JP6968698B2 - 抗muc16抗体及びその使用 - Google Patents
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Description
本明細書に提供されるのは、癌などの障害を管理、治療、又は予防するための、繋留型ムチンタンパク質であるMUC16に免疫特異的に結合し、かつMUC16の発現及び/又は活性を調節する抗体に関する組成物、方法、及び使用である。
ムチンは、細胞の恒常性及び上皮表面の保護にとって重要な生体分子である。卵巣癌におけるムチンの発現の変化は、診断、予後判定、及び治療において利用することができる(Singh APらの文献、Lancet Oncol 2008;9(11):1076-85)。MUC16は、ほとんどの卵巣癌で過剰発現される1つのそのようなムチンであり、卵巣癌の検出及び進行の確立された代用血清マーカー(CA-125)である(Badgwell Dらの文献、Dis Markers 2007;23(5-6):397410; Bast RC, Jrらの文献、Int J Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274-81; Fritsche HAらの文献、Clin Chem 1998;44(7):1379-80;及びKrivak TCらの文献、Gynecol Oncol 2009;115(1):81-5)。MUC16は、多数のリピート配列からなる、CA-125と呼ばれる、切断され、放出される大ドメインと、残りの非反復細胞外断片、膜貫通ドメイン、及び細胞質テールを含む保持ドメイン(MUC-CD)とから構成される高度にグリコシル化されたムチンである(O'Brien TJらの文献、Tumour Biol 2001;22(6):348-66)。この抗原は、それ以外の場合は、子宮、子宮内膜、卵管、卵巣、並びに腹腔及び胸腔の漿膜で低レベルで発現されるのみであるので、MUC16は、免疫ベースの療法の潜在的に魅力のある標的である。
提供されるのは、抗体及びその抗原結合断片、並びにそのような抗体又は抗原結合断片を含むポリペプチド、例えば、融合タンパク質、コンジュゲート、及び/又はキメラ抗原受容体、並びにこれらを発現する細胞である。該抗体及び抗原結合断片の中に、MUC16タンパク質のエピトープに特異的に結合するものがある。そのような抗体は、本明細書において「MUC16グリコシル化抗体」と呼ばれる。そのようなエピトープは、典型的には、MUC16分子、通常、MUC16の非放出形態の細胞外部分の内部又は実質的に内部のエピトープであり;いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16及び/もしくはMUC16の分泌形態のタンデムリピート領域内になく、又は該抗体もしくは断片は、MUC16及び/もしくはMUC16の分泌形態のタンデムリピート領域に結合しない。いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16c114の内部にあるか、又はMUC16c114の内部の残基を含み、典型的には、その中の1以上のグリコシル化残基又はグリコシル化部位を含む。いくつかの実施態様において、該エピトープは、1以上のグリコシル化部位、例えば、N-グリコシル化の部位を含む。いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150に示されるMUC16配列(及び/又はそのグリコシル化形態)のAsn1806又はAsn1800に対応するアスパラギン残基を含み;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含まず;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含まない。そのような実施態様のいずれかのいくつかにおいて、そのような1以上のアスパラギンは、グリコシル化、例えば、N-グリコシル化されている。いくつかの実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、配列番号131の内部のエピトープもしくは配列番号131の内部の残基を含むエピトープに結合し;配列番号130の内部のエピトープもしくは配列番号130の内部の残基を含むエピトープに結合するか、又はこれらの組合せであり;いくつかの実施態様において、該抗体又は断片は、配列番号168に対応するMUC16の領域内でも、配列番号168の残基2〜19の内部でも免疫特異的に結合しない。
を有するものがある。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、
(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し、
(b)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ
(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、
前記抗体又はその抗原結合断片。
(項目2)
前記抗体が、MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠く、項目1記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目3)
抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、
(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し、 (b)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ
(c)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、
前記抗体又はその抗原結合断片であり、
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記第二の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の前記細胞がSKOV3細胞である、項目1記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目4)
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記第三の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iii)工程(c)の該細胞がSKOV3細胞である、項目3記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目5)
(i)MUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(ii)MUC16の前記第二の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;(iii)MUC16の前記第三の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(iv)工程(c)の前記細胞がSKOV3細胞である、項目2記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目6)
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列
に免疫特異的に結合し、ここで、
のアミノ酸残基番号4(N4)及びアミノ酸残基番号10(N10)がグリコシル化されている、項目1〜5のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目7)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化アスパラギン1806を含むエピトープに免疫特異的に結合する、項目1〜6のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目8)
前記抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列
に免疫特異的に結合し、ここで、
のアミノ酸残基番号7(N7)がグリコシル化されている、項目1〜7のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目9)
前記グリコシル化がN-結合型キトビオースからなる、項目6〜8のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目10)
前記抗体又はその抗原結合断片が、MUC16の前記第一の形態を発現する細胞を該抗体又は抗原結合断片と接触させたとき、該細胞に内在化される、項目1〜9のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目11)
前記細胞がMUC16の前記第一の形態を組換え発現するSKOV3細胞である、項目10記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目12)
前記抗体が、MUC16のグリコシル化形態を発現する腫瘍の成長を阻害する、項目1〜11のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目13)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目1〜12のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目14)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 1 は、L又はVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 2 は、E又は非存在であり、かつX 3 は、Y又はNである)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVH CDR3
を含む、重鎖可変領域(VH)を含む、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目15)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 8 は、N又はSであり、かつX 9 は、L又はVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 10 は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVH CDR3
を含む、VHを含む、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目16)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 15 は、N又はSであり、かつX 16 は、V又はLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 17 は、E又は非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 18 は、T、A、又はSである)を含むVHCDR3
を含むVHを含む、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目17)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目18)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目19)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目20)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目21)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目22)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目23)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目24)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目25)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目26)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目27)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目28)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目29)
前記抗体が、配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目30)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目31)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVHを含む、項目1〜13又は16のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目32)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(ここで、X 21 は、T又はNであり、X 22 は、I又はKであり、X 23 は、N又はSであり、X 24 は、V又はLであり、X 25 は、S又はIであり、X 26 は、P又はSであり、X 27 は、E又は非存在であり、X 28 は、N又はYであり、X 29 は、K又はRであり、X 30 は、A又はDであり、X 31 は、T又はSであり、X 32 は、V又はAであり、X 33 は、G又はDであり、X 34 は、T、I、又はSであり、かつX 35 は、T、S、又はAである)というアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜31のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目33)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号1のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜19、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目34)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号21のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜16、20〜22、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目35)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号41のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜16、23〜25、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目36)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号61のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜16、26〜28、又は32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目37)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号81のアミノ酸配列を含むVHを含む、項目1〜16又は29〜32のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目38)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 4 は、R又はLであり、かつX 5 は、K又はHである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 6 は、G又はSであり、かつX 7 は、H又はYである)を含むVLCDR3
を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目39)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 11 は、L又はRであり、かつX 12 は、H又はKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 13 は、G又はSであり、かつX 14 は、H又はYである)を含むVLCDR3
を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目40)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 19 は、V又はLであり、かつX 20 は、H又はKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVL CDR3
を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目41)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目42)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目43)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目44)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目45)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目46)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目47)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜38のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目48)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37又は39のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目49)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37又は40のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目50)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目51)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目52)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目53)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目54)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目55)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む、VLを含む、項目1〜37のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目56)
前記抗体又はその抗原結合断片が、
(ここで、X 36 は、I又はVであり、X 37 は、P又はSであり、X 38 は、R又はLであり、X 39 は、K又はHであり、X 40 は、R又はKであり、X 41 は、E又はGであり、X 42 は、S又はGであり、かつX 43 は、Y又はHである)というアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜49のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目57)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号22のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜43のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目58)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号42のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜40、又は44〜46のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目59)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号82のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜40、又は47〜49のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目60)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号2のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜37、又は50〜52のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目61)
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号62のアミノ酸配列を含むVLを含む、項目1〜37、又は53〜55のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目62)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片がVHを含み、このVHが:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 1 は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X 2 は、Eもしくは非存在であり、かつX 3 は、YもしくはNである)を含むVHCDR2;
及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3;又は
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 8 は、NもしくはSであり、かつX 9 は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X 10 は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3;又は
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 15 は、NもしくはSであり、かつX 16 は、VもしくはLである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X 17 は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X 18 は、T、A、もしくはSである)を含むVHCDR3;又は
(d)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(e)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(f)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(g)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(h)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(j)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(k)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(l)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(m)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(n)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(o)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(p)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(q)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3;又は
(r)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目63)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片がVLを含み、このVLが:
(a)アミノ酸配列
(ここで、X 4 は、RもしくはLであり、かつX 5 は、KもしくはHである)を含むVLCDR1;アミノ酸配列
を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X 6 は、GもしくはSであり、かつX 7 は、HもしくはYである)を含むVLCDR3;又は
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 11 は、LもしくはRであり、かつX 12 は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X 13 は、GもしくはSであり、かつX 14 は、HもしくはYである)を含むVLCDR3;又は
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 19 は、VもしくはLであり、かつX 20 は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
を含むVL CDR3;又は
(d)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(e)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(f)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(h)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(i)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(j)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(k)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(l)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(m)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(n)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(o)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(p)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(q)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3;又は
(r)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目64)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が:
(a)(i)アミノ酸配列
(ここで、X 1 は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X 2 は、Eもしくは非存在であり、かつX 3 は、YもしくはNである)を含むVHCDR2;
及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X 4 は、RもしくはLであり、かつX 5 は、KもしくはHである)を含むVLCDR1;アミノ酸配列
を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X 6 は、GもしくはSであり、かつX 7 は、HもしくはYである)を含むVLCDR3
を含むVL;又は
(b)(i)アミノ酸配列
(ここで、X 8 は、NもしくはSであり、かつX 9 は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;アミノ
酸配列
(ここで、X 10 は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
を含むVH CDR3
を含むVH;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X 11 は、LもしくはRであり、かつX 12 は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X 13 は、GもしくはSであり、かつX 14 は、HもしくはYである)を含むVLCDR3を含むVL;又は
(c)(i)アミノ酸配列
(ここで、X 15 は、NもしくはSであり、かつX 16 は、VもしくはLである)を含むVHCDR1;アミノ酸配列
(ここで、X 17 は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及びアミノ酸配列
(ここで、X 18 は、T、A、もしくはSである)を含むVHCDR3;並びに(ii)アミノ酸配列
(ここで、X 19 は、VもしくはLであり、かつX 20 は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及びアミノ酸配列
を含むVL CDR3
を含むVL;又は
(d)(i)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(e)(i)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(f)(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(g)(i)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(h)(i)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(i)(i)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(j)(i)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(k)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(l)(i)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH、及び(ii)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(m)(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(n)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(o)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(p)(i)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(q)(i)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL;又は
(r)(i)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むVL
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目65)
MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が:
(a)(i)
(ここで、X 21 は、TもしくはNであり、X 22 は、IもしくはKであり、X 23 は、NもしくはSであり、X 24 は、VもしくはLであり、X 25 は、SもしくはIであり、X 26 は、PもしくはSであり、X 27 は、Eもしくは非存在であり、X 28 は、NもしくはYであり、X 29 は、KもしくはRであり、X 30 は、AもしくはDであり、X 31 は、TもしくはSであり、X 32 は、VもしくはAであり、X 33 は、GもしくはDであり、X 34 は、T、I、もしくはSであり、かつX 35 は、T、S、もしくはAである)というアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)
(ここで、X 36 は、IもしくはVであり、X 37 は、PもしくはSであり、X 38 は、RもしくはLであり、X 39 は、KもしくはHであり、X 40 は、RもしくはKであり、X 41 は、EもしくはGであり、X 42 は、SもしくはGであり、かつX 43 は、YもしくはHである)というアミノ酸配列を含むVL;
又は
(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL;
(c)(i)配列番号21のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号22のアミノ酸配列を含むVL;又は
(d)(i)配列番号41のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号42のアミノ酸配列を含むVL;又は
(e)(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL;又は
(f)(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVL
を含む、前記MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
(項目66)
前記抗体がヒト由来重鎖及び軽鎖定常領域を含む、項目14〜65のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目67)
前記重鎖定常領域が、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目66記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目68)
前記軽鎖定常領域が、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目66又は67記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目69)
前記抗体又はその抗原結合断片がヒト化されている、項目1〜31、38〜55、又は62〜64のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目70)
前記抗体又はその抗原結合断片が齧歯類抗体のヒト化形態である、項目69記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目71)
前記抗体が、2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖を含む免疫グロブリンである、項目1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目72)
前記免疫グロブリンがIgGである、項目71記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目73)
薬剤にコンジュゲートされている、項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片を含む抗体コンジュゲート。
(項目74)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目73記載の抗体コンジュゲート。
(項目75)
前記抗体又はその抗原結合断片が二重特異性抗体である、項目1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目76)
前記二重特異性抗体がCD3に免疫特異的に結合する、項目75記載の二重特異性抗体。
(項目77)
前記二重特異性抗体が、MUC16に免疫特異的に結合する免疫グロブリンを含み、ここで、該免疫グロブリンの軽鎖が、ペプチドリンカーを介して、CD3に免疫特異的に結合する単鎖可変断片(scFv)にコンジュゲートされている、項目75又は76記載の二重特異性抗体。
(項目78)
薬剤にコンジュゲートされた、項目75〜77のいずれか一項記載の二重特異性抗体を含む二重特異性抗体コンジュゲート。
(項目79)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目78記載の二重特異性抗体コンジュゲート。
(項目80)
前記その抗原結合断片がscFvである、項目1〜70のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
(項目81)
薬剤にコンジュゲートされた、項目80記載のscFvを含むscFvコンジュゲート。
(項目82)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目81記載のscFvコンジュゲート。
(項目83)
項目1〜72のいずれか一項記載の抗体もしくは抗原結合断片;又は項目80記載のscFv又は項目81もしくは82記載のscFvコンジュゲートを含む、キメラ抗原受容体(CAR)。
(項目84)
抗体重鎖もしくはその抗原結合部分であって、該重鎖もしくはその抗原結合部分がVHを含み、このVHが:
(I)(a)アミノ酸配列
(ここで、X 1 は、LもしくはVである)を含むVH相補性決定領域(CDR)1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 2 は、Eもしくは非存在であり、かつX 3 は、YもしくはNである)を含むVHCDR2;
及び
(c)アミノ酸配列
を含むVH CDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(II)(a)アミノ酸配列
(ここで、X 8 は、NもしくはSであり、かつX 9 は、LもしくはVである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 10 は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVH CDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(III)(a)アミノ酸配列
(ここで、X 15 は、NもしくはSであり、かつX 16 は、VもしくはLである)を含むVHCDR1;
(b)アミノ酸配列
(ここで、X 17 は、Eもしくは非存在である)を含むVHCDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 18 は、T、A、もしくはSである)を含むVHCDR3;ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する;
又は
(IV)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号15のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VII)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIII)配列番号29のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IX)配列番号35のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(X)配列番号43のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XI)配列番号49のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XII)配列番号55のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIII)配列番号63のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIV)配列番号69のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XV)配列番号75のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVI)配列番号83のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVII)配列番号89のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVIII)配列番号95のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列を含むVHCDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列を含むVH CDR3(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含む、前記抗体重鎖もしくはその抗原結合部分。
(項目85)
抗体重鎖又はその抗原結合部分であって、該重鎖又はその抗原結合部分が:
(I)
(ここで、X 21 は、TもしくはNであり、X 22 は、IもしくはKであり、X 23 は、NもしくはSであり、X 24 は、VもしくはLであり、X 25 は、SもしくはIであり、X 26 は、PもしくはSであり、X 27 は、Eもしくは非存在であり、X 28 は、NもしくはYであり、X 29 は、KもしくはRであり、X 30 は、AもしくはDであり、X 31 は、TもしくはSであり、X 32 は、VもしくはAであり、X 33 は、GもしくはDであり、X 34 は、T、I、もしくはSであり、かつX 35 は、T、S、もしくはAである)というアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(II)配列番号1のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)配列番号21のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号41のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号61のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号81のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体重鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含むVHを含む、前記抗体重鎖もしくはその抗原結合部分。
(項目86)
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分がヒト由来重鎖定常領域を含む、項目84又は85記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
(項目87)
前記重鎖又はその抗原結合部分の定常領域が、ガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、及びガンマ4からなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目86記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
(項目88)
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分がヒト化されている、項目85記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
(項目89)
前記抗体重鎖又はその抗原結合部分が齧歯類重鎖のヒト化形態である、項目88記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分。
(項目90)
項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖又はその抗原結合部分を含む抗体重鎖コンジュゲートであって、該抗体重鎖又はその抗原結合部分が薬剤にコンジュゲートされている、前記抗体重鎖コンジュゲート。
(項目91)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目90記載の抗体重鎖コンジュゲート。
(項目92)
抗体軽鎖又はその抗原結合部分であって、該軽鎖又はその抗原結合部分が:
(I)(a)アミノ酸配列
(ここで、X 4 は、RもしくはLであり、かつX 5 は、KもしくはHである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列
を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 6 は、GもしくはSであり、かつX 7 は、HもしくはYである)を含むVLCDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(II)(a)アミノ酸配列
(ここで、X 11 は、LもしくはRであり、かつX 12 は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
(ここで、X 13 は、GもしくはSであり、かつX 14 は、HもしくはYである)を含むVLCDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)(a)アミノ酸配列
(ここで、X 19 は、VもしくはLであり、かつX 20 は、HもしくはKである)を含むVLCDR1;
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VII)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIII)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VIX)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(X)配列番号46のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XI)配列番号52のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XII)配列番号58のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIII)配列番号66のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XIV)配列番号72のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XV)配列番号78のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVI)配列番号86のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVII)配列番号92のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(XVIII)配列番号98のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列を含むVLCDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列を含むVL CDR3(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含む、VLを含む、前記抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分。
(項目93)
抗体軽鎖であって、該軽鎖が:
(I)
(ここで、X 36 は、IもしくはVであり、X 37 は、PもしくはSであり、X 38 は、RもしくはLであり、X 39 は、KもしくはHであり、X 40 は、RもしくはKであり、X 41 は、EもしくはGであり、X 42 は、SもしくはGであり、かつX 43 は、YもしくはHである)というアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(II)配列番号2のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(III)配列番号22のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(IV)配列番号42のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(V)配列番号62のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する);
又は
(VI)配列番号82のアミノ酸配列(ここで、任意に、該抗体軽鎖もしくはその抗原結合部分を含む抗体もしくはその抗原結合断片は、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し;(ii)MUC16の第二の形態(この第二の形態はグリコシル化されておらず、ここで、該第二の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対する免疫特異的結合を欠き;かつ(iii)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する)
を含むVLを含む、前記抗体軽鎖。
(項目94)
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分がヒト由来軽鎖定常領域を含む、項目92又は93記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目95)
前記軽鎖又はその抗原結合部分の定常領域が、カッパ及びラムダからなる群から選択されるアイソタイプを有する、項目94記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目96)
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分がヒト化されている、項目92記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目97)
前記抗体軽鎖又はその抗原結合部分が齧歯類抗体のヒト化形態である、項目96記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分。
(項目98)
薬剤にコンジュゲートされた、項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖又はその抗原結合部分を含む抗体軽鎖コンジュゲート。
(項目99)
前記薬剤が、イメージング剤又は細胞毒性剤である、項目98記載の抗体軽鎖コンジュゲート。
(項目100)
ペプチドリンカーを介してscFvにコンジュゲートされた、項目92〜99のいずれか一項記載の抗体軽鎖を含む融合タンパク質。
(項目101)
前記scFvがCD3に結合する、項目100記載の融合タンパク質。
(項目102)
項目83記載のCARを組換え発現するT細胞。
(項目103)
項目80記載のscFvをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目104)
項目81もしくは82記載のscFvコンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目105)
項目83記載のCARをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目106)
項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目107)
項目90又は91記載の抗体重鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目108)
項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目109)
項目98又は99記載の抗体軽鎖コンジュゲートをコードする核酸配列を含むポリヌクレ
オチド。
(項目110)
項目100又は101記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目111)
(a)項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖又は項目90もしくは91記載の抗体重鎖コンジュゲート;及び(b)項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖、項目98もしくは99記載の抗体軽鎖コンジュゲート、又は項目100もしくは101記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
(項目112)
プロモーターに動作可能に連結された項目103〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目113)
(a)第一のプロモーターに動作可能に連結された項目106又は107記載のポリヌクレオチド;及び(b)第二のプロモーターに動作可能に連結された項目108〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目114)
プロモーターに動作可能に連結された項目103〜105のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目115)
プロモーターに動作可能に連結された項目106又は107記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目116)
プロモーターに動作可能に連結された項目108〜110のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目117)
項目112記載のベクターを含むエクスビボ細胞。
(項目118)
項目113記載のベクターを含むエクスビボ細胞。
(項目119)
プロモーターに動作可能に連結された項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする1以上のポリヌクレオチドを含むエクスビボ細胞。
(項目120)
抗体重鎖を産生する方法であって、項目115記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる該抗体重鎖又は抗体重鎖コンジュゲートを産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
(項目121)
抗体軽鎖を産生する方法であって、項目116記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体軽鎖、抗体軽鎖コンジュゲート、又は融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
(項目122)
抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、項目118記載のエクスビボ細胞を、前記第一のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチド及び前記第二のプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドが該細胞によって発現されて、(i)該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体重鎖又は前記抗体重鎖コンジュゲート;及び(ii)該ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体軽鎖、前記抗体軽鎖コンジュゲート、又は前記融合タンパク質を産生するような条件下で培養することを含む、前記方法。
(項目123)
項目1〜72のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合断片、項目73もしくは74記載の抗体コンジュゲート、項目75〜77のいずれか一項記載の二重特異性抗体、項目78もしくは79記載の二重特異性抗体コンジュゲート、項目80記載のscFv、項目81もしくは82記載のscFvコンジュゲート、項目83記載のCAR、項目84〜89のいずれか一項記載の抗体重鎖、項目90もしくは91記載の抗体重鎖コンジュゲート、項目92〜97のいずれか一項記載の抗体軽鎖、項目98もしくは99記載の抗体軽鎖コンジュゲート、項目100もしくは101記載の融合タンパク質、又は項目102記載のT細胞の治療有効量;及び医薬として許容し得る担体:を含む医薬組成物。
(項目124)
それを必要としている患者の癌を治療する方法であって、該患者に項目123記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目125)
前記癌が、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、又は原発性腹膜の癌である、項目124記載の方法。
(項目126)
前記癌が卵巣の癌である、項目124又は125記載の方法。
(項目127)
前記患者がヒト患者である、項目124〜126のいずれか一項記載の方法。
(項目128)
前記方法が、追加の治療剤の治療有効量を前記患者に投与することをさらに含む、項目124〜127のいずれか一項記載の方法。
(項目129)
前記医薬組成物が、項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片である第一の抗体の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し;ここで、前記追加の治療剤が、第二の抗体又はその抗原結合断片であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含み、かつ配列番号150のN-グリコシル化Asn1800も含むMUC16中のエピトープを認識する、項目128記載の方法。
(項目130)
前記第一の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され;ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型のものであり、かつ
前記第二の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(ii)MUC16の第五の形態(この第五の形態はグリコシル化されており、ここで、該第五の形態のアミノ酸配列は配列番号172である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞がMUC16の該第五の形態を組換え発現する細胞と同じ型の細胞である、項目129記載の方法。
(項目131)
前記医薬組成物が、項目1〜72のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片である第一の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含むが、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含まないMUC16中のエピトープを認識し;ここで、前記追加の治療剤が、第二の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量であり、ここで、該第二の抗体又はその抗原結合断片が、配列番号150のN-グリコシル化Asn1800を含むが配列番号150のN-グリコシル化Asn1806を含まないMUC16中のエピトープを認識する、項目128記載の方法。
(項目132)
前記第一の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(このMUC16の第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(この第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力によって同定され、ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型のものであり、かつ
前記第二の抗体又はその抗原結合断片が、(i)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、ここで、該第一の形態のアミノ酸配列は配列番号133である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;(ii)MUC16の第三の形態(MUC16のこの第三の形態はグリコシル化されており、ここで、該第三の形態のアミノ酸配列は配列番号139である)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合するその能力;及び(iii)MUC16の第四の形態(この第四の形態はグリコシル化されており、ここで、該第四の形態のアミノ酸配列は配列番号152である)を組換え発現する細胞に対するその免疫特異的結合の欠如によって同定され;ここで、MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞、MUC16の該第三の形態を組換え発現する細胞、及びMUC16の該第四の形態を組換え発現する細胞が同じ細胞型のものである、項目131記載の方法。
(項目133)
1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドであって、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり、かつ(ii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが炭水化物と結合している、前記免疫原性糖ペプチド。
(項目134)
1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む、項目133記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目135)
炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、項目133記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目136)
炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目133記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目137)
前記炭水化物がN-又はO-結合型炭水化物である、項目133〜136のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目138)
前記炭水化物が、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である、項目133〜137のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目139)
前記炭水化物が二糖である、項目133〜137のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目140)
前記二糖がキトビオースである、項目139記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目141)
前記免疫原性糖ペプチドのN末端がアセチル化されている、項目133〜140のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目142)
前記糖ペプチドのC末端がN-メチルカルボキサミド誘導体の形態である、項目133〜141のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目143)
免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、項目133〜142のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目144)
前記免疫原性キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、項目143記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目145)
15〜18アミノ酸残基の長さである、項目133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目146)
キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目145記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目147)
キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目145記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目148)
18アミノ酸残基の長さである、項目133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目149)
キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目148記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目150)
15アミノ酸残基の長さである、項目133〜144のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目151)
キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目150記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目152)
配列番号150のアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み、ここで、前記1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、項目133〜151のいずれか一項記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目153)
配列番号129のアミノ酸配列を含む、項目152記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目154)
キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目153記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目155)
Man 3 GlcNAc 2 部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目153記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目156)
配列番号130のアミノ酸配列を含む、項目152記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目157)
キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む、項目156記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目158)
配列番号131のアミノ酸配列を含む、項目152記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目159)
キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目158記載の免疫原性糖ペプチド。
(項目160)
糖タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、対象を、1以上のグリコシル化部位を含む免疫原性糖ペプチドで免疫することを含み、ここで、(i)該免疫原性糖ペプチドが、10〜60アミノ酸残基、10〜30アミノ酸残基、15〜25アミノ酸残基、15〜20アミノ酸残基、又は15〜18アミノ酸残基の長さであり;(ii)該免疫原性糖ペプチドが、該糖タンパク質アミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分を含み;(iii)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが炭水化物と結合しており;かつ(iv)該1以上のグリコシル化部位のうちの少なくとも1つが該アミノ酸配列の部分にある、前記方法。
(項目161)
前記抗体又はその抗原結合断片が、前記糖タンパク質の非グリコシル化形態に対する特異的結合を欠いている、項目160記載の方法。
(項目162)
前記対象が、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ニワトリ、モルモット、ラット、ウサギ、又はマウスである、項目160又は161のいずれか一項記載の方法。
(項目163)
前記対象が、ラット、ウサギ、又はマウスである、項目160又は161のいずれか一項記載の方法。
(項目164)
前記対象がマウスである、項目160又は161のいずれか一項記載の方法。
(項目165)
前記免疫原性糖ペプチドが、1つ、2つ、又は3つのグリコシル化部位を含む、項目160〜164のいずれか一項記載の方法。
(項目166)
前記免疫原性糖ペプチドが、炭水化物と結合しているグリコシル化部位を含む、項目160〜164のいずれか一項記載の方法。
(項目167)
前記免疫原性糖ペプチドが、炭水化物と各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目160〜164のいずれか一項記載の方法。
(項目168)
前記炭水化物がN-又はO-結合型炭水化物である、項目160〜167のいずれか一項記載の方法。
(項目169)
前記炭水化物が、単糖、二糖、三糖、四糖、又は五糖である、項目160〜168のいずれか一項記載の方法。
(項目170)
前記炭水化物が二糖である、項目160〜168のいずれか一項記載の方法。
(項目171)
前記二糖がキトビオースである、項目170記載の方法。
(項目172)
前記免疫原性糖ペプチドのN末端がアセチル化されている、項目160〜171のいずれか一項記載の方法。
(項目173)
前記糖ペプチドのC末端がN-メチルカルボキサミド誘導体の形態である、項目160〜172のいずれか一項記載の方法。
(項目174)
免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、項目160〜173のいずれか一項記載の方法。
(項目175)
前記免疫原性キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、項目174記載の方法。
(項目176)
前記免疫原性糖ペプチドが、15〜18アミノ酸残基の長さである、項目160〜175のいずれか一項記載の方法。
(項目177)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目176記載の方法。
(項目178)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目176記載の方法。
(項目179)
前記免疫原性糖ペプチドが18アミノ酸残基の長さである、項目160〜175のいずれか一項記載の方法。
(項目180)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している2つのグリコシル化部位を含む、項目179記載の方法。
(項目181)
前記免疫原性糖ペプチドが15アミノ酸残基の長さである、項目160〜175のいずれか一項記載の方法。
(項目182)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合しているグリコシル化部位を含む、項目181記載の方法。
(項目183)
前記糖タンパク質が配列番号150のアミノ酸配列を含む、項目160〜182のいずれか一項記載の方法。
(項目184)
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号129のアミノ酸配列を含む、項目183記載の方法。
(項目185)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目184記載の方法。
(項目186)
前記免疫原性糖ペプチドが、Man 3 GlcNAc 2 部分と結合している配列番号129の30番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目184記載の方法。
(項目187)
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号130のアミノ酸配列を含む、項目183記載の方法。
(項目188)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと各々結合している配列番号130の4番目の残基(Asn)及び10番目の残基(Asn)における2つのグリコシル化部位を含む、項目187記載の方法。
(項目189)
前記免疫原性糖ペプチドが配列番号131のアミノ酸配列を含む、項目183記載の方法。
(項目190)
前記免疫原性糖ペプチドが、キトビオースと結合している配列番号131の7番目の残基(Asn)におけるグリコシル化部位を含む、項目189記載の方法。
提供されるのは、抗体及びその抗原結合断片、並びにそのような抗体もしくは断片を含むポリペプチド、例えば、融合タンパク質、コンジュゲート、及び/又はキメラ抗原受容体、並びにこれら発現する細胞である。該抗体及び断片の中に、MUC16タンパク質のエピトープに特異的に結合するものがある。そのような抗体は、本明細書において、「MUC16グリコシル化抗体」と呼ばれる。そのようなエピトープは、典型的には、MUC16分子、通常、MUC16の非放出形態の細胞外部分の内部又は実質的に内部にあるエピトープであり;いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16のタンデムリピート領域及び/もしくはMUC16の分泌形態の内部にあることも、該抗体もしくは断片が、MUC16のタンデムリピート領域及び/もしくはMUC16の分泌形態に結合することもない。いくつかの実施態様において、該エピトープは、MUC16c114の内部にあるか、又はMUC16c114の内部の残基を含み、典型的には、その中に1以上のグリコシル化残基又はグリコシル化部位を含む。いくつかの実施態様において、該エピトープは、1以上のグリコシル化部位、例えば、N-グリコシル化の部位を含む。いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150に示されるMUC16配列(及び/又はそのグリコシル化形態)のAsn1806又はAsn1800に対応するアスパラギン残基を含み;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含まず;いくつかの態様において、該エピトープは、配列番号150のAsn1800に対応するアスパラギン残基を含むが、配列番号150のAsn1806に対応するアスパラギン残基を含まない。そのような実施態様のいずれかのいくつかにおいて、そのような1以上のアスパラギンは、グリコシル化されており、例えば、N-グリコシル化されている。いくつかの実施態様において、該抗体又は断片は、配列番号131の内部のエピトープもしくは配列番号131の内部の残基を含むエピトープに結合するか;配列番号130の内部のエピトープもしくは配列番号130の内部の残基を含むエピトープに結合するか、又はこれらの組合せであり;いくつかの実施態様において、該抗体又は断片は、配列番号168に対応するMUC16の領域内でも、配列番号168の残基2〜19の内部にあるMUC16の領域内でも免疫特異的に結合しない。
MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え産生抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、2つの重鎖分子と2つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖−抗体重鎖対、イントラボディ、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体もしくは単鎖可変断片(scFv)、ラクダ化抗体、アフィボディ、及びジスルフィド連結Fv(dsFv)、又はこれらの断片を挙げることができる。そのような抗体は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、例えば、表1、3、及び5に示される、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体のいずれかのVH CDRを含むMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片である。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR1を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR2を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDR3を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、表1、3、又は5に示されるMUC16グリコシル化抗体のVH CDRのうちの1つ、2つ、又は3つ全て(例えば、表1の2列目のVL CDR、例えば、抗体10C6のVH CDRの全て)を含む。
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVHを含む。
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVHを含む。
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVHを含む。
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVLを含む。
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVLを含む。
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVLを含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH;並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVL
を含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH;並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:113)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVL
を含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH、並びに
(ii)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列YMS (配列番号:119)を含むVL CDR2;及び
(c)アミノ酸配列
を含むVL
を含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号6のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号7のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号8のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH;並びに
(ii)
(a)配列番号12のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号13のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号20のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH、並びに
(ii)
(a)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号27のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号28のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH;並びに
(ii)
(a)配列番号32のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(b)配列番号33のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
(i)
(a)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
を含むVH、並びに
(ii)
(d)配列番号38のアミノ酸配列を含むVL CDR1;
(e)配列番号39のアミノ酸配列を含むVL CDR2;及び
(f)配列番号40のアミノ酸配列を含むVL CDR3;
を含むVL
を含む。
(a)
(b)
(a)
(b)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL領域を含む。
(a)
(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL領域を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/s未満のkdでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s、1×10-3/s、1.5×10-3/s、2×10-3/s、2.5×10-3/s、3×10-3/s、4×10-3/s、5×10-3/s、6×10-3/s、7×10-3/s、8×10-3/s、9×10-3/s、1×10-4/s、2×10-4/s、3×10-4/s、4×10-4/s、5×10-4/s、6×10-4/s、7×10-4/s、又は8×10-4/sのkdでMUC16に結合する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約0.5×10-3/s〜8×10-4/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約1.5×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2×10-3/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約2×10-4/sのkdでMUC16に結合する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、約7×10-4/sのkdでMUC16に結合する。
好ましい実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節を参照)は、任意の他の分子、例えば、有機部分、検出可能標識、又は同位体にコンジュゲートされていない。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節を参照)は、1以上の有機部分にコンジュゲートされている。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1以上の検出可能標識にコンジュゲートされている。代わりの実施態様において、本明細書に提供されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1以上の同位体にコンジュゲートされている。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節を参照)コンジュゲートであり、ここで、該MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、二重特異性抗体コンジュゲートであり、ここで、該二重特異性抗体は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、抗体重鎖コンジュゲートであり、ここで、該抗体重鎖は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、抗体軽鎖コンジュゲートであり、ここで、該抗体軽鎖は、1以上の薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。また本明細書に提供されるのは、融合タンパク質コンジュゲートであり、ここで、該融合タンパク質は、薬剤、例えば、イメージング剤又は細胞毒性剤にコンジュゲートされている。ある実施態様において、該薬剤は、共有結合的に又は非共有結合的にコンジュゲートされている。
(5.3.1 抗体の産生及びスクリーニング)
別の態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を産生する方法である(第5.1節及び第5.2節を参照)。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである(第5.1節及び第5.2節を参照)。また本明細書に提供されるのは、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターである(第5.3.3節を参照)。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の抗原をコードするポリヌクレオチドである(第5.1節及び第5.2節を参照)。また本明細書に提供されるのは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を(例えば、組換え)発現する細胞(例えば、エクスビボ細胞)である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、第5.3.2節を参照)を含む、宿主細胞における、好ましくは、哺乳動物細胞における組換え発現のためのベクター(例えば、発現ベクター)である。また本明細書に提供されるのは、そのようなベクター又はヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を組換え発現するための細胞(例えば、エクスビボ細胞)である。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、そのようなMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を細胞(例えば、エクスビボ細胞)から発現させることを含む、方法である。好ましい実施態様において、該細胞は、エクスビボ細胞である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の医薬有効量を含む組成物(例えば、医薬組成物)及びキットである。ある実施態様において、該医薬組成物は、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片、及び/又はCARを組換え発現する免疫細胞、例えば、T細胞を含む。組成物は、個々の単一単位剤形の調製において使用することができる。本明細書に提供される組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、オンマヤ内、眼内、硝子体内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、髄腔内、脳室内、脳実質内、又は経皮投与用に製剤化することができる。好ましい実施態様において、該組成物は、非経口投与用に製剤化される。特に好ましい実施態様において、該組成物は、静脈内投与用に製剤化される。好ましい実施態様において、該組成物は、腹腔内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、腹膜転移を治療するための腹腔内投与用に製剤化される。好ましい実施態様において、該組成物は、髄腔内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、脳転移を治療するための髄腔内投与用に製剤化される。例えば、Kramerらの文献、2010, 97: 409-418を参照されたい。好ましい実施態様において、該組成物は、脳における脳室内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、脳転移を治療するための脳室内投与用に製剤化される。例えば、Kramerらの文献、2010, 97: 409-418を参照されたい。好ましい実施態様において、該組成物は、脳における実質内投与用に製剤化される。具体的な実施態様において、該組成物は、脳腫瘍又は脳腫瘍転移を治療するための実質内投与用に製剤化される。例えば、Lutherらの文献、2014, Neuro Oncol, 16: 800-806、及びClinical Trial ID NO NCT01502917を参照されたい。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、非経口的な注射投与用に製剤化される。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、静脈内、血管内、筋肉内、皮内、皮下、及び眼内を含む。非経口投与用に、該組成物は、医薬として許容し得る非経口ビヒクルと関連した、又はそれとは別々に提供される、溶液、懸濁液、エマルジョン、又は凍結乾燥粉末として製剤化することができる。そのようなビヒクルの非限定的な例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、グリセロール、エタノール、及び1〜10%ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば、固定油を使用することもできる。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)並びに化学的安定性を維持する添加剤(例えば、緩衝剤及び防腐剤)を含むことができる。製剤は、公知の又は好適な技法によって滅菌される。
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む組成物は、肺投与用に製剤化される。肺投与用に、該組成物は、肺の下気道又は鼻洞(sinuses)に達するのに有効な粒子サイズで送達される。肺投与用の組成物は、吸入による治療剤の投与のための当技術分野で公知の種々の吸入装置又は鼻腔用装置のいずれかによって送達することができる。エアロゾル化製剤を患者の鼻腔(sinus cavity)又は肺胞に堆積させることができるこれらの装置としては、定量吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、スプレーなどが挙げられる。本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片の肺又は鼻腔投与を導くのに好適な他の装置も当技術分野で公知である。そのような装置は全て、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片をエアロゾル中に分配するための投与に好適な製剤を使用する。そのようなエアロゾルは、溶液(水性と非水性の両方)又は固形粒子のいずれかから構成されることができる。Ventolin(登録商標)定量吸入器のような定量吸入器は、通常、噴射剤ガスを使用し、吸気中の作動を必要とする(例えば、WO 94/16970号、WO 98/35888号を参照)。いくつか例を挙げると、Turbuhaler(商標)(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、Inhale Therapeuticsによって市販されている装置のような乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を使用する(引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第4,668,218号(Astra)、EP 237507号(Astra)、WO 97/25086号(Glaxo)、WO 94/08552号(Dura)、米国特許第5,458,135号(Inhale)、WO 94/06498号(Fisons))。Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)及びAcorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)(米国特許第5,404,871号(Aradigm)、WO 97/22376号)のようなネブライザー(上記の参考文献は引用により完全に本明細書中に組み込まれる)は、溶液からエアロゾルを生じさせるが、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などは、小粒子エアロゾルを発生させる。そのような市販の吸入装置の例は非限定的な例であり、範囲が限定されることを意図するものではない。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、経口投与用に製剤化される。ある実施態様において、経口投与用に、組成物及び本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片を投与する方法は、腸壁の透過性を人為的に増大させるための、例えば、レゾルシノール並びに非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどのアジュバントの共投与、並びに酵素的分解を阻害するための、例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFF)、及びトラジロールなどの酵素阻害剤の共投与に頼っている。経口投与用の固体型剤形の活性成分化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、ガムトラガカント、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドを含む、少なくとも1つの添加剤と混合することができる。これらの剤形は、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、パラベン、防腐剤、例えば、ソルビン酸、アスコルビン酸、α-トコフェロール、酸化防止剤、例えば、システイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、香味剤、芳香剤などのような、他のタイプの添加剤を含むこともできる。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、粘膜表面からの吸収用に製剤化される。ある実施態様において、粘膜表面からの吸収用に、組成物及び本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を投与する方法は、エマルジョン粒子の粘膜付着を達成することによって粘膜表面からの吸収を促進する、複数のサブミクロン粒子、粘膜付着性巨大分子、生体活性ペプチド、及び水性連続相を含むエマルジョンを含む(米国特許第5,514,670号)。本明細書に提供されるエマルジョンの適用に好適な粘膜表面としては、例えば、角膜、結膜、口腔内、舌下、鼻腔、膣内、肺、胃、腸、及び直腸への投与経路を挙げることができる。膣内又は直腸投与用の製剤、例えば、坐剤は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなどを含むことができる。鼻腔内投与用の製剤は固体であり、かつ賦形剤として、例えば、ラクトースを含むことができるか、又は点鼻剤の水性もしくは油性溶液であることができる。口腔内投与用に、賦形剤としては、例えば、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが挙げられる(米国特許第5,849,695号)。
ある実施態様において、本明細書に提供される組成物は、経皮投与用に製剤化される。ある実施態様において、経皮投与用に、該組成物は、例えば、リポソーム又はポリマー性ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、又はマイクロスフェア(別途明記されない限り、マイクロ粒子と総称される)などの送達装置に封入された、本明細書に記載される少なくとも1つのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む。いくつかの好適な装置が経皮投与用に知られており、これには、合成ポリマー、例えば、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びこれらのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、並びにポリホスファゼン、並びに天然ポリマー、例えば、コラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、及び他のタンパク質、アルギネート及び他の多糖、並びにこれらの組合せから作られたマイクロ粒子が含まれる(米国特許第5,814,599号)。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される1以上の抗体もしくはその抗原結合断片、又はそれらのコンジュゲートを含むキットである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される医薬組成物の成分のうちの1つ又は複数、例えば、本明細書に記載される1以上の抗体又はその抗原結合断片が充填された1以上の容器を含む医薬パック又はキットである。いくつかの実施態様において、該キットは、本明細書に記載される医薬組成物及び予防剤又は治療剤を含む。
(5.5.1 治療的使用及び方法)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象の癌、特に、対象のMUC16陽性癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)の治療有効量を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該対象は、第5.5.5節に記載されているような対象である。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.5.3節に記載されているような用量で投与される。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.5節に記載されているような方法に従って投与される。具体的な実施態様において、MUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.5.4節に記載されているような1以上の追加の医薬活性剤と組み合わせて投与される。
ある実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)は、本明細書に記載される疾病(例えば、MUC16陽性癌細胞が関与する疾病)を検出、診断、又はモニタリングするために、診断目的で使用することができる。ある実施態様において、診断目的で使用するためのMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片は、第5.2節に記載されている通りに標識される。
本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)、又は組成物(第5.4節を参照)、又は該抗体もしくはその抗原結合断片を発現する細胞は、種々の経路によって対象に送達することができる。これらには、限定されないが、非経口、鼻腔内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、腫瘍内、結膜、及び皮下経路が含まれる。肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザー、及びスプレー剤として使用されるエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって利用されることもできる。一実施態様において、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物は、対象(例えば、第5.5.5節に記載されているような対象)に非経口投与される。具体的な実施態様において、該非経口投与は、静脈内、筋肉内、又は皮下である。
具体的な実施態様において、対象の癌(例えば、卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、又は原発性腹膜癌)を治療するための本明細書に提供される方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又はその抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)を含む医薬組成物を投与することを含む方法は、該対象に、1以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。具体的な実施態様において、該追加の治療剤は、対象の癌(例えば、卵巣癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵管癌、子宮(例えば、子宮内膜)癌、及び原発性腹膜癌)を治療するためのものである。具体的な実施態様において、該追加の治療剤は、本明細書に記載されるMUC16グリコシル化抗体又は抗原結合断片(第5.1節及び第5.2節を参照)による治療の任意の副作用を治療するためのものである。
本明細書に提供される方法に従って治療される対象は、任意の哺乳動物、例えば、齧歯類、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、霊長類、又はヒトなどであることができる。好ましい実施態様において、該対象は、ヒトである。別の好ましい実施態様において、該対象は、イヌである。本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、互換的に使用される。
(6.1 実施例1: MUC16/CA125のカルボキシ末端部分の発現は形質転換及び腫瘍浸潤を誘導する)
(6.1.1 序論)
MUC16の抗原性断片である血清CA125抗原は、1980年代初頭から卵巣癌の評価及び管理の中心であるが、その生物現象及び卵巣癌の発現への寄与はあまり理解されていない(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献1〜3を参照)。2001年に達成されたCA125のクローニングにより、小さい細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、推定切断部位の近位にあるエクトドメイン、及び各々156アミノ酸長の12〜20個のタンデムリピートの大きい重度グリコシル化領域を有する繋留型ムチンとしてのMUC16が初めて同定された(図1A)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献4〜6を参照)。卵巣、卵管、及び子宮の漿液性癌は、多くの場合、大量のMUC16を発現し、異常なMUC16発現は、肺、膵臓、及び乳房の癌を含む、いくつかの他の悪性腫瘍に見出すことができる。他の繋留型ムチンの発現は上皮器官の共通の特徴であり、それらは、悪性腫瘍で過剰発現されることが多い。2つの著明な例は、多くの乳癌及び卵巣癌で過剰発現されるMUC1と膵癌及び消化器癌で特徴的に多く存在するMUC4である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献7を参照)。これらのムチンはどちらも、形質転換特性を有することが確認されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献8及び9を参照)。これらの形質転換機構は異なっており、完全には理解されていない。MUC1は、核に移行して、転写因子として作用することが示されているβ-カテニン相同性領域を有する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献10及び11を参照)。対照的に、MUC4は、その膜貫通領域内にHER結合ドメインを有し、少なくとも一部は、HERファミリーキナーゼを介して作用する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献12及び13を参照)。MUC16は、これらのドメインの両方に対する相同領域を欠いており、独立に進化したと思われる(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献12を参照)。MUC1とMUC4の両方と比較して、MUC16の発現はより制限されており、通常、ほとんどミュラー管及び眼球上皮のみに発現される(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14〜16を参照)。MUC16分子のタンデムリピート領域は、メソテリン及び他の間質タンパク質との重要な相互作用タンパク質として機能するように思われる(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献17を参照)。これらの相互作用は、おそらく、卵巣癌による古典的なパターンの漿膜拡散に関与している。臨床状況では、CA125抗原をコードするMUC16由来の高レベルの循環エレメントは、病期、悪性度、及び他の伝統的な臨床的因子とは独立に、有害な臨床転帰と関連している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。MUC16のC末端を浸潤及び成長に重要なものと特定している者もいるが、形質転換に関与する近位MUC16配列の特定の領域は明らかにされていない(例えば、Therialtらの文献、Gynecol Oncol 2011, 121(3):434-443及びGiannakourosらの文献、Int. J. Oncol. 2015, 41(1):91-98を参照)。卵巣癌DNA中のMUC16をコードするゲノム領域の増幅及びMUC16 mRNAの過剰発現が癌ゲノムアトラス(The Cancer Genome Atlas)(TCGA)卵巣癌プロジェクトで認められており、より悪い転帰と関連している(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献19を参照)。マウスにおけるMUC16の喪失は明確な表現型と関連しているわけではなく、持続的な又は異常なMUC16発現の効果は不明である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献20を参照)。本実施例におけるデータは、MUC16の114個のC末端アミノ酸残基(MUC16c114、配列番号133)の発現、特に、MUC16c114の残基Asn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)のグリコシル化が、シグナル伝達、遺伝子発現、及び侵襲的な生物学的挙動の特定の変化と関連することを示している。
(6.1.2.1 MUC16カルボキシ末端(MUC16c114)及びMUC16-CA125ドメイン(MUC16c344) DNAコンストラクト並びにグリコシル化融合タンパク質の合成)
MUC16の切断形態(MUC16c344、MUC16c114、MUC16c80、及びMUC16c86と表記される;図1B及び図1C)をコードするDNAコンストラクトを作製した。phrGFP II-Cベクター(phrGFP)(Stratagene, LaJolla, CA)のEcoRV及びNotIマルチクローニングサイトを用いて、MUC16c114、MUC16c80、MUC16c86、及びMUC16c344 DNAを組み込み、GFPタンパク質が切断型MUC16融合タンパク質のカルボキシ末端に存在する状態で得られるGFP融合コンストラクトを作製した。鋳型としてのpBK-CMV-MUC16-B53 DNA(Yin BWTらの文献、International Journal of Cancer, 2002, 98(5):737-740)を用いて、MUC16断片(MUC16c344、MUC16c114、MUC16c80、及びMUC16c86)のPCR産物を作製し、PCR産物を1%アガロースゲル中で精製し、シークエンシングし、phrGFP II-Cベクター(phrGFP)のEcoRV及びNotIマルチクローニングサイトに挿入した。pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターは、InvivoGen(San Diego, CA)から購入した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーをエクトドメインMUC16c57-114(配列番号150の位置1777〜1834)用に設計するか、又は制限酵素部位EcoRVをフォワードプライマーとして、及び制限酵素部位NcoIをリバースプライマーとして、117-244LGALS3の糖結合ドメインのDNA配列を合成した(Sigma-Genosys, The Woodlands, TX)。pBK-CMV-MUC16-B53 DNAを鋳型として用いて、MUC16c57-114断片のPCR産物を生成し、ATCC(Manassas, VA)から入手したLGALS3 cDNAクローン(MGC:2058 IMAGE:3050135 GenBank: AAH01120.1; DBSourceアクセッションBC001120.2)をDNA鋳型として用いて、LGALS3の糖結合ドメインのPCR産物を合成した。PCR産物を1%アガロースゲル中で精製し、シークエンシングし、pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターに挿入した。
MUC16-細胞質ドメイン(MUC16c114、カルボキシ末端114aa)のフォワード及びリバースプライマー
トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理し、洗浄し、血球計算盤によりカウントした。細胞を複数のエッペンドルフチューブに少なくとも0.5〜1×106個/チューブで分配した。細胞を、1%FCS及び0.025%アジ化ナトリウムを含むPBS(FACSバッファー)で洗浄した。表面FACS染色のために、細胞を、1μg/チューブのMUC16-カルボキシ末端モノクローナル体(4H11.2.5)の生体反応性上清、マウス抗ヒトOC125(M3519)(DakoCytomation, Dako North America社, Carpinteria, CA)なしで(二次抗体対照用に)、又はこれらとともに、氷上で30分間インキュベートした。エッペンドルフチューブ中の細胞を、1μg/チューブの非特異的アイソタイプマッチ対照マウス抗体(MSKCCモノクローナルコア施設から入手したIgG1モノクローナル体に対する13C4及びIgG2bモノクローナル体に対する4E11)でも表面染色し(データは示さない)、氷上で30分間インキュベートした。全ての細胞をFACSバッファーで3回洗浄した。細胞を1μg/チューブの二次抗体ヤギ抗マウスIgG1-PE又はIgG2b-PEとともに氷上で30分間インキュベートし、その後、FACSバッファーで3回洗浄した。細胞をFACS Caliburにより解析した。
NIH/3T3(3T3)細胞(線維芽細胞)は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC, Manassas, VA)から入手した。A2780細胞は、ヒト卵巣癌細胞株である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献28を参照)。両方の細胞株を公開されている条件に従って維持した。安定なMUC16陽性細胞株をMUC16発現ベクター(phrGFP-MUC16c344、phrGFP-MUC16c114、phrGFP-MUC16c80、及びphrGFP-MUC16c86)のトランスフェクションによって作出し、ジェネティシン(G418、Invitrogen, Grand Island, NY)を用いてそのそれぞれの培養培地中で選択し、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づいて単離した。MUC16c114トランスフェクタントは、推定切断部位からカルボキシ末端まで(配列番号150のアミノ酸1777〜1890)のMUC16タンパク質の細胞表面発現を有する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照)。MUC16のカルボキシ末端(アミノ酸1547〜1890)にまで及ぶ344アミノ酸断片としてのMUC16タンパク質の細胞表面発現を有するMUC16c344-GFPベクターの発現を有する株を含む、より長いMUC16断片を有する細胞株を同様の方法で調製した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照)。
全てのコンストラクトを、製造元のプロトコルに従ってDOTAP(Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN)を用いて、NIH/3T3(3T3)及びA2780細胞に導入した。安定なトランスフェクタントを、400μg/mLのG418を用いて、3T3及びA2780細胞について、そのそれぞれの培養培地中で選択した。これらをMSKCCフローサイトメトリーコア施設(FCCF)でGFP発現について2回細胞選別し、選択された細胞を、最大15回の継代の間、株として成長させた。FACS解析によるルーチンのモニタリングを行って、これらの株のGFP陽性を確認した。これらの株のタンパク質抽出物を、抗hrGFP(Stratagene, La Jolla, CA)及び抗MUC16-カルボキシ末端モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって解析した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5及び14を参照)。
1000個の安定なトランスフェクト細胞/ウェルをマルチプル96ウェル平底プレート中の200μLの培養培地/ウェルに播種し、37℃及び5%CO2で5日間インキュベートした。毎日、3つ組の培養プレートを25μL/ウェルのAlamar Blue(ABD Serotec Co. UK)で発色させ、37℃及び5%CO2で4時間インキュベートした。プレートを、530nMでの励起及び620nMでの放射を用いて、PerSeptive Biosystems CytoFluorマルチウェル蛍光プレートリーダーモデル# 4000で読み取った。4日間にわたる成長曲線を記録し、3つ組のプレートの平均値をそれに応じてプロットした。
安定なトランスフェクト細胞をアガロース懸濁液に入れ、薄いアガロース層の上にプレーティングし、足場非依存性コロニーを形成するその能力について解析した。ディッシュ当たり10mLの培地-アガロース懸濁液中の100〜500万個の細胞をプレーティングし、37℃及び5%CO2でインキュベートした。プレートをコロニー形成についてモニタリングした。追加の培養培地を4〜5日毎に重層した。11〜14日間培養した後、コロニーを数え、コロニーの写真を撮った。
MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2及び117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2コンストラクトを、融合タンパク質を無血清培地中に発現及び分泌するヒト胚性腎臓(HEK) FreeStyle 293F細胞(Invitrogen, CA)に別々にトランスフェクトした。3枚の10%SDS-PAGEゲルに、pFUSE-hIgG1-Fc2対照空ベクター、MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2ベクター、及びLGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2ベクターで一過性トランスフェクトされたHEK 293F細胞由来の5μg/レーンの融合タンパク質上清を泳動させた。1枚のゲルを、製造元のプロトコルに従って、Gelcode試薬で直接染色した。2枚のゲル由来のタンパク質を、5%無脂肪乳-0.1%Tween-20を含むリン酸緩衝食塩水(PBST)で、シェーカー上で、室温で1時間ブロッキングした2枚のニトロセルロース膜に転写した。これらの膜を、5%無脂肪乳PBST中1:5,000希釈の抗ヒトIgG1-Fc-HRP(γ1鎖特異的)(Southern Biotech社、CA); 5%無脂肪乳PBST中1:2000希釈の4H11-HRP mAb(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照)、及び5%無脂肪乳PBST中1:200希釈の抗ヒトGAL3 mAb(Santa Cruz Biotechnology, CA)で、シェーカー上で、4℃で一晩プロービングした。GAL3膜をPBSTで3回洗浄し、5%無脂肪乳PBST中1:3,000希釈の抗マウスIgG-HRP二次抗体で、シェーカー上で、室温で1時間標識した。膜をPBSTで3回洗浄し、その後、これらをECL試薬(Perkin Elmer, NY)化学発光基質で5分間処理し、発光したシグナルをX線フィルム上に捕捉した。
基底膜浸潤をマトリゲル浸潤チャンバー(BD Biosciences, Bedford, MA)で決定した。マトリゲル遊走を48時間で3つ組のウェル中で測定し、phrGFPベクター対照と比較し、%phrGFP対照マトリゲル浸潤として表した。0.1μg/mLのツニカマイシン(Sigma-Aldrich, St. Louis MO cat # T7765)又は5μg/mLのMUC16c57-c114-pFUSE-hIgG1-Fc2又は5μg/mLの117-244LGALS3 pFUSE-hIgG1-Fc2融合タンパク質で処理された安定細胞株の48時間後のマトリゲル遊走を測定し、%phrGFP対照マトリゲル浸潤として表した。
RNA単離物をRiboPureキット(Ambion, Austin, TX)プロトコルに従って調製した。転移及び細胞外マトリックスタンパク質遺伝子のパネルのRT PCRを、以前に記載されている通りに、RT2 Profiler PCRアレイシステム(Super Array, Frederick, MD)を用いて実施した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献29を参照)。
トランスフェクトされた細胞株及び適当な対照細胞株を無胸腺ヌードマウスの側腹又は腹腔に導入し、日常的な動物の世話は、MSKCC抗癌評価コア施設(MSKCC Antitumor Assessment Core Facility)によって提供された。腫瘍成長評価実験のために、各々の腫瘍株由来の200万個の細胞を5〜15匹の無胸腺ヌードマウスの各々に移植した。腫瘍測定を週2回行い、腫瘍成長を、MSKCC RARCガイドラインに従って、1500mm3の最大サイズまで記録した。
安定細胞株を、10cmディッシュで、そのそれぞれの培養培地中で培養し、37℃及び5%CO2で3日間インキュベートした。その後、これらを氷冷PBSで2回洗浄し、1〜2mLの氷冷PBSで擦り落とし、遠心分離した。ペレット化した細胞を、0.2mLの改変Ripa溶解バッファー(20mM Tris-HCL、pH 7.4; 150mM NaCl; 1%NP-40; 1mM Na3VO4; 1mM PMSF; 1mM DTT;プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(cat # 11836170001、Roche Diagnostics, IN製)を含む)で、氷上で30分間溶解させ、4℃で10分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度をBio-Radタンパク質アッセイ(BioRaD Laboratories, Hercules, CA)を用いて測定した。等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離し、BioRad転写装置を用いて4℃でPVDF膜に転写した。膜を、0.1%Tween-20を含むPBS(PBST)中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)又は5%無脂肪乳で、4℃で一晩ブロッキングした。膜を種々の一次抗体(Cell Signaling, MA: Akt cat #9272;ホスホ-Akt(Ser473)(193H12) cat # 4058; p44/43 MAPK(Erk1/2) cat # 9102;ホスホ-p44/43 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) cat #9101);(Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO:β-アクチン cat # A5441);(Southern BioTech, Birmingham, AL:抗ヒト-Fc-IgG1-HRP cat # 9054-05、及びAbgent, San Diego, CA:ポリクローナルLGALS3 抗体 cat # AP11938b)で4℃で一晩発色させた。膜をPBSTで3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体(GE Healthcare, UK)(1:5000希釈)で室温で1時間で発色させた。その後、膜をPBS-Tで3回洗浄し、Western Lightning化学発光試薬(ECL, Perkin Elmer)で室温で1〜5分間発色させ、シグナルをHyBlot CLフィルム(Denville Scientific社. Metuchen, NJ)上で現像した。
包括的なゲノムデータは、316個の漿液性卵巣癌試料について、TCGAプロジェクト(tcga.cancer.gov)の一部として入手可能であった。遺伝子レベルのDNAコピー数のコールを、GISTICを用いてCBSセグメント化Agilent 1Mマイクロアレイデータから得た。MUC16 mRNA発現を3つの異なるプラットフォーム(Agilent 244K全ゲノム発現アレイ、Affymetrix HT-HG-U133A、及びAffymetrix Exon 1.0アレイ)を用いて測定し、遺伝子発現値を以前に記載されている通りに導出した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献30を参照)。MUC16中の体細胞突然変異を、全エクソーム捕捉と、それに続く、次世代シークエンシング(SOLiD又はIllumina)により同定した。全てのTCGAデータをcBio Cancer Genomics Portal(www.cbioportal.org)からダウンロードした。その後、mRNA発現値を対応するDNAコピー数のカテゴリー(ホモ接合性欠失、半接合性欠失、二倍体、増加、高レベルの増幅)と関連付け、体細胞突然変異を全試料にわたって重ね合わせ、以前に記載されている通りに、統計的フレームワークR(www.R-project.org)を用いて、ボックスプロットとしてプロットした(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献31を参照)。臨床データは、TCGAデータポータル(tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)から入手した。
コンディショナルなカルボキシ末端354アミノ酸(MUC16c354)トランスジェニックコンストラクトを、ベクターphrGFP II-C(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて作製し、CMVプロモーターをベクターpCAG-CreERT2(Addgene, Cambridge, MA)由来のCAGプロモーターと交換した。MUC16c354断片を、Yin BWらによって作製されたコンストラクトB53から、PCRによって増幅させた(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5及び6を参照)。MUC16c354コンディショナルコンストラクトは、以下のユニット: pCAG、5'loxP、hrGFP、BGHpA、3'loxP、MUC16c354、HA、及びSV40pAを含有する。
12カ月齢のマウスを屠殺し、剖検した。肉眼検査の後、解剖された組織試料を10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定し、その後、アルコール及びキシレン中で処理し、パラフィンに包埋し、5μmの厚さで切削し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。組織は、獣医病理学者(SM)によって調べられ、腫瘍性病変と非腫瘍性病変が、齧歯類病理命名法に関する公表されたガイドラインに従って診断された。
インビトロ成長、浸潤、及び軟寒天成長潜在能力の検討のために、スチューデントの対応のある両側t検定を用いて、群を比較した。χ二乗検定を用いて、提供されているソフトウェア(SuperArray)に従って、RT-PCRデータを有意性について解析した。各々の動物における全腫瘍体積の経時的な曲線下面積評価を用いて、腫瘍体積の比較を行った。全ての動物が両方の群で生きていた最後の日を基にして、腫瘍体積の評価を行った。ノンパラメトリック順位検定(ウィルコクソン二標本検定)を用いて、群間分布差について検定した。動物生存研究で、事象を腫瘍体積が1,500mm3を超えるまでの時間又は潰瘍形成までの時間と定義して、時間事象解析を行った。1,500mm3未満の腫瘍体積を有する動物を最大60日間追跡調査し、その後、打ち切った。カプラン-マイヤー法を用いて、生存分布を推定した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献32を参照)。
MUC16タンパク質のタンデムリピート領域の明かな切断及び放出の後、このタンパク質のカルボキシ末端の約114アミノ酸(c114)は細胞表面に残ると考えられており、この分子のこの部分の潜在的な機能は不明である。3T3線維芽細胞及び卵巣癌細胞株の悪性形質転換及び挙動におけるMUC16タンパク質のこの最近位部分の役割を解析した。切断部位の近位にある残りのc114アミノ酸エレメントの効果を検討するために、2つのベクター:(1)MUC16c114-GFPベクター及び(2)切断型MUC16c344-GFPベクター(図1)を設計し、これらのベクター及びphrGFP対照ベクターを3T3線維芽細胞に独立にトランスフェクトした。MUC16c114発現細胞株及びMUC16c344発現細胞株をG418を用いて選択し、維持し、MUC16c114及びMUC16c344の安定発現を、MUC16カルボキシ末端のユニークなアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体を用いるFACS解析により確認した(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照)。MUC16タンパク質由来の344アミノ酸(配列番号132)を発現する細胞株(MUC16c344-GFP株)は、FACS解析により細胞表面でOC125抗体によって認識される古典的なCA125エピトープを担持しており、CA125は細胞培養上清中に放出される。OC125は、MUC16c114-GFP細胞を認識しない。しかしながら、トランスフェクトされた株は全て、推定切断部位の近位にあり、かつMUC16エクトドメイン特異的4H11抗体によって認識されるMUC16c114細胞外配列(配列番号133)について細胞表面陽性であった(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献14を参照;図1)。
MUC16の切断後の残存エレメントによって付与される形質転換特性を調べるために、3T3 MUC16c114-GFP及び3T3 MUC16c344-GFP細胞株の特徴を解析し、これら2つの最小MUC16エレメントの効果をベクター対照と比較した。MUC16配列の最近位の114アミノ酸(MUC16c114)又は近位の344アミノ酸(MUC16c344)のいずれかの発現は、親株のインビトロ成長速度と比較したとき、トランスフェクトされた細胞株のどのインビトロ成長速度にも有意な効果を有しなかった(図2A)。しかしながら、MUC16タンパク質の同じエレメントの発現は、軟寒天クローニングにおいて3T3足場依存性成長を実質的に変化させた。最小c114断片とc344断片はどちらも、ベクターのみの対照と比較して軟寒天コロニーの数を有意に増加させた(図3A)。MUC16タンパク質の近位部分の発現は、phrGFPベクター対照でトランスフェクトされた3T3細胞と比較して、古典的マトリゲル浸潤アッセイでMUC16+3T3細胞の遊走も増強した(p<0.0001)(図3B)。様々なMUC16タンパク質断片を発現する3T3細胞を選択された転移及び浸潤遺伝子転写物の発現について調べたとき、ケモカインリガンド12(CXCL12)、カドヘリン11(CDH11)、並びにマトリックスメタロプロテイナーゼMMP2及びMMP9を含む、多数の浸潤遺伝子が上方調節されていた(図3C)。フィブロネクチン(FN1)及びニューロフィブロミン(NF2)を含む他の転写物は一貫して減少している。MUC16はインビボ腫瘍成長を変化させ、かつMUC16タンパク質を担持する細胞の浸潤特性を増大させるので、MUC16は、MUC1及びMUC4の効果と同様の方法で、標準的なシグナル伝達経路を介して作用し得る。相互作用するERK及びAKT経路は、卵巣癌における重要なシグナル伝達機構及び腫瘍細胞浸潤の調節因子として以前に同定されている(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献21及び22を参照)。図3Dに示されているように、pAKT(S473)及びpERK(T202/Y204)の増大から明らかな両方の経路の活性化が見られた。
3T3細胞におけるMUC16タンパク質の発現は形質転換の特徴と明確に関連していたが、完全に形質転換した卵巣癌細胞株の中には、培養したとき、MUC16発現を欠くものもある。ヒト卵巣癌細胞の挙動に対するMUC16の寄与を調べるために、A2780細胞(MUC16を発現しないヒト卵巣癌細胞株)をMUC16c114-GFP又はMUC16c344-GFPでトランスフェクトした。MUC16発現細胞をG418により選択し、MUC16及びGFP発現についてのFACSに供した。これらの細胞は、MUC16発現がなくても軟寒天中でよく成長するので、マトリゲル浸潤に対するMUC16c344及びMUC16c114の効果を解析した。図4Aに示されているように、MUC16c114及びMUC16c344発現は、A2780細胞におけるマトリゲル浸潤を明らかに促進した。同様に、ERK及びAKT経路の活性化に対するMUC16c114及びMUC16c344の効果は、3T3細胞で見られるものと類似しており、pAKT(S473)とpERK(T202/Y204)の両方の基礎レベルを増大させた(図4B)。したがって、悪性卵巣細胞株でも、MUC16カルボキシ末端エレメントの発現の増大は、浸潤の増大及び癌遺伝子活性化と関連している。さらに、MUC16c114及びMUC16c344トランスフェクトA2780株のインビボ腫瘍成長を解析した(図4C)。両方の状況において、MUC16c114細胞株及びMUC16c344細胞株は、ベクターのみの対照よりも急速に成長した。このヒト癌モデルにおいて、ベクター対照は、実際、十分な速度で成長し、最後には動物を死滅させた。
形質転換に関与するMUC16c114の特定の部分を決定するために、2つのさらなるMUC16断片:(1)MUC16c114のエクトドメイン由来の34アミノ酸配列(原著公開文献で付番されている、位置1798〜1831)が欠失しているMUC16c80(図1D;配列番号135)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5を参照);並びに(2)MUC16c114コンストラクトがMUC16のエクトドメイン全体を保持しているが、細胞質ドメインの推定Ezrinドメイン、潜在的なチロシンリン酸化部位、及びSH2ドメイン由来の28アミノ酸配列(位置1857〜1884)を除去しているMUC16c86(図1D;配列番号134)を構築した。これらのコンストラクトを3T3細胞に導入し、残りのMUC16c80及びMUCc86配列の細胞表面発現についてFACSにより選択した。その後、これら2つのさらなる細胞集団をMUC16c80及びMUCc86依存的変化について調べた。MUC16c86コンストラクト(インタクトなエクトドメインを有するコンストラクト)は、MUC16c80コンストラクト(インタクトな細胞質ドメインを有するコンストラクト)よりもはるかに大きい軟寒天コロニー形成能力を保持していた(図5A)。これは、マトリゲル浸潤能力についても当てはまった(図5B)。MUC16c80発現3T3細胞は、phrGFPベクター対照の浸潤速度と統計的に異ならない浸潤速度を有していた。対照的に、MUC16c86発現3T3細胞は、インタクトなMUC16c114及びMUC16c344細胞と同様の、より浸潤性の高い表現型を保持していた。AKT及びERK経路の活性化を調べたとき、結果は、軟寒天コロニー及びマトリゲル浸潤研究と一致した(図5C)。(完全にインタクトなエクトドメインを有しない)MUC16c80断片の発現は、ERK及びAKTを活性化せず、phrGFPベクター対照と類似していたが、対照的に、(インタクトなエクトドメインを有する)MUC16c86を発現する3T3細胞は、ERK及びAKTの活性化に関して完全なMUC16c114を発現する3T3細胞と類似していた。最後に、インタクトなエクトドメインの重要性を異種移植腫瘍モデルで確認した。
トランスジェニックマウスにおけるカルボキシ末端MUC16エレメントの発現の効果及び自然発生的な腫瘍形成の割合を調べた。MUC16c354(完全なc114配列及び最近位のCA125担持タンデムリピート)を発現するコンディショナルトランスジェニックマウスを作製した。CMV初期エンハンサー+ニワトリβアクチンプロモーター(CAG)を用いて、全てのマウス組織における実質的なMUC16c354発現を強制した。ヒト卵巣の生理機能がマウス生殖器系と非常に異なり、組織特異的卵巣プロモーターが弱く、かつトランスジェニックシステムで使用するのが比較的難しいので、この戦略を選んだ。これらのマウスについての戦略を図9Aに示す。
実験モデルにおける形質転換及び腫瘍侵襲性に対するMUC16断片に基づいて、MUC16の遺伝子変化と卵巣癌の転帰の関連を調べた。TCGA卵巣癌プロジェクトは、臨床転帰データを含む完全なデータを備えた316種の漿液性卵巣癌を含むよく研究されたコレクションである。MUC16タンパク質の発現は癌挙動の重要な原動力であるので、MUC16 mRNA発現に対するMUC16コピー数の影響を解析した。MUC16転写物発現は、MUC16遺伝子コピー数に概ね関連していたが、調べた群の全て(当然ながら、MUC16の稀なホモ接合性欠失を除く)においてMUC16転写物発現に広範な変動があった。ほとんどの場合、MUC16 mRNA発現は、対照として含まれる正常な卵管試料よりも大きい転写物数でクラスター化した。遺伝子コピー数は、MUC16タンパク質の発現を変化させる可能性があるいくつかの変数の1つであるが、MUC16 mRNA発現(及び当然、MUC16タンパク質)が漿液性卵巣癌で増大していることが多いことは明白である。TCGAデータセットにおける臨床転帰に対するMUC16過剰発現又は突然変異の複合的影響も調べた。TCGAデータセットをMUC16発現五分位数に分けたとき、最大のMUC16発現を有する20%の患者は、より低いMUC16発現を有する患者よりも有意に悪い生存率を有していた(p=0.02969)。図11Aに示されているように、この関係は、MUC16突然変異を有する18人の患者を高MUC16発現群に含めるとさらに強くなった(p=0.02117)。まとめると、この解析から、MUC16発現が卵巣癌を有する患者の生存に対する悪影響を有することが示され、本発明者らの前臨床モデルで同定されたMUC16発現の負の生物学的効果が確認される。
CA125抗原をコードするMUC16は、卵巣癌を有する多くの患者の血漿中に循環する(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献1を参照)。MUC16は、その発現がミュラー組織の外側に限定されている点で、繋留型ムチンの中で独特である(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献2及び14を参照)。腫瘍の大きさと独立した有害な予後因子と見なされることが増えているが、その負の影響の生物学的機構は、十分には理解されていない(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献18を参照)。この分子のNH2-部分は、CA125抗原をコードし、かつメソテリン及びいくつかのガレクチンの重要な接着パートナーとしての機能を果たすと思われる多数のタンデムリピートを含む(図1A)(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献5、17、及び24〜26を参照)。これらの接着機能はMUC16関連の有害転帰に極めて重要であることが示唆されているが、これらの研究が、観察された卵巣癌細胞挙動の変化の全てを説明しているわけではない。MUC16糖タンパク質のクローニングにより、MUC16遺伝子産物に関する基本的な構造情報が提供された(下記の第6.1.5節に列挙されている参考文献4及び5を参照)。本実施例に提示されたデータは、MUC16が環境から癌細胞へのシグナル伝達を媒介し得ることを示す最初のデータであり、特に、本実施例に提示されたデータから、グリコシル化MUC16エクトドメインがMUC16による癌細胞挙動の変化にとって極めて重要なものとして特定される。
(6.1.5 実施例1で引用された参考文献)
(6.2.1 序論)
OC125抗体によって認識されるCA125抗原(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献1を参照)は、MUC16糖タンパク質の細胞外部分由来のタンデムリピートドメイン中で発現される重度グリコシル化抗原である(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献2及び3を参照)。この循環抗原は、主に、良性又は悪性のミュラー組織に由来し、ヒト卵巣癌の腫瘍マーカーとしてFDAに認可されているが、発癌におけるその機能及び役割は不明である(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献4〜6を参照)。MUC16は、複合繋留型ムチンのファミリーに属し、それは、大きい重度グリコシル化細胞外ドメイン、膜と推定切断部位の間にある小さいエクトドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、及び短い細胞質テールからなる(図1)(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献7及び8を参照)。ほとんどのMUC16タンパク質は、切断後、周囲の空間に放出され、エクトドメインは細胞表面に残る。OC125及び他のMUC16反応性モノクローナル抗体(mAb)の大半は、この分子の切断部分にのみ存在するタンデムリピート領域中の抗原と反応する。これらのエピトープは循環中に見られる可能性が高いので、既存のmAbを用いて、残りのMUC16タンパク質断片の結末を追跡することはできず、MUC16発現の真の分布を正確には反映しない可能性がある(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献9を参照)。グリコシル化された表面タンパク質が、EGFR、PDGFR、及びその他のようなチロシンキナーゼ受容体のN-グリコシル化部位とのガレクチン3に基づく相互作用を通じて細胞増殖及び分化を調節することができることを示している者もいる(KS Lau Cell 129:123, 2007)。実施例1(第6.1節を参照)に示されているように、MUC16の近位部分(わずか114アミノ酸程度のもの)は、不死化3T3細胞を形質転換することができ、この効果は、ツニカマイシンによって無効化されるように思われる。
(6.2.2.1 糖ペプチドの合成)
合成糖ペプチドを、MUC16c55(配列番号129、図13)のAsn30に明確に定義されたキトビオース(GlcNAc2)を取り込んだ重要なエピトープ模倣体として用いて、MUC16の55-アミノ酸配列
5匹のBALB/c及び5匹のSwiss Websterマウスを、25μLのTitermaxアジュバントの存在下、55-merの糖ペプチド(第6.2.2.1節を参照)で3週間毎に3回免疫して、マウスを免疫した。3週間後、マウスを、モノ-グリコシル化された15-mer(配列番号131)のKLHコンジュゲートコンストラクトとビス-グリコシル化された18-mer(配列番号130)のKLHコンジュゲートコンストラクトの混合物で免疫した。血清を、KLHにコンジュゲートされていない55-merのGlcNAc2-グリコシル化糖ペプチド及びより短い糖ペプチドに対する反応性について解析した。グリコシル化されていない55-mer、15-mer、及び18-merペプチドを、2つのMUC16非関連キトビオース含有ペプチドとともに、スクリーニングの陰性対照として使用した。マウスを15-mer及び18-merのKLH-コンジュゲートで3週間毎にさらにもう2回免疫し、各々の免疫付与後に、応答をELISAによって解析した。
第6.1.2.9節を参照されたい。shRNA実験のために、BD BioCoat(商標) Matrigel(商標)浸潤インサート又はチャンバー(カタログ# 354480、24ウェルプレート中)及び対照インサート(カタログ# 354578、24ウェルプレート中)は、BD Biosciences, MAから購入した。マトリゲル浸潤アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施した。簡潔に述べると、24ウェルプレート中のマトリゲルチャンバー(-20℃で保存されたもの)及び対照インサート(4℃で保存されたもの)を室温に至らせておいた。両方のインサートを、インサート中で、及び24ウェルプレートの外側のウェル中で、37℃の5%CO2加湿インキュベーターにて2時間、0.5mLの無血清培地で再水和させた。培養したSKOV3細胞をトリプシン処理し、培養培地で洗浄した。100万個の細胞を別の遠心分離チューブに分け、無血清培地で3回洗浄した。後に、これらの細胞を調整して、0.5mLの無血清培地中、5,000細胞にした。再水和させたインサート中の培地を除去し、このインサートを、化学誘引物質としての役割を果たすウェル中の0.75mLの10%胎仔ウシ血清(FBS)含有培養培地を含む新しい24ウェルプレートに移した。すぐに、無血清培地中の0.5mLの該細胞(5,000細胞)をインサートに添加した。適切な注意を払って、インサート及び外側のウェルに気泡が閉じ込められないように配慮した。24ウェルプレートを37℃の5%CO2加湿インキュベーターで48時間インキュベートした。インキュベーション後、綿棒をマトリゲル又は対照インサートに挿入して「擦る」ことにより、非浸潤細胞を膜の上表面から除去し、綿棒の先端を膜表面にわたって移動させながら、穏やかに圧力をかける。培地に浸した第二の綿棒で擦ることを繰り返した。その後、蒸留水中の0.5mLの0.5%クリスタルバイオレット染料を含む新しい24ウェルプレート中で30分間、インサートを染色した。染色後、インサートを蒸留水の3つのビーカー中ですすいで、余分な染料を除去した。インサートを新しい24ウェルプレート中で風乾させた。浸潤した細胞を、200倍の倍率の倒立顕微鏡下で、手でカウントした。3つ組の膜のいくつかの視野をカウントし、図に記録した。
第6.1.2.11節を参照されたい。
ForeBio Octet QKを用いて、結合親和性を決定した。ビオチン化され、キトビオースがコンジュゲートされた5μg/mLの18-merの糖ペプチドをストレプトアビジンバイオセンサー上にローディングした。余分な抗原を洗い流した後、マウス抗体を、それぞれ、会合及び解離工程について、10μg/mLで試験した。1:1結合部位モデル、部分フィットを用いて、結合パラメータを計算した。
既存のパラフィン包埋組織のコア針生検を、いわゆる、ドナーブロックから入手し、その後、Kononenらによる技法(Kononen Jらの文献、 Nat Med 1998;4(7):8447を参照)、その後、Hedvatら(Hedvat CVらの文献、Hum Pathol 2002;33(10):968-74を参照)によって改変された技法を用いて、レシピエントパラフィンアレイ「マスター」ブロックに再配置した。Beecher Instruments社(Sun Prairie, WI)製の手動で操作されるTissue Arrayer MTA-1を用いて、直径が0.6〜1.0mmの大きさの試料円形スポット(コア)を作製した。コアを、互いに0.3〜0.4mm離してアレイ化した。エッジング効果を避けるために、対照組織の層を実際の組織マイクロアレイの周囲に戦略的に置いた。各々の組織マイクロアレイの具体的な組成は、以下で詳述されている。卵巣癌又は対照組織についての組織マイクロアレイのスライドを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から4um切片を切ることにより調製した。
89Zr-19C11の内在化を、MUC16c114を発現するSKOV3細胞で調べた。約1×105個の細胞を12ウェルプレートに播種し、37℃の5%CO2インキュベーターで一晩インキュベートした。ある容量の放射性標識タンパク質を各々のウェルに添加し、プレートを37℃及び4℃で1、5、12、及び24時間インキュベートした。各々のインキュベーション期間の後、培地を回収し、細胞を1mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)ですすいだ。細胞を、100mMグリシンを含む1mLの100mM酢酸(1:1、pH 3.5)中、4℃で洗浄することにより、表面結合活性を回収した。その後、接着細胞を1mLの1M NaOHで溶解させた。各々の洗浄液を回収し、活性についてカウントした。最終洗浄液の活性と全ての洗浄液の全活性との比を用いて、内在化された%を決定した。
(6.2.3.1 MUC16病理生物現象はC末端のMUC16エクトドメインのN-グリコシル化に依存的である)
実施例1(第6.1節を参照)は、MUC16c114の発現が3T3マウス線維芽細胞のより侵襲的なインビトロ/インビボ挙動をもたらし、MUC16c114駆動性マトリゲル浸潤の顕著な増大及びインビボでのより急速な腫瘍成長をもたらすことを示した。したがって、SKOV-3細胞株(MUC16の発現を欠くヒト卵巣細胞株)をMUC16c114依存的特性の効果について調べた。MUC16c114発現は、細胞表面発現とマトリゲル浸潤のほぼ3倍の増大とを引き起こした(図12Aのレーン1と2を比較されたい)。Asn30のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N3、図12A、レーン3)、Asn1及びAsn24のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N12、図12A、レーン4)、並びにAsn1、Asn24、及びAsn30のアラニンへの突然変異(MUC16c114-N123、図12A、レーン4)がマトリゲル浸潤を無効化したので、この浸潤の増大は、MUC16c114のアミノ酸位置1(Asn1)、24(Asn24)、及び30(Asn 30)のアスパラギン(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する; MUC16c114-N123)のN-グリコシル化に依存的であった。図12Bも参照されたい。さらに、MGAT5又はLGALS3発現を低下させるノックダウンshRNA実験がN-グリコシル化部位におけるMUC16c114突然変異と類似した効果を有し、かつ浸潤を基礎レベル近くにまで低下させたので、MUC16c114によって誘導されるマトリゲル浸潤の増大は、MGAT5(N-グリコシル化反応に関与する最初の酵素)及び/又はLGALS3(多くの悪性度の高い漿液性癌で増幅される酵素)に依存的であった(図12A、レーン6〜10)。
MUC16c114のAsn30部位(成熟MUC16(配列番号150)のAsn 1806に対応する; MUC16c114-N3)におけるN-グリコシル化はMUC16発癌作用の主要な要件であることが明らかになったので、MUC16c114-N12がAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)でN-グリコシル化される能力を保持するため、SKOV3細胞で発現されるMUC16c114-N12のグリカンプロファイリングを実施した。グライコーム解析により、様々なマンノース部分が結合する最小反復単位としての極めて重要なキトビオース(GlcNAc2)ステムを有する、このC末端MUC16断片の極めて多様なN-グリコシル化パターンが示された(図13A)。
マウスワクチン接種及び血清回収を第6.2.2.2節に記載されているプロトコルに従って実施した。GlcNAc2-55-mer(図13B)による3回の免疫付与の後、マウスをKLHコンジュゲートコンストラクトの混合物(モノ-グリコシル化15-mer(配列番号131;図13C)及びビス-グリコシル化18-mer(配列番号130;図13D))でさらに免疫し、10匹のマウスのうち2匹が、両方の55-mers(GlcNAc2ありとGlcNAc2なし)について陽性のELISAシグナルを示したが、応答は概して弱く、マウスが55-merの免疫付与で完全には感作されなかったことを示唆している。KLHコンジュゲート(GlcNAc2-15-mer(図13C)及び(GlcNAc2)2-18-mer(図13D))によるさらに2回の免疫付与は、特に、2匹のマウス(マウス7及びマウス8)において、より短い15-mer及び18-merの糖ペプチドに対するIgG免疫応答の増強をもたらした。しかしながら、これらの抗体は、55-mer-糖ペプチドとのELISAによる検出可能な反応性を示さず、これにより、この特定のアッセイでは、この大きい断片中のエピトープが接近不可能であるか又は立体構造的に異なるかのどちらかであることが示唆される。両方の55-mer(キトビオース含有ペプチド及び/又は非グリコシル化ペプチド)に応答したマウス5は、Man3GlcNAc2誘導体化55-merに対して陰性であった。非グリコシル化ペプチド骨格に対する4H11 mAb(Raoらの文献、Appl. Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(5):462-72)が、コンジュゲートされていない15/18-merの糖ペプチドに対する結合を示さなかったことは驚くべきことではなく、利用可能なエピトープにある程度の違いがあり得ることを示した。図14を参照されたい。
その血清が非グリコシル化ペプチドと比較して短い糖ペプチドに対する最大の反応性比を示し、したがって、糖の存在に対してある程度の選好を示す、10匹のマウスのうちの1匹(マウス7)を選択した。マウス7の脾臓を摘出し、標準的なハイブリドーマ培養技術により、IgG産生ハイブリドーマ細胞株を提供した。脾細胞をハイブリドーマ融合パートナーと融合させ、並外れて高い融合効率を得た(平均して>5.5コロニー/ウェル、>30,000個のハイブリドーマ)。上清を、個々の糖ペプチドに対するELISAによる反応性について選択し、スクリーニングした。(同じウェル中で組み合わせた)15mer-キトビオースペプチド及び18mer-キトビオースペプチドに対する融合試験プレートの予備的なELISA解析は、抗ペプチド抗体の存在を示すいくつかの陽性シグナルを示したが、そのグリコシル化依存性をこの時点で完全には評価することができなかった。図14を参照されたい。それにもかかわらず、キトビオース-グリコシル化抗原に対する、好ましい陽性度を有し、したがって、より特異的な抗体の割合が、非グリコシル化抗原と比較してより高いことが観察された。培養物の希釈により、各々のウェルで成長している単一のクローン(上記の1:1の比)が得られ、一次スクリーニングにより、これらのハイブリドーマによって産生された抗体がグリコシル化されていない15-/18-merの近くにある4H11エピトープを認識しないことが明らかになった。図14を参照されたい。より大きい希釈でモノクローナル抗体スクリーニングを遂行した後に、糖ペプチドエピトープに対する選好を示す抗体が得られた。このように、このプロセスによって、36個のキトビオース依存性一次mAbが得られ、これをMUC16に対する反応性について試験した。これらのうち、15個のmAbを(4H11と並行して)、浸潤に対するその効果について、SKOV3-MUC16c114トランスフェクタントを用いるマトリゲルアッセイにより評価した(図15A)。MUC16グリコシル化抗体1B5、10C6、13A7、18C6、19C11、16C5、6H10、21F8、7B12は、マトリゲル浸潤の阻害を示したが、4H11は、この特性に対して効果がなく、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)に対する抗体がMUC16の生物現象を阻害することを示した。後に、MUC16グリコシル化抗体をサブクローニングし、精製した。特定のMUC16グリコシル化抗体の結合パラメータを決定した(表9を参照)。
MUC16グリコシル化抗体の特異性を調べるために、(i)ネイティブの(成熟)MUC16を発現する細胞(OVCA-433細胞)、(ii)対照ベクターを発現し、MUC16発現を欠く、SKOV3細胞(SKOV3 phrGFP細胞)、(iii)MUC16c114を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114)、(iv)MUC16c114-N1を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114-N1)、(v)MUC16c114-N3を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114-N3)、又は(vi)SKOV3 MUC16c114-N123を発現するSKOV3細胞(SKOV3 MUC16c114-N123)に対して、MUC16グリコシル化抗体(18C6、19C11、10C6、1B5、もしくは13A7)又はモノクローナル抗MUC16抗体4H11の存在下又は非存在下で、FACs解析を実施した。(表10)抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7は、OVCA-433細胞に対する結合を示した(表10; ID番号3〜8を陰性対照のID番号1及び2と比較されたい)。対照的に、抗体の研究及び作製の設計に基づいて予想されたように、抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7はいずれも、SKOV3 phrGFP細胞に結合しなかった(表10、陰性対照のID番号9及び10と比較した、ID番号11〜16)。抗体4H11、18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7は、SKOV3 MUC16c114に結合した(表10、陰性対照のID番号17及び18と比較した、ID番号19〜24)。MUC16c114のAsn1(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777に対応する)の突然変異は、SKOV3 MUC16c114-N1細胞に対する抗体結合を阻害しなかった(表10、陰性対照のID番号25及び26と比較した、ID番号27〜32)。しかしながら、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)の突然変異は、MUC16グリコシル化抗体18C6、19C11、10C6、1B5、及び13A7の結合を無効化した(表10、陰性対照のID番号33及び34と比較した、ID番号36〜40)。さらに、MUC16c114のAsn30(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する)の突然変異は、MUC16グリコシル化抗体ではない抗体4H11の結合を無効化しなかった(表10、陰性対照のID番号33及び34と比較した、ID番号35)。さらに、Asn1、Asn24、及びAsn30(それぞれ、成熟MUC16(配列番号150)のAsn1777、Asn1800、及びAsn1806に対応する)におけるアスパラギンからアラニンへの突然変異は、MUC16グリコシル化抗体18C6、19C11、10C6、及び1B5の結合を無効化したが(表10、陰性対照のID番号41及び42と比較した、ID番号44〜47)、4H11の結合は無効化されなかった。13A7がSKOV3 MUC16c114-N123細胞に対する結合を維持したことが留意される。これらのデータは、MUC16グリコシル化抗体がグリコシル化依存的な様式でMUC16c114に結合することを示している。
MUC16グリコシル化抗体のグリコシル化特異性(表9)を考慮して、MUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清がグリコシル化特異的な形でマトリゲル浸潤を阻害する能力を評価した。したがって、マトリゲル浸潤アッセイを、phrGFPを発現するSKOV3卵巣癌安定細胞株(図15A、レーン1)又はphr-GFP-MUC16c114を発現するSKOV3卵巣癌安定細胞株(MUC16c114;図15A、レーン2〜18)を用いて、MUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清の存在下(図15A、レーン3〜18)又は非存在下(図15A、レーン1及び2)で実施した。MUC16モノクローナル抗体4H11(図15A、レーン3)をMUC16グリコシル化抗体の生体反応性上清(図15A、レーン4〜18)の対照として用いて、マトリゲル浸潤のグリコシル化依存性を評価した。単独又は4H11の存在下(図15A、それぞれ、レーン2及び3)のいずれかのMUC16c114の発現は、マトリゲル浸潤活性の増大をもたらした。対照的に、MUC16グリコシル化抗体とのインキュベーション(図15A、レーン4〜18)は、MUC16c114発現卵巣癌細胞のマトリゲル浸潤を減少させた。
最後に、MUC16c114のAsn30を標的とするMUC16グリコシル化抗体が内在化される能力を評価した。MUC16c114を発現するSKOV3細胞を89Zr-DFO標識19C11抗体とともにインキュベートし、内在化をRadiotracerにより決定した(図17)。これらのデータは、37℃でインキュベートされたMUC16c114発現SKOV3細胞とともにインキュベートしたとき、抗体で処理してから早くも1時間後に標識19C11抗体が内在化されたことを示している。標識抗体の細胞取込みは4℃で減少した。
MUC1との相当な相同性を有するムチンファミリーのメンバーであるMUC16/CA125抗原は、長い間、婦人科悪性腫瘍と関連付けられてきた(下記の第6.2.5節に列挙されている参考文献4を参照)。一般的なスクリーニングツールとして十分に感度が高いわけでも、特異的であるわけでもないが、CA125測定は、通常、抗体ベースの検出方法によって、卵巣癌を有する患者をモニタリングするために使用される。OC125などの、圧倒的多数のMUC16反応性抗体は、この分子の切断画分に見られるグリコシル化依存性エピトープに対するものであり、切断後のMUC16の近位部分を検出するスクリーニングツールとしては有用でない。結果として、残りのMUC16タンパク質断片に関する生物学的研究が不足している。実施例1(第6.1節)のデータは、近位MUC16領域(MUC16C114)の114アミノ酸配列がいくつかの卵巣癌細胞株で浸潤及び腫瘍成長を増大させるのに十分であることを示した。このC末端エクトドメインの、特に、3番目のAsn部位(成熟MUC16(配列番号150)のAsn1806に対応する、Asn30)におけるN-グリコシル化が、MUC16の発癌効果にとって重要であるという本明細書における特筆すべき発見は、MUC16の新しい役割を示唆しており、その結果、疾患の消極的マーカーと考えることができるだけでなく、病原性分子と考えることもできる。この前提に基づいて、MUC16のこれらの保持される部分に対するモノクローナル抗体の開発は、このムチンの病理生物現象を探索し、かつMUC16を標的とする治療薬を作出するための強力なツールのように思われる。
(6.2.5 引用された参考文献)
本実施例は、(a)実施例2(第6.2節)に記載されている実験のうちのいくつかのより詳細な説明;並びに(b)実施例2(第6.2節)と比較した追加実験を提供するものである。
MUC16/CA125の過剰発現は、漿液性卵巣癌で一般的であり、血清CA125レベルの上昇は、生存の減少と関連している。OC125抗体によって認識されるCA125抗原は、MUC16糖タンパク質の細胞外部分由来のタンデムリピートドメイン内に発現される重度グリコシル化抗原である(下記の第6.3.13節の参考文献3及び22を参照)。この抗原は、良性又は悪性のミュラー組織によって主に発現されるが、発癌におけるその機能及び役割は、現在、完全には理解されていない(下記の第6.3.13節の参考文献4を参照)。MUC16は、不均一にグリコシル化された大きい細胞外ドメイン、細胞膜と推定切断部位の間にある58アミノ酸のエクトドメイン、疎水性膜貫通領域、及び短い細胞質テールからなる非常に複雑な繋留型ムチンである(下記の第6.3.13節の参考文献21を参照)。OC125及びほとんどの他のMUC16反応性モノクローナル抗体(mAb)は、この分子の切断部分に存在する免疫原性のある156アミノ酸のタンデムリピート領域を認識する。より新しいエクトドメイン特異的抗体(例えば、4H11及び4A5)は、切断後に保持されるMUC16の部分中のペプチドエピトープを認識する(下記の第6.3.13節の参考文献6を参照)。MUC16のC末端部分(MUC16c114)は、足場非依存的成長の増大、AKT及びERK経路の活性化、マトリゲル浸潤の増大、並びにヌードマウス異種移植片における成長の増強によって測定したとき、不死化3T3細胞を形質転換することが示されている(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。これらの効果はMUC16のエクトドメインに依存的であったが、31アミノ酸の細胞質テールの喪失は、これらの特性にほとんど効果がなかった。エクトドメインが発癌性挙動を促進する機構は完全には理解されていない(下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。コンセンサスタンパク質結合ドメインは存在しないが、MUC16エクトドメインの58アミノ酸配列は、MUC16の他の細胞表面分子との潜在的な相互作用/調節部位を表す3つのN-グリコシル化部位を含む。
(6.3.2.1 MUC16カルボキシ末端(MUC16c114)、MUC16-CA125ドメイン(MUC16c344)、及びグリコシル化融合タンパク質DNAコンストラクトの合成)
MUC16 C末端コンストラクトの説明については、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19を参照されたい。pFUSE-ヒトIgG1-Fc2ベクター(pFUSE)は、InvivoGen(San Diego, CA)から購入した。キメラタンパク質MUC16c57-114-pFUSE及び117-244LGALS3-pFUSEの構築も、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19に記載されている。
SKOV3、CAOV3、及びOVCAR3細胞株を入手し、第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19に記載されている通りに維持した。詳細については、第6.3.6節を参照されたい。
MUC16糖ペプチドの詳細な合成の説明については、第6.4節を参照されたい。
基底膜浸潤をマトリゲル浸潤チャンバー(BD Biosciences, Bedford, MA)で決定した。安定細胞株を、5μg/mLのツニカマイシン(Sigma-Aldrich, St. Louis MO cat # T7765)、又は5μg/mLのMUC16c57-c114-pFUSE、又は5μg/mLの117-244LGALS3-pFUSE融合タンパク質で処理し;次に、マトリゲル遊走を48時間後に3つ組のウェルで測定し、phrGFPベクター対照及びMUC16c114トランスフェクタントと比較した。第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19も参照されたい。
トランスフェクトされた細胞株及び適当な対照細胞株を無胸腺雌ヌードマウスの側腹に導入し、日常的な動物の世話は、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター抗腫瘍評価コア施設(Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitumor Assessment Core Facility)によって提供された。腫瘍測定を週2回行い、腫瘍成長を、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター研究動物資源センター(Memorial Sloan Kettering Cancer Center Research Animal Resource Center)のガイドラインに従って、1,500mm3の最大サイズまで記録した。第6.1.2節及び第6.2.2節、並びに下記の第6.3.13節の参考文献19も参照されたい。
免疫付与プロトコルは、5匹のBALB/cマウス及び5匹のSwiss Websterマウスにアジュバントの存在下で3週間毎に3回投与される、キトビオースを含有する55-merのMUC16糖ペプチド(GlcNAc2-55-mer;配列番号129)から開始された。4回目の免疫付与は、KLHコンジュゲートされ、モノ-グリコシル化された15-merのMUC16コンストラクト(GlcNAc2-15-mer-KLH;配列番号131)とKLHコンジュゲートされ、ビス-グリコシル化された18-merのMUC16コンストラクト([GlcNAc2]2-18-mer-KLH;配列番号130)の混合物を用いて実施した。血清を、GlcNAc2-55-mer(配列番号129)並びにコンジュゲートされていない、キトビオースを担持する15/18-merの糖ペプチド(それぞれ、配列番号131及び配列番号130)に対する反応性について解析した。さらに、グリコシル化されていない55-merペプチド(配列番号129)、15-merペプチド(配列番号131)、及び18-merペプチド(配列番号130)を、2つのMUC16非関連キトビオース含有ペプチドとともに、スクリーニングの陰性対照として使用した(配列番号168及び169)。マウスを、より短いKLH-コンジュゲート(配列番号130及び配列番号131)で3週間毎にさらにもう2回免疫し、各々の免疫付与の後、応答をELISAにより解析した。第6.2.2節も参照されたい。
サンドイッチELISAを実施し、ELISAアッセイのルーチンのコア施設プロトコルに従って、個々の(グリコール)ペプチドに対する抗体の陽性度を評価した。第6.2.2節も参照されたい。
等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分離し、BioRad転写装置を用いて4℃で二フッ化ポリビニリデン(PVDF)又はニトロセルロース膜に転写した。膜を0.1%Tween-20を含むPBS(PBST)中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)又は5%無脂肪乳で室温で1時間ブロッキングした。膜を種々の一次抗体[Cell Signaling, MA: Akt cat #9272;ホスホ-Akt(Ser473)(193H12) cat # 4058; p44/43 MAPK(Erk1/2) cat # 9102;ホスホ-p44/43 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204) cat #9101; Src cat # 2109S;ホスホ-Src cat # 2101L; EGFR cat # 2237L;ホスホ-EGFR(Y1068)(D7A5) XP(R) cat #3777S];(Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO:β-アクチンcat # A5441);(Southern BioTech, Birmingham, AL:抗ヒト-Fc-IgG1-HRP cat # 9054-05);(Abgent, San Diego, CA:ポリクローナルLGALS3抗体 cat # AP11938b);及び(Origene, Rockville, MD:マウスモノクローナル抗EGFR v3クローンOTI3H2 cat # TA506224;マウスモノクローナル抗DDKクローン4C5 cat # TA50011-100)で4℃で一晩発色させた。膜をPBS-Tで3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体(GE Healthcare, UK)(1:5000希釈)で室温で1時間で発色させた。その後、膜をPBS-Tで3回洗浄し、Western Lightning化学発光試薬(ECL, Perkin Elmer)で室温で1〜5分間発色させ、シグナルをHyBlot CLフィルム(Denville Scientific社. Metuchen, NJ)上で現像した。
ヒトTMAスクリーニングの免疫組織化学検査を以前に記載されている通りに実施した(下記の第6.3.13節の参考文献6を参照)。
50,000個の細胞をDelta TPG 0.17mmディッシュに個別に播種し、そのそれぞれの培地中、37℃、5%CO2で一晩培養した。接着細胞を、1%胎仔ウシ血清(FCS)及び0.025%アジ化ナトリウムを含むPBS(FACSバッファー)で2回洗浄した。細胞を、1:50希釈で、EGFR(R-1)-Alexa Fluor 647nm(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-101 AF647)と4H11又はインテグリンβ1(4B7R)-Alexa Fluor 647nm(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-9970 AF647)と4H11のいずれかで、4℃で30分間染色した。細胞をFACSバッファーで3回洗浄し、その後、ヤギ抗マウスIgG2b-PE(Santa Cruz Biotechnology, CA, cat # sc-3766-PE)で、4℃で30分間標識した。細胞をFACSバッファーで3回洗浄し、20x/0.8NAエア対物レンズ及び63x/1.4NAオイル対物レンズを備えたZeiss Axio Observer Z1で、ZEN2取得ソフトウェアを用いて、画像を撮影した
成長及び浸潤のインビトロ及びインビボ研究で評価した群を比較するために、両側スチューデントt-検定をGraphPad Prismソフトウェア(San Diego, CA)とともに用いて、データを統計的有意性について解析した。
OVCA-433細胞株に関しては、第6.3.13節の参考文献3を参照されたい。pLentiテトラサイクリン誘導性システムをInvitrogen, CA(cat # K4925-00)から購入し、pLenti-SKOV3c114を生成するために使用した。EGFR発現ウイルスプラスミドのshRNAヘアピンノックアウトは、メモリアル・スローン・ケタリング癌センターハイスループットスクリーニング(HTS)コア施設(Memorial Sloan Kettering Cancer Center High Throughput Screening(HTS) Core Facility)によって得られた;トランスフェクトされたHEK293細胞及びウイルス上清をHEK293細胞から回収して、pLenti-SKOV3c114-shEGFR細胞株に感染させた。MUC16c114トランスフェクタントは、推定切断部位からカルボキシ末端まで(配列番号150のアミノ酸1777〜1890)のMUC16タンパク質の細胞表面発現を有していた(下記の第6.3.13節の参考文献21を参照)。MUC16のカルボキシ末端にまで及ぶ344アミノ酸断片(配列番号150のアミノ酸1547〜1890)としてのMUC16タンパク質の細胞表面発現を有するMUC16c344-GFPベクターの発現を有する株を含む、より長いMUC16断片を有する細胞株を同様の方法で調製した(下記の第6.3.13節の参考文献19及び22を参照)。
製造元のプロトコルに従ってDOTAP(Roche Diagnostics, Indianapolis Corporation, IN)を用いて、DNAコンストラクトをSKOV3細胞に導入した。安定なトランスフェクタントを、その培養培地中のSKOV3細胞について、800μg/mLのG418で選択した。該細胞をGFP発現について2回細胞選別し、選択した細胞を最大15回の継代の株として成長させた。FACS解析のルーチンのモニタリングを行って、これらの株のGFP陽性を確認した。これらの株のタンパク質抽出物を、抗hrGFP(Stratagene, La Jolla, CA)及び抗MUC16-カルボキシ末端モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットにより解析した(下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。第6.1節に記載されているように、MUC16c57-114-pFUSE-hIgG1-Fc2及び117-244LGALS3-pFUSE-hIgG1-Fc2コンストラクトを、製造元のプロトコルに従って、融合タンパク質を無血清培地中に発現及び分泌するヒト胚性腎臓(HEK) FreeStyle 293F細胞(Invitrogen, CA)に別々にトランスフェクトした(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。分泌された融合タンパク質を精製し、抗ヒトIgG1-Fc-HRP(γ1鎖特異的)(Southern Biotech社, Birmingham, AL)又は4H11-HRP又はポリクローナル抗ヒトLGALS3抗体(Abgent, San Diego, CA)を用いるウェスタンブロット解析により特徴付けた。HEK293細胞で発現されるEGFRDDK-HIS(cat # TP700043)、LGALS3Myc-DDK(cat # TP308785)、及びインテグリン-β1Myc-DDK(cat # TP303818)精製タンパク質は、Origene, Rockville, MDから購入した。
MUC16発現のFACS解析は、第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献6に記載されている通りに実施した。
成長曲線は、第6.1節及び第6.2節並びに下記の第6.3.13節の参考文献18及び19に記載されている通りに実施した。
実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N1」は、「Asn1777」とも呼ばれる、配列番号150の位置1777のアスパラギンを指す。実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N24」は、「Asn1800」とも呼ばれる、配列番号150の位置1800のアスパラギンを指す。実施例3(第6.3節)で使用されているように、「N30」は、「Asn1806」とも呼ばれる、配列番号150の位置1806のアスパラギンを指す。
(6.3.11.1 MUC16の病理生物現象はC末端MUC16エクトドメインのN-グリコシル化に依存的である)
C末端MUC16エクトドメインの最近位の114アミノ酸(MUC16c114)の発現は、MUC16駆動性マトリゲル浸潤の顕著な増大及びインビボでのより急速な腫瘍成長を含む、3T3マウス線維芽細胞のより侵襲的なインビトロ/インビボ挙動を引き起こした(第6.1節及び下記の第6.3.13節の参考文献19を参照)。ヒト卵巣細胞におけるMUC16の役割及びそのグリコシル化効果を調べるために、MUC16陰性SKOV3ヒト卵巣細胞株をMUC16発現の影響について調べた(図18A〜18C)。図19Aに示されているように、MUC16c114安定発現ベクターによるSKOV3細胞のトランスフェクションは、高レベルの細胞表面MUC16発現及び2倍を超えるマトリゲル浸潤の増大をもたらした。該細胞をN-グリコシル化阻害剤のツニカマイシンに24時間曝露させると、SKOV3-MUC16c114細胞の浸潤特性が大きく減少したが、SKOV3-phrGFPベクターのみでトランスフェクトされた細胞のマトリゲル浸潤に対してはほとんど効果がなかった(図19A)。
MUC16c114のN24及びN30部位におけるN-グリコシル化がMUC16作用にとって重要な必要条件であることを確認したので、SKOV3-MUC16c114細胞株から精製された、N1及びN24にアラニンからアスパラギンへの突然変異を含むMUC16c114突然変異型糖ペプチドのグリカンプロファイルを解析した(図22)。この精製糖ペプチドは、したがって、N-グリコシル化のための単一のアスパラギン残基(N30)を含有していた。この精製糖ペプチドのグライコーム解析を図22Aに示す。これは、大部分は、フコース及び様々なマンノース残基が結合する最小反復単位としての共通の近位キトビオース(GlcNAc2)二糖を共有する切断されたグリコシル化種からなる多様なN-グリコシル化パターンを特徴とした(図22A)。
マウスワクチン接種及び血清回収は、第6.2節及び第6.4節に記載されているプロトコルに従って実施した。GlcNAc2-55-mer糖ペプチド(配列番号129、図22B)による3回の免疫付与と、それに続く、キトビオース担持KLHコンジュゲートコンストラクト(モノ-グリコシル化された15-mer(配列番号131)とビス-グリコシル化された18-mer(配列番号130))の等量の混合物による免疫付与の後、10匹のマウスのうちの2匹しか、両方の55-mer(GlcNAc2ありとGlcNAc2なし(配列番号129))について弱陽性のELISAシグナルを示さず、これらのマウスが、55-merの免疫付与に対する限られた免疫応答しか有しないことが示唆された。両方のKLHコンジュゲート(GlcNAc2-15-mer(配列番号131)及び(GlcNAc2)2-18-mer(配列番号130))によるさらに2回の追加免疫付与は、特に2匹のマウス(マウス7及びマウス8)において、より短い糖ペプチドに対する免疫応答(IgGタイプ)の増強をもたらした。MUC16ペプチド骨格の異なる非グリコシル化部分に対する4H11 mAbは、15-mer/18-merの糖ペプチドに対する結合を示さず、マウス血清陽性とは別の異なる認識エピトープを示した。
マウス7の脾臓を摘出し、脾細胞を高い融合効率でハイブリドーマ融合パートナーと融合させた。上清を選択し、個々の糖ペプチドに対するELISAによる反応性についてスクリーニングした(図22C)。複数の上清がGlcNAc2-15-mer及び(GlcNAc2)2-18-mer糖ペプチドと反応したが、スクリーニングされたハイブリドーマ上清の中に、ELISAスクリーニングで、非グリコシル化ペプチドよりもグリコシル化に対して高度の選択性を示すものはなかった。MUC16特異性は維持され、陽性の上清の中に、キトビオースでグリコシル化された無関係なペプチドと反応するものはなかった。4H11 mAbによって認識されるペプチド配列との重複は見られなかった。
4つの代表的な抗体についての確証的特徴解析研究の結果は、図23AのELISAにより示されている。様々な合成ペプチドに対する候補抗体の結合を評価し、MUC16-エクトドメインペプチド骨格を認識する4H11抗体の結合と比較した。関連のないキトビオース結合ペプチドは、選択されたどの抗グリカン-MUC16抗体による顕著な結合も示さなかった。候補抗体は全て、両方のMUC16由来の15-mer(すなわち、非グリコシル化ペプチド及び対応するキトビオース糖ペプチド)に対する同様の結合親和性を示した。単一のGlcNAc、末端トリマンノース-キトビオース(Man3GlcNAc2)、及びフコシル化キトビオース(GlcNAc2Fuc)を含む、別の糖部分を担持するさらなる合成糖ペプチドは、免疫付与に使用されたキトビオース結合MUC16ペプチドに対する抗体反応性を大きくは変化させなかった。
MUC16安定化EGFRは、卵巣癌細胞浸潤の重要な原動力であるように思われ、この相互作用は、EGFRと、適切にN-グリコシル化されたMUC16タンパク質エクトドメインと、ガレクチン-3の存在とに依存する。これら3つのタンパク質間の必要/十分な3者相互作用を立証するために、この相互作用を、精製タンパク質を用いて評価した。この目的のために、精製MUC16c57-114-pFUSEタンパク質(ヒト胚性腎臓[HEK] FreeStyle 293F細胞で産生される)(相互作用のMUC16部分としてのもの)、精製EGFRタンパク質(HEK293細胞によって産生される)、及び精製ガレクチン-3タンパク質(LGALS3; HEK293細胞によって産生される)を利用した。これらのタンパク質はヒト細胞で産生されるので、それらは、典型的なネイティブのグリコシル化種を担持すると予想された。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、この3つのタンパク質は、免疫共沈降法によって同定することができるヘテロマーを形成するという仮説を立てた。図24Aは、この免疫共沈降の結果を示しており、ここでは、検出された3つのタンパク質の各々が左の3つのレーンの直接的な免疫ブロットに示されている。アガロースプロテインA/G PLUSビーズを用いると、MUC16c57-114-pFUSEタンパク質がプロテインA/G PLUSコンジュゲートビーズに結合し、SDS-PAGEゲルで分離したとき、溶出液中に存在したことが分かる。EGFRは、ガレクチン-3(LGALS3)も存在したときにのみ、組み合わせた溶出液中でMUC16c57-114-pFUSEとともに存在した。抗体18C6は、ガレクチン-3のN-グリコシル化結合部位を遮断することにより、EGFR-MUC16相互作用を消失させた(図24Aを参照)。また、直接的な分子二重免疫蛍光イメージングを用いて、生きた細胞におけるEGFRとMUC16の共局在を確認した。図24B及び図25Aに示されているように、EGFRとMUC16は、OVCAR3、SKOV3-MUC16c344、及びSKOV3-MUC16c114細胞において密に共局在した(図24B及び25Aの矢印を参照)。これらの研究により、MUC16がガレクチン-3と組み合わさって、MUC16陽性卵巣癌細胞の表面のEGFRと関連することが強く確認された。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、多くの成長増強受容体はグリコシル化されているので、レクチン依存的なMUC16細胞表面効果は他のN-グリコシル化タンパク質を含み、EGFRに限定されない可能性があると推論された。インテグリンタンパク質は癌で変化し、SRCリン酸化及び他の下流の効果を誘発する間質-上皮相互作用によって開始される「外から内への」シグナル伝達に関与することが多い。図24Cは、MUC16と、癌の発生及び進行と関連する頻度が高いインテグリン成分であるインテグリンβ1との相互作用を示している。EGFRの場合と同様に、精製MUC16c57-114-pFUSEは、ガレクチン-3依存的な形でインテグリンβ1に結合し、このヘテロ三量体相互作用は、3つ全てのタンパク質を必要とした。EGFRと同様に、この相互作用は、抗MUC16c114グリコシル化部位ブロッキング抗体の18C6によって完全に遮断された。MUC16とインテグリンβ1の共局在もいくつかの卵巣癌細胞株における二重免疫蛍光により確認された(図24D及び図25B)。したがって、MUC16-エクトドメインペプチドエピトープ上の重要な部位におけるN-グリコシル化は、細胞表面タンパク質受容体との相互作用をレクチン特異的な形で媒介して、マトリゲル浸潤、PI3K/ERK及びSRC経路の活性化、及び免疫不全マウスにおけるMUC16陽性腫瘍成長の増強を含む、悪性挙動の特徴を生じさせた。
MUC16並びにMUC1及びMUC4などの他の繋留型ムチンは、3T3細胞を形質転換することができ、かつ有害転帰と関連している。癌における異常発現ムチンの機構は複雑かつ多様である。N-グリコシル化パターンが局所環境に応答した細胞成長において重要な役割を果たすということが十分に記載されている。糖タンパク質パターンの多様性は、ゴルジ体ベースのグリコシル化による環境依存的なヘキソサミンフラックスによって影響を受ける。EGFR、インスリン様成長因子受容体(IGF1R)、及びPDGFRなどの一般的な成長因子受容体は、栄養依存的な形で最初に優先的にグリコシル化され、これらの重度にグリコシル化された受容体は、細胞表面に優先的に送達される。対照的に、TGF-βなどの抑制性受容体はN-グリコシル化部位が少なく、後になって細胞表面に提示され、結果として成長プログラムの阻害が生じる(下記の第6.3.13節の参考文献12を参照)。卵巣癌において、EGFR発現は、侵襲的挙動と関連付けられており、EGFRシグナル伝達は、受容体のグリコシル化状態及びレクチンに対するN-グリコシル化種の親和性に依存的である(下記の第6.3.13節の参考文献2を参照)。酵素MGAT5は、癌細胞で過剰発現される重要なレクチンである、ガレクチン-3に対する最も大きい親和性を有する四本鎖の分岐N-グリカンの合成に重要であると思われる(下記の第6.3.13節の参考文献17を参照)。
(6.3.13 参考文献)
本実施例は、(a)実施例2及び3(第6.2節及び第6.3節)で使用された方法及び記載された実験のいくつかのより詳細な説明;並びに(b)実施例2及び3(第6.2節及び第6.3節)と比較した追加の情報を提供する。
市販の材料(Aldrich、Fluka、Novabiochem)は全て、それ以上精製することなく使用した。N-α-Fmoc保護アミノ酸、シュードプロリンジペプチド、Oxyma Pure、及びNovaSyn TG Sieber樹脂は、Novabiochemから購入した。1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)は、Genscriptから購入した。(7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyAOP)は、Oakwood Products社から購入した。キトビオースオクタアセテートは、Carbosynth Limitedから購入した。TCEP溶液(0.5M、中性pH)及びヘテロ二官能性リンカーのスルホ-GMBSは、Pierce, ThermoScientificから購入した。他の全ての試薬は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含め、Aldrichから購入した。溶媒は全て、試薬等級又はHPLC等級(Fisher Scientific)であった。無水テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、トルエン、及びベンゼンは、無水溶媒系(アルゴン雰囲気下で中性アルミナのカラムに通したもの)から取得し、それ以上乾燥させることなく使用した。
逆相クロマトグラフィー分離は全て、水中の0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)(v/v)及びアセトニトリル中の0.04%TFAからなる移動相を伴った。反応進行は、光ダイオード検出器及び単一の四重極質量検出器を有し、Acquity UPLC BEH C18/C8/C4カラム(1.7μm、2.1×100mm)を備えた、Waters AcquityTM超高速液体クロマトグラフィーシステムでのUPLC-MS分析により、0.3mL/分の流速でモニタリングした。分析的LC-MS分析は、Varian Microsorb C18カラム(150×2.0mm)、Varian Microsorb C8/C4カラム(250×2.0mm)、又はWaters X-Bridge C18カラム(150×2.1mm)を用いて、Waters 2996光ダイオードアレイ検出器を備えたWaters 2695分離モジュールで、0.2mL/分の流速で実施した。分取スケールのHPLC精製は、Agilent Dynamax逆相HPLC Microsorb C18/C8/C4カラム(250×21.4mm)又はWaters X-Bridge C18カラム(150×19.0mm)を用いて、Rainin UV-1検出器を備えたRanin HPLC溶媒送達系で、16.0mL/分の流速で実施した。
(6.4.2.1 Fmocベースの固相ペプチド合成(SPPS))
自動ペプチド合成をCEM Libertyマイクロ波ペプチド合成装置で行った。ペプチドを、標準的なFmocプロトコルの下、NovaSyn TG Sieber樹脂上で合成した。デブロック混合物は、Oxyma Pure(0.1M)の20%ピペリジン/DMF溶液からなっていた。Novabiochem製の以下のFmocアミノ酸: Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Dmcp)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Asp(OPp)-OH、Fmoc-Asp(OAllyl)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Dmcp)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OHを使用した。以下のDmb(2,4-ジメトキシベンジル)及びシュードプロリンジペプチド(Novabiochem): Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Phe-Thr(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,MePro)-OHを使用した。
0.1mmolスケールでの自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をDMF(2mL)で洗浄して、ペプチド合成容器に入れ、DMF(2mL)中の無水酢酸(188μL、2mmol)及びDIEA(384μL、2.2mmol)で処理した。混合物を穏やかな窒素バブリングによって1時間振盪させ、その後、DMF及びCH2Cl2で洗浄した後、脱アリル化に供した。
N-アセチル化樹脂結合ペプチド(0.1mol)をDMF/CH2Cl2中のPd(PPh3)4(7.5mg、6.5μmol)及びフェニルシラン(75μL、0.6mmol)(4mL、1:1)で処理した。20分間の穏やかな窒素バブリングの後、Pd(PPh3)4/フェニルシラン処理を2回繰り返した。その後、ペプチド-樹脂を、DMF、CH2Cl2、及びメタノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。
乾燥後、ペプチド-樹脂を切断カクテル(1%TFA/CH2Cl2、4mL)に5サイクル×5分で供し、このプロセスを4回繰り返した。さらなる切断シーケンスには、1.5%TFA/CH2Cl2(4mL、5サイクル×5分)及び2%TFA/CH2Cl2(4mL、5サイクル×5分)による処理が含まれた。切断溶液のそれぞれの部分を氷冷Et2Oに個別にプールし、濃縮した。対応する油性残渣を最小量のトリフルオロエタノールに再懸濁させ、水で沈殿させた。得られた混合物をすぐに凍結乾燥させると、C末端アミドを担持する粗保護ペプチドが得られた。
部分的に保護された全長ペプチド(1.0当量)及びグリカンアミン(キトビオース: 4.0当量; Man3GlcNAc2 1.6当量)を合わせ、無水DMSOに溶解させた。この混合物に、新たに調製されたPyAOP(4.0当量)のDMSO溶液、その後、DIEA(6.0当量)を添加した。反応混合物を3時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05%TFA)の添加によりクエンチした。形成された沈殿を遠心分離により単離し、水/CH3CN(1:1、0.05%TFA)に再懸濁させ、すぐに凍結乾燥させた。
部分的に保護されたペプチド(1.0当量)及びキトビオースアミン(3.0当量/二重ランズベリーアスパラギン酸化については、7.0当量)を合わせ、無水DMSOに溶解させた。この混合物に、新たに調製されたPyAOP(4当量/後者の場合、6当量)のDMSO溶液、その後、DIEA(それぞれ、6当量/8当量)を添加した。反応混合物を2.5時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05%TFA)の添加によりクエンチした。形成された沈殿を遠心分離により単離し、水/CH3CN(1:1、0.05%TFA)に再懸濁させ、すぐに凍結乾燥させた。
KLHを、まず、ヘテロ二官能性架橋剤のスルホ-GMBS)とともに、pH 7のリン酸緩衝食塩水(PBS)中で2時間インキュベートした。コンジュゲートされなかった架橋剤をサイズ排除クロマトグラフィー(それぞれ、Bio-Gel P-10微細カラムに通す)より除去し、その後、マレイミド活性化KLHを得た。末端チオール官能基を担持する新たに脱保護された(糖)ペプチドをマレイミド含有KLHとpH 7のPBS中で混合し、室温で6時間インキュベートした。この後、Amicon Ultra-4遠心分離フィルター(分子量カットオフは50000)を用いて、未反応の(糖)ペプチドを除去した。最終的に、対応するKLHコンジュゲートがPBS溶液として得られた。
(6.4.3.1 キトビオース担持全長糖ペプチドの合成)
第6.4.2.1節の方法による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化及び脱アリル化(それぞれ、第6.4.2.2節及び第6.4.2.3節を参照)に供すると、樹脂からの切断(第6.4.2.4節を参照)の後に、Asp30側鎖に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護されたペプチドp55-mer[N1-S55]が得られた。この粗ペプチドの画分を5→12%MeOH/CH2Cl2で溶出させるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、凍結乾燥後に、ペプチドp55-mer[N1-S55](70mg)が白色の固体として得られた。図27Aは、側鎖が保護されたN-アセチル化55-merペプチドアミドを示している。図27Bは、糖ペプチドp55-mer[N1-S55]についてのESI-MSとUPLC分析からのUVトレースとを示している。
第6.4.2.6節に従って、ペプチドp55-mer[N1-S55](10mg、1.0μmol)及び五糖Man3GlcNAc2アノマーアミン(1.5mg、1.6μmol)を合わせ、無水DMSO(30μL)に溶解させた。その後、PyAOP(2.1mg、4.1μmol)のDMSO(5μL)溶液、その後、DIEA(1.0μL、6.1μmol)を添加した。金色〜黄色の混合物を3時間撹拌し、1mLの氷冷水(0.05%TFA)の添加によりクエンチし、凍結させ、凍結乾燥させた。
(6.4.4.1 キトビオース-モノグリコシル化15-merの合成)
第6.4.2.1節による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化及び脱アリル化(それぞれ、第6.4.2.2節及び第6.4.2.3節を参照)に供すると、樹脂からの切断(第6.4.2.4節を参照)の後に、Asp30(配列番号150のAsn1806に対応する)側鎖に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護されたペプチドp15-mer[C-G25-V38]が得られた。図30A。このペプチドを、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。
第6.4.2.1節による自動合成の終了後、ペプチド-樹脂をN-アセチル化に供した(第6.4.2.2節を参照)。その後、樹脂からの切断及びそれと同時のOPp保護基の除去を、第6.4.2.4節に示される方法に従って達成すると、Asp24側鎖とAsp30側鎖の両方(それぞれ、配列番号150のAsn1800及びAsn1806に対応する)に遊離カルボン酸を担持する部分的に保護されたペプチドp18-mer[C-T22-V38]が得られた。このペプチドを、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。図32Aを参照されたい。
糖ペプチド「15-mer(キトビオース)[C-G25-V38]」及び「18-mer(キトビオース)2[C-T22-V38]」を、第6.4.2.7節に示された手順に従って、KLHにコンジュゲートすると、それぞれ、対応するKLHコンジュゲートのGlcNAc2-15-mer-KLH及び(GlcNAc2)2-18-mer-KLHが得られた。図33A及び図33Bを参照されたい。
本明細書に引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物又は特許出願が、引用により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されているかのように引用により本明細書中に組み込まれる。上の発明は、理解の明快さのために図及び実施例としていくらか詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなく、一定の変更及び修正をそれに加えることができることが当業者には容易に明らかになるであろう。
Claims (34)
- 抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が、
(a)MUC16の第一の形態(この第一の形態はグリコシル化されており、かつ配列番号133のアミノ酸配列を有する)を組換え発現する細胞に免疫特異的に結合し、該グリコシル化が、配列番号133のアミノ酸30位におけるN-結合型キトビオースを含み、ここで、該抗体又はその抗原結合断片が、配列番号133のアミノ酸30位(Ans30)におけるN-結合型キトビオースのグリコシル化を特異的に認識して結合し、
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
(d)MUC16の該第一の形態を組換え発現する細胞のインビトロでのマトリゲル浸潤を阻害する、
前記抗体又はその抗原結合断片。 - (i)(a)のMUC16の前記第一の形態を組換え発現する細胞がSKOV3細胞であり;かつ(ii)(d)の前記細胞がSKOV3細胞である、請求項1記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が、MUC16のグリコシル化形態を発現する腫瘍の成長を阻害する、請求項1又は2記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が:
(I)(i)配列番号83のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号86のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(II)(i)配列番号89のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号92のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(III)(i)配列番号95のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号98のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(IV)(i)配列番号3のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号6のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(V)(i)配列番号9のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号12のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(VI)(i)配列番号15のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号18のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(VII)(i)配列番号43のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号46のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(VIII)(i)配列番号49のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号52のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;又は
(IX)(i)配列番号55のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号58のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL
を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
(I)(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVL;
(II)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL;又は
(III)(i)配列番号41のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号42のアミノ酸配列を含むVL
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
(I)(i)配列番号83のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVHと、(ii)配列番号86のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(II)(i)配列番号89のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVHと、(ii)配列番号92のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;又は
(III)(i)配列番号95のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVHと、(ii)配列番号98のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL
を含む、請求項4記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
(I)(i)アミノ酸配列
アミノ酸配列
アミノ酸配列
(ii)アミノ酸配列
アミノ酸配列
アミノ酸配列
(II)(i)アミノ酸配列
アミノ酸配列
アミノ酸配列
(ii)アミノ酸配列
アミノ酸配列YMS (配列番号:113)からなるVL CDR2;及び
アミノ酸配列
(III)(i)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
(ii)アミノ酸配列
アミノ酸配列YMS (配列番号:119)からなるVL CDR2;及び
アミノ酸配列
を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVL
を含む、請求項5記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
(i)
(ii)
を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。 - MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が、
(I)(i)配列番号83のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号86のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(II)(i)配列番号89のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号92のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(III)(i)配列番号95のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号98のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(IV)(i)配列番号3のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号4のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号6のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(V)(i)配列番号9のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号12のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号13のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(VI)(i)配列番号15のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号16のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号18のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号19のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(VII)(i)配列番号23のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号24のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号25のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号26のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号27のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号28のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(VIII)(i)配列番号29のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号30のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号31のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号32のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号33のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号34のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(IX)(i)配列番号35のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号36のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号37のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、及び(ii)配列番号38のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号39のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号40のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(X)(i)配列番号43のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号44のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号45のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号46のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号47のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(XI)(i)配列番号49のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号50のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号52のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号53のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(XII)(i)配列番号55のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号56のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号58のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号59のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(XIII)(i)配列番号63のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号64のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号65のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号66のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号67のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号68のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(XIV)(i)配列番号69のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号70のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号71のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号72のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号73のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;又は
(XV)(i)配列番号75のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号76のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号77のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH;及び(ii)配列番号78のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号79のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号80のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL
を含む、抗体又はその抗原結合断片。 - MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が、
(I)(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVL;
(II)(i)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むVL;
(III)(i)配列番号21のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号22のアミノ酸配列を含むVL;
(IV)(i)配列番号41のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号42のアミノ酸配列を含むVL;又は
(V)(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むVL
を含む、抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
(I)(i)配列番号83のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号84のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号85のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVHと、(ii)配列番号86のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号87のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号88のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(II)(i)配列番号89のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号90のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号91のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVHと、(ii)配列番号92のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号93のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号94のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;又は
(III)(i)配列番号95のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号96のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号97のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVHと、(ii)配列番号98のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号99のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号100のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL
を含む、請求項10記載の抗体又はその抗原結合断片。 - MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が、
(I)(i)アミノ酸配列
アミノ酸配列
アミノ酸配列
(ii)アミノ酸配列
アミノ酸配列
アミノ酸配列
(II)(i)アミノ酸配列
アミノ酸配列
アミノ酸配列
(ii)アミノ酸配列
アミノ酸配列YMS (配列番号:113)からなるVL CDR2;及び
アミノ酸配列
(III)(i)アミノ酸配列
(b)アミノ酸配列
(c)アミノ酸配列
(ii)アミノ酸配列
アミノ酸配列YMS (配列番号:119)からなるVL CDR2;及び
アミノ酸配列
を含む、抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、
(i)配列番号81のアミノ酸配列を含むVH;及び(ii)配列番号82のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項11記載の抗体又はその抗原結合断片。 - MUC16に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又はその抗原結合断片が、
(i)
(ii)
を含む、抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片がヒト化されている、請求項1〜4、6、7、10、12または13のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項1〜15のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記二重特異性抗体が、CD3に免疫特異的に結合する、請求項17記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記二重特異性抗体が、MUC16に免疫特異的に結合する免疫グロブリンを含み、該免疫グロブリンの軽鎖が、ペプチドリンカーを介して、CD3に免疫特異的に結合する単鎖可変断片(scFv)にコンジュゲートされている、請求項17または18記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- scFvである、請求項1〜16のいずれか一項記載の抗原結合断片。
- 薬剤にコンジュゲートされた、請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片を含むコンジュゲート。
- 前記薬剤がイメージング剤又は細胞毒性剤である、請求項22記載のコンジュゲート。
- 請求項21記載の抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体(CAR)。
- 請求項24記載のCARを組換え発現するT細胞。
- (a)請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合断片;
(b)請求項22もしくは23記載のコンジュゲート;又は
(c)請求項24記載のCAR
をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。 - プロモーターに動作可能に連結された請求項26記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- プロモーターに動作可能に連結された請求項26記載のポリヌクレオチド、または請求項27に記載のベクターを含むエクスビボ細胞。
- 抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、請求項28記載のエクスビボ細胞を培養することを含む、前記方法。
- 請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項22もしくは23記載のコンジュゲート、請求項24記載のCAR、又は請求項25記載のT細胞;及び医薬として許容し得る担体:を含む医薬組成物。
- 請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項22もしくは23記載のコンジュゲート、請求項24記載のCAR、又は請求項25に記載のT細胞を含む医薬組成物であって、それを必要としている患者の癌を治療する方法における使用のための医薬組成物。
- 前記癌が、肺、膵臓、乳房、子宮、卵管、原発性腹膜、又は卵巣の癌である、請求項31記載の医薬組成物。
- 前記患者がヒト患者である、請求項31または32記載の医薬組成物。
- 前記方法が、追加の治療剤を前記患者に投与することをさらに含む、請求項31〜33のいずれか一項記載の医薬組成物。
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