽입물 둘 모두를 37℃ 5% CO2의 습윤한 인큐베이터에서 2시간 동안 24 웰 플레이트의 외부 웰뿐만 아니라, 삽입물에서, 0.5 mL의 무혈청 배지에 의해, 재수화시킨다. 배양된 SKOV3 세포를 트립신 처리하고, 배양 배지로 세척한다. 1 x 106개의 세포를 또 다른 원심분리 튜브로 분리시키고, 무혈청 배지로 3회 세척한다. 그 후, 이들 세포를 0.5 mL의 무혈청 배지에서 5,000개의 세포가 제공되도록 조정한다. 재수화된 삽입물의 배지를 제거하고, 웰 중에 0.75 mL의 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 배양 배지를 함유하는 새로운 24 웰 플레이트로 삽입물을 옮겼으며, 이는 화학유인물질로서 기능한다. 즉시, 무혈청 배지 중 0.5 mL의 세포 (5,000개의 세포)를 삽입물에 첨가한다. 기포가 삽입물 및 외부 웰에 포획되지 않았음을 알기 위해, 적절한 조치를 취한다. 24 웰 플레이트를 37℃ 5% CO2의 습윤한 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 솜이 부착된 면봉을 매트리겔 또는 대조군 삽입물 내로 삽입하고, 막 표면 상에서 면봉의 끝을 이동시키면서, 부드럽게 압력을 가하여, "스크럽 (scrubbing)"함으로써, 막의 상부 표면으로부터 비침입 세포를 제거한다. 배지로 적신 두 번째 면봉으로 스크럽을 반복한다. 이어서, 삽입물을 30분 동안 증류수 중의 0.5% 크리스탈 바이올렛 염색 (crystal violet stain) 0.5 mL를 함유하는 새로운 24 웰 플레이트에서 염색한다. 염색 후, 삽입물을 과량의 염색을 제거하기 위해, 개의 비이커의 증류수에서 세정한다. 삽입물을 새로운 24 웰 플레이트에서 공기 건조한다. 침입된 세포를 200X 배율의 도립 현미경 하에서 수작업으로 계산한다. 삼중 막의 여러 필드를 계수하고, 그 수치를 기록하였다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마우스 모델 연구에서 전이를 억제 또는 감소시키고, 종양 성장을 억제하거나, 종양 퇴화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주를 흉선 제거 누드 마우스 내로 도입시킬 수 있고, 흉선 제거 마우스에 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 1회 이상 투여할 수 있으며, 주사된 종양 세포의 종양 진행을 수주 및/또는 수개월의 기간 동안 모니터링할 수 있다. 일부 경우에, 투여 of the MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 흉선 제거 누드 마우스로의 투여는 종양 세포주의 도입 전에 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포가 본 명세서에 개시된 마우스 이종이식 모델을 위해 사용된다. 예를 들어, 섹션 6.2 및 섹션 6.3을 참조한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마우스 모델에서, 본 명세서에 개시되거나, 당업자에 공지된 방법에 의해 평가된 바와 같이, 모의 처리된 마우스와 비교하여, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%에 의해, 종양 성장을 억제하거나, 종양 퇴축을 유도한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마우스 모델에서, 본 명세서에 개시되거나, 당업자에 공지된 방법에 의해 평가된 바와 같이, 모의 처리된 마우스와 비교하여, 적어도 약 25% 또는 35%에 의해, 선택적으로 약 75%까지, 종양 성장을 억제하거나, 종양 퇴축을 유도한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마우스 모델에서, 본 명세서에 개시되거나, 당업자에 공지된 방법에 의해 평가된 바와 같이, 모의 처리된 마우스와 비교하여, 적어도 약 1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배에 의해, 종양 성장을 억제하거나, 종양 퇴축을 유도한다. 모의 처리된 마우스는, 예를 들어, 인산염 완충 식염수 또는 대조군 (예를 들어, 항-IgG 항체)에 의해 처리될 수 있다.
예를 들어, 일정 기간의 종양 크기의 모니터링, 예를 들어 감지가능한 종양의 물리적 측정 또는 다른 시각적 검출 방법에 의해, 종양 성장 억제 또는 종양 퇴축의 결정을 평가할 수 있다. 예를 들어, 시각화 제제, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼라제를 재조합적으로 발현하는 종양 세포주를 생성할 수 있고, 이어서, GFP의 생체내 시각화를 현미경에 의해 실시할 수 있으며, 이종이식 마우스에 루시퍼라제 기질을 투여하고, 루시퍼라제 기질의 루시퍼라제 효소 처리로 인한 발광을 검출함으로써, 루시퍼라제의 생체내 시각화를 실시할 수 있다. GFP 또는 루시퍼라제의 검출 정도 또는 그 수준은 이종이식 마우스의 종양 크기와 관련된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종양 이종이식 모델에서, 모의 처리된 마우스와 비교하여, 동물의 생존을 증가시킬 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종양 이종이식 모델에서, 본 명세서에 개시되거나, 당업자에 공지된 방법에 의해 평가된 바와 같이, 모의 처리된 마우스와 비교하여, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%에 의해, 마우스의 생존을 증가시킨다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종양 이종이식 모델에서, 본 명세서에 개시되거나, 당업자에 공지된 방법에 의해 평가된 바와 같이, 종양 이종이식 모델에서 모의 처리된 마우스와 비교하여, 적어도 약 25% 또는 35%에 의해, 선택적으로 약 75%까지, 마우스의 생존을 증가시킨다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종양 이종이식 모델에서, 본 명세서에 개시되거나, 당업자에 공지된 방법에 의해 평가된 바와 같이, 종양 이종이식 모델에서 모의 처리된 마우스와 비교하여, 적어도 약 1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배에 의해, 마우스의 생존을 증가시킨다. 예를 들어, 종양 세포주 주사 후, 시간 (예를 들어, 수일 또는 수주)에 대한 생존 마우스의 수의 생존 곡선을 도식화함으로써, 생존을 결정할 수 있다. 모의 처리된 마우스를, 예를 들어, 인산염 완충 식염수 또는 대조군 (예를 들어, 항-IgG 항체)으로 처리할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 세포의 접촉 시에, 당화되어 있고, MUC16의 아미노산 서열이 서열 번호 133 (MUC16c114)인 MUC16의 형태를 발현하는 세포 내로 내재화된다. "내재화된" 또는 "내재화"는, 세포에 의해 내재화되는 분자를 지칭하는 경우, 세포막의 세포 외 표면과 접촉 시에, 세포막을 가로질러, 세포막의 세포 내 표면 및/또는 세포의 세포질로의 분자의 통과를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 당화된 MUC16c114를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 아미노산 잔기 Asn30 (성숙한 MUC16 (서열 번호 150)의 Asn1806에 해당함)에서 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 아미노산 잔기 Asn 24 및 Asn30 (각각 성숙한 MUC16 (서열 번호 150)의 Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, MUC16c114의 당화된 형태는 아미노산 잔기 Asn1, Asn24 및 Asn30 (각각 성숙한 MUC16 (서열 번호 150)의 Asn1777, Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화되어 있다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 당화는 N-연결된 키토비오스로 이루어진다.
예를 들어, 방사성 표지된 항체를 사용하는 것과 같은, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 세포로의 내재화를 결정하는 분석은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, 섹션 6.2에 개시된 방법을 참조한다. 예를 들어, 89Zr-표지된 항체의 내재화는 MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포에서 조사할 수 있다. 간략히 말하면, 대략 1 x 105개의 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고, 37℃ 5% CO2의 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다. 일정한 용적의 방사성 표지된 단백질을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 4℃에서, 1, 5, 12 및 24시간 동안 인큐베이션한다. 각각의 인큐베이션 기간 후, 배지를 수집하고, 세포를 1 mL의 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세정한다. 4℃에서 100 mM 글리신이 포함된 1 mL의 100 mM 아세트산 (1:1, pH 3.5)에서 세포를 세척함으로써, 표면-결합된 활성을 수집한다. 이어서, 부착 세포를 1 mL의 1 M NaOH에 의해 용해시킨다. 각각의 세척물을 수집하고, 활성에 대해 계수한다. 최종 세척물 대 모든 세척물의 총 활성의 활성 비를 내재화된 %를 결정하는데 사용한다. 특정 실시형태에서, 분석은 37℃에서 수행한다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 인큐베이션된 세포의 적어도 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 퍼센트에서 내재화된다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 인큐베이션된 세포의 약 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 퍼센트에서 내재화된다. 특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 세포의 접촉 후, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20, 또는 24시간 내에 내재화된다.
5.2 항체 접합체
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 참조)은 임의의 다른 분자, 예를 들어 유기 모이어티, 검출 가능한 표지, 또는 동위원소에 접합되지 않는다. 대안적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 참조)은 하나 이상의 유기 모이어티에 접합되지 않는다. 대안적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하나 이상의 검출 가능한 표지에 접합되지 않는다. 대안적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하나 이상의 동위원소에 접합되지 않는다.
5.2.1 검출 가능한 표지 및 동위원소
특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 참조) 접합체가 본 명세서에서 제공되며, 상기 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하나 이상의 제제, 예를 들어, 영상화제 또는 세포독성제에 접합되어 있다. 또한, 이중특이적 항체 접합체가 본 명세서에서 제공되며, 상기 이중특이적 항체는 하나 이상의 제제, 예를 들어, 영상화제 또는 세포독성제에 접합되어 있다. 또한, 항체 중쇄 접합체가 본 명세서에서 제공되며, 상기 항체 중쇄는 하나 이상의 제제, 예를 들어, 영상화제 또는 세포독성제에 접합되어 있다. 또한, 항체 경쇄 접합체가 본 명세서에서 제공되며, 상기 항체 경쇄는 하나 이상의 제제, 예를 들어, 영상화제 또는 세포독성제에 접합되어 있다. 또한, 융합 단백질 접합체가 본 명세서에서 제공되며, 상기 융합 단백질은 제제, 예를 들어, 영상화제 또는 세포독성제에 접합되어 있다. 특정 실시형태에서, 상기 제제는 공유적으로 또는 비공유적으로 접합된다.
특정 실시형태에서, 상기 영상화제는 검출 가능한 표지, 예를 들어, 발색성, 효소, 방사성동위원소, 동위원소, 형광, 독성, 화학발광, 핵자기공명 조영제 또는 다른 표지이다.
적절한 발색성 표지의 비제한적인 예는 다이아미노벤지딘 및 4-하이드록시아조-벤젠-2-카르복실산을 포함한다.
적절한 효소 표지의 비제한적인 예는 말레이트 탈수소효소, 포도상구균 핵산분해효소, 델타-5-스테로이드 이성질화효소, 효모-알코올 탈수소효소, 알파-글리세롤 포스페이트 탈수소효소, 트라이오스 포스페이트 이성질화효소, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린 에스테라아제를 포함한다.
적절한 방사성 동위원소 표지의 비제한적인 예는 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 223Ra, 223Ra, 89Zr, 177Lu 및 109Pd를 포함한다. 특정 실시형태에서, 111In은 간에서 125I 또는 131I-표지된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 탈할로겐화의 문제를 벗어나도록 하므로, 생체내 영상을 위한 바람직한 동위원소이다. 또한, 111In은 영상을 위해 더 유리한 감마 방출 에너지를 갖는다 (문헌 [Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo et ah, J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)]). 예를 들어, 1-(P-아이소티오시아네이토벤질)-DPTA를 갖는 단일클론 항체에 커플링된 111In은 비종양 조직, 특히 간에서 거의 포획되지 않는 것으로 나타나며, 따라서, 종양 국소화의 특이성을 증강시킨다 (문헌 [Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)]).
적절한 비방사성활성 동위원소 표지의 비제한적인 예는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr 및 56Fe를 포함한다.
적절한 형광 표지의 비제한적인 예는 152Eu 표지, 플루오레세인 표지, 아이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, 그린 형광 단백질 (GFP) 표지, o-프트알데하이드 표지 및 플루오레사민 표지를 포함한다.
화학발광 표지의 비제한적인 예는 루미놀 표지, 아이소루미놀 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라제 표지 및 에쿼린 표지를 포함한다.
핵자기공명 조영제의 비제한적인 예는 중금속 핵, 예를 들어 Gd, Mn 및 철을 포함한다.
상기 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄 및 융합 단백질에 전술된 표지를 접합시키기 위한 당업자에 공지된 기법은, 예를 들어, 문헌 [Kennedy et at., Clin. CMm. Acta 70:1-31 (1976), 및 Schurs et al, Clin. CMm. Acta 81:1-40 (1977)]에 개시되어 있다. 후자의 문헌에서 언급된 커플링 기법은 글루타르알데하이드 방법, 과요오드산염 방법, 다이말레이미드 방법, m-말레이미도벤질-N-하이드록시-숙신이미드 에스테르 방법이며, 상기의 모든 방법은 본 명세서에서 참조로 포함된다.
세포독성제의 비제한적인 예는 세포증식억제성 또는 세포파괴성 제제, 방사성 금속 이온, 예를 들어, 알파-방사체 및 독소, 예를 들어, 슈도모나스 외독소, 아브린, 콜레라 독소, 리신 A 및 디프테리아 독소를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제제는 진단제이다. 진단제는, 항원을 함유하는 세포를 위치화시킴으로써, 질환을 진단 또는 검출하는데 유용한 제제이다. 유용한 진단제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 방사성 동위원소, 염료 (예를 들어, 바이오틴-스트렙타비딘 복합체에 의한 것), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기 공명 영상 (MRI)용 촉진제 (enhancing agent) (예를 들어, 상자성 이온)을 포함한다. 미국 특허 제 6,331,175호는 MRI 기법 및 MRI 촉진제에 접합된 항체의 제조에 대해 개시하고 있으며, 이는 그 전문이 본 명세서에서 참조로 포함된다. 바람직하게는, 진단제는 방사성 동위원소, 자기 공명 영상용 촉진제 및 형광 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방사성 금속 또는 상자성 이온을 갖는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 로딩 (loading)하기 위해, 이온을 결합시키기 위한 다양한 킬레이트기가 부착된 긴 꼬리를 갖는 시약과 반응시킬 필요가 있을 수 있다. 이러한 꼬리는, 예를 들어, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, bis-티오세미카르바존, 폴리옥심 및 이러한 목적에 유용한 것으로 알려진 유사 기와 같은 킬레이트기가 그에 결합할 수 있는 펜던트 기 (pendant group)를 가지는 중합체, 예를 들어 폴리라이신, 다당류, 또는 유도체화되거나, 유도체화가능한 다른 사슬일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 사용하여 항체에 커플링된다. 킬레이트는 일반적으로, 면역반응성 및 최소 응집 및/또는 내부 가교 결합의 손실을 최소화하면서, 분자에 대한 결합 형성을 가능하게 하는 기에 의해 항체에 연결되며, 킬레이트를 항체에 접합시키는 더 이례적인 다른 방법 및 시약이 1989년 4월 25일자로 발행된 호손 (Hawthorne)의 "항체 접합체 (Antibody Conjugates)"라는 명칭의 미국 특허 제 4,824,659호에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합은 2-벤질-DTPA 및 그의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함하며, 이는 방사선 이미징을 위한 진단 동위원소와 함께 사용된다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비방사성 금속과 복합체화되는 경우, 동일한 킬레이트는 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 함께 사용될 때, MRI에 유용하다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 마크로사이클릭 킬레이트 (Macrocyclic chelate)는 각각 다양한 금속 및 방사성 금속, 특히 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성 핵종과 함께 사용된다. 이러한 금속-킬레이트 복합체는 고리 크기를 관심대상 금속에 맞춤으로써, 매우 안정하게 할 수 있다. RAIT에 대한 223Ra와 같이 핵종을 안정하게 결합시키기 위해, 관심대상인 마크로사이클릭 폴리에테르와 같은 다른 고리형 킬레이트가 본 명세서에 포함되어 있다.
특정 실시형태에서, 제제는 유기 제제이다. 이러한 유기 제제는 개선된 약동학적 특성 (예를 들어, 증가된 생체내 혈청 반감기)을 갖는 접합체를 생성할 수 있다. 유기 모이어티는 친수성 중합체성 기, 지방산 기, 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 다이-카르복실산을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "친수성 중합체성 기"는 옥탄, 예를 들어, 폴리라이신보다는 물 중에서 더 안정한 유기 중합체를 지칭한다. 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 변형을 위해, 적합한 친수성 중합체는 직쇄형 또는 분지형일 수 있으며, 예를 들어, 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜), 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고당류 및 다당류), 친수성 아미노산의 중합체 (예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리아스파르테이트), 폴리알칸 옥사이드 (예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리프로필렌 옥사이드) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 융합 단백질을 변형시키는 친수성 중합체는 개별 분자체로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, 첨자가 달톤 단위의 중합체의 평균 분자량인 PEG5000 및 PEG20 ,000이 사용될 수 있다. 친수성 중합체성 기는 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르기에 의해 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르기에 의해 치환된 친수정 중합체는 적절한 방법을 사용함으로써, 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트 (예를 들어, N,N-카르보닐 다이이미다졸에 의해 활성화됨)는 중합체 상의 하이드록실기에 커플링될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 융합 단백질을 변형시키기에 적절한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나, 또는 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 융합 단백질을 변형시키기에 적절한 지방산은, 예를 들어, n-도데카노에이트, n-테트라데카노에이트, n-옥타데카노에이트, n-에이코사노에이트, n-도코사노에이트, n-트라이아콘타노에이트, n-테트라콘타노에이트, cis-델타-9-옥타데카노에이트, 모든 cis-델타-5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트, 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산 등을 포함한다. 적절한 지방산 에스테르는 직쇄형 또는 분지형 저급 알킬기를 포함하는 다이카르복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 상기 저급 알킬기는 하나 내지 약 12개, 바람직하게는 하나 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 접합체는 적합한 방법, 예를 들어 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "활성화기"는 적절한 조건 하에서 제2의 화학적 기와 반응하여, 변형제와 제2의 화학적 기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 화학적 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민 반응성 활성화 기는, 예를 들어 토실레이트, 메실레이트, 할로 (클로로, 브로 모, 플루오로, 요오드), N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 (NHS) 등과 같은 친전자성 기를 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 기는, 예를 들어 말레이미드, 요오드아세틸, 아크릴로릴, 피리딜 다이설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 등을 포함한다. 알데하이드 작용기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드기는 3가 인기 (trivalent phosphorous group)와 반응하여, 포스포아미데이트 또는 포스포이미드 연결을 형성할 수 있다. 분자 내로 활성화 기들을 도입하기 위한 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hernanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press : San Diego, Calif. (1996)] 참조). 활성화 기는 유기 기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접적으로 또는 링커 모이어티, 예를 들어 2가 C1-C12 기를 통해, 결합될 수 있으며, 여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있다. 적합한 링커 모이어티는, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, (CH2)3 및 NH를 포함한다. 예를 들어, 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성시키기 위해, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드 (EDC)의 존재 하에, 모노-Boc-알킬다이아민 (예를 들어, 모노-Boc-에틸렌다이아민 또는 모노-Boc-다이아미노헥산)과 지방산을 반응시킴으로써, 링커 모이어티를 포함하는 변형제가 생성될 수 있다. 개시된 바와 같이, 또 다른 카르복실레이트에 커플링될 수 있는 1차 아민을 노출시키기 위해, 트라이플루오로아세트산 (TFA)으로 처리하여, Boc 보호기를 생성물로부터 제거할 수 있거나, 말레산 무수물과 반응시켜, 생성된 생성물을 고리화시킴으로써, 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생성시킬 수 있다. (예를 들어, 그 전체 기술이 본 명세서에서 참조로 포함되는 문헌 [Thompson, et al.], WO 92/16221을 참조한다).
"변형제"는 활성화 기를 포함하는 적합한 유기 기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산 및 지방산 에스테르)를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민 반응성 변형제, 예를 들어 PEG의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 사용함으로써, 비-부위 특이적 방식으로 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 결합될 수 있다. 변형된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 융합 단백질의 이황화물 결합 (예를 들어, 사슬내 이황화물 결합)을 감소시킴으로써, 제조될 수 있다. 이어서, 감소된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 융합 단백질을 티올-반응성 변형제와 반응시켜, 본 명세서에서 제공되는 접합체를 생성할 수 있다. 본 명세서에서 제공된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 특이적 부위에 결합된 유기 모이어티를 포함하는 접합체는 역 단백분해 (문헌 [Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997), 및 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)]에 개시된 방법과 같은 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
5.3 항체 생성
5.3.1 항체의 생성 및 스크리닝
또 다른 양상에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 생성하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체의 합성을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기법에 의의해 생성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은, 달리 명시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 혼성화 및 당업계의 관련 분야의 통상적인 기법을 사용한다. 이들 기법은, 예를 들어 본 명세서에 인용된 참조문헌에 개시되어 있으며, 상기 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press, Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 예를 들어 합성, DNA 서열의 유전적 조작을 통한 생성을 포함하는 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 (예를 들어, 재조합 항체)이다. 특정 실시형태에서, 이러한 항체는 생체내에서 동물 또는 포유류 (예를 들어, 인간)의 항체 생식계열 레퍼토리 내에 천연으로 존재하지 않는 DNA 서열에 의해 인코딩되는 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 129, 서열 번호 130, 및/또는 서열 번호 131의 당화된 형태를 사용하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 구체적 실시형태에서, 서열 번호 129, 서열 번호 130, 및/또는 서열 번호 131의 당화된 형태는 하나 이상의 키토비오스에 의해 당화되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체의 생성 방법의 상세한 설명을 위해, 섹션 6.2, 섹션 6.3 및 섹션 6.4를 참조한다.
특정 양상에서, (i) 면역원성 당펩티드가 10 내지 60개의 아미노산 잔기, 10 내지 30개의 아미노산 잔기, 15 내지 25개의 아미노산 잔기, 15 내지 20개의 아미노산 잔기, 또는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이고, (ii) 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나가 탄수화물에 연결된, 하나 이상의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드가 본 명세서에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 1, 2 또는 3개의 당화 부위를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 하나의 당화 부위를 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 2개의 당화 부위를 포함한다.
구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 탄수화물에 연결된 하나의 당화 부위를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 각각 탄수화물에 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다.
면역원성 당펩티드의 하나 이상의 당화 부위에 연결된 탄수화물은 N-연결된 탄수화물, O-연결된 탄수화물, 또는 C-연결된 탄수화물일 수 있다. N-연결된 탄수화물은 아스파라긴 잔기에 부착되고, 자연에서 발견되는 가장 통상적인 형태이다. 대부분의 N-연결된 탄수화물은 GlcNAc-β-Asn의 형태로 펩티드에 연결된다. O-연결된 탄수화물은 (일반적으로 세린 또는 트레오닌의) 아미노산 하이드록실 측쇄에 부착된다. 대부분의 O-연결된 탄수화물은 GlcNAc-β-Ser/Thr 또는 GlcNAc-α-Ser/Thr의 형태로 펩티드에 연결된다. C-연결된 탄수화물은 트립토판 잔기에 부착된 만노스를 지칭하며, 자연에서 발견되는 최소의 통상적인 형태이다. 일 실시형태에서, 면역원성 당펩티드 내의 탄수화물은 N- 또는 O-연결된 탄수화물이다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드 내의 탄수화물은 N-연결된 탄수화물이다.
면역원성 당펩티드의 하나 이상의 당화 부위에 연결된 탄수화물은 단당류, 이당류, 올리고당류 (예를 들어, 삼당류, 사당류, 또는 오당류), 또는 다당류일 수 있다. 특정 실시형태에서, 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 또는 오당류이다. 구체적 실시형태에서, 탄수화물은 이당류이다. 특정 실시형태에서, 이당류는 키토비오스이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 탄수화물은 Man3GlcNAc2이다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드의 N 말단은 아세틸화되어 있다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드의 C 말단은 N-메틸카르복사미드 유도체의 형태이다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 면역원성 담체 단백질에 접합된다. 대부분의 경우에, 작은 항원 (예를 들어, 짧은 펩티드 또는 작은 합텐)은 항체의 생성을 유도하기에 충분히 복합적이지 않다. 면역원성 담체 단백질은 그의 큰 크기 및 복합 구조로 인해, 접합된 작은 항원에 면역원성을 부여하여, 면역원성 담체 단백질 및 작은 항원 상의 에피토프에 대한 항체의 생성을 야기할 수 있다. 따라서, 작은 항원은 성공적인 항체의 생성을 위해, 면역 반응을 강화시키기 위해, 언제나 면역원성 담체 단백질과 화학적으로 접합된다. 통상적으로 사용되는 면역원성 담체 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니나, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 콘코레파스 콘코레파스 헤모시아닌 (ohncholepas concholepas hemocyanin) (CCH), 소 혈청 알부민 (BSA) 및 오브알부민 (OVA)을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 KLH에 접합된다. KLH는 헤모시아닌으로 일컬어지는 비-헴 단백질 (non-heme protein)의 군에 속하는 구리-함유 폴리펩티드이며, 이는 절지동물 및 연체동물에서 발견된다. KLH는 키홀 림펫 (메가트후라 크레눌라타 (Megathura crenulata))으로부터 단리된 것이다. 포유류와의 진화적 거리, 고분자량, 복합 구조 및 1차 아민을 접합 표적으로서 제공하는 수백 개의 라이신기를 함유하는 큰 표면으로 인해, KLH는 포유류에서 매우 면역원성이며, 효과적인 담체 단백질이다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 10 내지 60개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 10 내지 30개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15 내지 25개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15 내지 20개의 아미노산 잔기 길이이다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 면역원성 당펩티드가 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이인 이러한 구체적 실시형태의 특정 양상에서, 면역원성 당펩티드는, 키토비오스에 연결된 당화 부위를 포함한다. 면역원성 당펩티드가 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이인 이러한 구체적 실시형태의 또 다른 특정 양상에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스에 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 55개의 아미노산 잔기 길이이다. 면역원성 당펩티드가 55개의 아미노산 잔기 길이인 이러한 구체적 실시형태의 특정 양상에서, 면역원성 당펩티드는, 키토비오스에 연결된 하나의 당화 부위를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 면역원성 당펩티드가 18개의 아미노산 잔기 길이인 이러한 구체적 실시형태의 특정 양상에서, 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스에 연결된 2개의 당화 부위를 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15개의 아미노산 잔기 길이이다. 면역원성 당펩티드가 15개의 아미노산 잔기 길이인 이러한 구체적 실시형태의 특정 양상에서, 면역원성 당펩티드는, 키토비오스에 연결된 당화 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 150의 아미노산 서열의 적어도 10개의 아미노산 부분을 포함하며, 면역원성 당펩티드의 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 상기 아미노 서열의 상기 부분에 존재한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 150의 아미노산 서열의 적어도 15, 20, 25, 또는 30개의 아미노산 부분을 포함하며, 면역원성 당펩티드의 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 상기 아미노 서열의 상기 부분에 존재한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 55개의 아미노산 잔기 길이이다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 55개의 아미노산 잔기 길이이고, 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 당펩티드는, 키토비오스에 연결된 제30 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 당펩티드는, Man3GlcNAc2 모이어티에 연결된 서열 번호 129의 제30 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 18개의 아미노산 잔기 길이이다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 18개의 아미노산 잔기 길이이고, 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 당펩티드는 각각 키토비오스에 연결된 제4 잔기 (Asn) 및 제10 잔기 (Asn)에서 2개의 당화 부위를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15개의 아미노산 잔기 길이이다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 15개의 아미노산 잔기 길이이고, 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 당펩티드는 키토비오스에 연결된 제7 잔기 (Asn)에서 당화 부위를 포함한다.
또 다른 양상에서, 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하는 방법으로서, 상기에서 개시된 바와 같은 하나 이상의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드에 의해 대상체를 면역화하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 당단백질의 아미노산 서열의 적어도 10개의 아미노산 부분을 포함하고, 면역원성 당펩티드의 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 상기 아미노산 서열의 상기 부분에 존재한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드는 당단백질의 아미노산 서열의 적어도 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산 부분을 포함하고, 면역원성 당펩티드의 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나는 상기 아미노산 서열의 상기 부분에 존재한다. 특정 실시형태에서, 상기 당단백질은 서열 번호 150의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 당단백질의 비당화된 형태와의 특이적 결합이 결여되어 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 따라 면역화되는 대상체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 염소, 양, 당나귀, 닭, 기니아피그, 래트, 토끼 또는 마우스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 면역화되는 대상체는 래트, 토끼 또는 마우스이다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 면역화되는 대상체는 마우스이다. 상기 대상체의 면역화는, 예를 들어 실시예 2 및 실시예 3에 개시된 바와 같이, 대상체에 면역원성 당펩티드 및 에쥬번트를 투여함으로써, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다 (섹션 6.2 및 섹션 6.3 참조).
또 다른 양상에서, 또한, 본 명세서에서 제공되는 면역원성 당펩티드의 제조 방법이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드의 제조 방법은 본 명세서에서 제공되는 면역원성 당펩티드의 하나 이상의 당화 부위와 탄수화물 (예를 들어, 키토비오스)을 연결하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역원성 당펩티드의 제조 방법은 또한, 펩티드 모이어티를 합성하는 단계를 포함한다. 면역원성 당펩티드의 펩티드 모이어티는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 실시예 2에 개시된 바와 같은 Fmoc 고상 (solid-phase) 펩티드 합성 (섹션 6.2 참조)에 의해 합성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 당화 부위의 아미노산 (예를 들어, 아스파라긴)은 면역원성 당펩티드의 합성 동안 보호기에 의해 보호된다. 구체적 실시형태에서, 펩티드 모이어티의 단지 하나의 아스파라긴 잔기가 탄수화물 (예를 들어, 키토비오스)과 연결되고, 아스파라긴 상의 보호기는 아릴기이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 펩티드 모이어티의 하나 초과의 (예를 들어, 2개의) 아스파라긴 잔기가 탄수화물 (예를 들어, 키토비오스)과 각각 연결되고, 아스파라긴 잔기 상의 보호기는 O-2-페닐아이소프로필 에스테르 (O-2-Phi Pr, OPp)이다. 상기 연결 단계는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 탄수화물 모이어티는 실시예 2에 개시된 바와 같은 1-플라스크 아스파틸화/탈보호 절차 (섹션 6.2.2.1 참조)를 사용하여, 펩티드 모이어티와 연결된다.
예를 들어, 포유류 세포 또는 트랜스제닉 조제물로부터의 것을 포함하여, 예를 들어 화학적 합성법, 생물학적 공급원으로부터의 정제 또는 재조합 발현 기법에 의한 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생성 방법은 당업자에 공지되어 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 혼성화 및 당업계의 관련 분야의 통상적인 기법을 사용한다. 이들 기법들은, 예를 들어 본 명세서에 인용된 참조문헌에 개시되어 있으며, 상기 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; ; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); ; Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; ; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; ; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다.
본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)의 생성을 위한 다양한 방법이 당업계에 존재한다. 예를 들어, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 미국 특허 제 4,816,567호에 개시된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 종래의 절차 (예를 들어, 쥣과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화된, 또는 다른 공급원으로부터의 이러한 사슬을 인코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)를 사용하여 용이하게 단리되고, 서열분석될 수 있다. 단리시, DNA를 발현 벡터 내에 위치시킬 수 있으며, 그 후, 재조합 숙주 세포에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 합성을 획득하기 위해, 달리는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 NS0 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 효모 세포, 조류 세포 (algae cell), 난자 (egg), 또는 골수종 세포 내로 형질전환시킨다. DNA는 또한, 예를 들어, 상동성 인간 서열 대신에 목적하는 종의 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나 (미국 특허 제 4,816,567호; 전술된 문헌 [Morrison et al]), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써, 변형시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 불변 도메인에서 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, DNA는 섹션 5.3.2에 개시된 바와 같다. 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 또한, 적어도 하나의 MUC16 당화 항체- 또는 그의 항원 결합 단편-인코딩 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 제조함으로써, 그들의 젖에서 이러한 항체가 생성되는 트랜스제닉 동물 또는 포유류, 예를 들어 염소, 소, 말, 양 등을 제공할 수 있다. 이러한 동물은 공지된 방법을 사용하여 제공할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 미국 특허 제 5,827,690호; 제 5,849,992호; 제 4,873,316호; 제 5,849,992호; 제 5,994,616호; 제 5,565,362호; 제 5,304,489호 등을 참조하며, 상기 문헌 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 본 명세서에서 제공되는 적어도 하나의 MUC16 당화 항체- 또는 그의 항원 결합 단편-인코딩 폴리뉴클레오티드를 사용하여 추가로 제조함으로써, 식물의 일부 또는 그로부터 배양된 세포에서, 이러한 항체, 특정 부분 또는 변이체를 생성하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포 (예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 담배 (tobacco) 및 옥수수 (maize))를 제공할 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담배 잎은, 예를 들어 유도성 프로모터를 사용하여, 다량의 재조합 단백질을 제공하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)] 및 그 내부에 인용된 참조문헌을 참조한다. 또한, 트랜스제닉 옥수수는 다른 재조합 시스템에서 생성되거나, 천연 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성을 갖는 포유류 단백질을 상업적 생성 수준에서 발현하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)] 및 그 내부에 인용된 참조문헌을 참조한다. 항체는 또한, 담배 종자 및 감자 괴경 (tuber)을 포함하는 scFv와 같은 항체 단편을 포함하는 트랜스제닉 식물 종자로부터 다량으로 생성되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 그 내부에 인용된 참조문헌을 참조한다. 따라서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한, 공지된 방법에 따라, 트랜스제닉 식물을 사용하여, 생성될 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (October, 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem Soc. Trans. 22:940-944 (1994)]; 및 그 내부에 인용된 참조문헌을 참조한다. 상기 참조문헌 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 적어도 하나의 MUC16 당화 항체- 또는 그의 항원 결합 단편-인코딩 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조함으로써, 이러한 MUC16 당화 항체 또는 항원 결합 단편을 생성하는 박테리아를 제공할 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 E. 콜라이는 다량의 재조합 단백질을 제공하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Verma et al., 1998, 216(1-2): 165-181] 및 그 내부에 인용된 참조문헌을 참조한다.
다중특이성 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 제조 방법이 개시되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 7,951,917호; 제 7,183,076호; 제 8,227,577호; 제 5,837,242호; 제 5,989,830호; 제 5,869,620호; 제 6,132,992호 및 제 8,586,713호를 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)은 이중특이적 항체의 생성에 사용된다. 이중특이적 항체는 2개의 하이브리도마를 융합하여, 2개의 결합 부위를 갖는 혼성 면역글로불린 분자를 생성함으로써, 제조할 수 있다. 이중 특이성 항체는 T 세포에 종양을 결박시킬뿐만 아니라; 이들은 T 세포 상에서 CD3를 교차 결합시키고, 활성화 케스케이드를 개시한다. 이러한 방식으로, T 세포 수용체-기반 세포독성은 MHC 제한을 우회하여, 원하는 종양 표적으로 재유도된다. 항-CD3-항-MUC16 이중특이적 결합 분자를 갖는 다클론적으로 활성화된 T 세포 (ATC)의 무장화 (Arming)는 MUC16 당화 항체의 표적화 특이성을 T 세포의 비-MHC-제한된 페르폴린/그랜자임 매개된 세포독성과 조합시킨다. 이중특이적 결합 분자 BsAb 또는 BiTE는 환자에게 주입하기 전에 생체 외 확장 활성화된 T 세포를 무장화시킬 수 있다. 이 전략은 모든 ATC를 특정 CTL로 전환시킨다 (문헌 [Thakur and Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340-349; Grabert et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 569-576]).
이중특이적 결합 분자는 MUC16 당화 항체로 구성될 수 있고, 각각의 면역글로불린의 경쇄는 융합 단백질이며, 상기 융합 단백질은 펩티드 링커를 통해 scFv 표적화 CD3에 연결된 면역글로불린 경쇄이다. CH2 도메인에서의 N297A 변이는 FcR 또는 Clq 결합을 야기하지 않는 비당화 (aglycosylation)를 초래한다.
MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CAR을 생성하는데 사용할 수 있다. CAR은 가장 통상적으로는 단일 사슬 가변 단편 길이 항체 (scFv), 예를 들어 주어진 종양 관련 항원 및/또는 그의 변이체를 표적화하는 단일클론 항체로부터 유래된 것, 막관통 도메인 (예를 들어, T 세포 표면 분자, 예를 들어 공동 자극 분자, 예를 들어 CD8, CD28, OX-40 및 4-1BB로부터 유래된 막관통 도메인), TCR 복합체의 신호전달 부분, 예를 들어 TCR 제타 (ζ) 사슬의 세포 내 도메인 및/또는 추가의 부분(들), 예를 들어 그의 세포질 신호전달 도메인으로 구성된다. 구체적 실시형태에서, 단일클론 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은, 단일클론 MUC16 당화 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주로부터 단리된다. 예를 들어, RNA는 하이브리도마 세포주로부터 추출되며, cDNA는 역적사 PCR에 의해, RNA로부터 생성된다. VH 및 VL 사슬 가변 영역은 이러한 가변 영역에 특이적인 프라이머를 사용한 표준 PCR에 의해 클로닝된다. 생성된 VH 및 VL 단편은, 예를 들어 TopoTA PCR 2.1 클로닝 벡터 (Invitrogen)와 같은 TU틀 벡터 내로 서브클로닝되고, 서열분석된다. 후속하여, VH 및 VL 단편을 (Gly4Ser)3 스페이서 도메인에 결찰시켜, MUC16 당화 항체 scFv를 생성하고, 중첩 PCR에 의해 인간 CD8 리더 펩티드 (CD8L) (CD8L-MUC16 당화 항체 scFv)에 융합시켰다 (예를 들어, [Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.; 및 Gong MC et al., Neoplasia 1999;1(2):123-7] 참조). CD8L-MUC16 당화 항체 scFv의 코딩 영역을 인간 CD8 힌지 및 막관통 도메인 또는 대안적으로 CD28 막관통 및 세포질 신호전달 도메인에 융합시키고, T 세포 수용체 CD3-ζ 신호전달 도메인에 융합시킨다 (예를 들어, [Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002;20(1):70-5.; Brentjens RJ, et al. Nat Med 2003;9(3):279-86; 및 Brentjens RJ, et al., Clin Cancer Res 2007;13(18 Pt 1):5426-35] 참조).
또한, 본 명세서에 개시된 CAR을 발현하는 T 세포가 본 명세서에서 제공된다. CAR을 발현하는 T 세포의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, CAR 작제물은 변형된 MMLV 레트로바이러스 벡터 SFG (예를 들어, 문헌 [Riviere I, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(15):6733-7] 참조) 또는 다른 적절한 레트로바이러스 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, HIV-기반 벡터이다. 형질도입된 gpg29 섬유아세포로부터 유래된 VSV-G 위형 (pseudotyped) 레트로바이러스 상청액은 안정한 PG13 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV) 엔빌로프 (envelope)-위형 레트로바이러스 생성 세포주를 작제하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gong MC, et al. Neoplasia 1999;1(2):123-7] 참조). 단리된 건강한 공여체 모세혈 단핵 세포 (PBMC)는 2μg/m1의 식물성응집소 (PHA) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma.)에 의해 활성화되고, 레트로넥틴 도포된 비-조직 배양 플레이트 (문헌 [Quintas-Cardama A, et al., Hum Gene Ther 2007;18(12):1253-60])에서 레트로바이어스에 의해 형질도입되어, CAR을 재조합적으로 발현하는 T 세포를 생성할 수 있다. CAR의 T 세포 내로의 유전자 전달은 FACS에 의해 평가될 수 있다.
단일 도메인 항체, 예를 들어, 경쇄가 결여된 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다. 문헌 [Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302]; 미국 특허 제 6,005,079호; 및 국제 공개 WO 94/04678, WO 94/25591 및 WO 01/44301을 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체와 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 하나의 항체를 MUC16과의 결합으로부터 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁적으로 블로킹하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 기능적 내인성 면역글로불린은 발현할 수 없으나, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스가 사용될 수 있다. 특히, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동성 재조합에 의해, 마우스 배아 줄기세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역 (diversity region)은 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여, 마우스 매아 줄기세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해, 인간 면역글로불린 좌위의 도입과 동시에 또는 개별적으로 비기능성이 되도록 할 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성을 억제한다. 변형된 배아 줄기세포를 확장시키고, 배반포 내로 미량 주사하여, 키메라 마우스를 생성한다. 이어서, 상기 키메라 마우스를 사육하여, 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생성한다. 상기 트랜스제닉 마우스를 선택된 항원, 예를 들어 항원의 전체 또는 그 일부에 의한 정상적인 방식으로 면역화시킨다. 상기 항원에 대해 유도된 단일클론 항체는 종래의 하이브리도마 기법을 사용하여, 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻을 수 있다. 인간 면역글로불린 전이유전자는 B 세포 분화 동안 트랜스제닉 마우스 재배열에 의해, 내포 (harboring)되고, 후속하여, 종류 변환 및 체세포 변이에 적용된다. 이러한 기법을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체의 생성이 가능하다. 인간 항체의 생성을 위한 이러한 기법의 개괄을 위해, 예를 들어, 문헌 [Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단일클론 항체의 생성을 위한 이러한 기법 및 이러한 항체의 생성을 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해, 예를 들어, 국제 공개 WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국 특허 제 5,413,923호, 제 5,625,126호, 제 5,633,425호, 제 5,569,825호, 제 5,661,016호, 제 5,545,806호, 제 5,814,318호, 및 제 5,939,598호를 참조한다. Examples of 마우스 capable of producing 인간 항체를 생성할 수 있는 마우스의 예는 XenomouseTM (Abgenix, Inc.; 미국 특허 제 6,075,181호 및 제 6,150,184호), HuAb-MouseTM (Mederex, Inc./Gen Pharm; 미국 특허 제 5,545,806호 및 제 5,569, 825호), Trans Chromo MouseTM (Kirin) 및 KM MouseTM (Medarex/Kirin)를 포함한다.
MUC16과 면역특이적으로 결합하는 인간항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여, 전술된 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 미국 특허 제 4,444,887호, 제 4,716,111호 및 제 5,885,793호; 및 국제 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741을 참조한다.
일부 실시형태에서, 인간 항체는 마우스-인간 하이브리도마를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, Epstein-Barr 바이러스 (EBV)에 의해 형질전환된 인간 모세혈 림프구를 마우스 골수종 세포와 융합하여, 인간 단일클론 항체를 분비하는 마우스-인간 하이브리도마를 생성할 수 있으며, 이들 마우스-인간 하이브리도마는, 표적 항원과 면역특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체를 분비하는 것의 결정을 위해, 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지 및 개시되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31]을 참조한다.
구체적 실시형태에서, MUC16과 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생성 방법은 하기의 섹션 6.2에 개시된 바와 같다.
구체적 실시형태에서, MUC16과 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 스크리닝 및 선택 방법은 하기의 섹션 6.2에 개시된 바와 같다.
본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 생성된 경우, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후의 특이적 항원에 대한 친화도 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해, 정제될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 항체는 정제의 용이성을 위해, 본 명세서에 개시되거나, 달리는 당업계에 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 단리하거나, 정제한다. 대체적으로, 단리된 항체는, 상기 단리된 항체와는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 부재하는 것이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조제물에는 세포성 물질 및/또는 화학적 전구체가 실질적으로 부재한다. 표현 "세포성 물질의 실질적 부재"는, 그로부터 단리되거나, 재조합적으로 생성된 세포의 세포성 성분으로부터 항체가 분리된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 조제물을 포함한다. 따라서, 세포성 물질이 실질적으로 부재하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% (건조중량%) 미만의 이종성 단백질 (또한, 본 명세서에서 "오염 단백질"로 지칭됨) 및/또는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 변이체, 예를 들어, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 번역후 변형된 상이한 형태 또는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 다른 상이한 버전 (예를 들어, 항체 단편)을 가지는 항체의 조제물을 포함한다. 항체가 재조합적으로 생성되는 경우, 이는 또한, 대체적으로 배양 배지가 실질적으로 부재하는 것으로, 즉, 배양 배지는 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만의 단백질 조제물의 용적을 나타낸다. 항체가 화학적 합성에 의해 생성되는 경우, 이는 대체적으로, 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 부재하며, 즉, 이는, 단백질의 합성에 수반되는 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질로부터 분리된다. 따라서, 이러한 항체의 조제물은 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% (건조중량%) 미만의 화학적 전구체 또는 관심대상 항체 이외의 화합물을 갖는다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 단리 또는 정제된다.
5.3.2 폴리뉴클레오티드
특정 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다. 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드 (섹션 5.3.3 참조)를 포함하는 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 또한, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)의 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다. 또한, 엄격한 혼성화 조건 또는 덜 엄격한 혼성화 조건하에, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다.
표현 "정제된"은 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만 (특히, 약 10% 미만)의 다른 물질, 예를 들어 세포성 물질, 배양 배지, 다른 핵산 분자, 화학적 전구체 및/또는 다른 화학 물질을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 조제물을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 인코딩하는 핵산 분자(들)는 단리 또는 정제된다.
본 명세서에서 제공되는 핵산 분자는, RNA 형태, 예를 들어 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태 또는, 이에 제한되는 것은 아니나, 클로닝에 의해 획득되거나, 합성적으로 생성된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA 형태 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥의 임의의 부분은, 또한, 센스 가닥으로 알려져 있는 코딩 가닥일 수 있거나, 또한, 안티센스 가닥으로 지칭되는 비코딩 가닥일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다.
특정 양상에서, 또한, MUC16과 면역특이적으로 결합하고, MUC16과의 결합에서 이러한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 경쟁하거나, 이러한 항체와 동일한 에피토프와 결합하는 항체뿐만 아니라, 본 명세서에 개시되는 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 알고 있는 경우, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 (예를 들어, 문헌 [Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)]에 개시된 바와 같이) 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립할 수 있으며, 이는 간략히 말하면, 항체를 인코딩하는 서열의 일부를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 중첩시키고, 상기 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 결찰시킨 후, 결찰된 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 합성법을 포함한다.
대안적으로, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 공급원의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수 없으나, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 서열을 알고 있는 경우, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산은, 상기 서열의 3' 및 5' 단부로 혼성화된 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의하거나, 예를 들어, 항체를 인코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위한, 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 클로닝에 의해 적절한 공급원 (예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하는 것으로 선택된 하이브리도마 세포와 같은 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 항체 cDNA 라이브러리, 또는 cDNA 라이브러리 또는 그로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA)으로부터 얻을 수 있거나, 화학적으로 합성할 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 복제 가능한 클로닝 벡터 (예를 들어, 섹션 5.3.3 참조) 내로 클로닝할 수 있다.
이러한 실시형태에서, 이러한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성하기 위해, 상이한 아미노산 서열을 갖는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하기 위해, 뉴클레오티드 서열의 조작을 위해 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기법, 부위 유도 돌연변이유발, PCR 등 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 및 Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.]에 개시된 기법을 참조하며, 이는 본 명세서에서 그 전문이 둘 모두 참조로 포함됨)을 사용하여, 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조작은 인코딩된 아미노산이 비당화되도록 하거나, C1q, Fc 수용체와 결합하거나, 보체 시스템을 활성화하는 항체의 능력을 파괴하기 위해, 수행될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 단리된 핵산 분자는 선택적으로 하나 이상의 인트론을 갖는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame) (ORF), 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3으로서, 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)의 적어도 하나의 특정 부분을 포함하는 핵산 분자; MUC16 당화 항체 또는 가변 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 전술된 것과 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 본 명세서에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 여전히 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
또한, 선택적 혼성화 조건 하에서 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 단리된 핵산이 본 명세서에서 제공된다. 따라서, 이 실시형태의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산의 단리, 검출 및/또는 정량화에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리의 일부 또는 전장의 클론의 확인, 단리 또는 증폭에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 포유류 핵산 라이브러리로부터 단리되거나, 달리는 그로부터의 cDNA에 상보적인 cDNA 서열 또는 게놈 서열이다.
상기 핵산은 편의상, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드에 더한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다-클로닝 부위가 폴리뉴클레오티드의 단리의 보조를 위해, 상기 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열이 본 명세서에서 제공되는 번역되는 폴리뉴클레오티드의 단리의 보조를 위해, 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드를 정제하기 위한 편의적 수단을 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 핵산―코딩 서열이 배제됨―은 선택적으로 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 연결자 (adapter), 또는 링커이다.
추가의 서열이 또한, 클로닝 및/또는 발현 시에 그들의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나, 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입을 향상시키기 위해, 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 첨가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 연결자 및 링커의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. (예를 들어, 전술된 문헌 [Ausubel; 또는 전술된 문헌 [Sambrook] 참조).
구체적 실시형태에서, 일상적인 재조합 DNA 기법을 사용하여, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 CDR 중 하나 이상을 주지의 프레임워크 영역 내로 삽입할 수 있다. 프레임워크 영역은 천연 발생 또는 공통 프레임워크 영역 및 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수 있다 (예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 목록을 위해, 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)] 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 MUC16과 면역특이적으로 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩한다. 하나 이상의 아미노산 치환이 프레임워크 영역 내에 유발될 수 있으며, 바람직하게는, 상기 아미노산 치환은 항체의 그의 항원과의 결합을 향상시킨다. 추가로, 이러한 방법은 사슬내 이황화물 결합에 관여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 유발시켜, 하나 이상의 사슬내 이황화물 결합이 결여된 항체 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 다른 변경이 본 명세서에서 제공되며, 이는 당업계의 기술 내의 것이다.
특정 실시형태에서, 또 다른 핵산 분자와의 연결 시에, 단리 또는 정제된 핵산 분자, 또는 그의 단편은 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 융합 단백질의 생성은 당업계의 일반적인 기술 내이며, 제한 효소 또는 재조합적 클로닝 기법의 사용을 포함할 수 있다 (예를 들어, Gateway.TM. (Invitrogen) 참조). 또한, 미국 특허 제 5,314,995호를 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 섹션 5.3.3에 개시된 바와 같은 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)의 형태이다.
특정 양상에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 MUC16과 면역특이적으로 결합하는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포 (예를 들어, E. 콜라이 및 포유류 세포)에서 그의 효과적인 발현을 위한 벡터, 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리 또는 정제된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는, 상기 핵산 분자의 천연 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 인간)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 또한, "단리된" 핵산 분자, 예를 들어 cDNA 분자는 재조합 기법에 의해 생성된 경우, 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 부재할 수 있거나, 화학적으로 합성된 경우, 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 부재할 수 있다. 예를 들어, 표현 "실질적으로 부재하는"은 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만의 다른 물질, 예를 들어, 세포성 물질, 배양 배지, 다른 핵산 분자, 화학적 전구체 및/또는 다른 화학 물질을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 조제물을 포함한다.
특정 양상에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편뿐만 아니라, MUC16과의 결합에서 이러한 항체와 (예를 들어, 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하거나, 이러한 항체와 동일하거나, 중첩되는 에피토프와 결합하는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다.
특정 양상에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 VH CDR을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 표 1, 표 3 및 표 5 참조). 상기 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 VL CDR을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 표 2, 표 4 및 표 6 참조).
특정 실시형태에서, 예를 들어, 표 1, 표 3, 또는 표 5에 개시된 바와 같은 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 함유하는 3개의 VH CDR을 포함하는 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 및 18C6 공통 VH CDR의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 103, 서열 번호 104 및 서열 번호 105, 또는 각각 서열 번호 109, 서열 번호 110 및 서열 번호 111, 또는 서열 번호 115, 서열 번호 116 및 서열 번호 117)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 10C6의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5, 또는 각각 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 또는 각각 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 17)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 7B12의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 23, 서열 번호 24 및 서열 번호 25, 또는 각각 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 또는 각각 서열 번호 35, 서열 번호 36 및 서열 번호 37)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 19C11의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 43, 서열 번호 44 및 서열 번호 45, 또는 각각 서열 번호 49, 서열 번호 50 및 서열 번호 51, 또는 각각 서열 번호 55, 서열 번호 56 및 서열 번호 57)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 16C5의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 63, 서열 번호 64 및 서열 번호 65, 또는 서열 번호 69, 서열 번호 70 및 각각 서열 번호 71, 또는 각각 서열 번호 75, 서열 번호 76 및 서열 번호 77)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 18C6의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 83, 서열 번호 84 및 서열 번호 85, 또는 각각 서열 번호 89, 서열 번호 90 및 서열 번호 91, 또는 각각 서열 번호 95, 서열 번호 96 및 서열 번호 97)를 인코딩한다.
구체적 실시형태에서, (a) 예를 들어, 표 1, 표 3, 또는 표 5에 개시된 바와 같은 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3를 함유하는 3개의 VH CDR, 및 (b) 예를 들어, 표 2, 표 4, 또는 표 6에 개시된 바와 같은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3를 함유하는 3개의 VL 사슬 CDR을 포함하는 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (a) 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 및 18C6 공통 VH CDR의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 103, 서열 번호 104 및 서열 번호 105 또는 각각 서열 번호 109, 서열 번호 110 및 서열 번호 111, 또는 서열 번호 115, 서열 번호 116 및 서열 번호 117)를 인코딩하며, (b) 10C6, 7B12, 19C11, 16C5 및 18C6 공통 VL CDR의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3 (즉, 각각 서열 번호 106, 서열 번호 107 및 서열 번호 108, 또는 각각 서열 번호 112, 서열 번호 113 및 서열 번호 114, 또는 서열 번호 118, 서열 번호 119 및 서열 번호 120)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (a) 10C6의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5, 또는 각각 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 또는 각각 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 17)를 인코딩하며, (b) 10C6의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3 (즉, 각각 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 또는 각각 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 서열 번호 14, 또는 각각 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (a) 7B12의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 23, 서열 번호 24 및 서열 번호 25, 또는 각각 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 또는 각각 서열 번호 35, 서열 번호 36 및 서열 번호 37)를 인코딩하며, (b) 7B12의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3 (즉, 각각 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 28, 또는 각각 서열 번호 32, 서열 번호 33 및 서열 번호 34, 또는 각각 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (a) 19C11의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 43, 서열 번호 44 및 서열 번호 45, 또는 각각 서열 번호 49, 서열 번호 50 및 서열 번호 51, 또는 각각 서열 번호 55, 서열 번호 56 및 서열 번호 57)를 인코딩하며, (b) 19C11의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3 (즉, 각각 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 또는 각각 서열 번호 52, 서열 번호 53 및 서열 번호 54, 또는 각각 서열 번호 58, 서열 번호 59 및 서열 번호 60)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (a) 16C5의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 63, 서열 번호 64 및 서열 번호 65 또는 각각 서열 번호 69, 서열 번호 70 및 서열 번호 71, 또는 각각 서열 번호 75, 서열 번호 76 및 서열 번호 77)를 인코딩하며, (b) 16C5의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3 (즉, 각각 서열 번호 66, 서열 번호 67 및 서열 번호 68, 또는 각각 서열 번호 72, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 각각 서열 번호 78, 서열 번호 79 및 서열 번호 80)를 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (a) 18C6의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 (즉, 각각 서열 번호 83, 서열 번호 84 및 서열 번호 85, 또는 각각 서열 번호 89, 서열 번호 90 및 서열 번호 91 또는 각각 서열 번호 95, 서열 번호 96 및 서열 번호 97)를 인코딩하며, (b) 18C6의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3 (즉, 각각 서열 번호 86, 서열 번호 87 및 서열 번호 88, 또는 각각 서열 번호 92, 서열 번호 93 및 서열 번호 94, 또는 각각 서열 번호 98, 서열 번호 99 및 서열 번호 100)를 인코딩한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는, 본 명세서에서 제공되는 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 1, 서열 번호 21, 서열 번호 41, 서열 번호 61, 서열 번호 81, 또는 서열 번호 101)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 항체는 MUC16과 면역특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 제공되는 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 22, 서열 번호 42, 서열 번호 62, 서열 번호 82, 또는 서열 번호 102)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 항체는 MUC16과 면역특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 또는 서열 번호 148의 핵산 서열을 포함하는 VH를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 또는 서열 번호 149의 핵산 서열을 포함하는 VL을 인코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 140의 핵산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 141의 핵산 서열을 포함하는 VL을 인코딩한다 (예를 들어, 10C6). 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 142의 핵산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 143의 핵산 서열을 포함하는 VL을 인코딩한다 (예를 들어, 7B12). 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 144의 핵산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 145의 핵산 서열을 포함하는 VL을 인코딩한다 (예를 들어, 19C11). 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 146의 핵산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 147의 핵산 서열을 포함하는 VL을 인코딩한다 (예를 들어, 16C5). 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 148의 핵산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 149의 핵산 서열을 포함하는 VL을 인코딩한다 (예를 들어, 18C6).
구체적 양상에서, 경쇄 및 중쇄, 예를 들어, 개별 경쇄 및 중쇄를 포함하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다. 중쇄와 관련하여, 구체적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 감마 (예를 들어, 감마1, 감마2, 감마3, 또는 감마4) 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 항체는 중쇄를 포함하고, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 21, 서열 번호 41, 서열 번호 61, 서열 번호 81, 또는 서열 번호 101의 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 중쇄의 불변 영역은 인간 감마 중쇄 불변 영역이다.
경쇄와 관련하여, 구체적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 카파 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 람다 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄를 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 항체는 경쇄를 포함하고, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 22, 서열 번호 42, 서열 번호 62, 서열 번호 82, 또는 서열 번호 102의 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 경쇄의 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 경쇄를 포함하는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 22, 서열 번호 42, 서열 번호 62, 서열 번호 82, 또는 서열 번호 102의 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 경쇄의 불변 영역은 인간 람다 경쇄 불변 영역이다.
본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체의 생성을 위한 상세한 예를 위해, 섹션 6.2 및 섹션 6.3을 참조한다.
5.3.3 세포 및 벡터
특정 실시형태에서, 하나 이상의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 (예를 들어, 재조합적으로) 발현하는 세포 (예를 들어, 생체 외 세포)가 본 명세서에서 제공된다. 또한, 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포에서의 재조합 발현을 위한 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 섹션 5.3.2 참조)을 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 본 명세서에서 제공된다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 발현시키기 위한 이러한 벡터 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 (예를 들어, 생체 외 세포)가 본 명세서에서 제공된다. 또한, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하는 방법으로서, 세포 (예를 들어, 생체 외 세포)로부터 이러한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 세포는 생체 외 세포이다.
벡터 (예를 들어, 발현 벡터)는 세포 (예를 들어, 생체 외 세포)에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 전형적으로, 유전자 발현은 항시성 또는 유도성 프로모터, 조직 특이적 조절 요소 및 인핸서를 포함하는 특정 조절 요소의 제어 하에 배치된다. 이러한 유전자는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 언급된다. 재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포 또는 숙주 세포의 세포 (예를 들어, 생체 외 세포)의 염색체 또는 게놈 내에 클로닝된 유전자(들)를 함유하도록 유전적으로 조작된 트랜스제닉 동물뿐만 아니라, 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다.
특정 실시형태에서, 섹션 5.3.2에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 섹션 5.3.2에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 임의의 적절한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 이러한 벡터를 작제하는 벡터 및 방법은 당업자에 공지되어 있고, 일반적인 기술 참조문헌에 개시되어 있다 (일반적으로, 문헌 [Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)]의 "재조합 DNA Part D," 방법 참조). 특정 실시형태에서, 벡터는, 상기 벡터가 DNA인지 또는 RNA인지 여부를 고려하여, 상기 벡터가 도입되는 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물, 곤충 또는 포유류)에 특이적인 조절 서열, 예를 들어 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 숙주의 속에 특이적인 조절 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 숙주의 종에 특이적인 조절 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 벡터는, 형질전환 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함한다. 마커 유전자의 비제한적인 예는 살생물제 (biocide) 저항성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 저항성, 원영양성 (prototrophy)을 제공하기 위한 영양 요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 벡터는 앰피실린 및 히드로마이신 선택성 마커를 포함한다.
특정 실시형태에서, 발현 벡터는 섹션 5.3.2에 개시된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 천연 또는 규정적 (normative) 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터, 예를 들어, 강한 프로모터, 약한 프로모터, 조직 특이적인 프로모터 및 발생 특이적인 프로모터의 선택은 당업계의 기술 내에 있다. 유사하게, 전술된 바와 같은 핵산 분자, 또는 그의 단편과 프로모터의 조합은 또한 당업계의 기술 내에 있다.
적절한 벡터의 비제한적인 예는 증대 및 확장 또는 발현 또는 둘 모두를 위해 설계된 것을 포함한다. 예를 들어, 클로닝 벡터는 pUC 시리즈, pBluescript 시리즈 (Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 및 pEX 시리즈 (Clontech, Palo Alto, Calif.). 박테리오파지 벡터, 예를 들어 람다-GT10, 람다-GT11, 람다-ZapII (Stratagene), 람다-EMBL4 및 람다-NM1149로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 또한, 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 비제한적인 예는 pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 비제한적인 예는 pEUK-C1, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)를 포함한다. TOPO 클로닝 시스템 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)이 또한, 제조사의 지침에 따라 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 포유류 벡터이다. 특정 실시형태에서, 포유류 벡터는 mRNA의 개시를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 코딩 서열 및 전사의 종결 및 전사체의 폴리아데닐화를 위해 요구되는 신호를 함유한다. 특정 실시형태에서, 포유류 벡터는, 예를 들어, 인핸서, Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 공여체 및 수용체 부위에 의해 플랭킹되는 개재 서열과 같은 추가의 요소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 고효율 전사는, 예를 들어 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복체 (LTRS), 예를 들어, RSV, HTLVI, HIVI 및 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 초기 프로모터에 의해, 달성될 수 있다. 그러나, 세포성 요소가 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 인간 액틴 프로모터). 포유류 발현 벡터의 비제한적인 예는 벡터, 예를 들어 pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, Calif.), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL 및 PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) 및 pBC12MI (ATCC 67109)를 포함한다. 이러한 포유류 벡터와 병용하여 사용할 수 있는 포유류 숙주 세포의 비제한적인 예는 인간 Hela 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 메추리 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 파르보바이러스-기반 벡터, 예를 들어, 아데노 관련 바이러스 (AAV)-기반 벡터, AAV-아데노바이러스 키메라 벡터 및 아데노바이러스-기반 벡터 및 렌티바이러스 벡터, 예를 들어 단순 포진 (HSV)-기반 벡터이다. 특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 바이러스 복제가 불완전해 지도록 조작된다. 특정 실시형태에서, 바이러스 벡터 숙주에 대한 독성이 제거되도록 조작된다. 이들 바이러스 벡터는 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)]에 개시된 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여, 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는 종래의 기법에 의해, 세포 (예를 들어, 생체 외 세포)로 전달될 수 있고, 생성된 세포는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하기 위해, 종래의 기법에 의해, 배양될 수 있다. 따라서, 숙주 세포에서 이러한 서열의 발현을 위해, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 경쇄 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 중쇄를 인코딩하는 벡터 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경쇄를 인코딩하는 벡터는 전체 MUC16 당화 항체의 발현을 위해, 세포에서 공동 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 중쇄를 인코딩하는 벡터 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경쇄는 전체 이중특이적 결합 분자의 발현을 위해, 세포에서 공동 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 명세서에 개시된 이중특이적 결합 분자의 중쇄 및 경쇄 융합 폴리펩티드 둘 모두를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 2개의 상이한 벡터인, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경쇄 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 세포는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터를 포함하고, 제2 세포는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체의 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 제1 세포 및 이러한 제2 세포를 포함하는 세포의 혼합물이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 제1 세포는 본 명세서에 개시된 이중특이적 결합 분자의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터를 포함하고, 제2 세포는 본 명세서에 개시된 이중특이적 결합 분자의 경쇄 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 제1 세포 및 이러한 제2 세포를 포함하는 세포의 혼합물이 본 명세서에서 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 세포는, 상기 세포에 의해 올리고뉴클레오티드의 효율적인 전사 및 번역 둘 모두가 이루어지도록 하는 벡터 또는 벡터들을 발현시킨다.
실시형태에서, 세포는, 상기 세포에 의해, 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 단편의 효율적인 전사 및 번역 둘 모두가 이루어지도록 하는 벡터를 발현시킨다.
특정 실시형태에서, 상기 세포는 동물, 예를 들어 포유류일 수 있는 숙주 내에 존재한다. 세포의 예는, 이로 제한되는 것은 아니나, 인간 세포, 인간 세포주, E. 콜라이 (예를 들어, E. 콜라이 TB-1, TG-2, DH5a, XL-Blue MRF' (Stratagene), SA2821 및 Y1090), B. 서브틸리스, P. 아에루게노사, S. 세레비시아에, N. 크라사, 곤충 세포 (예를 들어, Sf9, Ea4) 및 본 명세서의 하기에서 제시되는 다른 것들을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 세포는 CHO 세포이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 세포는 CHO-S 세포이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입에 의해, 염색체 내로 혼입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 전기천공법에 의해 세포 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 세포 내로의 형질감염에 의해, 세포 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, 벡터는, 형질감염된 세포의 확인 및 단리를 가능하게 하는 선택성 마커, 예를 들어 DHFR, GPT, 네오마이신, 또는 히그로마이신과 공동 형질감염된다. 특정 실시형태에서, 형질감염된 폴리뉴클레오티드는 또한, 인코딩된 다량의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키기 위해, 증폭될 수 있다. 예를 들어, DHFR (다이하이드로엽산 환원효소) 마커는, 관심대상 폴리뉴클레오티드의 수백 또는 심지어 수천 카피를 보유하는 세포주를 개발하는데 사용될 수 있다. 선택 마커의 또 다른 예는 효소적 글루타민 합성효소 (GS)이다 (문헌 [Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)]). 이들 마커를 사용하여, 세포를 선택 배지에서 성장시키고, 최고 저항성을 갖는 세포를 선택한다. 이들 세포주는 염색체 내로 혼입된 증폭된 유전자(들)을 함유한다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 및 NSO 세포는 종종 항체의 생성을 위해 사용된다.
일 실시형태에서, 벡터는 (i) 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 MUC16과 결합하는 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 (ii) 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 MUC16과 결합하는 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
일 실시형태에서, 벡터는 (i) 경쇄가 MUC16과 결합하고, scFv가 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 CD3와 결합하는, 펩티드 링커를 통해, scFv에 융합된 면역글로불린 경쇄를 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 (ii) 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 MUC16과 결합하는 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
5.4 약제학적 조성물
특정 실시형태에서, 약제학적 유효량의 하나 이상의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 및 키트가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 항체, 그의 항원 결합 단편, 및/또는 CAR을 재조합적으로 발현하는 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 포함한다. 조성물은 개별적 단일 단위 투여 형태의 제조에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 조성물은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복막내, 피막내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌심근내 (intracerebroventricular), Ommaya 내, 안구내, 초자체내, 결장내, 자궁경관내, 위장내, 간장내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 정수내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비내, 척수강내, 뇌실내, 뇌실질내 또는 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 비경구 투여를 위해 제형화된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 복강내 투여를 위해 제형화된다. 구체적 실시형태에서, 상기 조성물은 복강 전이를 치료하기 위한 복강내 투여를 위해 제형화된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 척수강내 투여를 위해 제형화된다. 구체적 실시형태에서, 상기 조성물은 뇌 전이를 치료하기 위한 척수강내 투여를 위해 제형화된다. 예를 들어, 문헌 [Kramer et al, 2010, 97: 409-418]을 참조한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 뇌실내 투여를 위해 제형화된다. 구체적 실시형태에서, 상기 조성물은 뇌 전이를 치료하기 위한 뇌실내 투여를 위해 제형화된다. 예를 들어, 문헌 [Kramer et al, 2010, 97: 409-418]을 참조한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 뇌실질내 투여를 위해 제형화된다. 구체적 실시형태에서, 상기 조성물은 뇌종양 또는 뇌종양 전이를 치료하기 위한 뇌실질내 투여를 위해 제형화된다. 예를 들어, 문헌 [Luther et al., 2014, Neuro Oncol, 16: 800-806] 및 임상 시험 NCT01502917을 참조한다.
구체적 실시형태에서, 상기 조성물은 복강 전이를 위한 복강내 투여를 위해 제형화된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 세포를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공되고, 상기 세포는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 벡터를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공되고, 상기 벡터는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공되고, 상기 세포는 벡터를 포함하며, 상기 벡터는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 안정하거나, 보존적인 제형물이다. 특정 실시형태에서, 안정한 제형물은 식염수 또는 선택된 염을 갖는 인산염 완충제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 개시된 조성물은 약제학용 또는 수의과용으로 적합한 다용도의 보존적인 제형물이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 보본제를 포함한다. 보존제는 당업자에 공지되어 있다. 보존제의 비제한적인 예는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐아질산수은 (phenylmercuric nitrite), 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부탄올, 염화 마그네슘 (예를 들어, 헥사하이드레이트), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화 벤즈알코늄, 염화 벤즈에토늄 및 소듐 디하이드로아세테이트 및 티메로살, 또는 수성 희석제 중의 그의 혼합물을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적절한 농도 또는 혼합물, 예를 들어 0.001% 내지 5%, 또는 임의의 범위 또는 그 범위내의 값, 예를 들어, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 임의의 범위 또는 그 범위내의 값이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비제한적인 예는 보존제 무함유, 0.1% 내지 2% m-크레졸 (예를 들어, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1% 내지 3% 벤질 알코올 (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001% 내지 0.5% 티메로살 (예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001% 내지 2.0% 페놀 (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005% 내지 1.0% 알킬파라벤(들) (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 조성물을 대상체에 연장된 기간 동안, 예를 들어, 단회 투여로부터 1주 내지 1년 이상의 기간 동안 전달하는 것이 때로 바람직할 수 있다. 다양한 서방성 방출 데포 (depot) 또는 임플란트 형태가 사용될 수 있다. 예를 들어, 투여 형태는 체액 중에서 낮은 정도의 용해도를 갖는 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 무독성 염, 예를 들어 (a) 다염기산, 예를 들어 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루타민산, 나프탈렌 모노- 또는 다이-술폰산, 폴리갈락투론산 등에 의한 산부가 염; (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온 또는 예를 들어 N,N'-다이벤질-에틸렌다이아민 또는 에틸렌다이아민으로부터 형성된 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합, 예를 들어, 탄닌산아연염을 함유할 수 있다. 추가로, 본 명세서에서 제공되는 조성물, 바람직하게는 직전에 개시된 바와 같은 비교적 불용성인 염은 겔, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 겔 중에, 예를 들어, 주사에 적합한 참깨유에 의해, 제형화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연염, 탄닌산아연염, 파모산염 등이다. 주사용의 또 다른 형태의 서방성 방출 데포 제형물은, 예를 들어 미국 특허 제 3,773,919호에 개시된 바와 같이, 서방성 분해의 비-독성 비-항원성 중합체, 예를 들어 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체 중의 캡슐화를 위해, 분산된 화합물 또는 염을 함유할 것이다. 전술된 것과 같은 화합물 또는 바람직하게는 비교적 불용성인 염은 또한 특히 동물에서 사용하기 위해, 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠릿 중에 제형화될 수 있다. 추가의 서방성 방출 데포 또는 임플란트 조성물, 예를 들어, 가스 또는 액체 리포솜이 문헌 (미국 특허 제 5,770,222호 및 문헌 ["Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978])에 공지되어 있다.
더 낮은 농도 및 더 높은 농도가 사용될 수 있고, 목적하는 전달 비히클에 의존적인 것으로, 예를 들어 용액 제형물이 경피 패치, 폐, 경점막 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과 다를 것이나, 본 명세서에서 제공되는 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 조성물 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)의 범위는, 습식/건식 시스템인 경우, 재구성 시에, 약 1.0 μg/ml 내지 약 1000 mg/ml의 농도를 생성하는 양을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 적어도 하나의 임의의 적절한 보조제, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 에쥬번트 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 보조제가 바람직하다. 또한, 이러한 멸균 용액의 비 제한적 예 및 제조 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 문헌 [Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990]와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여 방식, 용해도 및/또는 안정성에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체가 일상적으로 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 하나 이상의 약제학적 부형제 및/또는 첨가제를 함유한다. 약제학적 부형제 및 첨가제의 비제한적인 예는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물 (예를 들어, 단당류, 다이-, 트라이-, 테트라- 및 올리고당류; 유도체화된 당, 예를 들어 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 다당류 또는 당 중합체를 포함하는 당)이며, 이는 1 내지 99.99 중량% 또는 용적%의 조합 또는 단독의 경우를 포함하여, 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있다. 단백질 부형제의 비제한적인 예는 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카제인 등을 포함한다. 또한, 완충 투여량에서 기능할 수 있는 아미노산/항체 성분의 비제한적인 예는 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산은 글리신이다. 탄수화물 부형제의 비제한적인 예는 단당류, 예를 들어 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예를 들어 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예를 들어 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예를 들어 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨 소르비톨 (글루시톨), 미오이노시톨 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 또는 라피노스이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 하나 이상의 완충제 또는 pH 조정제를 포함하고; 전형적으로, 완충제는 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 완충제의 비제한적인 예는 유기산 염, 예를 들어 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 카본산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염; 트리스 (Tris), 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 인산염 완충제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 완충제는 유기산 염, 예를 들어 시트르산염이다. 다른 부형제, 예를 들어, 등장성 제제, 완충제, 항산화제, 보존제 인핸서가 선택적으로 바람직하게는 희석제에 첨가될 수 있다. 등장성 제제, 예를 들어 글리세린이 알려진 농도로 통상적으로 사용된다. 바람직하게는, 개선된 pH 제어를 제공하기 위해, 생리적으로 용인되는 완충제가 첨가된다. 상기 조성물은 광범위한 pH, 예를 들어 약 pH 4 내지 약 pH 10 및 약 pH 5 내지 약 pH 9의 바람직한 범위 및 약 6.0 내지 약 8.0의 가장 바람직한 범위를 포괄할 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 갖는다. 바람직한 완충제는 인산염 완충제, 가장 바람직하게는 인산 나트륨, 특히 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 하나 이상의 중합체성 부형제/첨가제, 예를 들어, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 피콜 (중합체성 당), 덱스트레이트 (dextrate) (예를 들어, 사이클로덱스트린, 예를 들어 2-하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미료, 항균제, 감미료, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트, 예를 들어 "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"), 지질 (예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드 (예를 들어, 콜레스테롤), 및/또는 킬레이트제 (예를 들어, EDTA)를 포함한다.
다른 첨가제, 예를 들어 약제학적으로 허용 가능한 가용화제는 Tween 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), Tween 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), Pluronic F68 (폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체) 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 80 또는 폴록사머 184 또는 188, Pluronic.RTM과 같다. 응집을 감소시키기 위해, 폴리일, 다른 블록 공중합체 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 및 EGTA가 선택적으로 조성물에 첨가될 수 있다. 이들 첨가제는, 상기 조성물의 투여에 펌프 또는 플라스틱 용기가 사용되는 경우, 특히 유용하다. 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제의 존재는 단백질의 응집 경향을 완화시킨다.
본 명세서에서 제공되는 조성물에서 사용하기에 적합한 추가의 약제학적 부형제 및/또는 첨가제는 당업자에 공지되어 있으며, 예를 들어 본 명세서에서 그 전문이 참조로서 포함되는 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19.sup.th ed., Williams & Williams, (1995), and in the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]을 참조한다. 바람직한 특정 실시형태에서, 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들어, 당류 및 알디톨) 및 완충제 (예를 들어, 시트르산염) 또는 중합체성 제제이다.
바람직하게는, 수성 희석제는 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 보존제를 추가로 포함한다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화 벤즈알코늄, 염화 벤즈에토늄, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로살, 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다. 조성물에 사용되는 보존제의 농도는 항균 효과를 생성하기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택된 보존제에 의존적이며, 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
본 명세서에서 제공되는 조성물은 수성 희석제 중에 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조) 및 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤, (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화 벤즈알코늄, 염화 벤즈에토늄, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로살 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제를 혼합하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 보존제를 혼합하는 단계는 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적절한 조성물을 제조하기 위해, 예를 들어, 완충 용액 중의 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 측정된 양은 원하는 농도의 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 보존제를 제공하기에 충분한 정량으로 완충 용액 중에 원하는 보존제와 조합된다. 본 명세서에서 제공되는 조성물은 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 선택된 완충제, 바람직하게는 인산염 완충제 함유 식염수 또는 선택된 염을 혼합하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 완충제를 혼합하는 단계는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적절한 조성물을 제조하기 위해, 예를 들어, 물 또는 완충제 중의 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 측정된 양은 원하는 농도의 단백질 및 완충제를 제공하기에 충분한 정량으로 물 중에 원하는 완충 제제와 조합된다. 이러한 과정의 변형이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분의 첨가 순서, 추가의 첨가제의 사용 여부, 조성물이 제조되는 온도 및 pH는 사용되는 농도 및 투여 방법에 대해 최적화될 수 있는 모든 인자이다.
5.4.1
비경구적
제형물
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 비경구적으로 주사 가능한 투여를 위해 제형화된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 혈관내, 근육내, 피내, 피하 및 안구내를 포함한다. 비경구적 투여의 경우, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로서, 혼화하여, 제형화될 수 있거나, 약제학적으로 허용 가능한 비경구적 비히클에 의해 개별적으로 제공될 수 있다. 이러한 비히클의 비제한적인 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 1% 내지 10% 인간 혈청 알부민이다. 리포솜 및 비수성 비히클, 예를 들어 고정유가 또한 사용될 수 있다. 상기 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성 (예를 들어, 완충제 및 보존제)을 유지시키는 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 제형물은 공지되거나, 적합한 기법에 의해, 멸균된다.
적합한 약제학적 담체는 당업계의 표준 참조문헌인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 가장 최신 판에 개시되어 있다.
비경구 투여를 위한 제형물은 통상의 부형제로서, 멸균수 또는 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 채소 유래의 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용의 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라, 적절한 유화제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용함으로써, 제조될 수 있다. 주사용 제제는 비독성의 비경구 투여 가능한 희석제, 예를 들어 수용액 또는 멸균 주사용수 또는 용매 중의 현탁액일 수 있다. 유용한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 식염수 등이 허용되며, 일반적인 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성유가 사용될 수 있다. 이들 목적을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방유 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 다이- 또는 트라이-글리세리드를 포함하는 임의의 종류의 비휘발성유 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구 투여는 당업계에 공지되어 있고, 이로 제한되는 것은 아니나, 통상적인 주사 수단, 미국 특허 제 5,851,198호에 개시된 바와 같은 가스 압력 무바늘 주사 장치 및 미국 특허 제 5,839,446호에 개시된 바와 같은 레이저 천공기 장치를 포함하며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
5.4.2 폐용
제형물
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 포함하는 조성물은 폐 투여용으로 제형화된다. 폐 투여를 위해, 상기 조성물은 부비강 또는 폐의 하부 기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 폐 투여용 조성물은 흡입에 의한 치료제 투여용으로 당업계에 공지된 임의의 다양한 흡입 또는 비강용 장치에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비강 또는 폐포에 에어로졸화된 제제를 침착시킬 수 있는 이러한 장치는 정량 흡입기, 분무기, 건조 분말 발생기, 스프레이 등을 포함한다. 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 폐 또는 비강 투여를 유도하는데 적합한 다른 장치가 또한 당업계에 공지되어 있다. 이러한 모든 장치는 에어로졸에서 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투약을 위한 투여에 적합한 제형물을 사용한다. 이러한 에어로졸은 용액 (수용액 및 비수용액 둘 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. Ventolin® 정량 흡입기와 같은 정량 흡입기는 전형적으로 추진 가스를 사용하고, 흡기 중 작동을 필요로 한다 (예를 들어, WO 94/16970, WO 98/35888 참조). 몇가지 예를 들자면, Inhale Therapeutics에 의해 판매되는 장치인 Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler®. (Glaxo), Diskus® (Glaxo)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 분말의 호흡 작동을 사용한다 (미국 특허 제 4,668,218호 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, 미국 특허 제 5,458,135호 Inhale, WO 94/06498 Fisons, 이는 그 전문이 본 명세서에서 참조로 포함됨). (Mallinckrodt) 및 Acorn II 분무기 (Marquest Medical Products) (미국 특허 제 5,404,871호 Aradigm, WO 97/22376)와 같은 분무기 (상기 참조 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨)는 용액으로부터 에어로졸을 생성하고, 계량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 작은 입자 에어로졸을 생성한다. 상업적으로 입수가능한 흡입 장치의 그러한 예는 비 제한적인 예로서 범위를 제한하려는 것은 아니다. Ultravent® 분무기 (Mallinckrodt) 및 Acorn II® 분무기 (Marquest Medical Products) (미국 특허 제 5,404,871호 Aradigm, WO 97/22376)와 같은 분무기는 용액으로부터 에어로졸을 생성하고, 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 작은 입자 에어로졸을 생성하며, 상기 참조문헌은 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함된다. 상업적으로 입수가능한 흡입 장치의 이러한 예는 비 제한적인 예로서, 범위를 제한하려는 것은 아니다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 포함하는 스프레이는 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 현탁액 또는 용액을 가압하에 노즐을 통과시킴으로써, 생성될 수 있다. 노즐 크기 및 구성, 적용 압력 및 액체 공급 속도는 원하는 출력 및 입자 크기가 달성되도록 선택할 수 있다. 전기 분사는, 예를 들어 모세관 또는 노즐 공급과 연결된 전계 (electric field)에 의해 생성될 수 있다. 유리하게는, 스프레이에 의해 전달되는 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 입자는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um의 범위 및 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um의 입자 크기를 갖는다.
스프레이용으로 적합한 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 포함하는 조성물의 제형물은 전형적으로 수성 용액 중에 약 0.1 mg 내지 약 100 mg/ml 용액 또는 mg/gm의 농도, 또는 임의의 범위 또는 그 범위내의 값, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/ml 또는 mg/gm의 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 제형물은 제제, 예를 들어 부형제, 완충제, 등장성 제제, 보존제, 계면활성제, 및, 바람직하게는, 아연을 포함할 수 있다. 상기 제형물은 또한, 부형제 또는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 조성물의 안정화제, 예를 들어 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물의 제형에 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질의 제형에 유용한 전형적 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 상기 조성물은 또한, 에어로졸 형성시 용액의 원자화에 의해 야기된 조성물의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 예방할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올 및 폴리옥시 에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 종래의 계면활성제가 사용될 수 있다. 양은 대체적으로 제형물의 0.001 내지 14 중량%의 범위일 것이다. 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다.
특정 실시형태에서, 상기 조성물은 제트 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 분무기를 통해 투여된다. 전형적으로, 제트 분무기에서 압축 공기 공급원은 오리피스를 통해 고속의 에어 제트를 생성하는데 사용된다. 가스가 노즐을 지나 팽창하면, 저압 영역이 생성되어, 액체 저장소에 연결된 모세관을 통해 항체 조성물 단백질의 용액을 도출시킨다. 모세관으로부터의 액체 흐름은 튜브를 빠져나올 때, 불안정한 필라멘트와 물방울로 전단되어, 에어로졸을 생성한다. 주어진 제트 분무기에서 원하는 성능 특성을 달성하기 위해, 다양한 구성, 유속 및 배플 유형이 사용될 수 있다. 초음파 분무기에서, 고주파 전기 에너지는 전형적으로 압전 변환기를 사용하여 진동, 기계 에너지를 생성하는데 사용된다. 이 에너지는 직접적으로 또는 커플링 유체를 통해, 항체 조성물 단백질 제형물에 전송되어, 상기 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성한다. 유리하게는, 분무기에 의해 전달되는 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um의 범위 및 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um의 입자 크기를 갖는다.
특정 실시형태에서, 상기 조성물은 정량 흡입기 (MDI)를 통해 투여되고, 압축가스, 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조) 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제는 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서, 캐니스터 (canister) 내에 함유된다. 계량 밸브의 작동은 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um 및 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um의 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 염료 혼합물을 방출한다. 원하는 에어로졸 입자 크기는 제트 분쇄, 스프레이 건조, 임계점 응축 등을 포함하는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 생성되는 항체 조성물 단백질의 제형물을 사용하여 획득될 수 있다. 바람직한 정량 흡입기는 3M 또는 Glaxo에 의해 제조되고, 하이드로플루오로카본 압축가스를 사용하는 것을 포함한다.
정량 흡입기 장치용의 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)의 제형물은 대체적으로, 예를 들어, 계면활성제의 보조 하에 압축가스 중에 현탁된 비수성 배지 중의 현탁액으로서 적어도 하나의 항-IL-6 항체를 함유하는 미분 분말을 포함한다. 압축가스는 이러한 목적을 위해 사용되는 통상의 임의의 물질, 예를 들어, 트리클로로플루오로메탄, 다이클로로다이플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a (하이드로플루오로알칸-134a), HFA-227 (하이드로플루오로알칸-227) 등을 포함하는 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 탄화수소일 수 있다. 바람직하게는, 압축가스는 하이드로플루오로탄소이다. 계면활성제는 화학적 분해 등에 대해 활성 제제를 보호하기 위해, 압축가스 중의 현탁액으로서, 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 안정화하는 것으로 선택될 수 있다. 적절한 계면활성제는 소르비탄 트라이올레에이트, 소야 레시틴 (soya lecithin), 올레산 등을 포함한다. 일부 경우에, 에탄올과 같은 용매를 사용하는 용액 에어로졸이 바람직하다. 단백질의 제형물용으로 당업계에 공지된 추가의 제제가 또한 상기 제형물 중에 포함될 수 있다.
5.4.3 경구적
제형물
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 경구 투여를 위해, 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여 조성물 및 방법은, 효소적 분해를 억제하기 위해, 예를 들어, 췌장 트립신 억제제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트 (DFF) 및 트라실롤과 같은 효소적 억제제의 공동-투여뿐만 아니라, 인위적으로 장벽의 침투성을 증가시키기 위해, 예를 들어, 레조르시놀 및 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르와 같은 에쥬번트의 공동-투여에 의존적이다. 경구 투여용 고형 투여 형태의 활성 성분 화합물은 수크로스, 락토스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체 및 글리세리드를 포함하는 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이들 투여 형태는 또한 다른 유형(들)의 첨가제, 예를 들어 비활성 희석제, 윤활제, 예를 들어 스테아르산 마그네슘, 파라벤, 보존제, 예를 들어 소르브산, 아스코르브산, 알파-토코페롤, 항산화제, 예를 들어 시스테인, 붕괴제, 결합제, 경화제, 완충제, 감미료, 향미료, 향료 등을 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 경구 투여용 정제 및 환제는 추가로 장용 코팅 조제물로 가공될 수 있다. 특정 실시형태에서, 경구 투여용 액체 조제물은, 예를 들어 의학적 용도로 허용되는 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 조제물을 포함한다. 이들 조제물은 상기 분야에서 일반적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 리포솜 조제물은, 예를 들어 인슐린 및 헤파린 (미국 특허 제 4,239,754호)에 대해 개시된 바와 같은 경구 투여용 조제물에 사용될 수 있다. 또한, 혼합된 아미노산 (프로티노이드)의 인공 중합체의 미소구체를 의약품의 경구 투여에 사용할 수 있는데, 이는, 예를 들어, 미국 특허 제 4,925,673호에 개시된 바와 같다. 또한, 담체 화합물, 예를 들어, 미국 특허 제 5,879,681호 및 미국 특허 제 5,871,753호에 개시된 것이 생물학적 활성제의 경구 투여에 사용된다.
5.4.4 점막용
제형물
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 점막 표면을 통한 흡수용으로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 점막 표면을 통한 흡수를 위해, 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)의 투여 조성물 및 방법은 에멀젼 입자의 점막점착의 달성에 의해, 점막 표면을 통한 흡수를 촉진하는 복수의 서브미크론 입자, 점막점착성 거대분자, 생체활성 펩티드 및 수성 연속 상을 포함한다 (미국 특허 제 5,514,670호). 본 명세서에서 제공되는 에멀젼의 적용에 적합한 점막 표면은, 예를 들어, 각막, 결막, 협측, 설하, 비강, 질, 폐, 위장, 장 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 좌제와 같은 질 또는 직장 투여용 제형물은 부형제로서, 예를 들어, 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비강내 투여용 제형물은 고체일 수 있고, 부형제로서, 예를 들어, 락토스를 함유할 수 있거나, 비강 적하 (nasal drop)의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 협측 투여를 위한 부형제는, 예를 들어, 당, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 사전 젤라틴화된 전분 등을 포함한다 (미국 특허 제 5,849,695호).
5.4.5
경피용
제형물
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 경피 투여용으로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 경피 투여를 위해, 상기 조성물은 전달 장치, 예를 들어, 예를 들어, 리포솜 또는 중합체성 나노입자, 미립자, 마이크로캡슐 또는 미소구체 (달리 언급되지 않는 한, 미립자로 총칭됨) 내에 캡슐화된 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 포함한다. 합성 중합체, 예를 들어 폴리하이드록시산, 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 그의 공중합체, 폴리오르소에스테르, 폴리안하이드라이드 및 폴리포스파젠 및 천연 중합체, 예를 들어 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 다른 단백질, 알지네이트 및 다른 다당류 및 그의 조합으로 이루어진 미립자를 포함하여, 경피 투여용의 다양한 적합한 장치가 공지되어 있다 (미국 특허 제 5,814,599호).
5.4.6
키트
또한, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 접합체를 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 같은 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물의 하나 이상의 구성성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물 및 예방제 또는 치료제를 함유한다.
선택적으로, 이러한 용기(들)와 관련되는 것은 의약품 또는 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지, 투여 형태 및/또는 그의 사용 설명서일 수 있다. 특정 실시형태에서, 키트에 포함된 설명서는 약제학적 조성물(들)의 투여를 위한 투여량 및/또는 투여 요법에 관한 지침을 제공한다.
약제학적 포장재의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 블리스터 팩, 병, 패킷, 사셰, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기 및 선택된 약제학적 조성물 및 투여 및 치료의 의도된 방식에 적합한 임의의 포장재를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 키트는 활성 구성성분을 투여하는데 사용되는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장치의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 주사기, 무바늘 인젝터 (needle-less injector), 드립 백 (drip bag), 패치 및 흡입기를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 키트는 구성성분을 투여하는데 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 구성성분이 비경구적 투여를 위해, 재구성되어야 하는 고체 형태로 제공되는 경우, 키트는, 비경구적 투여에 적합하거나, 경구 투여용의 현탁액으로서 재구성될 수 있는 미립자 무함유 멸균 용액의 생성을 위해, 구성성분이 용해될 수 있는 적합한 비히클의 밀봉 용기를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 비히클의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기를 포함한다: 이에 제한되는 것은 아니나, 주사용수 USP, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사 및 젖산 링거 주사를 포함하는 수성 비히클; 이에 제한되는 것은 아니나, 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하는 수혼화성 비히클 (water-miscible vehicle); 및 이에 제한되는 것은 아니나, 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 에틸 올레에이트, 아이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트를 포함하는 비수성 비히클.
5.5 용도 및 방법
5.5.1 치료적 용도 및 방법
특정 실시형태에서, 대상체의 암, 특히 대상체의 MUC16-양성 암을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 구체적 실시형태에서, 상기 대상체는 섹션 5.5.5에 개시된 바와 같은 대상체이다. 구체적 실시형태에서, 상기 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 섹션 5.5.3에 개시된 바와 같은 투여량으로 투여된다. 구체적 실시형태에서, 상기 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 섹션 5.5에 개시된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 구체적 실시형태에서, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 섹션 5.5.4에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제와 병용 투여된다.
특정 종의 대상체에서 MUC16 당화 항체 또는 그의 단편을 사용하는 경우에, 특정 종의 MUC16에 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 단편이 사용된다. 예를 들어, 인간의 치료를 위해, 인간 MUC16에 결합하는 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 사용된다. 구체적 실시형태에서, 상기 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 면역글로불린이다.
또한, 특정 종의 대상체에서 MUC16 당화 항체 또는 그의 단편을 사용하는 경우에, MUC16 당화 항체, 바람직하게는, MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 불변 영역은 특정 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 인간의 치료를 위해, MUC16 당화 항체 또는 그의 단편은 면역글로불린인 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있으며, 상기 면역글로불린은 인간 불변 영역을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 상기 대상체는 인간이다.
구체적 실시형태에서, 상기 MUC16-양성 암은 난소암, 폐암, 췌장암, 유방암, 나팔관암, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막암), 원발성 복막암 또는 MUC16 수용체를 발현하는 임의의 다른 조직의 암이다.
구체적 실시형태에서, 치료는, 검출 가능하거나, 검출 불 가능한지 여부에 상관없이, 이에 제한되는 것은 아니나, 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 저지 또는 지연, 질환 상태의 호전 또는 완화 및 관해 (remission) (부분적인지, 또는 전체적인지 여부와 상관없음)를 포함하여, 유리하거나, 바람직한 임상 결과를 달성하는 것일 수 있다. 구체적 실시형태에서, "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우의 예상 생존과 비교하여, 생존을 연장시키는 것일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 암 (예를 들어, 난소암, 폐암, 췌장암, 유방암, 나팔관암, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막암), 또는 원발성 복막암, 또는 MUC16 수용체를 발현하는 임의의 다른 조직의 암)을 가진 대상체에 투여하는 경우, 하기 효과 중 적어도 한 가지, 두 가지, 세 가지, 네 가지 이상이 달성된다: (i) 암의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소 또는 호전; (ii) 암과 관련된 하나 이상의 증상 지속 기간의 감소; (iii) 암과 관련된 증상의 재발의 예방; (iv) 대상체의 입원의 감소; (v) 입원 기간의 감소; (vi) 대상체의 생존의 증가; (vii) 또 다른 치료법의 치료 효과의 증강 또는 개선; (viii) 암과 관련된 하나 이상의 증상의 발생 또는 발병의 억제; (ix) 암과 관련된 증상의 수의 감소 (x) 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 평가된 바와 같은 삶의 질의 개선; (x) 종양의 재발의 억제; (xi) 종양 및/또는 그와 관련된 하나 이상의 증상의 퇴축; (xii) 종양 및/또는 그와 관련된 하나 이상의 증상의 진행의 억제; (xiii) 종양의 성장의 감소; (xiv) 종양 크기 (예를 들어, 용적 또는 직경)의 저하; (xv) 새로 형성된 종양의 형성의 감소; (xvi) 원발성, 국소성 및/또는 전이성 종양의 예방, 근치 (eradication), 제거 또는 제어; (xvii) 전이의 횟수 또는 크기의 저하; (xviii) 사망률의 감소; (xix) 무재발 생존의 증가; (xx) 당업자가 이용 가능한 통상적인 방법, 예를 들어 자기 공명 영상 (MRI), 역동적 조영 증강 MRI (DCE-MRI), X-선 및 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영 (position emission tomography) (PET) 스캔에 의해 측정되는 바와 같이, 표준 치료법의 투여 후, 종양의 크기는 유지되고, 증가하지 않거나, 종양의 증가보다 적게 증가함; 및/또는 (xxi) 환자에서 관해 기간의 증가. 치료는 전술된 것들 중 하나 이상을 달성하는 것일 수 있다.
5.5.2 진단적 용도
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)은 본 명세서에 개시된 병증 (예를 들어, MUC16-양성 암 세포를 포함하는 병증)을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적으로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 진단 목적으로 사용하기 위한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 섹션 5.2에 개시된 바와 같이 표지된다.
특정 실시형태에서, (a) 본 명세서에 개시된 하나 이상의 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용한 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서의 MUC16 또는 그의 단편의 발현의 분석; 및 (b) MUC16 또는 그의 단편 발현의 수준을 대조군 수준, 예를 들어 (예를 들어, 본 명세서에 개시된 병증을 갖지 않은 대상체 또는 상기 병증의 발병 전의 동일 환자의) 정상 조직 샘플에서의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 본 명세서에 개시된 병증의 검출 방법이 본 명세서에서 제공되며, MUC16 또는 그의 단편 발현의 대조군 수준과 비교하여, MUC16 또는 그의 단편 발현의 분석된 수준에서의 증가 또는 저하는 본 명세서에 개시된 병증의 징후이다.
본 명세서에 개시된 항체는 본 명세서에 개시되거나, 당업자에 공지된 바와 같은 정통의 면역조직학적 방법을 사용하여, 생물학적 샘플에서 MUC16 또는 그의 단편의 수준을 분석하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; 및 Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096] 참조). 단백질 유전자 발현의 검출에 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역분석, 예를 들어 효소 연결된 면역흡착 분석 (ELISA) 및 방사성면역분석 (RIA)을 포함한다. 적절한 항체 분석 표지는 당업계에 공지되어 있으며, 효소 표지, 예를 들어, 글루코스 옥시다제; 방사성 동위원소, 예를 들어 요오드 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 트리튬 (3H), 인듐 (121In) 및 테크네튬 (99Tc); 발광 표지, 예를 들어 루미놀; 및 형광 표지, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민 및 비오틴을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 병증 (예를 들어, MUC16-양성 암)의 모니터링은 초기 진단 후, 일정 기간 동안 진단 방법을 반복함으로써, 수행한다.
표지된 분자의 존재는 생체내 스캐닝을 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 대상체에서 검출할 수 있다. 당업자는 특정 표지를 검출하는 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에 사용될 수 있는 방법 및 장치는, 이로 제한되는 것은 아니나, 컴퓨터 단층촬영 (CT), 전신 스캔, 예를 들어 양전자 방출 단층촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 초음파조사를 포함한다.
5.5.3 투여량 및 요법
본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조), 또는 조성물 (섹션 5.4 참조), 또는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하는 세포는 다양한 경로에 의해, 대상체에 전달될 수 있다. 이는, 이로 제한되는 것은 아니나, 비경구, 비강내, 기관내, 경구, 피내, 국소, 근육내, 복강내, 경피, 정맥내, 종양내, 결막 및 피하 경로를 포함한다. 폐로의 투여는 또한, 예를 들어 흡입기 또는 분무기 및 스프레이용 에어로졸화제를 갖는 제형물의 사용에 의해, 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 조성물은 대상체 (예를 들어, 섹션 5.5.5에 개시된 바와 같은 대상체)에 비경구적으로 투여된다. 구체적 실시형태에서, 상기 비경구 투여는 정맥내, 근육내 또는 피하이다.
병증의 치료 및/또는 예방에 유효한 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 조성물의 양은 질환의 특성에 의존적일 것이고, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다.
조성물 중에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 암의 유형에 의존적일 것이고, 전문의의 판단 및 각 대상체의 환경에 따라, 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 투여량은 또한 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태 (연령, 체중 및 건강상태를 포함함), 상기 환자가 인간인지 또는 동물인지 여부, 투여된 다른 의약 또는 치료가 예방을 위한 것인지 또는 치료를 위한 것인지에 의존하여, 달라질 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능의 최적화를 위해, 최적으로 적정된다.
특정 실시형태에서, 최적의 투여량 범위를 확인하는데 도움이 되는 시험관내 분석이 사용된다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경우에, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg 및 더욱 대체적으로는 0.01 내지 15 mg/kg 환자 체중의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중, 10 mg/kg 체중, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위 내 또는 달리는, 70 kg의 환자의 경우에, 각각 70 mg 또는 700 mg 또는 70 mg 내지 700 mg의 범위 내이다. 대체적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해, 다른 종으로부터의 항체보다 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 더 낮은 투여량 및 저빈도의 투여가 보통 가능하다.
특정 실시형태에서, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 CAR를 발현하는 조작된 세포의 투여에서, 대상체는 약 1 x 106 내지 약 100 x 109 세포, 예를 들어, 예를 들어, 1 x 106 내지 약 50 x 109 세포 (예를 들어, 약 5 x 106 세포, 약 25 x 106 세포, 약 500 x 106 세포, 약 1 x 109 세포, 약 5 x 109 세포, 약 20 x 109 세포, 약 30 x 109 세포, 약 40 x 109 세포, 또는 전술된 값의 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), 예를 들어 약 10 x 106 내지 약 100 x 109 세포 (예를 들어, 약 20 x 106 세포, 약 30 x 106 세포, 약 40 x 106 세포, 약 60 x 106 세포, 약 70 x 106 세포, 약 80 x 106 세포, 약 90 x 106 세포, 약 10 x 109 세포, 약 25 x 109 세포, 약 50 x 109 세포, 약 75 x 109 세포, 약 90 x 109 세포, 또는 전술된 값의 임의의 2개에 의해 정의되는 범위) 및 일부 경우에, 약 100 x 106 세포 내지 약 50 x 109 세포 (예를 들어, 약 120 x 106 세포, 약 250 x 106 세포, 약 350 x 106 세포, 약 450 x 106 세포, 약 650 x 106 세포, 약 800 x 106 세포, 약 900 x 106 세포, 약 3 x 109 세포, 약 30 x 109 세포, 약 45 x 109 세포) 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 범위에서 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에서, 총 세포의 투여량 및/또는 세포의 개별 하위 집단의 투여량은 약 104 또는 약 109 세포/킬로그램 (kg) 체중 또는 그 사이, 예를 들어 105 내지 106 세포/kg 체중, 예를 들어, 또는 약 1 x 105 세포/kg, 1.5 x 105 세포/kg, 2 x 105 세포/kg, 또는 1 x 106 세포/kg, 2 x 106 세포/kg, 5 x 106 세포/kg, 또는 10 x 106 세포/kg 체중 사이의 범위 내이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 세포는 약 104 또는 약 109 T 세포/킬로그램 (kg) 체중 또는 그 사이, 예를 들어 105 내지 107 T 세포/kg 체중으로 또는 그 특정 오차 범위 내로 투여된다.
MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다수회의 경우로 투여될 수 있다. 단일 투여 사이의 간격은 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 또는 2년일 수 있다.
5.5.4 병용 치료법
구체적 실시형태에서, 대상체에서 암 (예를 들어, 난소암, 췌장암, 폐암, 유방암, 나팔관암, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막암), 또는 원발성 복막암)의 치료를 위한 본 명세서에서 제공되는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법은 대상체에 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 대상체에서의 암 (예를 들어, 난소암, 췌장암, 폐암, 유방암, 나팔관암, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막암) 및 원발성 복막암)을 치료하기 위한 것이다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 치료제는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)에 의한 치료의 임의의 부작용을 치료하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, N-당화된 Asn1806을 포함하고, 또한, N-당화된 Asn1800을 포함하는 MUC16의 에피토프 (즉, N-당화된 부위 둘 모두 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 의해 인식되는 에피토프의 일부임)를 인식하는 제2 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합하여, N-당화된 Asn1806을 포함하나, N-당화된 Asn1800을 포함하지 않는 MUC16의 에피토프 (즉, MUC16과의 결합을 위해, N-당화된 Asn1806이 필요하나, N-당화된 Asn1800은 필요하지 않음)를 인식하는 제1 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 투여된다. 이러한 제1 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) MUC16의 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; (ii) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여; 및 (iii) 제4 형태가 당화되어 있고, 제4 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 152인 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력에 의해 확인될 수 있으며, 여기서, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포, MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포 및 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 동일한 세포 유형이다. 이러한 제2 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; 및 (ii) 제5 형태가 당화되어 있고, 제5 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 172인 MUC16의 제5 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여에 의해 확인될 수 있으며, 여기서, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 MUC16의 제5 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 동일한 유형의 세포이다. 서열 번호 172의 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 또한 본 명세서에서 MUC16c114 -N23으로서 지칭된다. MUC16c114-N23은, 아미노산 위치 24 및 30의 아스파라긴 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1800 및 Asn1806에 상응함)이 알라닌으로 변이된 것을 제외하고, 성숙한 MUC16의 C 말단의 114개의 아미노산 잔기 (성숙한 MUC16의 서열은 서열 번호 150임)로 이루어진다. 따라서, MUC16c114 -N23은 서열 번호 172의 아미노산 위치 24 및 30 (서열 번호 150의 아미노산 위치 Asn1800 및 Asn1806에 상응함)에서 N-당화될 수 없다.
일 실시형태에서, N-당화된 Asn1800을 포함하나, N-당화된 Asn1806을 포함하는 MUC16의 에피토프 (즉, MUC16과의 결합을 위해, N-당화된 Asn1800이 필요하나, N-당화된 Asn1806은 필요하지 않음)를 인식하는 제2 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합하여, N-당화된 Asn1806을 포함하나, N-당화된 Asn1800을 포함하지 않는 MUC16의 에피토프 (즉, MUC16과의 결합을 위해, N-당화된 Asn1806이 필요하나, N-당화된 Asn1800은 필요하지 않음)를 인식하는 제1 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 투여된다. 이러한 제1 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) MUC16의 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; (ii) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여; 및 (iii) 제4 형태가 당화되어 있고, 제4 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 152인 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력에 의해 확인될 수 있으며, 여기서, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포, MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포 및 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 동일한 세포 유형이다. 이러한 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 제1 형태가 당화되어 있고, 제1 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 133인 MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; (ii) 제3 형태가 당화되어 있고, 제3 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 139인 MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와 면역특이적으로 결합하는 능력; 및 (iii) 제4 형태가 당화되어 있고, 제4 형태의 아미노산 서열이 서열 번호 152인 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포와의 면역특이적 결합의 결여에 의해 확인될 수 있으며, 여기서, MUC16의 제1 형태를 재조합적으로 발현하는 세포, MUC16의 제3 형태를 재조합적으로 발현하는 세포 및 MUC16의 제4 형태를 재조합적으로 발현하는 세포는 동일한 유형의 세포이다.
구체적 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 난소암의 치료에 사용되는 제제이다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 췌장암의 치료에 사용되는 제제이다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 폐암의 치료에 사용되는 제제이다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 유방암의 치료에 사용되는 제제이다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 나팔관 암의 치료에 사용되는 제제이다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 자궁 (예를 들어, 자궁내막) 암의 치료에 사용되는 제제이다. 구체적 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 원발성 복막암의 치료에 사용되는 제제이다.
본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)은 추가의 치료제와 동시에 또는 순차적으로 (전 및/또는 후) 투여될 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 추가의 치료제는 동일하거나 상이한 조성물 중에, 동일하거나 상이한 투여의 경로에 의해, 투여될 수 있다. 제1 치료법 (본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조), 또는 추가의 치료제)은 암 (예를 들어, 난소암, 췌장암, 폐암, 유방암, 나팔관암, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막암) 및 원발성 복막암)이 있는 대상체에 본 명세서에 개시된 제2 치료법 (본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조) 또는 추가의 치료제의 투여 전 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전)에 부수하여 또는 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후) 후속하여, 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)과 병용하여, 대상체에 투여되는 추가의 치료제는 동일한 조성물 (약제학적 조성물)로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)와 병용하여 투여되는 추가의 치료제는 본 명세서에 개시된 MUC16 당화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (섹션 5.1 및 섹션 5.2 참조)과 상이한 조성물로 대상체에 투여된다 (예를 들어, 둘 이상의 약제학적 조성물이 사용됨).
5.5.5 환자 집단
본 명세서에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 임의의 포유류, 예를 들어 설치류, 고양이, 개과동물, 말, 소, 돼지, 원숭이, 영장류, 또는 인간 등일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 대상체는 인간이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 대상체는 개과동물이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는, 이로 제한되는 것은 아니나, 난소암, 폐암, 췌장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암, 또는 원발성 복막암, 또는 MUC16을 발현하는 임의의 다른 조직의 암을 포함하는 MUC16-양성 암으로 진단된다.
하기의 실시예는 예시로서 제공되는 것이고, 제한하기 위한 것은 아니다.
6.
실시예
6.1
실시예
1:
MUC16
/CA125의
카르복시
-말단부의 발현이 형질전환 및 종양 침입을 유도한다.
6.1.1 도입
1980년대 초반 이래로 MUC16의 항원성 단편인 혈청 CA125 항원이 난소암 사정 및 관리의 주축이 되어 왔지만, 그의 생물학적 성질 및 난소암 소견에 대한 기여에 관해서는 충분히 이해되지 않은 상태이다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 1-3 참조). 2001년 달성된, CA125의 클로닝을 통해 작은 세포내 도메인, 막관통 도메인, 추정 절단 부위에 인접한 엑토도메인, 및 각각의 길이가 156개의 아미노산 길이인 것인 12-10개의 탠덤 반복부로 이루어진, 큰, 대량으로 당화된 영역을 포함하는 테더링된 뮤신으로서 MUC16이 최초로 확인되었다 (도 1a) (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 4-6 참조). 난소암, 나팔관암, 및 자궁암의 혈청은 대개 다량의 MUC16을 발현하며, 폐암, 췌장암, 및 유방암을 비롯한, 수개의 다른 악성 종양에서 비정상적인 MUC16 발현을 발견할 수 있다. 다른 테더링된 뮤신의 발현이 상피 기관의 공통된 특징이며, 이는 대개 악성 종양에서 과다발현된다. 2개의 중요한 예로는 다수의 유방암 및 난소암에서 과다발현되는 MUC1, 및 특징적으로 췌장암 및 위장암에 풍부하게 존재하는 MUC4가 있다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 7 참조). 상기 두 뮤신 모두 형질전환 특성을 가지는 것으로 확인되었다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 8 및 9 참조). 형질전환 기전은 상이하며, 불완전하게 이해되고 있다. MUC1은 핵으로 전위되고, 전사 인자로서 작용하는 것으로 밝혀진 베타-카테닌 상동성 영역을 가진다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 10 및 11 참조). 그에 반해, MUC4는 그의 막관통 영역 내에 HER-결합 도메인을 가지며, 적어도 부분적으로는 HER 패밀리 키나제를 통해 작용한다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 12 및 13 참조). MUC16에는 상기 도메인 중 어느 한 도메인과 상동성인 영역이 존재하지 않으며, 이는 독립적으로 진화한 것으로 보인다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 12 참조). MUC1 및 MUC4, 둘 모두와 비교하였을 때, MUC16의 발현은 뮐러관 및 눈 상피로 더욱 제한되며, 보통은 거의 전적으로 그에서 발현된다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 14-16 참조). MUC16 분자의 탠덤 반복부 영역은 메소텔린 및 다른 기질 단백질과의 중요한 상호작용 단백질로서 작용하는 것으로 보인다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 17 참조). 이러한 상호작용이 아마도 난소암에 의한 고전적 패턴의 장막 확산을 담당하는 것으로 보인다. 임상적 환경에서, CA125 항원을 코딩하는 것인, 고수준의, MUC16으로부터의 순환 요소가 병기, 등급 및 다른 전통적인 임상 인자와 상관없이, 유해한 임상 결과와 연관이 있다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 18 참조). 다른 당업자를 통해 MUC16의 C-말단이 침입 및 성장에서 중요한 것으로 확인되었지만, 형질전환을 담당하는 인접한 MUC16 서열의 특정 영역은 상세하게 설명되지는 않았다 (예컨대, 문헌 [Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-443] 및 [Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91-98] 참조). 더 캔서 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas: TCGA) 난소암 프로젝트에서 난소암 DNA에서의 MUC16을 코딩하는 게놈 영역의 증폭 및 MUC16 mRNA의 과다발현이 관찰되었으며, 이는 더욱 불량한 결과와 연관이 있다 (문헌 [하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 19 참조). 마우스에서 MUC16의 손실이 독특한 표현형과 연관은 없지만, 지속적이거나, 또는 비정상적인 MUC16 발현의 효과는 공지되어 있지 않다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 20 참조). 본 실시예의 데이터는 MUC16의 114개의 C-말단 아미노산 잔기 (MUC16c114, 서열 번호: 133) 발현, 및 특히, (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn1806에 상응하는) MUC16c114의 잔기 Asn30의 당화가 신호 전달, 유전자 발현, 및 공격적인 생물학적 거동의 특이적인 변경과 연관이 있다는 것을 제시한다.
6.1.2 물질 및 방법
6.1.2.1
MUC16
카르복시
-말단 (
MUC16c114
) 및
MUC16
-CA125 도메인 (MUC16c344) DNA 작제물 및
당화된
융합 단백질의 합성
말단절단된 형태의 MUC16 (MUC16c344, MUC16c114, MUC16c80, 및 MUC16c86으로 지정; 도 1b 및 도 1c)을 코딩하는 DNA 작제물을 생성하였다. phrGFP II-C 벡터 (phrGFP) (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야))의 EcoRV 및 NotI 다중 클로닝 부위를 사용하여 MUC16c114, MUC16c80, MUC16c86 및 MUC16c344 DNA를 도입함으로써 GFP 단백질이 말단절단된 MUC16 융합 단백질의 카르복시-말단 상에 존재하는 GFP 융합 작제물을 생성하여 수득하였다. 주형으로서 pBK-CMV-MUC16-B53 DNA를 사용하여 MUC16 단편 (MUC16c344, MUC16c114, MUC16c80, 및 MUC16c86)에 대한 PCR 생성물을 생성하였고 (문헌 [Yin BWT, et al., International Journal of Cancer, 2002, 98(5):737-740]), PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 정제하고, 서열분석하고, phrGFP II-C 벡터 (phrGFP)의 EcoRV 및 NotI 다중 클로닝 부위 내로 삽입하였다. pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터는 인비보겐(InvivoGen: 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 구입하였다. (서열 번호: 150의 위치 1777번부터 1834번까지의) 엑토도메인 MUC16c57-114에 대한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 프라이머를 디자인하거나, 또는 정방향 프라이머로서 제한 효소 부위 EcoRV 및 역방향 프라이머로서 제한 효소 부위 NcoI를 사용하여 117- 244LGALS3 DNA 서열의 당 결합 도메인을 합성하였다 (시그마-게노시스(Sigma-Genosys: 미국 텍사스주 더 우드랜즈)). 주형으로서 pBK-CMV-MUC16-B53 DNA를 사용하여 MUC16c57 -114 단편에 대한 PCR 생성물을 생성하였고, ATCC (미국 버지니아주 매너서스)로부터 입수한 LGALS3 cDNA 클론 (MGC:2058 IMAGE:3050135 진뱅크(GenBank): AAH01120.1; DB소스 수탁(DBSource accession) BC001120.2)을 DNA 주형으로서 사용하여 LGALS3 PCR 생성물의 당 결합 도메인을 합성하였다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔, 서열분석하고, 1% 아가로스 겔에서 정제하고, 서열분석하고, pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터 내로 삽입하였다.
6.1.2.2
프라이머
및
PCR
MUC16-세포질 도메인 (MUC16c114, 카르복시-말단 114 aa)에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 5'-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGAACTTCTCGCCACTGGCT-3' 및 5'-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3', 서열 번호: 121 및 서열 번호: 122). 정방향 프라이머 중 EcoRV 및 KOZAK, 및 역방향 프라이머 중 NotI를 포함하는, MUC16c344 (단 하나의 시스테인 루프를 가지는 1개의 탠덤 반복부, 344 aa)에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 5'-CCATGCGATATCGCCACCATGGTGACAGGCCCTGGGCTGGACAGA-3' 및 5'-TACGGCGGCCGCTTGCAGATCCTCCAGGTCTAGG-3'). MUC16c114-GFP DNA 작제물을 사용하여 퀵 체인지 프라이머에 의해 MUC16c80 및 MUC16c86 작제물을 생성하였다. MUC16c57 -114 pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 5'-CCATGCGATATCAAACTTCTCGCCACTGGCT-3' 및 5'-AGATCTAACCATGGGAAGGTCAGAATTCCCAGT-3', 서열 번호: 125 및 서열 번호: 126), 및 정방향 프라이머 중 EcoRV, 및 역방향 프라이머 중 NcoI를 포함하는, pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터에 대한 117- 244LGALS3의 당 결합 도메인에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 5'-CATGCGATATCACCTTATAACCTGCCTTTG-3' 및 5'-AGATCTAACCATGGTATATGAAGCACTGGT-3', 서열 번호: 127 및 서열 번호: 128). 상기 프라이머는 모두 시그마 게노시스 (미국 텍사스주 더 우드랜즈)에 의해 합성되었다.
PCR 조건은 하기 프로세스에 의해 달성하였다: 변성을 달성하기 위해 DNA를 95℃에서 5분 동안 용융시켰다. 97℃에서 30초 동안 가열, 60℃에서 1분 동안 어닐링, 및 72℃에서 1분 동안 연장으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 이어서, 생성된 PCR 생성물 가닥을 72℃에서 5분에서 연장시킨 후, 4℃에서 밤새도록 냉각시켰다.
phrGFP II-C 벡터 DNA, MUC16c114, MUC16c80, MUC16c86, MUC16c344, 및 MUC16c678 겔 정제된 DNA를 개별적으로 37℃ 수조에서 밤새도록 EcoRV 및 NotI (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs: 미국 매사추세츠주 비벌리)) 제한 효소로 소화시켰다. pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터 DNA, MUC16c57 -114 및 117- 244LGALS3 겔 정제된 DNA를 개별적으로 37℃ 수조에서 밤새도록 EcoRV 및 NcoI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 비벌리) 제한 효소로 소화시켰다. MUC16c114 및 phrGFP; MUC16c344 및 phrGFP; 또는 MUC16c678 및 phrGFP 제한 소화된 DNA를 겔 정제하고, T4 리가제 (로슈 다이어그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 사용하여 밤새도록 라이게이션시켰다. 유사하게, MUC16c57 -114 및 pFUSE-hIgG1-Fc2; 117- 244LGALS3 및 pFUSE-hIgG1-Fc2 제한 소화된 DNA를 겔 정제하고, T4 리가제 (로슈 다이어그노스틱스 코포레이션: 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 밤새도록 라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 제조사의 프로토콜에 따라 XL-1 블루(XL-1 Blue) 슈퍼 컴피턴트 세포 (스트라타진: 미국 캘리포니아주 라호야)로 형질전환시키고, 이를 phrGFP 벡터의 경우, 카나마이신 (50 ㎍/mL, 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.: 미국 미주리주 세인트루이스))을 함유하는 LB 배지를 포함하는 아가 플레이트 상에, 또는 25 ㎍/ml의 제오신(Zeocin) (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주))을 함유하는 LB 배지를 포함하는 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 다음날 클론을 선별하고, 위저드 플러스 미니프렙(Wizard Plus Miniprep) DNA 정제 시스템 (프로메가 코포레이션(Promega Corporation: 미국 위스콘신주 매디슨))을 사용하여 미니프렙(Miniprep) DNA를 추출하였다. 선별된 클론 DNA를 MSKCC DNA 서열분석 코어 설비에서 MUC16 및 phrGFP의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 서열분석하여 융합된 작제물 또는 MUC16c57-114 및 pFUSE-hIgG1-Fc2 또는 117- 244LGALS3 및 pFUSE-hIgG1-Fc2로서 서열 중 MUC16 및 phrGFP 존재를 확인하였다. 위저드 플러스 메가프렙(Wizard Plus Megaprep) DNA 정제 시스템 (프로메가 코포레이션: 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 상기 클론으로부터 메가프렙(Megaprep) DNA를 제조하고, 이 또한 융합된 작제물로서 상기 서열 중 MUC16 및 phrGFP 또는 MUC16c57 -114 및 pFUSE-hIgG1-Fc2 또는 117-244LGALS3 및 pFUSE-hIgG1-Fc2의 존재에 대해 확인하였다.
6.1.2.3 형광 활성화 세포 분류 (
FACS
)
형질감염된 세포를 트립신으로 처리하고, 세척하고, 혈구계에 의해 계수하였다. 세포를 적어도 0.5-1 X 106개/튜브로 다중 에펜도르프 튜브에 분포시켰다. 세포를, 1% FCS 및 0.025% 소듐 아지드를 함유하는 PBS (FACS 완충제)로 세척하였다. 표면 FACS 염색을 위해, 세포를 1 ㎍/튜브의, MUC16-카르복시-말단 단일클론 (4H11.2.5), 마우스 항-인간 OC125 (M3519) (다코사이토메이션, 다코 노쓰 아메리카 인크.(DakoCytomation, Dako North America Inc.: 미국 캘리포니아주 카핀테리아))의 생체반응성 상청액의 부재하에서 (2차 항체 대조군의 경우), 또는 그와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 에펜도르프 튜브 중의 세포를 또한 1 ㎍/튜브의 비특이적인 아이소타입 매칭된 대조군 마우스 항체 (IgG1 단일클론의 경우, 13C4 및 IgG2b 단일클론의 경우, 4E11, MSKCC 모노클로날(MSKCC Monoclonal) 코어 설비로부터 입수) (데이터 제시하지 않음)로 표면 염색하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 모든 세포를 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세포를 1 ㎍/튜브의 2차 항체 염소 항-마우스 IgG1-PE 또는 IgG2b-PE와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세포를 FACS 칼리버(FACS Calibur)에 의해 분석하였다.
6.1.2.4 세포 배양물
NIH/3T3 (3T3) 세포 (섬유아세포)는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC: 미국 버지니아주 매너서스)을 통해 입수하였고, A2780 세포는 인간 난소 암종 세포주이다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 28 참조). 두 세포주 모두 공개된 조건에 따라 유지시켰다. MUC16 발현 벡터 (phrGFP-MUC16c344, phrGFP-MUC16c114, phrGFP-MUC16c80, 및 phrGFP-MUC16c86)의 형질감염에 의해 안정적인 MUC16-양성 세포주를 생성하고, 그의 각 배양 배지에서 게네티신 (G418, 인비트로겐: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 선별하고, 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현에 기초하여 단리시켰다. MUC16c114 형질감염체는 추정 절단 부위부터 카르복시-말단까지 (서열 번호: 150의 아미노산 1777 내지 1890)의 MUC16 단백질의 세포 표면 발현을 보인다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 5 참조). MUC16의 카르복시-말단까지 연장된 344개의 아미노산 단편 (아미노산 1547 내지 1890)으로서의 MUC16 단백질의 세포 표면 발현을 보이는 MUC16c344-GFP 벡터의 발현을 포함하는 세포주를 비롯한, 더욱 긴 장쇄의 MUC16 단편을 가지는 세포주를 유사한 방식으로 제조하였다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 5 참조).
6.1.2.5 형질감염
모든 작제물을 제조사의 프로토콜에 따라 DOTAP (로슈 다이어그노스틱스, 인디애나폴리스 코포레이션(Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation: 미국 인디애나주))를 사용하여 NIH/3T3 (3T3) 및 A2780 세포 내로 도입하였다. 3T3 및 A2780에 대하여 400 ㎍/mL의 G418을 이용하여 그의 각 배양 배지 중에서 안정적인 형질감염체를 선별하였다. 이를 MSKCC 플로우 사이토메트리 코어 퍼실러티(MSKCC Flow Cytometry Core Facility: FCCF)에서 GFP 발현에 대하여 2회에 걸쳐 세포 분류하고, 선별된 세포를 최대 15 계대 세포주로서 성장시켰다. FACS 분석에 의해 통상의 모니터링을 수행하여 상기 세포주의 GFP-양성 반응을 확인하였다. 항-hrGFP (스트라타진: 미국 캘리포니아주 라호야) 및 항-MUC16-카르복시-말단 단일클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 상기 세포주의 단백질 추출물을 분석하였다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 5 및 14 참조).
6.1.2.6 성장 곡선
1,000개의 안정적인 형질감염된 세포/웰을 다중 96 웰 평저형 플레이트 중 200 ㎕의 배양 배지/웰에 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 5일 동안 인큐베이션시켰다. 매일, 삼중 배양된 플레이트를 25 ㎕/웰의 알라마르 블루(Alamar Blue) (ABD 세로테크 컴퍼니(ABD Serotec Co.: 영국))로 발색시키고, 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 530 nM에서의 여기 및 620 nM에서의 방출로 퍼셉티브 바이오시스템즈 사이토플루오르 멀티웰 플루오레센트 플레이트 리더 모델 # 4000(PerSeptive Biosystems CytoFluor Multiwell Fluorescent Plate Reader Model # 4000) 상에서 플레이트를 판독하였다. 4일 동안에 걸친 성장 곡선을 기록하고, 그에 따라 삼중 플레이트로부터의 평균값을 플롯팅하였다.
6.1.2.7 연질 아가 검정법
안정적인 형질감염된 세포를 아가로스 현탁액에 놓고, 얇은 아가로스 층 상에 플레이팅하고, 고정 비의존성 콜로니를 형성할 수 있는 그의 능력에 대해 분석하였다. 디쉬당 10 mL의 배지-아가로스 현탁액 중 100만 내지 500만 개의 세포를 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 콜로니 형성에 대하여 플레이트를 모니터링하였다. 매 4-5일마다 추가의 배양 배지를 중층시켰다(overlay). 배양 11-14일 후, 콜로니를 열거하고, 콜로니를 사진 촬영하였다.
6.1.2.8
진핵성
발현 벡터로의 형질감염
MUC16c57 -114-pFUSE-hIgG1-Fc2 및 117- 244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 작제물을 따로따로, 융합 단백질을 발현하고, 무혈청 배지로 분비하는 인간 배아 신장 (HEK) 프리스타일(FreeStyle) 293F 세포 (인비트로겐: 미국 캘리포니아주)로 형질감염시켰다. pFUSE-hIgG1-Fc2 대조군 공 벡터, MUC16c57 -114-pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터, 및 LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터로 일시적으로 형질감염된 HEK 293F 세포로부터의 5 ㎍/레인의 융합 단백질 상청액을 이용하여 3개의 10% SDS-PAGE 겔을 전개시켰다. 한 겔은 제조사의 프로토콜에 따라 겔코드(Gelcode) 시약으로 직접 염색하였다. 2개의 겔로부터의 단백질을 2개의 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 우유-0.1% 트윈-20을 함유하는 포스파타제 완충처리된 염수 (PBST)로 차단하였다. 막을 진탕기 상에서 4℃에서 밤새도록 5% 무지방 우유 PBST 중 1:5,000 희석률로 항-인간 IgG1-Fc-HRP (γ1 쇄 특이적) (써던 바이오테크 인크.(Southern Biotech Inc.: 미국 캘리포니아주))로; 5% 무지방 우유 PBST 중 1:2,000 희석률로 4H11-HRP로 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 14 참조) 및 5% 무지방 우유 PBST 중 1:200 희석률로 항-인간 GAL3 mAb (산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology: 미국 캘리포니아주))로 프로빙하였다. GAL3-막을 PBST로 3회에 걸쳐 세척하고, 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 우유 PBST 중 1:3,000 희석률로 항-마우스 IgG-HRP 2차 항체로 표지하였다. 막을 PBST로 3회에 걸쳐 세척한 후, 이를 5분 동안 ECL 시약 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer: 미국 뉴욕주)) 화학발광 기질로 처리하고, X선 필름 상에서 조명 신호를 포착하였다.
6.1.2.9 침입
기저막 침입을 매트리겔 침입 챔버 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences: 미국 매사추세츠주 베드포드)에서 측정하였다. 매트리겔 이동을 삼중 웰에서 48시간째에 측정하고, phrGFP 벡터 대조군과 비교하고, phrGFP 대조군 매트리겔 침입에 대한 상대적인 비율(%)로서 표시하였다. 48시간 경과 후, 0.1 ㎍/mL의 투니카마이신(Tunicamycin) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트루이스), 카탈로그 번호 T7765) 또는 5 ㎍/mL의 MUC16c57 -c114-pFUSE-hIgG1- Fc2 또는 5 ㎍/mL의 117- 244LGALS3 pFUSE-hIgG1-Fc2 융합 단백질로 처리된 안정적인 세포주 매트리겔 이동을 측정하고, phrGFP 대조군 매트리겔 침입에 대한 상대적인 비율(%)로서 표시하였다.
BD 바이오코트™ 매트리겔™ 침입 인서트(BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Inserts) 또는 챔버즈(Chambers) (24 웰 플레이트 중 카탈로그 번호 354480) 및 대조군 인서트(Control Inserts) (24 웰 플레이트 중 카탈로그 번호 354578)를 BD 바이오사이언시스 (미국 매사추세츠주)로부터 구입하였다. 매트리겔 침입 검정법을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하면, (-20℃에서 보관된) 24 웰 플레이트 중 매트리겔 챔버 및 (4℃에서 보관된) 대조군 인서트의 온도가 실온이 되도록 하였다. 상기 두 인서트 모두 37℃ 5% CO2 습윤화된 인큐베이터에서 2 hr 동안 인서트에서 뿐만 아니라, 24 웰 플레이트의 외부 웰에서 0.5 mL의 무혈청 배지로 재수화시켰다. 배양된 3T3 또는 A2780 세포를 트립신으로 처리하고, 배양 배지로 세척하였다. 100만 개의 세포를 또 다른 원심분리기 튜브로 분리하고, 무혈청 배지로 3회에 걸쳐 세척하였다. 이들 세포를 후에 0.5 mL 무혈청 배지 중 10,000개의 세포가 되도록 조정하였다. 재수화된 인서트 중의 배지를 제거하고, 인서트를, 주화인자로서 작용하는, 웰 중의 0.75 mL의 10% 우태아 혈청 (FBS) 함유 배양 배지를 함유하는 새 24 웰 플레이트로 옮겼다. 즉시, 무혈청 배지 중의 0.5 mL의 세포 (10,000개의 세포)를 인서트에 첨가하였다. 인서트와 외부 웰에 기포가 포획되지 않았음을 알 수 있도록 적절히 조심히 처리하였다. 24 웰 플레이트를 37℃ 5% CO2 습윤화된 인큐베이터에서 48 hr 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 솜 면봉을 매트리겔 또는 대조군 인서트 내로 삽입하여 "스크러빙"하여 비침입 세포를 막의 상부 표면으로부터 제거하고, 막 표면 상에 면봉 팁을 이동시키는 동안, 온화하게 압력을 가하였다. 배지에 적신 제2 면봉을 이용하여 스크러빙을 반복하였다. 이어서, 인서트를 30분 동안 증류수 중 0.5 mL의 0.5% 크리스탈 바이올렛 염료를 함유하는 새 24 웰 플레이트 중에서 염색하였다. 염색 후, 인서트를 증류수가 있는 3개의 비이커에서 세정하여 과량의 염료를 제거하였다. 인서트를 새 24 웰 플레이트에서 대기 건조시켰다. 침입된 세포를 200X 배율로 도립 현미경하에서 수동으로 계수하였다. 삼중 막의 여러 시계를 계수하고, 도면에 기록하였다.
6.1.2.10 실시간 중합효소 연쇄 반응
리보퓨어 키트(RiboPure Kit) (앰비온(Ambion: 미국 텍사스주 오스틴))에 따라 RNA 단리물을 제조하였다. 앞서 기술된 바와 같이 RT2 프로파일러 PCR 어레이 시스템(RT2 Profiler PCR Array system) 슈퍼 어레이(Super Array: 미국 메릴랜드주 프레더릭))를 사용하여 전이 및 세포외기질 단백질 유전자 패널에 대한 RT PCR을 수행하였다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 29 참조).
6.1.2.11
무흉선
누드 마우스에서의 종양 성장
형질감염된 세포주 및 적절한 대조군 세포주를 무흉선 누드 마우스의 옆구리 또는 복막강 내로 도입하고, MSKCC 안티튜머 어세스먼트 코어 퍼실러티(MSKCC Antitumor Assessment Core Facility)에 의해 통상의 동물 관리를 제공받았다. 종양 성장 사정 실험을 위해, 각 종양 세포주으로부터 200만 개의 세포를 5-15마리의 무흉선 누드 마우스 각각에 이식하였다. 주 2회에 걸쳐 종양을 측정하고, MSKCC RARC 가이드라인에 따라 최대 크기가 1,500 ㎣가 될 때까지 종양 성장을 기록하였다.
6.1.2.12
웨스턴
블롯
분석
안정적인 세포주를 10 cm 디쉬 중 그의 각 배양 배지에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 빙냉 PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, 1-2 mL의 빙냉 PBS로 스크래핑하고, 원심분리하였다. 펠릿화된 세포를 얼음 상에서 30 min 동안 0.2 mL의 개질된 리파(Ripa) 용해 완충제 (20 mM 트리스-HCL, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 1 mM Na3VO4; 1 mM PMSF; 1 mM DTT; 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (카탈로그 번호 11836170001, 로슈 다이어그노스틱스 (미국 인디애나주)로부터 입수) 포함)로 용해시키고, 4℃에서 10 min 동안 원심분리하였다. 바이오-래드 프로테인 어세이(Bio-Rad Protein Assay (바이오래드 라보라토리즈(BioRaD Laboratories: 미국 캘리포니아주 허큘리스))를 사용하여 상청액의 단백질 농도를 측정하였다. 동량의 단백질을 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하고, 4℃에서 바이로래드 전달 장치를 사용하여 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 4℃에서 밤새도록 3% 우혈청 알부민 (BSA) 또는 0.1% 트윈-20을 포함하는 PBS (PBST) 중 5% 무지방 우유로 차단하였다. 막을 4℃에서 밤새도록 다양한 1차 항체 (셀 시그널링(Cell Signaling: 미국 매사추세츠주): Akt 카탈로그 번호 9272; 포스포-Akt (Ser473)(193H12) 카탈로그 번호 4058; p44/43 MAPK (Erk1/2) 카탈로그 번호 9102; 포스포-p44/43 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) 카탈로그 번호 9101); (시그마-알드리치, 인크.: 미국 미주리주 세인트루이스: β-액틴 카탈로그 번호 A5441); (써던 바이오테크(Southern BioTech: 미국 앨라바마 버밍햄: 항-인간-Fc-IgG1-HRP 카탈로그 번호 9054-05 및 압젠트(Abgent: 미국 캘리포니아주 샌디에고: 다중클론 LGALS3 항체 카탈로그 번호 AP11938b)로 발색시켰다. 막을 PBST로 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 1시간 동안 HRP 접합된 항-마우스 또는 항-토끼 항체 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare: 영국)) (1:5,000 희석률)로 발색시켰다. 이어서, 막을 PBS-T로 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 1-5분 동안 웨스턴 라이트닝 케미루미네선스(Western Lightning Chemiluminescence) 시약 (ECL, 퍼킨 엘머)으로 발색시키고, 신호를 하이블롯 CL(HyBlot CL) 필름 (덴빌 사이언티픽 인크.(Denville Scientific Inc.: 미국 뉴저지주 메터친)) 상에서 발생시켰다.
6.1.2.13
MUC16의
TCGA
발현 분석
TCGA 프로젝트의 일부로서 316개의 혈청 난소암 샘플에 대한 종합적인 게놈 데이터를 이용가능하였다 (tcga.cancer.gov). GISTIC를 사용하여 CBS-세그먼트화된 애질런트(Agilent) 1M 마이크로어레이로부터 유전자 수준의 DNA 카피수 콜을 도출해 내었다. 3종의 상이한 플랫폼 (애질런트 244K 호울 게놈 익스프레션 어레이(Agilent 244K Whole Genome Expression Array), 아피매트릭스(Affymetrix) HT-HG-U133A, 및 아피매트릭스 엑손(Affymetrix Exon) 1.0 어레이)을 사용하여 MUC16 mRNA 발현을 측정하고, 유전자 발현 값을 앞서 기술된 바와 같이 도출해 내었다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 30 참조). 전체 엑솜 포획에 이어진 차세대 서열분석 (SOLiD 또는 일루미나(Illumina))에 의해 MUC16 중에서 체세포 돌연변이가 확인되었다. 모든 TCGA 데이터를 c바이오 캔서 게노믹스 포털(cBio Cancer Genomics Portal) (www.cbioportal.org)로부터 다운로드받았다. 이어서, mRNA 발현 값을 상응하는 DNA 카피수 카테고리 (동형접합성 결실, 반접합성 결실, 이배체, 획득, 고수준의 증폭)와 상호 연관시키고, 체세포 돌연변이를 모든 샘플 간에 중첩시키고, 앞서 기술된 바와 같이 통계 프레임워크 R (www.R-project.org)을 이용하여 박스 플롯으로 플롯팅하였다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 31 참조). TCGA 데이터 포털 (tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)로부터 임상 데이터를 입수하였다.
6.1.2.14
MUC16
c354
트랜스제닉
마우스
벡터 phrGFP II-C (스트라타진: 미국 캘리포니아주 라호야)를 사용하여 조건부 카르복시-말단 354 아미노산 (MUC16c354) 트랜스제닉 작제물을 제조하고, CMV 프로모터를 벡터 pCAG-CreERT2 (애드진(Addgene: 미국 매사추세츠주 케임브리지)로부터의 CAG 프로모터로 대체하였다. PCR에 의해 인 BW(Yin BW) 등에 의해 제조된 작제물 B53으로부터 MUC16c354 단편을 증폭시켰다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 5 및 6 참조). MUC16c354 조건부 작제물은 하기 유니트: pCAG, 5' loxP, hrGFP, BGHpA, 3' loxP, MUC16c354, HA, 및 SV40pA를 함유한다.
상기 MUC16c354 조건부 트랜스제닉 작제물을 사용하여, MSKCC 마우스 제네틱스 코어 퍼실러티(MSKCC Mouse Genetics Core Facility)는 B6CBAF1/J 마우스에 대해 미량주사 시술을 수행하였다. 써던 블롯에 의해 99마리의 마우스로부터 12마리의 MUC16c354 조건부 트랜스제닉 마우스를 확인하였다. 12마리의 모든 전-시조(pro-founder)를 B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J 마우스 (더 잭슨 라보라토리(The Jackson Laboratory: 미국 메인주 바 하버))와 교배시켜 두 loxP 사이에 위치하는 hrGFP를 제거하였다. 각 전-시조에 대한 MUC16c354 PCR 양성 암컷 마우스를 해부하였다. 상기 해부된 마우스로부터의 기관 (뇌, 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 난소, 및 비장)을 민싱하고, 균질화시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 단백질 샘플을 분석하여 MUC16c354를 고도로 발현하는 시조를 확인하였다. 생성된 트랜스제닉 마우스를 혼합된 배경에서 유지시켰다.
2마리의 트랜스제닉 MUC16c354 마우스 시조를 p53 이형접합성 마우스 (B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) (더 잭슨 라보라토리: 미국 메인주 바 하버)와 교배시켜 이중 트랜스제닉 MUC16c354:p53+/-를 생성하였다. 생성된 트랜스제닉 마우스를 혼합된 배경에서 유지시켰다. 추출된 발가락 또는 꼬리 DNA를 사용하여 PCR에 의해 모든 마우스의 유전형을 분석하였다. MSKCC 동물 실험 윤리 위원회(MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee) 및 연구 동물 자원 센터(Research Animal Resource Center)에 의해 승인받은 가이드라인, 및 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 가이드(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 모든 실험 동물을 유지시켰다.
6.1.2.15 조직학적 분석
12개월된 마우스를 희생시키고, 부검하였다. 육안으로 검사한 후, 해부된 조직 샘플을 10% 중성 완충처리된 포르말린 중에서 24시간 동안 고정시킨 후, 알콜 및 크실렌 중에서 프로세싱하고, 파라핀 중에 포매시키고, 5 ㎛ 두께로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 동물 병리학자 (SM)에 의해 조직을 검사하고, 설치류 병리학 명명법상의 공개된 가이드라인에 따라 신생물성 및 비-신생물성 병변을 진단하였다.
6.1.2.16 통계학적 분석
스튜던츠 양측 쌍별 t 검정을 사용하여 시험관내 성장, 침입, 및 연질 아가 성장 잠재능에 관한 연구를 위해 군들을 비교하였다. 제공된 소프트웨어에 따라 (슈퍼어레이(SuperArray)) 카이 제곱 검정을 사용하여 RT-PCR 데이터를 유의도에 대하여 분석하였다. 각 동물에서 시간 경과에 따른 종양의 총 부피에 대한 사정에 관한 곡선하 면적을 사용하여 종양 부피를 비교하였다. 두 군 모두의 모든 동물이 살아있는 최종일을 기준으로 하여 종양 부피에 대하여 사정하였다. 비-파라미터 순위 검정 (윌콕슨(Wilcoxon) 2 샘플 검정)을 사용하여 군들 간의 분포차에 대하여 검정하였다. 동물 생존 연구에서, 시간 대 이벤트 분석을 수행하였으며, 여기서, 이벤트는 종양 부피가 1,500 ㎣를 초과하거나, 또는 궤양화가 일어날 때까지의 시간으로서 정의된다. 종양 부피가 1,500 ㎣ 미만인 동물은 최대 60일 동안 추적 검사를 받은 후, 검열을 받았다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 생존 분포를 추정하였다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 32 참조).
6.1.3 결과
MUC16 단백질의 탠덤 반복부 영역의 겉보기 절단 및 유리 이후, 상기 단백질의 카르복시-말단의 대략 114개의 아미노산 (c114)은 세포 표면 상에 그대로 남아있는 것으로 여겨지며, 상기 분자의 이 부분의 잠재적인 기능은 알려져 있지 않다. 3T3 섬유아세포 및 난소암 세포주에서의 악성 형질전환 및 거동에서 MUC16 단백질의 상기 가장 가까운 인접 부분의 역할을 분석하였다. 절단 부위에 인접한 잔류 c114 아미노산 요소의 효과를 시험하기 위해, 2개의 벡터: (1) MUC16c114-GFP 벡터, 및 (2) 말단절단된 MUC16c344-GFP 벡터 (도 1)를 디자인하였고, 상기 벡터 및 phrGFP 대조군 벡터를 독립적으로 3T3 섬유아세포 세포로 형질감염시켰다. MUC16c114- 및 MUC16c344-발현 세포주를 G418을 이용하여 선별하고, 유지시키고, MUC16 카르복시-말단의 독특한 아미노산 서열을 인식하는 단일클론 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 MUC16c114 및 MUC16c344 안정적인 발현을 확인하였다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 14 참조). MUC16 (서열 번호: 132) 단백질로부터의 344개의 아미노산을 발현하는 세포주 (MUC16c344-GFP 세포주)는, FACS 분석에 의하면 세포 표면 상에 OC125 항체에 의해 인식되는 고전적 CA125 에피토프를 보유하고, CA125는 세포 배양물 상청액으로 유리된다. OC125는 MUC16c114-GFP 세포를 인식하지 못한다. 그러나, 형질감염된 세포주는 모두, 추정 절단 부위에 인접해 있고, MUC16 엑토도메인-특이적인 4H11 항체에 의해 인식되는 MUC16c114 세포외 서열 (서열 번호: 133)에 대하여 세포 표면 양성을 띠었다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 14 참조; 도 1).
6.1.3.1 3T3 세포
MUC16의 절단 후의 잔류 요소가 부여하는 형질전환 특성을 조사하기 위해, 3T3 MUC16c114-GFP 및 3T3 MUC16c344-GFP 세포주의 특징을 분석하고, 상기의 두 최소 MUC16 요소의 효과를 벡터 대조군과 비교하였다. 모체 세포주의 것과 비교하였을 때, MUC16 서열의 가장 가까운 인접한 114개의 아미노산 (MUC16c114) 또는 인접한 344개의 아미노산 (MUC16c344)의 발현이 형질감염된 세포주 중 임의의 것에 대한 시험관내 성장률에 대해서도 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았다 (도 2a). 그러나, MUC16 단백질의 동일 요소의 발현이 연질 아가 클로닝에서 3T3 고정 의존성 성장을 실질적으로 변경시켰다. 최소 c114 단편 및 c344 단편, 둘 모두는 벡터만 포함하는 대조군과 비교하였을 때, 연질 아가 콜로니의 개수를 유의적으로 증가시켰다 (도 3a). 고전적 매트리겔 침입 검정법에서 MUC16 단백질의 인접부의 발현은 또한 phrGFP 벡터 대조군으로 형질감염된 3T3 세포와 비교하였을 때, MUC16 + 3T3 세포의 이동을 증진시켰다 (도 3b). 각종 MUC16 단백질 단편을 발현하는 3T3 세포를 선별된 전이 및 침입 유전자 전사체의 발현에 대하여 조사하였을 때, 케모카인 리간드 12 (CXCL12), 카드헤린 11 (CDH11), 및 기질 메탈로프로테이나제 MMP2 및 MMP9를 비롯한, 다중의 침입 유전자가 상향조절된 것으로 나타났다 (도 3c). 피브로넥틴 (FN1) 및 뉴로피브로민 (NF2)을 비롯한 다른 전사체는 일관되게 감소된다. MUC16은 생체내 종양 성장을 변경시키고, MUC16 단백질을 보유하는 세포의 침입성 특성을 증가시키는 바, MUC16은 MUC1 및 MUC4의 효과와 유사한 방식의 정규 신호전달 경로를 통해 작용하는 것일 수 있다. 앞서 ERK 및 AKT 경로의 상호작용이 난소암에서 중요한 신호전달 기전이고, 종양 세포 침입의 조절인자인 것으로 확인되었다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 21 및 22 참조). 도 3d에 제시된 바와 같이, pAKT (S473) 및 pERK (T202/Y204)의 증가에 의해 입증된 바와 같이, 두 경로 모두 활성화되었다.
종양원성 형질전환의 가장 명확한 홀마크는 면역결핍 마우스에서 성장을 촉진시킬 수 있는 능력이다. MUC16이 종양 성장률에 미치는 효과를 측정하기 위해, 옆구리 종양 모델을 사용하여 정칙 종양 측정을 용이하게 하였다. 도 3e에 제시된 바와 같이, MUC16 발현 3T3 세포주 (벡터 phrGFP, MUC16c114-GFP 및 MUC16c344-GFP)를 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 이식하였을 때, 4주째에 MUC16c114-GFP 및 MUC16c344-GFP, 둘 모두는 벡터만 포함하는 대조군과 비교하여 더욱 큰 종양을 형성하였다. MUC16c114-GFP 및 MUC16c344-GFP 단백질을 발현하는 세포주 사이에 통계학 차이는 없었으며 (도 3e), 이는 MUC16 발현의 종양원성 효과가 상기 분자의 가장 가까운 인접 부분과 연관이 있음을 제안한다. 이러한 종양 성장률 증가는 종양 성장 전 기간 동안에 걸쳐 관찰되었고, 이는 고수준의 MUC16 발현 (혈청 CA125로서)과 불량한 생존 사이의 임상적 연관성과 일치한다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 18 참조).
6.1.3.2 A2780 인간 난소암 세포
3T3 세포에서의 MUC16 단백질 발현이 형질전환 홀마크와 명확한 연관성을 가지고 있지만, 완전히 형질전환된 일부 난소암 세포주는 배양되었을 때, MUC16을 발현하지 않는다. 인간 난소암 세포의 거동에의 MUC16의 기여를 조사하기 위해, A2780 세포 (MUC16을 발현하지 않는 인간 난소 암종 세포주)를 MUC16c114-GFP 또는 MUC16c344-GFP로 형질감염시켰다. MUC16 발현 세포를 G418에 의해 선별하고, 그에 대하여 MUC16 및 GFP 발현에 대하여 FACS를 수행하였다. 상기 세포는 MUC16 발현 부재하에 연질 아가에서 잘 성장하는 바, MUC16c344 및 MUC16c114가 매트리겔 침입에 미치는 효과를 분석하였다. 도 4a에 제시된 바와 같이, MUC16c114 및 MUC16c344 발현은 A2780 세포에서 매트리겔 침입을 명백하게 촉진시켰다. 유사하게, MUC16c114 및 MUC16c344가 ERK 및 AKT 경로의 활성화에 미치는 효과는 pAKT(S473) 및 pERK (T202/Y204)의 기저 수준을 증가시키는 것으로, 3T3 세포에서 관찰되는 것과 유사하다 (도 4b). 따라서, 심지어 악성 난소 세포주에서도 MUC16 카르복시-말단 요소 발현의 증가는 증가된 침입 및 온코진 활성화와 연관이 있다. 추가로, MUC16c114- 및 MUC16c344-형질감염된 A2780 세포주의 생체내 종양 성장을 분석하였다 (도 4c). 두 환경 모두에서, MUC16c114 세포주 및 MUC16c344 세포주는 벡터만 포함하는 대조군보다 더욱 빠르게 성장하였다. 상기 인간 암 모델에서, 벡터 대조군은 최종적으로는 동물이 사망에 이르게 하는 데 충분한 속도로 성장하였다.
6.1.3.3
당화
연구
형질전환을 담당하는 MUC16c114의 특정 부분을 측정하기 위해, 2개의 추가 MUC16 단편을 구축하였다: (1) MUC16c114의 엑토도메인으로부터의 34개의 아미노산 서열 (원 공개 문헌에서 넘버링된 바와 같이, 위치 1798번부터 1831번까지)이 결실되어 있는 MUC16c80 (도 1D; 서열 번호: 135) (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 5 참조); 및 (2) MUC16c114 작제물은 MUC16의 전체 엑토도메인을 유지하였지만, 세포질 도메인의 추정 에즈린(Ezrin) 도메인으로부터의 28개의 아미노산 서열인, 잠재적 티로신 인산화 부위 및 SH2 도메인 (위치 1857번부터 1884번까지)이 제거된 MUC16c86 (도 1d; 서열 번호: 134). 상기 작제물을 3T3 세포 내로 도입하고, FACS에 의해 남은 MUC16c80 및 MUCc86 서열의 세포 표면 발현에 대하여 선별하였다. 이어서, 상기 2개의 추가 세포 집단을 MUC16c80 및 MUCc86 의존성 변이에 대하여 조사하였다. MUC16c86 작제물 (무손상 엑토도메인을 포함하는 작제물)은 MUC16c80 작제물 (무손상 세포질을 포함하는 작제물) 도메인보다 훨씬 더 큰, 연질 아가 콜로니 형성 능력을 보유하였다 (도 5a). 이는 또한 매트리겔 침입 능력의 경우에 대해서도 그러하였다 (도 5b). MUC16c80 발현 3T3 세포는 phrGFP 벡터 대조군의 것과 통계학상 차이가 없는 침입률을 보였다. 그에 반해, MUC16c86 발현 3T3 세포는 무손상 MUC16c114 및 MUC16c344 세포와 유사하게, 더욱 큰 침입성을 보이는 표현형을 보유하였다. AKT 및 ERK 경로의 활성화를 조사하였을 때, 결과는 연질 아가 콜로니 및 매트리겔 침입 연구와 일치하였다 (도 5c). (완전한 무손상 엑토도메인을 포함하지 않는) MUC16c80 단편의 발현은 ERK 및 AKT를 활성화시키지 못했고, 이는 phrGFP 벡터 대조군과 유사하였으며, 그에 반해, (무손상 엑토도메인을 포함하는) MUC16c86 발현 3T3 세포는 ERK 및 AKT 활성화에 있어 전체 MUC16c114 발현 3T3 세포와 유사하였다. 마지막으로, 이종이식편 종양 모델에서 무손상 엑토도메인의 중요성을 확인하였다.
MUC16c114 대조군과 비교하였을 때, 무손상 MUC16 엑토도메인 (3T3 MUC16c80)의 손실은 MUC16c114 의존성 3T3 성장 증진을 손실시키는 반면, MUC16c86 발현 3T3 세포는 보통의 성장 지연을 보였지만, 전반적인 효과는 MUC16c114 발현 3T3 세포와 유사하였다 (도 5d). 따라서, MUC16c114 단편의 세포외 부분이 3T3 세포에서 MUC16의 형질전환 효과를 담당하는 것이었다. MUC16c114의 세포외 단편의 역할을 추가로 조사하기 위해, MUC16 표적화 항체로 이루어진 패널을 사용하여 MUC16c114 발현 3T3 세포를 이용함으로써 공침전 연구를 수행하였다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 14 참조). 은 염색에 의해서는 어떤 공침전 단일 밴드도 확인되지 않았고, EGFR, 인테그린 및 HER3에 대한 특이적인 웨스턴 블롯은 음성이었다. 그러나, MUC16c114 서열 분석은 엑토도메인 중 3개의 잠재적 N-당화 부위 (Asn1777, Asn1800, 및 Asn1806 (도 6, 서열 번호: 132 및 서열 번호: 133))가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안하였다. 상기 N-당화 부위의 역할을 분석하였다. 부위 특이적 점 돌연변이를 사용하여, 3개의 아스파라긴 모두를 알라닌으로 변이시켰다. MUC16c114 -N123으로 지정된, 상기의 변형된 MUC16c114 작제물을 3T3 세포로 도입하고, MUC16c114 -N123 발현 세포를 FACS 및 4H11 엑토도메인 항체에 의해 단리시켰다. 도 7a에 제시된 바와 같이, 이러한 아스파라긴의 알라닌으로의 돌연변이가 3T3 세포에서의 모체 MUC16c114 발현 벡터를 통해 관찰된 MUC16c114 유도성 매트리겔 침입 증진을 완전히 폐기시켰다. N-당화의 역할을 확인하기 위해, 3T3 세포를 당화 억제제인 투니카마이신 (0.1 ㎍/mL)으로 처리하였고, 매트리겔 침입이 유의적으로 감소된 것이 관찰되었다. MUC16c114 세포외 서열의 역할을 추가로 조사하기 위해 두 합성 단백질 억제제 또한 시험하였다. MUC16 외부 서열 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 5에서 넘버링된 바와 같이 위치 1777부터 1834까지)을 인간 Fc 골격 pFUSE에 부착시켜 (MUC16c57 -c114 pFUSE) "더미" 수용체를 제공하였다. 상기 작제물을 MUC16c114 침입 및 pFUSE 벡터 대조군, 둘 모두와 비교하였다. 도 7b에 제시된 바와 같이, "더미" 수용체 작제물은 MUC16c114 발현 벡터가 매트리겔 침입에 미치는 전반적인 효과를 감소시켰다 (도 7). 렉틴이 당화된 MUC16c114 단백질의 효과와 연관이 있다는 가정하에, 동일한 pFUSE 골격에 부착된 LGALS3의 당 결합 도메인 (아미노산 117 내지 244; 도 7 및 도 8) (117- 244LGALS3pFUSE)으로부터 제2 억제제를 구축하였다. 투니카마이신과 유사하게, 상기 단백질 억제제, 둘 모두 MUC16c114와 다른 세포 표면 단백질의 상호작용을 간섭한 반면, pFUSE 벡터 단독은 어떤 효과도 없었다 (도 7b). 다른 개입과 같이, 도 7c에 제시된 것처럼, N-당화 부위가 제거되었을 때에는 매트리겔 침입 손실과 병행하여 pAKT 발현 및 pERK에 미치는 효과는 감소되었다. 그러나, MUC16c114 -N123 작제물은 4H11 (MUC16 엑토도메인 특이적) 결합에 의해 입증된 바와 같이, 고수준의 MUC16c114 -N123 단백질 발현을 보였다. 도 7d에 제시된 바와 같이, 유사하게, nu/nu 마우스에서 N-당화 손실이 미치는 영향으로 형질감염된 3T3 세포 성장이 감소된 것이 확인되었다.
6.1.3.4
트랜스제닉
마우스
트랜스제닉 마우스에서의 카르복시-말단 MUC16 요소 발현 및 자발적 종양 형성률이 미치는 효과를 조사하였다. MUC16c354 (전장의 c114 서열 및 탠덤 반복부를 보유하는 가장 가까운 인접한 CA125)를 발현하는 조건부 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. CMV 조기 인핸서 + 닭 β 액틴 프로모터 (CAG)를 사용하여 모든 뮤린 조직에서의 실질적인 MUC16c354 발현이 이루어질 수 있도록 하였다. 인간 난소의 생리는 뮤린 생식계와 매우 상이하고, 조직 특이적 난소 프로모터는 약하고, 트랜스제닉 시스템에서 사용하기가 비교적 어렵기 때문에 상기 전략법을 선택하였다. 상기 마우스에 대한 전략법은 도 9a에 제시되어 있다.
도 9b에 제시된 바와 같이, 조건부 트랜스제닉 동물을 써던 블롯에 의해 선별하고, EIIa-Cre 마우스와 교배하여 MUC16c354 트랜스제닉 시조를 생산하였다. 도 9c에 제시된 바와 같이, 2마리의 시조를 선택하고, MUC16c354 트랜스제닉 마우스의 콜로니를 생성하였다. 2마리의 시조는 다수의 기관, 예컨대, 뇌, 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 난소, 및 비장에서 MUC16c354를 고도로 발현시킨다. 상기 마우스는 MUC16c354의 광범위한 이소성 발현으로부터 어떤 영향도 받지 않으며, 정상적인 수컷:암컷 자손 비율, 정상적인 번식률 및 2년을 초과하는, 겉보기상 정상적인 수명을 나타낸다. 대조군 집단으로부터의 겉보기상 건강해보이는 2마리의 동물 (수컷 1마리 및 암컷 1마리) 및 MUC16c354 트랜스제닉 마우스를 최대 1년까지 3개월 간격으로 부검한 결과, 나이든 암컷에서 경미한/중간 정도의 자궁 내막 증식증만이 두드러지게 나타났고, 발병률 및 중증도에 있어서는 야생형 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 선택된 조직이 도 10에 제시되어 있다. 2년 이상 관찰된 100마리 초과의 동물의 콜로니에서 단 하나의 자발적 연조직 종양 (육종)이 관찰되었다.
상기 결과에 기초하여, "두 번째 히트"가 잠재적으로 요구될 것이라는 가설이 제기되었다. BRCA1 돌연변이의 뮤린 모델 또한 두 번째 히트를 필요로 하고, p53 손실이 종양 빈도를 유의적으로 증가시켰다는 것이 주목할만 하다. MUC16c354 마우스를 잭슨 라보라토리로부터의 p53+/- 마우스와 교배시켰다. 제한된 조기 효과를 보였다. 그러나, 대략 6개월 경과 후, p53+/- MUC16c354 마우스에서는 정상적인 대조군 동물보다 더 높은 비율로 연조직의 자발적인 육종성 종양 및 림프종이 발생하기 시작하였다. 선택된 종양은 도 9d의 패널 인세트에 제시되어 있다. 상기 마우스에 대한 카플란-마이어 생존율은 도 9e에 제시되어 있다. MUC16c354:p53+/- 마우스는 자발적 종양에 기인하여 유의적으로 악화된 전체 생존율을 보였다 (p<0.014). 각 군에서 관찰된 종양의 총 개수는 하기와 같았다: p53 +/- 마우스, 20개/107마리의 마우스; MUC16c354 및 p53 +/- 마우스, 34개/91마리의 마우스; MUC16c354 마우스, 1개/72마리의 마우스; 야생형 마우스, 0개/91마리의 마우스. 수집된 8개의 종양을 p53 게놈 서열분석에 대하여 조사하였을 때, 자발적 종양은 모두 p53의 정상적인 대립유전자의 손실을 보였는데, 이는 MUC16 의존성 종양 발생 또한 정상적인 p53 기능 손실을 필요로 한다는 것을 시사하는 것이다.
6.1.3.5 난소
TCGA
실험 모델에서의 형질전환 및 종양 공격성에 관한 MUC16 단편에 대한 것에 기초하여, MUC16의 유전적 변경과 난소암에서의 결과 사이의 연관성을 조사하였다. TCGA 난소암 프로젝트는 임상 결과 데이터를 비롯한, 완전한 데이터와 함께 316건의 혈청 난소암을 포함하는 잘 연구된 컬렉션이다. MUC16 단백질의 발현이 암 거동의 중요한 구동자인 바, MUC16 카피수가 MUC16 mRNA 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 비록 연구된 모든 군에서 (단, MUC16의 드문 동형접합성 결실은 예외) MUC16 전사체 발현에서 광범위한 변이가 존재하기는 하였지만, MUC16 전사체 발현은 일반적으로 MUC16 유전자 카피수와 관련이 있었다. 대부분의 경우에서, MUC16 mRNA 발현은 대조군으로서 포함된 정상적인 나팔관 샘플보다 더 많은 전사체 개수로 클러스터링되었다. 유전자 카피수는 MUC16 단백질의 발현을 잠재적으로 변경시킬 수 있는 수개의 변수들 중 하나이지만, 대개는 MUC16 mRNA 발현 (및 물론 MUC16 단백질)이 혈청 난소암에 증가되어 있다는 것은 명백하다. MUC16 과다발현 또는 돌연변이가 TCGA 데이터 세트 중의 임상 결과에 미치는 조합 영향 또한 조사하였다. TCGA 데이터 세트를 MUC16 발현 5분위 수로 나누었을 때, 최고의 MUC16 발현을 보인 20%의 환자가 더 낮은 MUC16 발현을 보인 환자보다 유의적으로 더 악화된 생존율을 보였다 (p=0.02969). 도 11a에 제시된 바와 같이, MUC16 돌연변이를 가지는 18명의 환자를 MUC16 고발현군에 포함시켰을 때, 상기 관계는 추가로 강력해졌다 (p=0.02117). 종합해보면, 본 분석을 통해 MUC16 발현이 난소암 환자의 생존에 유해한 영향을 미친다는 것이 입증되고, 본 발명자들의 임상전 모델에서 확인된 MUC16 발현의 생물학상 부정적인 영향이 확인된다.
난소암은 대개 PI3K 경로의 활성화를 나타낸다. 난소암은 일반적으로는 카피수 변경을 특징으로 하는 바, 상기 활성화는 점 돌연변이화보다는 대개 증폭 및 과다발현을 통해 발생한다. 본 발명자들의 세포주 모델에서의 PI3K/AKT 경로의 활성화에 기초하여, PI3K 경로에서의 다른 활성화 유전적 변경과 MUC16 사이의 관계를 조사하였다. 도 11b에 제시된 바와 같이, MUC16과 연관된 과다발현 및 돌연변이 이벤트는 일반적으로 다른 경로 이벤트, 예컨대, PTEN 손실, AKT1, AKT2, 또는 PI3KCA의 증폭과 상보적이다. MUC16 유도성 AKT 활성화 기전은 여전히 미공지 상태이다. 추가로, ERK 활성화의 역할을 조사하였지만, MUC16 돌연변이와 ERK 경로 사이에는 어떤 연관성도 확인되지 않았다.
6.1.4 논의
CA125 항원을 코딩하는 MUC16은 다수의 난소암 환자의 혈장 중에서 순환한다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 1 참조). MUC16은 그의 발현이 뮐러 조직 외부에서는 제한이 되는 바, 테더링된 뮤신 중에서 독특한 것이다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 2 및 14 참조). 종양 벌크의 비의존성이 유해한 예후 인자로서 점점 더 간주되고 있지만, 그의 부정적인 영향에 대한 생물학적 기전은 잘 이해되고 있지 않다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 18 참조). 분자의 NH2-일부분이, CA125 항원을 코딩하고, 메소텔린 및 일부 갈렉틴에 대한 중요한 부착 파트너로서의 역할을 하는 것으로 보이는 다중 탠덤 반복부를 함유한다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 5, 17, 및 24-26 참조). 이러한 부착 작용이 MUC16과 관련된 유해 결과에서 중요한 것으로 제안되고 있지만, 이러한 연구가 난소암 세포 거동에서 관찰되는 모든 변화를 설명하지는 못하고 있다. MUC16 당단백질의 클로닝이 MUC16 유전자 생성물에 대한 기본 구조적 정보를 제공하여 왔다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 4 및 5 참조). 본 실시예에서 제공하는 데이터가, MUC16이 상기 환경으로부터 암 세포로의 신호전달을 매개할 수 있다는 것을 시사하는 최초의 데이터이고, 특히, 본 실시예에서 제공하는 데이터를 통해, 당화된 MUC16 엑토도메인이 암 세포 거동에서 MUC16 변경에 중요한 것으로 확인된다.
본 실시예는 MUC16의 카르복시-말단으로부터의 114개의 아미노산이 NIH/3T3 (3T3)을 형질전환시키는 데 충분하다는 것을 입증하며, 이는 연질 아가 성장 증가 및 매트리겔 침입 성장, 둘 모두를 뒷받침한다. 다른 발명자들을 통해서는 MUC16의 막에 가장 가까운 인접한 C-말단부가 MUC16 유동성 거동에서 중요한 요소인 것으로 확인되었지만, 본 발명자들은 이들 거동을 보유 MUC16 엑토도메인 중의 N-당화 부위에 연관시킨다. 이러한 변화는 변경된 유전자 발현 프로파일 및 중요한 침입 유전자, 예컨대, MMP2, MMP9, CXCL12, 및 CDH11의 발현 증가와 연관이 있다. 더욱 긴 장쇄인 요소가 병독성이 더욱 큰 거동을 유도할 수 있지만, 심지어는 추정 절단 부위에 인접한 잔류 114개의 아미노산도 3T3 세포에서 동일한 침입 유전자 발현 변화를 유도하는 데에는 충분하다. 또한, (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn1806에 상응하는) MUC16c114의 Asn30의 당화가 MUC16c114 종양원성 특성을 위해서는 필수적이었다. 어느 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 상기 관찰 결과는 막관통 도메인 및 세포질 테일과 함께 잔류 세포외 도메인을 포함하는, 상기 단백질의 가장 가까운 인접한 일부에 의한 "아웃사이드 인(outside in)" 신호전달과 일치한다. 테리올트(Theriault) (문헌 [Therialt et al. Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-443]) 및 지안나쿠로스(Giannakouros) (문헌 [Giannakouros et al. Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91-98])의 결과와 달리, 세포내 세포질 도메인 손실이 당화된 엑토도메인 손실보다 영향력이 더 작았다. 이러한 차이는 선택된 특이적인 돌연변이 및 발현을 감소시키는 방법을 반영할 수 있다. "인사이드-아웃(inside-out)" 신호는, 연질 아가 및 누드 마우스에서 MUC16 발현 세포의 이식 및 성장을 촉진시키는 유전자 프로그램의 전사를 활성화시키는 것으로 보인다. 형질감염된 세포를 일반 종양원성 경로의 활성화에 대하여 조사하였을 때, AKT 및 ERK 경로, 둘 모두 MUC16의 구성적 발현에 의해 활성화되는 것으로 보인다. MUC16이 AKT/ERK 인산화를 증가시키는 기전은 불명확하며, 이는 추가의 연구를 필요로 할 것이다. 공침전하는 수용체의 부재는 다른 기전도 또한 포함되어 있을 수 있다는 것을 제안한다. 비록 MUC16 서열이 매우 다르긴 하지만, MUC1 및 MUC4, 둘 모두를 비롯한, 다른 테더링된 뮤신도 3T3 세포 및 래트 섬유아세포에서 신호를 생성하는 온코진으로서의 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 8 및 9 참조). 암 세포 표면 상에서의 뮤신의 역할이 여전히 정의되고 있는 중인 기전을 통해 중요한 역할을 할 가능성이 있다.
3T3 세포에서의 관찰 결과에 기초하면, MUC16 트랜스제닉 마우스 실험의 결과는 매우 큰 신빙성을 더해 주는 것이 된다. 단독으로, 동일의 MUC16 인접한 354개 서열은 트랜스제닉 마우스에서 어떤 유해 효과도 없이 거의 모든 뮤린 조직에서 쉽게 발현될 수 있다. 자발적 종양 형성률은 상기 마우스에서 매우 낮았고, 생식 기능은 영향을 받지 않는 것으로 보였다. 그러나, 다른 뮤린 난소암 모델과 같이, p53 기능 손실은 MUC16 의존성 종양 형성에서 강력하게 관대한 역할을 하는 것으로 보인다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 27 참조). 이러한 결과는 분명히, TCGA 데이터 세트에서 난소암을 특징화하는 p53 불활성화와 일치한다.
이러한 관찰 결과는 세포 거동 및 유전자 전사에서의 MUC16과 연관된 변화를 기술한다. 시험관내 및 생체내 모델은 혈청 난소암에서의 MUC16 발현 수준의 유해 효과와 일치하며, 이는 MUC16을 난소암 거동에의 병원성 기여인자로서 이해하는 것을 증진시킨다. CA125 발현 증가가 미치는 유해한 영향은 생체내 종양 성장 증가 및 MUC16 (+) 3T3 형질감염체의 치사율 증가와 일치한다 (하기 섹션 6.1.5에서 언급된 참고 문헌 18 참조).
6.1.5
실시예
1에서 인용된 참고 문헌
6.2
실시예
2:
MUC16
당화
항체
6.2.1 도입
OC125 항체에 의해 인식되는 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 1 참조) CA125 항원은 MUC16 당단백질의 세포외 일부로부터 탠덤 반복부 도메인으로 발현되는 대량으로 당화된 항원이다 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 2 및 3 참조). 이러한 순환 항원은 주로 양성 또는 악성 뮐러 조직으로부터 유래되고, 인간 난소암에 대한 종양 마커로서 FDA의 승인을 받은 것이지만, 발암에서의 그의 기능 및 역할에 대해서는 알려져 있지 않다 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 4-6 참조). MUC16은 복합 테더링된 뮤신 패밀리에 속하고, 이는 큰, 대량으로 당화된 당화된 세포외 도메인, 막과 추정 절단 부위 사이의 작은 엑토도메인, 소수성 막관통 영역, 및 짧은 세포내 테일로 구성된다 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 7 및 8 참조). 대부분의 MUC16 단백질은 절단 후에 주변 공간으로 방출되고, 엑토도메인은 세포 표면 상에 그대로 남아있다. OC125 및 다른 MUC16 반응성 단일클론 항체 (mAb) 대부분은 오로지 분자의 절단부에만 존재하는 탠덤 반복부 영역에서 항원과 반응한다. 이들 에피토프는 순환 중에서 발견될 가능성이 있는 바, 현존하는 mAb는 남아있는 MUC16 단백질 단편의 운명을 추적하는 데에는 사용될 수 있고, MUC16 발현의 실제 분포를 정확하게 반영할 수는 없다 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 9 참조). 당화 표면 단백질은 예컨대, EGFR, PDGFR 등과 같은 티로신 키나제 수용체의 N-당화 부위와의 상호작용에 기초하여 갈렉틴 3을 통해 세포 증식 및 분화를 조절할 수 있다는 것이 다른 발명자들에 의해서 밝혀졌다 (문헌 [KS Lau Cell 129:123, 2007]). 실시예 1 (섹션 6.1 참조)에서 입증된 바와 같이, MUC16의 인접부 (최소 114개의 아미노산)는 무한증식 3T3 세포를 형질전환시킬 수 있고, 이러한 효과는 투니카마이신에 의해 방해를 받는 것으로 보인다.
본 실시예는 MUC16 의존성 형질전환에서 이러한 효과 및 갈렉틴 3의 필수적인 역할을 매개하는 정확한 당화 부위를 입증한다. 따라서, 중요한 MUC16 매개 암 기능, 예컨대, 부착 및 침입을 억제시키기 위하여 당화 특이적 방식으로 인접한 펩티드 서열 (예컨대, MUC16c114)에 결합할 수 있는 항체를 개발하였다. 중요한 에피토프 모방체로서 정의된 합성 N-당펩티드 항원을 사용함으로써 MUC16 엑토도메인 내의 중요한 N-당화 부위에 대한 단일클론 항체를 생성하였다. 이들 항체는, 어떤 영향도 미치지 않았던, 다른 비당화된 단백질에 대한 mAb와 달리, MUC16 유도성 매트리겔 침입, 온코진 활성화 및 종양 성장을 억제시킴으로써 MUC16의 종양원성 생물학적 성질을 억제시켰다. 이들 항체는 뮤신 형질전환에 대한 기전을 입증하였고, MUC16 양성 종양에서의 진단학적 및 치료학적 사용에서 유용한 도구를 제공한다.
6.2.2 물질 및 방법
6.2.2.1
당펩티드
합성
MUC16c55 (서열 번호: 129, 도 13)의 Asn30 상에 잘 정의된 키토비오스 (GlcNAc2)를 도입하고 있는 중요한 에피토프 모방체로서 합성 당펩티드를 사용함으로써 MUC16의 55개의 아미노산 서열 (MUC16c55: NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNS (서열 번호: 129)의 세 번째 당화 부위 (Asn30, MUC16의 Asn1806과 유사)에 특이적인 항체를 생성하였다. 동종 N-당펩티드의 합성은 고도의 수렴성을 띠었고, 랜스베리(Lansbury) 아스파르틸화 조건하에서의 부분적으로 보호된 전장의 펩티드 (MUC16c55; 서열 번호: 129)와 키토비오스 아민 사이의 커플링을 포함하였다 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 11 참조). 마이크로 웨이브 지원, Fmoc 고체상 펩티드 합성 (SPPS), 이어서, 수지상 N-아세틸화 (Ac2O, DIEA), Asp30 (Pd(PPh3)4, PhSiH3)의 탈알릴화, 및 이어서, 수지 절단 (1-2% TFA/CH2Cl2)에 의해 MUC16c55 (서열 번호: 129)을 수득하였다. (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 12에 기술된 바와 같이) 한 플라스크에서의 아스파르틸화/탈보호화 방법을 사용하여, 위치 Asn30에서의 유리 카르복실산 측쇄를 키토비오스 아민 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 13 참조)과 커플링한 후, TFA-처리 (칵테일 R: 90% TFA, 5% 티오아니솔, 3% 에탄디티올, 2% 아니솔)를 수행하여 당펩티드 GlcNAc2-55-mer를 제공하였다. 슈도프롤린 모티프의 존재는 아스파르틸화 동안 원치않는 아스파르티미드 형성을 경감시키는 역할을 하였다.
추가로, 유사한 한 플라스크에서의 순서로 Man3GlcNAc2 함유 펩티드를 제조하였다.
MUC16c55 (서열 번호: 129)의 Asn30 및 Asn24 (각각 MUC16의 Asn1800 및 Asn1806과 유사)를 포함하는 더 짧은 단쇄의 당펩티드: (1) 18-mer: CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호: 130), 및 (2) 15-mer: CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호: 131)를 제조하였다. 18-mer 및 15-mer 당펩티드를 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 접합시켰다. 15-mer (서열 번호: 131)은 Asn7 (MUC16의 Asn1806과 유사)에 키토비오스를 도입하였다. 55mer 당펩티드의 합성과 유사한 방식으로 15-mer 당펩티드를 합성하였다.
18-mer (서열 번호: 130)은 Asn4 및 Asn10 (각각 MUC16의 Asn1800 및 Asn1806과 유사)에 키토비오스를 도입하였다. 18-mer의 Asn4 및 Asn10 (각각 MUC16의 Asn1800 및 Asn1806과 유사)의 알릴 보호를 통해 상당한 아스파르티미드 형성이 이루어졌다. 따라서, SPPS에서 더 많이 방해를 받은 O-2-페닐이소프로필 에스테르 (O-2-PhiPr, OPp)를 사용하여 N-아세틸화, 및 동시의 수지 절단/OPp 제거 (1-2% TFA/CH2Cl2) 후, 18-mer의 유리 Asn4 및 Asn10 측쇄 (각각 MUC16의 Asn1800 및 Asn1806과 유사)와 함께 부분적으로 보호된 펩티드를 제공하였다. 이중 랜스베리 아스파르틸화를 통한 고도의 수렴성을 띠는 2개의 키토비오스 유니트 설치, 이어서, 전역 산성 탈보호화를 수행하여 이중당화된 18-mer 펩티드 (HPLC 정제 후 27%)를 생성하였다.
18-mer 및 15-mer 당펩티드의 N-말단 시스테인 잔기와 말레이미드-유도체화된 캐리어 단백질의 최종 커플링을 통해 마우스 백신 접종을 위해 KLH-접합된 작제물을 제공하였다.
6.2.2.2 마우스 면역화 프로토콜.
5마리의 BALB/c 및 5마리의 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스를 25 ㎕의 타이터맥스(Titermax) 애주번트의 존재하에서 매 3주마다 3회에 걸쳐 55-mer 당펩티드 (섹션 6.2.2.1 참조)로 면역화하여 마우스를 면역화시켰다. 3주 후, 마우스를 단일당화된 15-mer (서열 번호: 131) 및 이중당화된 18-mer (서열 번호: 130) KLH-접합된 작제물의 혼합물로 면역화시켰다. 55-mer GlcNAc2-당화된 당펩티드, 및 KLH에 비-접합된 더 짧은 단쇄의 당펩티드에 대한 반응성에 대하여 혈청을 분석하였다. 2개의 MUC16 비관련 키토비오스 함유 펩티드와 함께, 비당화된 55-mer, 15-mer 및 18-mer 펩티드를 스크리닝을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 마우스를 매 3주마다 2회 더 15-mer 및 18-mer KLH-접합체로 추가로 면역화시키고, 각 면역화 후에 ELISA에 의해 반응을 분석하였다.
6.2.2.3 침입
섹션 6.1.2.9를 참조한다. shRNA 실험을 위해, BD 바이오코트™ 매트리겔™ 침입 인서트 또는 챔버즈 (24 웰 플레이트 중 카탈로그 번호 354480) 및 대조군 인서트(Control Inserts) (24 웰 플레이트 중 카탈로그 번호 354578)를 BD 바이오사이언시스 (미국 매사추세츠주)로부터 구입하였다. 매트리겔 침입 검정법을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하면, (-20℃에서 보관된) 24 웰 플레이트 중 매트리겔 챔버 및 (4℃에서 보관된) 대조군 인서트의 온도가 실온이 되도록 하였다. 상기 두 인서트 모두 37℃ 5% CO2 습윤화된 인큐베이터에서 2 hr 동안 인서트에서 뿐만 아니라, 24 웰 플레이트의 외부 웰에서 0.5 mL의 무혈청 배지로 재수화시켰다. 배양된 SKOV3 세포를 트립신으로 처리하고, 배양 배지로 세척하였다. 100만 개의 세포를 또 다른 원심분리기 튜브로 분리하고, 무혈청 배지로 3회에 걸쳐 세척하였다. 이들 세포를 후에 0.5 mL 무혈청 배지 중 5,000개의 세포가 되도록 조정하였다. 재수화된 인서트 중의 배지를 제거하고, 인서트를, 주화인자로서 작용하는, 웰 중의 0.75 mL의 10% 우태아 혈청 (FBS) 함유 배양 배지를 함유하는 새 24 웰 플레이트로 옮겼다. 즉시, 무혈청 배지 중의 0.5 mL의 세포 (5,000개의 세포)를 인서트에 첨가하였다. 인서트와 외부 웰에 기포가 포획되지 않았음을 알 수 있도록 적절히 조심히 처리하였다. 24 웰 플레이트를 37℃ 5% CO2 습윤화된 인큐베이터에서 48 hr 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 솜 면봉을 매트리겔 또는 대조군 인서트 내로 삽입하여 "스크러빙"하여 비침입 세포를 막의 상부 표면으로부터 제거하고, 막 표면 상에 면봉 팁을 이동시키는 동안, 온화하게 압력을 가하였다. 배지에 적신 제2 면봉을 이용하여 스크러빙을 반복하였다. 이어서, 인서트를 30분 동안 증류수 중 0.5 mL의 0.5% 크리스탈 바이올렛 염료를 함유하는 새 24 웰 플레이트 중에서 염색하였다. 염색 후, 인서트를 증류수가 있는 3개의 비이커에서 세정하여 과량의 염료를 제거하였다. 인서트를 새 24 웰 플레이트에서 대기 건조시켰다. 침입된 세포를 200X 배율로 도립 현미경하에서 수동으로 계수하였다. 삼중 막의 여러 시계를 계수하고, 도면에 기록하였다.
6.2.2.4
무흉선
누드 마우스에서의 종양 성장
섹션 6.1.2.11을 참조한다.
6.2.2.5
비오티닐화된
당펩티드의
결합 검정법
포레바이오 옥테트 QK(ForeBio Octet QK)를 사용하여 결합 친화도를 측정하였다. 5 ㎍/mL의 비오티닐화된 키토비오스-접합된 18-mer 당펩티드를 스트렙트아비딘 바이오센서 상에 로딩하였다. 과량의 항원을 세척해 낸 후, 마우스 항체를 10 ㎍/mL에서 각각 회합 및 해리 단계에 대해 시험하였다. 1:1 결합 부위 모델, 부분 피트를 사용하여 결합 파라미터를 산출하였다.
6.2.2.6 조직
마이크로어레이의
면역조직화학법
소위 기증자 블록이라 불리는 것으로부터 기존 파라핀 포매된 조직의 중심부 바늘 생검을 입수한 후, 코노넨(Kononen) 등 (문헌 [Kononen J, et al. Nat Med 1998;4(7):8447] 참조)에 의한 기법을 사용하여 수혜자 파라핀 어레이된 "마스터" 블록으로 재배치한 후, 이어서, 헤드배트(Hedvat) 등 (문헌 [Hedvat CV et al. Hum Pathol 2002;33(10):968-74] 참조)에 의해 변형시켰다. 비처 인스트루먼츠 인크.(Beecher Instruments Inc.: 미국 위스콘신주 선 프레리)로부터의 수동식 조작형 티슈 어레이어 MTA-1(Tissue Arrayer MTA-1)을 사용하여 직경이 0.6 내지 1.0 mm로 측정된 샘플 둥근 스폿 (코어)을 제조하였다. 주변 효과를 피하기 위해, 전략적으로 대조군 조직으로 이루어진 층을 실제 조직 마이크로어레이 주변에 적층시켰다. 각 조직 마이크로어레이의 구체적인 조성은 하기에서 상세히 기술한다. 포르말린 고정된 파라핀 포매된 조직으로부터 4 um 절편을 절단함으로써 난소암 또는 대조군 조직에 대한 조직 마이크로어레이의 슬라이드를 제조하였다.
조직 마이크로어레이 표준 OC125 (벤타나(Ventana: 미국 애리조나주 투스콘)), 4H11 (문헌 [Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72] 참조) 및 19C11 단일클론 항체에 대해 면역조직화학법을 수행하였다. 조직 마이크로어레이의 절편을 4 ㎛로 절단하고, 슈퍼프로스트/플러스(Superfrost/Plus) 현미경 슬라이드 (피셔((Fisher) 브랜드) 상에 놓고, 60℃ 오븐에서 적어도 60분 동안 베이킹하였다. 이어서, 슬라이드에서 파라핀을 제거하고, 증류수에 수화시키고, 97℃에서 30분 동안 시트레이트 완충제 (pH 6.00) 중에 적시키고, 2-5분 동안 흐르는 물에서 세척하고, 증류수 중에 희석된 3% 과산화수소 중에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 1분 동안 증류수 중에서 세척하고, 2회에 걸쳐 교체하기 위해 각각 5분씩 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) (pH 7.2)의 배쓰로 옮기고, 최소 1분 동안 PBS 중에 희석된 0.05% BSA 중에 놓았다. 조직 절편 주변을 건조시킨 후, 정상 혈청을 2% BSA/PBS 중에 1:20 희석률로 적용시키고, 항습 챔버 중 실온에서 최소 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 절편을 건조시키지 않으면서, 혈청을 흡출하여 제거하고, 1:1,000 희석률의, 대략 150 람다의 새 항체를 조직 상에 놓았다. 슬라이드를 항습 챔버 중 4℃에서 밤새도록 (대략 15-18시간) 인큐베이션시켰다. 각각 10분씩 3회에 걸쳐 교체하면서 PBS를 사용하여 1차 항체를 세척하였다. 2차 항체, 벡터 라보라토리즈(Vector laboratories: 미국 캘리포니아주 벌링게임)로부터의 비오티닐화된 α-마우스를 1% BSA/PBS 중에 1:500 희석률로 적용시키고, 항습 챔버 중 실온에서 45-60분 동안 인큐베이션시켰다. 항체를 상기와 같이 3회에 걸쳐 교체하면서 PBS를 사용하여 다시 세척하였다. 이어서, 5-15분 동안 PBS 중에서 희석된 디아미노벤지딘 (DAB)의 배쓸로 슬라이드를 옮겨 놓았다. 이어서, 슬라이드를 수돗물에서 1분 동안 세척하고, 해리스(Harris) 개질된 헤마톡실린 (피셔)을 사용하여 대조염색시키고, 암모니아수 중 1% 산성 알콜 및 블루로 탈색시키고, 각각 2분씩 매회 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 크실렌으로 3회에 걸쳐 교체하면서 탈수화시키고, 영구 봉입제로 커버슬리핑하였다.
6.2.2.7 내재화
검정화
MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포 상에서 89Zr-19C11의 내재화를 조사하였다. 대략 1 x 105개의 세포를 12 웰 플레이트에 시딩하고, 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 일정 부피의 방사선 표지된 단백질을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 4℃에서 1, 5, 12, 및 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 인큐베이션 기간 후, 배지를 수집하고, 세포를 1 mL 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)로 세정하였다. 4℃에서 100 mM 글리신을 포함하는 1 mL의 100 mM 아세트산 (1:1, pH 3.5) 중에서 세포를 세척함으로써 표면 결합 활성을 수집하였다. 이어서, 부착 세포를 1 mL의 1 M NaOH로 용해시켰다. 각각의 세척액을 수집하고, 활성에 대해 계수하였다. 최종 세척액의 활성 대 모든 세척액의 전체 활성의 비를 사용하여 내재화율(%)을 측정하였다.
6.2.3 결과
6.2.3.1
MUC16
병리생물학적 성질은 C-말단
MUC16
엑토도메인의
N
-
당화에
의존한다.
실시예 1 (섹션 6.1 참조)에서는 MUC16c114의 발현이 3T3 마우스 섬유아세포의 더욱 공격적인 시험관내/생체내 거동을 유발함으로써 생체내에서 MUC16c114 유도성 매트리겔 침입의 유의적인 증가 및 더욱 빠른 종양 성장을 일으킨다는 것이 입증되었다. 따라서, SKOV-3 세포주 (MUC16이 발현되지 않는 인간 난소 세포주)를 MUC16c114 의존성 특성의 효과에 대하여 조사하였다. MUC16c114 발현은 세포 표면 발현, 및 거의 3배에 가까운 매트리겔 침입 증가를 일으켰다 (도 12a의 레인 1 및 2와 비교). Asn30의 알라닌으로의 돌연변이 (MUC16c114 -N3, 도 12a, 레인 3), Asn1 및 Asn24의 알라닌으로의 돌연변이 (MUC16c114 -N12, 도 12a, 레인 4), 및 Asn1, Asn24, 및 Asn30의 알라닌으로의 돌연변이 (MUC16c114 -N123, 도 12a, 레인 4)가 매트리겔 침입을 폐기시켰는 바, 이러한 침입 증가는 MUC16c114의 아미노산 위치 1번 (Asn1), 24번 (Asn24), 및 30번 (Asn 30)의 아스파라긴 (각각 성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn1777, Asn1800, 및 Asn1806에 상응; MUC16c114 -N123)의 N-당화에 의존하는 것이었다. 도 12b 또한 참조할 수 있다. 또한, MGAT5 또는 LGALS3 발현을 감소시킨 넉다운 shRNA 실험은 N-당화 부위에서의 MUC16c114 돌연변이와 유사한 효과를 보였고, 침입을 거의 기준 수준으로까지 감소시켰는 바 (도 12a, 레인 6-10), MUC16c114 유도성 매트리겔 침입 증가는 MGAT5 (N-당화 반응에 관여하는 첫 번째 효소) 및/또는 LGALS3 (다수의 고등급 혈청 암에서 증폭된 효소)에 의존하는 것이었다.
종양원성 형질전환의 가장 명확한 홀마크는 면역결핍 마우스에서 성장을 촉진시킬 수 있는 능력이다. MUC16 N-당화, MGAT5, 및 LGALS2가 종양 성장률에 미치는 효과를 측정하기 위해, 옆구리 종양 모델을 사용하여 정칙 종양 측정을 용이하게 하였다. 도 12c에 제시된 바와 같이, 벡터 (phrGFP), MUC16c114, MUC16c114 -N123, MUC16c114 및 항-MGAT5 shRNA (MUC16c114-shMGAT5), 또는 MUC16c114 및 항-LGALS3 shRNA (MUC16c114-shLGALS3)를 발현하는 3T3 세포주를 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 이식하였을 때, 24일째에 오직 MUC16c114 3T3 세포만이 벡터만 포함하는 대조군과 비교하여 더욱 큰 종양을 형성하였다. 본 데이터는 MUC16 N-당화, MGAT5, 및 LGALS3이 종양 성장을 위해 요구된다는 것을 시사하는 시험관내 분석을 확증한다.
6.2.3.2
mAb
개발을 위한 중요한
에피토프
모방체로서
동종
N
-
당펩티드
합성
MUC16c114의 Asn30 부위 (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn 1806에 상응; MUC16c114-N3)의 N-당화가 MUC16 종양원성 작용에 중요한 요건인 것으로 측정되었는 바, MUC16c114 -N12가 Asn30 (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn 1806에 상응)에서 N-당화될 수 있는 능력을 보유하기 때문에, SKOV3 세포에서 발현된 MUC16c114 - N12 의 글리칸 프로파일링을 수행하였다. 글리콤 분석 결과, 최소 반복 단위로서, 각종의 만노스 모이어티가 부착되는, 중요한 키토비오스 (GlcNAc2) 줄기 (도 13a)를 포함하는, 상기 C-말단 MUC16 단편에 대하여 매우 다양한 N-당화 패턴이 밝혀졌다.
따라서, 전이 및 침입에 대한 MUC16의 당화 의존성 효과를 억제시키기 위한 노력으로 당화에 대한 mAb가 생성되었다. 이들 항체는 MUC16 엑토도메인 내의 더 짧은 단쇄의 55개의 아미노산 서열 (MUC16C55; 서열 번호: 129) 상에 중요한 세 번째 당화 부위 (MUC16c114의 Asn30)를 함유하는 N-당펩티드 에피토프를 표적화하도록 디자인된 것이다. 면역원으로서 사용되는 당펩티드의 합성에 관한 설명을 위해 섹션 6.2.2.1 및 도 13b, 도 13c, 및 도 13d를 참조한다. 면역화 프로세스에 관한 설명을 위해 섹션 6.2.2.2를 참조한다.
MUC16c114의 Asn24 및/또는 Asn30 (각각 성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn1800 및 Asn1806에 상응)에 상응하는 아미노산 잔기에 키토비오스를 포함하는 짧은 단쇄 (55-mer, 18-mer, 및 15-mer) MUC16 당펩티드로 면역화함으로써 항체를 생성하였다. 더욱 큰 N 글리칸에 공통되는 가장 짧은 단쇄의 모티프 이외에도, 키토비오스 또한, 글리칸에의 의존성 뿐만 아니라, 펩티드 특이성을 보이는 항체를 유도하기 위한 기본 MUC16 유도성 펩티드를 더욱 잘 노출시킬 수 있을 것이다. 이러한 당화저하는 정상 세포와 비교하여 종양 세포의 표면 상의 뮤신 당단백질에서의 빈번하게 나타나는 독특한 특징이다.
6.2.3.3 합성
당펩티드
/
당접합체를
이용한 마우스 백신 접종 및 혈청학적 검정법
섹션 6.2.2.2에 기술된 프로토콜에 따라 마우스 백신 접종 및 혈청 수집을 수행하였다. GlcNAc2-55-mer (도 13b)로 3회 면역화시킨 후, 마우스를 KLH-접합된 작제물 (단일당화된 15-mer (서열 번호: 131; 도 13c) 및 이중당화된 18-mer (서열 번호: 130; 도 13d))의 혼합물로 추가로 면역화시켰을 때, 10마리의 마우스 중 2마리가 (GlcNAc2를 포함 및 포함하지 않는) 두 55-mer 모두에 대해 양성 ELISA 신호를 보였지만, 반응은 일반적으로 약했으며, 이는 마우스가 55-mer 면역화로 완전히 감작화되지 않았음을 제안하는 것이다. KLH 접합체 (GlcNAc2-15-mer (도 13c) 및 (GlcNAc2)2-18-mer (도 13d))로 2회 더 면역화하였을 때, 특히 2마리의 마우스 (마우스 7 및 마우스 8)에서 더 짧은 단쇄의 15-mer 및 18-mer 당펩티드에 대해 증진된 IgG 면역 반응이 나타났다. 그러나, 상기 항체는 55-mer-당펩티드의 경우에는 ELISA에 의해 어떤 검출가능한 반응도 보이지 않았는데, 이는 이러한 특정 검정법에서 상기의 큰 단편 중의 에피토프가 접근하기 어렵거나, 또는 입체구조상 상이하다는 것을 제안하는 것이다. 두 55-mer 모두 (키토비오스 함유 및/또는 비당화된 펩티드)에 대하여 반응한 마우스 5는 Man3GlcNAc2-유도체화된 55-mer에 대하여 음성이었다. 비당화된 펩티드 골격에 대한 것인 4H11 mAb (문헌 [Rao et al. Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72])는 비-접합된 15/18-mer 당펩티드에 대해서는 어떤 결합도 보이지 않았다는 것은 놀라운 것은 아니며, 이는 이용가능한 에피토프에 있어 약간의 차이가 있을 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 도 14를 참조한다.
6.2.3.4
당화
의존성 단일클론 항체 개발 및
시험관내
생물학적 검정법 - MUC16 유도성 매트리겔 침입
혈청이 비당화된 것 대비의 짧은 당펩티드에 대하여 가장 높은 반응비를 보였고, 따라서, 당 존재에 대해 얼마간의 선호를 보인 10마리의 마우스 중 1마리 (마우스 7)를 선택하였다. 마우스 7의 비장을 수거하였고, 표준 하이브리도마 배양 기술을 통해 IgG 생산 하이브리도마 세포주를 제조하였다. 비장 세포를 하이브리도마 융합 파트너와 융합하여 특별히 높은 융합 효율 (평균적으로 >5.5개의 콜로니/웰, > 30,000개의 하이브리도마)을 얻었다. 상청액을 선택하고, ELISA에 의해 개별 당펩티드에 대한 반응성에 대하여 스크리닝하였다. (동일 웰 중에 조합된) 15mer-키토비오스 펩티드 및 18mer-키토비오스 펩티드에 대한 융합 시험 플레이트에 관한 예비 ELISA 분석 결과, 일부는 양성 신호를 보였는데, 이는 비록 그의 당화 의존성이 이 시점에서 완전히 사정될 수 있는 것은 아니지만, 항-펩티드 항체의 존재를 암시하는 것이다. 도 14를 참조한다. 그럼에도 불구하고, 비당화된 것과 비교하였을 때, 키토비오스-당화된 항원을 선호하는 양성 반응을 보이고, 따라서, 그에 대하여 더욱 특이적인 항체의 비가 더 높은 것으로 관찰되었다. 배양물을 희석하였을 때, 각 웰에서 성장하는 단일 클론 (상기 1:1 비)을 수득하였고, 1차 스크리닝 결과, 상기 하이브리도마에 의해 생산된 항체는 비당화된 15-/18-mer에 가까이 있는 4H11 에피토프를 인식하지 못하는 것으로 밝혀졌다. 도 14를 참조한다. 더 높은 희석률로 단일클론 항체 스크리닝을 완료한 후, 당펩티드 에피토프를 선호하는 것으로 보이는 항체를 수득하였다. 따라서, 상기 프로세스를 통해 36개의 키토비오스 의존성 1차 mAb를 제공하였고, 이를 MUC16에 대한 반응성에 대하여 시험하였다. SKOV3-MUC16c114 형질감염체를 이용한 매트리겔 검정법에 의해 상기 mAb 중 15개의 mAb를 (4H11과 함께 동시에) 그가 침입에 대해 미치는 효과에 대하여 평가하였다 (도 15a). MUC16 당화 항체 1B5, 10C6, 13A7, 18C6, 19C11, 16C5, 6H10, 21F8, 7B12는 매트리겔 침입을 억제시키는 것으로 나타난 반면, 4H11은 상기 특성에 대하여 어떤 효과도 없었으며, 이는 MUC16c114의 Asn30 (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn1806에 상응)에 대한 항체가 MUC16의 생물학적 성질을 억제시킨다는 것을 시사하는 것이다. 이어서, MUC16 당화 항체를 서브클로닝하고, 정제하였다. 특정 MUC16 당화된 항체에 대한 결합 파라미터를 측정하였다 (하기 표 9 참조).
마지막으로, 4H11 또는 OC125를 이용하여 수행된 면역조직화학법과 비교하였을 때, MUC16 당화 항체 10C6을 이용하여 수행된, 인간 난소 조직 샘플의 면역조직화학법 결과, MUC16 검출이 개선된 것으로 나타났다 (도 16e).
6.2.3.5 MUC16 당화 항체는 MUC16 당화에 대하여 특이적이다.
MUC16 당화 항체의 특이성을 조사하기 위해, MUC16 당화된 항체 (18C6, 19C11, 10C6, 1B5, 또는 13A7) 또는 단일클론 항-MUC16 항체, 4H11의 존재 또는 부재하에서 (i) 천연 (성숙한) MUC16을 발현하는 세포 (OVCA-433 세포), (ii) MUC16이 발현되지 않고, 대조군 벡터를 발현하는 SKOV3 세포 (SKOV3 phrGFP 세포), (iii) MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포 (SKOV3 MUC16c114), (iv) MUC16c114 -N1을 발현하는 SKOV3 세포 (SKOV3 MUC16c114 -N1), (v) MUC16c114 -N3을 발현하는 SKOV3 세포 (SKOV3 MUC16c114-N3) 또는 (vi) SKOV3 MUC16c114 -N123을 발현하는 SKOV3 세포 (SKOV3 MUC16c114 -N123)에 대해 FAC 분석을 수행하였다 (하기 표 10). 항체 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, 및 13A7은 OVCA-433 세포에의 결합을 보였다 (표 10; ID 번호: 3-8을 음성 대조군인 ID 번호: 1 및 2와 비교). 그에 반해, 연구 디자인 및 항체 생성에 기초하여 이루어진 예상대로, 항체 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, 및 13A7 중 어느 것도 SKOV3 phrGFP 세포에 결합하지 않았다 (표 10, 음성 대조군인 ID 번호: 9 및 10과 비교하여 ID 번호: 11-16). 항체 4H11, 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, 및 13A7은 SKOV3 MUC16c114에 결합하였다 (표 10, 음성 대조군인 ID 번호: 17 및 18과 비교하여 ID 번호: 19-24). MUC16c114의 Asn1 (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150))의 Asn1777에 상응)의 돌연변이가 SKOV3 MUC16c114 -N1 세포에의 항체 결합을 억제시키지는 못했다 (표 10, 음성 대조군인 ID 번호: 25 및 26과 비교하여 ID 번호: 27-32). 그러나, MUC16c114의 Asn30 (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150))의 Asn1806에 상응)의 돌연변이는 MUC16 당화된 항체 18C6, 19C11, 10C6, 1B5, 및 13A7의 결합을 폐기시켰다 (표 10, 음성 대조군인 ID 번호: 33 및 34와 비교하여 ID 번호: 36-40). 또한, MUC16c114의 Asn30 (성숙한 MUC16 (서열 번호: 150))의 Asn1806에 상응)의 돌연변이는 MUC16 당화된 항체가 아닌 항체 4H11의 결합은 폐기시키지 못했다 (표 10, 음성 대조군인 ID 번호: 33 및 34와 비교하여 ID 번호: 35). 추가로, Asn1, Asn24, 및 Asn30 (각각 성숙한 MUC16 (서열 번호: 150))의 Asn1777, Asn1800, 및 Asn1806에 상응)에서의 아스파라긴의 알라닌으로의 돌연변이가 MUC16 당화된 항체 18C6, 19C11, 10C6, 및 1B5의 결합은 폐기시켰지만 (표 10, 음성 대조군인 ID 번호: 41 및 42와 비교하여 ID 번호: 44-47), 4H11의 결합은 폐기시키지 못했다. 13A7은 SKOV3 MUC16c114 -N123 세포에의 결합을 유지하였다는 것에 주의한다. 본 데이터는 MUC16 당화 항체가 당화에 의존하는 방식으로 MUC16c114에 결합한다는 것을 입증한다.
6.2.3.6 MUC16 당화 항체는 매트리겔 침입을 억제시킨다.
MUC16 당화 항체의 당화 특이성을 고려하여 (표 9), 당화에 특이적인 방식으로 매트리겔 침입을 억제시킬 수 있는 MUC16 당화 항체 생체반응성 상청액의 능력을 평가하였다. 따라서, MUC16 당화 항체 생체반응성 상청액의 존재 (도 15a, 레인 3-18) 또는 부재 (도 15a, 레인 1 및 2)하에서 phrGFP (도 15a, 레인 1) 또는 phr-GFP-MUC16c114 (MUC16c114; 도 15a, 레인 2-18)를 발현하는 SKOV3 난소암 안정 세포주를 이용한 매트리겔 침입 검정법을 수행하였다. MUC16 단일클론 항체 4H11 (도 15a, 레인 3)을 MUC16 당화 항체 생체반응성 상청액에 대한 대조군 (도 15a, 레인 4-18)으로서 사용하여 매트리겔 침입에서의 당화 의존성을 평가하였다. 4H11의 존재하에서 어느 한 MUC16c114의 발현 (도 15a, 각각 레인 2 및 3)은 매트리겔 침입 활성을 증가시켰다. 그에 반해, MUC16 당화 항체와의 인큐베이션 (도 15a, 레인 4-18)은 MUC16c114 발현 난소암 세포의 매트리겔 침입을 감소시켰다.
이어서, 정제된 MUC16 당화된 항체의 매트리겔 침입을 억제시킬 수 있는 능력에 대하여 평가하였다. 상기 목적을 달성하기 위해, MUC16c114 발현 SKOV3 세포를 MUC16 항체 4H11 또는 정제된 MUC16 당화된 항체의 존재 및 부재하에서 인큐베이션시켰다 (도 15b). MUC16 당화된 항체 7B12, 19C11, 18C6, 및 10C6은 MUC16c114 유도성 매트리겔 침입을 억제시켰다 (도 15b, 레인 3-6을 음성 대조군인, 레인 2와 비교). 그에 반해, 단일클론 항-MUC16 항체 4H11은 MUC16c114 유도성 매트리겔 침입을 억제시키지 못했다 (도 15b, 레인 2를 음성 대조군인, 레인 1와 비교). 본 데이터는 단일클론 항체 4H11과 대조적으로, MUC16 당화 항체 (예컨대, 7B12, 19C11, 18C6, 및 10C6)가 매트리겔 침입을 차단한다는 것을 입증한다.
MUC16c114 N-당화 돌연변이체와 관련하여 매트리겔 침입을 억제시킬 수 있는 MUC16 당화 항체의 능력에 대해 검정하였다 (도 16a). 상기 목적을 달성하기 위해, (i) 대조군 항체; (ii) 4H11 항체; 또는 (iii) MUC16 당화 항체 10C6의 존재하에서 SKOV3 phrGFP 세포, SKOV3 MUC16c114 세포, SKOV3 MUC16c114 -N1 세포, SKOV3 MUC16c114-N2 세포, 또는 SKOV3 MUC16c114 -N3 세포 (도 16a, 각각 레인 1-5) 상에서 매트리겔 침입 검정법을 수행하였다. MUC16c114의 Asn30이 MUC16c114 매트리겔 침입에 필요한 바, SKOV3 MUC16c114 -N3 세포에서는 MUC16c114 유도성 매트리겔 침입이 억제되었다. 또한, MUC16 단일클론 항체 4H11의 존재 및 부재하에서 매트리겔 침입은 SKOV3 MUC16c114 세포, SKOV3 MUC16c114 -N1 세포, 및 SKOV3 MUC16c114 -N2 세포에서 유도되었다. 그에 반해, 상기 항체를 MUC16 당화 항체 10C6과 함께 인큐베이션시켰을 때에는 매트리겔 침입이 폐기되었다 (도 16a). 본 데이터는 또한 도 16b에서 및 MUC16c344 돌연변이체를 발현하는 3T3 세포에서 (도 16c) 확증되었다.
종합해 보면, 본 데이터는 MUC16 당화 항체가 단일클론 항-MUC16 항체 4H11과는 대조적으로 당화에 의존하는 방식으로 매트리겔 침입을 억제시킬 수 있다는 것을 시사한다.
6.2.3.7
MUC16
당화
항체
19C11는
내재화된다.
마지막으로, MUC16c114의 Asn30을 표적화하는 MUC16 당화 항체의 내재화될 수 있는 능력을 사정하였다. MUC16c114를 발현하는 SKOV3 세포를 89Zr-DFO-표지된 19C11 항체와 함께 인큐베이션시키고, 레이디오우트레이서(Radiotracer)를 통해 내재화를 측정하였다 (도 17). 본 데이터는, 표지된 19C11 항체가, MUC16c114- 발현 SKOV3 세포와 함께 37℃에서 인큐베이션되었을 때, 이르면 항체 처리 후 1시간째에 내재화되었다는 것을 입증한다. 표지된 항체의 세포 흡수는 4℃에서 감소되었다.
6.2.4 논의
MUC1과 실질적으로 상동성인 뮤신 패밀리의 구성원인 MUC16/CA125 항원은 오랫동안 부인과 악성 종양과 연관되어져 왔다 (하기 섹션 6.2.5에서 언급된 참고 문헌 4 참조). 일반 스크리닝 도구로서 충분한 감수성 또는 특이성을 띠지 못함에도 불구하고, 항체 기반 검출 방법을 통해 난소암 환자를 모니터링을 하는 데 CA125 측정이 통상 사용된다. 대다수의 MUC16 반응성 항체, 예컨대, OC125는 상기 분자의 절단된 분획 중에서 발견되는 당화 의존성 에피토프에 대한 것이고, 절단 후 MUC16의 인접부를 검출하는 스크리닝 도구로서는 유용하지 못하다. 그 결과, 남은 MUC16 단백질 단편에 대한 생물학적 연구는 부족하다. 실시예 1 (섹션 6.1)의 데이터는 인접한 MUC16 영역의 114개의 아미노산 서열 (MUC16C114)이 여러 난소암 세포주 상에서 침입 및 종양 성장을 증가시키는 데 충분하다고 입증하였다. 상기 C-말단 엑토도메인, 특히, 세 번째 Asn 부위 (Asn30, 성숙한 MUC16 (서열 번호: 150)의 Asn1806에 상응)에서의 N-당화는 MUC16 종양원성 효과에 중요하다는 본원의 놀라운 발견 내용은 MUC16에 대한 새로운 역할을 제안하며, 이는 이어서 질환의 피동적 마커일 뿐만 아니라, 병원성 분자인 것으로 간주될 수 있다. 이러한 전제에 기초하여, MUC16의 이들 남은 일부분에 대한 단일클론 항체를 개발하는 것이 상기 뮤신의 병리생물학적 성질을 연구하고, MUC16 표적화 치료제를 생성하기 위한 강력한 도구인 것으로 보인다.
비록 선행 항체와 달리, 하기 mAb는 복합 당단백질 에피토프 대신 비당화된 펩티드 골격에 대한 것이기는 하였지만, 이전 연구에서는 MUC16의 비절단된 C-말단 영역에 대한 mAb가 확인되었다. 특히, 4H11은 MUC16 엑토도메인에 대하여 높은 친화도의 결합을 보였고, 에피토프의 가까운 위치에 기인하여 OC125보다 더욱 효율적으로 난소암 세포에 의해 내재화되었다. 이러한 관찰 결과는 당단백질의 인접한 영역이 추정 절단 부위에 대하여 원거리에 있는 MUC16의 유리된 일부분으로부터의 비의존적인 생물학적 성질을 가진다는 것을 제안하였다. 그러나, 4H11은 MUC16 병원성 작용에 요구되는 엑토도메인 내의 중요한 당화 부위를 인식하지 못하는 바, 표적화 요법에서의 미래 연구를 위한 그의 잠재성에는 한계가 있다.
하이브리도마 기술과 조합하여 KLH-접합된, 합성 당펩티드 모방체를 사용함으로써 MUC16 엑토도메인 중의 중요한 당펩티드 에피토프에 대한 당화 의존성 단일클론 항체 패널을 개발하였다. 다중클론 단계에서는 당펩티드 특이성이 완전하지 못하였고, 비당화된 MUC16 펩티드 단편에 대해 일부 결합은 또한 검출되었는 바, 상기 방법이 다중클론 항체 생성보다 바람직하다. MUC16 당화 항체를 수득하기 위해, 단일클론 항체 생성을 위한 1차 선별은 어느 정도로는 당의 존재를 선호하는 것과 연관된, 다클론성(multiclonal) 배양물 중에서의 더 높은 당화 의존비에 기초하였다. 새 단일클론 항체의 효력 및 당펩티드 에피토프에 대한 그의 더 높은 특이성은 그가 MUC16 유도성 매트리겔 침입에 미치는 효과를 연구함으로써 입증되었다. 이들 MUC16 당화 항체는 매트리겔 검정법에서 침입을 억제시킬 수 있었던 반면, 비당화에 대한 4H11은 억제시키지 못했다. Asn30에서의 N-당화가 MUC16 작용에 필수적이라는 관찰 결과에 기초하여, 새로 생성된 항체는 MUC16 엑토도메인의 중요한 당펩티드 에피토프를 특이적으로 표적화하고, 이로써, MUC16 병리생물학적 성질을 억제시킨다는 것을 본 결과를 통해 확인할 수 있다. 중요하게, MUC16 당화 항체 10C6은 MUC16c114 발현 난소암 세포를 이식받은 무흉선 누드 마우스 모델에서 MUC16 양성 종양 성장을 지연시켰는데, 이는 최적화된 임상 적용에서 그의 치료학적 용도를 위해 유망한 도구로서 부상할 수 있는 상기 단일클론 항체의 잠재능을 제안한다.
6.2.5 인용된 참고 문헌
6.3
실시예
3:
MUC16의
종양 촉진 효과는
갈렉틴
-3 및 세포 표면 수용체와의 상호작용을 필요로 한다.
본 실시예는 (a) 실시예 2 (섹션 6.2)에 기술된 특정 실험에 관한 더욱 상세한 설명; 및 (b) 실시예 2 (섹션 6.2)와 비교하는 추가 실험을 제공한다.
6.3.1 도입
MUC16/CA125의 과다발현은 혈청 난소암에서 공통된 것이며, 혈청 CA125 수준 상승은 생존 감소와 연관이 있다. OC125 항체에 의해 인식되는 CA125 항원은 MUC16 당단백질의 세포외 일부로부터의 탠덤 반복부 도메인 내에서 발현된, 대량으로 당화된 항원이다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 3 및 22 참조). 상기 항원은 주로 양성 또는 악성 뮐러 조직에 의해 발현되지만, 발암에서의 그의 기능 및 역할에 대해서는 현재 완전히 이해되고 있지 않다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 4 참조). MUC16은 큰, 이종으로 당화된 세포외 도메인, 세포막과 추정 절단 부위 사이의 58개의 아미노산 엑토도메인, 소수성 막관통 영역, 및 짧은 세포내 테일로 구성된, 고도의 복합 테더링된 뮤신이다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 21 참조). OC125 및 대부분의 다른 MUC16 반응성 단일클론 항체 (mAb)는 상기 분자의 절단부에 존재하는 면역원성인 156개의 아미노산 탠덤 반복부 영역을 인식한다. 더욱 새로운 엑토도메인 특이적 항체 (예컨대, 4H11 및 4A5)는 절단 후 MUC16의 일부에 남아있는 펩티드 에피토프를 인식한다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 6 참조). 고정 비의존성 성장의 증가, AKT 및 ERK 경로의 활성화, 매트리겔 침입 증가, 및 누드 마우스 이종이식편에서의 성장 증진으로 측정된 바와 같이, MUC16의 C-말단 부분 (MUC16c114)은 무한증식 3T3 세포를 형질전환시키는 것으로 입증되었다 (섹션 6.1 및 하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 19 참조). 상기 효과는 MUC16의 엑토도메인에 의존하였지만, 31개의 아미노산 세포질 테일의 손실은 상기 특성에 대하여 거의 영향을 미치지 않았다. 엑토도메인이 종양원성 거동을 촉진시키는 기전은 완전히 이해되지 않은 상태이다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 19 참조). 단백질-결합 도메인이 존재한다는 일치된 의견은 없지만, MUC16 엑토도메인의 58개의 아미노산 서열은 MUC16의 다른 세포 표면 분자와의 잠재적 상호작용/조절 부위를 나타내는 3개의 N-당화 부위를 포함한다.
티로신 키나제 수용체, 예컨대, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR), 및 다른 것의 N-당화 부위가 세포 렉틴, 예컨대, 갈렉틴-3과 상호작용하여 표면 상주, 신호전달 강도, 및 세포 거동을 조절하는 것으로 보인다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 12 참조). N-당화의 효과는 성장 증진 수용체 상의 N-당화 부위의 개수 및 복합 N-당화된 종에 대한 갈렉틴-3의 친화도에 의존한다. 세포 표면 분자, 예컨대, 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β) 수용체로부터의 길항성 억제성 신호 상에는 N-당화 부위가 더 적다. 이들 수용체는 성장 인자와 관련된 높은 영양분 유동률에 감수성을 띠고, 일반 환경에서 약화 기능을 제공한다. 그러나, 고전적 수용체 티로신 키나제와, 암 연관 당단백질의 상호작용에 관한 기전은 알려져 있지 않다. MUC1, MUC4, 및 MUC16은 모두 막관통 도메인 존재를 특징으로 하는 대량으로 당화된 테더링된 당단백질이고, 상피 암에서 과다발현된다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 10 참조).
본 실시예 (섹션 6.3)에서는 MUC16의 당화가 복합적인 세포 표면 상호작용을 매개함으로써 뮤신 관련된 형질전환에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다.
MUC16의 C-말단부가 온코진 활성화, 매트리겔 침입 및 종양 성장을 촉진시켰다. 이러한 효과는 MUC16 엑토도메인에 남아있는 58개의 아미노산 중 2개의 인접한 N 당화 부위의 MGAT5 의존성 당화에 의존하였다. 상기 두 부위 대신으로 더욱 원거리에 있는 MUC16 탠덤 반복부 영역 중의 N-당화 부위도 O-당화 부위도 기능상 치환되지 못한다. MUC16 당화 패턴은 다양하지만, 키토비오스 줄기는 모든 N-당화 종의 염기를 특징으로 하였다. 인접한, 키토비오스 함유 MUC16 당펩티드에 대한 항체가 세포 표면 신호전달 수용체에의 갈렉틴 3-매개 결합을 차단하였고, MUC16의 종양 촉진 효과를 억제하였다.
MUC16 당펩티드의 체계적 변경을 사용하여 글리칸 구조와, MUC16 발현에 의해 발휘되는 종양 촉진 효과 사이의 관계를 직접 심문하였다. 공동 국재화, 온코진 활성화, 매트리겔 침입, 및 종양 이종이식편 성장을 비롯한 상기 효과는 MUC16의 남아있는, 비순환 일부분 상의 N-당화된 서열과 세포 표면 분자, 예컨대, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 인테그린 β1 사이의 갈렉틴-3-매개 결합에 의해 발휘되었다. 세포외, 뮤신 유도성 종양 촉진은, N-당화 부위에 대한 항체에 의해 성공적으로 표적화될 수 있다는, 본원에서 제공하는 관찰 결과 및 데이터에 의해 뒷받침되는 기전이다.
본 실시예에 제시된 바와 같이: (1) MUC16의 세포외 당화가 난소 혈청 암 거동을 구동시켰고; (2) 침입 및 MUC16+ 이종이식편 성장은 특이적인 MUC16 N-당화 부위에 의존하였고; (3) MUC16은 갈렉틴-3 및 EGFR 또는 인테그린 β1과의 이종삼량체 복합체를 형성하였고; (4) 항-당화 부위 항체는 세포외 MUC16 종양 촉진을 차단하였다.
6.3.2 물질 및 방법
6.3.2.1
MUC16
카르복시
-말단 (
MUC16
c114
),
MUC16
-CA125 도메인 (
MUC16
c344
), 및
당화된
융합 단백질 DNA 작제물 합성
MUC16 C-말단 작제물에 관해서는 섹션 6.1.2 및 6.2.2, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 19를 참조한다. pFUSE-인간 IgG1-Fc2 벡터 (pFUSE)를 인비보겐 (미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 구입하였고, 키메라 단백질 MUC16c57 -114-pFUSE 및 117- 244LGALS3-pFUSE의 구축 또한 섹션 6.1.2 및 6.2.2, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 19에 기술되어 있다.
6.3.2.2 세포 배양물, 형질감염, 및 세포주
특징화
섹션 6.1.2 및 6.2.2, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 19에 기술되어 있는 바와 같이, SKOV3, CAOV3, 및 OVCAR3 세포주를 입수하고, 유지시켰다. 상세한 설명을 위해 섹션 6.3.6을 참조한다.
6.3.2.3 당펩티드의 합성
MUC16 당펩티드의 합성에 관한 상세한 설명에 대해서는 섹션 6.4를 참조한다.
6.3.2.4
매트리겔
침입
기저막 침입을 매트리겔 침입 챔버 (BD 바이오사이언시스에서 측정하였다. 안정적인 세포주를 5 ㎍/mL의 투니카마이신 (시그마-알드리치: 미국 미주리주 세인트루이스, 카탈로그 번호 T7765), 또는 5 ㎍/mL의 MUC16c57 -c114-pFUSE, 또는 5 ㎍/mL of 117- 244LGALS3-pFUSE 융합 단백질로 처리한 후; 매트리겔 이동을 삼중 웰에서 48시간 경과 후에 측정하고, phrGFP 벡터 대조군 및 MUC16c114 형질감염체와 비교하였다. 섹션 6.1.2 및 6.2.2, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 19 또한 참조한다.
6.3.2.5
무흉선
누드 마우스에서의 종양 성장
형질감염된 세포주 및 적절한 대조군 세포주를 암컷인 무흉선 누드 마우스의 옆구리 내로 도입하고, 메모리얼 슬로언 케터링 캔서 센터 안티튜머 어세스먼트 코어 퍼실러티(Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitumor Assessment Core Facility)에 의해 통상의 동물 관리를 제공받았다. 주 2회에 걸쳐 종양을 측정하고, 메모리얼 슬로언 케터링 캔서 센터 리서치 애니멀 리소스 센서(Memorial Sloan Kettering Cancer Center Research Animal Resource Center) 가이드라인에 따라 최대 크기가 1,500 ㎣가 될 때까지 종양 성장을 기록하였다. 섹션 6.1.2 및 6.2.2, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 19 또한 참조한다.
6.3.2.6 단일클론 항체 제조; 마우스 면역화 프로토콜
5마리의 BALB/c 및 5마리의 스위스 웹스터 마우스에게 애주번트의 존재하에서 매 3주마다 3회에 걸쳐 키토비오스 함유 55-mer MUC16 당펩티드 (GlcNAc2-55-mer; 서열 번호: 129)를 투여함으로써 면역화 프로토콜을 시작하였다. 4차 면역화는 KLH-접합된, 단일당화된 15-mer (GlcNAc2-15-mer-KLH; 서열 번호: 131) 및 이중당화된 18-mer ([GlcNAc2]2-18-mer-KLH; 서열 번호: 130) MUC16 작제물의 혼합물을 이용하여 수행하였다. GlcNAc2-55-mer (서열 번호: 129) 및 비-접합된, 키토비오스 보유 15/18-mer 당펩티드 (각각 서열 번호: 131 및 서열 번호: 130)에 대한 반응성에 대하여 혈청을 분석하였다. 추가로, 2개의 MUC16 비관련, 키토비오스 함유 펩티드 (서열 번호: 168 및 169)와 함께, 비당화된 55-mer (서열 번호: 129), 15-mer (서열 번호: 131) 및 18-mer 펩티드 (서열 번호: 130)를 스크리닝을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 마우스를 매 3주마다 2회 더 더욱 짧은 단쇄의 KLH-접합체 (서열 번호: 130 및 서열 번호: 131)로 추가로 면역화시키고, 각 면역화 후에 ELISA에 의해 반응을 분석하였다. 섹션 6.2.2 또한 참조한다.
6.3.2.7 ELISA
샌드위치 ELISA를 수행하여 ELISA 검정법을 위한 통상의 코어 설비 프로토콜에 따라 개별 (글리콜) 펩티드에 대한 항체의 양성 반응을 사정하였다. 섹션 6.2.2 또한 참조한다.
6.3.2.8
웨스턴
블롯
분석
동량의 단백질을 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하고, 4℃에서 바이로래드 전달 장치를 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 또는 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 실온에서 1시간 동안 3% 우혈청 알부민 (BSA) 또는 0.1% 트윈-20을 포함하는 PBS (PBST) 중 5% 무지방 우유로 차단하였다. 막을 4℃에서 밤새도록 다양한 1차 항체 (셀 시그널링: 미국 매사추세츠주: Akt 카탈로그 번호 9272; 포스포-Akt (Ser473)(193H12) 카탈로그 번호 4058; p44/43 MAPK (Erk1/2) 카탈로그 번호 9102; 포스포-p44/43 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) 카탈로그 번호 9101; Src 카탈로그 번호 2109S; 포스포-Src 카탈로그 번호 2101L; EGFR 카탈로그 번호 2237L; 포스포-EGFR (Y1068)(D7A5) XP(R) 카탈로그 번호3777S]; (시그마-알드리치, 인크.: 미국 미주리주 세인트루이스: 베타-액틴 카탈로그 번호 A5441); (써던 바이오테크: 미국 앨라바마 버밍햄: 항-인간-Fc-IgG1-HRP 카탈로그 번호 9054-05); (압젠트: 미국 캘리포니아주 샌디에고: 다중클론 LGALS3 항체 카탈로그 번호 AP11938b); 및 (오리진(Origene: 미국 메릴랜드주 록빌): 마우스 단일클론 항-EGFR v3 클론 OTI3H2 카탈로그 번호 TA506224; 마우스 단일클론 항-DDK 클론 4C5 카탈로그 번호 TA50011-100)로 발색시켰다. 막을 PBS-T로 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 1시간 동안 HRP 접합된 항-마우스 또는 항-토끼 항체 (GE 헬쓰케어: 영국) (1:5,000 희석률)로 발색시켰다. 이어서, 막을 PBS-T로 3회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 1-5분 동안 웨스턴 라이트닝 케미루미네선스 시약 (ECL, 퍼킨 엘머)으로 발색시키고, 신호를 하이블롯 CL 필름 (덴빌 사이언티픽 인크.: 미국 뉴저지주 메터친) 상에서 발생시켰다.
웨스턴 블롯 분석 프로토콜에 관한 설명에 대해서는 섹션 6.1.2 및 6.2.2, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 19 또한 참조한다.
6.3.3 조직
마이크로어레이
(
TMA
)의
면역조직화학법
인간 TMA 스크리닝의 면역조직화학법은 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 6 참조).
6.3.4
OVCAR3
,
SKOV3
-
MUC16
c344
, 및
SKOV3
-
MUC16
c114
의
면역형광
염색
50,000개의 세포를 델타(Delta) TPG 0.17 mm 디쉬에 따로따로 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새도록 배양하였다. 부착된 세포를 1% 우태아 혈청 (FCS) 및 0.025% 소듐 아지드를 함유하는 PBS (FACS 완충제)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 1:50 희석률로 EGFR(R-1)-알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 nm (산타 크루즈 바이오테크놀러지: 미국 캘리포니아주, 카탈로그 번호 sc-101 AF647) 및 4H11 또는 인테그린 β1(4B7R)-알렉사 플루오르 647 nm (산타 크루즈 바이오테크놀러지: 미국 캘리포니아주, 카탈로그 번호 sc-9970 AF647) 및 4H11로 염색하였다. 세포를 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척한 후, 4℃에서 30분 동안 염소 항-마우스 IgG2b-PE (산타 크루즈 바이오테크놀러지: 미국 캘리포니아주, 카탈로그 번호 sc-3766-PE)로 표지하였다. 세포를 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하고, ZEN2 획득 소프트웨어를 사용하여 20x/0.8NA 공기 및 63x/1.4NA 오일 대물렌즈가 장착된 자이스 엑시오 옵져버 Z1(Zeiss Axio Observer Z1)로 영상을 촬영하였다.
6.3.5 통계학적 분석
성장 및 침입에 관한 시험관내 및 생체내 연구에서 평가된 군들을 비교하기 위해, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 샌디에고)를 이용하여 스튜던츠 양측 t 검정을 사용하여 통계학적 유의도에 관하여 데이터를 분석하였다.
6.3.6 세포 배양물, 형질감염, 및 세포주
특징화
OVCA-433 세포주에 관하여 섹션 6.3.13의 참고 문헌 3을 참조한다. p렌티(pLenti) 테트라시클린-유도성 시스템을 인비트로겐 (미국 캘리포니아주) (카탈로그 번호 K4925-00)으로부터 구입하였고, 이를 사용하여 p렌티-SKOV3c114를 생성하였다. EGFR을 발현하는 바이러스 플라스미드에 대한 shRNA 헤어핀 넉아웃을 메모리얼 슬로언 케터링 캔서 센터 하이 스루풋 스크리닝 (HTS) 코어 퍼실러티(Memorial Sloan Kettering 암 Center High Throughput Screening (HTS) Core Facility)에 의해 수득하였고; HEK293 세포로부터 형질감염된 HEK293 세포 및 바이러스 상청액을 수집하여 p렌티-SKOV3c114-shEGFR 세포주를 감염시켰다. MUC16c114 형질감염체는 추정 절단 부위부터 카르복시-말단까지 (서열 번호: 150의 아미노산 1777 내지 1890)의 MUC16 단백질의 세포 표면 발현을 보였다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 21 참조). MUC16의 카르복시-말단까지 연장된 344개의 아미노산 단편 (서열 번호: 150의 아미노산 1547 내지 1890)으로서의 MUC16 단백질의 세포 표면 발현을 보이는 MUC16c344-GFP 벡터의 발현을 포함하는 세포주를 비롯한, 더욱 긴 장쇄의 MUC16 단편을 가지는 세포주를 유사한 방식으로 제조하였다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 19 및 22 참조).
6.3.7 형질감염
DNA 작제물을 제조사의 프로토콜에 따라 DOTAP (로슈 다이어그노스틱스, 인디애나폴리스 코포레이션: 미국 인디애나주)를 사용하여 SKOV3 세포 내로 도입하였다. SKOV3 세포에 대하여 800 ㎍/mL의 G418을 이용하여 그의 배양 배지 중에서 안정적인 형질감염체를 선별하였다. 이를 GFP 발현에 대하여 2회에 걸쳐 세포 분류하고, 선별된 세포를 최대 15 계대 세포주로서 성장시켰다. FACS 분석에 의해 통상의 모니터링을 수행하여 상기 세포주의 GFP 양성 반응을 확인하였다. 항-hrGFP (스트라타진: 미국 캘리포니아주 라호야) 및d 항-MUC16-카르복시-말단 단일클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 상기 세포주의 단백질 추출물을 분석하였다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 19 참조). 섹션 6.1에 기술된 바와 같이, 제조사의 프로토콜에 따라 MUC16c57 -114-pFUSE-hIgG1-Fc2 및 117- 244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2 작제물을 따로따로, 융합 단백질을 발현하고, 무혈청 배지로 분비하는 인간 배아 신장 (HEK) 프리스타일 293F 세포 (인비트로겐: 미국 캘리포니아주)로 형질감염시켰다 (섹션 6.1 및 하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 19 참조). 분비된 융합 단백질을 정제하고, 항-인간 IgG1-Fc-HRP (γ1 쇄 특이적) (써던 바이오테크 인크.: 미국 앨라바마 버밍햄) 또는 4H11-HRP 또는 다중클론 항-인간 LGALS3 항체 (압젠트: 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 특징화하였다. HEK293 세포에서 발현된 EGFRDDK-HIS (카탈로그 번호 TP700043), LGALS3Myc-DDK (카탈로그 번호 TP308785), 및 인테그린-β1 Myc-DDK (카탈로그 번호 TP303818) 정제된 단백질을 오리진 (미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 구입하였다.
6.3.8
FACS
분석에 의한
면역형광
염색
섹션 6.1 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 6에 기술되어 있는 바와 같이, MUC16 발현 FACS 분석을 수행하였다.
6.3.9 성장 곡선
섹션 6.1 및 6.2, 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 18 및 19에 기술되어 있는 바와 같이, 성장 곡선을 수행하였다.
6.3.10 명명법
실시예 3 (섹션 6.3)에서 사용된 바와 같이, "N1"은, "Asn1777"로도 지칭되는, 서열 번호: 150의 위치 1777번의 아스파라긴을 나타낸다. 실시예 3 (섹션 6.3)에서 사용된 바와 같이, "N24"는, "Asn1800"으로도 지칭되는, 서열 번호: 150의 위치 1800번의 아스파라긴을 나타낸다. 실시예 3 (섹션 6.3)에서 사용된 바와 같이, "N30"은, "Asn1806"으로도 지칭되는, 서열 번호: 150의 위치 1806번의 아스파라긴을 나타낸다.
6.3.11 결과
6.3.11.1
MUC16
병리생물학적 성질은 C-말단
MUC16
엑토도메인의
N
-
당화에
의존한다.
C-말단 MUC16 엑토도메인의 가장 가까운 인접한 114개의 아미노산 (MUC16c114)의 발현이, 생체내에서의 MUC16 유도성 매트리겔 침입의 유의적인 증가 및 더욱 빠른 종양 성장을 비롯한, 3T3 마우스 섬유아세포의 더욱 공격적인 시험관내/생체내 거동을 유발하였다 (섹션 6.1 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 6 참조). 인간 난소 세포에서의 MUC16의 역할 및 그의 당화 효과를 연구하기 위해, MUC16-음성 SKOV3 인간 난소 세포주를 MUC16 발현의 영향에 대하여 조사하였다 (도 18a-18c). MUC16c114 안정적인 발현 벡터로 SKOV3 세포를 형질감염시킨 결과, 도 19a에 제시된 바와 같이, 고수준의 세포 표면 MUC16 발현이 일어났고, 매트리겔 침입은 2배 초과로 증가하였다. 세포를 N-당화 억제제인 투니카마이신에 24시간 노출시켰을 때, SKOV3-MUC16c114 세포의 침입 특성은 크게 감소되었지만, SKOV3-phrGFP 벡터로만 형질감염된 세포의 매트리겔 침입에 대해서는 거의 영향을 미치지 않았다 (도 19a).
렉틴은 이전에 당화 효과 매개에 연루되어 왔고 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 17 참조), 갈렉틴-3은 대개 인간 난소암에서 과다발현되기 때문에, 갈렉틴-3의 당 결합 도메인을, 가변 결합 도메인이 결핍된 말단절단된 pFUSE-인간 IgG1-Fc2 서열 (pFUSE)과 조합함으로써 렉틴-차단 작제물 ("117- 244LGALS3-pFUSE")을 생성하였다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 1 참조). 상기 키메라 분자는 갈렉틴-3 리간드에 결합하지만, 갈렉틴-3 오량체를 형성할 수 있는 능력은 없다. 도 19a에 제시된 바와 같이, 상기 갈렉틴-차단 작제물을 세포 내로 도입하였을 때, 대조군 SKOV3-phrGFP 세포에 의한 매트리겔 침입에는 거의 영향을 미치지 않았지만, SKOV3-MUC16c114 침입은 유의적으로 감소시켰다. 갈렉틴-3 당 결합 도메인이 없는 대조군 pFUSE 벡터는 어떤 영향도 미치지 않았다. 동일한 pFUSE 벡터를 MUC16 엑토도메인으로부터의 58개의 아미노산에 연결시킴으로써 구축된 가용성 MUC16 엑토도메인 ("MUC16c57 -114-pFUSE") 또한 생성하였다. 갈렉틴-3-pFUSE (117-244LGALS3-pFUSE)-차단 작제물과 같이, MUC16c57 -114-pFUSE 작제물 또한 SKOV3-phrGFP 세포가 아닌, SKOV3-MUC16c114 세포의 침입을 유의적으로 감소시켰다. MGAT5는 갈렉틴-3 결합에 대하여 가장 높은 친화도를 가지는 테트라-안테너리 N-글리칸의 형성을 촉매화하는 당화 효소이다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 9 참조). MGAT5 넉아웃 마우스는 종양 성장에 대하여 저항성을 띤다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 8 참조). 어느 특정 이론으로 제한하지 않으면서, MUC16 효과는 갈렉틴-3 및 MGAT5 발현, 둘 모두에 의존할 것이라는 가설이 제기되었다. 도 19b에 제시된 바와 같이, MGAT5 또는 갈렉틴-3 (LGALS3)을 감소시키는 shRNA는 SKOV3-MUC16c114 침입을 현저히 감소시킨 반면, 라멜리(Lamelli)를 넉다운시키는 음성 대조군 shRNA는 어떤 영향도 미치지 않았다.
MUC16 엑토도메인 N-당화 부위 (MUC16c114 엑토도메인의 위치 N1, N24, 및 N30의 아스파라긴 잔기)로의 돌연변이 도입이 관찰된 MUC16-당화 의존성 변경을 감소시켰다. 도 19c에 제시된 바와 같이, 절단 부위에 인접한, 가장 원거리에 있는 아스파라긴 (N1)의 아스파라긴에서 알라닌으로의 돌연변이는 침입에 대하여 어떤 부정적인 영향도 미치지 않았다. 그에 반해, 더욱 인접한 아스파라긴 (N24 또는 N30)의 아스파라긴에서 알라닌으로의 돌연변이는 침입에 대하여 부정적인 영향을 미쳤다. 특히, 막 표면에 가장 가까운 위치에 있는 아스파라긴 (N30)의 보존이 침입 증진에 가장 중요하였고, 상기 효과가 다른 아스파라긴 잔기의 추가의 아스파라긴에서 알라닌으로의 돌연변이에 의해 실질적으로 증가되지는 않았다. MUC16 C-말단으로부터의 344개의 아미노산 (MUC16c344)을 포함하는 더욱 큰 MUC16 작제물 또한 조사하였다. MUC16c344의 N30 또는 MUC16c344의 N24 및 N30에 MUC16 돌연변이를 보유하는 발현 벡터로 SKOV3 세포주를 형질감염시켰을 때, 매트리겔 침입은 유의적으로 감소되었다 (도 19d). 비록 상기의 더욱 큰 작제물이 절단 부위에 대하여 원거리에 추가의 N-당화 부위 7개를 가지지만, SKOV3-MUC16c114의 경우, 상기 돌연변이가 침입을 변경시킨 것과 같이, 중요한 인접 N24 및 N30 부위의 돌연변이화는 도 19d에 제시된 바와 같이, 여전히 매트리겔 침입을 감소시켰다.
3T3 세포의 MUC16c114 형질전환에서 ERK 및 PI3K/AKT 경로, 둘 모두의 하류 활성화가 입증되었다 (섹션 6.1 및 하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 19 참조). 도 19e에서, MUC16c114를 가진 SKOV3 세포의 형질감염은 pERK1/2, pSRC, 및 EGFR의 인산화를 비롯한 다양한 온코진을 활성화시켰다는 것을 알 수 있다. 도 19e는 하기 조건: MGAT5의 넉다운 (shMGAT5), 갈렉틴-3의 넉다운 (shLGALS3), 및 N30의 아스파라긴에서 알라닌으로의 돌연변이인 각 조건이 MUC16c114 유도성 온코진 활성화를 손상시킨다는 것을 입증한다. 상기 데이터는 MUC16c114 발현과 관련하여 관찰된 매트리겔 침입 감소와 일치한다.
MGAT5 또는 LGALS3의 넉다운 또는 MUC16c114 엑토도메인 N-당화 부위의 돌연변이가 미치는 효과를 누드 마우스의 이종이식편 종양 성장에서 조사하였다. 도 19f에 제시된 바와 같이, 상기의 N-당화 지정 개입 중 임의의 것으로 MUC16c114 유도성 종양 성장이 완전히 폐기되었다. MUC16c114가 수용체 안정성에 미치는 효과 또한 조사하였다. N-당화, 및 갈렉틴 격자에의 연결, 이 둘 모두가 세포 표면 상의 EGFR의 안정화와 연관이 있다 (하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 11 참조). 어느 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 증가된 MUC16 존재가 세포 표면 갈렉틴 격자를 안정화시키고, 이로써, 세포 표면 상의 EGFR을 안정화시킨다고 판단되었다. 도 20a에 제시된 바와 같이, FACS 분석을 사용하여 안정적인 SKOV3-MUC16c114 형질감염체를 벡터만 포함하는 대조군과 비교하였을 때, SKOV3 세포 표면 상의 EGFR의 증가되어 있었다. 또한, phrGFP 벡터 대조군과 비교하였을 때, MUC16c114 발현은 새 EGFR 합성을 억제시키는 시클로헥시미드 (CHX) 처리 후, 세포 표면 상의 EGFR을 거의 2배로 배가시켰다. MUC16c114 엑토도메인 (4H11 양성)의 안정성은 CHX에 의해서는 변하지 않았다. CHX로 처리된 안정적인 SKOV3-MUC16c114 및 SKOV3-phrGFP 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 24시간 동안 시간 경과에 따른 전체 EGFR을 비교하였고, EGFR을 β-액틴과 비교하였다. 농도측정 곡선 (도 20b)은 phrGFP-벡터 대조군과 비교하였을 때, 세포 표면 상의 MUC16c114의 존재가 EGFR을 안정화시켰다는 것을 나타낸다. 이러한 효과는 SKOV3-안정적인 MUC16c114 클론 선택과 관련이 있을 수 있다는 가능성을 배제시키기 위해, 테트라시클린 유도성 MUC16c114 시스템을 사용하였다. 도 20c에 제시된 바와 같이, 공 phrGFP 벡터 또는 안정적인 CMV 유도성 MUC16c114 발현 벡터로 형질감염된 대조군 SKOV3 세포의 경우, 24시간 동안의 테트라시클린 노출이 매트리겔 침입에는 어떤 영향도 미치지 않았다. MUC16c114 테트라시클린 유도성 시스템에서, 테트라시클린 노출은 안정적인 형질감염체, 대조군 및 MUC16c114, 둘 모두와 유사한 MUC16c114 의존성 매트리겔 침입을 유도하였다. EGFR 발현을 감소시킨 SKOV3 세포 내로 도입된 shRNA 작제물의 안정적인 발현 (shEGFR)을 통해 EGFR에 대한 요건을 조사하였다. shEGFR-형질감염된 세포에 대한 단일 세포 클론, 둘 모두, 현저히 감소된 매트리겔 침입을 보였다. 상기 두 shEGFR 세포주에서의 테트라시클린 유도성 MUC16c114 발현은 SKOV3-MUC16c114 세포주와 비교하였을 때, 매트리겔 침입에 대하여 최소로 영향을 미쳤고, 이를 통해 SKOV3-MUC16c114 유도성 매트리겔 침입은 EGFR 발현에 상호 의존하였다는 것을 확인할 수 있었다. CHX로 처리된 테트라시클린 유도성 SKOV3-MUC16c114에서 웨스턴 블롯팅에 의해 EGFR의 안정성을 연구하고, β-액틴과 비교하였다. 도 20c에 제시된 바와 같이, 유도되지 않은 MUC16(-) SKOV3 세포에서는 24시간 동안의 CHX 노출을 통해 전체 EGFR 단백질이 지속적으로 감소되었다. SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포의 테트라시클린 유도 후 동일 실험을 수행하였을 때, CHX 유도성 EGFR 손실률은 감소되었다. MUC16은 세포의 EGFR 함량을 안정화시켰을 뿐만 아니라, 이는 유도되지 않은 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포와 비교하였을 때, 테트라시클린 유도성 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포에서 pEGFR 발현 수준을 안정화시켰다 (도 21).
6.3.11.2 단일클론 항체 (
mAb
) 개발을 위한
에피토프
모방체로서의
동종 N-당펩티드의 합성
MUC16c114의 N24 및 N30 부위에서의 N-당화가 MUC16 작용에 중요한 요건인 것으로 확인되었는 바, SKOV3-MUC16c114 세포주로부터 정제된, N1 및 N24에 아스파라긴 돌연변이에 대한 것으로 알라닌을 함유하는 MUC16c114 돌연변이화된 당펩티드의 글리칸 프로파일을 분석하였다 (도 22). 따라서, 정제된 상기 당펩티드는 N-당화를 위한 단일의 아스파라긴 잔기 (N30)를 함유하였다. 정제된 당펩티드의 글리콤 분석은 도 22a에 제시되어 있다. 대개는, 최소 반복 단위로서, 푸코스 및 각종의 만노스 모이어티가 부착되는, 공통된, 인접한 키토비오스 (GlcNAc2) 이당류를 공유한 말단절단된 당화된 종으로 구성된 다양한 N-당화 패턴을 특징으로 하였다 (도 22a).
중요한 N30 당화 부위를 포함하는 MUC-16-엑토도메인 에피토프를 표적화하는 항체가 종양 성장 및 침입을 비롯한, MUC16 발현의 유해한 효과를 감소시키면서, 갈렉틴 격자와의 MUC16 상호작용을 억제시킬 수 있다는 가설이 제기되었다. 따라서, 상기 N30 부위에서 키토비오스로 당화된, MUC16 엑토도메인 내의 다양한 길이 (즉, 55, 18 및 15개의 아미노산 길이; 각각 서열 번호: 129, 131, 130)의 합성 펩티드 항원을 디자인하였다. 더욱 크고, 더욱 복잡한 N-글리칸에 공통된 최소 모티프일 뿐만 아니라, 키토비오스 이당류는 또한 펩티드 특이성을 보유하는, 글리칸에 대한 항체를 유도하기 위해서는 기본 펩티드가 더욱 잘 노출될 수 있도록 하여야 한다.
55-mer MUC16-엑토도메인 N-당펩티드 (GlcNAc2-55-mer; 서열 번호: 129)의 합성은 고도의 수렴성을 띠었고, 용이하게 보호된 전장의 펩티드 (55-mer)와 키토비오스 아민 사이의 커플링, 이어서, 본 발명자들의 한 플라스크에서의 아스파르틸화/탈보호화 방법을 사용한 전역 산성 탈보호화를 포함하였다 (섹션 6.2 및 6.4, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 7 및 20 참조). 유사한 접근법에 따라, 말단 트리만노스 글리칸을 포함하는, 더욱 정교한 Man3GlcNAc2-55-mer 당펩티드 또한 수렴적 아스파르틸화에 의해 제조하였다.
관련된 당화 부위 주변의, 크기가 더 작은 에피토프에 대한 면역 반응을 중점적으로 다루기 위해, 각각 1개의 키토비오스 글리칸 (N30) 및 2개의 키토비오스 글리칸 (N24 및 N30)을 포함하는, 더 짧은 단쇄의 15- 및 18-mer 당펩티드 또한 합성하였고 (도 22c; 각각 서열 번호: 131 및 130), 후자의 경우, 이는 Tn 항원 (GalNAc-α-O-Ser/Thr)의 클러스터 제시와 유사하였고, 이는 일부 mAb에의 결합을 위해 필요한 것으로 밝혀졌다 (섹션 6.2 및 6.4, 및 하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 14-16 참조). 이어서, 상기 당펩티드를 N-말단 시스테인을 통해 KLH 캐리어 단백질에 접합시켜 마우스 백신 접종을 위한 상응하는 면역원을 생성하였다.
6.3.11.3 합성
당펩티드
/
당접합체를
이용한 마우스 백신 접종 및 혈청학적 검정법
섹션 6.2 및 6.4에 기술된 프로토콜에 따라 마우스 백신 접종 및 혈청 수집을 수행하였다. GlcNAc2-55-mer 당펩티드 (서열 번호: 129, 도 22b)로의 3회에 걸친 면역화, 이어서, 키토비오스를 포함하는, KLH-접합된 작제물 (단일당화된 15-mer (서열 번호: 131) 및 이중당화된 18-mer(서열 번호: 130))로 이루어진 동일한 혼합물로의 면역화 후, 10마리의 마우스 중 단 2마리만이 두 55-mer (GlcNAc2 (서열 번호: 129)를 포함하는 것 및 포함하지 않는 것), 둘 모두에 대하여 약한 양성 ELISA 신호를 보였으며, 이는 마우스가 55-mer 면역화에 대하여 제한된 면역 반응을 보였다는 것을 제안하는 것이다. KLH 접합체 (GlcNAc2-15-mer (서열 번호: 131) 및 (GlcNAc2)2-18-mer (서열 번호: 130)), 둘 모두로 2회 더 부스터 면역화하였을 때, 특히 2마리의 마우스 (마우스 7 & 마우스 8)에서 더 짧은 단쇄의 당펩티드에 대해 증진된 면역 반응 (IgG 형)이 나타났다. MUC16 펩티드 골격의 상이한, 비당화된 일부에 대한 4H11 mAb는 15-mer/18-mer 당펩티드에 대하여 어떤 결합도 보이지 않았으며, 이는 뚜렷이 다르게 인식된 에피토프가 마우스 혈청 양성 반응을 분류한다는 것을 시사한다.
마우스 7로부터의 다중클론 혈청을 ELISA에 의해 추가로 특징화하고, MUC16c114 발현을 보인 세포주 및 발현을 보이지 않은 세포주인 수개의 세포주 상에서 FACS에 의해 스크리닝하였다. 상기 세포 분류 연구를 통해, 항-MUC16 4H11 항체 대조군과 유사한, SKOV3-MUC16c114 세포 및 OVCAR3 세포, 둘 모두에 대한 양성 신호를 확인하였다 (하기 섹션 6.3.13에서 언급된 참고 문헌 6 참조). MUC16이 없는 SKOV3-phrGFP 대조군 세포는 마우스 7 혈청과의 결합에 대하여 음성 반응을 보였다.
6.3.11.4
당화에
대한
mAb
선별
마우스 7의 비장을 수거하였고, 비장 세포를 고도의 융합 효율로 하이브리도마 융합 파트너와 융합시켰다. ELISA에 의해 개별 당펩티드에 대한 반응성에 대하여 상청액을 선별하고, 스크리닝하였다 (도 22c). 비록 다중 상청액이 GlcNAc2-15-mer 및 (GlcNAc2)2-18-mer 당펩티드와 반응성을 보이기는 하였지만, 스크리닝된 하이브리도마 상청액 중 어느 것도 ELISA 스크리닝에서 비당화된 펩티드 대비 당화된 펩티드에 대하여 높은 정도의 선택성을 보이지는 않았다. MUC16 특이성은 유지되었고, 양성 상청액 중 어느 것도 키토비오스로 당화된 비관련 펩티드와는 반응성을 보이지 않았다. 4H11 mAb에 의해 인식되는 펩티드 서열과의 중첩은 관찰되지 않았다.
연속 서브클로닝 후, 본 프로세스를 통해, MUC16-당화된 에피토프 및 상동성 비당화된 서열과는 반응성을 보이지만, 음성 대조군으로서 작용한, 키토비오스를 포함하는 비관련 펩티드와는 반응성을 보이지 않은, 다중 키토비오스에 대한 1차 mAb를 수득하였다. 상기 풀 중 4개의 고친화성 항체를 선별하고, 특징화를 위해 추가로 정제하였다.
6.3.11.
5 항
-
MUC16
N30
당화
표적화된
/그에 대한
mAb의
특징화
ELISA에 의한 4개의 대표적인 항체에 대한 확인 특징화 연구 결과는 도 23a에 제시되어 있다. 다양한 합성 펩티드에의 후보 항체의 결합을 평가하고, MUC16-엑토도메인 펩티드 골격을 인식하는 4H11 항체의 결합과 비교하였다. 비관련 키토비오스가 연결된 펩티드는 선별된 항-글리칸-MUC16 항체 중 어느 것에 의해서도 유의적인 결합을 보이지 않았다. 후보 항체 모두 두 MUC16-유래 15-mer (즉, 비당화된 펩티드 및 상응하는 키토비오스 당펩티드)에 대하여 유사한 결합 친화도를 보였다. 단일 GlcNAc, 말단 트리만노스-키토비오스 (Man3GlcNAc2), 및 푸코실화된 키토비오스 (GlcNAc2Fuc)를 비롯한, 대안적 당 모이어티를 포함하는 추가의 합성 당펩티드는 면역화에 사용된, 키토비오스가 연결된 MUC16 펩티드에 대한 항체 반응성을 실질적으로 변경시키지 않았다.
각 항체를 또한 차별적으로 당화된 MUC16 펩티드를 발현하는 세포주로 이루어진 확장된 패널에서 글리칸-MUC16c114 및 글리칸-MUC16c344 특이성에 대해서도 시험하였다 (하기 표 11). 본 연구에서, SKOV3-phrGFP 형질감염체를 SKOV3-MUC16c114 (전체 N-당화), SKOV3-MUC16N24c114 돌연변이체 (N24 당화 부위 부재), SKOV3-MUC16N30c114 (N30 당화 부위 부재), 및 SKOV3-MUC16N1 -N24- N30c114 (N1, N24, 또는 N30 당화 부위 부재)와 비교하였다. SKOV3-MUC16c114는 N1, N24, 및 N30에서 N-당화될 수 있는, MUC16의 말단절단된 형태를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. SKOV3-MUC16N24c114는, 서열 번호: 150의 Asn1800에 상응하는 아미노산 위치가 아스파라긴에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하고, 이에, 상기 위치에서 N-당화될 수 없는 것인, MUC16의 말단절단된 돌연변이체 형태를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. SKOV3-MUC16N30c114는, 서열 번호: 150의 Asn1806에 상응하는 아미노산 위치가 아스파라긴에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하고, 이에, 상기 위치에서 N-당화될 수 없는 것인, MUC16의 말단절단된 돌연변이체 형태를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. SKOV3-MUC16N1-N24-N30c114는, Asn1777, Asn1800, 및 Asn1806에 상응하는 아미노산 위치가 아스파라긴에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하고, 이에, 상기 위치에서 N-당화될 수 없는 것인, MUC16의 말단절단된 돌연변이체 형태를 발현하는 SKOV3 세포를 지칭한다. ELISA 데이터와 같이, 본 결과는 MUC16 특이적 표적화가 존재하였다는 것을 시사하였다.
그러나, ELISA 데이터와는 대조적으로, MUC16 엑토도메인에서 N24 및 N30 당화 부위, 둘 모두의 손실은 당화 표적화된 항체 반응을 감소시킨 반면, 4H11 항체에 대한 반응성은 유지되었고, 이로써, 세포 표면 SKOV3-MUC16c114의 존재가 확인되었다. 344개의 아미노산까지 연장된 MUC16 C-말단 쇄를 포함하는 세포 (예컨대, SKOV3-MUC16c344) 또한 N24 또는 N30 당화에 대한 유사한 요건을 가졌다 (표 11). 추가로, 글리칸-MUC16 엑토도메인에 대한 항체와의 반응성이 MGAT5의 하향조절에 의해 감소되지 않았으며 (표 11), 이를 통해 더욱 복잡한 분지 형성과는 상관없이, N24/N30 부위의 키토비오스가 전체 세포와의 항체 결합에 기여한다는 것을 확인할 수 있다.
특징화된 4개의 대표적인 MUC16 당화 항체 (18C6, 10C6, 19C11, 7B12)를 4H11과 함께 결합 친화도 (하기 표 12), 및 SKOV3-MUC16c114 형질감염체를 이용한 매트리겔 검정법에 의한 상기 항체가 침입에 대해 미치는 효과에 대하여 평가하였다. 도 23b-23d에 제시된 바와 같이, 새로 개발된 항체는 매트리겔 침입을 광범위하게 억제시킨 반면, 4H11은 SKOV3-MUC16c114 매개 침입을 차단시킬 수 있는 능력이 없는 그의 무능력에 의해 구별되었으며, 이는 MUC16 엑토도메인 중의 당화된 펩티드 에피토프를 표적화하는 상기 항체가 가깝게 인접해 있는 에피토프를 표적화하는 항체보다 MUC16의 중요한 생물학적 특성들 중 일부를 더욱 잘 억제시켰다는 것을 시사하는 것이다. MUC16 당화 항체는 모두 천연, 전장의 MUC16을 발현하는 난소암 세포, 예컨대, CAOV3 및 OVCA-433 세포에서 억제성이었다. 이는 N24/N30 당화 부위가 MUC16의 증진된 침입 특성에 중요한 반면, 다른 MUC16 N- 및 O-당화 부위의 존재는 상기 중요한 에피토프를 차단하는 MUC16 당화 항체를 극복하는 데에는 불충분하였다는 것을 제안한다. 어느 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 갈렉틴-3의 MUC16에의 N24/30 결합의 항체 억제가 또한 EGFR 세포 표면 안정화도 손상시키는 것으로 예측될 것이다. 도 23b-23d는 이들 항체들 중 하나 (10C6)가 세포 배양물 내로 도입되었을 때, 테트라시클린 유도성 SKOV3-MUC16c114(tet)의 EGFR 안정화 효과는 극복되었고, CHX에 노출된 세포에서 EGFR 손실률은 MUC16c114 발현을 보이지 않는 유도되지 않은 SKOV3-MUC16c114 ( tet ) 세포주의 것과 유사하였다는 것을 입증한다. 난소암 조직 마이크로어레이에서 항체를 이용한 면역조직화학법 염색 또한 조사하였다. 도 23e에 제시된 바와 같이, 글리칸에 대한 MUC16 엑토도메인 항체들은 각각 4H11 거동과 유사하게, 다른 기질 조직과는 제한된 상호작용을 하면서, 파라핀 고정 조직 중의 혈청 난소암 세포에 결합하였다. 마지막으로, 면역손상된 마우스에서 10C6 항체가 SKOV3-MUC16344에 미치는 효과를 시험하였다. 다중 N- 및 O-당화 부위를 가진 MUC16-양성 종양 세포에서의 항체 효과에 대한 더욱 엄격한 시험으로서 SKOV3-MUC16c114 세포 대신, SKOV3-MUC16c344 세포를 사용하였다. 10C6 항체는 MUC16c344 세포에 의한 매트리겔 침입을 감소시켰고 (도 23f), 주 2회에 걸쳐 종양을 포함하는 마우스에게로 투여되었을 때에는 마우스 옆구리에서의 SKOV3-MUC16c344 종양 세포의 성장을 유의적으로 감소시켰다 (도 23g).
6.3.11.1
MUC16
및 다른 세포 표면 단백질의
갈렉틴
-의존성 공동
국재화
MUC16 안정화 EGFR은 난소암 세포 침입의 중요한 구동자인 것으로 보이며, 이러한 상호작용은 EGFR, 적절하게 N-당화된 MUC16 단백질 엑토도메인, 및 갈렉틴-3의 존재에 의존한다. 정제된 단백질을 이용하여 상기 상호작용을 평가함으로써 이들 세 단백질 사이의 필요한/충분한 3자간 상호작용을 확립하였다. 본 목적을 위해, (상호작용의 MUC16 부분으로서) (인간 배아 신장 [HEK] 프리스타일 293F 세포에서 생산된) 정제된 MUC16c57 -114-pFUSE, (HEK293 세포에 의해 생산된) 정제된 EGFR, 및 정제된 갈렉틴-3 (LGALS3; HEK293 세포에 의해 생산) 단백질을 사용하였다. 이들 단백질은 인간 세포에서 생산되었기 때문에, 전형적인, 천연 당화된 종을 포함할 것으로 예측되었다. 어느 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 세 단백질은 면역공침전에 의해 확인될 수 있는 이형복합체(heteromer)를 형성할 것이라는 가설이 제기되었다. 도 24a에는 상기 면역공침전의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 검출된 세 단백질은 각각 좌측 세 레인에서 직접 면역블롯으로 나타난다. 아가로스 단백질 A/G PLUS 비드 사용을 통해, MUC16c57 -114-pFUSE 단백질이 단백질 A/G PLUS-접합된 비드에 결합하였고, 이는 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되었을 때, 용출액 중에 존재하였다는 것을 알 수 있다. 갈렉틴-3 (LGALS3) 또한 존재할 때, EGFR은 오직 MUC16c57 -114-pFUSE와 함께 조합된 용출액 중에 존재하였다. 항체 18C6는 갈렉틴-3의 N-당화 결합 부위를 차단함으로써 EGFR-MUC16 상호작용을 제거하였다 (도 24a 참조). 살아있는 세포에서의 EGFR 및 MUC16의 공동 국재화를 확인하기 위해 직접적인 분자 이중 면역형광 영상화 또한 사용하였다. 도 24b 및 도 25a에 제시되어 있는 바와 같이, EGFR 및 MUC16은 OVCAR3, SKOV3-MUC16c344, 및 SKOV3-MUC16c114 세포에서 밀착 공동 국재화되어 있었다 (도 24b 및 도 25a에서 화살표 참조). MUC16은 갈렉틴-3과 조합하여 MUC16-양성 난소암 세포의 표면 상의 EGFR과 회합하였다는 것이 본 연구를 통해 강력하게 확인되었다. 어느 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 다수의 성장 증진 수용체는 당화되어 있는 바, 렉틴-의존성 MUC16 세포 표면 효과는 다른 N-당화된 단백질도 포함할 수 있고, EGFR로만 제한되지 않는다고 판단되었다. 인테그린 단백질이 대개 암에서 변경되고, SRC 인산화 및 다른 하류 효과를 일으키는 기질-상피 상포작용에 의해 개시되는 "아웃사이드 인" 신호전달에 참여한다. 도 24c에는 빈번하게는 암 발생 및 진행과 연관된 인테그린 성분인 인테그린 β1과의 MUC16 상호작용이 도시되어 있다. EGFR 경우와 같이, 정제된 MUC16c57 -114-pFUSE는 갈렉틴-3에 의존하는 방식으로 인테그린 β1에 결합하였고, 이러한 이종삼량체 상호작용은 세 단백질 모두를 필요로 하였다. EGFR 경우와 같이, 상호작용은 항-MUC16c114 당화 부위 차단 항체인 18C6에 의해 완전히 차단되었다. MUC16 및 인테그린 β1의 공동 국재화 또한 수개의 난소암 세포주에서의 이중 면역형광에 의해 확인되었다 (도 24d 및 도 25b). 따라서, MUC16-엑토도메인 펩티드 에피토프 상의 중요한 부위에서의 N-당화가 렉틴 특이적인 방식으로 세포 표면 단백질 수용체와의 상호작용을 매개함으로써 매트리겔 침입, PI3K/ERK 및 SRC 경로의 활성화 뿐만 아니라, 면역손상된 마우스에서의 증진된 MUC16-양성 종양 성장을 비롯한, 악성 종양 거동의 특징을 발생시켰다.
어느 특정 기전으로 제한하지 않으면서, 암 관련 뮤신인 MUC16의 기계론적인 모델, 및 그가 난소암 세포 거동에 미치는 효과가 도 26에 제시되어 있다. 도 26a에서, MUC16은 갈렉틴-3을 통해 EGFR 및 인테그린 β1에 결합하여 안정성, 및 성장 및 침입을 촉진시키는 "인사이드 아웃" 신호를 증진시킨다. MUC16 엑토도메인 N-당화 부위가 돌연변이화되었거나, 또는 MGAT5 활성이 억제되었을 때 (도 26b), 결합은 방해되고, EGFR/인테그린 신호는 감소된다. 유사하게, 갈렉틴-3 단백질 발현이 억제되었을 때 (도 26c), 분자 회합은 손실되고, 신호 및 침입은 감소된다. 마지막으로, MUC16-엑토도메인 키메라 항체 또는 키메라 "TRAP" LGALS3 분자가 분자 상호작용을 방해하였을 때, 암 세포는 관찰된 MUC16 종양 촉진 특정들 중 어느 것도 보이지 않는다 (도 26d).
6.3.12 논의
MUC16 및 다른 테더링된 뮤신, 예컨대, MUC1 및 MUC4는 3T3 세포를 형질전환시킬 수 있고, 이는 유해한 결과와 연관되어 있다. 암에서 비정상적으로 발현된 뮤신의 기전은 복잡하고, 다양하다. N-당화 패턴이 국소 환경에 대한 반응으로 세포 성장에서 중요한 역할을 한다는 것은 널리 기술되어 있다. 당단백질 패턴의 다양성은 환경에 의존적인, 골지 기반 당화를 통한 헥소사민 유동에 의해 영향을 받는다. 일반 성장 인자 수용체, 예컨대, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자 수용체 (IGF1R), 및 PDGFR은 먼저 영양소에 의존하는 방식으로 우선적으로 당화되고, 상기 대량으로 당화된 수용체는 세포 표면으로 우선적으로 전달된다. 그에 반해, 억제성 수용체, 예컨대, TGF-β는 더 적은 수의 N-당화 부위를 가지며, 더 나중에 세포 표면 상에 존재하게 되며, 그 결과로서, 성장 프로그램은 억제된다 (하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 12 참조). 난소암에서, EGFR 발현은 침입성 거동과 연관되어 있으며, EGFR 신호전달은 수용체의 당화 상태 및 렉틴에 대한 N-당화된 종의 친화도에 의존한다 (하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 2 참조). 효소 MGAT5는, 암 세포에서 과다발현되는 중요한 렉틴인 갈렉틴-3에 대하여 가장 높은 친화도를 가지는 테트라안테너리, 분지형 N-글리칸의 합성에 중요한 것으로 보인다 (하기 섹션 6.3.13의 참고 문헌 17 참조).
본 실시예는 MUC16 발현과 연관된 거동은 세포 표면 대비 MUC16의 가장 가까운 인접한 엑토도메인 영역 상의 특이적인 N-당화 부위에서의 상기 프로세스를 통해 매개된다는 증거를 제공하였다. 침입, 온코진 활성화, 및 면역손상된 마우스에서의 증가된 종양 성장을 촉진시키기 위한 갈렉틴-3 및 세포 표면 단백질과의 고친화성의 상호작용을 위해서는 N-당화의 MGAT5 의존적 패턴이 요구되었다. 특히, 절단 후 유지되고 있는 MUC16의 엑토도메인 상의 가장 가까운 인접한 부위의 N-당화가 상기 상호작용을 위해 결정적으로 중요하였다. 상기 N-당화 부위를 제거하거나, 더미 수용체를 가지는 부위를 차단하거나, 또는 그의 전체 N-당화를 간섭한 개입 모두 MUC16의 형질전환 효과를 손상시켰다. 이러한 형질전환 효과는 MUC16 단독에 뿐만 아니라, 갈렉틴-3 및 인접한 N-당화 부위에 있는 다른 세포 표면 단백질과 N-당화된 MUC16의 상호작용에도 의존하는 것으로 보인다. MUC16 엑토도메인 발현은 성장 및 침입의 매개인자인 EGFR을 안정화시키는 것으로 밝혀졌고, 모체 SKOV3phrGFP 세포와 비교하였을 때, SKOV3-MUC16c114 세포 표면 상에서의 그의 상주를 연장시켰다. 오직 단 하나의 N-당화 부위만을 유지하는, 간소화된 MUC16 당펩티드 모델에서도조차 당화의 확률론적 성질에 기인하여 그 결과로, 모두 공유된 키토비오스 줄기를 통해 MUC16 단백질 골격에 연결된 다양한 N-글리칸이 존재하게 되었다. 따라서, (N24/N30 부위에서) 키토비오스가 연결된 MUC16 엑토도메인의 MUC16c114 글리칸-펩티드 에피토프에 대한 항체가 제조되었다. 이들 새 항체 (MUC16 당화 항체)는 MUC16 증진된 침입, 온코진 활성화 및 생체내 종양 성장을 차단하였다. 중요하게는, 이들 MUC16 당화 항체는 전장의 MUC16 발현 뿐만 아니라, 더 짧은 단쇄의 MUC16 C-말단을 포함하는 시험, 말단절단된 작제물 발현을 보이는 세포에서 MUC16 관련 특성을 억제시켰다. MUC16 당화 항체는 CHX의 존재하에서 난소암 세포 표면의 EGFR 안정화를 간섭하였고, 누드 마우스에서 이식된 성장을 손상시켰다. 추가로, MUC16 당화 항체의 효과는 재조합 갈렉틴-3의 존재하에서 정제된 EGFR 또는 인테그린 β1과의 정제된 MUC16의 상호작용을 방해하였다.
본 실시예가 암에서 뮤신 과다발현의 역할에 대한 이해를 밝힌다. 렉틴 매개의, 저친화성 다중 분자 복합체의 형성을 통해, MUC16은 당화 의존성 방식으로 "아웃사이드 인" 신호전달을 증진시킬 수 있다. 최대 효과를 담당하는 특이적인 N-당화 부위는 독특하고, 세포 표면에 가깝게 존재하는 반면, 다른 더욱 원거리에 있는 N-당화 부위는 덜 중요할 수 있다. 갈렉틴-3 억제제가 임상 개발 중에 있지만, 더미 수용체 "갈렉틴-3-TRAP" 작제물 또는 말단절단된 "MUC16-TRAP" 분자는 본 실시예의 시험관내 모델에서 유사한 효과를 보였다. 본 실시예에서 확인된 MUC16 당화 항체는 MUC16의 형질전환 효과를 억제시켰다.
6.3.13 참고 문헌
6.4
실시예
4: 화학적
보충 정보
본 실시예는 실시예 2 및 3 (섹션 6.2 및 6.3)에서 사용된 특정 방법 및 기술된 특정 실험에 관한 더욱 상세한 설명; 및 (b) 실시예 2 및 3 (섹션 6.2 및 6.3)과 비교하는 추가 정보를 제공한다.
6.4.1 일반 물질 및 방법
상업적으로 이용가능한 모든 물질 (알드리치, 플루카(Fluka), 노바바이오켐(Novabiochem))은 추가 정제 없이 사용하였다. N-α-Fmoc 보호된 아미노산, 슈도프롤린 디펩티드, 옥시마 퓨어(Oxyma Pure) 및 노바신 TG 시에버(NovaSyn TG Sieber) 수지는 노바바이오켐으로부터 구입하였다. 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (HATU)는 진스크립트(Genscript)로부터 구입하였다. (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyAOP)를 오크우드 프로덕츠, 인크.(Oakwood Products, Inc.)로부터 구입하였다. 키토비오스 옥타아세테이트는 카르보신쓰 리미티드(Carbosynth Limited)로부터 구입하였다. TCEP 용액 (0.5 M, 중성 pH) 및 이종이작용성 링커 술포-GMBS는 피어스, 써모사이언티픽(ThermoScientific)으로부터 구입하였다. 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)을 비롯한 다른 모든 시약은 알드리치로부터 구입하였다. 모든 용매는 시약 등급 또는 HPLC 등급 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))이었다. 무수 테트라히드로푸란, 디에틸 에테르, 디클로로메탄, 톨루엔, 및 벤젠은 (아르곤 대기하에 중성 알루미나 칼럼을 거쳐 통과된) 건식 용매 시스템으로부터 수득하였고, 추가로 건조시키지 않고 사용하였다.
미리 정제된 건식 아르곤 대기하에서 반응을 수행하였다. 대기 및 수분 민감성 액체 및 용액을 시린지를 통해 옮겨 놓았다. 톨루엔과의 물의 공비 제거를 통해 적절한 탄수화물 시약을 건조시켰다. 350℃에서 분자체를 활성화시키고, 사용 직전에 파쇄시킨 후, 진공하에 화염 건조시켰다. 유기 용액을 감압하에 30℃ 미만인 온도에서 회전식 증발에 의해 농축시켰다. 브루커 어드밴스(Bruker Advance) DRX-600 MHz 분광계 상에서 NMR 스펙트럼 (1H 및 13C)을 기록하고, TMS 또는 잔류 용매를 참조하였다. JOEL JMS-DX-303-HF 질량 분광계 또는 워터스 마이크로매스 ZQ(Waters Micromass ZQ) 질량 분광계를 이용하여 저해상 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. E. 머크(E. Merck) 실리카 겔 60 F254 플레이트 상에서 분석적 TLC를 수행하고, UV 광 (254 nm)하에, 또는 세륨 암모늄 몰리브데네이트 (CAM) 또는 메탄올 중 5% 황산을 이용한 염색에 의해 시각화하였다. E. 머크 230-400 메쉬 실리카 겔 60 상에서 실리카 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다.
6.4.1.1
UPLC
/LC-MS 분석 및 RP-
HPLC
정제.
모든 역상 크로마토그래피 분리는 물 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA) (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.04% TFA로 구성된 이동상을 포함하였다. 0.3 mL/min 유속으로, 엑퀴티(Acquity) UPLC BEH C18/C8/C4 칼럼 (1.7 ㎛, 2.1 x 100 mm)이 장착된, 포토다이오드 검출기 및 단일 사중극자 질량 검출기가 있는 워터스 엑퀴티TM 울트라 프리포먼스 리퀴드 크로마토그래피(Waters AcquityTM Ultra Preformance Liquid Chromatography) 시스템 상에서 UPLC-MS 분석에 의해 반응 진행을 모니터링하였다. 0.2 mL/min의 유속으로, 바리안 마이크로소르브(Varian Microsorb) C18 칼럼 (150 x 2.0 mm), 바리안 마이크로소르브 C8/C4 칼럼 (250 x 2.0 mm) 또는 워터스 X-브릿지 C18 칼럼 (150 x 2.1 mm)을 사용하여 워터스 2996 포토다이오드 어레이 디텍터(Waters 2996 Photodiode Array Detector)가 장착된 워터스 2695 세퍼레이션즈 모듈(Waters 2695 Separations Module) 상에서 분석적 LC-MS 분석을 수행하였다. 16.0 mL/min의 유속으로, 애질런트 다이나맥스(Agilent Dynamax) 역상 HPLC 마이크로소르브 C18/C8/C4 칼럼 (250 x 21.4 mm), 또는 워터스 X-브릿지 C18 칼럼 (150 x 19.0 mm)을 사용하여 라이닌(Rainin) UV-1 검출기가 장착된 라이닌 HPLC 용매 전달 시스템 상에서 분취용 규모의 HPLC 정제를 수행하였다.
6.4.2 실험 방법
6.4.2.1
Fmoc
-기반 고체상 펩티드 합성 (
SPPS
)
CEM 리버티 마이크로웨이브 펩티드 신디사이저(CEM Liberty Microwave Peptide Synthesizer) 상에서 자동화 펩티드 합성을 수행하였다. 표준 Fmoc 프로토콜하에 노바신 TG 시에버 수지 상에서 펩티드를 합성하였다. 데블록 혼합물은 20% 피페리딘/DMF 중 옥시마 퓨어 (0.1 M)로 구성되었다. 노바바이오켐으로부터 입수한 하기 Fmoc 아미노산을 사용하였다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Dmcp)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Asp(OPp)-OH, Fmoc-Asp(OAllyl)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Dmcp)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH. 하기 Dmb (2,4-디메톡시벤질) 및 슈도프롤린 디펩티드 (노바바이오켐)를 사용하였다: Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH, Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH, Fmoc-Phe-Thr(ψMe,MePro)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,MePro)-OH.
6.4.2.2 펩티드-수지의 N-말단
아세틸화
0.1 mmol 규모로의 자동화 합성 완료시, 펩티드-수지를 DMF (2 mL)로 세척하고, 펩티드 합성 베쓸에 넣고, DMF (2 mL) 중 무수 아세트산 (188 ㎕, 2 mmol) 및 DIEA (384 ㎕, 2.2 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 1시간 동안 가볍게 질소 버블링하여 진탕시킨 후, DMF 및 CH2Cl2로 세척한 후, 탈알릴화시켰다.
6.4.2.3 아스파르트산
측쇄
, Asp(
O알릴
)
의 수지 상에서의
탈알릴화
N-아세틸화된 수지-결합된 펩티드 (0.1 mol)를 DMF/CH2Cl2 (4 mL, 1:1) 중 Pd(PPh3)4 (7.5 mg, 6.5 ㎛ol) 및 페닐실란 (75 ㎕, 0.6 mmol)으로 처리하였다. 가볍게 질소 버블링을 20분 동안 수행한 후, Pd(PPh3)4/페닐실란 처리를 2회 반복하였다. 이어서, 펩티드-수지를 DMF, CH2Cl2 및 메탄올로 세척하고, 진공 건조시켰다.
6.4.2.4 수지로부터의 절단 [및
적용가능한
경우, 동시 Asp(
O
-2-
Ph
i
Pr
)
측쇄
탈보호화]
건조 후, 펩티드-수지를 5 사이클 x 5 min으로 절단 칵테일 (1% TFA/CH2Cl2, 4 mL)에 가하고, 상기 프로세스를 4회 반복하였다. 추가의 절단 순서는 1.5% TFA/CH2Cl2 (4 mL, 5 사이클 x 5 min), 및 2% TFA/CH2Cl2 (4 mL, 5 사이클 x 5 min)로 처리하는 것을 포함하였다. 절단 용액의 각각의 일부분을 개별적으로 빙냉 Et2O로 풀링하고, 농축시켰다. 상응하는 오일성 잔류물을 최소량의 트리플루오로에탄올 중에 재현탁시키고, 물로 침전시켰다. 생성된 혼합물을 즉시 동결건조시켜 C-말단 아미드를 포함하는 조 보호된 펩티드를 수득하였다.
6.4.2.5
랜스베리
아스파르틸화
, 이어서, 칵테일 R을 이용한 산 불안정성 보호기의 제거를 통한
글리칸
아민과
부분적으로 보호된 전장의 펩티드 (55-mer)의 커플링
부분적으로 보호된 전장의 펩티드 (1.0 당량) 및 글리칸 아민 (키토비오스: 4.0 당량; Man3GlcNAc2 1.6 당량)을 조합하고, 무수 DMSO에 용해시켰다. 상기 혼합물에 새로 제조된, DMSO 중의 PyAOP (4.0 당량) 용액을 첨가한 후, DIEA (6.0 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 1 mL의 빙냉수 (0.05% TFA)를 첨가하여 퀀칭하였다. 형성된 침전물을 원심분리에 의해 단리시키고, 물/CH3CN (1:1, 0.05% TFA) 중에 재현탁시키고, 즉시 동결건조시켰다.
이어서, 보호된 당펩티드를 2시간 동안 칵테일 R (90% TFA, 5% 티오안니솔, 3% 에탄디티올, 2% 아니솔) (1 mL)로 처리하여 전역 산성 탈보호화하였다. 잔류물을 빙냉 Et2O (12 mL)로 침전시키고, 생성된 현탁액을 원심분리하여 백색 펠릿을 수득하였다. 상청액을 경사분리하고, 펠릿을 빙냉 디에틸 에테르 (12 mL)로 연마하였다. 상기 프로세스를 총 3회에 걸쳐 반복하고, 생성된 침전물을 물/CH3CN (1:1, 0.05% TFA)에 가용화시키고, 동결건조시켰다. 상응하는 조 당펩티드를 RP-HPLC에 의해 정제하였다.
6.4.2.6
랜스베리
/이중
랜스베리
아스파르틸화
, 이어서, 산 불안정성 보호기의 제거를 통한
키토비오스
아민과
부분적으로 보호된, 크기가 작은 펩티드 (15- 및 18-mer)의 커플링
부분적으로 보호된 펩티드 (1.0 당량) 및 키토비오스 아민 (3.0 당량/7.0 당량 (이중 랜스베리 아스파르틸화의 경우))을 조합하고, 무수 DMSO에 용해시켰다. 상기 혼합물에 새로 제조된, DMSO 중의 PyAOP (4 당량/6 당량 (후자의 경우)) 용액을 첨가한 후, DIEA (각각 6 당량/8 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2.5시간 동안 교반하고, 1 mL의 빙냉수 (0.05% TFA)를 첨가하여 퀀칭하였다. 형성된 침전물을 원심분리에 의해 단리시키고, 물/CH3CN (1:1, 0.05% TFA) 중에 재현탁시키고, 즉시 동결건조시켰다.
이어서, 보호된 당펩티드를 2시간 동안 TFA 칵테일 (94% TFA, 2.5% H2O, 2.5% EDT, 1% TIPSH) (1 mL)로 처리하여 전역 산성 탈보호화하였다. 잔류물을 빙냉 Et2O (12 mL)로 침전시키고, 생성된 현탁액을 원심분리하여 백색 펠릿을 수득하였다. 상청액을 경사분리하고, 펠릿을 빙냉 디에틸 에테르 (12 mL)로 연마하였다. 상기 프로세스를 총 3회에 걸쳐 반복하고, 생성된 침전물을 물/CH3CN (1:1, 0.05% TFA)에 용해시키고, 동결건조시켰다. 상응하는 조 당펩티드를 RP-HPLC에 의해 정제하였다.
6.4.
2.7 15
/18-mer
당펩티드의
KLH
-접합
먼저 KLH를 pH 7 포스페이트 완충제 염수 (PBS) 중에서 이종이작용성 가교제 술포-GMBS와 함께 인큐베이션시켰다. 크기 배제 크로마토그래피 (각각 바이오-겔(Bio-Gel) P-10 미세 칼럼 통과)에 의해 비접합된 가교제를 제거한 후, 말레이미드-활성화된 KLH를 수득하였다. 말단 티올 관능기를 포함하는, 새로 탈보호화된 (당)펩티드를 pH 7 PBS 중에서 말레이미드 함유 KLH와 함께 혼합하고, 6시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이후, 아미콘 울트라-4(Amicon Ultra-4) 원심분리 필터 (50,000 분자량 컷 오프)를 사용하여 반응하지 않은 (당)펩티드를 제거하였다. 마지막으로, PBS 용액으로서 상응하는 KLH 접합체를 수득하였다.
6.4.3 전장의
muc16
당펩티드
(55-mer)의 합성
6.4.3.1
키토비오스를
포함하는, 전장의
당펩티드의
합성
섹션 6.4.2.1에 따른 자동화 합성 완료시, 펩티드-수지를 N-아세틸화 및 탈알릴화하여 (각각 섹션 6.4.2.2 및 섹션 6.4.2.3 참조) 수지로부터의 절단 후 (섹션 6.4.2.4 참조), Asp30 측쇄에 유리 카르복실산을 포함하는 부분적으로 보호된 펩티드 p55-mer[N1-S55]를 수득하였다. 5→12% MeOH/CH2Cl2로 용출시키는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 상기 조 펩티드의 분획을 정제하여 동결건조시 백색 고체로서 펩티드 p55-mer[N1-S55] (70 mg)를 수득하였다. 도 27a에는 측쇄 보호된 N-아세틸화된 55-mer 펩티드 아미드가 도시되어 있다. 도 27b에는 당펩티드 p55-mer[N1-S55]에 대한 UPLC 분석으로부터의 UV 트레이스 및 ESI-MS가 도시되어 있다.
섹션 6.4.2.6에 따라, 펩티드 p55-mer[N1-S55] (20 mg, 2.0 ㎛ol) 및 키토비오스 (GlcNAc2) 아노머 아민 (3.5 mg, 8.1 ㎛ol)을 조합하고, 무수 DMSO (100 ㎕)에 용해시켰다. DMSO (30 ㎕) 중의 PyAOP (4.3 mg, 8.1 ㎛ol) 용액을 첨가한 후, DIEA (2.0 ㎕, 12.2 ㎛ol)를 첨가하였다. 황금색 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 1 mL의 빙냉수 (0.05% TFA)를 첨가하여 퀀칭하고, 냉동시키고, 동결건조시켰다.
이어서, 섹션 6.4.2.6에 기술된 바와 같이, 보호된 당펩티드를 2시간 동안 칵테일 R (1.0 mL)에 가하고, 빙냉 Et2O로 침전시키고, 원심분리하고, 재현탁시키고, 동결건조시켰다. 조 펩티드를 25% 아세토니트릴/물 (0.05% TFA) (2 mL) 중에 용해시키고, 30분 동안에 걸쳐 물 (0.05% TFA) 중 25-35% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 X-브릿지 C18 칼럼 상에서 HPLC에 의해 정제하였다. 20분째에 용출된 원하는 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 백색 고체로서 당펩티드 "55-mer(키토비오스)[N1-S55]" (GlcNAc2-55-mer) (3.0 mg, 수율 22%)를 수득하였다 (도 28a). 도 28b는 당펩티드 "55 mer(키토비오스) [N1-S55]" (GlcNAc2-55-mer)에 대한 UPLC 분석으로부터의 UV 트레이스 및 ESI-MS를 제공한다.
6.4.3.2
오당류를
포함하는, 전장의
당펩티드의
합성
섹션 6.4.2.6에 따라, 펩티드 p55-mer[N1-S55] (10 mg, 1.0 ㎛ol) 및 오당류 Man3GlcNAc2 아노머 아민 (1.5 mg, 1.6 ㎛ol)을 조합하고, 무수 DMSO (30 ㎕)에 용해시켰다. 이어서, DMSO (5 ㎕) 중 PyAOP (2.1 mg, 4.1 ㎛ol) 용액을 첨가한 후, DIEA (1.0 ㎕, 6.1 ㎛ol)를 첨가하였다. 황금색 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 1 mL의 빙수 (0.05% TFA)를 첨가하여 퀀칭하고, 냉동시키고, 동결건조시켰다.
이어서, 섹션 6.4.2.6에 기술된 바와 같이, 보호된 당펩티드를 2시간 동안 칵테일 R (1.0 mL)에 가하고, 빙냉 Et2O로 침전시키고, 원심분리하고, 재현탁시키고, 동결건조시켰다. 조 펩티드를 25% 아세토니트릴/물 (0.05% TFA) (2 mL) 중에 용해시키고, 30분 동안에 걸쳐 물 (0.05% TFA) 중 25-35% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 X-브릿지 C18 칼럼 상에서 HPLC에 의해 정제하였다. 18분째에 용출된 원하는 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 백색 고체로서 "55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]" (Man3GlcNAc2-55-mer) (1.5 mg, 수율 20%)를 수득하였다. 도 28a에는 Man3GlcNAc2를 포함하는 55-mer 당펩티드: "55-mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]" (Man3GlcNAc2-55-mer)가 도시되어 있다. 도 29b에는 당펩티드 "55 mer(Man3GlcNAc2)[N1-S55]" (Man3GlcNAc2-55-mer)에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 UV 트레이스 및 ESI-MS를 제공한다.
6.4.4 크기가 더 작은
당펩티드
(15-mer 및 18-mer)의 합성
6.4.4.1
키토비오스
-
단일당화된
15-mer의 합성
섹션 6.4.2.1에 따른 자동화 합성 완료시, 펩티드-수지를 N-아세틸화 및 탈알릴화하여 (각각 섹션 6.4.2.2 및 섹션 6.4.2.3 참조) 수지로부터의 절단 후 (섹션 6.4.2.4 참조), Asp30 (서열 번호: 150의 Asn1806에 상응) 측쇄에 유리 카르복실산을 포함하는 부분적으로 보호된 펩티드 p15-mer[C-G25-V38]을 수득하였다. 도 30a를 참조한다. 상기 펩티드를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
펩티드 p15-mer[C-G25-V38] (10 mg, 3.8 ㎛ol) 및 키토비오스 (GlcNAc2) 아노머 아민 (4.8 mg, 11.3 ㎛ol)을 조합하고, 무수 DMSO (80 ㎕)에 용해시켰다. DMSO (20 ㎕) 중의 PyAOP (5.9 mg, 11.3 ㎛ol) 용액을 첨가한 후, DIEA (2.6 ㎕, 15 ㎛ol)를 첨가하고, 황금색 혼합물을 2.5시간 동안 교반하고, 냉동시키고, 동결건조시켰다. 이어서, 섹션 6.4.2.6에 따라, 보호된 당펩티드를 2시간 동안 TFA 칵테일 (1 mL)에 가하고, 빙냉 디에틸 에테르로 침전시키고, 원심분리하고, 재현탁시키고, 동결건조시켰다. 조 펩티드를 15% 아세토니트릴/물 (0.05% TFA) (2 mL) 중에 용해시키고, 30분 동안에 걸쳐 물 (0.05% TFA) 중 15-35% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 C18 칼럼 상에서 HPLC에 의해 정제하였다. 17분째에 용출된 원하는 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 백색 고체로서 당펩티드 "15-mer(키토비오스)[C-G25-V38]" (GlcNAc2-15-mer) (2.0 mg, 수율 25%)을 수득하였다. 키토비오스-단일당화된 15-mer 당펩티드: 15-mer(키토비오스)[C-G25-V38] (GlcNAc2-15-mer)에 대하여 도 30b를 참조한다. 도 30c에는 당펩티드 "15 mer(키토비오스)[C-G25-V38]" (GlcNAc2-15-mer)에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 UV 트레이스 및 ESI-MS가 도시되어 있다.
6.4.4.2
키토비오스
-
이중당화된
18-mer의 합성
섹션 6.4.2.1에 따른 자동화 합성 완료시, 펩티드-수지를 N-아세틸화하였다 (6.4.2.2 참조). 이어서, 섹션 6.4.2.4에 기재된 방법에 따라 수지로부터의 절단, 및 동시에 OPp 보호기 제거를 수행하여 Asp24 및 Asp30 측쇄 (각각 서열 번호: 150의 Asn1800 및 Asn1806에 상응), 둘 모두에 유리 카르복실산을 포함하는 부분적으로 보호된 펩티드 p18-mer[C-T22-V38]을 수득하였다. 상기 펩티드를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 도 32a를 참조한다.
펩티드 p18-mer[C-T22-V38] (30 mg, 9.1 ㎛ol) 및 키토비오스 (GlcNAc2) 아노머 아민 (27 mg, 63.4 ㎛ol)을 조합하고, 무수 DMSO (150 ㎕)에 용해시켰다. 이어서, PyAOP (28.5 mg, 54.6 ㎛ol)를 DMSO (50 ㎕)에 첨가한 후, DIEA (2.6 ㎕, 15 ㎛ol)를 첨가하고, 황금색 혼합물을 2.5시간 동안 교반하고, 냉동시키고, 동결건조시켰다. 이어서, 섹션 6.4.2.6에 따라, 보호된 당펩티드를 2시간 동안 TFA 칵테일 (1 mL)에 가하고, 빙냉 디에틸 에테르로 침전시키고, 원심분리하고, 재현탁시키고, 동결건조시켰다. 조 펩티드를 15% 아세토니트릴/물 (0.05% TFA) (6 mL) 중에 용해시키고, 30분 동안에 걸쳐 물 (0.05% TFA) 중 15-27% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 C8 칼럼 상에서 HPLC에 의해 정제하였다. 15분째에 용출된 원하는 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 백색 고체로서 당펩티드 "18-mer(키토비오스)2[C-T22-V38]" [(GlcNAc2)2-18-mer] (6.5 mg, 수율 25%)을 수득하였다. 도 32b를 참조한다. 도 32c에는 당펩티드 "18 mer(키토비오스)2[C-T22-V38]" [(GlcNAc2)2-18-mer]에 대한 분석적 HPLC 분석으로부터의 UV 트레이스 및 ESI-MS가 도시되어 있다.
6.5 15
-MER 및 18-MER
MUC16
당펩티드의
KLH
-접합
섹션 6.4.2.7에 기재된 방법에 따라 당펩티드 "15-mer(키토비오스)[C-G25-V38]" 및 "18-mer(키토비오스)2[C-T22-V38]"을 KLH에 접합시켜 상응하는 KLH 접합체, 각각 GlcNAc2-15-mer-KLH 및 (GlcNAc2)2-18-mer-KLH를 수득하였다. 도 33a 및 도 33b를 참조한다.
7. 서열 표
8. 등가물
본 명세서에서 인용된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 공개 문헌 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이 본원에서 참조로 포함된다. 비록 상기 발명은 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예에 의해서 얼마간 상세하게 기술되기는 하였지만, 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 특허청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어남 없이 그에 대하여 특정 변형 및 수정이 이루어질 수 있다는 것이 당업계의 숙련가에게 쉽게 자명해질 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER
<120> ANTI-MUC16 ANTIBODIES AND USES THEREOF
<130> 13542-016-228
<150> 62/134,402
<151> 2015-03-17
<160> 175
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 VH
<400> 1
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 VL
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Asn
100 105
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (KABAT)
<400> 3
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (KABAT)
<400> 4
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (KABAT)
<400> 5
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (KABAT)
<400> 6
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (KABAT)
<400> 7
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (KABAT)
<400> 8
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 9
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met
1 5
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 10
Trp Asp Asp
1
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 11
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 12
Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 13
Leu Val Ser
1
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 14
Ile Arg Glu Leu Thr Arg
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR1 (IMGT)
<400> 15
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met Gly
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR2 (IMGT)
<400> 16
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 HCDR3 (IMGT)
<400> 17
Ser Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR1 (IMGT)
<400> 18
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR2 (IMGT)
<400> 19
Leu Val Ser
1
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 LCDR3 (IMGT)
<400> 20
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser
1 5
<210> 21
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 VH
<400> 21
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 VL
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Lys Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (KABAT)
<400> 23
Thr Val Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (KABAT)
<400> 24
His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (KABAT)
<400> 25
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (KABAT)
<400> 26
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (KABAT)
<400> 27
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (KABAT)
<400> 28
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 29
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met
1 5
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 30
Trp Asp Asp Glu
1
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 31
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 32
Ser Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 33
Tyr Met Ser
1
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 34
Ser Leu Glu Tyr Pro Leu
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR1 (IMGT)
<400> 35
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR2 (IMGT)
<400> 36
Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys
1 5
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 HCDR3 (IMGT)
<400> 37
Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR1 (IMGT)
<400> 38
Lys Ser Leu Arg Lys Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 39
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR2 (IMGT)
<400> 39
Tyr Met Ser
1
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 LCDR3 (IMGT)
<400> 40
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 41
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 VH
<400> 41
Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Lys Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Ala Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Val Asn Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 VL
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Glu His Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (KABAT)
<400> 43
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (KABAT)
<400> 44
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (KABAT)
<400> 45
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (KABAT)
<400> 46
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (KABAT)
<400> 47
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (KABAT)
<400> 48
Met Gln Gly Leu Glu His Pro Leu Thr
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 49
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu Gly Met
1 5
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 50
Trp Asp Asp
1
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 51
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 52
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 53
Tyr Met Ser
1
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 54
Gly Leu Glu His Pro Leu
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR1 (IMGT)
<400> 55
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Leu Gly Met Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR2 (IMGT)
<400> 56
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 HCDR3 (IMGT)
<400> 57
Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR1 (IMGT)
<400> 58
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR2 (IMGT)
<400> 59
Tyr Met Ser
1
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 LCDR3 (IMGT)
<400> 60
Met Gln Gly Leu Glu His Pro Leu Thr
1 5
<210> 61
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 VH
<400> 61
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 VL
<400> 62
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser
85 90 95
Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (KABAT)
<400> 63
Thr Leu Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (KABAT)
<400> 64
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (KABAT)
<400> 65
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (KABAT)
<400> 66
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Ile Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (KABAT)
<400> 67
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (KABAT)
<400> 68
Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 69
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met
1 5
<210> 70
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 70
Trp Asp Asp
1
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 71
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 72
Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
1 5
<210> 73
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 73
Gly Ala Ser
1
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 74
Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu
1 5
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR1 (IMGT)
<400> 75
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Gly Met Gly
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR2 (IMGT)
<400> 76
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 HCDR3 (IMGT)
<400> 77
Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR1 (IMGT)
<400> 78
Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
1 5
<210> 79
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR2 (IMGT)
<400> 79
Gly Ala Ser
1
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 LCDR3 (IMGT)
<400> 80
Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Thr
1 5 10
<210> 81
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 VH
<400> 81
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 VL
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (KABAT)
<400> 83
Thr Val Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (KABAT)
<400> 84
His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (KABAT)
<400> 85
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (KABAT)
<400> 86
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (KABAT)
<400> 87
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (KABAT)
<400> 88
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (CHOTHIA)
<400> 89
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met
1 5
<210> 90
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (CHOTHIA)
<400> 90
Trp Asp Asp Glu
1
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (CHOTHIA)
<400> 91
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (CHOTHIA)
<400> 92
Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 93
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (CHOTHIA)
<400> 93
Tyr Met Ser
1
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (CHOTHIA)
<400> 94
Ser Leu Glu Tyr Pro Leu
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR1 (IMGT)
<400> 95
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met Gly
1 5 10
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR2 (IMGT)
<400> 96
Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys
1 5
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 HCDR3 (IMGT)
<400> 97
Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR1 (IMGT)
<400> 98
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR2 (IMGT)
<400> 99
Tyr Met Ser
1
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 LCDR3 (IMGT)
<400> 100
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 101
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6-18C6 VH consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = Thr or Asn
<220>
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Ile or Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> 30
<223> Xaa = Asn or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 32
<223> Xaa = Val or Leu
<220>
<221> VARIANT
<222> 39
<223> Xaa = Ser or Ile
<220>
<221> VARIANT
<222> 42
<223> Xaa = Pro or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 58
<223> Xaa = Glu or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 63
<223> Xaa = Asn or Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> 74
<223> Xaa = Lys or Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> 75
<223> Xaa = Ala or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> 76
<223> Xaa = Thr or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 86
<223> Xaa = Val or Ala
<220>
<221> VARIANT
<222> 89
<223> Xaa = Gly or Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> 93
<223> Xaa = Thr, Ile or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 99
<223> Xaa = Thr, Ser or Ala
<400> 101
Gln Val Xaa Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Xaa Arg Gln Xaa Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys Tyr Tyr Xaa Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Xaa Xaa Xaa Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Xaa Asn Val Xaa Thr Ala Asp Xaa Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Xaa Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 VL consensus
<220>
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Ile or Val
<220>
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Pro or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 30
<223> Xaa = Arg or Leu
<220>
<221> VARIANT
<222> 31
<223> Xaa = Lys or His
<220>
<221> VARIANT
<222> 79
<223> Xaa = Arg or Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> 86
<223> Xaa = Glu or Gly
<220>
<221> VARIANT
<222> 96
<223> Xaa = Ser or Gly
<220>
<221> VARIANT
<222> 99
<223> Xaa = Tyr or His
<400> 102
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Xaa Xaa Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Xaa Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Xaa
85 90 95
Leu Glu Xaa Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1 KABAT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = Lue or Val
<400> 103
Thr Xaa Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2 KABAT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = Glu or Absent
<220>
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Tyr or Asn
<400> 104
His Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys Tyr Tyr Xaa Pro Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3 KABAT CONSENSUS
<400> 105
Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 KABAT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = Arg or Leu
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = Lys or His
<400> 106
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 KABAT CONSENSUS
<400> 107
Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 KABAT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = Gly or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or Tyr
<400> 108
Met Gln Xaa Leu Glu Xaa Pro Leu Thr
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR1 CHOTHIA CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = Asn or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = Leu or Val
<400> 109
Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa Gly Met
1 5
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR2 CHOTHIA CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = Glu or Absent
<400> 110
Trp Asp Asp Xaa
1
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR3 CHOTHIA CONSENSUS
<400> 111
Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR1 CHOTHIA CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = Leu or Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or Lys
<400> 112
Ser Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 CHOTHIA CONSENSUS
<400> 113
Tyr Met Ser
1
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 CHOTHIA CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Gly or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = His or Tyr
<400> 114
Xaa Leu Glu Xaa Pro Leu
1 5
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR1 IMGT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = Asn or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = Val or Leu
<400> 115
Gly Phe Ser Leu Xaa Thr Xaa Gly Met Gly
1 5 10
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR2 IMGT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = Glu or Absent
<400> 116
Ile Trp Trp Asp Asp Xaa Asp Lys
1 5
<210> 117
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6-18C6 HCDR3 IMGT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Thr, Ala or Ser
<400> 117
Xaa Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR1 IMGT CONSENSUS
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = Val or Leu
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = His or Lys
<400> 118
Lys Ser Leu Xaa Xaa Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 119
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR2 IMGT CONSENSUS
<400> 119
Tyr Met Ser
1
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12, 19C11, 18C6 LCDR3 IMGT CONSENSUS
<400> 120
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 121
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114 F primer
<400> 121
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala
1 5 10 15
Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Cys
20 25 30
Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr
35 40
<210> 122
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114 R primer
<400> 122
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala
20 25 30
Gly Gly
<210> 123
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c344 F primer
<400> 123
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala
1 5 10 15
Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys
20 25 30
Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala
35 40 45
<210> 124
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c344 R primer
<400> 124
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala
20 25 30
Gly Gly
<210> 125
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c57-114 F primer
<400> 125
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys
1 5 10 15
Thr Thr Cys Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr
20 25 30
<210> 126
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c57-114 R primer
<400> 126
Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly
20 25 30
Thr
<210> 127
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 117-244LGALS3 F primer
<400> 127
Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Thr Thr Gly
20 25 30
<210> 128
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 117-244LGALS3 R primer
<400> 128
Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr
20 25 30
<210> 129
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 55mer immunizing peptide
<400> 129
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
50 55
<210> 130
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18mer immunizing peptide
<400> 130
Cys Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser
1 5 10 15
Ser Val
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15mer immunizing peptide
<400> 131
Cys Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val
1 5 10 15
<210> 132
<211> 344
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c344
<400> 132
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 133
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114
<400> 133
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 134
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c86
<400> 134
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly
20 25 30
Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu
35 40 45
Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln
50 55 60
Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
65 70 75 80
<210> 135
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c80
<400> 135
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Asp Leu Glu Asp Leu Gln
85
<210> 136
<211> 14507
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Immature Human MUC16 amino acid sequence (NP_078966.2)
<400> 136
Met Leu Lys Pro Ser Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ser Pro Thr Arg Ser
1 5 10 15
Leu Met Thr Gly Ser Arg Ser Thr Lys Ala Thr Pro Glu Met Asp Ser
20 25 30
Gly Leu Thr Gly Ala Thr Leu Ser Pro Lys Thr Ser Thr Gly Ala Ile
35 40 45
Val Val Thr Glu His Thr Leu Pro Phe Thr Ser Pro Asp Lys Thr Leu
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr Gln Ser Leu Gly
65 70 75 80
Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg Gly Met Thr His
85 90 95
Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln Val Asn Gly Thr
100 105 110
Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser Gly Leu Ser Ser
115 120 125
Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe Thr Lys Glu Ala
130 135 140
Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly Pro Val Thr Glu
145 150 155 160
Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu Gly Asp Ser Thr
165 170 175
Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys Ile Thr Ser Pro
180 185 190
Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu Asn Ala Pro Val
195 200 205
Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser His Thr Pro Gly
210 215 220
Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Leu
225 230 235 240
Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr Ser Leu Glu Leu
245 250 255
Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Gly Ser
260 265 270
Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Ser Ala
275 280 285
Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile Phe Ser Gly Gln
290 295 300
Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu Ala Arg Ala Ser
305 310 315 320
Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala
325 330 335
Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Thr
340 345 350
Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile Leu Thr Phe His
355 360 365
Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His Ile Ala Lys Thr
370 375 380
Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu Gly Gly Thr Ser
385 390 395 400
Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr Leu Val Ser Glu
405 410 415
Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu Thr Glu Gly Thr
420 425 430
Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala Pro Gly Glu Glu
435 440 445
Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly Phe Thr Thr Leu
450 455 460
Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser Ser His Pro Thr
465 470 475 480
Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ser Ser Ser
485 490 495
Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala Thr Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr Ala Gln Gln Phe
515 520 525
Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser Pro Ser Met Lys
530 535 540
Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala Pro Ile Thr Thr
545 550 555 560
Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu Lys Thr Ser Ser
565 570 575
Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp Thr Leu Ile Gly
580 585 590
Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala Val Pro Thr Gly
595 600 605
Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser Gln Gly Thr Thr
610 615 620
His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser Ala Asp Leu
625 630 635 640
Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser Pro Ala Val Ser
645 650 655
Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr Lys Pro Ser Tyr
660 665 670
Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ser Ser
675 680 685
Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Leu Asn Thr Arg
690 695 700
His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly His Thr Lys Ile
705 710 715 720
Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val Leu Glu Asp Lys
725 730 735
Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala Thr Ser Ser Ile
740 745 750
Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys Pro Ser Ser Ala
755 760 765
Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr Ser Pro Glu Arg
770 775 780
Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser Pro Ser Gly Glu
785 790 795 800
Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ala Glu Thr Thr
805 810 815
Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr Ser Glu Ser Ser
820 825 830
Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser Gly Val Lys Thr
835 840 845
Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe Thr Ser Gly Glu
850 855 860
Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln Pro Glu Thr Ser
865 870 875 880
Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Val Pro Thr Pro
885 890 895
Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser Ala Gln Phe Ser
900 905 910
Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser Ser Thr Ser Val
915 920 925
Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser His Leu Thr Gly
930 935 940
Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe Asn Asp Ser Ala
945 950 955 960
Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro Arg Phe Lys Thr
965 970 975
Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ala Thr Ser Leu
980 985 990
Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro Ala Thr Ser Ser
995 1000 1005
Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr Ile Leu Thr
1010 1015 1020
Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala Ser Thr
1025 1030 1035
Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu Asp
1040 1045 1050
Thr Ser His Leu Pro Ile Gly Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser
1055 1060 1065
Met Asp Phe Thr Met Ala Lys Glu Ser Val Ser Met Ser Val Ser
1070 1075 1080
Pro Ser Gln Ser Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Thr Pro Gly Arg
1085 1090 1095
Thr Ser Gln Phe Val Asp Thr Phe Ser Asp Asp Val Tyr His Leu
1100 1105 1110
Thr Ser Arg Glu Ile Thr Ile Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Ala
1115 1120 1125
Leu Thr Pro Gln Met Thr Ala Thr His Pro Pro Ser Pro Asp Pro
1130 1135 1140
Gly Ser Ala Arg Ser Thr Trp Leu Gly Ile Leu Ser Ser Ser Pro
1145 1150 1155
Ser Ser Pro Thr Pro Lys Val Thr Met Ser Ser Thr Phe Ser Thr
1160 1165 1170
Gln Arg Val Thr Thr Ser Met Ile Met Asp Thr Val Glu Thr Ser
1175 1180 1185
Arg Trp Asn Met Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Ser Leu Thr Pro
1190 1195 1200
Ser Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Ile Gly Lys Ser Thr Leu Val
1205 1210 1215
Pro Leu Asp Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser Leu Glu Ala Ser Glu
1220 1225 1230
Gly Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Thr
1235 1240 1245
Pro Ser Ile His Leu Gly Ala His Ala Ser Ser Glu Ser Pro Ser
1250 1255 1260
Thr Ile Lys Leu Thr Met Ala Ser Val Val Lys Pro Gly Ser Tyr
1265 1270 1275
Thr Pro Leu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Thr His Ile His Val Ser
1280 1285 1290
Thr Ala Arg Met Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Pro Glu Met Thr
1295 1300 1305
Ala Pro Gly Glu Thr Asn Thr Gly Ser Thr Trp Asp Pro Thr Thr
1310 1315 1320
Tyr Ile Thr Thr Thr Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Ala Gln Val
1325 1330 1335
Ser Thr Pro His Ser Val Arg Thr Leu Arg Thr Thr Glu Asn His
1340 1345 1350
Pro Lys Thr Glu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Pro
1355 1360 1365
Lys Ile Ser Ser Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Thr Lys Ala
1370 1375 1380
Trp Thr Ile Thr Asp Thr Thr Glu His Ser Thr Gln Leu His Tyr
1385 1390 1395
Thr Lys Leu Ala Glu Lys Ser Ser Gly Phe Glu Thr Gln Ser Ala
1400 1405 1410
Pro Gly Pro Val Ser Val Val Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ile Gly
1415 1420 1425
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Thr Ser Asp Val Pro Gly Glu Pro Leu
1430 1435 1440
Val Leu Ala Pro Ser Glu Gln Thr Thr Ile Thr Leu Pro Met Ala
1445 1450 1455
Thr Trp Leu Ser Thr Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Ser Thr Asp
1460 1465 1470
Leu Asp Ile Ser Ser Pro Ser Ser Pro Met Ser Thr Phe Ala Ile
1475 1480 1485
Phe Pro Pro Met Ser Thr Pro Ser His Glu Leu Ser Lys Ser Glu
1490 1495 1500
Ala Asp Thr Ser Ala Ile Arg Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Asp
1505 1510 1515
Gln His Leu Gly Ile Arg Ser Leu Gly Arg Thr Gly Asp Leu Thr
1520 1525 1530
Thr Val Pro Ile Thr Pro Leu Thr Thr Thr Trp Thr Ser Val Ile
1535 1540 1545
Glu His Ser Thr Gln Ala Gln Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser
1550 1555 1560
Pro Thr His Val Thr Gln Ser Leu Lys Asp Gln Thr Ser Ile Pro
1565 1570 1575
Ala Ser Ala Ser Pro Ser His Leu Thr Glu Val Tyr Pro Glu Leu
1580 1585 1590
Gly Thr Gln Gly Arg Ser Ser Ser Glu Ala Thr Thr Phe Trp Lys
1595 1600 1605
Pro Ser Thr Asp Thr Leu Ser Arg Glu Ile Glu Thr Gly Pro Thr
1610 1615 1620
Asn Ile Gln Ser Thr Pro Pro Met Asp Asn Thr Thr Thr Gly Ser
1625 1630 1635
Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Ile Ala His Leu Pro Ile Gly
1640 1645 1650
Thr Ser Ser Pro Ala Glu Thr Ser Thr Asn Met Ala Leu Glu Arg
1655 1660 1665
Arg Ser Ser Thr Ala Thr Val Ser Met Ala Gly Thr Met Gly Leu
1670 1675 1680
Leu Val Thr Ser Ala Pro Gly Arg Ser Ile Ser Gln Ser Leu Gly
1685 1690 1695
Arg Val Ser Ser Val Leu Ser Glu Ser Thr Thr Glu Gly Val Thr
1700 1705 1710
Asp Ser Ser Lys Gly Ser Ser Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gly Asn
1715 1720 1725
Thr Ala Leu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Gly Ser
1730 1735 1740
Gln Met Ser Thr Ser Ile Pro Leu Thr Ser Ser Pro Thr Thr Pro
1745 1750 1755
Asp Val Glu Phe Ile Gly Gly Ser Thr Phe Trp Thr Lys Glu Val
1760 1765 1770
Thr Thr Val Met Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ser Ser Ala Arg Thr
1775 1780 1785
Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Met Ser Thr Ala Leu Gly Ser Thr
1790 1795 1800
Glu Asn Thr Gly Lys Glu Lys Leu Arg Thr Ala Ser Met Asp Leu
1805 1810 1815
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Met Glu Val Thr Pro Trp Ile Ser Leu
1820 1825 1830
Thr Leu Ser Asn Ala Pro Asn Thr Thr Asp Ser Leu Asp Leu Ser
1835 1840 1845
His Gly Val His Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Ala Thr Asp Arg
1850 1855 1860
Ser Leu Asn Thr Gly Val Thr Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gly
1865 1870 1875
Ser Asp Thr Ser Ser Lys Ser Leu Ser Met Gly Asn Ser Thr His
1880 1885 1890
Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile
1895 1900 1905
His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu
1910 1915 1920
Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe
1925 1930 1935
Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser
1940 1945 1950
Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr
1955 1960 1965
Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser
1970 1975 1980
Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln
1985 1990 1995
Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser
2000 2005 2010
Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser
2015 2020 2025
Pro Tyr Ser Ser Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ser Thr Ile Ser
2030 2035 2040
Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser
2045 2050 2055
Leu Pro Thr Thr Thr Trp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Glu Ala Leu
2060 2065 2070
Ser Ser Gly His Ser Gly Val Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Thr
2075 2080 2085
Glu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Lys Gln
2090 2095 2100
Arg Asn Pro Glu Thr Glu Thr His Gly Pro Gln Asn Thr Ala Ala
2105 2110 2115
Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu
2120 2125 2130
Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met
2135 2140 2145
Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser
2150 2155 2160
Thr Ala Asn Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ser Ala Gly Thr Lys
2165 2170 2175
Leu Thr Arg Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ser Glu Ser Leu Val Ser
2180 2185 2190
Phe Arg Met Asn Lys Asp Pro Trp Thr Val Ser Ile Pro Leu Gly
2195 2200 2205
Ser His Pro Thr Thr Asn Thr Glu Thr Ser Ile Pro Val Asn Ser
2210 2215 2220
Ala Gly Pro Pro Gly Leu Ser Thr Val Ala Ser Asp Val Ile Asp
2225 2230 2235
Thr Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ser Ile Pro Thr Val Ser Phe Ser
2240 2245 2250
Pro Ser Pro Asp Thr Glu Val Thr Thr Ile Ser His Phe Pro Glu
2255 2260 2265
Lys Thr Thr His Ser Phe Arg Thr Ile Ser Ser Leu Thr His Glu
2270 2275 2280
Leu Thr Ser Arg Val Thr Pro Ile Pro Gly Asp Trp Met Ser Ser
2285 2290 2295
Ala Met Ser Thr Lys Pro Thr Gly Ala Ser Pro Ser Ile Thr Leu
2300 2305 2310
Gly Glu Arg Arg Thr Ile Thr Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ser Pro
2315 2320 2325
Ile Val Leu Thr Ala Ser Phe Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Leu
2330 2335 2340
Asp Asn Glu Thr Thr Val Lys Thr Ser Asp Ile Leu Asp Ala Arg
2345 2350 2355
Lys Thr Asn Glu Leu Pro Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu
2360 2365 2370
Ile Asn Thr Ser Ile Ala Ser Ser Thr Met Asp Val Thr Lys Thr
2375 2380 2385
Ala Ser Ile Ser Pro Thr Ser Ile Ser Gly Met Thr Ala Ser Ser
2390 2395 2400
Ser Pro Ser Leu Phe Ser Ser Asp Arg Pro Gln Val Pro Thr Ser
2405 2410 2415
Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Asn
2420 2425 2430
Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Ser Asn Val Gly Gly Thr Pro Ser
2435 2440 2445
Thr Leu Pro Pro Phe Thr Ile Thr His Pro Val Glu Thr Ser Ser
2450 2455 2460
Ala Leu Leu Ala Trp Ser Arg Pro Val Arg Thr Phe Ser Thr Met
2465 2470 2475
Val Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Glu Asn Pro Thr Ser Ser Asn
2480 2485 2490
Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val
2495 2500 2505
Gly Ser Thr Thr Asp Leu Pro Ala Met Gly Phe Leu Lys Thr Ser
2510 2515 2520
Pro Ala Gly Glu Ala His Ser Leu Leu Ala Ser Thr Ile Glu Pro
2525 2530 2535
Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Leu Ser Ala Ala Val Val Thr Gly
2540 2545 2550
Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ser Glu Ser
2555 2560 2565
Lys Ala Ile His Ser Ser Pro Gln Thr Pro Thr Thr Pro Thr Ser
2570 2575 2580
Gly Ala Asn Trp Glu Thr Ser Ala Thr Pro Glu Ser Leu Leu Val
2585 2590 2595
Val Thr Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ser Lys Ile Leu Val
2600 2605 2610
Thr Asp Thr Ile Leu Phe Ser Thr Val Ser Thr Pro Pro Ser Lys
2615 2620 2625
Phe Pro Ser Thr Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ser Phe Pro Thr Leu
2630 2635 2640
Leu Pro Asp Thr Pro Ala Ile Pro Leu Thr Ala Thr Glu Pro Thr
2645 2650 2655
Ser Ser Leu Ala Thr Ser Phe Asp Ser Thr Pro Leu Val Thr Ile
2660 2665 2670
Ala Ser Asp Ser Leu Gly Thr Val Pro Glu Thr Thr Leu Thr Met
2675 2680 2685
Ser Glu Thr Ser Asn Gly Asp Ala Leu Val Leu Lys Thr Val Ser
2690 2695 2700
Asn Pro Asp Arg Ser Ile Pro Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Thr
2705 2710 2715
Glu Ser Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ser Lys Ile Val
2720 2725 2730
Ala Pro Arg Asn Thr Thr Tyr Glu Gly Ser Ile Thr Val Ala Leu
2735 2740 2745
Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln
2750 2755 2760
Ser Ser Glu Asn Ser Glu Thr Thr Ala Leu Val Asp Ser Ser Ala
2765 2770 2775
Gly Leu Glu Arg Ala Ser Val Met Pro Leu Thr Thr Gly Ser Gln
2780 2785 2790
Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser
2795 2800 2805
Thr Gly Thr Lys Thr Phe Ser Ser Leu Pro Leu Thr Met Asn Pro
2810 2815 2820
Gly Glu Val Thr Ala Met Ser Glu Ile Thr Thr Asn Arg Leu Thr
2825 2830 2835
Ala Thr Gln Ser Thr Ala Pro Lys Gly Ile Pro Val Lys Pro Thr
2840 2845 2850
Ser Ala Glu Ser Gly Leu Leu Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser
2855 2860 2865
Pro Ser Lys Ala Phe Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Pro Thr Trp
2870 2875 2880
Gly Ile Pro Gln Ser Thr Leu Thr Phe Glu Phe Ser Glu Val Pro
2885 2890 2895
Ser Leu Asp Thr Lys Ser Ala Ser Leu Pro Thr Pro Gly Gln Ser
2900 2905 2910
Leu Asn Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser
2915 2920 2925
Leu Ser Lys Ser Pro Glu Lys Asn Pro Arg Ala Arg Met Met Thr
2930 2935 2940
Ser Thr Lys Ala Ile Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ser Thr Gly Phe
2945 2950 2955
Thr Glu Thr Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Ser Met Ala Gly His
2960 2965 2970
Glu Pro Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Asp Pro Arg Tyr Ala
2975 2980 2985
Ser Glu Ser Met Ser Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Ala Ser Ser Ala
2990 2995 3000
Met Thr Ser Thr Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Phe Ser
3005 3010 3015
Thr Gly Gln Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser
3020 3025 3030
Leu Ser Thr Glu Lys Glu Thr Ser Phe Leu Ser Pro Thr Ala Ser
3035 3040 3045
Thr Ser Arg Lys Thr Ser Leu Phe Leu Gly Pro Ser Met Ala Arg
3050 3055 3060
Gln Pro Asn Ile Leu Val His Leu Gln Thr Ser Ala Leu Thr Leu
3065 3070 3075
Ser Pro Thr Ser Thr Leu Asn Met Ser Gln Glu Glu Pro Pro Glu
3080 3085 3090
Leu Thr Ser Ser Gln Thr Ile Ala Glu Glu Glu Gly Thr Thr Ala
3095 3100 3105
Glu Thr Gln Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro Thr Ser
3110 3115 3120
Leu Leu Pro Val Ser Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala Arg Arg Lys
3125 3130 3135
Ser Ser Pro Glu Thr Trp Ala Ser Ser Ile Ser Val Pro Ala Lys
3140 3145 3150
Thr Ser Leu Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Leu Val Thr Thr Ile
3155 3160 3165
Lys Met Ser Ser Gln Ala Ala Gln Gly Asn Ser Thr Trp Pro Ala
3170 3175 3180
Pro Ala Glu Glu Thr Gly Ser Ser Pro Ala Gly Thr Ser Pro Gly
3185 3190 3195
Ser Pro Glu Met Ser Thr Thr Leu Lys Ile Met Ser Ser Lys Glu
3200 3205 3210
Pro Ser Ile Ser Pro Glu Ile Arg Ser Thr Val Arg Asn Ser Pro
3215 3220 3225
Trp Lys Thr Pro Glu Thr Thr Val Pro Met Glu Thr Thr Val Glu
3230 3235 3240
Pro Val Thr Leu Gln Ser Thr Ala Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ser
3245 3250 3255
Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Thr Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro
3260 3265 3270
Thr Glu Asn Met Leu Ala Thr Glu Arg Val Ser Leu Ser Pro Ser
3275 3280 3285
Pro Pro Glu Ala Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Pro Gly Gly
3290 3295 3300
Thr Arg Gln Ser Leu Ala Thr Met Ser Ser Val Ser Leu Glu Ser
3305 3310 3315
Pro Thr Ala Arg Ser Ile Thr Gly Thr Gly Gln Gln Ser Ser Pro
3320 3325 3330
Glu Leu Val Ser Lys Thr Thr Gly Met Glu Phe Ser Met Trp His
3335 3340 3345
Gly Ser Thr Gly Gly Thr Thr Gly Asp Thr His Val Ser Leu Ser
3350 3355 3360
Thr Ser Ser Asn Ile Leu Glu Asp Pro Val Thr Ser Pro Asn Ser
3365 3370 3375
Val Ser Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys His Lys Thr Glu Thr Trp
3380 3385 3390
Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Ser Thr Val Leu Asn Asn Lys Ile
3395 3400 3405
Met Ala Ala Glu Gln Gln Thr Ser Arg Ser Val Asp Glu Ala Tyr
3410 3415 3420
Ser Ser Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gln Thr Ser Gly Ser Asp Ile
3425 3430 3435
Thr Leu Gly Ala Ser Pro Asp Val Thr Asn Thr Leu Tyr Ile Thr
3440 3445 3450
Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asp
3455 3460 3465
Gln Gly Ile Thr Ser Leu Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys Thr Ser
3470 3475 3480
Ser Ala Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Ile Gly Leu Glu Thr Leu
3485 3490 3495
Arg Ala Asn Val Ser Ala Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Thr Ala
3500 3505 3510
Gly His Leu Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ala Glu Val Ser Ile Leu
3515 3520 3525
Asp Val Thr Thr Ala Pro Thr Pro Gly Ile Ser Thr Thr Ile Thr
3530 3535 3540
Thr Met Gly Thr Asn Ser Ile Ser Thr Thr Thr Pro Asn Pro Glu
3545 3550 3555
Val Gly Met Ser Thr Met Asp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Arg Arg
3560 3565 3570
Thr Thr Ser Thr Glu His Pro Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ala
3575 3580 3585
Ser Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Met Thr Ser Asn Leu Lys Val
3590 3595 3600
Ala Arg Ser Pro Gly Thr Ile Ser Thr Met His Thr Thr Ser Phe
3605 3610 3615
Leu Ala Ser Ser Thr Glu Leu Asp Ser Met Ser Thr Pro His Gly
3620 3625 3630
Arg Ile Thr Val Ile Gly Thr Ser Leu Val Thr Pro Ser Ser Asp
3635 3640 3645
Ala Ser Ala Val Lys Thr Glu Thr Ser Thr Ser Glu Arg Thr Leu
3650 3655 3660
Ser Pro Ser Asp Thr Thr Ala Ser Thr Pro Ile Ser Thr Phe Ser
3665 3670 3675
Arg Val Gln Arg Met Ser Ile Ser Val Pro Asp Ile Leu Ser Thr
3680 3685 3690
Ser Trp Thr Pro Ser Ser Thr Glu Ala Glu Asp Val Pro Val Ser
3695 3700 3705
Met Val Ser Thr Asp His Ala Ser Thr Lys Thr Asp Pro Asn Thr
3710 3715 3720
Pro Leu Ser Thr Phe Leu Phe Asp Ser Leu Ser Thr Leu Asp Trp
3725 3730 3735
Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Ser Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala
3740 3745 3750
Pro Gln Gly Ala Thr Thr Pro Gln Glu Leu Thr Leu Glu Thr Met
3755 3760 3765
Ile Ser Pro Ala Thr Ser Gln Leu Pro Phe Ser Ile Gly His Ile
3770 3775 3780
Thr Ser Ala Val Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Ser Gly Val
3785 3790 3795
Thr Phe Ser Arg Pro Asp Pro Thr Ser Lys Lys Ala Glu Gln Thr
3800 3805 3810
Ser Thr Gln Leu Pro Thr Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln Val
3815 3820 3825
Pro Arg Ser Ala Ala Thr Thr Leu Asp Val Ile Pro His Thr Ala
3830 3835 3840
Lys Thr Pro Asp Ala Thr Phe Gln Arg Gln Gly Gln Thr Ala Leu
3845 3850 3855
Thr Thr Glu Ala Arg Ala Thr Ser Asp Ser Trp Asn Glu Lys Glu
3860 3865 3870
Lys Ser Thr Pro Ser Ala Pro Trp Ile Thr Glu Met Met Asn Ser
3875 3880 3885
Val Ser Glu Asp Thr Ile Lys Glu Val Thr Ser Ser Ser Ser Val
3890 3895 3900
Leu Arg Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu Glu Ser Gly Thr
3905 3910 3915
Thr Ser Ser Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Tyr Glu Arg Ile Ala
3920 3925 3930
Pro Ser Glu Ser Thr Thr Asp Lys Glu Ala Ile His Pro Ser Thr
3935 3940 3945
Asn Thr Val Glu Thr Thr Gly Trp Val Thr Ser Ser Glu His Ala
3950 3955 3960
Ser His Ser Thr Ile Pro Ala His Ser Ala Ser Ser Lys Leu Thr
3965 3970 3975
Ser Pro Val Val Thr Thr Ser Thr Arg Glu Gln Ala Ile Val Ser
3980 3985 3990
Met Ser Thr Thr Thr Trp Pro Glu Ser Thr Arg Ala Arg Thr Glu
3995 4000 4005
Pro Asn Ser Phe Leu Thr Ile Glu Leu Arg Asp Val Ser Pro Tyr
4010 4015 4020
Met Asp Thr Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser Ile Ile Ser Ser Pro
4025 4030 4035
Gly Ser Thr Ala Ile Thr Lys Gly Pro Arg Thr Glu Ile Thr Ser
4040 4045 4050
Ser Lys Arg Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Gln Ser Met Arg Ser
4055 4060 4065
Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Asn Phe Pro
4070 4075 4080
Ala Met Thr Glu Ser Gly Gly Met Ile Leu Ala Met Gln Thr Ser
4085 4090 4095
Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Leu Asp Thr Ser
4100 4105 4110
Ala Thr Ala Ser Trp Thr Gly Thr Pro Leu Ala Thr Thr Gln Arg
4115 4120 4125
Phe Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe Ser Lys Gly Pro Glu
4130 4135 4140
Asp Thr Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser
4145 4150 4155
Ser Ser Ser Leu Val Pro Ile His Ala Thr Thr Ser Pro Ser Asn
4160 4165 4170
Ile Leu Leu Thr Ser Gln Gly His Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro
4175 4180 4185
Val Thr Ser Val Phe Leu Ser Glu Thr Ser Gly Leu Gly Lys Thr
4190 4195 4200
Thr Asp Met Ser Arg Ile Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ser Leu Pro
4205 4210 4215
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ala Gly Glu Ala Leu Ser Thr Tyr Glu
4220 4225 4230
Ala Ser Arg Asp Thr Lys Ala Ile His His Ser Ala Asp Thr Ala
4235 4240 4245
Val Thr Asn Met Glu Ala Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Pro Ile Pro
4250 4255 4260
Gly His Thr Lys Pro Ser Lys Ala Thr Ser Pro Leu Val Thr Ser
4265 4270 4275
His Ile Met Gly Asp Ile Thr Ser Ser Thr Ser Val Phe Gly Ser
4280 4285 4290
Ser Glu Thr Thr Glu Ile Glu Thr Val Ser Ser Val Asn Gln Gly
4295 4300 4305
Leu Gln Glu Arg Ser Thr Ser Gln Val Ala Ser Ser Ala Thr Glu
4310 4315 4320
Thr Ser Thr Val Ile Thr His Val Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr
4325 4330 4335
His Val Thr Lys Thr Gln Ala Thr Phe Ser Ser Gly Thr Ser Ile
4340 4345 4350
Ser Ser Pro His Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe Thr Asp
4355 4360 4365
Val Ser Thr Asn Pro Ser Thr Ser Leu Ile Met Thr Glu Ser Ser
4370 4375 4380
Gly Val Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro Thr Gly Ala Ala Thr
4385 4390 4395
Gln Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Thr Met Pro Tyr Leu Thr
4400 4405 4410
Glu Thr Pro Leu Ala Val Thr Pro Asp Phe Met Gln Ser Glu Lys
4415 4420 4425
Thr Thr Leu Ile Ser Lys Gly Pro Lys Asp Val Ser Trp Thr Ser
4430 4435 4440
Pro Pro Ser Val Ala Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Ser Leu Thr Pro
4445 4450 4455
Phe Leu Val Thr Thr Ile Pro Pro Ala Thr Ser Thr Leu Gln Gly
4460 4465 4470
Gln His Thr Ser Ser Pro Val Ser Ala Thr Ser Val Leu Thr Ser
4475 4480 4485
Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Asn Thr Ser Met Glu Pro
4490 4495 4500
Val Thr Asn Ser Pro Gln Asn Leu Asn Asn Pro Ser Asn Glu Ile
4505 4510 4515
Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Thr Asp Ile Glu Thr Ile His Pro
4520 4525 4530
Ser Ile Asn Lys Ala Val Thr Asn Met Gly Thr Ala Ser Ser Ala
4535 4540 4545
His Val Leu His Ser Thr Leu Pro Val Ser Ser Glu Pro Ser Thr
4550 4555 4560
Ala Thr Ser Pro Met Val Pro Ala Ser Ser Met Gly Asp Ala Leu
4565 4570 4575
Ala Ser Ile Ser Ile Pro Gly Ser Glu Thr Thr Asp Ile Glu Gly
4580 4585 4590
Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ala Gly Arg Lys Glu Asn Ser Thr
4595 4600 4605
Leu Gln Glu Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser Asn Ile Ile Leu Ser
4610 4615 4620
Asn Val Ser Val Gly Ala Ile Thr Glu Ala Thr Lys Met Glu Val
4625 4630 4635
Pro Ser Phe Asp Ala Thr Phe Ile Pro Thr Pro Ala Gln Ser Thr
4640 4645 4650
Lys Phe Pro Asp Ile Phe Ser Val Ala Ser Ser Arg Leu Ser Asn
4655 4660 4665
Ser Pro Pro Met Thr Ile Ser Thr His Met Thr Thr Thr Gln Thr
4670 4675 4680
Gly Ser Ser Gly Ala Thr Ser Lys Ile Pro Leu Ala Leu Asp Thr
4685 4690 4695
Ser Thr Leu Glu Thr Ser Ala Gly Thr Pro Ser Val Val Thr Glu
4700 4705 4710
Gly Phe Ala His Ser Lys Ile Thr Thr Ala Met Asn Asn Asp Val
4715 4720 4725
Lys Asp Val Ser Gln Thr Asn Pro Pro Phe Gln Asp Glu Ala Ser
4730 4735 4740
Ser Pro Ser Ser Gln Ala Pro Val Leu Val Thr Thr Leu Pro Ser
4745 4750 4755
Ser Val Ala Phe Thr Pro Gln Trp His Ser Thr Ser Ser Pro Val
4760 4765 4770
Ser Met Ser Ser Val Leu Thr Ser Ser Leu Val Lys Thr Ala Gly
4775 4780 4785
Lys Val Asp Thr Ser Leu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gln Ser
4790 4795 4800
Met Ser Asn Thr Leu Asp Asp Ile Ser Val Thr Ser Ala Ala Thr
4805 4810 4815
Thr Asp Ile Glu Thr Thr His Pro Ser Ile Asn Thr Val Val Thr
4820 4825 4830
Asn Val Gly Thr Thr Gly Ser Ala Phe Glu Ser His Ser Thr Val
4835 4840 4845
Ser Ala Tyr Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Asn Val Thr
4850 4855 4860
Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Thr Ile Ser Arg Ser Ile Pro Lys
4865 4870 4875
Ser Ser Lys Thr Thr Arg Thr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Ser Leu
4880 4885 4890
Thr Pro Lys Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Glu Ile Thr Ser
4895 4900 4905
Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val Pro Tyr Lys Glu Leu Thr Gly Ala
4910 4915 4920
Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Asp Val Thr Ser Ser Ser Ser Thr
4925 4930 4935
Ser Phe Pro Gly Pro Asp Gln Ser Thr Val Ser Leu Asp Ile Ser
4940 4945 4950
Thr Glu Thr Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu
4955 4960 4965
Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro His Gly Ala
4970 4975 4980
Thr Ser Gln Asp Thr Phe Thr Met Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro
4985 4990 4995
Gln Ala Gly Ile His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln Leu
5000 5005 5010
Asp Val Thr Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Gln Asp Val Ser Trp
5015 5020 5025
Thr Ser Pro Pro Ser Val Asp Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe
5030 5035 5040
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Thr Pro Ser Leu Ile Ser Ser Thr
5045 5050 5055
Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ser Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr
5060 5065 5070
Ser Gly Leu Val Lys Ile Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Leu Glu
5075 5080 5085
Pro Val Thr Ser Ser Leu Pro Asn Phe Ser Ser Thr Ser Asp Lys
5090 5095 5100
Ile Leu Ala Thr Ser Lys Asp Ser Lys Asp Thr Lys Glu Ile Phe
5105 5110 5115
Pro Ser Ile Asn Thr Glu Glu Thr Asn Val Lys Ala Asn Asn Ser
5120 5125 5130
Gly His Glu Ser His Ser Pro Ala Leu Ala Asp Ser Glu Thr Pro
5135 5140 5145
Lys Ala Thr Thr Gln Met Val Ile Thr Thr Thr Val Gly Asp Pro
5150 5155 5160
Ala Pro Ser Thr Ser Met Pro Val His Gly Ser Ser Glu Thr Thr
5165 5170 5175
Asn Ile Lys Arg Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Thr Pro Arg Leu Arg
5180 5185 5190
Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ser Ser Phe Pro Thr Asp Thr Ser
5195 5200 5205
Phe Leu Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Thr Ile Thr Glu Val Ser
5210 5215 5220
Ser Thr Gly Val Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Thr Pro Asp His
5225 5230 5235
Asp Lys Ser Thr Val Pro Pro Asp Thr Phe Thr Gly Glu Ile Pro
5240 5245 5250
Arg Val Phe Thr Ser Ser Ile Lys Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr
5255 5260 5265
Ile Thr Thr Gln Ala Ser Pro Pro Glu Ser Ala Ser His Ser Thr
5270 5275 5280
Leu Pro Leu Asp Thr Ser Thr Thr Leu Ser Gln Gly Gly Thr His
5285 5290 5295
Ser Thr Val Thr Gln Gly Phe Pro Tyr Ser Glu Val Thr Thr Leu
5300 5305 5310
Met Gly Met Gly Pro Gly Asn Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro
5315 5320 5325
Val Glu Glu Thr Ser Ser Val Ser Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala
5330 5335 5340
Met Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Gln Ser Ile
5345 5350 5355
Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ala Leu Pro Thr Ser Val Leu
5360 5365 5370
Val Thr Thr Thr Asp Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Ser Val
5375 5380 5385
Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Ile Thr His Glu Arg Pro
5390 5395 5400
Ala Thr Tyr Lys Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Ala Met His His
5405 5410 5415
Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Ser Gly Ser Gly
5420 5425 5430
His Lys Ser Gln Ser Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Ser Lys
5435 5440 5445
Ala Thr Pro Leu Met Ser Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asp Thr Ser
5450 5455 5460
Val Ser Thr Ser Thr Pro Asn Ile Ser Gln Thr Asn Gln Ile Gln
5465 5470 5475
Thr Glu Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Arg Glu Ser Ser
5480 5485 5490
Thr Ser Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Phe
5495 5500 5505
Ser Tyr Val Pro Thr Gly Ala Ile Thr Gln Ala Ser Arg Thr Glu
5510 5515 5520
Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Asp Leu Asp Arg Pro Thr
5525 5530 5535
Ile Ala Pro Asp Ile Ser Thr Gly Met Ile Thr Arg Leu Phe Thr
5540 5545 5550
Ser Pro Ile Met Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr Val Thr Thr Gln
5555 5560 5565
Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Pro Trp Asp
5570 5575 5580
Thr Ser Thr Thr Leu Phe Gln Gly Gly Thr His Ser Thr Val Ser
5585 5590 5595
Gln Gly Phe Pro His Ser Glu Ile Thr Thr Leu Arg Ser Arg Thr
5600 5605 5610
Pro Gly Asp Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro Val Glu Glu Thr
5615 5620 5625
Ser Ser Gly Phe Ser Leu Met Ser Pro Ser Met Thr Ser Pro Ser
5630 5635 5640
Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Leu
5645 5650 5655
Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Ser Val Leu Val Thr Thr Thr Asn
5660 5665 5670
Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Pro Val Thr Ser Ser Pro Pro
5675 5680 5685
Asn Leu Ser Ser Pro Thr Gln Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys Asp
5690 5695 5700
Thr Ala His Thr Glu Ala Met His Ala Ser Met His Thr Asn Thr
5705 5710 5715
Ala Val Ala Asn Val Gly Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln
5720 5725 5730
Ser Ser Val Pro Ala Asp Ser His Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro
5735 5740 5745
Met Gly Ile Thr Phe Ala Met Gly Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser
5750 5755 5760
Thr Pro Ala Phe Phe Glu Thr Arg Ile Gln Thr Glu Ser Thr Ser
5765 5770 5775
Ser Leu Ile Pro Gly Leu Arg Asp Thr Arg Thr Ser Glu Glu Ile
5780 5785 5790
Asn Thr Val Thr Glu Thr Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Thr
5795 5800 5805
Thr Thr Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Thr Ser Ser
5810 5815 5820
Arg Thr Thr Ile Ser Gly Pro Asp His Ser Lys Met Ser Pro Tyr
5825 5830 5835
Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Ser Thr Phe Pro Phe Val
5840 5845 5850
Thr Gly Ser Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Gln Thr Gly Pro Ile
5855 5860 5865
Gly Thr Ile Ser Gln Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Thr
5870 5875 5880
Ala Ser Trp Glu Gly Thr His Ser Pro Val Thr Gln Arg Phe Pro
5885 5890 5895
His Ser Glu Glu Thr Thr Thr Met Ser Arg Ser Thr Lys Gly Val
5900 5905 5910
Ser Trp Gln Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Pro Ser
5915 5920 5925
Ser Pro Val Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ser His Ser Ser Leu Tyr
5930 5935 5940
Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr
5945 5950 5955
Ser Leu Leu Thr Ser Gly Arg Arg Lys Thr Ile Asp Met Leu Asp
5960 5965 5970
Thr His Ser Glu Leu Val Thr Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Ser
5975 5980 5985
Phe Ser Gly Glu Ile Leu Thr Ser Glu Ala Ser Thr Asn Thr Glu
5990 5995 6000
Thr Ile His Phe Ser Glu Asn Thr Ala Glu Thr Asn Met Gly Thr
6005 6010 6015
Thr Asn Ser Met His Lys Leu His Ser Ser Val Ser Ile His Ser
6020 6025 6030
Gln Pro Ser Gly His Thr Pro Pro Lys Val Thr Gly Ser Met Met
6035 6040 6045
Glu Asp Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Pro Glu Thr
6050 6055 6060
Lys Asn Val Asp Arg Asp Ser Thr Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu
6065 6070 6075
Lys Glu Asp Ser Thr Ala Leu Val Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser
6080 6085 6090
Asn Thr Val Phe Ser Ser Val Ser Leu Asp Ala Ala Thr Glu Val
6095 6100 6105
Ser Arg Ala Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Pro Thr Phe Met Pro Ala
6110 6115 6120
Ser Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Asp Ile Ser Pro Glu Ala Ser
6125 6130 6135
Ser Ser His Ser Asn Ser Pro Pro Leu Thr Ile Ser Thr His Lys
6140 6145 6150
Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Ser Leu Gly
6155 6160 6165
Gln Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ile Ala Thr Ser Ala Gly Thr
6170 6175 6180
Pro Ser Ala Arg Thr Gln Asp Phe Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser
6185 6190 6195
Val Met Asn Asn Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Thr Ser Pro Phe
6200 6205 6210
Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ser Leu Ser Ser Gln Ala Pro Leu Leu
6215 6220 6225
Val Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Thr Ser Thr Leu Gln Glu His
6230 6235 6240
Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Thr Ser Val Pro Thr Pro Thr
6245 6250 6255
Leu Ala Lys Ile Thr Asp Met Asp Thr Asn Leu Glu Pro Val Thr
6260 6265 6270
Arg Ser Pro Gln Asn Leu Arg Asn Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ala
6275 6280 6285
Thr Thr Asp Thr His Thr Met His Pro Ser Ile Asn Thr Ala Val
6290 6295 6300
Ala Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Pro Asn Glu Phe Tyr Phe Thr
6305 6310 6315
Val Ser Pro Asp Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val
6320 6325 6330
Ile Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Val Ser Thr Ser Met Pro
6335 6340 6345
Arg Ser Ser Ala Met Lys Lys Ile Glu Ser Glu Thr Thr Phe Ser
6350 6355 6360
Leu Ile Phe Arg Leu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Lys Ile Gly
6365 6370 6375
Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Val Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala
6380 6385 6390
Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Leu Thr Ser Ser Ser Arg
6395 6400 6405
Thr Ser Ile Gln Gly Thr Glu Lys Pro Thr Met Ser Pro Asp Thr
6410 6415 6420
Ser Thr Arg Ser Val Thr Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly Leu Thr
6425 6430 6435
Lys Ser Glu Glu Arg Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro His Arg
6440 6445 6450
Ala Thr Ser Gln Gly Thr Leu Thr Trp Asp Thr Ser Ile Thr Thr
6455 6460 6465
Ser Gln Ala Gly Thr His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln
6470 6475 6480
Leu Asp Leu Ser Thr Leu Thr Ser Arg Val Pro Glu Tyr Ile Ser
6485 6490 6495
Gly Thr Ser Pro Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
6500 6505 6510
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ile Thr Ser Pro Ser Pro Val Pro Thr
6515 6520 6525
Thr Leu Pro Glu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Val His Leu Thr Ser
6530 6535 6540
Leu Pro Thr Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Ala Ser
6545 6550 6555
Val Ala Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gly Ser Thr Ser His Lys Ile
6560 6565 6570
Pro Thr Thr Ser Glu Asp Ile Lys Asp Thr Glu Lys Met Tyr Pro
6575 6580 6585
Ser Thr Asn Ile Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Thr Ser Glu
6590 6595 6600
Lys Glu Ser Tyr Ser Ser Val Pro Ala Tyr Ser Glu Pro Pro Lys
6605 6610 6615
Val Thr Ser Pro Met Val Thr Ser Phe Asn Ile Arg Asp Thr Ile
6620 6625 6630
Val Ser Thr Ser Met Pro Gly Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu
6635 6640 6645
Met Glu Ser Thr Phe Ser Leu Ala His Gly Leu Lys Gly Thr Ser
6650 6655 6660
Thr Ser Gln Asp Pro Ile Val Ser Thr Glu Lys Ser Ala Val Leu
6665 6670 6675
His Lys Leu Thr Thr Gly Ala Thr Glu Thr Ser Arg Thr Glu Val
6680 6685 6690
Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Asp His Ser Thr
6695 6700 6705
Glu Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Pro Ser Leu Pro Ile
6710 6715 6720
Ser Leu Gly Ile Thr Glu Ser Ser Asn Met Thr Ile Ile Thr Arg
6725 6730 6735
Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ser Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu
6740 6745 6750
Asp Thr Pro Thr Thr Ser Ser Arg Ala Gly Thr His Ser Met Ala
6755 6760 6765
Thr Gln Glu Phe Pro His Ser Glu Met Thr Thr Val Met Asn Lys
6770 6775 6780
Asp Pro Glu Ile Leu Ser Trp Thr Ile Pro Pro Ser Ile Glu Lys
6785 6790 6795
Thr Ser Phe Ser Ser Ser Leu Met Pro Ser Pro Ala Met Thr Ser
6800 6805 6810
Pro Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Ile His Thr Thr Pro
6815 6820 6825
Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr Pro Ser Leu Val Met Thr Thr
6830 6835 6840
Asp Thr Leu Gly Thr Ser Pro Glu Pro Thr Thr Ser Ser Pro Pro
6845 6850 6855
Asn Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Ile Leu Thr Thr Asp Glu Asp
6860 6865 6870
Thr Thr Ala Ile Glu Ala Met His Pro Ser Thr Ser Thr Ala Ala
6875 6880 6885
Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly His Gly Ser Gln Ser Ser
6890 6895 6900
Val Leu Ala Asp Ser Glu Lys Thr Lys Ala Thr Ala Pro Met Asp
6905 6910 6915
Thr Thr Ser Thr Met Gly His Thr Thr Val Ser Thr Ser Met Ser
6920 6925 6930
Val Ser Ser Glu Thr Thr Lys Ile Lys Arg Glu Ser Thr Tyr Ser
6935 6940 6945
Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser
6950 6955 6960
Phe Ser Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Ser Glu Val Pro Thr Gly
6965 6970 6975
Thr Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Gly Arg
6980 6985 6990
Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile
6995 7000 7005
Ser Thr Arg Thr Met Thr Arg Leu Phe Ala Ser Pro Thr Met Thr
7010 7015 7020
Glu Ser Ala Glu Met Thr Ile Pro Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly
7025 7030 7035
Ser Thr Ser Gln Asp Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Lys
7040 7045 7050
Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His
7055 7060 7065
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Gly Pro Gly Asp Met Ser
7070 7075 7080
Trp Gln Ser Ser Pro Ser Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Pro Ser
7085 7090 7095
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser
7100 7105 7110
Thr Leu Pro Val Thr Ile Ser Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ser
7115 7120 7125
Leu Leu Thr Ser Ser Pro Val Thr Thr Thr Asp Met Leu His Thr
7130 7135 7140
Ser Pro Glu Leu Val Thr Ser Ser Pro Pro Lys Leu Ser His Thr
7145 7150 7155
Ser Asp Glu Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asp Thr Thr Asn Thr Glu
7160 7165 7170
Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ile
7175 7180 7185
Pro Ser Ser Gly His Glu Ser Pro Ser Ser Ala Leu Ala Asp Ser
7190 7195 7200
Glu Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro Met Phe Ile Thr Ser Thr Gln
7205 7210 7215
Glu Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr Pro His Phe Leu Glu Thr
7220 7225 7230
Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu
7235 7240 7245
Arg Glu Thr Gly Ser Ser Val Glu Thr Ser Ser Ala Ile Glu Thr
7250 7255 7260
Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7265 7270 7275
Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Gly
7280 7285 7290
Ser Ala Glu Ser Thr Met Leu Pro Glu Ile Ser Thr Thr Arg Lys
7295 7300 7305
Ile Ile Lys Phe Pro Thr Ser Pro Ile Leu Ala Glu Ser Ser Glu
7310 7315 7320
Met Thr Ile Lys Thr Gln Thr Ser Pro Pro Gly Ser Thr Ser Glu
7325 7330 7335
Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Pro Ser Leu Val Ile
7340 7345 7350
Thr His Ser Thr Met Thr Gln Arg Leu Pro His Ser Glu Ile Thr
7355 7360 7365
Thr Leu Val Ser Arg Gly Ala Gly Asp Val Pro Arg Pro Ser Ser
7370 7375 7380
Leu Pro Val Glu Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Gln Leu Ser Leu
7385 7390 7395
Ser Ala Met Ile Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Ala
7400 7405 7410
Ser Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro
7415 7420 7425
Gly Gln Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Ala Ser Ala Glu Pro
7430 7435 7440
Glu Thr Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile
7445 7450 7455
Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
7460 7465 7470
Phe Ser Asn Thr Ala Val Thr Lys Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly
7475 7480 7485
His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Pro Asp Ser Glu Thr Thr Lys
7490 7495 7500
Ala Thr Ser Ala Met Gly Thr Ile Ser Ile Met Gly Asp Thr Ser
7505 7510 7515
Val Ser Thr Leu Thr Pro Ala Leu Ser Asn Thr Arg Lys Ile Gln
7520 7525 7530
Ser Glu Pro Ala Ser Ser Leu Thr Thr Arg Leu Arg Glu Thr Ser
7535 7540 7545
Thr Ser Glu Glu Thr Ser Leu Ala Thr Glu Ala Asn Thr Val Leu
7550 7555 7560
Ser Lys Val Ser Thr Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu
7565 7570 7575
Ala Ile Ser Phe Ser Arg Thr Ser Met Ser Gly Pro Glu Gln Ser
7580 7585 7590
Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Ile Gly Thr Ile Pro Arg Ile Ser
7595 7600 7605
Ala Ser Ser Val Leu Thr Glu Ser Ala Lys Met Thr Ile Thr Thr
7610 7615 7620
Gln Thr Gly Pro Ser Glu Ser Thr Leu Glu Ser Thr Leu Asn Leu
7625 7630 7635
Asn Thr Ala Thr Thr Pro Ser Trp Val Glu Thr His Ser Ile Val
7640 7645 7650
Ile Gln Gly Phe Pro His Pro Glu Met Thr Thr Ser Met Gly Arg
7655 7660 7665
Gly Pro Gly Gly Val Ser Trp Pro Ser Pro Pro Phe Val Lys Glu
7670 7675 7680
Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Val Thr Ser
7685 7690 7695
Pro His Pro Val Ser Thr Thr Phe Leu Ala His Ile Pro Pro Ser
7700 7705 7710
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr
7715 7720 7725
Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Ser Ser
7730 7735 7740
Ser Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys
7745 7750 7755
Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Gly
7760 7765 7770
Gly Thr Asn Val Ala Thr Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Ser Gln Ser
7775 7780 7785
Ser Val Leu Ala Asp Ser Ser Pro Met Cys Thr Thr Ser Thr Met
7790 7795 7800
Gly Asp Thr Ser Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Leu Glu Thr
7805 7810 7815
Arg Arg Ile Gln Thr Glu Leu Ala Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu
7820 7825 7830
Arg Glu Ser Ser Gly Ser Glu Gly Thr Ser Ser Gly Thr Lys Met
7835 7840 7845
Ser Thr Val Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7850 7855 7860
Ser Lys Glu Asp Val Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr
7865 7870 7875
Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Thr
7880 7885 7890
Ser Pro Val Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Met Asn Thr His
7895 7900 7905
Thr Ser Pro Leu Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Ser Thr Leu Asp
7910 7915 7920
Thr Ser Ser Thr Thr Ser Leu Thr Met Thr His Ser Thr Ile Ser
7925 7930 7935
Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Ser Thr Leu Met Arg Arg Gly
7940 7945 7950
Pro Glu Asp Val Ser Trp Met Ser Pro Pro Leu Leu Glu Lys Thr
7955 7960 7965
Arg Pro Ser Phe Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala Thr Thr Ser Pro
7970 7975 7980
Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro
7985 7990 7995
Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ala Lys Thr Thr
8000 8005 8010
Asp Met Leu His Lys Ser Ser Glu Pro Val Thr Asn Ser Pro Ala
8015 8020 8025
Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val
8030 8035 8040
Thr Thr Asp Thr Glu Lys Thr His Pro Ser Ser Asn Arg Thr Val
8045 8050 8055
Thr Asp Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly His Glu Ser Thr Ser Phe
8060 8065 8070
Val Leu Ala Asp Ser Gln Thr Ser Lys Val Thr Ser Pro Met Val
8075 8080 8085
Ile Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro
8090 8095 8100
Gly Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Thr Glu Pro Thr Ser Ser
8105 8110 8115
Leu Thr Leu Gly Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ser
8120 8125 8130
Leu Ala Thr Glu Met Ser Thr Val Leu Ser Gly Val Pro Thr Gly
8135 8140 8145
Ala Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg
8150 8155 8160
Thr Ser Ile Ser Gly Phe Ala Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr
8165 8170 8175
Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Pro Thr Ser Ser Ile Met Thr
8180 8185 8190
Glu Ser Ala Glu Met Met Ile Lys Thr Gln Thr Asp Pro Pro Gly
8195 8200 8205
Ser Thr Pro Glu Ser Thr His Thr Val Asp Ile Ser Thr Thr Pro
8210 8215 8220
Asn Trp Val Glu Thr His Ser Thr Val Thr Gln Arg Phe Ser His
8225 8230 8235
Ser Glu Met Thr Thr Leu Val Ser Arg Ser Pro Gly Asp Met Leu
8240 8245 8250
Trp Pro Ser Gln Ser Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser
8255 8260 8265
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser
8270 8275 8280
Thr Leu Val Glu Asp Phe Pro Ser Ala Ser Leu Pro Val Thr Ser
8285 8290 8295
Leu Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp Arg Met Gly Ile
8300 8305 8310
Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Ser Thr
8315 8320 8325
Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr Val Asp Thr Glu
8330 8335 8340
Asp Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr Asn Val Arg Thr
8345 8350 8355
Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val Leu Ser Asp Ser
8360 8365 8370
Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr Thr Tyr Thr Met
8375 8380 8385
Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp Phe Phe Glu Thr
8390 8395 8400
Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu
8405 8410 8415
Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser Ala Thr Glu Gly
8420 8425 8430
Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Thr Glu Val
8435 8440 8445
Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr Ser Met Ser Gly
8450 8455 8460
Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Ala Ile
8465 8470 8475
Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ser
8480 8485 8490
Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Glu Gly
8495 8500 8505
Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe Trp Ser Gly Thr
8510 8515 8520
His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser Glu Met Thr Thr
8525 8530 8535
Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Pro Ser Leu Pro
8540 8545 8550
Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser Ser Pro
8555 8560 8565
Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile
8570 8575 8580
Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gly Pro
8585 8590 8595
Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr
8600 8605 8610
Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala
8615 8620 8625
Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile His Pro Ser Ser
8630 8635 8640
Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile Tyr Lys His Leu
8645 8650 8655
Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr Thr Lys Pro Thr
8660 8665 8670
Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn Thr Ser Val Ser
8675 8680 8685
Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met Thr Gln Pro Thr
8690 8695 8700
Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu
8705 8710 8715
Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Met Pro
8720 8725 8730
Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu Ala Leu Ser Leu
8735 8740 8745
Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Ile Ser Pro
8750 8755 8760
Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr
8765 8770 8775
Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro Lys Thr Gly His
8780 8785 8790
Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ser
8795 8800 8805
Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala Thr His Arg Ser
8810 8815 8820
Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp
8825 8830 8835
Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Pro Pro
8840 8845 8850
Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu
8855 8860 8865
Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser Pro Leu Arg Val
8870 8875 8880
Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr Thr Asp Met Leu
8885 8890 8895
Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro Pro Ser Met Asn
8900 8905 8910
Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys Ala Thr Met Glu
8915 8920 8925
Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala Val Thr Gln Met
8930 8935 8940
Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser Ser Tyr Pro Gly
8945 8950 8955
Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val Val Thr Ser Ser
8960 8965 8970
Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro Ala Ser Ser Glu
8975 8980 8985
Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Thr
8990 8995 9000
Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His Ser Ala Thr Lys
9005 9010 9015
Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser Ala Thr Ile Glu
9020 9025 9030
Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg Gly Pro Ser Pro
9035 9040 9045
Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Thr
9050 9055 9060
Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser Thr Glu Met Thr
9065 9070 9075
Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Arg Gly Thr
9080 9085 9090
Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser Gly Thr His Ser
9095 9100 9105
Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Thr Ala Leu Met
9110 9115 9120
Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Leu Ser His Pro Ser Val
9125 9130 9135
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser Ser Pro Val Met
9140 9145 9150
Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Asp Ser Ile His
9155 9160 9165
Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Val
9170 9175 9180
Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr Ser
9185 9190 9195
Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala Ile
9200 9205 9210
Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu Met Thr Asn Val
9215 9220 9225
Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala
9230 9235 9240
Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met Gly Ile Thr Tyr
9245 9250 9255
Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Ser
9260 9265 9270
Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu Ser Leu Thr Pro
9275 9280 9285
Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr
9290 9295 9300
Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr
9305 9310 9315
Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile
9320 9325 9330
Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp Thr Ser Met Glu
9335 9340 9345
Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg Lys Glu Ser Thr
9350 9355 9360
Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ser
9365 9370 9375
Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Trp Pro
9380 9385 9390
Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro Gln Ser Val Val
9395 9400 9405
Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser
9410 9415 9420
Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser
9425 9430 9435
Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser
9440 9445 9450
Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr Ser Leu Phe Thr
9455 9460 9465
Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp Ala Ser Leu Glu
9470 9475 9480
Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu
9485 9490 9495
Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr Glu Ala Ile His
9500 9505 9510
Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu Thr Thr Ser Ala
9515 9520 9525
Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe Ser Glu Pro Thr
9530 9535 9540
Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser Ile Arg Asp Asn
9545 9550 9555
Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly Ile Thr Arg Ile
9560 9565 9570
Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr
9575 9580 9585
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val
9590 9595 9600
Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu Val Ser Arg Thr
9605 9610 9615
Glu Val Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln
9620 9625 9630
Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Arg Leu
9635 9640 9645
Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr
9650 9655 9660
Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Val Thr Leu Pro
9665 9670 9675
Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr His Ser Thr Met
9680 9685 9690
Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn Leu Met Ser Arg
9695 9700 9705
Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg Phe Val Glu Thr
9710 9715 9720
Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro Leu Thr Thr Ser
9725 9730 9735
Leu Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Leu Asp Ser Ser Pro Ser Ser
9740 9745 9750
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Lys Thr
9755 9760 9765
Thr Glu Val Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Thr Ser Ser Ser
9770 9775 9780
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Pro Ala Thr Ser Glu
9785 9790 9795
Ile Met Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro Ser Ser Asn Thr Ala
9800 9805 9810
Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His Glu Ser His Ser
9815 9820 9825
Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Met
9830 9835 9840
Gly Ile Thr Ser Ala Val Asp Asp Thr Thr Val Phe Thr Ser Asn
9845 9850 9855
Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr Glu Pro Thr Phe
9860 9865 9870
Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr Ser Glu Glu Thr
9875 9880 9885
Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu Tyr Gly Val Pro Thr
9890 9895 9900
Ser Ala Thr Thr Glu Val Ser Met Thr Glu Ile Met Ser Ser Asn
9905 9910 9915
Arg Ile His Ile Pro Asp Ser Asp Gln Ser Thr Met Ser Pro Asp
9920 9925 9930
Ile Ile Thr Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Ser Ser Ser Met Met
9935 9940 9945
Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys Ser Ser Pro
9950 9955 9960
Gly Ala Thr Ala Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Thr Thr Ala
9965 9970 9975
Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro Arg Phe Leu His
9980 9985 9990
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro Glu Asn Pro Ser
9995 10000 10005
Trp Lys Ser Ser Leu Phe Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
10010 10015 10020
Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr
10025 10030 10035
Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser Val Thr Ser Leu
10040 10045 10050
Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr Ser Thr Glu Pro
10055 10060 10065
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr Ser Val Glu Ile
10070 10075 10080
Leu Ala Ala Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
10085 10090 10095
Ser Ser Ser Met Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Gly
10100 10105 10110
His Glu Leu Tyr Ser Ser Val Ser Ile His Ser Glu Pro Ser Lys
10115 10120 10125
Ala Thr Tyr Pro Val Gly Thr Pro Ser Ser Met Ala Glu Thr Ser
10130 10135 10140
Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr Thr Gly Phe Glu
10145 10150 10155
Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Phe Arg Lys Thr Asn
10160 10165 10170
Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Val Thr Pro Thr Asn Thr Pro Ser
10175 10180 10185
Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gln Ser Ser Lys Thr Asp Phe
10190 10195 10200
Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp Pro Pro Ala Ser
10205 10210 10215
Gln Tyr Thr Glu Ile Pro Val Asp Ile Ile Thr Pro Phe Asn Ala
10220 10225 10230
Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu
10235 10240 10245
Ser Arg Phe Thr Met Ser Val Thr Glu Ser Thr His His Leu Ser
10250 10255 10260
Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser Thr Gly Thr Val
10265 10270 10275
Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe Ala Thr Thr Gly
10280 10285 10290
Val Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro Phe Ser Arg Thr
10295 10300 10305
Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr Ile Ala Glu Ser
10310 10315 10320
Leu Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser Ser Thr Phe Thr
10325 10330 10335
Thr Thr Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ala Leu His Glu Ile Thr Ser
10340 10345 10350
Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser Leu Gly Thr Glu
10355 10360 10365
Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val Ser Thr Leu Asp
10370 10375 10380
Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Asp
10385 10390 10395
Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr Val Thr Ser Ala
10400 10405 10410
Tyr Gln Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr Arg Thr Asp Gly
10415 10420 10425
Ile Met Glu His Ile Thr Lys Ile Pro Asn Glu Ala Ala His Arg
10430 10435 10440
Gly Thr Ile Arg Pro Val Lys Gly Pro Gln Thr Ser Thr Ser Pro
10445 10450 10455
Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr Lys Arg Met Glu
10460 10465 10470
Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr
10475 10480 10485
Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr Thr Pro Thr Leu
10490 10495 10500
Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gln Met Ala Ser Thr
10505 10510 10515
Ile Pro Thr Glu Met Met Ile Thr Thr Pro Tyr Val Phe Pro Asp
10520 10525 10530
Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Ala Glu
10535 10540 10545
Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Asn Arg
10550 10555 10560
Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Ala Glu
10565 10570 10575
Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser Ser Ser Glu Pro
10580 10585 10590
Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val Ile His Pro Ala Glu Thr Ile Pro
10595 10600 10605
Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His Ser Glu Leu Asp
10610 10615 10620
Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala Asp Val Ser Ser
10625 10630 10635
Ala Ile Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu Asp Ala Leu Thr
10640 10645 10650
Pro Leu Val Thr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro
10655 10660 10665
Thr Leu Thr Lys Ser Pro His Glu Thr Glu Thr Arg Thr Thr Trp
10670 10675 10680
Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile Pro Arg Thr Ile
10685 10690 10695
Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr Pro Ser Ile Ala
10700 10705 10710
Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile Pro Ile Met Thr
10715 10720 10725
Val Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Val Thr Ser Gln Val Thr Ser
10730 10735 10740
Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser
10745 10750 10755
Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Val Thr His Pro Glu
10760 10765 10770
Ala Gln Thr Ser Ser Ala Ile Pro Thr Ser Thr Ile Ser Pro Ala
10775 10780 10785
Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys
10790 10795 10800
Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser Pro Gly Glu Pro
10805 10810 10815
Ala Thr Thr Val Ser Leu Val Thr His Pro Ala Gln Thr Ser Pro
10820 10825 10830
Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His Ser Lys Ser Asp
10835 10840 10845
Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala Glu Ser Ser Ser
10850 10855 10860
Ala Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Thr Glu Val Pro Gly Val Val
10865 10870 10875
Thr Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Ile Ser Thr Thr Ile
10880 10885 10890
Pro Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser
10895 10900 10905
Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ile Pro Thr
10910 10915 10920
Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val Thr Ser Leu Val
10925 10930 10935
Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr
10940 10945 10950
Phe Ser Leu Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser
10955 10960 10965
His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr Val Leu Pro Glu
10970 10975 10980
Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser Ser Arg Ala Val
10985 10990 10995
Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro
11000 11005 11010
Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser
11015 11020 11025
Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro Gly Val Val Thr
11030 11035 11040
Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser Thr Ser Ile Pro
11045 11050 11055
Thr Leu Ile Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr Thr Pro Ser Met
11060 11065 11070
Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala Val Pro Thr Pro
11075 11080 11085
Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr Pro Leu Val Thr
11090 11095 11100
Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu
11105 11110 11115
Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His
11120 11125 11130
Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val Ser Pro Glu Val
11135 11140 11145
Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr
11150 11155 11160
Ser Thr Thr Ile Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Asp Glu Pro Glu
11165 11170 11175
Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala Lys Met Ile Ser
11180 11185 11190
Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Ser Pro Thr Val Gln Gly Leu Val
11195 11200 11205
Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr Ser Ala Phe Ser
11210 11215 11220
Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr Ile Asp Ser Trp
11225 11230 11235
Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val Val Pro Thr Leu
11240 11245 11250
Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn Ile Ser Leu Val Thr
11255 11260 11265
His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Thr Thr Ser Arg
11270 11275 11280
Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser Thr Val Thr Ser
11285 11290 11295
Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr Thr Ile Ser Pro
11300 11305 11310
Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Arg
11315 11320 11325
Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu Ser Pro His Glu
11330 11335 11340
Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro Ala Val Thr Ser
11345 11350 11355
Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser His Ser Glu Pro
11360 11365 11370
Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Ala Thr
11375 11380 11385
Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp Val Pro Asp Met
11390 11395 11400
Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Ile Thr
11405 11410 11415
Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro Glu Thr Thr Thr
11420 11425 11430
Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser Ser Ala Ile Pro
11435 11440 11445
Thr Leu Pro Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Met Leu Thr Ser Leu
11450 11455 11460
Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr Phe Pro Thr Leu
11465 11470 11475
Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ile Gln Leu Ile
11480 11485 11490
His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg Thr Thr Pro Lys
11495 11500 11505
Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro Val Ala Ile Thr
11510 11515 11520
Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Ile
11525 11530 11535
Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu Val Pro Ser Ser
11540 11545 11550
Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu Ser Glu Thr Pro
11555 11560 11565
Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu
11570 11575 11580
Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn Phe Ser His Arg
11585 11590 11595
Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser Pro Gly Val Asp
11600 11605 11610
Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro Pro Ser Ile Pro
11615 11620 11625
Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Asp Thr Ser
11630 11635 11640
Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr
11645 11650 11655
Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln Thr Gly Phe Thr
11660 11665 11670
Val Pro Ile Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro Asp Thr Met Ala
11675 11680 11685
Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gln Thr Ser Thr Pro Val Ser Arg
11690 11695 11700
Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp Ala Thr Pro Val
11705 11710 11715
Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr
11720 11725 11730
Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr Ser Gln Ile Thr
11735 11740 11745
Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Leu Thr His
11750 11755 11760
Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu Ser Thr His Pro
11765 11770 11775
Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser Thr Val Phe Pro
11780 11785 11790
Gln Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Arg Pro Gly Ala
11795 11800 11805
Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Phe
11810 11815 11820
Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp Leu Ser Pro Thr
11825 11830 11835
Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro Leu Ser Thr His
11840 11845 11850
Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr Ser Thr Leu Ser
11855 11860 11865
Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ser Ser
11870 11875 11880
Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr Val Ser Pro Ala
11885 11890 11895
Val Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr Asp Lys Pro Gln
11900 11905 11910
Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro Ser Val Thr Ser
11915 11920 11925
Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr Gly Thr Thr Met
11930 11935 11940
Thr Leu Ile Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro Lys Thr Ser His
11945 11950 11955
Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg Thr Thr Met Val
11960 11965 11970
Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser Pro Thr Val Ala
11975 11980 11985
Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr
11990 11995 12000
Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Val
12005 12010 12015
Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp Ile Ser Thr Thr
12020 12025 12030
Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala Thr Ser Thr Pro
12035 12040 12045
Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ser Ile Pro
12050 12055 12060
Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val Pro Phe Thr Leu
12065 12070 12075
Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His
12080 12085 12090
Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg Glu Leu Gln Gly
12095 12100 12105
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr
12110 12115 12120
Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser
12125 12130 12135
Ala Thr Ala Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Glu
12140 12145 12150
Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Asn
12155 12160 12165
Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg
12170 12175 12180
Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Met Pro
12185 12190 12195
Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Gly Thr Ser
12200 12205 12210
Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
12215 12220 12225
Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr
12230 12235 12240
Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met
12245 12250 12255
Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr
12260 12265 12270
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
12275 12280 12285
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
12290 12295 12300
His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu
12305 12310 12315
Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile Glu Glu Leu Gly
12320 12325 12330
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
12335 12340 12345
His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr
12350 12355 12360
Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro
12365 12370 12375
Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn
12380 12385 12390
Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp Met Gly His Pro
12395 12400 12405
Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu
12410 12415 12420
Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
12425 12430 12435
Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala
12440 12445 12450
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser
12455 12460 12465
Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu
12470 12475 12480
Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn
12485 12490 12495
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr
12500 12505 12510
Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly
12515 12520 12525
Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu
12530 12535 12540
Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu
12545 12550 12555
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu
12560 12565 12570
Arg Val Leu Gln Thr Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser
12575 12580 12585
Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser
12590 12595 12600
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
12605 12610 12615
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr
12620 12625 12630
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro
12635 12640 12645
Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His
12650 12655 12660
Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
12665 12670 12675
Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr
12680 12685 12690
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr
12695 12700 12705
Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys
12710 12715 12720
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Ser Leu Leu Gly Pro Met
12725 12730 12735
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
12740 12745 12750
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
12755 12760 12765
Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp
12770 12775 12780
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile
12785 12790 12795
Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val
12800 12805 12810
Asn Gly Phe Thr His Gln Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ser Thr Pro
12815 12820 12825
Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser
12830 12835 12840
Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr
12845 12850 12855
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His
12860 12865 12870
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
12875 12880 12885
Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu
12890 12895 12900
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly
12905 12910 12915
Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Ile Cys Ser His Arg Leu Asp Pro
12920 12925 12930
Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
12935 12940 12945
Gln Leu Thr His Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp
12950 12955 12960
Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
12965 12970 12975
Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
12980 12985 12990
Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Val Pro
12995 13000 13005
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln
13010 13015 13020
Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr
13025 13030 13035
Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Leu Phe Lys Asn
13040 13045 13050
Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ile Ser Leu
13055 13060 13065
Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys
13070 13075 13080
Thr His His Leu Asn Pro Gln Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln
13085 13090 13095
Leu Tyr Trp Gln Leu Ser Gln Met Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
13100 13105 13110
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe
13115 13120 13125
Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr Ser Thr Pro Trp Thr Ser
13130 13135 13140
Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Pro Val Pro Ser
13145 13150 13155
Pro Thr Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
13160 13165 13170
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asn Met Gly His Pro Gly
13175 13180 13185
Ser Arg Lys Phe Asn Ile Thr Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu
13190 13195 13200
Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly
13205 13210 13215
Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Val Ala Thr
13220 13225 13230
Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ile Pro
13235 13240 13245
Gly Leu Asp Arg Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr
13250 13255 13260
His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser
13265 13270 13275
Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr
13280 13285 13290
Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gln Pro Glu Thr Ser Glu Thr
13295 13300 13305
Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala Thr Gly Pro Val Leu Leu
13310 13315 13320
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu
13325 13330 13335
Asp Met Arg Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
13340 13345 13350
Val Leu Gln Gly Leu Leu Met Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val
13355 13360 13365
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu
13370 13375 13380
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp Ala Val Cys Thr His Arg
13385 13390 13395
Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp
13400 13405 13410
Lys Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr
13415 13420 13425
Thr Leu Asp Arg His Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln
13430 13435 13440
Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro Asp Thr Ser Thr Met His
13445 13450 13455
Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Pro Met Thr
13460 13465 13470
Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile Thr
13475 13480 13485
Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His His Pro Gly Ser Arg Lys
13490 13495 13500
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val
13505 13510 13515
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
13520 13525 13530
Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val Asp
13535 13540 13545
Ala Ile Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp
13550 13555 13560
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile
13565 13570 13575
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
13580 13585 13590
Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Ile Pro
13595 13600 13605
Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Val Ser
13610 13615 13620
Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr
13625 13630 13635
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Gln
13640 13645 13650
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
13655 13660 13665
Gly Leu Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu
13670 13675 13680
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly
13685 13690 13695
Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Pro Asp Pro
13700 13705 13710
Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
13715 13720 13725
Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ala Leu Asp
13730 13735 13740
Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
13745 13750 13755
Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Pro Thr Val Tyr Leu Gly Ala
13760 13765 13770
Ser Lys Thr Pro Ala Ser Ile Phe Gly Pro Ser Ala Ala Ser His
13775 13780 13785
Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg
13790 13795 13800
Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr
13805 13810 13815
Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr
13820 13825 13830
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
13835 13840 13845
Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
13850 13855 13860
His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
13865 13870 13875
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly
13880 13885 13890
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
13895 13900 13905
His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu
13910 13915 13920
Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met
13925 13930 13935
Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp
13940 13945 13950
Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser
13955 13960 13965
Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
13970 13975 13980
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr
13985 13990 13995
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe
14000 14005 14010
His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro
14015 14020 14025
Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu
14030 14035 14040
Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr
14045 14050 14055
Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His
14060 14065 14070
Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr
14075 14080 14085
Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu
14090 14095 14100
Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
14105 14110 14115
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro
14120 14125 14130
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr
14135 14140 14145
His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr
14150 14155 14160
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe
14165 14170 14175
Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro
14180 14185 14190
Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile
14195 14200 14205
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr
14210 14215 14220
Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr
14225 14230 14235
Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr
14240 14245 14250
Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe
14255 14260 14265
Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp
14270 14275 14280
Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln
14285 14290 14295
Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln
14300 14305 14310
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn Phe Thr
14315 14320 14325
Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala Gln Pro Gly Thr
14330 14335 14340
Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
14345 14350 14355
Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys
14360 14365 14370
Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr Gly
14375 14380 14385
Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
14390 14395 14400
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly
14405 14410 14415
Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val
14420 14425 14430
Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
14435 14440 14445
Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu
14450 14455 14460
Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr
14465 14470 14475
Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys
14480 14485 14490
Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
14495 14500 14505
<210> 137
<211> 43815
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Immature Human MUC16 nucleic acid sequence (NM_024690.2)
<400> 137
agcgttgcac aattccccca acctccatac atacggcagc tcttctagac acaggttttc 60
ccaggtcaaa tgcggggacc ccagccatat ctcccaccct gagaaatttt ggagtttcag 120
ggagctcaga agctctgcag aggccaccct ctctgagggg attcttctta gacctccatc 180
cagaggcaaa tgttgacctg tccatgctga aaccctcagg ccttcctggg tcatcttctc 240
ccacccgctc cttgatgaca gggagcagga gcactaaagc cacaccagaa atggattcag 300
gactgacagg agccaccttg tcacctaaga catctacagg tgcaatcgtg gtgacagaac 360
atactctgcc ctttacttcc ccagataaga ccttggccag tcctacatct tcggttgtgg 420
gaagaaccac ccagtctttg ggggtgatgt cctctgctct ccctgagtca acctctagag 480
gaatgacaca ctccgagcaa agaaccagcc catcgctgag tccccaggtc aatggaactc 540
cctctaggaa ctaccctgct acaagcatgg tttcaggatt gagttcccca aggaccagga 600
ccagttccac agaaggaaat tttaccaaag aagcatctac atacacactc actgtagaga 660
ccacaagtgg cccagtcact gagaagtaca cagtccccac tgagacctca acaactgaag 720
gtgacagcac agagaccccc tgggacacaa gatatattcc tgtaaaaatc acatctccaa 780
tgaaaacatt tgcagattca actgcatcca aggaaaatgc cccagtgtct atgactccag 840
ctgagaccac agttactgac tcacatactc caggaaggac aaacccatca tttgggacac 900
tttattcttc cttccttgac ctatcaccta aagggacccc aaattccaga ggtgaaacaa 960
gcctggaact gattctatca accactggat atcccttctc ctctcctgaa cctggctctg 1020
caggacacag cagaataagt accagtgcgc ctttgtcatc atctgcttca gttctcgata 1080
ataaaatatc agagaccagc atattctcag gccagagtct cacctcccct ctgtctcctg 1140
gggtgcccga ggccagagcc agcacaatgc ccaactcagc tatccctttt tccatgacac 1200
taagcaatgc agaaacaagt gccgaaaggg tcagaagcac aatttcctct ctggggactc 1260
catcaatatc cacaaagcag acagcagaga ctatccttac cttccatgcc ttcgctgaga 1320
ccatggatat acccagcacc cacatagcca agactttggc ttcagaatgg ttgggaagtc 1380
caggtaccct tggtggcacc agcacttcag cgctgacaac cacatctcca tctaccactt 1440
tagtctcaga ggagaccaac acccatcact ccacgagtgg aaaggaaaca gaaggaactt 1500
tgaatacatc tatgactcca cttgagacct ctgctcctgg agaagagtcc gaaatgactg 1560
ccaccttggt ccccactcta ggttttacaa ctcttgacag caagatcaga agtccatctc 1620
aggtctcttc atcccaccca acaagagagc tcagaaccac aggcagcacc tctgggaggc 1680
agagttccag cacagctgcc cacgggagct ctgacatcct gagggcaacc acttccagca 1740
cctcaaaagc atcatcatgg accagtgaaa gcacagctca gcaatttagt gaaccccagc 1800
acacacagtg ggtggagaca agtcctagca tgaaaacaga gagaccccca gcatcaacca 1860
gtgtggcagc ccctatcacc acttctgttc cctcagtggt ctctggcttc accaccctga 1920
agaccagctc cacaaaaggg atttggcttg aagaaacatc tgcagacaca ctcatcggag 1980
aatccacagc tggcccaacc acccatcagt ttgctgttcc cactgggatt tcaatgacag 2040
gaggcagcag caccagggga agccagggca caacccacct actcaccaga gccacagcat 2100
catctgagac atccgcagat ttgactctgg ccacgaacgg tgtcccagtc tccgtgtctc 2160
cagcagtgag caagacggct gctggctcaa gtcctccagg agggacaaag ccatcatata 2220
caatggtttc ttctgtcatc cctgagacat catctctaca gtcctcagct ttcagggaag 2280
gaaccagcct gggactgact ccattaaaca ctagacatcc cttctcttcc cctgaaccag 2340
actctgcagg acacaccaag ataagcacca gcattcctct gttgtcatct gcttcagttc 2400
ttgaggataa agtgtcagcg accagcacat tctcacacca caaagccacc tcatctatta 2460
ccacagggac tcctgaaatc tcaacaaaga caaagcccag ctcagccgtt ctttcctcca 2520
tgaccctaag caatgcagca acaagtcctg aaagagtcag aaatgcaact tcccctctga 2580
ctcatccatc tccatcaggg gaagagacag cagggagtgt cctcactctc agcacctctg 2640
ctgagactac agactcacct aacatccacc caactgggac actgacttca gaatcgtcag 2700
agagtcctag cactctcagc ctcccaagtg tctctggagt caaaaccaca ttttcttcat 2760
ctactccttc cactcatcta tttactagtg gagaagaaac agaggaaact tcgaatccat 2820
ctgtgtctca acctgagact tctgtttcca gagtaaggac caccttggcc agcacctctg 2880
tccctacccc agtattcccc accatggaca cctggcctac acgttcagct cagttctctt 2940
catcccacct agtgagtgag ctcagagcta cgagcagtac ctcagttaca aactcaactg 3000
gttcagctct tcctaaaata tctcacctca ctgggacggc aacaatgtca cagaccaata 3060
gagacacgtt taatgactct gctgcacccc aaagcacaac ttggccagag actagtccca 3120
gattcaagac agggttacct tcagcaacaa ccactgtttc aacctctgcc acttctctct 3180
ctgctactgt aatggtctct aaattcactt ctccagcaac tagttccatg gaagcaactt 3240
ctatcaggga accatcaaca accatcctca caacagagac cacgaatggc ccaggctcta 3300
tggctgtggc ttctaccaac atcccaattg gaaagggcta cattactgaa ggaagattgg 3360
acacaagcca tctgcccatt ggaaccacag cttcctctga gacatctatg gattttacca 3420
tggccaaaga aagtgtctca atgtcagtat ctccatctca gtccatggat gctgctggct 3480
caagcactcc aggaaggaca agccaattcg ttgacacatt ttctgatgat gtctatcatt 3540
taacatccag agaaattaca atacctagag atggaacaag ctcagctctg actccacaaa 3600
tgactgcaac tcaccctcca tctcctgatc ctggctctgc tagaagcacc tggcttggca 3660
tcttgtcctc atctccttct tctcctactc ccaaagtcac aatgagctcc acattttcaa 3720
ctcagagagt caccacaagc atgataatgg acacagttga aactagtcgg tggaacatgc 3780
ccaacttacc ttccacgact tccttgacac caagtaatat tccaacaagt ggtgccatag 3840
gaaaaagcac cctggttccc ttggacactc catctccagc cacatcattg gaggcatcag 3900
aagggggact tccaaccctc agcacctacc ctgaatcaac aaacacaccc agcatccacc 3960
tcggagcaca cgctagttca gaaagtccaa gcaccatcaa acttaccatg gcttcagtag 4020
taaaacctgg ctcttacaca cctctcacct tcccctcaat agagacccac attcatgtat 4080
caacagccag aatggcttac tcttctgggt cttcacctga gatgacagct cctggagaga 4140
ctaacactgg tagtacctgg gaccccacca cctacatcac cactacggat cctaaggata 4200
caagttcagc tcaggtctct acaccccact cagtgaggac actcagaacc acagaaaacc 4260
atccaaagac agagtccgcc accccagctg cttactctgg aagtcctaaa atctcaagtt 4320
cacccaatct caccagtccg gccacaaaag catggaccat cacagacaca actgaacact 4380
ccactcaatt acattacaca aaattggcag aaaaatcatc tggatttgag acacagtcag 4440
ctccaggacc tgtctctgta gtaatcccta cctcccctac cattggaagc agcacattgg 4500
aactaacttc tgatgtccca ggggaacccc tggtccttgc tcccagtgag cagaccacaa 4560
tcactctccc catggcaaca tggctgagta ccagtttgac agaggaaatg gcttcaacag 4620
accttgatat ttcaagtcca agttcaccca tgagtacatt tgctattttt ccacctatgt 4680
ccacaccttc tcatgaactt tcaaagtcag aggcagatac cagtgccatt agaaatacag 4740
attcaacaac gttggatcag cacctaggaa tcaggagttt gggcagaact ggggacttaa 4800
caactgttcc tatcacccca ctgacaacca cgtggaccag tgtgattgaa cactcaacac 4860
aagcacagga caccctttct gcaacgatga gtcctactca cgtgacacag tcactcaaag 4920
atcaaacatc tataccagcc tcagcatccc cttcccatct tactgaagtc taccctgagc 4980
tcgggacaca agggagaagc tcctctgagg caaccacttt ttggaaacca tctacagaca 5040
cactgtccag agagattgag actggcccaa caaacattca atccactcca cccatggaca 5100
acacaacaac agggagcagt agtagtggag tcaccctggg catagcccac cttcccatag 5160
gaacatcctc cccagctgag acatccacaa acatggcact ggaaagaaga agttctacag 5220
ccactgtctc tatggctggg acaatgggac tccttgttac tagtgctcca ggaagaagca 5280
tcagccagtc attaggaaga gtttcctctg tcctttctga gtcaactact gaaggagtca 5340
cagattctag taagggaagc agcccaaggc tgaacacaca gggaaataca gctctctcct 5400
cctctcttga acccagctat gctgaaggaa gccagatgag cacaagcatc cctctaacct 5460
catctcctac aactcctgat gtggaattca tagggggcag cacattttgg accaaggagg 5520
tcaccacagt tatgacctca gacatctcca agtcttcagc aaggacagag tccagctcag 5580
ctacccttat gtccacagct ttgggaagca ctgaaaatac aggaaaagaa aaactcagaa 5640
ctgcctctat ggatcttcca tctccaactc catcaatgga ggtgacacca tggatttctc 5700
tcactctcag taatgccccc aataccacag attcacttga cctcagccat ggggtgcaca 5760
ccagctctgc agggactttg gccactgaca ggtcattgaa tactggtgtc actagagcct 5820
ccagattgga aaacggctct gatacctctt ctaagtccct gtctatggga aacagcactc 5880
acacttccat gacttacaca gagaagagtg aagtgtcttc ttcaatccat ccccgacctg 5940
agacctcagc tcctggagca gagaccactt tgacttccac tcctggaaac agggccataa 6000
gcttaacatt gcctttttca tccattccag tggaagaagt catttctaca ggcataacct 6060
caggaccaga catcaactca gcacccatga cacattctcc catcacccca ccaacaattg 6120
tatggaccag tacaggcaca attgaacagt ccactcaacc actacatgca gtttcttcag 6180
aaaaagtttc tgtgcagaca cagtcaactc catatgtcaa ctctgtggca gtgtctgctt 6240
cccctaccca tgagaattca gtctcttctg gaagcagcac atcctctcca tattcctcag 6300
cctcacttga atccttggat tccacaatca gtaggaggaa tgcaatcact tcctggctat 6360
gggacctcac tacatctctc cccactacaa cttggccaag tactagttta tctgaggcac 6420
tgtcctcagg ccattctggg gtttcaaacc caagttcaac tacgactgaa tttccactct 6480
tttcagctgc atccacatct gctgctaagc aaagaaatcc agaaacagag acccatggtc 6540
cccagaatac agccgcgagt actttgaaca ctgatgcatc ctcggtcaca ggtctttctg 6600
agactcctgt gggggcaagt atcagctctg aagtccctct tccaatggcc ataacttcta 6660
gatcagatgt ttctggcctt acatctgaga gtactgctaa cccgagttta ggcacagcct 6720
cttcagcagg gaccaaatta actaggacaa tatccctgcc cacttcagag tctttggttt 6780
cctttagaat gaacaaggat ccatggacag tgtcaatccc tttggggtcc catccaacta 6840
ctaatacaga aacaagcatc ccagtaaaca gcgcaggtcc acctggcttg tccacagtag 6900
catcagatgt aattgacaca ccttcagatg gggctgagag tattcccact gtctcctttt 6960
ccccctcccc tgatactgaa gtgacaacta tctcacattt cccagaaaag acaactcatt 7020
catttagaac catttcatct ctcactcatg agttgacttc aagagtgaca cctattcctg 7080
gggattggat gagttcagct atgtctacaa agcccacagg agccagtccc tccattacac 7140
tgggagagag aaggacaatc acctctgctg ctccaaccac ttcccccata gttctcactg 7200
ctagtttcac agagaccagc acagtttcac tggataatga aactacagta aaaacctcag 7260
atatccttga cgcacggaaa acaaatgagc tcccctcaga tagcagttct tcttctgatc 7320
tgatcaacac ctccatagct tcttcaacta tggatgtcac taaaacagcc tccatcagtc 7380
ccactagcat ctcaggaatg acagcaagtt cctccccatc tctcttctct tcagatagac 7440
cccaggttcc cacatctaca acagagacaa atacagccac ctctccatct gtttccagta 7500
acacctattc tcttgatggg ggctccaatg tgggtggcac tccatccact ttaccaccct 7560
ttacaatcac ccaccctgtc gagacaagct cggccctatt agcctggtct agaccagtaa 7620
gaactttcag caccatggtc agcactgaca ctgcctccgg agaaaatcct acctctagca 7680
attctgtggt gacttctgtt ccagcaccag gtacatggac cagtgtaggc agtactactg 7740
acttacctgc catgggcttt ctcaagacaa gtcctgcagg agaggcacac tcacttctag 7800
catcaactat tgaaccagcc actgccttca ctccccatct ctcagcagca gtggtcactg 7860
gatccagtgc tacatcagaa gccagtcttc tcactacgag tgaaagcaaa gccattcatt 7920
cttcaccaca gaccccaact acacccacct ctggagcaaa ctgggaaact tcagctactc 7980
ctgagagcct tttggtagtc actgagactt cagacacaac acttacctca aagattttgg 8040
tcacagatac catcttgttt tcaactgtgt ccacgccacc ttctaaattt ccaagtacgg 8100
ggactctgtc tggagcttcc ttccctactt tactcccgga cactccagcc atccctctca 8160
ctgccactga gccaacaagt tcattagcta catcctttga ttccacccca ctggtgacta 8220
tagcttcgga tagtcttggc acagtcccag agactaccct gaccatgtca gagacctcaa 8280
atggtgatgc actggttctt aagacagtaa gtaacccaga taggagcatc cctggaatca 8340
ctatccaagg agtaacagaa agtccactcc atccttcttc cacttccccc tctaagattg 8400
ttgctccacg gaatacaacc tatgaaggtt cgatcacagt ggcactttct actttgcctg 8460
cgggaactac tggttccctt gtattcagtc agagttctga aaactcagag acaacggctt 8520
tggtagactc atcagctggg cttgagaggg catctgtgat gccactaacc acaggaagcc 8580
agggtatggc tagctctgga ggaatcagaa gtgggtccac tcactcaact ggaaccaaaa 8640
cattttcttc tctccctctg accatgaacc caggtgaggt tacagccatg tctgaaatca 8700
ccacgaacag actgacagct actcaatcaa cagcacccaa agggatacct gtgaagccca 8760
ccagtgctga gtcaggcctc ctaacacctg tctctgcctc ctcaagccca tcaaaggcct 8820
ttgcctcact gactacagct cccccaactt gggggatccc acagtctacc ttgacatttg 8880
agttttctga ggtcccaagt ttggatacta agtccgcttc tttaccaact cctggacagt 8940
ccctgaacac cattccagac tcagatgcaa gcacagcatc ttcctcactg tccaagtctc 9000
cagaaaaaaa cccaagggca aggatgatga cttccacaaa ggccataagt gcaagctcat 9060
ttcaatcaac aggttttact gaaacccctg agggatctgc ctccccttct atggcagggc 9120
atgaacccag agtccccact tcaggaacag gggaccctag atatgcctca gagagcatgt 9180
cttatccaga cccaagcaag gcatcatcag ctatgacatc gacctctctt gcatcaaaac 9240
tcacaactct cttcagcaca ggtcaagcag caaggtctgg ttctagttcc tctcccataa 9300
gcctatccac tgagaaagaa acaagcttcc tttcccccac tgcatccacc tccagaaaga 9360
cttcactatt tcttgggcct tccatggcaa ggcagcccaa catattggtg catcttcaga 9420
cttcagctct gacactttct ccaacatcca ctctaaatat gtcccaggag gagcctcctg 9480
agttaacctc aagccagacc attgcagaag aagagggaac aacagctgaa acacagacgt 9540
taaccttcac accatctgag accccaacat ccttgttacc tgtctcttct cccacagaac 9600
ccacagccag aagaaagagt tctccagaaa catgggcaag ctctatttca gttcctgcca 9660
agacctcctt ggttgaaaca actgatggaa cgctagtgac caccataaag atgtcaagcc 9720
aggcagcaca aggaaattcc acgtggcctg ccccagcaga ggagacgggg agcagtccag 9780
caggcacatc cccaggaagc ccagaaatgt ctaccactct caaaatcatg agctccaagg 9840
aacccagcat cagcccagag atcaggtcca ctgtgagaaa ttctccttgg aagactccag 9900
aaacaactgt tcccatggag accacagtgg aaccagtcac ccttcagtcc acagccctag 9960
gaagtggcag caccagcatc tctcacctgc ccacaggaac cacatcacca accaagtcac 10020
caacagaaaa tatgttggct acagaaaggg tctccctctc cccatcccca cctgaggctt 10080
ggaccaacct ttattctgga actccaggag ggaccaggca gtcactggcc acaatgtcct 10140
ctgtctccct agagtcacca actgctagaa gcatcacagg gactggtcag caaagcagtc 10200
cagaactggt ttcaaagaca actggaatgg aattctctat gtggcatggc tctactggag 10260
ggaccacagg ggacacacat gtctctctga gcacatcttc caatatcctt gaagaccctg 10320
taaccagccc aaactctgtg agctcattga cagataaatc caaacataaa accgagacat 10380
gggtaagcac cacagccatt ccctccactg tcctgaataa taagataatg gcagctgaac 10440
aacagacaag tcgatctgtg gatgaggctt attcatcaac tagttcttgg tcagatcaga 10500
catctgggag tgacatcacc cttggtgcat ctcctgatgt cacaaacaca ttatacatca 10560
cctccacagc acaaaccacc tcactagtgt ctctgccctc tggagaccaa ggcattacaa 10620
gcctcaccaa tccctcagga ggaaaaacaa gctctgcgtc atctgtcaca tctccttcaa 10680
tagggcttga gactctgagg gccaatgtaa gtgcagtgaa aagtgacatt gcccctactg 10740
ctgggcatct atctcagact tcatctcctg cggaagtgag catcctggac gtaaccacag 10800
ctcctactcc aggtatctcc accaccatca ccaccatggg aaccaactca atctcaacta 10860
ccacacccaa cccagaagtg ggtatgagta ccatggacag caccccggcc acagagaggc 10920
gcacaacttc tacagaacac ccttccacct ggtcttccac agctgcatca gattcctgga 10980
ctgtcacaga catgacttca aacttgaaag ttgcaagatc tcctggaaca atttccacaa 11040
tgcatacaac ttcattctta gcctcaagca ctgaattaga ctccatgtct actccccatg 11100
gccgtataac tgtcattgga accagcctgg tcactccatc ctctgatgct tcagctgtaa 11160
agacagagac cagtacaagt gaaagaacat tgagtccttc agacacaact gcatctactc 11220
ccatctcaac tttttctcgt gtccagagga tgagcatctc agttcctgac attttaagta 11280
caagttggac tcccagtagt acagaagcag aagatgtgcc tgtttcaatg gtttctacag 11340
atcatgctag tacaaagact gacccaaata cgcccctgtc cacttttctg tttgattctc 11400
tgtccactct tgactgggac actgggagat ctctgtcatc agccacagcc actacctcag 11460
ctcctcaggg ggccacaact ccccaggaac tcactttgga aaccatgatc agcccagcta 11520
cctcacagtt gcccttctct atagggcaca ttacaagtgc agtcacacca gctgcaatgg 11580
caaggagctc tggagttact ttttcaagac cagatcccac aagcaaaaag gcagagcaga 11640
cttccactca gcttcccacc accacttctg cacatccagg gcaggtgccc agatcagcag 11700
caacaactct ggatgtgatc ccacacacag caaaaactcc agatgcaact tttcagagac 11760
aagggcagac agctcttaca acagaggcaa gagctacatc tgactcctgg aatgagaaag 11820
aaaaatcaac cccaagtgca ccttggatca ctgagatgat gaattctgtc tcagaagata 11880
ccatcaagga ggttaccagc tcctccagtg tattaaggac cctgaatacg ctggacataa 11940
acttggaatc tgggacgact tcatccccaa gttggaaaag cagcccatat gagagaattg 12000
ccccttctga gtccaccaca gacaaagagg caattcaccc ttctacaaac acagtagaga 12060
ccacaggctg ggtcacaagt tccgaacatg cttctcattc cactatccca gcccactcag 12120
cgtcatccaa actcacatct ccagtggtta caacctccac cagggaacaa gcaatagttt 12180
ctatgtcaac aaccacatgg ccagagtcta caagggctag aacagagcct aattccttct 12240
tgactattga actgagggac gtcagccctt acatggacac cagctcaacc acacaaacaa 12300
gtattatctc ttccccaggt tccactgcga tcaccaaggg gcctagaaca gaaattacct 12360
cctctaagag aatatccagc tcattccttg cccagtctat gaggtcgtca gacagcccct 12420
cagaagccat caccaggctg tctaactttc ctgccatgac agaatctgga ggaatgatcc 12480
ttgctatgca aacaagtcca cctggcgcta catcactaag tgcacctact ttggatacat 12540
cagccacagc ctcctggaca gggactccac tggctacgac tcagagattt acatactcag 12600
agaagaccac tctctttagc aaaggtcctg aggatacatc acagccaagc cctccctctg 12660
tggaagaaac cagctcttcc tcttccctgg tacctatcca tgctacaacc tcgccttcca 12720
atattttgtt gacatcacaa gggcacagtc cctcctctac tccacctgtg acctcagttt 12780
tcttgtctga gacctctggc ctggggaaga ccacagacat gtcgaggata agcttggaac 12840
ctggcacaag tttacctccc aatttgagca gtacagcagg tgaggcgtta tccacttatg 12900
aagcctccag agatacaaag gcaattcatc attctgcaga cacagcagtg acgaatatgg 12960
aggcaaccag ttctgaatat tctcctatcc caggccatac aaagccatcc aaagccacat 13020
ctccattggt tacctcccac atcatggggg acatcacttc ttccacatca gtatttggct 13080
cctccgagac cacagagatt gagacagtgt cctctgtgaa ccagggactt caggagagaa 13140
gcacatccca ggtggccagc tctgctacag agacaagcac tgtcattacc catgtgtcta 13200
gtggtgatgc tactactcat gtcaccaaga cacaagccac tttctctagc ggaacatcca 13260
tctcaagccc tcatcagttt ataacttcta ccaacacatt tacagatgtg agcaccaacc 13320
cctccacctc tctgataatg acagaatctt caggagtgac catcaccacc caaacaggtc 13380
ctactggagc tgcaacacag ggtccatatc tcttggacac atcaaccatg ccttacttga 13440
cagagactcc attagctgtg actccagatt ttatgcaatc agagaagacc actctcataa 13500
gcaaaggtcc caaggatgtg tcctggacaa gccctccctc tgtggcagaa accagctatc 13560
cctcttccct gacacctttc ttggtcacaa ccatacctcc tgccacttcc acgttacaag 13620
ggcaacatac atcctctcct gtttctgcga cttcagttct tacctctgga ctggtgaaga 13680
ccacagatat gttgaacaca agcatggaac ctgtgaccaa ttcacctcaa aatttgaaca 13740
atccatcaaa tgagatactg gccactttgg cagccaccac agatatagag actattcatc 13800
cttccataaa caaagcagtg accaatatgg ggactgccag ttcagcacat gtactgcatt 13860
ccactctccc agtcagctca gaaccatcta cagccacatc tccaatggtt cctgcctcca 13920
gcatggggga cgctcttgct tctatatcaa tacctggttc tgagaccaca gacattgagg 13980
gagagccaac atcctccctg actgctggac gaaaagagaa cagcaccctc caggagatga 14040
actcaactac agagtcaaac atcatcctct ccaatgtgtc tgtgggggct attactgaag 14100
ccacaaaaat ggaagtcccc tcttttgatg caacattcat accaactcct gctcagtcaa 14160
caaagttccc agatattttc tcagtagcca gcagtagact ttcaaactct cctcccatga 14220
caatatctac ccacatgacc accacccaga cagggtcttc tggagctaca tcaaagattc 14280
cacttgcctt agacacatca accttggaaa cctcagcagg gactccatca gtggtgactg 14340
aggggtttgc ccactcaaaa ataaccactg caatgaacaa tgatgtcaag gacgtgtcac 14400
agacaaaccc tccctttcag gatgaagcca gctctccctc ttctcaagca cctgtccttg 14460
tcacaacctt accttcttct gttgctttca caccgcaatg gcacagtacc tcctctcctg 14520
tttctatgtc ctcagttctt acttcttcac tggtaaagac cgcaggcaag gtggatacaa 14580
gcttagaaac agtgaccagt tcacctcaaa gtatgagcaa cactttggat gacatatcgg 14640
tcacttcagc agccaccaca gatatagaga caacgcatcc ttccataaac acagtagtta 14700
ccaatgtggg gaccaccggt tcagcatttg aatcacattc tactgtctca gcttacccag 14760
agccatctaa agtcacatct ccaaatgtta ccacctccac catggaagac accacaattt 14820
ccagatcaat acctaaatcc tctaagacta caagaactga gactgagaca acttcctccc 14880
tgactcctaa actgagggag accagcatct cccaggagat cacctcgtcc acagagacaa 14940
gcactgttcc ttacaaagag ctcactggtg ccactaccga ggtatccagg acagatgtca 15000
cttcctctag cagtacatcc ttccctggcc ctgatcagtc cacagtgtca ctagacatct 15060
ccacagaaac caacaccagg ctgtctacct ccccaataat gacagaatct gcagaaataa 15120
ccatcaccac ccaaacaggt cctcatgggg ctacatcaca ggatactttt accatggacc 15180
catcaaatac aaccccccag gcagggatcc actcagctat gactcatgga ttttcacaat 15240
tggatgtgac cactcttatg agcagaattc cacaggatgt atcatggaca agtcctccct 15300
ctgtggataa aaccagctcc ccctcttcct ttctgtcctc acctgcaatg accacacctt 15360
ccctgatttc ttctacctta ccagaggata agctctcctc tcctatgact tcacttctca 15420
cctctggcct agtgaagatt acagacatat tacgtacacg cttggaacct gtgaccagct 15480
cacttccaaa tttcagcagc acctcagata agatactggc cacttctaaa gacagtaaag 15540
acacaaagga aatttttcct tctataaaca cagaagagac caatgtgaaa gccaacaact 15600
ctggacatga atcccattcc cctgcactgg ctgactcaga gacacccaaa gccacaactc 15660
aaatggttat caccaccact gtgggagatc cagctccttc cacatcaatg ccagtgcatg 15720
gttcctctga gactacaaac attaagagag agccaacata tttcttgact cctagactga 15780
gagagaccag tacctctcag gagtccagct ttcccacgga cacaagtttt ctactttcca 15840
aagtccccac tggtactatt actgaggtct ccagtacagg ggtcaactct tctagcaaaa 15900
tttccacccc agaccatgat aagtccacag tgccacctga caccttcaca ggagagatcc 15960
ccagggtctt cacctcctct attaagacaa aatctgcaga aatgacgatc accacccaag 16020
caagtcctcc tgagtctgca tcgcacagta cccttccctt ggacacatca accacacttt 16080
cccagggagg gactcattca actgtgactc agggattccc atactcagag gtgaccactc 16140
tcatgggcat gggtcctggg aatgtgtcat ggatgacaac tccccctgtg gaagaaacca 16200
gctctgtgtc ttccctgatg tcttcacctg ccatgacatc cccttctcct gtttcctcca 16260
catcaccaca gagcatcccc tcctctcctc ttcctgtgac tgcacttcct acttctgttc 16320
tggtgacaac cacagatgtg ttgggcacaa caagcccaga gtctgtaacc agttcacctc 16380
caaatttgag cagcatcact catgagagac cggccactta caaagacact gcacacacag 16440
aagccgccat gcatcattcc acaaacaccg cagtgaccaa tgtagggact tccgggtctg 16500
gacataaatc acaatcctct gtcctagctg actcagagac atcgaaagcc acacctctga 16560
tgagtaccac ctccaccctg ggggacacaa gtgtttccac atcaactcct aatatctctc 16620
agactaacca aattcaaaca gagccaacag catccctgag ccctagactg agggagagca 16680
gcacgtctga gaagaccagc tcaacaacag agacaaatac tgccttttct tatgtgccca 16740
caggtgctat tactcaggcc tccagaacag aaatctcctc tagcagaaca tccatctcag 16800
accttgatcg gcccacaata gcacccgaca tctccacagg aatgatcacc aggctcttca 16860
cctcccccat catgacaaaa tctgcagaaa tgaccgtcac cactcaaaca actactcctg 16920
gggctacatc acagggtatc cttccctggg acacatcaac cacacttttc cagggaggga 16980
ctcattcaac cgtgtctcag ggattcccac actcagagat aaccactctt cggagcagaa 17040
cccctggaga tgtgtcatgg atgacaactc cccctgtgga agaaaccagc tctgggtttt 17100
ccctgatgtc accttccatg acatcccctt ctcctgtttc ctccacatca ccagagagca 17160
tcccctcctc tcctctccct gtgactgcac ttcttacttc tgttctggtg acaaccacaa 17220
atgtattggg cacaacaagc ccagagcccg taacgagttc acctccaaat ttaagcagcc 17280
ccacacagga gagactgacc acttacaaag acactgcgca cacagaagcc atgcatgctt 17340
ccatgcatac aaacactgca gtggccaacg tggggacctc catttctgga catgaatcac 17400
aatcttctgt cccagctgat tcacacacat ccaaagccac atctccaatg ggtatcacct 17460
tcgccatggg ggatacaagt gtttctacat caactcctgc cttctttgag actagaattc 17520
agactgaatc aacatcctct ttgattcctg gattaaggga caccaggacg tctgaggaga 17580
tcaacactgt gacagagacc agcactgtcc tttcagaagt gcccactact actactactg 17640
aggtctccag gacagaagtt atcacttcca gcagaacaac catctcaggg cctgatcatt 17700
ccaaaatgtc accctacatc tccacagaaa ccatcaccag gctctccact tttccttttg 17760
taacaggatc cacagaaatg gccatcacca accaaacagg tcctataggg actatctcac 17820
aggctaccct taccctggac acatcaagca cagcttcctg ggaagggact cactcacctg 17880
tgactcagag atttccacac tcagaggaga ccactactat gagcagaagt actaagggcg 17940
tgtcatggca aagccctccc tctgtggaag aaaccagttc tccttcttcc ccagtgcctt 18000
tacctgcaat aacctcacat tcatctcttt attccgcagt atcaggaagt agccccactt 18060
ctgctctccc tgtgacttcc cttctcacct ctggcaggag gaagaccata gacatgttgg 18120
acacacactc agaacttgtg accagctcct taccaagtgc aagtagcttc tcaggtgaga 18180
tactcacttc tgaagcctcc acaaatacag agacaattca cttttcagag aacacagcag 18240
aaaccaatat ggggaccacc aattctatgc ataaactaca ttcctctgtc tcaatccact 18300
cccagccatc cggacacaca cctccaaagg ttactggatc tatgatggag gacgctattg 18360
tttccacatc aacacctggt tctcctgaga ctaaaaatgt tgacagagac tcaacatccc 18420
ctctgactcc tgaactgaaa gaggacagca ccgccctggt gatgaactca actacagagt 18480
caaacactgt tttctccagt gtgtccctgg atgctgctac tgaggtctcc agggcagaag 18540
tcacctacta tgatcctaca ttcatgccag cttctgctca gtcaacaaag tccccagaca 18600
tttcacctga agccagcagc agtcattcta actctcctcc cttgacaata tctacacaca 18660
agaccatcgc cacacaaaca ggtccttctg gggtgacatc tcttggccaa ctgaccctgg 18720
acacatcaac catagccacc tcagcaggaa ctccatcagc cagaactcag gattttgtag 18780
attcagaaac aaccagtgtc atgaacaatg atctcaatga tgtgttgaag acaagccctt 18840
tctctgcaga agaagccaac tctctctctt ctcaggcacc tctccttgtg acaacctcac 18900
cttctcctgt aacttccaca ttgcaagagc acagtacctc ctctcttgtt tctgtgacct 18960
cagtacccac ccctacactg gcgaagatca cagacatgga cacaaactta gaacctgtga 19020
ctcgttcacc tcaaaattta aggaacacct tggccacttc agaagccacc acagatacac 19080
acacaatgca tccttctata aacacagcag tggccaatgt ggggaccacc agttcaccaa 19140
atgaattcta ttttactgtc tcacctgact cagacccata taaagccaca tccgcagtag 19200
ttatcacttc cacctcgggg gactcaatag tttccacatc aatgcctaga tcctctgcga 19260
tgaaaaagat tgagtctgag acaactttct ccctgatatt tagactgagg gagactagca 19320
cctcccagaa aattggctca tcctcagaca caagcacggt ctttgacaaa gcattcactg 19380
ctgctactac tgaggtctcc agaacagaac tcacctcctc tagcagaaca tccatccaag 19440
gcactgaaaa gcccacaatg tcaccggaca cctccacaag atctgtcacc atgctttcta 19500
cttttgctgg cctgacaaaa tccgaagaaa ggaccattgc cacccaaaca ggtcctcata 19560
gggcgacatc acagggtacc cttacctggg acacatcaat cacaacctca caggcaggga 19620
cccactcagc tatgactcat ggattttcac aattagattt gtccactctt acgagtagag 19680
ttcctgagta catatcaggg acaagcccac cctctgtgga aaaaaccagc tcttcctctt 19740
cccttctgtc tttaccagca ataacctcac cgtcccctgt acctactaca ttaccagaaa 19800
gtaggccgtc ttctcctgtt catctgactt cactccccac ctctggccta gtgaagacca 19860
cagatatgct ggcatctgtg gccagtttac ctccaaactt gggcagcacc tcacataaga 19920
taccgactac ttcagaagac attaaagata cagagaaaat gtatccttcc acaaacatag 19980
cagtaaccaa tgtggggacc accacttctg aaaaggaatc ttattcgtct gtcccagcct 20040
actcagaacc acccaaagtc acctctccaa tggttacctc tttcaacata agggacacca 20100
ttgtttccac atccatgcct ggctcctctg agattacaag gattgagatg gagtcaacat 20160
tctccctggc tcatgggctg aagggaacca gcacctccca ggaccccatc gtatccacag 20220
agaaaagtgc tgtccttcac aagttgacca ctggtgctac tgagacctct aggacagaag 20280
ttgcctcttc tagaagaaca tccattccag gccctgatca ttccacagag tcaccagaca 20340
tctccactga agtgatcccc agcctgccta tctcccttgg cattacagaa tcttcaaata 20400
tgaccatcat cactcgaaca ggtcctcctc ttggctctac atcacagggc acatttacct 20460
tggacacacc aactacatcc tccagggcag gaacacactc gatggcgact caggaatttc 20520
cacactcaga aatgaccact gtcatgaaca aggaccctga gattctatca tggacaatcc 20580
ctccttctat agagaaaacc agcttctcct cttccctgat gccttcacca gccatgactt 20640
cacctcctgt ttcctcaaca ttaccaaaga ccattcacac cactccttct cctatgacct 20700
cactgctcac ccctagccta gtgatgacca cagacacatt gggcacaagc ccagaaccta 20760
caaccagttc acctccaaat ttgagcagta cctcacatga gatactgaca acagatgaag 20820
acaccacagc tatagaagcc atgcatcctt ccacaagcac agcagcgact aatgtggaaa 20880
ccaccagttc tggacatggg tcacaatcct ctgtcctagc tgactcagaa aaaaccaagg 20940
ccacagctcc aatggatacc acctccacca tggggcatac aactgtttcc acatcaatgt 21000
ctgtttcctc tgagactaca aaaattaaga gagagtcaac atattccttg actcctggac 21060
tgagagagac cagcatttcc caaaatgcca gcttttccac tgacacaagt attgttcttt 21120
cagaagtccc cactggtact actgctgagg tctccaggac agaagtcacc tcctctggta 21180
gaacatccat ccctggccct tctcagtcca cagttttgcc agaaatatcc acaagaacaa 21240
tgacaaggct ctttgcctcg cccaccatga cagaatcagc agaaatgacc atccccactc 21300
aaacaggtcc ttctgggtct acctcacagg atacccttac cttggacaca tccaccacaa 21360
agtcccaggc aaagactcat tcaactttga ctcagagatt tccacactca gagatgacca 21420
ctctcatgag cagaggtcct ggagatatgt catggcaaag ctctccctct ctggaaaatc 21480
ccagctctct cccttccctg ctgtctttac ctgccacaac ctcacctcct cccatttcct 21540
ccacattacc agtgactatc tcctcctctc ctcttcctgt gacttcactt ctcacctcta 21600
gcccggtaac gaccacagac atgttacaca caagcccaga acttgtaacc agttcacctc 21660
caaagctgag ccacacttca gatgagagac tgaccactgg caaggacacc acaaatacag 21720
aagctgtgca tccttccaca aacacagcag cgtccaatgt ggagattccc agctctggac 21780
atgaatcccc ttcctctgcc ttagctgact cagagacatc caaagccaca tcaccaatgt 21840
ttattacctc cacccaggag gatacaactg ttgccatatc aacccctcac ttcttggaga 21900
ctagcagaat tcagaaagag tcaatttcct ccctgagccc taaattgagg gagacaggca 21960
gttctgtgga gacaagctca gccatagaga caagtgctgt cctttctgaa gtgtccattg 22020
gtgctactac tgagatctcc aggacagaag tcacctcctc tagcagaaca tccatctctg 22080
gttctgctga gtccacaatg ttgccagaaa tatccaccac aagaaaaatc attaagttcc 22140
ctacttcccc catcctggca gaatcatcag aaatgaccat caagacccaa acaagtcctc 22200
ctgggtctac atcagagagt acctttacat tagacacatc aaccactccc tccttggtaa 22260
taacccattc gactatgact cagagattgc cacactcaga gataaccact cttgtgagta 22320
gaggtgctgg ggatgtgcca cggcccagct ctctccctgt ggaagaaaca agccctccat 22380
cttcccagct gtctttatct gccatgatct caccttctcc tgtttcttcc acattaccag 22440
caagtagcca ctcctcttct gcttctgtga cttcacttct cacaccaggc caagtgaaga 22500
ctactgaggt gttggacgca agtgcagaac ctgaaaccag ttcacctcca agtttgagca 22560
gcacctcagt tgaaatactg gccacctctg aagtcaccac agatacggag aaaattcatc 22620
ctttctcaaa cacggcagta accaaagttg gaacttccag ttctggacat gaatcccctt 22680
cctctgtcct acctgactca gagacaacca aagccacatc ggcaatgggt accatctcca 22740
ttatggggga tacaagtgtt tctacattaa ctcctgcctt atctaacact aggaaaattc 22800
agtcagagcc agcttcctca ctgaccacca gattgaggga gaccagcacc tctgaagaga 22860
ccagcttagc cacagaagca aacactgttc tttctaaagt gtccactggt gctactactg 22920
aggtctccag gacagaagcc atctccttta gcagaacatc catgtcaggc cctgagcagt 22980
ccacaatgtc acaagacatc tccataggaa ccatccccag gatttctgcc tcctctgtcc 23040
tgacagaatc tgcaaaaatg accatcacaa cccaaacagg tccttcggag tctacactag 23100
aaagtaccct taatttgaac acagcaacca caccctcttg ggtggaaacc cactctatag 23160
taattcaggg atttccacac ccagagatga ccacttccat gggcagaggt cctggaggtg 23220
tgtcatggcc tagccctccc tttgtgaaag aaaccagccc tccatcctcc ccgctgtctt 23280
tacctgccgt gacctcacct catcctgttt ccaccacatt cctagcacat atccccccct 23340
ctccccttcc tgtgacttca cttctcacct ctggcccggc gacaaccaca gatatcttgg 23400
gtacaagcac agaacctgga accagttcat cttcaagttt gagcaccacc tcccatgaga 23460
gactgaccac ttacaaagac actgcacata cagaagccgt gcatccttcc acaaacacag 23520
gagggaccaa tgtggcaacc accagctctg gatataaatc acagtcctct gtcctagctg 23580
actcatctcc aatgtgtacc acctccacca tgggggatac aagtgttctc acatcaactc 23640
ctgccttcct tgagactagg aggattcaga cagagctagc ttcctccctg acccctggat 23700
tgagggagtc cagcggctct gaagggacca gctcaggcac caagatgagc actgtcctct 23760
ctaaagtgcc cactggtgct actactgaga tctccaagga agacgtcacc tccatcccag 23820
gtcccgctca atccacaata tcaccagaca tctccacaag aaccgtcagc tggttctcta 23880
catcccctgt catgacagaa tcagcagaaa taaccatgaa cacccataca agtcctttag 23940
gggccacaac acaaggcacc agtactttgg acacgtcaag cacaacctct ttgacaatga 24000
cacactcaac tatatctcaa ggattttcac actcacagat gagcactctt atgaggaggg 24060
gtcctgagga tgtatcatgg atgagccctc cccttctgga aaaaactaga ccttcctttt 24120
ctctgatgtc ttcaccagcc acaacttcac cttctcctgt ttcctccaca ttaccagaga 24180
gcatctcttc ctctcctctt cctgtgactt cactcctcac gtctggcttg gcaaaaacta 24240
cagatatgtt gcacaaaagc tcagaacctg taaccaactc acctgcaaat ttgagcagca 24300
cctcagttga aatactggcc acctctgaag tcaccacaga tacagagaaa actcatcctt 24360
cttcaaacag aacagtgacc gatgtgggga cctccagttc tggacatgaa tccacttcct 24420
ttgtcctagc tgactcacag acatccaaag tcacatctcc aatggttatt acctccacca 24480
tggaggatac gagtgtctcc acatcaactc ctggcttttt tgagactagc agaattcaga 24540
cagaaccaac atcctccctg acccttggac tgagaaagac cagcagctct gaggggacca 24600
gcttagccac agagatgagc actgtccttt ctggagtgcc cactggtgcc actgctgaag 24660
tctccaggac agaagtcacc tcctctagca gaacatccat ctcaggcttt gctcagctca 24720
cagtgtcacc agagacttcc acagaaacca tcaccagact ccctacctcc agcataatga 24780
cagaatcagc agaaatgatg atcaagacac aaacagatcc tcctgggtct acaccagaga 24840
gtactcatac tgtggacata tcaacaacac ccaactgggt agaaacccac tcgactgtga 24900
ctcagagatt ttcacactca gagatgacca ctcttgtgag cagaagccct ggtgatatgt 24960
tatggcctag tcaatcctct gtggaagaaa ccagctctgc ctcttccctg ctgtctctgc 25020
ctgccacgac ctcaccttct cctgtttcct ctacattagt agaggatttc ccttccgctt 25080
ctcttcctgt gacttctctt ctcaaccctg gcctggtgat aaccacagac aggatgggca 25140
taagcagaga acctggaacc agttccactt caaatttgag cagcacctcc catgagagac 25200
tgaccacttt ggaagacact gtagatacag aagacatgca gccttccaca cacacagcag 25260
tgaccaacgt gaggacctcc atttctggac atgaatcaca atcttctgtc ctatctgact 25320
cagagacacc caaagccaca tctccaatgg gtaccaccta caccatgggg gaaacgagtg 25380
tttccatatc cacttctgac ttctttgaga ccagcagaat tcagatagaa ccaacatcct 25440
ccctgacttc tggattgagg gagaccagca gctctgagag gatcagctca gccacagagg 25500
gaagcactgt cctttctgaa gtgcccagtg gtgctaccac tgaggtctcc aggacagaag 25560
tgatatcctc taggggaaca tccatgtcag ggcctgatca gttcaccata tcaccagaca 25620
tctctactga agcgatcacc aggctttcta cttcccccat tatgacagaa tcagcagaaa 25680
gtgccatcac tattgagaca ggttctcctg gggctacatc agagggtacc ctcaccttgg 25740
acacctcaac aacaaccttt tggtcaggga cccactcaac tgcatctcca ggattttcac 25800
actcagagat gaccactctt atgagtagaa ctcctggaga tgtgccatgg ccgagccttc 25860
cctctgtgga agaagccagc tctgtctctt cctcactgtc ttcacctgcc atgacctcaa 25920
cttctttttt ctccacatta ccagagagca tctcctcctc tcctcatcct gtgactgcac 25980
ttctcaccct tggcccagtg aagaccacag acatgttgcg cacaagctca gaacctgaaa 26040
ccagttcacc tccaaatttg agcagcacct cagctgaaat attagccacg tctgaagtca 26100
ccaaagatag agagaaaatt catccctcct caaacacacc tgtagtcaat gtagggactg 26160
tgatttataa acatctatcc ccttcctctg ttttggctga cttagtgaca acaaaaccca 26220
catctccaat ggctaccacc tccactctgg ggaatacaag tgtttccaca tcaactcctg 26280
ccttcccaga aactatgatg acacagccaa cttcctccct gacttctgga ttaagggaga 26340
tcagtacctc tcaagagacc agctcagcaa cagagagaag tgcttctctt tctggaatgc 26400
ccactggtgc tactactaag gtctccagaa cagaagccct ctccttaggc agaacatcca 26460
ccccaggtcc tgctcaatcc acaatatcac cagaaatctc cacggaaacc atcactagaa 26520
tttctactcc cctcaccacg acaggatcag cagaaatgac catcaccccc aaaacaggtc 26580
attctggggc atcctcacaa ggtaccttta ccttggacac atcaagcaga gcctcctggc 26640
caggaactca ctcagctgca actcacagat ctccacactc agggatgacc actcctatga 26700
gcagaggtcc tgaggatgtg tcatggccaa gccgcccatc agtggaaaaa actagccctc 26760
catcttccct ggtgtcttta tctgcagtaa cctcaccttc gccactttat tccacaccat 26820
ctgagagtag ccactcatct cctctccggg tgacttctct tttcacccct gtcatgatga 26880
agaccacaga catgttggac acaagcttgg aacctgtgac cacttcacct cccagtatga 26940
atatcacctc agatgagagt ctggccactt ctaaagccac catggagaca gaggcaattc 27000
agctttcaga aaacacagct gtgactcaga tgggcaccat cagcgctaga caagaattct 27060
attcctctta tccaggcctc ccagagccat ccaaagtgac atctccagtg gtcacctctt 27120
ccaccataaa agacattgtt tctacaacca tacctgcttc ctctgagata acaagaattg 27180
agatggagtc aacatccacc ctgaccccca caccaaggga gaccagcacc tcccaggaga 27240
tccactcagc cacaaagcca agcactgttc cttacaaggc actcactagt gccacgattg 27300
aggactccat gacacaagtc atgtcctcta gcagaggacc tagccctgat cagtccacaa 27360
tgtcacaaga catatccact gaagtgatca ccaggctctc tacctccccc atcaagacag 27420
aatctacaga aatgaccatt accacccaaa caggttctcc tggggctaca tcaaggggta 27480
cccttacctt ggacacttca acaactttta tgtcagggac ccactcaact gcatctcaag 27540
gattttcaca ctcacagatg accgctctta tgagtagaac tcctggagat gtgccatggc 27600
taagccatcc ctctgtggaa gaagccagct ctgcctcttt ctcactgtct tcacctgtca 27660
tgacctcatc ttctcccgtt tcttccacat taccagacag catccactct tcttcgcttc 27720
ctgtgacatc acttctcacc tcagggctgg tgaagaccac agagctgttg ggcacaagct 27780
cagaacctga aaccagttca cccccaaatt tgagcagcac ctcagctgaa atactggcca 27840
tcactgaagt cactacagat acagagaaac tggagatgac caatgtggta acctcaggtt 27900
atacacatga atctccttcc tctgtcctag ctgactcagt gacaacaaag gccacatctt 27960
caatgggtat cacctacccc acaggagata caaatgttct cacatcaacc cctgccttct 28020
ctgacaccag taggattcaa acaaagtcaa agctctcact gactcctggg ttgatggaga 28080
ccagcatctc tgaagagacc agctctgcca cagaaaaaag cactgtcctt tctagtgtgc 28140
ccactggtgc tactactgag gtctccagga cagaagccat ctcttctagc agaacatcca 28200
tcccaggccc tgctcaatcc acaatgtcat cagacacctc catggaaacc atcactagaa 28260
tttctacccc cctcacaagg aaagaatcaa cagacatggc catcaccccc aaaacaggtc 28320
cttctggggc tacctcgcag ggtaccttta ccttggactc atcaagcaca gcctcctggc 28380
caggaactca ctcagctaca actcagagat ttccacagtc agtggtgaca actcctatga 28440
gcagaggtcc tgaggatgtg tcatggccaa gcccgctgtc tgtggaaaaa aacagccctc 28500
catcttccct ggtatcttca tcttcagtaa cctcaccttc gccactttat tccacaccat 28560
ctgggagtag ccactcctct cctgtccctg tcacttctct tttcacctct atcatgatga 28620
aggccacaga catgttggat gcaagtttgg aacctgagac cacttcagct cccaatatga 28680
atatcacctc agatgagagt ctggccgctt ctaaagccac cacggagaca gaggcaattc 28740
acgtttttga aaatacagca gcgtcccatg tggaaaccac cagtgctaca gaggaactct 28800
attcctcttc cccaggcttc tcagagccaa caaaagtgat atctccagtg gtcacctctt 28860
cctctataag agacaacatg gtttccacaa caatgcctgg ctcctctggc attacaagga 28920
ttgagataga gtcaatgtca tctctgaccc ctggactgag ggagaccaga acctcccagg 28980
acatcacctc atccacagag acaagcactg tcctttacaa gatgccctct ggtgccactc 29040
ctgaggtctc caggacagaa gttatgccct ctagcagaac atccattcct ggccctgctc 29100
agtccacaat gtcactagac atctccgatg aagttgtcac caggctgtct acctctccca 29160
tcatgacaga atctgcagaa ataaccatca ccacccaaac aggttattct ctggctacat 29220
cccaggttac ccttcccttg ggcacctcaa tgaccttttt gtcagggacc cactcaacta 29280
tgtctcaagg actttcacac tcagagatga ccaatcttat gagcaggggt cctgaaagtc 29340
tgtcatggac gagccctcgc tttgtggaaa caactagatc ttcctcttct ctgacatcat 29400
tacctctcac gacctcactt tctcctgtgt cctccacatt actagacagt agcccctcct 29460
ctcctcttcc tgtgacttca cttatcctcc caggcctggt gaagactaca gaagtgttgg 29520
atacaagctc agagcctaaa accagttcat ctccaaattt gagcagcacc tcagttgaaa 29580
taccggccac ctctgaaatc atgacagata cagagaaaat tcatccttcc tcaaacacag 29640
cggtggccaa agtgaggacc tccagttctg ttcatgaatc tcattcctct gtcctagctg 29700
actcagaaac aaccataacc ataccttcaa tgggtatcac ctccgctgtg gacgatacca 29760
ctgttttcac atcaaatcct gccttctctg agactaggag gattccgaca gagccaacat 29820
tctcattgac tcctggattc agggagacta gcacctctga agagaccacc tcaatcacag 29880
aaacaagtgc agtcctttat ggagtgccca ctagtgctac tactgaagtc tccatgacag 29940
aaatcatgtc ctctaataga atacacatcc ctgactctga tcagtccacg atgtctccag 30000
acatcatcac tgaagtgatc accaggctct cttcctcatc catgatgtca gaatcaacac 30060
aaatgaccat caccacccaa aaaagttctc ctggggctac agcacagagt actcttacct 30120
tggccacaac aacagccccc ttggcaagga cccactcaac tgttcctcct agatttttac 30180
actcagagat gacaactctt atgagtagga gtcctgaaaa tccatcatgg aagagctctc 30240
tctttgtgga aaaaactagc tcttcatctt ctctgttgtc cttacctgtc acgacctcac 30300
cttctgtttc ttccacatta ccgcagagta tcccttcctc ctctttttct gtgacttcac 30360
tcctcacccc aggcatggtg aagactacag acacaagcac agaacctgga accagtttat 30420
ctccaaatct gagtggcacc tcagttgaaa tactggctgc ctctgaagtc accacagata 30480
cagagaaaat tcatccttct tcaagcatgg cagtgaccaa tgtgggaacc accagttctg 30540
gacatgaact atattcctct gtttcaatcc actcggagcc atccaaggct acatacccag 30600
tgggtactcc ctcttccatg gctgaaacct ctatttccac atcaatgcct gctaattttg 30660
agaccacagg atttgaggct gagccatttt ctcatttgac ttctggattt aggaagacaa 30720
acatgtccct ggacaccagc tcagtcacac caacaaatac accttcttct cctgggtcca 30780
ctcacctttt acagagttcc aagactgatt tcacctcttc tgcaaaaaca tcatccccag 30840
actggcctcc agcctcacag tatactgaaa ttccagtgga cataatcacc ccctttaatg 30900
cttctccatc tattacggag tccactggga taacctcctt cccagaatcc aggtttacta 30960
tgtctgtaac agaaagtact catcatctga gtacagattt gctgccttca gctgagacta 31020
tttccactgg cacagtgatg ccttctctat cagaggccat gacttcattt gccaccactg 31080
gagttccacg agccatctca ggttcaggta gtccattctc taggacagag tcaggccctg 31140
gggatgctac tctgtccacc attgcagaga gcctgccttc atccactcct gtgccattct 31200
cctcttcaac cttcactacc actgattctt caaccatccc agccctccat gagataactt 31260
cctcttcagc taccccatat agagtggaca ccagtcttgg gacagagagc agcactactg 31320
aaggacgctt ggttatggtc agtactttgg acacttcaag ccaaccaggc aggacatctt 31380
catcacccat tttggatacc agaatgacag agagcgttga gctgggaaca gtgacaagtg 31440
cttatcaagt tccttcactc tcaacacggt tgacaagaac tgatggcatt atggaacaca 31500
tcacaaaaat acccaatgaa gcagcacaca gaggtaccat aagaccagtc aaaggccctc 31560
agacatccac ttcgcctgcc agtcctaaag gactacacac aggagggaca aaaagaatgg 31620
agaccaccac cacagctctg aagaccacca ccacagctct gaagaccact tccagagcca 31680
ccttgaccac cagtgtctat actcccactt tgggaacact gactcccctc aatgcatcaa 31740
tgcaaatggc cagcacaatc cccacagaaa tgatgatcac aaccccatat gttttccctg 31800
atgttccaga aacgacatcc tcattggcta ccagcctggg agcagaaacc agcacagctc 31860
ttcccaggac aaccccatct gttttcaata gagaatcaga gaccacagcc tcactggtct 31920
ctcgttctgg ggcagagaga agtccggtta ttcaaactct agatgtttct tctagtgagc 31980
cagatacaac agcttcatgg gttatccatc ctgcagagac catcccaact gtttccaaga 32040
caacccccaa ttttttccac agtgaattag acactgtatc ttccacagcc accagtcatg 32100
gggcagacgt cagctcagcc attccaacaa atatctcacc tagtgaacta gatgcactga 32160
ccccactggt cactatttcg gggacagata ctagtacaac attcccaaca ctgactaagt 32220
ccccacatga aacagagaca agaaccacat ggctcactca tcctgcagag accagctcaa 32280
ctattcccag aacaatcccc aatttttctc atcatgaatc agatgccaca ccttcaatag 32340
ccaccagtcc tggggcagaa accagttcag ctattccaat tatgactgtc tcacctggtg 32400
cagaagatct ggtgacctca caggtcacta gttctgggac agacagaaat atgactattc 32460
caactttgac tctttctcct ggtgaaccaa agacgatagc ctcattagtc acccatcctg 32520
aagcacagac aagttcggcc attccaactt caactatctc gcctgctgta tcacggttgg 32580
tgacctcaat ggtcaccagt ttggcggcaa agacaagtac aactaatcga gctctgacaa 32640
actcccctgg tgaaccagct acaacagttt cattggtcac gcatcctgca cagaccagcc 32700
caacagttcc ctggacaact tccatttttt tccatagtaa atcagacacc acaccttcaa 32760
tgaccaccag tcatggggca gaatccagtt cagctgttcc aactccaact gtttcaactg 32820
aggtaccagg agtagtgacc cctttggtca ccagttctag ggcagtgatc agtacaacta 32880
ttccaattct gactctttct cctggtgaac cagagaccac accttcaatg gccaccagtc 32940
atggggaaga agccagttct gctattccaa ctccaactgt ttcacctggg gtaccaggag 33000
tggtgacctc tctggtcact agttctaggg cagtgactag tacaactatt ccaattctga 33060
ctttttctct tggtgaacca gagaccacac cttcaatggc caccagtcat gggacagaag 33120
ctggctcagc tgttccaact gttttacctg aggtaccagg aatggtgacc tctctggttg 33180
ctagttctag ggcagtaacc agtacaactc ttccaactct gactctttct cctggtgaac 33240
cagagaccac accttcaatg gccaccagtc atggggcaga agccagctca actgttccaa 33300
ctgtttcacc tgaggtacca ggagtggtga cctctctggt cactagttct agtggagtaa 33360
acagtacaag tattccaact ctgattcttt ctcctggtga actagaaacc acaccttcaa 33420
tggccaccag tcatggggca gaagccagct cagctgttcc aactccaact gtttcacctg 33480
gggtatcagg agtggtgacc cctctggtca ctagttccag ggcagtgacc agtacaacta 33540
ttccaattct aactctttct tctagtgagc cagagaccac accttcaatg gccaccagtc 33600
atggggtaga agccagctca gctgttctaa ctgtttcacc tgaggtacca ggaatggtga 33660
cctctctggt cactagttct agagcagtaa ccagtacaac tattccaact ctgactattt 33720
cttctgatga accagagacc acaacttcat tggtcaccca ttctgaggca aagatgattt 33780
cagccattcc aactttagct gtctccccta ctgtacaagg gctggtgact tcactggtca 33840
ctagttctgg gtcagagacc agtgcgtttt caaatctaac tgttgcctca agtcaaccag 33900
agaccataga ctcatgggtc gctcatcctg ggacagaagc aagttctgtt gttccaactt 33960
tgactgtctc cactggtgag ccgtttacaa atatctcatt ggtcacccat cctgcagaga 34020
gtagctcaac tcttcccagg acaacctcaa ggttttccca cagtgaatta gacactatgc 34080
cttctacagt caccagtcct gaggcagaat ccagctcagc catttcaaca actatttcac 34140
ctggtatacc aggtgtgctg acatcactgg tcactagctc tgggagagac atcagtgcaa 34200
cttttccaac agtgcctgag tccccacatg aatcagaggc aacagcctca tgggttactc 34260
atcctgcagt caccagcaca acagttccca ggacaacccc taattattct catagtgaac 34320
cagacaccac accatcaata gccaccagtc ctggggcaga agccacttca gattttccaa 34380
caataactgt ctcacctgat gtaccagata tggtaacctc acaggtcact agttctggga 34440
cagacaccag tataactatt ccaactctga ctctttcttc tggtgagcca gagaccacaa 34500
cctcatttat cacctattct gagacacaca caagttcagc cattccaact ctccctgtct 34560
cccctggtgc atcaaagatg ctgacctcac tggtcatcag ttctgggaca gacagcacta 34620
caactttccc aacactgacg gagaccccat atgaaccaga gacaacagcc atacagctca 34680
ttcatcctgc agagaccaac acaatggttc ccaggacaac tcccaagttt tcccatagta 34740
agtcagacac cacactccca gtagccatca ccagtcctgg gccagaagcc agttcagctg 34800
tttcaacgac aactatctca cctgatatgt cagatctggt gacctcactg gtccctagtt 34860
ctgggacaga caccagtaca accttcccaa cattgagtga gaccccatat gaaccagaga 34920
ctacagccac gtggctcact catcctgcag aaaccagcac aacggtttct gggacaattc 34980
ccaacttttc ccatagggga tcagacactg caccctcaat ggtcaccagt cctggagtag 35040
acacgaggtc aggtgttcca actacaacca tcccacccag tataccaggg gtagtgacct 35100
cacaggtcac tagttctgca acagacacta gtacagctat tccaactttg actccttctc 35160
ctggtgaacc agagaccaca gcctcatcag ctacccatcc tgggacacag actggcttca 35220
ctgttccaat tcggactgtt ccctctagtg agccagatac aatggcttcc tgggtcactc 35280
atcctccaca gaccagcaca cctgtttcca gaacaacctc cagtttttcc catagtagtc 35340
cagatgccac acctgtaatg gccaccagtc ctaggacaga agccagttca gctgtactga 35400
caacaatctc acctggtgca ccagagatgg tgacttcaca gatcactagt tctggggcag 35460
caaccagtac aactgttcca actttgactc attctcctgg tatgccagag accacagcct 35520
tattgagcac ccatcccaga acagagacaa gtaaaacatt tcctgcttca actgtgtttc 35580
ctcaagtatc agagaccaca gcctcactca ccattagacc tggtgcagag actagcacag 35640
ctctcccaac tcagacaaca tcctctctct tcaccctact tgtaactgga accagcagag 35700
ttgatctaag tccaactgct tcacctggtg tttctgcaaa aacagcccca ctttccaccc 35760
atccagggac agaaaccagc acaatgattc caacttcaac tctttccctt ggtttactag 35820
agactacagg cttactggcc accagctctt cagcagagac cagcacgagt actctaactc 35880
tgactgtttc ccctgctgtc tctgggcttt ccagtgcctc tataacaact gataagcccc 35940
aaactgtgac ctcctggaac acagaaacct caccatctgt aacttcagtt ggacccccag 36000
aattttccag gactgtcaca ggcaccacta tgaccttgat accatcagag atgccaacac 36060
cacctaaaac cagtcatgga gaaggagtga gtccaaccac tatcttgaga actacaatgg 36120
ttgaagccac taatttagct accacaggtt ccagtcccac tgtggccaag acaacaacca 36180
ccttcaatac actggctgga agcctcttta ctcctctgac cacacctggg atgtccacct 36240
tggcctctga gagtgtgacc tcaagaacaa gttataacca tcggtcctgg atctccacca 36300
ccagcagtta taaccgtcgg tactggaccc ctgccaccag cactccagtg acttctacat 36360
tctccccagg gatttccaca tcctccatcc ccagctccac agcagccaca gtcccattca 36420
tggtgccatt caccctcaac ttcaccatca ccaacctgca gtacgaggag gacatgcggc 36480
accctggttc caggaagttc aacgccacag agagagaact gcagggtctg ctcaaaccct 36540
tgttcaggaa tagcagtctg gaatacctct attcaggctg cagactagcc tcactcaggc 36600
cagagaagga tagctcagcc acggcagtgg atgccatctg cacacatcgc cctgaccctg 36660
aagacctcgg actggacaga gagcgactgt actgggagct gagcaatctg acaaatggca 36720
tccaggagct gggcccctac accctggacc ggaacagtct ctatgtcaat ggtttcaccc 36780
atcgaagctc tatgcccacc accagcactc ctgggacctc cacagtggat gtgggaacct 36840
cagggactcc atcctccagc cccagcccca cgactgctgg ccctctcctg atgccgttca 36900
ccctcaactt caccatcacc aacctgcagt acgaggagga catgcgtcgc actggctcca 36960
ggaagttcaa caccatggag agtgtcctgc agggtctgct caagcccttg ttcaagaaca 37020
ccagtgttgg ccctctgtac tctggctgca gattgacctt gctcaggccc gagaaagatg 37080
gggcagccac tggagtggat gccatctgca cccaccgcct tgaccccaaa agccctggac 37140
tcaacaggga gcagctgtac tgggagctaa gcaaactgac caatgacatt gaagagctgg 37200
gcccctacac cctggacagg aacagtctct atgtcaatgg tttcacccat cagagctctg 37260
tgtccaccac cagcactcct gggacctcca cagtggatct cagaacctca gggactccat 37320
cctccctctc cagccccaca attatggctg ctggccctct cctggtacca ttcaccctca 37380
acttcaccat caccaacctg cagtatgggg aggacatggg tcaccctggc tccaggaagt 37440
tcaacaccac agagagggtc ctgcagggtc tgcttggtcc catattcaag aacaccagtg 37500
ttggccctct gtactctggc tgcagactga cctctctcag gtctgagaag gatggagcag 37560
ccactggagt ggatgccatc tgcatccatc atcttgaccc caaaagccct ggactcaaca 37620
gagagcggct gtactgggag ctgagccaac tgaccaatgg catcaaagag ctgggcccct 37680
acaccctgga caggaacagt ctctatgtca atggtttcac ccatcggacc tctgtgccca 37740
ccagcagcac tcctgggacc tccacagtgg accttggaac ctcagggact ccattctccc 37800
tcccaagccc cgcaactgct ggccctctcc tggtgctgtt caccctcaac ttcaccatca 37860
ccaacctgaa gtatgaggag gacatgcatc gccctggctc caggaagttc aacaccactg 37920
agagggtcct gcagactctg cttggtccta tgttcaagaa caccagtgtt ggccttctgt 37980
actctggctg cagactgacc ttgctcaggt ccgagaagga tggagcagcc actggagtgg 38040
atgccatctg cacccaccgt cttgacccca aaagccctgg agtggacagg gagcagctat 38100
actgggagct gagccagctg accaatggca tcaaagagct gggcccctac accctggaca 38160
ggaacagtct ctatgtcaat ggtttcaccc attggatccc tgtgcccacc agcagcactc 38220
ctgggacctc cacagtggac cttgggtcag ggactccatc ctccctcccc agccccacaa 38280
ctgctggccc tctcctggtg ccgttcaccc tcaacttcac catcaccaac ctgaagtacg 38340
aggaggacat gcattgccct ggctccagga agttcaacac cacagagaga gtcctgcaga 38400
gtctgcttgg tcccatgttc aagaacacca gtgttggccc tctgtactct ggctgcagac 38460
tgaccttgct caggtccgag aaggatggag cagccactgg agtggatgcc atctgcaccc 38520
accgtcttga ccccaaaagc cctggagtgg acagggagca gctatactgg gagctgagcc 38580
agctgaccaa tggcatcaaa gagctgggtc cctacaccct ggacagaaac agtctctatg 38640
tcaatggttt cacccatcag acctctgcgc ccaacaccag cactcctggg acctccacag 38700
tggaccttgg gacctcaggg actccatcct ccctccccag ccctacatct gctggccctc 38760
tcctggtgcc attcaccctc aacttcacca tcaccaacct gcagtacgag gaggacatgc 38820
atcacccagg ctccaggaag ttcaacacca cggagcgggt cctgcagggt ctgcttggtc 38880
ccatgttcaa gaacaccagt gtcggccttc tgtactctgg ctgcagactg accttgctca 38940
ggcctgagaa gaatggggca gccactggaa tggatgccat ctgcagccac cgtcttgacc 39000
ccaaaagccc tggactcaac agagagcagc tgtactggga gctgagccag ctgacccatg 39060
gcatcaaaga gctgggcccc tacaccctgg acaggaacag tctctatgtc aatggtttca 39120
cccatcggag ctctgtggcc cccaccagca ctcctgggac ctccacagtg gaccttggga 39180
cctcagggac tccatcctcc ctccccagcc ccacaacagc tgttcctctc ctggtgccgt 39240
tcaccctcaa ctttaccatc accaatctgc agtatgggga ggacatgcgt caccctggct 39300
ccaggaagtt caacaccaca gagagggtcc tgcagggtct gcttggtccc ttgttcaaga 39360
actccagtgt cggccctctg tactctggct gcagactgat ctctctcagg tctgagaagg 39420
atggggcagc cactggagtg gatgccatct gcacccacca ccttaaccct caaagccctg 39480
gactggacag ggagcagctg tactggcagc tgagccagat gaccaatggc atcaaagagc 39540
tgggccccta caccctggac cggaacagtc tctacgtcaa tggtttcacc catcggagct 39600
ctgggctcac caccagcact ccttggactt ccacagttga ccttggaacc tcagggactc 39660
catcccccgt ccccagcccc acaaccaccg gccctctcct ggtgccattc acactcaact 39720
tcaccatcac taacctacag tatgaggaga acatgggtca ccctggctcc aggaagttca 39780
acatcacgga gagtgttctg cagggtctgc tcaagccctt gttcaagagc accagtgttg 39840
gccctctgta ttctggctgc agactgacct tgctcaggcc tgagaaggat ggagtagcca 39900
ccagagtgga cgccatctgc acccaccgcc ctgaccccaa aatccctggg ctagacagac 39960
agcagctata ctgggagctg agccagctga cccacagcat cactgagctg ggaccctaca 40020
ccctggatag ggacagtctc tatgtcaatg gtttcaccca gcggagctct gtgcccacca 40080
ccagcactcc tgggactttc acagtacagc cggaaacctc tgagactcca tcatccctcc 40140
ctggccccac agccactggc cctgtcctgc tgccattcac cctcaatttt accatcacta 40200
acctgcagta tgaggaggac atgcgtcgcc ctggctccag gaagttcaac accacggaga 40260
gggtccttca gggtctgctt atgcccttgt tcaagaacac cagtgtcagc tctctgtact 40320
ctggttgcag actgaccttg ctcaggcctg agaaggatgg ggcagccacc agagtggatg 40380
ctgtctgcac ccatcgtcct gaccccaaaa gccctggact ggacagagag cggctgtact 40440
ggaagctgag ccagctgacc cacggcatca ctgagctggg cccctacacc ctggacaggc 40500
acagtctcta tgtcaatggt ttcacccatc agagctctat gacgaccacc agaactcctg 40560
atacctccac aatgcacctg gcaacctcga gaactccagc ctccctgtct ggacccatga 40620
ccgccagccc tctcctggtg ctattcacaa ttaacttcac catcactaac ctgcggtatg 40680
aggagaacat gcatcaccct ggctctagaa agtttaacac cacggagaga gtccttcagg 40740
gtctgctcag gcctgtgttc aagaacacca gtgttggccc tctgtactct ggctgcagac 40800
tgaccttgct caggcccaag aaggatgggg cagccaccaa agtggatgcc atctgcacct 40860
accgccctga tcccaaaagc cctggactgg acagagagca gctatactgg gagctgagcc 40920
agctgaccca cagcatcact gagctgggcc cctacaccct ggacagggac agtctctatg 40980
tcaatggttt cacacagcgg agctctgtgc ccaccactag cattcctggg acccccacag 41040
tggacctggg aacatctggg actccagttt ctaaacctgg tccctcggct gccagccctc 41100
tcctggtgct attcactctc aacttcacca tcaccaacct gcggtatgag gagaacatgc 41160
agcaccctgg ctccaggaag ttcaacacca cggagagggt ccttcagggc ctgctcaggt 41220
ccctgttcaa gagcaccagt gttggccctc tgtactctgg ctgcagactg actttgctca 41280
ggcctgaaaa ggatgggaca gccactggag tggatgccat ctgcacccac caccctgacc 41340
ccaaaagccc taggctggac agagagcagc tgtattggga gctgagccag ctgacccaca 41400
atatcactga gctgggcccc tatgccctgg acaacgacag cctctttgtc aatggtttca 41460
ctcatcggag ctctgtgtcc accaccagca ctcctgggac ccccacagtg tatctgggag 41520
catctaagac tccagcctcg atatttggcc cttcagctgc cagccatctc ctgatactat 41580
tcaccctcaa cttcaccatc actaacctgc ggtatgagga gaacatgtgg cctggctcca 41640
ggaagttcaa cactacagag agggtccttc agggcctgct aaggcccttg ttcaagaaca 41700
ccagtgttgg ccctctgtac tctggctgca ggctgacctt gctcaggcca gagaaagatg 41760
gggaagccac cggagtggat gccatctgca cccaccgccc tgaccccaca ggccctgggc 41820
tggacagaga gcagctgtat ttggagctga gccagctgac ccacagcatc actgagctgg 41880
gcccctacac actggacagg gacagtctct atgtcaatgg tttcacccat cggagctctg 41940
tacccaccac cagcaccggg gtggtcagcg aggagccatt cacactgaac ttcaccatca 42000
acaacctgcg ctacatggcg gacatgggcc aacccggctc cctcaagttc aacatcacag 42060
acaacgtcat gcagcacctg ctcagtcctt tgttccagag gagcagcctg ggtgcacggt 42120
acacaggctg cagggtcatc gcactaaggt ctgtgaagaa cggtgctgag acacgggtgg 42180
acctcctctg cacctacctg cagcccctca gcggcccagg tctgcctatc aagcaggtgt 42240
tccatgagct gagccagcag acccatggca tcacccggct gggcccctac tctctggaca 42300
aagacagcct ctaccttaac ggttacaatg aacctggtcc agatgagcct cctacaactc 42360
ccaagccagc caccacattc ctgcctcctc tgtcagaagc cacaacagcc atggggtacc 42420
acctgaagac cctcacactc aacttcacca tctccaatct ccagtattca ccagatatgg 42480
gcaagggctc agctacattc aactccaccg agggggtcct tcagcacctg ctcagaccct 42540
tgttccagaa gagcagcatg ggccccttct acttgggttg ccaactgatc tccctcaggc 42600
ctgagaagga tggggcagcc actggtgtgg acaccacctg cacctaccac cctgaccctg 42660
tgggccccgg gctggacata cagcagcttt actgggagct gagtcagctg acccatggtg 42720
tcacccaact gggcttctat gtcctggaca gggatagcct cttcatcaat ggctatgcac 42780
cccagaattt atcaatccgg ggcgagtacc agataaattt ccacattgtc aactggaacc 42840
tcagtaatcc agaccccaca tcctcagagt acatcaccct gctgagggac atccaggaca 42900
aggtcaccac actctacaaa ggcagtcaac tacatgacac attccgcttc tgcctggtca 42960
ccaacttgac gatggactcc gtgttggtca ctgtcaaggc attgttctcc tccaatttgg 43020
accccagcct ggtggagcaa gtctttctag ataagaccct gaatgcctca ttccattggc 43080
tgggctccac ctaccagttg gtggacatcc atgtgacaga aatggagtca tcagtttatc 43140
aaccaacaag cagctccagc acccagcact tctacctgaa tttcaccatc accaacctac 43200
catattccca ggacaaagcc cagccaggca ccaccaatta ccagaggaac aaaaggaata 43260
ttgaggatgc gctcaaccaa ctcttccgaa acagcagcat caagagttat ttttctgact 43320
gtcaagtttc aacattcagg tctgtcccca acaggcacca caccggggtg gactccctgt 43380
gtaacttctc gccactggct cggagagtag acagagttgc catctatgag gaatttctgc 43440
ggatgacccg gaatggtacc cagctgcaga acttcaccct ggacaggagc agtgtccttg 43500
tggatgggta ttctcccaac agaaatgagc ccttaactgg gaattctgac cttcccttct 43560
gggctgtcat cctcatcggc ttggcaggac tcctgggagt catcacatgc ctgatctgcg 43620
gtgtcctggt gaccacccgc cggcggaaga aggaaggaga atacaacgtc cagcaacagt 43680
gcccaggcta ctaccagtca cacctagacc tggaggatct gcaatgactg gaacttgccg 43740
gtgcctgggg tgcctttccc ccagccaggg tccaaagaag cttggctggg gcagaaataa 43800
accatattgg tcgga 43815
<210> 138
<211> 518
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bispecific
<400> 138
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
210 215 220
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
225 230 235 240
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
245 250 255
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
275 280 285
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
290 295 300
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
305 310 315 320
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
325 330 335
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
340 345 350
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
355 360 365
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
370 375 380
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
405 410 415
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
420 425 430
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
435 440 445
Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu
450 455 460
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
465 470 475 480
Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
485 490 495
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr
500 505 510
Lys Leu Gln Ile Thr Arg
515
<210> 139
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114-N3
<400> 139
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 140
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 VH NUCLEIC ACID
<400> 140
caggtaactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac actcttggta tgggtgtagg ctggattcgg 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tataacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaagg attcctccaa aaaccaggtt 240
ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatattgcca catactactg ttctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctctggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 141
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10C6 VL NUCLEIC ACID
<400> 141
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac 330
<210> 142
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 VH NUCLEIC ACID
<400> 142
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actgttggta tgggtgtagg ctggagtcgt 120
cagccctcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacatct ggtgggatga tgaagataag 180
tattataatc cagccctgaa gagtcggctc acaatctcca aggatacctc caaaaaccag 240
gtcttcctca agatcgccaa tgtggacact gcagatagtg ccacatacta ctgtactcga 300
atcgggacag ctcaggctac ggatgctttg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 143
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7B12 VL NUCLEIC ACID
<400> 143
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtatctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttcgg aaaagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgaaga tgtgggtgtt tattactgta tgcaaagtct agaatatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac taagctaaaa ataaaa 336
<210> 144
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 VH NUCLEIC ACID
<400> 144
caggttaatc tgaaagagtc tggccctggg aaattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actcttggta tgggtgtagg ttggattcgt 120
cagtcttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tataacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaggg ctacctccaa aaaccaggtt 240
ttcctcaaga tcgtcaatgt gggcactgca gatactgcca catattactg tgctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctttggac tattggggtc agggaacctc agtcaccgtt 360
tcctca 366
<210> 145
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19C11 VL NUCLEIC ACID
<400> 145
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct atccctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttctg catagtaatg gcaacactta tttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgaaaatc 240
agtagagtgg aggctgggga tgtgggtgtt tattactgta tgcagggtct agagcatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 146
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 VH NUCLEIC ACID
<400> 146
caggttactc tgaaagagtc tggccctgga atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac actcttggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tattacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaggg atacctccaa aaaccaggta 240
ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaatc 300
gggacagctc aggctacgga tgctctggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 147
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16C5 VL NUCLEIC ACID
<400> 147
gagctcgata tgacccagac tccaccctcc ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcagg 60
attaggtgcc tggccagtga ggacatttat agtggtatat cctggtatca acagaagcca 120
gggaaacctc ctacactcct gatctatggt gcatccaatt tagaatctgg ggtcccacca 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tacaccctca ccattggcgg cgtgcaggct 240
gaagatgctg ccacctacta ctgtctaggc ggttatagtt atagtagtac cttgactttt 300
ggagctggca ccaatgtgga aatcaaa 327
<210> 148
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 VH NUCLEIC ACID
<400> 148
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc actgttggta tgggtgtagg ctggagtcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgaggataag 180
tattataacc cagccctgaa gagtcggctc acaatctcca aggatacctc caaaaaccag 240
gtattcctca agatcgccaa tgtggacact gcagatactg ccacatacta ctgtactcga 300
atcgggacag ctcaggctac ggatgctttg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 149
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18C6 VL NUCLEIC ACID
<400> 149
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtcttctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag cgcctgatat attatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcaga gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaaagtct agaatatcct 300
ctcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 150
<211> 14447
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Mature Human MUC16 amino acid sequence
<400> 150
Asp Lys Thr Leu Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr
1 5 10 15
Gln Ser Leu Gly Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg
20 25 30
Gly Met Thr His Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln
35 40 45
Val Asn Gly Thr Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser
50 55 60
Gly Leu Ser Ser Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe
65 70 75 80
Thr Lys Glu Ala Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Thr Glu Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu
100 105 110
Gly Asp Ser Thr Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys
115 120 125
Ile Thr Ser Pro Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu
130 135 140
Asn Ala Pro Val Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser
145 150 155 160
His Thr Pro Gly Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser
165 170 175
Phe Leu Asp Leu Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr
180 185 190
Ser Leu Glu Leu Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Pro Gly Ser Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu
210 215 220
Ser Ser Ser Ala Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile
225 230 235 240
Phe Ser Gly Gln Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu
245 250 255
Ala Arg Ala Ser Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr
260 265 270
Leu Ser Asn Ala Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser
275 280 285
Ser Leu Gly Thr Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile
290 295 300
Leu Thr Phe His Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His
305 310 315 320
Ile Ala Lys Thr Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu
325 330 335
Gly Gly Thr Ser Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr
340 345 350
Leu Val Ser Glu Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu
355 360 365
Thr Glu Gly Thr Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala
370 375 380
Pro Gly Glu Glu Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly
385 390 395 400
Phe Thr Thr Leu Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser
405 410 415
Ser His Pro Thr Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg
420 425 430
Gln Ser Ser Ser Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala
435 440 445
Thr Thr Ser Ser Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr
450 455 460
Ala Gln Gln Phe Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser
465 470 475 480
Pro Ser Met Lys Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala
485 490 495
Pro Ile Thr Thr Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu
500 505 510
Lys Thr Ser Ser Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp
515 520 525
Thr Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala
530 535 540
Val Pro Thr Gly Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser
545 550 555 560
Gln Gly Thr Thr His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr
565 570 575
Ser Ala Asp Leu Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser
580 585 590
Pro Ala Val Ser Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr
595 600 605
Lys Pro Ser Tyr Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser
610 615 620
Leu Gln Ser Ser Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro
625 630 635 640
Leu Asn Thr Arg His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly
645 650 655
His Thr Lys Ile Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val
660 665 670
Leu Glu Asp Lys Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala
675 680 685
Thr Ser Ser Ile Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys
690 695 700
Pro Ser Ser Ala Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr
705 710 715 720
Ser Pro Glu Arg Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser
725 730 735
Pro Ser Gly Glu Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser
740 745 750
Ala Glu Thr Thr Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr
755 760 765
Ser Glu Ser Ser Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser
770 775 780
Gly Val Lys Thr Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe
785 790 795 800
Thr Ser Gly Glu Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln
805 810 815
Pro Glu Thr Ser Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser
820 825 830
Val Pro Thr Pro Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser
835 840 845
Ala Gln Phe Ser Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser
850 855 860
Ser Thr Ser Val Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser
865 870 875 880
His Leu Thr Gly Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe
885 890 895
Asn Asp Ser Ala Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro
900 905 910
Arg Phe Lys Thr Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser
915 920 925
Ala Thr Ser Leu Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro
930 935 940
Ala Thr Ser Ser Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr
945 950 955 960
Ile Leu Thr Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala
965 970 975
Ser Thr Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu
980 985 990
Asp Thr Ser His Leu Pro Ile Gly Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser
995 1000 1005
Met Asp Phe Thr Met Ala Lys Glu Ser Val Ser Met Ser Val Ser
1010 1015 1020
Pro Ser Gln Ser Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Thr Pro Gly Arg
1025 1030 1035
Thr Ser Gln Phe Val Asp Thr Phe Ser Asp Asp Val Tyr His Leu
1040 1045 1050
Thr Ser Arg Glu Ile Thr Ile Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Ala
1055 1060 1065
Leu Thr Pro Gln Met Thr Ala Thr His Pro Pro Ser Pro Asp Pro
1070 1075 1080
Gly Ser Ala Arg Ser Thr Trp Leu Gly Ile Leu Ser Ser Ser Pro
1085 1090 1095
Ser Ser Pro Thr Pro Lys Val Thr Met Ser Ser Thr Phe Ser Thr
1100 1105 1110
Gln Arg Val Thr Thr Ser Met Ile Met Asp Thr Val Glu Thr Ser
1115 1120 1125
Arg Trp Asn Met Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Ser Leu Thr Pro
1130 1135 1140
Ser Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Ile Gly Lys Ser Thr Leu Val
1145 1150 1155
Pro Leu Asp Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser Leu Glu Ala Ser Glu
1160 1165 1170
Gly Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Thr
1175 1180 1185
Pro Ser Ile His Leu Gly Ala His Ala Ser Ser Glu Ser Pro Ser
1190 1195 1200
Thr Ile Lys Leu Thr Met Ala Ser Val Val Lys Pro Gly Ser Tyr
1205 1210 1215
Thr Pro Leu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Thr His Ile His Val Ser
1220 1225 1230
Thr Ala Arg Met Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Pro Glu Met Thr
1235 1240 1245
Ala Pro Gly Glu Thr Asn Thr Gly Ser Thr Trp Asp Pro Thr Thr
1250 1255 1260
Tyr Ile Thr Thr Thr Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Ala Gln Val
1265 1270 1275
Ser Thr Pro His Ser Val Arg Thr Leu Arg Thr Thr Glu Asn His
1280 1285 1290
Pro Lys Thr Glu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Pro
1295 1300 1305
Lys Ile Ser Ser Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Thr Lys Ala
1310 1315 1320
Trp Thr Ile Thr Asp Thr Thr Glu His Ser Thr Gln Leu His Tyr
1325 1330 1335
Thr Lys Leu Ala Glu Lys Ser Ser Gly Phe Glu Thr Gln Ser Ala
1340 1345 1350
Pro Gly Pro Val Ser Val Val Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ile Gly
1355 1360 1365
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Thr Ser Asp Val Pro Gly Glu Pro Leu
1370 1375 1380
Val Leu Ala Pro Ser Glu Gln Thr Thr Ile Thr Leu Pro Met Ala
1385 1390 1395
Thr Trp Leu Ser Thr Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Ser Thr Asp
1400 1405 1410
Leu Asp Ile Ser Ser Pro Ser Ser Pro Met Ser Thr Phe Ala Ile
1415 1420 1425
Phe Pro Pro Met Ser Thr Pro Ser His Glu Leu Ser Lys Ser Glu
1430 1435 1440
Ala Asp Thr Ser Ala Ile Arg Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Asp
1445 1450 1455
Gln His Leu Gly Ile Arg Ser Leu Gly Arg Thr Gly Asp Leu Thr
1460 1465 1470
Thr Val Pro Ile Thr Pro Leu Thr Thr Thr Trp Thr Ser Val Ile
1475 1480 1485
Glu His Ser Thr Gln Ala Gln Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser
1490 1495 1500
Pro Thr His Val Thr Gln Ser Leu Lys Asp Gln Thr Ser Ile Pro
1505 1510 1515
Ala Ser Ala Ser Pro Ser His Leu Thr Glu Val Tyr Pro Glu Leu
1520 1525 1530
Gly Thr Gln Gly Arg Ser Ser Ser Glu Ala Thr Thr Phe Trp Lys
1535 1540 1545
Pro Ser Thr Asp Thr Leu Ser Arg Glu Ile Glu Thr Gly Pro Thr
1550 1555 1560
Asn Ile Gln Ser Thr Pro Pro Met Asp Asn Thr Thr Thr Gly Ser
1565 1570 1575
Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Ile Ala His Leu Pro Ile Gly
1580 1585 1590
Thr Ser Ser Pro Ala Glu Thr Ser Thr Asn Met Ala Leu Glu Arg
1595 1600 1605
Arg Ser Ser Thr Ala Thr Val Ser Met Ala Gly Thr Met Gly Leu
1610 1615 1620
Leu Val Thr Ser Ala Pro Gly Arg Ser Ile Ser Gln Ser Leu Gly
1625 1630 1635
Arg Val Ser Ser Val Leu Ser Glu Ser Thr Thr Glu Gly Val Thr
1640 1645 1650
Asp Ser Ser Lys Gly Ser Ser Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gly Asn
1655 1660 1665
Thr Ala Leu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Gly Ser
1670 1675 1680
Gln Met Ser Thr Ser Ile Pro Leu Thr Ser Ser Pro Thr Thr Pro
1685 1690 1695
Asp Val Glu Phe Ile Gly Gly Ser Thr Phe Trp Thr Lys Glu Val
1700 1705 1710
Thr Thr Val Met Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ser Ser Ala Arg Thr
1715 1720 1725
Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Met Ser Thr Ala Leu Gly Ser Thr
1730 1735 1740
Glu Asn Thr Gly Lys Glu Lys Leu Arg Thr Ala Ser Met Asp Leu
1745 1750 1755
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Met Glu Val Thr Pro Trp Ile Ser Leu
1760 1765 1770
Thr Leu Ser Asn Ala Pro Asn Thr Thr Asp Ser Leu Asp Leu Ser
1775 1780 1785
His Gly Val His Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Ala Thr Asp Arg
1790 1795 1800
Ser Leu Asn Thr Gly Val Thr Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gly
1805 1810 1815
Ser Asp Thr Ser Ser Lys Ser Leu Ser Met Gly Asn Ser Thr His
1820 1825 1830
Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile
1835 1840 1845
His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu
1850 1855 1860
Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe
1865 1870 1875
Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser
1880 1885 1890
Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr
1895 1900 1905
Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser
1910 1915 1920
Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln
1925 1930 1935
Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser
1940 1945 1950
Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser
1955 1960 1965
Pro Tyr Ser Ser Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ser Thr Ile Ser
1970 1975 1980
Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser
1985 1990 1995
Leu Pro Thr Thr Thr Trp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Glu Ala Leu
2000 2005 2010
Ser Ser Gly His Ser Gly Val Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Thr
2015 2020 2025
Glu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Lys Gln
2030 2035 2040
Arg Asn Pro Glu Thr Glu Thr His Gly Pro Gln Asn Thr Ala Ala
2045 2050 2055
Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu
2060 2065 2070
Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met
2075 2080 2085
Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser
2090 2095 2100
Thr Ala Asn Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ser Ala Gly Thr Lys
2105 2110 2115
Leu Thr Arg Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ser Glu Ser Leu Val Ser
2120 2125 2130
Phe Arg Met Asn Lys Asp Pro Trp Thr Val Ser Ile Pro Leu Gly
2135 2140 2145
Ser His Pro Thr Thr Asn Thr Glu Thr Ser Ile Pro Val Asn Ser
2150 2155 2160
Ala Gly Pro Pro Gly Leu Ser Thr Val Ala Ser Asp Val Ile Asp
2165 2170 2175
Thr Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ser Ile Pro Thr Val Ser Phe Ser
2180 2185 2190
Pro Ser Pro Asp Thr Glu Val Thr Thr Ile Ser His Phe Pro Glu
2195 2200 2205
Lys Thr Thr His Ser Phe Arg Thr Ile Ser Ser Leu Thr His Glu
2210 2215 2220
Leu Thr Ser Arg Val Thr Pro Ile Pro Gly Asp Trp Met Ser Ser
2225 2230 2235
Ala Met Ser Thr Lys Pro Thr Gly Ala Ser Pro Ser Ile Thr Leu
2240 2245 2250
Gly Glu Arg Arg Thr Ile Thr Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ser Pro
2255 2260 2265
Ile Val Leu Thr Ala Ser Phe Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Leu
2270 2275 2280
Asp Asn Glu Thr Thr Val Lys Thr Ser Asp Ile Leu Asp Ala Arg
2285 2290 2295
Lys Thr Asn Glu Leu Pro Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu
2300 2305 2310
Ile Asn Thr Ser Ile Ala Ser Ser Thr Met Asp Val Thr Lys Thr
2315 2320 2325
Ala Ser Ile Ser Pro Thr Ser Ile Ser Gly Met Thr Ala Ser Ser
2330 2335 2340
Ser Pro Ser Leu Phe Ser Ser Asp Arg Pro Gln Val Pro Thr Ser
2345 2350 2355
Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Asn
2360 2365 2370
Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Ser Asn Val Gly Gly Thr Pro Ser
2375 2380 2385
Thr Leu Pro Pro Phe Thr Ile Thr His Pro Val Glu Thr Ser Ser
2390 2395 2400
Ala Leu Leu Ala Trp Ser Arg Pro Val Arg Thr Phe Ser Thr Met
2405 2410 2415
Val Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Glu Asn Pro Thr Ser Ser Asn
2420 2425 2430
Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val
2435 2440 2445
Gly Ser Thr Thr Asp Leu Pro Ala Met Gly Phe Leu Lys Thr Ser
2450 2455 2460
Pro Ala Gly Glu Ala His Ser Leu Leu Ala Ser Thr Ile Glu Pro
2465 2470 2475
Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Leu Ser Ala Ala Val Val Thr Gly
2480 2485 2490
Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ser Glu Ser
2495 2500 2505
Lys Ala Ile His Ser Ser Pro Gln Thr Pro Thr Thr Pro Thr Ser
2510 2515 2520
Gly Ala Asn Trp Glu Thr Ser Ala Thr Pro Glu Ser Leu Leu Val
2525 2530 2535
Val Thr Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ser Lys Ile Leu Val
2540 2545 2550
Thr Asp Thr Ile Leu Phe Ser Thr Val Ser Thr Pro Pro Ser Lys
2555 2560 2565
Phe Pro Ser Thr Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ser Phe Pro Thr Leu
2570 2575 2580
Leu Pro Asp Thr Pro Ala Ile Pro Leu Thr Ala Thr Glu Pro Thr
2585 2590 2595
Ser Ser Leu Ala Thr Ser Phe Asp Ser Thr Pro Leu Val Thr Ile
2600 2605 2610
Ala Ser Asp Ser Leu Gly Thr Val Pro Glu Thr Thr Leu Thr Met
2615 2620 2625
Ser Glu Thr Ser Asn Gly Asp Ala Leu Val Leu Lys Thr Val Ser
2630 2635 2640
Asn Pro Asp Arg Ser Ile Pro Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Thr
2645 2650 2655
Glu Ser Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ser Lys Ile Val
2660 2665 2670
Ala Pro Arg Asn Thr Thr Tyr Glu Gly Ser Ile Thr Val Ala Leu
2675 2680 2685
Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln
2690 2695 2700
Ser Ser Glu Asn Ser Glu Thr Thr Ala Leu Val Asp Ser Ser Ala
2705 2710 2715
Gly Leu Glu Arg Ala Ser Val Met Pro Leu Thr Thr Gly Ser Gln
2720 2725 2730
Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser
2735 2740 2745
Thr Gly Thr Lys Thr Phe Ser Ser Leu Pro Leu Thr Met Asn Pro
2750 2755 2760
Gly Glu Val Thr Ala Met Ser Glu Ile Thr Thr Asn Arg Leu Thr
2765 2770 2775
Ala Thr Gln Ser Thr Ala Pro Lys Gly Ile Pro Val Lys Pro Thr
2780 2785 2790
Ser Ala Glu Ser Gly Leu Leu Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser
2795 2800 2805
Pro Ser Lys Ala Phe Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Pro Thr Trp
2810 2815 2820
Gly Ile Pro Gln Ser Thr Leu Thr Phe Glu Phe Ser Glu Val Pro
2825 2830 2835
Ser Leu Asp Thr Lys Ser Ala Ser Leu Pro Thr Pro Gly Gln Ser
2840 2845 2850
Leu Asn Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser
2855 2860 2865
Leu Ser Lys Ser Pro Glu Lys Asn Pro Arg Ala Arg Met Met Thr
2870 2875 2880
Ser Thr Lys Ala Ile Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ser Thr Gly Phe
2885 2890 2895
Thr Glu Thr Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Ser Met Ala Gly His
2900 2905 2910
Glu Pro Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Asp Pro Arg Tyr Ala
2915 2920 2925
Ser Glu Ser Met Ser Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Ala Ser Ser Ala
2930 2935 2940
Met Thr Ser Thr Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Phe Ser
2945 2950 2955
Thr Gly Gln Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser
2960 2965 2970
Leu Ser Thr Glu Lys Glu Thr Ser Phe Leu Ser Pro Thr Ala Ser
2975 2980 2985
Thr Ser Arg Lys Thr Ser Leu Phe Leu Gly Pro Ser Met Ala Arg
2990 2995 3000
Gln Pro Asn Ile Leu Val His Leu Gln Thr Ser Ala Leu Thr Leu
3005 3010 3015
Ser Pro Thr Ser Thr Leu Asn Met Ser Gln Glu Glu Pro Pro Glu
3020 3025 3030
Leu Thr Ser Ser Gln Thr Ile Ala Glu Glu Glu Gly Thr Thr Ala
3035 3040 3045
Glu Thr Gln Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro Thr Ser
3050 3055 3060
Leu Leu Pro Val Ser Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala Arg Arg Lys
3065 3070 3075
Ser Ser Pro Glu Thr Trp Ala Ser Ser Ile Ser Val Pro Ala Lys
3080 3085 3090
Thr Ser Leu Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Leu Val Thr Thr Ile
3095 3100 3105
Lys Met Ser Ser Gln Ala Ala Gln Gly Asn Ser Thr Trp Pro Ala
3110 3115 3120
Pro Ala Glu Glu Thr Gly Ser Ser Pro Ala Gly Thr Ser Pro Gly
3125 3130 3135
Ser Pro Glu Met Ser Thr Thr Leu Lys Ile Met Ser Ser Lys Glu
3140 3145 3150
Pro Ser Ile Ser Pro Glu Ile Arg Ser Thr Val Arg Asn Ser Pro
3155 3160 3165
Trp Lys Thr Pro Glu Thr Thr Val Pro Met Glu Thr Thr Val Glu
3170 3175 3180
Pro Val Thr Leu Gln Ser Thr Ala Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ser
3185 3190 3195
Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Thr Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro
3200 3205 3210
Thr Glu Asn Met Leu Ala Thr Glu Arg Val Ser Leu Ser Pro Ser
3215 3220 3225
Pro Pro Glu Ala Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Pro Gly Gly
3230 3235 3240
Thr Arg Gln Ser Leu Ala Thr Met Ser Ser Val Ser Leu Glu Ser
3245 3250 3255
Pro Thr Ala Arg Ser Ile Thr Gly Thr Gly Gln Gln Ser Ser Pro
3260 3265 3270
Glu Leu Val Ser Lys Thr Thr Gly Met Glu Phe Ser Met Trp His
3275 3280 3285
Gly Ser Thr Gly Gly Thr Thr Gly Asp Thr His Val Ser Leu Ser
3290 3295 3300
Thr Ser Ser Asn Ile Leu Glu Asp Pro Val Thr Ser Pro Asn Ser
3305 3310 3315
Val Ser Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys His Lys Thr Glu Thr Trp
3320 3325 3330
Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Ser Thr Val Leu Asn Asn Lys Ile
3335 3340 3345
Met Ala Ala Glu Gln Gln Thr Ser Arg Ser Val Asp Glu Ala Tyr
3350 3355 3360
Ser Ser Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gln Thr Ser Gly Ser Asp Ile
3365 3370 3375
Thr Leu Gly Ala Ser Pro Asp Val Thr Asn Thr Leu Tyr Ile Thr
3380 3385 3390
Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asp
3395 3400 3405
Gln Gly Ile Thr Ser Leu Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys Thr Ser
3410 3415 3420
Ser Ala Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Ile Gly Leu Glu Thr Leu
3425 3430 3435
Arg Ala Asn Val Ser Ala Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Thr Ala
3440 3445 3450
Gly His Leu Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ala Glu Val Ser Ile Leu
3455 3460 3465
Asp Val Thr Thr Ala Pro Thr Pro Gly Ile Ser Thr Thr Ile Thr
3470 3475 3480
Thr Met Gly Thr Asn Ser Ile Ser Thr Thr Thr Pro Asn Pro Glu
3485 3490 3495
Val Gly Met Ser Thr Met Asp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Arg Arg
3500 3505 3510
Thr Thr Ser Thr Glu His Pro Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ala
3515 3520 3525
Ser Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Met Thr Ser Asn Leu Lys Val
3530 3535 3540
Ala Arg Ser Pro Gly Thr Ile Ser Thr Met His Thr Thr Ser Phe
3545 3550 3555
Leu Ala Ser Ser Thr Glu Leu Asp Ser Met Ser Thr Pro His Gly
3560 3565 3570
Arg Ile Thr Val Ile Gly Thr Ser Leu Val Thr Pro Ser Ser Asp
3575 3580 3585
Ala Ser Ala Val Lys Thr Glu Thr Ser Thr Ser Glu Arg Thr Leu
3590 3595 3600
Ser Pro Ser Asp Thr Thr Ala Ser Thr Pro Ile Ser Thr Phe Ser
3605 3610 3615
Arg Val Gln Arg Met Ser Ile Ser Val Pro Asp Ile Leu Ser Thr
3620 3625 3630
Ser Trp Thr Pro Ser Ser Thr Glu Ala Glu Asp Val Pro Val Ser
3635 3640 3645
Met Val Ser Thr Asp His Ala Ser Thr Lys Thr Asp Pro Asn Thr
3650 3655 3660
Pro Leu Ser Thr Phe Leu Phe Asp Ser Leu Ser Thr Leu Asp Trp
3665 3670 3675
Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Ser Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala
3680 3685 3690
Pro Gln Gly Ala Thr Thr Pro Gln Glu Leu Thr Leu Glu Thr Met
3695 3700 3705
Ile Ser Pro Ala Thr Ser Gln Leu Pro Phe Ser Ile Gly His Ile
3710 3715 3720
Thr Ser Ala Val Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Ser Gly Val
3725 3730 3735
Thr Phe Ser Arg Pro Asp Pro Thr Ser Lys Lys Ala Glu Gln Thr
3740 3745 3750
Ser Thr Gln Leu Pro Thr Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln Val
3755 3760 3765
Pro Arg Ser Ala Ala Thr Thr Leu Asp Val Ile Pro His Thr Ala
3770 3775 3780
Lys Thr Pro Asp Ala Thr Phe Gln Arg Gln Gly Gln Thr Ala Leu
3785 3790 3795
Thr Thr Glu Ala Arg Ala Thr Ser Asp Ser Trp Asn Glu Lys Glu
3800 3805 3810
Lys Ser Thr Pro Ser Ala Pro Trp Ile Thr Glu Met Met Asn Ser
3815 3820 3825
Val Ser Glu Asp Thr Ile Lys Glu Val Thr Ser Ser Ser Ser Val
3830 3835 3840
Leu Arg Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu Glu Ser Gly Thr
3845 3850 3855
Thr Ser Ser Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Tyr Glu Arg Ile Ala
3860 3865 3870
Pro Ser Glu Ser Thr Thr Asp Lys Glu Ala Ile His Pro Ser Thr
3875 3880 3885
Asn Thr Val Glu Thr Thr Gly Trp Val Thr Ser Ser Glu His Ala
3890 3895 3900
Ser His Ser Thr Ile Pro Ala His Ser Ala Ser Ser Lys Leu Thr
3905 3910 3915
Ser Pro Val Val Thr Thr Ser Thr Arg Glu Gln Ala Ile Val Ser
3920 3925 3930
Met Ser Thr Thr Thr Trp Pro Glu Ser Thr Arg Ala Arg Thr Glu
3935 3940 3945
Pro Asn Ser Phe Leu Thr Ile Glu Leu Arg Asp Val Ser Pro Tyr
3950 3955 3960
Met Asp Thr Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser Ile Ile Ser Ser Pro
3965 3970 3975
Gly Ser Thr Ala Ile Thr Lys Gly Pro Arg Thr Glu Ile Thr Ser
3980 3985 3990
Ser Lys Arg Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Gln Ser Met Arg Ser
3995 4000 4005
Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Asn Phe Pro
4010 4015 4020
Ala Met Thr Glu Ser Gly Gly Met Ile Leu Ala Met Gln Thr Ser
4025 4030 4035
Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Leu Asp Thr Ser
4040 4045 4050
Ala Thr Ala Ser Trp Thr Gly Thr Pro Leu Ala Thr Thr Gln Arg
4055 4060 4065
Phe Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe Ser Lys Gly Pro Glu
4070 4075 4080
Asp Thr Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser
4085 4090 4095
Ser Ser Ser Leu Val Pro Ile His Ala Thr Thr Ser Pro Ser Asn
4100 4105 4110
Ile Leu Leu Thr Ser Gln Gly His Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro
4115 4120 4125
Val Thr Ser Val Phe Leu Ser Glu Thr Ser Gly Leu Gly Lys Thr
4130 4135 4140
Thr Asp Met Ser Arg Ile Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ser Leu Pro
4145 4150 4155
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ala Gly Glu Ala Leu Ser Thr Tyr Glu
4160 4165 4170
Ala Ser Arg Asp Thr Lys Ala Ile His His Ser Ala Asp Thr Ala
4175 4180 4185
Val Thr Asn Met Glu Ala Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Pro Ile Pro
4190 4195 4200
Gly His Thr Lys Pro Ser Lys Ala Thr Ser Pro Leu Val Thr Ser
4205 4210 4215
His Ile Met Gly Asp Ile Thr Ser Ser Thr Ser Val Phe Gly Ser
4220 4225 4230
Ser Glu Thr Thr Glu Ile Glu Thr Val Ser Ser Val Asn Gln Gly
4235 4240 4245
Leu Gln Glu Arg Ser Thr Ser Gln Val Ala Ser Ser Ala Thr Glu
4250 4255 4260
Thr Ser Thr Val Ile Thr His Val Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr
4265 4270 4275
His Val Thr Lys Thr Gln Ala Thr Phe Ser Ser Gly Thr Ser Ile
4280 4285 4290
Ser Ser Pro His Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe Thr Asp
4295 4300 4305
Val Ser Thr Asn Pro Ser Thr Ser Leu Ile Met Thr Glu Ser Ser
4310 4315 4320
Gly Val Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro Thr Gly Ala Ala Thr
4325 4330 4335
Gln Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Thr Met Pro Tyr Leu Thr
4340 4345 4350
Glu Thr Pro Leu Ala Val Thr Pro Asp Phe Met Gln Ser Glu Lys
4355 4360 4365
Thr Thr Leu Ile Ser Lys Gly Pro Lys Asp Val Ser Trp Thr Ser
4370 4375 4380
Pro Pro Ser Val Ala Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Ser Leu Thr Pro
4385 4390 4395
Phe Leu Val Thr Thr Ile Pro Pro Ala Thr Ser Thr Leu Gln Gly
4400 4405 4410
Gln His Thr Ser Ser Pro Val Ser Ala Thr Ser Val Leu Thr Ser
4415 4420 4425
Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Asn Thr Ser Met Glu Pro
4430 4435 4440
Val Thr Asn Ser Pro Gln Asn Leu Asn Asn Pro Ser Asn Glu Ile
4445 4450 4455
Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Thr Asp Ile Glu Thr Ile His Pro
4460 4465 4470
Ser Ile Asn Lys Ala Val Thr Asn Met Gly Thr Ala Ser Ser Ala
4475 4480 4485
His Val Leu His Ser Thr Leu Pro Val Ser Ser Glu Pro Ser Thr
4490 4495 4500
Ala Thr Ser Pro Met Val Pro Ala Ser Ser Met Gly Asp Ala Leu
4505 4510 4515
Ala Ser Ile Ser Ile Pro Gly Ser Glu Thr Thr Asp Ile Glu Gly
4520 4525 4530
Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ala Gly Arg Lys Glu Asn Ser Thr
4535 4540 4545
Leu Gln Glu Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser Asn Ile Ile Leu Ser
4550 4555 4560
Asn Val Ser Val Gly Ala Ile Thr Glu Ala Thr Lys Met Glu Val
4565 4570 4575
Pro Ser Phe Asp Ala Thr Phe Ile Pro Thr Pro Ala Gln Ser Thr
4580 4585 4590
Lys Phe Pro Asp Ile Phe Ser Val Ala Ser Ser Arg Leu Ser Asn
4595 4600 4605
Ser Pro Pro Met Thr Ile Ser Thr His Met Thr Thr Thr Gln Thr
4610 4615 4620
Gly Ser Ser Gly Ala Thr Ser Lys Ile Pro Leu Ala Leu Asp Thr
4625 4630 4635
Ser Thr Leu Glu Thr Ser Ala Gly Thr Pro Ser Val Val Thr Glu
4640 4645 4650
Gly Phe Ala His Ser Lys Ile Thr Thr Ala Met Asn Asn Asp Val
4655 4660 4665
Lys Asp Val Ser Gln Thr Asn Pro Pro Phe Gln Asp Glu Ala Ser
4670 4675 4680
Ser Pro Ser Ser Gln Ala Pro Val Leu Val Thr Thr Leu Pro Ser
4685 4690 4695
Ser Val Ala Phe Thr Pro Gln Trp His Ser Thr Ser Ser Pro Val
4700 4705 4710
Ser Met Ser Ser Val Leu Thr Ser Ser Leu Val Lys Thr Ala Gly
4715 4720 4725
Lys Val Asp Thr Ser Leu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gln Ser
4730 4735 4740
Met Ser Asn Thr Leu Asp Asp Ile Ser Val Thr Ser Ala Ala Thr
4745 4750 4755
Thr Asp Ile Glu Thr Thr His Pro Ser Ile Asn Thr Val Val Thr
4760 4765 4770
Asn Val Gly Thr Thr Gly Ser Ala Phe Glu Ser His Ser Thr Val
4775 4780 4785
Ser Ala Tyr Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Asn Val Thr
4790 4795 4800
Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Thr Ile Ser Arg Ser Ile Pro Lys
4805 4810 4815
Ser Ser Lys Thr Thr Arg Thr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Ser Leu
4820 4825 4830
Thr Pro Lys Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Glu Ile Thr Ser
4835 4840 4845
Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val Pro Tyr Lys Glu Leu Thr Gly Ala
4850 4855 4860
Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Asp Val Thr Ser Ser Ser Ser Thr
4865 4870 4875
Ser Phe Pro Gly Pro Asp Gln Ser Thr Val Ser Leu Asp Ile Ser
4880 4885 4890
Thr Glu Thr Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu
4895 4900 4905
Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro His Gly Ala
4910 4915 4920
Thr Ser Gln Asp Thr Phe Thr Met Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro
4925 4930 4935
Gln Ala Gly Ile His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln Leu
4940 4945 4950
Asp Val Thr Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Gln Asp Val Ser Trp
4955 4960 4965
Thr Ser Pro Pro Ser Val Asp Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe
4970 4975 4980
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Thr Pro Ser Leu Ile Ser Ser Thr
4985 4990 4995
Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ser Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr
5000 5005 5010
Ser Gly Leu Val Lys Ile Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Leu Glu
5015 5020 5025
Pro Val Thr Ser Ser Leu Pro Asn Phe Ser Ser Thr Ser Asp Lys
5030 5035 5040
Ile Leu Ala Thr Ser Lys Asp Ser Lys Asp Thr Lys Glu Ile Phe
5045 5050 5055
Pro Ser Ile Asn Thr Glu Glu Thr Asn Val Lys Ala Asn Asn Ser
5060 5065 5070
Gly His Glu Ser His Ser Pro Ala Leu Ala Asp Ser Glu Thr Pro
5075 5080 5085
Lys Ala Thr Thr Gln Met Val Ile Thr Thr Thr Val Gly Asp Pro
5090 5095 5100
Ala Pro Ser Thr Ser Met Pro Val His Gly Ser Ser Glu Thr Thr
5105 5110 5115
Asn Ile Lys Arg Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Thr Pro Arg Leu Arg
5120 5125 5130
Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ser Ser Phe Pro Thr Asp Thr Ser
5135 5140 5145
Phe Leu Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Thr Ile Thr Glu Val Ser
5150 5155 5160
Ser Thr Gly Val Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Thr Pro Asp His
5165 5170 5175
Asp Lys Ser Thr Val Pro Pro Asp Thr Phe Thr Gly Glu Ile Pro
5180 5185 5190
Arg Val Phe Thr Ser Ser Ile Lys Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr
5195 5200 5205
Ile Thr Thr Gln Ala Ser Pro Pro Glu Ser Ala Ser His Ser Thr
5210 5215 5220
Leu Pro Leu Asp Thr Ser Thr Thr Leu Ser Gln Gly Gly Thr His
5225 5230 5235
Ser Thr Val Thr Gln Gly Phe Pro Tyr Ser Glu Val Thr Thr Leu
5240 5245 5250
Met Gly Met Gly Pro Gly Asn Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro
5255 5260 5265
Val Glu Glu Thr Ser Ser Val Ser Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala
5270 5275 5280
Met Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Gln Ser Ile
5285 5290 5295
Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ala Leu Pro Thr Ser Val Leu
5300 5305 5310
Val Thr Thr Thr Asp Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Ser Val
5315 5320 5325
Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Ile Thr His Glu Arg Pro
5330 5335 5340
Ala Thr Tyr Lys Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Ala Met His His
5345 5350 5355
Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Ser Gly Ser Gly
5360 5365 5370
His Lys Ser Gln Ser Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Ser Lys
5375 5380 5385
Ala Thr Pro Leu Met Ser Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asp Thr Ser
5390 5395 5400
Val Ser Thr Ser Thr Pro Asn Ile Ser Gln Thr Asn Gln Ile Gln
5405 5410 5415
Thr Glu Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Arg Glu Ser Ser
5420 5425 5430
Thr Ser Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Phe
5435 5440 5445
Ser Tyr Val Pro Thr Gly Ala Ile Thr Gln Ala Ser Arg Thr Glu
5450 5455 5460
Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Asp Leu Asp Arg Pro Thr
5465 5470 5475
Ile Ala Pro Asp Ile Ser Thr Gly Met Ile Thr Arg Leu Phe Thr
5480 5485 5490
Ser Pro Ile Met Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr Val Thr Thr Gln
5495 5500 5505
Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Pro Trp Asp
5510 5515 5520
Thr Ser Thr Thr Leu Phe Gln Gly Gly Thr His Ser Thr Val Ser
5525 5530 5535
Gln Gly Phe Pro His Ser Glu Ile Thr Thr Leu Arg Ser Arg Thr
5540 5545 5550
Pro Gly Asp Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro Val Glu Glu Thr
5555 5560 5565
Ser Ser Gly Phe Ser Leu Met Ser Pro Ser Met Thr Ser Pro Ser
5570 5575 5580
Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Leu
5585 5590 5595
Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Ser Val Leu Val Thr Thr Thr Asn
5600 5605 5610
Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Pro Val Thr Ser Ser Pro Pro
5615 5620 5625
Asn Leu Ser Ser Pro Thr Gln Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys Asp
5630 5635 5640
Thr Ala His Thr Glu Ala Met His Ala Ser Met His Thr Asn Thr
5645 5650 5655
Ala Val Ala Asn Val Gly Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln
5660 5665 5670
Ser Ser Val Pro Ala Asp Ser His Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro
5675 5680 5685
Met Gly Ile Thr Phe Ala Met Gly Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser
5690 5695 5700
Thr Pro Ala Phe Phe Glu Thr Arg Ile Gln Thr Glu Ser Thr Ser
5705 5710 5715
Ser Leu Ile Pro Gly Leu Arg Asp Thr Arg Thr Ser Glu Glu Ile
5720 5725 5730
Asn Thr Val Thr Glu Thr Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Thr
5735 5740 5745
Thr Thr Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Thr Ser Ser
5750 5755 5760
Arg Thr Thr Ile Ser Gly Pro Asp His Ser Lys Met Ser Pro Tyr
5765 5770 5775
Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Ser Thr Phe Pro Phe Val
5780 5785 5790
Thr Gly Ser Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Gln Thr Gly Pro Ile
5795 5800 5805
Gly Thr Ile Ser Gln Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Thr
5810 5815 5820
Ala Ser Trp Glu Gly Thr His Ser Pro Val Thr Gln Arg Phe Pro
5825 5830 5835
His Ser Glu Glu Thr Thr Thr Met Ser Arg Ser Thr Lys Gly Val
5840 5845 5850
Ser Trp Gln Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Pro Ser
5855 5860 5865
Ser Pro Val Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ser His Ser Ser Leu Tyr
5870 5875 5880
Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr
5885 5890 5895
Ser Leu Leu Thr Ser Gly Arg Arg Lys Thr Ile Asp Met Leu Asp
5900 5905 5910
Thr His Ser Glu Leu Val Thr Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Ser
5915 5920 5925
Phe Ser Gly Glu Ile Leu Thr Ser Glu Ala Ser Thr Asn Thr Glu
5930 5935 5940
Thr Ile His Phe Ser Glu Asn Thr Ala Glu Thr Asn Met Gly Thr
5945 5950 5955
Thr Asn Ser Met His Lys Leu His Ser Ser Val Ser Ile His Ser
5960 5965 5970
Gln Pro Ser Gly His Thr Pro Pro Lys Val Thr Gly Ser Met Met
5975 5980 5985
Glu Asp Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Pro Glu Thr
5990 5995 6000
Lys Asn Val Asp Arg Asp Ser Thr Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu
6005 6010 6015
Lys Glu Asp Ser Thr Ala Leu Val Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser
6020 6025 6030
Asn Thr Val Phe Ser Ser Val Ser Leu Asp Ala Ala Thr Glu Val
6035 6040 6045
Ser Arg Ala Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Pro Thr Phe Met Pro Ala
6050 6055 6060
Ser Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Asp Ile Ser Pro Glu Ala Ser
6065 6070 6075
Ser Ser His Ser Asn Ser Pro Pro Leu Thr Ile Ser Thr His Lys
6080 6085 6090
Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Ser Leu Gly
6095 6100 6105
Gln Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ile Ala Thr Ser Ala Gly Thr
6110 6115 6120
Pro Ser Ala Arg Thr Gln Asp Phe Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser
6125 6130 6135
Val Met Asn Asn Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Thr Ser Pro Phe
6140 6145 6150
Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ser Leu Ser Ser Gln Ala Pro Leu Leu
6155 6160 6165
Val Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Thr Ser Thr Leu Gln Glu His
6170 6175 6180
Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Thr Ser Val Pro Thr Pro Thr
6185 6190 6195
Leu Ala Lys Ile Thr Asp Met Asp Thr Asn Leu Glu Pro Val Thr
6200 6205 6210
Arg Ser Pro Gln Asn Leu Arg Asn Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ala
6215 6220 6225
Thr Thr Asp Thr His Thr Met His Pro Ser Ile Asn Thr Ala Val
6230 6235 6240
Ala Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Pro Asn Glu Phe Tyr Phe Thr
6245 6250 6255
Val Ser Pro Asp Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val
6260 6265 6270
Ile Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Val Ser Thr Ser Met Pro
6275 6280 6285
Arg Ser Ser Ala Met Lys Lys Ile Glu Ser Glu Thr Thr Phe Ser
6290 6295 6300
Leu Ile Phe Arg Leu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Lys Ile Gly
6305 6310 6315
Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Val Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala
6320 6325 6330
Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Leu Thr Ser Ser Ser Arg
6335 6340 6345
Thr Ser Ile Gln Gly Thr Glu Lys Pro Thr Met Ser Pro Asp Thr
6350 6355 6360
Ser Thr Arg Ser Val Thr Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly Leu Thr
6365 6370 6375
Lys Ser Glu Glu Arg Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro His Arg
6380 6385 6390
Ala Thr Ser Gln Gly Thr Leu Thr Trp Asp Thr Ser Ile Thr Thr
6395 6400 6405
Ser Gln Ala Gly Thr His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln
6410 6415 6420
Leu Asp Leu Ser Thr Leu Thr Ser Arg Val Pro Glu Tyr Ile Ser
6425 6430 6435
Gly Thr Ser Pro Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
6440 6445 6450
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ile Thr Ser Pro Ser Pro Val Pro Thr
6455 6460 6465
Thr Leu Pro Glu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Val His Leu Thr Ser
6470 6475 6480
Leu Pro Thr Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Ala Ser
6485 6490 6495
Val Ala Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gly Ser Thr Ser His Lys Ile
6500 6505 6510
Pro Thr Thr Ser Glu Asp Ile Lys Asp Thr Glu Lys Met Tyr Pro
6515 6520 6525
Ser Thr Asn Ile Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Thr Ser Glu
6530 6535 6540
Lys Glu Ser Tyr Ser Ser Val Pro Ala Tyr Ser Glu Pro Pro Lys
6545 6550 6555
Val Thr Ser Pro Met Val Thr Ser Phe Asn Ile Arg Asp Thr Ile
6560 6565 6570
Val Ser Thr Ser Met Pro Gly Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu
6575 6580 6585
Met Glu Ser Thr Phe Ser Leu Ala His Gly Leu Lys Gly Thr Ser
6590 6595 6600
Thr Ser Gln Asp Pro Ile Val Ser Thr Glu Lys Ser Ala Val Leu
6605 6610 6615
His Lys Leu Thr Thr Gly Ala Thr Glu Thr Ser Arg Thr Glu Val
6620 6625 6630
Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Asp His Ser Thr
6635 6640 6645
Glu Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Pro Ser Leu Pro Ile
6650 6655 6660
Ser Leu Gly Ile Thr Glu Ser Ser Asn Met Thr Ile Ile Thr Arg
6665 6670 6675
Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ser Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu
6680 6685 6690
Asp Thr Pro Thr Thr Ser Ser Arg Ala Gly Thr His Ser Met Ala
6695 6700 6705
Thr Gln Glu Phe Pro His Ser Glu Met Thr Thr Val Met Asn Lys
6710 6715 6720
Asp Pro Glu Ile Leu Ser Trp Thr Ile Pro Pro Ser Ile Glu Lys
6725 6730 6735
Thr Ser Phe Ser Ser Ser Leu Met Pro Ser Pro Ala Met Thr Ser
6740 6745 6750
Pro Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Ile His Thr Thr Pro
6755 6760 6765
Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr Pro Ser Leu Val Met Thr Thr
6770 6775 6780
Asp Thr Leu Gly Thr Ser Pro Glu Pro Thr Thr Ser Ser Pro Pro
6785 6790 6795
Asn Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Ile Leu Thr Thr Asp Glu Asp
6800 6805 6810
Thr Thr Ala Ile Glu Ala Met His Pro Ser Thr Ser Thr Ala Ala
6815 6820 6825
Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly His Gly Ser Gln Ser Ser
6830 6835 6840
Val Leu Ala Asp Ser Glu Lys Thr Lys Ala Thr Ala Pro Met Asp
6845 6850 6855
Thr Thr Ser Thr Met Gly His Thr Thr Val Ser Thr Ser Met Ser
6860 6865 6870
Val Ser Ser Glu Thr Thr Lys Ile Lys Arg Glu Ser Thr Tyr Ser
6875 6880 6885
Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser
6890 6895 6900
Phe Ser Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Ser Glu Val Pro Thr Gly
6905 6910 6915
Thr Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Gly Arg
6920 6925 6930
Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile
6935 6940 6945
Ser Thr Arg Thr Met Thr Arg Leu Phe Ala Ser Pro Thr Met Thr
6950 6955 6960
Glu Ser Ala Glu Met Thr Ile Pro Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly
6965 6970 6975
Ser Thr Ser Gln Asp Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Lys
6980 6985 6990
Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His
6995 7000 7005
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Gly Pro Gly Asp Met Ser
7010 7015 7020
Trp Gln Ser Ser Pro Ser Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Pro Ser
7025 7030 7035
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser
7040 7045 7050
Thr Leu Pro Val Thr Ile Ser Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ser
7055 7060 7065
Leu Leu Thr Ser Ser Pro Val Thr Thr Thr Asp Met Leu His Thr
7070 7075 7080
Ser Pro Glu Leu Val Thr Ser Ser Pro Pro Lys Leu Ser His Thr
7085 7090 7095
Ser Asp Glu Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asp Thr Thr Asn Thr Glu
7100 7105 7110
Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ile
7115 7120 7125
Pro Ser Ser Gly His Glu Ser Pro Ser Ser Ala Leu Ala Asp Ser
7130 7135 7140
Glu Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro Met Phe Ile Thr Ser Thr Gln
7145 7150 7155
Glu Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr Pro His Phe Leu Glu Thr
7160 7165 7170
Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu
7175 7180 7185
Arg Glu Thr Gly Ser Ser Val Glu Thr Ser Ser Ala Ile Glu Thr
7190 7195 7200
Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7205 7210 7215
Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Gly
7220 7225 7230
Ser Ala Glu Ser Thr Met Leu Pro Glu Ile Ser Thr Thr Arg Lys
7235 7240 7245
Ile Ile Lys Phe Pro Thr Ser Pro Ile Leu Ala Glu Ser Ser Glu
7250 7255 7260
Met Thr Ile Lys Thr Gln Thr Ser Pro Pro Gly Ser Thr Ser Glu
7265 7270 7275
Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Pro Ser Leu Val Ile
7280 7285 7290
Thr His Ser Thr Met Thr Gln Arg Leu Pro His Ser Glu Ile Thr
7295 7300 7305
Thr Leu Val Ser Arg Gly Ala Gly Asp Val Pro Arg Pro Ser Ser
7310 7315 7320
Leu Pro Val Glu Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Gln Leu Ser Leu
7325 7330 7335
Ser Ala Met Ile Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Ala
7340 7345 7350
Ser Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro
7355 7360 7365
Gly Gln Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Ala Ser Ala Glu Pro
7370 7375 7380
Glu Thr Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile
7385 7390 7395
Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
7400 7405 7410
Phe Ser Asn Thr Ala Val Thr Lys Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly
7415 7420 7425
His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Pro Asp Ser Glu Thr Thr Lys
7430 7435 7440
Ala Thr Ser Ala Met Gly Thr Ile Ser Ile Met Gly Asp Thr Ser
7445 7450 7455
Val Ser Thr Leu Thr Pro Ala Leu Ser Asn Thr Arg Lys Ile Gln
7460 7465 7470
Ser Glu Pro Ala Ser Ser Leu Thr Thr Arg Leu Arg Glu Thr Ser
7475 7480 7485
Thr Ser Glu Glu Thr Ser Leu Ala Thr Glu Ala Asn Thr Val Leu
7490 7495 7500
Ser Lys Val Ser Thr Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu
7505 7510 7515
Ala Ile Ser Phe Ser Arg Thr Ser Met Ser Gly Pro Glu Gln Ser
7520 7525 7530
Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Ile Gly Thr Ile Pro Arg Ile Ser
7535 7540 7545
Ala Ser Ser Val Leu Thr Glu Ser Ala Lys Met Thr Ile Thr Thr
7550 7555 7560
Gln Thr Gly Pro Ser Glu Ser Thr Leu Glu Ser Thr Leu Asn Leu
7565 7570 7575
Asn Thr Ala Thr Thr Pro Ser Trp Val Glu Thr His Ser Ile Val
7580 7585 7590
Ile Gln Gly Phe Pro His Pro Glu Met Thr Thr Ser Met Gly Arg
7595 7600 7605
Gly Pro Gly Gly Val Ser Trp Pro Ser Pro Pro Phe Val Lys Glu
7610 7615 7620
Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Val Thr Ser
7625 7630 7635
Pro His Pro Val Ser Thr Thr Phe Leu Ala His Ile Pro Pro Ser
7640 7645 7650
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr
7655 7660 7665
Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Ser Ser
7670 7675 7680
Ser Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys
7685 7690 7695
Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Gly
7700 7705 7710
Gly Thr Asn Val Ala Thr Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Ser Gln Ser
7715 7720 7725
Ser Val Leu Ala Asp Ser Ser Pro Met Cys Thr Thr Ser Thr Met
7730 7735 7740
Gly Asp Thr Ser Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Leu Glu Thr
7745 7750 7755
Arg Arg Ile Gln Thr Glu Leu Ala Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu
7760 7765 7770
Arg Glu Ser Ser Gly Ser Glu Gly Thr Ser Ser Gly Thr Lys Met
7775 7780 7785
Ser Thr Val Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Glu Ile
7790 7795 7800
Ser Lys Glu Asp Val Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr
7805 7810 7815
Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Thr
7820 7825 7830
Ser Pro Val Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Met Asn Thr His
7835 7840 7845
Thr Ser Pro Leu Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Ser Thr Leu Asp
7850 7855 7860
Thr Ser Ser Thr Thr Ser Leu Thr Met Thr His Ser Thr Ile Ser
7865 7870 7875
Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Ser Thr Leu Met Arg Arg Gly
7880 7885 7890
Pro Glu Asp Val Ser Trp Met Ser Pro Pro Leu Leu Glu Lys Thr
7895 7900 7905
Arg Pro Ser Phe Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala Thr Thr Ser Pro
7910 7915 7920
Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro
7925 7930 7935
Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ala Lys Thr Thr
7940 7945 7950
Asp Met Leu His Lys Ser Ser Glu Pro Val Thr Asn Ser Pro Ala
7955 7960 7965
Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val
7970 7975 7980
Thr Thr Asp Thr Glu Lys Thr His Pro Ser Ser Asn Arg Thr Val
7985 7990 7995
Thr Asp Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly His Glu Ser Thr Ser Phe
8000 8005 8010
Val Leu Ala Asp Ser Gln Thr Ser Lys Val Thr Ser Pro Met Val
8015 8020 8025
Ile Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro
8030 8035 8040
Gly Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Thr Glu Pro Thr Ser Ser
8045 8050 8055
Leu Thr Leu Gly Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ser
8060 8065 8070
Leu Ala Thr Glu Met Ser Thr Val Leu Ser Gly Val Pro Thr Gly
8075 8080 8085
Ala Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg
8090 8095 8100
Thr Ser Ile Ser Gly Phe Ala Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr
8105 8110 8115
Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Pro Thr Ser Ser Ile Met Thr
8120 8125 8130
Glu Ser Ala Glu Met Met Ile Lys Thr Gln Thr Asp Pro Pro Gly
8135 8140 8145
Ser Thr Pro Glu Ser Thr His Thr Val Asp Ile Ser Thr Thr Pro
8150 8155 8160
Asn Trp Val Glu Thr His Ser Thr Val Thr Gln Arg Phe Ser His
8165 8170 8175
Ser Glu Met Thr Thr Leu Val Ser Arg Ser Pro Gly Asp Met Leu
8180 8185 8190
Trp Pro Ser Gln Ser Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser
8195 8200 8205
Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser
8210 8215 8220
Thr Leu Val Glu Asp Phe Pro Ser Ala Ser Leu Pro Val Thr Ser
8225 8230 8235
Leu Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp Arg Met Gly Ile
8240 8245 8250
Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Ser Thr
8255 8260 8265
Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr Val Asp Thr Glu
8270 8275 8280
Asp Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr Asn Val Arg Thr
8285 8290 8295
Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val Leu Ser Asp Ser
8300 8305 8310
Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr Thr Tyr Thr Met
8315 8320 8325
Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp Phe Phe Glu Thr
8330 8335 8340
Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu
8345 8350 8355
Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser Ala Thr Glu Gly
8360 8365 8370
Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Thr Glu Val
8375 8380 8385
Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr Ser Met Ser Gly
8390 8395 8400
Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Ala Ile
8405 8410 8415
Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ser
8420 8425 8430
Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Glu Gly
8435 8440 8445
Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe Trp Ser Gly Thr
8450 8455 8460
His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser Glu Met Thr Thr
8465 8470 8475
Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Pro Ser Leu Pro
8480 8485 8490
Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser Ser Pro
8495 8500 8505
Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile
8510 8515 8520
Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gly Pro
8525 8530 8535
Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr
8540 8545 8550
Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala
8555 8560 8565
Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile His Pro Ser Ser
8570 8575 8580
Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile Tyr Lys His Leu
8585 8590 8595
Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr Thr Lys Pro Thr
8600 8605 8610
Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn Thr Ser Val Ser
8615 8620 8625
Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met Thr Gln Pro Thr
8630 8635 8640
Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu
8645 8650 8655
Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Met Pro
8660 8665 8670
Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu Ala Leu Ser Leu
8675 8680 8685
Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Ile Ser Pro
8690 8695 8700
Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr
8705 8710 8715
Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro Lys Thr Gly His
8720 8725 8730
Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ser
8735 8740 8745
Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala Thr His Arg Ser
8750 8755 8760
Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp
8765 8770 8775
Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Pro Pro
8780 8785 8790
Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu
8795 8800 8805
Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser Pro Leu Arg Val
8810 8815 8820
Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr Thr Asp Met Leu
8825 8830 8835
Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro Pro Ser Met Asn
8840 8845 8850
Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys Ala Thr Met Glu
8855 8860 8865
Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala Val Thr Gln Met
8870 8875 8880
Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser Ser Tyr Pro Gly
8885 8890 8895
Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val Val Thr Ser Ser
8900 8905 8910
Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro Ala Ser Ser Glu
8915 8920 8925
Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Thr
8930 8935 8940
Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His Ser Ala Thr Lys
8945 8950 8955
Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser Ala Thr Ile Glu
8960 8965 8970
Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg Gly Pro Ser Pro
8975 8980 8985
Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Thr
8990 8995 9000
Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser Thr Glu Met Thr
9005 9010 9015
Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Arg Gly Thr
9020 9025 9030
Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser Gly Thr His Ser
9035 9040 9045
Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Thr Ala Leu Met
9050 9055 9060
Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Leu Ser His Pro Ser Val
9065 9070 9075
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser Ser Pro Val Met
9080 9085 9090
Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Asp Ser Ile His
9095 9100 9105
Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Val
9110 9115 9120
Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr Ser
9125 9130 9135
Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala Ile
9140 9145 9150
Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu Met Thr Asn Val
9155 9160 9165
Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala
9170 9175 9180
Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met Gly Ile Thr Tyr
9185 9190 9195
Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Ser
9200 9205 9210
Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu Ser Leu Thr Pro
9215 9220 9225
Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr
9230 9235 9240
Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr
9245 9250 9255
Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile
9260 9265 9270
Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp Thr Ser Met Glu
9275 9280 9285
Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg Lys Glu Ser Thr
9290 9295 9300
Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ser
9305 9310 9315
Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Trp Pro
9320 9325 9330
Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro Gln Ser Val Val
9335 9340 9345
Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser
9350 9355 9360
Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser
9365 9370 9375
Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser
9380 9385 9390
Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr Ser Leu Phe Thr
9395 9400 9405
Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp Ala Ser Leu Glu
9410 9415 9420
Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu
9425 9430 9435
Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr Glu Ala Ile His
9440 9445 9450
Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu Thr Thr Ser Ala
9455 9460 9465
Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe Ser Glu Pro Thr
9470 9475 9480
Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser Ile Arg Asp Asn
9485 9490 9495
Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly Ile Thr Arg Ile
9500 9505 9510
Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr
9515 9520 9525
Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val
9530 9535 9540
Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu Val Ser Arg Thr
9545 9550 9555
Glu Val Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln
9560 9565 9570
Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Arg Leu
9575 9580 9585
Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr
9590 9595 9600
Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Val Thr Leu Pro
9605 9610 9615
Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr His Ser Thr Met
9620 9625 9630
Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn Leu Met Ser Arg
9635 9640 9645
Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg Phe Val Glu Thr
9650 9655 9660
Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro Leu Thr Thr Ser
9665 9670 9675
Leu Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Leu Asp Ser Ser Pro Ser Ser
9680 9685 9690
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Lys Thr
9695 9700 9705
Thr Glu Val Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Thr Ser Ser Ser
9710 9715 9720
Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Pro Ala Thr Ser Glu
9725 9730 9735
Ile Met Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro Ser Ser Asn Thr Ala
9740 9745 9750
Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His Glu Ser His Ser
9755 9760 9765
Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Met
9770 9775 9780
Gly Ile Thr Ser Ala Val Asp Asp Thr Thr Val Phe Thr Ser Asn
9785 9790 9795
Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr Glu Pro Thr Phe
9800 9805 9810
Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr Ser Glu Glu Thr
9815 9820 9825
Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu Tyr Gly Val Pro Thr
9830 9835 9840
Ser Ala Thr Thr Glu Val Ser Met Thr Glu Ile Met Ser Ser Asn
9845 9850 9855
Arg Ile His Ile Pro Asp Ser Asp Gln Ser Thr Met Ser Pro Asp
9860 9865 9870
Ile Ile Thr Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Ser Ser Ser Met Met
9875 9880 9885
Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys Ser Ser Pro
9890 9895 9900
Gly Ala Thr Ala Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Thr Thr Ala
9905 9910 9915
Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro Arg Phe Leu His
9920 9925 9930
Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro Glu Asn Pro Ser
9935 9940 9945
Trp Lys Ser Ser Leu Phe Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser
9950 9955 9960
Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr
9965 9970 9975
Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser Val Thr Ser Leu
9980 9985 9990
Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr Ser Thr Glu Pro
9995 10000 10005
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr Ser Val Glu Ile
10010 10015 10020
Leu Ala Ala Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro
10025 10030 10035
Ser Ser Ser Met Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Gly
10040 10045 10050
His Glu Leu Tyr Ser Ser Val Ser Ile His Ser Glu Pro Ser Lys
10055 10060 10065
Ala Thr Tyr Pro Val Gly Thr Pro Ser Ser Met Ala Glu Thr Ser
10070 10075 10080
Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr Thr Gly Phe Glu
10085 10090 10095
Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Phe Arg Lys Thr Asn
10100 10105 10110
Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Val Thr Pro Thr Asn Thr Pro Ser
10115 10120 10125
Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gln Ser Ser Lys Thr Asp Phe
10130 10135 10140
Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp Pro Pro Ala Ser
10145 10150 10155
Gln Tyr Thr Glu Ile Pro Val Asp Ile Ile Thr Pro Phe Asn Ala
10160 10165 10170
Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu
10175 10180 10185
Ser Arg Phe Thr Met Ser Val Thr Glu Ser Thr His His Leu Ser
10190 10195 10200
Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser Thr Gly Thr Val
10205 10210 10215
Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe Ala Thr Thr Gly
10220 10225 10230
Val Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro Phe Ser Arg Thr
10235 10240 10245
Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr Ile Ala Glu Ser
10250 10255 10260
Leu Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser Ser Thr Phe Thr
10265 10270 10275
Thr Thr Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ala Leu His Glu Ile Thr Ser
10280 10285 10290
Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser Leu Gly Thr Glu
10295 10300 10305
Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val Ser Thr Leu Asp
10310 10315 10320
Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Asp
10325 10330 10335
Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr Val Thr Ser Ala
10340 10345 10350
Tyr Gln Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr Arg Thr Asp Gly
10355 10360 10365
Ile Met Glu His Ile Thr Lys Ile Pro Asn Glu Ala Ala His Arg
10370 10375 10380
Gly Thr Ile Arg Pro Val Lys Gly Pro Gln Thr Ser Thr Ser Pro
10385 10390 10395
Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr Lys Arg Met Glu
10400 10405 10410
Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr
10415 10420 10425
Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr Thr Pro Thr Leu
10430 10435 10440
Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gln Met Ala Ser Thr
10445 10450 10455
Ile Pro Thr Glu Met Met Ile Thr Thr Pro Tyr Val Phe Pro Asp
10460 10465 10470
Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Ala Glu
10475 10480 10485
Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Asn Arg
10490 10495 10500
Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Ala Glu
10505 10510 10515
Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser Ser Ser Glu Pro
10520 10525 10530
Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val Ile His Pro Ala Glu Thr Ile Pro
10535 10540 10545
Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His Ser Glu Leu Asp
10550 10555 10560
Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala Asp Val Ser Ser
10565 10570 10575
Ala Ile Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu Asp Ala Leu Thr
10580 10585 10590
Pro Leu Val Thr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro
10595 10600 10605
Thr Leu Thr Lys Ser Pro His Glu Thr Glu Thr Arg Thr Thr Trp
10610 10615 10620
Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile Pro Arg Thr Ile
10625 10630 10635
Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr Pro Ser Ile Ala
10640 10645 10650
Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile Pro Ile Met Thr
10655 10660 10665
Val Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Val Thr Ser Gln Val Thr Ser
10670 10675 10680
Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser
10685 10690 10695
Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Val Thr His Pro Glu
10700 10705 10710
Ala Gln Thr Ser Ser Ala Ile Pro Thr Ser Thr Ile Ser Pro Ala
10715 10720 10725
Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys
10730 10735 10740
Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser Pro Gly Glu Pro
10745 10750 10755
Ala Thr Thr Val Ser Leu Val Thr His Pro Ala Gln Thr Ser Pro
10760 10765 10770
Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His Ser Lys Ser Asp
10775 10780 10785
Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala Glu Ser Ser Ser
10790 10795 10800
Ala Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Thr Glu Val Pro Gly Val Val
10805 10810 10815
Thr Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Ile Ser Thr Thr Ile
10820 10825 10830
Pro Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser
10835 10840 10845
Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ile Pro Thr
10850 10855 10860
Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val Thr Ser Leu Val
10865 10870 10875
Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr
10880 10885 10890
Phe Ser Leu Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser
10895 10900 10905
His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr Val Leu Pro Glu
10910 10915 10920
Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser Ser Arg Ala Val
10925 10930 10935
Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro
10940 10945 10950
Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser
10955 10960 10965
Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro Gly Val Val Thr
10970 10975 10980
Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser Thr Ser Ile Pro
10985 10990 10995
Thr Leu Ile Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr Thr Pro Ser Met
11000 11005 11010
Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala Val Pro Thr Pro
11015 11020 11025
Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr Pro Leu Val Thr
11030 11035 11040
Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu
11045 11050 11055
Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His
11060 11065 11070
Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val Ser Pro Glu Val
11075 11080 11085
Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr
11090 11095 11100
Ser Thr Thr Ile Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Asp Glu Pro Glu
11105 11110 11115
Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala Lys Met Ile Ser
11120 11125 11130
Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Ser Pro Thr Val Gln Gly Leu Val
11135 11140 11145
Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr Ser Ala Phe Ser
11150 11155 11160
Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr Ile Asp Ser Trp
11165 11170 11175
Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val Val Pro Thr Leu
11180 11185 11190
Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn Ile Ser Leu Val Thr
11195 11200 11205
His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Thr Thr Ser Arg
11210 11215 11220
Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser Thr Val Thr Ser
11225 11230 11235
Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr Thr Ile Ser Pro
11240 11245 11250
Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Arg
11255 11260 11265
Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu Ser Pro His Glu
11270 11275 11280
Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro Ala Val Thr Ser
11285 11290 11295
Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser His Ser Glu Pro
11300 11305 11310
Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Ala Thr
11315 11320 11325
Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp Val Pro Asp Met
11330 11335 11340
Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Ile Thr
11345 11350 11355
Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro Glu Thr Thr Thr
11360 11365 11370
Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser Ser Ala Ile Pro
11375 11380 11385
Thr Leu Pro Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Met Leu Thr Ser Leu
11390 11395 11400
Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr Phe Pro Thr Leu
11405 11410 11415
Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ile Gln Leu Ile
11420 11425 11430
His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg Thr Thr Pro Lys
11435 11440 11445
Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro Val Ala Ile Thr
11450 11455 11460
Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Ile
11465 11470 11475
Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu Val Pro Ser Ser
11480 11485 11490
Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu Ser Glu Thr Pro
11495 11500 11505
Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu
11510 11515 11520
Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn Phe Ser His Arg
11525 11530 11535
Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser Pro Gly Val Asp
11540 11545 11550
Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro Pro Ser Ile Pro
11555 11560 11565
Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Asp Thr Ser
11570 11575 11580
Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr
11585 11590 11595
Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln Thr Gly Phe Thr
11600 11605 11610
Val Pro Ile Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro Asp Thr Met Ala
11615 11620 11625
Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gln Thr Ser Thr Pro Val Ser Arg
11630 11635 11640
Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp Ala Thr Pro Val
11645 11650 11655
Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr
11660 11665 11670
Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr Ser Gln Ile Thr
11675 11680 11685
Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Leu Thr His
11690 11695 11700
Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu Ser Thr His Pro
11705 11710 11715
Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser Thr Val Phe Pro
11720 11725 11730
Gln Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Arg Pro Gly Ala
11735 11740 11745
Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Phe
11750 11755 11760
Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp Leu Ser Pro Thr
11765 11770 11775
Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro Leu Ser Thr His
11780 11785 11790
Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr Ser Thr Leu Ser
11795 11800 11805
Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ser Ser
11810 11815 11820
Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr Val Ser Pro Ala
11825 11830 11835
Val Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr Asp Lys Pro Gln
11840 11845 11850
Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro Ser Val Thr Ser
11855 11860 11865
Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr Gly Thr Thr Met
11870 11875 11880
Thr Leu Ile Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro Lys Thr Ser His
11885 11890 11895
Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg Thr Thr Met Val
11900 11905 11910
Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser Pro Thr Val Ala
11915 11920 11925
Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr
11930 11935 11940
Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Val
11945 11950 11955
Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp Ile Ser Thr Thr
11960 11965 11970
Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala Thr Ser Thr Pro
11975 11980 11985
Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ser Ile Pro
11990 11995 12000
Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val Pro Phe Thr Leu
12005 12010 12015
Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His
12020 12025 12030
Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg Glu Leu Gln Gly
12035 12040 12045
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr
12050 12055 12060
Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser
12065 12070 12075
Ala Thr Ala Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Glu
12080 12085 12090
Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Asn
12095 12100 12105
Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg
12110 12115 12120
Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Met Pro
12125 12130 12135
Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Gly Thr Ser
12140 12145 12150
Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
12155 12160 12165
Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr
12170 12175 12180
Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met
12185 12190 12195
Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr
12200 12205 12210
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
12215 12220 12225
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
12230 12235 12240
His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu
12245 12250 12255
Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile Glu Glu Leu Gly
12260 12265 12270
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
12275 12280 12285
His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr
12290 12295 12300
Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro
12305 12310 12315
Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn
12320 12325 12330
Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp Met Gly His Pro
12335 12340 12345
Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu
12350 12355 12360
Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
12365 12370 12375
Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala
12380 12385 12390
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser
12395 12400 12405
Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu
12410 12415 12420
Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn
12425 12430 12435
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr
12440 12445 12450
Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly
12455 12460 12465
Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu
12470 12475 12480
Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu
12485 12490 12495
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu
12500 12505 12510
Arg Val Leu Gln Thr Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser
12515 12520 12525
Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser
12530 12535 12540
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
12545 12550 12555
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr
12560 12565 12570
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro
12575 12580 12585
Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His
12590 12595 12600
Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
12605 12610 12615
Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr
12620 12625 12630
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr
12635 12640 12645
Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys
12650 12655 12660
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Ser Leu Leu Gly Pro Met
12665 12670 12675
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
12680 12685 12690
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
12695 12700 12705
Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp
12710 12715 12720
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile
12725 12730 12735
Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val
12740 12745 12750
Asn Gly Phe Thr His Gln Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ser Thr Pro
12755 12760 12765
Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser
12770 12775 12780
Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr
12785 12790 12795
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His
12800 12805 12810
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
12815 12820 12825
Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu
12830 12835 12840
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly
12845 12850 12855
Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Ile Cys Ser His Arg Leu Asp Pro
12860 12865 12870
Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
12875 12880 12885
Gln Leu Thr His Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp
12890 12895 12900
Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
12905 12910 12915
Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
12920 12925 12930
Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Val Pro
12935 12940 12945
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln
12950 12955 12960
Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr
12965 12970 12975
Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Leu Phe Lys Asn
12980 12985 12990
Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ile Ser Leu
12995 13000 13005
Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys
13010 13015 13020
Thr His His Leu Asn Pro Gln Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln
13025 13030 13035
Leu Tyr Trp Gln Leu Ser Gln Met Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
13040 13045 13050
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe
13055 13060 13065
Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr Ser Thr Pro Trp Thr Ser
13070 13075 13080
Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Pro Val Pro Ser
13085 13090 13095
Pro Thr Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
13100 13105 13110
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asn Met Gly His Pro Gly
13115 13120 13125
Ser Arg Lys Phe Asn Ile Thr Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu
13130 13135 13140
Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly
13145 13150 13155
Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Val Ala Thr
13160 13165 13170
Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ile Pro
13175 13180 13185
Gly Leu Asp Arg Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr
13190 13195 13200
His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser
13205 13210 13215
Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr
13220 13225 13230
Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gln Pro Glu Thr Ser Glu Thr
13235 13240 13245
Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala Thr Gly Pro Val Leu Leu
13250 13255 13260
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu
13265 13270 13275
Asp Met Arg Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
13280 13285 13290
Val Leu Gln Gly Leu Leu Met Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val
13295 13300 13305
Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu
13310 13315 13320
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp Ala Val Cys Thr His Arg
13325 13330 13335
Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp
13340 13345 13350
Lys Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr
13355 13360 13365
Thr Leu Asp Arg His Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln
13370 13375 13380
Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro Asp Thr Ser Thr Met His
13385 13390 13395
Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Pro Met Thr
13400 13405 13410
Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile Thr
13415 13420 13425
Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His His Pro Gly Ser Arg Lys
13430 13435 13440
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val
13445 13450 13455
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
13460 13465 13470
Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val Asp
13475 13480 13485
Ala Ile Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp
13490 13495 13500
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile
13505 13510 13515
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
13520 13525 13530
Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Ile Pro
13535 13540 13545
Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Val Ser
13550 13555 13560
Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr
13565 13570 13575
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Gln
13580 13585 13590
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
13595 13600 13605
Gly Leu Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu
13610 13615 13620
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly
13625 13630 13635
Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Pro Asp Pro
13640 13645 13650
Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser
13655 13660 13665
Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ala Leu Asp
13670 13675 13680
Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val
13685 13690 13695
Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Pro Thr Val Tyr Leu Gly Ala
13700 13705 13710
Ser Lys Thr Pro Ala Ser Ile Phe Gly Pro Ser Ala Ala Ser His
13715 13720 13725
Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg
13730 13735 13740
Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr
13745 13750 13755
Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr
13760 13765 13770
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
13775 13780 13785
Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
13790 13795 13800
His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
13805 13810 13815
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly
13820 13825 13830
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
13835 13840 13845
His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu
13850 13855 13860
Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met
13865 13870 13875
Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp
13880 13885 13890
Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser
13895 13900 13905
Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
13910 13915 13920
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr
13925 13930 13935
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe
13940 13945 13950
His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro
13955 13960 13965
Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu
13970 13975 13980
Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr
13985 13990 13995
Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His
14000 14005 14010
Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr
14015 14020 14025
Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu
14030 14035 14040
Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
14045 14050 14055
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro
14060 14065 14070
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr
14075 14080 14085
His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr
14090 14095 14100
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe
14105 14110 14115
Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro
14120 14125 14130
Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile
14135 14140 14145
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr
14150 14155 14160
Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr
14165 14170 14175
Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr
14180 14185 14190
Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe
14195 14200 14205
Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp
14210 14215 14220
Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln
14225 14230 14235
Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln
14240 14245 14250
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn Phe Thr
14255 14260 14265
Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala Gln Pro Gly Thr
14270 14275 14280
Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
14285 14290 14295
Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys
14300 14305 14310
Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr Gly
14315 14320 14325
Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
14330 14335 14340
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly
14345 14350 14355
Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val
14360 14365 14370
Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser
14375 14380 14385
Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu
14390 14395 14400
Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr
14405 14410 14415
Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys
14420 14425 14430
Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
14435 14440 14445
<210> 151
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114-N1
<400> 151
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 152
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114-N2
<400> 152
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 153
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114-N12
<400> 153
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 154
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114-N123
<400> 154
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c344 N-term of first tandem repeat
<400> 155
Trp Glu Leu Ser Gln Leu
1 5
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c344 C-term of first tandem repeat
<400> 156
Thr Gly Val Asp Ser Leu Cys
1 5
<210> 157
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c344 N-term of ectodomain
<400> 157
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg
1 5
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c344 C-term of ectodomain
<400> 158
Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
1 5
<210> 159
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Transmembrane
<400> 159
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
1 5 10 15
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val
20 25
<210> 160
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cytoplasmic tail
<400> 160
Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln
1 5 10 15
Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
20 25 30
<210> 161
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114 ectodomain
<400> 161
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50 55
<210> 162
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c80 ectodomain
<400> 162
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Asp Leu Pro
20
<210> 163
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c86 ectodomain
<400> 163
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50 55
<210> 164
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c86 transmembrane
<400> 164
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
1 5 10 15
Thr Cys Leu Ile Cys Gly
20
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c86 cytoplasmic
<400> 165
Asp Leu Glu Asp Leu Gln
1 5
<210> 166
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16 3(N to A)c114 ectodomain
<400> 166
Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
50 55
<210> 167
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LGALS3 sugar binding domain
<400> 167
Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Arg Met Leu Ile
1 5 10 15
Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile Ala Leu Asp
20 25 30
Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe Asn
35 40 45
Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn
50 55 60
Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu Ser Gly Lys
65 70 75 80
Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe Lys Val Ala
85 90 95
Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val Lys Lys Leu
100 105 110
Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp Leu Thr Ser
115 120 125
<210> 168
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16 nonglycosylated peptide 2
<400> 168
Cys Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn
1 5 10 15
Arg Asn Glu
<210> 169
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16 unrelated peptide 18mer
<400> 169
Gly Ala Val Pro Arg Ser Ala Thr Ile Asn Val Ser Arg Ile Ala Thr
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18mer (no C)
<400> 170
Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser
1 5 10 15
Val
<210> 171
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15mer (no C)
<400> 171
Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val
1 5 10
<210> 172
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUC16c114-N23
<400> 172
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 173
<211> 344
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N24 mut c344
<400> 173
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 174
<211> 344
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N30 mut c344
<400> 174
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
<210> 175
<211> 344
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N24-N30 mut c344
<400> 175
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Gln
35 40 45
Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu
65 70 75 80
His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser
85 90 95
Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser
100 105 110
Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His
115 120 125
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met
130 135 140
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala
165 170 175
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp
180 185 190
Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser
195 200 205
Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr
210 215 220
Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
225 230 235 240
Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly
260 265 270
Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro
275 280 285
Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile
290 295 300
Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser
325 330 335
His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
340
Claims (190)
- 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 항체는
(a) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고,
(b) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고;
(c) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서, 항체는 당화된 것인 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제3 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 항체는
(a) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고,
(b) 당화된 것인 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제3 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고;
(c) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. 제1항에 있어서, (i) 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 SKOV3 세포이고; (ii) 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 SKOV3 세포이고; (iii) 단계 (c)의 세포가 SKOV3 세포인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제3항에 있어서, (i) 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 SKOV3 세포이고; (ii) 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 SKOV3 세포이고; (iii) 단계 (c)의 세포가 SKOV3 세포인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제2항에 있어서, (i) 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 SKOV3 세포이고; (ii) 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 SKOV3 세포이고; (iii) 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 SKOV3 세포이고; (iv) 단계 (c)의 세포가 SKOV3 세포인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아미노산 서열 CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호: 130)에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, CTRNGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호: 130)의 아미노산 잔기 번호 4번 (N4) 및 아미노산 잔기 번호 10번 (N10)이 당화된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 150의 N-당화된 아스파라긴 1806을 포함하는 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아미노산 서열 CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호: 131)에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, CGTQLQNFTLDRSSV (서열 번호: 131)의 아미노산 잔기 번호 7번 (N7)이 당화된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 당화가 N 연결된 키토비오스로 구성된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 제1 형태의 MUC16을 발현하는 세포의 항체 또는 항원 결합 단편과의 접촉시 상기 세포내로 내재화되는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제10항에 있어서, 세포가 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 SKOV3 세포인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 당화된 형태의 MUC16을 발현하는 종양의 성장을 억제시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단일클론 항체인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이,
(a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호: 103)를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)1로서, 여기서, X1은 L 또는 V인 것;
(b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호: 104)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X2는 E이거나, 또는 존재하지 않고, X3은 Y 또는 N인 것; 및
(c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호: 105)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이,
(a) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호: 109)을 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X8은 N 또는 S이고, 여기서, X9는 L 또는 V인 것;
(b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호: 110)을 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X10은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및
(c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호: 111)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이,
(a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호: 115)를 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X15는 N 또는 S이고, 여기서, X16은 V 또는 L인 것;
(b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호: 116)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X17은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및
(c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호: 117)를 포함하는 VH CDR3으로서, 여기서, X18은 T, A, 또는 S인 것인 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가, 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제13항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호: 101)의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 여기서, X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나, 또는 존재하지 않고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이고, X35는 T, S, 또는 A인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제19항, 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항, 제20항 내지 제22항 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항, 제23항 내지 제25항 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항, 제26항 내지 제28항 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항, 또는 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이,
(a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호: 106)를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1로서, 여기서, X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H인 것;
(b) 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호: 107)를 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호: 108)를 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y인 것을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이,
(a) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호: 112)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K인 것;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 113)를 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호: 114)을 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y인 것을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이
(a) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호: 118)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K인 것;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 119)를 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호: 120)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 또는 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 또는 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 또는 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 또는 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 또는 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 또는 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (서열 번호: 102)의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 여기서, X36은 I 또는 V이고, X37은 P 또는 S이고, X38은 R 또는 L이고, X39는 K 또는 H이고, X40은 R 또는 K이고, X41은 E 또는 G이고, X42는 S 또는 G이고, X43은 Y 또는 H인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제40항, 또는 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제40항, 또는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항, 또는 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제37항, 또는 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 VH를 포함하고, 상기 VH는
(a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호: 103)를 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X1은 L 또는 V인 것; 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호: 104)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X2는 E이거나, 또는 존재하지 않고, X3은 Y 또는 N인 것; 및 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호: 105)를 포함하는 VH CDR3; 또는
(b) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호: 109)을 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X8은 N 또는 S이고, 여기서, X9는 L 또는 V인 것; 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호: 110)을 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X10은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호: 111)를 포함하는 VH CDR3; 또는
(c) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호: 115)를 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L인 것; 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호: 116)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X17은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호: 117)를 포함하는 VH CDR3으로서, 여기서, X18은 T, A, 또는 S인 것; 또는
(d) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(e) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(f) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(g) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(h) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(i) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(j) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(k) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(l) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(m) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(n) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(o) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(p) 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(q) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 또는
(r) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 VL을 포함하고, 상기 VL은
(a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호: 106)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H인 것; 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호: 107)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호: 108)를 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y인 것; 또는
(b) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호: 112)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K인 것; 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 113)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호: 114)을 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y인 것; 또는
(c) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호: 118)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K인 것; 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 119)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호: 120)를 포함하는 VL CDR3; 또는
(d) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(e) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(f) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(g) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(h) 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(i) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(j) 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(k) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(l) 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(m) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(n) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(o) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(p) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(q) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3; 또는
(r) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이
(a) (i) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호: 103)를 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X1은 L 또는 V인 것; 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호: 104)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X2는 E이거나, 또는 존재하지 않고, X3은 Y 또는 N인 것; 및 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호: 105)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호: 106)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H인 것; 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호: 107)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호: 108)를 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y인 것을 포함하는 VL; 또는
(b) (i) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호: 109)을 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X8은 N 또는 S이고, 여기서, X9는 L 또는 V인 것; 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호: 110)을 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X10은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호: 111)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호: 112)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K인 것; 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 113)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호: 114)을 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y인 것을 포함하는 VL; 또는
(c) (i) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호: 115)를 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X15는 N 또는 S이고, X16은 V 또는 L인 것; 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호: 116)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X17은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호: 117)를 포함하는 VH CDR3으로서, 여기서, X18은 T, A, 또는 S인 것을 포함하는 VH; 및 (ii) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호: 118)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K인 것; 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 119)를 포함하는 VL CDR2; 및 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호: 120)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(d) (i) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(e) (i) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(f) (i) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(g) (i) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(h) (i) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(i) (i) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(j) (i) 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(k) (i) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(l) (i) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(m) (i) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(n) (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(o) (i) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(p) (i) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(q) (i) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(r) (i) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이
(a) (i) QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호: 101)의 아미노산 서열을 포함하는 VH로서, 여기서, X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나, 또는 존재하지 않고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이고, X35는 T, S, 또는 A인 것; 및 (ii) DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (서열 번호: 102)의 아미노산 서열을 포함하는 VL로서, 여기서, X36은 I 또는 V이고, X37은 P 또는 S이고, X38은 R 또는 L이고, X39는 K 또는 H이고, X40은 R 또는 K이고, X41은 E 또는 G이고, X42는 S 또는 G이고, X43은 Y 또는 H인 것; 또는
(b) (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(c) (i) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(d) (i) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(e) (i) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(f) (i) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편. - 제14항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 유래 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제66항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 감마1, 감마2, 감마3, 및 감마4로 구성된 군으로부터 선택되는 아이소타입을 가지는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제66항 또는 제67항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 카파 및 람다로 구성된 군으로부터 선택되는 아이소타입을 가지는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제31항, 제38항 내지 제55항 또는 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제69항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간화 형태의 설치류 항체인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는 면역글로불린인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제71항에 있어서, 면역글로불린이 IgG인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 작용제에 접합된 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 접합체.
- 제73항에 있어서, 작용제가 조영제 또는 세포독성제인 것인 항체 접합체.
- 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 이중특이적 항체인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제75항에 있어서, 이중특이적 항체가 CD3에 면역특이적으로 결합하는 것인 이중특이적 항체.
- 제75항 또는 제76항에 있어서, 이중특이적 항체가 MUC16에 면역특이적으로 결합하는 면역글로불린을 포함하고, 여기서, 면역글로불린의 경쇄가 펩티드 링커를 통해, CD3에 면역특이적으로 결합하는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)에 접합된 것인 이중특이적 항체.
- 작용제에 접합된 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 포함하는 이중특이적 항체 접합체.
- 제78항에 있어서, 작용제가 조영제 또는 세포독성제인 것인 이중특이적 항체 접합체.
- 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 항원 결합 단편이 scFv인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 작용제에 접합된 제80항의 scFv를 포함하는 scFv 접합체.
- 제81항에 있어서, 작용제가 조영제 또는 세포독성제인 것인 scFv 접합체.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 제80항의 scFv 또는 제81항 또는 제82항의 scFv 접합체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
- 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부로서, 여기서, 중쇄 또는 그의 항원 결합부가 VH를 포함하고, 상기 VH는
(I) (a) 아미노산 서열 TX1GMGVG (서열 번호: 103)를 포함하는 VH 상보성 결정 영역 (CDR)1로서, 여기서, X1은 L 또는 V인 것;
(b) 아미노산 서열 HIWWDDX2DKYYX3PALKS (서열 번호: 104)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X2는 E이거나, 또는 존재하지 않고, X3은 Y 또는 N인 것; 및
(c) 아미노산 서열 IGTAQATDALDY (서열 번호: 105)를 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(II) 아미노산 서열 GFSLX8TX9GM (서열 번호: 109)을 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X8은 N 또는 S이고, 여기서, X9는 L 또는 V인 것;
(b) 아미노산 서열 WDDX10 (서열 번호: 110)을 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X10은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및
(c) 아미노산 서열 GTAQATDALD (서열 번호: 111)를 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(III) (a) 아미노산 서열 GFSLX15TX16GMG (서열 번호: 115)를 포함하는 VH CDR1로서, 여기서, X15는 N 또는 S이고, 여기서, X16은 V 또는 L인 것;
(b) 아미노산 서열 IWWDDX17DK (서열 번호: 116)를 포함하는 VH CDR2로서, 여기서, X17은 E이거나, 또는 존재하지 않는 것; 및
(c) 아미노산 서열 X18RIGTAQATDALDY (서열 번호: 117)를 포함하는 VH CDR3으로서, 여기서, X18은 T, A, 또는 S인 것을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(IV) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(V) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VI) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VII) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VIII) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(IX) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(X) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XI) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XII) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XIII) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XIV) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XV) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XVI) 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XVII) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XVIII) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고;
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것인 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부. - 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부로서, 여기서, 중쇄 또는 그의 항원 결합부가,
(I) QVX21LKESGPGX22LQPSQTLSLTCSFSGFSLX23TX24GMGVGWX25RQX26SGKGLEWLAHIWWDDX27DKYYX28PALKSRLTISX29X30X31SKNQVFLKIX32NVX33TADX34ATYYCX35RIGTAQATDALDYWGQGTSVTVSS (서열 번호: 101)의 아미노산 서열로서, 여기서, X21은 T 또는 N이고, X22는 I 또는 K이고, X23은 N 또는 S이고, X24는 V 또는 L이고, X25는 S 또는 I이고, X26은 P 또는 S이고, X27은 E이거나, 또는 존재하지 않고, X28은 N 또는 Y이고, X29는 K 또는 R이고, X30은 A 또는 D이고, X31은 T 또는 S이고, X32는 V 또는 A이고, X33은 G 또는 D이고, X34는 T, I, 또는 S이고, X35는 T, S, 또는 A인 것을 포함하는 VH를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(II) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(III) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(IV) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(V) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VI) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것인 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부. - 제84항 또는 제85항에 있어서, 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부가 인간 유래 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 제86항에 있어서, 중쇄 또는 그의 항원 결합부 불변 영역이 감마1, 감마2, 감마3, 및 감마4로 구성된 군으로부터 선택되는 아이소타입을 가지는 것인 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 제85항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부가 인간화 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부인 것인 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 제88항에 있어서, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부가 인간화 형태의 설치류 중쇄인 것인 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항의 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 중쇄 접합체로서, 여기서, 상기 항체 중쇄 또는 그의 항원 결합부는 작용제에 접합된 것인 항체 중쇄 접합체.
- 제90항에 있어서, 작용제가 조영제 또는 세포독성제인 것인 항체 중쇄 접합체.
- 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부로서, 여기서, 경쇄 또는 그의 항원 결합부가 VL을 포함하고, 상기 VL은
(I) (a) 아미노산 서열 RSSKSLX4X5SNGNTYLY (서열 번호: 106)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X4는 R 또는 L이고, X5는 K 또는 H인 것;
(b) 아미노산 서열 YMSNLAS (서열 번호: 107)를 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQX6LEX7PLT (서열 번호: 108)를 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X6은 G 또는 S이고, X7은 H 또는 Y인 것을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(II) (a) 아미노산 서열 SKSLX11X12SNGNTY (서열 번호: 112)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X11은 L 또는 R이고, X12는 H 또는 K인 것;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 113)를 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 X13LEX14PL (서열 번호: 114)을 포함하는 VL CDR3으로서, 여기서, X13은 G 또는 S이고, X14는 H 또는 Y인 것을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(III) (a) 아미노산 서열 KSLX19X20SNGNTY (서열 번호: 118)를 포함하는 VL CDR1로서, 여기서, X19는 V 또는 L이고, X20은 H 또는 K인 것;
(b) 아미노산 서열 YMS (서열 번호: 119)를 포함하는 VL CDR2; 및
(c) 아미노산 서열 MQSLEYPLT (서열 번호: 120)를 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(IV) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(V) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VI) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VII) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VIII) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VIX) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(X) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XI) 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XII) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XIII) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XIV) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XV) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XVI) 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XVII) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(XVIII) 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것인 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부. - 항체 경쇄로서, 여기서, 경쇄가,
(I) DIVMTQAAPSX36X37VTPGESVSISCRSSKSLX38X39SNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLX40ISRVEAX41DVGVYYCMQX42LEX43PLTFGGGTKLEIK (서열 번호: 102)의 아미노산 서열로서, 여기서, X36은 I 또는 V이고, X37은 P 또는 S이고, X38은 R 또는 L이고, X39는 K 또는 H이고, X40은 R 또는 K이고, X41은 E 또는 G이고, X42는 S 또는 G이고, X43은 Y 또는 H인 것을 포함하는 VL을 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(II) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(III) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(IV) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(V) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것이거나; 또는
(VI) 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하고,
여기서, 선택적으로, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하고, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133이고; (ii) 비당화된 것인 제2 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 않고, 여기서, 제2 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139이고; (iii) 상기 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포의 시험관내 매트리겔 침입을 억제시키는 것인 항체 경쇄. - 제92항 또는 제93항에 있어서, 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부가 인간 유래 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 제94항에 있어서, 경쇄 또는 그의 항원 결합부 불변 영역이 카파 및 람다로 구성된 군으로부터 선택되는 아이소타입을 가지는 것인 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 제92항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부가 인간화 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부인 것인 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 제96항에 있어서, 상기 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부가 인간화 형태의 설치류 항체인 것인 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부.
- 작용제에 접합된 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체 경쇄 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 경쇄 접합체.
- 제98항에 있어서, 작용제가 조영제 또는 세포독성제인 것인 항체 경쇄 접합체.
- 펩티드 링커를 통해 scFv에 접합된, 제92항 내지 제99항 중 어느 한 항의 항체 경쇄를 포함하는 융합 단백질.
- 제100항에 있어서, scFv가 CD3에 결합하는 것인 융합 단백질.
- 제83항의 CAR을 재조합적으로 발현하는 T 세포.
- 제80항의 scFv를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제81항 또는 제82항의 scFv 접합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제83항의 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항의 항체 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제90항 또는 제91항의 항체 중쇄 접합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제98항 또는 제99항의 항체 경쇄 접합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제100항 또는 제101항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- (a) 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항의 항체 중쇄 또는 제90항 또는 제91항의 항체 중쇄 접합체; 및 (b) 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체 경쇄, 제98항 또는 제99항의 항체 경쇄 접합체, 또는 제100항 또는 제101항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 제103항 내지 제110항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- (a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제106항 또는 제107항의 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생체외 세포.
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 제106항 또는 제107항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생체외 세포.
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생체외 세포.
- 제112항의 벡터를 포함하는 생체외 세포.
- 제113항의 벡터를 포함하는 생체외 세포.
- 프로모터에 작동가능하게 연결된, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생체외 세포.
- 제115항의 세포를, 폴리뉴클레오티드가 세포에 의해 발현되도록 하는 조건하에서 배양하여 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 중쇄 또는 항체 중쇄 접합체를 제조하는 단계를 포함하는, 항체 중쇄를 제조하는 방법.
- 제116항의 세포를, 폴리뉴클레오티드가 세포에 의해 발현되도록 하는 조건하에서 배양하여 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 경쇄, 항체 경쇄 접합체, 또는 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 항체 경쇄를 제조하는 방법.
- 제118항의 생체외 세포를, 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 및 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드가 세포에 의해 발현되도록 하는 조건하에서 배양하여 (i) 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 중쇄 또는 항체 중쇄 접합체; 및 (ii) 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 경쇄, 항체 경쇄 접합체, 또는 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
- 치료학상 유효량의, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 제73항 또는 제74항의 항체 접합체, 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체, 제78항 또는 제79항의 이중특이적 항체 접합체, 제80항의 scFv, 제81항 또는 제82항의 scFv 접합체, 제83항의 CAR, 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항의 항체 중쇄, 제90항 또는 제91항의 항체 중쇄 접합체, 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체 경쇄, 제98항 또는 제99항의 항체 경쇄 접합체, 제100항 또는 제101항의 융합 단백질, 또는 제102항의 T 세포; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
- 암 치료를 필요로 하는 환자에게 제123항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 암이 폐암, 췌장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암, 또는 원발성 복막암인 것인 방법.
- 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 암이 난소암인 것인 방법.
- 제124항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간 환자인 것인 방법.
- 제124항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 환자에게 치료학상 유효량의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제128항에 있어서, 제약 조성물이 치료학상 유효량의, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 제1 항체를 포함하고, 여기서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1806은 포함하지만, 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1800은 포함하지 않는 MUC16 중의 에피토프를 인식하고; 여기서, 추가 치료제는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 여기서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1806을 포함하고, 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1800 또한 포함하는 MUC16 중의 에피토프를 인식하는 것인 방법.
- 제129항에 있어서, 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합할 수 있는 그의 능력으로서, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133인 것; (ii) 당화된 것인 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 못하는 그의 무능력으로서, 여기서, 제3 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139인 것; 및 (iii) 당화된 것인 제4 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합할 수 있는 그의 능력으로서, 여기서, 제4 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 152인 것에 의해 확인되고; 여기서, 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포, 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포, 및 제4 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 동일 세포 유형의 것이고,
여기서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합할 수 있는 그의 능력으로서, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133인 것; 및 (ii) 당화된 것인 제5 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 못하는 그의 무능력으로서, 여기서, 제5 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 172인 것에 의해 확인되고, 여기서, 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포는 제5 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포와 동일한 유형의 세포인 것인 방법. - 제128항에 있어서, 제약 조성물이 치료학상 유효량의, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1806은 포함하지만, 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1800은 포함하지 않는 MUC16 중의 에피토프를 인식하고; 여기서, 추가 치료제는 치료학상 유효량의 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 여기서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1800은 포함하지만, 서열 번호: 150의 N-당화된 Asn1806은 포함하지 않는 MUC16 중의 에피토프를 인식하는 것인 방법.
- 제131항에 있어서, 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합할 수 있는 그의 능력으로서, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133인 것; (ii) 당화된 것인 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 못하는 그의 무능력으로서, 여기서, 제3 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139인 것; 및 (iii) 당화된 것인 제4 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합할 수 있는 그의 능력으로서, 여기서, 제4 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 152인 것에 의해 확인되고, 여기서, 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포, 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포, 및 제4 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 동일 세포 유형의 것이고,
여기서, 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) 당화된 것인 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합할 수 있는 그의 능력으로서, 여기서, 제1 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 133인 것; (ii) 당화된 것인 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합할 수 있는 그의 능력으로서, 여기서, 제3 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 139인 것; 및 (iii) 당화된 것인 제4 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포에는 면역특이적으로 결합하지 못하는 그의 무능력으로서, 여기서, 제4 형태의 아미노산 서열은 서열 번호: 152인 것에 의해 확인되고; 제1 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포, 제3 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포, 및 제4 형태의 MUC16을 재조합적으로 발현하는 세포가 동일한 유형의 세포인 것인 방법. - 하나 이상의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드로서, 여기서, (i) 면역원성 당펩티드의 길이가 10 내지 60개의 아미노산 잔기, 10 내지 30개의 아미노산 잔기, 15 내지 25개의 아미노산 잔기, 15 내지 20개의 아미노산 잔기, 또는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이고, (ii) 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나가 탄수화물과 연결되는 것인 면역원성 당펩티드.
- 제133항에 있어서, 1, 2, 또는 3개의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제133항에 있어서, 탄수화물과 연결되는 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제133항에 있어서, 각각이 탄수화물과 연결되는 2개의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물이 N- 또는 O-연결된 탄수화물인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물이 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 또는 오당류인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물이 이당류인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제139항에 있어서, 이당류가 키토비오스인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드의 N-말단이 아세틸화된 것인 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 당펩티드의 C-말단이 N-메틸카르복스아미드 유도체 형태인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 캐리어 단백질에 접합되어 있는 면역원성 당펩티드.
- 제143항에 있어서, 면역원성 캐리어 단백질이 키홀 림펫 헤모시아닌인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 길이가 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제145항에 있어서, 키토비오스와 연결되는 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제145항에 있어서, 각각이 키토비오스와 연결되는 2개의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 길이가 18개의 아미노산 잔기 길이인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제148항에 있어서, 각각이 키토비오스와 연결되는 2개의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 길이가 15개의 아미노산 잔기 길이인 것인 면역원성 당펩티드.
- 제150항에 있어서, 키토비오스와 연결되는 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제133항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 150의 아미노산 서열 중의 적어도 10개의 아미노산 일부분을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나가 아미노산 서열 중의 상기 일부분에 존재하는 것인 면역원성 당펩티드.
- 제152항에 있어서, 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제153항에 있어서, 키토비오스와 연결되는, 서열 번호: 129의 30번째 잔기 (Asn)에 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제153항에 있어서, Man3GlcNAc2 모이어티와 연결되는, 서열 번호: 129의 30번째 잔기 (Asn)에 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제152항에 있어서, 서열 번호: 130의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제156항에 있어서, 각각이 키토비오스와 연결되는, 서열 번호: 130의 4번째 잔기 (Asn) 및 10번째 잔기 (Asn)에 2개의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제152항에 있어서, 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 제158항에 있어서, 키토비오스와 연결되는, 서열 번호: 131의 7번째 잔기 (Asn)에 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드.
- 대상체를 하나 이상의 당화 부위를 포함하는 면역원성 당펩티드로 면역화하는 단계를 포함하고, 여기서, (i) 면역원성 당펩티드의 길이는 10 내지 60개의 아미노산 잔기, 10 내지 30개의 아미노산 잔기, 15 내지 25개의 아미노산 잔기, 15 내지 20개의 아미노산 잔기, 또는 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이이고; (ii) 면역원성 당펩티드가 당단백질의 아미노산 서열 중의 적어도 10개의 아미노산 일부분을 포함하고; (iii) 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나가 탄수화물과 연결되어 있고; (iv) 하나 이상의 당화 부위 중 적어도 하나가 아미노산 서열 중의 상기 일부분에 존재하는 것인, 당단백질에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성하는 방법.
- 제160항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 비당화된 형태의 당단백질에는 특이적으로 결합하지 않는 것인 방법.
- 제160항 또는 제161항에 있어서, 대상체가 염소, 양, 당나귀, 닭, 기니아 피그, 래트, 토끼, 또는 마우스인 것인 방법.
- 제160항 또는 제161항에 있어서, 대상체가 래트, 토끼, 또는 마우스인 것인 방법.
- 제160항 또는 제161항에 있어서, 대상체가 마우스인 것인 방법.
- 제160항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 1, 2, 또는 3개의 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제160항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 탄수화물과 연결되는 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제160항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 각각이 탄수화물과 연결되는 2개의 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제160항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물이 N- 또는 O-연결된 탄수화물인 것인 방법.
- 제160항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물이 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 또는 오당류인 것인 방법.
- 제160항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물이 이당류인 것인 방법.
- 제170항에 있어서, 이당류가 키토비오스인 것인 방법.
- 제160항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드의 N-말단이 아세틸화된 것인 방법.
- 제160항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 당펩티드의 C-말단이 N-메틸카르복스아미드 유도체 형태인 것인 방법.
- 제160항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 캐리어 단백질에 접합된 것인 방법.
- 제174항에 있어서, 면역원성 캐리어 단백질이 키홀 림펫 헤모시아닌인 것인 방법.
- 제160항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드 길이가 15 내지 18개의 아미노산 잔기 길이인 것인 방법.
- 제176항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 키토비오스와 연결되는 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제176항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 각각이 키토비오스와 연결되는 2개의 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제160항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드 길이가 18개의 아미노산 잔기 길이인 것인 방법.
- 제179항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 각각이 키토비오스와 연결되는 2개의 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제160항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 당펩티드 길이가 15개의 아미노산 잔기 길이인 것인 방법.
- 제181항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 키토비오스와 연결되는 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제160항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질이 서열 번호: 150의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제183항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제184항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 키토비오스와 연결되는, 서열 번호: 129의 30번째 잔기 (Asn)에 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제184항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 Man3GlcNAc2 모이어티와 연결되는, 서열 번호: 129의 30번째 잔기 (Asn)에 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제183항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 서열 번호: 130의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제187항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 각각이 키토비오스와 연결되는, 서열 번호: 130의 4번째 잔기 (Asn) 및 10번째 잔기 (Asn)에 2개의 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제183항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제189항에 있어서, 면역원성 당펩티드가 키토비오스와 연결되는, 서열 번호: 131의 7번째 잔기 (Asn)에 당화 부위를 포함하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562134402P | 2015-03-17 | 2015-03-17 | |
US62/134,402 | 2015-03-17 | ||
PCT/US2016/022643 WO2016149368A1 (en) | 2015-03-17 | 2016-03-16 | Anti-muc16 antibodies and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20170128525A true KR20170128525A (ko) | 2017-11-22 |
KR102618312B1 KR102618312B1 (ko) | 2023-12-28 |
Family
ID=55755670
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177029700A KR102618312B1 (ko) | 2015-03-17 | 2016-03-16 | 항muc16 항체 및 그의 용도 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11066480B2 (ko) |
EP (2) | EP3271398B1 (ko) |
JP (3) | JP6968698B2 (ko) |
KR (1) | KR102618312B1 (ko) |
CN (2) | CN115368460A (ko) |
AU (2) | AU2016233309B2 (ko) |
BR (1) | BR112017019978A2 (ko) |
CA (1) | CA2979976A1 (ko) |
ES (1) | ES2929614T3 (ko) |
HK (1) | HK1249911A1 (ko) |
IL (3) | IL296062A (ko) |
MX (2) | MX2017011822A (ko) |
RU (1) | RU2758113C2 (ko) |
SG (1) | SG11201707538XA (ko) |
WO (1) | WO2016149368A1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190073377A (ko) * | 2016-09-23 | 2019-06-26 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 항-muc16 (뮤신 16) 항체 |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3222632A1 (en) | 2010-03-26 | 2017-09-27 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Antibodies to muc16 and methods of use thereof |
EP4183806A3 (en) | 2014-11-12 | 2023-08-02 | Seagen Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
WO2016149368A1 (en) | 2015-03-17 | 2016-09-22 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anti-muc16 antibodies and uses thereof |
IL258768B2 (en) | 2015-11-12 | 2023-11-01 | Siamab Therapeutics Inc | Compounds interacting with glycans and methods of use |
EP3541847A4 (en) * | 2016-11-17 | 2020-07-08 | Seattle Genetics, Inc. | COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE |
MA47812A (fr) | 2017-03-03 | 2021-04-14 | Seagen Inc | Composés interagissant avec le glycane et méthodes d'utilisation |
CA3059753A1 (en) | 2017-04-26 | 2018-11-01 | Eureka Therapeutics, Inc. | Chimeric antibody/t-cell receptor constructs and uses thereof |
EA039842B1 (ru) * | 2017-09-14 | 2022-03-18 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Биспецифичные анти-muc16-cd3 антитела и конъюгаты анти-muc16-лекарственное средство |
EP3746123A4 (en) * | 2018-02-01 | 2021-12-01 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | ANTIBODIES TO GALECTIN-3 AND METHOD OF USING THEREOF |
CA3095457A1 (en) | 2018-05-09 | 2019-11-14 | Quest Pharmatech Inc. | Muc16 monoclonal antibody and uses thereof |
CN110526974A (zh) * | 2018-05-25 | 2019-12-03 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向muc16的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
CN110526977A (zh) * | 2018-05-25 | 2019-12-03 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向muc1的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
CN110526988A (zh) * | 2018-05-25 | 2019-12-03 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向muc1的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
CN110527667A (zh) * | 2018-05-25 | 2019-12-03 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向muc16的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
EP3880714A4 (en) * | 2018-11-16 | 2022-07-20 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | ANTIBODIES TO MUCIN-16 AND METHODS OF USE THEREOF |
EP3966248A4 (en) * | 2019-05-08 | 2023-04-12 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | HUMANIZED ANTIBODIES TO MUCIN-16 AND METHODS OF USE THEREOF |
US20210040174A1 (en) * | 2019-08-08 | 2021-02-11 | Navrogen, Inc. | Composition and Use of Humoral Immune Suppressor Antagonists for the Treatment of Humoral Immune Suppressed Diseases |
US20230340623A1 (en) * | 2020-06-30 | 2023-10-26 | Universiteit Antwerpen | Mucins and isoforms thereof in diseases characterized by barrier dysfunction |
US11883432B2 (en) | 2020-12-18 | 2024-01-30 | Century Therapeutics, Inc. | Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity |
WO2022140388A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Allogene Therapeutics, Inc. | Protease-activating cd45-gate car |
IL303853A (en) | 2021-01-29 | 2023-08-01 | Allogene Therapeutics Inc | Knockdown or knockout of one or more TAP2, NLRC5, B2m, TRAC, RFX5, RFXAP, and RFXANK to reduce T cell recognition of allogeneic cell products |
WO2022204249A1 (en) * | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Variants of humanized anti-muc16 ectodomain antibodies for treatment of muc16 overexpressing tumors |
CN113061186B (zh) * | 2021-04-09 | 2022-05-13 | 福州迈新生物技术开发有限公司 | 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 |
CN114835805B (zh) * | 2022-06-10 | 2023-06-06 | 郑州大学 | 抗SARS-CoV-2 spike蛋白的单克隆抗体及应用 |
WO2024026445A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Allogene Therapeutics Inc. | Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011119979A2 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Antibodies to muc16 and methods of use thereof |
WO2015006043A1 (en) * | 2013-07-09 | 2015-01-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Novel method of targeting glycoproteins to treat cancer |
Family Cites Families (100)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
FR2374910A1 (fr) | 1976-10-23 | 1978-07-21 | Choay Sa | Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations |
US4444887A (en) | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
US4716111A (en) | 1982-08-11 | 1987-12-29 | Trustees Of Boston University | Process for producing human antibodies |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
SE448277B (sv) | 1985-04-12 | 1987-02-09 | Draco Ab | Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel |
US4824659A (en) | 1985-06-07 | 1989-04-25 | Immunomedics, Inc. | Antibody conjugates |
US5776093A (en) | 1985-07-05 | 1998-07-07 | Immunomedics, Inc. | Method for imaging and treating organs and tissues |
US5057313A (en) | 1986-02-25 | 1991-10-15 | The Center For Molecular Medicine And Immunology | Diagnostic and therapeutic antibody conjugates |
SE453566B (sv) | 1986-03-07 | 1988-02-15 | Draco Ab | Anordning vid pulverinhalatorer |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
CH671155A5 (ko) | 1986-08-18 | 1989-08-15 | Clinical Technologies Ass | |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5869620A (en) | 1986-09-02 | 1999-02-09 | Enzon, Inc. | Multivalent antigen-binding proteins |
EP0832981A1 (en) | 1987-02-17 | 1998-04-01 | Pharming B.V. | DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US4978745A (en) | 1987-11-23 | 1990-12-18 | Centocor, Inc. | Immunoreactive heterochain antibodies |
US4975369A (en) | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
AU5554190A (en) | 1989-05-08 | 1990-11-29 | Mark I. Farber | Process and apparatus for the recovery of precious metals from slag, tailings and other materials |
US5413923A (en) | 1989-07-25 | 1995-05-09 | Cell Genesys, Inc. | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
US5580575A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
DE69120146T2 (de) | 1990-01-12 | 1996-12-12 | Cell Genesys Inc | Erzeugung xenogener antikörper |
US5314995A (en) | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
ES2246502T3 (es) | 1990-08-29 | 2006-02-16 | Genpharm International, Inc. | Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5404871A (en) | 1991-03-05 | 1995-04-11 | Aradigm | Delivery of aerosol medications for inspiration |
SG47099A1 (en) | 1991-03-15 | 1998-03-20 | Amgen Boulder Inc | Pegylation of polypeptides |
EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
ES2206447T3 (es) | 1991-06-14 | 2004-05-16 | Genentech, Inc. | Anticuerpo humanizado para heregulina. |
US5637481A (en) | 1993-02-01 | 1997-06-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell |
ATE359842T1 (de) | 1991-07-02 | 2007-05-15 | Nektar Therapeutics | Abgabevorrichtung für nebelförmige medikamente |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
DK1024191T3 (da) | 1991-12-02 | 2008-12-08 | Medical Res Council | Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker |
ES2202310T3 (es) | 1991-12-13 | 2004-04-01 | Xoma Corporation | Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos. |
US5976818A (en) * | 1991-12-16 | 1999-11-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Monoclonal antibodies which identify the glycoprotein carrying the CA 125 epitope |
GB9203459D0 (en) | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Scotgen Ltd | Antibodies with germ-line variable regions |
ES2149768T3 (es) | 1992-03-25 | 2000-11-16 | Immunogen Inc | Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065. |
US6005079A (en) | 1992-08-21 | 1999-12-21 | Vrije Universiteit Brussels | Immunoglobulins devoid of light chains |
ES2162823T5 (es) | 1992-08-21 | 2010-08-09 | Vrije Universiteit Brussel | Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras. |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
AU4829593A (en) | 1992-09-23 | 1994-04-12 | Fisons Plc | Inhalation device |
EP0665759B1 (en) | 1992-10-19 | 1998-12-23 | Dura Pharmaceuticals, Inc. | Dry powder inhaler |
US5643252A (en) | 1992-10-28 | 1997-07-01 | Venisect, Inc. | Laser perforator |
US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
JP3720353B2 (ja) | 1992-12-04 | 2005-11-24 | メディカル リサーチ カウンシル | 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用 |
US5849695A (en) | 1993-01-13 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of California | Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals |
EP0680451B1 (en) | 1993-01-19 | 1998-11-04 | Glaxo Group Limited | Aerosol dispenser and method of manufacture |
WO1994018317A1 (en) | 1993-02-12 | 1994-08-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Regulated transcription of targeted genes and other biological events |
AU6796094A (en) | 1993-04-29 | 1994-11-21 | Raymond Hamers | Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of (camelidae) |
US5514670A (en) | 1993-08-13 | 1996-05-07 | Pharmos Corporation | Submicron emulsions for delivery of peptides |
US5814599A (en) | 1995-08-04 | 1998-09-29 | Massachusetts Insitiute Of Technology | Transdermal delivery of encapsulated drugs |
US5827690A (en) | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
ES2304786T3 (es) | 1995-04-27 | 2008-10-16 | Amgen Fremont Inc. | Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados. |
EP0823941A4 (en) | 1995-04-28 | 2001-09-19 | Abgenix Inc | HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES |
US5730723A (en) | 1995-10-10 | 1998-03-24 | Visionary Medical Products Corporation, Inc. | Gas pressured needle-less injection device and method |
WO1997014719A1 (en) | 1995-10-16 | 1997-04-24 | Unilever N.V. | A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue |
GB9526100D0 (en) | 1995-12-20 | 1996-02-21 | Intersurgical Ltd | Nebulizer |
CZ212598A3 (cs) | 1996-01-03 | 1998-11-11 | Glaxo Group Limited | Inhalační zařízení |
US6107090A (en) | 1996-05-06 | 2000-08-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains |
US6027947A (en) | 1996-08-20 | 2000-02-22 | Ramtron International Corporation | Partially or completely encapsulated top electrode of a ferroelectric capacitor |
US5916771A (en) | 1996-10-11 | 1999-06-29 | Abgenix, Inc. | Production of a multimeric protein by cell fusion method |
DK1500329T3 (da) | 1996-12-03 | 2012-07-09 | Amgen Fremont Inc | Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa |
US5879681A (en) | 1997-02-07 | 1999-03-09 | Emisphere Technolgies Inc. | Compounds and compositions for delivering active agents |
US5921447A (en) | 1997-02-13 | 1999-07-13 | Glaxo Wellcome Inc. | Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof |
US20030148463A1 (en) | 1997-04-14 | 2003-08-07 | Micromet Ag | Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof |
WO1998046645A2 (en) | 1997-04-14 | 1998-10-22 | Micromet Gesellschaft Für Biomedizinische Forschung Mbh | Method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof |
US20020062010A1 (en) | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US7951917B1 (en) | 1997-05-02 | 2011-05-31 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
CU22731A1 (es) | 1998-02-05 | 2002-02-28 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen |
JP2002512776A (ja) | 1998-04-28 | 2002-05-08 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 免疫原性の低下したモノクローナル抗体 |
US6849425B1 (en) | 1999-10-14 | 2005-02-01 | Ixsys, Inc. | Methods of optimizing antibody variable region binding affinity |
AU765588C (en) | 1999-11-24 | 2004-12-16 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use |
AU2161501A (en) | 1999-11-29 | 2001-06-25 | Unilever Plc | Immobilized single domain antigen-binding molecules |
US6333410B1 (en) | 2000-08-18 | 2001-12-25 | Immunogen, Inc. | Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids |
AU2002254615A1 (en) * | 2001-04-17 | 2002-10-28 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Repeat sequences of the ca125 gene and their use for diagnostic and therapeutic interventions |
ITRM20010408A1 (it) | 2001-07-10 | 2003-01-10 | Univ Napoli Federico Ii | Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2. |
WO2004006955A1 (en) | 2001-07-12 | 2004-01-22 | Jefferson Foote | Super humanized antibodies |
US20040014194A1 (en) | 2002-03-27 | 2004-01-22 | Schering Corporation | Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same |
JP2006502110A (ja) | 2002-07-03 | 2006-01-19 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | 非放出Muc1およびMuc16に対する抗体、およびその使用 |
GB2424070B (en) | 2002-11-14 | 2007-06-27 | Univ Nottingham | Methods for preparing tumour marker proteins |
JP5356648B2 (ja) | 2003-02-20 | 2013-12-04 | シアトル ジェネティックス, インコーポレイテッド | 抗cd70抗体−医薬結合体、ならびに癌および免疫障害の処置のためのそれらの使用 |
EP1660534A2 (en) | 2003-08-22 | 2006-05-31 | MedImmune, Inc. | Humanization of antibodies |
WO2005105841A2 (en) | 2004-03-12 | 2005-11-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10 |
JP2007536938A (ja) | 2004-05-14 | 2007-12-20 | ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア | 抗Wnt2モノクローナル抗体およびsiRNAを使用して癌を治療するための方法 |
EP1791565B1 (en) | 2004-09-23 | 2016-04-20 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
CA2683568A1 (en) | 2007-05-08 | 2008-11-20 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates |
US8227577B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
AU2010265933B2 (en) | 2009-06-26 | 2015-05-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format |
NZ603581A (en) | 2010-06-19 | 2015-05-29 | Sloan Kettering Inst Cancer | Anti-gd2 antibodies |
WO2016149368A1 (en) | 2015-03-17 | 2016-09-22 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anti-muc16 antibodies and uses thereof |
-
2016
- 2016-03-16 WO PCT/US2016/022643 patent/WO2016149368A1/en active Application Filing
- 2016-03-16 EP EP16716959.8A patent/EP3271398B1/en active Active
- 2016-03-16 RU RU2017134592A patent/RU2758113C2/ru active
- 2016-03-16 KR KR1020177029700A patent/KR102618312B1/ko active IP Right Grant
- 2016-03-16 BR BR112017019978-5A patent/BR112017019978A2/pt active Search and Examination
- 2016-03-16 ES ES16716959T patent/ES2929614T3/es active Active
- 2016-03-16 MX MX2017011822A patent/MX2017011822A/es unknown
- 2016-03-16 CN CN202210174122.7A patent/CN115368460A/zh active Pending
- 2016-03-16 CA CA2979976A patent/CA2979976A1/en active Pending
- 2016-03-16 US US15/558,694 patent/US11066480B2/en active Active
- 2016-03-16 IL IL296062A patent/IL296062A/en unknown
- 2016-03-16 AU AU2016233309A patent/AU2016233309B2/en active Active
- 2016-03-16 CN CN201680028517.9A patent/CN107667120B/zh active Active
- 2016-03-16 JP JP2017548919A patent/JP6968698B2/ja active Active
- 2016-03-16 EP EP22192814.6A patent/EP4190817A1/en active Pending
- 2016-03-16 SG SG11201707538XA patent/SG11201707538XA/en unknown
-
2017
- 2017-09-14 IL IL254517A patent/IL254517B/en active IP Right Grant
- 2017-09-14 MX MX2022003891A patent/MX2022003891A/es unknown
-
2018
- 2018-07-18 HK HK18109320.2A patent/HK1249911A1/zh unknown
-
2020
- 2020-09-28 JP JP2020162274A patent/JP2021000132A/ja not_active Withdrawn
-
2021
- 2021-05-20 IL IL283321A patent/IL283321A/en unknown
- 2021-07-14 US US17/375,048 patent/US20230026100A1/en active Pending
-
2022
- 2022-02-11 AU AU2022200931A patent/AU2022200931A1/en active Pending
- 2022-06-06 JP JP2022091593A patent/JP2022116314A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011119979A2 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Antibodies to muc16 and methods of use thereof |
WO2015006043A1 (en) * | 2013-07-09 | 2015-01-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Novel method of targeting glycoproteins to treat cancer |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190073377A (ko) * | 2016-09-23 | 2019-06-26 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 항-muc16 (뮤신 16) 항체 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2758113C2 (ru) | 2021-10-26 |
JP2018509907A (ja) | 2018-04-12 |
IL254517A0 (en) | 2017-11-30 |
AU2016233309A1 (en) | 2017-10-12 |
IL254517B (en) | 2021-05-31 |
CN115368460A (zh) | 2022-11-22 |
EP3271398B1 (en) | 2022-08-31 |
IL296062A (en) | 2022-10-01 |
JP6968698B2 (ja) | 2021-11-24 |
CN107667120B (zh) | 2022-03-08 |
EP4190817A1 (en) | 2023-06-07 |
MX2017011822A (es) | 2017-12-07 |
AU2022200931A1 (en) | 2022-03-03 |
ES2929614T3 (es) | 2022-11-30 |
AU2016233309B2 (en) | 2021-11-18 |
CA2979976A1 (en) | 2016-09-22 |
KR102618312B1 (ko) | 2023-12-28 |
RU2017134592A3 (ko) | 2020-01-23 |
US11066480B2 (en) | 2021-07-20 |
HK1249911A1 (zh) | 2018-11-16 |
SG11201707538XA (en) | 2017-10-30 |
EP3271398A1 (en) | 2018-01-24 |
US20230026100A1 (en) | 2023-01-26 |
IL283321A (en) | 2021-07-29 |
US20180112008A1 (en) | 2018-04-26 |
CN107667120A (zh) | 2018-02-06 |
JP2021000132A (ja) | 2021-01-07 |
RU2017134592A (ru) | 2019-04-05 |
JP2022116314A (ja) | 2022-08-09 |
BR112017019978A2 (pt) | 2018-06-19 |
WO2016149368A1 (en) | 2016-09-22 |
MX2022003891A (es) | 2022-04-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230026100A1 (en) | Anti-muc16 antibodies and uses thereof | |
KR102389083B1 (ko) | 항-cd47 항체 및 그 용도 | |
US20210032350A1 (en) | Antibodies to galectin-3 and methods of use thereof | |
KR102338832B1 (ko) | Ccr9에 대한 항체 및 그의 적용방법 | |
JP6574257B2 (ja) | 新規の抗Nodal抗体及びその使用方法 | |
US20090070890A1 (en) | Product | |
WO2022135467A1 (zh) | 抗b7-h3抗体及其用途 | |
WO2004094612A2 (en) | Cancer specific monoclonal antibodies | |
US20240026009A1 (en) | Antibodies to galectin-3 and methods of use thereof | |
IL225042A (en) | Preparations for the treatment of multiple myeloma are drug resistant |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right |