BR112021005320A2 - ligante para conjugados de anticorpo-fármaco e seu uso - Google Patents

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BR112021005320A2
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linker
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Changjiang Huang
Hui Ye
Hu Chen
Xiuzhi Zhan
Nan Shen
Wenting Luo
Qiaohua Hou
Jianmin Fang
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Remegen Co., Ltd.
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Abstract

A presente invenção fornece um ligante para preparar conjugados de anticorpo-fármaco e conjugados de anticorpo-fármaco preparado pelo ligante, assim como o uso dos conjugados de anticorpo-fármaco em um medicamento para tratar tumor. O ligante é capaz de se ligar simultaneamente ao grupo tiol ou grupo amino no anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, especialmente, é capaz de se ligar a 2, 3 ou 4 grupos tiol no anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo. Um produto ligado é uniforme e estruturalmente estável.

Description

“LIGANTE PARA CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO E SEU USO” CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a um ligante para conjugados de anticorpo-fármaco e conjugados de anticorpo-fármaco preparados pelo ligante, assim como aos uso dos conjugados de anticorpo-fármaco no tratamento de tumor e outras doenças.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
[002] Os conjugados de anticorpo-fármaco (CAFs) são uma classe de fármacos terapêuticos alvejados, que são principalmente usados para tratar câncer, doenças autoimunes e semelhantes. Suas estruturas consistem usualmente de três porções: anticorpo ou ligante semelhante a anticorpo, porção de fármaco e ligante que liga o anticorpo ou ligante semelhante a anticorpo e o fármaco.
[003] O fármaco ADC tradicional é obtido pela ligação de um fármaco ao resíduo de lisina do anticorpo ou resíduo de cisteína produzido pela redução da ligação dissulfeto intercadeia do anticorpo através de um ligante. Quando o resíduo de lisina é usado como o sítio de ligação, visto que um anticorpo contém cerca de 40 ou mais resíduos de lisina, e a reação de ligação é não seletiva, o número e sítio de ligação apresentam grande incerteza e a uniformidade do produto é muito deficiente. Quando o resíduo de cisteína é usado como o sítio de ligação, embora o anticorpo (IgG1) tenha apenas 4 pares de ligações dissulfeto intercadeia e o valor de RFA (razão fármaco para anticorpo) do fármaco CAF formado pelo resíduo de cisteína produzido pela redução de ligação dissulfeto intercadeia seja relativamente uniforme, este método de ligação destrói a ligação dissulfeto do anticorpo, afetando a estabilidade do anticorpo. E, devido à baixa seletividade dos agentes redutores existentes (DTT, TCEP) para ligações dissulfeto intercadeia, a uniformidade do produto final também é deficiente. Tendo em vista o efeito terapêutico e a supervisão do fármaco, a uniformidade do produto é muito importante. Portanto, é necessário preparar os fármacos CAF com razão fármaco para anticorpo bem controlada.
[004] Nos últimos anos, alguns pesquisadores utilizaram tecnologia de engenharia genética para modificar anticorpos para obter ligação alvejada de anticorpos e fármacos e os CAFs obtidos também apresentam valores de RFA muito uniformes. Entretanto, pelo fato de que a tecnologia de recombinação genética exige muito trabalho e projeto para encontrar um sítio adequado para a ligação de fármaco ou modificação de polietilenoglicol, é muito demorada e extremamente cara no desenvolvimento.
[005] Considerando os defeitos mencionados acima na preparação de conjugados de anticorpo-fármaco na técnica anterior, há uma necessidade urgente na técnica quanto ao desenvolvimento de um novo ligante para obter ligação alvejada de fármacos tóxicos aos anticorpos, de modo a obter fármacos CAF com maior uniformidade do produto e estabilidade elevada.
CONTEÚDOS DA INVENÇÃO
[006] De modo a resolver os problemas mencionados acima, a presente invenção fornece um ligante para preparar conjugados de anticorpo-fármaco e conjugados de anticorpo-fármaco preparados pelo ligante, assim como o uso dos conjugados de anticorpo-fármaco em um medicamento para tratar tumor. O ligante é capaz de se ligar simultaneamente aos grupos tiol ou grupos amino no anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, especialmente, é capaz de se ligar a 2, 3 ou 4 grupos tiol no anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo. Um produto ligado é uniforme e estruturalmente estável.
[007] No primeiro aspecto, a presente invenção fornece um ligante, que apresenta uma estrutura da Fórmula I: M1' L1 Q L3' M2' L2 (I)
em que, M1’, M2’ são, independentemente, selecionados a partir de , , , , , , ou estão ausentes, M1’, M2’ são iguais ou diferentes, mas não estão ausentes ao mesmo tempo; X, Y, R1, L1, L2, L3’, Q são um grupo arbitrário.
[008] Além disso, X, Y, R1, L1, L2, L3’, Q mencionados acima podem ser: L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C9, alquenila C2-C9, alquinila C2-C9, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9, polietilenoglicol, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , C=NR3 , C (=S) O , C (=S) NR12 , C (=S) S , NR13 (C=O) , NR14 (C=S) NR5 , O (C=O) NR15 , S (=O) 2 e qualquer combinação dos mesmos; Q é selecionado a partir de , , N, B, P, arila, heteroarila, cicloalquila, (heterociclil) alquila; L3’ é selecionado a partir de R8 (C=O), C (=O) R8C (=O), polietilenoglicol, , NH2, OH, SH, X e qualquer combinação dos mesmos; X é selecionado a partir de F, Cl, Br, I; Y é , , ; (Nas duas estruturas acima, a substituição de R2 pode ocorrer em qualquer posição no anel.) Z é selecionado a partir de C, N;
R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R12, R13, R14, R15 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9.
[009] Além disso, X, Y, R1, L1, L2, L3’, Q mencionados acima podem ser: L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C4, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C5-C6, heterociclila C5-C6, polietilenoglicol C2-C12, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , O (C=O) NR15 ; Q é selecionado a partir de , N, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, C3-C8 cicloalquila, heterociclila C3-C8; L3’ é selecionado a partir de R8 (C=O), C (=O) R8C (=O), polietilenoglicol, , NH2, OH, SH, X e qualquer combinação dos mesmos; X é Br; Yé ; R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R15 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C4, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C5-C6, heterociclila C5-C6.
[010] Além disso, o ligante apresenta a estrutura representada pela fórmula: (A’-1’) ou
(A’-2’) ou (A’-3’) ou (A’-4’) .
[011] Preferivelmente, o ligante pode apresentar a estrutura: A’-1 A’-2 A’-4
A’-5 A’-7 A’-8
A’-9 A’-10 A’-11
A’-12 A’-13 A’-14
A’-15 A’-16 A’-19
A’-20 A’-21 A’-22 A’-24 A’-26 A’-27 A’-28 A’-29 A’-31 A’-33 A’-34 .
[012] A presente invenção também fornece o uso do ligante mencionado acima na preparação de conjugados de anticorpo-fármaco.
[013] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um conjugado de anticorpo-fármaco, o conjugado de anticorpo-fármaco apresentando a estrutura representada pela Fórmula II: Ab-(A-L-D) n (II) em que, Ab é qualquer anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo. Além disso, o anticorpo inclui um derivado ou um análogo do anticorpo; fragmento “funcional” representa um anticorpo, um fragmento, um derivado ou um análogo do mesmo que é capaz de reconhecer o mesmo antígeno e é capaz de reconhecer fragmentos,
derivados ou análogos derivados do antígeno, que inclui, por exemplo, mas não é limitado a: fragmentos F (ab’) 2, Fab, Fab’, Fv e dímeros de cadeia pesada e leve de anticorpos, ou qualquer um entre seus menores fragmentos, tais como Fvs ou anticorpos de cadeia única (fragmento de anticorpo de cadeia única/fragmento variável de cadeia única, scFv). Além disso, o anticorpo pode ser uma proteína de fusão do anticorpo.
O anticorpo também pode incluir análogos e derivados modificados ou não modificados (isto é, ligação covalente através de qualquer molécula), contanto que tal ligação covalente permita que o anticorpo conserve sua especificidade imunológica de ligação ao antígeno.
Inclui, por exemplo, mas não é limitado a: análogos e derivados de anticorpo, incluindo quaisquer modificações, tais como: glicosilação, acetilação, PEGilação, fosforilação, amidação, derivatização através de grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem de protease, conexão às unidades de anticorpo celular ou outras proteínas e semelhantes.
Qualquer grande número de modificações químicas pode ser obtido usando técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica na presença de tunicamicina e semelhantes.
Além disso, análogos ou derivados podem incluir um ou mais aminoácidos não naturais.
Em alguns exemplos, os anticorpos podem apresentar modificações (por exemplo, substituição, deleção ou adição) nos resíduos de aminoácidos que interagem com o receptor Fc.
Além disso, o anticorpo é selecionado a partir de anticorpos murinos, anticorpos de mamíferos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpo humano e anticorpos multiespecíficos.
A porção de ligante inclui uma primeira porção de ligante A e uma segunda porção de ligante L; a primeira porção de ligante A inclui um grupo covalentemente ligado ao grupo tiol ou grupo amino no Ab.
D é a porção de fármaco, o fármaco incluindo, mas não limitado a fármacos citotóxicos, fatores de diferenciação celular, fatores nutricionais de células-tronco,
fármacos esteroides, fármacos para o tratamento de doenças autoimunes, fármacos anti-inflamatórios ou fármacos para o tratamento de doenças infecciosas. Além disso, a porção de fármaco D inclui, mas não é limitada a inibidores de tubulina ou agentes de dano ao DNA. Os inibidores de tubulina incluem, mas não são limitados à dolastatina, auristatinas, maitansinas; os agentes de dano ao DNA incluem, mas não são limitados às caliqueamicinas, duocarmicinas, derivado de antramicina PBD (pirrolobenzodiazepina), derivado de camptotecina SN-38, inibidores de topoisomerase I. Os fármacos de auristatina incluem, mas não são limitados a monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF) e auristatina F (AF) ou seus derivados. Os fármacos de maitansina incluem, mas não são limitados a DM1, DM3, DM4 ou seus derivados (Research Progress on Warhead Molecules of antibody-drug conjugate, Hu Xinyue et al., Chinese Medicinal Biotechnology, Dez. de 2017, Vol. 12, No 6) (Research advance of maytansinoid class antibody drug conjugates, Zhou Lei et al., Chinese Journal of New Drugs, 2016, Vol. 25, No 22, páginas 2521 a 2530). A porção de fármaco D também pode ser amanitinas, antraciclinas, bacatinas, camptotecinas, cemadotinas, colchicinas, colcimidas, combretastatinas, criptoficinas, discodermolidas, docetaxel, doxorrubicina, equinomicinas, eleuterobinas, epotilonas, estramustinas, lexitropsinas, maitansinas, metotrexato, netropsinas, puromicinas, rizoxinas, taxanos, tubulisinas ou alcaloides da vinca. A porção de fármaco D também pode ser precursor de vitamina A, ácido fólico e semelhantes. A porção de fármaco D não é limitada às categorias acima, mas também inclui todos os fármacos que podem ser usados para CAF. n é 1, 2, 3 ou 4;
[014] É caracterizado pelo fato de que, a primeira porção de ligante A apresenta a estrutura representada pela Fórmula III: (III)
em que: M1, M2 são covalentemente ligados ao grupo tiol ou grupo amino do anticorpo ou porção de fragmento funcional do anticorpo (que é Ab), que são,
independentemente, selecionados a partir de , , ,
, , , , , , ou estão ausentes, M1 e M2 são iguais ou diferentes, mas não podem estar ausentes ao mesmo tempo; L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C9, alquenila C2-C9, alquinila C2-C9, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9, polietilenoglicol, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , C=NR3 , C (=S) O , C (=S) NR12 , C (=S) S , NR13 (C=O) , NR14 (C=S) NR5 , O (C=O) NR15 , S (=O) 2 e qualquer combinação dos mesmos;
Q é selecionado a partir de , , N, B, P, arila, heteroarila, cicloalquila, (heterociclil) alquila; L3 é covalentemente ligado à segunda porção de ligante L, que é selecionada a partir de R2 (C=O) , C (=O) R2C (=O) , polietilenoglicol,
, NR9 , O, S e qualquer combinação dos mesmos ou está ausente; R1 é um grupo arbitrário ou está ausente, R2, R3, R4, R5, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C6,
alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9; a segunda porção de ligante L é qualquer ligante clivável ou ligante não clivável ou está ausente, quando L está ausente, L3 é diretamente covalentemente ligado à porção de fármaco D.
[015] Além disso, L1, L2, L3, Q, R1 mencionados acima ainda podem ser, respectivamente: L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C4, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C5-C6, heterociclila C5-C6, polietilenoglicol C2-C12, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , O (C=O) NR15 ; Q é selecionado a partir de , N, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C3-C8, heterociclila C3-C8; L3 é selecionado a partir de R2 (C=O) , C (=O) R2C (=O) , polietilenoglicol, , NR9 , O, S e qualquer combinação dos mesmos ou está ausente; R1 é selecionado a partir de H, alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2- C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9.
[016] Além disso, a primeira porção de ligante apresenta a estrutura: (A-1’) (A-1’’) (A-1’’’) (A-2’) (A-2’’) (A-2’’’)
(A-2’’’’) (A-3’) (A-3’’)
(A-3’’’) (A-3’’’’) (A-4’)
(A-4’’) (A-4’’’) (A-5’)
(A-5’’) (A-5’’’) (A-5’’’’)
(A-6’) (A-6’’) (A-6’’’)
(A-7’) (A-7’’) (A-8’)
(A-8’’) .
[017] Além disso, o anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo se liga especificamente aos receptores de superfície celular ou antígenos relacionados ao tumor.
[018] Além disso, a primeira porção de ligante A inclui um grupo que é covalentemente ligado ao grupo tiol ou grupo amino no Ab.
[019] Além disso, a primeira porção de ligante A pode apresentar a estrutura: A-1 A-2 A-4 A-5 A-6 A-7 A-10 A-11 A-12 A-13 A-15 A-16
A-17 A-18 A-19 A-20 A-21 A-23 A-24 A-25 A-28 A-29 A-31 A-33 A-34 .
[020] Além disso, a segunda porção de ligante L pode ser: alquila C1-C9, alquenila C2-C9, alquinila C2-C9, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila
C3-C9, , O, S, NR6 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR6 , C=NR6 , C (=S) O , C (=S) NR6 , C (=S) S , NR6 (C=O) , NR6 (C=S) NR7 , O (C=O) NR6 , S (=O) 2 , Val-Val-PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala- PAB, Val-Lys (Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys (Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly- Arg, Ala-Ala-Asn-PAB, Ala-PAB, PAB e qualquer combinação dos mesmos ou está ausente, em que, R6, R7 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9, e é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[021] Preferivelmente, a segunda porção de ligante L pode ser: L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6
O O O O H
O N N e N N
H H H O
NH O NH2 L-7 L-8
L-9 L-10 L-11 L-12 L-13 L-14 .
[022] Além disso, a porção de fármaco é selecionada a partir de fármacos citotóxicos, fatores de diferenciação celular, fatores nutricionais de células-tronco, fármacos esteroides, fármacos para o tratamento de doenças autoimunes, fármacos anti-inflamatórios ou fármacos para o tratamento de doenças infecciosas.
[023] Além disso, a porção de fármaco inclui, mas não é limitada aos inibidores de tubulina ou agentes de dano ao DNA.
[024] Além disso, o inibidor de tubulina inclui, mas não é limitado às dolastatinas, auristatinas, maitansinas; o agente de dano ao DNA inclui, mas não é limitado às caliqueamicinas, duocarmicinas, derivados de antramicina PBD, derivados de camptotecina (preferivelmente, derivado de camptotecina SN-38), inibidores de topoisomerase I (isto é, Dxd).
[025] Além disso, a porção de fármaco inclui, mas não é limitada às amanitinas, antraciclinas, bacatinas, camptotecinas, cemadotinas, colchicinas, colcimidas, combretastatinas, criptoficinas, discodermolidas, docetaxel,
doxorrubicina, equinomicinas, eleuterobinas, epotilonas, estramustinas, lexitropsinas, maitansinas, metotrexato, netropsinas, puromicinas, rizoxinas, taxanos, tubulisinas ou alcaloides da vinca, precursor de vitamina A, ácido fólico, derivados de camptotecina SN-38, inibidores de topoisomerase I (isto é, Dxd).
[026] Preferivelmente, a porção de fármaco D pode ser:
MMAD MMAE
MMAF DM1 DM4
PBD
CBI Dxd SN-38 .
[027] Em alguns exemplos preferidos, o conjugado de anticorpo-fármaco apresenta a estrutura:
ADC1
ADC2
ADC3
ADC4
O O O H O N S N O S N N N O O O O O
N O O O O O Cl
O N S O O N HHO
O n1
O O O H O N N S O S HN N N OH O O O O O
N O O O O O Cl
O N
S O Ab O
N HHO
O n2
O O O H O N N S O S HN N N OH O O O O HO O
NH O O O O O Cl
O N S O O N HHO
O n3 ADC5 ADC6
ADC7
ADC8
ADC9
S O O O S H N N N O O O N N N H O N O O O O N N O H H N O O NH O OH S O NH
S O NH2 m1
S O O O S H OH H N N N
O O O N N Ab O N H
N O O O O N N O H H N O O NH O OH S O NH
S O NH2 m2
S O O O S H OH H N N N O O O N N O N H N O O O O N N O H H N O O NH H O OH S OH O NH
S O NH2 m3 ADC10 ADC11
ADC12
ADC13
ADC14
ADC15
ADC16 ,
em que: o anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, Ab, é um anticorpo contra receptores de superfície celular e antígenos relacionados ao tumor;
n1, n2, n3 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2, 3, 4; n1, n2, n3 não são 0 ao mesmo tempo e n1 + n2 + n3 ≤4; n4, n5, n6, n7 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2, 3, 4; n4, n5, n6, n7 não são 0 ao mesmo tempo e n4 + n5 + n6 + n7 ≤4; n8, n9 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2, 3, 4; n8, n9 não são 0 ao mesmo tempo e n8 + n9 ≤4; m1, m2, m3 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2; pelo menos um entre m1, m2, m3 é 0, mas m1, m2, m3 não são 0 ao mesmo tempo e m1 + m2 + m3 ≤2; m4, m5 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2; m4, m5 não são 0 ao mesmo tempo e m4 + m5 ≤2.
[028] Além disso, o conjugado de anticorpo-fármaco apresenta a estrutura: ADC17 ADC18
ADC19
ADC20
ADC21
ADC22
ADC23
ADC24
ADC25
ADC26
ADC27
ADC28
ADC29
ADC30 ADC31 ADC32 , em que: o Ab é um anticorpo contra receptores de superfície celular e antígenos relacionados ao tumor; n10 é 0, 1, 2, 3 ou 4; m6 é 0, 1 ou 2.
[029] Além disso, o conjugado de anticorpo-fármaco apresenta a estrutura: ADC33
ADC34
ADC35
ADC36
ADC37
ADC38
ADC39
ADC40
ADC41
ADC42
ADC43
ADC44
ADC45
ADC46
ADC47
ADC48 ,
em que: o Ab é um anticorpo contra receptores de superfície celular e antígenos relacionados ao tumor; n11 é 0, 1, 2, 3 ou 4; m7 é 0, 1 ou 2.
[030] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende qualquer conjugado de anticorpo-fármaco descrito na presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável.
[031] A presente invenção também fornece o uso de qualquer ligante descrito na presente invenção na preparação de conjugado de anticorpo-fármaco.
[032] A presente invenção também fornece o uso de qualquer conjugado de anticorpo-fármaco descrito na presente invenção ou qualquer composição farmacêutica descrita na presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[033] A Figura 1A mostra um cromatograma de HIC-HPLC do conjugado de anticorpo-fármaco Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE (a razão molar do fármaco para o grupo tiol do anticorpo adicionado durante a ligação é 5:1).
[034] A Figura 1B mostra um cromatograma de HIC-HPLC do conjugado de anticorpo-fármaco Her2-A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE (a razão molar do fármaco para o grupo tiol do anticorpo adicionado durante a ligação é 5:1).
[035] A Figura 1C mostra um cromatograma de HIC-HPLC do conjugado de anticorpo-fármaco Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE (a razão molar do fármaco para o grupo tiol do anticorpo adicionado durante a ligação é 5:1).
[036] A Figura 1D mostra um cromatograma de HIC-HPLC do conjugado de anticorpo-fármaco Her2 - 575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE (a razão molar do fármaco para o grupo tiol do anticorpo adicionado durante a ligação é 5:1).
[037] A Figura 2A mostra padrões de eletroforese SDS-PAGE de Her2-A’-11- Val-Cit-PAB-MMAE (os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE (os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE (os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 8,5, 9,0, 7,4) (o tampão de ligação tem o pH de 9,0).
[038] A Figura 2B mostra padrões de eletroforese SDS-PAGE de Her2-A’-7- Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB- MMAE (o tampão de ligação tem o pH de 9,0).
[039] A Figura 3 mostra as curvas de afinidade para o antígeno de conjugados de anticorpo-fármaco (os conjugados de anticorpo-fármaco sendo Her2- A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE e Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE; anticorpo Her2 e Her2- Mc-Val-Cit-PAB-MMAE sendo controles negativos e positivos), conforme determinado pelo método ELISA, em que a abscissa é concentração e a ordenada é a absorção de densidade óptica.
[040] A Figura 4A mostra as curvas de taxa de inibição de proliferação contra células SK-BR-3 de câncer de mama humano dos conjugados de anticorpo-fármaco (Her2-A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE).
[041] A Figura 4B mostra as curvas de taxa de inibição de proliferação contra células SK-BR-3 de câncer de mama humano dos conjugados de anticorpo-fármaco (Her2-A’-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE).
[042] A Figura 5 mostra os resultados de ligação de conjugados (Ab-A) do anticorpo (Ab) e primeira porção de ligante (A), em que os Nos 1, 2, 3 são Her2-A’-7, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 8,5, 9,0, 7,4; os Nos 4, 5, 6 são Her2-A’-8, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 8,5, 7,4, 9,0; os Nos 7, 8, 9 são Her2-A’-10, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 8,5, 9,0, 7,4; os Nos 10, 11, 12 são Her2-A’-11, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 9,0, 7,4, 9,5; os Nos 13, 14, 15 são Her2-A’-12, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 7,4, 9,0, 8,5; os Nos 16, 17, 18 são Her2-A’-20, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 8,5, 9,0, 7,4; os Nos 19, 20, 21 são Her2-A’-28, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 9,0, 8,5, 7,4;
os Nos 22, 23, 24 são Her2-A’-31, os tampões de ligação, respectivamente, têm o pH de 7,4, 8,5, 9,0.
[043] A Figura 6A mostra um espectro de LC-MS do anticorpo nu (anticorpo claudina 18.2).
[044] A Figura 6B mostra um espectro de LC-MS do claudina 18.2-A’-7-VC- PAB-MMAE.
[045] A Figura 7A mostra um mapa de distribuição de pontos isoelétricos do anticorpo nu (anticorpo claudina 18.2).
[046] A Figura 7B mostra um mapa de distribuição de pontos isoelétricos do claudina 18.2-A’-7-VC-PAB-MMAE.
MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[047] As formas de realização da presente invenção são descritas em detalhes abaixo por via de exemplos específicos, mas, em qualquer caso, não podem ser interpretadas como limitantes da presente invenção.
DEFINIÇÕES
[048] A menos que de outro modo definido, todos os termos científicos e tecnológicos usados neste relatório têm os mesmos significados, conforme entendido pelos técnicos no assunto.
[049] Embora as faixas numéricas e valores aproximados dos parâmetros sejam mostrados no amplo escopo da presente invenção, os valores numéricos mostrados nos exemplos específicos são registrados com a maior precisão possível. Entretanto, qualquer valor numérico inerentemente inevitavelmente contém um certo erro, que é causado pelo desvio padrão na medição. Além disso, todas as faixas divulgadas neste relatório abrangem quaisquer e todas as sub-faixas contidas nas mesmas. Por exemplo, a faixa de “1 a 10” registradas abrangem quaisquer e todas as sub-faixas contidas entre o valor mínimo 1 e o valor máximo 10 (incluindo pontos finais), isto é, todas as sub-faixas que iniciam com o valor mínimo 1 ou maior, por exemplo, 1 a 6,1, e todas as sub-faixas que terminam com o valor máximo 10 ou menor, por exemplo, 5,5 a 10. Além disso, qualquer referência referida como “incorporada neste relatório” deve ser integralmente incorporada.
[050] O símbolo “ ” usado na presente invenção refere-se àquele do grupo contendo “ ” é ligado neste relatório a outros grupos através da ligação química.
[051] O termo “anticorpo” na presente invenção é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não limitadas a anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo multiespecífico (tal como anticorpo biespecífico) e fragmentos de anticorpos. Em particular, “anticorpo” usado neste relatório refere-se a uma proteína contendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada inclui uma região variável de cadeia pesada (abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada inclui três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve inclui uma região variável cadeia leve (abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve inclui um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em múltiplas regiões com alta variabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservativas chamadas regiões de estrutura (FR). Cada uma entre VH e VL consiste de três CDRs e quatro FRs, dispostas na seguinte ordem a partir do terminal amino ao terminal carbóxi: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Estas regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve contêm domínios de ligação que interagem com os antígenos. A região constante de um anticorpo pode mediar a ligação de imunoglobulinas aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células (tais como células efetoras) do sistema imune e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico. Os anticorpos quimérico ou humanizados também estão incluídos nos anticorpos, de acordo com a presente invenção.
[052] O termo “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo que contém região CDR derivada de um anticorpo não humano e a outra porção da molécula de anticorpo é derivada de um (ou vários) anticorpo humanos. Além disso, para conservar a afinidade de ligação, é possível modificar alguns resíduos das regiões de estrutura (chamadas FR) (Jones et al., Nature, 321: 522 a 525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 a 1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323 a 327, 1988). O anticorpo humanizado ou fragmentos do mesmo, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados por técnicas conhecidas pelos técnicos no assunto (por exemplo, aquelas descritas nos documentos Singer et al., J. Immun. 150: 2844 a 2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1 a 142, 1992; ou Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169 a 175, 1992).
[053] O termo “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo em que a sequência de região variável ocorre a partir de uma espécie e a sequência de região constante ocorre a partir de outra espécie. Por exemplo, a sequência de região variável ocorre a partir de um anticorpo de camundongo e a sequência de região constante ocorre a partir de um anticorpo humano. O anticorpo quimérico ou fragmentos do mesmo, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados usando tecnologia de recombinação genética. Por exemplo, o anticorpo quimérico pode ser produzido por meio da clonagem do DNA recombinante e o DNA recombinante compreende um promotor e uma sequência que codifica as regiões variáveis de um anticorpo não humano, especialmente de murino, monoclonal, de acordo com a presente invenção, e uma sequência que codifica as regiões constantes de um anticorpo humano. O anticorpo quimérico da presente invenção codificado por este gene recombinante será, por exemplo, uma quimera de camundongo-humana. A especificidade deste anticorpo é determinada pela região variável derivada de DNA murino e seu isotipo é determinado pela região constante derivada de DNA humano. Quanto ao método para preparar um anticorpo quimérico, por exemplo, consultar o documento Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988).
[054] O termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um produto preparado de moléculas de anticorpo com uma composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal mostra uma especificidade de ligação única e afinidade para um epítopo específico.
[055] O termo “fragmento funcional” na presente invenção significa que o fragmento de anticorpo é composto de, ou compreende a sequência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo a partir da qual o mesmo é derivado, e a sequência parcial é suficiente para conservar a mesma especificidade de ligação como o anticorpo a partir da qual o mesmo é derivado e afinidade suficiente, preferivelmente, pelo menos igual a 1/100 da afinidade do anticorpo a partir da qual o mesmo é derivado, e, mais preferivelmente, pelo menos igual a 1/10. Este fragmento funcional conterá um mínimo de 5 aminoácidos, preferivelmente, 10, 15, 25, 50 e 100 aminoácidos consecutivos da sequência de anticorpo a partir da qual o mesmo é derivado.
[056] O termo “RFA”, também chamado de razão fármaco para anticorpo, na presente invenção, é um atributo de qualidade único do conjugado de anticorpo- fármaco. Um valor de RFA alto pode afetar a segurança do CAF e sua janela de tratamento é estreita. Um valor de RFA baixo pode levar a uma diminuição na eficácia do CAF, mas sua segurança é forte e sua janela de tratamento é ampla. A melhor faixa de valor de RFA médio é 2 a 4.
[057] O termo “ligante” na presente invenção refere-se a um composto que pode atuar como uma “ponte” para reagir, respectivamente, com anticorpo/fragmento funcional do anticorpo e fármaco, e conectar os dois. O “ligante” envolvido na presente invenção inclui uma primeira porção de ligante e uma segunda porção de ligante. O termo “primeira porção de ligante” na presente invenção inclui dois grupos de ligação que são iguais ou diferentes. Os grupos de ligação são capazes de se ligar simultânea e covalentemente aos grupos tiol ou grupos amino intercadeia do anticorpo/fragmento funcional do anticorpo, e os grupos de ligação são quaisquer grupos funcionais capazes de se ligar covalentemente aos grupos tiol ou grupos amino. O termo “segunda porção de ligante” na presente invenção é usado para ligação a um fármaco e é qualquer ligante clivável ou não clivável. O ligante clivável libera toxinas, dependendo dos processos intracelulares, tais como processo de redução intracitoplasmática, exposição às condições ácidas em lisossomos ou clivagem por protease específica intracelular. O ligante não clivável pode liberar o fármaco apenas depois que a proteína da porção do anticorpo CAF é degradada.
[058] O termo “fármaco” na presente invenção, em geral, refere-se a qualquer composto que apresenta a atividade biológica desejada e apresenta um grupo funcional reativo para preparar o conjugado da presente invenção. A atividade biológica desejada inclui diagnóstico, cura, alívio, tratamento e prevenção de doenças humanas ou de outros animais. Com a descoberta e desenvolvimento contínuos de novos fármacos, estes novos fármacos também devem ser incluídos nos fármacos da presente invenção. Especificamente, os fármacos incluem, mas não são limitados aos fármacos citotóxicos, fatores de diferenciação celular, fatores nutricionais de células-tronco, fármacos esteroides, fármacos para o tratamento de doenças autoimunes, fármacos anti-inflamatórios ou fármacos para o tratamento de doenças infecciosas. Mais especificamente, os fármacos incluem, mas não são limitado aos inibidores de tubulina ou agentes de dano ao DNA, RNA.
[059] Em algumas formas de realização da presente invenção, o fármaco é selecionado a partir de: compostos de maitansina, inibidores de V-ATPase, agentes pró-apoptóticos, inibidores de Be 12, inibidores de McL1, inibidores de HSP90, inibidor de IAP, inibidores de mTOr, estabilizadores de microtúbulos,
desestabilizadores de microtúbulos, auristatina, dolastatina, MetAP (metionina aminopeptidase), inibidores de exportação nuclear da proteína CRM1, inibidores de DPPIV, inibidores de proteassoma, inibidores da reação de transferência de fosforila em mitocôndrias, inibidores da síntese de proteína, inibidores de cinase, inibidores de CDK2, inibidores de CDK9, inibidores de cinesina, inibidores de HDAC, agentes de dano ao DNA, agentes alquilantes de DNA, intercaladores de DNA, aglutinante de sulco menor de DNA, inibidores de DHFR, assim como peptídeo de dolastatina, precursores de vitamina A, ácido fólico, derivados de camptotecina.
[060] Em algumas formas de realização preferidas da presente invenção, o fármaco é um fármaco citotóxico (tal como antimetabólitos, antibióticos antitumor, alcaloides), imunopotenciador ou radioisótopo. Preferivelmente, o fármaco pode ser selecionado a partir de amanitinas, antraciclinas, bacatinas, camptotecinas, cemadotinas, colchicinas, colcimidas, combretastatinas, criptoficinas, discodermolidas, docetaxel, doxorrubicina, equinomicinas, eleuterobinas, epotilonas, estramustinas, lexitropsinas, maitansinas, metotrexato, netropsinas, puromicinas, rizoxinas, taxanos, tubulisinas ou alcaloides da vinca. Mais preferivelmente, o “fármaco” é selecionado a partir de MMAD (Monometil auristatina D) e seus derivados, MMAE (Monometil auristatina E) e seus derivados, MMAF (Monometil auristatina F) e seus derivados, derivados de maitansina DM1 (Derivado de mertansina M1), derivados de maitansina DM4 (Derivado de mertansina M4), Duocarmicina e seus derivados, Caliqueamicina e seus derivados, PBDA (Pirrolobenzodiazepinas), Doxorrubicina, Alcaloides da vinca, Metrotrexato, Vinblastina, Daunorrubicina e seus derivados, tubulisinas e seus derivados, derivados de camptotecina SN-38, inibidores de topoisomerase I (isto é, Dxd).
[061] Em algumas formas de realização específicas, o “fármaco” pode ser as seguintes substâncias e seus derivados: Maitansina:
Maitansina
Derivados maitansinoides:
Derivados de ansamitocina:
Y é um grupo substituinte Derivados de ansamitocina
Alaninil maitansinol:
Alaninil maitansinol
MMAE: MMAD:
M MMAF: Tubulisina D: Tubulisina D
Caliqueamicina:
Caliqueamicina
Doxorrubicina:
Doxorrubicina
Derivados de pirrolobenzodiazepina:
Precursor de Vitamina A:
Ácido fólico: Inibidor de topoisomerase I (isto é, Dxd):
[062] O termo “conjugado de anticorpo-fármaco” na presente invenção refere-se a um composto obtido pela ligação de um anticorpo/um fragmento funcional do anticorpo, um ligante (uma primeira porção de ligante, uma segunda porção de ligante) e uma porção de fármaco juntos através de reação química. Embora o conjugado de anticorpo-fármaco envolvido na presente invenção ainda seja uma mistura, em comparação ao conjugado obtido na forma tradicional, sua faixa de distribuição da RFA é muito estreita e o melhor conjugado de anticorpo- fármaco apresenta uma faixa de valor de RFA médio de 2 a 4. Com respeito à preparação do conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a presente invenção, quando o conjugado (A-L-D) da primeira porção de ligante (A) e do segundo conjugado de porção de ligante-fármaco (L-D) é ligado a um anticorpo (tal como anticorpo claudina18.2 fornecido no exemplo), o mesmo pode hidrolisar sob condições de hidrólise fáceis e o sítio de hidrólise está na porção de maleimida do primeiro ligante. Tomando Ab-A’-7-VC-PAB-MMAE (e, no caso em que um anticorpo é ligado a 4 fármacos) como um exemplo, quando o conjugado Ab-A’-7-VC-PAB- MMAE sofre 4 hidrólises, o diagrama da estrutura é:
ou
[063] Quando o conjugado Ab-A’-7-VC-PAB-MMAE sofre 7 hidrólises, o diagrama de estrutura é:
[064] Quando o conjugado Ab-A’-7-VC-PAB-MMAE sofre 8 hidrólises, o diagrama de estrutura é:
[065] O termo “composição farmacêutica” na presente invenção refere-se a uma combinação de pelo menos um fármaco e, opcionalmente, um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável que são combinados para obter um propósito específico. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica inclui uma combinação de ingredientes que são separados no tempo e/ou espaço, contanto que possam trabalhar juntos para obter o propósito da presente invenção. Por exemplo, os ingredientes contidos na composição farmacêutica podem ser administrados a um indivíduo como um todo ou separadamente. Quando os ingredientes contidos na composição farmacêutica são separadamente administrados a um indivíduo, os ingredientes podem ser simultânea ou sequencialmente administrados ao indivíduo. Preferivelmente, o portador farmaceuticamente aceitável é água, solução aquosa tamponada, solução salina isotônica, tal como PBS (tampão fosfato), glicose, manitol, dextroglucose, lactose, amido, estearato de magnésio, celulose, carbonato de magnésio, glicerol 0,3 %, ácido hialurônico, etanol ou polialquileno glicol, tal como polipropileno glicol, triglicerídeos e semelhantes. O tipo do portador farmaceuticamente aceitável usado depende, particularmente, de a composição, de acordo com a presente invenção, ser formulada para administração oral, nasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa. A composição, de acordo com a presente invenção, pode conter agentes umectantes, emulsificantes ou substâncias tampão, tais como aditivos.
[066] A composição farmacêutica, vacina ou preparação farmacêutica, de acordo com a presente invenção, pode ser administrada por qualquer via adequada, tal como administração oral, nasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa.
[067] O termo “alquila” na presente invenção refere-se a um hidrocarboneto saturado, linear ou ramificado (isto é, livre de ligações duplas ou ligações triplas). O grupo alquila pode apresentar 1 a 9 átomos de carbono (quando aparece na presente invenção, a faixa numérica de “1 a 9” refere-se a qualquer número inteiro nesta faixa, por exemplo, “1 a 9 átomos de carbono” significa que o grupo alquila pode conter 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, …, até 9 átomos de carbono. Ao mesmo tempo, a definição de alquila também inclui grupos alquila sem comprimento de cadeia especificado). O grupo alquila pode ser um grupo alquila de tamanho médio contendo 1 a 9 átomos de carbono. Um grupo alquila típico inclui, mas não é limitado a: metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, hexila e semelhantes.
[068] O termo “alquenila” na presente invenção refere-se a um hidrocarboneto linear ou ramificado contendo uma ou múltiplas ligações duplas. O grupo alquenila pode apresentar 2 a 9 átomos de carbono e também inclui grupos alquenila sem comprimento de cadeia especificado. O grupo alquenila pode ser um grupo alquenila de tamanho médio contendo 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquenila também pode ser um grupo alquenila de tamanho pequeno contendo 2 a 4 átomos de carbono. O grupo alquenila pode ser projetado como “alquenila C2-4” ou projetos similares. Por exemplo, “alquenila C2-4” significa que existem 2 a 4 átomos de carbono na cadeia alquenila, isto é, a cadeia alquenila pode ser selecionada a partir de: etenila, propen-1-ila, propen-2-ila, propen-3-ila, buten-1-ila, buten-2-ila, buten-3-ila, buten-4-ila, 1-metil-propen-1-ila, 2-metil-propen-1-ila, 1-etil-eten-1-ila, 2- metil-propen-3-ila, buta-1,3-dienila, buta-1,2-dienila, buta-1,2-dien-4-ila. Alquenila típico inclui, mas não é limitado a: etenila, propenila, butenila, pentenila, hexenila e semelhantes.
[069] O termo “alquinila” na presente invenção refere-se a um hidrocarboneto linear ou ramificado contendo uma ou múltiplas ligações triplas. Grupo alquinila pode apresentar 2 a 9 átomos de carbono e também inclui grupos alquinila sem comprimento de cadeia especificado. O grupo alquinila pode ser um grupo alquinila de tamanho médio contendo 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquinila também pode ser um grupo alquinila inferior contendo 2 a 4 átomos de carbono. O grupo alquinila pode ser designado como “alquinila C2-4” ou projetos similares. Por exemplo, “alquinila C2-4” significa que existem 2 a 4 átomos de carbono na cadeia alquinila, isto é, a cadeia alquinila pode ser selecionada a partir de: etinila, propin-1-ila, propin-2-ila, butin-1-ila, butin-2-ila, butin-3-ila e 2-butinila. Alquinila típico inclui, mas não é limitado a: etinila, propinila, butinila, pentinila, hexinila e semelhantes.
[070] O termo “arila” na presente invenção refere-se a um anel ou sistema de anel com sistema π-elétron conjugado e inclui arila carbocíclico (tal como fenila) e arila heterocíclico (tal como piridina). O termo inclui grupos com um anel único ou múltiplos anéis fundidos (isto é, anéis que compartilham um par de átomos adjacentes) e todo o sistema de anel é aromático.
[071] O termo “heteroarila” na presente invenção refere-se a um anel aromático ou sistema de anel (isto é, dois ou múltiplos anéis fundidos que compartilham dois átomos adjacentes) contendo um ou múltiplos heteroátomos. Isto é, além de carbono, o esqueleto do anel inclui, mas não é limitado a nitrogênio, oxigênio, enxofre e outros elementos. Quando heteroarila é um sistema de anel, cada anel no sistema é aromático. Heteroarila pode apresentar 5 a 18 membros no anel (isto é, o número de átomos constituindo o esqueleto do anel, incluindo o número de átomos de carbono e heteroátomos). A atual definição também inclui grupos heteroarila sem tamanho de anel especificado. Exemplos de heteroarila incluem, mas não são limitados a furila, tienila, ftalazinila, pirrolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, pirazolila, isoxazolila, isotiazolila, triazolila, tiadiazolila, piridila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, triazinila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzotiazolila, indolila, isoindolila, benzotienila.
[072] O termo “cicloalquila” na presente invenção refere-se a um sistema carbocíclico ou de anel completamente saturado. Exemplos incluem, mas não são limitados a ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila.
[073] O termo “(heterociclil) alquila” na presente invenção refere-se a heterociclila como um substituinte conectado a outros grupos através de alquileno. Exemplos incluem, mas não são limitados a imidazolinil metila e indolinil etila. O termo “heterociclila” refere-se a um anel não aromático ou sistema de anel contendo pelo menos um heteroátomo em seu esqueleto. Heterociclila pode ser conectado na forma de anéis fundidos, anéis ligados em ponte ou anéis espiro. Pelo menos um anel no sistema de anel heterociclila é não aromático e pode apresentar qualquer grau de saturação. O heteroátomo pode estar localizado no anel não aromático ou aromático do sistema de anel. O heterociclila pode apresentar 3 a 20 átomos no anel (isto é, o número de átomos constituindo o esqueleto do anel, incluindo o número de átomos de carbono e heteroátomos). A atual definição também inclui grupos heterociclila sem faixa especificada de números de anel. O grupo heterociclila pode ser um grupo heterociclila de tamanho médio contendo 3 a 10 átomos no anel. O grupo heterociclila também pode ser um grupo heterociclila de tamanho pequeno contendo 3 a 6 átomos no anel. Exemplos de heterociclila incluem, mas não são limitados a: azepinila, acridinila, carbazolila, cinolinila, dioxolanila, imidazolinila, imidazolidinila, morfolinila, oxiranila, oxepanila, tietanila, piperidinila, piperazinila, pirazolinila, pirazolidinila, 1,3-dioxinila, 1,3-dioxanila, 1,4-dioxinila, 1,4-dioxanila, 1,3- oxatianila, 1,4-oxatianila, 1,4-oxatianila, 2H-1,3-dioxolanila, 1,3-ditiolanila, 1,3- ditiolanila, isoxazolinila, isoxazolidinila, oxazolinila, oxazolidinila, oxazolidinona, oxazolidinona, tiazolidinila, 1,3-oxatiolila, indolinila, isoindolinila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrotienila, tetra-hidrotiopiranila, tetra-hidro-1,4-tiazinila, tiomorfolinila, di-hidrobenzofuranila, benzimidazolidinila e tetra-hidroquinolinila.
EXEMPLOS Procedimento geral A: método de síntese geral de ligante de bromomaleimida
O O Br Amines andetheir Aminas seussalts orderivados sais ou Boc protected derivatives Boc protegidos Br N
O AcONa,AcOH
O
O Bromomaleic Anidrido anhydride bromomaleico
[074] Aminas e seus sais ou derivado Boc protegido (1 eq) e acetato de sódio anidro (2,5 eq) foram dissolvidos em ácido acético (1 mmol/2 mL) e aquecidos até 50 a 100 °C, seguido pela adição rápida de anidrido bromomaleico (2,5 eq) e reagidos entre 50 a 100 °C durante a noite. A solução de reação foi esfriada até 45
°C, concentrada sob pressão reduzida e acetato de etila foi adicionado ao resíduo, seguido por lavagem, secagem e concentrada para obter um produto bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal ou cromatografia líquida preparativa de fase reversa para obter o produto principal. Procedimento geral B: método de síntese geral de ligante de tiofenol maleimida
O SNa O Br N +
DMF S N
O Tiofenolato Sodium de sódio thiophenolate O
[075] O ligante de bromomaleimida (1,0 eq) foi dissolvido em DMF anidra (1 mmol/5 mL), ao qual foi adicionado piridina (3,0 eq), seguido por agitação na temperatura ambiente durante 5 a 10 min. Tiofenolato de sódio (2,1 eq) foi dissolvido em DMF anidra (1 mmol/1 mL) e adicionado, às gotas, à solução de reação. Em seguida, a agitação foi continuada na temperatura ambiente durante 0,5 a 5 h. Depois que a reação foi concluída, 5 vezes o volume de água destilada foi adicionado aos sólidos precipitados, seguido por filtragem, lavagem, secagem e concentrada para obter um produto bruto. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em coluna de fase normal ou cromatografia líquida preparativa de fase reversa para obter o produto principal. Exemplo 1 - Síntese de A’-1 Br NH2 O O
O N Br + O O
OH H2N OH Br N
O O
O Anidrido bromomaleico Bromomaleic anhydride O 1 A'-1
[076] De acordo com o procedimento de geral A, 300 mg de composto 1 (isto é, ácido 3,5-diaminobenzoico) foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter o composto principal A’-1. LC-MS (ESI+) 468,9 [M+H]+. Exemplo 2 - Síntese de A’-4 Br S
O O O N O
N SNa O + O
OH OH Br N S N O Tiofenolato de sódio O O Sodium thiophenolate O A'-1 A'-4
[077] De acordo com o procedimento geral B, 100 mg de composto A’-1 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter o composto principal A’-4. LC-MS (ESI+) 529,0 [M+H]+. Exemplo 3 - Síntese de A’-2
O Br
O
O O O Br O
O O2N N OH Fe/NH4Cl H2N OH Anidrido bromomaleico Bromomaleic anhydride OH
O N NH2 NaOAc/Ac2O O N NH2 N N 2 DMF A‘-2 Br 3 O
[078] O composto 2 (1 mol) foi dissolvido em uma mistura de etanol e água, agitada, à qual foram adicionados de uma vez pó de ferro reduzido (5 mols), cloreto de amônio (3 mols), seguido por reação a 80 °C durante 1 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi esfriada até a temperatura ambiente, filtrada para remover sólidos e destilada sob pressão reduzida para remover o solvente, para obter o composto 3. LC-MS m/z (ES+), 154,05 (M+H)+.
[079] De acordo com o procedimento geral A, o composto 3 (1 mol) foi adicionado, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 80 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter o composto principal A’-2. LC-MS m/z (ES+), 471,85 (M+H)+. Exemplo 4 - Síntese de A’-7 O O NHBoc NBoc O
H N O N 5 BocHN NHBoc 7 N H2N NH2 N BocHN OH
H
O 4 6 8 O Br
O
O N O Br
O
O O Bromomaleic Anidrido anhydride bromomaleico N Br N OH
O
O A'-7
[080] O composto 5 (Boc-imidazol, 2,37 g, 14,1 mmols) foi dissolvido em 30 mL de tolueno, ao qual foi adicionado o composto 4 (dietilenotriamina, 0,66 g, 6,41 mmols) na temperatura ambiente, seguido por agitação com aquecimento a 60 °C durante 6 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi destilada sob pressão reduzida para obter um produto bruto oleoso. O produto bruto foi dissolvido em 40 mL de diclorometano, lavado com água (40 mL×3), seco, filtrado e concentrado para obter 1,84 g de composto 6, com um rendimento de 95 %. LC-MS (ESI+) 304,2 [M+H]+.
[081] O composto 6 (3,3 g, 10,89 mmols) foi dissolvido em 30 mL de tolueno anidro, ao qual foi adicionado o composto 7 (anidrido succínico, 1,3 g, 13 mmols), seguido por agitação com aquecimento a 60 °C durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi destilada sob pressão reduzida para remover o tolueno, o resíduo foi dissolvido em 20 mL de diclorometano, lavado com água (20 mL × 2), lavado com NaCl saturado (20 mL × 1), seco, filtrado e destilado sob pressão reduzida para obter 3,5 g de composto 8, com um rendimento de 80 %. LC-MS (ESI+) 404,3 [M+H]+.
[082] De acordo com o procedimento geral A, 100 mg de composto 8 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter 25,8 mg do composto principal A’-7, com um rendimento de 20 %. LC-MS (ESI+) 519,9 [M+H]+. Exemplo 5 - Síntese de A’-8
O O
O Br
OH O
OH H H O (Boc)2O N N 11 H H H2N NH2 Boc Boc N N THF/H2 O NaH,THF Boc Boc 10 12 9
O Br
O O OH Br
O
O OH O O DCM Anidrido bromomaleico Bromomaleic anhydride N
O NaOAc,AcOH O N Cl H3 N NH3 Cl O O 13 Br A'-8
[083] O composto 9 (1,3-diaminopropanol, 5,0 g, 55,47 mmols) foi dissolvido com 50 mL de THF e 20 mL de água com agitação. Uma solução de Boc2O (25,4 g, 116,5 mmols, 2,1 eq) em 30 mL de THF foi adicionada, às gotas, na temperatura ambiente. Em seguida, a solução de reação foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo, ao qual foram adicionados 30 mL de éter de petróleo, foi agitado na temperatura ambiente durante 20 min, para precipitar um sólido branco, que foi filtrado e seco para obter 14,7 g de composto branco 10, com um rendimento de 91 %. LC-MS (ESI+) 291,2 [M+H]+.
[084] O composto 10 (14,7 g, 50,64 mmols) foi dissolvido com 100 mL de THF anidro com agitação, seguido por resfriamento em banho de gelo. Em seguida, NaH (4,8 g, 202,55 mmols, 4 eq) foi adicionado em lotes, seguido por agitação durante 10 min. Uma solução de composto 11 (bromoacetato de terc-butila, 24,7 g, 126,6 mmols, 2,5 eq) em 50 mL de THF foi adicionada às gotas. Em seguida, a solução de reação foi aquecida até 40 °C e agitada durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi esfriada até a temperatura ambiente, diluída com 250 mL de acetato de etila, ao qual foi adicionada lentamente uma mistura de água e gelo até que nenhuma grande quantidade de bolhas fosse formada e, em seguida, a separação líquida foi realizada. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila e as fases orgânicas foram combinadas, lavadas, secas e concentradas. O resíduo, ao qual foram adicionados 50 mL de éter de petróleo, foi agitado na temperatura ambiente durante 20 min, para precipitar um sólido branco, que foi filtrado e seco para obter 12,1 g de composto branco 12, com um rendimento de 60 %. LC-MS (ESI+) 404,1 [M+H]+.
[085] O composto 12 (12,1 g, 30,0 mmols) foi dissolvido com 120 mL de DCM anidro com agitação, ao qual depois foi adicionada uma solução (4 M, 45 mL, 180 mmols) de cloreto de hidrogênio em 1,4-dioxano, seguido por agitação na temperatura ambiente durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi disperso através de ultrassom com 30 mL de éter metil-terc-butílico, centrifugado com a remoção do sobrenadante e, em seguida, disperso com 30 mL de éter de petróleo, centrifugado com a remoção do sobrenadante. O sólido foi destilado sob pressão reduzida para remover o solvente, para obter 7,7 g de composto branco 13, com um rendimento de 100 %. LC-MS (ESI+) 148,1 [M+H]+.
[086] De acordo com o procedimento geral A, 1,2 g de composto 13 foi adicionado, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 85 °C durante 5 h. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter 890 mg do composto principal A’-8, com um rendimento de 35 %. LC-MS (ESI+) 464,9 [M+H]+. Exemplo 6 - Síntese de A’-9 Br
O
O Br N
OH H2N + O O O
O O H2N N
O OH Anidrido bromomaleico
O Composto 14 Compound 14 Bromomaleic anhydride Br A'-9
[087] De acordo com o procedimento geral A, 500 mg de composto 14 (ácido 2,3-diaminopropiônico) foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 240 mg do composto principal A’-9, com um rendimento de 23 %. LC-MS (ESI+) 420,9 [M+H]+. Exemplo 7 - Síntese de A’-10 Br S
O N O O O SNa N O +
O S O
N N Br N OH N OH Sodium thiophenolate S O Tiofenolato de sódio
O
O O A'-7 A'-10
[088] De acordo com procedimento geral B, 104 mg de composto A’-7 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada na temperatura ambiente durante 2,5 h. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter 27,7 mg do composto principal A’-10, com um rendimento de 24 %. LC-MS (ESI+) 596,1 [M+H]+. Exemplo 8 - Síntese de A’-11
O OH O Br
O O N S
O N SNa S N O + O
O N O O
O O Tiofenolato Sodium de sódio thiophenolate OH Br A'-8 A'-11
[089] De acordo com o procedimento geral B, 600 mg de composto A’-8 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada na temperatura ambiente durante 2,5 h. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter 203 mg do composto principal A’-11, com um rendimento de 30 %. LC-MS (ESI+) 525,1 [M+H]+. Exemplo 9 - Síntese de A’-12 Br S
O O
N N SNa
O O O + O
O O N N
S OH Tiofenolato de sódio Sodium thiophenolate OH
O O Br A'-9 A'-12
[090] De acordo com o procedimento geral B, 120 mg de composto A’-9 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada na temperatura ambiente durante 0,7 h. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter 30 mg do composto principal A’-12, com um rendimento de 22 %. LC-MS (ESI+) 481,0 [M+H]+. Exemplo 10 - Síntese de A’-13
O
O O O Br Br N H2 N + O OH
OH NH2 O N
O O
O Composto 15 15 Compound Anidrido bromomaleico Bromomaleic anhydride Br A'-13
[091] De acordo com o procedimento geral A, 500 mg de composto 15 (L- lisina) foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 410 mg do composto principal A’-13, com um rendimento de 26 %. LC-MS (ESI+) 462,9 [M+H]+. Exemplo 11 - Síntese de A’-14
O O O O O N O
O O O O Br
O OH O N N Anidrido bromomaleico Bromomaleic anhydride O 17 OH
OH
O N H2 N O HN O O O
N O H
O Br 16 18 A'-14
[092] O composto 16 (500 mg, 2,03 mmols) foi dissolvido com a adição de 1 mL de THF e 1 mL de solução de NaHCO3 aquosa saturada com agitação, seguido por agitação em banho de gelo durante 5 min. Em seguida, o composto 17 (724,4 mg, 4,67 mmols) foi adicionado lentamente em lotes, seguido por agitação em banho de gelo durante 40 min e, em seguida, agitação na temperatura ambiente durante 2,5 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi submetida à evaporação rotativa para remover o THF, diluída com 1 mL de metanol e separada através de cromatografia líquida preparativa para obter 245 mg de composto 18, com um rendimento de 37 %. LC-MS (ESI+) 327,1 [M+H]+.
[093] De acordo com o procedimento geral A, 245 mg de composto 18 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 67 mg do composto principal A’-14, com um rendimento de 23 %. LC-MS (ESI+) 462,9 [M+H]+. Exemplo 12 - Síntese de A’-15
H3C CH3 O O Br Br O
O CH3 + N H2N O OH
HN O O O N O
OH O O Br Composto Compound19 19 Anidrido bromomaleico Bromomaleic anhydride A'-15
[094] De acordo com o procedimento geral A, 56,1 mg de composto 19 (Boc- 4-amino-L-fenilalanina) foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 17,9 mg do composto principal A’-15, com um rendimento de 18 %. LC-MS (ESI+) 496,9 [M+H]+. Exemplo 13 - Síntese de A’-16
O O O
O S N Br OH
N O OH SNa O N O O N +
O O
S Br Tiofenolato Sodium de sódio thiophenolate A'-13 A'-16
[095] De acordo com o procedimento geral B, 218 mg de composto A’-13 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada na temperatura ambiente durante 0,7 h. A solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter 65 mg do composto principal A’-16, com um rendimento de 26 %. LC-MS (ESI+) 523,1 [M+H]+. Exemplo 14 - Síntese de A’-19 O Br
O O
O OH O H2N O OH Cl OHO Anidrido bromomaleico Bromomaleic anhydride Br
O O O 21 O O O
N N O NH HN H HN
O 20 22 A'-19
[096] O composto 20 (140 mg, 0,5 mmol) foi dissolvido com 3 mL de diclorometano, ao qual foi adicionada trietilamina (210 μL, 1,5 mmol), seguido por agitação em banho de gelo. O composto 21 (62,5 μL, 0,75 mmol) foi dissolvido em 2 mL de DCM e adicionado, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação em banho de gelo durante 0,5 h e agitação na temperatura ambiente durante 2 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi concentrada. O resíduo foi dissolvido com acetonitrila e separado através de cromatografia líquida preparativa para obter 93,5 mg de composto 22, com um rendimento de 56,1 %. LC- MS (ESI+) 335,2 [M+H]+.
[097] De acordo com o procedimento geral A, 33,4 mg de composto 22 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 7,5 mg do composto principal A’-19, com um rendimento de 19,1 %. LC-MS (ESI+) 393,0 [M+H]+. Exemplo 15 - Síntese de A’-20
[098] O composto 23 (230 mg, 1 mmol) foi dissolvido em 3 mL de THF, ao qual foi adicionado anidrido bromomaleico (354 mg, 2 mmols), seguido por agitação na temperatura ambiente durante 3 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi submetida à evaporação rotativa para remover o THF, para obter um produto bruto de composto 24. O composto 24 foi dissolvido com 3 mL de anidrido acético, ao qual foi adicionado acetato de sódio (41 mg, 0,5 mmol), seguido por agitação a 70 °C durante 8 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi submetida à evaporação rotativa para remover o solvente. O resíduo foi dissolvido com 4 mL de acetonitrila/água (1:1) e purificado através de cromatografia líquida preparativa para obter 70 mg de composto 25, com um rendimento de 18 %. LC-MS (ESI+) 389,0 [M+H]+.
[099] Ao composto 25 (99,2 mg, 0,32 mmol), 2 mL de uma solução (4M, 8 mmols) de cloreto de hidrogênio em 1,4-dioxano foram adicionados, seguido por agitação em banho de gelo durante 2 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi submetida à evaporação rotativa para remover o solvente. O resíduo foi lavado com éter dietílico (5 mL × 3) e seco para obter 64,1 mg de composto 26, com um rendimento de 95,3 %. LC-MS (ESI+) 289,0 [M+H]+.
[0100] O composto 26 (21 mg, 0,1 mmol) foi dissolvido com 1 mL de diclorometano, ao qual foi adicionada trietilamina (42 μL, 0,3 mmol), seguido por agitação em banho de gelo. O composto 21 (12,5 μL, 0,15 mmol) foi dissolvido em 1 mL de DCM e adicionado, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação em banho de gelo durante 0,5 h e agitação na temperatura ambiente durante 2 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi concentrada. O resíduo foi dissolvido com acetonitrila e separado através de cromatografia líquida preparativa para obter 18,2 mg de A’-20, com um rendimento de 69,1 %. LC-MS (ESI+) 343,0 [M+H]+. Exemplo 16 - Síntese de A’-26
O O O
OH OH OH Br
O O BH3-THF (Boc)2O 11
O THF NaHCO3,THF,H2O K2CO3,DMF H2N H2N BocHN NH2 NH2 NHBoc BocHN NHBoc 27 28 29 30
O HO O Br
HO O O O
O O Anidrido Bromomaleic bromomaleico anhydride HCl O dioxane,DCM NaOAc,AcOH Br N Cl H3N
O N
O O NH3Cl Br 31 A'-26
[0101] O composto 27 (150 mg, 0,63 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido com 5 mL de THF anidro e, em seguida, esfriado até -5 °C sob a proteção de Ar, ao qual foi adicionado cuidadosamente BH3-THF (1 N, 2,5 mL, 2,5 mmols, 4,0 eq), seguido por agitação durante 10 min e, em seguida, agitação na temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, a solução foi progressivamente aquecida até 65 °C e reagiu durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi resfriada até 0 °C e 5 mL de metanol foram lentamente adicionados, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação durante 30 min e, em seguida, agitação na temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, a solução de reação foi aquecida até 60 °C, agitada durante 3 h e concentrada sob pressão reduzida, para obter um produto bruto de 140 mg de composto 28, como um líquido oleoso que, sem purificação, foi diretamente colocado na próximo etapa. LC-MS (ESI+) 167,1 [M+H]+.
[0102] O produto bruto de composto 28 (140,0 mg, 0,58 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 5 mL de THF, ao qual foram adicionados 3 mL de água e, em seguida, adicionada, às gotas, uma solução de Boc2O (255,5 g, 1,17 mmol, 2,0 eq) em 2,5 mL de THF, seguido por agitação na temperatura ambiente durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo, ao qual foram adicionados 30 mL de EA, foi lavado, seco, concentrado e purificado para obter 185 mg de composto 29, como um sólido branco, com um rendimento de 72 %. LC-MS (ESI+) 367,1 [M+H]+.
[0103] O composto 29 (94,0 mg, 0,25 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 3 mL de DMF, ao qual foi adicionado K2CO3 (71,0 mg, 0,51 mmol, 2,0 eq) e, em seguida, adicionada, às gotas, uma solução de composto 11 (75,0 mg, 0,38 mmol, 1,5 eq) em 1 mL de DMF, seguido por aquecimento até 55 °C e agitação durante a noite. Depois que a reação foi concluída, 20 mL de EA foram adicionados à solução de reação. A solução de reação foi ajustada com solução de ácido cítrico 30 % ao pH = 3, extraída, lavada, seca e concentrada para obter 108 mg de composto 30, como um sólido branco amarelado, com um rendimento de 88 %. LC-MS (ESI+) 481,3 [M+H]+.
[0104] O composto 30 (108 mg, 0,22 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 5 mL de DCM anidro, ao qual depois foi adicionada uma solução (4 M, 1,5 mL, 6,0 mmols, 27,0 eq) de HCl em 1,4-dioxano, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 3 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi disperso através de ultrassom com 10 mL de éter metil-terc-butílico, centrifugado com a remoção do sobrenadante e, em seguida, disperso com 10 mL de éter de petróleo, centrifugado com a remoção do sobrenadante. O sólido foi destilado sob pressão reduzida para remover o solvente, para obter 66,6 mg de composto 31, como um sólido branco, com um rendimento de 100 %. LC-MS (ESI+) 225,1 [M+H]+.
[0105] De acordo com o procedimento geral A, 66,6 mg de composto 31 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 40 mg do composto principal A’-26, com um rendimento de 33 %. LC-MS (ESI+) 540,9 [M+H]+. Exemplo 17 - Síntese de A’-27
HO O HO O
O O SNa O + O Br N S N Sodium thiophenolate Tiofenolato de sódio
O N O N
O O O O Br S A'-26 A'-27
[0106] O composto A’-26 (40,0 mg, 0,074 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido com 1,0 mL de THF anidro, ao qual foi adicionada uma solução de TEA (22,5 mg, 0,22 mmol, 3,0 eq) em 500 μL de THF, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 5 min. O composto 32 (20,5 mg, 0,16 mmol, 2,2 eq) foi dissolvido em 500 μL de DMF e adicionado, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação na temperatura ambiente durante a noite. Depois que a reação foi concluída, 15 mL de acetato de etila foram adicionados à solução de reação. A solução de reação foi lavada com 15 % de solução de ácido cítrico, lavada com água, lavada com solução de NaCl saturada, seca, concentrada e purificada para obter 12 mg de composto A’- 27, como um sólido branco, com um rendimento de 26 %. LC-MS (ESI+) 629,1 [M+H]+. Exemplo 18 - Síntese de A’-28
O HO OH
O O OH (Boc)2O Boc OH OH H2N N 35 BocHN NHBoc
H O O O Dioxano, 2 O NaHCO3,Dioxane,H O T 3P,TEA,DMF
O OH 33 34 36
O Br
O O O O Br Br HCl O O Cl H3N NH3Cl Bromomaleic anhydride Anidrido bromomaleico O O
O O Dioxane,DCM Dioxano, N N NaOAc,AcOH O O
O OH O O
O OH 37 A'-28
[0107] O composto 33 (150 mg, 2 mmols, 1,0 eq) foi dissolvido em 5 mL de dioxano, ao qual foram adicionados 3 mL de uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e, em seguida, adicionada, às gotas, uma solução de Boc2O (523 mg, 2,40 mmols, 1,2 eq) em 2,5 mL de dioxano, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 2 h. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo, ao qual foram adicionados 30 mL de EA, foi ajustado com ácido cítrico 30 % ao pH = 3, extraído, lavado, seco, concentrado, disperso com 15 mL de PE, filtrado e seco para obter 344 mg de composto 34, com um rendimento de 62 %. LC-MS (ESI+) 176,1 [M+H]+.
[0108] O composto 34 (350 mg, 2,00 mmols, 1,0 eq) foi dissolvido em 4 mL de DMF e resfriado até -15 °C sob atmosfera de Ar, ao qual foi adicionada uma solução de TEA (606,0 mg, 6,00 mmols, 3,0 eq) em 1 mL de DMF, seguido por agitação durante 5 min e, em seguida, adicionada uma solução de T3P (700,0 mg, 2,20 mmols, 1,1 eq) em 1 mL de DMF, seguido por agitação durante 1,5 h. Uma solução de composto 35 (135,0 mg, 1,00 mmol, 0,5 eq) em 1 mL de DMF foi adicionada, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação durante a noite. A solução de reação, em que foram adicionados 30 mL de EA, foi ajustada com ácido cítrico 30 % ao pH = 3, extraída, lavada, seca e concentrada para obter 350 mg de composto 36 como um líquido oleoso que, sem purificação, foi diretamente colocado na próxima etapa. LC-MS (ESI+) 449,2 [M+H]+.
[0109] O composto 36 (350 mg, 0,78 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido com 5 mL de DCM anidro com agitação, ao qual então foi adicionada uma solução (4 M, 2,0 mL, 8,0 mmols, 10,2 eq) de HCl em 1,4-dioxano, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 2 h. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi disperso através de ultrassom com 20 mL de éter metil-terc- butílico, centrifugado com a remoção do sobrenadante e, em seguida, disperso com 20 mL de éter de petróleo, centrifugado com a remoção do sobrenadante. O sólido foi destilado sob pressão reduzida para remover o solvente, para obter 254 mg de composto 37, com um rendimento de 100 %. LC-MS (ESI+) 249,1 [M+H]+.
[0110] De acordo com o procedimento geral A, 195 mg de composto 37 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada a 70 °C durante a noite. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 58 mg do composto principal A’-28, como um sólido amarelo claro, com um rendimento de 17 %. LC-MS (ESI+) 564,9 [M+H]+. Exemplo 19 - Síntese de A’-29 Br Br
O O S S O O SNa O O
O O N N +
O O N N O O
O O O O O OH Sodium thiophenolate Tiofenolato de sódio O OH 38 A'-29
[0111] De acordo com o procedimento geral B, 58 mg de composto 38 foram adicionados, enquanto outros materiais foram adicionados em proporções molares. A reação foi realizada na temperatura ambiente durante 0,7 h. A solução de reação foi purificada através de cromatografia em coluna de fase normal, para obter 14,1 mg do composto principal A’-29, com um rendimento de 22 %. LC-MS (ESI+) 625,1 [M+H]+. Exemplo 20 - Síntese de A’-31
O O O
O Br N Br NH2 Br H Bromomaleic anhydride Anidrido bromomaleico N O OH O
O O O Br N H2N HO O N
H Br O 43 44 A'-31
[0112] O composto 43 (342,0 mg, 3,00 mmols, 1,0 eq) foi dissolvido com 15 mL de THF anidro e ao qual foi adicionado, às gotas, anidrido bromomaleico (1110,0 mg, 6,30 mmols, 2,1eq), seguido por agitação na temperatura ambiente durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi filtrada. A torta do filtro foi lavada com DCM e seca para obter 1160 mg de composto 44, como um sólido branco, com um rendimento de 83 %. LC-MS (ESI+) 466,9 [M+H]+.
[0113] Ao composto 45 (300 mg, 0,64 mmol, 1,0 eq) e acetato de sódio anidro (158,0 mg, 1,93 mmol, 3,0 eq) foram adicionados 6 mL de ácido acético, seguido por aquecimento até 85 °C e reagiram durante a noite. A solução de reação foi esfriada até 45 °C e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo, em que foi adicionado 20 mL de acetonitrila, foi filtrado. O filtrado foi purificado através de cromatografia líquida preparativa para obter 15 mg de um sólido amarelo claro (isto é, composto A’-31), com um rendimento de 5 %. LC-MS (ESI+) 430,9 [M+H]+. Exemplo 21 - Síntese de A’-33
[0114] De acordo com o procedimento geral A, o composto 48 (95 mg, 0,5 mmol) e o composto 8 (80,6 mg, 0,2 mmol) foram adicionados, para obter 10,9 mg de composto A’-33, com um rendimento de 10,1 %. LC-MS (ESI+) 548,0 [M+H]+. Exemplo 22 - Síntese de A’-34
O OH O O Br O Br N + O OH
O N Cl N NH2 O Cl Anidrido bromomaleico 49 Bromomaleic anhydride A'-34
[0115] De acordo com o procedimento geral A, o composto 49 (ácido 2- amino-6-cloroisonicotínico, 86 mg, 0,5 mmol) foi adicionado, para obter 21,3 mg de composto A’-34, com um rendimento de 13 %. LC-MS (ESI+) 330,9 [M+H]+. Exemplo 23 - Síntese de conjugado (Ab-A) de anticorpo (Ab) e primeira porção de ligante (A)
[0116] O ligante (isto é, primeira porção de ligante A) fornecido pela presente invenção foi principalmente usado para a ligação ao anticorpo no conjugado de anticorpo-fármaco.
De modo a verificar a capacidade de ligação do ligante fornecido pela presente invenção ao anticorpo, o ligante sintetizado nos exemplos acima foi ligado separadamente ao anticorpo.
O método de ligação usado foi como a seguir: 1) Preparação de líquidos precursores do agente de redução e agente protetor: os líquidos precursores do agente de redução e agente protetor, 1~20 mM TCEP (Tris-2-carbóxietil-fosfina) (agente de redução) e 1~20 mM DTPA (ácido pentacetato de dietilenotriamina) (agente protetor) foram, respectivamente, preparados com água purificada; 2) Reação de redução do anticorpo: os líquidos precursores DTPA e TCEP foram adicionados a uma solução de anticorpo monoclonal (por exemplo, 5 a 30 mg/mL), respectivamente.
O líquido precursor DTPA foi misturado na solução de anticorpo monoclonal (por exemplo, 5 a 30 mg/mL), de acordo com uma certa razão em volume (1~5:10) e a razão molar de TCEP para o anticorpo monoclonal foi 0,5~6,0:1. Depois que o agente de redução e o agente protetor foram adicionados, a reação foi realizada a 25 °C com agitação durante 1 h; 3) Preparação da primeira solução da porção de ligante (A): uma primeira porção de ligante (A) foi dissolvida em DMSO 25 % (sufóxido de dimetila) para formar uma primeira solução da porção de ligante (A) em uma concentração de 5 mM; 4) Reação de ligação entre a primeira porção de ligante (A) e o anticorpo: a primeira solução da porção de ligante (A) obtida na etapa 3) foi lentamente adicionada à solução de anticorpo monoclonal reduzida obtida na etapa 2) e, de acordo com as necessidades reais, embora controlando a razão molar da primeira porção de ligante (A) para o grupo de anticorpos estar na faixa de 0,3~5:1, a reação foi realizada a 25 °C com agitação durante 4 h;
5) Purificação e etapas de detecção: depois que a reação da etapa 4) foi concluída, a solução de reação foi centrifugada e ultrafiltrada 3 vezes com tampão PBS para purificar e remover substâncias químicas não reagidas residuais e pequenas moléculas livres, tais como DMSO, e o resultado da ligação foi detectado através de eletroforese SDS-PAGE.
[0117] O resultado da ligação do conjugado anticorpo-ligante foi analisado através de eletroforese SDS-PAGE. O método usado foi como a seguir: para a detecção de SDS-PAGE, uma placa de gel de NUPAGE 4 a 12 % foi usada, 1,5 μL de uma amostra foi colocado em um tubo EP de 1,5 mL, 2,5 μL de tampão foram adicionados, em seguida, 1,5 μL de agente de redução foi adicionado e água foi adicionada para tornar o volume de 10 μL. A mistura foi misturada em um oscilador e aquecida em um micro-ondas durante 1 min. Após o carregamento da amostra, a eletroforese em gel foi realizada. Depois que eletroforese em gel foi concluída, o gel foi retirado e colocado uma caixa nova, à qual foram adicionados 50 mL de uma mancha rápida, aquecido em um micro-ondas durante 5 min e, em seguida, tingido em um agitador durante 5 min. Depois que a solução de coloração foi derramada, 100 mL de água purificada foram adicionados, aquecidos em um fogão de indução durante 5 min e descoloridos em um agitador durante 1 h. Esta operação foi repetida três vezes.
[0118] O anticorpo usado neste relatório foi o anticorpo monoclonal Her2 (para as informações de sequência do anticorpo, consultar os parágrafos 41,42, 43 do relatório descritivo na Publicação de Patente Chinesa No CN105008398B) e os ligantes foram:
A’-7 A’-8 A’-10 A’-11 A’-12 A’-20 A’-28 A’-31 .
[0119] Os resultados de ligação foram mostrados na Figura 5. Na Figura 5, os nos 1, 2, 3 eram Her2-A’-7, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 8,5, 9,0, 7,4; os nos 4, 5, 6 eram Her2-A’-8, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 8,5, 7,4, 9,0; os nos 7, 8, 9 eram Her2-A’-10, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 8,5, 9,0, 7,4; os nos 10, 11, 12 eram Her2-A’-11, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 9,0, 7,4, 9,5; os nos 13, 14, 15 eram Her2-A’-12, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 7,4, 9,0, 8,5; os nos 16, 17, 18 eram Her2-A’-20, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 8,5, 9,0, 7,4; os nos 19, 20, 21 eram Her2-A’-28, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 9,0, 8,5, 7,4; os nos 22, 23, 24 eram Her2-A’-31, os tampões de ligação tinham, respectivamente, o pH de 7,4, 8,5, 9,0.
[0120] Devido ao uso de eletroforese de redução, todos os grupos tio entre os anticorpos foram expostos. Portanto, na Figura 5, 25 KD representa o peso molecular de uma cadeia leve do anticorpo, 50 KD representa o peso molecular de uma cadeia pesada e 75 KD representa o peso molecular de uma cadeia leve e de uma cadeia pesada (isto é, um ligante foi covalentemente ligado aos grupo tio entre uma cadeia pesada e uma cadeia leve), 100 KD representa o peso molecular de duas cadeias pesadas (isto é, um ligante foi covalentemente ligado ao grupo tio entre duas cadeias pesadas), 125 KD representa o peso molecular de uma cadeia leve e de duas cadeias pesadas (isto é, um ligante foi covalentemente ligado aos grupos tio entre duas cadeias pesadas e uma cadeia leve), 150 KD representa o peso molecular de duas cadeias pesadas e de duas cadeias leves (isto é, um ligante foi covalentemente ligado aos grupos tio entre duas cadeias pesadas e duas cadeias leves).
[0121] Os resultados mostram que os conjugados de anticorpo-ligante acima apresentaram ligantes que foram simultânea e covalentemente ligados aos grupos tio, respectivamente, entre uma cadeia pesada e uma cadeia leve, entre duas cadeias pesadas, entre duas cadeias pesadas e uma cadeia leve ou entre duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. E, havia bandas de 150 a 75 KD na maioria dos conjugados de anticorpo-ligante, o que provou que os 4 pares de ligações dissulfeto no anticorpo foram completa ou parcialmente ligados em ponte e o efeito de ligação em ponte foi melhor. A partir da Figura 5, também pode ser observado que o resultado da ligação sob a condição de tampão de pH = 9,0 foi melhor do que sob as condições de pH = 8,5 e 7,4.
[0122] Tendo em vista o melhor efeito de ligação em ponte do ligante fornecido pela presente invenção ao anticorpo, A’-7, A’-8, A’-10, A’-11, A’-28 foram selecionados para a preparação de conjugados de anticorpo-fármaco. O anticorpo usado foi o anticorpo monoclonal Her2 (o mesmo usado acima) e os fármacos usados foram MMAE, MMAF, MMAD, CBI, DM1, DM4.
[0123] Como para MMAE e MMAD, a preparação do conjugado de anticorpo-fármaco envolvida na presente invenção foi geralmente dividida em três etapas: a primeira etapa foi para preparar um conjugado L-D do segundo ligante L e fármaco D; a segunda etapa foi para preparar um conjugado A-L-D do primeiro ligante A e L-D; e a terceira etapa foi para preparar um conjugado de anticorpo Ab e A-L-D, isto é, um conjugado de anticorpo-fármaco Ab-A-L-D.
[0124] Como para MMAF, CBI, DM1, DM4, a preparação do conjugado de anticorpo-fármaco envolvida na presente invenção foi geralmente dividida em duas etapas: a primeira etapa foi para preparar um conjugado A-D do primeiro ligante A e fármaco D; e a segunda etapa foi para preparar um conjugado de anticorpo Ab e A- D, isto é, um conjugado de anticorpo-fármaco Ab-A-D.
[0125] O método de preparação específico foi mostrado nos Exemplos 26 a
29. Exemplo 24 - Síntese de conjugado (L-D) da segunda porção de ligante (L) e fármaco (D) Método geral para a síntese de L-D: uma segunda porção de ligante L foi dissolvida em uma quantidade adequada de DMF, à qual foram adicionados, sob a proteção de gás de nitrogênio, fármaco (D), HOBt, DIPEA e piridina em quantidades adequadas, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 24 horas, enquanto TLC foi usado para monitorar o progresso da reação. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi purificada através de cromatografia líquida preparativa de alto desempenho e a solução de preparação foi liofilizada para obter um conjugado (L-D) da segunda porção de ligante e o fármaco.
[0126] Val-Cit-PAB-MMAE foi preparado pelo método geral descrito acima e a via sintética foi mostrada abaixo:
[0127] O composto 53 (isto é, Fomc-Val-Cit-PAB-PNP, 995,4 mg, 1,3 mmol) e HOBt (67,6 mg, 0,65 mmol) foram colocados em um frasco de reação e dissolvidos com 5 mL de DMF anidra, ao qual foi adicionado DIPEA (258,5 mg, 2 mmols), seguido por agitação na temperatura ambiente durante 10 min. O composto 54 (isto é, MMAE, 717 mg, 1 mmol) foi dissolvido em 5 mL de DMF anidra e adicionado, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação na temperatura ambiente durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi filtrada. A fase orgânica foi concentrada. O resíduo foi separado através de cromatografia líquida preparativa para obter 636,2 mg de composto 55 (isto é, Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAE), como um sólido branco, com um rendimento de 47,3 %, LC-MS (ESI+) 1345,8 [M+H]+.
[0128] O composto 55 (270 mg, 0,2 mmol) foi adicionado até 3 mL de uma solução de piperidina em acetonitrila (v/v) a 20 %, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 2,5 h, para dissolver gradualmente o sólido. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi destilada sob pressão reduzida para remover o solvente. O resíduo foi separado através de cromatografia líquida preparativa, para obter 214 mg de composto 62 (isto é, Val-Cit-PAB-MMAE), com um rendimento de 95 %. LC-MS (ESI+) 1123,7 [M+H]+.
[0129] A síntese com o uso da segunda porção de ligante (L) e fármaco (D) foi um método geral para a síntese de outros compostos L-D, tais como Val-Cit-PAB- MMAD. Exemplo 25 - Síntese de conjugado (A-L-D) da primeira porção de ligante (A) e segunda porção de conjugado ligante-fármaco (L-D)
[0130] Método geral para a síntese de A-L-D: primeira porção de ligante, EDCI, HOBt em quantidades adequadas foram dissolvidos em uma quantidade adequada de DMF anidra e agitados na temperatura ambiente durante 2 h. Uma quantidade adequada de L-D de fabricação própria foi dissolvida em uma quantidade adequada de DMF anidra e lentamente adicionada, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 4 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi diluída com acetonitrila e, em seguida, separada através de cromatografia líquida preparativa. O eluente foi liofilizado para obter um conjugado da primeira porção de ligante (A) e segunda porção do conjugado ligante- fármaco (L-D).
[0131] O conjugado de A’-7 e o composto 56 (Val-Cit-PAB-MMAE) foram sintetizados por meio do uso do método geral acima. A via sintética foi mostrada abaixo:
[0132] O composto A’-7 (27,8 mg, 0,053 mmol), EDCI (11,2 mg, 0,058 mmol), HOBt (1,4 mg, 0,01 mmol) foram dissolvidos em 0,3 mL de DMF anidra e agitados na temperatura ambiente durante 2 h. O composto 56 (isto é, Val-Cit-PAB- MMAE, 40 mg, 0,035 mmol) foi dissolvido em 0,2 mL de DMF anidra e adicionado, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 4 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi diluída com 2 mL de acetonitrila e, em seguida, separada através de cromatografia líquida preparativa. O eluente foi liofilizado para obter 8,6 mg de composto 57 (isto é, A’-7- Val-Cit-PAB-MMAE), como um sólido amarelo claro, com um rendimento de 15 %. LC-MS (ESI+) 1624,6 [M+H]+.
[0133] Outros conjugados da primeira porção de ligante e o composto L-D foram sintetizados por meio do uso do método geral acima, tais como A’-8-Val-Cit- PAB-MMAE, A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE, A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE, A’-11-Val-Cit- PAB-MMAD, A’-28-Val-Cit-PAB-MMAE e semelhantes.
[0134] Para comparação, um conjugado 575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE do composto 6 (este composto é definido neste relatório como 575DZ) divulgado na página 7 das reivindicações da Patente Chinesa No CN103933575A com a segunda porção de ligante (Val-Cit-PAB) e porção de fármaco (MMAE) também foi preparado neste relatório.
Exemplo 26 - Síntese de conjugado (A-D) da primeira porção de ligante (A) e fármaco (D) (1) Síntese de A’-7-MMAF
[0135] O composto A’-7 (51,8 mg, 0,1 mmol), EDCI (21,1 mg, 0,11 mmol), HOBt (2,7 mg, 0,01 mmol) foram dissolvidos em 2 mL de DMF anidra e agitados na temperatura ambiente durante 2 h. O composto 58 (isto é, MMAF, 48,8 mg, 0,066 mmol) foi dissolvido em 0,8 mL de DMF anidra e adicionado, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 4 h. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi diluída com 4 mL de acetonitrila e separada através de cromatografia líquida preparativa. O eluente foi liofilizado para obter 25,9 mg de composto A’-7-MMAF, como um sólido amarelo claro, com um rendimento de 21 %. LC-MS (ESI+) 1233,4 [M+H]+. (2) Síntese de A’-8-CBI
[0136] O método de síntese foi o mesmo que o de A’-7-MMAF. A’-8 (22,0 mg, 0,047 mmol, 1,0 eq) e o composto 59 (isto é, CBI, 14,0 mg, 0,020 mmol, 0,7 eq) foram adicionados, para obter 6,0 mg de um sólido branco A’-8-CBI, com um rendimento de 21 %. LC-MS (ESI+) 868,0 [M+H]+. (3) Síntese de A’-8-DM1
[0137] O composto 60 (45,0 mg, 0,21 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido com 2 mL de THF anidro, ao qual foi adicionado 1 mL de solução NaHCO3 aquosa sat. e adicionada, às gotas, uma solução de DM1 (61, 150,0 mg, 0,21 mmol, 1,0 eq) em 1 mL de DMF, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 2 h. A solução de reação foi diluída com 10 mL de água e extraída com EA. A fase aquosa foi ajustada com solução de ácido cítrico 15 % ao pH = 3, extraída com 15 mL de EA, lavada com NaCl saturado, seca e concentrada para obter 165,7 mg de composto 62, como um sólido branco, com um rendimento de 85 %. LC-MS (ESI+) 949,3 [M+H]+.
[0138] A’-8 (150,0 mg, 0,33 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 5 mL de DMF e resfriado até -15 °C sob atmosfera de Ar, à qual foi adicionada uma solução de TEA (98,0 mg, 0,99 mmol, 3,0 eq) em 1 mL de DMF, seguido por agitação durante 5 min e, em seguida, adicionada uma solução de T3P (154,0 mg, 0,48 mmol, 1,5 eq) em 1 mL de DMF, seguido por agitação durante 1,5 h. Uma solução do composto 63 (46,0 mg, 0,29 mmol, 0,9 eq) em 1 mL de DMF foi adicionada, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação durante a noite. Depois que a reação foi concluída, 30 mL de EA foram adicionados e a solução de reação foi ajustada com ácido cítrico 30 % ao pH = 3, extraída, lavada, seca, concentrada e purificada através de cromatografia em coluna de fase normal para obter 90 mg de composto 64, como um sólido branco, com um rendimento de 52 %. LC-MS (ESI+) 607,1 [M+H]+.
[0139] O composto 64 (90 mg, 0,15 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido com 3 mL de DCM anidro com agitação, ao qual depois foi adicionada uma solução (4 M, 1,0 mL, 4 mmols, 26,7 eq) de HCl em 1,4-dioxano, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 2 h. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi disperso através de ultrassom com 20 mL de éter metil-terc-butílico, centrifugado com a remoção do sobrenadante e, em seguida, disperso com 20 mL de éter de petróleo, centrifugado com a remoção do sobrenadante. O sólido foi destilado sob pressão reduzida para remover o solvente, para obter 82 mg de composto 65, como um sólido branco, com um rendimento de 100 %. LC-MS (ESI+) 506,9 [M+H]+.
[0140] O composto 62 (30,0 mg, 0,03 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 2 mL de DMF e resfriado até -15 °C sob atmosfera de Ar, à qual foi adicionada uma solução de TEA (11,0 mg, 0,095 mmol, 4,0 eq) em 500 μL de DMF, seguido por agitação durante 5 min e, em seguida, adicionada uma solução de T3P (15,0 mg, 0,047 mmol, 1,5 eq) em 500 μL de DMF, seguido por agitação durante 1,5 h. Uma solução do composto 65 (19,0 mg, 0,035 mmol, 1,1 eq) em 500 μL de DMF foi adicionada, às gotas, à solução de reação, seguido por agitação durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi diluída com 2 mL de acetonitrila e purificada através de cromatografia líquida preparativa, para obter 9 mg do produto A’-8-DM1, com um rendimento de 20 %. LC-MS (ESI+) 1437,3 [M+H]+. (4) Síntese de A’-7-DM4
[0141] O composto 67 (737,5 mg, 4,03 mmols), EDCI (846,13 mg, 4,43 mmols), HOBt (108,9 mg, 0,806 mmol) foram dissolvidos em 10 mL de DCM, seguido por agitação na temperatura ambiente durante 2 h. O composto 66 (1 g,
4,03 mmols) foi dissolvido em 5 mL de diclorometano e adicionado lentamente, às gotas, em 3 lotes para o sistema de reação, seguido por agitação na temperatura ambiente durante a noite. Depois que a reação foi concluída, a solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O resíduo foi dissolvido com 6 mL de acetonitrila/água (1:1), separado através de cromatografia líquida preparativa e liofilizado para obter 1,11 g de composto 68, como um composto oleoso incolor, com um rendimento de 67 %. LC-MS (ESI+) 414,2 [M+H]+.
[0142] O composto 68 (1,11 g, 2,7 mmols) foi dissolvido com 1,1 mL fr DMA. 0,1 mL da solução obtida foi dissolvido em 1 mL de DMA, ao qual foi adicionado DIPEA (41,3 mg, 0,32 mmol), seguido por agitação na temperatura ambiente durante 2 min e, em seguida, adicionado DM4 (69, 202,5 mg, 0,26 mmol), seguido por agitação na temperatura ambiente durante 6 h. A solução de reação foi diretamente separada através de cromatografia líquida preparativa e liofilizada para obter 260 mg de composto 70, como um sólido branco, com um rendimento de 84 %. LC-MS (ESI+) 1193,5 [M+H]+.
[0143] O método de síntese do composto 71 foi o mesmo que o do composto
65. 119,3 mg de composto 70 foram adicionados, para obter 106 mg de composto 71, como um sólido branco, com um rendimento de 96 %. LC-MS (ESI+) 1093,5 [M+H]+.
[0144] O método de síntese de A’-7-DM4 foi o mesmo que o de A’-8-DM1. 52 mg de A’-7 e 54,6 mg de composto 71 foram adicionados, para obter 15 mg de A’-8-DM1, como um sólido branco, com um rendimento de 19 %. LC-MS (ESI+) 1594,4 [M+H]+. Exemplo 27 - Síntese de conjugado de anticorpo-fármaco e análise da uniformidade do produto
[0145] Método geral para a síntese de conjugado de anticorpo-fármaco:
1) Preparação de líquidos precursores do agente de redução e agente protetor: os líquidos precursores do agente de redução e agente protetor, 1~20 mM TCEP (Tris-2-carbóxietil-fosfina) (agente de redução) e 1~20 mM DTPA (ácido pentacetato de dietilenotriamina) (agente protetor) foram, respectivamente, preparados com água purificada; 2) Reação de redução do anticorpo: os líquidos precursores DTPA e TCEP foram adicionados a uma solução de anticorpo monoclonal (por exemplo, 5 a 30 mg/mL), respectivamente.
O líquido precursor DTPA foi misturado com a solução de anticorpo monoclonal (por exemplo, 5 a 30 mg/mL), de acordo com uma certa razão em volume (1~5:10) e a razão molar de TCEP para o anticorpo monoclonal foi 0,5~6,0:1. Depois que o agente de redução e agente protetor foram adicionados, a reação foi realizada a 25 °C com agitação durante 1 h. 3) Síntese de A-L-D e preparação da solução: um conjugado (A-L-D) da primeira porção de ligante-segunda porção de ligante-porção de fármaco foi sintetizado e o A-L-D sintetizado foi dissolvido em DMSO 25 % (sulfóxido de dimetila) para obter uma solução de A-L-D com concentração de 5 mM; 4) Reação de ligação do fármaco e anticorpo: a solução de A-L-D obtida na etapa 3) foi adicionada lentamente à solução reduzida de anticorpo monoclonal obtida na etapa 1) e, de acordo com as necessidades reais, controlando a razão molar de A-L-D para o grupo tio do anticorpo estar na faixa de 0,3~5:1, a reação foi realizada a 25 °C com agitação durante 4 h; 5) Purificação e detecção de etapas: depois que a reação da etapa 4) foi concluída, a solução de reação foi centrifugada e ultrafiltrada 3 vezes com tampão PBS para purificar e remover substâncias químicas não reagidas residuais e pequenas moléculas livres, tais como DMSO, e o resultado da ligação foi detectado através de eletroforese SDS-PAGE e cromatografia líquida de alto desempenho hidrofóbico (HIC-HPLC).
[0146] O resultado da ligação do conjugado de anticorpo-fármaco foi analisado através de eletroforese SDS-PAGE e HIC-HPLC. O método usado foi mostrado como a seguir: 1) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
[0147] Para a detecção de SDS-PAGE, uma placa de gel de NUPAGE 4 a 12 % foi usada, 1,5 μL de uma amostra foi colocado em um 1,5 mL de tubo EP, 2,5 μL de tampão foram adicionados, em seguida, 1,5 μL de agente de redução foi adicionado e água foi adicionada para o tornar o volume de 10 μL, seguido por mistura em um oscilador e aquecimento em um micro-ondas durante 1 min. Depois do carregamento da amostra, a eletroforese em gel foi realizada. Depois que a eletroforese em gel foi concluída, o gel foi retirado e colocado em uma caixa nova, à qual foram adicionados 50 mL de uma mancha rápida, e aquecido em um micro- ondas durante 5 min e, em seguida, tingido em um agitador durante 5 min. Depois da solução de coloração ser derramada, 100 mL de água purificada foram adicionados, aquecidos em um fogão de indução durante 5 min e descoloridos em um agitador durante 1 h. Esta operação foi repetida três vezes. 2) Cromatografia líquida de alto desempenho hidrofóbico (HIC) Condições de teste: HIC-HPLC: Tosoh TSK Gel Butyl, 4,6 mm × 3,5 cm, 10 mm; tampão A: fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1,5 M, pH 7,0; tampão B: fosfato de sódio 20 mM, isopronal 25 % (v/v), pH 7,0; taxa de fluxo: 1 mL/min; gradiente: tampão B 10 % a tampão B 100 % em 15 minutos; 10 μL de amostra.
[0148] Os seguintes 4 conjugados de anticorpo-fármaco foram preparados usando o método acima: Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-11-Val-Cit-PAB- MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, em que o anticorpo é o anticorpo monoclonal Her2 (o mesmo usado acima). Os resultados da ligação dos 4 conjugados de anticorpo-fármaco acima foram analisados através de
HIC-HPLC e eletroforese SDS-PAGE, os quais foram mostrados na Tabela 1, Figura 1A, Figura 1B, Figura 1C, Figura 1D e Figura 2A, Figura 2B.
[0149] Na tabela 1 e Figura 1A, Figura 1B, Figura 1C, Figura 1D, D0 % representa uma razão de conjugados de anticorpo-fármaco com 0 fármaco ligado a um anticorpo via ligante, isto é, uma razão de anticorpo nu, D1 % representa uma razão de conjugados de anticorpo-fármaco com 1 fármaco ligado a um anticorpo via ligante, D2 % representa uma razão de conjugados de anticorpo-fármaco com 2 fármacos ligados a um anticorpo via ligante, D3 % representa uma razão de conjugados de anticorpo-fármaco com 3 fármacos ligados a um anticorpo via ligante, D4 % representa uma razão de conjugados de anticorpo-fármaco com 4 fármacos ligados a um anticorpo via ligante e D5 % representa uma razão de conjugados de anticorpo-fármaco com 5 fármacos ligados a um anticorpo via ligante.
[0150] Os resultados mostram que o valor RFA médio de Her2-A’-7-Val-Cit- PAB-MMAE foi 4,10 (a razão molar do fármaco para o anticorpo durante ligação foi 5:1); o valor RFA médio de Her2-A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE foi 2,12 (a razão molar do fármaco para o anticorpo foi 5:1 durante a ligação); o valor RFA médio de Her2-A’- 10-Val-Cit-PAB-MMAE foi 2,26 (a razão molar do fármaco para o anticorpo foi 5:1 durante a ligação); o valor RFA médio de Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE foi 4,10 (a razão molar do fármaco para o anticorpo foi 5:1 durante a ligação). Os resultados mostram que Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2- A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE apresentaram efeito de ligação satisfatório (o valor RFA médio foi entre 2 a 4 sob condições ideais), em que as proporções DAR2 de Her2- A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE e Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE foram 65,574 % e 78,9 %, respectivamente, a razão de D4 % de Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE foi 59,45 %, a distribuição do valor RFA foi muito concentrada e a uniformidade do produto foi muito satisfatória (sendo melhores do que Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE).
Tabela 1 - Resultados analíticos dos conjugados de anticorpo-fármaco por cromatografia líquida hidrofóbica de alto desempenho (HIC-HPLC) CAF D0 % D1 % D2 % D3 % D4 % D5 % RFA Her2-A’-7-Val-Cit-PAB- 0 0,07 1,93 12,16 59,45 26,40 4,10
MMAE Her2-A’-10-Val-Cit-PAB- 0 9,03 78,9 11,9 0 0 2,26
MMAE Her2-A’-11-Val-Cit-PAB- 0 11,41 65,57 23,02 0 0 2,12
MMAE Her2 - 575DZ-Val-Cit- 0 0 1,99 18,46 52,94 21,17 4,10 PAB-MMAE
[0151] As Figuras 2A e 2B mostram os padrões de eletroforese SDS-PAGE dos conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que a Figura 2A mostrou os padrões de eletroforese SDS-PAGE de Her2-A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE (os tampões de ligação, respectivamente, apresentaram o pH de 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A’-7-Val-Cit- PAB-MMAE (os tampões de ligação, respectivamente, apresentaram o pH de 8,5, 9,0, 7,4), Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE (os tampões de ligação, respectivamente, apresentaram o pH de 8,5, 9,0, 7,4) e a Figura 2B mostrou os padrões de eletroforese SDS-PAGE da esquerda para a direita de Her2-A’-7-Val-Cit-PAB- MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE (o tampão de ligação apresentou o pH de 9,0).
[0152] Devido ao uso da eletroforese de redução, todos os grupos tio entre os anticorpos foram expostos. Portanto, 25 KD representou o peso molecular de uma cadeia leve do anticorpo, 50 KD representou o peso molecular de uma cadeia pesada e 75 KD representou o peso molecular de uma cadeia leve e de uma cadeia pesada (isto é, um ligante foi covalentemente ligado ao grupo tio entre uma cadeia pesada e uma cadeia leve), 100 KD representou o peso molecular de duas cadeias pesadas (isto é, um ligante foi covalentemente ligado ao grupo tio entre duas cadeias pesadas), 125 KD representou o peso molecular de uma cadeia leve e duas cadeias pesadas (isto é, um ligante foi covalentemente ligado aos grupos tio entre duas cadeias pesadas e uma cadeia leve), 150 KD representou o peso molecular de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves (isto é, um ligante foi covalentemente ligado aos grupos tio entre duas cadeias pesadas e duas cadeias leves).
[0153] A Figura 2A mostrou que os conjugados de anticorpo-fármaco (Her2- A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-11-Val-Cit-PAB- MMAE) fornecidos nos presente exemplos apresentaram ligantes que foram simultânea e covalentemente ligados aos grupos tio, respectivamente, entre uma cadeia pesada e uma cadeia leve (75 KD), entre duas cadeias pesadas (100 KD), entre duas cadeias pesadas e uma cadeia leve (125 KD) ou entre duas cadeias pesadas e duas cadeias leves (150KD), o que provou que os 4 pares de ligações dissulfeto no anticorpo foram completa ou parcialmente ligados em ponte e o efeito da ligação em ponte foi melhor.
[0154] A Figura 2B mostrou os padrões de eletroforese SDS-PAGE de contraste paralelo de Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB- MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE (o tampão de ligação apresentou o pH de 9,0). A partir da Figura, pode ser observado que a razão das bandas de 150 KD e 125 KD nos conjugados Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE e Her2-A’-10-Val-Cit-PAB- MMAE foi significantemente maior do que a razão das bandas correspondentes no conjugado Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE. Ao mesmo tempo, a razão das bandas de 50 KD e 25 KD também foi significantemente reduzida, o que provou que a primeira porção de ligante da presente invenção apresentou melhor eficácia de ligação e pode resultar em um conjugado de anticorpo-fármaco com uma maior razão de ponte. Exemplo 28 - Análise da hidrólise do conjugado de anticorpo-fármaco
[0155] O resultado da hidrólise do conjugado de anticorpo-fármaco (claudina18.2-A’-7-VC-PAB-MMAE) foi caracterizado pela análise de peso molecular e análise de ponto isoelétrico da proteína. 1) Análise de peso molecular (LC-MS) Condições de teste: modelo do instrumento: Thermo Q Exactive Plus; fase móvel: solução de acetato de amônio 25 mM; taxa de fluxo: 0,3 mL/min; volume de injeção: 1 mg/mL, 20 μL, isto é, 20 μg; faixa de detecção: 5000 a 8000 Da; faixa de saída: 140000 a 160000 Da. 2) Análise de distribuição de ponto isoelétrico Informações do Instrumento: Instrumento de Eletroforese de Focalização Isoelétrica Capilar de Imageamento, modelo: iCE 3. Configurações do instrumento: tempo de foco 1: 1500V durante 1,00 min; tempo de foco 2: 3000V durante 8,00 min. Anticorpo nu (anticorpo claudina18.2): portador de eletrólito anfótero: 1 % Pharmalyte 5-8, 3 % Pharmalyte 8-10,5; marcador de baixo ponto isoelétrico: 8,18; marcador de alto ponto elétrico: 9,77; concentração da proteína: 0,25 mg/mL; temperatura da bandeja: 15 °C. claudina18.2-A’-7-VC-PAB-MMAE: portador de eletrólito anfótero: 3 % Servalyt 5-9, 1 % Servalyt 9-11; marcador de baixo ponto isoelétrico: 5,85; marcador de alto ponto elétrico: 9,46; concentração da proteína: 0,50 mg/mL; temperatura da bandeja: 15 °C.
[0156] A Figura 6A mostrou o resultado do peso molecular do anticorpo nu e a Figura 6B mostrou o resultado do peso molecular de claudina18.2-A’-7-VC-PAB- MMAE. A partir das Figuras, pode ser observado que o peso molecular do anticorpo nu foi de 145144 Da e os pesos moleculares de claudina18.2-A’-7-VC-PAB-MMAE (quando a razão de A’-7-VC-PAB-MMAE para o anticorpo foi 4:1) foram de 152078 Da, 152119 Da, 152147 Da. Quando um anticorpo foi ligado a 4 A’-7-VC-PAB-MMAE sem hidrólise, seu peso molecular teórico foi de 151999 Da. Os pesos moleculares determinados reais foram de 152078 Da, 152119 Da, 152147 Da, que apresentaram um grande desvio do peso molecular teórico, excedendo a faixa de desvio (20 Da) do instrumento. Quando o conjugado claudina18.2-A’-7-VC-PAB-MMAE sofreu hidrólise em que 4, 7, 8 maleimidas foram hidrolisadas, seus pesos moleculares teóricos foram de 152071 Da, 152125 Da, 152143 Da. Em comparação a estes valores teóricos, o desvio relativo dos valores determinados reais estava dentro da faixa de desvio do instrumento. Especulou-se que o anticorpo-A’-7-VC-PAB-MMAE foi parcialmente hidrolisado.
[0157] Em seguida, a porção hidrolisada foi estudada. A Figura 7A mostrou o resultado da distribuição de ponto isoelétrico do anticorpo nu e a Figura 7B mostrou o resultado da distribuição de ponto isoelétrico de claudina18.2-A’-7-VC-PAB-MMAE. A partir da Figura 7A, pode ser observado que o pico principal do ponto isoelétrico do anticorpo nu foi 8,91 e a razão de pico ácido (ponto isoelétrico <8,91) e pico alcalino (ponto isoelétrico >8,91) foi relativamente baixa. A partir da Figura 7B, pode ser observado que o ponto isoelétrico do anticorpo-A’-7-VC-PAB-MMAE foi distribuído entre 7,86 a 8,70. Em comparação ao anticorpo nu, o ponto isoelétrico do anticorpo-A’-7-VC-PAB-MMAE foi significantemente diminuído, indicando que havia mais grupos ácidos, tais como grupos carboxila, sobre sua superfície. Ao combinar a análise estrutural, pode ser observado que a posição da hidrólise estava na porção de maleimida do anticorpo-A’-7-VC-PAB-MMAE, e, controlando a síntese e o meio de hidrólise do conjugado de anticorpo-fármaco, foi possível controlar o grau de hidrólise de maleimida no ligante do conjugado de anticorpo-fármaco, por exemplo, para obter hidrólise total ou nenhuma hidrólise. Além disso, os meios de purificação também podem ser utilizados para separar os produtos, que foram hidrolisados no mesmo grau, a partir dos produtos sintetizados.
Exemplo 29 - Determinação da afinidade dos conjugados de anticorpo- fármaco ao antígeno (método ELISA)
[0158] Procedimento geral: o antígeno foi diluído com um tampão de revestimento até a concentração exigida (tal como 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml ou arranjado por si mesmo, de acordo com as necessidades experimentais) em 100 µl/poço e colocado de lado a 4 °C durante a noite; lavagem da placa: uma placa foi lavada 3 vezes com uma solução de lavagem PBST em 350 µl/poço e seca por batimento; bloqueio: a placa foi bloqueada com solução de bloqueio BSA 3 % em 200 µl/poço e colocada de lado a 4 °C durante a noite; lavagem da placa: a placa foi lavada duas vezes com PBST em 300 µl/poço e a solução no poço foi manchada; carregamento da amostra: uma amostra foi diluída com uma solução diluente BSA- PBST 1 %, depois a amostra diluída foi adicionada à placa de cultura celular bloqueada em 100 µl/poço, com três replicatas e o diluente como um controle em branco e incubada em uma incubadora a 3 °C durante 2 h (o esquema de diluição pode ser alterado, de acordo com a situação real); lavagem da placa: a placa foi lavada duas vezes com PBST em 200 µl/poço e a solução no poço foi manchada; carregamento do anticorpo de teste: IgG-Fc HRP antA-Humano de Cabra conjugado foi diluído em 1:5000 com BSA-PBST 1 % em 100 µl/poço e incubado a 37 °C durante 1 h (o diluente pode ser alterado, de acordo com a situação real); lavagem da placa: a placa foi lavada 4 vezes com PBST em 200 µl/poço e a solução no poço foi manchada; desenvolvimento de cor: o substrato TMB foi adicionado em 100 µl/poço para efetuar o desenvolvimento de cor durante 2 min; terminação: H2SO4 2 M foi adicionado em 50 µl/poço para terminar a reação; leitura: a absorvância de densidade óptica em 450/655 nm foi medida por um leitor de microplacas e os resultados experimentais foram analisados pelo software de análise Prism com a concentração como a abscissa e a absorvância de densidade óptica como a ordenada, os valores de EC50 e semelhantes foram automaticamente calculados pelo software. Os resultados foram mostrados na Tabela 2 e na Figura 3.
[0159] A Tabela 2 mostrou os valores de EC50 dos conjugados de anticorpo- fármaco (Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE) contra o antígeno Her2, em que Her2 foi o anticorpo nu, com Her2-Mc-vc-PAB-MMAE como o CAF controle. Os resultados mostraram que Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE e Her2- A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE apresentaram melhor afinidade ao antígeno e os resultados dos dados mostraram que o método de ligação usado não alterou a afinidade original do anticorpo. Tabela 2 - Afinidade dos conjugados de anticorpo-fármaco ao antígeno (valor de EC50) CAF EC50 (ng/mL) R2 Her2 1,073 0,999 Her2-Mc-vc-PAB-MMAE 2,132 0,994 Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE 1,725 0,999 Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE 2,692 1,000 Exemplo 30 - Teste de eficácia in vitro
[0160] Uma placa de cultura contendo células SK-BR-3 de câncer de mama humano e meio de cultura foi colocada em uma incubadora de CO2 5 % 37 °C para a incubação. As células em condição de crescimento satisfatório foram retiradas e o meio de cultura original foi descartado, depois as células obtidas foram colocadas em suspensão com o meio de cultura e separadamente contadas. A suspensão celular foi adicionada a uma placa de 96 poços (5000 células por poço) e incubada em uma incubadora de CO2 5 % 37 °C durante a noite. Depois, um fármaco que foi diluído foi adicionado à suspensão celular para a incubação. Depois da incubação durante 72 h, o Kit de Contagem Celular-8 (abreviado como kit CCK-8) foi usado para desenvolvimento de cor ativa e a placa de 96 poços depois do desenvolvimento de cor foi detectada por um leitor de microplacas para obter o valor de OD em 450 nm. O valor de IC50 foi calculado através do valor de OD pelo software Prism. Um ajuste de curva de quatro parâmetros foi realizado usando o software com a taxa de inibição como valor y e a concentração do fármaco como valor x e o valor de concentração do fármaco (que foi padronizado como o valor IC50 pelo software) correspondente ao valor da taxa de inibição entre a taxa de inibição máxima e a taxa de inibição mínima foi registrado. Quando a curva ajustada foi “curva S” e R2 ≥ 0,95, o valor de IC50 foi válido. Os valores de IC50 dos conjugados de anticorpo-fármaco Her2-A’-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-11-Val-Cit- PAB-MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE contra células SK-BR-3 de câncer de mama humano foram mostrados na Tabela 3 e as curvas da taxa de inibição foram mostradas na Figura 4A e na Figura 4B.
[0161] A Tabela 3 mostrou as taxas de inibição de IC50 dos conjugados de anticorpo-fármaco (Her2-A’-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE) contra células SK- BR-3 de câncer de mama humano. Tabela 3 - Eficácia in vitro dos conjugados de anticorpo-fármaco contra células SK-BR-3 de câncer de mama humano CAF IC50 (ng/mL) Her2-A’-8-Val-Cit-PAB-MMAE 5,13 Her2-A’-7-Val-Cit-PAB-MMAE 1,57 Her2-A’-11-Val-Cit-PAB-MMAE 2,53 Her2-A’-10-Val-Cit-PAB-MMAE 2,11
[0162] A presente invenção foi exemplificada por várias formas de realização específicas. Entretanto, os técnicos no assunto podem entender que a presente invenção não é limitada a cada específico forma de realização e podem fazer várias alterações ou modificações no escopo da presente invenção e as várias características técnicas mencionadas no presente relatório descritivo podem ser combinadas entre si sem divergir do espírito e escopo da presente invenção.
Tais alterações e modificações estão no escopo da presente invenção.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Ligante, CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a estrutura representada pela Fórmula I, M1' L1 Q L3' M2' L2 (I) em que, M1’, M2’ são, independentemente, selecionados a partir de , , , , , , ou estão ausentes, M1’, M2’ são iguais ou diferentes, mas não estão ausentes ao mesmo tempo; L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C9, alquenila C2-C9, alquinila C2-C9, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9, polietilenoglicol, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , C=NR3 , C (=S) O , C (=S) NR12 , C (=S) S , NR13 (C=O) , NR14 (C=S) NR5 , O (C=O) NR15 , S (=O) 2 e qualquer combinação dos mesmos; Q é selecionado a partir de , , N, B, P, arila, heteroarila, cicloalquila, (heterociclil) alquila; L3’ é selecionado a partir de R8 (C=O), C (=O) R8C (=O), polietilenoglicol, , NH2, OH, SH, X e qualquer combinação dos mesmos; X é selecionado a partir de F, Cl, Br, I;
Yé , , ; Z é selecionado a partir de C, N; R1 é um grupo arbitrário ou está ausente, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R12, R13, R14, R15 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9.
2. Ligante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C4, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C5-C6, heterociclila C5-C6, polietilenoglicol C2-C12, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , O (C=O) NR15 ; Q é selecionado a partir de , N, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C3-C8, heterociclila C3-C8; L3’ é selecionado a partir de R8 (C=O), C (=O) R8C (=O), polietilenoglicol, , NH2, OH, SH, X e qualquer combinação dos mesmos; X é Br; Yé ; R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R15 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C4, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C5-C6, heterociclila C5-C6.
3. Ligante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a estrutura:
(A’-1’) ou (A’-2’) ou (A’-3’) ou (A’-4’).
4. Ligante, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a estrutura:
A’-1 A’-2 A’-4
A’-5 A’-7 A’-8
A’-9 A’-10 A’-11
A’-12 A’-13 A’-14
A’-15 A’-16 A’-19
A’-20 A’-21 A’-22 A’-24 A’-26 A’-27 A’-28 A’-29 A’-31 A’-33 A’-34 .
5. Uso do ligante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de conjugados de anticorpo-fármaco.
6. Conjugado de anticorpo-fármaco, CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a estrutura representada pela Fórmula II: Ab-(A-L-D)n (II)
em que, Ab é um anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo; a porção de ligante inclui uma primeira porção de ligante A e uma segunda porção de ligante L; D é uma porção de fármaco; n é 1, 2, 3 ou 4; em que: a primeira porção de ligante A inclui um grupo covalentemente ligado ao grupo tiol ou grupo amino no Ab, que apresenta a estrutura representada pela Fórmula III: (III) em que M1, M2 são, independentemente, selecionados a partir de
O O
O O O O
OH OH
OH H
N H
N N H N N
N R1 R1 O , O , O , O , O , O , O
O O
S S , O , O , O ou estão ausentes, M1 e M2 são iguais ou diferentes, mas não podem estar ausentes ao mesmo tempo; L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C9, alquenila C2-C9, alquinila C2-C9, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9, polietilenoglicol, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , C=NR3 , C (=S) O , C (=S) NR12 , C (=S) S , NR13 (C=O) , NR14 (C=S) NR5 , O (C=O) NR15 , S (=O) 2 e qualquer combinação dos mesmos;
Q é selecionado a partir de , , N, B, P, arila, heteroarila, cicloalquila, (heterociclil) alquila; L3 é covalentemente ligado à segunda porção de ligante L, L3 é selecionado a partir de R2 (C=O) , C (=O) R2C (=O) , polietilenoglicol, , NR9 , O , S e qualquer combinação dos mesmos ou está ausente; R1 é um grupo arbitrário ou está ausente, R2, R3, R4, R5, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9; a segunda porção de ligante L é qualquer ligante clivável ou ligante não clivável ou está ausente.
7. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que: L1, L2 são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-C4, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C5-C6, heterociclila C5-C6, polietilenoglicol C2-C12, O, S, NR4 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR11 , O (C=O) NR15 ; Q é selecionado a partir de , N, arila C6-C8, heteroarila C6-C8, cicloalquila C3-C8, heterociclila C3-C8; L3 é selecionado a partir de R2 (C=O) , C (=O) R2C (=O) , polietilenoglicol, , NR9 , O, S e qualquer combinação dos mesmos ou está ausente; R1 é selecionado a partir de H, alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2- C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9.
8. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira porção de ligante apresenta a estrutura:
(A-1’) (A-1’’) (A-1’’’)
(A-2’) (A-2’’) (A-2’’’)
(A-2’’’’) (A-3’) (A-3’’)
(A-3’’’) (A-3’’’’) (A-4’)
(A-4’’) (A-4’’’) (A-5’)
(A-5’’) (A-5’’’) (A-5’’’’)
(A-6’) (A-6’’) (A-6’’’) (A-7’) (A-7’’) (A-8’) (A-8’’) .
9. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo se liga especificamente a receptores de superfície celular ou antígenos relacionados ao tumor.
10. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira porção de ligante A inclui um grupo covalentemente ligado ao grupo tiol no Ab.
11. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira porção de ligante A pode apresentar a estrutura: A-1 A-2 A-4
A-5 A-6 A-7
A-10 A-11 A-12
A-13 A-15 A-16
A-17 A-18 A-19
A-20 A-21 A-23
A-24 A-25 A-28 A-29 A-31 A-33 A-34 .
12. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda porção de ligante L pode ser: alquila C1-C9, alquenila C2-C9, alquinila C2-C9, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9, , O, S, NR6 , C (=O) , C (=O) O , C (=O) NR6 , C=NR6 , C (=S) O , C (=S) NR6 , C (=S) S , NR6 (C=O) , NR6 (C=S) NR7 , O (C=O) NR6 , S (=O) 2 , Val-Val- PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys (Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys (Ac)- PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB, Ala-PAB, PAB e qualquer combinação dos mesmos ou está ausente, em que, R6, R7 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, arila, heteroarila, cicloalquila C3-C9, heterociclila C3-C9, e é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
13. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda porção de ligante L pode ser: L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6
O
O O O
H
O N N e N N
H H H
O
NH O NH2 L-7 L-8 L-9 L-10 L-11 L-12
L-13 L-14 .
14. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de fármaco D é fármacos citotóxicos, fatores de diferenciação celular, fatores nutricionais de células-tronco, fármacos esteroides, fármacos para o tratamento de doenças autoimunes, fármacos anti-inflamatórios ou fármacos para o tratamento de doenças infecciosas; a porção de fármaco D é, preferivelmente, inibidores de tubulina ou agentes de dano ao DNA; ou a porção de fármaco D é, ainda preferivelmente, dolastatinas, auristatinas, maitansinas, caliqueamicinas, duocarmicinas, derivado de antramicina PBD, derivado de camptotecina SN-38, inibidores de topoisomerase I, amanitinas, antraciclinas, bacatinas, camptotecinas, cemadotinas, colchicinas, colcimidas, combretastatinas, criptoficinas, discodermolidas, docetaxel, doxorrubicina, equinomicinas, eleuterobinas, epotilonas, estramustinas, lexitropsinas, maitansinas, metotrexato, netropsinas, puromicinas, rizoxinas, taxanos, tubulisinas, alcaloides da vinca, precursor de Vitamina A, ácido fólico.
15. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de fármaco é:
MMAD
MMAE
MMAF DM1 DM4
PBD
CBI Dxd
SN-38 .
16. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco apresenta a estrutura: ADC1
ADC2
ADC3
ADC4
ADC5
ADC6
ADC7
S
N O O N
H H
S O O
N
N O O N
O N O O
H H O O Ab O N O
N N
H H
O n8
S
N O O N H
H
S O O
NH OH
N O O N
O N O O
H H O O
O N O
N N
H H
O n9 ADC8 ADC9
S
O
O O
S H
N N N
O O O N N
N H
O N O O O
O N N O
H H
N O O NH
O OH
S
O
NH
S O NH2 m1
S
O
O O
S H OH H
N N N
O O O N N Ab O N H
N O O O
O N N O
H H
N O O NH
O OH
S
O
NH
S O NH2 m2
S
O
O O
S H OH H
N N N
O O O N N
N H
O N O O O
O N N O
H H
N O O NH
H O OH
S OH
O
NH
S O NH2 m3 ADC10 ADC11
ADC12
ADC13
ADC14
ADC15
ADC16
,
em que:
o Ab é um anticorpo contra receptores de superfície celular e antígenos relacionados ao tumor; n1, n2, n3 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2, 3, 4; n1, n2, n3 não são 0 ao mesmo tempo e n1 + n2 + n3 ≤4; n4, n5, n6, n7 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2, 3, 4; n4, n5, n6, n7 não são 0 ao mesmo tempo, e n4 + n5 + n6 + n7 ≤4; n8, n9 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2, 3, 4; n8, n9 não são 0 ao mesmo tempo e n8 + n9 ≤4; m1, m2, m3 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2; pelo menos um entre m1, m2, m3 é 0, mas m1, m2, m3 não são 0 ao mesmo tempo e m1 + m2 + m3 ≤2; m4, m5 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1, 2; m4, m5 não são 0 ao mesmo tempo e m4 + m5 ≤2.
17. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco apresenta a estrutura: ADC17 ADC18
ADC19
ADC20
ADC21
ADC22
ADC23
ADC24
ADC25
ADC26
ADC27
ADC28
ADC29
ADC30 ADC31 ADC32 , em que: o Ab é um anticorpo contra receptores de superfície celular e antígenos relacionados ao tumor; n10 é 0, 1, 2, 3 ou 4; m6 é 0, 1 ou 2.
18. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco apresenta a estrutura: ADC33
ADC34
ADC35
ADC36
ADC37
ADC38
ADC39
ADC40
ADC41
ADC42
ADC43
ADC44
ADC45
ADC46
ADC47
ADC48 ,
em que: o Ab é um anticorpo contra receptores de superfície celular e antígenos relacionados ao tumor; n11 é 0, 1, 2, 3 ou 4; m7 é 0, 1 ou 2.
19. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir de: anticorpos murinos, anticorpos de mamíferos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpo humano, anticorpos multiespecíficos.
20. Composição farmacêutica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 19, e um portador farmaceuticamente aceitável.
21. Uso do conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 19, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas.
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