ES2536676T3 - Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide - Google Patents

Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide Download PDF

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Abstract

Conjugado huMAb4D5-8(Herceptin®)-maitansinoide, conjugado de fragmento de anticuerpo huMAb4D5-8 que se une a antígeno-maitansinoide, o una formulación farmacéutica que comprende dicho conjugado huMAb4D5- 8(Herceptin®)-maitansinoide o un conjugado de fragmento de anticuerpo huMAb4D5-8 que se une a antígenomaitansinoide, para utilizar en un método de tratamiento de un tumor, en el que el tumor se caracteriza por la sobreexpresión de ErbB2 y no responde o responde mal al tratamiento con huMAb4D5-8(Herceptin®).

Description

E10010047
11-05-2015
DESCRIPCIÓN
Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide
5 Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos de tratamiento, especialmente terapias contra el cáncer dirigidas a
10 receptores ErbB, utilizando conjugados de anticuerpo anti-receptor ErbB-maitansinoide, y artículos de fabricación adecuados para utilizar en dicho métodos.
Descripción de la técnica relacionada
15 1. Maitansina y maitansinoides
La maitansina fue aislada por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de EEUU n.º 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol (patente de EEUU n.º 4.151.042). Se describen el maitansinol y análogos
20 del maitansinol sintéticos, por ejemplo, en las patentes de EEUU n.os 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533, las descripciones de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.
25 La maitansina y los maitansinoides son muy citotóxicos, pero su uso clínico en la terapia del cáncer se ha visto seriamente limitado por sus graves efectos secundarios sistémicos atribuidos principalmente a su baja selectividad por tumores. Los ensayos clínicos con maitansina han tenido que detenerse debido a los graves efectos adversos sobre el sistema nervioso central y el sistema gastrointestinal (Issel et al., Can. Trtmnt. Rev., 5:199-207 (1978)).
30 2. La familia ErbB de receptores de tirosina quinasas y anticuerpos anti-ErbB
Los miembros de la familia ErbB de receptores de tirosina quinasas son importantes mediadores del crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular. La familia de receptores incluyen cuatro miembros diferenciados, que incluyen el receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR o ErbB1), HER2 (ErbB2 o p185neu), HER3 (ErbB3) y
35 HER4 (ErbB4 o tyro2).
El receptor p185neu fue identificado originariamente como el producto del gen transformante procedente de neuroblastomas de ratas tratadas de modo químico. La forma activada del protooncogén neu se produce como resultado de una mutación puntual (de valina a ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína 40 codificada. Se observa amplificación del homólogo humano de neu en cánceres de mama y ovario, y se correlaciona con una mala prognosis (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); y patente de EEUU n.º 4.968.603). Hasta la fecha, no se ha indicado ninguna mutación puntual análoga a la del protooncogén neu para tumores humanos. También se ha observado la sobreexpresión de ErbB2 (con frecuencia, pero no de forma uniforme, debida a la amplificación de genes) en otros carcinomas, que incluyen carcinomas de 45 estómago, endometrio, glándulas salivares, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga. Véase, entre otros, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol. Cell Biol., 6:955958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. 50 Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer, 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology, 59:46-52 (1991); y McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). ErbB2 puede estar sobreexpresado en cáncer de próstata (Gu et al., Cancer Lett., 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer. 79:2162-70 (1997); y Sadasivan et al., J. Urol., 150:126-31 (1993)). Una forma de corte y empalme del oncogén erbB2 que codifica un receptor ErbB2 constitutivamente fosforilado en la tirosina se describe en la solicitud PCT WO 00/20579,
55 publicada el 13 de abril, 2000. La proteína erbB2 codificada por el variante de corte y empalme tiene una deleción dentro de marco de 16 aminoácidos (CVDLDDKGCPAEQRAS), dos de los cuales son restos cisteína conservados.
Se han descrito anticuerpos dirigidos contra los productos de proteínas de ErbB2 humano y p185neu de rata. Drebin et al. han generado anticuerpos contra el producto del gen neu de rata, p185neu. Véase, por ejemplo, Drebin et al.,
60 Cell, 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991); y el documento WO94/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) indican que mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones diferenciadas de p185neu dan como resultado unos efectos antitumorales sinérgicos en células NIH-3T3 transformadas con neu implantadas en ratones atímicos. Véase, también la patente de EEUU n.º 5.824.311, expedida el 20 de octubre, 1998.
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Se han descrito otros anticuerpos anti-ErbB2 con diversas propiedades en Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993); el documento WO94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992); la patente de EEUU n.º 5.783.186; y Klapper et al., Oncogene, 14:20992109 (1997).
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9(3):1165-1172 (1989) describen la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2 que se caracterizaron utilizando la línea de células de tumor de mama humano SK-BR-3. Se determinó la proliferación celular relativa de las células SK-BR-3 después de la exposición a anticuerpos mediante tinción con violeta cristal de las monocapas después de 72 horas. Utilizando este ensayo, se obtuvo la máxima inhibición con el anticuerpo denominado 4D5, que inhibe la proliferación celular en 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular en un grado menor en este ensayo. También se descubrió que el anticuerpo 4D5 sensibiliza a líneas de células de tumor de mama que sobreexpresan ErbB2 frente a los efectos citotóxicos del TNF-. Véase también la patente de EEUU n.º 5.677.171, expedida el 14 de octubre, 1997. Los anticuerpos anti-ErbB2 analizados en Hudziak et al. han sido caracterizados más a fondo en Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro, 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2):979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research, 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465 (1996); y Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997).
El anticuerpo anti-HER2 monoclonal murino inhibe el crecimiento de líneas de cáncer de mama que sobreexpresan HER2 en el nivel 2+ y 3+, pero no presenta actividad sobre células que expresan niveles más bajos de HER2 (Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. (1993)). Basándose en esta observación, el anticuerpo 4D5 se humanizó (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992)). La versión humanizada denominada HERCEPTIN (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, patente de EEUU n.º 5.821.337) se ensayó en pacientes con cáncer de mama cuyos tumores sobreexpresan HER2, pero que han avanzado después de una quimioterapia convencional (Baselga et al.,
J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996)); Cobleigh et al., J. Clin. Oncol., 17: 2639-2648 (1999)). La mayoría de los pacientes en este ensayo expresan HER2 al nivel 3+, aunque una fracción la constituían tumores 2+. De forma notable, HERCEPTIN induce respuestas clínicas en 15% de los pacientes (una respuesta completa en 4% de los pacientes, y respuestas parciales en 11%), y la mediana de la duración de estas respuests fue de 9,1 meses. HERCEPTIN ha recibido el permiso de comercialización de the Food and Drug Administration el 25 de septiembre, 1998, para el tartamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína de ErbB2.
La búsqueda de homología ha dado como resultado la identificación de otros dos miembros de la familia del receptor ErbB: ErbB3 (patentes de EEUU n.os 5.183.884 y 5.480.968, así como Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989)) y ErbB4 (solicitud de patente EP n.º 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Estos dos receptores muestran una mayor expresión en al menos algunas líneas de células de cáncer de mama.
3. Conjugados de maitansinoide-anticuerpo
En un intento para mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides han sido conjugados con anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides se describen, por ejemplo, en las patentes de EEUU n.os 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1, las descripciones de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8618-8623 (1996) describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado es muy citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas, y muestra actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjuga a través de un enlazador de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno sobre líneas de células de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino, TA.1, que se une al oncogén neu/HER2. La citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansinoide se ensayó in vitro en la línea de células de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de la superficie de HER2 por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al del fármaco de maitansinoide libre, que puede aumentarse aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide muestra una baja citotoxicidad sistémica en ratones.
Aunque HERCEPTIN es un importante avance en el tratamiento de pacientes con cánceres de mama que sobreexpresan ErbB2 que han recibido una extensa terapia anticáncer previa, en general aproximadamente 85% de
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los pacientes en esta población no responden, o responden muy mal, al tratamiento con HERCEPTIN®, y en el ensayo clínico anterior al permiso de comercialización, la mediana del tiempo hasta el avanze de la enfermedad en todos los pacientes tratados fue solo de 3,1 meses. Por tanto, existe una significativa necesidad clínica de desarrollar otras terapias para el cáncer dirigidas a HER2 para los pacientes con tumores que sobreexpresan HER2 u otras enfermedades asociadas con la expresión de HER2 que no responden, o responden muy mal, a un tratamiento con HERCEPTIN .
Descripción resumida de la invención
La presente invención se basa en el inesperado descubrimiento experimental de que los conjugados de HERCEPTIN®-maitansinoide son muy eficaces para el tratamiento de tumores que sobreexpresan HER2 (ErbB2) que no responden, o responden muy mal, a una terapia con HERCEPTIN .
En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un tumor en un mamífero, en el que el tumor se caracteriza por la sobreexpresión de un receptor ErbB y no responde o responde muy mal a un tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB monoclonal, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado del anticuerpo anti-ErbB con un maitansinoide.
En una realización preferida, el paciente es humano. En otra realización preferida, el receptor ErbB es ErbB2 (HER2) humano. El método no se limita por el mecanismo de acción del anticuerpo anti-ErbB utilizado. De este modo, el anticuerpo anti-ERbB puede tener, por ejemplo, propiedades inhibidoras del crecimiento y/o puede inducir la muerte celular y/o la apoptosis. En una realización particularmente preferida, el método se refiere al tratamiento del cáncer, que incluye, sin limitación, cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, colorrectal, tiroides, pancreático, próstata y vejiga. Preferiblemente, el cáncer es cáncer de mama, en particular cáncer de mama que sobreexpresa ErbB2 a un nivel 2+ o superior, más preferiblemente a un nivel 3+. Un grupo preferido de anticuerpos tiene una característica biológica de un anticuerpo monoclonal 4D5, o se une esencialmente al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal 4D5, siendo particularmente preferida una forma humanizada del anticuerpo monoclonal murino 4D5 (ATCC CRL 10463).
El maitansinoide utilizado en los conjugados de la presente invención puede ser maitansina o, preferiblemente, maitansinol o un éster de maitansinol. El anticuerpo y el maitansinoide se pueden conjugar mediante un enlazador químico biespecífico, tal como N-succinimidil-4-(2-piridiltio)propanoato (SPDP) o N-succinimidil-4-(2piridiltio)pentanoato (SPP). El grupo de enlace entre el anticuerpo y el maitansinoide puede ser, por ejemplo, un grupo difulfuro, tioéter, lábil a ácido, fotolábil, lábil a peptidasa o lábil a esterasa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un conjugado anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide, y que comprende además un prospecto o etiqueta que indica que la composición se puede utilizar para tratar el cáncer caracterizado por la sobreexpresión de un receptor ErbB, preferiblemente a un nivel 2+ o superior.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la estructura del maitansinoide denominado "DM1". La figura 2 ilustra la estructura de un conjugado de HERCEPTIN®-DM1. La figura 3 es el perfil de elución del conjugado de HERCEPTIN®-DM1 sobre una columna de filtración en gel de Sephacryl S300. La figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de una construcción de plásmido con el transgén HER2 (SEQ ID NO:1) que dirige la expresión de HER2 humano nativo (ErbB2) en la glándula mamaria de un ratón transgénico. La figura incluye la secuencia de nucleótidos del inserto de ADNc de HER2 (ErbB2) (SEQ ID NO:2), así como la secuencia de aminoácidos deducida de HER2 (ErbB2) (SEQ ID NO:3), que incluye la secuencia señal. Dentro de SEQ ID NO:3, los restos desde aproximadamente 22 hasta aproximadamente 645, ambos inclusive, representan el dominio extracelular de HER2 (ErbB2). La figura 5 ilustra el efecto de HERCEPTIN®-DM1 sobre tumores HER2-transgénicos. Se trasplantaron trozos de 2 mm3 de tumores MMTV-HER2-transgénicos hacia la almohadilla de grasa mamaria de ratones FVB. Cuando los tumores alcanzaron 250 mm3, grupos de 8 ratones fueron inyectados i.v. en 5 días consecutivos con un conjugado de HERCEPTIN®-DM1. Otros dos grupos de ratones fueron tratados i.p. dos veces semanales con 10 mg/kg de HERCEPTIN o RITUXAN . La figura 6 muestra la secuencia de la región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-HER2 humanizado 2C4. La figura 7 muestra la secuencia de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-HER2 humanizado 2C4.
Descripción detallada de la invención
1. Definiciones
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A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención (Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y., 1994). Los expertos en la técnica reconocerán muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria que pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. En efecto, la presente invención no se limita de ningún modo a los métodos y los materiales descritos. Para los objetivos de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos y expresiones.
Un "receptor ErbB" o "ErbB" es un receptor de proteína tirosina quinasa que pretenece a la familia de receptores ErbB y que incluye receptores ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) y ErbB4 (HER4) y otros miembros de esta familia que serán identificados en el futuro. La definición incluye específicamente receptores ErbB codificados por formas de corte y empalme de los correspondientes oncogenes erbB que incluyen, sin limitación, el variante de deleción de ErbB2 descrito en la publicación PCT n.º WO 00/20579 (publicada el 13 de abril, 2000). El receptor ErbB comprenderá en general un dominio extracelular, que puede unirse a un ligando de ErbB; un dominio transmembrana lipófilo; un dominio de tirosina quinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización carboxilo-terminal que porta varios restos tirosina que pueden estar fosforilados. El receptor ErbB puede ser un receptor ErbB "de secuencia nativa" o un derivado funcional, tal como uno de sus "variantes de secuencia de aminoácidos". Preferiblemente, el receptor ErbB es el receptor ErbB humano de secuencia nativa.
Los términos y la expresión "ErbB1", "receptor del factor del crecimiento epidérmico" y "EGFR" se emplean de modo intercambiable en la presente memoria y se refieren a EGFR de secuencia nativa, tal como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem., 56:881-914 (1987), que incluye sus formas mutantes naturales (por ejemplo, un mutante de deleción de EGFR, como en Humphrey et al., PNAS (USA), 87:4207-4211 (1990)), y sus derivados funcionales, tales como variantes de secuencia de aminoácidos. erbB1 se refiere al gen que codifica el producto de proteína de EGFR.
Los términos "EbrB2" y "HER2" también se emplean de modo intercambiable en la presente memoria y se refieren a la proteína de HER2 humano de secuencia nativa descrita, por ejemplo, en Semba et al., PNAS (USA), 82:64976501 (1985), y Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986) (n.º de registro de Genebank X03363), y los derivados funcionales, tales como sus variantes de secuencia de aminoácidos. El término erbB2 se refiere al gen que codifica HER2 humano, y neu se refiere al gen que codifica p185neu de rata. El HER2 preferido es el HER2 humano de secuencia nativa. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a HER2 incluyen los MAb 4D5 (ATCC CRL 10463), 2C4 (ATCC HB-12697), 7F3 (ATCC HB-12216), y 7C2 (ATCC HB 12215) (véase la patente de EEUU n.º 5.772.997; WO98/77797; y la patente de EEUU n.º 5.840.525). Los anticuerpos anti-HER2 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®), tal como se describe en la tabla 3 de la patente de EEUU n.º 5.821.337 incorporada expresamente en el presente documento por referencia; y 520C9 humanizado (documento WO93/21319). Los anticuerpos anti-HER2 humanos se describen en la patente de EEUU n.º 5.772.997, expedida el 30 de junio, 1998, y el documento WO 97/00271, publicado el 3 de enero, 1997.
"ErbB3" y "HER3" se refieren al polipéptido del receptor según se describe, por ejemplo, en las patentes de EEUU n.º 5.183.884 y 5.480.968, así como en Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989), y los derivados funcionales, que incluyen sus variantes de secuencia de aminoácidos. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a HER3 se describen en la patente de EEUU n.º 5.968.511 (Akita y Sliwkowski), por ejemplo, el anticuerpo 8B8 (ATCC HB 12070) o uno de sus variantes humanizados.
Los términos "ErbB4" y "HER4" en la presente memoria se refieren al polipéptido del receptor, tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente EP n.º 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), y los derivados funcionales, que incluyen sus variantes de secuencia de aminoácidos, tales como las isoformas de HER4 descritas en el documento WO 99/19488.
Un polipéptido de EGFR, HER2, HER3 o HER4 "nativo" o "de secuencia nativa" puede aislarse de la naturaleza, producirse mediante técnicas de la tecnología del ADN recombinante, sintetizarse de modo químico, o producirse mediante cualquier combinación de estos métodos o de métodos similares.
Los "derivados funcionales" incluyen variantes de secuencia de aminoácidos y derivados covalentes del polipéptido nativo, con la condición de que conserven una actividad biológica cualitativa del correspondiente polipéptido nativo. Los variantes de secuencia de aminoácidos en general se diferencian de una secuencia nativa en la sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos en cualquier posición dentro de una secuencia de aminoácidos nativa. Los variantes de deleción incluyen fragmentos de los polipéptidos nativos, y los variantes que tienen truncamientos N-y/o C-terminales. Normalmente, los variantes de secuencia de aminoácidos poseerán al menos aproximadamente 70% de homología, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de homología con un polipéptido nativo.
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La "homología" se define como el porcentaje de restos en el variante de secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de homología. Los métodos y los programas informáticos para el alineamiento son muy conocidos en la técnica. Uno de estos programas informáticos es "Align 2", creado por Genentech, Inc., que se ha sido archivado con la documentación para el usuario en the United States Copyright Office, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre, 1991.
Un "ligando de ErbB" significa un polipéptido que se une y/o activa un receptor ErbB. El lilgando de ErbB de interés concreto en la presente memoria es un ligando de ErbB humano de secuencia nativa, tal como el factor del crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem., 247:7612-7621 (1972)); el factor del crecimiento transformante-alfa (TGF-alfa) (Marquardt et al., Science, 223:1079-1082 (1984)); la anfirregulina, también conocida como factor del crecimiento autocrino de queratinocitos o schwanoma (Shoyab et al., Science, 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990); y Cook et al., Mol. Cell Biol., 11:2547-2557 (1991)); la betacelulina (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993); y Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); el factor del crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); la epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995); y Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)), una herregulina (véase a continuación); la neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); la neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9562-9567 (1997)); o cripto(CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). Los ligandos de ErbB que se unen a EGFR incluyen EGF, TGF-alfa, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF y epirregulina. Los ligandos de ErbB que se unen a HER3 incluyen herregulinas. Los ligandos de ErbB capaces de unirse a HER4 incluyen betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3 y herregulinas.
Una "herregulina" (HRG), cuando se emplea en la presente memoria, se refiere a un polipéptido que activa los complejos de proteínas de ErbB2-ErbB3 y ErbB2-ErbB4 (es decir, induce la fosforilación de los restos tirosina en el complejo tras su unión a él). Se describen diversos polipéptidos de herregulina englobados por este término en Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); el documento WO 92/20798; Wen et al., Mol. Cell. Biol., 14(3):19091919 (1994); y Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993), por ejemplo. El término incluye los fragmentos biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido de HRG natural, tal como uno de sus fragmentos de dominio similar a EGF (por ejemplo, HRGβ177-244).
Un "heterooligómero de ErbB" en la presente memoria es un oligómero asociado de forma no covalente que comprende al menos dos receptores ErbB diferentes. Estos complejos pueden formarse cuando una célula que expresa dos o más receptores ErbB se expone a un ligando de ErbB y puede aislarse mediante inmunoprecipitación y analizarse mediante SDS-PAGE según se describe en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por ejemplo. Los ejemplos de estos heterooligómeros de ErbB incluyen los complejos de EGFR-HER2, HER2-HER3 y HER3-HER4. Además, el heterooligómero de ErbB puede comprender dos o más receptores HER2 combinados con un receptor ErbB diferente, tal como HER3, HER4 o EGFR. En el heterooligómero pueden incluirse otras proteínas, tales como una subunidad del receptor de citoquinas (por ejemplo, gp130).
En el contexto de los variantes de HER2, tales como fragmentos de HER2, la expresión "que tiene la actividad biológica de un HER2 humano nativo" se emplea para referirse a la capacidad cualitativa de dichos fragmentos para inducir el crecimiento tumoral cuando se sobreexpresan en un modelo animal (transgénico o no transgénico).
Un "tumor", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier crecimiento y proliferación celular neoplásico, tanto maligno como benigno, y a todos los tejidos y las células precancerosos y cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen el trastorno fisiológico en mamíferos que se caracteriza generalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Los ejemplos más concretos de etos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epitelial), cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer renal o de riñón, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor ErbB es un cáncer que tiene niveles significativamente mayores de un receptor ErbB, tal como HER2, en la superficie de sus células, comparado con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Esta sobreexpresión puede estar provocada por una amplificación de genes o por una mayor transcripción o traducción. La sobreexpresión del receptor ErbB puede ser determinada en un ensayo de diagnóstico
o prognóstico evaluando unos mayores niveles de la proteína de ErbB presente sobre la superficie de una célula (por ejemplo, a través de un ensayo de inmunohistoquímica; IHC). Como alternativa, o además, se pueden medir los niveles de ácidos nucleicos que codifican ErbB en la célula, por ejemplo, a través de hibridación in situ fluorescente
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(FISH, véase el documento WO98/45479, publicado en octubre, 1998), análisis de la transferencia Southern, o técnicas de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), tales como una PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR). También se puede estudiar la sobreexpresión del receptor ErbB midiendo el antígeno desprendido (por ejemplo, el dominio extracelular de ErbB) en un fluido biológico, tal como suero (véase, por ejemplo, la patente de EEUU n.º 4.933.294, expedida el 12 de junio, 1990; el documento WO91/05264, publicado el 18 de abril, 1991; la patente de EEUU n.º 5.401.638, expedida el 28 de marzo, 1995; y Sias et al., J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)). Además de los anteriores ensayos, los expertos en la técnica pueden utilizar diversos ensayos in vivo. Por ejemplo, se pueden exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a las células en el paciente, por ejemplo, mediante barrido externo para detectar radiactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo.
Los tumores que sobreexpresan HER2 se clasifican mediante puntuaciones inmunohistoquímicas que se corresponden con el número de copias de moléculas de HER2 expresadas por célula, y esto puede realizarse de modo bioquímico: 0 = 0-10.000 copias/célula, 1+ = al menos aproximadamente 200.000 copias/célula, 2+ = al menos aproximadamente 500.000 copias/célula, 3+ = al menos aproximadamente 2.000.000 copias/célula. La sobreexpresión de HER2 al nivel 3+, que conduce a una activación independiente del ligando de la tirosina quinasa (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7159-7163 (1987)), se produce en aproximadamente 30% de los cánceres de mama y, en estos pacientes, la supervivencia sin recaída y la supervivencia global son menores (Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987)).
A la inversa, un cáncer que "no se caracteriza por la sobreexpresión de un receptor ErbB" es un cáncer que, en un ensayo de diagnóstico, no expresa unos niveles mayores que los niveles normales de receptores ErbB, comparados con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido.
Un cáncer "independiente de hormonas" es un cáncer cuya proliferación no depende de la presencia de una hormona que se une a un receptor expresado por las células en el cáncer. Estos cánceres no sufren una regresión clínica después de la administración de estrategias farmacológicas o quirúrgicas que reducen la concentración de hormonas en el tumor o cerca del tumor. Los ejemplos de cánceres independientes de hormonas incluyen cáncer de próstata independiente de andrógenos, cáncer de mama independiente de estrógenos, cáncer endometrial y cáncer de ovario. Estos cánceres pueden comenzar como tumores dependientes de hormonas y avanzar desde un estadio sensible a hormonas hasta un tumor refractario a hormonas después de una terapia antihormonal.
El término "anticuerpo" en la presente memoria se emplea en su sentido más amplio e incluye específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada.
El término "anticuerpo monoclonal" se emplea en la presente memoria para indicar un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en cantidades pequeñas. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen a un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden ser sintetizados sin contaminación por otros anticuerpos. El adjetivo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante algún método concreto. Por ejemplo, pueden prepararse los anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención mediante el método del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EEUU n.º 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bancos de anticuerpos de fagos, utilizando las técnicas describas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales en la presente memoria incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos", en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie concreta o que pertenecen a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas u homólogas a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (patente de EEUU n.º 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos primatizados que comprenden secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, monos cercopitecos, simios, etc.) y secuencias de la región constante humanas.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente 7
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su región variable o de unión al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de un fragmento o fragmentos de anticuerpos.
Un anticuerpo "intacto" es un anticuerpo que comprende una región variable de unión al antígeno, así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2, y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humanos) o sus variantes de secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tenga la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región de marco (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más la actuación del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y generalmente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
Los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®), tal como se describe en la tabla 3 de la patente de EEUU n.º 5.821.337 incorporada expresamente en el presente documento por referencia; y los anticuerpos 520C9 humanizado (documento WO93/21319) y 2C4 humanizado, como que los que aparecen en la figura 6.
Las "funciones efectoras" de los anticuerpos se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectores de anticuerpos incluyen la unión a C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento; la unión al receptor de Fc; la citoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); la fagocitosis; la infrarregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden clasificarse en diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos también pueden dividirse en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se denominan, , , , y , respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.
La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen al anticuerpo unido sobre una célula diana y después provocan la lisis de la célula diana. Las principales células para mediar en la ADCC, las células NK, solo expresan Fc RIII, mientras que los monocitos expresan Fc RI, Fc RII y Fc RIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tales como los descritos en las patentes de EEUU n.os 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBCM) y células asesinas naturales (NK). Como alternativa, o además, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos Fc RIII y realizan la función efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, siendo preferidas las PMBC y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse a partir de su fuente natural, por ejemplo, a partir de sangre o PMBC, tal como se describe en la presente memoria.
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El término "receptor de Fc" o el término "FcR" se emplean para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es un FcR que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc RI, Fc RII y Fc RIII, que incluyen los variantes alélicos y las formas de corte y emplamen alternativo de estos receptores. Los receptores Fc RII incluyen Fc RIIA (un "receptor activador") y Fc RIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador Fc RIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor Fc RIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase revisión M. en Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcR se analizan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-341 (1995). El término "FcR" de la presente memoria incluye otros FcR, que incluyen los que se identificarán en el futuro. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejada con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, según se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Los "anticuerpos nativos" normalmente son glicoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, y el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados a intervalos regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH), seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene en un extremo un dominio variable (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos aminoácidos concretos forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
El término "variable", tal como se emplea en conexión con los anticuerpos, se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables de anticuerpos se diferencian mucho en secuencia entre los anticuerpos, y se emplean en la unión y la especificidad de cada anticuerpo concreto por su antígeno concreto. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada nativas comprenden cada uno cuatro FR, que en gran parte adoptan una configuración en lámina, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
El término "región hipervariable", cuando se emplea en la presente memoria, se refiere a los restos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende restos aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los restos 24-34 (L1), 5056 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Los restos de "región de marco" o "FR" son los restos del dominio variable que son distintos a los restos de la región hipervariable, según se define en la presente memoria.
Un anticuerpo "aislado" es un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que pueden interferir con los usos de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpos estará purificado (1) hasta más del 95% en peso del anticuerpo, según se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferiblemente en más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos Nterminal o internos mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante 9 15
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SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, normalmente el anticuerpo aislado prepará mediante al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo, antígeno ErbB2, es un anticuerpo capaz de unirse al antígeno con una afinidad suficiente de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a una célula que expresa el antígeno y/o para el transporte dirigido de un citotóxico u otro agente quimioterapéutico, tal como un maitansinoide. Cuando el anticuerpo es un anticuerpo que se une a ErbB2, normalmente se une preferentemente a ErbB2, en oposición a otros receptores ErbB, y puede ser un anticuerpo que no presente reacción cruzada significativa con otras proteínas, tales como EGFR, ErbB3 o ErbB4. En estas realizaciones, el grado de unión del anticuerpo a estas proteínas que no son ErbB2 (por ejemplo, la unión de la superficie celular al receptor endógeno) será menor que 10%, según se determina mediante análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA). A veces, el anticuerpo anti-ErbB2 no presenta reacción cruzada significativa con la proteína neu de rata, por ejemplo, según se describe en Schecter et al., Nature, 312:513 (1984); y Drebin et al., Nature, 312:545-548 (1984).
A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo monoclonal 4D5" (en inglés “monoclonal antibody 4D5” y “4D5 monoclonal antibody” se refiere a un anticuerpo que tiene restos de unión al antígeno del anticuerpo 4D5 murino o que se derivan del anticuerpo 4D5 murino. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4D5 puede ser un anticuerpo monoclonal 4D5 murino (ATCC CRL 10463) o uno de sus variantes, tales como un anticuerpo 4D5 humanizado, que posea restos aminoácidos de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal 4D5 murino. Los ejemplos de anticuerpos 4D5 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como en la patente de EEUU n.º 5.821.337, siendo preferido el anticuerpo 4D5 humanizado huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®).
Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo indicado, tal como el anticuerpo monoclonal denominado 4D5, es un anticuerpo que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distingue de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno (por ejemplo, ErbB2). Por ejemplo, un anticuerpo con una característica biológica de 4D5 puede mostrar un efecto inhibidor del crecimiento sobre células que sobreexpresan ErbB2 de una manera que depende del nivel de expresión de ErbB2 y/o se une al mismo epitopo en el dominio extracelular de ErbB2 al que se une 4D5 (por ejemplo, que bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 4D5 a ErbB2).
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se emplea en la presente memoria, se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula, en especial una célula cancerosa que expresa ErbB in vitro o in vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento puede ser un agente que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan ErbB en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase M. Los bloqueantes de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, y inhibidores de topo II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen G1 también se desbordan hacia la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders, Filadelfia, 1995), en especial p. 13.
Los ejemplos de anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son los anticuerpos que se unen a ErbB2 e inhiben el crecimiento de células cancerosas que sobreexpresan ErbB2. Los anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de células de tumor de mama SK-BR-3 en cultivo celular en más del 20%, y preferiblemente en más del 50% (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 g/ml, determinándose la inhibición del crecimiento seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (véase la patente de EEUU n.º 5.677.171, expedida el 14 de octubre, 1997). El ensayo de inhibición del crecimiento de células SK-BR-3 se describe con más detalle en esta patente y a continuacion. El anticuerpo inhibidor del crecimiento preferido es el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, 4D5 humanizado.
Una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que "induce la muerta celular" es una molécula que hace que una célula viable se convierta en no viable. La célula, en general, es una célula que expresa el receptor ErbB2, en especial si la célula sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferiblemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula de cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas, próstata o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. La muerte celular in vitro puede determinarse en ausencia del complemento y células efectoras inmunológicas para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Así, el ensayo para la muerte celular
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puede realizarse utilizando suero termoinactivado (es decir, en ausencia del complemento) y en ausencia de células efectoras inmunológicas. Para determinar si la molécula es capaz de inducir la muerte celular, puede evaluarse la pérdida de la integridad de las membranas mediante la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano (véase Moore et al., Cytotechnology, 17:1-11 (1995)) o 7AAD, con relación a las células no tratadas. Los anticuerpos inductores de la muerte celular preferidos son los anticuerpos que inducen la captación de PI en el ensayo de captación de PI en células BT474. Los ejemplos de anticuerpos que inducen la muerte celular incluyen los anticuerpos anti-ErbB2 7C2 y 7F3 (documento WO 98/17797 incorporado expresamente en el presente documento por referencia), que incluyen sus variantes humanizados y/o madurados por afinidad.
Una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que "induce la apoptosis" es una molécula que induce la muerte celular programada, según se determina mediante la unión de anexina V, la fragmentación del ADN, el encogimiento de las células, la dilatación del retículo endoplásmico, la fragmentación de las células y/o la formación de vesículas de membranas (denominadas cuerpos apoptóticos). La célula normalmente es una célula que sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferiblemente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas, próstata o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. Están disponibles diversos métodos para evaluar los acontecimientos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, puede medirse la translocación de la fosfatidil serina (PS) mediante la unión de anexina; la fragmentación del ADN puede evaluarse mediante la formación de escaleras de ADN; y la condensación de cromatina/nuclear, junto con la fragmentación del ADN, puede evaluarse mediante un aumento en las células hipodiploides. Preferiblemente, la molécula que induce la apoptosis es una molécula que produce un aumento en aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente en aproximadamente 5 a 50 veces, y lo más preferiblemente en aproximadamente 10 a 50 veces de la inducción de la unión de anexina, con relación a una célula no tratada en un ensayo de unión de anexina que emplea células BT474. A veces, la molécula preapoptótica será una molécula que también bloquea la activación por ligando de ErbB de un receptor ErbB. En otras situaciones, la molécula es una molécula que no bloquea significativamente la activación por ligando de ErbB de un receptor ErbB. Además, la molécula puede inducir la apoptosis, sin inducir una gran reducción en el porcentaje de células en fase S (por ejemplo, una molécula que solo induce aproximadamente 0-10% de reducción en el porcentaje de estas células con relación a un control). Los ejemplos de anticuerpos que inducen la apoptosis incluyen los anticuerpos anti-ErbB2 7C2 y 7F3 (documento WO 98/17797 incorporado expresamente en el presente documento por referencia), que incluyen sus variantes humanizadas y/o maduradas por afinidad.
Un anticuerpo que "bloquea" la activación por ligando de un receptor ErbB es un anticuerpo que reduce o previene dicha activación, tal como se describió anteriormente en la presente memoria, en el que el anticuerpo es capaz de bloquear la activación por ligando del receptor ErbB de una manera sustancialmente más eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, de una manera aproximadamente tan eficaz como los anticuerpos monoclonales 7F3
o 2C4 o sus fragmentos Fab, y preferiblemente de una manera aproximadamente tan eficaz como el anticuerpo monoclonal 2C4 o sus fragmentos Fab. Por ejemplo, el anticuerpo que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB puede ser un anticuerpo que sea aproximadamente 50-100% más eficaz que 4D5 para bloquear la formación de un heterooligómero de ErbB. El bloqueo de la activación por ligando de un receptor ErbB puede producirse por cualquier medio, por ejemplo, interfiriendo con la unión del ligando a un receptor ErbB, la formación de complejos de ErbB, la actividad tirosina quinasa de un receptor ErbB en un complejo de ErbB y/o la fosforilación de un resto o restos tirosina quinasa en el receptor ErbB o por un receptor ErbB. Los ejemplos de anticuerpos que bloquean la activación por ligando de un receptor ErbB incluyen los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 (que bloquean la activación por HRG de los heterooligómeros ErbB2/ErbB3 y ErbB2/ErbB4; y la activación por EGF, TGF, anfirregulina, HB-EGF y/o epirregulina de un heterooligómero EGFR/ErbB2); y los anticuerpos L26, L96 y L288 (Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997)), que bloquean la unión de EGF y NDF a células T47D que expresan EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4. Dentro de las definiciones se incluyen específicamente los variantes humanizados y/o madurados por afinidad de estos y otros anticuerpos.
El término "epitopo" se emplea para referirse a la los sitios de unión para anticuerpos (monoclonales o policlonales) sobre antígenos de proteínas.
Los anticuerpos que se unen a cierto epitopo se identifican mediante "cartografiado de epitopos". Existen muchos métodos conocidos en la técnica para el cartografiado y la caracterización de la localización de epitopos sobre proteínas, que incluyen resolver la estructura cristalina de un complejo de antígeno-anticuerpo, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmentos génicos, y ensayos basados en péptidos sintéticos, según se describe, por ejemplo, en el capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1999. Los ensayos de competición se analizan a continuación. Según los ensayos de expresión de fragmentos génicos, el marco de lectura abierto que codifica la proteína se fragmenta de modo aleatorio o mediante construcciones genéticas específicas, y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de la proteína con el anticuerpo que se va a ensayar. Los fragmentos génicos, por ejemplo, pueden producirse mediante PCR y después transcribirse y traducirse en la proteína in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. Después se determina la unión del anticuerpo a los fragmentos de proteínas marcados de modo radiactivo mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Ciertos epitopos también pueden identificarse utilizando grandes bancos de secuencias de péptidos aleatorias mostradas sobre la
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superficie de partículas de fagos (bancos de fagos). Como alternativa, puede ensayarse un banco definido de fragmentos de péptidos solapantes para la unión a un anticuerpo de ensayo en ensayos de unión simples. Esta útlima estrategia es adecuada para definir epitopos lineales de aproximadamente 5 a 15 aminoácidos. Un anticuerpo se une "fundamentalmente al mismo epitopo" que un epitopo de referencia cuando los dos anticuerpos reconocen epitopos idénticos o estéricamente solapantes. Los métodos más rápidos y que más ampliamente se utilizan para determinar si dos epitopos se unen a epitopos idénticos o estéricamente solapantes son los ensayos de competición, que pueden configurarse en toda una serie de diferentes formatos, utilizando un antígeno marcado o un anticuerpo marcado. Normalmente, el antígeno se inmoviliza sobre una placa de 96 pocillos, y se mide la capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados utilizando marcadores radiactivos o enzimáticos.
El "epitopo 4D5" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la cual se une el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463). Este epitopo está cerca del dominio transmembrana de ErbB2, y se extiende desde aproximadamente el resto 519 a aproximadamente el resto 625, ambos inclusive, dentro de la secuencia del dominio extracelular de ErbB2 incluida en SEQ ID NO:3, figura 4. Para seleccionar anticuerpos que se unen al epitopo 4D5 puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado habitual, tal como el descrito en Harlow y Lane, supra. Como alternativa, puede realizarse un cartografiado de epitopos para evaluar si el anticuerpo se une al epitopo 4D5 de ErbB2 (por ejemplo, cualquier resto o restos en la región desde aproximadamente el resto 529 a aproximadamente el resto 625, ambos inclusive, en SEQ ID NO:3).
El "epitopo 3H4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la cual se une el anticuerpo 3H4. Este epitopo incluye los restos desde aproximadamente 541 hasta aproximadamente 599, ambos inclusive, en la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de ErbB2 (véase la figura 4 y SEQ ID NO:3).
El "epitopo 7C2/7F3" es la región en el N-terminal del dominio extracelular de ErbB2 a la cual se unen los anticuerpos 7C2 y 7F3 (cada uno depositado en ATCC, veáse a continuación). Para seleccionar anticuerpos que se unen al epitopo 7C2/7F3, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado habitual, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, puede realizarse un cartografiado de epitopos para establecer si el anticuerpo se une al epitopo 7C2/7F3 sobre ErbB2 (por ejemplo, cualquier resto o restos en la región desde aproximadamente el resto 22 a aproximadamente el resto 53 de ErbB2; véase la figura 4, y SEQ ID NO:3).
Un tumor que "no responde, o responde muy mal, a un tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-ErbB" no muestra una mejora estadísticamente significativa en respuesta a un tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB, cuando se compara con no recibir tratamiento o con un tratamiento con placebo en un modelo animal reconocido o un ensayo clínico humano, o que responde a un tratamiento inicial con anticuerpos anti-ErbB pero que crece a medida que continúa el tratamiento. Un modelo animal particularmente adecuado para ensayar la eficacia de anticuerpos anti-ErbB es el modelo de animales transgénicos descrito en la presente memoria e ilustrado en el ejemplo 3.
Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico y profiláctico o a medidas preventivas, en los que el objetivo es prevenir o frenar (disminuir) un trastorno o cambio fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o la propagación de un cáncer. Para los objetivos de esta invención, los resutlados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan al alivio de los síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, un estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, el retraso o el freno del avance de la enfermedad, la mejora o la paliación del estado de enfermedad, y la remisión (parcial o total), detectable o no detectable. Un "tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia, comparado con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno o la afección, así como los propensos a padecer el trastorno o la afección, o aquellos en los debe prevenirse el trastorno o la afección.
Un "trastorno" es cualquier afección que podría beneficiarse de un tratamiento de la presente invención. Esto incluye enfermedades o trastornos crónicos y agudos, que incluyen las condiciones patológicas que predisponen a un mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que van a ser tratados con la presente incluyen tumores benignos y malignos; leucemias y malignidades linfoides, en particular cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas, próstata o vejiga. Un trastorno preferido que va a ser tratado según la presente invención es un tumor maligno, tal como cáncer de mama, que sobreexpresa un receptor ErbB (por ejemplo, ErbB2 y/o EGFR), y que no responde, o responde muy mal, a un tratamiento con un anticuerpo contra el receptor o receptores que están sobreexpresados. Un trastorno particularmente preferido es un cáncer de mama que sobreexpresa ErbB2 que no responde, o responde muy mal, a una terapia con HERCEPTIN®.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco que es eficaz para tratar una enfermedad o un trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; puede reducir el tamaño del tumor; puede inhibir (es decir, frenar en
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alguna medida y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas hacia órganos periféricos; puede inhibir (es decir, frenar en alguna medida y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; puede inhibir, en alguna medida, el crecimiento tumoral; y/o puede aliviar en alguna medida uno o más síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco puede evitar el crecimiento y/o matar las células cancerosas existentes, este puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta el avance de la enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
El término "agente citotóxico", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una sustancia que inhibe o
previene la función de células y/o provoca la destrucción de células. El término pretende incluir isótopos radiactivos At211 I131 I125 Y90 Re186 Re188 Sm153 Bi212 P32
(por ejemplo, , , , , , , , , e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen sus fragmentos y/o variantes.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; gases mostaza, tales como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicin, detorrubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores del ácido fólico, tales como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glucósido; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos del platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; el inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y las sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores, tales como antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifena, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y las sales farmacéuticamente aceptables, ácidos
o derivados de cualquiera de los anteriores.
El término "profármaco", tal como se emplea en esta solicitud, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico hacia las células tumorales, cuando se compara con el fármaco de origen, y que es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma de origen más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375382, 615th Meeting Belfast (1986); y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con Daminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida, o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco incluyen, pero no se limitan a los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
El término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando resulte apropiado, ácido ribonucleico (ARN). La expresión también incluye, como equivalentes, análogos de ADN o ARN
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preparados a partir de análogos de nucleótidos, y según sea aplicable, polinucleótidos monocatenarios (sentido o antisentido) y bicatenarios. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la que tiene la forma o el emplazamiento en los que encuentra en la naturaleza. Por tanto, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. El término "vector de expresión" incluye plásmidos, cósmidos o fagos capaces de sintetizar la proteína HER2 concreta codificada por el respectivo gen recombinante portado por el vector. Los vectores preferidos son los vectores capaces de una replicación autónoma y/o de la expresión de los ácidos nucleicos a los que están unidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se emplean de modo intercambiable, puesto que el plásmido es la forma de vector que se emplea de modo más habitual.
Tal como se emplean en la presente memoria, los términos "elementos reguladores de la transcripción" y "secuencias reguladoras de la transcripción" se emplean de modo intercambiable y se refieren a las secuencias de un ácido nucleico, por ejemplo, ADN, necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida operablemente en un organismo hospedante concreto. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eurcariotas utilizan promotores, potenciadores, señales de corte y empalme, y señales de poliadenilación. Estos términos y expresiones pretenden incluir todos los elementos que estimulan o regulan la transcripción, que incluyen promotores, elementos de núcleo requeridos para la interacción básica de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, elementos cadena arriba, potenciadores, y elementos de respuesta (Lewin, "Genes V" (Oxford University Press, Oxford), págs. 847-873). La referencia en la presente memoria a los elementos reguladores de la transcripción de un gen o una clase de genes incluye los elementos reguladores de la transcripción completos que aparecen en la naturaleza o una región intacta de estos, y las formas modificadas de los elementos reguladores de la transcripción del gen o grupo de genes. Estas formas modificadas incluyen la redisposición de los elementos, deleciones de algunos elementos o secuencias irrelevantes, y la inserción de elementos heterólogos. La naturaleza modular de los elementos reguladores de la transcripción y la ausencia de dependencia de la posición de la función de algunos elementos reguladores, tales como potenciadores, hacen posibles estas modificaciones. Están disponibles numerosas técnicas para diseccionar los elementos reguladores de genes para determinar su localización y función. Esta información puede utilizarse para dirigir la modificación de los elementos, si se desea. Sin embargo, se prefiere utilizar una región intacta de los elementos reguladores de la transcripción de un gen.
El término "promotor específico de tejido" significa una secuencia de nucleótidos que actúa como promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ADN seleccionada unida operablemente al promotor, y que realiza la expresión de la secuencia de ADN seleccionada en células específicas de un tejido, tales como células de una glándula mamaria. En un caso, pueden utilizarse construcciones de genes que emplean promotores específicos de glándula mamaria y que dirigen preferentemente la expresión de una proteína de HER2 o de un fragmento de la proteína en el tejido de glándula mamaria.
Un ácido nucleico está "unido operablemente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un ADN para una presecuencia o conductor de la secreción está unido operablemente al ADN para un polipéptido, si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operablemente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operablemente a una secuencia codificadora si está colocado de forma que se facilite la traducción. En general, "unido operablemente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un conductor de la secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores estén contiguos. La unión se realiza mediante acoplamiento en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se emplean enlazadores o adaptadores oligonucleotídicos sintéticos según la práctica convencional.
El término "transfección" se refiere a la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, en una célula receptora mediante transferencia de genes mediada por ácido nucleicos. Una "transformación", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un proceso en el que el genotipo de una célula cambia como resultado de la captación celular de ADN o ARN exógeno y, por ejemplo, la célula transformada expresa una forma recombinante de HER2.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término "transgén" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es parcial o totalmente heteróloga, es decir, extraña, para la célula o el animal transgénico en la que se introduce, o es homóloga con un gen endógeno de la célula o el animal transgénico en la que se introduce, pero está diseñada para ser insertada, o se inserta en el genoma del animal de tal forma que altera el genoma de la célula en la que se
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inserta (por ejemplo, se inserta en una localización diferente de la del gen natural o su inserción da como resultado una inactivación). Un transgén puede estar unido operablemente a una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tales como intrones, que puedan ser necesarios para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado.
Por consiguiente, el término "construcción de transgén" se refiere a un ácido nucleico que incluye un transgén, y (opcionalmente) otras secuencias de ácidos nucleicos, tales como una secuencia reguladora de la transcripción, sitios de poliadenilación, orígenes de la replicación, genes marcadores, etc., que puedan ser útiles en la manipulación general del transgén para la inserción en el genoma de un organismo hospedante.
El término "transgénico" se emplea en la presente memoria como un adjetivo para describir la propiedad, por ejemplo, de un animal o una construcción, de alojar un transgén. Por ejemplo, tal como se emplea en la presente memoria, un "organismo transgénico" es cualquier animal, preferiblemente un mamífero no humano, en el que una o más de las células del animal contiene un ácido nucleico heteróogo introducido por medio de la intervención humana, tal como mediante técnicas transgénicas muy conocidas en la técnica. El ácido nucleico se introduce en la célula, directa o indirectamente, mediante la introducción en un precursor de la célula, mediante manipulación genética deliberada, tal como mediante microinyección o mediante infección con un virus recombinante. El término "manipulación genética" no incluye el cruzamiento clásico, o la fertilización in vitro, sino que se dirige a la introducción de una molécula de ADN recombinante. Esta molécula puede integrarse dentro de un cromosoma, o puede ser ADN de replicación extracromosómica. En los animales transgénicos típicos descritos en la presente memoria, el transgén provoca que las células expresen o sobreexpresen una forma recombinante de proteínas de HER2 concretas. Las expresiones "línea fundadora" y "animal fundador" se refieren a los animales que son el producto maduro de los embriones a los que se añadió el transgén, es decir, los animales que han crecido a partir de los embriones en los que se insertó el ADN, y que fueron implantados en uno o más hospedantes sustitutos. El término "progenie" y la expresión "progenie del animal transgénico" se refieren a cualquiera y toda la descendencia de cada generación posterior a los mamíferos que fueron originariamente transformados. El término "mamífero no humano" se refiere a todos los miembros de la clase Mammalia, excepto los seres humanos. Un "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, que incluye seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como un ratón, rata, conejo, cerdo, oveja, cabra, ganado vacuno y primates superiores.
Tal como se emplea en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean de modo intercambiable y todas estas denominaciones incluyen la progenie. Así, el término "transformantes" y la expresión "células transformadas" incluyen las células concretas primarias y los cultivos derivados de ellas independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido en ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la seleccionada en la célula originariamente transformada. Cuando se pretendan denominaciones diferenciadas, estas serán evidentes a partir del contexto.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para administrar un fármaco (tal como los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente memoria y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma están dispuestos habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.
El término "inserto en el envase" se emplea para referirse a las instrucciones que se incluyen habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, utilización, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias acerca del uso de dichos productos terapéuticos.
Un "cardioprotector" es un compuesto o una composición que previene o reduce la disfunción miocárdica (es decir, cardiomiopatía y/o insuficiencia cardíaca congestiva) asociada con la administración de un fármaco, tal como un anticuerpo anti-ErbB o su conjugado con maitansinoide, a un paciente. El cardioprotector, por ejemplo, puede bloquear o reducir un efecto cardiotóxico mediado por radicales libres y/o prevenir o reducir las lesiones de estrés oxidativo. Los ejemplos de cardioprotectores incluidos en la presente definición incluyen el agente quelante de hierro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28:1063-1072 (1994)); un agente de disminución de lípidos y/o antioxidante, tal como probucol (Singal et al., J. Mol. Cell Cardiol., 27:1055-1063 (1995)); amifostina (éster 2-[(3-aminopropil)amino]etantiol-dihidrógeno fosfato de aminotiol, también denominado WR-2721, y su forma de captación celular desfosforilada denominada WR-1065) y ácido S-3-(3metilaminopropilamino)propilfosforotioico (WR-151327), véase Green et al., Cancer Research, 54:738-741 (1994); digoxina (Bristow, M.R., en: Bristow M.R., ed., Drug-Induced Heart Disease, Nueva York, Elsevier, 191-215 (1980)); beta-bloqueantes, tales como metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs, 47, supl. 4:31-39 (1994); y Shaddy et al., Am. Heart J., 129:197-9 (1995)); vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C); captadores de radicales libres, tales como ácido oleanólico, ácido ursólico y N-acetilcisteína (NAC); compuestos de atrapamiento de espín, tales como alfafenil-terc-butil nitrona (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res., 13:1607-1612 (1993)); compuestos selenoorgánicos, tales como P251 (Elbesen); y similares.
2. Descripción detallada 15
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La presente invención se basa en los resultados obtenidos en un nuevo modelo de tumor HER2-transgénico murino en el que HERCEPTIN®, o el anticuerpo murino 4D5 del cual se deriva HERCEPTIN®, tiene poco efecto sobre el crecimiento tumoral. Utilizando este modelo para ensayar la eficacia de HERCEPTIN y de conjugados de HERCEPTIN®-maitansinoide, se descubrió, de modo sorprendente, que aunque el tumor transplantado obtenido de dichos ratones transgénicos responde mal al tratamiento con HERCEPTIN®, los conjugados de HERCEPTIN®maitansinoide son muy eficaces.
Por consiguiente, la presente invención se basa en el uso de conjugados anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide en el tratamiento de tumores que sobreexpresan ErbB que no responden bien al tratamiento con anticuerpo anti-ErbB y/o maitansinoide.
A. Producción de anticuerpos anti-ErbB
A continuación se ofrece una descripción de ejemplos de técnicas para la producción de los anticuerpos utilizados según la presente descripción. La producción de anticuerpos se ilustrará haciendo referencia a anticuerpos anti-ErbB2, pero será evidente para los expertos en la técnica que pueden producirse anticuerpos contra otros miembros de la familia del receptor ErbB y modificarse de una manera similar.
El antígeno de ErbB2 que se va a utilizar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de ErbB2 o una de sus porciones, que contenga el epitopo deseado. Como alternativa, pueden utilizarse células que expresan ErbB2 sobre la superficie celular (por ejemplo, células NIH-3T3 transformadas para que sobreexpresen ErbB2; o una línea celular de carcinoma, tal como células SK-BR-3, véase Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991)) para generar anticuerpos. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.
(i) Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales preferiblemente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o un inhibidor de tripsina de soja, empleando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoíl sulfosuccinimida (conjugación a través de restos cisteína), Nhidroxisuccinimida (a través de restos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antígeno, los conjugados inmunogénicos o los derivados combinando, por ejemplo, 100 g o 5 g de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, los animales reciben un refuerzo de 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante una inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días después, los animales se sangran y el suero se ensaya para la titulación de anticuerpos. Los animales reciben un refuerzo hasta que la titulación alcanza un valor de meseta. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, de forma adecuada, se emplean agentes agregantes, tales como alumbre, para potenciar la respuesta inmunológica.
(ii) Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en pequeñas cantidades. Así, el adjetivo "monoclonal" indica el cáracter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos.
Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (patente de EEUU n.º 4.816.567).
En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedante apropiado, tal como un hámster, se inmuniza tal como se describió anteriormente en la presente memoria, para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unen específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos después se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
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Las células de hibridomas preparadas de esta forma se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma de origen no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), evitando estas sustancias el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son las células que se fusionan con eficacia, mantienen una producción estable de alto nivel del anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Entre estas, las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles en the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EEUU, y células SP-2 o X63-Ag8-653 cells, disponibles en the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EEUU. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede ser determinada, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan de modo adecuado del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla con facilidad y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma actúan como fuente preferida de dicho ADN. Tras haber sido aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedantes, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que, en otros casos, no producen proteínas de anticuerpos, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedantes recombinantes. Los artículos científicos sobre la expresión recombinante de ADN que codifica el anticuerpo en bacterias incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993); y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
En otro caso, pueden aislarse anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos a partir de bancos de fagos de anticuerpos utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bancos de fagos. Posteriores publicaciones han descrito la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (en el intervalo de nM) mediante barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como mediante infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bancos de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora por dominios constantes de cadena pesada y de cadena ligera, en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EEUU n.º 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido que no es una inmunoglobulina.
Generalmente, estos polipéptidos que no son inmunoglobulinas tienen una sustitución de los dominios constantes de un anticuerpo, o tienen una sustitución de los dominios variables de un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de unión al antígeno que tiene especificidad
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por un antígeno y otro sitio de unión al antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
(iii) Anticuerpos humanizados
En la técnica se han descrito métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que es no humana. Estos restos aminoácidos no humanos a menudo se denominan restos "de importación", y se obtienen generalmente de un dominio variable "de importación". La humanización puede realizarse fundamentalmente siguiendo el método de Winter et al. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de la región hipervariable por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EEUU n.º 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados generalmente son anticuerpos humanos en los que algunos restos de la región hipervariable y probablemente algunos restos de FR están sustituidos por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
La elección de los dominios variables humanos, tanto de cadena ligera como de cadena pesada, para ser utilizados para preparar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método denominado "de mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona frente al banco completo de secuencias de dominios variables humanos conocidas. La secuencia humana que es más parecida a la del roedor entonces se acepta como la región de marco (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método emplea una región de marco concreta derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
También es importante que los anticuerpos que se van a humanizar mantengan una alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias de origen y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias de origen y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están disponibles con facilidad y son conocidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. El estudio de estos modelos permite el análisis del papel probable que desempeñan los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De esta forma, pueden seleccionarse y combinarse restos de FR procedentes de secuencias del receptor y de importación, de modo que se logra la característica del anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los restos de la región hipervariable están implicados directamente, y de modo más sustancial, en influir en la unión al antígeno.
El siguiente ejemplo 1 describe la producción de un ejemplo de anticuerpo anti-ErbB2 humanizado. El anticuerpo humanizado en la presente memoria puede comprender, por ejemplo, restos de la región hipervariable no humana incorporados en un dominio pesado variable humano, y también puede comprender una sustitución de la región de marco (FR) en una posición seleccionada del grupo que consiste en 69H, 71H y 73H utilizando el sistema de numeración de dominios variables indicado en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). En un caso, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en dos o todas las posiciones 69H, 71H y 73H.
Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.
(iv) Anticuerpos humanos
Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras una inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógena. Por ejemplo, se ha indicado que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) de un anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógena. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humanos en estos ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y las patentes de EEUU n.os 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807.
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Como alternativa, puede utilizarse la tecnología de presentación de fagos (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulinas a partir de donantes no inmunizados. Según esta técnica, se clonan genes del dominio V de anticuerpos dentro de marco en el gen de la proteína de la envuelta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula fiilamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra estas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación de fagos puede realizarse en una diversidad de formatos; para un análisis, véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación de fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos antioxazolona a partir de un pequeño banco combinatorio aleatorio de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V procedentes de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos contra una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) siguiendo fundamentalmente las técncias descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993). Véanse también las patentes de EEUU n.os 5.565.332 y 5.573.905.
Tal como se analizó anteriormente, las células B activadas in vitro también pueden generar anticuerpos humanos (véanse las patentes de EEUU n.os 5.567.610 y 5.229.275).
Se describen anticuerpos anti-ErbB2 humanos en la patente de EEUU n.º 5.772.997, expedida el 30 de junio, 1998, y el documento WO 97/00271, publicado el 3 de enero, 1997.
(v) Fragmentos de anticuerpos
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se han obtenido a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science,
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(1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células hospedantes recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse a partir de los bancos de fagos de anticuerpos analizados anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH directamente de
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coli y acoplarse de modo químico para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Según otra estrategia, pueden aislarse fragmentos F(ab')2 directamente de un cultivo de células hospedantes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica. En otros casos, el anticuerpo elegido es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase el documento WO 93/16185; la patente de EEUU n.º 5.571.894; y la patente de EEUU n.º 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, según se describe en la patente de EEUU n.º 5.641.870, por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
(vi) Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epitopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epitopos diferentes de la proteína ErbB2. Otros anticuerpos de este tipo pueden combinar un sitio de unión a ErbB2 con un sitio o sitios de unión a EGFR, ErbB3 y/o ErbB4. Como alternativa, un brazo anti-ErbB2 puede combinarse con un brazo que se une a una molécula activadora sobre un leucocito, tal como una molécula de receptor de células T (por ejemplo, CD2 o CD3), o receptores de Fc para for IgG (Fc R), tales como Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) y Fc RIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celulares hacia la célula que expresa ErbB2. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para trasportar agentes citotóxicos a las células que expresan ErbB2. El documento WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc RIII, y la patente de EEUU n.º 5.837.234 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc RI. Un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fc se muestra en el documento WO 98/02463. La patente de EEUU n.º 5.821.337 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.
En la técnica se conocen métodos para la preparación de anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se realiza mediante estapas de cromatografía de afinidad, es algo incómoda, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:36553659 (1991). Según una estrategia diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de unión al antígeno-anticuerpo) se condensan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulinas. La fusión preferiblemente se realiza con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera
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región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera esté presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulinas y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona una mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mútuas de los tres fragmentos de polipéptidos en los casos en los que proporciones no iguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras de dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales produzca unos rendimientos altos o cuando las proporciones no tengan una importancia particular.
En un caso preferido de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha descubierto que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, puesto que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo la mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Esta estrategia se describe en el documento WO 94/04690. Para otro detalles para la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
Según otra estrategia descrita en la patente de EEUU n.º 5.731.168, la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos puede modificarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar al de la cadena o cadenas laterales más grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos utilizando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos son rotos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados después se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB después se reconvierte en el FAb'-tiol mediante una reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Avances recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden ser acoplados de modo químico para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' es segregado por separado desde E. coli y sometido a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera es capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así como puede activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.
También se han descrito diversas técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de un cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio varible de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir un apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son obligados a aparearse con los dominio VL y VH complementarios de otro fragmento, formando con ello dos sitios de unión al antígeno. También se ha descrito otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (scFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991)).
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(vii) Otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos
Se contempla la modificación o modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente memoria. Por ejemplo, puede resultar deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Los variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2 se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB2, o mediante síntesis peptídica. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2. Se realiza cualquier combinación de deleciones, inserciones y sustituciones para conseguir la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo anti-ErbB2, tal como alterar el número o la posición de los sitios de glicosilación.
Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del anticuerpo anti-ErbB2 que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", según se describe en Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). En este método, se identifica un resto o un grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido con carga neutra o negativa (lo más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno ErbB2. Las localizaciones de aminoácidos que muestran sensibilidad funcional frente a las sustituciones después se refinan mediante la introducción de otros variantes en los sitios de sustitución. Así, aunque el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar la actuación de una mutación en un sitio concreto se realiza un barrido de ala o una mutagénesis aleatoria en el codón o región diana, y se seleccionan los variantes de anticuerpos anti-ErbB2 expresados para la actividad deseada.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino-y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones dentro de la secuencia de un único o de múltiples restos aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-ErbB2 con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otros variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-ErbB2 incluyen la fusión al N-o C-terminal del anticuerpo anti-ErbB2 de una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida sérica del anticuerpo.
Otro tipo de variante es un variante de sustitución de aminoácidos. Estos variantes tienen al menos un resto aminoácido en la molécula del anticuerpo anti-ErbB2 reemplazado por un resto diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "Sustituciones preferidas". Si estas sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "Ejemplos de sustituciones" en la tabla 1, o como se describe más a fondo a continuación con respecto a las clases de aminoácidos, y los productos pueden seleccionarse.
Tabla 1
Resto original
Ejemplos de sustituciones Sustituciones preferidas
Ala (A)
val; leu; ile val
Arg (R)
lys; gln; asn lys
Asn (N)
gln; his; asp; lys; arg gln
Asp (D)
glu; asn glu
Cys (C)
ser; ala ser
Gln (Q)
asn; glu asn
Glu (E)
asp; gln asp
Gly (G)
ala ala
His (H)
asn; gln; lys, arg arg
Ile (I)
leu; val; met; ala; phe; norleucina leu
Leu (L)
norleucina; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K)
arg; gln; asn arg
Met (M)
leu; phe; ile leu
Phe (F)
leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P)
ala ala
Ser (S)
thr thr
Thr (T)
ser ser
Trp (W)
tyr; phe tyr
Tyr (Y)
trp; phe; thr; ser phe
Val (V)
ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
Se logran unas modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que se diferencien significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del
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esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal; (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana; o (c) la voluminosidad de la cadena lateral. Los restos que aparecen en la naturaleza se dividen en grupos basados en sus propiedades comunes de la cadena lateral:
(1)
hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3)
ácidos: asp, glu;
(4)
básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5)
restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6)
aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implican el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Cualquier resto cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti-ErbB2 también puede sustituirse, en general por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el entrecruzamiento aberrante. A la inversa, pueden añadirse uno o más enlaces cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).
Un tipo de variante de sustitución particularmente preferido implica la sustitución de uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo de origen (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, el variante
o variantes resultantes seleccionados para un posterior desarrollo tendrán mejores propiedades biológicas con relación al anticuerpo de origen a partir del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichos variantes de sustitución implica una maduración por afinidad utilizando la presentación de fagos. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los variantes de anticuerpos generados de esta manera se presentan de una manera monovalente en partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 encapsulado dentro de cada partícula. Los variantes presentados por fagos después se seleccionan para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión), tal como se describe en la presente memoria. Para identificar candidatos de sitios de la región hipervariable para su modificación puede realizarse una mutagénesis de barrido de alanina para identificar restos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Como alternativa, o además, puede resultar beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el ErbB2 humano. Estos restos de contacto y los restos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente memoria. Tras haber generado estos variantes, el panel de variantes se somete a una selección según se describe en la presente memoria, y pueden seleccionarse anticuerpos con mejores propiedades en uno o más ensayos pertinentes para su posterior desarrollo.
Puede resultar deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Como alternativa, o además, pueden introducirse uno o más restos cisteína en la región Fc, permitiendo con ello la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta forma puede tener mejor capacidad de internalización y/o una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y de muerte celular mediada por el complemento. Véase Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992), y Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral utilizando entrecruzadores heterobifuncionales, según se describe en Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, un anticuerpo puede modificarse para que tenga regiones Fc duales y, así, puede tener mayores capacidades de ADCC y de lisis de complemento. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).
Para aumentar la semivida sérica del anticuerpo se puede incorporar un epitopo de unión al receptor de salvamento en el anticuerpo (de modo específico, un fragmento de anticuerpo) según se describe en la patente de EEUU n.º 5.739.277, por ejemplo. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "epitopo de unión al receptor de salvamento" se refiere a un epitopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida sérica in vivo de la molécula de IgG.
(viii) Variantes de glicosilación
Los anticuerpos se glicosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, Chem. Immunol., 65:111-128 (1997); Wright y Morrison, TibTECH, 15:26-32 (1997)). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd et al., Mol. Immunol., 32:1311-1318 (1996); Wittwe y Howard, Biochem., 29:4175-4180 (1990)), y a la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína que puede afectar a la conformación y la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (Hefferis y Lund, supra; Wyss y Wagner, Current Opin. Biotech., 7:409-416 (1996)). Los oligosacáridos también pueden actuar para transportar una glicoproteína concreta hasta ciertas moléculas basándose en estructuras de reconocimiento específicas. Por ejemplo, se ha indicado que, en IgG agalactosilado, el resto oligosacárido "se voltea" hacia fuera del espacio inter-CH2 y los restos N-actilglucosamina terminales se hacen disponibles para
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unirse a la proteína de unión a manosa (Malhotra et al., Nature Med., 1:237-243 (1995)). La eliminación por glicopeptidasa de los oligosacáricos de CAMPATH-1H (un anticuerpo IgG1 monoclonal murino humanizado recombinante que reconoce el antígeno CDw52 de linfocitos humanos) producido en células de ovario de hámster chino (CHO) produce una reducción completa en la lisis mediada por el complemento (CMCL) (Boyd et al., Mol. Immunol., 32:1311-1318 (1996)), mientras que la eliminación selectiva de restos ácido siálico utilizando neuraminidasa no produce pérdida de DMCL. También se ha indicado que la glicosilación de anticuerpos afecta a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, se ha indicado que células CHO con expresión regulada por tetraciclina de la β(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una formación catalizada por glicosiltransferasa de GlcNAc biseccionante, tienen mayor actividad ADCC (Umana et al., Mature Biotech., 17:176-180 (1999)).
La glicosilación de anticuerpos se realiza generalmente de modo N-enlazado u O-enlazado. N-enlazado se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparaginaX-serina y asparagina-X-treonina, en las que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, de forma más habitual serina o treonina, aunque también pueden utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
Los variantes de glicosilación de anticuerpos son variantes en los que el patrón de glicosilación de un anticuerpo está alterado. Alterar significa delecionar uno o más restos carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo, añadir uno o más restos carbohidrato al anticuerpo, cambiar la composición de glicosilación (patrón de glicosilación), el grado de glicosilación, etc.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza de modo conveniente alterando la secuencia de aminoácidos, de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosliación N-enlazados). La alteración también puede realizarse mediante la adición o la sustitución de uno o más restos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación Oenlazados). De modo similar, puede lograrse la eliminación de sitios de glicosilación mediante la alteración de aminoácidos dentro de los sitios de glicosilación nativos del anticuerpo.
La secuencia de aminoácidos habitualmente se altera mediante la alteración de la secuencia del ácido nucleico subyacente. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2 se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan al aislamiento desde una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos naturales), o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), mutagénesis de PCR, y mutagénesis de módulos de un variante preparado antes o de una versión no variante del anticuerpo anti-ErbB2.
La glicosilación (incluyendo el patrón de glicosilación) de los anticuerpos también puede alterarse sin alterar la secuencia de aminoácidos de la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula hospedante utilizada para expresar el anticuerpo. Puesto que el tipo celular utilizado para la expresión de las glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como producto terapéutico potencial raramente es la célula nativa, pueden esperarse una variaciones significativas en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse et al., J. Biol. Chem., 272:9062-9070 (1997)). Además de la elección de las células hospedantes, los factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación del medio, la densidad del cultivo, la oxigenación, el pH, los programas de purificación y similares. Se han propuesto diversos métodos para alterar el patrón de glicosilación en un organismo hospedante concreto que incluyen introducir o sobreexpresar ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (patentes de EEUU n.os 5.047.335; 5.510.261; y 5.278.299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, puede ser eliminada de modo enzimático de la glicoproteína, por ejemplo, utilizando endoglicosidasa H (Endo H). Además, la célula hospedante recombinante puede ser genéticamente modificada, por ejemplo, hacer que sea defectuosa para procesar ciertos tipos de polisacáridos. Estas técnicas y otras similares son muy conocidas en la técnica.
La estructura de glicosilación de los anticuerpos puede analizarse con facilidad mediante técnicas convencionales de análisis de carbohidratos, que incluyen cromatografía de lectina, RNM, espectrometría de masas, HPLC, GPC, análisis de la composición de monosacáricos, digestión enzimática secuencial, y HPAEC-PAD, que emplea una cromatografía de intercambio aniónico de pH alto para separar los oligosacáridos basándose en la carga. Los métodos para liberar los oligosacáridos para fines analíticos también son conocidos e incluyen, sin limitación, un tratamiento enzimático (realizado habitualmente utilizando péptido N-glicosidasa F/endo-β-galactosidasa), la eliminación utilizando un entorno alcalino duro para liberar principalmente estructuras O-enlazadas, y métodos químicos que emplean hidrazina anhidra para liberar oligosacáridos N-y O-enlazados.
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(viii) Selección de anticuerpos con las propiedades deseadas
Anteriormente se han descrito técnicas para generar anticuerpos. También se pueden seleccionar anticuerpos con ciertas características biológicas, según se desee.
Por ejemplo, para identificar anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del crecimiento se pueden seleccionar anticuerpos que inhiban el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2. En un caso, el anticuerpo inhibidor del crecimiento elegido es capaz de inhibir el crecimiento de células SK-BR-3 en un cultivo celular en aproximadamente 20-100% y preferiblemente en aproximadamente 50-100% a una concentración de anticuerpos de aproximadamente 0,5 a 30 g/ml. Para identificar estos anticuerpos, puede realizarse el ensayo SK-BR-3 descrito en la patente de EEUU n.º 5.677.171. Según este ensayo, se cultivan células SK-BR-3 en una mezcla 1:1 de medio F12 y DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina y penicilina-estreptomicina. Las células SK-BR-3 se cultivan a 20.000 células en una placa de cultivo celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm). Se añaden de 0,5 a 3 g/ml del anticuerpo anti-ErbB2 por placa. Después de seis días, se cuenta el número de células, comparadas con las células no tratadas, utilizando un contador de células COULTER electrónico. Los anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 en aproximadamente 20-100% o en aproximadamente 50-100% pueden seleccionarse como anticuerpos inhibidores del crecimiento.
Para seleccionar los anticuerpos que inducen la muerte celular, puede evaluarse la pérdida de la integridad de la membrana, según indica, por ejemplo, la captación de PI, azul de tripano o 7AAD, con relación a un control. El ensayo preferido es el ensayo de captación de PI empleando células BT474. Según este ensayo, se cultivan células BT474 (que pueden obtenerse en the American Type Culture Collection (Rockville, MD)) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado con FBS termoinactivado al 10% (Hyclone) y L-glutamina 2 mM (así, el ensayo se realiza en ausencia de complemento y células efectoras inmunológicas). Las células BT474 se siembran a una densidad de 3 x 106 por placa en placas de 100 x 20 mm y se deja que se fijen durante la noche. El medio después se retira y se reemplaza por medio fresco solo o con medio que contiene 10 g/ml del anticuerpo monoclonal apropiado. Las células se incuban durante un periodo de 3 días. Después de cada tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se desprenden mediante tripsinización. Las células después se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 ºC, el sedimento se resuspende en 3 ml de tampón de unión de Ca2+ enfriado en hielo (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) y se divide en partes alícuotas en tubos 12 x 75 de 35 mm tapados con un filtro (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de los agregados celulares. Los tubos después reciben PI (10 g/ml). Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN y el programa informático FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Los anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular, según se determina mediante la captación de PI, pueden seleccionarse como anticuerpos inductores de la muerte celular.
Para seleccionar los anticuerpos que inducen la apoptosis, está disponible un ensayo de unión de anexina que emplea células BT474. Las células BT474 se cultivan y se siembran en placas según se analizó en el párrafo anterior. El medio después se retira y se reemplaza por medio fresco solo o con medio que contiene 10 g/ml del anticuerpo monoclonal. Después de un periodo de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se desprenden mediante tripsinización. Las células después se centrifugan, se resuspenden en tampón de unión de Ca2+ y se dividen en partes alícuotas en tubos, según se indicó anteriormente para el ensayo de la muerte celular. Los tubos después reciben anexina marcada (por ejemplo, anexina V-FITC) (1 g/ml). Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN y el programa informático FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Los anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina, con relación a un control, se seleccionan como anticuerpos inductores de la apoptosis.
Además del ensayo de unión de anexina, está disponible un ensayo de tinción de ADN que emplea células BT474. Para realizar este ensayo, células BT474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés, según se describe en los dos párrafos anteriores, se incuban con HOECHST 33342 9 g/ml durante 2 h a 37 ºC, y después se analizan en un citómetro de flujo EPICS ELITE (Coulter Corporation) utilizando el programa informático MODFIT LT (Verity Software House). Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que es mayor en 2 veces (y preferiblemente mayor en 3 veces o más) que en las células no tratadas (hasta 100% de células apoptóticas) pueden seleccionarse como anticuerpos proapoptóticos utilizando este ensayo.
Para identificar un anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB, puede determinarse la capacidad del anticuerpo para bloquear la unión del ligando de ErbB a las células que expresan el receptor ErbB (por ejemplo, en conjugación con otro receptor ErbB con el cual el receptor ErbB de interés forma un heterooligómero de ErbB). Por ejemplo, las células que expresan de modo natural, o que se han transfectado para que expresen receptores ErbB del heterooligómero de ErbB pueden incubarse con el anticuerpo y después exponerse al ligando de ErbB marcado. Entonces puede evaluarse la capacidad del anticuerpo anti-ErbB2 para bloquear la unión del ligando al receptor ErbB en el heterooligómero de ErbB.
Por ejemplo, la inhibición de la unión de HRG a líneas de células de tumor de mama MCF7 por anticuerpos anti-ErbBb2 puede realizarse utilizando cultivos en monocapa de MCF7 sobre hielo en un formato de placa de 24 pocillos fundamentalmente como se describe en el siguiente ejemplo 1. Pueden añadirse anticuerpos monoclonales anti
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ErbB2 a cada pocillo e incubar durante 30 minutos. Entonces puede añadierse rHRG 1177-224 marcado con 125I (25 pm), y la incubación puede continuar durante 4 a 16 horas. Pueden prepararse curvas de dosis-respuesta y puede calcularse un valor de CI50 para el anticuerpo de interés. En un caso, el anticuerpo que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB tendrá una CI50 para la inhibición de la unión de HRG a células MCF7 en este ensayo de aproximadamente 50 nM o menor, más preferiblemente 10 nM o menor. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, la CI50 para la inhibición de la unión de HRG a células MCF7 en este ensayo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menor, más preferiblemente de 50 nM o menor.
Como alternativa, o además, puede evaluarse la capacidad de un anticuerpo anti-ErbB2 para bloquear la fosforilación de tirosina estimulada por el ligado de ErbB de un receptor ErbB presente en un heterooligómero de ErbB. Por ejemplo, pueden cultivarse células que expresan de modo endógeno los receptores ErbB, o transfectadas para que los expresen, con el anticuerpo y después ensayarse para la actividad de fosforilación de tirosina dependiente del ligando de ErbB utilizando un anticuerpo monoclonal antifosfotirosina (que está opcionalmente conjugado con un marcador detectable). El ensayo de activación del receptor de quinasa descrito en la patente de EEUU n.º 5.766.863 está disponible para determinar la activación del receptor ErbB y el bloqueo de esta actividad por un anticuerpo.
En una realización, se puede seleccionar un anticuerpo que inhiba la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina de p180 en células MCF7. Por ejemplo, las células MCF7 pueden cultivarse en placas de 24 pocillos y pueden añadirse anticuerpos monoclonales contra ErbB2 a cada pocillo e incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente; después puede añadirse rHRG 1177-224 a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y la incubación puede continuar durante 8 minutos. El medio puede aspirarse de cada pocillo y las reacciones pueden detenerse mediante la adición de 100 l de tampón de muestra de SDS (SDS al 5%, DTT 25 mM, y Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Cada muestra (25 l) puede someterse a una electroforesis sobre un gradiente de gel del 4-12% (Novex) y después transferirse electroforéticamente a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno). Pueden revelarse las inmunotransferencias de antifosfotirosina (a 1 g/ml), y puede cuantificarse la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr aproximadamente 180.000 mediante densitometría de reflectancia. El anticuerpo seleccionado preferiblemente inhibe significativamente la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina de p180 en aproximadamente 0-35% del control en este ensayo. Puede prepararse una curva de dosis-respuesta para la inhibición de la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina de p180, según se determina mediante densitometría de reflectancia, y puede calcularse una CI50 para el anticuerpo de interés. En un caso, el anticuerpo que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB tendrá una CI50 para la inhibición de la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina de p180 en este ensayo de aproximadamente 50 nM o menor, más preferiblemente de 10 nM o menor. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, la CI50 para la inhibición de la estimulación por HRG de la estimulación de la fosforilación de la tirosina de p180 en este ensayo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menor, más preferiblemente de 50 nM o menor.
También se pueden evaluar los efectos inhibidores del crecimiento del anticuerpo sobre células MDA-MB-175, por ejemplo, fundamentalmente como se describe en Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997). Según este ensayo, pueden tratarse células MDA-MB-175 con un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 (10 g/ml) durante 4 días y teñirse con violeta cristal. Una incubación con un anticuerpo anti-ErbB2 puede mostrar un efecto inhibidor del crecimiento sobre esta línea celular similar al mostrado por el anticuerpo monoclonal 2C4. En otro caso, HRG exógeno no revierte significativamente esta inhibición. Preferiblemente, el anticuerpo será capaz de inhibir la proliferación celular de las células MDA-MB-175 en un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 4D5 (y opcionalmente en un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 7F3), tanto en presencia como en ausencia de HRG exógeno.
En un caso, el anticuerpo anti-ErbB2 de interés puede bloquear la asociación dependiente de herregulina de ErbB2 con ErbB3 en células MCF7 y SK-BR-3, según se determina en un experimento de coinmunoprecipitación de una manera sustancialmente más eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5, y preferiblemente de una manera sustancialmente más eficaz que el anticuerpo monoclonal 7F3. Para seleccionar los anticuerpos que se unen a un epitopo sobre ErbB2 al que se une un anticuerpo de interés, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado habitual, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, o además, puede realizarse un cartografiado de epitopos mediante métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las figuras 1A y 1B en la presente memoria).
A los resultados obtenidos en los ensayos basados en células descritos anteriormente puede seguir el ensayo en animales, por ejemplo, modelos murinos y ensayos clínicos humanos. En particular, puede demostrarse la incapacidad o la capacidad limitada de un anticuerpo para tratar tumores que sobreexpresan ErbB2 en el modelo de ratón transgénico descrito en la presente solicitud, según se describe en los siguientes ejemplos.
C. Conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide (inmunoconjugados)
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ErbB con una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo ni de la molécula de maitansinoide. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse a partir de fuentes naturales. Se describen maitansionides adecuados, por ejemplo, en la patente de EEUU n.º 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones que no son patentes indicadas anteriormente en la presente memoria. Los maitansinoides preferidos son el maitansinol y los análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como diversos ésteres de maitansinol.
Existen muchos grupos enlazadores conocidos en la técnica para fabricar los conjugados de anticuerpomaitansinoide que incluyen, por ejemplo, los descritos en la patente de EEUU n.º 5.208.020 o en la patente EP 0 425 235 B1, y en Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992). Los grupos enlazadores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles frente a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles frente a peptidasas, o grupos lábiles frente a esterasas, según se describe en las patentes mencionadas anteriormente, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter.
Los conjugados de anticuerpo y maitansinoide pueden prepararse utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésters (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutareldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexandiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J., 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.
El enlazador puede estar unido a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiente del tipo de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace éster en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, en la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y en la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo, utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 del maitansinol o de un análogo de maitansinol.
D. Formulaciones farmacéuticas
Se preparan formulaciones terapéuticas de los conjugados de anticuerpo-maitansinoide utilizados según la presente invención para su conservación, mezclando un anticuerpo que tenga el grado deseado de pureza con vehículos, diluyentes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A., ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquilparabenos, tales como metil-o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menores que aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones de anticuerpos anti-ErbB2 liofilizadas preferidas se describen en el documento WO 97/04801, incorporada expresamente en el presente documento por referencia
Las formulaciones de la presente memoria también pueden contener más de un compuesto activo, según sea necesario para la indicación concreta que se esté tratando, preferiblemente los que tienen actividad complementaria que no afecten de modo adverso a los demás. Por ejemplo, puede resultar deseable proporcionar también anticuerpos o conjugados de anticuerpo-maitansinoide que se unen a EGFR, ErbB2 (por ejemplo, un anticuerpo que se une a un epitopo diferente sobre ErB2), ErbB3, ErbB4, o el factor endotelial vascular (VEGF) en una sola formulación. Como alternativa, o además, la composición también puede comprender un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una citoquina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente antihormonal y/o un cardioprotector. Estas moléculas están presentes, de modo adecuado, en combinación en unas cantidades que son eficaces para los objetivos previstos.
Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A.,
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Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando estas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico), polilactidas (patente de EEUU n.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de etilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable, tales como LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico).
Las formulaciones que se van a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto puede lograrse con facilidad mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
E. Tratamiento con los conjugados de anticuerpo anti-ErbB2-maitansinoide
Se contempla que, según la presente invención, los conjugados de anticuerpo anti-ErbB2-maitansinoide puedan utilizarse para tratar diversas enfermedades o trastornos. Los ejemplos de afecciones o trastornos incluyen tumores benignos o malignos; leucemias y malignidades linfoides; otros trastornos, tales como trastornos neuronales, gliales, astrocíticos, hipotalámicos, glandulares, de macrófagos, epiteliales, estromáticos, blastocélicos, inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.
En general, la enfermedad o el trastorno que se a tratar es el cáncer. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. Los ejemplos más concretos de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epitelial), cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer renal o de riñón, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
El cáncer comprenderá células que expresan ErbB, de forma que un anticuerpo anti-ErbB de la presente memoria sea capaz de unirse al cáncer, y generalmente se caracterizará por la sobreexpresión del receptor ErbB. En una realización preferida, el cáncer comprende células que expresan ErbB2, aún más preferiblemente células que se caracterizan por la sobreexpresión del receptor ErbB2. Para determinar la expresión de ErbB, por ejemplo, ErbB2, en el cáncer, están disponibles diversos ensayos de diagnóstico/prognóstico. En una realización, la sobreexpresión de ErbB2 puede analizarse mediante IHC, por ejemplo, utilizando HERCEPTEST (Dako). Secciones de tejidos sumergidas en parafina procedentes de la biopsia de un tumor pueden someterse al ensayo IHC y determinarse los criterios de intensidad de tinción de la proteína de ErbB2 como sigue: -Puntuación 0: no se observa tinción o se observa tinción de las membranas en menos del 10% de las células tumorales. -Puntuación 1+: se detecta una tinción de las membranas tenue/apenas perceptible en más del 10% de las células tumorales; las células solo se tiñen en parte de sus membranas. -Puntuación 2+: se observa una tinción completa de las membranas de débil a moderada en más del 10% de las células tumorales. -Puntuación 3+: se observa una tinción completa de las membranas de moderada a fuerte en más del 10% de las células tumorales.
Los tumores con una puntuación de 0 o 1+ para la evaluación de la sobreexpresión de ErbB2 pueden caracterizarse como que no sobreexpresan ErbB2, mientras que los tumores con una puntuación de 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que sobreexpresan ErbB2.
Como alternativa, o además, pueden realizarse ensayos FISH, tales como INFORM (comercializado por Ventana, Arizona) o PATHVISION (Vysis, Illinois) sobre tejido tumoral sumergido en parafina fijado con formaldehído, para determinar el grado (si existe) de sobreexpresión de ErbB2 en el tumor.
En una realización, el cáncer será un cáncer que expresa (y puede sobreexpresar) EGFR. Los ejemplos de cánceres que pueden expresar/sobreexpresar EGFH incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epitelial), cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer renal o de riñón,
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cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
Preferiblemente, los inmunoconjugados de la presente invención y/o ErbB, por ejemplo, la proteína de ErbB2 o EGFR a la cual se unen, son internalizados por la célula, dando como resultado una mayor eficacia terapéutica de los inmunoconjugados para matar a la célula cancerosa a la cual se unen. En una realización preferida, el agente citotóxico (maitansinoide) se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa.
El tratamiento de la presente invención se dirige a tumores que sobreexpresan ErbB que no responden, o que responden muy mal, a un tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB no conjugado. Estos pacientes pueden haber recibido un tratamiento previo con un anticuerpo anti-ErbB no conjugado con un resto maitansinoide, en el que el tratamiento previo puede no haber no producido una mejora significativa, o haya producido una respuesta transitoria. Sin embargo, el tratamiento previo de cualquier paciente concreto con un anticuerpo anti-ErbB no conjugado no es un prerrequisito para identificar pacientes que sean candidatos para un tratamiento según la presente descripción. Cualquier médico puede identificar con facilidad pacientes que se espera que se beneficien de un tratamiento con los inmunoconjugados de la presente invención basándose en datos clínicos disponibles al público o su propia experiencia. El tratamiento de mamíferos, y en particular de pacientes humanos, con o sin un tratamiento previo con un anticuerpo anti-ErbB (no conjugado) se encuentra específicamente dentro del alcance de la presente invención.
Los conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide se administran a un mamífero, preferiblemente a un paciente humano, según métodos conocidos, tales como la administración intravenosa, por ejemplo, como una inyección en embolada o mediante infusión continua, a lo largo de un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo.
Pueden combinarse otros regímenes terapéuticos con la administración de los conjugados de anticuerpo anti-ErbBmaitansinoide. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en la que preferiblemente existe un periodo de tiempo en el que ambos agentes activos (o todos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
En una realización preferida, el paciente se trata con dos o más anticuerpos anti-ErbB diferentes, de los cuales al menos uno está en forma de un conjugado de maitansinoide. Por ejemplo, el paciente puede tratarse con un primer conjugado de anticuerpo anti-ErbB2-maitansinoide, en el que el anticuerpo es un inhibidor del crecimiento (por ejemplo, HERCEPTIN®), y un segundo inmunoconjado de anticuerpo o anticuerpo anti-ErbB2, por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-maitansinoide que bloquee la activación por ligando de un receptor ErbB (por ejemplo, 2C4
o un variante de este humanizado y/o madurado por afinidad) o induzca la apoptosis de una célula que sobreexpresa ErbB2 (por ejemplo, 7C2, 7F3, o sus variantes humanizados). En otro caso, el tratamiento implica la administración de anticuerpos que se unen específicamente a dos o más receptores ErbB diferentes tales como, por ejemplo, receptores ErbB2 y EGFR, en el que al menos uno de los anticuerpos anti-ErbB se administra como un conjugado de maitansinoide. Preferiblemente, esta terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinérgico.
Puede resultar deseable combinar la administración de los conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado a un tumor, que no sea un miembro de la familia de receptores ErbB. El otro anticuerpo, en este caso, puede unirse, por ejemplo, al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y puede estar en forma de un conjugado de maitansinoide u otro inmunoconjugado.
En una realización, el tratamiento de la presente invención implica la administración combinada de un conjugado (o conjugados) de anticuerpo anti-ErbB2-maitansinoide y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, que incluye la coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y los programas de dosificación para estos agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse según las instrucciones del fabricante, o según determinan de modo empírico los médicos expertos en la técnica. La preparación y los programas de dosificación para esta quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).
Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide pueden combinarse con un compuesto antihormonal, por ejemplo, un compuesto antiestrógeno, tal como tamoxifeno; un compuesto antiprogesterona, tal como onapristona (véase el documento EP 616 812); o un compuesto antiandrógeno, tal como flutamida, en dosificaciones conocidas para estas moléculas. Cuando el cáncer que se va a tratar es un cáncer independiente de hormonas, el paciente puede haber sido sometido previamente a una terapia antihormonal, y después de que el cáncer se haya hecho independiente de hormonas, puede administrarse al paciente el anticuerpo anti-ErbB2 (y opcionalmente otros agentes, según se describe en la presente memoria).
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A veces, puede resultar beneficioso coadministrar también un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción miocárdica asociada con la terapia) o una o más citoquinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a la eliminación quirúrgica de las células cancerosas y/o a una terapia de radiación.
Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los anteriores agentes coadministrados son las que se emplean en la presente memoria y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-ErbB2.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de los conjugados de anticuerpomaitansinoide dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, tal como se definió anteriormente, la gravedad y el desarrollo de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica y la respuesta al anticuerpo del paciente, y el criterio del médico encargado. El conjugado de anticuerpo-maitansinoide se administra de modo adecuado al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de conjugado de anticuerpo-maitansinoide será una dosificación inicial candidata para la administración al paciente, por ejemplo, en una o más administraciones separadas, o mediante una infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del trastorno, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un régimen de dosificación preferido comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del conjugado de anticuerpo anti-ErbB2-maitansinoide. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El avance de esta terapia puede controlarse con facilidad mediante técnicas y ensayos convencionales.
F. Artículos manufacturados
En otra realización de la invención, se proporciona un artículo manufacturado que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo manufacturado comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto en el envase sobre el recipiente o asociado a él. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados por una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar el trastorno y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa para una disolución intravenosa o un vial que tenga un tapón que pueda ser atravesado por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un conjugado de anticuerpo anti-ErbB2-maitansinoide. La etiqueta o el prospecto en el envase indican que la composición se utiliza para tratar el trastorno elegido, tal como cáncer. En una realización, la etiqueta
o el prospecto en el envase indica que la composición que comprende el anticuerpo que se une a ErbB2 puede utilizarse para tratar un cáncer que exprese un receptor ErbB seleccionado del grupo que consiste en el receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR), ErbB2, ErbB3 y ErbB4, preferiblemente EGFR. Además, la etiqueta o el prospecto en el envase pueden indicar que el paciente que se va a tratar es un paciente que tiene un cáncer que se caracteriza por una activación excesiva de un receptor ErB seleccionado de EGFR, ErbB2, ErbB3 o ErbB4. Por ejemplo, el cáncer puede ser un cáncer que sobreexpresa uno de estos receptores y/o que sobreexpresa un ligando de ErbB (tal como TGF-). La etiqueta o el prospecto en el envase también pueden indicar que la composición puede utilizarse para tratar un cáncer, en el que el cáncer no se caracteriza por la sobreexpresión del receptor ErbB2. Por ejemplo, aunque el presente prospecto en el envase para HERCEPTIN indica que el anticuerpo se utiliza para tratar pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína de ErbB2, el presente prospecto en el envase puede indicar que el anticuerpo o la composición se utiliza para tratar un cáncer que no responde, o responde muy mal, a un tratamiento con HERCEPTIN®. En otras realizaciones, el prospecto en el envase puede indicar que el conjugado de anticuerpo-maitanosinoide o la composición puede utilizarse también para tratar un cáncer independiente de hormonas, cáncer de próstata, cáncer de colon o cáncer colorrectal. Además, el artículo manufacturado puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida de él, en el que la composición comprende un conjugado de maitansinoide de un primer anticuerpo que se une a ErbB2 e inhibe el crecimiento de células cancerosas que sobreexpresan ErbB2; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en él, en el que la composición comprende un segundo anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB, o un conjugado de este segundo anticuerpo con un maitansinoide. El artículo manufacturado en esta realización de la invención también puede comprender un prospecto en el envase que indique que la primera y la segunda composición pueden utilizarse para tratar un cáncer. Como alternativa, o además, el artículo manufacturado puede comprender también un segundo (o un tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), disolución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Otros detalles de la invención se ilustran en los siguientes ejemplos no limitantes.
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Ejemplo 1
Producción, caracterización y humanización del anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 4D5
Se produjo el anticuerpo monoclonal murino 4D5 que se une específicamente al dominio extracelular de ErbB2 según se describe en Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990). Brevemente, células NIH 3T3/HER2-3400 (que expresan aproximadamente 1 x 105 moléculas de ErbB2/célula) producidas según se describe en Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7158-7163 (1987) se recolectaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene EDTA 25 mM y se utilizaron para inmunizar ratones BALB/c. Los ratones recibieron inyecciones i.p. de 107 células en 0,5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. Los ratones con antisuero que inmunoprecipitó ErbB2 marcado con 32P recibieron inyecciones i.p. de un extracto de membranas de ErbB2 purificado con aglutinina de trigo (WGA)-Sepharose en las semanas 9 y 13. A esto le siguió una inyección i.v. de 0,1 ml de la preparación de ErbB2, y los esplenocitos se fusionaron con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Los sobrenadantes de los hibridomas se seleccionaron para la unión a ErbB2 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación.
Cartografiado y caracterización de epitopos
Se determinó el epitopo de ErbB2 unido por el anticuerpo monoclonal 4D5 mediante un análisis de unión competitiva (Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990)). Se realizaron estudios de bloqueo cruzado por fluorescencia directa sobre células intactas utilizando la máquina de selección PANDEX™ Screen Machine para cuantificar la fluorescencia. El anticuerpo monoclonal se conjugó con isotiocianato de fluoresceína (FITC), utilizando procedimientos establecidos (Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel y Schiigi (eds.), San Francisco, W.J. Freeman Co. (1980)). Las monocapas confluentes de células NIH 3T3/HER2-3400 se tripsinizaron, se lavaron una vez y se resuspendieron a 1,75 x 106 células/ml en PBS frío que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5% y NaN3 al 0,1%. Se añadió una concentración final de partículas de látex al 1% (IDC, Portland, OR) para reducir la coagulación de las membranas de la placa PANDEX™. Se añadieron 20 l de células en suspensión y 20 l de anticuerpos monoclonales purificados (de 100 g/ml a 0,1 g/ml) a los pocillos de la placa PANDEX y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Se añadió una dilución predeterminada del anticuerpo monoclonal marcado con FITC en 20 l a cada pocillo, se incubó durante 30 minutos, se lavó y se cuantificó la fluorescencia mediante PANDEX™. Se consideró que los anticuerpos monoclonales compartían un epitopo si cada uno bloquea la unión del otro en 50% o mayor, en comparación con un anticuerpo monoclonal control irrelevante. En este experimiento, se asignó el epitopo I al anticuerpo monoclonal 4D5 (restos aminoácidos desde aproximadamente 529 a aproximadamente 625, ambos inclusive, dentro del dominio extracelular de ErbB2 (véase SEQ ID NO:3)).
Se evaluaron las características inhibidoras del crecimiento del anticuerpo monoclonal 4D5 utilizando la línea de células de tumor de mama SK-BR-3 (véase Hudziak et al., Molec. Cell. Biol., 9(3):1165-1172 (1989)). Brevemente, se desprendieron células SK-BR-3 utilizando tripsina al 0,25% (en vol/vol) y se suspendieron en medio completo a una densidad de 4 x 105 células por ml. Se cultivaron partes alícuotas de 100 l (4 x 104 células) en placas de microdilución de 96 pocillos, se dejó que las células se adhirieran y después se añadieron 100 l de medio solo o de medio que contiene el anticuerpo monoclonal (concentración final 5 g/ml). Después de 72 horas, las placas se lavaron dos veces con PBS (pH 7,5), se tiñeron con violeta cristal (al 0,5% en metanol) y se analizaron para la proliferación celular relativa según se describe en Sugarman et al., Science, 230:943-945 (1985). El anticuerpo monoclonal 4D5 inhibe la proliferación celular relativa de SK-BR-3 en aproximadamente 56%.
El anticuerpo monoclonal 4D5 también se evaluó para su capacidad para inhibir la fosforilación de tirosina estimulada por HRG de proteínas en el intervalo de Mr 180.000 procedentes de lisados de células completas de células MCF7 (Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465 (1996)). Se ha indicado que las células MCF7 expresan todos los receptores ErbB conocidos, pero a niveles relativamente bajos. Puesto que ErbB2, ErbB3 y ErbB4 tienen un tamaño molecular casi idéntico, no es posible discernir cuál es la proteína que está siendo fosforilada en la tirosina cuando se evalúan lisados de células completas mediante un análisis de transferencia Western. Sin embargo, estas células son ideales para los ensayos de fosforilación de tirosina por HRB porque, bajo las condiciones de ensayo utilizadas, en ausencia de HRG añadido de modo exógeno, muestran unos niveles de bajos a indetectables de proteínas de fosforilación de tirosina en el intervalo de Mr 180.000.
Las células MCF7 se cultivaron en placas de 24 pocillos y se añadieron anticuerpos monoclonales contra ErbB2 a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente; después se añadió rHRG 1177-244 a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y la incubación continuó durante 8 minutos. El medio se aspiró cuidadosamente de cada pocillo y las reacciones se detuvieron mediante la adición de 100 l de tampón de muestra de SDS (SDS al 5%, DTT 25 mM, y Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Cada muestra (25 l) se sometió a una electroforesis sobre un gel con gradiente del 4-12% (Novex), y después se transfiere electroforéricamente a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno). Se revelaron las inmunotransferencias de antifosfotirosina (4G10, de UBI, utilizada a 1 g/ml) y se cuantificó la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr 180.000 mediante densitometría de reflectancia, según se ha descrito previamente (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269:14661-14665 (1994)).
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El anticuerpo monoclonal 4D5 inhibe significativamente la generación de una señal de fosforilación de tirosina inducida por HRG a Mr 180.000. En ausencia de HRG es incapaz de estimular la fosforilación de la tirosina de proteínas en el intervalo de Mr 180.000. Además, este anticuerpo no presenta reacción cruzada con EGFR (Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990)), ErbB3 ni ErbB4. El anticuerpo monoclonal 4D5 es capaz de bloquear la estimulación de HRG de la fosforilación de tirosina en 50%.
Se evaluó el efecto inhibidor del crecimiento del anticuerpo monoclonal 4D5 sobre células MDA-MB-175 y SK-BR-3 en presencia o en ausencia de rHRG 1 exógeno (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). Los niveles de ErbB2 en células MDA-MB-175 son 4-6 veces mayores que el nivel ue se encuentra en células epiteliales de mama normales, y el receptor ErbB2-ErbB4 está constitutivamente fosforilado en la tirosina en células MDA-MB-175. El anticuerpo monoclonal 4D5 fue capaz de inhibir la proliferación de células MDA-MB-175, en presencia y en ausencia de HRG exógeno. La inhibición de la proliferación celular por 4D5 depende del nivel de expresión de ErbB2 (Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255-263 (1993)). Puede detectarse una inhibición máxima de 66% en células SK-BR-3. Sin embargo, este efecto puede ser superado por HRG exógeno.
Humanización
El anticuerpo monoclonal murino 4D5 se humanizó utilizando una nueva estrategia de "mutagénesis de conversión de genes", según se describe en la patente de EEUU n.º 5.821.337, cuya descripción completa se incorpora expresamente en la presente memoria como referencia. El anticuerpo monoclonal humanizado 4D5 utilizado en los siguientes experimentos se denomina huMAb4D5-8. Este anticuerpo tiene el isotipo IgG1.
Ejemplo 2
Conjugados de HERCEPTIN®-DM1
1. Purificación de HERCEPTIN
Se disuelve HERCEPTIN (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, patente de EEUU n.º 5.821.337) (1 vial que contiene 440 mg de anticuerpo) en 50 ml de tampón MES (MES 25 mM, NaCl 50 mM, pH 5,6). La muestra se carga sobre una columna de intercambio catiónico (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm) que ha sido equilibrada en el mismo tampón. La columna también se lava con el mismo tampón (5 volúmenes de columna). Se eluye el HERCEPTIN aumentando la concentración de NaCl en el tampón hasta 200 mM. Las fracciones que contienen el anticuerpo se reúnen, se diluyen hasta 10 mg/ml y se dializan en un tampón que contiene fosfato de potasio 50 mm, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5.
2. Modificación de HERCEPTIN con SPP
El anticuerpo HERCEPTIN purificado se modificó con N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para introducir grupos ditiopiridilo. El anticuerpo (376,0 mg, 8 mg/ml) en 44,7 ml de tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 6,5) que contiene NaCl (50 mM) y EDTA (1 mM) se trató con SPP (5,3 equivalentes molares en 2,3 ml de etanol). Después de una incubación durante 90 minutos bajo una atmósfera de argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró en gel a través de una columna de Sephadex G25 equilibrada con citrato de sodio 35 mM, NaCl 154 mM, EDTA 2 mM. Las fracciones que contienen anticuerpo se reúnen y se ensayan. Se determina el grado de modificación del anticuerpo según se describió anteriormente. La recuperación del anticuerpo modificado (HERCEPTIN®-SPP-Py) fue de 337 mg (89,7%) con 4,5 grupos 2-tiopiridina liberables unidos por anticuerpo.
3. Conjugación de HERCEPTIN®-SPP-Py con DM1
El anticuerpo modificado (337,0 mg, 9,5 µmol de grupos 2-tiopiridina liberables) se diluyó con el anterior tampón citrato de sodio 35 mM, pH 6,5, hasta una concentración final de 2,5 mg/ml. Entonces se añadió DM1 (cuya estructura se muestra en la figura 1) (1,7 equivalentes, 16,1 µmol) en dimetilacetamida 3,0 mM (DMA, al 3% en v/v en la mezcla de reacción final) a la disolución de anticuerpo. La reacción se desarrolla a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón durante 20 horas. La estructura de los conjugados de HERCEPTIN®-DM1 se ilustra en la figura 2.
La reacción se carga sobre una columna de filtración en gel de Sephacryl S300 (5,0 cm x 90,0 cm, 1,77 l) equilibrada con citrato de sodio 35 mM, NaCl 154 mM, pH 6,5. El caudal es de 5,0 ml/min y se recogen 65 fracciones (20,0 ml cada una). Un pico principal se centra alrededor de la fracción n.º 47 (figura 3). El pico principal comprende HERCEPTIN®-DM1 monomérico. Se reúnen las fracciones 44-51 y se ensayan. Se determina el número de moléculas del fármaco DM1 unidas por molécula de anticuerpo midiendo la absorbancia a 252 y 280 nm, y se descubre que es de 3,7 moléculas de fármaco por molécula de anticuerpo.
Ejemplo 3
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Animales transgénicos
Para mejorar la actividad clínica de HERCEPTIN®, se desarrolló un modelo de ratón HER2-transgénico con el que pueden ensayarse de modo preclínico nuevas terapias dirigidas a HER2. En los ratones transgénicos que expresan una forma mutacionalmente activida de neu, el homólogo de rata de HER2, se desarrollan tumores con facilidad, pero el HER2 que se sobreexpresa en cánceres de mama no está mutado, y la formación de tumores es mucho menos robusta en ratones transgénicos que sobreexpresan HER2 no mutado (Webster et al., Semin. Cancer Biol., 5: 69-76 (1994)). Para mejorar la formación de tumores con HER2 no mutado se empleó una estrategia para potenciar aún más la sobreexpresión de HER2 no mutado en un ratón transgénico.
Cualquier promotor que estimule la expresión de HER2 en células epiteliales en la glándula mamaria de ratón puede utilizarse en las construcciones descritas. Muchos de los genes de las proteínas de la leche son transcritos por elementos de promotor/potenciador que son específicamente activos en las glándulas mamarias. Los genes de las proteínas de la leche incluyen los genes que codifican caseinas (α-S, y β) β-lactoglobulina, α-lactoalbúmina y la proteína ácida del suero. El promotor de β-lactoglobulina ovino está bien caracterizado y se emplea mucho en la técnica (Whitelaw et al., Biochem J., 286:31-39 (1992)). Sin embargo, también son adecuados fragmentos similares de ADN de promotor de otras especies. Un promotor preferido es el promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del virus de tumor mamario de ratón (MMTV). Se generó una construcción de transgén de HER2 empleando el promotor MMTV LTR.
Para mejorar la formación de tumores con HER2 no mutado se generaron ratones transgénicos utilizando un plásmido de ADNc de HER2 en el que un ATG cadena arriba se deleciona para evitar el inicido de la traducción en estos codones ATG cadena arriba, que de otra forma reduciría la frecuencia del inicio de la traducción desde el codón de inicio auténtico cadena abajo de HER2 (por ejemplo, véase Child et al., J. Biol. Chem., 274: 24335-24341 (1999)). Además, se añadió un intrón quimérico en el extremo 5', que también debería potenciar el nivel de expresión, tal como se ha indicado previamente (Neuberger y Williams, Nucleic Acids Res., 16:6713 (1988); Buchman y Berg, Mol. Cell. Biol., 8:4395 (1988); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:836 (1988)). El intrón quimérico se derivó de un vector de Promega, el vector de expresión de mamífero pCI-neo (pb 890-1022). El extremo 3' del ADNc está flanqueado por los exones 4 y 5 de la hormona del crecimiento humana y secuencias de poliadenilación. Además, se emplearon ratones FVB, porque esta raza es más susceptible al desarrollo de tumores. Se empleó el promotor de MMTV-LTR para asegurar la expresión de HER2 específica de tejido en la glándula mamaria. Los animales recibieron una dieta AIN 76A para aumentar la susceptibilidad a la formación de tumores (Rao et al., Breast Cancer Res. and Treatment, 45:149-158 (1997)). La secuencia de nucleótidos de esta construcción de plásmido de transgén (SEQ ID NO:1) se muestra en la figura 4.
Los animales adecuados para los experimentos transgénicos pueden obtenerse de fuentes comerciales convencionales, tales como Taconic (Germantown, N.Y.). Son adecuadas muchas razas, pero se prefieren los ratones hembra FVB por su mayor susceptibilidad a la formación de tumores. Los machos FVB se emplean para el apareamiento y se utilizando sementales CD.1 vasectomizados para estimular la psedopreñez. Pueden obtenerse ratones vasectomizados de cualquier suministrador comercial. Los fundadores se cruzan con ratones FVB o con ratones heterocigóticos 129/BL6 x FVB p53. Los ratones con heterocigosis en el alelo p53 se emplean para aumentar potencialmente la formación de tumores. Sin embargo, esto ha demostrado ser innecesario. Por tanto, algunos tumores F1 son de la raza mixta. Los tumores de los fundadores son solo FVB. Se obtuvieron seis fundadores con algunos tumores en desarrollo que no han tenido camadas.
Ejemplo 4
El ratón HER2-transgénico como modelo tumoral para evaluar terapias dirigidas a HER2
Las biopsias de glándulas mamarias de un ratón transgénico fundador generado como se describe en el ejemplo 3 mostraron expresión 3+ de HER2, según se determina mediante tinción inmunohistoquímica, con aproximadamente 2 meses de edad. La cantidad de dominio extracelular de HER2 (ECD) desprendido hacia el suero se midió y se descubrió que era de aproximadamente 1,2 ng/ml (Huang et al., supra). Este ratón posteriormente desarrolló un tumor mamario a los 5 meses de edad, después de parir 4 camadas. El tumor se reseccionó de modo quirúrgico bajo condiciones asépticas y se trituró en trozos pequeños, 2 mm3, que después se transplantaron a la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra FVB de tipo salvaje. Se desarrollaron tumores en 22 de los 31 ratones receptores, con una latencia de 5 semanas. Con la posterior transferencia, los tumores se desarrollaron con una latencia más corta y crecieron con más rapidez, y la incidencia de los tumores aumentó hasta >95% de los receptores. La expresión de HER2, según se determina mediante tinción inmunohistoquímica, fue de 3+ pero heterogénea en el tumor primario, que se convirtió en 3+ uniforme después de la primera transferencia.
El tratamiento de ratones que portan tumores con HERCEPTIN o 4D5, el anticuerpo murino a partir del cual se deriva el HERCEPTIN humanizado, solo produce un efecto modesto sobre el crecimiento de los tumores transplantados (figura 5). La expresión de HER2 fue de 3+ en tumores que crecieron durante la terapia con
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HERCEPTIN o 4D5, lo cual indica que no existe selección de tumores HER2-negativos. Además, se detectó cy3-HERCEPTIN decorando las células tumorales después de la inyección en ratones que portan tumores, lo cual indica que la falta de eficacia no fue debida a la incapacidad del anticuerpo para acceder al tumor.
Basándose en la expresión persistente de HER2 y la incapacidad de este modelo tumoral para responder a HERCEPTIN®, se ensayó una nueva estrategia, utilizando HERCEPTIN conjugado con el maitansinoide DM1, según se describe en el ejemplo 3. La figura 5 demuestra que el conjugado de HERCEPTIN®-DM1 tiene una espectacular actividad antitumoral en este modelo. El RITUXAN®, un anticuerpo monoclonal anti-CD20 no relacionado, se empleó como control negativo para estos estudios. Se produjo poca respuesta frente a HERCEPTIN®, comparado con el anticuerpo control, RITUXAN®, pero se produjo una notable actividad antitumoral del conjugado de maitansinoide de HERCEPTIN®. Tal como se muestra en la figura 5, todos los ratones tratados con HERCEPTIN®-maitansinoide mostraron un notable encogimiento de sus tumores, aunque ninguno desapareció. Después de aproximadamente 4 semanas, los tumores volvieron a crecer. En este momento se sacrificaron cinco animales. Se descubrió que sus tumores expresaban HER2 a niveles 3+. Así, no se produjo selección por tumores HER2-negativos. Basándose en esta observación, los 3 ratones restantes se trataron con HERCEPTIN®maitansinoide durante 5 días consecutivos. Los tumores de nuevo retrocedieron en respuesta al tratamiento.
Depósito del material biológico
Se han depositado las siguientes líneas celulares de hibridoma en the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EEUU (ATCC):
Denominación del anticuerpo
ATCC n.º Fecha de depósito
7C2
ATCC HB-12215 17 de octubre, 1996
7F3
ATCC HB-12216 17 de octubre, 1996
4D5
ATCC CRL 10463 24 de mayo, 1990
2C4
ATCC HB-12697 8 de abril, 1999
Este depósito se realizó según las disposiciones de the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure y las regulaciones allí expuestas (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables durante 30 años desde la fecha del depósito. El ATCC puede suministrar los organismos bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura una disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie de los cultivos al público tras la expedición de la pertinente patente de EEUU o tras abrir al público cualquiera de las solicitudes de patente de EEUU o de otro país, cualquiera que sea la primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para aquellos que the U.S. Commissioner of Patents and Trademarks determine que tenga derecho a ello, según 35 USC §122 y las normas de dicho comisiario conformes a ello (que incluye 37 CFR §1.12 con particular referencia a 886 OG 638).
Con respecto a las denominaciones para las que se busca una patente europea, una muestra del microorganismo depositado estará disponible hasta la publicación de la mención de la concesión de la patente europea, o hasta la fecha en la que la aplicación haya sido rechazada o retirada o se considere retirada, solo mediante la entrega de dicha muestra a un experto nombrado por la persona que pide la muestra (Regla 28(4) EPC).
El cesionario de la presente solicitud ha accedido a que, si los cultivos en depósito mueren o se pierden o se destruyen cuando se cultivan bajo condiciones adecuadas, estos serán reemplazados inmediatamente tras la notificación por un espécimen viable del mismo cultivo. La disponibilidad de las cepas depositadas no debe considerarse una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de ningún gobierno según sus leyes de patentes.
La anterior memoria descriptiva escrita se considera suficiente para que los expertos en la técnica practiquen la invención. La presente invención no se ve limitada en su alcance por las construcciones depositadas, puesto que se pretende que las realizaciones depositadas solo ilustren ciertos aspectos de la invención, y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente se encuentra dentro de la invención. El depósito de los materiales en la presente memoria no constituye una admisión de que la presente memoria descriptiva escrita sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo su mejor modo, ni debe considerarse limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representan. En efecto, a partir de la anterior descripción, serán evidentes para los expertos en la técnica diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria, y se encontrarán dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Se entiende que la aplicación de las indicaciones de la presente invención a un problema o situación específicos está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica a la luz de las indicaciones contenidas en la presente memoria.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Conjugado huMAb4D5-8(Herceptin®)-maitansinoide, conjugado de fragmento de anticuerpo huMAb4D5-8 que se une a antígeno-maitansinoide, o una formulación farmacéutica que comprende dicho conjugado huMAb4D5
    5 8(Herceptin®)-maitansinoide o un conjugado de fragmento de anticuerpo huMAb4D5-8 que se une a antígenomaitansinoide, para utilizar en un método de tratamiento de un tumor, en el que el tumor se caracteriza por la sobreexpresión de ErbB2 y no responde o responde mal al tratamiento con huMAb4D5-8(Herceptin®).
  2. 2. Conjugado, según la reivindicación 1, o formulación farmacéutica, según la reivindicación 1, para utilizar en dicho 10 método de tratamiento de un tumor, en el que el maitansinoide es maitansina, maitansinol o un éster de maitansinol.
  3. 3. Conjugado, según la reivindicación 1 ó 2, o formulación farmacéutica, según la reivindicación 1 ó 2, para utilizar en dicho método de tratamiento de un tumor, en el que el maitansinoide es DM1.
    15 4. Conjugado, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o formulación farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para utilizar en dicho método de tratamiento de un tumor, en el que se utiliza un segundo anticuerpo anti-ErbB2 en dicho método de tratamiento de un tumor.
  4. 5. Conjugado, según la reivindicación 4, o formulación farmacéutica, según la reivindicación 4, para utilizar en dicho
    20 método de tratamiento de un tumor, en el que el segundo anticuerpo anti-ErbB2 es un anticuerpo que bloquea la activación de ligando de ErbB2.
  5. 6. Conjugado, según la reivindicación 4, o formulación farmacéutica, según la reivindicación 4, para utilizar en dicho
    método de tratamiento de un tumor, en el que el segundo anticuerpo anti-ErbB2 es 2C4 humanizado (ATCC HB25 12697).
  6. 7. Conjugado, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o formulación farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para utilizar en dicho método de tratamiento de un tumor, en el que el cáncer se caracteriza por la sobreexpresión del receptor ErbB2 en un nivel 2+ o superior.
    30
  7. 8. Conjugado, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o formulación farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para utilizar en dicho método de tratamiento de un tumor, en el que el cáncer es un cáncer de mama.
    35
    34
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