CN100398558C - HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用。HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段是HER2/neu分子能被有效抑制的敏感位点，是今后设计拮抗HER2/neu的小分子肽或抑制剂的理想靶标，将在制备拮抗HER2/neu的药物中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用。
背景技术
HER2/neu为EGFR家族成员之一，该家族包括EGFR(epidermal growth factorreceptor，又称c-c-erbB-1，HER1)、HER2/neu(c-erbB-2)、HER3(c-erbB-3)和HER4(c-erbB-4)等成员。HER2/neu基因编码1255个氨基酸，分子量大小为185KD。胞外区分为四个功能结构域，L1和L2区，S1和S2区。两S区为富含半胱氨酸区。胞浆中的C末端1139、1196和1246的酪氨酸为酪氨酸磷酸化区域。HER2/neu与EGFR家族成员形成同源或异源二聚体而激活，伴随HER2/neu胞内的酪氨酸磷酸化，引起胞内能结合含SH2区、SH3区和PTB区蛋白的位点活化，从而激活下游的相关蛋白的活化，通过级联的信号转导反应，最终影响细胞增殖、分化和存活等生理机能的改变。HER2/neu具有促进肿瘤细胞的增殖效应。激活的PI3K-Akt不仅有促进细胞的增殖作用，而且通过NF-κB的激活使细胞具有抵抗TNF-α和各种化疗药物引起的细胞凋亡作用。甚至通过MDM2途径，促使P53的泛素化，使P53在细胞内的水平下降，抑制突变细胞的凋亡。所以，HER2/neu的表达与肿瘤的发生发展密切相关。
临床研究发现，HER2/neu在多种肿瘤组织中过表达，在正常组织中低表达或不表达。HER2/neu在乳腺癌(25～30％)、卵巢癌(18～43％)、非小细胞肺癌(13～55％)、前列腺癌(5-46％)、胃癌(21-64％)、头颈部肿瘤(16-50％)等多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达。HER2/neu高表达的临床肿瘤患者对放疗和化疗不敏感，易发生肿瘤的转移，患者预后不佳。HER2/neu在成人正常组织中表达水平很低或不表达，因而成为肿瘤治疗的理想靶分子，也是目前肿瘤研究治疗的热点。
目前，以HER2/neu为治疗靶点的手段主要有：1、抗HER2/neu受体的抗体，如鼠源的抗HER2/neu的4D5抗体经人源化改造的后得到的抗体，商品名为Herceptin，1998年已被FDA批准用于乳腺癌的临床治疗，并收到了较好的治疗效果；2、抑制HER2/neu表达的策略，如5型腺病毒的E1A蛋白可抑制HER2/neu mRNA的转录，使HER2/neu高表达的肿瘤细胞生长受到抑制，转移能力下降，对化疗药物敏感性增强，对它的研究已进入临床II期；3、抑制HER2/neu的酪氨酸激酶活性和信号传导途径，emodin能抑制HER2/neu的自身磷酸化和酪氨酸激酶活性，喹唑啉类的CI-1033能抑制EGFR家族酪氨酸磷酸化，已通过I期临床实验。此外还有针对HER2/neu的小分子模拟肽、反义核苷酸和HER2/neu的DNA疫苗等。
最近的研究发现，HER2/neu mRNA加工过程中可发生选择性地剪接，产生一种可溶性的受体-Herstatin。体外实验证实，Herstatin能与细胞表面HER2/neu高亲和力结合，它们的亲和常数为14nM。与HER2/neu结合后干扰HER2/neu同源或异源二聚体的形成。Herstatin存在时，AKTPI3K/AKT的磷酸化水平仅为对照细胞的2％，AKT信号通路几乎完全被抑制。此外，Herstatin可阻碍HER2/neu和HER3间异源二聚体形成，由于HER3缺乏自身磷酸化的能力，它的磷酸化过程依赖于与其他EGFR受体家族成员形成异二聚体。所以，Herstatin作用于HER2过表达的SKOV-3细胞和NIH3T3/HER2细胞，可使其克隆形成能力降低数倍，细胞增殖能力受到抑制。
但Herstatin如何与HER2/neu相互作用这一基本的问题目前还不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因。
本发明所提供的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段，是具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的多肽或将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与Herstatin相互作用的多肽。
序列表中的序列1由340个氨基酸残基组成，为L1和S1结构域，自序列1的氨基端第149-151位、170-171位、173-181位、256位、266-267位、275-280位、284位、317-319位、321-324位、329位、336-340位氨基酸残基为直接参与作用的氨基酸残基。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段的编码基因具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：1多肽序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能多肽的DNA序列。
序列表中的序列2由1020个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端起第1位-1020位碱基。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有所述HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段编码基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段编码基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明采用结构生物学、分子生物学和生物信息学相结合的方法，根据已解析出的HER2/neu细胞外区ECD的晶体结构，利用同源模建、分子对接的方法获得Herstatin与HER2/neu相互作用的复合物理论模型。借助分子间氢键形成理论、反应自由能理论、范德华作用力及静电作用从理论上初步确定Herstatin与HER2/neu结合的空间结构，及参与二者结合的关键性残基。根据计算机模拟结果，利用分子生物学技术，通过荧光共振能量转移和免疫共沉淀等技术手段，证实计算机模拟的正确性，得到HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段。
本发明的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段是HER2/neu分子能被有效抑制的敏感位点，是今后设计拮抗HER2/neu的小分子肽或抑制剂的理想靶标，将在制备拮抗HER2/neu的药物中发挥重要作用。
附图说明
图1A为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst载体的酶切鉴定结果
图1B为含有pDsRedHst载体的菌落PCR鉴定结果
图1C为pDsRedHst载体的XhoI和HindIII双酶切鉴定结果
图1D为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pDsRedHst转染的CHO细胞表达的Herstatin和DsRedHst电泳图谱
图2A为以Her2/neu胞外段晶体结构为模板获得的Her2/neu胞外段理论空间结构
图2B为Herstatin蛋白C端79个残基二级结构预测
图2C为利用从头搭建、同源模建获得的Herstatin蛋白优化构象
图2D为Her2/neu与Herstatin作用复合物模型
图2E为Her2/neu与Herstatin二者的作用模式示意图
图3为HER2/neu缺失突变体与EGFP融合蛋白ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP和mE2-EGFP及DsRedHst示意图
图4A为pDsRedHst单独转染时，表达的DsRedHst的细胞定位照片
图4B为pEGFP/ECDt单独转染时，表达的ErbB2ECD-EGFP的细胞定位照片
图4C为pEGFP/mE1单独转染时，表达的mE1-EGFP细胞定位照片
图4D为pEGFP/mE2单独转染时，表达的mE2-EGFP定位照片
图5A为pDsRedHst与pEGFP/ECDt共转染时，表达的ErbB2ECD-EGFP细胞定位照片
图5B为pDsRedHst与pEGFP/ECDt共转染时，表达的DsRedHst细胞定位照片
图5C为pDsRedHst与pEGFP/ECDt共转染时，表达的ErbB2ECD-EGFP和DsRedHst叠加的细胞定位照片
图5D为pDsRedHst与pEGFP/ECDt共转染时，表达的ErbB2ECD-EGFP和DsRedHst的FRET结果
图6A为pDsRedHst与pEGFP/mE1共转染时，表达的mE1-EGFP细胞定位照片
图6B为pDsRedHst与pEGFP/mE1共转染时，表达的DsRedHst细胞定位照片
图6C为pDsRedHst与pEGFP/mE1共转染时，表达的mE1-EGFP和DsRedHst叠加的细胞定位照片
图6D为pDsRedHst与pEGFP/mE1共转染时，表达的mE1-EGFP和DsRedHst的FRET结果
图7A为pDsRedHst pEGFP/mE2共转染时，表达的mE1-EGFP细胞定位照片
图7B为pDsRedHst与pEGFP/mE2共转染时，表达的DsRedHst细胞定位照片
图7C为pDsRedHst与pEGFP/mE2共转染时，表达的mE1-EGFP和DsRedHst叠加的细胞定位照片
图7D为pDsRedHst与pEGFP/mE2共转染时，表达的mE2-EGFP和DsRedHst的FRET结果
图8为免疫共沉淀结果
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段
一、Herstatin基因的克隆及表达
转染试剂LipofectamineTM和pcDNA3.1/Myc-His(-)为Invitrogen产品；限制性内切酶购自New England Biolabs公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；Pyrobest DNA聚合酶、DNA分子量标准DL2000为TaKaRa产品；DNA片段回收试剂盒、质粒回收试剂盒购自博大泰克公司；引物由博润生物有限公司合成。
1、构建pcDNA3.1(-)myc-his/Hst载体
按Doherty等(Doherty JK，Bond C，Jardim A，Adelman JP，Clinton GM.1996.The ER-2/neu receptor tyrosine kinase gene encodes a secreted autoinhibitor.Proc Natl Acad Sci USA 96：10869-10874)介绍的方法将Herstatin的全长cDNA(克隆号gi|10181232|gb|AF177761.2|AF177761)克隆到pcDNA3.1(-)myc-his表达载体的限制性内切酶XhoI和HindIII识别位点间，得到含有Herstatin的全长cDNA的重组表达载体pcDNA3.1(-)myc-his/Hst。将pcDNA3.1(-)myc-his/Hst导入E.coli JM109，培养E.coli JM109，提取质粒，用XhoI和HindIII双酶切提取的质粒，1％琼脂糖凝胶电泳后可得到一条分子量为1300bp左右的酶切片段(图1A)。图1A中，M为分子量标准DL2000，1为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst。说明目的片段成功地插入载体中。将pcDNA3.1(-)myc-his/Hst载体送上海博亚生物有限公司测序，测序结果与GenBank中公布的序列比较并用DNAClub软件预测表达的蛋白序列。测序结果与GenBank中公布的cDNA序列一致，预测表达的氨基酸序列结果也一致。
2、构建Herstatin与DsRed融合蛋白表达载体pDsRedHst
pcDNA3.1(-)myc-his/Hst经XhoI和HindIII双酶切后，回收1300bp酶切片段，与同样双酶切后的线性质粒pDsRed-Express-N1(购自Clontech)，经T4DNA连接酶连接。室温连接4小时后，转化JM109大肠杆菌。12小时后挑取转化菌落。利用引物P1：ccgctcgaggcaccatggagctggcggc和P2：cccaagcttgccttcatac cgggac进行菌落PCR扩增Herstatin基因，结果如图1B所示，得到大小为1300bp的片段；提取质粒经XhoI和HindIII双酶切鉴定，结果得到与插入基因大小相同1300bp的片段(图1C)。说明载体构建成功，命名为pDsRedHst。图1B和图1C中，M为分子量标准DL2000；图1B中2、3、4和5为菌落号；图1C中，6为pDsRedHst。
3、pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pDsRedHst转染真核细胞
将pcDNA3.1(-)myc-his/Hst、pDsRedHst通过转染试剂LipofectamineTM分别转染CHO细胞，具体方法如下：细胞培养于含10％FCS的DMEM培养液中，转染前一天均匀铺于6孔板，每孔3×105个细胞，24h后，开始进行转染。载体pcDNA3.1(-)myc-his/Hst或pDsRedHst 3μg/孔，脂质体9μl/孔，分别加入用无抗生素无血清的双无DMEM培养基，至最终体积100μl，混匀。静置10min后，将两液(含有载体的DMEM和含有脂质体的DMEM)混合，室温放置30min。吸弃培养板中的细胞培养液，用双无DMEM培养液轻轻洗两次，加入800μl双无DMEM培养液。再将混匀好的载体/脂质体混合液200μl加入培养板，轻轻混匀。细胞置于5％CO2，37℃孵箱孵育8h。加入等体积(1mL)20％FCS的DMEM完全培养液继续培养48h后，吸弃培养液，用预冷的PBS洗二次，每孔加入80μμl 1×SDS上样缓冲液(50mmol/L Tris，pH6.8，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚蓝，临用前加入100mmol/LDTT)，刮下细胞，将细胞裂解液吸入EP管。100℃水浴3min。离心取上清进行10％SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白电转印至硝酸纤维素膜。转印膜用含5％脱脂奶粉的TBS(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，pH7.5)室温封闭2h。5％脱脂奶TBS-T(50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，pH7.5，0.2％Tween 20)稀释Herstatin抗体(anti-Herstatin，克隆号CWO01，Upstate产品，美国)至1μg/ml，4℃孵育3h，TBS-T洗膜3次，每次10min；用5％脱脂奶稀释HRP-羊抗鼠IgG(购自中山生物制品有限公司)(1∶5000)，室温孵育1h，TBS洗膜3次，每次10min；按照公司手册(Amersham Biosciences产品，美国)用增敏的化学发光底物(ECL)，进行X光显影。结果如图1D所示，表明转染pcDNA3.1(-)myc-his/Hst的CHO细胞表达的Herstatin为60KD左右蛋白，除该条带外，还可在上述细胞中检测到一条特异的大分子条带，其可能为Herstatin的多聚体；转染pDsRedHst的CHO细胞表达的Herstatin与DsRed融合蛋白-DsRedHst则为87KD左右。图1D中，1为转染pcDNA3.1(-)myc-his/Hst的CHO细胞表达的Herstatin；2为转染pDsRedHst的CHO细胞表达的DsRedHst。
二、Her2/neu和Herstatin空间结构的理论模拟
1、Her2/neu空间结构的理论模拟
以Her2/neu基因胞外段晶体结构(PDB库号：1n8z)为模板，利用InsightII(2000)程序包同源模建方法从理论上构建Her2/neu胞外段功能域的理论空间结构。依次选择CVFF、Amber力场，通过InsightII(2000)程序包Discover_3方法对构建的Her2/neu胞外段功能域理论空间结构依次经最陡下降(收敛判据0.05Kcal/molA)、共轭梯度(收敛判据0.01Kcal/molA)进行能量最小化处理，获得常温条件下的优势构象(图2A)。将获得的Her2/neu胞外段理论空间结构与其晶体结构进行主链碳原子结构叠合，计算均方根位移RMSD为0.32
，表明选择的模建方法、优化手段、分子力场是合适的。
2、Herstatin空间结构的理论模拟
(1)Herstatin蛋白C端79个残基二级结构预测
Herstatin蛋白源自Genbank数据库，其序号为gi|10181232|gb| AF177761.2|AF177761。分别选择蛋白质数据库SwissProt、蛋白质结构数据库PDB，利用http:www.ncbi.nlm.nig.gvo/Blastp进行序列相似性检索发现，与Herstatin蛋白C端79个残基具有序列、结构相似性在50％以上的模板蛋白不存在。为了能够获得Herstatin蛋白的合理空间构象，拟采用从头搭建的方法对其C末端构象进行理论评估。
借助http://www.expasy.ch提供的GOR IV方法对Herstatin蛋白C端79个残基进行二级结构预测，预测结果如图2B，表明Herstatin蛋白C端79个残基形成的二级结构主要为无规卷曲，存在两段Beta片层结构。图2B中，大写字母为氨基酸代号，小写字母“c”表示其对应的氨基酸残基的二级结构是无规则卷曲，小写字母“e”表示其对应的氨基酸残基的二级结构是Beta片层结构。
(2)Herstatin蛋白C端79个残基空间构象搭建
借助二级结构预测结果，考虑其骨架Ramachandran图二面角φ、ψ的限制条件，利用从头搭建的方法构建Herstatin蛋白C端空间构象。
(3)Herstatin蛋白空间构象的理论模拟
利用Her2/neu蛋白胞外段晶体结构，通过同源模建的方法构建Herstatin蛋白N端340个残基的空间结构；考虑拐角特点，通过构型调整将其与Herstatin的C端连接，从而搭建Herstatin蛋白的空间结构。
在CVFF、AMBER力场作用下，依次通过最陡下降、共轭梯度方法对构建的Herstatin蛋白的空间结构进行分子力学优化。其中，最陡下降法选择的优化步长为40000步，收敛判据0.05Kcal/molA；共轭梯度法选择的优化步长为50000步，收敛判据0.01Kcal/molA。
为了保证结构的最优化程度，考虑溶剂效应，在CVFF、Amber力场下对Herstatin蛋白的空间结构进一步进行分子动力学常温模拟。由于Herstatin蛋白的N端源自晶体结构数据，在动态模拟过程中保持不变，而C端79个残基组成的功能域处于力学动态模拟中，选定120×90×80
三维箱，考虑溶剂效应、离子氛效应，每5fs收集1个构象，经历常温1000fs的动态模拟，最终获得常温稳定构象。经分子力学优化获得的Herstatin蛋白的空间结构如图2C所示。
3、Her2/neu与Herstatin相互作用复合物的结构模拟
借助模拟的Her2/neu以及Herstatin理论空间结构，通过表观静电分布、可及性表面积分析，利用AutoDock3.0程序评价Her2与Herstatin作用的分子作用能，计算Van der Waals能、静电能、分子间氢键，确定Her2与Herstatin的作用模式。在相同力场下，依次经过最陡下降、共轭梯度对复合物空间结构进行能量优化处理。对于最陡下降法，选用步长60000步，收敛判据0.02Kcal/molA；共轭梯度法，选用步长100000步，收敛判据0.01Kcal/molA。获得的能量优化构象经常温动力学模拟，考虑溶剂效应的前提下进行进一步优化。获得的Her2/neu与Herstatin作用复合物模型如图2D所示。
4、Her2/neu与Herstatin相互作用结构域的确定
借助获得的Her2/neu与Herstatin复合物空间结构，利用分子间氢键形成理论、距离几何学、计算机图形学技术探讨了Herstatin与Her2-neu相互作用区域。二者的作用模式示意图如图2E所示。
利用分子间氢键形成理论对复合物的分子间氢键形成情况进行了分析，Her2/neu与Herstatin之间的氢键形成情况如表1所示。
表1Her2/neu与Herstatin二者间氢键形成情况
| 供体 | 受体 | 距离(A) | 角度(°) |
| Her2:Gly151:HN | Herstatin:Thr2:O | 1.89 | 164.86 |
| Her2:Lys170:HZ1 | Herstatin:Ser4:O | 2.14 | 154.51 |
| Her2:Asn177:HD21 | Herstatin:Gly79:OXT | 2.14 | 141.27 |
| Her2:Arg217:NE | Herstatin:Glu78:OE2 | 2.83 | NA |
| Herstatin:Glu78:HE2 | Her2:Arg217:NE | 1.97 | 146.46 |
| Her2:Arg217:HH11 | Herstatin:Gly79:OXT | 1.92 | 163.73 |
| Her2:Arg217:HH21 | Herstatin:Gly79:OXT | 2.27 | 150.91 |
| Her2:Arg217:HH22 | Herstatin:Glu78:OE2 | 2.49 | 131.90 |
| Her2:Ala225:HN | Herstatin:Gly79:O | 2.07 | 156.56 |
| Herstatin:Thr51:HN | Her2:Glu238:OE2 | 2.25 | 142.46 |
| Herstatin:Arg17:HH21 | Her2:Thr273:OG1 | 2.29 | 169.05 |
| Her2:Asn275:HD22 | Herstatin:Pro25:O | 2.04 | 139.95 |
| Her2:Arg340:HH22 | Herstatin:Asp65:OD 1 | 2.05 | 167.06 |
| Her2:Arg340:NE | Herstatin:Asp65:OD 1 | 2.93 | NA |
| Herstatin:Asp65:HD 1 | Her2:Arg340:NE | 1.98 | 164.75 |
| Her2:His318:HN | Herstatin:Asp67:NH1 | 2.42 | 172.65 |
利用距离几何学、计算机图形学技术对复合物间的作用区域进行分析可以看出，Herstatin蛋白的C-端(1-9，15-17，19-20，32-33，47-48，50-51，74-79位氨基酸残基)参与作用Her2/neu的L1和S1功能域(149-151，170-171，173-181，256，266-267，275-280，284，317-319，321-324，329，336-340位氨基酸残基)，二者通过分子间氢键、Van der Waals力发生作用。
三、荧光共振能量转移实验(fluorescence resonance energy transferFRET)确定HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段
荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时(＜10nm)，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。本实验供体为HER2/neu突变体与EGFP相融合蛋白ErbB2ECD-EGFP(包含HER2/neu的细胞外全长和跨膜序列T)、mE1-EGFP(包含HER2/neu的信号肽S、细胞外L1、S1结构域和跨膜序列T)和mE2-EGFP(包含HER2/neu的信号肽S、细胞外L2、S2结构域和跨膜序列T)。受体为Herstatin与DsRed的融合产物-DsRedHst。
材料
转染试剂LipofectamineTM为Invitrogen产品；载体pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1和pEGFP/mE2按照文献(Wang JN，Feng JN，Yu M，Xu M，Shi M，ZhouT，Yu XD，Shen BF，Guo N.2004.Structural analysis of the epitopes on erbB2interacted with inhibitory or non-inhibitory monoclonal antibodies.MolImmunol 40：963-969)的方法构建，pDsRedHst载体。这些载体分别表达的蛋白ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP、mE2-EGFP和DsRedHst的结构示意图如图3所示，图中，S表示HER2/neu的信号肽S；S1，S2，L1和L2表示HER2/neu胞外区的四个功能结构域S1，S2，L1和L2区；T表示HER2/neu跨膜序列；GFP表示EGFP；Hst表示Herstatin；激光共聚焦显微镜Radiance 2100，美国Bio-Rad产品。培养皿，美国MatTek Co.产品。LaserSharp 2000software Bio-Rad。
按照实施例1步骤一中3的方法转染CHO细胞，其中载体DNA 3μg/皿，pDsRedHst与pEGFP/ECDt、pDsRedHst与pEGFP/mE1、pDsRedHst与pEGFP/mE2共转染时，每个皿两种质粒各加等量的1.5μg，脂质体9μl/皿；pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1、pEGFP/mE2和pDsRedHst单独转染时，3μg/皿的质粒DNA。
转染细胞培养48h后，激光扫描共聚焦显微镜采集数据。选用三组滤片：(1)ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP或mE2-EGFP：excitation 488nm，dichroic mirror560DCLPXR，emission HQ515/30；(2)DsRedHst：excitation 543nm，dichroicmirror 650DCLPXR，emission HQ590/70；(3)FRET：excitation 488nm，dichroicmirror 650DCLPXR，emission HQ590/70。采集各组EGFP，DsRed和FRET图像时各种参数分别保持不变。EGFP和FRET图像同时采集，DsRed图像在同一焦面上单独采集。所有分析均选用中等表达强度的细胞，过高或过低表达强度的细胞不宜选用。FRET通道采集的数据中包含FRET、EGFP和DsRed通道的信号，为消除EGFP和DsRed通道光渗透的信号和消除背景的干扰，表达ErbB2ECD-EGFP、mE1-EGFP或mE2-EGFP的细胞分别同时采集EGFP及FRET图像，表达DsRedHst的细胞也同时采集DsRed及FRET图像，用于背景去除及串色校正。为确定两共定位蛋白质是否发生了相互作用，对采集到的数据用三滤片法进行了FRET分析以计算蛋白质间的相互作用。采用Ratio/FRET/Dencitometry Module of Slidebood 4.0(Intelligent Imaging Innovations，Denver，CO，USA)计算图像FRETc和Ratio值。计算公式如下：
FRETc＝IFRET-a×IGFP-b×IDs Red
Ratio＝FRETc/IGFP
式中a和b各为EGFP和DsRed渗透系数，I为采集到的图像的FRET值。FRET结果用“伪彩色”表示，Ratio值接近0时，FRET结果阴性，“伪彩色”用蓝色表示；Ratio值接近1时，FRET结果阳性，“伪彩色”用红色表示。“伪彩色”黄绿色到红色，在图像中代表FRET阳性。“伪彩色”由绿色到蓝色，在图像中代表FRET阴性。
结果表明pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1和pEGFP/mE2单独转染时，ErbB2ECD-EGFP表达产物主要定位于胞膜、核膜和空泡表面(图4B)，mE1-EGFP和EGFP-mE2则在细胞的膜系统分布(图4C，图4D)；pDsRedHst单独转染时，DsRedHst在细胞的胞核周围的胞质中均匀分布(图4A)。但当pDsRedHst和pEGFP/ECDt共转染时，DsRedHst与ErbB2ECD-EGFP在细胞核周围产生明显的共定位信号，并产生黄色或橘黄色的结合性物质(图5A-图5C)；ErbB2ECD-EGFP的分布发生了改变，由主要在细胞膜表面分布，改变在核周分布，DsRedHst继续在细胞的核周分布。当pDsRedHst和pEGFP/mE1共转染时，mE1-EGFP则由在细胞的膜系统分布，改变到了核周分布；DsRedHst在细胞的核周分布(图6A-图6C)。当pDsRedHst和pEGFP/mE2共转染时，DsRedHst和mE2-EGFP在细胞中的分布未发生明显改变，未观察到明显的共定位现象(图7A-图7C)。
为进一步确定两共定位蛋白发生了相互作用，采集到的数据用三滤片法进行了FRET分析以计算蛋白质间的相互作用。结果表明，含有L1区和S1区编码基因的pEGFP/ECDt或pEGFP/mE1与pDsRedHst共同转染的细胞中检测到明显的FRET信号(图5D和图6D)，图5D中“伪彩色”是红色；图6D中，“伪彩色”是黄绿色到红色；而不含L1区和S1区编码基因的pEGFP/mE2与pDsRedHst共转染时细胞中检测不到明显的FRET信号(图7D)，图7D中，“伪彩色”是蓝色。说明计算机模拟得到的模型Herstatin与HER2/neu相互作用模型是正确的，HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段是HER2/neu的L1和S1区域，该HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段具有序列表中序列1的氨基酸残基序列，其编码基因具有序列表中序列2的DNA序列。
实施例2、免疫共沉淀实验验证HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段
为进一步验证计算机模建的正确性。采用Herstatin与HER2/neu三个突变体进行免疫共沉淀的方法进一步验证此模型。
材料
转染试剂LipofectamineTM为Invitrogen产品；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst、载体pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1和pEGFP/mE2按照文献(Wang JN，Feng JN，YuM，Xu M，Shi M，Zhou T，Yu XD，Shen BF，Guo N.2004.Structural analysisof the epitopes on erbB2 interacted with inhibitory or non-inhibitorymonoclonal antibodies.Mol Immunol 40：963-969)的方法构建。proteinA/G plusagarose beads，Santa Cruz产品。cocktail，Roche产品。anti-Herstatin，小鼠单抗CWO01，upstate产品；GFP兔多克隆抗体，BioVision公司产品。
将3×106个CHO细胞铺于10cm培养板，24h后进行转染。其中，同时有以下几种转染情况：pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pEGFP/ECDt共转染；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pEGFP/mE1共转染；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst和pEGFP/mE2共转染；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst单独转染；pEGFP/ECDt单独转染；pEGFP/mE1单独转染；pEGFP/mE2单独转染。转染方法同实施例1步骤一中3，共转染时每皿两种质粒各1.5μg。细胞转染48h后。吸去培养液，用预冷PBS洗涤2次。用细胞刮刮取转染细胞。预冷PBS再洗涤2次，每次10min。加入1ml细胞裂解液MTG(50mM Tris.Cl，pH7.4，100mM NaCl，10％glycerol，1％Nonidet P-40，1×cocktail，cocktail临用时加入)。4℃振荡裂解30min。细胞裂解物4℃，12000r/min，离心20min，收获上清。
上清中加入20μl proteinA/G plus agarose beads。4℃振荡孵育2h，4000r/min，离心5min。保存上清，去除沉淀物质，目的是除去细胞裂解液中与proteinA/G plus agarose beads非特异结合的物质。上清中加入4μg抗体(anti-Herstatin或GFP兔多克隆抗体)，4℃振荡孵育4h或过夜。加入40μlproteinA/G plus agarose beads，振荡孵育4h。4000r/min离心5min去除上清。MTG液洗涤4次，收集沉淀。
沉淀中加入70μl SDS-PAGE上样缓冲液(100mM DTT，2％SDS，10％glycerol，0.1％溴酚蓝，50mM Tris，pH6.8，DTT临用前加入)，100℃水浴3min。离心取上清进行8％SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白电转印至硝酸纤维素膜。转印完毕用含5％脱脂奶粉的TBS室温封闭1.5h，TBS-T(TBS，含0.2％Tween 20)洗膜3次，每次10min；用含5％BSA的TBS稀释一抗(GFP兔多克隆抗体或anti-Herstatin，)至1μg/ml，分别与转印膜4℃孵育3h，TBS-T洗膜2次，每次10min；用含5％BSA的TBS稀释酶标二抗HRP-GAM IgG(购自中山生物制品有限公司)(1∶5000)，室温孵育45min，TBS-T洗膜3次，每次10min；然后，按照Amersham Biosciences公司提供的增敏化学发光底物(ECL)显色，X光片(Koda公司产品)显影。
免疫共沉淀结果如图8所示，当pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/ECDt或pEGFP/mE1或pEGFP/mE2共转染CHO细胞时，用抗Herstatin的抗体可从细胞裂解液中把含L1和S1结构域的ErbB2ECD-EGFP或mE1-EGFP沉淀下来，但pcDNA3.1(-)myc-his/Hst不与缺乏L1和S1结构域的mE2-EGFP发生免疫共沉淀。Herstatin与含L1和S1结构域的ErbB2ECD-EGFP的免疫共沉淀产物大小为87KDa，Herstatin与含L1和S1结构域的mE1-EGFP的免疫共沉淀产物大小为69KDa。反之，用抗GFP的抗体(GFP兔多克隆抗体)沉淀共转染标本，在pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/ECDt或pEGFP/mE1共转染的标本中可沉淀到Herstatin；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/mE2共转染细胞中，则沉淀不到Hersatin。这些结果说明HRE2/neu与Herstatin的结合是通过其L1和S1结构域。
pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/ECDt共转染的标本中用GFP兔多克隆抗体可沉淀到60KD的Hersatin条带(泳道7)；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/mE1共转染的标本中用GFP兔多克隆抗体可沉淀到60KD的Hersatin条带(泳道8)；pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/mE2共转染的标本中用GFP兔多克隆抗体沉淀不到60KD的Hersatin条带(泳道9)。图中50KD左右的条带为抗GFP抗体的重链。
图8中，泳道1为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/ECDt共转染的CHO细胞用anti-Herstatin进行免疫沉淀的结果，泳道2为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/mE1共转染的CHO细胞用anti-Herstatin进行免疫沉淀的结果，泳道3为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/mE2共转染的CHO细胞用anti-Herstatin进行免疫沉淀的结果；泳道4、泳道5和泳道6为pEGFP/ECDt、pEGFP/mE1、pEGFP/mE2单独转染CHO细胞的用GFP兔多克隆抗体进行West-bloting结果；泳道7为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/ECDt共转染的CHO细胞用GFP兔多克隆抗体进行免疫沉淀的结果、泳道8为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/mE1共转染的CHO细胞用GFP兔多克隆抗体进行免疫沉淀的结果；泳道9为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst与pEGFP/mE2共转染的CHO细胞用GFP兔多克隆抗体进行免疫沉淀的结果；泳道10为pcDNA3.1(-)myc-his/Hst单独转染的CHO细胞用anti-Herstatin进行免疫沉淀的结果。
序列表
<160>2
<210>1
<211>340
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg
340
<210>2
<211>1020
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
Claims (7)
1.HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段，其氨基酸残基序列如SEQ IDNO：1所示。
2.权利要求1所述的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段的编码基因。
3.根据权利要求2所述的活性片段编码基因，其特征在于：所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
4.含有权利要求2或3所述的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段编码基因的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段编码基因的细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段编码基因的宿主菌。
7.权利要求1所述的HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段在制备拮抗HER2/neu的药物的应用。
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