ES2879799T3 - Anticuerpo anti-HER2 y conjugado del mismo - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmentos funcionales del mismo que se pueden unir específicamente a HER2, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que: (i) la cadena pesada comprende tres regiones CDR, en donde las regiones CDR tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 1, 2 y 3, respectivamente; (ii) la cadena ligera comprende tres regiones CDR, en donde las regiones CDR tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 4, 5 y 6, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo anti-HER2 y conjugado del mismo
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud CN N° 201310586326.2 titulada “ANTI-HER2 ANTIBODY AND CONJUGATE THEREOF”, presentada el 19 de noviembre de 2013.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un novedoso anticuerpo contra HER2 o fragmentos funcionales del mismo, que comprende cadenas pesadas y cadenas ligeras manipuladas. La presente invención se refiere además a conjugados del anticuerpo contra HER2 mejorado con fármacos de molécula pequeña. La presente invención se refiere además al uso del anticuerpo y los conjugados en la fabricación de una medicina para tratar tumores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. Sumario de HER2
ErbB2, también conocido como HER2/neu, es el segundo miembro de la familia de EGFR, que forma un heterodímero con otros tres miembros en la familia de EGFR, para ejercer la función biológica. Hasta la fecha, todavía no se ha encontrado el ligando que se puede unir directamente a ErbB2. El gen neu que codifica ErbB2 se separó en primer lugar de neuroblastoma de rata. Un gen homólogo del gen neu en células somáticas humanas, conocido como HER2, está localizado en el cromosoma 17q21.1. El producto codificado es ErbB2, que consiste en 1255 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 185 kDa, en el que las posiciones 720-987 pertenecen al dominio activo de tirosina cinasa. Además de desempeñar una función a través de la vía de señalización de PI3K y MAPK, ErbB2 también puede reducir la expresión de ciclina D y c-myc, reduciendo así la expresión del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (cdk) p27kip1, que conduce a proliferación celular resultante de la inhibición de la actividad de cdk2 [1 ].
Con los estudios cada vez más amplios y profundos, se ha encontrado que HER2 se expresa o expresa en exceso en diversos tumores. Hasta la fecha, se ha informado que la tasa de expresión positiva, la tasa de expresión en exceso de HER2 en varios tumores y el número de personas en las que HER2 se expresa en exceso son del siguiente modo: cáncer de ovario, 45 %, 21 %, 23316 personas [2]; cáncer de mama, 58 %, 38 %, 223112 personas [3]. Por tanto, existe una necesidad urgente en la práctica clínica de fármacos eficaces que se dirijan a HER2 para tratar tumor maligno. Hasta ahora, los anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles que se dirigen a HER2 incluyen trastuzumab y pertuzumab.
2. Trastuzumab y pertuzumab y otros anticuerpos anti-HER2
Herceptin® (trastuzumab), desarrollado por Genentech, es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige a HER2. En 1998, la FDA estadounidense autorizó trastuzumab en combinación con paclitaxel como una pauta terapéutica de primera línea para tratar cáncer de mama metastásico expresado en exceso por HER2/neu, o como un único fármaco para tratar cáncer de mama metastásico que se expresa en exceso HER2/neu que se había sometido a al menos un ciclo de quimioterapia. Trastuzumab no solo tiene alta afinidad por el receptor HER2 , sino que también resuelve el problema de la inmunogenicidad causada aplicando anticuerpo derivado de murino contra el cuerpo humano. Los resultados de los ensayos clínicos muestran que el uso de trastuzumab solo tiene una tasa efectiva del 11,6 %~16 %, mientras que su terapia de combinación con fármacos químicos tiene una tasa efectiva de hasta el 50 %. En comparación con la quimioterapia solo, dicha combinación confiere a los pacientes con cáncer de mama recurrente avanzado una mayor esperanza de vida y una mortalidad reducida.
Otro fármaco de anticuerpo que se dirige a HER2 es pertuzumab [4], que también fue desarrollado por Genentech. Pertuzumab se une a la región II del dominio extracelular del receptor HER2, que inhibe la formación de un dímero, inhibiendo así la vía de señalización mediada por receptor, mientras que trastuzumab (Herceptin) se une a la región IV del dominio extracelular del receptor HER2. Pertuzumab fue autorizado por la FDA estadounidense el 8 de junio de 2012 para tratar pacientes con cáncer de mama metastásico avanzado HER2-positivo.
La solicitud de patente internacional WO 2011/107957 de Symphogen AS y la solicitud de patente de EE. UU. US 2011/217305 de Symphogen AS describen anticuerpos dirigidos contra HER2 (ErB2). La solicitud de patente internacional WO 2011/14 7982 de Genmab AS describe anticuerpos monoclonales aislados que se unen a HER2.
3. Conjugados de anticuerpo-fármaco
El anticuerpo monoclonal ha recibido cada vez más atención debido a sus características de alta especificidad por diana, efectos secundarios bajos y similares. Sin embargo, cuando se usa solo, su efecto terapéutico es limitado. Ahora, los fármacos de anticuerpo monoclonal más satisfactorios contra el tumor son aquellos contra linfocitoma, tales como linfocitoma crónico no hodgkiniano (NHL). El estudio clínico de fase II de Rituxan dirigido a NHL muestra que la tasa de respuesta total fue solo del 6 %. Con respecto a Herceptin® contra cáncer de mama metastásico, solo el 15 % tienen una respuesta. Por lo tanto, la mayoría de los fármacos de anticuerpo monoclonal se usan en combinación con quimioterapia. Por ejemplo, se usa Rituxan en combinación con quimioterapia habitual para tratar linfocitoma crónico, que puede aumentar la tasa efectiva hasta el 90 %. Hasta ahora, la principal forma de aumentar el efecto terapéutico del anticuerpo monoclonal es los conjugados de anticuerpo-fármaco.
El conjugado de anticuerpo-fármaco pertenece a un tipo de nuevo fármaco antineoplásico de “proyectil biológico”, que consiste en tres partes: anticuerpo, citotoxina y el conector que conecta las dos partes. El anticuerpo monoclonal se acopla con la citotoxina mediante acoplamiento químico. Entonces el conjugado de anticuerpo-fármaco reconoce específicamente el receptor sobre la superficie de células cancerosas y se une al receptor usando el direccionamiento del anticuerpo monoclonal, y entonces el conjugado entra en las células, y previene que las células cancerosas proliferen y destruye las células cancerosas usando proteasas en células que pueden liberar la citotoxina. La tecnología de acoplamiento de anticuerpo-fármaco hace que el fármaco de molécula pequeña y la proteína biológica se fusionen juntos, que puede tener las ventajas de ambos y aumentar la potencia de los fármacos sorprendentemente, reducir los efectos secundarios y así se convierte en una nueva generación de producto terapéutico
La solicitud de patente internacional WO 2011/107957 de Symphogen AS y la solicitud de patente de EE. UU. US 2011/217305 de Symphogen AS describen anticuerpos dirigidos contra HER2 (ErB2). La solicitud de patente internacional WO 2011/147982 de Genmab AS describe anticuerpos monoclonales aislados que se unen a HER2.
El primer ejemplo satisfactorio en la práctica clínica de conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido es gemtuzumab ozogamicina (Wyeth, nombre comercial: Mylotarg). Mylotarg es el primer conjugado de anticuerpo monoclonal-fármaco autorizado. Este fármaco consiste en el anticuerpo anti-CD33, caliqueamicina (un fármaco que degrada ADN) y el conector químico AcBut. Mylotarg es un fármaco en el que la IgG4 humanizada anti-CD33 se acopla con el fármaco antitumoral caliqueamicina, para tratar leucemia mieloide aguda [5]. Mylotarg es la primera generación de conjugado de anticuerpo-fármaco, que tiene tres defectos fundamentales en la tecnología: en primer lugar, el conector usado para conectar la toxina es muy inestable, cuya semivida es solo de dos días, que conduce a un intenso descenso de toxina y a un alto efecto secundario tóxico en la práctica clínica; en segundo lugar, el anticuerpo se acopla con el conector mediante el grupo amino de la lisina, sin embargo, existen decenas de lisinas sobre la superficie de un anticuerpo, y los sitios de acoplamiento son aleatorios, que afectan parcialmente la potencia de los fármacos; lo que es más importante, puesto que la tecnología de acoplamiento no está desarrollada en ese momento, solo el 50 % de los anticuerpos se pueden acoplar con el fármaco, que da como resultado una potencia insatisfactoria de los fármacos en la práctica clínica; en tercer lugar, el anticuerpo usado es IgG4, que carece de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por lo tanto, diez años después de la comercialización, Mylotarg fue retirado del mercado debido a un alto efecto secundario tóxico y a un efecto terapéutico limitado.
El segundo ejemplo satisfactorio en la práctica clínica de conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido es un novedoso fármaco para tratar linfoma de Hodgkin. Puesto que tiene un efecto terapéutico muy bueno, fue autorizado por la FDA estadounidense en 2011 después de solo realizar el ensayo clínico de fase II. Este fármaco fue desarrollado por Seattle Genetics como un novedoso conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) dirigido, que es un tratamiento dirigido para dos tipos de pacientes con linfoma que expresa el antígeno CD30. Este conjugado de anticuerpo-fármaco, brentuximab vedotina, consiste en el anticuerpo monoclonal contra CD30, el inhibidor de microtúbulos (MMAE) y un conector químico dipeptídico. Este conjugado de anticuerpo-fármaco tiene características de bajos efectos secundarios y eficaz inhibición de linfomas. En un ensayo clínico de un solo grupo de fase II, 102 pacientes de 15 a 77 años (mediana de la edad = 31) con linfoma de Hodgkin recurrente o resistente al tratamiento, recibieron tratamiento con brentuximab vedotina, y la mediana del tratamiento comprendía 9 ciclos. Cuando la mediana del ciclo de tratamiento fue 6,7 meses, la tasa de respuesta global fue del 73 %. Cuando la mediana del ciclo de tratamiento fue 20,5 meses, la tasa de respuesta completa fue del 34 %; el 40 % de los pacientes que recibieron el tratamiento lograron una respuesta parcial [7]. La reacción adversa más común es la lesión de los nervios periféricos. El éxito de este fármaco sugiere una factibilidad tecnológica y un futuro muy brillante del conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido.
Otro ejemplo satisfactorio del conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido es T-DM1 contra cáncer de mama maligno desarrollado por Genentech Inc. [8]. El anticuerpo monoclonal en este conjugado de anticuerpo-fármaco es un anticuerpo anti-HER2 (ErbB2) sobre la superficie de células de cáncer de mama, que se acopla con la citotoxina, el inhibidor de microtúbulos DM1. El resultado en el ensayo clínico de fase III de este fármaco muestra mejor efecto terapéutico que la quimioterapia, y un menor efecto secundario. Los pacientes con cáncer de mama, que han recibido previamente tratamiento con los fármacos quimioterapéuticos Herceptin y taxanos, todavía tienen enfermedades progresivas. Sin embargo, el recibir el tratamiento con el conjugado de anticuerpo-fármaco puede prolongar significativamente el tiempo de supervivencia de los pacientes con cáncer de mama HER2-positivo bajo la premisa de que no empeore la enfermedad [9]. Basándose en el buen efecto terapéutico de este fármaco, el fármaco fue autorizado por la FDA estadounidense el 22 de febrero de 2013, para tratar pacientes con cáncer de mama metastásico avanzado HER2-positivo (véase el documento de patente CN100482281C).
Aunque Herceptin es un avance en la historia del tratamiento del cáncer de mama expresado en exceso por HER2 en el que ya se han probado diversos tratamientos contra el cáncer, aproximadamente el 85 % de los sujetos no tienen o solo tienen una débil respuesta a la terapia con Herceptin [11]. Se ha mostrado que HER2 se expresa o expresa en exceso en diversos tumores. Así, existe una necesidad urgente en la práctica clínica de desarrollar fármacos antineoplásicos que se dirijan a HER2, para pacientes con tumores en los que se expresa en exceso HER2 u otras enfermedades relevantes en las que se expresa HER2 (que no solo incluyen cáncer de mama), que no tienen o solo tienen una débil respuesta a la terapia con Herceptin.
Por lo tanto, existe una necesidad urgente en la práctica clínica de desarrollar un fármaco que se dirija a HER2. La presente invención proporciona una solución técnica para cumplir esta necesidad.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmentos funcionales del mismo que se pueden unir específicamente a HER2, en donde
el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que:
(i) la cadena pesada comprende tres regiones CDR, cada una de las cuales tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1,2 y 3, respectivamente; y
(ii) la cadena ligera comprende tres regiones CDR, cada una de las cuales tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4, 5 y 6, respectivamente.
En una realización preferible, la presente invención proporciona un anticuerpo secretado de las células de hibridoma (depositadas en la China General Microbiological Culture Collection Center (ubicado en el Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No. 3, 1 st Beichen West Rd., Chaoyang District, Beijing 100101, R. P. China) el 22 de agosto de 2013, con el número de depósito de 8102 (CGMCC N° 8102)) o un anticuerpo derivado del mismo (la fecha de transferencia al Tratado de Budapest es el 29 de octubre de 2013). En otra realización preferible, la presente invención proporciona un anticuerpo secretado de las células de ovario de hámster chino (CHO) (depositadas en el China Center for Type Culture Collection (ubicado en la Wuhan University, Luojia Mountain, Wuchang District, Wuhan City, Hubei 430072, R. P. China) el 6 de noviembre de 2013, con el número de depósito C2013170 (CCTCC C2013170)) o un anticuerpo derivado del mismo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una combinación de los polinucleótidos aislados, que comprende el polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención o los fragmentos funcionales del mismo y el polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención o los fragmentos funcionales del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la presente invención o la combinación de los polinucleótidos según la presente invención, en el que el polinucleótido se une operativamente a una secuencia reguladora que permite que el polipéptido codificado por el polinucleótido se exprese en una célula hospedadora o un sistema de expresión sin células.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un conjugado que comprende el anticuerpo de la presente invención o los fragmentos funcionales del mismo que se acoplan con uno o más agentes terapéuticos. Preferentemente, el agente terapéutico es un fármaco citotóxico (tal como antimetabolitos, antibióticos antitumorales, alcaloides), inmunopotenciadores o isótopos radiactivos. Más preferentemente, el agente terapéutico se selecciona de maitansinoides (tales como ansamitocina o mertansina), dolastatina y derivados de la misma. Lo más preferentemente, el agente terapéutico se selecciona de MMAE (monometil auristatina E) y MMAF (monometil auristatina F). En otras realizaciones, el agente terapéutico también se puede seleccionar de los enumerados en la Tabla 1 que sigue.
Tabla 1 Lista de los agentes terapéuticos disponibles en los conjugados de la presente invención
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En algunas realizaciones específicas, el agente terapéutico se acopla con dicho anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo mediante un conector. El conector usado en la presente invención se puede unir con el anticuerpo por cualquier forma conocida en la técnica, preferentemente se une mediante tiol y/o amino. En una realización preferible particular, el anticuerpo de la presente invención se une con el conector mediante tiol. El conector usado en la presente invención puede ser un conector escindible (es decir, el conector se podría romper en medio in vivo) o un conector no escindible. En algunas realizaciones, el conector usado en la presente invención se selecciona de conectores escindibles, preferentemente de conectores de péptido, hidrazona y disulfuro, tales como maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (abreviada en lo sucesivo como mc-vc-pAB o vc). En otras realizaciones, el conector usado en la presente invención se selecciona de conectores no escindibles, tales como maleimidocaproílo (abreviado en lo sucesivo como mc). En otras realizaciones, el conector también se puede seleccionar de los enumerados en la Tabla 2 que sigue.
Tabla 2 Lista de los conectores disponibles en los conjugados adecuados para su uso en la presente invención
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En otro aspecto, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la fórmula general de Ab-(L-U)n, en donde Ab representa el anticuerpo según la presente invención o los fragmentos funcionales del mismo, L representa un conector (por ejemplo, mc-vc-pAB o mc), U representa el agente terapéutico (preferentemente, el agente terapéutico se selecciona de fármaco citotóxico, inmunopotenciadores e isótopos radiactivos; más preferentemente, el agente terapéutico se selecciona de maitansinoides, dolastatina y derivados de la misma; lo más preferentemente, el agente terapéutico se selecciona de MMAE y MMAF), y n representa un número entero desde 1 hasta 8 (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8). El conector usado en la presente invención puede ser un conector escindible (es decir, el conector se podría romper in vivo) o un conector no escindible.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo según la presente invención o los fragmentos funcionales del mismo y/o el conjugado según la presente invención, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento o prevención del cáncer (especialmente cáncer HER2-positivo), que incluye administrar el anticuerpo, polinucleótido, combinación de los polinucleótidos, vector de expresión, conjugado y/o composición farmacéutica según la presente invención en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto en necesidad del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del anticuerpo, polinucleótido, combinación de los polinucleótidos, vector de expresión, conjugado y/o composición farmacéutica según la presente invención en la fabricación de una medicina para tratar o prevenir cáncer.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo, polinucleótido, combinación de los polinucleótidos, vector de expresión, conjugado y/o composición farmacéutica según la presente invención, que se usa para tratar o prevenir cáncer. Preferentemente, el cáncer es cáncer HER2-positivo. Más preferentemente, el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de ovario o cáncer gástrico. Más preferentemente, el cáncer es cáncer resistente a Lapatinib y/o Herceptin, tal como cáncer de mama, cáncer de ovario o cáncer gástrico resistente a Lapatinib y/o Herceptin.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula de hibridoma, que se depositó en el China General Microbiological Culture Collection Center el 22 de agosto de 2013 con el número de depósito de 8102 (la fecha de transferencia al Tratado de Budapest fue el 29 de octubre de 2013).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula CHO, que se depositó en el China Center for Type Culture Collection el 6 de noviembre de 2013, con el número de depósito de C2013170.
En concreto, la presente invención se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC), que puede tratar cáncer. El conjugado comprende un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al receptor de superficie de la célula cancerosa, un fármaco de molécula pequeña con efecto citotóxico, así como un conector que puede unir juntas las dos partes anteriormente mencionadas mediante enlace covalente. La presente invención también se refiere al uso de estos conjugados en la fabricación de una medicina para tratar cáncer de mama y/o cáncer de ovario y/o cáncer gástrico.
En algunas realizaciones específicas, la presente invención se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco, que tiene la fórmula general de Ab-(L-U)n, en donde Ab representa el anticuerpo monoclonal que se dirige a HER2, L se selecciona de mc-vc-pAB o mc, U se selecciona de MMAE o MMAF, y n representa un número entero desde 1 hasta 8.
Particularmente, el anticuerpo humanizado que se dirige a HER2 como se desvela en la presente invención es RC48, en el que las regiones CDR de la cadena pesada son como se muestran por SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3, respectivamente, y en el que las regiones CDR de la cadena ligera son como se muestran por SEQ ID NO. 4, SeQ ID NO. 5 y SeQ ID NO. 6, respectivamente.
Más particularmente, el anticuerpo humanizado que se dirige a HER2 como se desvela en la presente invención es RC48, que es secretado de las células depositadas en el China Center for Type Culture Collection el 6 de noviembre de 2013, con el número de depósito
Ventajas técnicas
Trastuzumab (Herceptin®) es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante, que se dirige selectivamente al dominio extracelular del receptor-2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), usado principalmente para tratar cáncer HER2-positivo. El anticuerpo humanizado RC48 de la presente invención es un anticuerpo humano recombinante contra HER2, que es capaz de unirse al dominio extracelular de HER2 con alta afinidad. En los experimentos in vitro e in vivo, el anticuerpo monoclonal RC48 muestra alta capacidad para inhibir la proliferación de células tumorales humanas que expresan en exceso HER2.
Las dos citotoxinas de molécula pequeña implicadas en la presente invención son MMAE (monometil auristatina E) o MMAF (monometil auristatina F) (véase la Fig. 6), que son dos tipos de molécula pequeña que inhiben la tubulina celular. La presente invención también se refiere a dos tipos de conectores: Maleimidocaproílo (abreviado en lo sucesivo mc) y maleimido-caproil-valina-vitrulina-p-AminoBenciloxi (abreviado en los sucesivo mc-vc-pAB, que también se representa simplemente por vc en el nombre de un conjugado) (véase la Fig. 7); el primer conector es no escindible, mientras que el último es escindible, y los conjugados correspondientes muestran diferente estabilidad y semivida in vivo. Los tres siguientes conjugados de anticuerpo-fármaco se forman por el anticuerpo monoclonal RC48 unido al conector mediante cisteína: RC48-vc-MMAE (véase la Fig. 8), RC48-vc-MMAF (véase la Fig. 9) y RC48-mc-MMAF (véase la Fig. 10).
El conjugado de la presente invención tiene capacidad de unión a antígeno-anticuerpo comparable in vitro con el anticuerpo no marcado RC48, y T-DM1. En el ensayo de viabilidad celular, su citotoxicidad es significativamente superior a la del anticuerpo no marcado RC48, Herceptin, T-DM1, en el que las células usadas en el experimento incluyen la cepa SK-BR-3 de células de cáncer de mama de alta expresión de HER2 (Fig. 12) y la cepa SK-OV-3 de cáncer de células de ovario de alta expresión de HER2 (Fig. 13). En los experimentos animales del modelo de tumor por trasplante en ratones sin pelo, el conjugado de la presente invención tiene un efecto antitumoral significativo para el ratón sin pelo portador del tumor de cáncer de mama humano BT474 (Fig. 14), y el conjugado preferible muestra una actividad antitumoral significativa para ratón sin pelo portador de tumor resistente a Herceptin® y Lapatinib, con un efecto significativamente mejor que los fármacos de control positivo (Fig. 15); mientras tanto, el conjugado de anticuerpo de la presente invención muestra un efecto inesperadamente antitumoral para el ratón sin pelo portador de tumor por trasplante de cáncer de ovario y cáncer gástrico (Fig. 16 y Fig. 17). Mediante el experimento in vivo en ratón, se determina que las dosis de tolerancia máxima del presente conjugado son del siguiente modo: RC48-mc-MMAF: >150 mg/kg, RC48-vc-MMAF: 60 mg/kg, RC48-vc-MMAE: 100 mg/kg, respectivamente. Además, la prueba de eficacia se lleva a cabo usando el modelo de tumor por trasplante de cáncer de ovario humano de ratones sin pelo, y se encuentra que, durante la administración del fármaco, observando el cambio de los volúmenes del modelo de tumor en los ratones y los pesos corporales de los ratones en sí, la potencia del conjugado es significativamente superior a la del anticuerpo no marcado y T-DM1. Además, los pesos corporales de los ratones son elevados (Fig. 18), que muestra una buena potencia con baja toxicidad y alta eficiencia. El conjugado proporciona una nueva elección de fármaco candidato para tratar cáncer HER2-positivo, cáncer resistente a fármaco de anticuerpo contra HER2, cáncer resistente a inhibidor de tirosina cinasas y otras enfermedades relevantes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 representa la figura de SDS-PAGE de la proteína recombinante humana purificada HER2-ECD, que se tiñe con azul brillante de Coomassie. Cada pocillo se carga con 10 pg.
La Fig. 2 representa las figuras del análisis de SDS-PAGE de cRC48, RC48, en las que cada pocillo se carga con 2 gg de anticuerpo.
La Fig. 3 muestra la afinidad de unión entre anticuerpo humanizado RC48 y HER2-ECD determinada por el ensayo de ELISA, y la constante de afinidad de unión Kd calculada. Herceptin y cRC48 se usan como control en este ensayo.
La Fig. 4A representa el análisis de la capacidad de unión del anticuerpo humanizado anti-HER2 RC48 con células HER2+ (SK-BR3, BT474) y células HEr 2- (MDA-MB468) por citometría de flujo. La Fig. 4B muestra el análisis de capacidad de unión del anticuerpo anti-HER2 con el antígeno de superficie celular BT474 por citometría de flujo a diferentes concentraciones de anticuerpo. El anticuerpo anti-HER2 incluye Herceptin, cRC48, RC48. Se analizan un total de 5x104 células.
La Fig. 5 indica que RC48 solo muestra afinidad de unión específica con HER2, pero no con EGFR, HER3 ni HER4.
La Fig. 6 muestra las estructuras moleculares de antitubulina, MMAE y MMAF.
La Fig. 7 muestra las estructuras moleculares de conectores químicos, mc-vc-pAB y mc.
La Fig. 8 muestra la estructura molecular del conjugado de anticuerpo-fármaco RC48 (RC48-vc-MMAE).
La Fig. 9 muestra la estructura molecular del conjugado de anticuerpo-fármaco RC48 (RC48-vc-MMAF).
La Fig. 10 muestra la estructura molecular del conjugado de anticuerpo-fármaco RC48 (RC48-mc-MMAF).
La Fig. 11 muestra el efecto antitumoral de RC48 dirigido al modelo de tumor por trasplante de cáncer de mama humano BT474.
La Fig. 12 muestra el efecto inhibidor del crecimiento del conjugado RC48 dirigido a la célula HER2-positivo SK-BR-3.
La Fig. 13 muestra el efecto inhibidor del crecimiento del conjugado RC48 dirigido a la célula HER2-positivo SK-OV-3.
La Fig. 14 muestra el efecto inhibidor del crecimiento del conjugado RC48 dirigido al modelo de ratón sin pelo portador de tumor por cáncer de mama humano BT474.
La Fig. 15 muestra los efectos terapéuticos de RC48-vc-MMAE, T-DM1 dirigidos a tumores por trasplante en ratón sin pelo de cáncer de mama humano resistente a Herceptin y Lapatinib BT-474/L1.9.
La Fig. 16 muestra el efecto antitumoral del conjugado de RC48 dirigido al modelo de tumor por trasplante de cáncer de ovario humano SK-OV-3.
La Fig. 17 muestra los efectos terapéuticos de RC48-vc-MMAE, Herceptin, Lapatinib dirigidos a los tumores por trasplante en ratón sin pelo de cáncer gástrico humano NCI-N87.
La Fig. 18 muestra el efecto de diferentes conjugados de anticuerpo-fármaco sobre los pesos corporales de ratón.
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ESPECÍFICAS
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos tecnológicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entienden los expertos en la técnica. En cuanto a las definiciones y los términos en la técnica, el experto puede referirse a Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel) para más detalles. La abreviatura del resto de aminoácido es el código trilítero y/o unilítero habitual usado en la técnica, que representa uno de los 20 L-aminoácidos comunes.
Aunque la presente invención usa el intervalo de números y valor aproximado de parámetro en un amplio sentido, el número que se muestra en un ejemplo específico se cita con la mayor exactitud posible. Sin embargo, cualquier número en sí incluye inevitablemente un error en cierta medida, que es causado por la desviación estándar producida de cada una de sus mediciones. Además, se debe entender que todos los intervalos que se desvelan en la presente invención cubren todos y cada uno de los subintervalos contenidos en ella. Por ejemplo, se debe considerar que el intervalo de “desde 1 hasta 10” que se cita contiene todos y cada uno de los subintervalos entre el valor mínimo de 1 y el valor máximo de 10 (incluyendo los extremos); es decir, todos los subintervalos empiezan desde el valor mínimo de 1 o desde otro punto mayor (tal como desde 1 hasta 6,1 ), y los subintervalos terminan con el valor máximo de 10 u otro punto menor (tal como desde 5,5 hasta 10). Además, se debe entender que cualquier referencia citada como “incorporado en el presente documento” se incorpora en su totalidad.
Además, se debe observar que, como se usa en la presente memoria descriptiva, la forma en singular incluye la forma en plural del sujeto indicado, a menos que esté evidentemente e indudablemente limitado a un sujeto indicado. El término “o” se puede usar indistintamente con “y/o”, a menos que se indique evidentemente en el contexto.
Los términos “composición farmacéutica”, “fármaco de combinación” y “combinación de fármacos”, como se usan en el presente documento, se pueden usar indistintamente, que significa la combinación para lograr un cierto fin específico combinando juntos al menos un tipo de fármacos y opcionalmente vehículo farmacéuticamente aceptable o adyuvante. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye la combinación separada en el nivel tiempo y/o espacio, en tanto que se pueda lograr el fin de la presente invención funcionando juntos. Por ejemplo, los ingredientes contenidos en la composición farmacéutica (tales como el anticuerpo, molécula de ácido nucleico, combinación de moléculas de ácido nucleico y/o conjugado) se pueden administrar a un sujeto completamente o por separado. Cuando los ingredientes contenidos en la composición farmacéutica se administran por separado al sujeto, los ingredientes se pueden administrar simultáneamente o uno detrás del otro. Preferentemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es agua, disolución acuosa tamponada, solución salina isotónica, tal como PBS (disolución de tampón fosfato), glucosa, manitol, dextrosa, lactosa, almidón, estearato de magnesio, celulosa, carbonato de magnesio, 0,3 % de glicerina, ácido hialurónico, etanol o polialquilenglicol tal como poli(propilenglicol), triglicérido y similares. Los tipos de vehículos farmacéuticamente aceptables usados se basan especialmente en si la composición según la presente invención se formula para administración oral, nasal, intracutánea, subcutánea, intramuscular o intravenosa. La composición según la presente invención puede comprender humectante, emulsionante o materiales tampón como aditivo.
La composición, vacuna o formulación farmacéutica según la presente invención se podría administrar por cualquier vía adecuada, tal como administración oral, nasal, intracutánea, subcutánea, intramuscular o intravenosa.
El término “agente terapéutico”, como se usa en el presente documento, significa cualquier material o entidad que pueda desempeñar una función en el tratamiento (por ejemplo, tratamiento, prevención, alivio o inhibición de cualquier enfermedad y/o afección), que incluye, pero no se limita a: agente terapéutico químico, agente terapéutico radiactivo, agente inmunoterapéutico, agente térmicamente terapéutico y similares.
“Región CDR” o “CDR”, como se usa en el presente documento, significa la región hipervariable de la cadena pesada y cadena ligera de la inmunoglobulina, como se define por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 y versiones posteriores). Existen tres CDR de la cadena pesada y tres CDR de la cadena ligera. Dependiendo de las situaciones, el término “CDR”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a una o a algunas o incluso a todas estas regiones que contienen la mayoría de los restos de aminoácidos que son responsables de la unión mediante la afinidad del anticuerpo dirigido al antígeno o su epítope de reconocimiento.
Por “uniformidad”, “identidad” o “similitud” entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos en la presente invención, significa un porcentaje de restos de nucleótidos o de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después del mejor alineamiento (alineamiento óptimo). Este porcentaje es puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente y cubren su longitud completa. Una comparación de secuencias entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se hace normalmente comparando estas secuencias después de su emparejamiento óptimo. Dicha comparación se podría hacer en un segmento o una “ventana de comparación”. Además de hacerse manualmente, el alineamiento óptimo para la comparación de secuencias se puede hacer por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2:482), por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) (J. Mol. Biol.
48:443), por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444) y por medio de software informático usando estos algoritmos (GAP, BESTFlT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o usando el software de comparación BLAST N o BLAST P).
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz”, como se usa en el presente documento, se refiere a una dosis suficiente para mostrar los beneficios dirigidos al sujeto que se administra. La dosis real, así como la tasa y la evolución temporal de la administración, variarán dependiendo de la afección propia y el nivel de gravedad del sujeto que está tratándose. La prescripción de tratamiento (tal como la determinación de la dosis, etc.) es en definitiva responsabilidad del médico general y otros médicos, y la determinación se hace basándose en los factores anteriores. Normalmente, la determinación se hace en vista de la enfermedad que está tratándose, la afección individual del paciente, el lugar de administración, el método de administración y cualquier otro factor conocido por los médicos.
El término “sujeto”, como se usa en el presente documento, significa mamíferos tales como el ser humano, y también puede ser otro animal, tales como animales salvajes (tales como garza, cigüeña, grulla, etc.), ganado (tal como pato, ganso, etc.) o animales de laboratorio (tales como chimpancé, mono, rata, ratón, conejo, cobaya, marmota, ardilla terrestre, etc.).
El término “anticuerpo” significa el anticuerpo intacto y cualquier fragmento de unión al antígeno del mismo (“porción de unión al antígeno”) o cadena individual. El “anticuerpo de longitud completa” significa una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) unidas entre sí por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada contiene una región variable de la cadena pesada (abreviada VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera contiene una región variable de la cadena ligera (abreviada VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera contiene un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden dividir además en diversas regiones con hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con diversas regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo amino a extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Estas regiones variables de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras comprenden un dominio de unión para su interacción con un antígeno. La región constante de los anticuerpos puede mediar en la unión de la inmunoglobulina con los tejidos o factores de hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (tales como células efectoras) y el primer componente del sistema del complemento clásico (C1q). El anticuerpo quimérico o humanizado también está englobado en el anticuerpo según la presente invención.
El término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que comprende la región CDR de un anticuerpo derivado no de un humano, y las otras porciones de esta molécula de anticuerpo son de un tipo (o algunos tipos) de anticuerpo humano. Además, con el fin de retener la afinidad de unión, se pueden modificar algunos restos en el segmento de la región estructural (FR) (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988). El anticuerpo humanizado o los fragmentos del mismo según la presente invención se pueden preparar por medio de las tecnologías que conocen los expertos en la técnica (tales como las descritas en los siguientes documentes: Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).
El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo, en el que la secuencia de la región variable es de una especie, mientras que la secuencia de la región constante es de otra especie; por ejemplo, la secuencia de la región variable es de anticuerpo de ratón, mientras que la secuencia de la región constante es de anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico o los fragmentos del mismo según la presente invención se pueden preparar usando una tecnología recombinante de genes. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico se puede producir clonando ADN recombinante que comprende un promotor y una secuencia que codifica la región variable del anticuerpo monoclonal no humano (especialmente murino) según la presente invención y una secuencia que codifica la región constante de anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico de la presente invención codificado por este gen recombinante será, por ejemplo, una quimera murina-humana, que tiene una especificidad determinada por la región variable derivada de ADN murino y tiene el isotipo del mismo determinado por la región constante derivada de ADN humano. Para el método de preparación del anticuerpo quimérico, se podría hacer referencia, por ejemplo, a Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).
El término “anticuerpo monoclonal” significa una preparación molecular de anticuerpo con constitución molecular individual. La composición del anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad dirigida contra un epítope específico.
El término “anticuerpo mRC48”, como se usa en el presente documento, significa, a menos que se indique lo contrario, el anticuerpo monoclonal anti-HER2 derivado de murino mRC48 obtenido por el inventor. El término “anticuerpo RC48”, como se usa en el presente documento, significa, a menos que se indique lo contrario, el anticuerpo anti-HER2 humanizado RC48, que deriva del anticuerpo mRC48 por ingeniería para humanización.
El anticuerpo cRC48, como se usa en el presente documento, significa anticuerpo RC48 quimérico, es decir, anticuerpo quimérico humano-murino, que contiene región variable derivada de murino y región constante derivada de humano. La diferencia entre el anticuerpo cRC48 y el anticuerpo RC48 solo radica en la diferencia de la región estructural en la región variable, es decir, la región estructural de cRC48 deriva de murino, mientras que la región estructural de RC48 deriva de humano.
El término “fragmento funcional”, como se usa en el presente documento, significa particularmente el fragmento de anticuerpo, tal como Fv, scFv (sc indica cadena individual), Fab, F(ab’)2, Fab’, fragmentos scFv-Fc o diacuerpo, o cualquier fragmento que pueda aumentar la semivida por medio de modificación química o por ser incorporado en liposoma. Dicha modificación química incluye, por ejemplo, añadir poli(alquilen)glicol, tal como polietilenglicol (“pegilado”) (denominados fragmentos pegilados Fv-p Eg , scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab’)2-PEG o Fab’-PEG, “PEG” indica polietilenglicol), y dichos fragmentos tienen actividad de unión a EGFR. Preferentemente, el fragmento funcional está compuesto por o comprende secuencias parciales de las cadenas variables pesadas o ligeras del anticuerpo derivado del mismo, la secuencia parcial es suficiente para retener la misma especificidad de unión y afinidad suficiente por el anticuerpo derivado del mismo (para EGFR, preferentemente al menos es igual a 1/100 de la afinidad del anticuerpo derivado del mismo, más preferentemente al menos es igual a 1/10). Este fragmento funcional contendrá al menos 5 aminoácidos, preferentemente 10, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos continuos de la secuencia de anticuerpo derivada del mismo.
Normalmente, con el fin de preparación del anticuerpo monoclonal o fragmentos funcionales del mismo, especialmente anticuerpo monoclonal derivado de murino o fragmentos funcionales del mismo, se puede hacer referencia a las tecnologías particularmente descritas en el manual “Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988), o por las tecnologías para la preparación a partir de las células de hibridoma como se describe por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
El anticuerpo monoclonal según la presente invención se puede purificar, por ejemplo, en una columna de afinidad que ya se ha fijado con el antígeno HER2 (por ejemplo, HER2-ECD) o uno de los fragmentos que contienen el epítope que puede ser específicamente reconocido por el anticuerpo monoclonal según la invención por adelantado. Más específicamente, el anticuerpo monoclonal se puede purificar del siguiente modo: por cromatografía con proteína A y/o G, seguido o no seguido por cromatografía de intercambio iónico que tiene el objetivo de eliminar contaminantes de proteína residual, así como ADN y LPS, seguido o no seguido por la cromatografía de exclusión en gel Sepharose que tiene el objetivo de eliminar los posibles agregados provocados por los dímeros u otros polímeros. En una forma más preferible, todas estas tecnologías se pueden usar simultáneamente o continuamente.
El término “dolastatina”, como se usa en el presente documento, significa un polipéptido separado de un tipo de organismo marino, Dollabella auricularia, que incluye, pero no se limita a, dolastatina 10 y dolastatina 15. La dolastatina es un inhibidor de la mitosis, que muestra una fuerte actividad antineoplásica, y así se considera un candidato del fármaco antineoplásico. Los investigadores han descubierto además y sintetizado muchos derivados de dolastatina, tales como MMAE y MMAF.
El término “conector”, como se usa en el presente documento, significa la parte que conecta el anticuerpo con el fármaco en el conjugado de anticuerpo-fármaco (es decir, ADC), que podría ser escindible o no escindible. El conector escindible (es decir, conector rompible o conector biodegradable) se puede romper en o sobre las células diana, y así liberar el fármaco. En algunas realizaciones, el conector de la presente invención tiene muy mala estabilidad y disminuye enormemente la liberación del fármaco durante el proceso de administración a la diana (por ejemplo, en sangre), reduciendo así el efecto secundario y la toxicidad. En algunas realizaciones particulares, el conector de la presente invención se selecciona de conector escindible, tal como el conector basado en disulfuro (que se rompe selectivamente en las células tumorales a una mayor concentración de tiol), el conector peptídico (que se escinde por la enzima en las células tumorales) y el conector de hidrazona. En realizaciones particulares adicionales, el conector de la presente invención se selecciona de conector no escindible, tal como conector de tio éter. Preferentemente, el conector de la presente invención se selecciona de conector escindible de mc-vc-pAB y conector no escindible de mc.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar y explicar adicionalmente algunas realizaciones y aspectos preferibles de la presente invención, y no se deben interpretar como limitantes del alcance de las reivindicaciones adjuntas, que definen la invención.
Ejemplo 1 Preparación y análisis de secuencias del anticuerpo monoclonal derivado de murino mRC48
1) Expresión y purificación del antígeno HER2
En primer lugar, en el presente estudio, se preparó la proteína HER2 humana recombinante HER2-ECD compuesta de su dominio extracelular (ECD) y se utilizó como el antígeno para la siguiente inmunización y generación de anticuerpos monoclonales, así como diversos ensayos biológicos.
Se clonó el fragmento de ADNc que codifica HER2-ECD (aminoácidos Thr23 a Thr652, acceso de GenBank M11730) en el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen Inc.) por PCR.
El método detallado comprendió: obtener ADNc de la región codificante de HER2-ECD de la cepa de células HER2+ SKBR3 (ATCC N° HTB-30) por medio del método de RT-PCR (se aplicó el kit de ImProm-IITM Reverse Transcription System de Promega Inc.). Los cebadores fueron:
P1: 5'CGGGATCCTGCCACCAGCTGTGCGCC (SEQ ID NO: 7),
P2: 5'GCTCTAGA TCAGTTGATGGGGCAAGGCT (SEQ ID NO: 8);
las secuencias subrayadas fueron los sitios de enzima fíamHl, Xbal introducidos, respectivamente. La amplificación por PCR se realizó con el molde de ADNc de HER2-ECD retrotranscrito usando los cebadores anteriormente mencionados, comprendiendo las condiciones de amplificación 30 ciclos de desnaturalizante a 94 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 1 min, finalmente extensión a 72 °C durante 10 min. Entonces, los fragmentos de PCR se recuperaron, se digirieron con las enzimas fíamHl y Xbal (NEB) y se unieron con el vector pcDNA3. Al extremo C de HER2-ECD se añadió una marca de polihistidina para la purificación convenientemente. Se transfectaron células HEK293 (ATCC de EE. UU.) con el vector de expresión de ADN construido, y la proteína soluble HER2-ECD con la marca His se purificó del líquido de cultivo celular por cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). SDS-PAGE y la tinción con azul brillante de Coomassie indicaron que las proteínas HER2-ECD purificadas tuvieron una homogeneidad superior al 95 %, y el resultado se mostró en la Fig. 1. HER2-ECD soluble estuvo en forma de monómero, con un peso molecular relativo de ~75 kDa que era ligeramente superior al peso molecular calculado (71 kDa), lo que sugirió que la proteína estaba glucosilada en las células HEK293. La proteína HER2-ECD purificada resultante se concentró aún más, y se transfirió al tampón PBS estéril (pH 7,4), para su posterior análisis in vivo e in vitro.
2) Producción y selección de células de hibridoma
Se usó HER2-ECD como se ha descrito anteriormente como el antígeno para inmunizar la generación de anticuerpo de ratón y monoclonal. Se realizaron inmunización, fusión de células de hibridoma y selección primaria según procedimientos convencionales (referencia: WHO Technical Report Series, N° 822, 1992 Anexo 3). Se inmunizaron cuatro ratones Balb/c (comercialmente obtenidos de Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.) con volumen igual de 0,25 mL de proteína HER2-ECD bien mezclada (50-100 pg) y 0,25 mL de adyuvante completo de Freund (Difco Lab). Dos semanas después, se llevó a cabo la segunda inyección con adyuvante incompleto de Freund (Difco Lab) en el que la cantidad de antígeno fue 25-50 pg/0,5 mL/ratón. Tres semanas después, se puso la tercera inyección en la que la cantidad era la misma que la de la segunda inyección. Diez días después de la tercera inyección se sacó sangre. El suero de los ratones se detectó por enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), y se tomaron los bazos de los dos ratones con el mayor título de anticuerpos anti-HER2 en suero, que entonces se fusionaron con la célula de mieloma P3X63Ag8 (ATCC CRL-1580). Se diluyeron las células fusionadas en diez placas de 96 pocillos, y se realizó la selección preliminar mediante el método de ELISA dependiendo de la capacidad de unión con HER2-ECD. En un ensayo de ELISA clásico, la placa de 96 pocillos Maxisorp de Nunc se recubrió con HER2-ECD (0,2-1 pg/mL), y luego se incubó con suero de ratón diluido en gradiente o sobrenadante de hibridoma (100 pL). El anticuerpo anti-HER2 derivado de murino se detectó por el segundo anticuerpo específico de Fc IgG anti-murina F(ab')2 de cabra acoplado con peroxidasa de rábano picante (Invitrogen Inc.).
Se seleccionaron los sobrenadantes de 400 cepas de células de hibridoma por medio del método de ELISA, 36 de las cuales mostraran una fuerte capacidad de unión a HER2-ECD. Se eligieron las diez cepas de células de hibridoma con la capacidad de unión a HER2 más fuerte, y se seleccionaron las cepas de células de hibridoma del subclón mediante el método de dilución limitada. La afinidad de unión de las cepas de células de hibridoma del subclón con HER2 se determinó por cultivo en suspensión de las cepas de células de hibridoma del subclón, purificación de proteínas y ELISA, y la capacidad de unión de las cepas de células de hibridoma del subclón con HER2 expresado naturalmente sobre la superficie de cepas de células de cáncer de mama humanas se examinó aún más por citómetro de flujo (BD FACS Calibur) (véase el Ejemplo 4 para descripciones más detalladas). Finalmente, se determinó una cepa de células de hibridoma mRC48 (IgG1 k derivada de murino) mediante análisis de secuencias, que poseyó una fuerte capacidad de unión a HER2, y luego se analizó más por experimentos de ELISA y celulares. La célula de hibridoma mRC48 se depositó en el China General Microbiological Culture Collection Center el 22 de agosto de 2013, con el número de depósito 8102 (la fecha de transferencia al T ratado de Budapest fue el 29 de octubre de 2013).
3) Análisis de secuencias del clon de células de hibridoma anti-HER2 mRC48
Se secuenciaron las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del clon de células de hibridoma mRC48 por amplificación rápida de extremos 5’ usando el kit comercialmente disponible SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Inc.) según las instrucciones.
Se extrajo ARN total de las células de hibridoma por RNApure Tissue Kit (Beijing Kangweishiji Biological Technology Co. Ltd.), y se llevó a cabo la transcripción inversa del ARN total por SMARt ™ RACE cDNA Amplification Kit, usando el ARN total como molde, usando los cebadores en el kit, añadiendo la transcriptasa inversa SMARTScribeTM Reverse Transcriptase y obteniendo ADNc de primera cadena RACE-Ready mediante transcripción inversa según las etapas que se proporcionan por el kit, y luego realizando dos rondas de PCR en las que: la primera ronda de PCR se llevó a cabo usando el ADNc obtenido como molde, UPM provisto en el kit como cebador del extremo 5’ y mRC48-VL-1/mRC48-VH-1 como cebador del extremo 3’. Las condiciones de reacción de PCR incluyeron predesnaturalización a 94 °C durante 5 min, 25 ciclos de amplificación (desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 68 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 2 min), finalmente extensión a 72 °C durante 10 min.
La segunda ronda de PCR se llevó a cabo usando el producto de la primera ronda de PCR como molde, NUP provisto en el kit como cebador del extremo 5’ y mRC48-VL-2/mRC48-VH-2 como cebador del extremo 3’. Las condiciones de reacción de PCR incluyeron: predesnaturalización a 94 °C durante 5 min, 25 ciclos de amplificación (desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 68 °C durante 30s, extensión a 72 °C durante 2 min), finalmente extensión a 72 °C durante 10 min. De esta forma, se obtuvieron las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del clon de células de hibridoma anterior mRC48.
Figure imgf000012_0002
Los productos de PCR se purificaron por electroforesis en gel de agarosa, y se subclonaron en el vector del clon pCR2.1TOPO (Invitrogen Inc.). Por PCR, se obtuvo ADN de 10 plásmidos clonados independientes y se secuenciaron más usando cebadores directos e inversos M13. El análisis de secuencias de ADN indica que todos estos 10 clones poseyeron ADNc que codifica el polipéptido VH o VL. La secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) se definió por el código de Kabat, y se enumera en la Tabla 3. El análisis de comparación de secuencias indica que la CDR de anti-HER2 mRC48 es significativamente diferente de la de los anticuerpos contra HER2 conocidos que incluyen Herceptin (trastuzumab).
Tabla 3 Las secuencias de aminoácidos de las CDR del anticuerpo monoclonal anti-HER2 mRC48
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 2 Humanización del anticuerpo monoclonal anti-HER2 mRC48
Los presentes inventores humanizaron el anticuerpo monoclonal murino anti-HER2 mRC48 injertando sus CDR de cadena ligera o cadena pesada en una región estructural humana IgG1 k.
Según los métodos publicados, los presentes inventores saben que IgG 1 k humana era altamente homóloga al anticuerpo RC48 murino (mRC48). Así, los presentes inventores diseñaron una región variable de la cadena ligera del anticuerpo RC48 humanizado (RC48-VL) y una región variable de la cadena pesada del anticuerpo RC48 humanizado (RC48-VH), combinándolas con un anticuerpo anti-HER2 humanizado: RC48. La secuencia global de RC48-VH tuvo una similitud del 84 % con el gen IgG1 VH humano. El anticuerpo RC48 contuvo la región variable de la cadena ligera RC48-VL y la región variable de la cadena pesada RC48-VH.
El anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado RC48 se obtuvo por el método de trasplante de CDR, en el que la región variable de la cadena pesada o ligera fue sintetizada directamente por GenScript (Nanjing) Co. Ltd. , y la región variable sintetizada contuvo la secuencia consenso de Kozak, codón de iniciación, péptido señal de cadena pesada o ligera, región estructural derivada de humano y CDR derivada de murino, que se unió con la región constante de IgG1 k humana para formar un fragmento completo mediante el método de PCR de extensión con solapamiento.
Los cebadores de PCR de extensión con solapamiento incluyeron:
Cadena pesada:
VH1: 5'CGCGGATCC GCCGCCACCATGGGATGGAGCT3' (SEQ ID NO: 13)
VH2: 5'GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACTGTCACC AGTGTT3' (SEQ ID NO: 14)
CH1: 5'GCTAGCACCAAGGGCCCATC 3' (SEQ ID NO: 15)
CH2: 5'CCGGAATTCTTTACCGGGAGACAGGGAGA 3' (SEQ ID NO: 16)
Cadena ligera:
VL1: 5'CGCGGATCC GCCGCCACCATGGACATGAGGGT 3' (SEQ ID NO: 17)
VL2: 5'GATGGTGCAGCCACAGTACGCTTTATCTCAACTTTTG TAC3' (SEQ ID NO: 18)
CL1: 5'CGTACTGTGGCTGCACCAT 3' (SEQ ID NO: 19)
CL2: 5'CCGGAATTCACACTCTCCCCTGTTGAAGC3' (SEQ ID NO: 20).
La amplificación de la cadena pesada se llevó a cabo del siguiente modo: en primer lugar, se usó la región variable sintetizada como molde y VH1 y VH2 como cebadores para amplificar la región variable de cadena pesada; se usó la región constante de la cadena pesada de IgG1 k humana como molde y CH1 y CH2 como cebadores para amplificar la región constante de cadena pesada. Las condiciones de amplificación incluyeron 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30s, extensión a 72 °C durante 1 min, finalmente extensión a 72 °C durante 10 min. Entonces, la secuencia de la cadena pesada de RC48 se amplificó usando los dos productos de PCR como molde y VH1 y CH2 como cebadores. Las condiciones de amplificación incluyeron 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 2 min, finalmente extensión a 72 °C durante 10 min.
La amplificación de la cadena ligera se llevó a cabo del siguiente modo: en primer lugar, se usó la región variable sintetizada como molde y VL1 y VL2 como cebadores para amplificar la región variable de cadena ligera; se usó la región constante de la cadena ligera IgG 1 k humana como molde y CL1 y CL2 como cebadores para amplificar la región constante de cadena ligera. Las condiciones de amplificación incluyeron 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 1 min, finalmente extensión a 72 °C durante 10 min. Entonces, la secuencia de la cadena ligera se amplificó usando los dos productos de PCR como molde y VL1 y CL2 como cebadores. Las condiciones de amplificación incluyeron 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 2 min, finalmente extensión a 72 °C durante 10 min.
Por lo tanto, los presentes inventores obtuvieron un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado RC48, en el que RC48 contuvo la región constante de la cadena pesada de IgG 1 k humana y la región variable de la cadena pesada RC48-VH, y la región constante de la cadena ligera IgG1 k humana y región variable de la cadena ligera RC48-VL.
También se obtuvo el anticuerpo quimérico cRC48 humano-murino por los mismos métodos, en el que la región variable murina se asoció con la región constante IgG 1 k humana para formar un fragmento completo mediante PCR de extensión con solapamiento.
Cada uno de los fragmentos amplificados se subclonó en el vector de expresión pcDNA3.0 respectivamente. Los diferentes plásmidos construidos se transfectaron en células CHO suspensas (Invitrogen), para generar diferentes anticuerpos recombinantes, la purificación se llevó a cabo por proteína A y se realizaron análisis de características posteriores. El RC48 anti-HER2 quimérico (denominado cRC48) consistió en una cadena pesada y una cadena ligera de cRC48 quimérico murino-humano. RC48 comprende cadena pesada humanizada RC48-VH y cadena ligera humanizada RC48-VL. cRC48 y RC48 fueron ambos capaces de ser expresados, y los anticuerpos se recogieron del sobrenadante de células CHO, se purificaron por proteína A y se analizaron por ensayo de SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras (véase la Fig. 2). Las células CHO anteriormente mencionadas que secretan el anticuerpo RC48 (es decir, las células CHO transfectadas con la región constante de la cadena pesada y región variable de la cadena pesada de IgG1 k humana RC48-VH, y región constante de la cadena ligera y región variable de la cadena ligera de IgG 1 k humana RC48-VL) se depositaron en el China Center for Type Culture Collection el 6 de noviembre de 2013 con el número de depósito de C2013170.
Ejemplo 3 Caracterización del análisis del anticuerpo anti-HER2 RC48
Se determinaron las constantes de afinidad de unión a HER2 (Kd) del anticuerpo cRC48 quimérico y RC48 humanizado (RC48) por el método de ELISA, y el método detallado se podría encontrar en el Ejemplo 1, es decir, la placa de 96 pocillos se recubrió con proteína HER2-ECD soluble, luego se incubó con anticuerpos diluidos (Herceptin y cRC48 quimérico como controles), y se detectaron los anticuerpos relevantes HER2-ECD (todas las formas de IgG1 k humana) por el segundo anticuerpo específico de Fc IgG anti-humana de cabra acoplada a HRP F(ab’)2 (Invitrogen). Se representó la curva de unión, y se calculó adicionalmente el valor de la constante de afinidad de unión a la superficie (Kd) para cada anticuerpo anti-HER2 por ecuación no lineal específica de sitio de unión único (Journal of Immunological Methods, 270:155-162, 2002) (la Fig. 3 mostró una curva de unión a HER2 típica obtenida de 3 ensayos de ELISA independientes). Los resultados del ensayo de ELISA se muestran en la Fig. 3.
Como se sabe de los 3 ensayos independientes, en comparación con cRC48 (constante de afinidad promedio de 77 pM) y Herceptin (constante de afinidad promedio de 97 pM), el anticuerpo anti-HER2 humanizado RC48 tuvo mayor afinidad de unión a HER2-ECD, con la constante de afinidad promedio de 44 pM. El resultado se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4 Comparación de la constante de afinidad promedio entre el anticuerpo de la presente invención y Herceptin
Figure imgf000014_0002
Ejemplo 4 Capacidad de unión del anticuerpo humanizado RC48 con HER2
1) Experimentos de afinidad de unión del anticuerpo RC48 con HER2
La capacidad de unión del anticuerpo anti-HER2 humanizado RC48 con HER2 que se expresó endógenamente en células de cáncer de mama humano se detectó por citómetro de flujo, y el resultado se mostró en la Fig.3. Se incubaron conjuntamente 6 pg de IgG humana (grupo de control), Herceptin, cRC48, RC48 con dos tipos de células de cáncer de mama humano de estirpe celular HER2+, SK-BR-3, BT474, y células HER2- MDA-MBA468 (2X107 células) sobre hielo durante 30-45 minutos, respectivamente. Después de lavar minuciosamente 2 veces con 4 mL de PBS frío, se detectaron los anticuerpos que se unen con la superficie celular por el segundo anticuerpo específico de Fc de IgG anti-humano de cabra acoplado con R-PE (15 pL, 25 pg/mL), y luego se analizaron por citómetro de flujo (BD FACSCalibur). No se detectó la unión entre la IgG 1 humana (grupo de control) y los tres tipos de células cancerosas. A diferencia, hubo una fuerte unión entre Herceptin, cRC48, RC48 con los dos tipos de células HER2-positivo, mientras que ninguna unión con células HER2 negativas, lo que sugiere que esta unión fue específica de HER2 (como se muestra en la Fig. 4a). Comparando la intensidad de fluorescencia promedio del grupo de control de isotipo, se encontró que en comparación con Herceptin y cRC48, RC48 mostró una mayor afinidad de unión. Ajustando la concentración de anticuerpo anti-HER2 y analizando los números de células en citometría de flujo, se obtuvo una curva de unión basada en células de anticuerpo anti-HER2 con HER2 sobre la superficie celular, y el resultado se mostró en la Fig. 4b. El anticuerpo anti-HER2 humanizado RC48 mostró una afinidad de unión significativa, que tuvo la afinidad de unión (Kd) con HER2 sobre la superficie celular de BT474 de 4 nM, mientras que las afinidades de unión para Herceptin y cRC48 fueron 10 nM y 5 nM, respectivamente, y los resultados se mostraron en la Tabla 5.
Tabla 5 Afinidad de unión del anticuerpo de la presente invención con HER2 sobre la superficie celular de BT474
Figure imgf000014_0001
2) Experimento de especificidad de unión al antígeno
Se determinaron las capacidades de unión de Herceptin, cRC48, RC48 con diferentes antígenos de superficie EGFR, HER2, HER3 y HER4 por el método de ELISA. El método de ELISA se podría encontrar en el Ejemplo 1. La placa de 96 pocillos se recubrió con antígenos EGFR, HER2, HER3, HER4, respectivamente, cargándose cada pocillo con 20 ng, y se incubaron con diferentes anticuerpos anti-HER2, es decir, anticuerpos Herceptin, cRC48, RC48, y luego se detectaron por el segundo anticuerpo específico de Fc de IgG anti-murina de cabra F(ab’)2 acoplado a peroxidasa de rábano picante (Invitrogen Inc.). El resultado se mostró en la Fig. 5, que indica que los anticuerpos Herceptin, cRC48, RC48 casi no tuvieron capacidad de unión con EGFR, HER3 ni HER4, pero tuvieron una fuerte capacidad de unión con HER2, lo que sugiere unión altamente específica de Herceptin, RC48 con HER2.
Ejemplo 5 Ensayo de inhibición tumoral de RC48 hacia el modelo de tumor por trasplante de cáncer de mama humano BT474
Se estableció un modelo de tumor por trasplante en ratones sin pelo de cáncer de mama BT474 humano inoculando células BT474 en ratón sin pelo por vía subcutánea. Después de cultivar continuamente in vivo durante 3 generaciones, se recogió el tejido tumoral que creció vigorosamente y se cortó en aproximadamente 1,5 mm3, y se inoculó por vía subcutánea en la axila derecha del ratón sin pelo (proporcionado por Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., con el N° de certificado 2007000540582 y N° de licencia ScXK(hu)2012-0002) en condiciones estériles. El diámetro del tumor por trasplante del ratón sin pelo se midió por un calibrador vernier. Los animales se agruparon aleatoriamente hasta que el tumor creció hasta 100~300 mm3. Se administraron los fármacos probados huIgG1, Herceptin, RC48 (cada uno a 10 mg/kg), y una semana después se administraron una segunda vez, y otras dos semanas después se administraron la tercera vez, es decir, los fármacos se administraron en total tres veces.
El resultado se mostró en la Fig. 11. Después de administrar huIgG1, el tumor no se inhibió, y su volumen siguió creciendo continuamente. Después de administrar Herceptin y RC48, se inhibieron ambos tumores de BT474. En comparación con Herceptin, RC48 tuvo un efecto inhibidor del tumor significativamente mejor.
Ejemplo 6 Preparación del conjugado de anticuerpo-fármaco
1) Purificación del anticuerpo monoclonal RC48
Se capturó el anticuerpo monoclonal RC48 del cultivo de células CHO por proteína A, que luego se sometió a electroforesis en SDS-PAGE, con la pureza hasta el 95 % o superior por análisis de SEC. Las proteínas de anticuerpo obtenidas se dializaron por ultrafiltración en tampón PBS usando un paquete de membranas de 30 KD, se concentraron y la concentración se calibró por espectrómetro ultravioleta, para la posterior reacción de acoplamiento.
2) Acoplamiento del anticuerpo monoclonal RC48 con molécula de fármaco
Se formularon el agente reductor y el agente protector con tampón PBS del siguiente modo: 1 ~20 mmol/L de TCEP (tris-2-carboxietil-fosfina), 1 ~20 mmol/L de disolución madre de DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético), pudiendo añadirse el agente reductor en un cierto intervalo de concentraciones dependiendo la cantidad de la relación fármacoanticuerpo requerida, mezclado con el anticuerpo monoclonal en una cierta concentración (por ejemplo, 5~30 mg/mL) con una cierta relación en volumen (por ejemplo, 1:1), en la que la relación molar de la concentración final entre TCEP y anticuerpo fue 0,5-6,0 : 1, y la reacción se realizó con agitación durante 2 h a 25 °C. La concentración de tiol libre se detectó a 412 nm por el método de DTNB, y se calcularon los números de tiol libre con la relación molar de anticuerpo. La reacción reductora con TCEP tuvo una reproducibilidad muy buena, y los números de tiol libre podrían alcanzar 1,0-8,0 después de la reducción.
Después de la reducción con TCEP, el anticuerpo se puede someter directamente a una conjugación posterior. Los fármacos (vc-MMAE, vc-MMAF, mc-MMAF) (comprados de Shanghai Haoyuan Chemexpress Co. Ltd.) a una cierta concentración (10 mM) se disolvieron en 25 % de DMSO (sulfóxido de dimetilo), para la que los fármacos se añadieron lentamente en la relación molar entre fármaco y tiol de 0,3~2,8 : 1, y la reacción se realizó con agitación durante 2 h a 25 °C. La concentración de tiol libre (próxima a cero) se detectó a 412 nm por el método de DTNB, los fármacos sin reaccionar residuales y las moléculas pequeñas libres, tales como DMSO, se retiraron por purificación en Sephadex G-25, y se determinó la condición de acoplamiento por métodos de electroforesis en SDS-PAGE, cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (R-HPLC) y cromatografía líquida de alta resolución hidrófoba (HIC-HPLC).
Ejemplo 7 Ensayo de afinidad de ADC
Ensayo de afinidad por el método de ELISA
Se recubrió la placa de ELISA con proteína recombinante HER2-ECD (con la concentración de 0,5 mg/mL), durante la noche a 2-8 °C. La placa se lavó 3 veces con el Wellwash. A 37 °C, se usó 3 % de disolución de BSA-PBST para el bloqueo durante 2 h. La placa se lavó durante 3 veces con el Wellwash. Las muestras se cargaron del siguiente modo: a 37 °C, se diluyeron en gradiente 11 puntos desde 1000 ng/ml (línea normal) con disolución de PBST, 100 pL/pocillo, durante 2 h. La placa se lavó durante 3 veces con el Wellwash. El segundo anticuerpo (IgG-Fc-HRP anti-humano de cabra) se diluyó 5000 veces con disolución de PBST. Se añadió el reactivo de revelado de color TMB para el desarrollo de color durante 8-10 minutos alejado de la luz a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por H2SO42 M, y se leyó a 450/655 nm en el instrumento marcado con enzima. El resultado se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6 Comparación de la afinidad entre los conjugados y T-DM1
Figure imgf000016_0001
Como se sabe de los resultados, las afinidades con HER2-ECD de RC48-vc-MMAE, RC48-vc-MMAF y RC48-mc-MMAF son comparables a las de T-DM1.
Ejemplo 8 Efecto inhibidor del ADC RC48 sobre células tumorales
Se digirieron las células bien crecidas con tripsina (compradas de Sigma), después de lo cual la célula de cáncer de mama HER2-positivo SK-BR-3, la célula de cáncer de ovario HER2-positivo SK-OV-3 se resuspendieron con medio DMEM que contenía 10 % de suero bovino fetal, medio McCoy’s 5A (tambos medios se compraron de Gibco) y se inocularon en placa de 96 pocillos a la densidad de 5000, 4000 células/pocillo, respectivamente, y se incubaron en la estufa de incubación a 37 °C, en 5 % de CO2 durante 24 h. Se diluyeron RC48, Herceptin, RC48-vc-MMAE, RC48-vc-MMAF, RC48-mc-MMAF y T-DM1 (de fabricación propia) con el medio que contenía 10 % de suero bovino fetal a concentraciones que se muestran en la siguiente figura antes de añadir a la placa de 96 pocillos. Después de incubarse en la estufa de incubación a 37 °C, en 5 % de CO2 durante 72h, la detección se llevó a cabo usando el kit CCK-8 (comprado de DOJINDO), y los datos resultantes se sometieron a un análisis estadístico usando el software Prism.
Los resultados se mostraron en la Fig. 12 a Fig. 13, de los que se sabe que el fármaco del ADC de la presente invención tuvo un efecto inhibidor significativamente más fuerte hacia diversas células que el fármaco de anticuerpo no marcado en la misma concentración, y la tasa de inhibición dirigida hacia la proliferación celular se pudo aumentar en la mitad. El fármaco de ADC acoplado con MMAF según la presente invención tuvo un efecto inhibidor más fuerte dirigido hacia células SK-BR-3, SK-OV-3 que el fármaco de ADC acoplado con MMAE según la presente invención, sin embargo, ambos tuvieron efectos significativamente mejores que el control positivo T-DM1.
Ejemplo 9 Actividad antitumoral de los conjugados de anticuerpo-fármaco dirigidos hacia cáncer de mama
1) Experimento antitumoral de conjugados de RC48 dirigidos hacia el modelo de ratón sin pelo portador de tumor por cáncer de mama humano BT474
Se suspendieron cinco millones de células BT474 en PBS, y se inocularon en la axila del ratón sin pelo BALB/c (proporcionado por Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., con el N° de certificado 2007000540582 y el N° de licencia SCXK(hu)2012-0002). Después de que se formara el tumor, se recogió el tejido tumoral que creció vigorosamente y se cortó en aproximadamente 1,5 mm3, y se inoculó por vía subcutánea en la axila derecha del ratón sin pelo en condiciones estériles. El diámetro del tumor por trasplante en el ratón sin pelo se midió por un calibrador vernier. Los animales se agruparon aleatoriamente hasta que el tumor creció hasta 100~300 mm3. Se administraron los fármacos probados RC48 10 mg/kg, RC48-vc-MMAE 10 mg/kg, RC48-vc-MMAF 10 mg/kg y RC48-mc-MMAF 10 mg/kg, y los fármacos se administraron en total tres veces; el grupo de control negativo se administró con una cantidad igual de solución salina fisiológica.
Como se muestra en la Fig. 14, 37 días después de la administración, el volumen del tumor del grupo de control negativo llegó a 485 mm3, mientras que el volumen del tumor del grupo RC48 fue del 83 % del grupo de control, que indicó que RC48 tuvo un efecto inhibidor en cierta medida sobre el crecimiento tumoral de BT474. Los tres conjugados de anticuerpo probados en el presente experimento (RC48-vc-MMAE, RC48-vc-MMAF, RC48-mc-MMAF) pudieron inhibir el crecimiento tumoral de BT474 significativamente, y 37 días después de la administración, los volúmenes de tumor se encogieron hasta el 13-19 % del grupo de control. Durante el experimento de 37 días, murieron 3 ratones en el grupo de control, mientras que sobrevivieron todos los ratones en el grupo RC48-vc-MMAE.
2) Experimento antitumoral de RC48-vc-MMAE dirigido hacia el modelo de tumor por trasplante por vía subcutánea en ratón sin pelo de cáncer de mama humano BT-474/L1.9 resistente a Herceptin® y Lapatinib
BT474/L1.9 es la célula BT-474 que se ha tratado durante un largo tiempo con Herceptin® y Lapatinib, y también resistente a Herceptin® y Lapatinib.
Se inocularon por vía subcutánea ratones sin pelo BALB/c al nivel SPF con una cierta cantidad de células tumorales BT-474/L1.9, y después del crecimiento del tumor hasta 100~200 mm3, los animales se agruparon aleatoriamente. La dosis se indicó por las leyendas: para RC48-vc-MMAE, Kadcyla™ (comprado de Roche Pharmaceuticals), administración una vez por semana, en total 2 veces; para Herceptin® (comprado de Roche Pharmaceuticals), Roche Pharmaceuticals una vez por semana, en total 3 veces; para lapatinib (comprado de GSK), administración diaria. El volumen del tumor se midió 2 veces a la semana. Se pesó el peso murino y se observó la capacidad de resistencia de los ratones portadores de tumor hacia los fármacos. Se registraron los datos. Se calcularon el volumen del tumor y la tasa de inhibición tumoral de cada ratón portador de tumor en diferentes momentos de tiempo de observación.
Como se muestra en la Fig. 15, la tasa de inhibición tumoral de Herceptin® (10 mg/kg) hacia el tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo BT474/L1.9 fue del 51 %; la tasa de inhibición tumoral de Lapatinib (200 mg/kg) hacia BT474/L1.9 fue del 45 %; sugirió que el cáncer de mama BT474/L1.9 era resistente a tanto Herceptin® como a Lapatinib. RC48-vc-MMAE (1,5, 5 mg/kg) inhibió el crecimiento del tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo BT474/L1.9 en un forma dependiente de la dosis, con la tasa de inhibición tumoral del 38 % y 91 %, respectivamente; la tasa de inhibición tumoral del fármaco de referencia Kadcyla™ (5 mg/kg) hacia el tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo BT474/L1.9 fue del 58 %, que indica que BT474/L1.9 también fue resistente a Kadcyla™. Los ratones portadores de tumor fueron muy resistentes a todos los fármacos anteriores.
En conclusión, el ADC de la presente invención muestra un actividad antitumoral significativa hacia el modelo de tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo de células BT474/L1.9, que es significativamente más fuerte que Herceptin y Lapatinib (p<0,01); en comparación con Kadcyla™ con la misma dosis de 5 mg/kg, el efecto inhibidor del tumor de RC48-vc-MMAE de la presente invención tiene una ventaja evidente (p<0,01), con la tasa de inhibición tumoral del 91 %: 58 %.
Ejemplo 10 La actividad antitumoral de los conjugados de fármaco hacia el cáncer de ovario
1) Experimento inhibidor del tumor de conjugados de RC48 hacia el modelo de tumor por trasplante de cáncer de ovario humano SK-OV-3
Se estableció un modelo de tumor por trasplante en ratón sin pelo de cáncer de ovario humano SK-OV-3 inoculando células SK-OV-3 en ratón sin pelo (proporcionado por Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., con el certificado N° 2007000540582 y la licencia N° SCXK(hu)2012-0002) por vía subcutánea. Los animales se agruparon aleatoriamente hasta que el tumor creció hasta 100~300 mm3. Se administraron los fármacos probados RC48 10 mg/kg, T-DM1 10 mg/kg, RC48-vc-MMAE 3 mg/kg, RC48-vc-MMAE 10 mg/kg, RC48-vc-MMAF 3 mg/kg, RC48-vc-MMAF 10 mg/kg, RC48-mc-MMAF 3 mg/kg y RC48-mc-MMAF 10 mg/kg, administrando una vez por semana, en total administración de 3 veces; paclitaxel 10 mg/kg, 3 veces por semana, en total 3 semanas; mientras tanto, el control negativo se administró con una cantidad igual de solución salina fisiológica.
Los efectos inhibidores del tumor de RC48 unido con diferentes conectores y agentes terapéuticos sobre SK-OV-3 sugieren que: en comparación con RC48 de anticuerpo no marcado que no se acopla, todos los ADC de la presente invención tienen buenos efectos inhibidores del tumor; en comparación con T-DM1 en la misma dosis de 10 mg/kg, los efectos inhibidores del tumor de conjugados de RC48 de la presente invención tienen ventajas evidentes. Los resultados detallados se muestran en Fig. 16.
Ejemplo 11 Experimento inhibidor de tumor de conjugados de fármaco hacia el modelo de tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo de células de cáncer gástrico humano HER2-positivo NCI-N87
Células NCI-N87 de cáncer gástrico humano expresaron altamente HER2 y EGFR, que fue resistente a Herceptin®, y se estableció el modelo con el mismo método que el Ejemplo 9. El resultado se mostró en la Fig. 17.
Como se muestra en la Fig. 17, una única inyección intravenosa de RC48-vc-MMAE (2,5, 5, 10 mg/kg) pudo inhibir significativamente el crecimiento de tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo de cáncer gástrico humano NIC-N87 de alta expresión de HER2, con la tasa de inhibición de tumor del 133 %, 193 % y 200 %. El grupo de baja dosis provocó la regresión parcial de tumores en 6/6 ratones; el grupo de dosis media provocó la regresión parcial de tumores en 1/6 ratones y la regresión completa en 5/6 ratones; el grupo de dosis alta provocó la regresión completa de tumores en todos los ratones (6/6), que no recayeron hasta que terminó el experimento (D21). El fármaco de referencia Herceptin® (10 mg/kg, administración una vez por semana, 3 veces) pudo inhibir el crecimiento del tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo NCI-N87, con la tasa de inhibición del tumor solo del 49 %; otro inhibidor de EGFR/HER2 de fármaco de referencia de molécula pequeña Lapatinib (200 mg/kg, administración una vez por semana, durante 21 días) tuvo un efecto sobre el tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo NCI-N87, con la tasa de inhibición del tumor del 78 %. Los ratones portadores de tumor fueron resistentes a todos los fármacos anteriores, y no hubo síntomas tales como pérdida de peso corporal.
Este resultado de la investigación indica: 1) la inyección intravenosa única de RC48-vc-MMAE (2,5, 5, 10 mg/kg) puede inhibir significativamente el crecimiento de tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo de cáncer gástrico humano NIC-N87 de alta expresión de HER2, causando la regresión parcial o incluso completa de tumores; 2) el efecto terapéutico de RC48-vc-MMAE hacia el tumor por trasplante subcutáneo en ratón sin pelo NCI-N87 es evidentemente más fuerte que el de los fármacos de referencia Herceptin® y Lapatinib (p<0,01).
Ejemplo 12 El ensayo de tolerancia en ratón de conjugados de RC48
Los ratones KM macho y hembra que pasaron la inspección de cuarentena se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos de dosis según los pesos corporales: MMAE 2 mg/kg, MMAF 50 mg/kg, RC48-vc-MMAE 25 mg/kg (la dosis de MmAE correspondiente fue 0,5 mg/kg) ~ 200 mg (la dosis de MMAE fue 4,0 mg/kg), RC48-vc-MMAF 50 mg/kg (la dosis de MMAF fue 1,0 mg/kg) ~ 450 mg/kg (la dosis de MMAF fue 9,0 mg/kg) y RC48-mc-MMAF 50 mg/kg (la dosis de MMAF 1,0 mg/kg) ~ 450 mg/kg (la dosis de MMAF fue 9,0 ml/kg), en los que hubo 13 grupos de diferentes dosis, con la mitad machos y la mitad hembras, y los líquidos de fármaco correspondientes se inyectaron por vía intravenosa. Los grupos de ratones en el mismo lote se usaron como los grupos de control, que se administraron con inyecciones de 0,9 % de NaCl del mismo volumen por la vena de la cola. Después de la administración, se pesó el peso corporal una vez cada dos días, hasta el día 16. La curva de aumento de peso corporal de ratones en serie con MMAE o MMAF se puede encontrar en la Fig. 18, respectivamente.
El resultado del experimento indica: en las condiciones del presente experimento, la toxicidad de RC48-vc-MMAE es inferior a la de MMAE sin acoplar a la misma dosis. La dosis máxima tolerada de ratón hacia RC48-vc-MMAE es entre 100 mg/kg (la dosis de MMAE es 2,0 mg/kg) y 150 mg/kg (la dosis de MMAE es 3,0 mg/kg).
La toxicidad de RC48-vc-MMAF es evidentemente superior a la de RC48-mc-MMAF a la misma dosis. La dosis máxima tolerada de ratón hacia RC48-vc-MMAF es entre 50 mg/kg (la dosis de MMAF es 1,0 mg/kg) y 100 mg/kg (la dosis de MMAF es 2,0 mg/kg). La MTD de ratón hacia RC48-mc-MMAF es entre 150 mg/kg (la dosis de MMAF es 3,0 mg/kg) y 450 mg/kg (la dosis de MMAF es 9,0 mg/kg).
Ejemplo 13 El experimento de toxicidad de los conjugados de fármaco hacia rata SD administrada por infusión intravenosa única
Se dividieron aleatoriamente ratas SD al nivel SPF (el N° de certificado es SCXK (jing)2012-0001) compradas de Beijing Vital River Laboratories Animal Technology Co, Ltd., en 7 grupos según sexo, en los que hubo 10 ratas en un grupo con la mitad machos y la mitad hembras. Estos 7 grupos incluyeron el grupo de control negativo de solución salina fisiológica, 0,48 mg/kg de grupo de control de MMAE, 40 mg/kg de grupo de control de anticuerpo no marcado RC48 y las series de grupos de dosis de RC48-vc-MMAE, en los que las ratas se administraron por infusión en la vena de la cola, y el periodo de observación experimental fue 21 días. Los pesos corporales se pesaron en el D1 (antes de la administración), D8, D15 y D22. Después del periodo de observación, los animales se sacrificaron y se realizó una observación anatomopatológica general, y los tejidos anormales u órganos observados por la observación anatómica general se sometieron a un examen histológico.
Condiciones de muerte de los animales: Se encontraron muertos 9/10 animales (grupo de control de MMAE), 1/10 animales (RC48-vc-MMAE, grupo de 30 mg/kg) y 2/10 animales (RC48-vc-MMAE, grupo de 40 mg/kg) durante los experimentos, mientras que los grupos de animales restantes no se encontraron ni muertos ni en estado agonizante.
En las condiciones del presente experimento, la dosis letal de RC48-vc-MMAE hacia la rata fue 30 mg/kg y la dosis máxima tolerada fue superior o igual a 24 mg/kg (la dosis de MMAE acoplada correspondiente fue 0,48 mg/kg). El anticuerpo no marcado RC48 se administró a la rata SD con la dosis de 40 mg/kg por infusión intravenosa única, y no hubo síntoma de respuesta a toxicidad evidente, lo que indica que la dosis máxima tolerada de la rata fue superior o igual a 40 mg/kg. Este resultado mostró que, aunque el conjugado de la presente invención se usó con una dosis mucho más alta a la del fármaco sin conjugar MMAE (40 mg/kg frente a 0,48 mg/kg), todavía mostró una toxicidad mucho más baja que la del fármaco sin conjugar MMAE, lo que demuestra que tras la formación de ADC acoplando MMAE con el anticuerpo, la toxicidad disminuyó significativamente.
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmentos funcionales del mismo que se pueden unir específicamente a HER2, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que:
(i) la cadena pesada comprende tres regiones CDR, en donde las regiones CDR tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 1,2 y 3, respectivamente;
(ii) la cadena ligera comprende tres regiones CDR, en donde las regiones CDR tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 4, 5 y 6, respectivamente.
2. El anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo derivan de un anticuerpo secretado de las células de hibridoma que se depositaron en el China General Microbiological Culture Collection Center el 22 de agosto de 2013, con el número de depósito de CGMCC N28102.
3. El anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y, preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo secretado de las células CHO que se depositaron en el China Center for Type Culture Collection el 6 de noviembre de 2013, con el número de depósito de CCTCC C2013170.
4. Un polinucleótido aislado, que codifica el anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
5. Una combinación de polinucleótidos aislados, que comprende: un polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. Un vector de expresión, que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4 o la combinación de polinucleótidos aislados según la reivindicación 5, en donde el polinucleótido se une operativamente a una secuencia reguladora que permite que el polipéptido codificado por el polinucleótido se exprese en una célula hospedadora o un sistema de expresión sin células.
7. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. El anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el polinucleótido según la reivindicación 4, la combinación de polinucleótidos aislados según la reivindicación 5, el vector de expresión según la reivindicación 6 o la composición farmacéutica según la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento o la prevención de cáncer.
9. El anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el polinucleótido según la reivindicación 4, la combinación de polinucleótidos aislados según la reivindicación 5, el vector de expresión según la reivindicación 6, o la composición farmacéutica según la reivindicación 7 para el uso según la reivindicación 8, en donde el cáncer es un cáncer HER2-positivo, en donde el cáncer es preferentemente cáncer de mama o cáncer de ovario o cáncer gástrico, más preferentemente cáncer de mama o cáncer de ovario o cáncer gástrico resistente a Lapatinib y/o Herceptin.
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