PL213213B1 - Zastosowanie koniugatu przeciwcialo anty-ErbB- maitansynoid, koniugat przeciwcialo anty-ErbB-maitansynoid i koniugat do zastosowania w sposobie leczenia nowotworu - Google Patents

Zastosowanie koniugatu przeciwcialo anty-ErbB- maitansynoid, koniugat przeciwcialo anty-ErbB-maitansynoid i koniugat do zastosowania w sposobie leczenia nowotworu

Info

Publication number
PL213213B1
PL213213B1 PL352678A PL35267800A PL213213B1 PL 213213 B1 PL213213 B1 PL 213213B1 PL 352678 A PL352678 A PL 352678A PL 35267800 A PL35267800 A PL 35267800A PL 213213 B1 PL213213 B1 PL 213213B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
cancer
antibodies
erbb2
cells
Prior art date
Application number
PL352678A
Other languages
English (en)
Other versions
PL352678A1 (pl
Inventor
Sharon Erickson
Ralph Schwall
Mark X. Sliwkowski
Walter Blattler
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26838985&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL213213(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of PL352678A1 publication Critical patent/PL352678A1/pl
Publication of PL213213B1 publication Critical patent/PL213213B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania koniugatu przeciwciało anty-ErbB-maitansynoid, koniugatu przeciwciało anty-ErbB-maitansynoid i koniugatu do zastosowania w leczeniu nowotworu.
Wynalazek pozwala na leczenie nowotworów, zwłaszcza w terapiach skierowanych na receptor ErbB, przy zastosowaniu koniugatów przeciwciało anty-receptor ErbB-maitansynoid oraz pozwala na wytworzenie produktów przemysłowych przydatnych do zastosowania w tych terapiach.
1. Maitansyna i maitansynoidy
Maitansynoid wyizolowano po raz pierwszy z wschodnio afrykańskiego krzewu Maytenus serrata (patent USA nr 3,896,111). Następnie odkryto, że niektóre mikroorganizmy również wytwarzają maitansynoidy, takie jak maitansynol i estry maitansynolowe C-3 (patent USA nr 4,151,042). Syntetyczny maitansynol i analogi maitansynolu są ujawnione na przykład w patentach USA nr 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533, ujawnienia których są tu dokładnie włączone jako odniesienie.
Maitansyna i maitansynoidy są wysoce cytotoksyczne, ale ich zastosowanie kliniczne w terapii nowotworów było bardzo ograniczone przez ich poważne ogólnoustrojowe efekty uboczne wynikające przede wszystkim z ich słabej selektywności wobec nowotworów. Testy kliniczne z maitansyną zostały przerwane na skutek poważnego szkodliwego działania na centralny układ nerwowy i układ żołądkowo-jelitowy (Issel i wsp., Can. Trtmnt. Rev. 5:199-207 (1978)).
2. Rodzina ErbB receptorowych kinaz tyrozynowych i przeciwciała anty-ErbB
Przedstawiciele rodziny ErbB receptorowych kinaz tyrozynowych są ważnymi pośrednikami we wzroście komórek, różnicowaniu i przeżywalności. Rodzina receptorów obejmuje czterech odrębnych członków, włączając w to receptor nabłonkowego czynnika wzrostowego (EGFR lub ErbB1), HER2 (ErbB2 lub p185new), HER3 (ErbB3) i HER4 (ErbB4 lub tyro2).
p185neu został wyjściowo wyizolowany jako produkt genu transformującego z niedojrzałego nerwiaka szczurów poddanych działaniu związków chemicznych. Aktywowana postać protoonkogenu neu jest wynikiem punktowej mutacji (walina do kwasu glutaminowego) w transbłonowym regionie zakodowanego białka. Amplifikację ludzkiego homologa neu obserwuje się w nowotworach sutka i jajnika i koreluje ona ze słabym rokowaniem (Slamon i wsp., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon i wsp., Science, 244:707-712 (1989); i pat. USA nr 4,96B,603). Jak dotychczas, w ludzkich nowotworach nie zaobserwowano mutacji punktowych analogicznych do tych w protoonkogenie neu. Nadekspresję ErB2 (często ale nie zawsze na skutek amplifikacji genu) obserwuje się również w innych nowotworach, włączając w to nowotwór żołądka, śluzówki macicy, gruczołu śliniankowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki i pęcherza. Patrz miedzy innymi King i wsp., Science, 229:974 (1985); Yokota i wsp., Lancet 1:765-767 (1986); Fukushigi i wsp., Mol Cell Biol, 6:955-958 (1986); Geuerin i wsp., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen i wsp., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura i wsp., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst i wsp., Gynecol Oncol, 38:364 (1990); Weiner i wsp., Cancer, Res., 50:421-425 (1990); Kern i wsp., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park i wsp., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau i wsp., Mol Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland i wsp. Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams i wsp., Pathobiology 59:46-52 (1991) oraz McCann i wsp., Cancer, 65:88-92 (1990). ErbB2 może ulegać nadekspresji w nowotworze prostaty. Forma składania mRNA onkogenu erbB2, kodująca konstytutywnie fosforylowany receptor tyrozynowy ErbB2 jest ujawniona w publikacji PCT WO 00/20579, opublikowanej 13 kwietnia, 2000. Białko erbB2 zakodowane przez wariant składania ma delecję w ramce 16 aminokwasów (CVDLD-DKGCPAEQRAS), z których dwa są zakonserwowanymi resztami cysteinowymi.
Opisano przeciwciała skierowane przeciwko produktom białkowym: szczurzemu p185neu i ludzkiemu ErbB2. Drebin i współpracownicy uzyskali przeciwciała przeciwko produktowi szczurzego genu neu, p185neu. Patrz na przykład Drebin i wsp., Cell 41:695-706 (1985); Myers i wsp., Meth. Enzym. 198:277- 290 (1991) oraz W094/22478. Drebin i wsp., Oncogene 2:273-277 (1988) donoszą, że mieszanina przeciwciał reagujących z dwoma odrębnymi rejonami p185neu prowadzi do synergicznego efektu przeciwnowotworowego w transformowanych neu komórkach NIH-BT3 wszczepionych do nagich myszy. Patrz również patent USA 5,824,311 opublikowany 20 października 1998.
Inne przeciwciała anty-ErbB2 z różnymi właściwościami zostały opisane w Tagliabue i wsp., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie i wsp., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier i wsp., Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus i wsp., Molecular Carcynaogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski
PL 213 213 B1 i wsp., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus i wsp., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu i wsp., Int. J. Cancer 53:401408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk i wsp., Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock i wsp., Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver i wsp., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga i wsp., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth i wsp., J. Biol Chem. 267:15160-15167 (1992); patent USA nr 5,783,186 oraz Klapper i wsp., Oncogene 14:20992109 (1997).
Hudziak i wsp., Mol Cell Biol 9(3): 1165-1172 (1989) opisują wytwarzanie zestawu przeciwciał anty-ErbB2, które zostały scharakteryzowane przy zastosowaniu linii komórkowej ludzkiego raka sutka SK-BR-3. Względną proliferację komórkową komórek SK-BR-3 po wystawieniu na działanie przeciwciał określano poprzez barwienie fioletem krystalicznym pojedynczej warstwy komórek po 72 godzinach. Stosując ten test, maksimum hamowania uzyskano z przeciwciałem nazwanym 4D5, które hamowało proliferację komórkową w 56%. Inne przeciwciała w zestawie zmniejszały proliferację komórkową w mniejszym stopniu w tym teście. Stwierdzono ponadto, źe przeciwciało 4D5 uczula linie komórkowe raka sutka wyrażające ErbB2 na efekt cytotoksyczny TNF. Patrz również patent USA nr 5,677,171 opublikowany 14 października 1997. Przeciwciała anty-ErbB2 dyskutowane w Hudziak i wsp. są dalej charakteryzowane w Fendly i wsp., Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts i wsp., In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup i wsp., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard i wsp., J. Clin. Immunol 11(3):117-127 (1991); Kumar i wsp., Mol Cell Biol 11(2):979-986 (1991); Lewis i wsp., Cancer Immunol Immunother 37:255-263 (1993); Pietras i wsp., Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta i wsp., Cancer Research 54:5301- 5309 (1994); Sliwkowski i wsp., J. Biol Chem. 269(20):14 661-14665 (1994); Scott i wsp., J. Biol Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis i wsp., Cancer Research 56:1457-1465 (1996) oraz Schaefer i wsp., Oncogene 15: 1385-1394 (1997).
Mysie przeciwciało anty-HER2 hamuje wzrost linii komórkowych raka sutka, które wyrażają HER2 na poziomie 2+ i 3+, ale nie wykazuje aktywności wobec komórek, które wyrażają niższe poziomy HER2 (Lewis i wsp., Cancer Immunol Immunother. [1993])). W oparciu o tą obserwację, przeciwciało 4D5 humanizowano (Carter i wsp., Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 4285-4289 [1992]. Humanizowaną wersję nazwaną HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, patent USA nr 5,821,337) testowano u pacjentów z rakiem sutka, których nowotwory naprodukowały HER2, ale u których następował rozwój choroby po konwencjonalnej chemioterapii (Baselga i wsp., J Clin. Oncol. 4:737-744 11996]); Cobleigh i wsp., J. Clin. Oncol 17: 2639-2648 [1999]. Większość pacjentów w tym teście wyrażała HER2 na poziomie 3+, jakkolwiek część miała nowotwory 2+. Co warte zauważenia, HERCEPTIN® indukuje odpowiedź kliniczną u 15% pacjentów (całkowita odpowiedź u 4% pacjentów, częściowa odpowiedz u 11%) a mediana trwania tych odpowiedzi wynosiła 9,1 miesięcy. HERCEPTIN® został zatwierdzony do sprzedaży przez Food and Drug Adminidstration 25 września, 1998 do leczenia pacjentów z przerzutującym rakiem sutka, których nowotwory nadprodukowały białko Erb2.
Przeszukiwanie poprzez homologię doprowadziło do zidentyfikowania dwóch innych członków rodziny receptorów ErbB: ErbB3 (pat. USA nr 5,183,884 i 5,480,968, jak również Kraus i wsp., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) i ErbB4 (EP Zgł. Pat. Nr 599,274; Plowman i wsp., Proc. Natl Acad Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) oraz Plowman i wsp., Nature, 366:473-475 (1993)). Obydwa receptory wykazują zwiększoną ekspresję w co najmniej niektórych nowotworowych liniach komórkowych.
3. Koniugaty maitansynoid-przeciwciało
Podejmując próbę polepszenia wskaźnika terapeutycznego, maitansynę i maitansynoidy skoniugowano z przeciwciałami wiążącymi się specyficznie z antygenami komórek nowotworowych. Immunokoniugaty zawierające maitansynoidy są ujawnione na przykład w patentach USA nr 5,208,020; 5,416,064 i patencie europejskim EP O 425235 B1, ujawnienia których są tu dokładnie włączone jako odniesienie.
Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) opisuje immunokoniugaty zawierające maitansynoid oznaczony jako DM1 połączony z przeciwciałem monoklonalnym C242 skierowanym przeciw ludzkiemu nowotworowi okrężnicy i odbytnicy. Stwierdzono, że koniugat był wysoce cytotoksyczny wobec hodowanych komórek raka okrężnicy i wykazywał aktywność przeciwnowotworową w teście wzrostowym in vivo. Chari i wsp., Cancer Research 52:127-131 (1992) opisują immunokoniugaty, w których maitansynoid jest połączony poprzez wiązania dwusiarczkowe z mysim przeciwciałem A7 wiążącym się z antygenem na komórkach inni komórkowej ludzkiego nowotworu okrężnicy albo z innym mysim przeciwciałem monoklonalnym TA.1, które wiąże się z onkogenem HER-1/neu. Cytotoksyczność koniugatu TA.1-maitansynoid testowano in vitro na liniach komórkowych ludzkiego raka
PL 213 213 B1 5 sutka SK-BR-3, które wyrażają 3 x 105 antygenów powierzchniowych HER2 na komórkę. Lek w postaci koniugatu osiągnął poziom cytoksyczności podobny do leku w postaci wolnego maitansynoidu i można go zwiększyć poprzez zwiększenie liczby cząsteczek maitansynoidu na cząsteczkę przeciwciała. Koniugat A7-maitansynoid wykazuje niską cytotoksyczność ogólnoustrojową u myszy.
Jakkolwiek HERCEPTIN® stanowi przełom w leczeniu pacjentów z rakiem sutka nadprodukującym ErbB2, którzy byli poddani intensywnej terapii przeciwnowotworowej, generalnie około 85% pacjentów w tej populacji wykazuje brak odpowiedzi albo odpowiada słabo na leczenie HERCEPTIN®, a w testach klinicznych poprzedzających zatwierdzenie do sprzedaży mediana czasu dla rozwoju choroby u wszystkich traktowanych pacjentów wynosiła jedynie 3,1 miesięcy. A zatem, istnieje znacząca potrzeba kliniczna rozwoju dalszych skierowanych wobec HER2 terapii nowotworów dla tych pacjentów z nowotworami nadprodukującymi HER2, którzy nie odpowiadają albo odpowiadają słabo na leczenie HERCEPTIN®.
Streszczenie wynalazku
Niniejszy wynalazek opiera się na nieoczekiwanym odkryciu eksperymentalnym, że koniugaty HERCEPTIN®-maitansynoid są wysoce skuteczne w leczeniu nowotworów nadprodukujących HER2 (ErbB2), które nie odpowiadają albo odpowiadają słabo na leczenie HERCEPTIN®.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie koniugatu przeciwciała anty-ErbB2-maitansynoid, które to przeciwciało jest humanizowanym przeciwciałem huMAb4D5-8 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u ssaka, przy czym nowotwór ten charakteryzuje się nadekspresją receptora ErbB2 i nie odpowiada albo odpowiada słabo na leczenie przeciwciałem anty-ErbB2.
W korzystnym wykonaniu zastosowania według wynalazku nowotworem jest rak.
W bardziej korzystnym wykonaniu zastosowania rakiem jest rak sutka.
W kolejnym korzystnym zastosowaniu maitansynoidem jest DM1 o strukturze:
przy czym przeciwciało jest połączone chemicznie z mitansynoidem poprzez grupę dwusiarczkową lub tioeterową reprezentowaną przez „R.
Również korzystnie wspomniane przeciwciało i wspomniany maitansynoid są skoniugowane poprzez łącznik chemiczny wybrany z N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propanianu (SPDP), N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanianu (SPP), sukcynomidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (SMCC).
W kolejnym korzystnym wykonaniu zastosowania według wynalazku koniugat zawiera od 3 do 5 cząsteczek maitansynoidu na cząsteczkę przeciwciała.
Przedmiotem wynalazku jest również koniugat przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid, charakteryzujący się tym, że przeciwciało to jest humanizowanym przeciwciałem huMab4D5-8.
Korzystną postacią koniugatu według wynalazku jest koniugat taki, że maitansynoid jest DM1 o strukturze:
PL 213 213 B1
przy czym przeciwciało jest połączone chemicznie z mitansynoidem poprzez grupę dwusiarczkową lub tioeterową reprezentowaną przez „R.
Korzystnie koniugat według wynalazku zawiera od 3 do 5 cząsteczek maitansynoidu na cząsteczkę przeciwciała.
Bardziej korzystna postać wynalazku to koniugat charakteryzujący się tym, że wspomniane przeciwciało i wspomniany maitansynoid są skoniugowane poprzez łącznik chemiczny wybrany z N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propanianu (SPDP), N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanianu (SPP), sukcynomidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (SMCC).
Przedmiotem wynalazku jest także koniugat jak zdefiniowano powyżej do zastosowania w sposobie leczenia nowotworu u ludzi, przy czym nowotwór ten charakteryzuje się nadekspresją receptora ErbB2 i nie odpowiada lub odpowiada słabo na leczenie przeciwciałem anty-ErbB2, przy czym sposób ten obejmuje podawanie koniugatu człowiekowi.
Korzystnie w koniugacie do zastosowania, wspomnianym nowotworem jest rak, a bardziej korzystnie w koniugacie do zastosowania rakiem jest rak sutka.
Jak wspomniano, niniejszy wynalazek pozwala na rozwinięcie metody leczenia nowotworów u ssaków, gdzie nowotwór charakteryzuje się nadprodukcją receptora ErbB i nie odpowiada albo odpowiada słabo na leczenie przeciwciałami monoklonalnymi anty-ErbB, obejmujący podawanie ssakowi skutecznej terapeutycznie ilości koniugatu przeciwciała anty-ErbB z maitansynoidem. Zgodnie z tą metodą pacjentem jest człowiek. Receptorem ErbB jest (ludzki) ErbB2 (HER2). Metoda nie jest ograniczona przez mechanizm działania zastosowanego przeciwciała anty-ErbB. A zatem przeciwciało anty-ErbB może na przykład mieć właściwości hamowania wzrostu i/lub może indukować śmierć komórki i/lub apoptozę. Metoda obejmuje leczenie raka obejmujące bez ograniczania, raka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu śliniankowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki, prostaty i pęcherza. Korzystne jest jeżeli rakiem jest rak sutka, a w szczególności rak sutka, który nadprodukuje ErbB2 na poziomie 2+ albo wyższym, a korzystniej na poziomie 3+. Korzystna grupa przeciwciał ma właściwości biologiczne przeciwciała monoklonalnego 4D5 albo wiąże się zasadniczo z tym samym epitopem co przeciwciało monoklonalne 4D5, przy czym szczególnie korzystna jest humanizowana postać mysiego przeciwciała 4D5 (ATCC CRL 10463).
Maitansynoidem zastosowanym w koniugatach według niniejszego wynalazku może być maitansyna albo korzystniej maitansynol lub ester maitansynolowy. Przeciwciało i maitansynoid można połączyć poprzez specyficzny łącznik chemiczny, taki jak N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)propanian (SPDP) lub N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanian (SPP). Grupą łącznikową pomiędzy przeciwciałem i maitansynoidem może być na przykład grupa dwusiarczkowa, tioeterowa, kwasolabilna, fotolabilna, wrażliwa na peptydazę albo wrażliwa na esterazę.
Wynalazek pozwala na wytworzenie produktu przemysłowego obejmującego pojemnik oraz zawartą w nim kompozycję, gdzie kompozycja zawiera koniugat przeciwciało anty-ErbB-maitansynoid i obejmującego ponadto ulotkę albo etykietkę wskazującą, że kompozycja może być stosowana do leczenia nowotworu charakteryzującego się nadprodukcją receptora ErbB, korzystnie na poziomie 2+ albo wyższym.
PL 213 213 B1
Krótki opis rysunków
Fig. 1 pokazuje strukturę maitansynoidu, oznaczonego jako „DM1”.
Fig. 2 pokazuje strukturę koniugatu HERCEPTIN®-DM1.
Fig. 3 pokazuje profil elucji koniugatu HERCEPTIN® HERCEPTIN®-DM1 na kolumnie do sączenia molekularnego Sephacryl S330.
Fig. 4 pokazuje sekwencję nukleotydową konstruktu plazmidowego z transgenem HER2 (SEK ID nr: 1) kierującą ekspresją natywnego ludzkiego HER2 (ErbB2) w gruczole mlecznym transgenicznej myszy. Figura obejmuje sekwencję nukleotydową wstawki cDNA HER2 (ErbB2) (SEK ID nr: 2), jak również wydedukowaną sekwencję HER2 (ErbB2) (SEK ID nr: 3), włączając w to sekwencję sygnałową. W obrębie SEK ID nr: 3, reszty od około 22 do około 645, łącznie, reprezentują zewnątrzkomórkową domenę HER2 (ErbB2).
Fig. 5 ilustruje wpływ HERCEPTIN®-DM1 na transgeniczne guzy HER2. Kawałki transgenicz3 nych guzów MMTV-HER2 o rozmiarach dwóch mm3 transplantowano do ciała tłuszczowego gruczołu 3 mlecznego myszy FVB. Kiedy guz osiągnął 250 mm3, grupom 8 myszy wstrzykiwano przez 5 kolejnych dni koniugat HERCEPTIN®-DM1 Dwie inne grupy myszy traktowano IP dwa razy w tygodniu 10 mg/kg bądź HERCEPTIN® bądź RITUXAN®.
Fig. 6 pokazuje sekwencję regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała anty-HER2 2C4.
Fig. 7 pokazuje sekwencję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-HER2 2C4.
Szczegółowy opis wynalazku
O ile nie zdefiniowano inaczej, stosowane tu terminy naukowe i techniczne mają takie same znaczenia jak są zwykle rozumiane przez specjalistów w dziedzinie, której dotyczą. Singleton i wsp., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology wyd. 2-gie., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994). Dla celów niniejszego wynalazku, zdefiniowane są poniżej następujące terminy.
„Receptor ErbB albo „ErbB to receptorowa kinaza tyrozynowa, która należy do rodziny receptora ErbB i obejmuje receptory ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) i ErbB4 (HER4) oraz innych członków tej rodziny, którzy będą zidentyfikowani w przyszłości. Definicja obejmuje w szczególności receptory ErbB kodowane przez formy składania odpowiednich onkogenów erbB, włączając w to miedzy innymi, wariant delecyjny ErbB2 ujawniony w publikacji PCT nr WO 00/20579 (opublikowanej 3 kwietnia, 2000). Receptor ErbB generalnie zawiera domenę zewnątrzkomórkową, która może wiązać się z ligandem ErbB, lipofilową domenę transbłonową, konserwowaną wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej oraz karboksy-końcową domenę sygnalizującą niosącą kilka reszt tyrozynowych, które mogą być fosforylowane. Receptorem ErbB może być „sekwencja natywna receptora ErbB albo jego funkcjonalna pochodna, taka jak wariant jego sekwencji aminokwasowej. Korzystne jest, jeżeli receptorem ErbB jest natywna sekwencja ludzkiego receptora ErbB.
Terminy „ErbB1, „receptor nabłonkowego czynnika wzrostowego i „EGFR są tu stosowane wymiennie i odnoszą się do ujawnionej tu natywnej sekwencji EGFA, na przykład w Carpenter i wsp., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), włączając w to ich naturalnie występujące postaci zmutowane (np. mutant delecyjny EGFR jak w Humphrey i wsp., PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)) oraz jego funkcjonalne pochodne, takie jak wariant jego sekwencji aminokwasowej. ErbB1 odnosi się do genu kodującego produkt białkowy EGFR.
Wyrażenia „ErbB2 i „HER2 są tu stosowane wymiennie i odnoszą się do natywnej sekwencji ludzkiego białka HER2 opisanej na przykład w Semba i wsp., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) oraz Yamamoto i wsp., Nature 319:230-234 (1986) (numer dostępu do Genebank X03363) oraz jego funkcjonalnych pochodnych, takich jak wariant jego sekwencji aminokwasowej. Termin erbB2 odnosi się do genu kodującego ludzki HER2, a neu odnosi się do genu kodującego szczurze białko p185neu. Korzystną sekwencją HER2 jest natywna sekwencja ludzkiego HER2. Przykłady przeciwciał, które wiążą się z HER2 obejmują MAbs 4D5 (ATCC CRl1 0463), 2C4 (ATCC HB-12697), 7F3 (ATCC HB-12216), i 7C2 (ATCC HB 12215) (patrz patent USA nr 5,772,997; W098/77797 oraz patent USA nr 5,840,525, włączone tu dokładnie jako odniesienie). Humanizowane przeciwciała anty-HER2 obejmują huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) jak opisano w Tabeli 3 patentu USA nr 5,821,337 włączonego tu dokładnie jako odniesienie; humanizowane 520C9 (WO 93/21319). Ludzkie przeciwciała anty-HER2 są opisane w patencie USA nr 5,772,997 wydanym 30 czerwca 1998 oraz WO 97100271 opublikowanym 3 stycznia, 1997.
PL 213 213 B1
Terminy „ErbB3 i „HER3 odnoszą się do polipeptydu receptorowego jak ujawniono na przykład w patentach USA nr 5,183,884 i 5,480,968, jak również Kraus i wsp., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989), oraz jego funkcjonalnych pochodnych, włączając w to warianty jego sekwencji aminokwasowej. Przykłady przeciwciał, które wiążą się z HER3 są opisane w patencie USA nr 5, 968,511 (Akita i Sliwkowski), np. przeciwciało 8B8 (ATCC HB 12070) albo ich humanizowany wariant.
Terminy „ErbB4 i „HER4 odnoszą się tu do receptorowego polipeptydu, jak ujawniony na przykład EP Zgł. Pat. nr 599,274; Plowman i wsp., Proc. Natl Acad. Sci USA, 90: 1746-1750 (1993) oraz Plowman i wsp., Nature, 366:473-475 (1993), oraz jego funkcjonalnych pochodnych, włączając w to warianty jego sekwencji aminokwasowej, takie jak izoformy HER4 ujawnione w WO 99/19488.
„Natywną albo „sekwencję natywną polipeptydu EGFR, HER2, HER3 lub HER4 można wyizolować ze źródła naturalnego, wytwarzać przy użyciu technologii rekombinowania DNA, syntetyzować chemicznie albo wytwarzać dowolną kombinacją tych albo podobnych metod.
„Funkcjonalne pochodne obejmują warianty sekwencji aminokwasowej oraz pochodne kowalencyjne natywnych polipeptydów, o ile zachowują jakościową aktywność biologiczną odpowiadającego mu peptydu natywnego. Warianty sekwencji aminokwasowej generalnie różnią się od sekwencji natywnej podstawieniem, delecją i/lub wstawieniem jednego albo większej liczby aminokwasów gdziekolwiek w obrębie natywnej sekwencji aminokwasowej. Warianty delecyjne obejmują fragmenty natywnych polipeptydów oraz warianty ze skróceniami na końcu C albo N. Zazwyczaj warianty sekwencji aminokwasowej będą miały około 70% homologii, korzystnie co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 90% homologii z polipeptydem natywnym.
„Homologia jest zdefiniowana jako procent reszt w sekwencji aminokwasowej wariantu, które są identyczne po dopasowaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeżeli to konieczne, dla uzyskania maksymalnego procentu homologii. Metody i programy komputerowe do dopasowania są dobrze znane w tej dziedzinie. Jednym z takich programów komputerowych jest „Align 2 autorstwa Genentech, Inc., który został złożony z dokumentacją w biurze United States Copyright Office, Washington, DC 20559, 10 grudnia, 1991.
„Ligand ErbB ma oznaczać polipeptyd, który wiąże się i/lub aktywuje receptor ErbB. Ligandem ErbB będącym przedmiotem szczególnego zainteresowania jest natywna sekwencja ludzkiego ligandu ErbB, takiego jak nabłonkowy czynnik wzrostowy (ang. Epidermal Growth Factor, EGF) (Savage i wsp., J. Biol Chem. 247:7 612-7 621 (1972)); transformujący czynnik wzrostu alfa (ang. Tansforming Growth Factor alpha, TGF-alpha) (Marquardt i wsp., Science 223:107 9-1082 (1984)); amfiregulina znana również jako czynnik wzrostowy nerwiaka osłonkowego albo keratynocytowy autokrynny czynnik wzrostowy (Shoyab i wsp., Science 243:1074-1076 (1989); Kimura i wsp., Nature 348:257-260 (1990) oraz Cook i wsp., Mol. Cell Biol 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing i wsp., Science 259:1604-1607 (1993) oraz Sasada i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173-1993)); nabłonkowy czynnik wzrostowy wiążący heparynę (HB-EGF) (Higashiyama i wsp., Science 251:936.939 (1991)); epiregulina (Toyoda i wsp., J. Biol Chem. 270:7495-7500 (1995) oraz Ko-murasaki i wsp., Oncogene 15:2841-2848 (1997)), heregulina (patrz poniżej); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway i wsp., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang i wsp., Proc. Natl Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)) oraz cripto (CR-1) (Kannan i wsp., J. Biol Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). Ligandy ErbB, które wiążą się z EGFR obejmują EGF, TGF-alpha, amfiregufinę, betacelulinę, HB-EGF i epiregulinę. Ligandy ErbB, które wiążą się z HER3 obejmują hereguliny. Ligandy ErbB, które wiążą się z HER4 obejmują betacelulinę, epiregulinę, ΗΒ-EGF, NRG-2, NRG-3 i hereguliny.
Stosowany tu termin „heregulina (HRG) odnosi się do polipeptydu, który aktywuje kompleksy białkowe ErbB2-ErbB3 i ErbB2-ErbB4 (tj. indukuje fosforylację reszt tyrozynowych w kompleksie po związaniu się z nim). Różne polipeptydy heregulinowe objęte tym terminem są ujawnione na przykład w Holmes i wsp., Science 256: 1205-1210 (1992); WO 92/20798; Wen i wsp., Mol. Cell. Biol. 14(3):1909-1919 (1994) oraz Marchionni i wsp., Nature 362:312-318 (1993). Termin obejmuje biologicznie aktywne fragmenty i/lub warianty naturalnie występującego polipeptydu HRG, takiego jak fragment jego domeny typu EGF (np. HRGp177.244) „Hetero-oligomer ErbB oznacza tu niekowalencyjnie związany oligomer zawierający co najmniej dwa różne receptory ErbB. Takie kompleksy mogą tworzyć się wówczas, kiedy komórka wyrażająca dwa albo większą liczbę receptorów ErbB jest wystawiona na działanie ligandu ErbB i można je wyizolować poprzez immunoprecypitację i analizować poprzez SDS-PAGE jak opisano na przykład w Sliwkowski i wsp., J. Biol Chem., 269(20):14661-14665 (1994). Przykłady takich hetero-oligomerów ErbB obejmują kompleksy EGFR-HER2, HER2-HER3 i HER3-HER4. Ponadto, hetero-oligomery ErbB mogą zawierać dwa albo większą liczbę receptorów
PL 213 213 B1
ErbB w kombinacji z różnymi receptorami ErbB, takimi jak HER3, HER4 lub EGFR. W heterooligomerze mogą znajdować się inne białka, takie jak podjednostka receptora cytokiny (np. gp 130).
W kontekście wariantów HER2, takich jak fragmenty HER2, zdanie „mające aktywność biologiczną natywnego ludzkiego HER2 jest stosowane w odniesieniu do jakościowej zdolności takich fragmentów do indukowania wzrostu nowotworu, kiedy ulega nadprodukcji w modelu zwierzęcym (transgenicznym albo nietransgenicznym) według niniejszego wynalazku.
Stosowany tu termin „nowotwór, dotyczy wzrostu i proliferacji wszystkich komórek nowotworowych, czy to złośliwych czy łagodnych, oraz komórek i tkanek przedrakowych i rakowych.
Terminy „rak i rakowaty dotyczą albo opisują stan fizjologiczny u ssaków, który typowo charakteryzuje się nieregulowanym wzrostem komórkowym. Przykłady raka obejmują między innymi raka, chłoniaka, raka z niedojrzałych komórek, mięśniaka oraz choroby białaczkowe i Iimfatyczne. Bardziej konkretnie przykłady takich raków obejmują raka płaskokomórkowego np. śródbłonkowego raka płaskokomórkowego), raka płuc włączając w to raka płuc z małych komórek, raka płuc nie z małych komórek, gruczolakoraka płuc i płaskokomórkowego raka płuc, raka otrzewnej, raka wątrobo-komórkowego, raka żołądka, włączając w to raka żołądkowo-jelitowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka wątroby, raka pęcherza, wątrobiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka odbytnicy, raka jelita grubego, raka śluzówki macicy lub macicy, raka gruczołu śliniankowego, raka nerki, raka prostaty, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia jak również raka głowy i szyi.
Rak, który „naprodukuje receptor ErbB to taki, który ma znacząco wyższy poziom receptora ErbB, takiego jak HEA2, na powierzchni swoich komórek w porównaniu w komórkami nierakowymi z tego samego typu tkanki. Taka nadprodukcja może być spowodowana przez amplifikację genu albo poprzez wzrost transkrypcji albo translacji. Nadprodukcja receptora Erg może być oznaczona w teście diagnostycznym albo prognostycznym poprzez określenie wzrostu poziomu białka ErbB obecnego na powierzchni komórki np. poprzez zastosowanie testu immunohistochemicznego; IHC). Alternatywnie albo dodatkowo, można zmierzyć poziomy kwasów nukleinowych kodujących ErbB w komórce, np. poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH; patrz W098/45479 opublikowany październik, 1998), analizę Southern albo techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takie jak PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Można również badać nadprodukcję receptora ErbB poprzez mierzenie wyrzuconych antygenów (np., domeny zewnątrzkomórkowej ErbB) w płynach biologicznych takich jak surowica (patrz np. patent USA nr 4,933,294 wydany 172 czerwca, 1990; W0 91/05264 opublikowany 18 kwietnia 18, 1991; Patent USA 5,401,638 wydany 28 marca,1995 oraz Sias i wsp., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Poza powyższymi testami dostępne są dla soecjalistów różne testy in vivo. Przykładowo, można eksponować komórki wewnątrz ciała pacjenta na przeciwciało, które jest fakultatywnie wyznakowane wykrywalnym znacznikiem np., radioaktywnym izotopem i wiązanie przeciwciała z komórkami u pacjenta można zmierzyć na przykład poprzez zewnętrzne skanowanie radioaktywności albo analizowanie biopsji pobranej od pacjenta wystawionego uprzednio na działanie przeciwciała.
Nowotwory nadprodukujące HER2 klasyfikuje się na podstawie wyników immunohistochemicznych odpowiadających liczbie kopii cząsteczek HEA2 wyrażanych na komórkę i można je oznaczyć biochemicznie: 0 = 0-10000 kopii/komórkę, 1+ = co najmniej około 200000 kopii/komórkę, 2+ = co najmniej około 500000 kopii/komórkę, 3+ = co najmniej około 2000000 kopii/komórkę. Nadprodukcja HER2 na poziomie 3+, która prowadzi do niezależnej od ligandu aktywacji kinazy tyrozynowej (Hudziak i wsp., Proc. NatI Acad. Sci. USA 34: 7159-7163 [1987]), następuje w około 30% raka sutka i u tych pacjentów przeżycie wolne od nawrotów, i w ogóle przeżycie, jest zmniejszone (Slamon i wsp., Science 244: 707-712 [1939]; Siamon i wsp., Science 235: 177-132 (1987]).
Odwrotnie, rak, który nie charakteryzuje się nadprodukcją receptora ErbB to taki, który w teście diagnostycznym nie nadprodukuje wyższych niż normalne poziomów receptora ErbB w porównaniu z komórkami nie rakowymi z tego samego typu tkanki.
Rak „niezależny od hormonu to taki, którego proliferacja nie jest zależna od obecności hormonu, który wiąże się z receptorem wyrażanym przez komórki raka. Takie raki nie podlegają klinicznej regresji po zastosowaniu strategii farmakologicznych albo chirurgicznych, które zmniejszają stężenie hormonu w pobliżu guza. Przykłady raków niezależnych od hormonu obejmują niezależnego od androgenu raka prostaty, niezależnego od estrogenu raka sutka, raka śluzówki macicy i raka jajnika. Takie raki mogą zaczynać się jako guzy zależne od hormonu i rozwijać się od stadium zależnego od hormonu do opornego na hormon po terapii przeciwhormonalnej.
PL 213 213 B1
Termin „przeciwciało jest tu stosowany w najszerszym znaczeniu i obejmuje konkretnie nienaruszone przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np. przeciwciała bispecyficzne) utworzone z co najmniej dwóch nienaruszonych przeciwciał, fragmenty przeciwciał o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną. Stosowany tu termin „przeciwciało monoklonalne dotyczy przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennycn przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała zawarte w populacji są identyczne z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w niewielkiej ilości. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, będąc skierowanymi wobec pojedynczego miejsca antygenowego. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które zawieraną różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciw pojedynczej determinancie antygenu. Poza ich specyficznością, przeciwciała monoklonalne są korzystne z tego względu, że mogą być syntetyzowane bez zanieczyszczeń innymi przeciwciałami. Określenie „monoklonalny wskazuje na charakter przeciwciała jako otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie ma być traktowane jako wymaganie odnośnie wytwarzania przeciwciała jakąś konkretną metodą. Przykładowo, monoklonalne przeciwciała do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być wytwarzane metodą hybrydom po raz pierwszy opisaną przez Kohler i wsp., Nature, 256:495 (1975) albo wytwarzane metodami rekombinowania DNA (patrz np. patent USA nr 4,816,567). „Przeciwciała monoklonalne można również izolować z fagowych bibliotek przeciwciałowych przy zastosowaniu technik opisanych na przykład w Clackson i wsp., Nature, 352:624-628(1991) oraz Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
Stosowane tu przeciwciała monoklonalne obejmują w szczególności przeciwciała „chimerowe, w których część łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego jest identyczna albo homologiczna z odpowiadającymi im sekwencjami przeciwciał pochodzących z określonych gatunków albo należących do określonej klasy przeciwciał, podczas gdy reszta łańcucha(ów) jest identyczna albo homologiczna z odpowiednimi sekwencjami przeciwciał pochodzących z innego gatunku albo należących do określonej klasy albo podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał tak długo jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (patent USA nr 4,816,567 oraz Morrison i wsp., Proc. Natl Acad Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Przeciwciała chimerowe będące przedmiotem zainteresowania obejmują przeciwciała prymatyzowane zawierające sekwencje wiążące antygen domeny zmiennej pochodzące od naczelnego innego niż człowiek (np. małpy Old World Monkey, Ape itd.) i ludzkie sekwencje regionu stałego.
„Fragmenty przeciwciał obejmują część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie zawierającą jego region wiążący antygen albo zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2' i Fv; diciała; przeciwciała liniowe, przeciwciała jednołańcuchowe oraz przeciwciała multispecyficzne utworzone z fragmentu(ów) przeciwciał.
Przeciwciało „nienaruszone to takie, które zawiera wiążący antygen region zmienny łańcucha lekkiego (CL) i domeny stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Domeny stałe mogą być natywną sekwencją domen stałych (np. ludzką natywną sekwencją domen stałych) albo sekwencją aminokwasową ich wariantów. Korzystne jest, jeżeli nienaruszone przeciwciało ma jedną albo więcej funkcji efektorowych.
„Humanizowane postaci przeciwciał nie-ludzkich (np. gryzoni) to chimerowe przeciwciała, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny nie-ludzkiej. W większości przypadków, humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało-biorca), w którym reszty z regionu hiperzmiennego biorcy są zastąpione resztami hiperzmiennego regionu przeciwciała z gatunku innego niż człowiek (przeciwciało donorowe), takiego jak mysz, szczur, królik albo naczelny nie-człowiek, mającego pożądaną specyficzność, powinowactwo i pojemność. W niektórych przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR) ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione przez odpowiadające im nieludzkie reszty. Ponadto humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie są znajdywane w przeciwciele biorcy ani w przeciwciele donorowym. Tych modyfikacji dokonuje się w celu dalszej zmiany właściwości przeciwciała. Generalnie, humanizowane przeciwciała będą zawierały zasadniczo wszystkie spośród co najmniej jednej, a typowo dwóch domen zmiennych, w których wszystkie albo zasadniczo wszystkie pętle hiperzmienne odpowiadają tym z immunoglobulin nie-ludzkich i wszystkie albo zasadniczo wszystkie FR są z sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Humanizowane przeciwciała będą ewentualnie zawierały co najmniej cześć regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo z immunoglobuliny ludzkiej. Dla dalszych szczegółów patrz Jones i wsp., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann i wsp., Nature 332:323-329 (1988) oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992).
PL 213 213 B1
Humanizowane przeciwciała anty-ErbB2 obejmują huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (HERCEPIN®; jak opisano w Tabeli 3 w patencie USA 5,821,337 dokładnie włączonym jako odniesienie; humanizowane przeciwciało 520C9 (W093121319) i humanizowane przeciwciała 2C4 jak te pokazane na Fig. 6.
„Funkcje efektorowe przeciwciała dotyczą tych aktywności biologicznych, które można przypisać regionowi Fc (natywnej sekwencji regionu Fc albo wariantu sekwencji aminokwasowej regionu Fc) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowej przeciwciała obejmują wiązanie C1q; cytotoksyczność zależną od dopełniacza; wiązanie receptora Fc; zależną od przeciwciała cytotoksyczność za pośrednictwem komórek (ang. antibody-dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC); fagocytozę; obniżenie poziomu receptorów powierzchniowych (np. receptorów komórek B cell; BCR), itd.
W zależności od sekwencji aminokwasowej domeny stałej łańcuchów ciężkich, nienaruszone przeciwciało może być zaliczone do różnych „klas. Istnieje pięć głównych klas nienaruszonych przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na „podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają różnym klasom przeciwciał są nazywane,,, i, odpowiednio. Struktury podjednostek i trójwymiarowa konfiguracja różnych klas immunoglobulin są dobrze znane.
„Zależna od przeciwciała cytotoksyczność i „ADCC dotyczą reakcji z udziałem komórek, w której niespecyficzne komórki cytotoksyczne, które wyrażają receptory Fc (FcRs) (np. komórki naturalnych zabójców, ang. Natural Killer (NK), komórki obojętnochłonne i makrofagi, rozpoznają związane przeciwciało na komórce docelowej, a następnie powodują lizę komórki docelowej. Komórki pierwotne uczestniczące w ADCC, komórki NK, wyrażają jedynie Fc RIII, podczas gdy monocyty wyrażają Fc RI, Fc RII i Fc RIII. Ekspresja FcR na komórkach krwiotwórczych jest zestawiona w Tabeli 3 na stronie 464 w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). W celu zbadania aktywności ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można przeprowadzić test ADCC in vitro, taki jak opisany w patencie USA nr 5,500,362 lub 5,821,337. Przydatne komórki efektorowe do takich testów obejmują jednojądrowe komórki z krwi obwodowej (PBMC) i komórki naturalnych zabójców (NK). Alternatywnie albo dodatkowo, aktywności ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można badać in vivo, np. w modelu zwierzęcym, takim jak ujawniony w Clynes i wsp., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
„Ludzkie komórki efektorowe to leukocyty, które wyrażają jedną albo większą liczbę FcRs i pełnią funkcje efektorowe. Korzystne jest, jeżeli komórki wyrażają co najmniej Fc RII i pełnią funkcje efektorowe ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC obejmują jednojądrowe komórki z krwi obwodowej (PBMC), komórki naturalnych zabójców (NK), monocyty, cytotoksyczne komórki T i komórki obojętnochłonne; przy czym korzystne są komórki PBMC i NK. Komórki efektorowe można izolować z naturalnych źródeł, np. z krwi albo PBMC jak tu opisano.
Terminy „receptor Fc albo „FcR są użyte dla opisania receptora, który wiąże się z regionem Fc przeciwciała. Korzystnym FcR jest natywna sekwencja ludzkiego FcR. Ponadto, korzystnym FcR jest taki, który wiąże się z przeciwciałem IgG (receptorem gamma) i obejmuje receptory podklas Fc RI, Fc RII oraz Fc RIII, włączając w to warianty alleliczne i formy tych receptorów powstałe w wyniku alternatywnego składania. Receptory Fc RII obejmują Fc RIIA („receptor aktywujący) i Fc RIIB („receptor hamujący), które mają podobne sekwencje aminokwasowe, różniące się głównie w domenach cytoplazmatycznych. Receptor aktywujący Fc RIIA zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej immunoreceptorowy oparty o tyrozynę motyw aktywacyjny (JTAM). Receptor hamujący Fc RIIB zawiera w swojej domenie cytopiazmatycznej immunoreceptorowy oparty o tyrozynę motyw hamujący (ITIM). (patrz praca przeglądowa M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Przegląd FcRs jest w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Imimunol 9:457-92 (1991); Capel i wsp., Immunomethods 4:25-34 (1994) oraz de Haas i wsp., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Inne FcRs, włączając w to te, które będą zidentyfikowane w przyszłości, są tu objęte terminem „FcR. Termin obejmuje również receptor noworodkowy, FcRn, który jest odpowiedzialny za transfer matczynych IgG do płodu (Guyer i wsp., J. Immunol. 117:587 (1976) oraz Kim i wsp., J. Immunol 24:249 11994)).
„Cytotoksyczność zależna od dopełniacza lub „CDC dotyczy zdolności komórek do Iizy komórki docelowej w obecności dopełniacza. Szlak aktywności dopełniacza jest zapoczątkowywany poprzez wiązanie się pierwszego składnika systemu dopełniacza (C1q) z cząsteczką (np. przeciwciałem) w kompleksie z pokrewnym antygenem. W celu zmierzenia aktywności dopełniacza można przeprowadzić test CDC jak opisano w Gazzano-Santoro i wsp., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
PL 213 213 B1 „Przeciwciała natywne są zwykle heterotetramerowymi glikoproteinami o masie około 150,000 daltonów, składającymi się z dwóch identycznych łańcuchów lekkich i (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, jakkolwiek liczba wiązań dwusiarczkowych może być zróżnicowana wśród łańcuchów ciężkich z różnych izotypów immunoglobulin. Każdy łańcuch ciężki i lekki ma również regularnie rozmieszczone wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki ma na jednym końcu domenę zmienną (VH), po której następują liczne domeny stałe. Każdy łańcuch lekki ma na jednym końcu domenę zmienną (VL), a na drugim końcu domenę stałą. Domena stała łańcucha lekkiego pasuje do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego pasuje do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą połączenie pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.
Termin „zmienny stosowany w połączeniu z przeciwciałami dotyczy faktu, że niektóre części domen zmiennych przeciwciał wykazują bardzo duże różnice w sekwencji pomiędzy przeciwciałami i są wykorzystywane w wiązaniu i specyficzności poszczególnych przeciwciał wobec konkretnego antygenu. Jednakże zmienność nie jest równomiernie rozmieszczona na przestrzeni domen zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech odcinkach zwanych regionami hiperzmiennymi w domenach zmiennych zarówno łańcucha lekkiego, jak i ciężkiego. Najbardziej zakonserwowane części domen zmiennych są nazywane regionem zrębowym (ang. framework region, FRS). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów lekkich i ciężkich zawiera cztery FRS, przyjmujące w większości konfigurację -kartki, połączone przez trzy regiony hiperzmienne, które tworzą pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzą część struktury -kartki. Regiony hiperzmienne w każdym łańcuchu są utrzymywane razem w bliskości przez FRS i wraz z regionami hiperzmiennymi z innego łańcucha uczestniczą w tworzeniu się miejsca wiążącego antygen przeciwciała (patrz Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Domeny stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu się przeciwciała z antygenem, ale pełnią funkcje efektorowe, takie jak udział przeciwciała w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała (ADCC).
Stosowany tu termin „region hiperzmienny odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny generalnie obejmuje reszty aminokwasowe z „regionu określającego komplementarność, ang. complementarity determining region albo „CDR, (np. reszty 24-34 (11), 50-56 (12) i 89-97 (13) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) i/lub reszty z „pętli hiperzmiennej (np. reszty 26-32 (11), 50-52 (L2) i 91-96 (13) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Resztami „regionu zrębowego lub „FR są reszty domeny zmiennej inne niż zdefiniowane tu reszty regionu hiperzmiennego.
Przeciwciało „wyizolowane to takie, które zostało zidentyfikowane i wydzielone i/lub odzyskane ze składników jego naturalnego otoczenia. Składniki zanieczyszczające z jego naturalnego otoczenia to materiały, które przeszkadzałyby w zastosowaniach diagnostycznych i terapeutycznych przeciwciała i mogą obejmować enzymy, hormony i inne białkowe albo niebiałkowe substancje rozpuszczone. W korzystnych wykonaniach, przeciwciało będzie oczyszczone (1) do więcej niż 95% wagowo przeciwciała przy określaniu metodą Lowry, a korzystniej więcej niż 99% wagowo, (2) do stopnia dostatecznego dla otrzymania co najmniej 15 reszt N-końcowej albo wewnętrznej sekwencji aminokwasowej poprzez zastosowanie sekwenatora wirówkowego albo (3) do homogenności poprzez SDS-PAGE w warunkach redukujących albo nie redukujących przy zastosowaniu barwienia błękitem Coomassie albo korzystniej barwienia srebrem. Wyizolowane przeciwciała obejmują przeciwciała in situ w obrębie zrekombinowanych komórek, o ile co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała nie będzie obecny. Zazwyczaj, wyizolowane przeciwciało będzie otrzymane w co najmniej jednym etapie oczyszczania.
Przeciwciało, które „wiąże się z antygenem będącym przedmiotem zainteresowania, np. antygenem ErbB2 jest takim, które ma zdolność wiązania się z antygenem z wystarczającym powinowactwem, tak że przeciwciało jest przydatne jako czynnik diagnostyczny i/lub terapeutyczny do dotarcia do komórki wyrażającej antygen i/lub nakierowanego dostarczania czynnika cytotoksycznego albo innego czynnika chemioterapeutycznego, takiego jak maitansynoid. Tam, gdzie przeciwciało jest takim, które wiąże się z ErbB2, zwykle będzie wiązać się preferencyjnie z ErbB2 w przeciwieństwie do
PL 213 213 B1 innych receptorów ErbB i może być takim, które nie reaguje znacząco z innymi białkami, takimi jak EGFR, ErbB3 lub ErbB4. W takich wykonaniach poziom wiązania się przeciwciała z tymi białkami nie będącymi ErbB2 (np. wiązania się powierzchni komórki z endogennymi receptorami) będzie wynosił mniej niż 10% co określa się poprzez analizę aktywowanego fluorescencyjnie sortowania komórek (ang. fluorescence activated cell sorting, FACS) albo radioimmunoprecypitację (RIA). Czasami, przeciwciała anty-ErbB2 nie będą znacząco reagowały krzyżowo z białkiem neu, np. jak opisano w Schecter i wsp., Nature 312:513 (1984) oraz Orebin i wsp., Nature 312:545-543 (1934).
O ile nie zaznaczono inaczej, wyrażenia „przeciwciało monoklonalne 4D5 i „monoklonalne przeciwciało 4D5 dotyczy przeciwciała, które ma reszty wiązania antygenu z albo pochodzące z mysiego przeciwciała 4D5. Przykładowym przeciwciałem monoklonalnym 4D5 może być mysie przeciwciało monoklonalne 4D5 (ATCC CRl 10463) albo jego wariant, taki jak humanizowane przeciwciało 4D5, posiadające reszty aminokwasowe wiążące antygen mysiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Przykładowe humanizowane przeciwciała 4D5 obejmują huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) jak w patencie USA nr 5,821,337, przy czym huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) jest korzystnym humanizowanym przeciwciałem 4D5.
Przeciwciało mające „właściwości biologiczne określonego przeciwciała, takiego jak monoklonalne przeciwciało oznaczone 4D5, to takie, które posiada jedną albo większą liczbę właściwości biochemicznych tego przeciwciała odróżniających je od innych przeciwciał, które wiążą się z tym samym antygenem (np. ErbB2). Przykładowo, przeciwciała o właściwościach biologicznych 4D5 mogą wykazywać efekt hamowania wzrostu wobec komórek nadprodukujących ErbB2 w sposób, który jest zależny od poziomu ekspresji ErbB2 i/lub wiążą ten sam epitop w domenie zewnątrzkomórkowej ErbB2 co 4D5 (np. które blokują wiązanie się monoklonalnego przeciwciała 4D5 z ErbB2).
Stosowane tu określenie „czynnik hamujący wzrost dotyczy związku albo kompozycji, która hamuje wzrost komórki, a w szczególności komórki nowotworowej wyrażającej ErbB in vitro bądź in vivo. A zatem czynnikiem hamującym wzrost może być taki, który znacząco zmniejsza udział procentowy komórek wyrażających ErbB w fazie S. Przykłady czynników hamujących wzrost obejmują czynniki, które blokują postęp cyklu komórkowego (w punkcje innym niż faza S), takie jak czynniki, które indukują zatrzymanie fazy Gl i M. Klasyczne czynniki blokujące fazę M obejmują czynniki winka (winkrystynę i winblastynę), taksany oraz inhibitory topo II, takie jak doksorubicyna, epirubicyna, daunorubicyna, etopozyd oraz bleomycyna. Te czynniki, które powodują zatrzymanie w fazie Gl wpływają również na zatrzymanie w fazie S, na przykład, czynniki alkilujące DNA, takie jak tamoksiten, prednizon, dakarbazyna, mechloretamina, cisplatyna, metotreksan, 5-fluorouracyl oraz ara-C. Dalsze informacje można znaleźć w The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, wyd., Rozdział 1, zatytułowany „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs autorstwa Murakami i wsp., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), a w szczególności str. 13.
Przykładami przeciwciał „hamujących wzrost są takie, które wiążą się z ErbB2 i hamują wzrost komórek nadprodukujących ErbB2. Korzystne hamujące wzrost przeciwciała anty-ErbB2 hamują wzrost komórek raka sutka SK-BR-3 w hodowli komórkowej więcej niż 20%, a korzystnie więcej niż 50% (np. od około 50% do około 100%) przy stężeniu przeciwciał od około 0,5 do 30 g/ml, gdzie hamowanie wzrostu określa się sześć dni po wystawieniu komórek SK-BR-3 na przeciwciało (patrz patent USA nr 5,677,171 opublikowany 14 października 1997). Hamowanie wzrostu komórek SK-BR-3 jest opisane bardziej szczegółowo w tym patencie i tu poniżej. Korzystnym przeciwciałem hamującym wzrost jest monoklonalne przeciwciało 4D5, np. humanizowane przeciwciało 4D5.
Cząsteczka (np. przeciwciało), które „indukuje śmierć komórki jest taką, która powoduje, że żywa komórka staje się nieżywą. Komórką jest generalnie taka, która wyraża receptor ErbB2, a w szczególności taka, która naprodukuje receptor ErbB2. Korzystne jest, jeżeli komórką jest komórka nowotworowa, np. komórka raka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu śliniankowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki, prostaty albo pęcherza. In vitro komórką może być komórka SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDAMB-453, MDA-MB-361 Iub SKDV3. Śmierć komórek można określać in vitro w nieobecności dopełniacza i efektorowej komórki immunologicznej w celu rozróżnienia śmierci komórki indukowanej przez zależną od przeciwciała cytotoksyczność z udziałem komórek (ADCC) i cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). A zatem badanie śmierci komórek można przeprowadzać przy zastosowaniu surowicy inaktywowanej termicznie (tj. w nieobecności dopełniacza) i w nieobecności immunologicznych komórek efektorowych. W celu określenia, czy cząsteczka ma zdolność do indukowania śmierci komórki, można testować utratę integralności błony, którą ocenia się
PL 213 213 B1 poprzez pobieranie jodku propidynowego (PI), błękitu trypanowego (patrz Moore i wsp., Cytotechnology 17:1-11 (1995)) oraz 7AAD w stosunku do komórek nietraktowanych. Korzystnymi przeciwciałami indukującymi śmierć komórki są takie, które indukują pobieranie PI w teście pobierania PI w komórkach BT474. Przykłady przeciwciał, które indukują śmierć komórki obejmują przeciwciała anty-ErbB2 7C2 i 7F3 (WD 98/17797, dokładnie włączone tu jako odniesienie), włączając w to ich warianty, humanizowane albo o zwiększonym powinowactwie.
Cząsteczka (np. przeciwciało), które „indukuje apoptozę to takie, które indukuje programowaną śmierć komórki, co określa się poprzez wiązanie aneksyny V, fragmentację DNA, kurczenie się komórek, rozszerzanie się siateczki endoplazmatycznej, fragmentację komórki i/lub tworzenie się pęcherzyków błonowych (zwanych ciałkami apoptotycznymi). Komórką jest zwykle taka, która nadprodukcje receptor ErbB2. Korzystne jest, jeżeli komórką jest komórka nowotworowa, np. komórka raka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu śliniankowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki, prostaty albo pęcherza. In vitro, komórką może być komórka SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDAMB-453, MDA-MB-361 lub SKDV3. Dostępnych jest wiele metod oceny zdarzeń komórkowych związanych z apoptozą. Przykładowo, można mierzyć przemieszczanie się fosfatydyloseryny (PS) poprzez wiązanie aneksyny; fragmentację DNA można oceniać poprzez obserwację drabinki DNA; kondensację jądrowo/chromatynową łącznie z fragmentacją DNA można oceniać poprzez wzrost liczby komórek hipodiploidalnych. Korzystne jest, jeżeli cząsteczką która indukuje apoptozę jest taka, która prowadzi do około 2- do 50-krotnego, korzystniej 5- do 50-krotnego, a najkorzystniej, około 10- do 50-krotnego wzrostu wiązania aneksyny w porównaniu do komórek nie traktowanych w teście wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474. Czasami cząsteczką proapoptyczną będzie taka, która blokuje ponadto aktywację przez ligand ErbB receptora ErbB. W innych sytuacjach, cząsteczką jest taka, która nie blokuje znacząco aktywacji przez ligand ErbB receptora ErbB. Ponadto, cząsteczka może indukować apoptozę bez indukowania dużego zmniejszenia udziału procentowego komórek w fazie S (np. może indukować około 0-10% zmniejszenia udziału procentowego tych komórek w stosunku do kontroli). Przykłady przeciwciał, które indukują apoptozę obejmują przeciwciała anty-ErbB2 7C2 i 7F3 (WD 98/17797, dokładnie włączone tu jako odniesienie), humanizowane albo o zwiększonym powinowactwie.
Przeciwciało, które „blokuje aktywację przez ligand receptora ErbB jest takim, które zmniejsza albo zapobiega aktywacji jak zdefiniowano powyżej, gdzie przeciwciało jest zdolne do blokowania aktywacji przez ligand receptora ErbB zasadniczo bardziej skutecznie niż monoklonalne przeciwciało 4D5, np. tak skutecznie jak monoklonalne przeciwciała 7F3 i 2C4 lub ich fragmenty Eab i korzystnie mniej więcej tak skutecznie, jak monoklonalne przeciwciało 2C4 lub ich fragmenty Fab. Przykładowo, przeciwciałem, które blokuje aktywację przez ligand receptora ErbB może być takie, które jest około 50-100% bardziej skuteczne niż 4D5 w blokowaniu tworzenia się hetero-oligomeru ErbB. Blokowanie aktywacji przez ligand receptora ErbB może nastąpić dowolną drogą np. poprzez zakłócanie wiązania ligandu z receptorem ErbB, tworzenia kompleksu ErbB, aktywności kinazy tyrozynowej receptora ErbB w kompleksie ErbB i/lub fosforylacji reszty (reszt) kinazy tyrozynowej w albo przez receptor ErbB. Przykłady przeciwciał, które blokują aktywację przez ligand receptora ErbB obejmują monoklonalne przeciwciała 2D4 i 7F3 (które blokują aktywację przez HRG hetero-oligomerów ErbB2/ErbB3 i ErbB2/ErbB4; oraz aktywację przez EGF, TGF-, amfiregulinę, HB-EGF i epiregulinę hetero-oligomeru EGFRfErbB2) oraz przeciwciała L26, L96 i L288 (Klapper i wsp., Oncogene 14:2099-2109 (1997)), które blokują wiązanie EGF i NOF z komórkami T470, które wyrażają EGFR, ErbB2, ErbB3 i ErbB4. W szczególności są tu włączone warianty humanizowane i o zwiększonym powinowactwie tych i innych przeciwciał mieszczących się w tej definicji.
Termin „epitop jest stosowany w odniesieniu do miejsc wiązania dla przeciwciał (poliklonalnych lub monoklonalnych) na białkowych antygenach.
Przeciwciała, które wiążą się z pewnym epitopem identyfikuje się poprzez „mapowanie epitopów. Istnieje wiele sposobów znanych w tej dziedzinie do mapowania i charakteryzowania położenia epitopów na białku, włączając w to ustalenie struktury krystalicznej kompleksu antygen-przeciwciało, testy współzawodnictwa, testy ekspresji fragmentów genów oraz testy w oparciu o syntetyczne peptydy, jak opisano na przykład w Rozdziale 11 z Harlow i lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Testy współzawodnictwa są dyskutowane poniżej. Według testów ekspresji fragmentów genu, otwarta ramka odczytu kodująca białko jest fragmentowana bądź losowo albo przy użyciu specyficznych konstruktów i określa się reaktywność wyrażanych fragmentów białka z przeciwciałem, które ma być testowane. Fragmenty genu
PL 213 213 B1 mogą być na przykład wywarzane poprzez PCR, a następnie ulegać transkrypcji i translacji do białka in vitro, w obecności radioaktywnych aminokwasów. Wiązanie przeciwciała z wyznakowanymi radioaktywnie fragmentami określa się następnie poprzez immunoprecypitację i elektroforezę w żelu. Niektóre epitopy można również zidentyfikować przy zastosowaniu bibliotek fagowych losowych sekwencji peptydowych prezentowanych na powierzchni cząstek fagowych (biblioteki fagowe). Alternatywnie, określoną bibliotekę zachodzących na siebie fragmentów peptydowych można testować pod kątem wiązania przeciwciała w prostych testach wiązania. To ostatnie podejście jest przydatne do definiowania liniowych epitopów o złożonych z około 5 do 15 aminokwasów.
Przeciwciało wiąże się z „zasadniczo takim samym epitopem jak przeciwciało odnośnikowe kiedy dwa przeciwciała rozpoznają identyczne albo sferycznie pasujące epitopy. Najpowszechniej stosowanymi i szybkimi sposobami określania, czy dwa epitopy wiążą się z identycznymi albo sferycznie pasującymi epitopami są testy współzawodnictwa, które można zaprojektować w różny sposób, z zastosowaniem wyznakowanego antygenu albo wyznakowanego przeciwciała. Zazwyczaj antygen jest unieruchamiany na 96-studzienkiwej płytce, a zdolność niewyznakowanych przeciwciał do blokowania wiązania wyznakowanych przeciwciał mierzy się przy zastosowaniu znaczników radioaktywnych albo enzymatycznych.
„Epitop 4D5 to region zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, do którego wiąże się przeciwciało 4D5 (A TCC CRl 10463). Epitop ten znajduje się w pobliżu transbłonowej domeny ErbB2 i rozciąga się mniej więcej od reszty 519 do reszty 625, łącznie, w obrębie sekwencji zewnątrzkomórkowej domeny zawartej w SEK ID nr: 3 na Fig. 4. W celu przeszukania przeciwciał pod kątem wiązania się z epitopem 4D5, można przeprowadzić test krzyżowego blokowania, taki jak opisany w Harlow i Lane, jak wyżej. Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopów w celu badania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 4D5 ErbB2 (np. z jedną albo większą liczbą reszt w regionie od reszty około 529 do reszty około 625, łącznie, w SEK ID nr: 3).
„Epitop 3H4 to region zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, do którego wiąże się przeciwciało 3H4. Epitop ten obejmuje reszty od około 541 do około 599, łącznie, w obrębie sekwencji aminokwasowej zewnątrzkomórkowej domeny (patrz Fig. 4 i SEK ID nr: 3).
„Epitop 7C2/7F3 to region na końcu N zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, do którego wiążą się przeciwciała 7C2 i/lub 7F3 (każdy zdeponowany jako A TCC, patrz poniżej). W celu przeszukania przeciwciał pod kątem wiązania się z epitopem 7C2/7F3 na ErbB2, można przeprowadzić test krzyżowego blokowania, taki jak opisany w Harlow i Lane, jak wyżej. Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopów w celu badania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 7C2/7F3 na ErbB2 (np. z jedną albo większą liczbą reszt w regionie od reszty około 22 do reszty około 53 ErbB2; patrz Fig. 4 i SEK ID nr: 3).
Nowotwór, który „nie odpowiada, albo odpowiada słabo na leczenie monoklonalnym przeciwciałem anty-ErbB nie wykazuje znaczącego polepszenia w odpowiedzi na traktowanie przeciwciałem anty-ErbB w porównaniu z brakiem leczenia albo traktowaniem placebo w poznanych modelach zwierzęcych albo w ludzkich testach klinicznych, albo który odpowiada na początkowe traktowanie przeciwciałami anty-ErbB, ale rośnie w trakcie kontynuowania leczenia. Szczególnie przydatnym modelem do testowania skuteczności przeciwciał anty-ErbB jest ujawniony tu zwierzęcy model transgeniczny, zilustrowany w Przykładzie 3.
Termin „leczenie albo „traktowanie odnosi się zarówno do traktowania terapeutycznego i profilaktycznego albo środków zapobiegawczych, gdzie celem jest zapobieganie albo zwolnienie (zmniejszenie) niepożądanej zmiany fizjologicznej albo choroby, takiej jak rozwój albo rozprzestrzenianie się nowotworu. Dla potrzeb tego wynalazku, korzystne albo pożądane wyniki kliniczne obejmują miedzy innymi, złagodzenie objawów, zmniejszenie zakresu choroby, stabilizację (tj. nie pogarszanie się) stanu chorobowego, opóźnienie albo zwolnienie postępów choroby, złagodzenie bólu w stanach chorobowych oraz remisję (częściową albo całkowitą), wykrywalną albo niewykrywalną. „Leczenie może również oznaczać przedłużone życie w porównaniu z oczekiwanym czasem przeżycia w przypadku braku leczenia. Potrzebujący leczenia obejmują tych, u których już występuje stan chorobowy albo choroba, jak również tych ze skłonnością do wystąpienia stanu chorobowego albo choroby albo tych, u których chce się zapobiec stanowi chorobowemu albo chorobie.
„Choroba to jakikolwiek stan chorobowy, w którym odnosi się korzyści z leczenia według niniejszego wynalazku. Obejmuje to przewlekłe i ostre choroby i schorzenia, włączając w to stany patologiczne, które predysponują ssaka do wystąpienia choroby będącej przedmiotem zainteresowania. Nie ograniczające przykłady chorób, które mogą być leczone obejmują łagodne i złośliwe guzy nowotwoPL 213 213 B1 rowe, białaczki i nowotwory limfatyczne, a w szczególności raka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu śliniankowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki, prostaty i pęcherza. Preferowane choroby dla leczenia według niniejszego wynalazku to nowotwory złośliwe, takie jak rak sutka, które naprodukują receptor ErbB (np. ErbB2 i/lub EGFR), nie odpowiadające albo odpowiadające słabo na leczenie monoklonalnym przeciwciałem wobec receptora, który jest nadprodukowany. Szczególnie preferowane choroby to rak sutka nadprodukujący receptor ErbB, który nie odpowiada, albo odpowiada słabo na leczenie HERCEPTIN®
Termin „ilość skuteczna terapeutycznie odnosi się do ilości leku skutecznej do leczenia choroby albo stanu chorobowego u ssaka. W przypadku nowotworu, skuteczna terapeutycznie ilość leku może zmniejszyć liczbę komórek nowotworowych; zmniejszyć rozmiar guza; zahamować (tj. zwolnić do pewnego stopnia, a korzystnie zatrzymać) naciekanie komórek nowotworowych do narządów obwodowych; zahamować (tj. zwolnić do pewnego stopnia, a korzystnie zatrzymać) przerzuty raka; zahamować do pewnego stopnia wzrost guza i/lub w pewnym stopniu złagodzić jeden albo więcej objawów związanych z nowotworem. W zakresie, w którym lek może zapobiegać wzrostowi i zabijać istniejące komórki nowotworowe, może być on cytostatyczny i/lub cytotoksyczny. Dla terapii nowotworów skuteczność można mierzyć na przykład poprzez badanie czasu rozwoju choroby (TTP) i/lub ustalanie szybkości odpowiedzi (RR).
Stosowany tu termin „czynnik cytotoksyczny dotyczy substancji, która hamuje albo przeciwdziała funkcji komórek i/lub powoduje zniszczenie komórek. Termin ma obejmować izotopy radioaktywne (np. At211, I131, Ι125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 oraz radioaktywne izotopy Lu), czynniki chemioterapeutyczne oraz toksyny, takie jak niskocząsteczkowe toksyny albo enzymatycznie aktywne toksyny pochodzenia bakteryjnego, roślinnego albo zwierzęcego, włączając w to ich fragmenty i/lub warianty.
„Czynnik chemioterapeutyczny to związek chemiczny przydatny w leczeniu raka. Przykłady czynników chemioterapeutycznych obejmują czynniki alkilujące, takie jak tiotepa i cyklosfosfamid (CYTOXAN™); sulfoniany alkilowe, takie jak busulfan, improsulfan i piposulfan; azyrydyny, takie jak benzodopa, karbokuon, meturedopa i uredopa; etylenoiminy i metylamelaminy, włączając w to altretaminę, trietyIomeIaminy, trietylenofosforamid, trietylenotiofosforoamid i trimetylolomelaminę; iperyty azotowe, takie jak chlorambucyl, chloronafazyma, chorofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloroetamina, chlorowodowek tlenku mechloroetaminy, melfalan, nowembichina, fenesteryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uraculowy; nitrosury, takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna, ranimustyna; antybiotyki, takie jak aklacynomyzyny, aktynomycyna, autramycyna, azaseryna, bleomycyny, kaktynomycyna, kalicheamycyna, karabicyna, karminomycyna, karzynofilina, chromomycyny, daktynomycyna, daunorubicyna, detorubicyna, 6-diazo-5-okso-L-norleucyna, doksorubicyna, epirubicyna, ezorubicyna, idarubicyna, marcelomycyna, mitomycyny, kwas mykofenolowy, nogalamycyna, oligomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, kelamycyna, rodorubicyna, streptonigryn, streptozocyna, tubercydyna, ubenimeks, zynostatyna, zorubicyna; antymetabolity, takie jak metotreksan i 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksan, pteropteryna, trimetreksan; analogi puryn, takie jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna, tioguanina; analogi pirymidyn, takie jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, karmofur, cytarabma, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabma, lioksyurydyna, 5-FU; androgeny takie jak kalusteron, propionian dromstanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; czynniki anty-adrenalgiczne, takie jak ammoglutetimid, mitotan, trilostan; dopełniacz dla kwasu foliowego, taki jak kwas frolinowy; aceglaton; glikozyd aldofosfamidu; kwas aminolewulinowy; amsakryna; bestrabucyl; bisantren; edatraksan; defofamina; demekolcyna; diazykuon; elfornityna; octan eliptynowy; etoglucyd; azotan galu; hydroksylomocznik; lentinan; lonidamina; mitoguazon; mitoxantron; mopidamoI; nitracrina; pentostatin; fenamet; pirarubicyna; kwas podofilinowy acid; 2-etylohydrazyd; prokarbazyna; PSK; razoksan; sizofiran; spirogermanium; kwas tenuazonowy; triazikon; 2,2',2'-trichlorotrietyloamina; uretan; windesyna; dakarbazyna; mannomustyna; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytozyna; arabinozyd („Ara-C); cyklofosfamid; tiotepa; taksany, np. paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) oraz doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Pouienc Rorer, Antony, France); chlorambucyl; gemcytabina; 6-tioguanina; merkaptopuryna; metotreksan; analogi platyny, takie jak cysplatyna i karboplatyna; winblastyna; platyna; etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitomycyna C; mitoksantron; winkrystyna; winorelbina; nawelbina; nowantron; tenipozyd; daunomycyna; aminopteryna; kseloda; ibandronan; CPT-11; inhibitor topoizomerazy RFS 2000; difluorometyloornityna (DMFO); kwas retynowy; esperamycyny; kapecytabina oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy albo pochodne
PL 213 213 B1 dowolnej z powyższych. Definicja ta obejmuje również czynniki przeciwhormonalne, które działają regulując albo hamując działanie hormonów na nowotwory, takie jak anty-estrogeny włączając w to na przykład tamoksifen, raloksifen, 4(5)-imidazole hamujące aromatazę, trioksifen, keoksifen, LY 117018, onapriston i toremifen (Fareston) oraz anty-androgeny, takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy albo pochodne dowolnej z powyższych.
Termin „prolek stosowany w tym zgłoszeniu dotyczy formy prekursorowej albo pochodnej aktywnej farmaceutycznie substancji, która jest mniej toksyczna wobec komórek nowotworowych w porównaniu z lekiem rodzicielskim i podlega aktywacji enzymatycznej albo przekształceniu w bardziej aktywną postać rodzicielską. Patrz, np. Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-332, 615th Meeting Belfast (1936) oraz Stella i wsp., „Prodrugs: A Chemikal Approach to Targeted Drug Delivery Directed Drug Delivery, Borchardt i wsp., (wyd.), str. 247. 267, Humana Press (1935). Proleki według tego wynalazku obejmują między innymi proleki zawierające tiofosforany, proleki zawierające siarczan, proleki zawierające peptyd, proleki ze zmodyfikowanymi D-aminokwasami, proleki glikozylowane, proleki zawierające laktam, proleki zawierające fenoksyacetamid ewentualnie podstawione albo proleki zawierające fenyloacetamid ewentualnie podstawione, 5-fluorocytozynę i inne proleki 5-fluorourydynowe, które można przekształcić w bardziej aktywne wolne leki cytotoksyczne. Przykłady leków cytotoksycznych, które można przekształcić w postać proleku do zastosowania w tym wynalazku obejmują miedzy innymi opisane powyżej czynniki chemioterapeutyczne.
Termin „kwas nukleinowy dotyczy polinukleotydów, takich jak kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) i gdzie trzeba kwas rybonukleinowy (RNA). Termin obejmuje również, jako ekwiwalenty, analogi DNA Iub wytworzone z analogów nukleotydów i, zgodnie z zastosowaniem, polinukieotydy jednoniciowe (sensowne lub antysensowne) lub dwuniciowe. „Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego to cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest zidentyfikowana i oddzielona od co najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinowego stanowiącej zanieczyszczenie, z którą występuje normalnie razem w naturalnym źródle kwasu nukleinowego. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest odmienna od postaci albo układu, w którym występuje w naturze. Wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego można zatem odróżnić od cząsteczki kwasu nukleinowego występującej w naturalnych komórkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawartą w komórkach, które wyrażają przeciwciało, gdzie na przykład cząsteczka kwasu nukleinowego jest w pozycji chromozomowej innej niż w komórkach naturalnych.
Stosowany tu termin „wektor dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą została połączona. Termin „wektor ekspresyjny obejmuje plazmidy, kosmidy lub fagi zdolne do syntetyzowania białka HER2 kodowanego przez odpowiedni zrekombinowany gen przenoszony przez wektor. Korzystnymi wektorami są te zdolne do autonomicznej replikacji i/lub ekspresji kwasów nukleinowych, do których są przyłączone. W niniejszym opisie, „plazmid i „wektor są stosowane wymiennie, jako że plazmid jest najczęściej stosowaną formą wektora.
Stosowany tu termin „transkrypcyjne elementy regulacyjne i „transkrypcyjne sekwencje regulacyjne są stosowane zamiennie i dotyczą kwasu nukleinowego, np. sekwencji DNA niezbędnych do ekspresji połączonych w sposób funkcjonalny sekwencji kodujących w organizmie danego gospodarza. Sekwencje kontrolne, które są odpowiednie na przykład dla organizmów prokariotycznych, obejmują promotor, przyłączoną funkcjonalnie sekwencję operatorową oraz miejsce wiązania rybosomu. Wiadomo, że komórki eukariotyczne wykorzystują promotory, wzmacniacze, sygnały wycinania intronów i sygnały poliadenylacji. Termin ten ma obejmować wszystkie elementy, które promują albo regulują transkrypcję, włączając w to promotory, elementy podstawowe, wymagane do podstawowego oddziaływania polimerazy RNA i czynników transkrypcyjnych, elementy po stronie 5', wzmacniacze i elementy odpowiedzi (Lewin, „Genes V (Oxford University Press, Oxford) strony 847-873). Odniesienie się tu do transkrypcyjnych elementów regulacyjnych genu albo klasy genów obejmuje zarówno cały albo nienaruszony region naturalnie występujących transkrypcyjnych elementów regulatorowych, jak i zmodyfikowane postaci transkrypcyjnych elementów regulacyjnych genu albo grupy genów. Takie zmodyfikowane postaci obejmują rearanżacje elementów, delecje samego elementu albo sekwencji zewnętrznych oraz wstawienie elementów heterologicznych. Modularna natura transkrypcyjnych elementów regulacyjnych i brak zależności funkcji od umiejscowienia w przypadku niektórych elementów regulacyjnych, takich jak wzmacniacze czyni takie modyfikacje możliwymi. Dostępnych jest wiele
PL 213 213 B1 technik do badania poszczególnych elementów regulacyjnych genów w celu określenia ich położenia i funkcji. Takie informacje można następnie zastosować jeśli to pożądane do modyfikowania elementów. Korzystne jest jednakże stosowanie nienaruszonych regionów transkrypcyjnych elementów regulacyjnych.
Termin „promotor specyficzny tkankowo oznacza sekwencję nukleotydową, która służy jako promotor, tj. reguluje ekspresję wybranej sekwencji DNA, połączonej w sposób funkcjonalny z promotorem, i która wpływa na ekspresję wybranej sekwencji DNA w specyficznych komórkach tkanki, takich jak komórki gruczołu mlecznego. W stanowiącym ilustrację wykonaniu, konstrukty genowe wykorzystujące promotory specyficzne dla gruczołu mlecznego można zastosować do preferencyjnego kierowania ekspresją białka HR2 albo fragmentu białkowego w tkance gruczołu mlecznego.
Kwas nukleinowy jest „połączony funkcjonalnie kiedy jest umieszczony w związku funkcjonalnym z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Przykładowo, DNA dla prosekwencji albo lidera sekrecyjnego jest połączony funkcjonalnie z DNA dla polipeptydu jeżeli jest wyrażany jako prebiałko, które uczestniczy w sekrecji polipeptydu; promotor albo wzmacniacz jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą jeżeli wpływa na transkrypcję sekwencji; albo miejsce wiązania rybosomu jest połączone funkcjonalnie z sekwencją kodującą jeżeli jest umieszczone tak, aby ułatwiać translację. Generalnie, „połączony funkcjonalnie oznacza, że połączone sekwencje DNA są ciągłe, a w przypadku sekwencji lidera sekrecyjnego, ciągłe i w fazie odczytu. Natomiast wzmacniacze nie muszą być ciągłe. Połączenie uzyskuje się poprzez ligację w odpowiednich miejscach restrykcyjnych. Jeżeli takie miejsca nie istnieją, stosowane są syntetyczne oligonukleotydy-adaptory albo łączniki, zgodnie z konwentcjonalną praktyką.
Termin „transfekcja dotyczy wprowadzenia kwasu nukleinowego np. wektora ekspresyjnego do komórki biorcy poprzez transfer genów za pośrednictwem kwasu nukleinowego. Stosowany tu termin „transformacja dotyczy procesu, w którym genotyp komórki jest zmieniany w wyniku pobrania przez komórkę egzogennego DNA albo RNA i na przykład transformowane komórki wyrażają zrekombinowaną postać HER2.
Stosowany tu termin „transgen dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego, która jest całkowicie albo częściowo heterologiczna, tj. obca dla transgenicznego zwierzęcia albo komórki, do której jest wprowadzona albo jest homologiczna do endogennego genu transgenicznego zwierzęcia albo komórki, do której jest wprowadzona, ale która ma być wprowadzona albo jest wprowadzona do genomu zwierzęcia w taki sposób, aby zmienić genom komórki, do której jest ona wstawiona (np. jest wstawiona w miejscu, które różni się od miejsca naturalnego genu albo jego wstawienie prowadzi do nokautu genu). Transgen może być połączony funkcjonalnie z jednym albo większą liczbą transkrypcyjnych sekwencji regulacyjnych i dowolnym innym kwasem nukleinowym, takim jak introny, który może być potrzebny dla optymalnej ekspresji wybranego kwasu nukleinowego.
A zatem, termin „konstrukt transgenu dotyczy kwasu nukleinowego, który zawiera transgen i (ewentualnie) takie sekwencje kwasu nukleinowego, jak transkrypcyjne sekwencje regulacyjne, miejsca poliadenylacji, początki replikacji, geny markerowe ltd., które mogą być przydatne do ogólnej manipulacji transgenem w celu wstawienia do genomu organizmu gospodarza.
Termin „transgeniczny jest tu stosowany jako przymiotnik dla opisania właściwości, na przykład zwierzęcia albo konstruktu niosącego transgen. Przykładowo, stosowany tu „organizm transgeniczny to dowolne zwierzę, korzystnie ssak inny niż człowiek, gdzie jedna albo większa liczba komórek zwierzęcia zawiera heterologiczny kwas nukleinowy wstawiony na drodze interwencji człowieka, na przykład poprzez techniki transgeniczne dobrze znane w tej dziedzinie. Kwas nukleinowy wprowadza się do komórki na drodze przemyślanych manipulacji genetycznych, takich jak mikrowstrzyknięcie albo iniekcja zrekombinowanym wirusem. Termin manipulacja genetyczna nie obejmuje klasycznych krzyżówek hodowlanych albo zapłodnienia in vitro, ale raczej dotyczy wprowadzania zrekombinowanej cząsteczki DNA. Cząsteczka ta może być włączana do chromosomu, albo może być pozachromozomowo replikującym się DNA. W typowych opisanych tu zwierzętach transgenicznych, transgen powoduje że komórki produkują albo nadprodukują zrekombinowaną postać białek ΗΕΡ2 będących przedmiotem zainteresowania. Terminy „linia założycielska albo „zwierzę-założyciel dotyczy tych zwierząt, które są dojrzałym produktem zarodków, do których transgen został dodany, tj. tych zwierząt, które wyrastają z zarodków, do których został wprowadzony DNA i które zostały implantowane do jednego albo większej liczby zastępczych gospodarzy.
Terminy „potomstwo i „potomstwo zwierząt transgenicznych dotyczy dowolnego spośród i całego potomstwa każdego kolejnego pokolenia wyjściowo transformowanych zwierząt. Termin „ssak
PL 213 213 B1 inny niż człowiek dotyczy przedstawicieli klasy ssaków poza ludźmi. „Ssak dotyczy dowolnego zwierzęcia zaklasyfikowanego jako ssak, włączając w to ludzi, zwierzęta udomowione i gospodarskie, zwierzęta w zoo, sportowe albo domowe, takie jak mysz, szczur, królik, świnia, owca, koza, bydło i wyższe naczelne.
Stosowany tu termin ekspresyjna „komórka, „linia komórkowa i „hodowla komórkowa są stosowane wymiennie i wszystkie te określenia obejmują potomstwo. A zatem słowa „transformant i „komórki transformanta obejmują pierwotną komórkę obiektu i hodowle z niej pochodzące niezależnie od liczby transferów. Jest również zrozumiałe, że całe potomstwo nie musi być całkowicie identyczne pod kątem zawartości DNA na skutek przemyślanych albo przypadkowych mutacji. Zmutowane potomstwo, które ma taką samą funkcję albo aktywność biologiczną jak poszukiwana przy wyjściowo stransformowanych komórkach jest również tu włączone. Tam gdzie zamierzone są inne cele, będzie to jasne z kontekstu.
„Liposom to mały pęcherzyk złożony z różnego rodzaju lipidów, fosfolipidów i/lub związków powierzchniowo czynnych, które są przydatne do dostarczania leku, takiego jak ujawnione tu przeciwciała anty-ErbB2 i fakultatywnie, czynnika chemioterapeutycznego do ssaka. Składniki liposomu są zazwyczaj zorganizowane w postaci podwójnej warstwy, podobnie jak przy organizacji lipidów w błonach biologicznych.
Termin „załączona ulotka jest użyty w odniesieniu do instrukcji zwykle zawartej w opakowaniach handlowych produktów terapeutycznych, która zawiera informację o wskazaniach, zastosowaniu, dawkowaniu, podawaniu, przeciwwskazaniach i/lub ostrzeżeniach dotyczących zastosowania takich produktów terapeutycznych.
„Kardiologiczny środek ochronny to związek albo kompozycja, która przeciwdziała albo zmniejsza zaburzenia mięśnia sercowego (tj. kardiomiopatii i/lub zastoinowej niewydolności serca) związanej z podawaniem leku, takiego jak przeciwciało anty-ErbB albo jego koniugat maitansoidowy. „Kardiologiczny środek ochronny może na przykład blokować albo zmniejszać efekt kardiotoksyczny, w którym pośredniczą wolne rodniki i/lub przeciwdziałając albo zmniejszając uszkodzenia związane ze stresem oksydacyjnym. Przykłady kardiologicznych środków ochronnych objętych niniejszym wynalazkiem obejmują chelatujący żelazo czynnik deksrazoksan (ICRF-187) (Seifert i wsp., The Annals of Pharmacotherapy 28:1 1053-1072 (1994)); czynnik obniżający poziom lipidu i/lub przeciwutleniacz, taki jak probukol (Singal i wsp., J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063 (1995)); amifostinę (ester aminotioio-2-[(3-aminopropylo)amino]etanotiolodiwodorofosforanowy) zwany również WR-2721 i jego defosforylowaną postać po pobraniu przez komórkę, zwaną WR-1065) oraz kwas S-3-(3-metyloaminopropyloamino)propylofosforotionowy (WR-151327), patrz Green i wsp., Cancer Research 54:738-741 (1994); digoksynę (Bristow, M.R. W: Bristow MR, wyd. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980)); czynniki blokujace-beta, takie jak metoprolol (Hjalmarson i wsp., Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994) oraz Shaddy i wsp., Am. Heart J. 129:197-9 (1995)); witaminę E; kwas askorbinowy (witamina C); czynniki usuwające wolne rodniki, takie jak kwas oleinianowy, kwas urosolowy i N-acetylocysteina (NAC); spinowe związki wyłapujące, takie jak alfafenylotertbutylonitron (PBN); (Paracchini i wsp., Anticancer Res. 13:1607-1612 (1993)); organiczne związki selenu, takie jak P251 (Elbesen); i temu podobne.
Szczegółowy opis
Niniejszy wynalazek opiera się na wynikach otrzymanych w nowym mysim modelu nowotworu transgenicznego pod względem HER2, w którym HERCEPTIN® albo mysie przeciwciało 4D5, z którego pochodzi HERCEPTIN® miały niewielki wpływ na wzrost guza nowotworowego. Stosując fen model do testowania skuteczności HERCEPTIN® i koniugatów HERCEPTIN®-maitansynoid, stwierdzono ku zaskoczeniu, że jakkolwiek przeszczepiony guz otrzymany z takich myszy transgenicznych nie odpowiadał na leczenie z zastosowaniem HERCEPTIN®, koniugaty HERCEPTIN®maitansynoid były wysoce skuteczne.
A zatem, niniejszy wynalazek opiera się na zastosowaniu koniugatów przeciwciało anty-ErbBmaitansynoid w leczeniu nowotworów nadprodukujących ErbB, które nie odpowiadają dobrze na leczenie przeciwciałem anty-ErbB i/lub maitansynoidem.
A. Wytwarzanie przeciwciał anty-ErbB
Opis dotyczy przykładowych technik wytwarzania przeciwciał stosowanych według niniejszego wynalazku. Wytwarzanie przeciwciał będzie zilustrowane w odniesieniu do przeciwciał anty-ErbB, ale będzie oczywiste dla specjalisty, że przeciwciała wobec innego przedstawiciela rodziny receptora SrbB można wytwarzać i modyfikować w podobny sposób.
PL 213 213 B1
Antygenem ErbB2 do zastosowania do wytwarzania przeciwciał może być np. rozpuszczalna forma zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2 albo jej cześć zawierająca pożądany epitop. Alternatywnie, do wytwarzania przeciwciał można zastosować komórki wyrażające ErbB2 na swojej powierzchni, np. komórki NIH-3T3 transformowane tak, aby nadprodukowany ErbB2; linię komórek nowotworowych, taką jak komórki SK-BR-3, patrz Stancovski i wsp., PNAS (USA) 83:8691- 3695 (1991)). Inne postaci ErbB2 przydatne do wytwarzania przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.
(i) Przeciwciała poliklonalne
Przeciwciała poliklonalne korzystnie wzbudza się w zwierzętach poprzez wielokrotne podskórne (sc) albo dootrzewnowe(ip) wstrzyknięcie odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Może być przydatne sprzężenie odpowiedniego antygenu z białkiem, które jest immunogenne w gatunkach, które mają być immunizowane, np. hemocyjaniną ze skałoczepa, albuminą z surowicy, wołową tyroglobuliną albo inhibitorem trypsyny z ziaren soi stosując czynnik bifunkcjonalny albo derywaryzujący na przykład ester maleimidobenzoylosulfosukcynoimidowy (sprzężenie poprzez reszty cysteinowe), N-hy-droksysukcynimid (poprzez reszty lizyowe), glutaraldehyd, bezwodnik bursztynianowy, SOCI2, lub R1N-CNR, gdzie R i R1 są różnymi grupami alkilowymi.
Zwierzęta immunizuje się wobec antygenu, immunogennych koniugatów albo pochodnych poprzez zmieszanie, np. 100 g lub 5 g białka albo koniugatu (dla królików i myszy, odpowiednio) z 3 objętościami kompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykniecie roztworu doskórne w wielu miejscach. Miesiąc później zwierzętom podaje się dawkę przypominającą wstrzykując doskórnie w wielu miejscach 1/5 do 1/10 wyjściowej ilości peptydu albo koniugatu w Kompletnym adiuwancie Freunda. Siedem do 14 dni później zwierzęta skrwawia się i surowice testuje pod kątem, miana przeciwciała. Zwierzętom podaje się dawki przypominające aż do osiągnięcia plateau. Korzystne jest, jeżeli zwierzętom podaje się dawkę przypominającą z koniugatem tego samego antygenu, ale sprzężonym z różnymi białkami i/lub poprzez inny czynnik łączący krzyżowo. Koniugaty można również wytwarzać w zrekombinowanych hodowlach komórkowych jako fuzje białkowe. Ponadto, czynniki agregujące, takie jak ałun są odpowiednie do zastosowania do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej.
(ii) Przeciwciała monoklonalne
Przeciwciała monoklonalne otrzymuje się z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała stanowiące populację są identyczne z wyjątkiem możliwych występujących naturalnie mutacji, które mogą być obecne w niewielkiej liczbie. A zatem określenie „monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała jako nie będącego mieszaniną odrębnych przeciwciał.
Przykładowo, monoklonalne przeciwciała można wytworzyć stosując metodę hybrydom opisaną po raz pierwszy przez Kohler i wsp., Nature, 256:495 (1975), albo można wytwarzać metodami rekombinowania DNA (patent USA nr 4, 816,567).
W metodzie hybrydomy, mysz albo inne odpowiednie zwierzę będące gospodarzem, takie jak chomik, immunizuje się jak opisano powyżej w celu wzbudzenia limfocytów, które wytwarzają albo są zdolne do wytwarzania przeciwciał wiążących się specyficznie z białkiem zastosowanym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Limfocyty można następnie poddać fuzji z komórkami szpiczaka stosując odpowiedni czynnik powodujący fuzję, taki jak glikol polietylenowy do wytwarzania komórek hybrydomy (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986).
Utworzone w ten sposób komórki hybrydomy wysiewa się i hoduje na odpowiedniej pożywce hodowlanej, która korzystnie zawiera jedną albo większą liczbę substancji, które hamują wzrost i przeżycie nie poddanych fuzji rodzicielskich komórek szpiczaka. Przykładowo, jeśli w rodzicielskim szpiczaku brak jest enzymu fosforybozylotransferazy hipokantyno-guaninowej (HGPRT or HPRT), pożywka hodowlana dla hybrydom zwykle zawiera hipoksantynę, aminopterynę oraz tymidynę (pożywka HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek z brakiem HGPRT.
Korzystnymi komórkami szpiczaka są takie, które podlegają fuzji wydajnie, utrzymują stabilny poziom wytwarzania przeciwciała przez wybrane komórki wytwarzające przeciwciało i są wrażliwe na pożywkę, taką jak HAT. Wśród nich, korzystnymi liniami komórkowymi szpiczaka, są linie mysiego szpiczaka, takie jak te pochodzące z mysich nowotworów MOPC-21 i MPC-11 dostępnych z Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA oraz komórki SP-2 lub X63-Ag8-653 dostępne z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Zostały również opisane komórki ludzkiego szpiczaka i linie komórkowe mysio-ludzkiego heretoszpiczaka do wytwarzania Iudzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984) oraz Brodeur i wsp., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
PL 213 213 B1
Pożywki hodowlane, w których hoduje się komórki, testuje się pod kątem wytwarzania monoklonalnych przeciwciał skierowanych wobec antygenu. Korzystne jest, jeżeli specyficzność wiązania monoklonalnych przeciwciał wytwarzanych przez komórki hybrydomy określa się poprzez immunoprecypitację albo test wiązania in vitro, taki jak test radioimmunologiczny (RIA) albo enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA).
Powinowactwo wiązania monoklonalnych przeciwciał można następnie określić poprzez analizę Scatchard według Munson i wsp., Anal. Blochem, 107:220 (1980).
Po zidentyfikowaniu komórek hybrydomy, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klon można subklonować poprzez procedurę ograniczonych rozcienczeń i hodować według standardowych metod (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986). Odpowiednie pożywki hodowlane do tych celów obejmują na przykład pożywkę, D-MEM lub pożywkę RPMI-1640. Ponadto komórki hybrydomy można hodować in vivo w nowotworach puchlinowych u zwierząt.
Monoklonalne przeciwciała wydzielane przez subklony dogodnie jest wydzielać z pożywki hodowlanej, płynów puchlinowych albo surowicy poprzez konwencjonalne procedury oczyszczania przeciwciał, takie jak na przykład chromatografię na białku A-Sepharose, hydroksyloapatycie, elektroforezę w żelu, dializę albo chromatografię powinowactwa.
DNA kodujący monoklonalne przeciwciała można łatwo wyizolować i zsekwencjonować stosując konwencjonalne procedury (np. poprzez zastosowanie sond oligonukleotydowych, które mają zdolność wiązania się specyficznie z genami kodującymi lekkie i ciężkie łańcuchy mysich przeciwciał). Komórki hybrydomy służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu, DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, które przenosi się następnie do komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (ang. Chinese Hamster Ovary, CHO) lub komórki szpiczaka, które w innym przypadku nie wytwarzają przeciwciała, w celu otrzymania syntezy przeciwciał monoklonalnych w zrekombinowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe na temat rekombinowanej ekspresji w bakterii DNA kodującego przeciwciała obejmują Skerra i wsp., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993) oraz Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
W dalszym wykonaniu, monoklonalne przeciwciała albo fragmenty przeciwciał można izolować z przeciwciałowych bibliotek fagowych wytworzonych przy zastosowaniu technik opisanych w McCafferty i wsp., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson i wsp., Nature, 352:624-628 (1991) oraz Marks i wsp., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) opisują izolację przeciwciał mysich i ludzkich, odpowiednio, przy zastosowaniu bibliotek fagowych. Kolejne publikacje opisują wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (rzędu nM) (Marks i wsp., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), jak również kombinatorycznej infekcji i rekombinacji in vivo jako strategii konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i wsp., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). A zatem techniki te stanowią atrakcyjną alternatywę wobec tradycyjnych technik hybrydom monoklonalnych przeciwciał do izolacji przeciwciał monoklonalnych.
DNA można również modyfikować na przykład poprzez podstawienie sekwencji kodującej domen stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich (patent USA nr 4,816,567 oraz Morrison, i wsp., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) albo poprzez połączenie kowalencyjne sekwencji kodujących immunoglobulinę, całych albo części, z sekwencją kodującą polipeptydu innego niż immunoglobulina.
Typowo, takim polipeptydem innym niż immunoglobulina zastępuje się domeny regionu stałego przeciwciała, albo zastępuje się zmienne miejsca wiązania antygenu w celu wytworzenia chimerowego biwalencyjnego przeciwciała zawierającego jedno miejsce wiązania antygenu mające specyficzność wobec antygenu i inne miejsce wiążące antygen mające specyficzność wobec odmiennego antygenu.
Przeciwciała humanizowane
Sposoby humanizowania przeciwciał innych niż ludzkie zostały opisane w tej dziedzinie. Korzystne jest, jeżeli humanizowane przeciwciało ma wprowadzoną jedną albo większą liczbę reszt ze źródła innego niż człowiek. Te reszty aminokwasowe inne niż ludzkie są często określane jako reszty „zaimportowane”, które są typowo wzięte z „zaimportowanej” domeny zmiennej. Humanizację można zasadniczo przeprowadzić według metody Winter i współpracowników (Jones i wsp., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann i wsp., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen i wsp., Science, 239: 1534-1536 (1988), poprzez zastąpienie sekwencji regionu hiperzmiennego odpowiadającymi im
PL 213 213 B1 sekwencjami ludzkimi. A zatem takimi przeciwciałami „humanizowanymi są przeciwciała chimerowe (Patent USA nr 4,816,567), gdzie zasadniczo mniej niż nienaruszona ludzka domena zmienna została zastąpiona odpowiednią sekwencją z gatunku innego niż człowiek. W praktyce, humanizowanymi przeciwciałami są typowo przeciwciała ludzkie, w których niektóre reszty z regionu hiperzmiennego i możliwe niektóre reszty FR są zastąpione resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.
Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno lekkiej, jak i ciężkiej, która ma być zastosowana do wytwarzania humanizowanych przeciwciał jest bardzo ważna dla zmniejszenia antygenności. Według tak zwanej metody „najlepszego dopasowania sekwencje domeny zmiennej przeciwciała gryzonia przeszukuje się wobec całej biblioteki znanych ludzkich sekwencji ludzkiej domeny zmiennej. Ludzka sekwencja, która jest najbliższa tej z gryzoni jest następnie zaakceptowana jako ludzki region zrębowy (FA) dla humanizowanego przeciwciała (Sims i wsp., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia i wsp., J. Mol Biol, 196:901 (1937)). Inne metody stosują konkretny region zrębowy pochodzący z sekwencji najwyższej zgodności wszystkich ludzkich przeciwciął z danej podgrupy łańcuchów lekkich i ciężkich. Ten sam region zrębowy może być zastosowany dla kilku różnych przeciwciał humanizowanych (Carter i wsp., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta i wsp., J. Immunol, 151:2623 (1993)).
Ważne jest ponadto, żeby przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa do antygenu i innych korzystnych właściwości biologicznych. Aby osiągnąć ten cel według korzystnych metod humanizowane przeciwciała wytwarza się poprzez przeprowadzenie analizy sekwencji rodzicielskich i różnych zaprojektowanych produktów humanizowanych przy użyciu trójwymiarowych modeli sekwencji rodzicielskich i humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i są znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, które ilustrują i pokazują możliwe trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych kandydatów dla sekwencji immunoglobulin. Badanie tych obrazów umożliwia analizę prawdopodobnej roli reszt w funkcjonowaniu sekwencji immunoglobuliny-kandydata, tj. analizę reszt, które wpływają na zdolność immunoglobuliny-kandydata do wiązania się ze swoim antygen. W ten sposób można wybrać reszty FR i połączyć sekwencje biorcy i zaimportowane, uzyskując pożądane właściwości przeciwciała, takie jak zwiększone powinowactwo do docelowych antygenu(ów). Generalnie, reszty regionu hiperzmiennego mają bezpośredni i najbardziej znaczący wpływ na wiązanie antygenu.
Przykład 1 poniżej opisuje wytwarzanie przykładowego humanizowanego przeciwciała antyFrbB2. Humanizowane przeciwciało może na przykład zawierać inne niż ludzkie reszty regionu hiperzmiennego włączone do ludzkiej zmiennej domeny ciężkiej i może zawierać ponadto podstawienie w regionie zrębowym (FR) w pozycji wybranej z grupy składającej się z 69H, 71H i 73H stosując system numeracji domeny zmiennej przedstawiony w Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MO (1991). W jednym z wykonań humanizowane przeciwciało zawiera podstawienia w FR w dwóch albo wszystkich pozycjach spośród 69H, 71H i 73H.
Różne postaci humanizowanych przeciwciał są brane pod uwagę. Przykładowo, humanizowanym przeciwciałem może być fragment przeciwciała, taki jak Fab. Alternatywnie, humanizowanym przeciwciałem może być przeciwciało nienaruszone, takie jak nienaruszone przeciwciało IgG1.
(iv) Przeciwciała ludzkie
Alternatywą dla humanizowania może być wywarzenie ludzkich przeciwciał. Przykładowo, możliwe jest obecnie wytwarzanie transgenicznych zwierząt (np. myszy), które są zdolne po immunizacji do wytwarzania pełnego repertuaru ludzkich przeciwciał w nieobecności wytwarzania endogennych immunoglobulin. Przykładowo, opisano, że homozygotyczna delecja regionu łącznikowego łańcucha ciężkiego (JH) przeciwciała w mutancie chimerowym i w linii płciowej myszy prowadzi do całkowitego zahamowania wytwarzania endogennych przeciwciał. Przeniesienie ludzkiego układu genów z ludzkiej linii płciowej do takiego mutanta w linii płciowej myszy będzie prowadziła do wytwarzania Iudzkich przeciwciał po prowokacji antygenem. Patrz np. Jakobovits i wsp., Proc. Natl Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits i wsp., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann i wsp., Year In Immuno., 7:33 (1993) oraz Patent USA nr 5,591,669, 5,589,369 i 5,545,807. Alternatywnie można zastosować technologię prezentacji na fagach (McCafferty i wsp., Nature 348:552-553 (1990)) do wytwarzania ludzkich przeciwciał i fragmentów przeciwciał in vitro z repertuaru genów dla domen zmiennych (V) immunoglobulin z nie immunizowanych donorów. Według tej techniki, geny dla domeny V przeciwciała klonuje się w ramce w genie bądź większego bądź mniejszego białka płaszcza nitkowatego bakteriofaga, takiego jak M 13 lub fd, i prezentuje jako funkcjonalne fragmenty przeciwciał na powierzchni cząstki fagowej. Ponieważ nitkowata cząstka zawiera jednoniciową kopię DNA genomu fagowego, selekcja
PL 213 213 B1 oparta o funkcjonalne własności przeciwciała prowadzi również do wyboru genu kodującego przeciwciało wykazujące te właściwości. A zatem, fag imituje niektóre właściwości komórek 3. Prezentacje na fagu można przeprowadzać w różny sposób, dla dokonania ich przeglądu patrz np. Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Do prezentacji na fagach można użyć kilka źródeł segmentów genu V. Clackson i wsp., Nature, 352:624-628 (1991) wyizolowali różne zestawy przeciwciał anty-oksazolon z małej losowej biblioteki kombinatorycznej genów V pochodzących ze śledzion immunizowanych myszy. Można skonstruować repertuar genów V z nie immunizowanych ludzkich dawców i przeciwciała wobec różnego zestawu antygenów (włączając w to antygeny własne) można wyizolować zasadniczo według technik opisanych przez Marks i wsp., J. Mol Biol 222:5B1-597 (1991) lub Griffith i wsp., FMBO J. 12:725-734 (1993). Patrz także patenty USA nr 5,565,332 i 5,573,905.
Jak dyskutowano powyżej, ludzkie przeciwciała mogą być również wytwarzane przez aktywowane in vitro komórki B (patrz, patenty USA nr 5,567,610 i 5,229,275).
Ludzkie przeciwciała anty-ErbB2 są opisane w patencie USA nr 5,772,997 wydanym 30 czerwca, 1998 i WO 97100271 opublikowanym 3 stycznia, 1997.
(v) Fragmenty przeciwciał
Opracowano różne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał. Tradycyjnie, fragmenty te pochodziły z proteolitycznego trawienia nienaruszonych przeciwciał (patrz np. Morimoto i wsp., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) oraz Brennan i wsp., Science, 229:81 (1985)). Jednakże fragmenty te mogą być obecnie wytwarzane bezpośrednio przez zrekombinowane komórki gospodarza. Przykładowo, fragmenty przeciwciał można izolować z przeciwciałowych bibliotek fagowych dyskutowanych powyżej. Alternatywnie, fragmenty Fab'-SH można odzyskiwać bezpośrednio z E. coli i łączyć chemicznie w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2 (Carter i wsp., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Według innego podejścia fragmenty F(ab')2 można izolować bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek. Inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla wykonawcy-specjalisty. W innych wykonaniach, przeciwciałem z wyboru jest jednołańcuchowy fragment Fv (scFv). Patrz WD 93/16185; Paten: USA nr 5,571,894; Patent USA nr 5,5B7,458. Fragmentem przeciwciała może być również „przeciwciało liniowe, np. jak opisano w patencie USA nr 5,641,870. Takie liniowe fragmenty przeciwciała mogą być monospecyficzne albo bispecyficzne.
(vi) Przeciwciała bispecyficzne
Przeciwclałami bispecyficznymi są przeciwciała, które wykazują specyficzność wiązania wobec co najmniej dwóch różnych epitopów. Przykładowe przeciwciała bispecyficzne mogą wiązać się z dwoma różnymi epitopami białka FrbB2. Inne takie przeciwciała mogą zawierać kombinację miejsca wiązania ErbB2 z miejscem(ami) wiązania dla EGFR, ErbB3 i/lub ErbB4. Alternatywnie, ramię antyErbB2 może być połączone z ramieniem, które wiąże się z cząsteczką przełącznikową na leukocycie T, taką jak cząsteczka receptora komórki T (CD2 lub CD3), albo receptorami Fc dla IgG (Fc R), takimi jak FcRI (CD64), Fc RII (CD32) i Fc RIII (CD16), tak aby skupić komórkowe mechanizmy obronne na komórkach wyrażających ErbB2. Przeciwciała bispecyficzne można również zastosować do kierowania czynników cytotoksycznych do komórek wyrażających FrbB2. WO 96/16673 opisuje bispecyficzne przeciwciało antyErbB2/anty-Fc R III, a patent USA nr 5,837,234 ujawnia bispecyficzne przeciwciało anty-ErbB2/anty-Fc RI. Bispecyficzne przeciwciało anty-ErbB2/Fc jest pokazane w WO 98/02463. Patent USA nr 5,821,337 przedstawia bispecyficzne przeciwciała anty-ErbB2 i anti-C03.
Sposoby wytwarzania przeciwciał bispecyficznych są znane w tej dziedzinie. Tradycyjne wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał pełnej długości opiera sie na jednoczesnej ekspresji dwóch lekkich i ciężkich łańcuchów immunoglobuliny, gdzie te dwa łańcuchy mają różne specyficzności (Millstein i wsp., Nature, 335:537-539 (1983)). Dzięki losowemu doborowi łańcuchów lekkich i ciężkich, hybrydomy te (kwadromy) wytwa rzają potencjalnie mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna ma prawidłową strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie prawidłowej cząsteczki , które zwykle wykonuje się poprzez etapy oczyszczania przez powinowactwo jest raczej kłopotliwe, a wydajność produktów niska. Podobne procedury są ujawnione w WO 93/08829 i Traunecker i wsp., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). W różnych podejściach domeny zmienne przeciwciała z pożądanymi specyficznościami wiązania (miejsca połączenia przeciwciało-antygen) łączy się z sekwencjami domen stałych immunoglobuliny, zawierającymi co najmniej część regionu zawiasowego, CH2 i CH3. Korzystne jest posiadanie pierwszego regionu stałego łańcucha ciężkiego (CH1) zawierającego miejsce niezbędne do wiązania łańcucha lekkiego, obecnego w co najmniej jednej
PL 213 213 B1 z fuzji. DNA kodujący fuzję łańcucha ciężkiego immunoglobuliny i jeżeli to pożądane, łańcuch lekki immunoglobuliny, wstawia się do odrębnych wektorów ekspresyjnych i przeprowadza kotransfekcję do odpowiedniego organizmu gospodarza. To daje dużą elastyczność w dobieraniu wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych w wykonaniach, tam gdzie stosowanie nierównych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych przy konstrukcji dostarcza optymalnych wydajności. Możliwe jest jednakże wstawienie sekwencji kodujących dla dwóch albo wszystkich trzech łańcuchów polipeptydowych do jednego wektora ekspresyjnego, kiedy ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach prowadzi do wysokich wydajności lub kiedy stosunki nie mają szczególnego znaczenia.
Przy tym podejściu w korzystnym wykonaniu bispecyficzne przeciwciała składają się z hybrydowego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny z pierwszą specyficznością wiązania w jednym ramieniu i hybrydowej pary łańcuchów lekkich immunoglobuliny (dostarczającego drugiej specyficzności wiązania) w drugim ramieniu. Stwierdzono, że ta niesymetryczna struktura ułatwia rozdzielenie pożądanych bispecyficznych składników od niepożądanej kombinacji łańcuchów immunoglobulinowych, ponieważ obecność łańcucha lekkiego immunoglobuliny tylko w jedynej połowie bispecyficznej cząsteczki dostarcza łatwego sposobu rozdziału. Podejście to jest ujawnione w WO 94/04690. Dla daIszych szczegółów wytwarzania bispecyficznych przeciwciał, patrz na przykład, Suresh i wsp., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
Według innego podejścia opisanego w patencie USA nr 5,731,168 miejsce styku pomiędzy parą cząsteczek przeciwciała można poddać manipulacjom, tak aby zmaksymalizować udział procentowy heterodimerów, które odzyskuje się z hodowli zrekombinowanych komórek. Korzystne miejsce styku obejmuje co najmniej część domeny stałej CH3 przeciwciała. W tej metodzie, jeden albo więcej małych bocznych łańcuchów aminokwasowych z miejsca styku w pierwszej cząsteczce przeciwciała zastępuje się dłuższym i łańcuchami bocznymi (np. tyrozyną albo tryptofanem). Kompensujące „zagłębienia o ide ntycznych albo podobnych rozmiarach co duży łańcuch(y) boczny(e) wytwarza się w miejscu styku w drugiej cząsteczce przeciwciała poprzez zastąpienie dużego aminokwasowego łańcucha bocznego mniejszym (np. alaniną albo treoniną). Dostarcza to mechanizmu dla zwiększenia wydajności heterodimeru w stosunku do niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery.
Techniki wytwarzania przeciwciał bispecyficznych z fragmentów przeciwciał zostały również opisane w literaturze. Przykładowo, bispecyficzne przeciwciała można wytwarzać przy zastosowaniu połączeń chemicznych. Brennan i wsp., Science, 229: 81(1985) opisują procedurę, gdzie nienaruszone przeciwciała są cięte proteolitycznie w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2. Fragmenty te redukuje się w obecności czynnika kompleksującego ditiol, arseninu sodowego, w celu stabilizacji sąsiadujących ditioli i zapobiegania tworzeniu się wewnątrzcząsteczkowych mostków siarczkowych. Wytworzone fragmenty Fab' przekształca się następnie do pochodnych tionitrobenzoesanowych (TNB). Jedna z pochodnych Fab'-TNB jest następnie z powrotem przekształcana do Fab'-tiol poprzez redukcję merkaptoetyloaminą i jest mieszana z ekwimolarną ilością innej pochodnej Fafr-ΤΝΒ w celu wytworzenia przeciwciała bispecyficznego. Wytworzone przeciwciała bispecyficzne można zastosować jako czynniki do wybiórczego unieruchamiania enzymów.
Ostatnie postępy ułatwiły bezpośrednie odzyskiwanie z E. coli fragmentów Fab'-SH, które można łączyć chemicznie z wytworzeniem przeciwciał bispecyficznych. Shalaby i wsp., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisują wytwarzanie całkowicie humanizowanej bispecyficznej cząsteczki przeciwciała F(ab')2. Każdy fragment Fab' był oddzielnie wydzielany z E.coli i poddany bezpośredniemu połączeniu chemicznemu in vitro z wytworzeniem przeciwciała bispecyficznego. Powstałe w fen sposób przeciwciało bispecyficzne miało zdolność wiązania się z komórkami wyrażającym i receptor ErbB2 i normalnymi ludzkimi komórkami T, jak również do włączania aktywności litycznej ludzkich cytotoksycznych limfocytów wobec ludzkich nowotworów sutka stanowiących cel.
Opisano także różne techniki wytwarzania i izolowania fragmentów przeciwciał bispecyficznych bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek. Przykładowo, wytworzono bispecyficzne przeciwciała przy zastosowaniu suwaków leucynowych. Kosteiny i wsp., J. Immunol, 148(5):1547-1553 (1992). Peptydy z suwakiem leucynowym z białek Fos i Jun przyłączono do części Fab' dwóch różnych przeciwciał poprzez fuzję genową. Homodimery przeciwciała zredukowano w regionie zawiasowym w celu utworzenia monomerów, a następnie powtórnie utleniono w celu wytworzenia heterodimerów przeciwciała. Metodę tą można również stosować do wytwarzania homodimerów przeciwciała. Technologia „diciała opisana przez Hollinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:6444-6448 (1993)
PL 213 213 B1 dostarczyła alternatywnego mechanizmu wytwarzania bispecyficznych fragmentów przeciwciał. Fragmenty te zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) poprzez łącznik, który jest zbyt krótki, aby umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha. A zatem, domeny VH i VL jednego fragmentu są zmuszone do tworzenia par z komplementarnymi domenami VL I VH innego fragmentu, tworząc w ten sposób dwa miejsca wiązania antygenu. Doniesiono również o innej strategii wytwarzania bispecyficznych fragmentów przeciwciał poprzez zastosowanie dimerów pojedynczego łańcucha Fv (sFv). Patrz Gruber i wsp., J. Immunol, 152:5368 (1994).
Bierze się również pod uwagę możliwość zastosowania przeciwciała z więcej niż dwiema walencyjnościami. Przykładowo, można wytworzyć przeciwciała trójspecyficzne. Tutt i wsp., J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) Inne modyfikacje sekwencji aminokwasowej
Bierze się pod uwagę modyfikację(e) sekwencji aminokwasowej opisanych tu przeciwciał antyErbB2. Przykładowo, może być pożądane zwiększenie powinowactwa wiązania i/lub innych właściwości biologicznych przeciwciała. Warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała anty-ErbB2 wytwarza się poprzez wprowadzenie odpowiednich zmian nukleotydowych do kwasu nukleinowego przeciwciała anty-ErbB2 albo poprzez syntezę peptydów. Iakie modyfikacje obejmują na przykład delecje i/lub wstawienia i/lub podstawienia reszt w obrębie sekwencji aminokwasowych przeciwciała ErbB2. Wykonuje się dowolną kombinację delecji, wstawienia i podstawienia aby uzyskać ostateczny konstrukt, przy założeniu, że ten ostateczny produkt ma pożądane właściwości. Zmiany aminokwasowe mogą również zmieniać potranslacyjną obróbkę przeciwciała anty-ErbB2, taką jak zmiana liczby i pozycji miejsc glikozylacji.
Przydatną metodą identyfikacji pewnych reszt lub regionów przeciwciała anty-ErbB2, które są korzystnymi miejscami dla mutagenezy jest tak zwana „alaninowa mutageneza skaningowa jak opisano przez Cunningham i Wells, Science, 244:1081-1085 (1939). W tym przypadku, identyfikuje się resztę albo grupę reszt docelowych (np. reszty naładowane, takie jak arg, asp, his, Iys i glu) i zastępuje aminokwasami obojętnymi albo naładowanymi ujemnie (najkorzystniej alaniną albo polialaniną) w celu wywarcia wpływu na oddziaływanie aminokwasów z antygenem ErbB2. Pozycje aminokwasowe wykazujące wrażliwość funkcjonalną na podstawienia dalej są badane poprzez wprowadzenie dalszych albo innych wariantów w miejscu albo zamiast podstawienia. A zatem, jakkolwiek miejsce do wprowadzenia wariantu sekwencji aminokwasowej jest wstępnie określane, natura mutacji jako taka nie musi być wstępnie określana. Przykładowo, w celu przeanalizowania efektów mutacji w danym miejscu, przeprowadza się mutagenezę skaningową z ala lub losową w miejscu docelowego kodonu albo regionu i wyrażone warianty przeciwciała anty-ErbB2 przeszukuje się pod kątem pożądanej aktywności.
Wstawienia sekwencji aminokwasowej obejmują amino- i/lub karboksykońcowe fuzje o długości w zakresie od jednej reszty do polipeptydów zawierających setkę lub więcej reszt, jak również wstawienia w obrębie sekwencji pojedynczych albo wielu reszt aminokwasowych. Przykłady końcowych wstawień obejmują przeciwciało anty-ErbB2 z N-końcową resztą metionylową albo przeciwciała połączone z polipeptydem cytoplazmatycznym. Inne warianty cząsteczki przeciwciała anty-ErbB2 ze wstawieniami obejmują dołączenie na końcu N albo C przeciwciała anty-ErbB2 enzymu (np. dla ADEPT) albo polipeptydu, który zwiększa okres półtrwania przeciwciała w surowicy.
Innym typem wariantu jest wariant z podstawieniem aminokwasowym. Warianty te mają co najmniej jedną resztę aminokwasową w cząsteczce przeciwciała anty-ErbB2 zastąpioną przez inną resztę. Miejsca najbardziej interesujące z punktu widzenia mutagenezy z podstawieniami obejmują regiony hiperzmienne, ale rozważa się również zmiany w FR. Konserwatywne podstawienia są przedstawione w Tabeli 1 pod nagłówkiem „korzystne podstawienia. Jeżeli takie podstawienia prowadzą do zmiany w aktywności biologicznej, wówczas można wprowadzać bardziej zasadnicze zmiany określone jako „przykładowe podstawienia w Tabeli 1 albo jak opisano dalej poniżej w odniesieniu do klas aminokwasów, i produkty poddawać analizie.
PL 213 213 B1
T a b e l a 1
Wyjściowe reszty Przykładowe podstawienia Korzystne podstawienia
Ala (A) val; Ieu; ile val
Arg (R) Iys; gln; asn Iys
Asn(N) gln; his; asp; Iys; arg gln
Asd(D) gIu; asn glu
Cys(C) ser; aIa ser
Gin (O) asn; gIu asn
Glu (E) asp; gln asp
Gly (G) Ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucyna leu
Leu (L) norleucyna; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) Ieu; phe; ile Ieu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P) Ala ala
Ser (S) Thr thr
Tnr (T) Ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; Ieu; met; phe; ala; norleucine Ieu
Zasadnicze modyfikacje we właściwościach biologicznych przeciwciał uzyskuje się poprzez dobranie podstawień, które różnią się znacząco wpływem na utrzymywanie się (a) struktury szkieletu polipeptydowego w obszarze podstawienia, na przykład konformacji płaskiej albo heliakalnej, (b) ładunku albo hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym lub (c) wielkości łańcucha bocznego. Występujące naturalnie reszty dzieli się na grupy w oparciu o wspólne właściwości łańcuchów bocznych.
(1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile;
(2) obojętne hydrofilowe: cys, ser, thr;
(3) kwaśne: asp, glu;
(4) zasadowe: asn, gln, his, lys, arg;
(5) reszty, które wpływają na orientację łańcucha: gly, pro; oraz (6) aromatyczne: trp, tyr, phe.
Niekonserwatywne podstawienia będą polegały na wymianie przedstawiciela jednej z tych klas na inną klasę.
Można również zastąpić dowolną resztę cysteinową nie uczestniczącą w utrzymywaniu prawidłowej konformacji przeciwciała anty-ErbB2, generalnie seryną, w celu polepszenia stabilności oksydacyjnej cząsteczki i zapobieganiu nieprawidłowym połączeniom krzyżowym. Odwrotnie, do przeciwciała można dodawać wiązanie (a) cysteinowe dla zwiększenia stabilności (szczególnie wtedy, gdy przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fv).
PL 213 213 B1
Szczególnie korzystny typ wariantu z podstawieniem obejmuje podstawienie jednego albo większej liczby reszt regionu hiperzmiennego przeciwciała rodzicielskiego (np. przeciwciała humanizowanego albo ludzkiego). Generalnie, otrzymany w rezultacie wariant(y) wybierane do dalszych badań będą miały polepszone właściwości biologiczne w stosunku do przeciwciał rodzicielskich, z których zostały wytworzone. Dogodny sposób wytwarzania takich wariantów z podstawieniami obejmuje powinowactwo dojrzewania przy zastosowaniu prezentacji na fagach. W skrócie, kilka miejsc w regionach hiperzmiennych (np. 6-7 miejsc) mutuje się w celu wytworzenia wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych w każdym miejscu. Wytworzone w ten sposób warianty przeciwciała prezentuje się w sposób monowalencyjny na cząstkach fagów nitkowatych jako fuzje z produktem genu III M13 zapakowanym w każdej cząstce. Warianty prezentowane na fagu przeszukuje się następnie pod kątem aktywności biologicznej (np. powinowactwa wiązania) jak tu ujawniono. W celu zidentyfikowania miejsc regionu zmiennego będących kandydatami na modyfikację, przeprowadza się alaninową mutagenezę skaningową w celu zidentyfikowania reszt regionu biorących znaczący udział w wiązaniu antygenu. Alternatywnie, albo dodatkowo, może być korzystna analiza struktury krystalicznej kompleksu antygen-przeciwciało w celu zidentyfikowania miejsc styku pomiędzy przeciwciałem i ludzkim ErbB2. Takie reszty na styku lub sąsiadujące są kandydatami na podstawienia zgodnie z omówionymi tu technikami. Po wytworzeniu takich wariantów, zestawy wariantów poddaje się przeszukiwaniu jak tu opisano i przeciwciała o lepszych właściwościach w jednym albo większej liczbie odpowiednich testów można wybrać do dalszych badań.
Może być pożądane zmodyfikowanie przeciwciał według wynalazku pod względem funkcji efektorowej, np. tak, aby zwiększyć zależną od antygenu cytotoksyczność z udziałem komórek (ADCC) albo zależną od dopełniacza cytotoksyczność (CDC) przeciwciała. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie jednego albo większej liczby podstawień aminokwasowych w regionie Fc przeciwciała. Alternatywnie, albo dodatkowo, można wprowadzić resztę(y) cysteinowe w regionie Fc, umożliwiając w ten sposób tworzenie się międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych w tym regionie. Wytworzone w ten sposób przeciwciało homodimerowe ma zwiększoną zdolność internalizacji i/lub zwiększoną zdolność zabijania komórek z udziałem dopełniacza i zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). Patrz Caron i wsp., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) oraz Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Przeciwciała homodimerowe ze zwiększoną aktywnością przeciwnowotworową można również wytworzyć przy zastosowaniu heterobifunkcjonalnych łączników, jak opisano w Wolff i wsp., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternatywnie, można skonstruować przeciwciało, które ma podwójny region Fc, a zatem może wykazywać zwiększoną lizę z udziałem dopełniacza i wzmocnione zdolności ADCC. Patrz Stevenson i wsp., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
W celu zwiększenia okresu półtrwania przeciwciała w surowicy, do przeciwciała można włączyć „epitop ratunkowy jak na przykład opisano w patencie USA 5,739,277. Stosowany tu termin „ratunkowy epitop wiążący się z receptorem dotyczy epitopu w regionie Fc cząsteczki IgG (np. IgG IgGz, IgG3, lub IgG), który jest odpowiedzialny za zwiększenie okresu półtrwania cząsteczki IgG in vivo w surowicy.
(viii) Warianty glikozylacji
Przeciwciała są glikozylowane w konserwowanych pozycjach regionów stałych (Jefferis i Lund, Chem. Immunol. 65:111-128 [1997]; Wright i Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]). Oligosacharydowe łańcuchy boczne immunoglobulin wpływają na funkcję białka Boyd i wsp., Mol. Immunol 32:1311-1318 [1996]; Wittwe i Howard, Biochem. 29:4175-4180 [1990]) oraz wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania pomiędzy częściami glikoproteiny, co może wpływać na konformację i prezentowaną trójwymiarową powierzchnię glikoproteiny (Hefferis i Lund, jak wyżej; Wyss i Wagner, Current Opin. Biotech. 1:409-416 (1996)). Oligosacharydy mogą również służyć do kierowania danej glikoproteiny do pewnych cząsteczek w oparciu o specyficzne rozpoznawane struktury. Przykładowo, doniesiono, że w nieglikozylowanej IgG, reszta oligosacharydowa „wystaje z przestrzeni między CH2 i końcowe reszty N-acetyloglukozaminy stają się dostępne dla wiązania się z białkiem wiążącym mannozę (Malhotra i wsp., Nature Med. 1:237-243 [1995]). Usunięcie przez glikopeptydazę oligosacharydów z CAMPATH-1H (zrekombinowane humanizowane mysie monoklonalne przeciwciało IgGl, które rozpoznaje antygen CDw52 ludzkich leukocytów) wytwarzanego w komórkach jajnika chomika chińskiego (ang. Chinese Hamster Ovary, CHO) doprowadziło do całkowitego zmniejszenia Iizy z udziałem dopełniacza (CMCL) (Boyd i wsp., Mol Immunol. 32:1311-1318 [1996]), natomiast selektywne usunięcie reszt kwasu sialowego przy zastosowaniu neuraminidazy nie prowadziło do utraty DMCL. Doniesiono
PL 213 213 B1 również, że glikozylacja przeciwciał wpływa na zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). W szczególności doniesiono, że komórki CHO z regulowaną przez tetracyklinę ekspresją e(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnTIII), glikozylotransferazy katalizującej tworzenie się podzielonych na pół GlcNAc, ma zwiększoną aktywność ADCC (Umana i wsp., Nature Biotech. 11:176-180 (1999)).
Glikozylacja przeciwciał ma miejsce zazwyczaj poprzez N Iub poprzez O. N-glikozylacja dotyczy przyłączenia reszty cukrowej do łańcucha bocznego reszty asparaginowej. Tripeptydowe sekwencje asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, gdzie X to dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny są miejscami rozpoznawania dla enzymatycznego przyłączenia reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. O-glikozylacja odnosi się do przyłączenia jednego z cukrów N-acetylogalaktozaminy, galaktozy lub ksylozy do kwasu hydroksyaminowego, najczęściej seryny lub treoniny, jakkolwiek można również zastosować 5-hydroksyprolinę lub 5-hydroksylizynę.
Warianty glikozylacji przeciwciał są wariantami, w których wzór glikozylacji przeciwciała jest zmieniony. Poprzez zmianę rozumie się delecję jednej lub większej liczby reszt węglowodanowych znajdujących się w przeciwciele, dodawanie do przeciwciała jednej lub większej liczby reszt węglowodanowych, zmianę składu glikozylacji (wzoru glikozylacji), stopnia glikozylacji, itd.
Dodanie miejsc glikozylacji do przeciwciała zazwyczaj przeprowadza się poprzez zmianę sekwencji aminokwasowej tak, aby zawierała jedną albo większą liczbę opisanych powyżej sekwencji tripeptydowych (dla miejsc N-glikozylacji). Zmian można również dokonać poprzez dodanie albo zastąpienie jednej albo większej liczby reszt serynowych albo treoninowych w sekwencji wyjściowego przeciwciała (dla miejsc O-glikozylacji). Podobnie, usunięcia miejsc glikozylacji można dokonać poprzez zmianę aminokwasową w obrębie natywnych miejsc glikozylacji przeciwciała.
Sekwencję aminokwasową zwykle zmienia się poprzez zmianę leżącego u jej podstaw kwasu nukleinowego. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała anty-ErbB2 wytwarza się przy zastosowaniu rozmaitych znanych w tej dziedzinie metod. Metody te obejmują miedzy innymi izolację z naturalnego źródła (w przypadku występujących naturalnie wariantów sekwencji aminokwasowej) albo wytwarzanie poprzez mutagenezę za pośrednictwem oligonukleotydów (lub ukierunkowaną), mutagenezę poprzez PCR oraz mutagenezę kasetową wytworzonego wcześniej wariantu albo nie wariantowej wersji przeciwciała anty-ErbB2.
Glikozylacja (włączając w to wzór glikozylacji) przeciwciał może być również zmieniona bez dokonania zmian w sekwencji aminokwasowej albo leżącej u jej podstawy sekwencji nukleotydowej. Glikozylacja zależy w dużym stopniu od komórek gospodarza zastosowanych do ekspresji przeciwciała. Ponieważ typem komórek stosowanych do ekspresji zrekombinowanych glikoprotein, np. przeciwciał jako potencjalnych leków rzadko bywają komórki natywne, można spodziewać się znaczących różnic we wzorze glikozylacji przeciwciał (patrz np. Hse i wsp., J. Biol. Chem. 272:9062-9070 (1997)). Poza wyborem komórek gospodarza, czynniki, które wpływają na glikozylację w czasie wytwarzania przeciwciał na drodze rekombinowania DNA obejmują sposób hodowania, skład pożywki, gęstość hodowli, natlenienie, pH, schemat oczyszczania i temu podobne. Zaproponowano rozmaite sposoby dla zmiany wzoru glikozylacji uzyskiwanego w poszczególnych organizmach, włączając w to wprowadzanie albo nadprodukcję pewnych enzymów uczestniczących w wytwarzaniu oligosacharydów (patent USA nr 5,047,335; 5,510,261 i 5,278,299). Glikozylacji albo pewnych typów glikozylacji można pozbyć się z glikoprotein enzymatycznie, stosując na przykład endoglikozydazę H (Endo H). Ponadto, zrekombinowane komórki gospodarza można zmieniać poprzez manipulacje genetyczne np. uczynić defektywnymi w obróbce pewnych rodzajów polisacharydów. Te i inne techniki są dobrze znane w tej dziedzinie.
Strukturę glikozylacji przeciwciał można łatwo analizować przy zastosowaniu konwencjonalnych technik analizy węglowodanów, włączając w to chromatografię lektynową, NMR, spektrometrię mas, HPLC, GPC, analizę składu monosacharydów, stopniowe trawienie enzymatyczne i HPAEC-PAD, gdzie stosuje się chromatografię anionowymienną w wysokim pH w celu rozdzielenia oligosacharydów w oparciu o ładunek. Sposoby uwalniania oligosacharydów dla celów analitycznych są również znane i obejmują między innymi działanie enzymatyczne (powszechnie przeprowadzane przy zastosowaniu peptydo-N-glikozydazy/endo-3-galaktozydazy), eliminacji przy zastosowaniu ostrego środowiska alkalicznego w celu uwolnienia głównie struktur z wiązaniami-O oraz metody chemiczne z zastosowaniem bezwodnej hydrazyny w celu uwolnienia oligosacharydów połączonych zarówno przez O, jak i przez N.
PL 213 213 B1 (viii) Poszukiwanie przeciwciał o pożądanych właściwościach
Techniki wytwarzania przeciwciał zostały opisane powyżej. Można następnie wybrać przeciwciała z pewnymi pożądanymi właściwościami biologicznymi.
Przykładowo, w celu zidentyfikowania przeciwciał anty-ErbB2 hamujących wzrost, można poszukiwać przeciwciał, które hamują wzrost komórek nowotworowych nadprodukujących ErbB2. W jednym z wykonań, wybrane przeciwciało hamujące wzrost ma zdolność do hamowania wzrostu komórek SK-BR-3 w hodowli komórkowej o około 20-100%, a korzystnie 50-100% przy stężeniu przeciwciała od około 0,5 do 30 g/ml. W celu zidentyfikowania takich przeciwciał można przeprowadzić test SK-BR-3 opisany w patencie USA nr 5,677,171. Według tego testu, komórki SK-BR-3 hoduje się w mieszaninie w stosunku 1:1 F12 i pożywki DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, glutaminą oraz penicyliną i streptomycyną. Komórki SK-BR-3 wysiewa się w ilości 20,000 komórek na 35 mm płytki do hodowli komórkowej (2 ml/35 mm płytki). Do każdej płytki dodaje się 0,5 do 30 g/ml przeciwciał anty-ErbB2. Po sześciu dniach, zlicza się liczbę komórek w porównaniu do komórek nie traktowanych przy zastosowaniu elektronicznego czytnika do komórek COULTER. Te przeciwciała, które będą hamowały wzrost komórek SK-BR-3 około 20-100% lub około 50-100% można wybrać jako przeciwciała hamujące.
W celu wybrania przeciwciał, które indukują śmierć komórek, można zmierzyć utratę integralności błon na co wskazuje np. pobieranie PI, błękitu trypanowego albo 7AAD. Korzystnym testem jest test pobierania PI przy zastosowaniu komórek BT474. Według tego testu, komórki BT474 (które można otrzymać z Amierican Type Culture Collection (Rockville, MD)) hoduje się w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM):Ham's F-12 (50:50) uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie FBS (Hyclone) i 2 mM L-glutaminą. (A zatem test przeprowadza się w nieobecności dopełniacza i efektorowych komórek immunologicznych). Komórki BT474 wysiewa się przy gęstości 3 x 106 na płytkę w płytkach 100 x 20 mm i umożliwia się im przywarcie przez noc. Pożywkę usuwa się następnie i zastępuje samą świeżą pożywką albo pożywką zawierającą 10 g/ml odpowiedniego przeciwciała monoklonalnego. Komórki inkubuje się przez okres trzech dni. Po każdym traktowaniu, pojedyncze warstwy komórek przemywa się PBS i oddziela od podłoża poprzez trypsynizację. Komórki zwirowuje się następnie przy 1200 rpm przez 5 minut w 4°C, osad zawiesza ponownie w 3 ml schłodzonego w lodzie buforu wiążącego Ca2+ (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2 i rozporcjowuje do 35 mm zamkniętych filtrem siatkowym probówek 12 x 75 (1 ml na probówkę, 3 probówki na traktowaną grupę) w celu usunięcia zgrupowań komórek). Do probówek dodaje się następnie PI (10 g/ml). Próbki można analizować przy zastosowaniu cytometru przepływowego FACSCAN i oprogramowania FACSCONVERT CellOuest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które będą znacząco statystycznie indukowały śmierć komórek, co określa się poprzez pobieranie PI, można wybrać jako przeciwciała indukujące śmierć Komórek.
Dla wybrania przeciwciał, które indukują apoptozę, dostępny jest test wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474. Komórki BT474 hoduje się i wysiewa na szalki jak dyskutowano w poprzednim rozdziale. Pożywkę usuwa się następnie i zamienia na świeżą samą pożywkę albo pożywkę zawierającą 10 g/ml przeciwciała monoklonalnego. Po okresie trzech dni inkubacji pojedyncze warstwy przemywa się PBS i odłącza od podłoża poprzez trypsynizację. Komórki zwirowuje się, zawiesza w buforze do wiązania Ca2+ i rozporcjowuje do probówek jak opisano powyżej dla testu śmierci komórek. Do probówek dodaje się następnie wyznakowanej aneksyny (np. aneksyny V-FITC) (1 g/ml). Próbki można również analizować przy użyciu cytometru przepływowego FACSCAN i oprogramowania FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które będą znacząco statystycznie indukowały poziom wiązania aneksyn w stosunku do kontroli wybiera się jako przeciwciała indukujące apoptozę.
Poza wiązaniem aneksyny, dostępny jest również test barwienia przy zastosowaniu komórek BT474. W celu przeprowadzenia tego testu komórki BT474, które były traktowane przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania jak opisano w dwóch poprzednich akapitach inkubuje się z 9 g/ml HOECHST 33342 przez 2 godz. w 37°C, a następnie analizuje w cytometrze przepływowym EPICS ELITE (Coulter Corporation) przy zastosowaniu oprogramowania MODFIT LT (Verity Software House). Przeciwciała indukujące zmianę w udziale procentowym komórek apoptotycznych, który jest 2 lub więcej razy wyższy (a korzystnie 3-krotnie wyższy niż komórek nie traktowanych (do 100% komórek apoptotycznych) można wybrać jako przeciwciała pro-apoptotyczne przy zastosowaniu tego testu.
W celu zidentyfikowania przeciwciała, które blokuje aktywację receptora ErbB, można określić zdolność przeciwciała do blokowania wiązania się ligandu ErbB z komórkami wyrażającymi receptor
PL 213 213 B1
ErbB (np. w połączeniu z innym receptorem ErbB, z którym receptor ErbB będący przedmiotem zainteresowania tworzy hetero-oligomer). Przykładowo, komórki naturalnie wyrażające albo transfekowane tak, aby wyrażać receptory ErbB z hetero-oligomeru ErbB można inkubować z przeciwciałem, a następnie wystawiać na działanie wyznakowanego ligandu ErbB. Można następnie ocenić zdolność przeciwciała anty-ErbB do blokowania wiązania ligandu z receptorem ErbB w hetero-oligomerze ErbB.
Przykładowo, hamowanie wiązania HRG z liniami komórkowymi MCF7 z guza sutka przez przeciwciała anty-ErbB2 można przeprowadzić przy zastosowaniu jednowarstwowych hodowli komórek MCF7 w lodzie w 24-studzienkowych płytkach, zasadniczo jak odpisano w Przykładzie 1 poniżej.
Monoklonalne przeciwciała anty-ErbB2 można dodawać do każdej studzienki i inkubować przez
125 minut. Można następnie dodać wyznakowane 125I rHRG 1177-244 (25 pm) i inkubację kontynuować przez 4 do 16 godzin. Można sporządzić krzywą odpowiedzi na dawkę i dla przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania można obliczyć wartość IC50. W jednym z wykonań, przeciwciało, które blokuje aktywację ligandu receptora ErbB będzie miało IC50 dla hamowania wiązania się HRG z komórkami MCF7 w tym teście wynoszącą 50 nM lub mniej, korzystniej 1 nM lub mniej. Tam gdzie przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fab, IC50 dla hamowania wiązania się HRG z komórkami MCF7 w tym teście może wynosić na przykład około 100 nM lub mniej, korzystniej 50 nM lub mniej.
Alternatywnie lub dodatkowo można testować zdolność przeciwciała anty-ErbB2 do blokowania stymulowanej przez ligand ErbB fosforylacji tyrozynowej receptora ErbB obecnego w heterooligomerze ErbB. Przykładowo, komórki, w których następuje endogenna ekspresja receptorów ErbB albo transfekowanych tak, aby je wyrażać mogą być inkubowane przeciwciałem, a następnie testowane pod kątem aktywności stymulowanej przez ligand ErbB fosforylacji tyrozynowej receptora ErbB przy użyciu anty-fosfotyroznowego przeciwciała monoklonalnego (które jest ewentualnie połączone z wykrywalnym znacznikiem). Do określania aktywacji receptora ErbB i blokowania aktywności przeciwciała dostępny jest również test na aktywację receptora przez kinazę opisany w patencie USA 5,766,863.
W jednym z wykonań, można poszukiwać przeciwciał, które hamują stymulację przez HGR fosforylacji tyrozynowej p180 w komórkach MCF7. Przykładowo, komórki MCF7 można wysiewać w 24-studzienkowych płytkach, do każdej ścieżki dodawać przeciwciała monoklonalne wobec Erb82 i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej; następnie do każdej studzienki można dodawać rHRG 1177-244 w końcowym stężeniu 0,2 nM, i inkubację kontynuować przez 8 minut. Pożywkę można następnie odessać z każdej studzienki i reakcję zatrzymywać poprzez dodanie 100 μΐ buforu do próbek z SDS (5% SDS, 25 mM DTT i 25 mM Tris-HCl, pH 6,8). Każdą próbkę (25 μΐ) można poddać elektroforezie na 4-12% żelu gradientowym (Novex), a następnie przenieść elektroforetycznie na filtr z poliwinylidenodifluorku. Filtry po inkubacji z antyfosfotyrozyną (1 g/ml) można wywołać i intensywność głównego prążka na wysokości Mr 180,000 można ocenić ilościowo przez sensytometrię współczynnika odbicia. Korzystne jest, jeżeli wybrane przeciwciało będzie znacząco hamowało stymulację przez HRG fosforylacji tyrozynowej p130 do około 0-35% kontroli w tym teście. Można sporządzić krzywą odpowiedzi na dawkę dla hamowania stymulacji przez HRG fosforylacji tyrozynowej p180, co można ocenić ilościowo poprzez densytometrię współczynnika odbicia i można obliczyć IC50 dla przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W jednym z wykonań przeciwciało, które blokuje aktywację ligandu receptora ErbB będzie miało IC50 dla hamowania stymulacji przez HRG fosforylacji tyrozynowej p180 w tym teście wynoszącą około 50 nM albo mniej, korzystniej 10 nM albo mniej. Tam gdzie przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fab, IC50 dla hamowania stymulacji przez HRG fosforylacji tyrozynowej p180 w tym teście może wynosić około 100 nM albo mniej, korzystniej 50 nM albo mniej.
Można również testować efekty hamowania wzrostu dla przeciwciała wobec komórek MDA-MB-175, np. zasadniczo jak opisano w Schaefer i wsp., Oncogene 15:1385-1394 (1997). Według tego testu komórki MDA-MB-175 można traktować monoklonalnym przeciwciałem anty-FrbB2 (10 g/ml) przez 4 i barwić fioletem krystalicznym. Inkubacja z przeciwciałem anty-Erb82 może wykazywać efekt hamowania wzrostu wobec tej linii komórkowej, podobnie do wykazywanej przez przeciwciało monoklonalne 2C4. W dalszym wykonaniu, egzogenny HGR nie będzie znacząco odwracać tego hamowania. Korzystne jest, jeżeli przeciwciało będzie miało zdolność do hamowania proliferacji komórek w stosunku do komórek MDA-M8-175 w większym stopniu niż przeciwciało monoklonalne 4D5 (i ewentualnie w większym stopniu niż przeciwciało monoklonalne 7F3), zarówno w obecności jaki i nieobecności egzogennego HRG.
PL 213 213 B1
W jednym z wykonań przeciwciałem anty-ErbB2 będącym przedmiotem zainteresowania można blokować zależne od hereguliny połączenie ErbB2 z ErbB3 zarówno w komórkach MCF7, jak i SK-BR-3, co ustalono w doświadczeniach z zasadniczo bardziej wydajną koimmunoprecypitacją niż dla przeciwciała monoklonalnego 4D5, a korzystnie bardziej wydajną niż dla monoklonalnego przeciwciała 7F3.
W celu poszukiwania przeciwciał, które wiążą się z epitopem na ErbB2 wiązanym przez przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić rutynowy test blokowania krzyżowego, taki jak opisany w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie albo dodatkowo, można przeprowadzić mapowanie epitopów przy zastosowaniu metod znanych w tej dziedzinie (patrz, np. Fig. 1A i 1B).
Po otrzymaniu wyników w opisanych powyżej testach w oparciu o komórki można następnie przeprowadzić testy na zwierzętach, np. w modelach mysich i w testach klinicznych dla człowieka. W szczególności, niezdolność albo ograniczoną zdolność przeciwciała do leczenia nowotworów nadprodukujących ErbB2 można wykazać w transgenicznych modelach mysich ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu jak opisano w Przykładach poniżej.
C. Koniugaty przeciwciało anty-ErbB-maitansynoid(immunokoniugaty)
Koniugaty przeciwciało anty-ErbB-maitansynoid wytwarza się poprzez połączenie chemiczne przeciwciała anty-ErbB z cząsteczka maitansynoidu bez znaczącego zmniejszenia aktywności biologicznej zarówno przeciwciała, jak cząsteczki maitansynoidu. Maitansynoidy są dobrze znane w tej dziedzinie i mogą być syntetyzowane znanymi technikami albo izolowane z naturalnych źródeł. Przydatne maitansynoidy są ujawnione na przykład w patencie USA nr 5,208,020 albo w innych patentach i publikacjach nie patentowych do których odnoszono się powyżej. Korzystnymi maitansynoidami są maitansynol i analogi maitansynolu zmodyfikowane w pierścieniu aromatycznym albo innych pozycjach cząsteczki maitansynolu, takie jak rozmaite estry maitansynolu. Istnieje wiele grup łączących znanych w dziedzinie wytwarzania koniugatów przeciwciało-maitansynoid, włączając w to między innymi te ujawnione w patencie USA 5,208,020 lub patencie EP Patent O 425 235 81 oraz Chari i wsp., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Grupy łączące obejmują grupy dwusiarczkowe, grupy tioeterowe, grupy kwasolabilne, grupy fotolabilne, grupy rozkładane przez peptydazy albo grupy rozkładane przez esterazy jak ujawniono w wymienionych powyżej patentach, przy czym korzystne są grupy dwusiarczkowe i tioeterowe.
Koniugaty przeciwciała i maitansynoidu można wytwarzać przy użyciu rozmaitych bifunkcjonalnych czynników łączących białka, takich jak N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propionian (SPDP), sukcynimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-carboksylan, iminotiolan (IT), bifunkcjonalne pochodne imidoesterów (takie jak dimetyloadipimidan HCl), aktywne estry (takie jak disukinimidylosuberan), aldehydy (takie jak glutareldehyd), związki bis-azydowe (takie jak bis(p-azydobenzoylo) heksanodiamina), pochodne bis-diazoniowe (takie jak bis-(p-diazoniumbenzoylo)-etylenodiamino), diizocyjaniany (takie jak tolieno 2, 6-diizocyjanian), oraz bis-aktywne związki fluoru (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Szczególnie korzystnymi czynnikami łączącymi dla dostarczania wiązań dwusiarczkowych są N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propionian (SPDP) (Carlsson i wsp., Blochem. J. 173: 723-737 [1978]) i lub N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanian (SPP).
Łącznik może być przyłączony do cząsteczki maitansynoidu w różnych pozycjach, w zależności od typu połączenia, na przykład wiązanie estrowe może być utworzone w pozycji C-3 mającej grypę hydroksylową, w pozycji C-14 zmodyfikowanej hydroksymetylem, w pozycji C-15 zmodyfikowanej grupą hydroksylową oraz pozycji C-20 mającej grupę hydroksylową przy zastosowaniu konwencjonalnych technik łączenia. W korzystnych wykonaniach, połączenie jest tworzone w pozycji C-3 maitansynoidu albo analogu maitansynoidu.
D. Kompozycje farmaceutyczne
Kompozycje farmaceutyczne koniugatów przeciwciało-maitansynoid stosowane według niniejszego wynalazku wytwarza się w celu przechowywania poprzez zmieszanie przeciwciała mającego pożądany stopień czystości z ewentualnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, zaróbkami lub stabilizatorami (Remington's Pharmaceutical Sciences wydanie 16, Osol, A. Ed. (1980)), w postaci preparatów liofilizowanych albo roztworów wodnych. DopuszczaIne nośniki, zaróbki lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w zastosowanych dawkach i stężeniach i obejmują bufory, takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne, przeciwutleniacze, włączając w to kwas askorbinowy i metioninę; środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamonowy; chlorek heksametoniowy; chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetoniowy; aIkohoi fenolowy, butylowy lub benzylowy; parabeny alkilowe, takie jak paraben metylowy lub propylowy; katechol; rezorcynol; cycloheksanol;
PL 213 213 B1
3-pentanol; oraz m-krezol); polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt); białka, takie jak albumina z surowicy, żelatyna albo immunoglobuliny; polimery hydrofilowe takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histidyna, arginina lub lizyna; monosaccharydy, disacharydy i inne węglowodany włączając w to glukozę, mannozę lub dekstryny; czynniki chelatujące, takie jak EDTA; cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol; tworzące sole jony, takie jak sodowe; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko); oraz niejonowe związki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN, PLURONICS oraz glikol polietylenowy (PEG). Korzystne liofilizowane kompozycje z przeciwciałem anty-ErbB2 są opisane w WO 97/04801, dokładnie włączonym tu jako odniesienie.
Kompozycje mogą również zawierać jeden albo większą liczbę związków czynnych niezbędnych podczas leczenia przy poszczególnych wskazaniach, korzystnie o uzupełniających się aktywnościach, które nie mają na siebie wzajemnie szkodliwego wpływu. Przykładowo, może być pożądane dostarczenie dalszych przeciwciał albo koniugatów przeciwciało-maitansynoid, które wiążą się z EGFR, ErbB2 (np. przeciwciało, które wiąże inny epitop na ErbB2), ErbB3, ErbB4 albo śródbłonkowym czynnikiem naczyniowym (VEGF) w jednej kompozycji. Alternatywnie, albo dodatkowo, kompozycja może zawierać ponadto czynnik chemioterapeutyczny, czynnik cytotoksyczny, cytokinę, czynnik hamujący wzrost, czynnik przeciwhormonalny i i/lub ochronny czynnik kardiologiczny. Takie cząsteczki powinny być obecne w kombinacji w ilościach, które są skuteczne dla zamierzonych potrzeb.
Składniki czynne można również zamykać w mikrokapsułkach wytwarzanych na przykład techniką koacerwacji albo polimeryzacji międzyfazowej, na przykład mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych albo żelatynowych, odpowiednio i mikrokapsułkach poli(merylometacylanowych), odpowiednio, w koloidalnym systemie dostarczania leków (na przykład liposomy, mikrokulki albuminowe, mikroemulsje, nanocząstki i nanokapsułki) lub w makroemulsjach. Takie techniki są ujawnione w Remington's Pharmaceutical Sciences wyd. 16, Osol, A. Ed. (1930).
Można również wytworzyć preparaty o opóźnionym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o opóźnionym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne podłoża ze stałych hydrofobowych polimerów zawierających przeciwciało, gdzie podłoża wytwarza się w postaci uformowanych artykułów, np. błon albo mikrokapsułek. Przykłady podłóż o opóźnionym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (na przykład, poli(2-hydroksyetylometakrylan) albo poli(winyloalkohol)), polimleczany (Pat. USA nr 3,773,919), kopolimery kwasu L-glutaminowego oraz etylo-L-glutaminianu, nie podlegający rozkładowi octan etyleno-winylowy, podlegające rozkładowi kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy, takie jak LUPRON DEPOT (wstrzykiwaine mikrokulki składające się kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidowego), oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy.
Kompozycje do stosowania in vivo muszą być jałowe. To można łatwo osiągnąć poprzez filtrację przez błony filtracyjne.
E. Leczenie koniugatami przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid
Rozważana jest zgodnie z niniejszym wynalazkiem możliwość zastosowania koniugatów przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid do leczenia różnych chorób i schorzeń. Przykłady stanów chorobowych i schorzeń obejmują łagodne i złośliwe guzy; białaczki i chłoniaki inne choroby takich jakie jak zaburzenia neuronów, gleju, astrocytów, podwzgórza, gruczołów, makrofagów, śródbłonka, zrębu, choroby blastoceliczne, zapalne, związane z rozwojem naczyń i immunologiczne. Generalnie chorobą albo schorzeniem do leczenia jest nowotwór. Przykłady nowotworów do leczenia obejmują miedzy innymi raki, chłoniaka, blastoma, mięsaka oraz białaczki i chłoniaki. Bardziej konkretne przykłady takich nowotworów obejmują raka płaskokomórkowego (np. śródbłonkowego raka płaskokomórkowego), raka płuc włączając w to raka płuc z małych komórek, raka płuc nie z małych komórek, gruczolakoraka płuc i płaskokomórkowego raka płuc, raka otrzewnej, raka wątrobo-komórkowego, raka żołądka, włączając w to raka żołądkowo-jelitowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka wątroby, raka pęcherza, wątróbiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka odbytnicy, raka jelita grubego, raka śluzówki macicy lub macicy, raka gruczołu śliniankowego, raka nerki, raka prostaty, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia jak również raka głowy i szyi.
Nowotwór będzie zawierał komórki wyrażające ErbB, tak że przeciwciało anty-ErbB jest zdolne do wiązania się z nowotworem i będą typowo charakteryzowały się nadprodukcją receptora ErbB. W korzystnym wykonaniu nowotwory zawierają komórki wyrażające ErbB, a nawet korzystniej, komórki, które charakteryzują się nadprodukcją receptora ErbB2. W celu oznaczenia ErbB, np. ekspresji ErbB2 w nowotworach dostępne są rozmaite testy diagnostyczne/prognostyczne. W jednym z wykonań, nadekspresję ErbB2 można analizować poprzez test IHC, np. stosując HERCEPTEST®
PL 213 213 B1 (Dako). Zatopione w parafinie skrawki z biopsji guza można poddać testowi i przyjąć następujące kryteria intensywności zabarwienia:
Wynik 0 obserwuje się brak zabarwienia albo zabarwienie błon obserwowane jest w mniej niż 10% komórek guza.
Wynik 1 +
Słaoe/ledwo widoczne zabarwienie błon jest wykrywalne w więcej niż 10% komórek guza.
Wynik 2 +
Słabe do średniego kompletne zabarwienie błon obserwuje się w więcej niż 10% komórek guza.
Wynik 3 +
Średnie do silnego kompletne zabarwienie błon obserwuje się w więcej niż 10% komórek guza.
Guzy z wynikiem 0 lub 1 + przy testowaniu nadekspresji można scharakteryzować jako nie nadprodukujące ErbB2, podczas gdy guzy wynikami 2 + lub 3 + można scharakteryzować jako nadprodukujące ErbB2.
Alternatywnie albo dodatkowo, na utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie tkankach guza można przeprowadzić testy FISH, takie jak INFORM (sprzedawane przez Ventana, Arizona) lub PATHVISION (Vysis, Illinois) w celu określenia stopnia (jeżeli taka w ogóle ma miejsce) nadekspresji ErbB2 w guzie.
W jednym z wykonań nowotworem może być taki, który wyraża (albo może naprodukować) EGFR. Przykłady nowotworów, które wyrażają/nadprodukują) EGFR obejmują raka płaskokomórkowego (np. śródbłonkowego raka płaskokomórkowego), raka płuc włączając w to raka płuc z małych komórek, raka płuc nie z małych komórek, gruczolakoraka płuc i płaskokomórkowego raka płuc, raka otrzewnej, raka wątrobo-komórkowego, raka żołądka, włączając w to raka żołądkowo-jelitowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka wątroby, raka pęcherza, wątrobiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka odbytnicy, raka jelita grubego, raka śluzówki macicy lub macicy, raka gruczołu śIiniankowego, raka nerki, raka prostaty, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia jak również raka głowy i szyi.
Korzystne jest, jeżeli immunokoniugaty według niniejszego wynalazku i/lub białka ErbB, np. białko ErbB2 lub EGFR z którymi się wiążą, są internalizowane, prowadząc do zwiększonej skuteczności terapeutycznej immunokoniugatów w zabijaniu komórek nowotworowych, z którymi się zwiążą. W korzystnym wykonaniu, czynnik cytotoksyczny (mainansynoid) ma za cel albo przeszkadza kwasom nukleinowym w komórce nowotworowej.
Leczenie według niniejszego wynalazku jest skierowane wobec nowotworów nadprodukujących ErbB, które nie odpowiadają albo odpowiadają słabo na leczenie nieskoniugowanym, przeciwciałem anty-ErB. Tacy pacjenci mogą być wcześniej leczeni przeciwciałem anty-Er3 nie połączonym z cząsteczką maitansynoidu, gdzie wcześniejsze leczenie albo nie powoduje znaczącej poprawy albo prowadzi do odpowiedzi przejściowej. Wcześniejsze leczenie jakiegoś pacjenta nie skoniugowanym przeciwciałem anty-ErB nie jest jednakże koniecznym warunkiem wybrania pacjentów na kandydatów do leczenia według niniejszego wynalazku. Biegły w tej dziedzinie lekarz może łatwo zidentyfikować pacjentów, dla których można spodziewać się odniesienia korzyści z leczenia immunokoniugatami według niniejszego wynalazku w oparciu o dostępne publicznie dane kliniczne albo własne doświadczenie. Leczenie ssaków, a w szczególności ludzi z albo bez wcześniejszego leczenia (nieskoniugowanym) przeciwciałem anty-ErB mieści się konkretnie w zakresie niniejszego wynalazku.
Koniugaty przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid podaje się ssakom, korzystnie ludziom, zgodnie ze znanymi metodami, takimi jak podawanie dożylne np. w postaci jednej dużej dawki albo stałego wlewu na przestrzeni pewnego okresu czasu, domięśniowo, dootrzewnowo, dordzeniowo, podskórnie, dostawowo, dozatokowo, doczaszkowo, doustnie, miejscowo albo na drodze inhalacji. Z podawaniem koniugatów przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid można łączyć inne tryby leczenia. Podawanie łączone obejmuje podawanie jednoczesne przy zastosowaniu oddzielnych kompozycji albo jako jedna kompozycja farmaceutyczna oraz podawanie następujące po sobie w dowolnej kolejności, gdzie korzystnie ma miejsce taki okres kiedy obydwa (albo wszystkie) składniki czynne jednocześnie przejawiają swoje aktywności biologiczne).
W jednym z korzystnych wykonań pacjent jest traktowany dwoma albo większą liczbą przeciwciał anty-ErB, gdzie co najmniej jeden z nich jest w postaci koniugatu z maitansyniodem. Przykładowo, pacjent może być leczony pierwszym koniugatem przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid, w którym przeciwciało hamuje wzrost (np. HERCEPTIN®), a drugim przeciwciałem anty-ErbB2 albo immunokoPL 213 213 B1 niugatem z przeciwciałem, np. koniugatem przeciwciało-maitansynoid, który blokuje aktywację ligandu receptora (np. 2C4 albo jego humanizowane albo poddane obróbce przez powinowactwo warianty) albo indukuje apoptozę komórek nadprodukujących receptor ErbB receptor (np. 7C2, 7F3 albo ich humanizowane warianty). W innym wykonaniu leczenie obejmuje podawanie przeciwciał, które wiążą się specyficznie z dwoma Iub większą liczbą różnych receptorów ErbB, na przykład receptorami ErbB2 i EGFR, gdzie co najmniej jedno z przeciwciał anty-ErbB jest podawane jako koniugat maitansynoidu. Korzystne jest jeżeli taka łączona terapia prowadzi do synergicznego efektu leczniczego.
Może być pożądane łączenie podawania koniugatu przeciwciało anty-ErbB-maitansynoid z podawaniem przeciwciała skierowanego innemu związanemu z nowotworem antygenowi, który nie jest członkiem rodziny receptbrów ErbB. Inne przeciwciała w tym przypadku może, na przykład wiązać się z naczyniowym śródblonkowym czynnikiem wzrostowym (VEGF) i może być w postaci koniugatu z maitansynoiden albo innego immunokoniugatu.
W jednym z wykonań, leczenie według niniejszego wynalazku obejmuje łączone podawanie koniugatu (albo koniugatów) przeciwciało-maitansynoid i jednego albo większej liczby czynników chemioterapeutycznych. Korzystne czynniki chemioterapeutyczne obejmują taksany (takie jak paklitaksel i doksetaksel) i/lub antybiotyki antracyklinowe. Wytwarzanie i tryb dawkowania dla takich czynników chemioterapeutycznych można przeprowadzać zgodnie z instrukcjami producentów albo poprzez ustalenie doświadczalne przez specjalistę. Wytwarzanie i tryb dawkowania dla takiej chemioterapii są również opisane w Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MO (1992).
Koniugat przeciwciało anty-ErbB-maitansynoid można łączyć ze związkiem przeciwhormonalnym np. związkiem przeciwestrogenowym, takim jak tamoksifen; przeciwprogesteronowym, takim jak onapriston (patrz, EP 616 812); albo przeciwandrogenowym, takim jak flutamid, w dawkach znanych dla takich cząsteczek. Tam, gdzie nowotwór, który ma być leczony jest nowotworem niezależnym od hormonu, pacjent może być poddany najpierw terapii przeciwhormonalnej, a kiedy nowotwór stanie się niezależny od hormonu, pacjentowi można podawać przeciwciało anty-ErbB (i fakultatywnie inne czynniki jak tu opisano).
Czasami, może być korzystne jednoczesne podawanie pacjentowi ochronnego czynnika kardiologicznego (w celu zapobieżenia albo zmniejszenia zaburzenia mięśnia sercowego związanego z terapią) albo jednej lub większej liczby cytokin. Poza powyższymi trybami terapeutycznymi, pacjent może być poddany chirurgicznemu usunięciu komórek nowotworowych i/lub radioterapii.
Odpowiednie dawki przy dowolnym z powyższych podawanych jednocześnie czynników są takimi, jak obecnie stosowane i można je obniżać dzięki połączonemu działaniu (synergii) czynnika i przeciwciała anty-ErbB2.
Dla zapobiegania albo leczenia choroby odpowiednia dawka koniugatów przeciwciało-maitansynoid będzie zależała od typu leczonej choroby, jak zdefiniowano powyżej, ostrości i przebiegu choroby, tego czy przeciwciało jest podawane dla celów zapobiegawczych czy leczniczych, wcześniejszej terapii, historii klinicznej pacjenta i odpowiedzi na przeciwciało oraz opinii prowadzącego lekarza. Korzystne jest podawanie pacjentowi koniugatu przeciwciało-maitansynoid jednorazowo albo w postaci serii dawek. W zależności od typu i ostrości choroby, wyjściowa proponowana dawka koniugatu przeciwciało-maitansynoid do podawana pacjentowi wynosi około 1 g/kg do 15 mg/kg (np. 0,1-20 mg/kg), podawana jednokrotnie albo więcej razy albo jako ciągły wlew. Typowo, dzienna dawka może mieścić się w zakresie od około 1 g/kg do 100 mg/kg lub więcej w zależności od wspomnianych powyżej czynników. Przy podawaniu powtarzanym na przestrzeni kilku dni lub dłużej, zależnie od stanu chorobowego, leczenie podtrzymuje się aż do pożądanego zniesienia objawów chorobowych. Korzystny tryb dawkowania obejmuje podawanie wyjściowej dawki podstawowej około 4 mg/kg, a następnie cotygodniowo dawki podtrzymującej około 2 mg/kg koniugatu przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid. Jednakże mogą być użyteczne inne tryby podawania. Postęp tej terapii można łatwo śledzić przy zastosowaniu konwencjonalnych technik i testów.
F. Produkty przemysłowy
Dostarczony jest produkt przemysłowy zawierający materiały przydatne do leczenia opisanych powyżej chorób. Produkty przemysłowe zawierają pojemnik oraz etykietkę albo ulotkę na pojemniku albo do niego dołączoną. Odpowiednie pojemniki obejmują butelki, fiolki, strzykawki, ltd. Pojemniki mogą być wytworzone z rozmaitych materiałów, takich jak szkło albo plastyk. Pojemniki zawierają kompozycję, która jest skuteczna do leczenia danego stanu chorobowego, i może mieć jałową drogę dostępu (na przykład pojemnikiem może być woreczek na roztwór dożylny albo fiolka mająca zatyczkę, którą można przebić igłą do zastrzyków podskórnych. Co najmniej jednym ze składników czynnych
PL 213 213 B1 w kompozycji jest koniugat przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid. Etykietka albo ulotka wskazuje, że kompozycja ma być stosowana do leczenia wybranych stanów chorobowych takich jak nowotwór. W jednym z wykonań etykietka albo ulotka wskazuje, że kompozycję zawierającą przeciwciało, które wiąże się z ErbB2 można zastosować do leczenia nowotworów, które wyrażają receptor ErbB wybrany z grupy składającej się z receptora nabłonkowego czynnika wzrostowego (EGFR), ErbB2, ErbB3 i ErbB4, korzystnie EGFR. Ponadto, etykietka albo ulotka może również wskazywać, że kompozycja ma być stosowana do leczenia nowotworu, gdzie nowotwór charakteryzującego się nadmierną aktywacją receptora ErbB, wybranego spośród EGFR, ErbB2, ErbB3 lub ErbB4. Przykładowo, nowotworem może być taki, który naprodukuje jeden z tych receptorów i/lub naprodukuje ligand ErbB (taki jak TGF). Etykietka albo ulotka może również wskazywać, że kompozycja ma być stosowana do leczenia nowotworu, gdzie nowotwór nie charakteryzuje się nadekspresją receptora ErbB. Przykładowo, podczas gdy ulotka dla HERCEPTIN® wskazuje, że przeciwciało ma być stosowane do leczenia pacjentów z przerzutującym rakiem sutka, w którym guzy naprodukują białko ErbB2, omawiana ulotka może wskazywać, że kompozycje przeciwciała stosuje się do leczenia pacjentów z przerzutującym rakiem sutka, który nie odpowiada albo odpowiada słabo na leczenie HERCEPTIN®. W innych wykonaniach, ulotka może również wskazywać, że kompozycja ma być stosowana do leczenia raka niezależnego od hormonu, raka prostaty, raka okrężnicy albo raka odbytu i okrężnicy. Ponadto, produkt fabryczny może zawierać(a) pierwszy pojemnik z zawartą w nim kompozycją, gdzie kompozycja zawiera koniugat maitansynoidu z pierwszym przeciwciałem, które wiąże się ErbB2 i hamuje wzrost komórek nowotworowych, które naprodukują ErbB2; i (b) drugi pojemnik z zawartą w nim kompozycją, gdzie kompozycja zawiera koniugat maitansynoidu z drugim przeciwciałem, które wiąże się ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB albo koniugat tego drugiego przeciwciała z maitansynoidem. Produkt fabryczny w tym wykonaniu wynalazku może ponadto zawierać ulotkę wskazującą, że pierwsza i druga kompozycja może być zastosowana do leczenia nowotworu. Alternatywnie lub dodatkowo, produkt fabryczny może ponadto zawierać drugi (albo trzeci) pojemnik zawierający akceptowalny farmaceutycznie bufor, taki jak bakteriostatyczna woda do zastrzyków (BWFI), sól fizjologiczna buforowana fosforanem, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. Może on ponadto zawierać inne materiały pożądane z punktu widzenia handlowego, włączając w to inne bufory, rozcieńczalniki, filtry, igły i strzykawki. Dalsze szczegóły wynalazku będą zilustrowane w następujących nie ograniczających przykładach.
P r z y k ł a d 1
Oczyszczanie, charakteryzowanie i humanizacja monoklonalnego przeciwciała anty-ErbB2 4D5
Mysie monoklonalne przeciwciało 4D5, które wiąże się specyficznie z zewnątrzkomórkową domeną ErbB2 wytworzono jak opisano w Fendly i wsp., Cancer Research 50:1550-1558 (1990). Po5 krótce, komórki NIH 3T3/HER2-3400 (wyrażające około 1 x 105 cząsteczek ErbB2/komórkę) wytwarzane jak opisano w Hudziak i wsp. Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 84:7158-7163 (1987) zbierano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 25 mM EDTA i użyto do immunizacji myszy
BALB/c. Myszom podawano zastrzyki i.p. z 107 komórek w 0,5 ml PBS w tygodniach 0, 2, 5 i 7. My32 szom z surowicami, które immunoprecypitowały wyznakowany 32P ErbB2, podawano w zastrzyku i.p. ekstrakt z błon oczyszczany na złożu aglutynina z kiełków pszenicy-Sepharose (WGA) w tygodniach 9 i 13. Po tym następowało wstrzykniecie 0,1 ml preparatu ErbB2 i splenocyty poddawano fuzji z mysią linia szpiczaka X63-Ag8-653. Supernatanty hybrydom przeszukiwano pod kątem wiązania ErbB2 poprzez ELISA i radioimmunoprecypitację.
Mapowanie i charakteryzowanie epitopów
Epitop ErbB2 wiązany przez monoklonalne przeciwciało 4D5 był określany poprzez kompetycyjną analizę wiązania (Fendly i wsp., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)). Badania blokowania krzyżowego przeprowadzono poprzez bezpośrednią fluorescencję na nienaruszonych komórkach przy zastosowaniu urządzenia PANDEXTM Screen Machine do oceny ilościowej fluorescencji. Monoklonalne przeciwciała sprzęgano z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), stosując ustalone procedury (Wofsy i wsp., Selected Methods in Cellular Immunology, str. 287, Mishel i Schiigi (wyd.) San Francisco: W.J. Freeman Co. [1980]). Konfiuentne pojedyncze warstwy komórek NIH BT3/HER2-3400 trypsynizowano, przemywano jeden raz i zawieszano przy 1,75 x 106 komórek/ml w zimnym PBS zawierającym 0,5% wołową surowiczą albuminę (BSA) i 0,1% NaN3. Dodawano kulki lateksowe do końcowego stężenia 1% (IDC, Portland, DR) w celu zredukowania zbijania się komórek na filtrach płytkowych PANOEXTM. Komórki w zawiesinie, 20 I, i 20 I oczyszczonych monoklonalnych przeciwciał (100 g/ml do 0,1 g/ml) dodawano do studzienek płyki ΡΑΝΟΕΧ™ i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Ustalone wcześniej rozcieńczenia wyznakowanych FITC monoklonalnych przeciwciał w 20 l dodawano do
PL 213 213 B1 każdej studzienki, inkubowano 30 minut, przemywano i fluorescencję oceniano ilościowo przy pomocy PANDEXTM. Uznawano, że przeciwciała monoklonalne mają wspólny epitop jeżeli każde z nich blokowało wiązanie ponad 50% lub więcej w porównaniu z niezależnym monoklonalnym przeciwciałem kontrolnym. W tym doświadczeniu, monoklonalnemu przeciwciału przypisano epitop I (reszty aminokwasowe od około 529 do około 625, łącznie w obrębie zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2 (patrz SEK ID nr: 3).
Właściwości wzrostowe monoklonalnego przeciwciała 4D5 oceniano przy zastosowaniu linii komórkowej z raka sutka, SK-BR-3 (patrz Hudziak i wsp., Molec. Cell Biol. 9(3) :1165-1172 (1989)). Pokrótce, komórki SK-BR-3 odłączano od podłoża przy użyciu 0,25% (obj./obj.) trypsyny i zawierzano w pożywce kompletnej przy gęstości 4 x 103 komórek na ml. Próbki 100 I (4 x 14 komórek) wysiewano na 96-studzienkowe płytki do mikrorozcieńczeń, umożliwiano komórkom przyczepienie się do podłoża i dodawano 100 I samej pożywki albo pożywkę zawierającą monoklonalne przeciwciało (końcowe stężenie 5 g/ml). Po 72 godzinach, płytki przemywano dwukrotnie (pH 7,5), barwiono fioletem krystalicznym (0,5% w metanolu) i analizowano pod kątem względnej proliferacji komórek jak opisano w Sugarman i wsp. Science 230:943-945 (1985). Monoklonalne przeciwciało 4D5 hamowało względną proliferację komórek SKBR-3 o około 56%.
Monoklonalne przeciwciało 4D5 oceniano również pod kątem jego zdolności do hamowania stymulowanej przez HAG-fosforylacji tyrozynowej białek w zakresie MW 180,000 z całych lizatów komórkowych MCF7 (Lewis i wsp., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)). Są doniesienia, że komórki MCF7 wyrażają wszystkie znane receptory ErbB, ale na stosunkowo niskich poziomach. Ponieważ ErbB2, ErbB3 i ErbB4 mają prawie takie same masy cząsteczkowe, niemożliwe jest rozróżnienie, które białko zostaje poddane fosforylacji tyrozynowej, kiedy analizuje się na filtrach Western lizaty z całych komórek. Jednakże, komórki są idealne do testów na fosforylację tyrozynową HGR ponieważ w stosowanych warunkach testu, w nieobecności dodawanego HGR, wykazują one niskie do niewykrywalnych poziomy fosforylacji tyrozynowej białek w zakresie Mr 180,000.
Komórki MCF7 wysiewano na 24-studzienkowe płytki, do każdej płytki dodawano przeciwciało monoklonalne ErbB2 i płytki inkubowano 30 min w temperaturze pokojowej; następnie do każdej studzienki dodawano rHRG 1177-244 w końcowym stężeniu 0,2 nM i inkubację kontynuowano przez 8 minut. Pożywkę starannie odsysano z każdej studzienki i reakcję zatrzymywano poprzez dodanie 100 I buforu do próbek z SDS (5% SDS, 25 mM DTT i 25 mM Tris-HCl, pH 6,8). Każdą próbkę poddawano elektroforezie na (25 I) 4-12% żelu gradientowym (Novex), a następnie przenoszono elektroforetycznie na filtr z poliwinylidenodifluorkowego. Wywołano filtry dla antyfosfotyrozyny (4G10, z UBI, stosowany w ilości 1 g/ml) i intensywność głównych prążków o masie Mr 180,000 po reakcji oceniano ilościowo poprzez densytometrię odbicia, jak opisano uprzednio (Holmes i wsp., Science 256:1205-1210 [1992]; Sliwkowski i wsp., J. Biol Chem. 269:14661-14665 [1994]).
Przeciwciało monoklonalne 4D5 znacząco hamowało wytwarzanie indukowanego przez HAG sygnału fosforylacji tyrozynowej na poziomie Mr 180,000 w nieobecności HRG, ale było niezdolne do stymulacji fosforylacji tyrozynowej białka w obszarze 180,000. Ponadto, białko to nie reagowało krzyżowo z EGFR (Fendly i wsp., Cancer Research 50:1550-1558 [1990]), ErbB3 lub ErbB4. Monoklonalne przeciwciało 4D5 miało zdolność blokowania symulacji przez HRG fosforylacji tyrozynowej na poziomie 50%.
Badano hamujący wpływ monoklonalnego przeciwciała 4D5 na wzrost komórki MDA-MB-1 75 i SK-BR-3 w obecności albo nieobecności zewnętrznego rHRG (Schaefer i wsp., Oncogene 15:13851394 [1997]). Poziomy ErbB2 w komórkach MDA-MB-175 były 4-6 razy większe niż w normalnych komórkach nabłonkowych sutka, a receptor ErbB2-ErbB4 podlegał konstytutywnej fosforylacji tyrozynowej w komórkach MDA-MB-175. Monoklonalne przeciwciało miało zdolność do hamowania proliferacji komórek 4D5 MDA-MB-175, zarówno w obecności, jak i nieobecności egzogennego HRG. Hamowanie proliferacji komórkowej przez 4D5 jest zależne od poziomów ekspresji (Lewis i wsp., Cancer Immunol. Immunother. 37:255263 [1993]). Maksimum inhibicji, którą można wykryć w komórkach SKBR-3 wynosi 66%, jednakże efekt ten można przezwyciężyć poprzez egzogenny HRG.
Humanizacja
Mysie monoklonalne przeciwciało 4D5 humanizowano, stosując nową strategię „mutagenezy poprzez konwersję jak opisano w patencie USA nr 5,821,337, którego ujawnienie jest tu w całości włączone jako odniesienie. Humanizowane przeciwciało monoklonalne 4D5 stosowane w następujących dalej doświadczeniach jest oznaczane jako huMAb4D5-8. Przeciwciało to jest izotypu IgG1.
PL 213 213 B1
P r z y k ł a d 2
Koniugaty HERCEPTIN®-DM1
Oczyszczanie HERCEPTIN®
HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, patent USA nr 5,821,337) (1 fiolka zawierająca 440 mg przeciwciała) rozpuszczano w 50 ml buforu MES (25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5,6). Próbkę nakładano na kolumnę kationowymienną (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm), która była zrównoważona tym samym buforem. Kolumnę wymywano następnie tym samym buforem (5 objętościami kolumny). HERCEPTIN® wymywano wzrastającym do 200 mM stężeniem NaCl w buforze. Frakcje zawierające przeciwciało łączono, rozcieńczano do 10 mg/ml i dializowano wobec buforu zawierającego 50 mm fosforan potasowy, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,5.
2. Modyfikacja HERCEPTIN® przy użyciu SPP
Oczyszczone przeciwciało HERCEPTIN® modyfikowano przy użyciu N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanianu (SPP) w celu wprowadzenia grup ditiopirydylowych. Przeciwciało (376,0 mg, 8 mg/ml) w 44,7 ml buforu fosforanowego 50 mM (pH 6,5) zawierającego NaCl (50 mM) i EDTA (1 mM) traktowano SPP (5,3 równoważników molowych w 2,3 ml etanolu).
Po inkubacji przez 90 minut pod argonem w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną poddano sączeniu molekularnemu na kolumnie z Sephadex 625 zrównoważonej 35 mM cytrynianem sodowym, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA. Frakcje zawierające przeciwciało mieszano i testowano. Stopień modyfikacji przeciwciała określano jak opisano powyżej. Odzysk zmodyfikowanego przeciwciała (HERCEPTIN®-SPP-Py) wynosił 337 mg (89,7%) z przyłączonymi uwalnialnymi grupami 2-tiopirydynowymi w liczbie 4,5 na przeciwciało.
3. Połączenie HERCEPTIN®-SPP-Pv z DM1
Zmodyfikowane przeciwciało (337,0 mg, 9,5 μmoli uwalnialnych grup 2-tiopirydynowych) rozcieńczano jak wyżej w 35 mM cytrynianie sodowym, pH 6,5, do stężenia końcowego 2,5 mg/ml. Do roztworu przeciwciała dodawano następnie DM1 (którego struktura jest pokazana na Fig. 1) (1,7 równoważników, 16,1 μmoli) w 3,0 mM dimetyloacetamidzie (DMA, 3% obj./obj. w końcowej mieszaninie reakcyjnej). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej pod argonem przez 20 godzin. Struktura koniugatów HERCEPTIN®-DM1 jest przedstawiona na Fig 2.
Mieszaninę reakcyjną nakładano na kolumnę filtracyjną Sephacryl S300 (5,0 cm x 90,0 cm, 1,77 I) zrównoważoną 35 mM cytrynianem sodowym, 154 mM NaCl, pH 6,5. Szybkość przepływu wynosiła 5,0 ml/min., zebrano 65 frakcji (każda po 20,0 ml). Główny pik koncentrował się wokół frakcji nr 47 (Fig. 3). Główny pik zawiera monomery HERCEPTIN®-DM1. Frakcje 44-51 łączono i testowano. Liczba cząsteczek leku DM1 przyłączonego na cząsteczkę przeciwciała określano poprzez pomiar absorbancji przy 252 nm i 280 nm i stwierdzono, że wynosi 3,7 cząsteczek leku na cząsteczkę przeciwciała.
P r z y k ł a d 3
Zwierzęta transgeniczne
W celu polepszenia aktywności klinicznej HERCEPTIN®, opracowano mysi model transgeniczny HER2, w którym można by było testować przedklinicznie nowe terapie skierowane wobec HER2. U transgenicznych myszy, które wyrażają zaktywowaną mutacyjnie formę neu, szczurzego homologa HER2, łatwo powstają guzy, ale HER2 który jest nadprodukowany w rakach sutka nie jest zmutowany i tworzenie się guzów u myszy transgenicznych, z nadekspresją niezmutowanego HER2 jest znacznie mniej nasilone (Webster i wsp., Semin. Cancer Biol 5: 69-76 [1994];. W celu zwiększenia powstawania guzów z niezmutowanym HER2, zastosowano strategię dalszej nadekspresji niezmutowanego HER2 u transgenicznej myszy. Dowolny promotor, który kieruje ekspresją HER2 w komórkach nabłonkowych gruczołu mlecznego myszy można zastosować w ujawnionych konstruktach. Wiele genów mlecznych, podlega transkrypcji przez elementy promotor/wzmacniacz, które są szczególnie aktywne w gruczołach mlecznych. Białka mleka obejmują geny kodujące kazeiny (a-S1 i β), β-laktoglobulię, α-laktoalbuminę i kwaśne białko serwatki. Promotor β-laktoglobuliny jaja jest dobrze scharakteryzowany i szeroko stosowany w tej dziedzinie (Whiteiaw i wsp., Biochem J. 286: 31-39, [1992]). Jednakże przydatne są również podobne fragmenty promotorowego DNA innych gatunków. Korzystny promotor pochodzi z długiego końcowego powtórzenia (1 TR) mysiego wirusa raka gruczołu mlecznego (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV). Transgeniczny konstrukt HER2 według niniejszego wynalazku został wytworzony przy zastosowaniu promotora 1 TR MMTV.
W celu zwiększenia tworzenia się guzów z niezmutowanym HER2, uzyskaliśmy transgeniczne myszy przy zastosowaniu plazmidu z cDNA HER2, z którego usunięto ATG leżący po stronie 5' w celu
PL 213 213 B1 zapobiegnięcia inicjacji translacji z tego kodonu ATG, co prowadziłoby do zmniejszenia częstości inicjacji translacji z autentycznego kodonu inicjacyjnego HER2 leżącego poniżej (patrz na przykład Child i wsp., J. Biol Chem. 274: 24335-24341 [1999]). Ponadto na końcu 5' został dodany chimerowy intron, który również powinien zwiększać poziom ekspresji, jak doniesiono uprzednio (Neuberger i Williams, Nucleic Acids Res. 16: 6713 [1988]; Buchman i Berg, Mol Cell Biol 8: 4395 [1988]; Brinster i wsp., Proc. Nati Acad. Sci USA 85: 836 [1988]). Chimerowy intron pochodził z wektora Promega, ssaczego wektora ekspresyjnego pCI-neo (bp 890-1022). Koniec 3' jest oflankowany przez eksony 4 i 5 ludzkiego hormonu wzrostu i sekwencje poliadenylacji. Ponadto, użyto myszy FVB ponieważ szczep ten jest bardziej wrażliwy na rozwój nowotworu. Zastosowano promotor MMTV-1 TR dla zapewnienia specyficznej tkankowo ekspresji HER2 w gruczole mlecznym. Zwierzeta karmiono pokarmem AIN 76A w celu zwiększenia podatności na tworzenie się guzów (Rao i wsp., Breast Cancer Res. and Treatment 45: 149-158 [1997]). Sekwencja nukleotydowa tego plazmidowego konstruktu transgenicznego (SEK ID nr: 1) jest pokazana na Fig. 4.
Zwierzęta odpowiednie do doświadczeń transgenicznych można otrzymać ze standardowych źródeł handlowych, takich jak Taconic (Germantown, N.Y.). Odpowiednich jest wiele szczepów, ale samice myszy FVB są preferowane z powodu ich większej podatności na tworzenie się guzów. Samce FVB używano do krzyżówek, a osobniki CD1 po wazektomii używano do stymulowania pseudociąży. Myszy po wazektomii można otrzymać od dowolnego dostawcy. Krzyżówka założycielska była bądź z myszy FVB bądź myszy hecerozygotycznych 29/BL6 x FVB p53. Myszy heterozygotyczne pod względem allelu p53 używano dla potencjalnego zwiększania tworzenia się guzów. Jednakże udowodniono, że nie jest to konieczne. A zatem niektóre guzy F1 są ze szczepów mieszanych. Guzy założycielskie są jedynie z FBV. Otrzymano sześć myszy założycielskich, u niektórych rozwinął się guz bez posiadania potomstwa.
P r z y k ł a d 4
Transgeniczna mysz HFR2 jako model nowotworu dla oceny terapii skierowanej wobec HER2
Biopsje gruczołu mlecznego od jednej z transgenicznych myszy założycielskich przeprowadzone jak odpisano w Przykładzie 3, wykazały stopień ekspresji HER2 3+, określony poprzez barwienie histochemiczne, w wieku około dwóch miesięcy. Mierzono ilość zewnątrzkomórkowej domeny (ECD) wyrzucanej do surowicy i stwierdzono, że wynosi około 1,2 ng/ml (Huang i wsp., jak wyżej). U myszy tych rozwijał się następnie guz gruczołu mlecznego w wieku 5 miesięcy, po urodzeniu 4 potomstwa. 3
Guz usuwano chirurgicznie w warunkach aseptycznych i rozdrabniano na małe kawałki, 2 mm3 które przeszczepiano następnie do ciała tłuszczowego gruczołu mlecznego dzikiej samicy FVB. Guzy rozwijały się u 22 z 321 myszy biorców, z opóźnieniem 5 tygodni. W następnym pasażu guzy rozwinęły się z po krótszym okresie latencji i rosły szybciej, a szansa wystąpienia nowotworu wzrosła do >95% biorców. Ekspresja HER2 określona poprzez barwienie histochemiczne w pierwotnym guzie wynosiła 3+ choć była heterogenna, ale stawała się jednorodnie 3+ po pierwszym pasażu.
Leczenie myszy z nowotworem poprzez zastosowanie HERCEPTIN® lub mysiego przeciwciała 4D5, z którego pochodził humanizowany HERCEPTIN® miało tylko umiarkowany efekt na wzrost przeszczepianych guzów (Fig. 5). Ekspresja HER2 była 3+ w guzach, które rosły w czasie terapii HERCEPTIN® lub 4D5 wskazując, że nie było selekcji wobec guzów HER2-ujemnych. Ponadto wykrywano cy3-HERCEPTJN® na komórkach nowotworowych po wstrzyknięciu ich myszom z nowotworem, co wskazuje że brak skuteczności nie był spowodowany niepowodzeniem w dotarciu przeciwciała do guza.
W oparciu o stałą ekspresję HER2 i brak odpowiedzi tego modelu nowotworowego na HERCEPTIN®, przetestowano nowe podejście stosując HERCEPTIN® połączony z maitansynoidem DM1, jak opisano w Przykładzie 3. Fig. 5 pokazuje, że koniugat HERCEPTIN®-DM1 wykazuje dramatyczną aktywność przeciwnowotworową w tym modelu. RITUXAN®, niespokrewnione monoklonalne przeciwciało anty-CD20 użyto jako kontrolę negatywną w tych badaniach. Odpowiedź na HERCEPTIN® w porównaniu do przeciwciała kontrolnego, RITUXAN®, jest niewielka, ma miejsce natomiast uderzająca aktywność przeciwnowotworowa w przypadku koniugatu maitansynoid-HERCEPTIN®. Jak pokazano na Fig. 5, wszystkie myszy traktowane HERCEPTIN®-maitansynoid wykazywały kurczenie się guzów, jakkolwiek żaden z guzów nie znikał. Po około 4 tygodniach guz zaczynał ponownie rosnąć. Pięć myszy poświecono w tym czasie. Stwierdzono, ze ich guzy wyrażają HER2 na poziomie 3+. Nie było więc selekcji na guzy KER2-ujemne. W oparciu o te obserwacje pozostałe 3 myszy traktowano HERCEPTIN®-maytansinoid przez 5 kolejnych dni. Guzy te ponownie cofały się w odpowiedzi na leczenie.
PL 213 213 B1
Wszystkie odnośniki zacytowane w tym opisie i zacytowane w nich odnośniki są tu dokładnie włączone jako odniesienie.
Depozyt materiału biologicznego
Następujące linie hybrydom zostały zdeponowane w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Oznaczenie przeciwciała Nr ATCC Data depozytu
7C2 ATCC HB-12215 17 październik 1996
7F3 ATCC HB-12216 17 październik 1996
4D5 ATCC CRL 10463 24 maj 1990
2C4 ATCC HB-12697 3 kwiecień 1999
Depozyty te wykonano zgodnie z porozumieniem budapeszteńskim dotyczącym międzynarodowego trybu dokonywania depozytów dla celów procedur patentowych (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure) i zawartych tam regulacji (Porozumienie Budapeszteńskie). To zapewni utrzymywanie żywych hodowli przez 30 lat od daty zdeponowania. Organizmy będą udostępniane przez ATCC zgodnie z porozumieniem Budapeszteńskim i zgodnie z porozumieniem pomiędzy Genentech, Inc. a ATCC, które zapewnia stały i nieograniczony dostęp publiczny do potomstwa hodowli po przyznaniu właściwego patentu USA albo po publicznym udostępnieniu, w zależności od tego co będzie pierwsze i zapewnia dostępność potomstwa upoważnionym do tego przez komisję USA U.S. Commissioner of Patents and Trademarks zgodnie z 35 USC $122 i zawartymi tam dotyczącymi tego rozporządzeniami oceniających (włączając w to 37 CFR $ 1.12 ze szczególnym odniesieniem do 836 OG 638).
Beneficjanci niniejszego zgłoszenia zgadzają się, że jeżeli hodowle albo depozyt straci żywotność albo zostanie zgubiony przy przechowywaniu w odpowiednich warunkach, będzie natychmiast zastąpiony po uzyskaniu zawiadomienia żywą próbką tej samej hodowli. Dostępność zdeponowanych szczepów nie ma być traktowana jako licencja na wykonywanie wynalazku w niezgodzie z prawami autorskimi gwarantowanymi przez autorytet dowolnego rządu zgodnie z jego prawami patentowymi.

Claims (13)

1. Zastosowanie koniugatu przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid, przy czym przeciwciało to jest humanizowanym przeciwciałem huMAb4D5-8 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u ssaka, przy czym nowotwór ten charakteryzuje się nadekspresją receptora ErbB2 i nie odpowiada albo odpowiada słabo na leczenie przeciwciałem anty-ErbB2.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nowotworem jest rak.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że rakiem jest rak sutka.
4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że maitansynoidem jest DM1 o strukturze:
PL 213 213 B1 przy czym przeciwciało to jest połączone chemicznie z mitansynoidem poprzez grupę dwusiarczkową lub tioeterową reprezentowaną przez „R.
5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniane przeciwciało i wspomniany maitansynoid są skoniugowane poprzez łącznik chemiczny wybrany z N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propanianu (SPDP), N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanianu (SPP), sukcynomidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (SMCC).
6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że koniugat zawiera od 3 do 5 cząsteczek maitansynoidu na cząsteczkę przeciwciała.
7. Koniugat przeciwciało anty-ErbB2-maitansynoid, znamienne tym, że przeciwciało to jest humanizowanym przeciwciałem huMab4D5-8.
8. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że maitansynoid jest DM1 o strukturze:
przy czym przeciwciało to jest połączone chemicznie z mitansynoidem poprzez grupę dwusiarczkową lub tioeterową reprezentowaną przez „R.
9. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera od 3 do 5 cząsteczek maitansynoidu na cząsteczkę przeciwciała.
10. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że wspomniane przeciwciało i wspomniany maitansynoid są skoniugowane poprzez łącznik chemiczny wybrany z N-sukcynimidylo-3-(2-piry-dylotio)propanianu (SPDP), N-sukcynimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanianu (SPP), sukcynomidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (SMCC).
11. Koniugat jak zdefiniowano w zastrz. 7 do 10, do zastosowania w sposobie leczenia nowotworu u ludzi, przy czym nowotwór ten charakteryzuje się nadekspresją receptora ErbB2 i nie odpowiada lub odpowiada słabo na leczenie przeciwciałem anty-ErbB2, przy czym sposób ten obejmuje podawanie koniugatu człowiekowi.
12. Koniugat do zastosowania według zastrz. 11, przy czym nowotworem jest rak.
13. Koniugat do zastosowania według zastrz. 12, przy czym rakiem jest rak sutka.
PL352678A 1999-06-25 2000-06-23 Zastosowanie koniugatu przeciwcialo anty-ErbB- maitansynoid, koniugat przeciwcialo anty-ErbB-maitansynoid i koniugat do zastosowania w sposobie leczenia nowotworu PL213213B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14131699P 1999-06-25 1999-06-25
US18984400P 2000-03-16 2000-03-16
PCT/US2000/017229 WO2001000244A2 (en) 1999-06-25 2000-06-23 METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ErbB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL352678A1 PL352678A1 (pl) 2003-09-08
PL213213B1 true PL213213B1 (pl) 2013-01-31

Family

ID=26838985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL352678A PL213213B1 (pl) 1999-06-25 2000-06-23 Zastosowanie koniugatu przeciwcialo anty-ErbB- maitansynoid, koniugat przeciwcialo anty-ErbB-maitansynoid i koniugat do zastosowania w sposobie leczenia nowotworu

Country Status (20)

Country Link
EP (5) EP2283866B1 (pl)
JP (3) JP4780633B2 (pl)
KR (1) KR20020012292A (pl)
CN (1) CN100482281C (pl)
AU (1) AU784157B2 (pl)
BR (3) BR0012196A (pl)
CA (1) CA2370466C (pl)
CY (1) CY1120070T1 (pl)
DK (3) DK2283866T3 (pl)
ES (3) ES2466715T3 (pl)
HK (1) HK1220897A1 (pl)
HU (1) HU230586B1 (pl)
IL (2) IL147241A0 (pl)
LT (1) LT2803367T (pl)
MX (1) MXPA01013240A (pl)
NZ (1) NZ515975A (pl)
PL (1) PL213213B1 (pl)
PT (3) PT2283866E (pl)
SI (1) SI2803367T1 (pl)
WO (1) WO2001000244A2 (pl)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2466715T3 (es) * 1999-06-25 2014-06-11 Immunogen, Inc. Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
RU2270029C2 (ru) * 1999-06-25 2006-02-20 Джинентех, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ ОБЛАДАЕТ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ ErbB2 И БЛОКИРОВАТЬ АКТИВАЦИЮ ЛИГАНДОМ РЕЦЕПТОРА ErbB (ВАРИАНТЫ) И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТО АНТИТЕЛО
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
HK1049787B (en) * 1999-10-01 2014-07-25 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP1231944A2 (en) * 1999-11-15 2002-08-21 University Of Southern California Targeted delivery of therapeutic and diagnostic moieties
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
PT1282443E (pt) 2000-05-19 2009-12-04 Genentech Inc Análise de detecção génica para melhorar a probabilidade de uma resposta eficaz a uma terapia do cancro com um antagonista de erbb
AU2002257132A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Erbb interface peptidomimetics and methods of use thereof
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US20030103985A1 (en) 2001-05-18 2003-06-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
EP2270049A3 (en) * 2002-04-12 2011-03-09 Medimmune, Inc. Recombinant anti-interleukin-9-antibody
US20050276812A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
EP1513543B1 (en) 2002-05-23 2010-10-06 The Trustees of The University of Pennsylvania Fas peptide mimetics and uses thereof
EP2263691B1 (en) * 2002-07-15 2012-08-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer with the recombinant humanized monoclonal anti-erbb2 antibody 2C4 (rhuMAb 2C4)
KR100555211B1 (ko) * 2002-07-16 2006-03-03 주식회사 팬제노믹스 항암효과를 갖는 Ｈｅｒ-２/ｎｅｕ ＤＮＡ 백신
EP1391213A1 (en) * 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
JP4703566B2 (ja) * 2003-05-14 2011-06-15 イムノゲン インコーポレーティッド 薬剤複合体組成物
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
CA2530172A1 (en) * 2003-06-27 2005-02-10 Abgenix, Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
US20080267865A1 (en) * 2003-11-28 2008-10-30 Biotech Igg Ab Targeting of Erb Antigens
EP1740954B1 (en) * 2004-04-07 2015-08-19 Genentech, Inc. Mass spectrometry of antibody conjugates
WO2005117952A2 (en) * 2004-05-14 2005-12-15 Abraxis Bioscience, Inc. Treatment methods utilizing albumin-binding proteins as targets
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
CA2591148A1 (en) 2004-12-09 2006-06-15 Centocor, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
UA94899C2 (ru) 2005-01-21 2011-06-25 Дженентек, Инк. Фиксированное дозирование антител к her
DK1850874T3 (da) 2005-02-23 2013-11-11 Genentech Inc Forlængelse af tid til sygdomsprogression eller overlevelse for ovariecancer ved anvendelse af pertuzumab
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
JP2006316040A (ja) * 2005-05-13 2006-11-24 Genentech Inc Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）補助療法
JP2009503105A (ja) 2005-08-03 2009-01-29 イミュノジェン・インコーポレーテッド 免疫複合体製剤
US8080534B2 (en) 2005-10-14 2011-12-20 Phigenix, Inc Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer
BRPI0808418A2 (pt) 2007-03-02 2014-07-22 Genentech, Inc Predição de resposta a um inibidor de her
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
ES2583377T3 (es) 2007-06-08 2016-09-20 Genentech, Inc. Marcadores de expresión génica de la resistencia tumoral al tratamiento con inhibidor de HER2
MX2010009940A (es) 2008-03-14 2010-09-28 Genentech Inc Variaciones geneticas asociadas con resistencia a drogas.
HUE035184T2 (en) 2008-03-18 2018-05-02 Genentech Inc Combinations of an anti-HER2 antibody-drug conjugate and docetaxel
JP5646457B2 (ja) 2008-04-29 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
AR072000A1 (es) 2008-06-03 2010-07-28 Abbott Lab Proteinas de union multivalentes con capacidad de unir dos o mas antigenos y usos de la misma
JP2011523853A (ja) 2008-06-03 2011-08-25 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
BRPI0915448A2 (pt) 2008-07-08 2015-11-10 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo para prostaglandina e2 e usos das mesmas
EP3543256A1 (en) 2009-01-12 2019-09-25 Cytomx Therapeutics Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
NZ594665A (en) 2009-03-20 2013-08-30 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
SG176073A1 (en) 2009-05-29 2011-12-29 Hoffmann La Roche Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
KR20120060877A (ko) 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
TW201119676A (en) 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
MX2012008958A (es) 2010-02-18 2012-08-23 Genentech Inc Antagonista de neurogulina y usos de los mismos para el tratamiento contra el cancer.
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
CA3051311A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
US9714294B2 (en) 2010-05-27 2017-07-25 Genmab A/S Monoclonal antibodies against HER2 epitope
MX336540B (es) 2010-06-08 2016-01-22 Genentech Inc Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
ES2544608T3 (es) * 2010-11-17 2015-09-02 Genentech, Inc. Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol
US20130245233A1 (en) 2010-11-24 2013-09-19 Ming Lei Multispecific Molecules
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
US10570211B2 (en) 2011-01-24 2020-02-25 Gilead Sciences, Inc. Antibodies selective for cells presenting EGFR at high density
AU2012245116A1 (en) 2011-04-20 2013-11-07 Genmab A/S Bispecific antibodies against HER2 and CD3
MX2013013054A (es) 2011-05-12 2014-02-20 Genentech Inc Metodo de monitoreo de lc-ms/ms de reaccion multiple para detectar anticuerpos terapeuticos en muestras de animales utilizando peptidos de firma de estructura.
KR20140057326A (ko) 2011-08-17 2014-05-12 제넨테크, 인크. 뉴레귤린 항체 및 그의 용도
WO2013052114A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Fmc Corporation Stabilizer composition of microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose, method for making, and uses
US9055757B2 (en) 2011-10-05 2015-06-16 Fmc Corporation Stabilizer composition of co-attrited microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose, method for making, and uses
WO2013055987A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9327023B2 (en) 2011-10-25 2016-05-03 The Regents Of The University Of Michigan HER2 targeting agent treatment in non-HER2-amplified cancers having HER2 expressing cancer stem cells
RU2019103083A (ru) 2011-11-30 2019-03-22 Дженентек, Инк. МУТАЦИИ ErbB3 ПРИ РАКЕ
BR112014013792B8 (pt) 2011-12-09 2020-11-10 Dupont Nutrition Usa Inc composição estabilizadora co-atritada compreendendo carboximetilcelulose de alto grau de substituição e baixa viscosidade, alimento, composição industrial, e, método para fazer a composição estabilizadora
EP2788500A1 (en) 2011-12-09 2014-10-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Identification of non-responders to her2 inhibitors
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
WO2013148315A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
CN112587671A (zh) 2012-07-18 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
PL2906251T3 (pl) 2012-10-12 2018-02-28 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało anty-CD22
WO2014057117A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
KR101645905B1 (ko) 2012-10-12 2016-08-04 스피로즌 살 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
HRP20181646T2 (hr) 2012-10-12 2019-08-09 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin - anti-psma protutijela
MY171664A (en) 2012-11-01 2019-10-22 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6998646B2 (ja) 2012-11-30 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－ｌ１阻害剤併用療法を必要とする患者の同定
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
AU2013366493B2 (en) 2012-12-21 2017-08-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2014140862A2 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2968585B1 (en) 2013-03-13 2018-07-18 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6445519B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
US10442836B2 (en) 2013-08-12 2019-10-15 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo[E]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
RU2656161C1 (ru) 2013-11-19 2018-05-31 Ремеджен, Лтд. Анти-неr2 антитело и его конъюгат
JP6895254B2 (ja) 2013-12-16 2021-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
CA2928952A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
BR112016013258A2 (pt) 2013-12-16 2018-01-16 Genentech Inc composto conjugado anticorpo-droga, composição farmacêutica, método para tratar câncer e kit
DK3424955T3 (da) 2013-12-25 2025-06-16 Daiichi Sankyo Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af anti-trop2 antistof-lægemiddelkonjugat
AU2015205753A1 (en) 2014-01-10 2016-07-21 Birdie Biopharmaceuticals Inc. Compounds and compositions for treating HER2 positive tumors
EP4212552B1 (en) 2014-01-31 2024-11-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-drug conjugate
US11185594B2 (en) 2014-04-10 2021-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited (Anti-HER2 antibody)-drug conjugate
AU2015271100B2 (en) * 2014-06-06 2020-07-30 Redwood Bioscience, Inc. Anti-HER2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
WO2016004876A1 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Shanghai Birdie Biotech, Inc. Anti-pd-l1 combinations for treating tumors
CN112587672A (zh) 2014-09-01 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-pd-l1结合物
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10149913B2 (en) 2014-09-12 2018-12-11 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
US10077318B2 (en) 2014-09-12 2018-09-18 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP2017533887A (ja) 2014-09-17 2017-11-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピン類及びその抗体ジスルフィドコンジュゲート
US20170252335A1 (en) 2014-10-17 2017-09-07 Novartis Ag Combination of Ceritinib with an EGFR Inhibitor
US10780096B2 (en) 2014-11-25 2020-09-22 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2969689A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
SG11201708223QA (en) 2015-04-17 2017-11-29 Bristol Myers Squibb Co Compositions comprising a combination of an anti-pd-1 antibody and another antibody
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
AU2016286898B2 (en) 2015-06-29 2022-12-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for selectively manufacturing antibody-drug conjugate
CA2990465A1 (en) * 2015-07-07 2017-01-12 Genentech, Inc. Combination therapy with an anti-her2 antibody-drug conjugate and a bcl-2 inhibitor
NZ741261A (en) 2015-10-02 2019-11-29 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
EP3365025B1 (en) 2015-10-20 2020-07-15 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
CN106943597A (zh) 2016-01-07 2017-07-14 博笛生物科技（北京）有限公司 用于治疗肿瘤的抗-egfr组合
CN115554406A (zh) 2016-01-07 2023-01-03 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-cd20组合
CN115350279A (zh) 2016-01-07 2022-11-18 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-her2组合
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP3433621A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US20190151346A1 (en) 2016-05-10 2019-05-23 INSERM (Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
LT3458053T (lt) 2016-05-20 2022-02-25 Biohaven Pharmaceutical Holding Company Ltd. Riluzolo, rilizolo provaistų arba riluzolo analogų panaudojimas kartu su imunoterapijomis vėžio formų gydymui
CN118436801A (zh) 2016-05-20 2024-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
CN109789211A (zh) 2016-10-07 2019-05-21 第一三共株式会社 基于抗her2抗体-药物偶联物施予的耐性癌的治疗
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
JPWO2018110515A1 (ja) 2016-12-12 2019-10-24 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
BR112019012847A2 (pt) 2017-01-17 2019-12-10 Daiichi Sankyo Co Ltd anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, células hospedeiras, método para produção de um anticorpo de interesse ou de um fragmento funcional do anticorpo e para produção de um conjugado de anticorpo-fármaco, conjugado de anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, fármaco antitumoral, e, método de tratamento de um tumor.
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
UA125198C2 (uk) 2017-02-08 2022-01-26 Ейдісі Терапьютікс Са Кон'югати піролобензодіазепін-антитіло
EP3589286B1 (en) 2017-03-02 2022-08-03 ASLAN Pharmaceuticals Pte Ltd Dhodh inhibitor for treating haematological cancer
US20210330801A1 (en) 2017-03-02 2021-10-28 Cadila Healthcare Limited Novel protein drug conjugate formulation
IL269026B2 (en) 2017-03-31 2024-12-01 Bristol Myers Squibb Co Anti-pd-1 antibodies for treating tumors in high tumor mutational burden (tmb) patients
SI3612537T1 (sl) 2017-04-18 2022-10-28 Medimmune Limited Konjugati pirolobenzodiazepina
WO2018193102A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
CN118515666A (zh) 2017-04-27 2024-08-20 博笛生物科技有限公司 2-氨基-喹啉衍生物
TW202542161A (zh) 2017-05-15 2025-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物及其用途
WO2018222135A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Aslan Pharmaceuticals Pte Ltd Cancer therapy
JP7145891B2 (ja) 2017-06-14 2022-10-03 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 抗ｃｄ１９ ａｄｃを投与するための投与レジメ
KR20200019226A (ko) 2017-06-23 2020-02-21 버디 바이오파마슈티칼즈, 인크. 약학 조성물
BR112020003003A2 (pt) 2017-08-18 2020-08-11 Medimmune Limited conjugados de pirrolobenzodiazepina
AU2018327171B2 (en) 2017-08-31 2023-03-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
JP7248578B2 (ja) 2017-08-31 2023-03-29 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの新規製造方法
AU2018337815A1 (en) 2017-09-20 2020-03-12 Ph Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs
KR20200064132A (ko) 2017-10-15 2020-06-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
WO2019150985A1 (ja) * 2018-01-31 2019-08-08 国立大学法人東京大学 抗体薬物複合体及びそれを含む医薬組成物
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
BR112020018539A2 (pt) 2018-03-23 2020-12-29 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra mica e/ou micb e usos dos mesmos
KR20200139724A (ko) 2018-03-30 2020-12-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
HUE067382T2 (hu) 2018-05-18 2024-10-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-MUC1-exatecan antitest-hatóanyag konjugátum
EP3831853A4 (en) 2018-07-27 2022-06-01 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PROTEIN-RECOGNIZING DRUG UNIT
KR20250172902A (ko) 2018-07-31 2025-12-09 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트 투여에 의한 전이성 뇌종양의 치료
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
MX2021010477A (es) 2019-03-15 2021-10-01 Medimmune Ltd Dimeros de azetidobenzodiazepina y conjugados que los comprenden para uso en el tratamiento de cancer.
CN110396130B (zh) * 2019-08-23 2020-06-30 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种鼠抗人ErbB2单克隆抗体10A6、编码基因及其制备方法和应用
US11802151B2 (en) * 2019-11-04 2023-10-31 Code Biotherapeutics, Inc. Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) antibodies and uses thereof
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022146947A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
MX2023007650A (es) 2020-12-28 2023-09-11 Bristol Myers Squibb Co Metodos de tratamiento de tumores.
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
IL312728A (en) 2021-11-30 2024-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Protease-cleavable masked antibodies
EP4477674A1 (en) 2022-02-09 2024-12-18 Daiichi Sankyo Company, Limited Environmentally responsive masked antibody and use thereof
EP4531916A1 (en) 2022-06-02 2025-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
JP2026502860A (ja) 2022-12-23 2026-01-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド セレブロン分解剤コンジュゲートおよびその使用
CN121263210A (zh) 2023-04-17 2026-01-02 沛科生物公司 抗体和抗体-药物偶联物以及使用方法和合成工艺及中间体
US20250215087A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy of kras inhibitor and treg depleting agent
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026006688A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Degrader antibody conjugates and uses thereof

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6034997A (ja) 1983-05-09 1985-02-22 ジヨージ、ジヨセフ、トダロ 生物学的活性ポリペプチド類
DE3587657D1 (de) 1984-01-30 1993-12-23 Imp Cancer Res Tech Verbesserungen an wachstumsfaktoren.
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JPH0775478B2 (ja) 1987-05-20 1995-08-09 三菱電機株式会社 交流エレベ−タ制御装置
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
WO1991005264A1 (en) 1989-09-29 1991-04-18 Oncogenetics Partners Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
IL101943A0 (en) 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
JP3571337B2 (ja) 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
JPH08504172A (ja) 1992-06-30 1996-05-07 オンコロジクス，インコーポレイティド 抗−ｅｒｂＢ−２モノクロナール抗体の組み合わせ物及び使用方法
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
ATE186219T1 (de) 1993-03-24 1999-11-15 Berlex Biosciences Kombination von antihormonale und bindende moleküle zur krebsbehandlung
AU6527894A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Prevention of tumors with monoclonal antibodies against (neu)
EP0730646A1 (en) 1993-11-23 1996-09-11 Genentech, Inc. PROTEIN TYROSINE KINASES NAMED Rse
WO1996016673A1 (en) 1994-12-02 1996-06-06 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
ATE483733T1 (de) 1995-06-14 2010-10-15 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
PT1516628E (pt) 1995-07-27 2013-09-24 Genentech Inc Formulação de proteína liofilizada isotónica estável
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
CA2269204C (en) 1996-10-18 2012-01-24 Genentech, Inc. Anti-erbb2 antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
AU9805398A (en) 1997-10-15 1999-05-03 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
WO2000020579A1 (en) 1998-10-02 2000-04-13 Mcmaster University Spliced form of erbb-2/neu oncogene
DK1187632T3 (da) * 1999-05-14 2009-04-06 Genentech Inc Behandling med anti-ErbB2-antistoffer
RU2270029C2 (ru) * 1999-06-25 2006-02-20 Джинентех, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ ОБЛАДАЕТ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ ErbB2 И БЛОКИРОВАТЬ АКТИВАЦИЮ ЛИГАНДОМ РЕЦЕПТОРА ErbB (ВАРИАНТЫ) И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТО АНТИТЕЛО
CN100381172C (zh) * 1999-06-25 2008-04-16 吉尼泰克公司 使用抗-ErbB2抗体治疗前列腺癌
ES2466715T3 (es) * 1999-06-25 2014-06-11 Immunogen, Inc. Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide
US6627196B1 (en) 1999-08-27 2003-09-30 Genentech, Inc. Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011105755A (ja) 2011-06-02
CA2370466A1 (en) 2001-01-04
EP2803367A1 (en) 2014-11-19
HK1133600A1 (zh) 2010-04-01
JP2010270129A (ja) 2010-12-02
ES2662581T3 (es) 2018-04-09
CN1387444A (zh) 2002-12-25
PT2803367T (pt) 2018-03-29
SI2803367T1 (en) 2018-04-30
JP4778101B2 (ja) 2011-09-21
LT2803367T (lt) 2018-03-26
AU784157B2 (en) 2006-02-16
HK1153151A1 (en) 2012-03-23
BRPI0012196B1 (pt) 2018-09-25
NZ515975A (en) 2004-01-30
EP2283867A2 (en) 2011-02-16
AU5632900A (en) 2001-01-31
DK2283867T3 (da) 2014-06-10
HU230586B1 (hu) 2017-02-28
PL352678A1 (pl) 2003-09-08
IL147241A0 (en) 2002-08-14
EP1191944A2 (en) 2002-04-03
CA2370466C (en) 2011-02-08
CN100482281C (zh) 2009-04-29
PT2283866E (pt) 2015-07-20
ES2536676T3 (es) 2015-05-27
EP2283866B1 (en) 2015-02-25
JP2003503365A (ja) 2003-01-28
EP2283867A3 (en) 2012-01-25
BRPI0017590B1 (pt) 2020-02-04
EP2283867B1 (en) 2014-05-21
HK1202446A1 (en) 2015-10-02
ES2466715T3 (es) 2014-06-11
BRPI0012196B8 (pt) 2021-05-25
JP4780633B2 (ja) 2011-09-28
HUP0201616A3 (en) 2004-11-29
KR20020012292A (ko) 2002-02-15
HK1152479A1 (en) 2012-03-02
DK2803367T3 (en) 2018-04-16
EP2977063A1 (en) 2016-01-27
EP2803367B1 (en) 2018-01-31
HUP0201616A2 (en) 2002-08-28
WO2001000244A3 (en) 2001-10-04
CY1120070T1 (el) 2018-12-12
EP2283866A3 (en) 2012-01-25
DK2283866T3 (en) 2015-05-18
HK1220897A1 (en) 2017-05-19
EP2283866A2 (en) 2011-02-16
WO2001000244A2 (en) 2001-01-04
IL147241A (en) 2006-12-10
BRPI0017590B8 (pt) 2021-05-25
BR0012196A (pt) 2002-03-19
MXPA01013240A (es) 2002-06-21
PT2283867E (pt) 2014-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2466715T3 (es) Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide
CN101518653B (zh) 使用抗ErbB抗体-类美坦素偶联物的治疗方法
US7097840B2 (en) Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
JP2003503365A5 (pl)
US20200048362A1 (en) Methods of treatment using anti-erbb antibody-maytansinoid conjugates
HK1133600B (en) Methods of treatment using anti-erbb antibody-maytansinoid conjugates
HK1202446B (en) Methods of treatment using anti-erbb antibody-maytansinoid conjugates
HK1153151B (en) Methods of treatment using anti-erbb antibody-maytansinoid conjugates
HK1152479B (en) Methods of treatment using anti-erbb antibody-maytansinoid conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification