KR20210083282A - 항체-약물 컨쥬게이트에 사용하기 위한 커넥터 및 커넥터의 적용 - Google Patents

항체-약물 컨쥬게이트에 사용하기 위한 커넥터 및 커넥터의 적용 Download PDF

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KR20210083282A
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창지앙 후앙
후이 예
후 첸
쉬우지 잔
난 쉔
웬팅 루오
치아오후아 호우
지안민 팡
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레메젠 코, 리미티드
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Abstract

본 발명은 항체-약물 컨쥬게이트를 제조하기위한 링커 및 상기 링커에 의해 제조된 항체-약물 컨쥬게이트를 비롯하여 종양 치료를 위한 약제 내의 상기 항체-약물 컨쥬게이트의 용도를 제공한다. 상기 링커는 항체 또는 항체의 기능적 단편 상의 싸이올기 또는 아미노기와 동시에 결합할 수 있으며, 특히 항체 또는 항체의 기능적 단편상의 2, 3 또는 4개의 싸이올 그룹과 결합할 수 있다. 결합된 생성물은 균일하고 구조적으로 안정적이다.

Description

항체-약물 컨쥬게이트를 위한 링커 및 이의 용도
본 발명은 항체-약물 컨쥬게이트를 위한 링커 및 링커에 의해 제조된 항체-약물 컨쥬게이트, 뿐만 아니라 종양 및 기타 질병을 치료하는데 있어서의 항체-약물 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)는 주로 암, 자가 면역 질환 등을 치료하는 데 사용되는 표적 치료제의 한 종류이다. 그들의 구조는 일반적으로 다음 세 모이어티로 구성된다: 항체 또는 항체 유사 리간드, 약물 모이어티 및 항체 또는 항체 유사 리간드와 약물을 결합하는 링커.
전통적인 ADC 약물은 링커를 통해 항체의 사슬 간 이황화 결합을 감소시켜 생성된 시스테인 잔기 또는 항체의 라이신 잔기에 약물을 결합시켜 얻는다. 라이신 잔기를 결합 부위로 사용하는 경우, 항체에는 약 40개 이상의 라이신 잔기가 포함되어 있고 결합 반응이 비 선택적이기 때문에, 결합 수와 부위의 불확실성이 크며 생성물 균일성이 매우 불량하다. 시스테인 잔기가 결합 부위로 사용되는 경우, 상기 항체 (IgG1)가 오직 4쌍의 체인 간 이황화 결합만을 갖고, 체인 간 이황화 결?d의 감소에 의해 생성된 시스테인 잔기에 의해 형성된 ADC 약물의 DAR (drug to antibody ratio) 값이 비교적 균일하더라도, 본 커플링 방법은 항체의 이황화 결합을 파괴하고, 항체의 안정성에 영향을 준다. 또한 사슬 간 이황화 결합에 대한 기존 환원제 (DTT, TCEP)의 선택성이 좋지 않아, 최종 생성물의 균일성 또한 불량하다. 치료 효과와 약물 감독 측면에서, 생성물의 균일 성이 매우 중요하다. 따라서 잘 조절된 항체에 대한 약물 비율을 갖는 ADC 약물을 준비하는 것이 필요하다.
최근 몇 년 동안, 일부 연구자들은 항체와 약물의 표적 결합을 달성하기 위해 항체를 수정하기 위해 유전 공학 기술을 사용해왔으며, 획득된 ADC는 매우 균일한 DAR 값을 갖는다. 그러나 유전자 재조합 기술은 약물 결합 또는 폴리에틸렌 글리콜 변형에 적합한 부위를 찾기 위해 많은 작업과 설계가 필요하기 때문에 개발에 많은 시간과 비용이 소요된다.
선행 기술에서 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서 상기 언급된 결함을 고려할 때, 항체에 대한 독성 약물의 표적 결합을 달성하기 위한 새로운 링커를 개발하여 더 높은 생성물 균일성 및 더 강한 안정성을 갖는 ADC 약물을 얻기 위한 시급한 필요성이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 항체-약물 컨쥬게이트를 제조하기 위한 링커 및 상기 링커에 의해 제조된 항체-약물 컨쥬게이트, 뿐만 아니라 종양 치료 용 약제에서의 항체-약물 컨쥬게이트의 용도를 제공한다. 상기 링커는 항체 또는 항체의 기능적 단편 상의 싸이올기(들) 또는 아미노기(들)과 동시에 결합할 수 있으며, 특히 상기 항체 또는 상기 항체의 기능적 단편상의 2, 3 또는 4개의 싸이올기와 결합할 수 있다. 결합된 제품은 균일하고 구조적으로 안정적이다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 식 I의 구조를 갖는 링커를 제공한다:
Figure pct00001
(I)
상기 M1', M2'는 각각 독립적으로
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
,
Figure pct00008
이거나 또는 존재하지 않고, M1', M2'는 동일하거나 또는 다르지만, 동시에 부재하지 않으며;
X, Y, R1, L1, L2, L3', Q는 각각 임의의 기이다.
더욱이, 상기 언급한 X, Y, R1, L1, L2, L3', Q는 다음과 같을 수 있다:
L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C9 알킬, C2-C9 알케닐, C2-C9 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴, 폴리에틸렌글리콜, O, S,
Figure pct00009
NR4
Figure pct00010
,
Figure pct00011
C(=O)
Figure pct00012
,
Figure pct00013
C(=O)O
Figure pct00014
,
Figure pct00015
C(=O)NR11
Figure pct00016
,
Figure pct00017
C=NR3
Figure pct00018
,
Figure pct00019
C(=S)O
Figure pct00020
,
Figure pct00021
C(=S)NR12
Figure pct00022
,
Figure pct00023
C(=S)S
Figure pct00024
,
Figure pct00025
NR13(C=O)
Figure pct00026
,
Figure pct00027
NR14(C=S)NR5
Figure pct00028
,
Figure pct00029
O(C=O)NR15
Figure pct00030
,
Figure pct00031
S(=O)2
Figure pct00032
및 이들의 조합으로부터 선택되고;
Q는
Figure pct00033
,
Figure pct00034
, N, B, P, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, (헤테로사이클릴)알킬로부터 선택되며;
L3'는
Figure pct00035
R8 (C=O),
Figure pct00036
C (=O) R8C (=O), 폴리에틸렌글리콜,
Figure pct00037
,
Figure pct00038
NH2,
Figure pct00039
OH,
Figure pct00040
SH,
Figure pct00041
X 및 이들의 조합으로부터 선택되며;
X는 F, Cl, Br, I로부터 선택되고;
Y는
Figure pct00042
,
Figure pct00043
,
Figure pct00044
이고; (상기 두 구조에서, R2의 치환은 링 상의 어떠한 위치에서도 일어날 수 있다.)
Z는 C, N으로부터 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R12, R13, R14, R15는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
또한, 상기 언급된 X, Y, R1, L1, L2, L3', Q는 다음과 같을 수 있다:
L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C5-C6 사이클로알킬, C5-C6 헤테로사이클릴, C2-C12 폴리에틸렌글리콜, O, S,
Figure pct00045
NR4
Figure pct00046
,
Figure pct00047
C(=O)
Figure pct00048
,
Figure pct00049
C(=O)O
Figure pct00050
,
Figure pct00051
C(=O)NR11
Figure pct00052
,
Figure pct00053
O(C=O)NR15
Figure pct00054
로부터 선택되고;
Q는
Figure pct00055
, N, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C3-C8 사이클로알킬, C3-C8 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
L3'는
Figure pct00056
R8 (C=O),
Figure pct00057
C (=O) R8C (=O), 폴리에틸렌글리콜,
Figure pct00058
,
Figure pct00059
NH2,
Figure pct00060
OH,
Figure pct00061
SH,
Figure pct00062
X 및 이들의 조합으로부터 선택되고;
X는 Br이며;
Y는
Figure pct00063
이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R15는 각각 독립적으로 H, C1-C4 알킬, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C5-C6 사이클로알킬, C5-C6 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
더욱이, 상기 링커는 화학식에 의해 표시된 구조를 갖는다:
Figure pct00064
(A'-1') 또는
Figure pct00065
(A'-2') 또는
Figure pct00066
(A'-3') 또는
Figure pct00067
(A'-4').
바람직하게, 상기 링커는 다음 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
본 발명은 또한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에 있어서의 상술한 링커의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체-약물 컨쥬게이트를 제공하고, 상기 항체-약물 컨쥬게이트는 식 II로 표시되는 구조를 갖는다:
Ab-(A-L-D)n (II)
여기에서,
상기 Ab는 항체 또는 항체의 기능적 단편이다. 또한, 항체는 항체의 유도체 또는 유사체를 포함하며; "기능적" 단편은 동일한 항원을 인식할 수 있고 항원으로부터 유래된 단편, 유도체 또는 유사체를 인식할 수 있는 항체, 이의 단편, 유도체 또는 유사체를 나타내며, 예를 들어 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: F (ab') 2, Fab, Fab', Fv 단편 및 항체의 중쇄 및 경쇄 다이머, 또는 Fv 또는 단일 사슬 항체(단일 사슬 항체 단편/단일 사슬 가변 단편, scFv)와 같은 가장 작은 단편. 또한, 상기 항체는 항체의 융합 단백질일 수 있다. 상기 항체는 또한 공유 결합이 항체가 그의 항원 결합 면역 특이성을 유지하도록 허용하는 한, 변형되거나 변형되지 않은 (즉, 임의의 분자를 통한 공유 결합) 유사체 및 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 다음과 같은 추가 변형을 포함하는 항체의 유사체 및 유도체: 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기를 통한 유도체화, 프로테아제 절단, 세포 항체 유닛 또는 다른 단백질들에 대한 연결 등. 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신(tunicamycin)의 존재 하에서의 대사 합성 등을 포함 하지만 이에 제한되지 않는 공지된 기술들을 사용하여 임의의 많은 수의 화학적 변형들이 달성 될 수 있다. 또한, 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 비 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항체는 Fc 수용체와 상호 작용하는 아미노산 잔기에서 변형 (예들 들어, 치환, 결실 또는 추가)을 가질 수 있다. 또한, 항체는 뮤린 항체, 포유 동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중 특이적 항체로부터 선택된다.
상기 링커 모이어티는 제1 링커 모이어티 A 및 제2 링커 모이어티 L을 포함하고; 제1 링커 모이어티 A는 Ab에서 싸이올 그룹 또는 아미노 그룹에 공유결합된 그룹을 포함한다.
D는 약물 모이어티이고, 상기 약물은 세포독성 약물, 세포 분화 인자, 줄기세포 영양 인자, 스테로이드 약물, 자가면역 질환 치료용 약물, 항 염증 약물 또는 감염성 질환 치료용 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 약물 모이어티 D는 튜불린 억제제 또는 DNA 손상제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 튜불린 억제제는 돌라스타틴, 아우리스타틴, 메이탄신을 포함하지만 이에 제한되지 않고; 상기 DNA 손상제는 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 안트라마이신 유도체 PBD (피롤로벤조디아제핀), 캄프토테신 유도체 SN-38, 토포아이소머라아제 I 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아우리스타틴 약물은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 및 아우리스타틴 F (AF) 또는 이들의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 메이탄신 약물은 DM1, DM3, DM4 또는 이들의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (Research Progress on Warhead Molecules of antibody-drug conjugate, Hu Xinyue et al., Chinese Medicinal Biotechnology, Dec., 2017, Vol.12, No 6) (Research advance of maytansinoid class antibody drug conjugates, Zhou Lei et al., Chinese Journal of New Drugs, 2016, Vol. 25, No. 22, pages 2521-2530). 약물 모이어티 D는 또한 아마니틴, 안트라사이클린, 바카틴, 캄프토테신, 세마도틴, 콜히친, 콜시미드, 콤브레타스타틴, 크립토피신, 디스코더몰리드, 도세탁셀, 독소루비신, 에키노마이신, 엘레우테로빈, 에포틸론, 에스트라무스틴, 렉시트롭신, 메이탄신, 메토트렉세이트, 네트록신, 퓨로마이신, 리족신, 탁산, 튜불리신, 또는 빈카 알칼로이드를 포함할 수 있다. 상기 약물 모이어티 D는 또한 비타민 A 전구체, 엽산(folic acid) 등 일 수 있다. 약물 모이어티 D는 상기 범주로 제한되지 않고, ADC에 사용할 수 있는 모든 약물을 또한 포함한다.
n은 1, 2, 3 또는 4이며;
상기 제1 링커 모이어티 A가 식 III으로 표시되는 구조를 갖는 특징을 갖는다:
Figure pct00077
(III)
상기에서:
M1, M2는 항체 또는 항체의 기능적 단편 모이어티 (즉, Ab)의 싸이올기 또는 아미노기에 공유결합되고, 각각 독립적으로
Figure pct00078
,
Figure pct00079
,
Figure pct00080
,
Figure pct00081
,
Figure pct00082
,
Figure pct00083
,
Figure pct00084
,
Figure pct00085
,
Figure pct00086
,
Figure pct00087
로부터 선택되거나 또는 존재하지 않고, M1 및 M2는 동일하거나 다르지만, 동시에 부재할 수 없고;
L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C9 알킬, C2-C9 알케닐, C2-C9 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴, 폴리에틸렌글리콜, O, S,
Figure pct00088
NR4
Figure pct00089
,
Figure pct00090
C(=O)
Figure pct00091
,
Figure pct00092
C(=O)O
Figure pct00093
,
Figure pct00094
C(=O)NR11
Figure pct00095
,
Figure pct00096
C=NR3
Figure pct00097
,
Figure pct00098
C(=S)O
Figure pct00099
,
Figure pct00100
C(=S)NR12
Figure pct00101
,
Figure pct00102
C(=S)S
Figure pct00103
,
Figure pct00104
NR13(C=O)
Figure pct00105
,
Figure pct00106
NR14(C=S)NR5
Figure pct00107
,
Figure pct00108
O(C=O)NR15
Figure pct00109
,
Figure pct00110
S(=O)2
Figure pct00111
및 이들의 조합으로부터 선택되며;
Q는
Figure pct00112
,
Figure pct00113
, N, B, P, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, (헤테로사이클릴)알킬로부터 선택되고;
L3은 제2 링커 모이어티 L에 공유 결합되고,
Figure pct00114
R2 (C=O)
Figure pct00115
,
Figure pct00116
C (=O) R2C (=O)
Figure pct00117
, 폴리에틸렌 글리콜,
Figure pct00118
,
Figure pct00119
NR9
Figure pct00120
,
Figure pct00121
O
Figure pct00122
,
Figure pct00123
S
Figure pct00124
및 이들의 조합으로부터 선택되거나 부재하며;
R1은 임의의 기이거나 부재하고, R2, R3, R4, R5, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
제2 링커 모이어티 L은 임의의 절단 가능한 링커 또는 절단 불가능한 링커이거나 존재하지 않고, L이 부재할 때, L3은 약물 모이어티 D에 직접적으로 공유결합된다.
또한, 상술한 L1, L2, L3, Q, R1은 각각 다음과 같을 수 있다:
L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C5-C6 사이클로알킬, C5-C6 헤테로사이클릴, C2-C12 폴리에틸렌 글리콜, O, S,
Figure pct00125
NR4
Figure pct00126
,
Figure pct00127
C (=O)
Figure pct00128
,
Figure pct00129
C (=O) O
Figure pct00130
,
Figure pct00131
C (=O) NR11
Figure pct00132
,
Figure pct00133
O (C=O) NR15
Figure pct00134
로부터 선택되고;
Q는
Figure pct00135
, N, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C3-C8 사이클로알킬, C3-C8 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
L3은
Figure pct00136
R2 (C=O)
Figure pct00137
,
Figure pct00138
C (=O) R2C (=O)
Figure pct00139
, 폴리에틸렌글리콜,
Figure pct00140
,
Figure pct00141
NR9
Figure pct00142
, O, S 및 이들의 조합으로부터 선택되거나 부재하고;
R1은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
또한, 제1 링커 모이어티는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
.
또한, 상기 항체 또는 항체의 기능적 단편이 세포 표면 수용체 또는 종양 관련 항원에 특이적으로 결합한다.
또한, 제1 링커 모이어티 A가 Ab에서 싸이올기 또는 아미노기에 공유 결합 된 기를 함유한다.
또한, 제1 링커 모이어티 A는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
또한, 제2 링커 모이어티 L이 C1-C9 알킬, C2-C9 알케닐, C2-C9 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴,
Figure pct00161
, O, S,
Figure pct00162
NR6
Figure pct00163
,
Figure pct00164
C (=O)
Figure pct00165
,
Figure pct00166
C (=O) O
Figure pct00167
,
Figure pct00168
C (=O) NR6
Figure pct00169
,
Figure pct00170
C=NR6
Figure pct00171
,
Figure pct00172
C (=S) O
Figure pct00173
,
Figure pct00174
C (=S) NR6
Figure pct00175
,
Figure pct00176
C (=S) S
Figure pct00177
,
Figure pct00178
NR6 (C=O)
Figure pct00179
,
Figure pct00180
NR6 (C=S) NR7
Figure pct00181
,
Figure pct00182
O (C=O) NR6
Figure pct00183
,
Figure pct00184
S (=O) 2
Figure pct00185
, Val-Val-PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys (Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys (Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB, Ala-PAB, PAB 및 이들의 조합이거나 존재하지 않고, 여기서 R6, R7은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택되며, e는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
바람직하게, 제2 링커 모이어티 L이 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00186
Figure pct00187
Figure pct00188
Figure pct00189
Figure pct00190
Figure pct00191
Figure pct00192
또한, 상기 약물 모이어티는 세포독성 약물, 세포 분화 인자, 줄기세포 영양 인자, 스테로이드 약물, 자가면역질환 치료용 약물, 항 염증 약물, 또는 감염질환 치료용 약물로부터 선택된다.
또한, 상기 약물 모이어티는 튜불린 억제제 또는 DNA 손상제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 튜불린 억제제는 돌라스타틴, 아우리스타틴, 메이탄신을 포함하지만, 이에 제한되지 않고; 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 안트라마이신 유도체 PBD, 캄프토테신 유도체 (바람직하게 캄프토테신 유도체 SN-38), 토포아이소머라아제 I 억제제 (즉, Dxd)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 약물 모이어티는 아마니틴, 안트라사이클린, 바카틴, 캄프토테신, 세마도틴, 콜히친, 콜시미드, 콤브레타스타틴, 크립토피신, 디스코더몰리드, 도세탁셀, 독소루비신, 에키노마이신, 엘레우테로빈, 에포틸론, 에스트라무스틴, 렉시트로프신, 메이탄신, 메토트렉세이트, 넷롭신, 퓨로마이신, 리족신, 탁산, 튜불리신, 또는 빈카알칼로이드, 비타민 A 전구체, 엽산, 캄프토테신 유도체 SN-38, 토포아이소머라아제 I 억제제 (즉, Dxd)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 상기 약물 모이어티 D는 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00193
Figure pct00194
Figure pct00195
Figure pct00196
Figure pct00197
Figure pct00198
Figure pct00199
Figure pct00200
Figure pct00201
.
몇몇 바람직한 실시예에서, 항체-약물 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00202
Figure pct00203
Figure pct00204
Figure pct00205
Figure pct00206
Figure pct00207
Figure pct00208
Figure pct00209
Figure pct00210
Figure pct00211
Figure pct00212
Figure pct00213
Figure pct00214
Figure pct00215
Figure pct00216
Figure pct00217
.
상기에서:
상기 항체 또는 항체의 기능적 단편인 Ab는 세포 표면 수용체 및 종양 관련 항원에 대한 항체이며;
n1, n2, n3은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4로부터 선택되고; n1, n2, n3은 동시에 0이 아니고 n1+n2+n3≤4이며;
n4, n5, n6, n7은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4로부터 선택되고; n4, n5, n6, n7은 동시에 0이 아니고, n4+n5+n6+n7≤4이며;
n8, n9는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4로부터 선택되고; n8, n9는 동시에 0이 아니고 n8+n9≤4이며;
m1, m2, m3은 각각 독립적으로 0, 1, 2로부터 선택되고; m1, m2, m3 중 적어도 하나는 0이지만 m1, m2, m3은 동시에 0이 아니며, m1+m2+m3≤2이고;
m4, m5는 각각 독립적으로 0, 1, 2로부터 선택되며; m4, m5는 동시에 0이 아니며, m4+m5≤2이다.
더욱이, 상기 항체-약물 컨쥬게이트가 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00218
Figure pct00219
Figure pct00220
Figure pct00221
Figure pct00222
Figure pct00223
Figure pct00224
Figure pct00225
Figure pct00226
Figure pct00227
Figure pct00228
Figure pct00229
Figure pct00230
Figure pct00231
Figure pct00232
Figure pct00233
,
상기에서:
상기 Ab는 세포 표면 수용체 및 종양 관련 항원에 대한 항체이고;
n10은 0,1,2,3 또는 4이며;
m6은 0, 1 또는 2이다.
또한, 상기 항체-약물 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00234
Figure pct00235
Figure pct00236
Figure pct00237
Figure pct00238
Figure pct00239
Figure pct00240
Figure pct00241
Figure pct00242
Figure pct00243
Figure pct00244
Figure pct00245
Figure pct00246
Figure pct00247
Figure pct00248
Figure pct00249
상기에서:
상기 Ab는 세포 표면 수용체 및 종양-관련 항원에 대한 항체이고;
n11은 0,1,2,3 또는 4이며;
m7은 0, 1 또는 2이다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에서의 본 발명에 기재된 바와 같은 임의의 링커의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 암, 자가 면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트 또는 본 발명에 기재된 임의의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
도 1a는 항체-약물 컨쥬게이트 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE의 HIC-HPLC 크로마토그램을 나타낸다 (커플링 반응 동안 약물의 추가된 항체의 티올 그룹에 대한 몰비는 5:1이다).
도 1b는 항체-약물 컨쥬게이트 Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE의 HIC-HPLC 크로마토그램을 나타낸다 (커플링 반응 동안 약물의 추가된 항체의 티올 그룹에 대한 몰비는 5:1이다).
도 1c는 항체-약물 컨쥬게이트 Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE의 HIC-HPLC 크로마토그램을 나타낸다 (커플링 반응 동안 약물의 추가된 항체의 티올 그룹에 대한 몰비는 5:1이다).
도 1d는 항체-약물 컨쥬게이트 Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE의 HIC-HPLC 크로마토그램을 나타낸다 (커플링 반응 동안 약물의 추가된 항체의 티올 그룹에 대한 몰비는 5:1이다).
도 2a는 Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 완충액은 각각 pH 8.5, 9.0, 및 7.4를 가진다), Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 완충액은 각각 pH 8.5, 9.0, 및 7.4를 가진다), Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 완충액은 각각 pH 8.5, 9.0, 및 7.4를 가진다) (커플링 완충액은 pH 9.0 을 가진다)의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 2b는 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 완충액은 pH 9.0 을 가진다)의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 나타낸다..
도 3은 ELISA 방법에 의해 측정된 항체-약물 컨쥬게이트의 항원에 대한 친화도 곡선을 나타낸다(항체-약물 컨쥬게이트는 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 및 Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE이고; Her2 antibody and Her2-Mc-Val-Cit-PAB-MMAE는 음성 및 양성 대조군 임). 여기서 가로 좌표는 농도이고 세로 좌표는 흡광 밀도(optical density absorption)이다.
도 4a는 항체-약물 컨쥬게이트 (Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE)의 인간 유방암 SK-BR-3 세포에 대한 증식 억제율 곡선을 나타낸다.
도 4b는 항체-약물 컨쥬게이트 (Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE)의 인간 유방암 SK-BR-3 세포에 대한 증식 억제율 곡선을 나타낸다.
도 5는 항체(Ab) 및 제1 링커 모이어티(A)의 컨쥬게이트 (Ab-A)의 커플링 결과를 나타낸다. 1, 2, 3은 Her2-A'-7이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다; 4, 5, 6은 Her2-A'-8이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다; 7, 8, 9는 Her2-A'-10이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다; 10, 11, 12는 Her2-A'-11이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다; 13, 14, 15는 Her2-A'-12이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다; 16, 17, 18은 Her2-A'-20이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다; 19, 20, 21은 Her2-A'-28이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다; 22, 23, 24는 Her2-A'-31이고 각각의 커플링 완충액은 pH 8.5, 9.0, 7.4이다.
도 6a는 네이키드 항체 (클라우딘 18.2 항체)의 LC-MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 6b는 클라우딘 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE의 LC-MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 7a는 네이키드 항체 (클라우딘 18.2 항체)의 등전점 분포 맵을 나타낸다.
도 7b는 클라우딘 18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE의 등전점 분포 맵을 나타낸다.
본 발명의 구현예는 구체적인 실시예를 통해 아래에서 상세히 설명되지만, 어떠한 경우에도 본 발명을 제한하는 것으로 해석 될 수 없다.
[정의]
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
수치 범위 및 매개 변수 근사값은 본 발명의 넓은 범위에 표시되지만, 구체적인 실시예에 표시된 수치는 가능한 한 정확하게 기록된다. 그러나 모든 수치는 본질적으로 측정의 표준 편차로 인해 발생하는 특정 오류를 포함 할 수밖에 없다.
또한, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 그 안에 포함 된 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 기록 된 "1-10"의 범위는 최소값 1과 최대 값 10 (끝점 포함) 사이에 포함 된 모든 하위 범위, 즉 최소값 1 이상의 값으로 시작하는, 예를 들어, 1 ~ 6.1, 및 최대 값 10 이하의 값으로 끝나는, 예를 들어 5.5 ~ 10, 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, "본 명세서에 포함 된"으로 언급 된 모든 참조는 그 전체가 포함 된 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서 사용되는 기호 "
Figure pct00250
"는 "
Figure pct00251
"를 포함하는 그룹이 화학 결합을 통하여 다른 그룹과 링크되었음을 말한다.
본 발명에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중 특이적 항체 (예 : 이중 특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 특히, 본원에서 사용되는 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2 개 이상의 중쇄 (H) 및 2 개의 경쇄 (L)를 함유하는 단백질을 의미한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (약칭 VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.
중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3 개의 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)이라고하는 높은 가변성을 가진 여러 영역으로 더 세분화 될 수 있고, 프레임 워크 영역 (FR)이라는 보다 보수적인 영역 사이에 배치된다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 다음 순서로 배열 된 3 개의 CDR과 4 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 이러한 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다.
항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (이펙터 세포와 같은) 및 고전적 보체 시스템의 제 1 성분 (Clq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역 글로불린의 결합을 매개 할 수있다. 키메라 또는 인간화 항체도 본 발명에 따른 항체에 포함된다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간 항체로부터 유래 된 CDR 영역을 포함하는 항체를 지칭하고, 항체 분자의 다른 모이어티는 하나 (또는 여러) 인간 항체로부터 유래된다. 또한 결합 친화도를 유지하기 위해 프레임 워크 영역 (FR이라고 함)의 일부 잔기를 수정할 수 있다. (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988). 본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지 된 기술에 의해 제조 될 수 있다(예를 들어, Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992 문서에 기재된 방법으로).
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종에서 유래하고 불변 영역 서열이 다른 종에서 유래된 항체를 지칭한다. 예를 들어, 가변 영역 서열은 마우스 항체에서 유래하고 불변 영역 서열은 인간 항체에서 유래한다. 본 발명에 따른 키메라 항체 또는 이의 단편은 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수있다. 예를 들어, 키메라 항체는 재조합 DNA를 클로닝하여 생산할 수 있으며, 재조합 DNA는 프로모터와 본 발명에 따른 비인간, 특히 마우스의 모노클로날 항체의 가변 영역을 코딩하는 서열 및 인간 항체의 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 이 재조합 유전자에 의해 코딩되는 본 발명의 키메라 항체는 예를 들어, 마우스-인간 키메라가 될 것이다. 이 항체의 특이성은 마우스 DNA에서 유래한 가변 영역에 의해 결정되고 그의 아이소 타입은 인간 DNA에서 유래한 불변 영역에 의해 결정된다. 키메라 항체를 제조하는 방법에 관해서는 예를 들어, 문헌 Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)를 참고 바람.
용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성을 갖는 항체 분자의 제조 생성물을 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친 화도를 나타낸다.
본 발명에서 용어 "기능성 단편"은 항체 단편이 그것이 유래된 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 사슬의 부분 서열로 구성되거나 이를 포함함을 의미한다. 부분 서열은 그것이 유래된 항체와 동일한 결합 특이성 및 충분한 친화도를 유지하기에 충분하며, 바람직하게는 그것이 유래 된 항체의 친화도의 적어도 1/100 이상, 보다 바람직하게는 1/10 이상이다. 이 기능적 단편은 그것이 유래 된 항체 서열의 적어도 5 개의 아미노산, 바람직하게는 10, 15, 25, 50 및 100 개의 연속적인 아미노산을 포함할 것이다.
본 발명에서 약물 대 항체 비율이라고도 하는 용어 "DAR"은 항체-약물 컨쥬게이트의 고유한 품질 속성이다. 높은 DAR 값은 ADC의 안전성에 영향을 미칠 수 있으며 처리 범위(treatment window)가 좁다. DAR 값이 낮으면 ADC의 효능이 저하될 수 있지만 안전성이 강하고 처리 범위(treatment window)가 넓다. 가장 좋은 평균 DAR 값 범위는 2-4이다.
본 발명에서 용어 "링커"는 항체 및 약물의 항체/기능성 단편과 각각 반응하여 둘을 연결하는 "다리" 역할을 할 수있는 화합물을 의미한다. 본 발명에 관련된 "링커"는 제1 링커 모이어티 및 제2 링커 모이어티를 포함한다.
본 발명에서 용어 "제1 링커 모이어티"는 동일하거나 상이한 2개의 연결기(linking groups)를 포함한다. 연결기는 항체의 항체/기능성 단편의 사슬 간 티올기(들) 또는 아미노기(들)에 동시에 공유적으로 연결될 수 있으며, 연결기는 티올기(들) 또는 아미노기(들)에 공유적으로 연결될 수 있는 임의의 기능기이다.
본 발명에서 용어 "제2 링커 모이어티"는 약물과의 커플링에 사용되며, 이는 임의의 절단 가능하거나 또는 절단 불가능한 링커이다. 절단 가능한 링커는 세포질 내 환원 과정, 리소좀의 산성 조건에 대한 노출 또는 세포 내 특정 프로테아제에 의한 절단과 같은 세포 내 과정에 따라 독소를 방출한다. 절단 불가능한 링커는 ADC 항체 모이어티의 단백질이 분해된 후에만 약물을 방출 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "약물"은 일반적으로 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하기 위해 원하는 생물학적 활성을 갖고 반응성 작용기를 갖는 임의의 화합물을 지칭한다. 원하는 생물학적 활동에는 인간 또는 기타 동물 질병의 진단, 치료, 완화, 치료, 예방이 포함된다. 신약의 지속적인 발견과 개발에 따라 이들 신약도 본 발명의 약에 포함되어야 한다. 구체적으로, 약물은 세포 독성 약물, 세포 분화 인자, 줄기 세포 영양 인자, 스테로이드 약물, 자가 면역 질환 치료용 약물, 항염증 약물 또는 감염 질환 치료용 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 약물은 튜불린 억제제 또는 DNA, RNA 손상제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 약물은 다음으로부터 선택된다:
돌라스타틴 펩타이드(dolastatin peptide), 비타민 A 전구체(vitamin A precursors), 엽산(folic acid), 캄토테신 유도체(camptothecin derivatives) 뿐만 아니라, 메이탄신 화합물(maytansine compounds), V-ATPase 억제제(V-ATPase inhibitors), 프로-아폽토틱 제제(pro-apoptotic agents), Be 12 억제제(Be 12 inhibitors), McL1 억제제(McL1 inhibitors), HSP90 억제제(HSP90 inhibitors), IAP 억제제(IAP inhibitor), mTOr 억제제(mTOr inhibitors), 미세소관 안정화제(microtubule stabilizers), 미세소관 불안정화제(microtubule destabilizers), 오리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), MetAP (methionine aminopeptidase), CRM1 단백질의 핵수출 억제제(nuclear export inhibitors of protein CRM1), DPPIV 억제제(DPPIV inhibitors), 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitors), 미토콘드리아 내 포스포릴 전달 반응 억제제(inhibitors of phosphoryl transfer reaction in mitochondria), 단백질 합성 억제제(protein synthesis inhibitors), 키나아제 억제제(kinase inhibitors), CDK2 억제제(CDK2 inhibitors), CDK9 억제제(CDK9 inhibitors), 키네신 억제제(kinesin inhibitors), HDAC 억제제(HDAC inhibitors), DNA 손상제제(DNA damaging agents), DNA 알킬화제(DNA alkylating agents), DNA 인터칼레이터(DNA intercalators), DNA 마이너 그루브 결합제(A minor groove binder), DHFR 억제제(DHFR inhibitors).
본 발명의 바람직한 일부 구현예에 있어서, 약물은 세포독성 약물 (항대사물질, 항종양 제제, 항생제, 알칼로이드와 같은), 면역강화제 또는 방사성동위원소를 포함한다. 바람직하게는, 상기 약물은 아마니틴, 안트라사이클린, 바카틴(baccatins), 캄토테신, 세마도틴(cemadotins), 콜키친(colchicines), 콜키미드(colcimids), 캄브레타스타틴(combretastatins), 크립토피신(cryptophycins), 디스코더몰리드(discodermolides), 도세탁셀, 독소루비신, 에키토마이신(echinomycins), 엘류더로빈(eleutherobins), 에포틸론(epothilones), 에스트라무스틴(estramustines), 렉시트롭신(lexitropsins), 메이탄신(maytansines), 메토트렉세이트(methotrexate), 네트롭신(netropsins), 퓨로마이신(puromycins), 리족신(rhizoxins), 탁산(taxane), 튜뷸리신(tubulysins), 또는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids)로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 상기 "약물"은
MMAD (Monomethyl auristatin D) 및 그의 유도체, MMAE (Monomethyl auristatin E) 및 그의 유도체, MMAF (Monomethyl auristatin F) 및 그의 유도체, 메이탄신 유도체 DM1 (maytansine derivatives DM1 (Mertansine derivative M1)), 메이탄신 유도체 DM4 (maytansine derivatives DM4 (Mertansine derivative M4)), 듀오카르마이신 및 그의 유도체(Duocarmycine and its derivatives),
칼리키아마이신 및 그의 유도체 Calicheamicin and its derivatives), PBDA (Pyrrolobenzodiazepines), 독소루비신, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 다우노루비신 및 그의 유도체(Daunorubicin and its derivatives), 튜불리신 및 그의 유도체 (tubulysins and its derivatives), 캄토테신 유도체 SN-38(camptothecin derivatives SN-38), 토포아이소머라제 I 억제제(topoisomerase I inhibitors (즉, Dxd))으로부터 선택된다.
일부 구체적인 구현예에 있어서, 상기 "약물"은 다음의 물질 및 그들의 유도체일 수 있다:
메이탄신(Maytansine):
Figure pct00252
메이탄시노이드 유도체(Maytansinoid derivatives):
Figure pct00253
안사미토신 유도체 (Ansamitocin derivatives):
Figure pct00254
아라니닐 메이탄시놀(Alaninyl maytansinol):
Figure pct00255
MMAE:
Figure pct00256
MMAD:
Figure pct00257
MMAF:
Figure pct00258
튜불리신 D(Tubulysin D):
Figure pct00259
칼리치아마이신(Calicheamicin):
Figure pct00260
독소루비신:
Figure pct00261
피롤로벤조다이아제핀 유도체(Pyrrolobenzodiazepine derivatives):
Figure pct00262
비타민 A 전구체 (Vitamin A precursor):
Figure pct00263
엽산:
Figure pct00264
토포아이소머라제 I 억제제 (즉, Dxd):
Figure pct00265
본 발명에서 용어 "항체-약물 컨쥬게이트"는 항체/항체의 기능적 단편, 링커 (제1 링커 모이어티, 제2 링커 모이어티) 및 약물 모이어티를 화학 반응을 통해 함께 연결하여 얻은 화합물을 의미한다. 본 발명에 포함 된 항체-약물 컨쥬게이트는 여전히 혼합물이지만, 전통적인 방식으로 얻은 컨쥬게이트에 비해 DAR 분포 범위가 매우 좁고 최상의 항체-약물 컨쥬게이트는 평균 DAR 값 범위가 2-4이다. 본 발명에 따른 항체-약물 컨쥬게이트의 제조와 관련하여,제1 링커 모이어티 (A) 및 제2 링커 모이어티-약물 컨쥬게이트 (L-D)의 컨쥬게이트 (A-L-D)가 (실시예에서 제공된 claudin18.2 항체와 같은) 항체와 결합 될 때, 그것은 쉬운 가수 분해 조건 하에서 가수 분해 될 수 있고, 가수 분해 부위는 제1 링커의 말레이미드 모이어티에 있다. Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE (1 개의 항체가 4 개의 약물과 결합된 경우)를 예로 들면, Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE 컨쥬게이트가 4 개의 가수 분해를 겪을 때 구조 다이어그램은 다음과 같다:
Figure pct00266
또는
Figure pct00267
Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE 컨쥬게이트가 7개의 가수분해를 겪을 때 구조 다이어그램은 다음과 같다:
Figure pct00268
Ab-A'-7-VC-PAB-MMAE 컨쥬게이트가 8개의 가수분해를 겪을 때 구조 다이어그램은 다음과 같다:
Figure pct00269
본 발명에서 용어 "약제학적 조성물"은 적어도 하나의 약물 및 선택적으로 특정 목적을 달성하기 위해 조합되는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제의 조합을 지칭한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 함께 작용할 수 있는 한, 시간 및/또는 공간에서 분리되는 성분의 조합을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물에 함유된 성분은 전체로서 또는 개별적으로 대상체에게 투여 될 수있다. 약제학적 조성물에 포함된 성분을 대상체에게 별도로 투여하는 경우, 성분을 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여 할 수 있다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 완충 수용액, PBS (인산염 완충액)와 같은 등장성 염 용액, 글루코스, 만니톨, 덱스트로 글루코스, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘, 0.3 % 글리세롤, 히알루론산, 에탄올 또는 폴리프로필렌 글리콜, 트리글리세리드 등과 같은 폴리알킬렌 글리콜이다. 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체의 유형은 특히 본 발명에 따른 조성물이 경구, 비강, 피내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 투여 용으로 제형화되었는지에 따라 달라진다. 본 발명에 따른 조성물은 첨가제로서 습윤제, 유화제 또는 완충 물질을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물, 백신 또는 약제학적 제제는 경구, 비강, 피내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 투여와 같은 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어 "알킬"은 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 (즉, 이중 결합 또는 삼중 결합이 없음)를 의미한다. 알킬기는 1 내지 9 개의 탄소 원자를 가질 수있다 (본 발명에서 나타날 때, "1 내지 9"의 수치 범위는 이 범위의 임의의 정수를 의미하고, 예를 들어, "1 내지 9 개의 탄소 원자"는 알킬기가 1 개의 탄소 원자, 2 개의 탄소 원자, 3 개의 탄소 원자, ..., 최대 9 개의 탄소 원자를 포함 할 수 있음을 의미한다. 동시에 알킬의 정의에는 지정된 사슬 길이가 없는 알킬기가 포함된다.) 알킬기는 1 내지 9 개의 탄소 원자를 함유하는 중간 크기의 알킬기일 수 있다. 전형적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소 프로필, 부틸, 이소 부틸, tert- 부틸, 펜틸, 헥시 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "알케닐"은 하나 또는 다중 이중 결합을 포함하는 선형 또는 분지형 탄화수소를 의미한다. 알케닐 그룹은 2 ~ 9 개의 탄소 원자를 가질 수 있으며 지정된 사슬 길이가 없는 알케닐 그룹도 포함한다. 알케닐 그룹은 2 내지 9 개의 탄소 원자를 포함하는 중간 크기의 알케닐 그룹 일 수있다. 알케닐 그룹은 또한 2 내지 4 개의 탄소 원자를 함유하는 소형 알케닐 그룹 일 수있다. 알케닐 그룹은 "C2-4 알케닐"또는 유사한 디자인으로 디자인 될 수 있다.
예를 들어, "C2-4 알케닐"은 알케닐 사슬에 2-4 개의 탄소 원자가 있음을 의미한다. 즉, 알케닐 사슬은 다음으로부터 선택 될 수 있다:
에테닐, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 프로펜-3-일, 부텐-1-일, 부텐-2-일, 부텐-3-일, 부텐-4-일, 1-메틸-프로펜-1-일, 2-메틸-프로펜-1-일, 1-에틸-에텐-1-일, 2-메틸-프로펜-3-일, 부타-1,3-디에닐, 부타-1,2-디에닐, 부타-1,2-디엔-4-일. 전형적인 알케닐은 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 선형 또는 분 지형 탄화수소를 의미한다. 알키닐 그룹은 2~9 개의 탄소 원자를 가질 수 있으며 특정 사슬 길이가 없는 알키 닐 그룹도 포함한다. 알키닐 그룹은 2 내지 9 개의 탄소 원자를 함유하는 중간 크기의 알키닐 그룹 일 수있다. 알키닐 그룹은 또한 2 내지 4 개의 탄소 원자를 함유하는 저급 알키닐 그룹 일 수 있다. 알키닐 그룹은 "C2-4 알키닐"또는 유사한 디자인으로 설계될 수 있다. 예를 들어, "C2-4 알키닐"은 알키닐 사슬에 2-4 개의 탄소 원자가 있음을 의미한다. 즉, 알키닐 사슬은 다음으로부터 선택 될 수 있다:
에티닐, 프로핀-1-일, 프로핀-2-일, 부틴-1-일, 부틴-2-일, 부틴-3-일 및 2-부티닐. 전형적인 알키닐은 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "아릴"은 공액 p- 전자 시스템을 갖는 고리 또는 고리 시스템을 지칭하며, 카보사이클릭 아릴(carbocyclic aryl) (예 : 페닐) 및 헤테로 사이 클릭 아릴 (예 : 피리딘)을 포함한다. 이 용어는 단일 고리 또는 다중 융합 고리 (즉, 인접한 원자 쌍을 공유하는 고리)를 가진 그룹을 포함하며 전체 고리 시스템은 방향족이다.
본 발명에서 용어 "헤테로 아릴"은 하나 또는 다중의 헤테로 원자를 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템 (즉, 2 개의 인접한 원자를 공유하는 2 개 또는 다중 융합 고리)을 지칭한다. 즉, 탄소 이외에, 고리 골격은 질소, 산소, 황 및 기타 원소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 헤테로 아릴이 고리 시스템인 경우 시스템의 각 고리는 방향족이다. 헤테로 아릴은 5-18 개의 고리 구성원 (즉, 탄소 원자 및 헤테로 원자의 수를 포함하여 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수있다. 현재 정의에는 지정된 고리 크기가 없는 헤테로 아릴 그룹도 포함된다. 헤테로 아릴의 예는 푸릴(furyl), 티에닐(thienyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 피리딜(pyridyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 트리아지닐(triazinyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 트리아지닐(triazinyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 이소퀴놀리닐(isoquinolinyl), 벤지미다졸릴(benzimidazolyl), 벤족사졸릴(benzoxazolyl), 벤조티아졸릴(benzothiazolyl), 인돌릴(indolyl), 이소인돌릴(isoindolyl), 벤조티에닐(benzothienyl)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "사이클로 알킬"은 완전히 포화된 카보사이클릭 또는 고리 시스템을 의미한다. 예는 시클로 프로필, 시클로 부틸, 시클로 펜틸, 시클로 헥실을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "(헤테로 사이클릴) 알킬"은 알킬렌을 통해 다른 그룹에 연결된 치환기로서 헤테로 사이클릴을 의미한다. 예는 이미다졸리닐 메틸(imidazolinyl methyl) 및 인돌리닐 에틸(indolinyl ethyl)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "헤테로 사이클릴(heterocyclyl)"은 골격에 하나 이상의 헤테로 원자를 함유하는 비 방향족 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로 사이클릴(heterocyclyl)은 융합 고리, 다리 걸친 고리(bridged ring) 또는 스피로 고리의 형태로 연결될 수 있다. 헤테로 사이클릴 고리 시스템에서 적어도 하나의 고리는 비 방향족이고 임의의 정도의 포화도를 가질 수 있다. 헤테로 원자는 고리계의 비 방향족 또는 방향족 고리에 위치할 수 있다. 헤테로 사이클릴은 3 내지 20개의 고리 원자 (즉, 탄소 원자 및 헤테로 원자의 수를 포함하여 고리 골격을 구성하는 원자의 수)를 가질 수 있다. 현재 정의에는 지정된 범위의 고리 번호가 없는 헤테로 사이클릴 그룹도 포함된다. 헤테로 사이클릴 그룹은 3 내지 10 개의 고리 원자를 포함하는 중간 크기의 헤테로 사이클릴 그룹일 수 있다. 헤테로 사이클릴 그룹은 또한 3 내지 6 개의 고리 원자를 함유하는 작은 크기의 헤테로 사이클릴 그룹일 수 있다.
헤테로사이클릴의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다:
아제피닐(azepinyl), 아크리디닐(acridinyl), 카르바졸릴(carbazolyl), 신놀리닐(cinnolinyl), 디옥솔라닐(dioxolanyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 이미다졸리디닐(imidazolidinyl), 모포리닐(morpholinyl), 옥시라닐(oxiranyl), 옥세파닐(oxepanyl), 티에타닐(thietanyl), 피페리디닐(piperidinyl), 피페라지닐(piperazinyl), 피라졸리닐(pyrazolinyl), 피라놀리디닐(pyrazolidinyl), 1,3-디옥시닐(1,3-dioxinyl), 1,3-디옥사닐(1,3-dioxanyl), 1,4-디옥시닐(1,4-dioxinyl), 1,4-디옥사닐(1,4-dioxanyl), 1,3-옥사티아닐(1,3-oxathianyl), 1,4-옥사티아닐(1,4-oxathianyl), 1,4-옥사티아닐(1,4-oxathianyl), 2H-1,3-디옥솔라닐(2H-1,3-dioxolanyl), 1,3-디티올라닐(1,3-dithiolanyl), 1,3-디티올라닐(1,3-dithiolanyl), 이속사졸리닐(isoxazolinyl), 이속사졸리디닐(isoxazolidinyl), ㅇ옥사졸리닐(oxazolinyl), 옥사졸리디닐(oxazolidinyl), 옥사졸리디논(oxazolidinone), 옥사졸리디논(oxazolidinone), 티아졸리디닐(thiazolidinyl), 1,3-옥사티올릴(1,3-oxathiolyl), 인돌리닐(indolinyl), 이소인돌리닐(isoindolinyl), 테트라하이드로퓨라닐(tetrahydrofuranyl), 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl), 테트라하이드로티에닐(tetrahydrothienyl), 테트라하이드로티오피라닐(tetrahydrothiopyranyl), 테트라하이드로-1,4-티아지닐(tetrahydro-1,4-thiazinyl), 티오모포리닐(thiomorpholinyl), 다이하이드로벤조퓨라닐(dihydrobenzofuranyl), 벤지미다졸리디닐(benzimidazolidinyl) 및 테트라하이드로퀴놀리닐(tetrahydroquinolinyl).
[실시예]
일반적 방법 A: 브로모말레이미드(bromomaleimide) 링커의 일반적 합성 방법
Figure pct00270
아민 및 이의 염 또는 Boc 보호-유도체 (1 eq) 및 무수아세트산나트륨 (2.5 eq)을 아세트산 (1 mmol/2 mL)에 용해시키고, 50-100℃까지 가열시킨 다음, 브로모말레산무수물(2.5 eq)을 빠르게 첨가하고, 50-100℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 용액을 45℃로 냉각시키고, 감압하에서 농축한 후, 잔류물에 에틸 아세테이트를 첨가하고, 세척, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 순상 컬럼 크로마토그래피(normal phase column chromatography) 또는 역상 분취 액체 크로마토그래피(reversed phase preparative liquid chromatography)로 정제하여 목적(target) 생성물을 수득하였다.
일반적 방법 B: 싸이오페놀 말레이미드(thiophenol maleimide) 링커의 일반적 합성 방법
Figure pct00271
브로모말레이미드 링커 (1.0 eq)를 무수 DMF (1 mmol/5 mL)에 용해시키고, 여기에 피리딘 (3.0 eq)을 첨가한 다음, 실온에서 5-10 분 동안 교반하였다. 싸이오페놀산나트륨 (2.1 eq)을 무수 DMF (1 mmol/1 mL)에 용해시키고, 반응 용액에 적가하였다. 그 후, 실온에서 0.5-5 시간 동안 계속 교반하였다. 반응이 완료된 후, 5 배 부피의 증류수를 첨가하고, 고체를 석출시킨 후, 여과, 세척, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 순상 컬럼 크로마토그래피 또는 역상 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물을 수득하였다.
실시예 1: A'-1의 합성
Figure pct00272
일반적 방법 A에 따라, 300 mg의 화합물 1 (i.e., 3, 5-다이아미노벤조산)을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물 A'-1을 수득하였다. LC-MS (ESI+) 468.9 [M+H]+.
실시예 2: A'-4의 합성
Figure pct00273
일반적 방법 B에 따라, 100 mg의 화합물 A'-1을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물 A'-4를 수득하였다. LC-MS (ESI+) 529.0 [M+H]+.
실시예 3: A'-2의 합성
Figure pct00274
화합물 2 (1 mol)를 에탄올 및 물의 혼합물에 용해시키고, 교반하고, 환원철 분말 (5 mol), 염화암모늄 (3 mol)을 한 번에 첨가한 후, 80℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 실온까지 냉각시키고, 여과하여 고체를 제거한 후, 감압 증류로 용매를 제거하여 화합물 3을 수득하였다. LC-MS m/z (ES+), 154.05 (M+H) +.
일반적 방법 A에 따라, 화합물 3 (1 mol)을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 80℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물 A'-2를 수득하였다. LC-MS m/z (ES+), 471.85 (M+H) +.
실시예 4: A'-7의 합성
Figure pct00275
화합물 5 (Boc-이미다졸, 2.37 g, 14.1 mmol)를 톨루엔 30 mL 에 용해시키고, 실온에서 화합물 4 (다이에틸렌트라이아민, 0.66 g, 6.41 mmol)를 첨가한 후, 60℃에서 6 시간 동안 가열 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 증류하여 오일성 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 다이클로로메탄 40 mL에 용해시키고, 물 (40 mLХ3)로 세척, 건조, 여과 및 농축하여 1.84 g의 화합물 6을 95%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 304.2 [M+H]+.
화합물 6 (3.3 g, 10.89 mmol)을 무수 톨루엔 30 mL에 용해시키고, 화합물 7 (숙신산무수물, 1.3 g, 13 mmol)을 첨가한 후, 60℃에서 밤새 가열 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 증류하여 톨루엔을 제거하고, 잔류물을 다이클로로메탄 20 mL에 용해시킨 후, 물 (20 mLХ2)로 세척하고, 포화 NaCl (20 mLХ1)로 세척, 건조, 여과 및 감압 증류하여 3.5 g의 화합물 8을 80%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 404.3 [M+H]+.
일반적 방법 A에 따라, 100 mg의 화합물 8을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 25.8 mg의 목적 화합물 A'-7을 20%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 519.9 [M+H]+.
실시예 5: A'-8의 합성
Figure pct00276
화합물 9 (1,3-다이아미노프로판올, 5.0 g, 55.47 mmol)를 THF 50 mL 및 물 20 mL에 교반하면서 용해시켰다. THF 30 mL 중 Boc2O (25.4 g, 116.5 mmol, 2.1 eq) 용액을 실온에서 적가하였다. 그 후, 반응 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물에 석유 에테르 30 mL를 첨가하고, 실온에서 20 분 동안 교반하여 백색 고체를 석출한 후, 여과 및 건조하여 14.7 g의 백색 화합물 10을 91%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 291.2 [M+H]+.
화합물 10 (14.7 g, 50.64 mmol)을 무수 THF 100 mL에 교반하면서 용해시키고, 얼음 바스(ice bath)에서 냉각시켰다. 그 다음, NaH (4.8 g, 202.55 mmol, 4 eq)를 일괄적으로 첨가하고, 10 분 동안 교반하였다. THF 50 mL 중 화합물 11 (tert-뷰틸 브로모아세테이트, 24.7 g, 126.6 mmol, 2.5 eq) 용액을 적가하였다. 그 후, 반응 용액을 40℃까지 가열하고, 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 실온까지 냉각시키고, 에틸 아세테이트 250 mL로 희석한 후, 다량의 기포가 생기지 않을 때까지 얼음물(ice-water)을 천천히 첨가한 다음, 액체 분리(liquid separation)를 수행하였다. 수상을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 결합, 세척, 건조 및 농축하였다. 잔여물에 석유 에테르 50 mL를 첨가하고, 실온에서 20 분 동안 교반하여 백색 고체를 석출한 후, 여과 및 건조하여 12.1 g의 백색 화합물 12를 60%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 404.1 [M+H]+.
화합물 12 (12.1 g, 30.0 mmol)를 무수 DCM 120 mL에 교반하면서 용해시킨 다음, 1,4-다이옥산 중 염화수소 용액 (4 M, 45 mL, 180 mmol)을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 메틸 tert-뷰틸 에터 30 mL로 초음파 분산시키고, 상층액을 제거하여 원심분리한 다음, 석유 에테르 30 mL로 분산시키고, 상층액을 제거하여 원심분리하였다. 고체를 감압 증류하여 용매를 제거하고, 7.7 g의 백색 화합물 13을 100%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 148.1 [M+H]+.
일반적 방법 A에 따라, 1.2 g의 화합물 13을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 85℃에서 5 시간 동안 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 890 mg의 목적 화합물 A'-8을 35%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 464.9 [M+H]+.
실시예 6: A'-9의 합성
Figure pct00277
일반적 방법 A에 따라, 500 mg의 화합물 14 (2, 3-다이아미노프로피온산)를 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 240 mg의 목적 화합물 A'-9를 23%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 420.9 [M+H]+.
실시예 7: A'-10의 합성
Figure pct00278
일반적 방법 B에 따라, 104 mg의 화합물 A'-7을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 실온에서 2.5 시간 동안 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 27.7 mg의 목적 화합물 A'-10을 24%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 596.1 [M+H]+.
실시예 8: A'-11의 합성
Figure pct00279
일반적 방법 B에 따라, 600 mg의 화합물 A'-8 을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 실온에서 2.5 시간 동안 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 203 mg의 목적 화합물 A'-11을 30%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 525.1 [M+H]+.
실시예 9: A'-12의 합성
Figure pct00280
일반적 방법 B에 따라, 120 mg의 화합물 A'-9를 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 실온에서 0.7 시간 동안 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 30 mg의 목적 화합물 A'-12를 22%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 481.0 [M+H]+.
실시예 10: A'-13의 합성
Figure pct00281
일반적 방법 A에 따라, 500 mg의 화합물 15 (L-라이신)를 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 410 mg의 목적 화합물 A'-13을 26%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 462.9 [M+H]+.
실시예 11: A'-14의 합성
Figure pct00282
화합물 16 (500 mg, 2.03 mmol)을 THF 1 mL 및 포화 NaHCO3 수용액 1 mL를 첨가하여 교반하면서 용해시키고, 얼음 바스에서 5 분 동안 교반하였다. 그 다음, 화합물 17 (724.4 mg, 4.67 mmol)을 천천히 일괄적으로 첨가하고, 얼음 바스에서 40 분 동안 교반한 다음, 실온에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 회전 증발시켜 THF를 제거하고, 메탄올 1 mL로 희석하고, 분취 액체 크로마토그래피로 분리하여 245 mg의 화합물 18을 37%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 327.1 [M+H]+.
일반적 방법 A에 따라, 245 mg의 화합물 18을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 67 mg의 목적 화합물 A'-14를 23%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 462.9 [M+H]+.
실시예 12: A'-15의 합성
Figure pct00283
일반적 방법 A에 따라, 56.1 mg의 화합물 19 (Boc-4-아미노-L-페닐알라닌)를 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 17.9 mg의 목적 화합물 A'-15를 18%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 496.9 [M+H]+.
실시예 13: A'-16의 합성
Figure pct00284
일반적 방법 B에 따라, 218 mg의 화합물 A'-13을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 실온에서 0.7 시간 동안 수행되었다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 65 mg의 목적 화합물 A'-16을 26%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 523.1 [M+H]+.
실시예 14: A'-19의 합성
Figure pct00285
화합물 20 (140 mg, 0.5 mmol)을 다이클로로메탄 3 mL에 용해시키고, 트라이에틸아민 (210 μL, 1.5 mmol)을 첨가한 후, 얼음 바스에서 교반하였다. 화합물 21 (62.5 μL, 0.75 mmol)을 DCM 2 mL에 용해시키고, 반응 용액에 적가한 후, 얼음 바스에서 0.5 시간 동안 교반하고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 농축하였다. 잔류물을 아세토나이트릴에 용해시키고, 분취 액체 크로마토그래피로 분리하여, 93.5 mg의 화합물 22를 56.1%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 335.2 [M+H]+.
일반적 방법 A에 따라, 33.4 mg의 화합물 22를 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 7.5 mg의 목적 화합물 A'-19를 19.1%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 393.0 [M+H]+.
실시예 15: A'-20의 합성
Figure pct00286
화합물 23 (230 mg, 1 mmol)을 THF 3 mL에 용해시키고, 브로모말레산무수물 (354 mg, 2 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 회전 증발시켜 THF를 제거하여 화합물 24의 조 생성물을 수득하였다. 화합물 24를 아세트산무수물 3 mL에 용해시키고, 아세트산나트륨 (41 mg, 0.5 mmol)을 첨가한 후, 70℃에서 8 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 회전 증발시켜 용매를 제거하였다. 잔류물을 아세토나이트릴/물 (1:1) 4 mL에 용해시키고, 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여 70 mg의 화합물 25를 18%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 389.0 [M+H]+.
화합물 25 (99.2 mg, 0.32 mmol)에 1,4-다이옥산 중 염화수소 용액 (4M, 8 mmol) 2 mL를 첨가하고, 얼음 바스에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 회전 증발시켜 용매를 제거하였다. 잔류물을 다이에틸 에터 (5 mLХ3)로 세척, 건조시켜 64.1 mg의 화합물 26을 95.3%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 289.0 [M+H]+.
화합물 26 (21 mg, 0.1 mmol)을 다이클로로메탄 1 mL에 용해시키고, 트라이에틸아민 (42 μL, 0.3 mmol)을 첨가한 후, 얼음 바스에서 교반하였다. 화합물 21 (12.5 μL, 0.15 mmol)을 DCM 1 mL에 용해시키고, 반응 용액에 적가한 후, 얼음 바스에서 0.5 시간 동안 교반하고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 농축하였다. 잔류물을 아세토나이트릴에 용해시키고, 분취 액체 크로마토그래피로 분리하여 18.2 mg의 A'-20을 69.1%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 343.0 [M+H]+.
실시예 16: A'-26의 합성
Figure pct00287
화합물 27 (150 mg, 0.63 mmol, 1.0 eq)을 무수 THF 5 mL에 용해시키고, 그 다음 Ar 보호 하에 -5℃로 냉각시킨 후, 조심스럽게 BH3-THF (1N, 2.5 mL, 2.5 mmol, 4.0 eq)를 첨가하고, 10 분 동안 교반한 다음, 실온에서 10 분 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 65℃까지 꾸준히 가열하고, 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 0℃까지 냉각시키고, 메탄올 5 mL를 천천히 반응 용액에 적가한 다음, 30 분 동안 교반하고, 그 다음 실온에서 10 분 동안 교반하였다. 그 후, 반응 용액을 60℃까지 가열하고, 3 시간 동안 교반한 후, 감압 하에서 농축하여, 140 mg의 화합물 28의 조 생성물을 오일성 액체로 수득하였으며, 이를 정제하지 않고 다음 단계에 투입하였다. LC-MS (ESI+) 167.1 [M+H]+.
화합물 28 (140.0 mg, 0.58 mmol, 1.0 eq)의 조 생성물을 THF 5 mL에 용해시키고, 물 3 mL를 첨가한 다음, THF 2.5 mL 중 Boc2O (255.5 g, 1.17 mmol, 2.0 eq) 용액을 적가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물에 EA 30 mL를 첨가하고, 세척, 건조, 농축 및 정제하여 185 mg의 화합물 29를 백색 고체, 72%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 367.1 [M+H]+.
화합물 29 (94.0 mg, 0.25 mmol, 1.0 eq)를 DMF 3 mL에 용해시키고, K2CO3 (71.0 mg, 0.51 mmol, 2.0 eq)를 첨가한 후, DMF 1 mL 중 화합물 11 (75.0 mg, 0.38 mmol, 1.5 eq) 용액을 적가하고, 55℃까지 가열한 후 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, EA 20 mL를 반응 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 30% 시트르산 용액으로 pH=3으로 조정하고, 추출, 세척, 건조 및 농축하여 108 mg의 화합물 30을 회백색(off-white) 고체, 88%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 481.3 [M+H]+.
화합물 30 (108 mg, 0.22 mmol, 1.0 eq)을 무수 DCM 5 mL에 용해시키고, 1,4-다이옥산 중 HCl 용액 (4 M, 1.5 mL, 6.0 mmol, 27.0 eq)을 첨가한 다음, 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 메틸 tert-뷰틸 에터 10 mL로 초음파 분산시키고, 상층액을 제거하여 원심분리한 다음, 석유 에테르 10 mL로 분산시키고, 상층액을 제거하여 원심분리하였다. 고체를 감압 증류하여 용매를 제거하고, 66.6 mg의 화합물 31을 백색 고체, 100%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 225.1 [M+H]+.
일반적 방법 A에 따라, 66.6 mg의 화합물 31을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70℃에서 밤새 수행되었다. 반응 용액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 40 mg의 목적 화합물 A'-26을 33%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 540.9 [M+H]+.
실시예 17: A'-27의 합성
Figure pct00288
화합물 A'-26 (40.0 mg, 0.074 mmol, 1.0 eq)을 무수 THF 1.0 mL에 용해시키고, THF 500 μL 중 TEA (22.5 mg, 0.22 mmol, 3.0 eq) 용액을 첨가한 후, 실온에서 5 분 동안 교반하였다. 화합물 32 (20.5 mg, 0.16 mmol, 2.2 eq)를 DMF 500 μL에 용해시키고, 반응 용액에 적가한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 에틸 아세테이트 15 mL를 반응 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 15% 시트르산 용액으로 세척하고, 물로 세척하고, 포화 NaCl 용액으로 세척, 건조, 농축, 및 정제하여 12 mg의 화합물 A'-27을 백색 고체, 26%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 629.1 [M+H]+.
실시예 18: A'-28의 합성
Figure pct00289
화합물 33 (150 mg, 2 mmol, 1.0 eq)을 5 mL의 디옥산(dioxane)에 용해하고, 3 mL의 포화 중탄산 나트륨 수용액(saturated sodium bicarbonate aqueous solution)을 가한 후, Boc2O (523 mg, 2.40 mmol, 1.2 eq) 용액을 2.5 mL의 디옥산(dioxane)에 적가한 후, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 용액을 감압하에서 농축하였다. EA 30 mL를 첨가한 잔류물을 30 % 시트르산으로 pH=3으로 조정하고 추출, 세척, 건조, 농축, PE 15 mL로 분산, 여과 및 건조하여 344 mg의 화합물 34를 62 %의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 176.1 [M+H]+.
화합물 34 (350 mg, 2.00 mmol, 1.0 eq)를 DMF 4 mL에 용해하고, Ar 기체에서 -15 ℃로 냉각 한 후, 1 mL의 DMF에 TEA (606.0 mg, 6.00 mmol, 3.0 eq) 용액을 첨가한 후, 5 분 동안 교반 한 후, 1 mL의 DMF에 T3P (700.0 mg, 2.20 mmol, 1.1 eq) 용액을 첨가 한 후 1.5 시간 동안 교반하였다. 1 mL의 DMF에 녹인 화합물 35 (135.0 mg, 1.00 mmol, 0.5 eq) 용액을 반응 용액에 적가하고 밤새 교반하였다. EA 30 mL를 첨가한 반응 용액을 30 % 시트르산(citric acid)으로 pH=3으로 조정하고 추출, 세척, 건조 및 농축하여 오일성 액체인 350 mg의 화합물 36을 얻었으며, 이는 정제없이 다음 단계로 바로 진행하였다. LC-MS (ESI+) 449.2 [M+H]+.
화합물 36(350 mg, 0.78 mmol, 1.0 eq)을 5 mL의 무수 DCM과 함께 교반하면서 용해시키고, 1,4-디옥산(dioxane) 중 HCl 용액(4 M, 2.0 mL, 8.0 mmol, 10.2 eq)을 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 메틸 tert-부틸 에테르 20 mL에서 초음파로 분산시키고, 원심분리로 상층액을 제거하고, 20 mL 석유 에테르(petroleum ether)로 분산시키고, 원심분리로 상층액을 제거하였다. 고체를 감압 증류하여 용매를 제거하고, 254 mg의 화합물 37을 100 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 249.1 [M+H]+.
일반 절차 A에 따라 195mg의 화합물 37을 첨가하고 다른 물질은 몰비로 첨가 하였다. 반응은 70 ℃에서 밤새 수행되었다. 반응액을 순상 컬럼 크로마토 그래피로 정제하여 표적 화합물 A'-28 58 mg을 담황색 고체 형태로 17 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 564.9 [M+H]+.
일반 절차 A에 따라, 195 mg의 화합물 37을 첨가하고 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 70 ℃에서 밤새 수행하였다. 반응액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 58 mg의 목적 화합물 A'-28을 담황색 고체 형태로 17 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 564.9 [M+H]+.
실시예 19: A'-29의 합성
Figure pct00290
일반 절차 B에 따라, 58 mg의 화합물 38을 첨가하고, 다른 물질은 몰비로 첨가하였다. 반응은 실온에서 0.7 시간 동안 수행하였다. 반응액을 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 14.1 mg의 목적 화합물 A'-29를 22 %의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 625.1 [M+H]+.
실시예 20: A'-31의 합성
Figure pct00291
화합물 43 (342.0 mg, 3.00 mmol, 1.0 eq)을 무수 THF 15 mL에 용해하고 브로모말레산무수물(bromomaleic anhydride) (1110.0 mg, 6.30 mmol, 2.1 eq)을 적가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응액을 여과하였다. 필터 케이크를 DCM으로 세척하고, 건조하여 1160 mg의 화합물 44를 백색 고체 형태로 83 %의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 466.9 [M+H]+.
화합물 45(300 mg, 0.64 mmol, 1.0 eq)와 무수 아세트산 나트륨(158.0 mg, 1.93 mmol, 3.0 eq)에 아세트산 6 mL를 가한 후, 85 ℃까지 가열하고 밤새 반응시켰다. 반응액을 45 ℃로 냉각하고 감압하에서 농축하였다. 20 mL의 아세토니트릴(acetonitrile)이 첨가된 잔류물을 여과하였다. 여액을 분취 액체 크로마토그래피(preparative liquid chromatography)로 정제하여 15 mg의 담황색 고체(즉, 화합물 A'-31)을 5 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 430.9 [M+H]+.
실시예 21: A'-33의 합성
Figure pct00292
일반 절차 A에 따라, 화합물 48 (95 mg, 0.5 mmol)과 화합물 8 (80.6 mg, 0.2 mmol)을 첨가하여 10.9 mg의 화합물 A'-33을 10.1 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 548.0 [M+H]+.
실시예 22: A'-34의 합성
Figure pct00293
일반 절차 A에 따라, 화합물 49 (2-아미노-6-클로로이소니코틴산, 2-amino-6-chloroisonicotinic acid, 86 mg, 0.5 mmol)를 첨가하여 21.3 mg의 화합물 A'-34을 13 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 330.9 [M+H]+.
실시예 23: 항체(Ab)와 제1링커 모이어티(A)의 컨쥬게이트(conjugate)(Ab-A) 합성
본 발명에서 제공하는 링커(즉, 제1링커 모이어티 A)는 주로 항체-약물 컨쥬게이트에서 항체와의 커플링에 사용되었다. 본 발명에서 제공하는 링커와 항체의 결합능을 확인하기 위해 상기 실시예에서 합성한 링커를 항체와 결합하였다. 사용된 결합 방법은 다음과 같다:
1) 환원제 및 보호제의 모액(mother liquors) 제조 : 환원제 및 보호제의 모액(mother liquors), 1~20 mM TCEP(트리스-2-카르복시에틸-포스핀, Tris-2-carboxyethyl-phosphine)(환원제) 및 1~20 mM DTPA(디에틸렌 트리아민 펜타세테이트산, Diethylene triamine pentacetate acid)(보호제)을 각각 정제수로 제조하였다;
2) 항체의 환원 반응 : DTPA 및 TCEP 모액을 각각 단일 클론 항체 용액 (예: 5-30 mg/mL)에 첨가하였다. DTPA 모액은 특정 부피비(1~5:10)에 따라 단일 클론 항체 용액(예: 5-30 mg/mL)에 혼합되었으며, TCEP과 단일 클론 항체의 몰비는 0.5~6.0:1이었다. 환원제와 보호제를 첨가한 후, 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하면서 반응을 수행하였다;
3) 제1링커 모이어티(A) 용액의 제조: 제1링커 모이어티(A)를 25 % DMSO(디메틸 설폭사이드)에 용해시켜 5 mM 농도의 제1링커 모이어티(A) 용액을 제조하였다;
4) 제1링커 모이어티(A)와 항체 간의 커플링 반응: 단계 3)에서 얻은 제1링커 모이어티(A) 용액을 단계 2)에서 얻은 환원된 단일 클론 항체 용액에 천천히 첨가하고, 실제 필요에 따라 제1링커 모이어티(A)의 항체의 티오기(thio group)에 대한 몰비를 0.3~5:1 범위로 조절하고, 25 ℃에서 4 시간 동안 교반하면서 반응을 수행하였다;
5) 정제 및 검출 단계: 4) 단계의 반응이 완료된 후, 반응 용액을 PBS 버퍼로 3 회 원심분리 및 한외 여과하여 잔류 미 반응 화학 물질 및 DMSO와 같은 자유 소분자를 정제 및 제거하고 커플링 결과를 SDS-PAGE 전기 영동으로 검출하였다.
항체-링커 컨쥬게이트의 커플링 결과는 SDS-PAGE 전기 영동으로 분석하였다. 사용된 방법은 다음과 같다: SDS-PAGE 검출을 위해 NUPAGE 4-12 %의 겔 플레이트를 사용하고, 1.5 μL의 샘플을 1.5 mL EP 튜브에 넣고, 2.5 μL의 버퍼를 추가 한 다음, 1.5 μL의 환원제를 첨가하고, 물을 첨가하여 부피를 10μL로 만들었다. 혼합물을 오실레이터(oscillator)에서 혼합하고 전자 레인지(microwave oven)에서 1 분 동안 가열하였다. 샘플을 넣은 후 겔 전기 영동을 수행하였다. 겔 전기 영동이 완료된 후 겔을 꺼내 보관함에 담아 퀵 스테인(quick stain) 50 mL를 넣고 전자 레인지에서 5 분간 가열한 후 쉐이커에서 5 분간 염색하였다. 염색 용액을 쏟아 내고, 정제수 100 mL를 첨가하고, 인덕션 쿠커(induction cooker)에서 5 분간 가열한 후 쉐이커에서 1 시간 동안 탈색하였다. 상기 단계를 세 번 반복하였다.
상기 사용된 항체는 Her2 단일 클론 항체(항체의 서열 정보는 중국 특허 번호 CN105008398B의 명세서의 41, 42, 43 단락 참조)이고, 링커는 다음과 같다:
Figure pct00294
커플링 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 Nos. 1, 2, 3은 Her2-A'-7이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 8.5, 9.0, 7.4이며; Nos. 4, 5, 6은 Her2-A'-8이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 8.5, 7.4, 9.0이며; Nos. 7, 8, 9은 Her2-A'-10이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 8.5, 9.0, 7.4이며; Nos. 10, 11, 12는 Her2-A'-11이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 9.0, 7.4, 9.5이며; Nos. 13, 14, 15는 Her2-A'-12이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 7.4, 9.0, 8.5이며; Nos. 16, 17, 18는 Her2-A'-20이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 8.5, 9.0, 7.4이며; Nos. 19, 20, 21는 Her2-A'-28이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 9.0, 8.5, 7.4이며; Nos. 22, 23, 24는 Her2-A'-31이고, 커플링 버퍼는 각각 pH 7.4, 8.5, 9.0이다.
환원 전기 영동을 사용하여 항체 중 모든 티오 기(thio group)가 노출되었다. 따라서, 도 5에서, 25 KD는 항체의 경쇄 1 개의 분자량, 50 KD는 1 개의 중쇄의 분자량, 75 KD는 1 개의 경쇄와 1 개의 중쇄의 분자량을 나타내고(즉, 하나의 링커는 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 사이의 티오 기에 공유결합으로 연결됨), 100 KD는 2 개의 중쇄의 분자량을 나타내며(즉, 하나의 링커는 두 중쇄 사이의 티오 기에 공유결합으로 연결됨), 125 KD는 1 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄의 분자량을 나타내고(즉, 하나의 링커는 2 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 사이의 티오 기에 공유결합으로 연결됨), 150 KD는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄의 분자량을 나타냈다 (즉, 하나의 링커가 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄 사이의 티오 기에 공유결합으로 연결됨).
상기 결과는 항체-링커 컨쥬게이트가 각각 1 개의 중쇄와 1 개의 경쇄 사이, 2 개의 중쇄 사이, 2 개의 중쇄와 1 개의 경쇄 사이, 또는 2 개의 중쇄와 2 개의 경쇄 사이에서 티오 기에 각각 동시에 공유 결합된 링커를 가지고 있음을 나타낸다. 그리고 대부분의 항체-링커 컨쥬게이트에는 150-75 KD 밴드가 있었으며, 이는 항체에서 4 쌍의 이황화 결합이 완전히 또는 부분적으로 가교되었고, 가교 커플링 효과(bridge coupling effect)가 우수하다는 것을 증명하였다. 도 5에서도 버퍼 pH 9.0 조건에서 커플링 결과가 pH 8.5 및 7.4 조건에서보다 더 우수한 것을 나타낸다.
항체에 대한 본 발명에서 제공하는 링커의 더 나은 가교 커플링 효과(bridge coupling effect)를 고려하여, 항체-약물 컨쥬게이트 제조를 위해 A'-7, A'-8, A'-10, A'-11, A'-28을 선택하였다. 사용된 항체는 Her2 단일 클론 항체(상기와 동일)이며 사용 된 약물은 MMAE, MMAF, MMAD, CBI, DM1, DM4이다.
MMAE 및 MMAD의 경우, 본 발명에 포함된 항체-약물 컨쥬게이트의 제조는 일반적으로 3 단계로 나누어진다 : 제 1 단계는 제 2 링커 L과 약물 D의 컨쥬게이트 L-D를 제조하는 것고; 제 2 단계는 제 1 링커 A와 L-D의 컨쥬게이트 A-L-D를 제조하는 것이고; 제 3 단계는 항체 Ab와 A-L-D의 컨쥬게이트, 즉 항체-약물 컨쥬게이트 Ab-A-L-D를 제조하는 것이다.
MMAF, CBI, DM1, DM4의 경우, 본 발명에 포함된 항체-약물 컨쥬게이트의 제조는 일반적으로 2 단계로 나누어진다 : 제 1 단계는 제 1 링커 A와 약물 D의 컨쥬게이트 A-D를 제조하는 것이고; 제 2 단계는 항체 Ab와 A-D의 컨쥬게이트, 즉 항체-약물 컨쥬게이트 Ab-A-D를 제조하는 것이다.
구체적인 제조 방법은 실시 예 26-29에 나타내었다.
실시예 24 : 제 2 링커 모이어티(L) 및 약물(D)의 접합 (L-D) 합성
LD의 일반적인 합성 방법 : 제 2 링커 모이어티 L을 적절한 양의 DMF에 용해시키고, 질소 기체 보호하에 약물(D), HOBt, DIPEA 및 피리딘을 적절한 양으로 첨가 한 후 실온에서 24 시간 동안 교반하고 TLC를 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다. 반응이 완료된 후 반응액을 분취 액체 크로마토그래피(preparative liquid chromatography)로 정제하고, 제조액을 동결 건조하여 제 2 링커 모이어티와 약물의 컨쥬게이트(L-D)를 수득하였다.
Val-Cit-PAB-MMAE는 상술한 일반적 방법으로 제조되었으며 합성 경로는 다음과 같다:
Figure pct00295
화합물 53 (즉, Fomc-Val-Cit-PAB-PNP, 995.4 mg, 1.3 mmol)과 HOBt(67.6 mg, 0.65 mmol)를 반응 용기에 넣고 5 mL의 무수 DMF에 용해시킨 후, DIPEA(258.5 mg, 2 mmol)를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 교반하였다. 화합물 54(즉, MMAE, 717 mg, 1 mmol)를 5 mL의 무수 DMF에 용해시킨 후, 반응 용액에 적가하고, 상온에서 밤새 교반 하였다. 반응이 완료된 후 반응액을 여과하였다. 유기상(organic phase)은 농축되었다. 잔류물을 분취 액체 크로마토그래피(preparative liquid chromatography)로 분리하여 636.2 mg의 화합물 55(즉, Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAE)을 백색 고체 형태로 47.3 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1345.8 [M+H]+.
화합물 55 (270 mg, 0.2 mmol)를 아세토니트릴 중 20 % 피페리딘(piperidine) 용액(v/v) 3 mL에 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 동안 교반하여 고체를 서서히 용해시켰다. 반응이 완료된 후, 반응액을 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 분취 액체 크로마토그래피(preparative liquid chromatography)로 분리하여 214 mg의 화합물 62 (즉, Val-Cit-PAB-MMAE)을 95 % 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1123.7 [M+H]+.
제 2 링커 모이어티(L) 및 약물(D)을 사용한 합성은 Val-Cit-PAB-MMAD와 같은 다른 L-D 화합물의 합성을 위한 일반적 방법이었다.
실시예 25 : 제 1 링커 모이어티(A) 및 제 2 링커 모이어티-약물 컨쥬게이트(L-D)의 컨쥬게이트(A-L-D) 합성
A-L-D 합성을 위한 일반적 방법: 적절한 양의 제 1 링커 모이어티, EDCI, HOBt를 적절한 양의 무수 DMF에 용해시키고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 적절한 양의 자체 제작 L-D를 적절한 양의 무수 DMF에 용해시키고, 반응 용액에 천천히 적가 한 후, 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후 반응액을 아세토니트릴로 희석한 후, 분취 액체 크로마토그래피(preparative liquid chromatography)로 분리하였다. 용리액(eluent)을 동결 건조하여 제 1 링커 모이어티(A)와 제 2 링커 모이어티-약물 컨쥬게이트(L-D)의 컨쥬게이트를 수득하였다.
A'-7과 화합물 56 (Val-Cit-PAB-MMAE)의 컨쥬게이트는 상술한 일반적 방법을 사용하여 합성하였다. 합성 경로는 다음과 같다:
Figure pct00296
화합물 A'-7 (27.8 mg, 0.053 mmol), EDCI (11.2 mg, 0.058 mmol), HOBt (1.4 mg, 0.01 mmol)를 0.3 mL의 무수 DMF에 용해시키고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 화합물 56 (즉, Val-Cit-PAB-MMAE, 40 mg, 0.035 mmol)을 0.2 mL의 무수 DMF에 용해시키고, 반응 용액에 적가하고, 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응액을 아세토니트릴 2 mL로 희석 한 후, 분취 액체 크로마토그래피(preparative liquid chromatography)로 분리하였다. 용리액(eluent)을 동결건조하여 8.6 mg의 화합물 57 (즉, A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE)을 담황색 고체 형태로 15 %의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1624.6 [M+H]+.
A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE, A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, A'-11-Val-Cit-PAB-MMAD, A'-28-Val-Cit-PAB-MMAE 및 이들과 같은, 제 1 링커 모이어티와 L-D 화합물의 다른 컨쥬게이트는 상술한 일반적 방법을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00297
비교를 위해, 제 2 링커 모이어티(Val-Cit-PAB) 및 약물 모이어티(MMAE)와 함께 중국 특허번호 CN103933575A의 청구항 7 페이지에 개시된 화합물 6의 컨쥬게이트 575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE도 제조하였다.
Figure pct00298
실시예 26 제 1 링커 모이어티(A) 및 약물(D)의 컨쥬게이트(A-D) 합성
(1) A'-7-MMAF의 합성
Figure pct00299
화합물 A'-7 (51.8 mg, 0.1 mmol), EDCI (21.1 mg, 0.11 mmol), HOBt (2.7 mg, 0.01 mmol)를 2 mL의 무수 DMF에 용해시키고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 화합물 58 (즉, MMAF, 48.8 mg, 0.066 mmol)을 0.8 mL의 무수 DMF에 용해시키고, 반응 용액에 적가한 다음, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 4 mL의 아세토나이트릴로 희석하고, 분취 액체 크로마토그래피로 분리하였다. 용리액(eluent)을 동결건조하여(lyophilized) 25.9 mg의 화합물 A'-7-MMAF를 연노랑색(light yellow) 고체, 21%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1233.4 [M+H]+.
(2) A'-8-CBI의 합성
Figure pct00300
합성 방법은 A'-7-MMAF의 것과 동일하였다. A'-8 (22.0 mg, 0.047 mmol, 1.0 eq) 및 화합물 59 (즉, CBI, 14.0 mg, 0.020 mmol, 0.7 eq)를 첨가하여 6.0 mg의 백색 고체 A'-8-CBI를 21%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 868.0 [M+H]+.
(3) A'-8-DM1의 합성
Figure pct00301
화합물 60 (45.0 mg, 0.21 mmol, 1.0 eq)을 2 mL의 무수 THF에 용해시키고, 1 mL의 포화(sat.) NaHCO3 수성 용액(aqueous solution)에 첨가하고, 1 mL의 DMF 중 DM1 (61, 150.0 mg, 0.21 mmol, 1.0 eq)의 용액에 적가한 다음, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 용액을 10 mL의 물로 희석하고, EA로 추출하였다. 수성 층을 15% 시트르산 용액으로 pH=3으로 조정하고, 15 mL의 EA로 추출하고, 포화 NaCl로 세척, 건조 및 농축하여 165.7 mg의 화합물 62를 백색 고체, 85%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 949.3 [M+H]+.
A'-8 (150.0 mg, 0.33 mmol, 1.0 eq)를 5 mL의 DMF에 용해시키고, Ar 대기(atmosphere) 하에서 -15℃로 냉각시키고, 1 mL의 DMF 중 TEA (98.0 mg, 0.99 mmol, 3.0 eq)의 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반한 다음, 1 mL의 DMF 중 T3P (154.0 mg, 0.48 mmol, 1.5 eq)의 용액에 첨가한 후, 1.5시간 동안 교반하였다. 1 mL의 DMF 중 화합물 63 (46.0 mg, 0.29 mmol, 0.9 eq)의 용액을 반응 용액에 적가하고, 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 30 mL의 EA를 첨가하고, 반응 용액을 30% 시트르산으로 pH=3으로 조정하고, 추출, 세척, 건조, 농축하고, 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 90 mg의 화합물 64를 백색 고체, 52%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 607.1 [M+H]+.
화합물 64 (90 mg, 0.15 mmol, 1.0 eq)를 3 mL의 무수 DCM에 교반하면서 용해시키고, 1,4-다이옥산 중 HCL의 용액(4 M, 1.0 mL, 4 mmol, 26.7 eq)을 첨가한 다음, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 용액을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 20 mL의 메틸 tert-뷰틸 에터로 초음파 분산시키고, 상측액을 제거하여 원심분리한 다음, 20 mL의 석유 에테르로 분산시킨 다음, 상측액을 제거하여 원심분리하였다. 고체를 감압 증류하여 용매를 제거하고, 82 mg의 화합물 65를 백색 고체, 100%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 506.9 [M+H]+.
화합물 62 (30.0 mg, 0.03 mmol, 1.0 eq)를 2 mL의 DMF에 용해시키고, Ar 대기 하에서 -15℃로 냉각시키고, 500 μL의 DMF 중 TEA (11.0 mg, 0.095 mmol, 4.0 eq) 용액을 첨가하고, 5분 동안 교반한 다음, 500 μL의 DMF 중 T3P (15.0 mg, 0.047 mmol, 1.5 eq)의 용액을 첨가한 후, 1.5시간 동안 교반하였다. 500 μL의 DMF 중 화합물 65 (19.0 mg, 0.035 mmol, 1.1 eq)의 용액을 반응 용액에 적가한 후, 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 2 mL의 아세토나이트릴로 희석하고, 분취 액체 크로마토그래피로 정제하여, 9 mg의 생성물 A'-8-DM1을 20%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1437.3 [M+H]+.
(4) A'-7-DM4의 합성
Figure pct00302
화합물 67 (737.5 mg, 4.03 mmol), EDCI (846.13 mg, 4.43 mmol), HOBt (108.9 mg, 0.806 mmol)를 10 mL의 DCM에 용해시킨 후, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 화합물 66 (1 g, 4.03 mmol)을 5 mL의 다이클로로메탄에 용해시키고, 반응 시스템으로 3개의 배치(batch)로 천천히 적가하고, 밤새 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 하에서 농축하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 6 mL의 아세토나이트릴/물 (1:1)에 용해시키고 분취 액체 크로마토그래피로 분리하고, 동결건조하여 1.11 g의 화합물 68을, 무색의 유성 화합물, 67%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 414.2 [M+H]+.
화합물 68 (1.11 g, 2.7 mmol)을 1.1 mL의 DMA에 용해시켰다. 0.1 mL의 상기 수득한 용액을 1 mL의 DMA에 용해시키고, DIPEA (41.3 mg, 0.32 mmol)를 첨가한 후, 2분 동안 실온에서 교반한 다음, DM4 (69, 202.5 mg, 0.26 mmol)를 첨가하고, 6시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 용액을 분취 액체 크로마토그래피로 직접 분리하고, 동결건조하여 260 mg의 화합물 70을 백색 고체, 84%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1193.5 [M+H]+.
화합물 71의 합성 방법은 화합물 65의 것과 동일하였다. 119.3 mg의 화합물 70을 첨가하여, 106 mg의 화합물 71을 백색 고체, 96%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1093.5 [M+H]+.
A'-7-DM4의 합성 방법은 A'-8-DM1의 것과 동일하였다. 52 mg의 A'-7 및 54.6 mg의 화합물 71을 첨가하여, 15 mg의 A'-8-DM1을 백색 고체, 19%의 수율로 수득하였다. LC-MS (ESI+) 1594.4 [M+H]+.
실시예 27 항체-약물 컨쥬게이트(conjugate)의 합성 및 생성물 균일성(uniformity) 분석
항체-약물 컨쥬게이트의 일반적 합성 방법:
1) 환원제(reducing agent) 및 보호제(protective agent)의 모액(mother liquors) 제조: 환원제 및 보호제의 모액, 1~20 mM TCEP (트리스-2-카르복시에틸-포스핀) (환원제) 및 1~20 mM DTPA (다이에틸렌 트리아민 펜타아세트산) (보호제)는 각각 정제수(purified water)로 제조되었다;
2) 항체의 환원 반응: DTPA 및 TCEP 모액을 단일클론 항체(monoclonal antibody) 용액(예, 5-30 mg/mL)에 각각 첨가하였다. 특정 부피 비율(1~5:10)에 따라 DTPA 모액을 단일클론 항체 용액(예, 5-30 mg/mL)과 혼합하였고, 단일클론 항체에 대한 TCEP의 몰비(molar ratio)는 0.5~6.0:1이었다. 환원제 및 보호제를 첨가한 후, 반응을 1시간 동안 교반하면서 25℃에서 수행하였다;
3) A-L-D의 합성 및 용액의 제조: 제 1 링커 모이어티(first linker moiety)-제 2 링커 모이어티(second linker moiety)-약물 모이어티(drug moiety)의 컨쥬게이트(A-L-D)를 합성하고, 합성된 A-L-D를 25% DMSO (다이메틸 설폭사이드)에 용해시켜 A-L-D 용액을 5 mM의 농도로 수득하였다;
4) 약물 및 항체의 커플링 반응(coupling reaction): 단계 3)에서 수득한 A-L-D 용액을 단계 1)에서 수득한 환원된 단일클론 항체 용액에 천천히 첨가하고, 실제 필요에 따라, 항체의 싸이오기(thio group)에 대한 A-L-D의 몰비를 0.3~5:1의 범위로 조절하면서, 반응을 4시간 동안 교반하면서 25℃에서 수행하였다;
5) 정제 및 검출 단계: 단계 4)의 반응이 완료된 후, 반응 용액을 원심분리하고 PBS 버퍼로 3회 한외여과(ultrafilter)하여 정제하고 잔류 미반응 화학 물질 및 DMSO와 같은 유리 소분자(free small molecule)를 제거하고, 커플링 결과를 SDS-PAGE 전기영동 및 소수성 고성능 액체 크로마토그래피(hydrophobic high performance liquid chromatography, HIC-HPLC)로 검출하였다.
항체-약물 컨쥬게이트의 커플링 결과를 SDS-PAGE 전기영동 및 HIC-HPLC로 분석하였다. 사용한 방법은 다음과 같다:
1) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
SDS-PAGE 검출을 위해, NUPAGE 4-12%의 겔 플레이트(gel plate)를 사용하고, 1.5 μL의 샘플을 1.5 mL EP 튜브에 넣고, 2.5 μL의 버퍼를 넣은 다음, 1.5 μL의 환원제를 첨가하고, 물을 첨가하여 부피를 10 μL로 만든 후, 오실레이터(oscillator) 상에서 혼합하고, 1분 동안 전자레인지에서 열을 가하였다. 샘플을 로딩(loading)한 후, 겔 전기영동을 수행하였다. 겔 전기영동을 완료한 후, 겔을 꺼내서 새로운-보관함(keeping box)에 넣고, 50 mL의 퀵 스테인(quick stain)을 넣고, 5분 동안 전자레인지에서 가열한 다음, 5분 동안 진탕기(shaker) 상에서 염색하였다. 염색 용액(staining solution)을 부은 후, 100 mL의 정제수를 첨가하고, 5분 동안 인덕션레인지(induction cooker)에서 가열하고, 1시간 동안 진탕기 상에서 탈색하였다. 이 작업을 3회 반복하였다.
2) 소수성 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC)
시험 조건: HIC-HPLC: Tosoh TSK Gel Butyl, 4.6 mm Х 3.5 cm, 10 mm; 버퍼 A: 20 mM 인산나트륨(sodium phosphate), 1.5 M 황산암모늄(ammonium sulfate), pH 7.0; 버퍼 B: 20 mM 인산나트륨, 25% (v/v) 이소프로날(isopronal), pH 7.0; 유속(flow rate): 1 ml/min; 구배(gradient): 15분 내에 10% 버퍼 B에서 100% 버퍼 B로; 10 μL의 샘플.
다음의 4개의 항체-약물 컨쥬게이트를 상기 방법을 사용하여 제조하였다: Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, 상기 항체는 Her2 단일클론 항체(상기와 동일)이다. 상기 4개의 항체-약물 컨쥬게이트의 커플링 결과를 HIC-HPLC 및 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하고, 표 1, 도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 1d 및 도 2a, 도 2b에 나타내었다.
표 1 및 도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 1d에서, D0%는 링커를 통해 한 개의 항체가 커플링된 0개의 약물을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율, 즉 네이키드(naked) 항체의 비율을 나타내고, D1%는 링커를 통해 한 개의 항체가 커플링된 1개의 약물을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율을 나타내며, D2%는 링커를 통해 한 개의 항체가 커플링된 2개의 약물을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율을 나타내고, D3%는 링커를 통해 한 개의 항체가 커플링된 3개의 약물을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율을 나타내며, D4%는 링커를 통해 한 개의 항체에 커플링된 4개의 약물을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율을 나타내고, 및 D5%는 링커를 통해 한 개의 항체에 커플링된 5개의 약물을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트의 비율을 나타낸다.
결과는 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE의 평균 DAR 값이 4.10 (커플링 동안 항체에 대한 약물의 몰비가 5:1임)이고; Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE의 평균 DAR 값이 2.12 (커플링 동안 항체에 대한 약물의 몰비가 5:1임)이며; Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE의 평균 DAR 값이 2.26 (커플링 동안 항체에 대한 약물의 몰비가 5:1임)이고; Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE의 평균 DAR 값이 4.10 (커플링 동안 항체에 대한 약물의 몰비가 5:1임)이었음을 나타내었다. 결과는 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 모두 우수한 커플링 효과(이상적인 조건에서 평균 DAR 값은 2-4 사이임)를 가지며, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE 및 Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE의 DAR2 비율은 각각 65.574% 및 78.9%이고, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE의 D4% 비율은 59.45%이며, DAR 값 분포는 매우 집중되어 있고, 생성물 균일성은 매우 우수하였음(모두 Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE보다 우수하였음)을 나타내었다.
소수성 고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의한 항체-약물 컨쥬게이트의 분석 결과
ADC D0% D1% D2% D3% D4% D5% DAR
Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 0 0.07 1.93 12.16 59.45 26.40 4.10
Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 0 9.03 78.9 11.9 0 0 2.26
Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE 0 11.41 65.57 23.02 0 0 2.12
Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE 0 0 1.99 18.46 52.94 21.17 4.10
도 2a, 도 2b는 상기 항체-약물 컨쥬게이트의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 나타내었고, 도 2a는 Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 버퍼의 pH는 각각 8.5, 9.0, 7.4임), Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 버퍼의 pH는 각각 8.5, 9.0, 7.4임), Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 버퍼의 pH는 각각 8.5, 9.0, 7.4임)의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 나타내었고, 도 2b는 좌측으로부터 우측으로 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 버퍼의 pH 는 9.0임)의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 나타내었다. 환원 전기영동의 사용으로 인해, 항체 중 모든 싸이오기가 노출되었다. 따라서, 25KD은 항체의 경쇄 1개의 분자량을 나타내고, 50KD은 중쇄 1개의 분자량을 나타내며, 75KD은 경쇄 1개 및 중쇄 1개의 분자량을 나타내고(즉, 링커 1개가 중쇄 1개 및 경쇄 1개 사이의 싸이오기에 공유결합됨), 100KD은 중쇄 2개의 분자량을 나타내며(즉, 링커 1개가 중쇄 2개의 사이의 싸이오기에 공유결합됨), 125KD은 경쇄 1개 및 중쇄 2개의 분자량을 나타내고(즉, 링커 1개가 중쇄 2개 및 경쇄 1개 사이의 싸이오기에 공유결합됨), 150KD은 중쇄 2개 및 경쇄 2개의 분자량을 나타내었다(즉, 링커 1개가 중쇄 2개 및 경쇄 2개 사이의 싸이오기에 공유결합됨).
도 2a는 본 실시예에서 제공된 항체-약물 컨쥬게이트 (Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE) 각각이 중쇄 1개 및 경쇄 1개 사이 (75KD), 중쇄 2개 사이 (100KD), 중쇄 2개 및 경쇄 1개 사이 (125KD), 또는 중쇄 2개 및 경쇄 2개 사이 (150KD) 각각에서 싸이오기에 동시에 공유결합된 링커를 갖는다는 것을 나타내며, 이는 항체에서 4쌍의 이황화 결합이 완전히 또는 부분적으로 가교(bridged ring)되었고, 가교 커플링 효과가 더 우수하였음을 입증하였다.
도 2b는 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE (커플링 버퍼의 pH는 9.0임)의 평행 대비(parallel contrast) SDS-PAGE 전기영동 패턴을 나타내었다. 상기 도면으로부터, 컨쥬게이트 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 및 Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE에서 150KD 및 125KD 밴드의 비율이 컨쥬게이트 Her2-575DZ-Val-Cit-PAB-MMAE에서 해당 밴드의 비율보다 유의하게 높았음을 확인할 수 있었다. 동시에, 50KD 및 25KD 밴드의 비율 또한 유의하게 감소하였는데, 이는 본 발명의 제 1 링커 모이어티가 더 우수한 커플링 효율을 가지며 더 높은 가교 비율을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트를 생성할 수 있음을 입증하였다.
실시예 28: 항체-약물 컨쥬게이트의 가수분해 분석
항체-약물 컨쥬게이트(claudin18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE)의 가수분해 결과는 분자량 분석 및 단백질 등전점 분석을 특징으로 한다.
1) 분자량 분석 (LC-MS)
시험 조건: 기기 모델: Thermo Q Exactive Plus; 이동상: 25 mM 아세트산암모늄 용액; 유속: 0.3 mL/min; 주입 부피: 1 mg/mL, 20 μL, 즉, 20 μg; 검출 범위: 5000-8000 Da; 출력 범위: 140000-160000 Da.
2) 등전점 분포 분석(Isoelectric point distribution analysis)
기기 정보: Imaging Capillary Isoelectric Focusing Electrophoresis Instrument, 모델: iCE 3.
기기 설정: 포커스 타임 1: 1.00분 동안 1500V; 포커스 타임 2: 8.00분 동안 3000V.
네이키드 항체(claudin18.2 antibody, 클라우딘18.2 항체): 양쪽성 전해질 담체(amphoteric electrolyte carrier): 1% Pharmalyte 5-8, 3% Pharmalyte 8-10.5; 낮은 등전점 마커: 8.18; 높은 전기점 마커(high electric point marker): 9.77; 단백질 농도: 0.25 mg/mL; 트레이 온도: 15℃.
claudin18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE: 양쪽성 전해질 담체: 3% Servalyt 5-9, 1% Servalyt 9-11; 낮은 등전점 마커: 5.85; 높은 전기점 마커: 9.46; 단백질 농도: 0.50 mg/mL; 트레이 온도: 15℃.
도 6a는 네이키드 항체의 분자량 결과를 나타내었고, 도 6b는 claudin18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE의 분자량 결과를 나타내었다. 상기 도면으로부터, 네이키드 항체의 분자량은 145144Da이고, claudin18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE (항체에 대한 A'-7-VC-PAB-MMAE의 비율이 4:1인 경우)의 분자량은 152078 Da, 152119 Da, 152147 Da이었음을 확인할 수 있었다. 1개의 항체가 가수분해 없이 4 A'-7-VC-PAB-MMAE와 커플링되는 경우, 이의 이론적 분자량은 51999 Da이었다. 실제 측정된 분자량은 152078 Da, 152119 Da, 152147 Da이었고, 이는 이론적 분자량으로부터 큰 편차를 보인 것으로, 기기의 편차 범위(20 Da)를 초과하였다. 4개, 7개, 8개의 말레이미드가 가수분해되고 컨쥬게이트 claudin18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE가 가수분해되는 경우, 이의 이론적 분자량은 152071 Da, 152125 Da, 152143 Da이었다. 이러한 이론적 값과 비교하여, 실제 측정된 값의 상대적 편차는 기기의 편차 범위 내에 있었다. 항체-A'-7-VC-PAB-MMAE가 부분적으로 가수분해된 것으로 추측되었다.
다음으로, 가수분해된 모이어티를 연구하였다. 도 7a는 네이키드 항체의 등전점 분포 결과를 나타내었고, 도 7b는 claudin18.2-A'-7-VC-PAB-MMAE의 등전점 분포 결과를 나타내었다. 도 7a로부터, 네이키드 항체의 등전점의 주요 피크는 8.91이었고, 산성 피크(등전점 <8.91) 및 알칼리 피크(등전점 >8.91)의 비율이 상대적으로 낮았음을 확인할 수 있었다. 도 7b로부터, 항체-A'-7-VC-PAB-MMAE의 등전점이 7.86-8.70 사이에 분포되어 있음을 확인할 수 있었다. 네이키드 항체와 비교하여, 항체-A'-7-VC-PAB-MMAE의 등전점은 유의하게 감소하였는데, 이는 이의 표면 상에 카르복실기(carboxyl group)와 같은 산성기가 더 많이 있음을 나타낸다. 구조 분석을 결합함으로써, 가수분해의 위치는 항체-A'-7-VC-PAB-MMAE의 말레이미드 모이어티에 있음을 확인할 수 있었으며, 항체-약물 컨쥬게이트의 합성 및 가수분해 환경을 조절함으로써, 예를 들어, 완전 가수분해(full hydrolysis)를 이루거나 또는 가수분해가 없도록 하여, 항체-약물 컨쥬게이트의 링커에서 말레이미드의 가수분해 정도를 조절할 수 있었다. 게다가, 정제 수단을 또한 사용하여 생성물을 분리할 수 있고, 이는 합성된 생성물에서와 같은 정도로 가수분해되었다.
실시예 29: 항원에 대한 항체-약물 컨쥬게이트의 친화도(affinity) 측정 (ELISA 방법)
일반적 방법: 항원을 100 μl/웰(well)씩 필요한 농도(예컨대 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml, 또는 실험적 필요에 따라 자체적으로 조절되었음)로 코팅 버퍼로 희석하고, 4℃에서 밤새 보관하였다; 플레이트 세척: 플레이트를 350 μl/웰씩 PBST 세척 용액으로 3회 세척하고, 두드려 건조하였다(pat dried); 블로킹(blocking): 플레이트를 200 μl/웰씩 3% BSA 블로킹 용액으로 블로킹하고, 4℃에서 밤새 보관하였다; 플레이트 세척: 플레이트를 300 μl/웰씩 PBST로 2회 세척하고, 웰의 용액을 닦아냈다(blotting); 샘플의 로딩(loading): 샘플을 희석액 1%BSA-PBST 용액으로 희석한 다음, 희석된 샘플을 100 μl/웰씩, 3회 반복으로, 블로킹된 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 블랭크 대조군(blank control)으로서 희석액을 사용하여, 37℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다(희석 방식은 실제 상황에 따라 변경될 수 있음); 플레이트 세척: 플레이트를 200 μl/웰씩 PBST로 2회 세척하고, 웰의 용액을 닦아냈다; 시험 항체의 로딩: Goat antA-Human IgG-Fc HRP 컨쥬게이션된 항체를 100 μl/웰씩 1% BSA-PBST로 1:5000으로 희석하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다(희석액은 실제 상황에 따라서 변경될 수 있음); 플레이트 세척: 플레이트를 200 μl/웰씩 PBST로 4회 세척하고, 웰의 용액을 닦아냈다; 발색: TMB 기질을 100μl/웰씩 첨가하여, 2분 동안 발색되도록 하였다; 종결: 2 M H2SO4를 50 μl/웰씩 첨가하여 반응을 종결하였다; 판독: 450/655 nm에서 광학 밀도 흡광도(optical density absorbance)를 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 측정하였으며, 농도는 가로축으로, 광학 밀도 흡광도는 세로축으로 하고, 실험 결과를 프리즘(Prism) 분석 소프트웨어로 분석하였고, EC50 의 값 등은 자동으로 상기 소프트웨어에 의해 계산되었다. 결과는 표 2 및 도 3에 나타내었다.
표 2는 Her2 항원에 대한 항체-약물 컨쥬게이트(Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE)의 EC50 값을 나타내고, Her2는 대조군 ADC로서 Her2-Mc-vc-PAB-MMAE와 함께 사용되는 네이키드 항체이다. 결과는 Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 및 Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 모두 항원에 대한 더 우수한 친화도를 갖는 것으로 나타났고, 데이터 결과는 사용된 연결 방법이 항체의 원래 친화도를 변경하지 않았음을 나타내었다.
항원에 대한 항체-약물 컨쥬게이트의 친화도 (EC50 값)
ADC EC50 (ng/mL) R2
Her2 1.073 0.999
Her2-Mc-vc-PAB-MMAE 2.132 0.994
Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 1.725 0.999
Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 2.692 1.000
실시예 30: In vitro 효능 시험
인간 유방암 SK-BR-3 세포 및 배양 배지를 포함하는 배양 접시를 배양을 위해 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣었다. 성장 상태가 양호한 세포를 선택하여 원래의 배양 배지는 버린 다음, 수득한 세포를 배양 배지에 현탁하고 별도로 계수(counting)하였다. 세포 현탁액을 96-웰 플레이트(웰당 5000개 세포)에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 그 다음 희석된 약물을 배양을 위해 세포 현탁액에 첨가하였다. 72시간 동안 배양한 후, Cell Counting Kit-8 (CCK-8 키트로 약칭함)을 사용하여 활성 발색을 일으키고, 발색 후 96-웰 플레이트를 마이크로플레이트 판독기로 측정하여 450 nm에서 OD 값을 수득하였다. OD 값을 통해 Prism 소프트웨어로 IC50 값을 계산하였다. 상기 소프트웨어를 이용하여 억제율(inhibition rate)을 y 값으로, 약물 농도를 x 값으로, 4개의 매개변수 곡선 피팅(fitting)을 수행하였고, 최대 억제율 및 최소 억제율 사이의 억제율에 해당하는 약물 농도 값(소프트웨어에 의해 디폴트로 설정된 IC50 값임)이 기록되었다. 피팅된 곡선이 "S 곡선"이고 R2 ≥ 0.95인 경우, IC50 값은 유효하였다. 인간 유방암 SK-BR-3 세포에 대한 항체-약물 컨쥬게이트 Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE의 IC50 값을 표 3에 나타내었고, 억제율 곡선은 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
표 3은 인간 유방암 SK-BR-3 세포에 대한 항체-약물 컨쥬게이트(Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE, Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE)의 IC50 억제율을 나타내었다.
인간 유방암 SK-BR-3 세포에 대한 항체-약물 컨쥬게이트의 In vitro 효능
ADC IC50 (ng/mL)
Her2-A'-8-Val-Cit-PAB-MMAE 5.13
Her2-A'-7-Val-Cit-PAB-MMAE 1.57
Her2-A'-11-Val-Cit-PAB-MMAE 2.53
Her2-A'-10-Val-Cit-PAB-MMAE 2.11
본 발명은 구체적인 실시예에 의해 예시되었다. 그러나, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 각각의 구체적인 실시예에 본 발명이 한정되는 것이 아니라는 것을 이해할 수 있고, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 또는 수정이 가능함을 이해할 수 있으며, 본 명세서에서 언급된 다양한 기술적 특징은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 서로 결합될 수 있다. 이러한 변경 및 수정은 모두 본 발명의 범위 내에 있다.

Claims (21)

  1. 식 I로 표시되는 구조를 갖는 링커:
    Figure pct00303
    (I)
    상기 M1', M2'는 각각 독립적으로
    Figure pct00304
    ,
    Figure pct00305
    ,
    Figure pct00306
    ,
    Figure pct00307
    ,
    Figure pct00308
    ,
    Figure pct00309
    ,
    Figure pct00310
    이거나 또는 존재하지 않고, M1', M2'는 동일하거나 또는 다르지만, 동시에 부재하지 않으며;
    L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C9 알킬, C2-C9 알케닐, C2-C9 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴, 폴리에틸렌글리콜, O, S,
    Figure pct00311
    NR4
    Figure pct00312
    ,
    Figure pct00313
    C(=O)
    Figure pct00314
    ,
    Figure pct00315
    C(=O)O
    Figure pct00316
    ,
    Figure pct00317
    C(=O)NR11
    Figure pct00318
    ,
    Figure pct00319
    C=NR3
    Figure pct00320
    ,
    Figure pct00321
    C(=S)O
    Figure pct00322
    ,
    Figure pct00323
    C(=S)NR12
    Figure pct00324
    ,
    Figure pct00325
    C(=S)S
    Figure pct00326
    ,
    Figure pct00327
    NR13(C=O)
    Figure pct00328
    ,
    Figure pct00329
    NR14(C=S)NR5
    Figure pct00330
    ,
    Figure pct00331
    O(C=O)NR15
    Figure pct00332
    ,
    Figure pct00333
    S(=O)2
    Figure pct00334
    및 이들의 조합으로부터 선택되고;
    Q는
    Figure pct00335
    ,
    Figure pct00336
    , N, B, P, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, (헤테로사이클릴)알킬로부터 선택되며;
    L3'는
    Figure pct00337
    R8(C=O),
    Figure pct00338
    C(=O)R8C(=O), 폴리에틸렌글리콜,
    Figure pct00339
    ,
    Figure pct00340
    NH2,
    Figure pct00341
    OH,
    Figure pct00342
    SH,
    Figure pct00343
    X 및 이들의 조합으로부터 선택되며;
    X는 F, Cl, Br, I로부터 선택되고;
    Y는
    Figure pct00344
    ,
    Figure pct00345
    ,
    Figure pct00346
    이고;
    Z는 C, N으로부터 선택되며;
    R1은 임의의 기이거나 부재하고, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R12, R13, R14, R15는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C5-C6 사이클로알킬, C5-C6 헤테로사이클릴, C2-C12 폴리에틸렌글리콜, O, S,
    Figure pct00347
    NR4
    Figure pct00348
    ,
    Figure pct00349
    C(=O)
    Figure pct00350
    ,
    Figure pct00351
    C(=O)O
    Figure pct00352
    ,
    Figure pct00353
    C(=O)NR11
    Figure pct00354
    ,
    Figure pct00355
    O(C=O)NR15
    Figure pct00356
    로부터 선택되고;
    Q는
    Figure pct00357
    , N, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C3-C8 사이클로알킬, C3-C8 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
    L3'는
    Figure pct00358
    R8 (C=O),
    Figure pct00359
    C (=O) R8C (=O), 폴리에틸렌글리콜,
    Figure pct00360
    ,
    Figure pct00361
    NH2,
    Figure pct00362
    OH,
    Figure pct00363
    SH,
    Figure pct00364
    X 및 이들의 조합으로부터 선택되고;
    X는 Br이며;
    Y는
    Figure pct00365
    이고;
    R1, R2, R3, R4, R5, R8, R10, R11, R15는 각각 독립적으로 H, C1-C4 알킬, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C5-C6 사이클로알킬, C5-C6 헤테로사이클릴로부터 선택되는, 링커.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음 구조를 갖는, 링커:
    Figure pct00366
    (A'-1') 또는
    Figure pct00367
    (A'-2') 또는
    Figure pct00368
    (A'-3') 또는
    Figure pct00369
    (A'-4').
  4. 제3항에 있어서, 다음 구조를 갖는, 링커:
    Figure pct00370

    Figure pct00371

    Figure pct00372

    Figure pct00373

    Figure pct00374

    Figure pct00375

    Figure pct00376

    Figure pct00377

    Figure pct00378
    .
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 컨쥬게이트의 제조에 있어서의 상기 링커의 용도.
  6. 식 II로 표시되는 구조를 갖는 항체-약물 컨쥬게이트:
    Ab-(A-L-D)n (II)
    상기 Ab는 항체 또는 항체의 기능성 절편이고;
    상기 링커 모이어티는 제1 링커 모이어티 A 및 제2 링커 모이어티 L이며;
    D는 약물 모이어티이고;
    n은 1, 2, 3 또는 4이며;
    상기 제1 링커 모이어티 A는 Ab 내의 싸이올기 또는 아미노기에 공유 결합된 그룹을 포함하고, 식 III으로 표시되는 구조를 가지며:
    Figure pct00379
    (III)
    상기 M1, M2는 각각 독립적으로
    Figure pct00380
    ,
    Figure pct00381
    ,
    Figure pct00382
    ,
    Figure pct00383
    ,
    Figure pct00384
    ,
    Figure pct00385
    ,
    Figure pct00386
    ,
    Figure pct00387
    ,
    Figure pct00388
    ,
    Figure pct00389
    로부터 선택되거나 또는 존재하지 않고, M1 및 M2는 동일하거나 다르지만, 동시에 부재할 수 없고;
    L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C9 알킬, C2-C9 알케닐, C2-C9 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴, 폴리에틸렌글리콜, O, S,
    Figure pct00390
    NR4
    Figure pct00391
    ,
    Figure pct00392
    C(=O)
    Figure pct00393
    ,
    Figure pct00394
    C(=O)O
    Figure pct00395
    ,
    Figure pct00396
    C(=O)NR11
    Figure pct00397
    ,
    Figure pct00398
    C=NR3
    Figure pct00399
    ,
    Figure pct00400
    C(=S)O
    Figure pct00401
    ,
    Figure pct00402
    C(=S)NR12
    Figure pct00403
    ,
    Figure pct00404
    C(=S)S
    Figure pct00405
    ,
    Figure pct00406
    NR13(C=O)
    Figure pct00407
    ,
    Figure pct00408
    NR14(C=S)NR5
    Figure pct00409
    ,
    Figure pct00410
    O(C=O)NR15
    Figure pct00411
    ,
    Figure pct00412
    S(=O)2
    Figure pct00413
    및 이들의 조합으로부터 선택되며;
    Q는
    Figure pct00414
    ,
    Figure pct00415
    , N, B, P, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, (헤테로사이클릴)알킬로부터 선택되고;
    L3은 제2 링커 모이어티 L에 공유 결합되고,
    Figure pct00416
    R2(C=O)
    Figure pct00417
    ,
    Figure pct00418
    C(=O)R2C(=O)
    Figure pct00419
    , 폴리에틸렌 글리콜,
    Figure pct00420
    ,
    Figure pct00421
    NR9
    Figure pct00422
    ,
    Figure pct00423
    O
    Figure pct00424
    ,
    Figure pct00425
    S
    Figure pct00426
    및 이들의 조합으로부터 선택되거나 부재하며;
    R1은 임의의 기이거나 부재하고, R2, R3, R4, R5, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
    제2 링커 모이어티 L은 임의의 절단 가능한 링커 또는 절단 불가능한 링커이거나 존재하지 않는다.
  7. 제6항에 있어서, 다음 특징을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트:
    L1, L2는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C5-C6 사이클로알킬, C5-C6 헤테로사이클릴, C2-C12 폴리에틸렌글리콜, O, S,
    Figure pct00427
    NR4
    Figure pct00428
    ,
    Figure pct00429
    C (=O)
    Figure pct00430
    ,
    Figure pct00431
    C(=O)O
    Figure pct00432
    ,
    Figure pct00433
    C(=O)NR11
    Figure pct00434
    ,
    Figure pct00435
    O(C=O)NR15
    Figure pct00436
    로부터 선택되고;
    Q는
    Figure pct00437
    , N, C6-C8 아릴, C6-C8 헤테로아릴, C3-C8 사이클로알킬, C3-C8 헤테로사이클릴로부터 선택되며;
    L3은
    Figure pct00438
    R2(C=O)
    Figure pct00439
    ,
    Figure pct00440
    C(=O)R2C(=O)
    Figure pct00441
    , 폴리에틸렌글리콜,
    Figure pct00442
    ,
    Figure pct00443
    NR9
    Figure pct00444
    , O, S 및 이들의 조합으로부터 선택되거나 부재하고;
    R1은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
  8. 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 링커 모이어티가 다음 구조를갖는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00445

    Figure pct00446

    Figure pct00447

    Figure pct00448

    Figure pct00449

    Figure pct00450

    Figure pct00451

    Figure pct00452

    Figure pct00453
    .
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체의 기능적 단편이 세포 표면 수용체 또는 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 링커 모이어티 A가 Ab에서 싸이올기에 공유 결합 된 기를 함유하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 링커 모이어티 A가 다음 구조를 가질 수 있는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00454

    Figure pct00455

    Figure pct00456

    Figure pct00457

    Figure pct00458

    Figure pct00459

    Figure pct00460

    Figure pct00461

    Figure pct00462

  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 링커 모이어티 L이 C1-C9 알킬, C2-C9 알케닐, C2-C9 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴,
    Figure pct00463
    , O, S,
    Figure pct00464
    NR6
    Figure pct00465
    ,
    Figure pct00466
    C (=O)
    Figure pct00467
    ,
    Figure pct00468
    C (=O) O
    Figure pct00469
    ,
    Figure pct00470
    C (=O) NR6
    Figure pct00471
    ,
    Figure pct00472
    C=NR6
    Figure pct00473
    ,
    Figure pct00474
    C (=S) O
    Figure pct00475
    ,
    Figure pct00476
    C (=S) NR6
    Figure pct00477
    ,
    Figure pct00478
    C (=S) S
    Figure pct00479
    ,
    Figure pct00480
    NR6 (C=O)
    Figure pct00481
    ,
    Figure pct00482
    NR6 (C=S) NR7
    Figure pct00483
    ,
    Figure pct00484
    O (C=O) NR6
    Figure pct00485
    ,
    Figure pct00486
    S (=O) 2
    Figure pct00487
    , Val-Val-PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys (Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys (Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB, Ala-PAB, PAB 및 이들의 조합이거나 존재하지 않고, 여기서 R6, R7은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-C9 사이클로알킬, C3-C9 헤테로사이클릴로부터 선택되며, e는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, 제2 링커 모이어티 L이 다음일 수 있는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00488

    Figure pct00489

    Figure pct00490

    Figure pct00491

    Figure pct00492

    Figure pct00493

    Figure pct00494

  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 모이어티 D가 세포독성 약물, 세포 분화 인자, 줄기세포 영양 인자, 스테로이드 약물, 자가면역질환 치료용 약물, 항 염증 약물, 또는 감염질환 치료용 약물이고; 약물 모이어티 D는 바람직하게 튜불린 억제제 또는 DNA 손상제이거나; 약물 모이어티 D는 더욱 바람직하게 돌라스타틴, 아우리스타틴, 메이탄신, 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 안트라마이신 유도체 PBD, 캄프토테신 유도체 SN-38, 토포아이소머라제 I 억제제, 아마니틴, 안트라사이클린, 바카틴, 캄프토테신, 세마도틴, 콜히친, 콜시미드, 콤브레타스타틴, 크립토피신, 디스코더몰리드, 도세탁셀, 독소루비신, 에키노마이신, 엘레우테로빈, 에포틸론, 에스트라무스틴, 렉시트로프신, 메이탄신, 메토트렉세이트, 넷롭신, 퓨로마이신, 리족신, 탁산, 튜불리신, 빈카알칼로이드, 비타민 A 전구체, 엽산인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 다음인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00495

    Figure pct00496

    Figure pct00497

    Figure pct00498

    Figure pct00499

    Figure pct00500

    Figure pct00501

    Figure pct00502

    Figure pct00503
    .
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-약물 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00504

    Figure pct00505

    Figure pct00506

    Figure pct00507

    Figure pct00508

    Figure pct00509

    Figure pct00510

    Figure pct00511

    Figure pct00512

    Figure pct00513

    Figure pct00514

    Figure pct00515

    Figure pct00516

    Figure pct00517

    Figure pct00518

    Figure pct00519
    .
    상기 Ab는 세포 표면 수용체 및 종양 관련 항원에 대한 항체이며;
    n1, n2, n3은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4로부터 선택되고; n1, n2, n3은 동시에 0이 아니고 n1+n2+n3≤4이며;
    n4, n5, n6, n7은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4로부터 선택되고; n4, n5, n6, n7은 동시에 0이 아니고, n4+n5+n6+n7≤4이며;
    n8, n9는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4로부터 선택되고; n8, n9는 동시에 0이 아니고 n8+n9≤4이며;
    m1, m2, m3은 각각 독립적으로 0, 1, 2로부터 선택되고; m1, m2, m3 중 적어도 하나는 0이지만 m1, m2, m3은 동시에 0이 아니며, m1+m2+m3≤2이고;
    m4, m5는 각각 독립적으로 0, 1, 2로부터 선택되며; m4, m5는 동시에 0이 아니며, m4+m5≤2이다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체-약물 컨쥬게이트가 다음 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00520

    Figure pct00521

    Figure pct00522

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    Figure pct00533

    Figure pct00534

    Figure pct00535
    ,
    상기 Ab는 세포 표면 수용체 및 종양 관련 항원에 대한 항체이고;
    n10은 0,1,2,3 또는 4이며;
    m6은 0, 1 또는 2이다.
  18. 제16항에 있어서, 상기 항체-약물 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00536

    Figure pct00537

    Figure pct00538

    Figure pct00539

    Figure pct00540

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    Figure pct00543

    Figure pct00544

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    Figure pct00547

    Figure pct00548

    Figure pct00549

    Figure pct00550

    Figure pct00551
    ,
    상기 Ab는 세포 표면 수용체 및 종양-관련 항원에 대한 항체이고,
    n11은 0,1,2,3 또는 4이며;
    m7은 0, 1 또는 2이다.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다음으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트: 뮤린 항체, 포유 동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중 특이적 항체.
  20. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 암, 자가 면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 컨쥬게이트 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
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